DE69616453T2

DE69616453T2 - Liposomensuspensionen als blut-pool-kontrastmittel

Info

Publication number: DE69616453T2
Application number: DE69616453T
Authority: DE
Inventors: Bernard Lamy; Herve Tournier
Original assignee: Bracco Research SA
Current assignee: Bracco Research SA
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1996-02-22
Publication date: 2002-07-11
Anticipated expiration: 2016-02-23
Also published as: JPH10500999A; FI964250A; EP0759785B1; IL117248A; ES2165971T3; EP0759785A1; ZA961485B; NO964501L; IL117248A0; AU4546996A; ATE207763T1; CA2187427A1; DK0759785T3; NO316311B1; FI964250A0; DE69616453D1; WO1996025955A1; NO964501D0

Description

Die Erfindung betrifft injizierbare NMR- und Röntgenblutpoolkontrastmittel, die wäßrige Suspensionen von Liposomen enthalten, die Bilderzeugungskontrastverstärker, z. B. paramagnetische bzw. radioopake Verbindungen, zur bildgebenden Untersuchung des Kreislaufs und/oder von durch den Kreislauf angesteuerten Organen transportieren. Die Zusammensetzungen sind so formuliert, daß sie die Kontrastmittel vor einer frühzeitigen Entfernung durch das retikuloendotheliale (RES)-System der Leber und der Milz schützen, so daß sie lange genug für eine Bilderzeugung von den Blutgefäßen und von durch das Blut perfundierten Organen im Kreislauf bleiben. Die bildgebende Röntgen- und NMR- Untersuchung des Kreislaufs und von zielgerichtet angesteuerten Organen kann erheblich dazu beitragen, mögliche Krankheiten bei menschlichen und tierischen Patienten zu diagnostizieren.

