DE69533197T2

DE69533197T2 - Liposomale Mittel

Info

Publication number: DE69533197T2
Application number: DE69533197T
Authority: DE
Inventors: Martha Garrity; John Varadarajan; David Alan WATSON
Original assignee: Amersham Health Salutar Inc
Current assignee: Amersham Health Salutar Inc
Priority date: 1994-10-10
Filing date: 1995-10-09
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2015-10-10
Also published as: JPH10507172A; AU3613695A; JP4057646B2; EP0785804B1; GB9420390D0; CA2200867A1; WO1996011023A1; MX9702523A; DE69533197D1; EP0785804A1; US6045821A; CN1168636A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf neue liposomale Mittel, insbesondere parenteral verabreichbare Mittel mit Membran-gebundenen makrocyclischen Komplexbildungsgruppen, die diagnostisch oder therapeutisch verwendbare Metallionen tragen. Solche liposomalen Mittel können in der Therapie oder als Kontrastverstärker in diagnostischen Bildgebungsanwendungsmethoden wie MRI, Szintigraphie, Röntgen und CT verwendet werden.
Die Verwendung diagnostischer Mittel in medizinischen Bildgebungsverfahren ist sehr geläufig.
Bei der MRI beziehen Kontrastmittel ihren Kontrastverstärkungseffekt im allgemeinen aus dem Einschluß eines Materials, das paramagnetisches, ferrimagnetisches, ferromagnetisches oder superparamagnetisches Verhalten zeigt, zum Beispiel ein komplexiertes paramagnetisches Metallion (wie Gd oder Dy) oder ein Eisenoxidnanoteilchen. Diese Materialien beeinflussen die charakteristischen Relaxationszeiten des Bildkerns in Körperregionen, in denen sie sich verteilen, was zur Erhöhung oder Verringerung der MR-Signalintensität führt.
Beim Röntgen und bei CT beziehen Kontrastmittel ihre Wirkung aus ihrer Fähigkeit, die Röntgenstrahlendurchlässigkeitsmerkmale der Körperregionen, in denen sie sich verteilen, zu verändern, und als Ergebnis ist die Verwendung von komplexierten Schwermetallionen, die große Röntgenstrahlen-Querschnitte aufweisen, als Röntgenstrahlenkontrastmittel vorgeschlagen worden.
Bei der Szintigraphie ist das Bildgebungsmittel ein Radionuklid, zum Beispiel ein komplexiertes radioaktives Metallion, im allgemeinen ein Gammastrahler.
Für die Therapie ist auch die Verwendung von komplexierten Metallspezies, entweder Radionukliden oder Metallen, die selbst eine therapeutische Wirkung haben, wie Vanadium für die Diabetestherapie, allgemein bekannt.
Während seit langem in der Medizin therapeutisch und diagnostisch verwendbare Metallkomplexe verwendet worden sind, verbleibt der Bedarf nach Metallkomplex-basierenden Mitteln mit verbesserten Bioverteilungs- und Bioeliminierungsprofilen. Bei der parenteralen Verabreichung verteilen sich einfach wasserlösliche Metallkomplexe mit niedrigem Molekulargewicht, wie die MRI-Kontrastmittel GdDTPA und GdDTPA-BMA, durch das extrazelluläre Fluid (ECF) ohne eine besondere Ortsspezifizität und werden schnell durch die Nieren mittels glomerulärer Filtration extrahiert. Es sind andere Mittel vorgeschlagen worden, die, aufgrund ihres partikulären oder lipophilen Wesens, schnell durch das Blut mittels des reti kuloendothelialen Systems (RES) oder von Leberzellen abstrahiert werden, und daher geeignete hepatobiliäre Mittel sind.
Ein Ansatz für die Entwicklung eines Blutpoolmittels, das heißt, eines Mittels, das im vaskkulären Raum für einen auseichenden Zeitraum verbleibt, um den zur Bildgebung zur Verfügung stehenden Zeitraum auszudehnen, ist der gewesen, wasserlösliche Polykomplexmakromoleküle mit Molekulargewichten über dem Nieren-Schwellenwert zu verwenden. Ein anderer Ansatz zur Entwicklung ortsspezifischer Mittel ist der gewesen, Komplexe, zum Beispiel Monokomplexe, Oligokomplexe oder Polykomplexe, an ein ortsgerichtetes Molekül zu koppeln, normalerweise ein Makromolekül. Daher sind beispielsweise Gadoliniumkomplexe an Albumin- und Immunoglobuline gekoppelt worden. Es gibt jedoch mehrere Nachteile bei diesem Ansatz. Eine große Anzahl an komplexierten Metallionen pro Makrostruktur ist erforderlich. Wo eine große Anzahl an Komplexen an ein ortsgerichtetes Molekül gekoppelt ist, kann seine Ortsspezifität verringert sein. Die Kontrolle der Herstellungsverfahren, um reproduzierbare Metalladungsniveaus, homogene Produkte und hohe Zielspezifität zu erhalten, ist schwierig, und solche Verfahren sind kostenintensiv. Die Exkretions- und Stoffwechselwege für solche Mittel sind komplex und nicht allgemein verständlich. Die wissenschaftliche Studie und Dokumentation, die erforderlich ist, um alle potentiellen Metabolite aufzuspüren, die durch die RES-Eliminierung erzeugt werden, würde zu teuer sein. Es ist daher nicht überraschend, daß es bis heute in klinischen Versuchen keine makromolekularen Gadolinium-basierenden Kontrastmittel gibt.
Da injizierte Teilchen schnell von dem RES aufgenommen werden, ist ebenso die Verwendung von liposomalen Kontrastmitteln verbreitet vorgeschlagen worden.
Liposome, der Ausdruck bezieht sich hierin auf Teilchen mit einer oder mehreren eingekapselten Membranen, die durch amphiphile Moleküle gebildet werden (wie zum Beispiel Lipide), und insbesondere auf Teilchen mit einer Doppelschichtmembran und einem eingeschlossenen wässerigen Kern, sind vielseitige Träger für die ortsspezifische Abgabe von therapeutischen und diagnostischen Mitteln. Sie können an selektiv markierten spezifischen Organen, wie der Leber, der Milz, der Lunge, dem Lymphsystem und dem Knochenmark verwendet werden, oder sie können in der Gefäßversorgung verbleiben.
Die Zusammensetzung und die Größe liposomaler Mittel kann so ausgewählt werden, daß deren Bioverteilung kontrolliert werden kann und, da man als Masse der Membran-bildenden Moleküle natürlich vorkommende Phospholipide verwenden kann, kann ihre Metabolisierung und Metaboliteliminierung weitere Probleme aufwerfen, als dies mit makromolekularen Reagenzien der Fall ist.
Liposomale Mittel fallen im allgemeinen in zwei Kategorien: eine erste, worin das Liposom dazu verwendet wird, ein gewünschtes therapeutisches oder diagnostisches Mittel in den zentralen wässerigen Hohlraum einzuschließen; und eine zweite, worin das gewünschte Objekt in der liposomalen Membran gebunden wird, als ein Ergebnis dessen, daß es eine hydrophobe „Anker-„Gruppe, die in die Membran eingeführt wird, beinhaltet. Beide Formen sind in bezug auf Bildgebungsmittel vorgeschlagen worden.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit liposomalen Mitteln, in denen Metallkomplexeinheiten an die liposomale Membran gebunden sind.
Die zuvor vorgeschlagenen Membran-gebundenen Komplexe haben im allgemeinen lineare Komplexbildungsgruppen, wie DTPA, mit ein oder zwei Komplexbildungsfunktionen einbezogen, die so derivatisiert wurden, daß sie an lipophile Ankergruppen haften. Beispiele umfassen das Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (PE): die DTPA-Anhydridkomplexbildner von Karlik et al. (siehe Mag. Res. Med. 19: 56–66 (1991)), die DTPA-Distearylamide von Hnatowich et al. (siehe J. Nucl. Med. 22: 810–814 (1981)), die DTPA-Stearylester von Tilcock et al. (siehe Mag. Res. Med. 27: 44–51 (1992)) und die verschiedenen doppelt lipophile Gruppen-tragenden Komplexbildner von Unger et al. (siehe WO-92/21017).
Neben linearen Komplexbildnern, die doppelt lipophile Ankergruppen tragen, schlug Unger (supra) ebenso die Verwendung von N4 makrocyclischen Komplexbildnern vor, die lipophile Gruppen auf zwei gegenüberliegenden Ringstickstoffen tragen. Der synthetische Weg, der zur Herstellung des doppelt verankerten Komplexes beschrieben wird, führt zu einem Gemisch aus Produkten, nicht dem angegebenen 1,7-Diamid. Ein synthetischer Weg zu dem 1,7-di-substituierten Isomer wäre viel komplizierter. Beispielsweise das von Dumont (Tetrahedron Lett. 35(22), 3707) beschriebene Verfahren. Ferner wird die Komplexbildungseffizienz stark beeinflußt. Da Liposome von dem RES aus dem Körper gereinigt werden, wobei sie der sauren Umgebung in den Leberzellen ausgesetzt werden, sind sehr stabile Komplexe erforderlich, um die Langzeitretention von Gadolinium zu vermeiden. Wir haben herausgefunden, daß die Metalleliminierung durch die Verwendung Membran-gebundener, makrocyclischer Komplexbildungseinheiten mit einer lipophilen Ankergruppe, die nur an einem Ringatom angebracht ist, optimiert wird.
Wir haben daher herausgefunden, daß die Metallverwertung und -eliminierung durch die Verwendung Membran-gebundenen, makrocyclischen Komplexbildungseinheiten mit einer lipophilen Ankergruppe, die nur an einem Ringatom angebracht ist, optimiert wird, wobei der makrocyclische Komplexbildner und die Ankergruppen vorzugsweise mit einander gekoppelt sind, vorteilhafterweise durch eine bioabbaubare Bindung, nach der Liposombildung.
Aus einem Aspekt betrachtet, liefert die Erfindung daher ein liposomales Mittel, umfassend Liposome, die an eine Membran hiervon ein komplexiertes, diagnostisch oder therapeutisch wirksames Metallion gebunden haben, wobei der Komplexbildner, der das Metallion bindet, eine makrocyclische Komplexbildungseinheit aufweist, wobei an ein Einfachringatom hiervon eine lipophile membranassoziierende Einheit angebracht ist.
Als einen weiteren Aspekt liefert die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine liposommembranbildende Verbindung und eine kontrastverstärkende Verbindung, wobei die letztere eine makrocyclische Komplexbildungseinheit aufweist, wobei an ein Einfachringatom hiervon eine lipophile membranassoziierende Einheit angebracht ist, aus der liposomale Zusammensetzungen hergestellt werden können.
Die Erfindung ist insbesondere dahingehend wichtig, daß sie Liposomzusammensetzungen liefert, die die kontrastverstärkende Komponente aus der Leber besser eliminieren. Schließlich werden Liposome von dem RES erkannt, durch Phagozytose in die Zellen aufgenommen und in der Leber abgeschieden. Der Mechanismus, bei dem die Komplexe aus der Leber gereinigt werden, ist nicht allgemein verständlich. Wasserunlösliche, hydrophobe Materialien wie GdDTPA-SA verbleiben unbestimmt in der Leber. Die meisten wasserlöslichen Komplexe haben eine Eliminierungs-Halbwertszeit in der Leber von 6 bis 8 Tagen. Wir haben jedoch herausgefunden, daß die Einbeziehung bestimmter Einheiten in die Struktur der Kontrastmittel die Eliminierung aus der Leber beschleunigt. Zum Beispiel weisen Gadoliniumkomplexe mit einem Phenylring gegenüber einfachen aliphatischen Komplexen verbesserte Eliminierung aus der Leber auf. Eine weitere Verbesserung der Eliminierung kann durch die Gegenwart von einer oder mehreren ionisierbaren Gruppen (wie Carboxylat oder Sulfonat) an einem Phenylring erreicht werden. Die Eliminierungsverbesserungsgruppe kann in die Struktur des Kontrastmittels in Form einer Ankergruppe, einer Verknüpfungsgruppe oder als das bioabbaubare Produkt einer Anker- oder Verknüpfungsgruppe eingeführt werden.
