DE68916956T2

DE68916956T2 - Aktives mittel: lipid-komplex mit hohem verhältnis.

Info

Publication number: DE68916956T2
Application number: DE68916956T
Authority: DE
Inventors: Lawrence Boni; Andrew Janoff; Sharma Minchey; Walter Perkins; Kathy Stewart; Christine Swenson
Original assignee: Liposome Co Inc
Current assignee: Elan Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1988-05-20
Filing date: 1989-05-22
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2009-05-23
Also published as: EP0414806A1; EP0414806A4; EP0414806B1; DE68916956D1; JPH03504382A; WO1989011272A1; ATE108651T1

Description

Diese Anmeldung ist eine Continuation-in-Part-Anmeldung der parallel anhängigen, am 20. Mai 1988 eingereichten U.S. Patentanmeldung mit der fortlaufende Nummer 196 913.

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung befaßt sich mit Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid-Komplexen, ihrer Herstellung und Verwendung. Besonders erwähnt sei ein Cephalosporin:Lipid-Komplex und ein iodiertes Kontrastmittel:Lipid-Komplex. Ganz besonders wird ein Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplex offenbart, der ein rigides Lipid und ein Cephalosporin umfaßt. Ein Verfahren zur Herstellung von Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid-Komplexen wird ebenfalls offenbart. Weiter wird die Verwendung des Cephalosporin:Lipid-Komplexes in der bakteriellen Prophylaxe und besonders in der Bakteriämie-Prophylaxe offenbart, die ein Verfahren zur Prävention bakterieller Infektionen in einem Tier über einen ausgedehnten Zeitraum einschließt, daß den Schritt der Verabreichung des Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid- Komplexes an das genannte Tier umfaßt. Eine Ausführungsform dieser Erfindung schließt eine solche Prophylaxe ein, bei der das verfügbare Arzneimittelniveau von wenigstens ungefähr der minimalen Hemmkonzentration über einen ausgedehnten Zeitraum aufrechterhalten wird. Eine weitere Ausführungsform besteht in der Verwendung eines Hochverhältnis-iodiertes Kontrastmittel-:Lipid-Komplexes in Röntgen-Anwendungen.

Hintergrund der Erfindung

Ein grundlegendes Element in der Praxis therapeutischer Mittel besteht in der Verabreichung aktiver Mittel an zu behandelnde Personen. In vielen Situationen besteht das Problem der Verabreichung darin, in effizienter Weise genügend aktives Mittel an der Wirkungsstelle abzugeben. Die Liposomeinkapselung bietet in einigen Fällen eine wirksame Abgabe aktiver Mittel. Die wirksamen Mittel wurden jedoch vor allem nicht effizient oder in nicht genügend hohen Konzentrationen abgegeben oder in Konzentrationen, die relativ zum begleitenden Lipid, mit einer exzessiven Lipidverabreichung verbunden war. Ein Verfahren zur Bildung eines Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid:Komplexes ist daher von großer Bedeutung.
Aktive Mittel (auch als bioaktive Mittel bezeichnet) sind zum Beispiel: ein Arzneimittel, Hormone, Proteine, Farbstoffe, Vitamine oder bildgebende Mittel. Der Ausdruck aktives Mittel, wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist so zu verstehen, daß er jede Verbindung mit biologischer Wirkung einschließt; z.B. Arzneimittel und andere therapeutische Mittel, wie Peptide, Hormone, Toxine, Enzyme, Neurotransmitter, Lipoproteine, Glycoproteine, Immunomodulatoren, Immunoglobuline, Polysaccharide, Zellrezeptorbindungsmoleküle, Nukleinsäuren, Polynukleotide und ähnliche, ebenso wie biologische Markierungssubstanzen, wie Farblösungen, Radioopaque Mittel oder Radiokontrastmittel für Röntgenbilder (zusammen "Kontrastmittel") und fluoreszierende Mittel.
Die prophylaktische Verwendung antimikrobieller Mittel ist ein breit diskutiertes Feld der pharmazeutischen Behandlung, z.B. "Prophylaktische Anwendung antimikrobieller Mittel bei erwachsenen Patienten", Mayo Clin Proc, 62: 1137-1141 (1987). In geeigneten Fällen wurden rheumatisches Fieber, Beulenpest, Malaria und andere Erkrankungen Prophylaktisch behandelt. Ein besonders gut bekannter Bereich der antimikrobiellen, und besonders der antibakteriellen Prophylaxe ist die präoperative Anwendung antimikrobieller Mittel. Im allgmeinen war es eine Begleiterscheinung der chirurgischen Prophylaxe, daß das antimikrobielle Mittel nur während oder höchstens nicht mehr als ca. drei Stunden vor der Operation verabreicht wurde.
Ein zentraler Gesichtspunkt der Verabreichung in der prophylaktischen Arzneimitteltherapie ist die Fähigkeit und Leichtigkeit, mit der eine "minimale Hemmkonzentration" ("MHK") eines einzelnen antimikrobiellen Mittels errichtet und die Zeitspanne, über die ein solches Niveau in einem Tier aufrechterhalten werden kann. Die MHK wird definiert als das niedrigste Niveau eines einzelnen antimikrobiellen Mittels (ob antibakterielles, antiinfektiöses oder ein anderes Mittel), das die Proliferation des behandelten pathogenen Organismus verhindert. Eine MHK kann in einer physiologischen Flüssigkeit, wie der cerebrospinalen Flüssigkeit, im Serum oder Plasma oder in Geweben und vor allem in Geweben am Ort der Infektion (wie dem reticuloendothelialen System in disseminierten Infektionen) errichtet werden.
Gewöhnlich wird die MHK für einen besonderen Organismus in einem in vitro-System gemessen und ausgedrückt als Menge des Arzneimittels (pro Gewicht) pro Menge (gewöhnlich Volumen) des Materials, in dem das Arzneimittel verteilt ist. Damit das Arzneimittel eine therapeutische oder prophylaktische Wirkung in vivo ausübt, wird es gewöhnlich erforderlich sein, daß die Konzentration eines solchen Arzneimittels in vivo gleich oder größer als die in vitro gemessene MIC ist. Weiterhin, je höher die Konzentration des Arzneimittels über der MHK liegt, und je länger der Zeitraum ist, in dem das in vivo-Arzneimittelniveau die MHK übersteigt, um so größer ist die therapeutische Reaktion.
Um den Zeitparameter auszudrücken, während dem die in vivo-Plasmakonzentration eines Antibiotikums gleich oder über der MHK des Krankheitserregers liegt, wird der Ausdruck T größer als MHKp verwendet und als Tp geschrieben.
Um den Zeitparameter auszudrücken, während dem die in vivo-Gewebekonzentration eines Antibiotikums gleich oder über der MHK des Krankheitserregers liegt, wird der Ausdruck T größer als MHKt verwendet und als Tt geschrieben.
Liposome sind vollständig geschlossene molekulare Lipid- Doppelschicht-Membranen, die ein eingeschlossenes wässriges Volumen enthalten. Liposome können unilamellare Vesikel (die eine einfache molekulare Membran-Doppelschicht besitzen) oder multilamellare Vesikel sein (zwiebelartige Strukturen, charakterisiert durch multiple molekulare Membran-Doppelschichten, die jeweils durch eine wässrige Schicht von der nächsten getrennt sind). Die molekulare Doppelschicht ist aus zwei Lipidmonoschichten zusammengesetzt, die einen hydrophoben "Schwanz"- Bereich und einen hydrophilen "Kopf"-Bereich aufweisen. Die Struktur der molekularen Membran-Doppelschicht ist derart, daß sich die hydrophoben (unpolaren) "Schwänze" der Lipidmonoschichten zum Zentrum der molekularen Doppelschicht hinorientieren, während sich der hydrophile "Kopf" zur wässrigen Phase hinorientiert.
Die ursprüngliche Liposomherstellung von Bangham et al. (J. Mol. Biol., 1965, 12:238-252) beinhaltet das Suspendieren von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel, das dann zur Trockene abgedampft wird, wobei ein Phospholipidfilm auf dem Reaktionsgefäß zurückbleibt. Dann wird eine geeignete Menge wässriger Phase hinzugegeben, die Mischung wird dann "quellen" gelassen, und die resultierenden Liposome, die aus multilamellaren Vesikeln (MLVs) bestehen, werden durch mechanische Hilfen dispergiert. Diese Technik stellt die Grundlage für die Entwicklung der kleinen beschallten unilamellaren Vesikel, beschrieben durch Papahadjopoulos et al. (Biochem. Biophys., Acta., 1968, 135:624-638), und großer unilamellarer Vesikel bereit.
Unilamellare Vesikel können unter Verwendung eines Extrusionsapparates durch ein von Cullis et al. beschriebenes Verfahren, PCT-Anmeldung Nr. WO 86/00238, veröffentlicht am 16. Januar 1986 mit dem Titel "Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles", die hier als Referenz enthalten ist, hergestellt werden. Durch diese Technik hergestellte Vesikel, LUVETS genannt, werden unter Druck durch einen Membranfilter extrudiert. LUVETs mit gewöhnlich ca. 500 nm oder weniger Durchmesser und häufig mit 100 nm Durchmesser sind bevorzugte Liposome dieser Erfindung. LUVETs sind 50 zu verstehen, daß sie in dem Ausdruck "unilamellare Vesikel" eingeschlossen sind.
Eine weitere Klasse von Liposomen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind solche, die durch eine, im wesentlichen gleiche, lamellare Verteilung des Gelösten charakterisiert sind. Diese Klasse von Liposomen wird als stabile plurilamellare Vesikel (SPLV) bezeichnet, wie sie im U.S. Patent Nr. 4.522.803 von Lenk et al. definiert sind, als monophasische Vesikel, wie sie im U.S. Patent Nr. 4.558.579 von Fountain et al. beschrieben sind, und als gefrorene und aufgetaute multilamellare Vesikel (FATMLV), worin die Vesikel wenigstens einem Gefrier- und Auftauzyklus ausgesetzt werden; dieses Verfahren wird in Bally et al., PCT-Veröffentlichung Nr. 87/00043, 15. Januar 1987, mit dem Titel "Multilamellar Liposomes Having Improved Trapping Efficiencies", beschrieben. Der bedeutende Teil dieser Dokumente ist hier als Referenz enthalten.