Stand der Technik

Bis jetzt sind Substanzen, die als Bilderzeugungskontrastmittel in injizierbaren Zusammensetzungen für Untersuchungen des Blutpools geeignet waren, zumeist auf NMR ansprechende feste anorganische und organische Partikel oder wasserlösliche Polymere gewesen. Die Partikel können ferromagnetische oder superparamagnetische Materialien wie auch paramagnetische Spezies, die an polymere Träger gebunden sind, enthalten. Um diese für eine bildgebende Untersuchung des Kreislaufs ausreichend langlebig zu machen, sollten die Partikel gegen ein vorzeitiges Entfernen aus dem Blutstrom geschützt werden.
Normalerweise ist die Lebensdauer von in den Kreislauf injizierten Partikeln wegen des schnellen physiologischen Entfernens aus diesem durch Opsonisierung, gefolgt von Phagozytose, kurz. Der Opsonisierungsprozess umfaßt das Überziehen der Partikel durch ein Antigenprotein, Opsonin, das durch Makrophagen erkannt werden kann. Dann folgt der Opsonisierung in einer zweiten Stufe die Phagozytose und Metabolisierung der überzogenen (opsonisierten) Partikel durch die Kupffer-Zellen der Leber und der Milz. Folglich ist, obwohl ungeschützte Partikel für eine Bilderzeugung von der Leber und der Milz geeignet sind, deren Lebensdauer im Blut zu kurz für eine bildgebende Untersuchung des Blutpools.
Der Schutz von Partikeln gegen ein frühzeitiges Entfernen aus dem Kreislauf wird in vielen Dokumenten diskutiert, und eine signifikante Verlängerung von deren Lebensdauer im Blut ist erzielt worden, indem Magnetit-Partikel mit einem Überzug, der amphiphile Substanzen, beispielsweise Ethylenoxid-Propylenoxid- Blockcopolymere, enthält, überzogen wurden (siehe beispielsweise WO-A-94/04197, Sintetica).
Es ist die Verwendung von Dispersionen von Mikrovesikeln, die konzentrierte Lösungen von iodierten oder paramagnetischen Spezies verkapselt in den Vesikeln enthalten, z. B. Liposomen, als Träger von Röntgen-Opazität verleihenden Mitteln oder NMR- Kontrastmitteln vorgeschlagen worden. So offenbart EP-A-0 314 764 (Dibra) injizierbare wäßrige Suspensionen von Liposomvesikeln, die verkapselt mindestens eine iodierte organische Verbindungen, die für Röntgenstrahlen opak ist, transportieren, die als Kontrastmittel für die bildgebende Röntgenuntersuchung von Leber und Milz nützlich sind. Die Liposomen haben eine mittlere Größe zwischen 0,15 und 3 um und das Verhältnis des Gewichts des in den Liposomen verkapselten Iods zu dem Gewicht der liposombildenden Lipide (I/L) beträgt 1,5 bis 6 g/g. Die Liposomsuspensionen als Träger für Opazität verleihende Verbindungen sind aufgrund ihrer relativen biologischen Verträglichkeit und leichten Herstellung vorgeschlagen worden.
Vorschläge, Opazität verleihende Mittel in die Liposommembranen zu inkorporieren, sind ebenfalls gemacht worden (E. Unger et al., Liposome bearing membrane-bound complexes of manganese as magnetic resonance contrast agents, Proceedings of the Contrast Media Research Symposium, San Antonio, Texas, 3.-8. Oktober 1993, S. 168). Jedoch unterliegen die meisten Liposomen einer schnellen Entfernung aus dem Kreislauf durch die Leber und die. Milz und, obwohl diese Eigenschaft für eine bildgebende Untersuchung von diesen Organen vorteilhaft sein kann, ist sie nicht wünschenswert, wenn eine bildgebende Untersuchung des Blutpools beabsichtigt wird, weil für die bildgebende Untersuchung des Blutpools die Konzentrationen von Opazität verleihenden Verbindungen im Blut für längere Zeit auf einem relativ hohen Niveau gehalten werden sollten.
Um die Lebenszeit von Liposomvesikeln im Blut zu verlängern, sind verschiedene Abhilfemaßnahmen vorgeschlagen worden. Das überziehen von Liposomen mit Copolymeren, die hydrophile und hydrophobe Segmente enthalten, ist beispielsweise in J. Pharmacy & Pharmacol. 39 (1987), 52P, vorgeschlagen worden, wohingegen das Einbringen von schützenden Substanzen in die Vesikel bildenden Lipide in EP-A-0 354 855 (Terumo) und in WO-A- 91/05545 (Liposome Technology) vorgeschlagen worden ist. Gemäß der letztgenannten Strategie "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnde Faktoren" ("stealth factors"), beispielsweise kovalent modifizierte Lipide, d. h. Lipide, die aufgepfropfte, sich nach außen erstreckende Polyethylenglycol (PEG)- oder Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Segmente tragen. Es ist auch darüber berichtet worden, daß das Einbringen von Produkten, wie Palmitoylglucuronsäure (PGlcUA) als "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnde" ("stealth") Faktoren in die vesikelbildenden Lipide die Halbwertszeit von Liposomen im Blut verlängert (siehe Naoto Oku et al., in Biochimica et Biophysica Acta 1126 (1992) 255-260).
EP-A-0 354 855 (Terumo) offenbart die Verwendung von Mitteln zum Inhibieren der Adsorption von Protein an die Liposomoberfläche, einen hydrophoben Rest an einem Ende und einen hydrophilen makromolekularen Ketten-Rest an dem anderen Ende enthalten. Die bevorzugten hydrophoben Reste sind alkoholische Reste von langkettigen aliphatischen Alkoholen, ein Sterol, ein Polyoxypropylenalkyl oder ein Glycerinfettsäureester und Phospholipide, während bevorzugte hydrophile Reste Polyethylenglycole (PEG) sind. Nicht-ionische grenzflächenaktive Mittel, in denen PEG und ein alkoholischer Rest des hydrophoben Rests durch eine Etherbindung gebunden sind, oder PEG-gebundene Phospholipide sind besonders bevorzugt. Nach der Bildung wird das Mittel mit liposombildenden Phospholipiden gemischt, um "schwer wahrnehmbare" ("stealth") Liposomen herzustellen.
Die Lebensdauer von Liposomen im Blut kann signifikant verlängert werden, indem man die Vesikel sehr klein macht, d. h. indem man sie für Opsonin aufgrund der Größe weniger erkennbar macht; dieser Ansatz ist in WO-A-88/04924 und EP-A-0 442 962 offenbart worden.
Die WO-A-88/04924 offenbart ein eingeschlossenes pharmazeutisches Mittel enthaltende Liposomzusammensetzungen, in denen die Liposomen überwiegend zwischen 0,07 und 0,5 um groß sind, mindestens 50 Mol-% Membran-versteifendes Lipid, wie Sphingomyelin oder neutrale Phospholipide, und zwischen 5 und 20 Mol-% Gangliosid GM&sub1;, gesättigtes Phosphatidylinositol oder Galactocerebrosidsulfatester aufweisen. Aus der Offenbarung (Beispiele 8 und 9) folgt, daß mit negativ geladenen Phospholipiden, in denen die Phosphatidylgruppierung an Glycerin gebunden ist, hergestellte Liposomen für Anwendungen im Blutpool nicht sehr nützlich sind, da diese relativ schnell vom RES erkannt werden.
In der EP-A-0 442 962 werden Liposomen von 50 nm oder weniger für das Transportieren von sehr geringen Mengen von Arzneimitteln durch den Kreislauf zu ausgewählten Bereichen im Körper vorgeschlagen. Die Schwierigkeit bei sehr kleinen Vesikeln besteht darin, daß deren Verkapselungskapazität sehr gering wird und solch kleine Vesikel nicht leicht mit den Mengen von Kontrastmitteln, die für eine bildgebende Untersuchung des Blutpools mit paramagnetischen oder Röntgenverbindungen erforderlich sind, verträglich sind. So wäre es unter den offenbarten Bedingungen erforderlich, Lebewesen Liposomsuspensionen zu injizieren, die mehr als 100 mg Lipide/ml enthalten, was aus Gründen von Kosten, potentieller Toxizität und sehr hoher Viskosität nicht wünschenswert ist. Die Verwendung von winzigen Liposomvesikeln der in EP-A-0 442 962 vorgeschlagenen Art für die Abgabe von Arzneimitteln (in der Größenordnung von 50 nm oder weniger) ist dementsprechend für eine bildgebende Untersuchung des Blutpools nicht praktikabel. Im wesentlichen dasselbe trifft auf die Vorschläge von Gabizon et al. in Biochim. et Biophys. Acta 1103 (1992) 94-100 und I. A. J. M. Bakker-Woudenberg et al., ebenda, 318-326 zu, die auf Liposomen mit einer durchschnittlichen Größe zwischen 0,07 um und 0,1 um und verlängerten Verweilzeiten im Blut gerichtet sind.
Aus den neueren Veröffentlichungen von M. C. Woodle et al., Journal of Drug Targeting 2 (1994) 397-403, und I. A. J. M. Backer-Woudenberg et al., ebenda, 363-371, folgt, daß angesichts der relativ schnellen Entfernung sogar von jenen sehr kleinen Liposomen die Anwesenheit der anerkannten schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden ("stealth") Faktoren absolut erforderlich ist, wenn diese Liposomen beim Transportieren verschiedener zielgerichteter Arzneimittel wirksam sein sollen. Dies wirft dann weitere Probleme auf, da die Herstellung von Liposomen mit den "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") relativ beschwerlich ist. Zusätzlich haben die mit schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren versehenen ("stealth factored") Liposomen bekanntermaßen eine sehr geringe Verkapselungskapazität und, obwohl solche Liposomen zum Transport spezieller Arzneimittel geeignet und dementsprechend in der Therapie nützlich sein können, sind sie bei bildgebenden Untersuchungen nahezu nutzlos.
Folglich bleibt das Problem der Verwendung von Standard- oder nicht-modifizierten Liposomen, d. h. Liposomen, die eine ausreichende Menge von Opazität verleihendem Mittel transportieren können und ausreichend lange im Blutkreislauf bleiben, um eine bildgebende Röntgen- und NMR-Untersuchung zu ermöglichen, ungelöst. Es wird allgemein angenommen, daß das Kontrastmittel zusätzlich dazu, daß es in der Lage sein sollte, eine ausreichende Menge von Opazität verleihenden Mittel zu liefern, für eine gute bildgebende Untersuchung des Blutpools nach einer Verabreichung zwischen 1 und 2 h im Kreislauf bleiben sollte. Danach sollte das Blutpoolkontrastmittel so schnell wie möglich aus dem Körper eliminiert werden. Die Verwendung von Liposomen, die diese Kriterien erfüllt, ist wünschenswert, da Liposomherstellungstechniken wohlbekannt sind; deren Verwendung in der Medizin und in diagnostischen Präparaten weit verbreitet ist; ihre Effekte im lebenden Körper ziemlich gut verstanden werden. Folglich würde deren Verwendung für die bildgebende Untersuchung des Blutpools oder die Herstellung von Blutpoolmitteln aus schwer wahrnehmbaren ("stealth") Liposomen ohne "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") eine Anzahl von Vorteilen bieten.
Aktuell ist dieses Problem unerwartet durch die Erfinder gemäß der nachfolgenden Offenbarung gelöst worden.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die erfindungsgemäßen Blutpoolmittel Liposomsuspensionen enthalten, die leicht in den Kreislauf von lebenden Körper injiziert werden können, ausreichend stabil sind und eine ausreichende Menge eines paramagnetischen oder Röntgenopazität verleihenden Materials transportieren, um eine bequeme bildgebende Untersuchung des Blutstroms und angrenzender Organen zu erlauben. Die Blutpoolmittel enthalten Liposomen mit erstaunlichen sogenannten "schwere Wahrnehmbarkeit-" ("stealth") -Eigenschaften, ohne daß sie ein Einbringen der zuvor identifizierten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") erfordern.
Die Blutpoolkontrastmittel der Erfindung enthalten Liposomsuspensionen, in denen
(a) das Verhältnis der Verkapselungskapazität Ec des eingeschlossenen Volumens an Verbindung in ul/mg Lipid der Vesikel zur Größe D mindestens 25 oder mehr beträgt, wobei D der durchschnittliche Durchmesser der Vesikel in um ist;