Die makrocyclische Komplexeinheit in der kontrastverstärkenden Verbindung ist bevorzugt hydrophil und ist gegebenenfalls elektrostatisch geladen, wenn sie in situ in den Liposomen vorhanden ist. Als ein Ergebnis wird die Komplexeinheit außerhalb der Lipidschicht oder -schichten der Liposommembran positioniert sein. Während es die Erfindung ermöglicht, daß der Komplex außerhalb der Liposommembran oder innerhalb des wässerigen liposomalen Kernvolumens positioniert wird, wird die Komplexeinheit vorzugsweise, vorwiegend oder im wesentlichen vollständig auf der Außenseite der Liposomen positioniert. Dies ist insbesondere der Fall, wo die komplexierte Spezies als ein positives, T₁-MR-Kontrastmittel fungieren soll.
Aus einem weiteren Aspekt betrachtet, liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines liposomalen Kontrastmittels gemäß der Erfindung, wobei das Verfahren einen der folgenden Schritte umfaßt: (a) Transformieren einer Zusammensetzung, umfassend ein wässeriges Trägermedium, eine liposomale membranbildende Verbindung und eine wahlweise metallierte, makrocyclische Komplexbildungsverbindung, die an einem makrocyclischen Ringatom eine hydrophobe membranassoziierende Gruppe angebracht hat, zu einer liposomalen Zusammensetzung und, falls erforderlich, danach Metallieren der Komplexbildungsverbin dung; und (b) Kuppeln einer wahlweise metallierten, makrocyclischen Komplexbildungsverbindung an eine Ankerverbindung, bei der eine hydrophobe Einheit innerhalb einer liposomalen Membran eines Liposoms eingebracht ist, und, falls erforderlich danach Metallieren der Komplexbildungsverbindung.
Die Liposombildung und die Komplexbildnermetallierung können durch herkömmliche Mittel, wie nachstehend weiter erörtert, herbeigeführt werden, und die Komplexbildner: Anker-Kupplung kann ebenso durch herkömmliche Kupplungsreaktionen unter Verwendung geeigneter funktionalisierter, und, falls gewünscht, aktivierter Komplexbildner- und Ankerverbindungen, gegebenenfalls zusammen mit einem bifunktionellen Verknüpfungsmittel herbeigeführt werden.
Die liposomalen Kontrastmittelzusammensetzungen der Erfindung können in diagnostischen Bildgebungsverfahren verwendet werden, und daher liefert die Erfindung in einem weiteren Aspekt ebenso ein Verfahren zur Erzeugung eines verbesserten Bildes des menschlichen oder nicht menschlichen, bevorzugt des Säugetier-, Körpers, was die parenterale Verabreichung, insbesondere die Verabreichung in die systemische Gefäßversorgung, eines Kontrastmittels an den Körper, und die Erzeugung eines Bildes von zumindest einem Teil des Körpers umfaßt, wobei die Verbesserung die Verabreichung eines erfindungsgemäßen liposomalen Mittels als das erwähnte Mittel umfaßt.
Aus einem noch anderen Aspekt betrachtet liefert die Erfindung ebenso die Verwendung eines makrocyclischen Komplexbildners oder eines Komplexes oder eines Salzes hiervon, zur Herstellung eines liposomalen Kontrastmittels gemäß der Erfindung zur Verwendung bei der diagnostischen Bildgebung.
Da es sehr geläufig ist, daß bioverträgliche Liposome hergestellt werden können, und da in vivo liposomale Kontrastmittel gemäß der Erfindung einfach biologisch die Liposomkomponenten (die Membran- und Kernbildungsspezies) und die Kontrast-verstärkenden Spezies oder die Metabolite hiervon abbauen würden, ist die Gestaltung der liposomalen Mittel mit leicht charakterisierten Metaboliten, deren Bioverteilung und Bioeliminierung ohne weiteres untersucht werden kann, einfacher und geradliniger als die Gestaltung des makromolekularen Mittels.
Der Komplexbildungsmittel in dem liposomalen Mittel der Erfindung ist daher eine bifunktionelle Spezies, die eine Komplexbildungskomponente und eine Membranankerkomponente, die daran mittels einer Bindungs- oder Linkerkomponente angebracht ist, aufweist. Vorteilhafterweise wird die Linkerkomponente eine bioabbaubare Verknüpfung einführen, so daß Komplexmoleküle mit niedrigem Molekulargewicht von den Liposomen, entweder bevor oder nachdem der Liposomabbau stattfindet, freigesetzt werden können, um ihre Bioeliminierung zu erleichtern. Zu diesem Zweck ist es besonders bevorzugt, daß die Komplexkomponente, gegebenenfalls zusammen mit ihrem später abgebauten Rest der Linkereinheit, wasserlöslich ist.
Solche Anker-bioabbaubarer Linker-makrocyclischer Komplexbildungs-Verbindungen, deren Salze und Chelatkomplexe, sind an sich neu und bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Besonders bevorzugt wird die Linkereinheit zumindest teilweise aus der Reaktion zur Kupplung eines makrocyclischen Komplexbildners an ein lipophiles Ankermolekül erwachsen. Daher ist es bevorzugt, daß, während der lipophile Anker-makrocyclische Komplex hergestellt werden kann, bevor die Liposombildung bewirkt wird, solche Verbindungen in situ durch die Kupplung eines makrocyclischen Komplexbildners, oder stärker bevorzugt eines metallierten makrocyclischen Komplexbildners, an ein Molekül hergestellt werden, das bereits in die liposomale Membran eingeführt wurde.
Daher sind eine besonders bevorzugte Klasse von Komplexbildungsmolekülen die der allgemeinen Formel I An-L-Ch(R)_n (I)worin An eine hydrophobe, membranassoziierende Gruppe ist, L eine Linkereinheit ist, angebracht an ein Ringatom von Ch und abtrennbar an einer bioabbaubaren Bindung, und Ch eine makrocyclische Komplexbildungseinheit ist, die wahlweise eine oder mehrere hydrophile oder ortsgerichtete Gruppen R trägt (d. h. n ist 0 oder eine positive ganze Zahl).
In einer alternativen Ausführungsform ist der Komplexbildner eine amphiphile Verbindung, wie in WO 95/28392 beschrieben, d. h., eine Verbindung der Formel II (R)_nCh-L'-Ar-(AH)_q (II)worin (R)_nCh eine hydrophile makrocyclische Komplexbildungseinheit wie oben definiert ist, L' eine wahlweise oxo-substituierte C_2-25-Alkylenlinkereinheit ist, angebracht an ein Ringatom von Ch, und in welcher mindestens eine CH₂-Einheit durch eine Oxa-, Aza- oder Thiagruppe ersetzt ist, und welche wahlweise durch eine bioabbaubare Gruppe M unterbrochen ist, Ar ein Arylring ist, wahlweise substituiert durch oder ankondensiert hieran einen weiteren Arylring, q eine positive ganze Zahl ist, bevorzugt 1 oder 2, und jedes AH eine Protonensäuregruppe ist, zum Beispiel eine Kohlenstoff-, Schwefel- oder Phosphoroxysäure.
Die Komplexbildungseinheit Ch(R)_n ist günstigerweise eine Gruppe der Formel (XN(CHR₁)_m)_p worin p 3, 4, 5 oder 6, bevorzugt 4 ist;
jedes m 2, 3 oder 4, bevorzugt 2 ist;
jedes R₁ ein Wasserstoffatom, eine hydrophile Gruppe oder eine ortsgerichtete Gruppe ist;
und jedes X eine Gruppe R₁ oder eine metallkoordinierende Gruppe ist, wobei jedoch eine kohlenstoff- oder stickstoffgebundene R₁-Gruppe eine Bindung zu der Linkereinheit vorsieht.
Beispiele bevorzugter Koordinationsgruppen umfassen lineare C_1-3-Alkylgruppen, die durch Carboxyl-, Phosphonat- oder Sulfonatgruppen substituiert sind, und gegebenenfalls weiter durch eine oder mehrere R₁-Gruppen substituiert sind. Besonders bevorzugt sind Carboxymethyl- und Phosphonomethylgruppen.
Beispiele bevorzugter hydrophiler Gruppen umfassen hydroxylierte und/oder alkoxylierte Alkylgruppen, z. B. Hydroxymethyl-, 2-Hydroxyethyl-, 3-Hydroxypropyl-, 2,3-Dihydroxypropyl- und 2-Hydroxyethoxyethylgruppen.
In den Komplexbildungs- und Linkereinheiten, auf die sich hierin bezogen wird, soweit nicht anders spezifiziert, enthalten Alkyl- und Alkyleneinheiten vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome.
Daher umfassen bevorzugte Komplexbildungseinheiten Gruppen der Formel
(worin jedes m 2, 3 oder 4, bevorzugt 2 ist;
jeder R₂ Wasserstoff oder eine Alkylgruppe ist, die durch zumindest eine Hydroxy-, Alkoxy-, Amino-, Oxo-, Carboxyl-, Sulphonsäure-, Bromacyl-, Isothiocyanat- oder ortsgerichtete Gruppe substituiert ist, und gegebenenfalls durch einen homo- oder heterocyclischen, gesättigten oder ungesättigten Ring substituiert ist oder diesen beinhaltet; und
jedes Z eine CO₂H-, PO₃H- CON(R₂)₂- oder R₂-Gruppe ist, wobei zumindest 2 und bevorzugt alle 3 COOH- oder PO₃H-Gruppen sind; und
eine R₂-Gruppe eine Bindung zu der Linkereinheit ist).
Besonders bevorzugte Komplexbildungsgruppen umfassen DO3A- und DOTA-Reste, zum Beispiel
(worin jedes Z COOH oder PO₃H, bevorzugt COOH, ist und jeder R₂ Wasserstoff oder eine hydrophile Gruppe ist, zum Beispiel eine C_1-4-Mono- oder -Polyhydroxyallcylgruppe).
Besonders bevorzugt sind die Komplexbildungsreste einfache DO3A-Reste der Formel
und DO3A-Monoamide wie in WO 95/24225 und PCT/GB95/00833 beschrieben.
Die hydrophobe „Anker-"Gruppe, die zur Bindung der Komplexbildungseinheit an die liposomale Membran verwendet wird, kann jede hydrophobe Gruppe sein, die diese Funktion bieten kann.
Im allgemeinen wird sie eine oder mehrere, zum Beispiel 1, 2, 3 oder 4, bevorzugt jedoch 1 oder 2, lipophile Ketten oder mono- oder polycyclische, gesättigte oder ungesättigte Gruppen enthalten, wobei die letzteren gegebenenfalls durch verzweigte oder lineare, gegebenenfalls ungesättigte C_1-12-Alkylgruppen, Fluoratome oder Kohlenstoff-, Schwefel- oder Phosphoroxysäuregruppen oder Ester oder Amide hiervon, zum Beispiel C_1-20-Alkylester oder Alkylamide, worin die Alkylgruppen gegebenenfalls ungesättigt oder fluoriert sind, substituiert sind. Einzelne Kettenankergruppen in den Komplexbildnern der Formel II oben können, wenn sie in situ in dem Liposom vorliegen, gefaltet werden, um die (R)_nCh- und Ar(AH)_q-Gruppen auf der Membranoberfläche darzustellen, wobei der gefaltete Linker L' als der membranassoziierende Anker agiert.
Beispiele geeigneter zcyclischer Gruppen umfassen Phenyl-, Biphenyl-, Naphthyl-, 5-7-gliedrige O-, N- oder S-enthaltende Heteroarylgruppen, Steroidgruppen usw. Beispiele geeigneter hydrophober linearer Gruppen umfassen gesättigte, ungesättigte oder fluorierte, zum Beispiel perfluorierte, C_12-18-Alkylgruppen.