Liposome mit einem Durchmesser von ca. 500 nm oder weniger werden als "kleine Liposome" bezeichnet. Ähnlich werden die Cephalosporin:Lipid-Komplexe dieser Erfindung als "klein" bezeichnet, wenn sie einen Durchmesser von ca. 500 nm oder weniger aufweisen. Der Durchmesser in der Beschreibung einer Population von Liposomen oder Vesikeln ist derart zu verstehen, daß ein Bereich von Durchmessern gemeint ist.
Die Cephalosporin:Lipid-Komplexe dieser Erfindung liegen in der Form von Liposomen bei niedrigen Arzneimittel zu Lipid- Verhältnissen vor. Bei höheren Arzneimittel zu Lipidverhältnissen scheinen die Komplexe die molekulare Doppelschichtorganisation beizubehalten, in elektronenmikroskopischen Aufnahmen können sie jedoch anders als vollständig geschlossen erscheinen. Der Ausdruck "Komplex" ist so zu verstehen, daß er beides, Liposome ebenso wie die Cephalosporin-Lipid-Einheiten mit höherem Verhältnis umfaßt, selbst wenn solche Einheiten sich von den Liposomen darin unterscheiden, daß sie unvollständig geschlossene molekulare Doppelschichten oder andere Anomalitäten aufweisen.
Als ein Aspekt dieser Erfindung bilden iodierte Kontrastmittel ebenfalls Komplexe mit Lipiden und zeigen hohe Einfangvolumina von bis zu ca. 20 µl/µmol Lipid. Diese scheinen in der Form von Liposomen vorzuliegen und sind hauptsächlich unilamellar und gleichmäßig in der Größe von ca. 0,5 Mikrometer. Vor dieser Erfindung wurden Kontrastmittel:Lipid-Verhältnisse von ca. 2,7:1 bei nichtionischen iodierten Kontrastmitteln und 1:1 bei negativ geladenen iodierten Kontrastmitteln (z.B. Amidotrizoat) berichtet.
Während der vergangenen zehn Jahre gab es zahlreiche Gruppen, die versuchten, partikuläre Kontrastmittel zu entwickeln, die speziell die Organe des RE-Systems trüben würden, S.E. Seltzer, Liposomes as Drug Carriers, G. Gregoriadis, ed., S. 509-525 (John Wiley and Sons Ltd. New York 1988). Eine solche Anwendung beinhaltet den Nachweis von metastatischen Schädigungen der Leber durch Röntgen-Computertomographie (CT). Gewöhnlich wird einem Patienten ein wasserlösliches Kontrastmittel vor dem CT-Scanning gegeben; da jedoch das Mittel im wesentlichen gleichen Zugang zu beidem, dem normalen und dem Tumorgewebe hat, gibt es einen, wenn überhaupt, minimalen Kontrast zwischen den beiden Geweben. Wenn dem Patienten jedoch ein partikuläres Kontrastmittel gegeben würde, würden die Kupffer-Zellen der Leber das Mittel phagocytieren, wobei die Zellen zur Undurchsichtigkeit gebracht würden und die Tumorzellen dunkel zurückblieben. Verschiedene partikuläre Mittel wurden entwickelt und beim Menschen verwendet, jedoch weisen diese Mittel einige damit verbundene Toxizitäten auf, vermutlich infolge ihrer ausgedehnten Verweilzeit im Gewebe. Über partikuläre Kontrastmittel wurde berichtet in Z. Cohen et al., J. Compt. Assist. Tomogr., 5:843-7 (1981); D.L. Miller et al., AJR, 143:235-243 (1984); M.A. Longino et al., J. Comput. Assist. Tomogr., 7:775-9 (1983); R.F. Mattrey et al., Radiology, 145:755-8 (1983); M.R. Violante et al., Invest. Radiol., 16:40-5 (1981). Ein anderes Mittel, um partikuläre Kontrastmittel zu erhalten, ist der Einschluß des Mittels in Liposomen, H.A. Havron et al., Radiology, 140:507-11 (1981). Die in diesen Präparaten erforderliche Lipiddosis ist für die Verabreichung an Menschen zu hoch. Das höchste Iod:Lipid- Verhältnis, von dem in der Literatur für Amidotrizoat als dem verbreitetesten Kontrastmittel berichtet wurde, beträgt ca. 1:1 (w/w).
In einigen Anwendungen wird das Zusammenmischen des Lipids mit Cholesterol den Einschluß des Cephalosporins vermindern. Dies ist potentiell das Ergebnis der Verteilung von Cholesterol in der Lipid-molekularen Doppelschicht und der Verminderung der Rigidität der molekularen Doppelschicht. Lipide werden dadurch charakterisiert, daß sie eine hydrophobe "Schwanz"-Region und eine hydrophile "Kopf"-Region aufweisen. Die Struktur dieser molekularen Doppelschicht-Membran ist derart, daß die hydrophoben (unpolaren) "Schwänze" der molekularen Lipiddoppelschichten sich zum Zentrum der molekularen Doppelschicht hinorientieren, während sich die hydrophilen "Köpfe" zur wässrigen Phase hinorientieren. Die Schwanz-Region kann aus Fettacylketten (auch als Kohlenstoffketten bezeichnet) oder aus einer einzelnen solchen Kette, wie im Falle des Alpha-Tocopherol-Hemisuccinats, bestehen. Beispiele für Lipide sind die Phospholipide, wie Phosphatidylcholin (PC) (Ei-Phosphatidylcholin wird als EPC bezeichnet), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylglycerol (PG), Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinositol (PI), Sphingomyelin (SPM) und ähnliche, allein oder in Kombination und besonders in hydrierter oder gesättigter Form der Kohlenstoffkette. Die Phospholipide können synthetisch oder aus natürlichen Quellen wie Ei oder Soya gewonnen werden. Synthetische Phospholipide schließen ein: Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG). Die bevorzugten Lipide dieser Erfindung sind diejenigen mit gesättigten Kohlenstoffketten mit einer Länge von mindestens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten, ebenso wie Nichtphospholipide wie Digalaktosyldiglycerid. Sie können auch organische Säurederivate von Sterolen, wie Cholesterolhemisuccinat (CHS) und ähnliche enthalten. Organische Säurederivate von Tocopherol können auch als liposombildende Bestandteile verwendet werden, wie Alpha-Tocopherolhemisuccinat (THS). Beide, CHS- und THS- enthaltende Liposome und deren Tris-Salzformen können im allgemeinen durch jedes im Stand der Technik bekanntes Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die diese Sterole enthalten, hergestellt werden. Siehe insbesondere die Verfahren von Janoff et al., U.S.-Patent Nr. 4.721.612, herausgegeben am 26. Januar 1988, mit dem Titel "Steroidal Liposomes", bzw. Janoff et al., PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/02219, veröffentlicht am 23. April 1987, mit dem Titel "Alpha-Tocopherol Based Vesicles", eingereicht am 24. September 1986. Zusätzlich bekannte Lipide sind Glycolipide.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein weiter Aspekt dieser Erfindung präsentiert ein Verfahren zur Herstellung eines Hochverhältnis-aktives Mittel :-Lipid-Komplexes, der ein Lipid und ein aktives Mittel umfaßt, das den Schritt des Eindampfens zur Monophase - im wesentlichen aber nicht zur Trockene - einer Mischung von Lipid und aktivem Mittel in einem monophasischen Lösungsmittel-System umfaßt, das eine wässrige Phase, ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel und ein Lipid umfaßt.
Genauer stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 bereit.
Diese Erfindung beinhaltet einen Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplex, der ein Lipid und ein Cephalosporin umfaßt, und in einer Ausführungsform ist das Lipid ein rigides Lipid, wie eines, worin das Lipid aus einer Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten besteht, wobei die Ketten gesättigt sind und eine Länge von mindestens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten aufweisen. Ein rigides Lipid ist Dipalmitoylphosphatidylcholin.
In besonderen Ausführungsformen des Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplexes bestehen mindestens 20%, 30%, 40% oder 50% des Komplexes aus Cephalosporin (w/w - was das Gewicht der Komponente im Verhältnis zum Gesamtgewicht bezeichnet). In einer Ausführungsform ist das Lipid Dipalmitoylphosphatidylcholin und beträgt potentiell bis zu ca. 80% (w/w) des Komplexes. In noch einer anderen Ausführungsform des Cephalosporin:Lipid-Komplexes umfaßt das Lipid eine Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten; die genannten Ketten sind gesättigt und weisen eine Länge von wenigstens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten auf.
In besonderen Ausführungsformen ist das Cephalosporin des Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplexes Cefazolin, Cephapirin, Cephalotin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium, besonders Cefazolin.
Die Erfindung beinhaltet auch ein Verfahren zur Herstellung eines Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid:Komplexes der ein rigides Lipid und ein Cephalosporin umfaßt, das den Schritt des Abdampfes zur Monophase - aber im wesentlichen nicht zur Trockene - einer Mischung eines rigiden Lipids und eines Cephalosporins in einem monophasischen Lösungsmittel-System umfaßt, das eine wässrige Phase, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel und ein Lipid umfaßt. In einer Verkörperung des Verfahrens besteht das monophasische Lösungsmittel-System ungefähr zu gleichen Mengen (v/v) aus (a) einer wässrigen Phase eines Arzneimittels, (b) Ethanol und (c) Chloroform und dem genannten Lipid.
In einer besonderen Ausführungsform umfaßt das Verfahren den Schritt der Abdampfens zur Monophase - aber im wesentlichen nicht zur Trockene - einer Mischung des genannten Lipids und des Cephalosporins in einem Lösungsmittelsystem, das ungefähr gleiche Mengen (v/v) wässriger Phase (Arzneimittel-und-Lipid) :-Ethanol:Chloroform umfaßt, und schließt das Abdampfens des Lösungsmittels bei Überdruck und ca. 30ºC bis ca. 37ºC ein. In der Ausübung einer Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt das Verfahren ca. zwei Verabreichungen pro Tag oder weniger. In weiteren Ausführungsformen umfaßt das Verfahren die Aufrechterhaltung eines verfügbaren Cephalosporin-Niveaus von mindestens der minimalen Hemmkonzentration ("MHK") des Cephalosporins in einem Tier über einen ausgedehnten Zeitraum, und speziell, worin das Cephalosporin-Niveau mindestens ca. viermal der MHK entspricht. In einigen Ausführungsformen wird die MHK als Blutplasma-, Serum-Niveau oder als Gewebe-Niveau gemessen. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Verabreichung intramuskulär, intraperitoneal, intravenös oder subkutan. In der Ausübung dieses Verfahrens kann das Cephalosporin irgendeines oder alle aus Cefazolin, Cephapirin, Cephalotin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium umfassen. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens, worin das Cephalosporin Cefazolin umfaßt, umfaßt das Verfahren weiterhin das Verabreichen des genannten Cefazolins bei einer Dosierung von ca. 20-150 mg Grundgewicht pro Kilogramm Tiekörpergewicht pro Tag, oder das aufrechterhaltene verfügbare Cephalosporin-Niveau des Cefazolins beträgt mindestens ca. 0,5, 5 oder 50 µg (Grundgewicht)/ml Plasma oder mindestens ca. 5 µg (Grundgewicht)/mg Gewebe (RES- Gewebe wie Leber oder Milz).