(b) die liposombildenden Lipide zwischen 80 und 99 Mol-% neutrale Phospholipide und ungefähr 1 bis 20 Mol-% negativ geladene Phospholipide enthalten, deren Phosphatidylrest an Glycerin gebunden ist, wobei die negativ geladenen Phospholipide unter einem oder mehreren von Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Distearoylphosphatidylglycerin (DSPG) und den entsprechenden Lipiden, in denen das Glycerin durch Inositol ersetzt ist, ausgewählt sind;
(c) mindestens 80% (bezogen auf das Volumen) der Liposomvesikel im Bereich von 0,2-1,0 um liegen; und
(d) abhängig von der Liposomgröße die Lipidkonzentration (CLip) in den Suspensionen unter 20 mg/ml für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1,0 um und unter 100 mg/ml für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 um liegt.
Ebenso wird ein Verfahren zur Herstellung der Blutpoolmittel durch Verkapseln einer konzentrierten Lösung von Opazität verleihendem Mittel in den Vesikeln, die gemäß Liposomherstellungsmöglichkeiten aus einer Lipidmischung gebildet sind, die zwischen 80 und 99 Mol-% neutrale Phospholipide und 1 bis 20 Mol-% negativ geladene Phospholipide, deren Phosphatidylrest an Glycerin gebunden ist, und gegebenenfalls weitere Additive, wie Cholesterin, enthält, Normalisieren der Vesikel durch wiederholte Extrusion durch kalibrierte semi-permeable Membranen, bis die Größe von mindestens 80% der Vesikel zwischen 0,2 und 1,0 um liegt, und gegebenenfalls Abtrennen der Vesikel mit dem darin verkapselten Kontrastmittel von nicht-verkapseltem Kontrastmittel und Einstellen der Menge des Trägers in der Suspension offenbart, so daß die Lipidkonzentration (CLip in mg/ml) darin einen Wert nicht überschreitet, der durch das Verhältnis 20/D gegeben ist, wobei D der in um ausgedrückte durchschnittliche Volumendurchmesser der Vesikel ist.
Die Verwendung der Röntgen- oder NMR-Blutpoolmittel bei der bildgebenden Untersuchung von menschlichen oder tierischen Patienten wird ebenfalls offenbart.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Diagramm des Prozentsatzes der injizierten Dosis (ID) als Funktion der Zeit für die mit Liposomen mit vier verschiedenen Größen hergestellten Suspensionen nach einer Injektion in den Blutstrom von Laborratten.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung des Prozentsatzes der injizierten Dosis (ID) als Funktion der Zeit für die mit "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") versehenen Liposomen und erfindungsgemäßen Liposomen hergestellten Suspensionen nach einer Injektion in den Blutstrom von Laborratten.
Fig. 3 ist ein Graph des Prozentsatzes der injizierten Dosis (ID) als Funktion der Zeit für die mit erfindungsgemäßen Liposomen und mit Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA) enthaltenden Liposomen hergestellten Suspensionen nach einer Injektion in den Blutstrom von Laborratten.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Hauptaspekte der Erfindung beruhen auf der unerwarteten Feststellung, daß die Liposomsuspensionen, in denen (a) das Verhältnis der Verkapselungskapazität Ec des eingeschlossenen Volumens an Verbindung in ul/ml Lipid der Vesikel zu der Größe D, wobei D der durchschnittliche Vesikeldurchmesser in um ist, mindestens 25 oder mehr beträgt; (b) die liposombildenden Lipide zwischen 80 und 99 Mol-% neutrale Phospholipide und ungefähr 1 bis 20 Mol-% negativ geladene Phospholipide enthalten, deren Phosphatidylrest an Glycerin gebunden ist, wobei die negativ geladenen Phospholipide unter einem oder mehreren von Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Distearoylphosphatidylglycerin (DSPG) und den entsprechenden Lipiden, in denen das Glycerin durch Inositol ersetzt ist, ausgewählt sind; (c) mindestens 80% (bezogen auf das Volumen) der vorliegenden Liposomvesikel eine Größe in Bereich von 0,2-1,0 um aufweisen; und (d) abhängig von dem Liposomdurchmesser die maximale Lipidkonzentration (CLip) zwischen 20 und 100 mg/ml liegt. Die maximale Konzentration (leicht als 20/durchschnittlicher Vesikeldurchmesser D in um berechnet) bedeutet, daß für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 um die maximale Lipidkonzentration in der Suspension unter 100 mg/ml liegt, für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,4 um die maximale Lipidkonzentration unter 50 mg/ml liegt, für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,6,um die maximale Lipidkonzentration unter 33 mg/ml liegt, für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,8 um die maximale Lipidkonzentration unter 25 mg/ml liegt und für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1,0 um die maximale Lipidkonzentration unter 20 mg/ml liegt. Solche Suspensionen können leicht in den Kreislauf von lebenden Körper injiziert werden, sie haben ausreichende Stabilität, um für längere Zeit im Kreislauf zu bleiben, sie zeigen sogenannte "schwere Wahrnehmbarkeit- ("stealth") -Eigenschaften, ohne daß sie das Einbringen der anerkannten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") erfordern, und besitzen dennoch eine ausreichende Verkapselungskapazität gegenüber Lösungen von paramagnetischen oder Röntgenkontrastmitteln, um sehr praktische Kontrastmittel bereitzustellen, die für eine bildgebende Untersuchung des Blutstroms und angrenzender Organen nützlich sind.
Es sollte festgehalten werden, daß 1 bis 20 Mol-% der negativ geladenen gesättigten oder ungesättigten Phospholipide, deren Phosphatidylrest an Glycerin gebunden ist, gegebenenfalls Phospholipide enthalten, in denen das Glycerin durch Inositol ersetzt ist. Der andere Phosphatidylrest des negativ geladenen Phospholipids ist an einen Glycerindiester der üblichen Fettsäuren, wie Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Ölsäure und ähnliche, gebunden. Die Zugabe von mehr als 20 Mol-% der negativ geladenen Phospholipide zu den Liposomen verringert die Verkapselungskapazität der Vesikel beträchtlich und sollte folglich vermieden werden. Die besten Ergebnisse hinsichtlich "schwere Wahrnehmbarkeit-" ("stealth") -Eigenschaften und Verkapselungskapazität der Liposomen der Erfindung werden erhalten, wenn dieser Bereich zwischen 3 und 15 Mol-% gehalten wird.
In der Erfindung umfassen die neutralen Phospholipide die üblichen gesättigten und ungesättigten Phosphatidylcholine und -ethanolamine, beispielsweise die entsprechenden Mono- und Dioleoyl-, Mono- und Dimyristoyl-, Mono- und Dipalmitoyl- und Mono- und Distearoyl-Verbindungen. Die negativ geladenen Phospholipide umfassen die Phosphatidylglycerine, vorzugsweise Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Distearoylphosphatidylglycerin (DSPG) und gegebenenfalls die entsprechenden Phospholipide, worin das Glycerin durch Inositol ersetzt ist. Zusätzlich können die Lipide der vorliegenden Liposomen Additive enthalten, die in Liposomformulierungen gewöhnlich vorhanden sind, wie die Sterole und einige Glycolipide; die Sterole können Cholesterin, Ergosterol, Coprostanol, Cholesterinester, wie das Hemisuccinat (CHS), Tocopherolester und ähnliches umfassen. Die Glycolipide können Cerebroside, Galactocerebroside, Glucocerebroside, Sphingomyeline, Sulfatide und mit Mono-, Di- und Trihexosiden derivatisierte Sphingolipide umfassen.
Es ist wichtig festzuhalten, daß die Phosphatidsäuren in den Formulierungen der vorliegenden Liposomsuspensionen vermieden werden müssen, da sogar geringe Menge davon die "schwere Wahrnehmbarkeit"- ("stealth") -Eigenschaften zerstören. Es ist auch bemerkenswert, daß das zusätzliche Einbringen der zuvor identifizierten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") in die Liposomen und die Suspensionen der Erfindung (die in anderen Liposomformulierungen nützlich sind) keine weitere Verbesserung bei den "schwere Wahrnehmbarkeit"- ("stealth") -Eigenschaften der vorliegenden Suspensionen bringen wird. Das Inkorporieren dieser Faktoren in die Liposomen wird folglich einen unzureichenden Einfluß auf die Verweilzeit der Liposomen der Erfindung im Blut haben. Aktuell könnte das Einbringen von anerkannten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden" ("stealth") Faktoren in die Formulierungen der erfindungsgemäßen Liposomsuspensionen sogar schädlich sein, da das eingeschlossene Volumen Ec (eingeschlossenes Volumen/Gewicht von Lipid) signifikant reduziert werden kann. Folglich sind die Liposomformulierungen der Erfindung einfach zu formulieren und herzustellen und sind folglich sogar wirtschaftlich vorteilhaft verglichen mit anderen Formulierungen mit schlechteren Leistungseigenschaften.
Es ist vorteilhaft, Suspensionen zu verwenden, in denen die Vesikel eine so enge Größenverteilung wie möglich um einen nominalen Wert, ausgewählt in dem gegebenen 0,2 bis 1,0 um-Bereich und vorzugsweise im Bereich zwischen 0,2 und 0,6 um, aufweisen. Wenn beispielsweise die Auswahl wünschehswerterweise eine Suspension von Vesikeln von z. B. 0,4 um umfaßt, ist es bevorzugt, daß mindestens 80% der Vesikel gemäß der Volumenverteilung eine Größe von 0,4 um ± 10% aufweisen. Die enge Breite des Vesikelgrößenverteilungsbands kann hier als ein Qualitätsfaktor angesehen werden, d. h. je enger das Band, um so kontrollierbarer sind die Eigenschaften der Liposomsuspensionen und um so besser sind deren eigentliche Leistungseigenschaften als Träger von Mitteln zur bildgebenden Untersuchung des Blutpools in injizierbaren Formulierungen. Ein Einengen des Vesikelgrößenverteilungsbands von Liposomsuspensionen wird normalerweise durch "Normalisierung", d. h. Kalibrierung der Vesikel durch Extrusion der Liposomsuspensionen durch genau klassierte Filtrationsmembranen, beispielsweise Nuclepore®-Polycarbonatmembranen, erreicht.
Aus dem Obigen ist leicht ersichtlich, daß die zulässige Lipidkonzentration (CLip) in den Suspensionen der Erfindung in direkter Beziehung zu der Vesikelgröße und deren Verkapselungspotential steht. Beispielsweise beträgt am unteren Ende des Größenbereichs die zugelassene maximale Lipidkonzentration 100 mg/ml. Dieser Grenzwert entspricht 0,2 um-Vesikeln; für 0,6 um-Vesikel beträgt dieser Grenzwert 33 und für 1,0 um-Vesikel beträgt dieser Grenzwert 20 mg/ml. Diese Werte sind bevorzugt, obwohl möglicherweise akzeptable Ergebnisse erhalten werden, wenn die Größen innerhalb von ± 20% an beiden Enden des Grenzwerts variieren. Diese sind angesichts der Eigenschaftsveränderungen, die aus unterschiedlichen Lipidzusammensetzungen resultieren können, zulässig. Dementsprechend wird die Viskosität der Suspensionen 50 mPa.s nicht überschreiten und wird vorzugsweise unter 25 mPa.s liegen. Tatsächlich können diese Werte in einigen Fällen, beispielsweise wenn außergewöhnlich große Injektionsnadeln verwendet werden oder wenn die Injektion langsam erfolgen kann, überschritten werden.
Im Falle von Röntgenkontrastmitteln werden die Suspensionen aus Liposomen, die iodierte Verbindungen transportieren, hergestellt, sollte die Lipidkonzentration (CLip) in den Suspensionen nicht unter ungefähr einem Viertel bis einer Hälfte des vorerwähnten Maximalwerts liegen, da andernfalls die Menge an Opazität verleihendem Mittel, das von den Liposomen transportiert wird, zu gering für den Bilderzeugungskontrast wird; beispielsweise beträgt für 0,4 um-Vesikel der halbmaximale Wert 25 mg/ml. Folglich beträgt bei einem eingeschlossenen Volumen (Er) von ungefähr 9 ul/mg Lipide (dieser Wert, der ungefähr % des theoretischen Werts ist, kann mit Liposomen der Erfindung leicht erreicht werden) und unter Verwendung von Lösungen von nicht-ionischen Monomeren für die Verkapselung mit der Standard-Iod-Lösung der Konzentration C1 = 260 g Iod/l (0,26 mg/ul) die Iodendkonzentration der Liposomsuspension (CIS) 25 · 9 · 0,26 = 58,5 mg/nE und liegt bereits oberhalb des bevorzugten unteren Grenzwerts der Iodkonzentration für eine zufriedenstellende Opazifizierung für bildgebende Untersuchungen. Selbstverständlich trifft das Vorangehende auch zu, wenn Iodlösungen von nicht-ionischen Monomeren mit 260 g/l-Standardkonzentrationen für die Liposomverkapselung verwendet werden; bei Lösungen mit höheren Iodkonzentrationen (die für Mischungen von Monomeren und Dimeren 300 g/l oder mehr erreichen können) sollten die vorangehenden Beziehungen entsprechend angepaßt werden. Jedoch sind Iodkonzentrationen, die viel höher als 260 g/l sind, im allgemeinen weniger bevorzugt, da der osmotische Druckgradient durch die Vesikelmembran hindurch in einigen Fällen ein Lecken von Iod in das äußere wäßrige Trägermedium verursachen kann.