Viele geeignete Ankergruppen sind aus der Literatur bekannt. Siehe zum Beispiel Kinsky in Biochim Biophys Acta 769: 543 (1984), Kung in Biochim Biophys Acta 862: 435 (1986), Gregoriades in Biochem Soc. Trans. 17: 128 (1989), Wessig in Biochim Biophys Acta 1003: 54 (1989), Dancy in J. Immunol 122: 638 (1979), Carroll in J. Med. Chem 29: 1821 (1986), Unger in WO92/21017 und Herslöf in WO92/21384.
Bevorzugte Beispiele für Phospholipide, die als Ankergruppen auf diese Art verwendet werden können, umfassen C_4-14-α,ω-Alkan-dicarbonsäureamide von Phosphatidylethanolaminen (PE), zum Beispiel Dioleoyl, Dipalmitoyl oder andere zwei Fettsäureketten-tragende PEs (wie N-Succinyl-, N-Glutamyl- und N-Dodecenyl-PE) und Amide von Cholesterol.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Ankergruppe an die Komplexeinheit gekuppelt, nachdem die Liposombildung bewirkt worden ist. Zu diesem Zweck werden Ankerverbindungen, die sich in die Liposommembran einfügen, wodurch eine funktionelle Gruppe (für die direkte oder indirekte Komplexanlagerung) auf der Außenseite der verwendeten Membranen hinterlassen wird, verwendet.
Solche Verbindungen umfassen günstigerweise eine Spacereinheit, die am günstigsten amphiphiler Natur ist, zwischen der Ankergruppe und der Komplexanlagerungsgruppe. Beispiele einer solchen Verbindung umfassen Verbindungen der Formeln II bis V unten
Ar'-O-Y-Z₁ (III)
(worin jeder R₃ unabhängig voneinander eine gesättigte, ungesättigte oder perfluorierte C_12-18-Alkylgruppe ist;
w 0 oder 1 ist;
jedes X₁ unabhängig voneinander eine Bindung, ein Sauerstoff- oder ein Schwefelatom oder eine NH-Gruppe ist;
r 0, 1, 2 oder 3 ist;
s 0 oder 1 ist;
X₂ eine Bindung, ein Sauerstoff- oder ein Schwefelatom oder eine NH- oder -OPO₃H-Gruppe ist;
Y eine (CH₂)_t-, (CH₂CH₂O)_t-, (CH₂)_tX₁-Ar'X₁(CH₂)_t- oder (NHCH₂CO)_t-Gruppe ist;
jedes t eine ganze Zahl von 0 bis 12 ist;
jedes Ar' eine Phenyl-, Biphenyl-, Naphthyl- oder 5 bis 7-gliedrige O-, N- oder S-enthaltende Heteroarylgruppe ist, die gegebenenfalls durch COOH-, SO₃H-, PO₃H-, PO₂H- oder COOR₃-Gruppen substituiert ist;
Z₁ eine CO₂H-, NH₂-, COO-Succinimid-, Maleimid-, Thiol-, COCH₂R₄-, Ar'NCS-, Ar'N₃-, Ar'NCO- oder CHO-Gruppe ist; und
R₄ eine OTs-, OMs-, I-, Br- oder Cl-Gruppe ist).
Die Linkergruppe in den Anker:Komplex-Konjugaten kann jede Gruppe sein, die dazu dient, die hydrophobe Ankergruppe (oder Gruppen), die sich in der Liposommembran verbirgt, mit der Komplexgruppe, die sich außerhalb der Membran befindet, zu verbinden. In Abhängigkeit des Herstellungsmodus des Komplex-tragenden Liposoms kann der Linker Gruppen enthalten oder auch nicht, die das Ergebnis einer Ankerverbindung:Komplexverbindung-Konjugation sind; das ist jedoch im allgemeinen der Fall. Dem ähnlich können sie, oder auch nicht, jedoch bevorzugt werden sie, hydrophile oder stärker bevorzugt amphiphile, Abschnitte umfassen, die als räumliche Trennung für die Komplexgruppe von der Membranoberfläche dienen. Überdies wird die Linkergruppe bevorzugt eine bioabbaubare Funktion umfassen, die abtrennbar ist, um Komplexmoleküle freizusetzen (der Ausdruck Molekül, wie hierin verwendet, umfaßt geladene und nicht geladene Spezies), um deren Bioeliminierung oder, möglicherweise im Falle einer Therapie, die Freisetzung eines therapeutischen Metalls an der in Frage kommenden Stelle, zu erleichtern.
Beispiele geeigneter bioabbaubarer Funktionen umfassen Ester-, Carbamat-, Doppelester- und Disulfidbindungen. Doppelesterbindungen, das heißt, Bindungen der Formel -O-CO-O-CH₂-O-CO-O-, aus der einer oder beide endständigen Sauerstoffe weggelassen werden können, und worin die Methylengruppe substituiert sein kann, sind als bioabbaubare Bindungen besonders geeignet.
Daher umfaßt die Linkereinheit günstigerweise eine lineare oder verzweigte C_2-20-Alkylenkette, gegebenenfalls terminiert oder unterbrochen durch N-, O-, S- und P-Atome oder durch homo- oder heterocyclische, gesättigte oder ungesättigte Ringe und gegebenenfalls durch Sauerstoff- oder Fluoratome oder durch Hydroxy-, Amin-, Alkoxy-, Imino, Alkyl- oder Arylgruppen substituiert, wobei die Alkoxy-, Imino-, Alkyl- oder Arylgruppen selbst gegebenenfalls durch Hydroxy-, Amin- oder C_1-5-Alkoxygruppen substituiert sind.
Wo die Linkergruppen an Ringheteroatome der Anker- oder Komplexeinheiten angebracht sind, wird das endständige Atom des Linkers im allgemeinen Kohlenstoff sein. Für DO3A- und DOTA-artige N₄C₁₂-Makrocyclen, findet die Anbringung bevorzugt mittels eines Ringstickstoffes, zum Beispiel mittels des Restes einer N-Carboxymethylgruppe oder einer Ring-NH-Gruppe, statt, obgleich, wenn auch weniger bevorzugt, die Anbringung an einen Ringkohlenstoff zum Beispiel unter Verwendung von C-Aralkyl-substituierten Komplexen wie denen, die von Meares et al. (siehe Bioconjugate Chem. 3: 563 (1992)) für die Anker:Komplex-Kupplungsreaktion vorgeschlagen werden, stattfinden kann.
Das Komplexmolekül für solche Kupplungsreaktionen trägt dann bevorzugt eine reaktive Seitenkette (bevorzugt an einen Ringstickstoff angebracht), die eine reaktive Gruppe trägt wie eine Carboxyl-, Thiol-, NCS- oder Amingruppe. Die Kette, an der diese getragen wird, ist günstigerweise eine C_1-20-Alkylengruppe, die gegebenenfalls durch eine Arylgruppe oder durch N-, O- oder S-Atome substituiert ist, und gegebenenfalls durch Oxo, Alkyl oder Fluor, zum Beispiel ein -CONHCH₂CH₂NH₂-, CONHCH₂CH₂NHCO(CH₂)₃COOH, substituiert ist. Gruppen wie diese können ohne weiteres an einer DOTA- oder DO3A-N-Carboxymethyl- oder -NH-Stelle gebildet werden.
Für Komplexbildner der Formel II oben umfassen Beispiele bevorzugter Linkerstrukturen L' (CH₂)_dO, worin d 1 bis 15 ist, wobei Ar bicyclisch ist, und 6 bis 15, wobei Ar monocyclisch ist, und bevorzugte Ar(AH)_q-Gruppen umfassen 4-Carboxyphenyl und 3,5-Biscarboxyphenyl. Besonders bevorzugte Komplexbildner der Formel II umfassen die folgenden:
Die Auswahl an Metallen, die durch die Komplexbildungseinheit komplexiert werden sollen, wird natürlich von der gewünschten Verwendung der liposomalen Mittel der Erfindung abhängen, wird jedoch im allgemeinen aus paramagnetischem, Schwer- oder radioaktivem Metall allein oder in polyatomaren Clustern erfolgen.
Die liposomalen Mittel werden im allgemeinen, neben Anker:Komplex-Molekülen, liposommembranbildenden Verbindungen, das heißt, Lipiden und insbesondere Phospholipiden, ebenso wie die Materialien, die den Liposomkern und dessen äußere Umgebung ausmachen, im allgemeinen in jedem Fall ein wässeriges Medium umfassen.
Die Liposome an sich sind sphärische Vesikel mit einer Lipidschicht, die einen zentralen Raum umgibt. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere unilammellare und multilamellare Liposome, die jeweils eine einzelne Lipiddoppelschicht oder mehrere Lipiddoppelschichten um einen wässerigen Kern aufweisen.
Liposome bilden sich spontan bei der Dispersion von Lipiden, insbesondere Phospholipiden, in wässerigen Medien, und die liposomale Struktur der Mittel dieser Erfindung kann durch herkömmliche Techniken hergestellt werden. Auf solche herkömmlichen Techniken bezieht man sich in WO 92/21O17 (Unger) und Papahadjopolous in Ann Rep. Med. Chem. 14: 250–260 (1979), und diese umfassen Umkehrverdampfung, Gefrieren-Auftauen, Detergens-Dialyse, Homogenisierung, Ultraschallbehandlung, Mikroemulgierung und spontane Bildung bei Hydratisierung eines trockenen Lipidfilmes. Multilamellare Liposome können gemäß der Erfindung verwendet werden, oder können durch bekannte Verfahren zu Liposomen mit geringerer Lamellarität umgewandelt werden oder zu Unilamellaren Liposomen. Unilamellare Liposome können ebenso direkt hergestellt werden.
Liposompräparate sind normalerweise hinsichtlich der Größe heterogen und die Liposome, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können auf den gewünschten Durchmesser durch bekannte Techniken, zum Beispiel Extrusion, Gefrieren-Auftauen, mechanische Fragmentierung, Homogenisierung und Ultraschallbehandlung klassiert werden. Die Liposome, die gemäß der Erfindung verwendet werden, haben vorteilhafterweise einen Durchmesser von 20 bis 5.000 nm, unilamellar oder multilamellar.
Die Liposome können lyophilisiert werden, um die Lagerfähigkeit zu erhöhen, und lyophilisierte Liposome können durch vorsichtiges Schütteln mit wässerigem Puffer vor der Verwendung rekonstruiert werden. Die Formulierungen können Mittel umfassen, die dazu dienen, das liposomale Material für das Lyophilisierungsverfahren zu stabilisieren.
Liposome, die kleiner als 200 nm sind, können nach der Formulierung durch Filtration durch einen 0,2 μm-Filter sterilisiert werden.
Die Lipide, die als die liposomale membranbildendenden Moleküle verwendet werden, sind normalerweise Phospholipide oder hydrierte Phospholipide wie natürliche oder synthetische Phosphatidylcholine (Lezithine) (PC), Phosphatidylethanolamine (PE), Lysolezithine, Lysophosphatidylethanolamine, Phosphatidylserine (PS), Phosphatidylglycerole (PG), Phosphatidylinositol (PI), Sphingomyeline, Cardiolipin, Phosphatidsäuren (PA), Fettsäuren, Ganglioside, Glucolipide, Glycolipide, Mono-, Di- oder Triglyceride, Ceramide oder Cerebroside, zum Beispiel liposommembranbildende Verbindungen wie sie in WO-92/21017 beschrieben werden.
Die membranbildenden Lipide können ebenso polymerisierbare Lipide umfassen, zum Beispiel Methacrylatlipide, Thiol- und Disulfidlipide, Dienoatlipide, Styryllipide und Diacetylanlipide, wie von Johnston in Liposome Technology Vol. I, Gregoriades Ed., Seiten 123 bis 129 (1983) und Singh in Phospholipid Handbook, Cevc Ed., Dekker, Seiten 233 bis 291 (1993) und den darin enthaltenden Verweisen beschrieben. Die Verwendung von polymerisierbaren Lipiden bei der Bildung der Liposome liefert einen Weg zur Erhöhung der Liposomstabilität.