In besonderen Ausführungsformen des Verfahrens enthält der resultierende Cephalosporin:Lipid-Komplex mindestens ca. 30%, 40% oder 50% (w/w) Cephalosporin. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens besteht das Lipid aus einer Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten, wobei die genannten Ketten gesättigt sind und eine Länge von wenigstens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten aufweisen, oder das Lipid Dipalmitoylphosphatidylcholin ist und bis zu 80% (w/w) des Komplexes ausmacht. In der Ausführung des Verfahrens ist das Cephalosporin in besonderen Ausführungsformen Cefazolin, Cephapirin, Cephalotin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium und besonders Cefazolin.
Das Verfahren dieser Erfindung schließt weiter noch ein Verfahren zur bakteriellen Infektionsprophylaxe in einem Tier, einschließlich des Menschen, ein, das den Schritt der Verabreichung an das genannte Tier in einer zur bakteriellen Infektionsprophylaxe wirksamen Menge des Cephalosporin: Lipid-Komplexes umfaßt, und eine Ausführungsform, worin der Komplex ein Hochverhältnis Cephalosporin:Lipid-Komplex ist, und das Lipid ein rigides Lipid ist.
Eine besondere Ausführungsform des Prophylaxe-Verfahrens dieser Erfindung betrifft die Bakteriämie. In der Ausübung einer Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt das Verfahren zwei Verabreichungen pro Tag oder weniger. In weiteren Ausführungsformen umfaßt das Verfahren das Aufrechterhalten eines verfügbaren Cephalosporin-Niveaus von mindestens der minimalen Hemmkonzentration ("MHK") des Cephalosporins in einem Tier über einen ausgedehnten Zeitraum, und speziell, worin der Cephalosporin-Niveau mindestens ca. viermal der MHK entspricht. In einigen Ausführungsformen wird die MHK als Blutplasma- oder Serum-Niveau oder Gewebe-Niveau gemessen. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Verabreichung intramuskulär, intraperitoneal, intravenös oder subkutan. In der Ausübung dieses Verfahrens kann das Cephalosporin irgendeines oder alle aus Cefazolin, Cephapirin, Cephalotin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium umfassen. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens, worin das Cephalosporin Cefazolin umfaßt, umfaßt das Verfahren weiterhin das Verabreichen des genannten Cefazolins bei einer Dosierung von ca. 20-150 mg Grundgewicht pro Kilogramm Tierkörpergewicht pro Tag, oder das aufrechterhaltene verfügbare Cephalosporin-Niveau des Cefazolins beträgt mindestens ca. 0,5, 5 oder 50 µg (Grundgewicht)/ml Plasma oder mindestens ca. 5 µg (Grundgewicht)/mg Gewebe (RES-Gewebe wie Leber oder Milz).
In besonderen Ausführungsformen des Verfahrens enthält der resultierende Cephalosporin:Lipid-Komplex mindestens ca. 30%, 40% oder 50% (w/w) Cephalosporin. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens besteht das Lipid aus einer Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten, wobei genannte Ketten gesättigt sind und eine Länge von wenigstens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten aufweisen, oder das Lipid ist Dipalmitoylphosphatidylcholin und macht bis zu 80% (w/w) des Komplexes aus. In der Ausübung des Verfahrens ist das Cephalosporin in besonderen Ausführungs formen Cefazolin, Cephapirin, Cephalotin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium und besonders Cefazolin.
Eine besondere Ausführungsform des prophylaktischen Verfahrens dieser Erfindung betrifft disseminierte bakterielle Infektionen, die das reticuloendotheliale System beinhalten. In der Ausübung einer Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt das Verfahren zwei Verabreichungen pro Tag oder weniger. In weiteren Ausführungsformen umfaßt das Verfahren das Aufrechterhalten eines verfügbaren Cephalosporin-Niveaus von mindestens der minimalen Hemmkonzentration ("MHK") des Cephalosporins in einem Tier über einen ausgedehnten Zeitraum, und speziell, worin der Cephaloporin-Niveau mindestens ca. viermal der MHK entspricht. In einigen Ausführungs formen wird die MHK als Blutplasma- oder Serum-Niveau oder Gewebe-Niveau (wie RES-Gewebe, z.B. Leber oder Milz) gemessen. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Verabreichung intramuskulär, intra-peritoneal, intravenös oder subkutan. In der Ausübung dieses Verfahrens kann das Cephalosporin irgendeines oder alle aus Cefazolin, Cephapirin, Cephalotin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium umfassen. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens, worin das Cephalosporin Cefazolin umfaßt, umfaßt das Verfahren weiterhin das Verab-reichen des genannten Cefazolins bei einer Dosierung von ca. 20-150 mg Grundgewicht pro Kilogramm Tierkörpergewicht pro Tag, oder das aufrechterhaltene verfügbare Cephalosporin-Niveau des Cefazolins beträgt mindestens ca. 0,5, 5 oder 50 µg (Grundgewicht)/ml Plasma oder mindestens ca. 5 µg (Grundgewicht)/mg Gewebe (RES-Gewebe wie Leber oder Milz).
In besonderen Ausführungsformen des Verfahrens enthält der resultierende Cephalosporin:Lipid-Komplex mindestens ca. 30%, 40% oder 50% (w/w) Cephalosporin. In einigen Ausführungsformen des Verfahrens besteht das Lipid aus einer Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten, wobei die genannten Ketten gesättigt sind und eine Länge von wenigstens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten aufweisen, oder das Lipid Dipalmitoylphosphatidylcholin ist und bis zu 80% (w/w) des Komplexes ausmacht. In der Ausübung des Verfahrens ist das Cephalosporin in besonderen Ausführungsformen Cefazolin, Cephapirin, Cephalotin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium und besonders Cefazolin. Eine besondere Ausführungsform umfaßt die Prophylaxe für die Bakterien Mycobacterium sp. oder Salmonella sp.. Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die auf die bakterielle Osteomyelitis gerichtete Prophylaxe.
Ein wichtiger Aspekt dieser Erfindung ist ein Hochverhältnis-iodiertes Kontrastmittel:Lipid-Komplex, der ein Lipid und ein iodiertes Kontrastmittel umfaßt, besonders worin das Lipid ein rigides Lipid ist, jedoch auch mit ungesättigten Lipiden, wie Phosphatidylcholin. In einigen Ausführungsformen beträgt das Kontrastmittel wenigstens ca. 2:1 (Iod w/w) oder wenigstens ca. 4:1 (Iod w/w) oder wenigstens ca. 8:1 (Iod w/w). In einigen Fällen umfaßt das Lipid eine Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten, wobei die genannten Ketten gesättigt sind und eine Länge von wenigstens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten aufweisen, wie Dipalmitoylphosphatidylcholin, das so wenig wie ca. 20 bis 7% (w/w) des Komplexes umfaßt. Gebräuchliche Kontrastmittel sind ohne Einschränkung Amidotrizoat, Iocetaminsäure, Iodamid, Iodoxamat (Iodoximat), Iohexol, Iopamid, Iopamidol, Iopansäure, Iofendylat, Iothalamat, Iothalaminsäure, Iopodat, Metrizamid oder Tyropanoat (Tyropanat) und Salze davon.
Diese Erfindung schließt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid-Komplexes ein, worin das aktive Mittel ein iodiertes Konstrastmittel ist, das den Schritt des Abdampfens zur Monophase - aber im wesentlichen nicht zur Trockene - einer Mischung von Lipid und Kontrastmittel in einem monophasischen Lösungsmittelsystem umfaßt, das eine wässrige Phase, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel und ein Lipid umfaßt. In einer Ausführungsform dieses Verfahrens enthält das monophasische Lösungsmittelsystem ca. gleiche Mengen (v/v) einer wässrigen Phase eines (a) Kontrastmittels, (b) Ethanol und (c) Chloroform und das genannte Lipid. Wahlweise umfaßt es weiterhin auch das Eindampfen des Lösungsmittels bie Überdruck bei ca. 30 bis ca. 75ºC. Durch dieses Verfahren beträgt das Kontrastmittel in dem resultierenden Kontrastmittel:Lipid-Komplex wenigstens ca. 2:1 (Iod w/w) oder wenigstens ca. 4:1 (Iod w/w) oder wenigstens 8:1 (Iod w/w). In diesem Verfahren werden rigide Lipide verwendet, wie solche, worin das Lipid eine Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten umfaßt, wobei die genannten Ketten gesättigt und von einer Länge von mindestens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten sind; insbesondere worin genanntes Dipalmitoylphosphatidylcholin so wenig wie ca. 20% bis ca. 7% (w/w) des Komplexes umfaßt. Es ist auch nützlich, wenn das Lipid in dem Verfahren Phosphatidylcholin, wie Ei- oder Soya-Phosphatidylcholin umfaßt. Besondere Kontrastmittel des Verfahrens sind Amidotrizoat, Iocetaminsäure, Iodamid, Iodoxamat (Iodoximat), Iopamid, Iopamidol, Iopansäure, Iofendylat, Iothalamat, Iotalaminsäure, Calciumiopodat, Natriumiopodat, Metrizamid oder Tyropanoat (Tyropanat) und Salze davon.