Wenn man berücksichtigt, daß das Volumen eines hohlen Körpers bezogen auf seine Oberfläche linear als Funktion seiner körperlichen Größe variiert, dann wird im Falle einer Kugel des Radius "r" (= D/2) das Verhältnis von Volumen zu Oberfläche r/3 sein. Im Falle von ideal kugelförmigen Liposomvesikeln, die durch eine äußere Lipidmembran der Oberflächendichte φ (g/cm²) begrenzt werden, beträgt das eingeschlossene Volumen (Ec) in ml/g (oder ul/mg) Lipide r/3φ. In der Lipiddoppelschicht eines unilamellaren Liposomvesikels ist das Molekulargewicht "Mw" von zwei einander gegenüberliegenden Lipidmolekülen 2 · 800 und die Fläche des entsprechenden Oberflächenelements 50 Å² 5 · 10&supmin;¹&sup5; cm². Nimmt man die Avogadro-Zahl als 6,02 · 10²³ an, beträgt die Oberflächendichte (φ) der Lipiddoppelschicht =
Für ein 100 nm-Vesikel (Durchmesser D = 0,1 um) wäre dementsprechend das theoretische eingeschlossene Volumen (Ec = r/3φ) ungefähr
Es ist festzuhalten, daß angesichts des vorangegangenen EC/D = 1/6φ (konstant) 30, wenn Ec in ul/mg (oder ml/g) Lipide und D in um ausgedrückt wird. In der Praxis sind die Vesikel nicht perfekt, sogar nach einer sorgfältigen "Größennormalisierung", z. B. durch Extrusion. Dementsprechend ist, da die durchschnittliche Vesikelgröße einer statistischen Verteilungsordnung folgt, das eingeschlossene Volumen üblicherweise signifikant geringer, d. h. es erreicht selten ¹/&sub4; - ¹/&sub2; des berechneten Werts, was bedeutet, daß Ec/D bei den bislang berichteten besten Ergebnissen möglicherweise kleiner als 10 ist.
Wie in der Erfindung festgestellt werden kann, können Ec/D- Werte in der Größenordnung von 25 oder sogar mehr erreicht werden. So überstieg bis jetzt sogar unter den günstigsten Umständen das eingeschlossene Volumen eines in der Praxis erhältlichen 100 nm-Vesikels normalerweise 2 ml/g (ul/mg) Lipide nicht und war im allgemeinen viel geringer. So beträgt theoretisch, wenn die Vesikel mit einer üblicherweise erhältlichen konzentrierten Iodlösung gefüllt sind (beispielsweise ergibt eine 530 g/l-Lösung von Iomeprol eine Iodkonzentration (CI)von 260 g/l), das Gewicht des eingeschlossenen verfügbaren Iods in g pro g Lipid (I/L) höchstens 2 · 0,26 = 0,52.
Jetzt erfordert, wie auf dem Gebiet der Bilderzeugung allgemein zugestanden wird, ein ausreichender Bilderzeugungskontrast in dem Blutpool vorteilhafterweise eine injizierte Dosis von mindestens ungefähr 50-100 mg Iod/kg Körpergewicht, und aus Sicherheitsgründen ist diese in einer Menge einer injizierbaren Flüssigkeit, die vorzugsweise 1 ml/kg nicht überschreitet, verteilt. Daher sollten wir, wenn wir (mittels einer Liposomsuspension) 100 mg Iod in 1 ml injizierbarer Flüssigkeit verteilen wollen, d. h. wir eine Konzentration (CIS) von Iod in der Liposomsuspension von 100 mg/ml unter Verwendung von 100 nm- Vesikeln haben möchten, eine Liposomsuspension einer Konzentration (CLip) = 100/0,52 = 190 mg Lipide/ml verwenden. Dieser Wert ist hinsichtlich der Viskosität viel zu hoch, um als brauchbar angesehen werden zu können.
Bei größeren Teilchen ist die Situation eine andere. Wenn beispielsweise die vorangegangenen Erwägungen auf z. B. 1-1,5 um- Vesikel angewendet werden, wird das I/L-Verhältnis ungefähr 5-6 mg Iod pro mg Lipide (und kann sogar höher sein, wenn die erfindungsgemäßen Herstellungsbedingungen verwendet werden), was bedeutet, daß die Lipidkonzentration so gering wie 15-20 mg/ml sein kann, um eine Liposomsuspension zu haben, die 100 mg Iod/ml enthält. Unglücklicherweise haben 1 um-Liposomvesikel eine sehr kurze Lebensdauer im Blut, sogar wenn "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnde" ("stealth") Faktoren in die Formulierungen aufgenommen werden, und darüber hinaus nimmt die Viskosität von Liposomsuspensionen, an denen größere Vesikel beteiligt sind, viel schneller zu als bei kleineren Vesikeln. Beispielsweise hat eine 20 mg Lipid/ml-Liposomsuspension mit hauptsächlich 1-1,5 um-vesikeln ungefähr dieselbe Viskosität [40-50 mpa.s] wie eine 80-100 mg/ml-Suspension mit 0,2 um- Vesikeln; und je größer die Vesikel, um so steiler die Viskositäts/Lipidkonzentrations-Kurve.
Es ist ebenfalls interessant, festzuhalten, daß die eingeschlossene Iodendkonzentration in der Liposomsuspension (CIS in mg Iod/ml) gleich der Iodkonzentration (CI in mg/ml) in der eingeschlossenen Lösung multipliziert mit dem Verhältnis des Volumens der eingekapselten Flüssigkeit zu dem Gesamtvolumen der Suspension (CEC) ist. Wobei das Letztgenannte gleich der Lipidkonzentration CLiP (in mg/ml) x dem eingeschlossenen Volumen (Ec) (in ml/mg Lipid) ist. Üblicherweise sind das eingeschlossene Volumen E~ oder die Verkapselungskapazität von Liposomvesikeln signifikant geringer als der berechnete Wert, d. h. das Ec/D-Verhältnis (wobei Ec in ul/mg und D in um angegeben wird) erreicht selten, wenn überhaupt, ungefähr 15 oder mehr. In der Erfindung kann Ec/D 25 oder mehr erreichen.
Für das Verleihen von Röntgenopazität wird man vorzugsweise konzentrierte Lösungen von gegenwärtig erhältlichen nichtionischen, organischen, iodierten, Opazität verleihenden Verbindungen verkapseln, wie Iopamidol, Iomeprol, Iofratol, Iohexol, Iopentol, Iopromid, Iosimid, Ioversol, Iotrolan, Iotasul, Iodixanol, Iodecimol, 1,3-Bis-(N-3,5-bis-[2,3- dihydroxypropylaminocarbonyl]-2,4, 6-triiod-phenyl)-Nhydroxyacetylamino)propan und Mischungen davon. Lösungen solcher iodierten Verbindungen ergeben gegenwärtig Iodkonzentrationen im Bereich von 250-300 g/l. Wie bereits erwähnt, entspricht eine 530 g/l-Iomeprol oder -Iopamidol-Lösung einer CI von 260 g/l von gelöstem Iod, folglich wird für 0,4 um-Vesikel, die gemäß der vorigen Diskussion vorteilhafterweise ungefähr 10 ul/mg Lipide (I/L = 2,6) oder sogar mehr einschließen können, eine Liposomsuspension, die ungefähr 40 mg/ml (CLip) Lipide enthält, ergibt ungefähr 2,6 · 40 = 104 mg/ml Iod (CIS). Diese anfängliche Iodkonzentration (Cl) der injizierbaren Suspension ist ausreichend für eine gute Opazifizierung bei der bildgebenden Untersuchung des Blutpools durch Röntgen, da, einmal in den Blutstrom injiziert, diese gemäß den Erkenntnissen der Erfindung mit der Zeit nur langsam abnehmen wird; man kann dementsprechend nach wie vor mit Liposomen mit geringeren Lipidkonzentrationen arbeiten, d. h. man stellt verkapselte Iodkonzentrationen (CIS) von 60-80 mg/ml und sogar weniger bereit, wenn gewünscht. Dieselbe Art von Erwägungen trifft auf das Verkapseln von paramagnetischen Substanzen, die als Kontrastmittel für bildgebende Untersuchungen durch NMR bestimmt sind, zu. In diesem Falle werden die paramagnetischen Substanzen jene sein, die auch ein ausreichende Wasserlöslichkeit aufweisen, um eine effiziente Kontrastverstärkung nach Verdünnung im Blutstrom bereitzustellen. Unter solchen Substanzen kann man die linearen und cyclischen Alkylenamin-Polycarboxylat-Chelate von auf NMR ansprechenden Übergangselementen (z. B. den Lanthaniden), beispielsweise Gadolinium-DTPA (Magnevist® von Schering A. G.), Gadolinium-BOPTA (von BRACCO), Gadolinium-D03A (Gadoteridol® oder ProHance® von BRACCO Diagnostics Inc.), Gadolinium-DOTA (Dotarem® von Guerbet), Gadolinium-DTPA-BMA (Omniscan® von Salutar) und ähnliches anführen.
Es war besonders erstaunlich, festzustellen, daß die Liposomvesikel in den Suspensionen der Erfindung eine Lebensdauer im Blut erzielen können, die für eine bildgebende Untersuchung des Blutpools ausreichend lang ist, und gleichzeitig eine Verkapselungskapazität bereitstellen, die adäquat ist, um dem Kreislauf eine Menge an Kontrastmittel, die für eine gute Bildverbesserung ausreichend ist, zu verabreichen. Aktuell kann, wenn mit Iod beladene Suspensionen von Liposomen gemäß der Erfindung für eine bildgebende Röntgenuntersuchung des Blutpools von Versuchstieren verwendet werden, die Menge an Iod, die sich eine Stunde nach der Injektion noch im Kreislauf befindet, so hoch wie 50% der injizierten Dosis sein. Nach 2 h kann die Menge noch ungefähr 40% der injizierten Dosis betragen. Diese Eigenschaft ermöglicht es wohl, die Suspensionen in den meisten Fällen für eine zufriedenstellende bildgebende Untersuchung des Blutpools anzuwenden. Die Gründe, warum dem so ist, sogar in Abwesenheit von Artefakten, um die normale physiologische Entfernung der Lipide im Blut und das Verschwinden des Iods durch die Niere zu verhindern, sind nach wie vor ungeklärt.
Zum Herstellen der Liposomsuspensionen kann man auf die meisten Techniken, die auf diesem Gebiet zur Herstellung von Liposomen und der Verkapselung von Substanzen darin bekannt sind, zurückgreifen, mit der Maßgabe, daß die so erhaltenen Suspensionen danach korrekt durch Extrusion durch passend klassierte Filtrationsmembranen kalibriert werden, wobei dies erfolgt, um die Vesikelgrößenverteilung innerhalb passende Grenzen einzuengen. Die bevorzugten Methoden umfassen die Hydratisierung der Lipide in einer wäßrigen Trägerflüssigkeit bei oder oberhalb der Lipidübergangstemperatur, entweder direkt in der zu verkapselnden Lösung oder in unbeladenen wäßrigen Medien, wobei dem eine Transmembranpermeations-Beladung folgt (siehe WO-A-92/10166).
Nach der Extrusion sollten mindestens 80 Vol.-% der Vesikel innerhalb des 0,2-1,0 um- und vorzugsweise 0,2 und 0,6 um- Bereichs liegen. Am besten liegen 80% der Vesikel innerhalb von ± 10% ausgehend von einem beliebigen zwischen 0,2 und 1,0 um ausgewählten nominalen Wert. Jede andere breitere oder engere Verteilung innerhalb der vorerwähnten Grenzen ist zulässig. Nach der Extrusion wird die Suspension überprüft, um sicherzustellen, daß die Konzentration an Lipiden in der Liposomsuspension adäquat ist, und diese muß möglicherweise angepaßt werden, um mit den zuvor diskutierten Erfordernissen konform zu sein. Eine Anpassung kann durch Verdünnen mit mehr Trägerflüssigkeit erfolgen, wenn die Lipidkonzentration die zuvor angegebenen Grenzwerte überschreitet; andernfalls kann sie durch gewöhnliche Maßnahmen erhöht werden, beispielsweise durch Mikro- oder Ultrafiltration mit Membranen mit zum Zurückhalten der Vesikel geeigneten Porositäten, die aber für die Trägerflüssigkeit durchlässig sind.
Alternativ können die Liposomsuspensionen in Medien ohne das Kontrastmittel hergestellt und danach die Vesikel durch Inkubation in Gegenwart einer konzentrierten Lösung des Kontrastmittels gefüllt werden. In diesem Falle erfolgt die Verkapselung über eine Transmembranpermeation. Ein Anpassen der Lipidendkonzentration erfolgt dann wie zuvor erläutert.
Die folgenden praktischen Beispiele veranschaulichen die Erfindung detaillierter:

Beispiel 1

Es wurde eine Lösung hergestellt, die 59 mg (0; 079 mmol) Dipalmitoylphosphatidylglycerin-Natriumsalz (DPPG-Na, Mw 744, 96, Sygena), 790 mg (1,0 mmol) Distearoylphosphatidylcholin (DSPC, Sygena) und 193 mg (0,5 mmol) Cholesterin (Fluka) in einer Mischung von 4 ml Methanol und 36 ml Chloroform enthielt. Die Lösung wurde mit einer sterilen Filtermembran mit einer Feinheit von 0,2 um (Macherey Nagel) filtriert und es wurde eine Tracer- Menge von ¹&sup4;C-Tripalmitin (10 ul in CHCl&sub3;; spezifische Aktivität 50 uCi/ml) als Marker zugesetzt. Die organischen Lösemittel wurden durch Eindampfen in einem Rotationsverdampfer (Rotavapor) bei 40ºC unter verringertem Druck entfernt und der Rückstand über Nacht bei derselben Temperatur unter einem Druck von 1 Torr getrocknet.
Dann wurde den trockenen Lipiden eine Menge Iomeprol (BRACCO) - Lösung 30 mg/ml = 260 mg Iod/ml) zugesetzt, so daß die erhaltene Lösung ungefähr (CLip) 15 mg Lipide/ml enthielt. Dann wurde die Lösung ungefähr eine halbe Stunde bei 80ºC unter sanftem Rühren erwärmt, um eine Hydratisierung der Lipide mit einer nachfolgenden Liposomvesikelbildung zu bewirken. Die Liposomsuspension wurde dann nacheinander 5-mal durch einen 2,0 um- Polycarbonatfilter, dann 5-mal durch einen 0,6 um-Polycarbonatfilter (Nuclepore-Membranen) extrudiert, um eine Normalisierung der Vesikelgrößen zu bewirken.
Um die Menge Iod zu bestimmen, die effektiv in den Liposomvesikeln verkapselt war, wurde ein 1 ml-Aliquot des filtrierten Präparats 10-12 h gegen 1 l PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung; PO&sub4; 10 mM, NaCl 0,9%) dialysiert (Dialysebeutel von Serva; Mw-Ausschluß 10000-15000). Der Dialysevorgang wurde einmal wiederholt, um sicherzustellen, daß alles freie, nicht-verkapselte Iod entfernt worden war. Zu der dialysierten Lösung (0,9 ml) wurden 0,1 ml einer 10% Natriumdodecylsulfatlösung zugesetzt und die Mischung wurde 5 min auf 40ºC erwärmt. Durch Messen der optischen Dichte dieser Lösung bei 260 nm, wurde in diesem Stadium bestimmt, daß das fertige Präparat 84,41 mg/ml Iomeprol enthielt, entsprechend 41,36 mg led pro ml. Die Menge von Lipiden, die in dem Präparat effektiv vorlag, wurde durch Messen der Radioaktivität der Probe unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationsanalysiergeräts (Packard 2200-CA, TRI-CARB®) bestimmt. Der gefundene Lipidkonzentrations (CLip)-Wert war 14,72 mg/ml, folglich war I/L 2,81.
In diesem Stadium wurde die Liposomsuspension auf einer Ultrafiltrationsmemberan (Amicon-Zelle) mikrofiltriert, um die Lipidkonzentration ungefähr zu verdoppeln (um sie auf ungefähr 30 mg/ml zu bringen).
Die mittlere Größe der Liposomvesikel und die Vesikelgrößenverteilung wurden durch ein Dynamic Light Scattering-Verfahren (DLS), das auch unter dem Namen "Photo Correlation Spectroscopy" (PCS) bekannt ist, unter Verwendung einer Malvern Mastersizer Ausrüstung (Malvern Instruments) oder eines Nicomp 370 HDL- NPSS bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß die mittlere Größe der meisten Vesikel in dem vorliegenden Präparat 0,4 um betrug mit weniger als 10% über 0,6 um und unter 0,2 um. Unter Verwendung eines Partikelzählers (COULTER Nanosizer) wurde festgestellt, das die mittlere Größe der Vesikel praktisch 0,4 um betrug, wobei sich weniger als ungefähr 20 Gew.-% der Vesikel nicht innerhalb des Bereichs von 0,35 bis 0,45 um befanden.
Die wie oben hergestellte, mit Iod beladene Liposomsuspension wurde Laborratten in der Dosis von ungefähr 1 ml/kg Tier (2,81 · 30 = 84 mg/kg Tier von verkapseltem Iod) injiziert und danach wurden die Tiere einer Röntgentomographie des Kreislaufs unterworfen. Es wurde über eine zufriedenstellende Abbildung der Blutgefäße berichtet einschließlich eines guten Kontrasts der linken Herzabschnitte. Die Bilderzeugung konnte für mehr als ungefähr 30 min durchgeführt werden, bevor das Verblassen des Kontrasteffekts signifikant wurde.