Die liposomale Membran kann ebenso Steroide und andere Verbindungen, die diese beinhalten, aufweisen, zum Beispiel um die Bioverteilung der Liposome zu beeinflussen. Geeignete Steroide umfassen zum Beispiel Cholesterol, Cholesterolderivate, Cholestan, Cholinsäure und Gallensäuren, insbesondere jedoch Cholesterol.
Der Einschluß von Steroiden dient dazu, die Fluidität der Liposommembran zu modifizieren, und dies beeinflußt die Bioverteilung. Daher führen Lipide mit einer höheren Übergangstemperatur zu längeren Bluthalbwertszeiten und der Einschluß von Cholesterol führt zu einer steiferen und weniger permeablen Doppelschicht. Eine Verringerung der RES-Aufnahme wird bei der Zugabe von Cholesterol beobachtet.
Die Bioverteilungsmodifizierer können durch die Verwendung eines Phospholipidderivats mit einer anhängenden Bioverteilungs-Modifikationsfunktion, durch die Verwendung eines Bioverteilungsmodifikationsmittels mit einer hydrophoben „Anker-"Einheit die mit der liposomalen Membran assoziiert ist, oder durch Kupplung eines Bioverteilungsmodifizierers an ein Ankermolekül (wie oben in Bezug auf die Komplexbindung erörtert), das in der liposomalen Membran vorhanden ist, eingeführt werden.
Besonders bevorzugte Bioverteilungsmodifizierer umfassen Verbindungen, insbesondere amphiphile Polymere, die dazu dienen, die in vivo Proteinbindung an das Liposom zu verringern und daher die Halbwertszeit der Liposome im Blut zu verlängern. Polyalkylenoxypolymere, wie Polethylenglykol (PEG) und Ganglioside, wie Gm₁, sind in diesem Zusammenhang effektiv.
Die Einbeziehung von 1 bis 10%, bezogen auf das Gewicht des liposommembranbildenden Materials, an PEG-PE-Derivaten verlängert daher die Bluthalbwertszeit signifikant.
Liposome, die aus perfluorierten Phospholipiden hergestellt werden (siehe Santaella, FEBS Letters 336: 481–484 (1993) und Angew, Chem. Int. Ed. Eng. 30: 567–568 (1991)) können die Bluthalbwertszeiten ebenso verlängern.
Aktives Targetting für spezifische Organe oder Gewebe kann durch das Einführen von Lipiden mit daran angebrachten monoklonalen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die für tumorassoziierte Antigene, Lectine oder Peptide spezifisch sind, erreicht werden.
Die Liposom-Bioverteilung hängt ebenso signifikant von der Oberflächenladung ab und die erfindungsgemäßen Liposome können wünschenswerterweise 1 bis 10%, bezogen auf das Gewicht des liposommembranbildenden Materials, an negativ geladenen Phospholipiden wie zum Beispiel Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerole, Phosphatidsäuren und Phosphatidylinositol umfassen.
Wie oben erörtert können die komplexierten Metalle auf mehrere Arten an die Liposome gebunden werden, zum Beispiel:

(i) durch Metallieren von Komplexbildungsgruppen, die an die Oberfläche der vorgeformten Liposome gebunden sind;
(ii) durch Kupplung der Komplexeinheiten an Ankermoleküle in den vorgeformten Liposomen;
(iii) durch Bildung von Liposomen unter Verwendung eines Lipidgemisches, das Komplex:Anker-Moleküle umfaßt.

Alle drei Verfahren repräsentieren Aspekte der vorliegenden Erfindung. Diese Verfahren vereinfachen das Verfahren zur Herstellung von membrangebundenen Mitteln, indem sie die Synthese und Reinigung von hydrophoben Komplexen vermeiden (insbesondere in Verfahren (iii)) und indem sie die unerwünschte schwache (leicht umkehrbar in vivo) Bindung von Metall an Liposom, die mit Verfahren (i) in Verbindung steht, vermeiden.
Wie erwähnt werden die Liposome der Erfindung bevorzugt durch die Kupplung metallierter Komplexmolekühle an Ankermoleküle in vorher hergestellten Liposomen hergestellt. Auf diese Weise wird der Komplex nur an das Äußere der Liposommembran gebunden. Liposome, die mit derivatisierten Komplexen gebildet werden, weisen den Komplex sowohl an das Innere als auch an das Äußere der Membran angebracht auf. Die Wasserpermeabilität der Membran oder die Diffusionsgeschwindigkeit der Wasserhauptmenge durch die Membran wird die Relaxivität der inneren paramagnetischen Ionen bestimmen. Mit dichten, stabilen Liposomen kann die Relaxivität von Gadolinium in dem Liposom sehr gering sein. Daher wird mit den Komplexgruppen, die nur an das Äußere des Liposoms gebunden sind, die Effizienz der Verwendung des Metalls optimiert, das heißt, die Liposome haben eine höhere Relaxivität pro Metallion.
Wenn die Komplexe nur an das Äußere der Liposomen gebunden sind, hat dies ebenso einen Vorteil für die Bindung von Radionukliden, insbesondere α-Strahlern, da die Membran des Liposoms von den α-Strahlen nicht penetriert werden muß.
Daher können die Liposome, die durch ein herkömmliches Verfahren aus einem Phospholipidgemisch hergestellt wurden, das die Ankerverbindung, eine Verbindung mit einer hydrophoben Ankereinheit, die an eine reaktive, funktionelle Gruppe gebunden ist, die einen Anbringungspunkt für die Komplexeinheit liefert, umfaßt, hergestellt werden. Die Liposome können dann durch bekannte Verfahren auf den gewünschten Durchmesser klassiert werden. Die reaktive funktionelle Gruppe wird dann an eine kompatible funktionelle Gruppe an dem Komplex gekuppelt, und das nicht umgesetzte Mittel mit niedrigem Molekulargewicht kann ohne weiteres entfernt werden, zum Beispiel durch Gelpermeationschromatographie, Dialyse oder Ultrafiltration.
Die Ankerverbindung umfaßt günstigerweise 5 bis 50%, bezogen auf das Gesamtgewicht, an liposommembranbildenden Verbindungen, bevorzugt 10 bis 30%. Die Kupplungseffizienz des Komplexes, daß heißt, an die nach außen gerichteten reaktiven Gruppen, kann sehr hoch sein, zum Beispiel etwa 90%.
Die reaktiven Gruppen an der Ankerverbindung können einfach primäre Amine an einem Liposommembranlipid sein, die mit einer nicht koordinierenden Carboxylgruppe eines Komplexmoleküls umgesetzt werden können. Im allgemeinen können die meisten bekannten Verfahren zur Kupplung von Komplexen an Makromoleküle, wie Proteine, für die Komplexanbringung an Liposome verwendet werden. Die Oberflächenchemie ist jedoch durch die Liposomstabilität eingeschränkt, und daher wäre die Überwachung des pHs und der Osmolalität des Reaktionsgemisches wünschenswert. Einige Beispiele für Kupplungsstrategien werden nachstehend schematisch dargestellt:
Als eine Alternative zur Kupplung von Komplexen an Ankergruppen in dem Liposom können die Ankergruppen vor der Liposombildung an den Komplex gekuppelt werden. Der Komplexbildner wird in einer wässerigen Lösung metalliert, und dann wird der Komplex an das Ankermolekül durch herkömmliche Verfahren unter Verwendung eines gemischten Lösungsmittels gekuppelt. Das Liposom wird dann unter Verwendung eines Lipidgemisches, das die Komplex:Anker-Moleküle umfaßt, gebildet. Dies vermeidet Schwierigkeiten der nicht spezifischen Bindung von Metallionen an Liposome, die auftreten kann, wenn Komplexe in situ an die Liposomoberfläche metalliert werden, ebenso wie Auflösungsprobleme, die mit der Metallierung wasserunlöslicher Komplexbildung vor der Liposombildung in Verbindung stehen. Die Metallionen dienen ebenso als Schutzgruppen während der Liposombildung für potentiell aktive Komplexbildungsgruppen.
Um die Kontrastmedienzusammensetzungen der Erfindung herzustellen, werden die Liposome in einem physiologisch verträglichen Flüssigträgermedium, zum Beispiel einer wässerigen Lösung, die ein oder mehrere Zusatzstoffe umfassen kann, wie einen pH-Modifizierer, Komplexbildner, Antioxidationsmittel, Tonizitätsmodifizierer, Frostschutzmittel, weitere Kontrastmittel usw., formuliert.
Beispiele geeigneter Inhaltsstoffe, um den pH einzustellen, umfassen, physiologisch verträgliche Säuren, Basen und Puffer, wie Essigsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Salzsäure, Äpfel säure, Phosphorsäure, Schwefelsäure oder Weinsäure, Ammoniak, Ammoniumcarbonat, Diethanolamin, Diisopropanolamin, Kaliumhydroxid, Natriumbicarbonat, Natriumborat, Natriumcarbonat, Natriumhydroxid, Trolamin, Ammoniumphosphat, Borsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Kaliummetaphosphat, einbasiges Kaliumphosphat, Natriumacetat, Natriumbiphosphat, Natriumcitrat, Natriumlactat, Natriumphosphat, Tris- und N-Methylglucamin.
Beispiele geeigneter Komplexbildner umfassen EDTA, DTPA, DTPA-BMA und Salze und Komplexe hiervon, insbesondere Calcium-, Natrium- oder Megluminsalze, zum Beispiel EDTA-Dinatrium, Edetinsäure, Calcium-EDTA.
Beispiele geeigneter Antioxidationsmittel umfassen Ascorbinsäure, Ascorbylpalmitat, Cystein, Monothioglycerol, butyliertes Hydroxyanisol, butyliertes Hydroxytoluen, Hypophosphorsäure, Propylgallat, Natriumbisulfat, Natriumformaldehydsulfoxylat, Natriummetabisulfat, Natriumthiosulfat, Schwefeldioxid oder Tocopherol.
Beispiele geeigneter Tonizitätsmittel umfassen Natriumchlorid, Glucose, Saccharose, Mannitol, Sorbitol und Dextrose. Diese Mittel machen die Formulierung vorzugsweise isotonisch oder nahe isotonisch zu Blut.
Beispiele geeigneter antimikrobieller Mittel umfassen Benzalkoniumchlorid, Benzylalkohol, Chlorbutanol, Metacresol, Methyl-p-hydroxybenzoat, Propyl-p-hydroxybenzoat und Timerosal.
Beispiele geeigneter Frostschutzmittel, Mittel die bei der Lyophilisierung und den Rekonstitutionsverfahren behilflich sind, umfassen Natriumchlorid, Sorbitol, Mannitol, Glucose und Polyethylenglykol.
Der flüssige Träger kann, wie oben erwähnt, ein sekundäres Kontrastmittel enthalten. Dies könnte zu einem zweiten Mittel führen, das in das innere, wässerige Volumen des Liposoms eingeschlossen wird. Mittel in dem äußeren wässerigen Volumen können entfernt werden oder auch nicht. Dies kann zur Herstellung eines dualen Kontrastmediums geschehen [zum Beispiel wie in WO 89/09625 beschrieben]. Beispielsweise könnte ein T2*-Empfindlichkeitsmittel wie ein löslicher Dysprosiumkomplex wie DyDTPA-BMA mit einem T1-Relaxationsmittel, zum Beispiel einem Gadoliniumkomplex wie GdDO3A, der an die Außenseite der Membran angebracht ist, in ein Liposom eingeschlossen werden. Sekundäre Mittel umfassen zum Beispiel wasserlösliche MRI-, Röntgenstrahlen-, szintigraphische und Lichtbildgebungsmittel.
Andere Beispiele weiterer Kontrastmittel, die in die Liposomen eingeschlossen werden können, umfassen Schwermetallcluster und deren Chelatkomplexe, wie zum Beispiel in WO 91/14460 und WO 92/17215 beschrieben. Solche Liposome können zum Beispiel als Röntgenstrahlen-Kontrastmittel, insbesondere (Ct)₂L₃-Cluster (worin Ct ein Metallcluster ist, zum Beispiel W₃- oder W₄-Cluster und L ein Ligand ist), verwendet werden.