Ein zusätzlicher Aspekt dieser Erfindung ist ein Verfahren zur Steigerung der Röntgenstrahlendichte in einem Tier, einschließlich eines Menschen, das den Schritt des Verabreichens einer die Röntgenstrahldichte erhöhenden wirksamen Menge eines iodierten Kontrastmittel:Lipid-Komplexes an das genannten Tier umfaßt, wobei das Lipid ein rigides Lipid ist, und ebenso, worin das Kontrastmittel Amidotrizoat, Iocetaminsäure, Iodamid, Iodoxamat (Iodoximat), Iopamid, Iopamidol, Iopansäure, Iofendylat, Iothalamat, Iotalaminsäure, Calciumiopodat, Natriumiopodat, Metrizamid oder Tyropanoat (Tyropanat) und Salze davon ist. In einigen Anwendungen umfaßt das Kontrastmittel Amidotrizoat, weiter ist die Verabreichung des genannten Amidotrizoats in einer Dosis von ca. 500 mg oder ca. 1 mg Iod pro Kilogramm Körpergewicht des Tieres pro Tag umfaßt. Eine Ausführungsform ist diejenige, bei der der Anstieg der Röntgenstrahlendichte in der Leber erfolgt.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Fig. 1 zeigt den abnehmenden Einschluß von Cephapirin- Natrium in einem Ei-Phosphatidylcholin-Komplex vs. Arzneimittelkonzentration.
Fig. 2 zeigt den Einschluß von Cephapirin-Natrium in einem Ei-Phosphatidylcholin-Komplex vs. Arzneimittelkonzentration.
Fig. 3 zeigt Flexibilitätsprofile von EPC, CHS und Alpha- THS zur Definition rigider Lipide.
Fig. 4 zeigt einen Hochverhältnis 1:2 (w/w) Cefazolin: Dipalmitoylphosphatidylcholin-Komplex in einer elektronenmikroskopischer Aufnahme.
Fig. 5 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von Gefrierbruchstellen von Cephapirin-Ei-Phosphatidylcholin-Komplexen, hergestellt entweder durch einen Standard- oder einen modifizierten MPV-Prozeß, in dem (a) der Arzneimittel-Lipid- Film zu scheinbarer Trockene getrocknet wurde (Standardprozeß) oder (b) der Arzneimittel-Lipid-Film folgte einer erhöhten anfänglichen wässrigen Komponente und hielt zurückgebliebenes Wasser aufrecht - und kann etwas zurückgebliebenes organisches Lösungsmittel enthalten (modifizierter MPV-Prozeß).
Fig 6 zeigt die Wirkung des anfänglichen wässrigen Volumens in der Cephalosporin:Lipid-Mischung auf die Assoziation von Cephapirin mit Dipalmitoylphosphatidylcholin.
Fig. 7 zeigt die Wirkung des steigenden Lipid: Cephapirinmolaren-Verhältnisses auf die Assoziation des Cephapirins mit Dipalmitoylphosphatidylcholin.
Fig. 8 zeigt Serum-Niveaus der Cephapirin-Aktivität in Mäusen in Intervallen nach der Injektion von freiem Cephapirin in Form des Cephalosporin:Lipid-Komplex-Cephapirins.
Fig. 9 zeigt Serum-Niveaus der Cefazolin-Aktivität in Mäusen in Intervallen nach der Injektion von freiem Cefazolin in Form des Cephalosporin:Lipid-Komplex-Cefazolins.
Fig. 10 zeigt die Wirkung von Cephapirin, entweder frei oder als Cephalosporin:Lipid-Komplex auf die Abszeßgröße.
Fig. 11 zeigt die Wirkung von Cephapirin, entweder frei oder als Cephalosporin:Lipid-Komplex auf die Sterblichkeit von Mäusen, die Salmonella typhimurium ausgesetzt worden waren.
Fig. 12 offenbart die Erhaltung des Kontrastmittels in der Leber in der Hochverhältnis-Komplex-Form vs. freies Kontrastmittel.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Experimente in Tieren haben gezeigt, daß Cephalosporin, das mit einem Lipid verbunden ist, wie in einem Liposom oder in einem Cephalosporin:Lipid-Komplex, dramatisch die Verteilung des Cephalosporins im Körper und die Geschwindigkeit seiner Clearance verändern kann. Diese pharmakokinetischen Unterschiede können ebenso wie andere, weniger gut verstandene Wirkungen, zu einem verlängerten prophylaktischen Niveau des Cephalosporins, verminderter Toxizität und/oder erhöhter Wirksamkeit des Cephalosporins führen, das mit einem Lipid verbunden ist.
Der Einschluß des Cephalosporins in Liposome (oder Komplexe) erfolgt jedoch typischerweise bei niedrigen Prozentanteilen des verfügbaren Arzneimittels. Wie in Figur 1 gezeigt, nimmt der Einschluß des Cephalosporins Cephapirin in dem Lipid Ei-Phosphatidylcholin mit steigender Menge des Cephalosporins ab. Der abnehmende Einschluß zeigt den schädlichen Einfluß auf den Einschluß durch hohe Konzentrationen des Cephalosporins.
Ein "Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplex" enthält mindestens 20% Cephalosporin bezogen auf das Lipid (w/w). In einigen Ausführungsformen mit Cephalosporinen enthalten diese mindestens ca. 30% und bis zu ca. 50% und mehr des Cephalosporins (w/w). Ein hohes Cephalosporin:Lipid-Verhältnis ist aus verschiedenen Gründen besonders nützlich in der Cephalosporin- Therapie. Erstens ist mit einem konventionellem Cephalosporin: Lipid-Verhältnis die physikalische Masse der Einheitslipiddosis unbrauchbar, wenn nicht untragbar für die Verabreichung. Eine typische Cephalosporin-Dosis beträgt 4 g/Tag. Für einen Erwachsenen würde die Einheitsdosis bei den bisher berichteten Verhältnissen, 0,14 g (Cephalosporin):1g (Lipid), 32 g des Arzneimittels und Lipids betragen. Die gewöhnliche Art der Verabreichung würde das Zusammenmischen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger erfordern, was zu einer Einheitsdosis führen würde, die bestenfalls unhandlich wäre. Die Verminderung dieses Bolus um eine beträchtliche Menge von bis zu 75% oder mehr ist ein besonderer Vorteil dieser Erfindung. Zweitens kann mit einer Verabreichung großer Mengen des Lipids eine Toxizität verbunden sein, die durch das Reduzieren der Menge des zu verabreichenden Lipids verringert wird. Drittens werden die Kosten einer konzentrierten Dosis durch die Verringerung der erforderlichen Menge des Lipids beträchtlich gesenkt. Ein zusätzlicher Vorteil dieser Erfindung ist der hohe Prozentanteil des Arzneimittels, der in der Arzneimittel:Lipid- Komplex-Zubereitungsmischung des endgültigen Komplexes eingeschlossen ist, was die Kosten der endgültigen Cephalosporin :-Lipid-Herstellung weiter verringert.
Ein Hochverhältnis Kontrastmittel:Lipid-Komplex wird mehr als ca. 2,7:1 (Iod w/w) für nicht-ionische Kontrastmittel und mehr als ca. 1:1 (Iod:Lipid wt/wt) für ionische Kontrastmittel (negativ geladene) sein.
In der vorliegenden Erfindung soll der hierin verwendete Ausdruck rigides Lipid Lipide von einer Flexibilität bedeuten, die ungefähr gleich oder geringer als die von Ei-Phosphatidylcholin ist. Die Rigidität wird leicht durch die im Stand der Technik bekannten Verfahren bestimmt. So drückt z.B. Figur 3 die Rigidität bei der Spinmarkierung für Lipide in Komplexen via eine Doxyl-Reporter-Gruppe aus. Wie in Figur 3 dargestellt, sind rigide Lipide solche mit einem Ordnungsparameter, der ungefähr gleich dem des EPC oder größer ist, und daher einem Ordnungsparameter von 1 näher ist (über EPC in Figur 3). Die Ordnungsparameter werden durch Spinmarkierung der Vesikel mit einer Serie von Doxyl-Stearinsäuren erhalten, bei der die Doxyl-Reporter-Gruppe an verschiedenen Positionen entlang der Fettsäurekette vorhanden war. Die erhaltenen Spektren zeigten keinen Hinweis auf nichtinkorporierte Label.
Besonders sind als rigide Lipide solche mit einer Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten eingeschlossen, wobei die Ketten gesättigt sind und eine Länge von mindestens ca. 16 Kohlenstoffeinheiten aufweisen. Solche Lipide wie Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Distearoylphosphatidylcholin sind in dieser Gruppe. Auch Cholesterol-Hemisuccinat-Tris(hydroxymethyl)aminomethan (CHStris) und ähnliche sind rigide Lipide.
Die Herstellung eines Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid- Komplexes, wie desjenigen mit entweder einem Cephalosporin oder einem Kontrastmittel, kann durch die Modifizierung des Verfahrens erreicht werden, das im U.S. Patent Nr. 4.588.578 mit dem Titel "Lipid Vesicles Prepared in a Monophase", dessen Lehre hierin als Referenz enthalten ist, beschrieben ist. Die in einer Monophase hergestellten Vesikel werden als monophasische Vesikel oder "MPV's" bezeichnet. Monophasische Vesikel stammen aus einem neuen Herstellungsprozeß, der ein monophasisches Lösungsmittelsystem verwendet. Das monophasische Lösungsmittelsystem besteht aus drei Komponenten -- (1) Lipid, (2) mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel und (3) einer wässrigen Komponente. Um das neue monophasische Vesikel herzustellen werden diese Komponenten gemischt, um vor der Entfernung des organischen Lösungsmittels eine Monophase zu bilden. Nach der Entfernung des organischen Lösungsmittels wird ein Arzneimittel-Lipid-Film gebildet, der auf Hydratation monophasische Vesikel bildet.
Das modifizierte MPV-Verfahren bringt es mit sich, den MPV-Prozeß bei einem relativ hohen anfänglichen wässrigen Volumen auszuüben, im allgemeinen bei ca. 8:1 bis ca. 1:1 (v/v) des wässrigen aktiven Mittels (z.B. Cephalosporin) zum organischen Lösungsmittel. Bei der Ausübung des Verfahrens zur Bildung des Hochverhältnis-aktiven Mittels:Lipid-Komplexes muß die anfängliche Mischung des monophasischen Lösungsmittelsystems über eine Monophase-Stufe geführt werden, ob das Lösungsmittelsystem als Monophase beginnt oder nicht. Der Ausdruck "Monophase" bedeutet eine Kombination von zwei oder mehr Lösungsmitteln, die nach dem Mischen zu einer klaren Lösung einer konstanten Zusammensetzung führen. In der Praxis werden zwei nicht mischbare Lösungsmittel, die nach dem Mischen ein biphasisches System bilden, durch die Zugabe eines dritten Lösungsmittels, das mit beiden der ursprünglichen Lösungsmittel mischbar ist, in die Monophase überführt. Zum Beispiel bilden Chloroform und Wasser ein biphasisches System, jedoch nach Zugabe von genügend Ethanol bilden sie eine Monophase.