Beispiel 2

Fünfzig mg einer 9/1 (Molverhältnis) -Mischung von Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) und Dipalmitoylphosphatidylinositol (DPPI), gelöst in 2 ml einer Mischung (1/2) von MeOH und CHCl&sub3;, wurden in einen 5 ml-Kolben gegeben und bei 30ºC unter 20-30 Torr rotationsverdampft. Dann wurden 5,0 ml destilliertes Wasser zugesetzt und die Mischung wurde ungefähr 1/2 h bei 60ºC sanft bewegt. Die resultierende Liposomsuspension wurde dann wiederholt bei Raumtemperatur durch eine mikroporöse 0,6 um- Membran (Polycarbonat) extrudiert.
Zu der extrudierten Suspension wurden 5 ml einer konzentrierten wäßrigen Iopamidol-Lösung (520 g/l Iod, 1 g/l Tris und 0,34 g/l EDTA) gegeben. Die Mischung wurde ¹/&sub2; h bei 60ºC inkubiert, wodurch das gelöste Iod in die Liposomvesikel durch Transmembranpermeation eindrang, und man ließ die Suspension abkühlen. Nach Entfernen des nicht-eingeschlossenen Iods wie üblich (Zentrifugation oder Dialyse) und Ersetzen der Trägerflüssigkeit durch ein Pufferäquivalent, wurden die durchschnittliche Vesikelgröße und die Liposomgrößenverteilung durch übliche Maßnahmen bestimmt. Es wurden Werte von ungefähr 0,56 um mit weniger als 10% der Vesikel über 0,6 um und unter 0,2 um erhalten. Das I/L, das wie in dem vorigen Beispiel beschrieben gemessen wurde, betrug 4,1. Dieses Experiment zeigte, daß die Extrusion der Liposomen auch vor dem Füllen der Liposomvesikel mit Iod erfolgen kann.
Bei einer Injektion in Labortiere nach ungefähr 3-4-fachem Aufkonzentrieren durch Mikrofiltration ermöglichte das vorangegangene Präparat eine zufriedenstellende bildgebende Untersuchung der Blutgefäße durch Röntgen.
Gleich gute Ergebnisse wurden erhalten, wenn anstelle von Iopamidol Iohexol, Ioversol, Iopromid oder Iotrolan verwendet wurden.

Beispiel 3

Die folgende Mischung von Lipiden wurde in 20 ml organischem Lösemittel (18 ml CHCl&sub3; und 2 ml MeOH) gelöst:
Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) 379,8 mg (63,3 Mol-%)
Cholesterin 92,5 mg (31,7 Mol-%) Dipalmitoylphosphatidylglycerin-Na-Salz (DPPG-Na) 28,2 mg (5,0 Mol-%).
Die organische Lösung wurde mit einer 0,2 um-Polycarbonatfiltrationsmembran filtriert und ¹&sup4;C-Tripalmitin (50 uCi/g Lipid) wurde zugesetzt. Die Lösung wurde dann in einem Rundkolben unter Vakuum in einer Rotavapor-Apparatur (40ºC/< 1 Torr) 6 h eingedampft. Zu dem festen Rückstand wurden 32 ml einer konzentrierten Lösung (530 g/l) Iomeprol (CI = 260 mgl/l; CLip = 15 mg/ml) zugesetzt. Hydratisierung, Liposombildung und Iodverkapselung wurden durch sanftes Bewegen für 30 min bei 80ºC ausgeführt.
Die Liposomsuspension wurde dann nacheinander einer Reihe von Extrusionen durch Polycarbonatmembranen (Nuclepore®) verschiedener Porositätsgrade unterworfen, was zu vier Proben (1) bis (4) führte, wobei dies gemäß dem folgenden Protokoll erfolgte: Tabelle 1
Die spezifische Aktivität der vorangegangenen Proben (117087 dpm/mg Lipide) wurde gemessen, indem ein Aliquot genommen wurde, mit DIMILUME (Szintillationsflüssigkeit) gemischt und die Radioaktivität mittels eines BECKMANN LS-8100 Szintillationszählers gemessen wurde.
Die Vesikelgröße und Größenverteilung in den vorstehenden 4 Proben wurde unter Verwendung von einem der folgenden Partikelgrößenbestimmungssysteme gemessen: MALVERN Master Sizer und NICOMP Modell 370/HPL. Die Ergebnisse sind nachfolgend aufgeführt. Für die Proben (2) bis (4) war die Größenverteilung so, daß sich weniger als 20% (bezogen auf das Volumen) der Vesikel außerhalb des Bereichs von 0,2 bis 0,6 um befanden. Die I/L- Werte wurden unter Verwendung derselben Technik, die in Beispiel 1 beschrieben ist, gemessen.
Die Proben (1) bis (4) wurden hinsichtlich ihrer Lebensdauer nach einer Injektion in Labortiere getestet. Dafür wurden sie in die Schwanzvene von Sprague-Dawley-Ratten in der Dosis von 1 ml/kg Tier injiziert. Blutproben wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion gesammelt und auf Radioaktivität getestet; nach Abnahme der letzten Blutprobe Tabelle 2
* Dieser Wert ist hoch und spiegelt die Anwesenheit (obwohl von weniger als 20%) von Vesikeln einer größeren Größe als dem Nominalwert wieder.
(ungefähr 26 h nach dem Beginn) wurden einige der Tiere getötet und das Blut wurde in heparinisierten Röhrchen gesammelt wie auch die Organe, Lebern, Milzorgane und Lungen, die, nachdem sie getrocknet und gewogen worden waren, ebenso als Kontrollen analysiert wurden. Die Blutproben wurden, wie folgt, getestet: 0,3 ml Blut wurden mit 0,5 ml einer 1 : 1 "Soluene"-Isopropanol- Lösung gemischt, dann wurden nach 1 h Ruhe 0,25 ml H&sub2;O&sub2; (30%) zugesetzt, gefolgt von 10 ml Szintillationslösung (Hionic Fluor). Nach weiteren 6 h Ruhe im Dunkeln wurde die Radioaktivität mit einem Packard-Counter gemessen.
In Tabelle 3 ist für die Proben (1) bis (4) die Menge von Lipid (Liposomen) gezeigt, die im Blut für verschiedene Zeitspannen nach der Injektion verblieben, wobei diese Menge als % der injizierten Dosis ausgedrückt ist. Tabelle 3
Tabelle 4 enthält die Ergebnisse, die erhalten werden, indem man den Prozentsatz der injizierten Dosis nach einer bestimmten Zeit "t" im Kreislauf, wie in Tabelle 3 angegeben, mit dem Ausgangsverhältnis von I/L für die in Tabelle 2 präsentierten Proben multipliziert. Die Ergebnisse sind direkt proportional zu dem im Blut zum Zeitpunkt "t" noch vorhandenen Iod. Tabelle 4
Die Ergebnisse in den vorangegangenen Tabellen zeigen, daß die Beständigkeit der Vesikel im Blut in umgekehrtem Verhältnis zu deren Größe steht. So sind beispielsweise nach 1 h noch ungefähr 56% der anfänglich in das Blut injizierten 0,2 um-Vesikel vorhanden und nur 24% der 1 um-Vesikel, jedoch können Suspensionen, die Liposomen mit einer durchschnittlichen Größe von 1 um enthalten, für die bildgebende Untersuchung des Blutpools verwendet werden mit der Maßgabe, daß die Untersuchung unverzüglich nach der Verabreichung der Suspension an einen Patienten ausgeführt wird. In einigen Fällen kann dies sogar wünschenswert sein, da die Liposomen dieser Größe ein hohes I/L aufweisen. Es kann auch geschlossen werden, daß die 0,6 um- und 0,4 um-Vesikel für eine Bilderzeugung besonders interessant sind, da die Menge des beispielsweise nach 1 h noch im Kreislauf befindlichen Iods äußerst signifikant ist. Die Bedeutung des Beitrags der 0,4 um-vesikel zu dem Bestehenbleiben einer relativ hohen Iodkonzentration im Kreislauf ist nach 2 h besonders auffallend. Dies zeigt klar, daß die erfindungsgemäßen Formulierungen, die Vesikel im 0,2-0,6 um-Bereich enthalten, hervorragende Leistungseigenschaften hinsichtlich einer effektiven bildgebende Untersuchung des Blutpools mit verkapselten Kontrastmitteln liefern, und dies, ohne daß ein Einbringen von hochentwickelten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden" ("stealth") Faktoren erforderlich ist.
Das Diagramm der beigefügten Fig. 1 veranschaulicht auch die Ergebnisse dieses Beispiels, indem der Prozentsatz des Bestehenbleibens der anfänglichen injizierten Dosis gegen die Zeit für vier unterschiedliche Vesikelgrößen der Proben (1) bis (4) aufgetragen wird.