Das komplexierte Metall in den liposomalen Kontrastmitteln der Erfindung wird so ausgewählt, das es in dem Bildgebungsanwendungsverfahren der Wahl Kontrast bereitstellt. Für die MRI- und magnetometrische Bildgebung, wird dies im allgemeinen die Komplexierung der die Relaxationszeit (d. h., T₁, T₂ oder T₂*) modifizierenden Zentren einbeziehen, wie paramagnetische Metallionen und polyatomare Clusterionen.
Für die Röntgenstrahlen-Bildgebung und die CT-Bildgebung, werden die komplexierten Metallspezies im allgemeinen Metallionen mit einer hohen Atomzahl sein (und daher einem hohen Röntgenstrahlen-Querschnitt) mit Atomzahlen von 37 oder darüber, oder polyatomare Clusterionen.
Für die Licht-Bildgebung wird die Metallkomplexeinheit ein Chromophor oder Fluorophor mit einem charakteristischen Absorptions- oder Emissionspeak sein. Für SPECT, PET und Szintigraphie wird ein geeigneter Metallionen-Radioemitter komplexiert.
Daher deckt die Erfindung auf dem Gebiet der MRI insbesondere liposomale Kontrastmittel ab, die multiple Komplexe an kontrastverstärkenden Spezies beinhalten, die an die Doppelschicht der liposomalen Membran angebracht sind. Die kontrastverstärkende Spezies kann irgendein magnetisches Metallion, Metallionencluster oder Mikrokristall sein. Diese umfassen insbesondere Ionen und Clusterionen mit den Atomzahlen 21 bis 29, 42, 44 oder 57 bis 71. Positive MRI-Mittel können normalerweise die Metallionen Eu (III), Gd (III), Dy (III), Ho (III), Cr (III), Fe (III) oder Mn (II) umfassen. Negative Kontrastmittel umfassen normalerweise Tb (III)-, Sm (III)- und ganz besonders Dy (III)-Ionen.
Die Anbringung von Radioisotopen an die Liposome ist für die szintigraphische Bildgebung oder als therapeutische Mittel nützlich. Besonders bevorzugt sind die folgenden Radioisotope: ^99mTC, ⁵¹Cr, ²⁰¹Tl, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ¹⁶⁸Yb, ¹⁴⁰La, ⁹⁰Y, ⁸⁸Y, ¹⁵³Sm, ¹⁵⁶Ho, ¹⁶⁵Dy, ⁶⁴Cu, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²⁰³Pb, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹⁴Bi. Die Wahl des Metallions wird basierend auf der gewünschten therapeutischen oder diagnostischen Anwendung getroffen.
Für Röntgenstrahlen werden im allgemeinen nicht-radioaktive Schwermetallionen komplexiert. Diese Erfindung umfaßt die Verwendung von Metallionen mit einer Atomzahl von größer als 37 und insbesondere Metallionen mit Atomzahlen von größer als 50. Besonders bevorzugt sind multinukleare Cluster, wie in WO 91/14460 beschrieben.
Zur Verwendung als Licht-Bildgebungsmittel sollten die Kontrastmittel der Erfindung vorzugsweise eine Extinktions- oder Fluoreszenzeinheit mit einer Extinktion oder Emission im nahen IR (670 bis 1.300 nm), bevorzugt rot-verschoben in Richtung 1300 nm, umfassen. Der Extinktionskoeffizient sollte so groß wie möglich sein, bevorzugt größer als oder gleich 10⁵ cm^–1 M^–1.
Damit die liposomalen Kontrastmittel der Erfindung echogen sein können, das heißt, fähig, als Ultraschallkontrastmittel zu agieren, haben sie vorzugsweise eine di- oder oligolamellar e Struktur mit einer Trennung zwischen den Lamellen. Lipide, die eine Bindung mit einer ionisierbaren Gruppe enthalten (wie Carboxylat) sollten eine relativ große Distanz zwischen den konzentrischen Phospholipid-Doppelschichten aufweisen. Dies sollte die akustische Reflexion der Liposome erhöhen. Diese Erfindung umfaßt zu diesem Zweck die Einführung von Derivaten von Lipiden.
Alternativ könnten perfluorierte Lipide als Komponenten der Liposome verwendet werden. Sowie die Erhöhung der Blutresonanzzeit der Liposome, kann die Verwendung perfluorierter Lipide die akustischen Eigenschaften der Liposome erhöhen.
Wie oben erörtert können mögliche hydrophobe Anker, das heißt die membranassoziierende Einheit in den kontrastverstärkenden Spezies, Phospholipide, lange Alkylketten oder Moleküle, die mehrere lange Alkylketten enthalten, einschließlich Ester und Amide von Fettsäuren, Steroid, aromatische und polyaromatische Gruppen umfassen. Die Ankergruppe kann so gestaltet sein, daß sie die Eliminierung der kontrastverstärkenden Einheit erhöht (zum Beispiel des Chelatkomplexes), wenn sie sich erst einmal in der Leber abgesetzt hat. Die Eliminierung kann durch den Ausgleich des hydrophoben und hydrophilen Wesens des ganzen Moleküls, zum Beispiel durch Einbeziehung potentiell ionisierbarer Gruppen wie Carbon-, Phosphon- oder Sulfonsäuren, in der kontrastverstärkenden Komponente kontrolliert werden. Auf diese Weise könnte es möglich sein, die Struktur biologisch relevanter Verbindungen, die von der Leber schnell ausgeschieden werden, zu imitieren. Alternativ könnte der hydrophobe Anker eine polymerisierbare Gruppe enthalten, was die Bildung eines stabileren Liposoms durch Polymerisation des hydrophoben Ankers mit dem Hauptlipid des Vesikels ermöglicht.
Die Verknüpfung zwischen der kontrastverstärkenden Einheit und der membranassoziierenden Einheit in der kontrastverstärkenden Spezies kann relativ inert zu biologischer Abbaubarkeit sein (wie eine Alkyl-, Aryl- oder Ethergruppe) oder kann hydrolysierbar sein, zum Beispiel einschließlich einer Carbonsäure- oder Kohlensäureester-, Disulfid-, Acetal-, Ketal-, Thioester-, Carbamat-, Amid-, Lactam-, Thio-Harnstoff- oder einer Harnstoffgruppe. Die Linkereinheit kann einen Spacer umfassen, der als eine Bindung dient, wie eine gesättigte und ungesättigte Alkylkette und/oder Ringstrukturen, wie alicyclische, aromatische, polyaromatische und heterocyclische Gruppen. Die Länge und die Flexibilität des Spacers kann geändert werden, um die Kupplungseffizienz und die Relaxivität des Mittels zu optimieren. Der Linker kann hydrophob sein, so daß er in der Lipiddoppelschicht untergebracht ist, oder hydrophil, so daß er sich in die wässerigen Medien ausdehnt. Die Linkergruppe kann daher bei der Kontrolle der Stoffwechsel- und Eliminierungswege der kontrastverstärkenden Einheit eine wichtige Rolle spielen.
Die Zusammensetzung und die Größe des Liposoms kann so ausgewählt werden, daß die Bioverteilung des Mittels kontrolliert wird. Beispielsweise können Liposome mit positiver oder negativer Oberflächenladung durch die Einführung von Lipiden mit geladenen polaren Kopfgruppen hergestellt werden. Bei intravenöser Verabreichung beeinflußt die Oberflächenladung die Bioverteilung der Mittel [siehe Paphadjopolous, in Biochim. Biophys. Acta. 1103: 185–197 (1992)]-negativ geladene Liposome werden durch das RES schneller aufgenommen als neutrale oder positiv geladene Liposome, während sich positiv und negativ geladene Liposome in den Lungen zu einem größeren Ausmaß als neutrale Liposome ansammeln.
Außerdem beeinflußt der Durchmesser der Liposome deren Bioverteilung und deren Pharmakokinetiken. Kleine Liposome haben längere Zirkulationszeiten als größere Liposome. Die Kupffersche-Zellaufnahme ist bei größeren Liposomen schneller, wohingegen Hepatozyten kleine Liposome mit einer schnelleren Geschwindigkeit aufnehmen. Sehr große Liposome (> 100 μm) werden nach der Injektion in den Lungen aufgefangen.
Die Hydrophilie der Lipidmembran beeinflußt ebenso die Zirkulationszeit von Liposomen. Die Konjugation hydrophiler oder amphiphilier Polymere wie Polyethylenglykol an die Membranoberfläche, erhöht die Zirkulationszeit bis zu 8000% durch die Verringerung der Geschwindigkeit der Phagozytose durch Makrophagen.
Das aktive Targeting von Liposomen kann durch die Anbringung von Liganden, Carbohydraten, Antigenen, Proteinen, Aminosäuren, Oligopeptiden, Enzymen, Hormonen, Antikörpern und Antikörperfragmenten an die äußere Oberfläche der Liposome bewirkt werden. Bei der Wiedererkennung einer Rezeptorstelle binden die Liposome an die Zielzellen [siehe Jones, Adv. Drug Deliv. 13: 215–250 (1994), US-A 4,603,044, J. Med. Chem., 29: 1821–1826 (1986), Ann. N. Y. Acad. Sci., 698: 427–43 (1993), Liposomes Technology, Gregoriadis, ed. Bd. II, (1983), und die Verweise darin]. Diese Erfindung sorgt ebenso für die Anbringung von mehrfach ortsgerichteten Targetingmitteln an die äußere Oberfläche des Liposoms, insbesondere bezogen auf Komponenten mit relativ geringem Molekulargewicht wie Peptid- oder Antikörperfragmente.
Die Kontrastmittel der Erfindung können den Patienten zur Bildgebung in Mengen verabreicht werden, die ausreichen, um den gewünschten Kontrast mit der bestimmten Bildgebungstechnik zur erzielen. Übliche Dosierungen von 0,001 bis 5,0 mmol an komplexiertem Bildgebungs-Metallion pro Kilogramm an Körpergewicht des Patienten sind wirksam, um adäquate Kontrastverbesserungen zu erhalten. Für die meisten MRI-Anwendungen werden bevorzugte Dosierungen an Bildgebungs-Metallion im Bereich von 0,001 bis 1,2, zum Bei spiel 0,01 bis 0,5, mmol/kg Körpergewicht liegen, wohingegen die Dosierungen für die Röntgenstrahlen-Anwendungen zwischen 0,5 und 1,5 mmol/kg im allgemeinen effektiv sind, um Röntgenstrahlenschwächung zu erreichen. Bevorzugte Dosierungen für die meisten Röntgenstrahlen-Anwendungen liegen zwischen 0,8 und 1,2 mmol des Lanthanoids oder Schwermetalls/kg Körpergewicht.
Bei Röntgenstrahlen-Anwendungen können zur Erweiterung des Photonenenergiebereiches, über den die Kontrastmittel der Erfindung optimalerweise wirksam sind, zwei oder mehr komplexierte Metalle als Gemische aus Homopolykomplexen oder als ein Heteropolykomplex verwendet werden.
Die liposomalen Mittel der Erfindung liefern gegenüber dem Stand der Technik mehrere Verbesserungen.
Die Metallaustauschgeschwindigkeit ist für die Blutpool-Bildgebung sehr wichtig, wo die Blutverweilzeiten viel länger sind als für ECF-Mittel, und für die Leber-Bildgebung, wo der Komplex intrazellulär aufgenommen wird und der sauren Umgebung der Lysosome ausgesetzt wird. Die erfindungsgemäße Verwendung von makrocyclischen Komplexbildungsgruppen ist aufgrund der erhöhten Komplexstabilität wichtig. Überdies können die Komplexeinheiten, DO3A-Gd(III), neutral oder mit ausgewählter Ladung sein, und dies kann bei der Kontrolle der Bioverteilung ein Vorteil sein, da die Oberflächenladung des Liposoms sein Schicksal in vivo bestimmt.