Die zentrale Modifizierung des MPV-Prozesses ist der Schritt der Aufrechterhaltung des aktiven Mittels (wie des Cephalosporins oder des Kontrastmittels) und des Lipids als zu allen Zeiten hydratisiert. Dieses hydratisierte Material ist der Komplex dieser Erfindung, der zweckmäßig zu Konzentrationen verdünnt wird, die für die pharmazeutische Einheitsdosierungsform brauchbarer sind. Die Modifizierung der Aufrechterhaltung des Materials als hydratisiert vermeidet dann den üblichen Endpunkt der Entfernung der gesamten wässrigen Komponente und der Bildung eines aktives Mittel:Lipid-Films. Daß die Monophase hydratisiert ist, ist einfach dadurch zu bestimmen, daß man das Material während des Eindampfungsschrittes beobachtet. Das Vorhandensein eines gelartigen Materials zeigt an, daß noch Wasser vorhanden ist, während, wenn das gesamte Wasser entfernt ist, sich ein aktives Mittel-Lipid-Film auf dem das Material enthaltende Gefäß bilden würde. Das vorangegangene Verfahren steigert den prozentualen Anteil des eingeschlossenen aktiven Mittels relativ zu dem verfügbaren aktiven Mittel bedeutend. Dieses Verfahren führt auch zur Erhöhung des endgültigen aktives Mittel:Lipid-Verhältnisses, was zu dem Hochverhältnisaktives Mittel:Lipid-Komplex der vorliegenden Erfindung führt. Durch Anwendung des vorangegangenen Verfahrens und rigider Lipide können ein Einschluß oder eine Assoziation von bis zu ca. 60 oder 70% des anfänglichen aktiven Mittels, wie des Cephalosporins erhalten werden, verglichen mit dem Einschluß oder der Assoziation ohne das vorliegende Verfahren ungefähr die eineinhalbfachen Menge. Weiterhin stieg das endgültige aktives Mittel:Lipid-Verhältnis im Falle von Cephapirin von ca. 1:7 (w/w) (Cephapirin, Ei-Phosphatidylcholin und MPV-Verfahren) auf besser als ca. 1:1, einschließlich ca. 1,2:1 an.
Endgültige Iod:Lipid-Verhältnisse für Kontrastmittel sind für Iopamidol berichtet worden, C. Musu et al., Invest. Radiol., 23(Supp.1): S126-129 (1988).
Durch das Verfahren dieser Erfindung werden Verhältnisse von mindestens ca. 2:1 (Iod-Masse/Masse) oder ca. 4:1 (Iod w/w), 6:1 (Iod w/w) und bis sogar ca. 8:1 (Iod w/w) erhalten. Ein 8:1 Amidotrizoat:Lipid-Komplex wurde hergestellt. Die Verwendung rigider Lipide mit Iod-Kontrastmitteln ist so vorteilhaft wie die Verwendung ungesättigter Phosphatidylcholine. Es wird angenommen, daß rigide Lipide Komplexe ergeben, die im Serum stabiler sind, während ungesättigte Phosphatidylcholine höhere Iod:Lipid-Verhältnisse im Komplex ergeben.
Ein Maßstab bei der Erreichung von Röntgenkontrast mit iodierten Mitteln ist die Menge des abgegebenen Iods. Für Amidotrizoat ist das Iod zu Amidotrizoat-Verhältnis 1 g Iod für 1,623 g Amidotrizoat. In vielen Anwendungen ist die Verabreichung von ca. 500 bis ca. 1000 mg Iod pro Kilogramm Körpergewicht erforderlich. Jedoch können in Äbhängigkeit von verschiedenen Faktoren, wie der Konzentration des Iods am Ort der Abbildung oder der Ausscheidung des Kontrastmittels vor der biologischen Verfügbarkeit, Dosierungen ausserhalb dieser Beschränkungen verwendet werden. Ohne an irgendeine Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, daß da die Teilchen wie Liposome und Komplexe dieser Erfindung durch Leberzellen phagozytiert werden, der intrazelluläre Raum bevorzugt vor dem interstitiellen markiert wird. Wie unten zu sehen sein wird, erleichtert das durch die Komplexe dieser Erfindung bereitete Kontrastmittel insbesondere die Sichtbarmachung von Lebertumoren.
Fig. 5A und 5B sind elektromenmiskroskopische Aufnahmen von Gefrierbruchstellen von Cephapirin-Ei-Phosphatidylcholin- Komplexen, die entweder durch einen Standard- oder einen modifizierten MPV-Prozeß hergestellt wurden, in dem (a) der Cephalosporin-Lipid-Film zur offensichtliche Trockene getrocknet wurde (Standardverfahren) oder (b) der Cephalosporin-Lipid-Film folgte einer erhöhten anfänglichen wässrigen Komponente und hielt zurückgebliebenes Wasser aufrecht (modifizierter MPV- Prozeß). Die Komplexe in (a) erscheinen unregelmäßig und von bekannten Cephalosporin:Lipid-Komplexen verschieden, während in (b) die Komplexe typische EPC MPV's zu sein scheinen. Ohne an irgendeine besondere Theorie gebunden zu sein, scheint es, daß es das konventionelle MPV-Verfahren mit sich bringt, daß die gesamte Flüssigkeit aus dem wässrigen Arzneimittel-Lipid-organisches Lösungsmittel entfernt wird - eine solche Entfernung jedoch vermieden werden sollte. Die Wasserentfernung zur Trockene führt zu einem niedrigen Arzneimittel-Einschluß und zu einem niedrigen Cephalosporin:Lipid-Komplex-Verhältnis, wie in Fig. 5A gezeigt ist. Durch das Aufrechterhalten einer zurückbleibenden wässrigen Phase wird der Einschluß oder die Assoziation ungefähr verdoppelt, wobei die Komplexe von Fig. 5B gebildet werden.
Fig. 6 zeigt die Wirkung der Steigerung des anfänglichen wässrigen Volumens auf den Einschluß oder die Assoziation von Cephapirin in einem DPPC-Komplex, während das Cephalosporin :-Lipid-Verhältnis konstant bei 1:3 gehalten wird. Fig. 6 offenbart, daß die Steigerung des anfänglichen wässrigen Volumens um das sechsfache, das Cephalosporin:Lipid-Verhältnis von 1:1 auf 2:1 steigert. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß dieser Anstieg des Cephalosporin:Lipid-Verhältnisses nicht allein die Folge der Erhöhung des wässrigen Volumens war, sondern der Abnahme der Arzneimittelkonzentration, wurde der Einschluß unter Verwendung des höchsten wässrigen in Fig. 1 gestesteten Volumens getestet, während dieses Volumen ebenso wie die Lipidmenge konstant gehalten wurde. Fig. 7 stellt die Ergebnisse eines Einschlußtestes dar, bei dem Volumen und Lipid konstant gehalten wurden. Fig. 7 offenbart, daß keine dramatische Änderung hinsichtlich des Einschlusses stattfindet, wenn das anfängliche Cephalosporin:Lipid-Verhältnis erhöht wird, d.h. mehr Arzneimittel hinzugegeben wird.
Das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung weicht in einigen Punkten vom MPV-Verfahren ab. Erstens, die anfängliche Kombination des Arzneimittels und des Lipids in einem Lösungsmittel-System darf nicht aus einer Monophase bestehen. Das Lösungsmittel-System durchläuft jedoch an einigen Punkten eine Monophase während der Lösungsmittelentfernung, um einen hohen Einschluß oder eine hohe Assoziation zu erreichen und führt zu einem hohen aktives Mittel:Lipid-Verhältnis. Ungeachtet des verwendeten Systems sollten beide, aktives Mittel (auch als Arzneimittel bezeichnet) und Lipid, komplett in ihren jeweiligen Phasen gelöst sein. Wenn das aktive Mittel ein Kontrastmittel und das Lipid ein rigides Lipid ist, sind Temperaturen von ca. 10ºC über der Übergangstemperatur des Lipids nützlich. Als nächstes sollte als Verdampfungsverfahren, eher die Überdruck- als die Vakuumrotationsverdampfungsverfahren verwendet werden, um den Verlust von Wasser während des Lösungsmittelentfernungsverfahrens zu beschränken. Die Verwendung eines Schaufelrührers während dieses Schrittes ist vorteilhaft. Im bevorzugten Verfahren wird die Geschwindigkeit der Lösungsmittelentfernung kontrolliert, um eine Lösungsmittelentfernung zu verhindern, die zu rasch ist, um die Bildung einer ausgeprägten Monophase zu erlauben. Diese Geschwindigkeit ist eng in der Weise mit der Temperatur verbunden, in der eine höhere Temperatur zu einer rascheren Lösungsmittelentfernung führt. Es ist auch wünschenswert die größte Menge des organischen Lösungsmittels zu entfernen, während die größte Menge des Wassers bestehen bleibt.
Während im MPV-Verfahren eine Anzahl von organischen Lösungsmitteln akzeptabel sind, müssen die Kombinationen der Lösungsmitteln in dem vorliegenden Verfahren, beides, das Arzneimittel und das Lipid gemeinsam lösen und während des Verfahrens eine Monophase bilden. Im wesentlichen ist Ethanol das bevorzugte, mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel für einen hohen Einschluß oder Assoziation und den Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid-Komplex. Ein Vorteil von Ethanol als ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel ist es, daß hohe Rückstände von Ethanol in vivo keine nachteilige Wirkung auf den Komplex zu haben scheinen, wie durch Maus I.V. pharmacokinetische Experimente beurteilt wurde.
Ein Aspekt dieser Erfindung ist die bakterielle Infektionsprophylaxe in einem Tier durch Aufrechterhalten eines verfügbaren Arzneimittelniveaus von mindestens ca. des MHK- Niveaus eines Cephalosporins über einen ausgedehnten Zeitraum in einem Tier, das den Schritt der Verabreichung eines Lipid :-Cephalosporin-Komplexes, und bevorzugt eines Hochverhältnis- Komplexes, in einem gesteigertem Verabreichungs-Intervall- Dosierungsschema umfaßt.
Als "ausgedehnter Zeitraum" der Aufrechterhaltung des prophylaktischen Niveaus (Tt oder Tp) eines einzelnen Cephalosporins (oder eines anderen antibakteriellen oder antiinfektiösen Mittels) soll der Zeitraum verstanden werden, der mindestens ca. zweimal die Zeitperiode übersteigt, über der das Arzneimittelniveau ungefähr gleich der MHKp oder der MHKt ist, die durch eine einfache Verabreichung eines äquivalenten Gewichtes einer freien Form - das ist kein Komplex - eines solchen Cephalosporins aufrechterhalten werden kann, oder sie übersteigt.