Beispiel 4

Vier auf eine Vesikelgröße von 0,4 um kalibrierte Liposomsuspensionen (A bis D) wurden gemäß den Anweisungen von Beispiel 3 unter Verwendung der folgenden Lipidformulierungen hergestellt:
(A) DSPC 340,9 mg (60 Mol-%); Cholesterin 84,0 mg (30 Mol-%); Palmitoylglucuronsäure (PGlcUA) von Nippon Fine Chemicals 30 mg (10 Mol-%).
(B) DSPC 244,1 mg (60 Mol-%); Cholesterin 59,8 mg (30 Mol-%); an Polyethylenglycol von Mw 2000 gebundenes Phosphatidylethanolamin (PE-PEG), hergestellt gemäß T. M. Allen et al., Biochim & Biophys. Acta 1066 (1991), 29-36, 147,2 mg (10 Mol- %).
(C) Formulierung identisch zu jener von Beispiel 1.
(D) DSPC (63,3 Mol-%); Cholesterin (31,7 Mol-%); Dipalmitoylphosphatidsäure-Natriumsalz (DPPA-Na) (5 Mol-%).
Die Suspensionen wurden denselben Prüfungen und Analysen, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, unterworfen, einschließlich Größenverteilung (weniger als 80% der Vesikel außerhalb des Bereichs von 0,4 um ± 10%); und I/L [(A) 0,85, (B) 1,54, (C) 2,81, (D) 2,5]. In diesem Zusammenhang ist die abträgliche Wirkung der den Formulierungen (A) und (B) beigemischten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") auf den I/L-Wert festzuhalten.
Die vier Suspensionen wurden Laborratten injiziert und das Blut wurde regelmäßig analysiert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Ergebnisse sind in dem Diagramm der beigefügten Fig. 2 angegeben, in dem der Prozentsatz der anfänglich injizierten Dosis gegen die Zeit genau wie in Fig. 1 aufgetragen ist.
Die Ergebnisse des Diagramms von Fig. 2 zeigen, daß die erfindungsgemäße Formulierung (Probe C) längere Verweilzeiten im Blut zeigt als die Formulierungen, die die anerkannten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") PE- PEG und PGlcUA des Standes der Technik (Probe A/PGlcUA & Probe B/PE-PEG) enthalten. Zusätzlich haben die Formulierungen, die mit den bekannten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") hergestellt worden sind, nicht nur geringere Verweilzeiten im Kreislauf, sondern die Liposomen dieser Formulierungen haben eine geringere Verkapselungskapazität.
Dementsprechend zeigen die vorliegenden Ergebnisse ganz im Gegensatz zu der Annahme, daß "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnde" ("stealth") Faktoren sogar erforderlich sind, wenn die Liposomen von sehr kleiner Größe sind (siehe M. C. WOODLE et al. und I. A. J. M. BAKKER-WOUDENBERG et al., Journal of Drug Targeting 2 (1994) 397-403 bzw. 363-371), daß dies nicht notwendig ist, vorausgesetzt, daß die eingesetzte Liposomen bestimmte Kriterien erfüllen. Diese unerwartete Feststellung wird dementsprechend als ein weiterer Beweis des Verdienstes der offenbarten Erfindung angesehen.
Die Ergebnisse zeigen auch die negative Wirkung der Anwesenheit von DPPA, d. h. eines Phospholipids mit zwei negativen Ladungen an dem Phosphorylrest. Es scheint wohl, daß alle Liposomformulierungen, die DPPA enthalten, schnell von dem RES aufgenommen werden.

Beispiel 5

Die vier nachfolgend angegebene Lipidformulierungen (E), (F), (G) und (H) wurden ausgewählt und jeweils unter Zusatz von radioaktivem Tracer in 4 ml einer 1 : 1-Mischung von CHCl&sub3; und Methanol gelöst:
(E) Hydriertes Sojalecithin (SPC-3) von Lipoid K. G., Deutschland, 71,9 mg (60 Mol-%); Cholesterin 17,8 mg (30 Mol-%; DPPG-Na 11,3 mg (10 Mol-%).
(F) SPC-3 71,8 mg (60 Mol-%); Cholesterin 17,7 mg (30 Mol-%); DPPG-Na 8,5 mg (7,5 Mol-%); DPPA-Na 2,6 mg (2,5 Mol-%).
(G) SPC-3 (57 Mol-%); Cholesterin (28,5 Mol-%); DPPA-Na (4,5 Mol-%); PE-PEG (10 Mol-%).
(H) Wie (G), aber das PE-PEG durch ein Moläquivalent PGIcUA ersetzt.
Die Lösungen wurden unter Vakuum von den Lösemitteln befreit und die Rückstände in entsprechende mit Iod beladene Liposomsuspensionen (E) bis (H) genau wie in Beispiel 3 beschrieben umgewandelt. Dann wurden sie durch Extrusion, wie zuvor beschrieben, auf eine enge 0,4 um-Größenverteilung normalisiert. Analysen auf spezifische Aktivität und I/L wurden ausgeführt wie üblich; die I/L-Werte waren 2,44 für (E), 2,39 für (F), 1,54 für (G) und 0,81 für (H).
Die Suspensionen wurden in Ratten getestet, wie in den vorigen Beispielen beschrieben, und die Ergebnisse, wie üblich in Fig. 3 aufgetragen, zeigen an, daß (E) im Blut, wie erwartet, langlebig, war. Der schnelle Abbau der Formulierung (F) zeigt die dramatische abträgliche Wirkung von DPPA auf die Vesikelstabilität im Kreislauf. Die Kurven (G) und (H) zeigen, daß durch das Einbringen der bekannten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden Faktoren" ("stealth factors") die negative Wirkung von DPPA nicht geheilt werden kann. Unter allen Umständen sollte die Anwesenheit von DPPA oder analogen Verbindungen in den erfindungsgemäßen Liposomsuspensionen vermieden werden.
Weitere Experimente wurden mit Formulierungen, die weniger DPPA (bis hinunter zu 1 Mol-%) und entsprechend mehr der vorerwähnten "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden" ("stealth") Faktoren PGlcUA und PE-PEG enthielten, ausgeführt; dennoch waren die Letztgenannten nicht in der Lage, der negativen Wirkung der DPPA entgegenzuwirken. Darüber hinaus kann ausgehend von den obigen I/L-Ergebnissen auch festgestellt werden, daß die herkömmlichen "schwere Wahrnehmbarkeit vermittelnden" ("stealth") Faktoren in den Formulierungen der Erfindung nachteilig sind, da sie dazu neigen, die Verkapselungskapazität der Vesikel zu verringern (das I/L-Verhältnis ist niedrig).
Wenn in den vorherigen Beispielen das DPPG durch eine äquivalente Menge von Diphosphatidylinositol (DPPI) ersetzt wird, haben die Liposomen nach einer Injektion eine äquivalente oder sogar längere Lebensdauer im Blut.

Beispiel 6

Eine Lösung von Lipiden, enthaltend 152 mg SPC-3 (63,3 Mol-%), 37 mg Cholesterin (31,7 Mol-%) und 11 mg DPPG. Na (5 Mol-%), wurde erhalten, indem die vorangegangenen Bestandteile einschließlich einer Tracer-Menge ¹&sup4;C-Tripalmitin (entsprechend 1310 dpm/mg Lipide) in einer Mischung von Methanol (2 ml) und Chloroform (18 ml) gelöst wurden. Nach Entfernen der flüchtigen Lösemittel mit dem Rotavapor bei 40ºC unter ungefähr 1 Torr und Trocknen über Nacht unter denselben Bedingungen blieb eine trockene Lipidmischung (~ 200 mg) im Kolben zurück. Diese trockene Lipidmischung wurde in einer Mischung von 20 ml CHCl&sub3; und 20 ml Diisopropylether gelöst und 6 ml einer 0,5 M Lösung von Gd-BOPTA (BRACCO) wurden danach zugesetzt. Die Mischung wurde auf 60ºC erwärmt und 3 min Ultraschall (Branson Sonifier) unterworfen; dann wurde sie erneut unter verringertem Druck in dem Rotavapor (60ºC) eingedampft, wodurch ein Rückstand erhalten wurde, der in 20 ml PBS dispergiert wurde. Das Eindampfen wurde fortgesetzt, bis die gesamten etherischen Lösemittel vollständig entfernt worden waren (geruchloser Rückstand).
Dann wurde die Liposomsuspension fünfmal durch eine 2 um- Membran und danach fünf weitere Male durch eine 1 um-Membran extrudiert. Ein Aliquot (5 ml) wurde über Nacht gegen 2 · 1 l PBS dialysiert und einer Analyse unterworfen, wie zuvor berichtet. Radioaktivitätszählung ergab, daß die Lipidkonzentration CLip in der Liposomsuspension 5,18 mg/ml betrug; die Gd-BOPTA- Konzentration in der Suspension, wie durch HPLC gemäß J. J. Hagan et al., Anal. Chem. 60 (1988), 514-516 (Fluorescence Detection of Gadolinium Chelates separated by Reverse-phase Highperformance Liquid Chromatography) nach Auflösen der Vesikel durch Zugabe von SDS bestimmt, betrug 8,07 mM, d. h. 1,56 mmol Gd/g Lipide. Die durchschnittliche Größe der Vesikel (Malvern) betrug 0,52 um ± 10%. Die dialysierte Suspension wurde danach auf ungefähr 30 mg Lipide/ml unter Verwendung einer Amicon- Ultrafiltrationszelle aufkonzentriert.
Bei einer Injektion in Labortiere ergab dieses Präparat einen brauchbaren Kontrast bei der bildgebenden Untersuchung des Kreislaufs durch MRI.