Mit der Anbringung vormetallierter Komplexe an vorgeformte Liposome gemäß der bevorzugten Herstellungsweise der Liposome der Erfindung, kann nicht gebundener Komplexe leichter aus dem Liposom entfernt und recycelt werden, und da das Metallion bereits an den Komplex gebunden ist, verhindert dies eine nicht spezifische Bindung von Metallionen an das Liposom oder konjugierte Targetingmittel.
Das Kontrastmittel der Erfindung ermöglicht insbesondere eine effektive Eliminierung des komplexierten Metalls. Die Technik hat dieses Erfordernis bisher nicht zufriedengestellt. Die Eliminierung radioaktiver Komplexe in Mäusen für eingekapselte und membrangebundene Mittel wurde studiert. Beispiel 13 hieraus zeigt eine bessere Eliminierungs-Halbwertszeit als ein eingekapselter GdD03A-Komplex (3,2 gg. 6 Tage).
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist, daß die Verwendung einer bioabbaubaren Verknüpfung zu einem zeitlichen Freisetzungsmechanismus der komplexierten Spezies führt. Dies ist insbesondere für therapeutische Mittel nützlich, zum Beispiel Mittel, bei denen das komplexierte Metall eine therapeutische Funktion hat. Solche therapeutischen, eher als diagnostische oder Kontrastmittel, bilden ebenso einen Teil der Erfindung.
Alle Veröffentlichungen, auf die sich hierin bezogen wird, sind hiermit durch Verweis aufgenommen.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden nicht einschränkenden Beispiele ausführlicher beschrieben:
In den Beispielen wurden Gadoliniumkonzentrationen durch die Digestion liposomaler Proben, gefolgt von der Analyse durch ICP, bestimmt. Die Lipidkonzentrationen wurden durch die Digestion der Probe, gefolgt von der spektrophotometrischen Bestimmung der Phosphatkonzentration unter Verwendung von Molybdat bestimmt. Die Liposome wurden unter Verwendung eines Lipex-Extruders mit zwei Schichten aus den geeigneten Poretics-Polycarbonatmembranen extrudiert. Die Größenverteilung der Liposome wurde durch Laser-Lichtstreuung unter Verwendung eines Malvern Zetasizer 4 bestimmt.
Die verwendeten Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids erhalten. Sie wurden in einem Kühler unter Argon gelagert. Cholesterol wurde von Aldrich und Cholsterolhemisuccinat von Sigma erhalten. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDAC) wurde von Aldrich erhalten und in einem Kühler gelagert. Dipalmityl-PE-Glutaryl wurde durch das Verfahren von Torchilin hergestellt [siehe Phospholipid Handbook, Marcel Dekker, Inc., G. Cevc, ed., Kapitel 8], 6-(Cholesteryl)-7-oxaheptan-1-ol wurde durch das Verfahren von Carroll hergestellt [siehe J. Med. Chem., 29, 1821, 1986], und Cholesterol-Otosylat wurde durch das Verfahren von Koswer hergestellt [siehe JACS, 78, 4347–4355 (1956)].
Beispiel 1
1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonylmethyl-10-methoxycarbonyl-methyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclo-dodecanhydrobromid (25,0 g, 42 mmol) wurde in Acetonitril aufgeschlämmt und mit TMG (70 ml) behandelt. Methylbromacetat (6,5 g, 42 mmol) wurde in einem Teil zugegeben und das Gemisch wurde 3 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Rühren bei Umgebungstemperatur für weitere 18 Stunden wurde das Lösungsmittel und der Überschuß TMG durch Rotationsverdampfung entfernt. Der Rest wurde in CHCl₃ gelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab das Titelprodukt als ein blasses Öl (23 g, 95%).
¹H-NMR (CDCl₃) 1,4 (s, 27H), 2,8 (s, 16H), 3,2 (s, 6H), 3,4 (s, 2H), 3,6 (s, 3H).
Beispiel 2
1,4,7-Tri-tertbutoxycarbonyl-10-(N-(2-aminoethyl)-amido-methyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan
Der Methylester aus Beispiel 1 (23,0 g, 40 mmol) wurde in Methanol (500 ml) gelöst und mit Ethylendiamin (200 ml) behandelt. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur für drei Tage gerührt. Das Lösungsmittel und der Überschuß Ethylendiamin wurden durch Rotationsverdampfung entfernt und der Rest wurde in Chloroform gelöst, mit Wasser gewaschen und getrocknet (Na₂SO₄). Das Lösungsmittel wurde verdampft, wodurch das Titelprodukt als ein viskoses Öl erhalten wurde (18 g, 75%). 1H-NMR (CDCl₃) δ 1,4 (s, 27H), 2,5–3,0 (m, 20H), 3,3 (m, 8H), 6,0 (br s, 1H).
Beispiel 3
1,4,7-Tri(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan [AE-DO3A]
Der Ester aus Beispiel 2 (10,0 g, 16 mmol) wurde durch die Umsetzung mit reinem TFA (200 ml) bei Umgebungstemperatur für 3 Stunden entschützt. Nach der Entfernung des TFA wurde der Rückstand in 1 M NaOH gelöst und in eine Ionenaustauschsäule geladen [AG 1 × 8 (OH-), 200 ml]. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und das Produkt wurde mit 1,5 M HOAc eluiert. Die Konzentration der Fraktionen, die das Titelprodukt enthalten, ergaben 7,0 g (93%) als einen weißen Feststoff. ¹H-NMR (D₂O) δ 2,9–3,6 (br mult.) Anal. Berechnet für C₁₈H₃₄N₆O₇HOAc: C, 47,14; H, 8,11; N, 16,49. Gefunden: C, 47,40; H, 7,98; N, 16,48.
Beispiel 4
1,4,7-Tri(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan Gadolinium (III) [GdAE-DO3A]
Die Verbindung aus Beispiel 3 (1,0 g, 2,38 mmol) wurde in Wasser gelöst (37 ml). Der pH wurde durch die Zugabe von 1 M NaOH auf 5 eingestellt. Gadolinium(III)acetat wurde in kleinen Anteilen zugegeben, bis ein leichter Überschuß an Metall vorhanden war (durch Xylenol-orange). Während der Zugabe wurde der pH bei 5 bis 6 gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Ligand (50 mg) wurde zugegeben und das Rühren wurde fortgesetzt, bis ein negativer Xylenol-Orange-Test erhalten wurde. Das Wasser wurde unter Vakuum entfernt. Der Rest wurde auf Sephadex G-10 chromatographiert, um anorganische Salze zu entfernen. Die Fraktionen wurden durch MS (FAB): MH+ = 602 analysiert.
Beispiel 5
1,4,7-Tri(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N-hemisuccinamid
Die Verbindung aus Beispiel 3 (6,1 g, 13,6 mmol) in Pyridin (20 ml) wurde bis zur vollständigen Auflösung erhitzt. Bernsteinsäureanhydrid (1,5 g, 15 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde eine Stunden erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt und es wurde Aceton zugegeben, um das Produkt auszufällen. Der weiße Feststoff wurde kräftig mit Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet, um 5,0 g des Titelproduktes (67%) zu erhalten.
Beispiel 6
1,4,7-Tri(carboxymethyl)-10-(N-(2-aminoethyl)amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-N-hemisuccinamid Gadolinium (III)

(A) Die Verbindung aus Beispiel 5 (1,9 g, 3 mmol) wurde in Wasser gelöst (30 ml). Der pH wurde mit 1 N NaOH auf 5,0 eingestellt. Gadolinium(III)chlorid (~1,4/10 ml) in Wasser wurde tropfenweise zugegeben, bis ein leichter Überschuß an Metall für mehrere Stunden verblieb. Zusätzliches Gadolinium (50 mg) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde gerührt, bis ein negativer Xylenol-Orange-Test erhalten wurde. Das Wasser wurde verdampft und der Rest wurde mehrere Male mit Ethanol aufgenommen. Das Titelprodukt wurde durch präparative Umkehrphasen-(C₁₈)-HPLC mit 2% Methanol in Wasser als die mobile Phase gereinigt.
(B) Die Titelverbindung wurde ebenso durch ein alternatives Verfahren hergestellt: Die Verbindung aus Beispiel 3 (240 mg, 0,4 mmol) in DMSO (10 ml) wurde bei 80°C bis zur vollständigen Auflösung erhitzt. Bernsteinsäureanhydrid (40 mg, 0,4 mmol) wurde zugegeben und das Gemisch wurde für 6 Stunden erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Umgebungstemperatur wurde Aceton zugegeben, um das Titelprodukt auszufällen. Das weiße Pulver wurde mit Aceton gewaschen und unter Vakuum getrocknet. MS (FAB): M H⁺ 683,2, M Na⁺ 705,1.

Beispiel 7
13-Cholesteryl-3,6,9,12-tetraoxa-dodecan-1-ol
Cholesteroltosylat (2,0 g, 3,7 mmol) und Tetraethylenglykol (6,42 ml, 37 mmol) wurde in Dioxan (100 ml) gelöst und bei 70°C für 6 Stunden erhitzt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rest wurde in Toluen gelöst und kräftig mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄) und zu einem Öl konzentriert. Das Rohmaterial wurde durch Chromatographie auf einer kurzen Säule aus Siliciumdioxid mit einer Gradientenelution von 0 bis 20% Methanol in Chloroform gereinigt, wodurch 1,0 g (49%) des Titelproduktes als ein blasses Öl erhalten wurden.
Beispiel 8
13-Cholesteryl-3,6,9,12-tetraoxa-dodecan-1-onsäure
Die Verbindung aus Beispiel 7 (0,5 g) in Aceton (20 ml) wurde durch die tropfenweise Zugabe des Jones-Reagens oxidiert, bis ein leichter Überschuß vorhanden war. Das Reaktionsgemisch wurde mit Isopropanol behandelt und wurde durch einen Stopfen aus Kieselgel filtriert. Das rohe Titelprodukt war rein, wie durch TLC und NMR bestätigt.
Beispiel 9
GdDO3A-Stearylamid
Die Verbindung aus Beispiel 3 (100 mg, 1,6 mmol) wurde in DMSO (10 ml) gelöst und wurde mit Stearoylchlorid (51 mg, 1,6 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 60°C für 2 Stunden erhitzt und über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt. Wasser wurde zugegeben (50 ml) und das Produkt wurde in Chloroform extrahiert (3 × 100 ml). Die Extrakte wurden getrocknet und konzentriert, um das Titelprodukt als einen weißen Feststoff zu erhalten. MS (FAB) 868,5 MH⁺.
Beispiel 10
GdAE-D03A-Cholesterolcarbamat
Die Verbindung aus Beispiel 3 (300 mg, 0,8 mmol) wurde in DMSO (20 ml) gelöst und mit Cholesterolchlorformiat (225 mg, 0,5 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 80°C für 5 Stunden erhitzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur stehengelassen, bis sich farblose Kristalle absetzten. MS (FAB): MH⁺ 1014,5, MNa⁺ 1036,5.
Beispiel 11
LaD03A-Succinyl-PE
LaD03A-Succinamid (130 mg, 0,2 mmol) wurde in DMSO (3 ml) gelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (39 mg, 0,2 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von N-Hydroxysuccinimid (22 mg, 0,2 mmol). Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur für eine Stunde gerührt, und PE (130 mg, 0,2 mmol) in Chloroform (20 ml) wurde zugegeben. Nach 6 Stunden wurde das Reaktionsgemisch filtriert, mit Wasser gewaschen, getrocknet und verdampft, wodurch das Titelprodukt erhalten wurde. TLC (65 CHCl₃/25 MeOH/4 H₂O/l Ameisensäure) R_f = 0,2. MS (FAB): MH⁺ 1400,7, MNa⁺ 1422,7.