"Verfügbar" bezüglich des prophylaktisch wirksamen Niveaus eines Cephalosporins (oder eines antibakteriellen oder antiinfektiösen Mittels) soll bioverfügbar bedeuten; das ist das Cephalosporin, ob in einer physiologischen Flüssigkeit wie einer cerebrospinalen Flüssigkeit, einem Serum oder Plasma oder im Gewebe, das eine antibakterielle Aktivität gegen pathogene Mikroorganismen aufweist, wie solche Krankheitserreger, die in vivo vorliegen.
"Arzneimittel von mindestens der minimalen Hemmkonzentration" soll verstanden werden, als ein bakterielles infektionsprophylaktisches Niveau des Cephalosporins (oder eines anderen antibakteriellen oder antiinfektiösen Mittels), das ausreicht die Proliferation eines Organismus in einem Tiersubjekt zu verhindern. Dieses bakterielle infektionsprophylaktische Niveau wird mindestens ungefähr das MHK-Niveau sein. Dieses Niveau wird leicht durch eine Anzahl von in vitro-Tests der MHK bestimmt, die den Fachleuten gut bekannt sind. Die verabreichte Dosis, die in vivo ein solches prophylaktisch wirksames Niveau einrichtet, wird von dem zu erhaltenden absoluten Arzneimittelniveau, dem besonderen Arzneimittel, dem Ort an dem das Niveau zu errichten ist, und anderen, den Fachleuten bekannten Faktoren abhängen. Für Tiere, einschließlich Menschen, wird der verabreichende Mediziner endgültig die geeignete Dosierung für eine gegebene Person in der Prophylaxe der bakteriellen Infektion bestimmen, und es kann erwartet werden, daß sich diese mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des Tieres, dem Verabreichungsweg ebenso wie der Natur und der Schwere der bakteriellen Erkrankung ändert. Das prophylaktische Niveau und somit die Dosierungsmenge, die damit in der liposomeingeschlossenen Form erforderlich ist, wird im allgemeinen diejenige sein, die für das freie thepareutische Mittel angewendet wird. In einigen Fällen kann es jedoch erforderlich sein, Dosierungen außerhalb dieser Grenzen zu verabreichen, um die gewünschten in vivo- Arzneimittelniveaus zu errichten. In einer speziellen Anwendung, wie der Prophylaxe der Bakteriämie, das ist die bakterielle Infektion des Blutes, soll das prophylaktische Niveau des Cephalosporins als das Niveau verstanden werden, welches die Proliferation des Bakteriensubjektes im Blut verhindert.
Cephalosporin soll verstanden werden als jedes Mitglied der Cephalosporin-Klasse der β-Lactamantibiotika ohne Einschränkung, einschließlich Cefazolin, Cephapirin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephaloridin, Cephradin, Cephlexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim und Cefalotin und Analoge und Derivate davon.
"Iodierte Kontrastmittel" soll bedeuten: Ohne Einschränkung iodierte pharmazeutisch verträgliche Materialien mit erkennbarer Röntgentrübung, wie Amidotrizoat, Iocetaminsäure, Iodamid, Iodoxamat (Iodoximat), Iohexol, Iopamid, Iopamidol, Iopansäure, Iofendylat, Iothalamat, Iotalaminsäure, Calciumiopodat, Natriumiopodat, Metrizamid oder Tyropanoat (Tyropanat), die so verstanden werden, daß sie Salze davon wie Meglumin (z.B. Amidotrizoatmeglumin, Iodamidmeglumin, Iodoximatmeglumin, Iopamidmeglumin, Iothalamatmeglumin), genauso wie andere pharmazeutisch verträgliche Salze und zusätzlich Analoge und Derivate davon einschließen.
Ein freies Arzneimittel kann einem Tier in einer Menge verabreicht werden, die ausreichend ist eine MHK in einem Tier, im allgemeinen im ganzen Tier oder an einer Stelle innerhalb des Tieres zu errichten. Die MHK für ein solches Arzneimittel wird für eine bestimmte Zeitdauer vorhanden sein, die für jedes Arzneimittel und Tier und andere gut bekannten Faktoren spezifisch sein wird. Nach einer Zeit wird das Arzneimittelniveau unter die MHK fallen und das Arzneimittel muß wieder verabreicht werden, um die MHK wieder einzurichten. Um daher ein Arzneimittelniveau oder irgendein gegebenes Arzneimittelniveau kontinuierlich auf mindestens der MHK zu halten, müssen wiederholte Verabreichungen des Arzneimittels an das Tier erfolgen.
Der Cephalosporin:Lipid-Komplex, und insbesondere der Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplex ist nützlich, um, verglichen mit dem freien Arzneimittel, ein Arzneimittelniveau von mindestens der MHK ohne wiederholte Verabreichungen des Arzneimittels kontinuierlich aufrechtzuerhalten. "Cephalosporin:Lipid-Komplex" bezieht sich auf ein Cephalosporin, das mit einem Lipid assoziiert ist, bevorzugt mit einem rigiden Lipid. Das Arzneimittel kann an der äußeren Oberfläche eines Komplexes oder innerhalb des wässrigen- oder Lipidanteils eines Komplexes adsorbiert sein. Da ein Cephalosporin im allgemeinen hydrophil ist, wird das meiste Cephalosporin des Cephalosporin: Lipid-Komplexes innerhalb des Komplexes sein, jedoch ist dies nicht kritisch.
Die Komplexe können gewaschen werden, um das aktive Mittel wie das Cephalosporin, das vom Komplex disassoziierbar ist, zu entfernen, wobei dies keine Einschränkung der Erfindung darstellt. Da sich etwas äußerliches Cephalosporin leicht vom Komplex nach der Verabreichung an ein Tier abtrennt, kann es sich mehr als freies Cephalosporin als ein Hochverhältnis- Cephalosporin:Lipid-Komplex verhalten. Um die komplexierte Dosis des Cephalosporins zu maximieren und gleichzeitig eine unnötige Toxizität des disassoziierbaren Cephalosporins zu vermeiden, werden in der bevorzugten Ausführungsform die Komplexe gewaschen, um mindestens ca. 90% des disassoziierbaren Cephalosporins zu entfernen. Verfahren zum Waschen von Komplexen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen Zentrifugation ebenso wie Chromatographie ein.
Bei der Ausübung dieser Erfindung zur Prophylaxe wird die Anzahl der Verabreichungen des Arzneimittels, das komplexiert ist, verglichen mit einem freien Arzneimittel, das in äquivalenten Dosierungen verabreicht werden muß, um das gleiche Arzneimittelniveau oder die MHK des Arzneimittels aufrechtzuerhalten, reduziert. Das Reduzieren der Häufigkeit mit der das Arzneimittel verabreicht werden muß, um ein gegebenes Gewebe- oder Blutniveau aufrechtzuerhalten, wird notwendigerweise durch einen erhöhten Zeitraum zwischen den Verabreichungen eines solchen Arzneimittels zum Ausdruck gebracht. Dies ist insbesondere vorteilhaft bei der Prophylaxe von Infektionen, die einen ausgedehnten intrazellulären Überlebenszeitraum besitzen, einschließlich der disseminierten Infektionen, die das retikuloendotheliale System ("RES") beinhalten, wie Salmonella sp. oder Mycobakterium sp., insbesondere Mycobakterium avium intracellulare. Der "verlängertes Verarbeichungsintervall-Therapieplan" dieser Erfindung soll so verstanden werden, daß er einen Verabreichungstherapieplan mit einem Intervall zwischen den Verabreichungen des Arzneimittels von mindestens zweimal dem Intervall bedeutet, in dem das freie Arzneimittel erneut verabreicht werden muß (bei äquivalenten Gewichten und demselben Arzneimittel), um ein gegebenes Arzneimittelniveau aufrechtzuerhalten. In einigen therapeutischen Situationen wird nur eine Verabreichung des Cephalosporin:Lipid-Komplexes erforderlich sein, um zwei oder mehr Verabreichungen des nichtkomplexen Arzneimittels zu ersetzen, was notwendigerweise einen unendlichen Anstieg des Verabreichungsintervalls darstellt, was als innerhalb dieser Definition liegend verstanden werden soll. In der Behandlung disseminierter bakterieller Infektionen, die das retikuloendotheliale System beinhalten, erlaubt das Fortdauern des Cephalosporins nach der Verabreichung in der Cephalosporin:Lipid-Komplexform eine Wirksamkeit, bei der die frühere Cephalosporin-Therapie unwirksam war.
"Minimale Hemmkonzentration" ("MHK") ist ein bekannter Fachbegriff, der das niedrigste Niveau bezeichnet, gewöhnlich ausgedrückt als w/w oder w/v, das die Vermehrung des Erregers - hier eines Bakteriums - hemmt. Die im Blutplasma festgestellte MHK, wie sie hier verwendet wird, wird als "MHKp" bezeichnet und so verstanden, daß sie sich auf eine Konzentration des therapeutischen Mittels im Plasma oder Serum bezieht, die gleich oder größer ist, als die minimale Hemmkonzentration des pharmazeutischen Mittels in Gewicht pro Volumen des Plasmas oder Serums, wie sie in vitro für den Erregerorganismus bestimmt wurde. Für Cefazolin beträgt die MHKp für viele empfängliche Organismen ca. 0,5 µg (Basisgewicht)/ml (Plasma oder Serum). Cephalosporin:Lipid-Komplex-Cefazolin kann verabreicht werden, um dieses Niveau zu erreichen, und weiter um Niveaus von 10 oder 100 µg/ml oder mehr zu erreichen. Das Basisgewicht wird verwendet, um das Gewicht des aktiven Anteils, ohne das Gegenion einzuschließen, zu bezeichnen.
Die MHK, wie sie hierin verwendet wird, wenn sie im Gewebe bestimmt wurde, wird als MHKt bezeichnet und ist so zu verstehen, daß sie sich auf eine Konzentration des therapeutischen Mittels im Gewebe bezieht, die gleich oder größer als die minimale Hemmkonzentration des pharmazeutischen Mittels in Gewicht pro Gewicht ist, wie sie in vitro für den Erregerorganismus bestimmt wurde. Für Cefazolin beträgt die MHKt für viele empfängliche Organismen 0,5 µg (Basisgewicht)/mg (Milz). Arzneimittel-:Lipid-Komplex-Cephazolin kann verabreicht werden, um dieses Niveau zu erreichen und weiter um Niveaus von 10 oder 100 ug/ml oder mehr zu erreichen.