Beispiel 7

Eine Lösung von Lipiden wurde hergestellt, indem 114 mg SPC-3 (63,3 Mol-%), 28 mg Cholesterin (31,7 Mol-%) und 8 mg (5 Mol-%) DPPG. Na einschließlich einer Tracer-Menge ¹&sup4;C-Tripalmitin (entsprechend 1220 dpm/mg Lipide) in einer Mischung von MeOH (2 ml) und CHCl&sub3; (8 ml) gelöst wurden. Die Lösung wurde in einem Rotavapor bei 40ºC und bei ungefähr 1 Torr eingedampft, um die flüchtigen Lösemittel zu entfernen, und sie wurde über Nacht unter denselben Bedingungen getrocknet. Der trockene Rückstand (~ 150 mg Lipide) wurde mit 10 ml einer 0,5 M Lösung von Gadoteridol (ProHance®, BRACCO Diagnostic Inc.) gemischt und durch Erwärmen bei 65ºC für eine % h unter sanfter Bewegung hydratisiert. Dies ergab eine Suspension von MLV- (multilamellaren) - Liposomen, die danach fünfmal durch eine 2 um- Polycarbonatmembran und dann fünf weitere Mal durch eine 0,6 um-Membran extrudiert wurde. Ein 5 ml-Aliquot der normalisierten Suspension wurde über Nacht gegen 2 aufeinanderfolgende 1 1-Portionen PBS dialysiert und wie zuvor analysiert. Die Radioaktivitätszählung ergab eine Lipidkonzentration von 6,52 mg/ml. Die durchschnittliche Größe der Liposomvesikel (Malvern) wurde zu 0,44 um ± 10% ermittelt. Die Gadoteridolkonzentration in der Suspension (zu 20,67 mM bestimmt) wurde durch HPLC nach Auflösen der Vesikel in einer Probe durch die Zugabe von SDS bestimmt; dies entsprach einem Verhältnis mmol Gd/g Lipide von 3,17 und einer Verkapselungskapazität Ec von 6,3 ul/mg Lipide (die theoretische Verkapselungskapazität von 0,44 um-Vesikeln ist gleich 13 ul/mg).
Die Hauptmenge der Suspension wurde wie oben dialysiert und danach auf ungefähr 40 mg Lipide/ml (CLip) unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationszelle aufkonzentriert. Nach Injektion in Labortiere unter den zuvor offenbarten Bedingungen ermöglichte sie die Bereitstellung nützlicher Kontrasteffekte bei der MIR des Kreislaufs.
In nachfolgenden Experimenten wurde die Gadoteridolkonzentration in der Suspension nach einem Auflösen der Vesikel in einer Probe wie oben zu 30,18 mM bestimmt, was einem Verhältnis mmol Gd/g Lipide von 4,63 und einer Verkapselungskapazität Ec von 9,2 um/mg Lipide entspricht.

Claims

1. MRT- oder Röntgenblutpoolkontrastmittel enthaltend eine injizierbare wäßrige Suspension von Liposomvesikeln in einer Trägerflüssigkeit, wobei die Vesikel darin verkapselte Lösungen von iodierten Röntgenopazität verleihenden Verbindungen oder auf NMR ansprechenden, paramagnetischen Substanzen enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß

(a) das Verhältnis der Verkapselungskapazität Ec des eingeschlossenen Volumens an Verbindung in 1/mg Lipid der Vesikel zur Größe D mindestens 25 oder mehr beträgt, wobei D der durchschnittliche Durchmesser der Vesikel in m ist;

(b) die liposombildenden Lipide zwischen 80 und 99 Mol- % neutrale Phospholipide und 1 bis 20 Mol-% negativ geladene Phospholipide enthalten, deren Phosphatidylreste an Glycerin gebunden sind, wobei die negativ geladenen Phospholipide unter einem oder mehreren von Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Distearoylphosphatidylglycerin (DSPG) und den entsprechenden Lipiden, in denen das Glycerin durch Inositol ersetzt ist, ausgewählt sind;

(c) mindestens 80 Vol.-% der Liposomvesikel in der Suspension Liposomen mit einer Größe im Bereich von 0,2 bis 1,0 m sind; und

(d) abhängig von der Liposomgröße die maximale Lipidkonzentration (CLip) in der Suspension zwischen 20 und 100 mg/nl ist.

2. Blutpoolkontrastmittel gemäß Anspruch 1, in dem für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 m die maximale Lipidkonzentration kleiner als 100 mg/ml ist, für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,4 m die maximale Lipidkonzentration kleiner als 50 mg/ml ist, und für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,6 m die maximale Lipidkonzentration kleiner als 33 mg/ml ist, für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,8 m die maximale Lipidkonzentration kleiner als 25 mg/ml ist und für Liposomen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1,0 m die maximale Lipidkonzentration 20 mg/ml ist.

3. Blutpoolkontrastmittel gemäß Anspruch 1, in dem die Größe von mindestens 80 Vol.-% der Liposomvesikel in der Suspension im Bereich von 0,2 bis 0,6 m liegt.

4. Blutpoolkontrastmittel gemäß Anspruch 1, in dem die negativ geladenen Phospholipide in einer Menge von 3 bis 15 Mol-% vorhanden sind.

5. Blutpoolkontrastmittel gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, in dem die Viskosität unter 50 mPa·S, vorzugsweise unter 25 mPa·S liegt.

6. Blutpoolkontrastmittel gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die neutralen Lipide unter einem oder mehreren der hydrierten Sojalecithine, Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) ausgewählt sind.

7. Blutpoolkontrastmittel gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, in dem die Röntgenopaziät verleihenden Verbindungen unter Iopamidol, Iomeprol, Iohexol, lopentol, Iopromid, Iosimid, Ioversol, Iotrolan, Iotasul, lodixanol, Iodecimol, 1,3-Bis-(N-3,5-bis-[2,3-dihydroxypropylaminocarbonyl]-2,4, 6-triiod-phenyl)-N-hydroxy-acetylamino)- propan und Mischungen davon ausgewählt sind.

8. Blutpoolkontrastmittel gemäß Anspruch 7, in dem die Konzentration der iodierten Opazität verleihenden Verbindung, die zur Blutpooltomographie verfügbar ist, zwischen 50 und 120 g Iod/l liegt.

9. Blutpoolkontrastmittel gemäß Anspruch 7, in dem die Menge der iodierten Opazität verleihenden Verbindung, die sich eine Stunde nach der Injektion noch im Kreislauf befindet, etwa 50% der injizierten Dosis beträgt.

10. Blutpoolkontrastmittel gemäß Anspruch 7, in dem die Menge der iodierten Opazität verleihenden Verbindung, die sich zwei Stunden nach der Injektion noch im Kreislauf befindet, etwa 40% der injizierten Dosis beträgt.

11. Blutpoolkontrastmittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, in dem die paramagnetischen Substanzen unter Gd-DTPA, Gd-BOPTA, Gd-DTPA-BMA, Gd-DOTA und Gd-DO3A ausgewählt sind.

12. Verfahren zur Herstellung eines Blutpoolkontrastmittels gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, gekennzeichnet durch die Schritte:

(a) Verkapseln einer konzentrierten Lösung von Kontrastmittel in Vesikeln, die gemäß Liposomherstellungsmöglichkeiten aus einer Lipidmischung gebildet sind, die neutrale Phospholipide und negativ geladene Phospholipide, deren Phosphatidylrest an Glycerin gebunden ist, und gegebenenfalls weitere Additive enthält,

(b) Normalisieren der Vesikel durch wiederholte Extrusion durch kalibrierte, semi-permeable Membranen, bis die Größe von mindestens 80% der Vesikel zwischen 0,2 und 1,0 m liegt, und gegebenenfalls Abtrennen der Vesikel mit dem darin verkapselten Kontrastmittel von dem nicht verkapselten Kontrastmittel und

(c) Einstellen der Menge des Trägers in der Suspension, so daß die Lipidkonzentration (CLip in mg/ml) darin einen Wert nicht überschreitet, der durch das Verhältnis 20/D gegeben ist, wobei D der durchschnittliche Volumendurchmesser der Vesikel in m ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, in dem die Größe von mindestens 80% der Vesikel zwischen 0,2 und 0,6 m liegt.

14. Verfahren nach Anspruch 12, in dem die Reihenfolge der Schritte (a) und (b) umgekehrt und der Verkapselungsschritt durch Transmembranpermeation bewirkt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12, in dem das Additiv Cholesterin ist.

16. Blutpoolkontrastmittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Verwendung bei bildgebenden Untersuchungen von menschlichen und tierischen Patienten.