Beispiel 12
GdAE-D03A-Glutaryl-PE
Ei-PE-Glutaryl (100 mg, 0,11 mmol) in Chloroform (5 ml) wurde mit N-Hydroxysuccinimid (25 mg, 0,21 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (50 mg, 20,25 mmol) behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Umgebungstemperatur über Nacht gerührt und filtriert, um den Harnstoff zu entfernen. Die Verbindung aus Beispiel 4 (100 mg, 0,16 mmol) in Methanol (1 ml) und 1 ml Triethylamin wurden zugegeben. Die Reaktion wurde bei Umgebungstemperatur 6 Stunden gerührt und zur Trockne verdampft. Der Rest wurde in Chloroform (10 ml) gelöst und in einen Dialyseschlauch eingebracht. Die Reaktion wurde gegen Natriumacetatpuffer (1 l, 50 mM, pH 5,5, 12 Stunden), Tris-Puffer (1 l, pH 8, 50 mM, 5 Stunden) und deionisiertes Wasser (1 l, 5 Stunden) dialysiert. Eine kleine Menge an Niederschlag, der sich in der Chloroformschicht gebildet hatte, wurde durch die Zugabe von Methanol gelöst. Die Lösung wurde getrocknet (Na₂SO₄) und verdampft, wodurch das Titelprodukt als ein weißer, wachsartiger Feststoff erhalten wurde (150 mg, 89%). TLC (65 CHCl₃/25 MeOH/4 H₂O/l Ameisensäure) R_f = 0,2. MS (FAB): MNa⁺ 1459.
Beispiel 13
Ein Gemisch aus Ei-PC (52 μmol) und Ei-PE-Glutaryl (48 μmol) in Chloroform wurde zu einem dünnen Film unter Vakuum verdampft. Das Lipidgemisch wurde in Diethylether (3 ml) gelöst und mit 23 ml Puffer (25 mM MES, 100 mM NaCl) behandelt. Eine Emulsion wurde durch die Ultraschallbehandlung des Gemisches gebildet. Der Ether wurde verdampft, um ein Gel zu bilden. Das Gel wurde durch Verwirbeln und Verdampfen des restlichen Lösungsmittels kollabiert. Zusätzliche 1 ml Puffer wurden zugegeben und das Verdampfen wurde fortgesetzt, bis alle Spuren des Lösungsmittels entfernt waren. Die Liposome wurden mit GdAE-D03A (140 mg) und EDAC (130 mg) über Nacht bei Umgebungstemperatur unter schnellem Rühren behandelt. Nicht umgesetzte Reagenzien wurden durch das Führen des Produktes durch eine Sephadex G-75-Säule (1 × 8 in) entfernt. Die Liposome wurden dreimal durch zwei 100 nm-Membranen extrudiert. Die Analyse des endgültigen Gemisches ergab [Gd] = 1,14 mM, [P] = 5,04 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis wurden 47,1% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 18 ± 2 (mMs)^–1.
Beispiel 14
Es wurde dasselbe Verfahren, wie für die Synthese aus Beispiel 13 verwendet. Ei-PC (20 μmol) und Dioleoyl-PE-Succinyl (17 μmol). Die Analyse des endgültigen Gemisches ergab [Gd] = 0,56 mM, [P] = 3,8 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis wurden 30% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 18 ± 2 (mMs)^–1.
Beispiel 15
Es wurde dasselbe Verfahren, wie für die Synthese aus Beispiel 13 verwendet. Ei-PC (10 μmol) und Dioleoyl-PE-Dodecanoyl (8 μmol). Die Liposome wurden extrudiert (3 × 200 nm, 3 × 50 nm). Die Analyse des endgültigen Gemisches ergab [Gd] = 0,66 mM, [P] = 3,49 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis wurden 43% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 17 ± 2 (mMs)^–1.
Beispiel 16
Es wurde dasselbe Verfahren, wie für die Synthese aus Beispiel 13 für ein Gemisch aus Ei-PC (56 μmol) und Ei-PE (53 μmol) verwendet. Die Liposome wurden mit EDAC (100 mg) und GdAE-D03A-Succinamid (80 mg) über Nacht bei Umgebungstemperatur unter schnellem Rühren behandelt. Nach der Entfernung des nicht umgesetzten Reagenz wurden die Liposome extrudiert (3 × 200 nm, 3 × 50 nm). Die Analyse des endgültigen Gemisches ergab [Gd] = 0,39 mM, [P] = 5,87 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis wurden 14% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 27 ± 2 (mMs)^–1.
Beispiel 17
Es wurden Liposome aus Ei-PC (13 μmol) und Cholesterolhemisuccinat (16 μmol) durch dasselbe Verfahren wie zur Herstellung von Beispiel 13 hergestellt. Die Liposome wurden mit EDAC (25 mg) und GdAE-D03A (25 mg) behandelt. Nach der Entfernung der nicht umgesetzten Reagenzien wurden die Liposome extrudiert (3 × 200 nm und 3 × 50 nm). Die Analyse des endgültigen Gemisches ergab [Gd] = 0,26 mM, [P] = 2,93 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis wurden 7,2% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 21 ± 2 (mMs)^–1.
Beispiel 18
Es wurden Liposome aus Ei-PC (80 μmol) und 6-(Cholesteryl)-7-oxaheptan-1-ol(80 μmol) durch das in Beispiel 13 beschriebene Verfahren hergestellt. Die Liposome wurden mit EDAC (70 mg) und GdAE-D03A (40 mg) behandelt. Nach der Entfernung der nicht umgesetzten Reagenzien wurden die Liposome extrudiert (3 × 200 nm und 3 × 50 nm). Die Analyse des endgültigen Gemisches ergab [Gd] = 0,39 mM, [P] = 3,34 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis wurden 11% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 19 ± 2 (mMs)^–1.
Beispiel 19
Es wurden Liposome aus Ei-PC (68 μmol), Ei-PE-Glutaryl (55 μmol) und Hirn-PS (6 μmol) durch das in Beispiel 13 beschriebene Verfahren hergestellt. Die Liposome wurden mit GdAE-D03A (40 mg) und EDAC (75 mg) behandelt. Nach der Entfernung der nicht umgesetzten Reagenzien wurden die Liposome extrudiert (3 × 200 nm und 3 × 50 nm). Die Analyse des endgültigen Gemisches ergab [Gd] = 0,51 mM, [P] = 4,15 mM. Basierend auf dem P/Gd-Verhältnis wurden 29% des PE-Glutaryls derivatisiert. Relaxivität (Wasser, 20 MHz) r₁ = 18 ± 2 (mMs)^–1.
Beispiel 20
Die Liposome wurden durch das Verfahren für die Synthese aus Beispiel 13 aus Cholesterolhemisebacat (130 μmol) und Ei-PC (130 mmol) hergestellt. Die Liposome wurden mit GdAE-D03A (120 mg) und EDAC (120 mg) behandelt. Die nicht umgesetzten Reagenzien wurden durch Gelchromatographie entfernt und die Liposome wurden extrudiert.
Beispiel 21
Die Verbindung aus Beispiel 10 (71 mg, 6 μmol) wurde zu Dioleolyl-PC (15 mg, 20 μmol) in Chloroform zugegeben. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in Ether (1 ml) gelöst. Wasser (1 ml) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde ultraschallbehandelt, bis sich eine Emulsion bildete. Der Ether wurde langsam unter Vakuum verdampft. Es bildete sich ein dickes Gel. Zusätzliches Wasser (1 ml) wurde zugegeben und das Gel wurde verwirbelt, bis das Gel kollabierte, wodurch Vesikel gebildet wurden. Das Produkt wurde extrudiert (3 × 200 nm, 3 × 50 nm).
Beispiel 22
Die Verbindung aus Beispiel 12 (25 mg, 17,4 μmol) und Ei-PC (13,7 mg, 18 μmol) wurden in Chloroform (3 ml) gelöst. Die Lösung wurde zur Trockne unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in Ether (3 ml) gelöst und filtriert. MES-Puffer (3 ml) wurde zugegeben und das Gemisch wurde ultraschallbehandelt, bis sich eine Emulsion bildete. Der Ether wurde durch Verdampfung unter Vakuum unter gelegentlichem Verwirbeln verdampft.
Beispiel 23
Die Verbindung aus Beispiel 9 (50 μmol) und hydriertes Ei-PC (150 μmol) wurden in einem Gemisch aus Chloroform (10 ml) und Methanol (2 ml) gelöst. Das Lösungsmittel wurde bei 75°C verdampft. Der restliche dünne Film wird in MES-Puffer bei 75°C durch Schütteln hydratisiert. Nach viermaligem Gefrieren-Auftauen werden die Liposome bei 75°C extrudiert (3 × 100 nm).
Beispiel 24
Pharmkokinetiken
Ein Katheter wurde in die Drosselvene einer Ratte ein paar Tage vor der Studie eingeführt. Eine 300 μl-Blutprobe wurde gezogen und in einer abgewogenen Röhre, die Heparin enthält, plaziert, bevor sie in die Probe injiziert wurde. Die Testverbindung wurde bei einer Zeit null injiziert. Blutproben (300 μl) wurden bei Intervallen über einen Zeitraum von 24 Stunden genommen. Bei 7 Tagen wurde das Tier getötet und die Leber, die Milz und die Nieren wur den entfernt. Die Blut- und Organproben wurden mit Salpetersäure und Wasserstoffperoxid digeriert und hinsichtlich der Gadoliniumkonzentration (μg/g) durch ICP analysiert.
Beispiel 25
Bioverteilung
(2-Aminoethyl)-D03A wurde mit ¹⁵³Gd markiert. Der Komplex wurde an 1 : 1-Ei-PC/Ei-Glutarylliposome (100 nm) wie in Beispiel 13 gekuppelt. Die radioaktiv markierten Liposome wurden in die Schwanzvenen von Mäusen injiziert. Drei Mäuse wurden für jeden Zeitpunkt verwendet. Es wurden Proben von Blut, Leber, Milz, Nieren und Haut am 1. Tag, 3. Tag und 7. Tag gezählt. Die prozentuale injizierte Dosis, die in jedem Organ verblieb, wurde berechnet und wird unten angegeben. Die Eliminierungshalbwertszeit für die Leber betrug 3,2 Tage.
Beispiel 26
Synthese von GdDOTA-DOBA
(i) Synthese von Methyl-p(10-bromdecyloxy)benzoat
Ein Gemisch aus 1,10-Dibromdecan (18,01 g, 60 mmol), Methyl-p-hydroxybenzoat (9,12 g, 60 mmol) und K₂CO₃ (8,28 g, 60 mmol) in Aceton (90 ml) wurde bei Rückfluß für 20 Stunden gerührt. Der weiße Feststoff wurde abfiltriert und mit Aceton gewaschen. Das Filtrat und die Wäschen wurden vereinigt und zu einem weißen Feststoff konzentriert, aus dem das gewünschte Produkt durch Säulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan/Chloroform-Lösungsmittelgradient für die Elution isoliert wurde (10,8 g, 48,4%). ¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7,95 (d), 6,88 (d), 3,98 (t), 3,85 (s), 3,39 (t), 1,80 (m), 1,52 (m), 1,42 (m) und 1,29 (m). FABMS: 371 (MH⁺).
(ii) Synthese von Methyl-p-(10-N-phthalimidodecyloxy)-benzoat
Ein Gemisch aus Methyl-p-(10-bromdecyloxy)benzoat (10,44 g, 28,12 mmol) und Kaliumphthalimid (5,47 g, 29,53 mmol) in wasserfreiem DMF (175 ml) wurde bei 60°C 14 Stunden unter Stickstoff gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in CHCl₃ gelöst und mit Wasser gewaschen (4 × 15 ml). Die wässerigen Wäschen wurden vereinigt und einmal mit CHCl₃ (100 ml) zurück extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit MgSO₄ getrocknet und die Lösung wurde konzentriert, wodurch das Rohprodukt erhalten wurde, das durch Chromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von Hexan/Chloroform-Lösungsmittel-Gradient für die Elution gereinigt wurde (11,8 g, 96%). ¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7,95 (d), 7,81 (m), 7,68 (m), 6,86 (d), 3,97 (t), 3,85 (s), 3,64 (t), 1,76 (m), 1,65 (m), 1,54 (m), 1,42 (m), 1,29 (m). FABMS: 438 (MH⁺).