In der Behandlung pathologischer Erkrankungen kann die Errichtung eines prophylaktischen Niveaus eines pharmazeutischen Mittels im Gewebe auch eine wirksame therapeutische Option sein. Häufig sind für die zuverlässigste Prophylaxe Niveaus vom ca. 4- bis ca. 8-fachen der MHK erwünscht. Solche Niveaus sind durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhältlich. Die parenterale wie die intravenöse Verabreichung des Lipidkomplex-pharmazeutischen Mittels, wie des Cephalosporins, führt zur verlängerten Anwesenheit des pharmazeutischen Mittels im ausgewählten Gewebe, wobei sich eine ausgeprägte antibakterielle Aktivität zeigt (Tabelle 1). Die Experimente zeigen, daß die Gewebeniveaus des Cephapirins über einen längeren Zeitraum als die Serum- oder Plasmaniveaus bestehen und über einen ausgedehnten Zeitraum, Tt, über den MHK's der meisten empfindlichen Organismen liegen. So sind zum Beispiel Niveaus, die größer als ca. 60 µg/gm sind, für mindestens 24 Stunden in der Milz und für ungefähr 24 Stunden in der Leber vorhanden.
Neben der prophylaktischen Behandlung bakterieller Infektionen ist das Fortdauern des Hochverhältnis-Cephalosporin- Komplexes besonders wichtig in der Behandlung fakultativer bakterieller intrazellulärer Infektionen, die auch als disseminierte bakterielle Infektionen, die das retikuloendotheliale System beinhalten, bezeichnet werden. Fakultativ bezeichnet Krankheitserreger, die fähig sind, in eukariotischen Zellen, insbesondere Makrophagen des RES, ebenso wie auf einem azellulärem Medium zu überleben. Beispiele fakultativer intrazellulärer Organismen sind: Listeria monocytogenes. Brucella sp., Legionella pneumophilia, Mycobakterium sp. und Salmonella sp.. Eine zusätzliche Gruppe bakterieller Krankheitserreger, die obligaten intrazellulären Organismen, wird in die fakultativen Organismen eingeschlossen. Die obligaten intrazellulären Organismen, wie Coxiella Burnetii, können nur intrazellulär überleben.
Es wird davon ausgegangen, daß einige Bakterien bei subtoxischen Niveaus von Cephalosporin cephalosporinresistent sind oder gegenüber Cephalosporin nur bei toxischen Niveaus empfindlich sind. Eine ähnliche Resistenz kann bei anderen antibakteriellen oder antiinfektiösen Mitteln auftreten. Die Fachleute wissen, daß diese Erfindung bei Organismen anwendbar sein wird, die gegenüber Cephalosporin oder anderen antibakteriellen oder antiinfektiösen Mitteln empfindlich sind. Dies ist durch in vitro-Untersuchungen feststellbar. Organismen wie Salmonella sp., die nicht typischerweise mit Cephalosporin behandelt werden, in vitro jedoch empfindlich sind, werden durch das vorliegende Verfahren wirksam behandelt.
Die prophylaktische Behandlung bakterieller Infektionen wird durch Verabreichen einer wirksamen Menge des Hochverhältis-Cephalosporin:Lipid-Komplexes (oder anderer antibakterieller oder antiinfektiöser Mittel) erreicht. Eine zur bakteriellen Infektionsprophylaxe wirksame Menge soll so verstanden werden, daß sie eine, zum Erreichen der prophylaktischen Reaktion über den gewünschten Zeitraum, ausreichende Menge bedeutet. Die zur bakteriellen Infektionsprophylaxe wirksame Menge eines gegebenen Cephalosporins (oder anderer antibakterieller oder antiinfektiöser Mittel) wird sich mit der Art der Verabreichung, den Besonderheiten des Empfängers, der Empfindlichkeit des Zielbakteriums und anderer im Stand der Technik gut bekannter Faktoren verändern.
Die Dauer der Prophylaxe aus einer einfachen Dosis des Cephalosporin:Lipid-Komplexes (oder anderer antibakterieller oder antiinfektiöser Mittel) wird von dem spezifischen Arzneimittel abhängen, dein behandelten Tier, dem Erregerorganismus und anderer den Fachleuten gut bekannten Faktoren. Im allgemeinen wird ein prophylaktisches Gewebeniveau des Arzneimittels, das aus einer einzelnen Verabreichung des Arzneimittels resultiert, in der Milz und der Leber wesentlich länger aufrechterhalten und größer sein als die Tt des freien Mittels im ähnlichen Gewebe bei einer einzelnen Verabreichung. In der Leber besteht der Komplex mindestens ca. zweimal und bis zu ca. fünfmal oder mehr länger als das freie Arzneimittel. In der Milz war das freie Arzneimittel unter nachweisbaren Niveaus, während das Komplexarzneimittel mindestens ca. 24 Stunden anhielt.
Die Dauer, die für die prophylaktische Behandlung erforderlich ist, wird mit der Erkrankung des Versuchstieres variieren. Bei immungeschädigten Tieren ist die Prophylaxe potentiell für die Zeit der Immunschädigung erforderlich. Folglich kann der Zeitraum bei Patienten mit erwobenem Immundefekt (AIDS) ein Leben lang andauern, während in Patienten, die an Neutropenie sekundär zur Chemotherapie leiden, oder die für einen Organtransplantatempfang immunosupprimiert sind, die Dauer der Prophylaxe eingegrenzter sein kann. Die Dauer solcher Perioden der erforderlichen Prophylaxe sind den Fachleuten gut bekannt.
Das Aufrechterhalten von wenigstens einer minimalen Hemmkonzentration des Antibiotikums in bestimmten Organen des RES in Abwesenheit nachweisbarer Serumniveaus kann vorteilhaft für die Prävention und die Behandlung von Bakterämie in Patienten mit einem Risiko oder in der Behandlung oder Unterdrückung von bestimmten chronischen Infektionen sein (z.B. Osteomyelitis, Mycobakterium avium intracellulare-Infektion, Salmonella sp.- Infektionen).
Das retikuloendotheliale System oder RES ist so zu verstehen, daß es sich auf Zellen des Körpers bezieht, die beides, endotheliale und retikuläre Anteile besitzen und ein gewöhnliches phagozytäres Verhalten gegenüber Farbstoffen zeigen. Solche Zellen neigen dazu den verabreichten Cephalosporin :-Lipid-Komplex zu inkorporieren. Darin eingeschlossene Zellen sind solche von Milz und Lymphknoten, Kupffer-Stern-Zellen der Leber, alveolare Makrophagen der Lunge, das retikuloendotheliale System des Knochenmarks und die Clasmatozyten. In der Terminologie dieser Erfindung werden das Knochenmark und das Hartgewebe so behandelt als wären sie innerhalb des RES, und die bakterielle Osteomyelitis als wäre sie eine Infektion des RES.
Um die Bioverfügbarkeit des Cefazolins bei der Verabreichung in einem Cephalosporin:Lipid-Komplex zu bestimmen, wurden verschiedene Infektionsmodelle untersucht.
Im allgemeinen wurden die Serumniveau- und Gewebeverteilungsuntersuchungen für Antibiotika in Mäusen durch Injizieren einer einzelnen intravenösen Dosis des freien oder eingeschlossenen Antibiotikums und Quantifizieren des Betrages der antibakteriellen Aktivität im Serum oder Plasma und ausgewählten Geweben der Tiere in danach liegenden Zeiträumen durchgeführt.
Die antibakterielle Aktivität wurde durch ein Agarmulden- Diffusions-Bioassay gemessen, obwohl dem Fachmann andere Assays für die antibakterielle Aktivität oder chemische oder immunologische Assays für Arzneimittelsubstanzen bekannt sind. Kurz - wird das hier verwendete Agarmulden-Diffusions-Bioassay durch Einschneiden von Vertiefungen in Agar, wie Tryptikase-Soya-Agar (Difco., Detroit, MI), das zuvor mit der Testbakterie, Bacillus subtilis (ATCC # 6633) geimpft worden war, durchgeführt. Die Vertiefungen wurden mit einer kleinen Menge des Testmaterials, hier ca. 50 pl der Testprobe, gefüllt und die Agarplatten wurden inkubiert. Die Inkubation von Bacillus subtilis erfolgte für ca. 16 - 24 Stunden bei ca. 35ºC. Das Wachstum eines Bakterien-"Rasens" um die Vertiefung wurde durch das Vorhandensein des Antibiotikums im Agar gehemmt, das aus der Testprobe diffundierte. Die Durchmesser der Zonen des inhibierten Wachstums um die Vertiefungen waren proportional zur Konzentration des Antibiotikums in der Testprobe und wurden durch Vergleich mit bekannten Standardantibiotikalösungen quantifiziert.
Die (parenterale) Verabreichung des Cephalosporin:Lipid- Komplex-Antibiotikums, wie Cefazolin, an ein Tier führte charakteristisch zu einem höheren Maximalserum- oder Plasmaniveau, gemessen durch die Konzentration des pharmazeutischen Mittels im Plasma zur Zeit Null (Cpo), als für das pharmazeutische Mittel in freier Form beobachtet wurde. Auch wurde für die Cephalosporin:-Lipid-Komplexform eine größere Serum- oder Plasma-Halbwertzeit (T 1/2) als für die freie Form und eine größere Fläche unter der graphischen Darstellung der Serum- oder Plasmakonzentration gegen die Zeit, genannt Fläche unter der Kurve (AUC), beobachtet.
Fig. 8 zeigt Serumniveaus der Cephapirin-Aktivität in Mäusen (jeder Punkt stellt 3-5 Mäuse dar) in Intervallen nach der Injektion von freiem Cephapirin von Cephalosporin:Lipid- Komplex-Cephapirin (jede 200 mg/kg), während Fig. 9 die Cefazolin-Aktivität (jede 100 mg/kg) nach einer einzelnen intravenösen Dosis des Cefazolins zeigt, verabreicht in einer konventionellen wässrigen Lösung (Kreise) oder im Komplex, zusammengesetzt aus DPPC mit einem endgültigen Arzneimittel zu Lipid-Verhältnis von 1:5 pro Gewicht (Quadrate). Beide, Cephapirin und Cefazolin, zeigen eine verlängerte Aktivität im Serum und eine Aktivität bei höheren Niveau durch das Cephalosporin-:Lipid-Komplex-Präparat verglichen mit dem freien Arzneimittel. Man kann erkennen, daß in beiden Bildern 8 und 9 die Cephapirin-/Cefazolin-Niveaus, und folglich die Aktivität im Serum oder Plasma, bei der Cephalosporin:Lipid-Dosierungsform, verglichen mit dem freien Arzneimittel, höher waren und länger andauerten. Die ausgedehnte prophylaktische Aktivität im Serum kann auch durch subkutane Verabreichung des Cephalosporin :-Lipid-Komplex-Antibiotikums erreicht werden.