(iii) Synthese von Methyl-p-(10-aminodecyloxy)benzoat
Methyl-p-(10-N-phthalimidodecyloxy)benzoat (8,52 g, 19,48 mmol) wurde in Methanol (75 ml) bei 65°C gelöst. Hydrazinmonohydrat (1 ml, 20,62 mmol) wurde zugegeben und die Lösung wurde unter Stickstoff 22 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und der Niederschlag wurde filtriert. Die Lösung wurde konzentriert und der Rückstand wurde mit dem Niederschlag vereinigt und mit Chloroform (500 ml) behandelt. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen und die Wäschen wurden mit Chloroform (2 × 100 ml) zurück extrahiert. Die vereinigte organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das Produkt erhalten wurde (5,62 g, 97%). ¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7,95 (d), 6,88 (d), 3,97 (t), 3,86 (s), 2,64 (t), 1,78 (m), 1,53 (m), 1,43 (m), 1,28 (m).
(iv) Synthese von Methyl-p-(10-chloracetamidodecyloxy)-benzoat
Das Rohprodukt aus (iii) oben (5,62 g, 18,84 mmol) und Triethylamin (2,6 ml, 18,7 mmol) wurden in Chloroform (90 ml) gelöst und in einem Eisbad abgekühlt. Eine Lösung aus Chloracetylchlorid (1,5 ml) in Chloroform (40 ml) wurde tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach der Beendigung der Zugabe wurde die Lösung in dem Eisbad 15 Minuten gerührt und auf Umgebungstemperatur erwärmt und 20 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen (4 × 80 ml). Das Trocknen (MgSO₄) und die Konzentration ergaben das Produkt (6,71 g, 93%), das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. ¹H-NMR (CDCl₃, δ): 7,95 (d), 6,87 (d), 6,54 s, br), 4,01 (d), 3,96 (t), 3,86 (s), 3,28 (q), 1,76 (m), 1,55 (m), 1,45 (m), 1,29 (m). ¹³C-NMR (CDCl₃, δ): 130,71, 130,66, 121,52, 113,23, 75,37, 67,33, 50,95, 41,85, 39,04, 28,56, 28,53, 28,47, 28,43, 28,33, 28,25, 25,94, 25,11.
(v) Synthese von 10-(p-Methoxycarbonyl-phenyloxydecylcarbamoylmethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-tri-t-butylacetat
D03A-Tri-t-butylester (9,31 g, 15,63 mmol) und Triethylamin wurden in DMF (90 ml) gelöst und das Chloracetamid aus (iv) oben (6,0 g, 15,63 mmol) wurde zu der Lösung gegeben, die bei 60°C unter Stickstoff für 19 Stunden erhitzt wurde. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in Chloroform (200 ml) aufgenommen. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen (3 × 100 ml), über MgSO₄ getrocknet und konzentriert, wodurch das Rohprodukt (10,97 g) als ein Öl erhalten wurde.
(D03A = 1,4,7-Triscarboxymethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan).
Beispiele 27–31
Unter Verwendung des folgenden Reaktionsschemas wurden Analoga von D03A-D0BA (die Verbindung aus Beispiel 26) hergestellt:
(worin R₁₁ Halogen, zum Beispiel Br ist; X₁₁ CH₂ oder O ist und d eine positive ganze Zahl ist).
Die Synthese der Verbindungen aus den Beispielen 27 bis 31 war einfach und in allen Fällen reproduzierbar.
Beispiel 32
Liposome mit der Membranbindung Gd D03A-D0BA
110 nm große Liposome wurden unter Verwendung von 90 mol-% Ei-Phosphatidyl-cholin und 10 mol-% Gd D03A-D0BA in einem 175 mM-Glucose-, 100-mM-Saccharose-Medium mit einer Gesamtosmolalität von 282 mOs hergestellt.
T₁-Relaxivität: 17 mM^–1s^–1
Gd-Konzentration: 7,87 mM
Lipid-Konzentration: 65,9 mM
Bluthalbwertszeit (Ratten) gefolgt von einer iv Injektion bei 0,03 mmol/kg: 20–90 min Geweberetention (als Prozentsatz an injizierter Dosis):
Liposome, die mit Gadoliniumkomplexen der Komplexbildner aus den Beispielen 27 bis 31 beladen sind, werden analog hergestellt.
Beispiel 33
Duales Kontrastmittel
200 nm große Liposome werden unter Verwendung von Gd D03A-D0BA als ein membranassozierter Komplex, Ei-Phosphatidylcholin als ein membranbildendes Lipid und eine wässerige Glucose/Saccharose-Lösung wie in Beispiel 32 hergestellt. Gelöster Dy DTPA-BMA wird in die Liposomen bei einem Dy/Gd-Verhältnis von 2 eingeführt, wodurch ein duales Kontrastmittel erhalten wird.
T₁ Relaxivität = 14,6 mM^–1s^–1
T₂* Relaxivität = 16,6 mM^–1s^–1

Claims

Liposomales Mittel, umfassend Liposome, die an eine Membran hiervon ein komplexiertes, diagnostisch oder therapeutisch wirksames Metallion gebunden haben, wobei der Komplexbildner, der das Metallion bindet, eine makrocyclische Komplexbildungseinheit aufweist, wobei an ein Einfachringatom hiervon eine lipophile membranassoziierende Einheit angebracht ist.
Mittel nach Anspruch 1, wobei der Komplexbildner der Formel I entspricht An-L-Ch(R)_n (I)worin An eine hydrophobe membranassoziierende Gruppe ist, L eine Linkereinheit ist, angebracht an ein Ringatom von Ch und abtrennbar an einer bioabbaubaren Bindung, Ch eine makrocyclische Komplexbildungseinheit ist, die wahlweise eine oder mehrere hydrophile oder ortsgerichtete Gruppen R trägt, und n 0 oder eine positive ganze Zahl ist.
Mittel nach Anspruch 2, wobei in dem Komplexbildner An eine Cholesteryl- oder Phosphatidylgruppe umfasst.
Mittel nach Anspruch 1, wobei der Komplexbildner eine amphiphile Verbindung der Formel II ist (HA)_qAr-L'-Ch(R)_n (II)worin Ch(R)_n wie in Anspruch 2 definiert ist, L' eine wahlweise oxo-subsituierte C_2-25-Alkylenlinkereinheit ist, angebracht an ein Ringatom von Ch, und in welcher mindestens eine CH₂-Einheit durch eine Oxa-, Aza- oder Thiagruppe ersetzt ist, und welche wahlweise durch eine bioabbaubare Gruppe M unterbrochen ist, Ar ein Arylring ist, wahlweise substituiert durch oder ankondensiert hieran mit einem weiteren Arylring, q eine positive ganze Zahl ist, und jedes AH eine Protonensäuregruppe ist.
Mittel nach Anspruch 4, wobei in dem Komplexbildner der Formel II, q 1 oder 2 ist, Ar Phenyl ist, und L' eine über Sauerstoff an Ar gebundene C₆-C₁₅-Alkylenoxygruppe ist.
Mittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in dem Komplexbildner Ch(R)_n eine Gruppe der Formel (XN(CHR₁)_m)_p ist, worin p 3, 4, 5 oder 6 ist, jedes m 2, 3 oder 4 ist, jedes R₁ ein Wasserstoffatom, eine hydrophile Gruppe oder eine ortsgerichtete Gruppe ist, und jedes X eine Gruppe R₁ oder eine metallkoordinierende Gruppe ist, wobei jedoch eine kohlenstoff- oder stickstoffgebundene R₁-Gruppe eine Bindung zu der Linkereinheit vorsieht.
Mittel nach Anspruch 6, wobei in dem Komplexbildner Ch(R)_n ein 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triscarboxymethyl (DO3A)- oder 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetracarboxymethyl (DOTA)-Rest ist.
Mittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Komplexbildner gewählt ist aus: 1,4,7-Triscarboxymethyl-10-[N-{2-(N-cholesteryloxy-carbonyl)aminoethyl}amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (AE-DO3A-Cholesterylcarbamat), 1,4,7-Triscarboxymethyl-10-[N-{2-(N-(N-phosphatidylethanolamido)succinamido)-ethyl}amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (DO3A-Succinyl-PE), 1,4,7-Triscarboxymethyl-10-[N-{2-(N-N-phosphatidyl-ethanolamido)glutaramido)ethyl}-amidomethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan (DO3A-Glutaryl-PE), 10-(p-Carboxyphenyloxydecyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triscarboxymethyl (DO3A-DOBA), 10-(m-Carboxyphenyloxydecyl)-1,4,7,10-tetraazacyclo-dodecan-1,4,7-triscarboxymethyl (DO3A-DOmBA), 10-(o-Carboxyphenyloxydecyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-tris-carboxymethyl (DO3A-DOo-BA), 10-(3,5-Dicarboxyphenyloxydecyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triscarboxymethyl (DO3A-DOIA), 6-(p-Carboxyphenyloxyhexyl)-1,4,7,10-tetraazacyclo-dodecan-1,4,7-triscarboxymethyl (DO3A-HOBA), 8-(p-Carboxyphenyloxyoctyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triscarboxy-methyl (DO3A-OOBA) und 10-{N-(12-Phosphatidylethanolaminododecyl-1-aminoethyl)}amidomethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triscarboxymethyl (AE-DO3A-Dodecenyl-PE).
Mittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Liposome ein Phospholipid- oder hydriertes phospholipidliposom-membranbildendes Material umfassen.
Mittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Metallion ein paramagnetisches Metallion ist.
Mittel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, enthaltend einen weiteren Komplex eines diagnostisch oder therapeutisch wirksamen Metallions.
Mittel nach Anspruch 11, wobei der weitere Komplex in dem Liposomkern disponiert ist.
Mittel nach Anspruch 12, enthaltend einen Gadoliniumkomplex des Komplexbildners und einen wasserlöslichen, hydrophilen Dysprosiumkomplex als den weiteren Komplex.
Mittel nach Anspruch 11, wobei der weitere Komplex ein Komplex aus einem Schwermetallcluster ist.
Zusammensetzung, umfassend eine liposommembranbildende Verbindung und eine kontrastverstärkende Verbindung, wobei letztere eine makrocyclische Komplexbildungseinheit umfasst, wobei an ein Einfachringatom hiervon eine lipophile membranassoziierende Einheit angebracht ist, aus welcher liposomale Zusammensetzungen erzeugt werden können.
Verfahren zur Herstellung eines liposomalen Mittels nach Anspruch 1, wobei das Verfahren einen der folgenden Schritte umfasst: (a) Transformieren einer Zusammensetzung, umfassend ein wässriges Trägermedium, eine liposomale membranbildende Verbindung und eine wahlweise metallierte makrocyclische Komplexbildungsverbindung, die an einem makrocyclischen Ringatom eine hydrophobe membranassoziierende Gruppe angebracht hat, zu einer liposomalen Zusammensetzung und, falls erforderlich, danach Metallieren der Komplexbildungsverbindung; und (b) Kuppeln einer wahlweise metallierten makrocyclischen Komplexbildungsverbindung an eine Ankerverbindung, bei der eine hydrophobe Einheit innerhalb einer liposomalen Membran eines Liposoms eingebracht ist, und, falls erforderlich, danach Metallieren der Komplexbildungsverbindung.
Verwendung eines makrocyclischen Komplexbildners oder eines Komplexes oder Salzes hiervon zur Herstellung eines liposomalen Kontrastmittels, wie in Anspruch 1 beschrieben, zur Verwendung bei der diagnostischen Bilderzeugung.
Verwendung eines liposomalen Mittels nach Anspruch 1 zur Herstellung eines diagnostischen Kontrastmittels zur Verwendung in einem Verfahren zur Erzeugung eines verstärkten Bildes eines menschlichen oder nichtmenschlichen Körpers, dem vorausgehend eine kontrastwirksame Menge eines Kontrastmittels verabreicht worden ist, wobei das Verfahren ein Bild mindestens eines Teils des Körpers erzeugt.