Kontrastmittel wurden in Mäusen durch Injizieren einer einzelnen intravenösen Dosis des freien oder komplexierten Kontrastmittels (Amidotrizoat) in die Schwanzvene getestet. Bei einer Dosis von 924 mg/kg Iod wurde ein Niveau von mehr als ca. 2 mg I pro Gramm der Leber erreicht (Fig. 12). Wie in Fig. 12 und Tabelle 3 gezeigt, betrug das endgültige Iod/Lipid-Verhältnis in den MPV's 4,5:1 (w/w); die Iodkonzentration betrug 38,5 mg/ml und die Lipidkonzentration betrug 8,5 mg/ml. Die spezifische Aktivität der Dosierungen betrugen ca. 10000 c/mg I.
Die Wirksamkeit der prophylaktischen Verwendung von Antibiotika kann durch eine Anzahl von Verfahren untersucht werden, die den Fachleuten gut bekannt sind. Verschiedene Modelle zur Untersuchung der prophylaktischen Wirksamkeit sind unten beschrieben.

Staphylococcal-Abszeß-Modell.

S. Aureus (ATCC # 29740) wurde über Nacht bei 30ºC in Trypticase-Soyabrühe gezüchtet. Aliquote dieser Suspension wurden bei -70ºC gefroren. Die in vitro minimale Hemmkonzentration (MHK) von Cephapirin-Natrium für diesen Stamm wurde durch das Mikrotiter-Dilutionsverfahren auf 0,05 - 0,10 µg/ml bestimmt. Die Kulturen wurden zur Verwendung aufgeteilt und mit einer Salzlösung verdünnt, um die gewünschte Anzahl koloniebildender Einheiten (CFU) pro ml zu enthalten. Mäusen (Herauszüchtung CD-1, Männchen) wurde subkutan 0,1 ml der S. Aureus-Suspension in den Unterleibsbereich injiziert. Eine Behandlung mit dem freien oder eingeschlossenen Arzneimittel wurde vor oder nach der Infektion durchgeführt. Vier Tage nach der Infektion wurden die Mäuse durch Zervikaldislokation getötet. Die Aszesse wurden sorgfältig herausseziert und ihre Durchmesser wurden gemessen.

Staphylococcal-Septikämie-Modell.

Das S. Aureus-Inoculum wurde wie für das Abszeβ-Modell hergestellt. Mäuse wurden intraperitoneal mit 2 x 10&sup8; CFU in 5% Schweine/Muzin inoculiert. Die Behandlung wurde vor oder nach der Infektion durchgeführt. Die Sterblichkeit wurde für 3 Tage post-Infektion überwacht.

Salmonella-Typhimurium-Septikämie-Modell.

S. Typhimurium (ATCC # 14028) wurde in Tryptikase-Soyabrühe bei 35ºC über Nacht gezüchtet. Aliquote dieser Suspension wurden gefroren und bei -70ºC gehalten. Zur Verwendung wurden die Kulturen aufgetaut und verdünnt, um 700 CFU/ml in 0.9%iger Salzlösung zu enthalten. Mäuse wurden intravenös (0,1 ml) durch die laterale Schwanzvene inokuliert. Die Behandlung wurde zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion durchgeführt. Die Sterblichkeit wurde täglich für zwei Wochen überwacht.
Zusätzlich zur Bereitstellung verlängerter antibakterieller Serumaktivitäts-Niveaus bringt die EPC-Liposom-Formulierung das Arzneimittel zu bestimmten Organen, wenn sie intravenös verabreicht wurde. Dies schließt besonders das retikuloendotheliale System und ganz besonders die Milz ein.
Salmonella Typhimurium ist ein falkultatives intrazelluläres Bakterium, das fähig ist, die systemische Infektion in Mäusen zu verursachen. Die spontane Maus-Salmonellose resultiert üblicherweise aus der Nahrungsaufnahme des Organismus (durch vergiftetes Futter, Streu oder Kot). Die Infektion kann auch über einen konjunktivalen Weg oder nach einer experimentellen subkutanen, intraperitonealen oder intravenösen Inokulation auftreten. In allen Fällen erlangt der Organismus Zugang zum Körperkreislauf, wobei er Septikämie verursacht, gefolgt von der Lokalisation in den Haupt-retikuloendothelialen-Organen (Milz, Leber, Lymphknoten). Wenn der Tod nicht dazwischenkommt, kann das Bakterium überleben, sich in den Makrophagen vermehren und eine chronische Infektion auslösen.
Der Hochverhältnis-Cephalosporin-Komplex, der den Versuchstieren verabreicht wurde, steigert beträchtlich die Überlebensdauer bei allen untersuchten Dosierungen und Behandlungszeiten und übertrifft die der freien Cephalosporin-Verabreichung.
Cephalosporin:Lipid-Komplex-Cephazolin stellt eine signifikante prophylaktische Aktivität bereit, Tt für Zeiträume die zum ersten Mal das freie pharmazeutische Mittel übertreffen. Der Hochverhältnis-Cephalosporin-Komplex wirkte eindeutig signifi-kant länger als das freie Cephalosporin.
In den Untersuchungen der Gewebeniveaus des Cephalosporins wurde gefunden, das die Gewebeniveaus des Cephalosporins die der Verabreichung des Hochverhältnis-Cephalosporin-Komplexes folgten, die Plasmaniveaus in beidem, der Konzentration des Arneimittels und der Länge der Zeit der Arzneimittelretention übertreffen. Er ist therapeutisch wirksam in der Prophylaxe für Zeiträume von bis zu sieben Tagen oder länger, in denen das Cephalosporin bioverfügbar ist, um die bakterielle Vermehrung zu stoppen. Die Beladung eines RES-Organs - eine Begleiterscheinung der Hochverhältnis-Cephalosporin-Komplex-Verabreichung - wie der Milz mit Cephalsoporin, kann selbst in Abwesenheit meßbarer Plasmaniveaus des Arzneimittels ein Schutz gegen Organismen im Blut (z.B. Bakterämie) gewähren.
Das Verfahren dieser Erfindung wird in einigen Ausführungsformen durch die Komplexgröße beeinflußt. Die prophylaktische Aufnahme durch das RES tritt am schnellsten mit Komplexen auf, die größer als 0,5 µ im Durchmesser sind. Folglich wird, wenn verlängerte Zeiträume von Plasmaniveaus des Cephalosporins das primäre Ziel sind, dies durch die Verwendung von Komplexen von weniger als 0,5 µ im Durchmesser gefördert, während die RES-Beladung durch die Verwendung von Komplexen von ca. 0,5 µ oder größer erleichtert wird. In jeder Situation wird das RES letztlich das intrakorporale Medikamentendepot von vielem der verabreichten Dosierung des Hochverhältnis-Cephalosporin-Komplexes sein.
Obgleich konventionelle Liposome, einschließlich MLV's kleiner beschallter unilamellarer Vesikel, großer lamellarer Vesi-kel, LUVET's, SPLV's, FATMLV's, steroidaler Liposome oder alpha-Tocoperol-basierender Vesikel nützlich zur Prophylaxe in der Ausübung dieser Erfindung sind, sind Hochverhältnis- Cephalosporin:Lipid-Komplexe bevorzugt.
In einem lipidbasierenden Arzneimittelfreisetzungssystem wird ein bioaktives Mittel, wie ein Arzneimittel, in einem Lipid eingeschlossen oder mit ihm assoziiert, wie in einer Cephalosporin:Lipid-Einheit, und dann dem zu behandelnden Patienten verabreicht. Zum Beispiel, siehe Rahman et al., U.S. Patent Nr. 3.993.754; Sears, U.S. Patent Nr. 4.145.410; Papahadjopoulos et al., U.S. Patent Nr. 4.235.871; Schneider, U.S. Patent Nr. 4.114.179; Lenk et al., U.S. Patent Nr. 4.522.803; und Fountain et al., U.S. Patent Nr. 4.588.578.
Die Art der Verabreichung des aktives Mittel: Lipid-Komplexes kann die Orte und Zellen in den Organismen, an denen die Verbindung abgegeben wird, bestimmen. Der Cephalosporin:Lipid- Komplex (oder andere antibakterielle oder antiinfektiöse Mittel) kann allein verabreicht werden, er wird jedoch im allgemeinen in Zusammenmischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht, der im Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsroute und die übliche pharmazeutische Praxis ausgewählt wird. Der iodierte Kontrastmittel-Komplex wird ähnlich verabreichbar sein. Die Präparate können parenteral injiziert werden, zum Beispiel intraarteriell oder intravenös. Die Präparate können auch über orale, subkutane oder intramuskuläre Routen oder durch Inhalation verabreicht werden. Zur parenteralen Verabreichung können sie zum Beispiel in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, die andere gelöste Bestandteile, zum Beispiel genügend Salze oder Glucose, enthalten kann, um die Lösung isotonisch zu machen. Andere Verwendungen können, abhängig von den den besonderen Eigenschaften des Präparats, von den Fachleuten in Betracht gezogen werden. In einigen Ausführungsformen kann Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid- Komplex-Cephalosporin in einer Einheitsdosierungsform verwendet werden, angepaßt an eine bequeme Verabreichung an das zu behandelnde Tier, einschließlich des Menschen,.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" soll so zu verstehen sein, daß sie eine ausreichende Menge bedeutet, um eine physikalische oder physiologische Reaktion zu erreichen. Die therapeutisch wirksame Menge eines gegebenen Cephalosporins wird von der Art der Verabreichung, den Besonderheiten des Empfängers, der Empfindlichkeit des Zielbakteriums und anderen, im Stand der Technik gut bekannten Faktoren abhängen. Eine therapeutisch wirksame Menge eines Kontrastmittels wird mit der Ansicht des zu behandelnden Patienten und mit der Natur des Röntgenaufnahmegerätes variieren, jedoch leicht durch empirische Beobachtung von Fachleuten bestimmbar sein.
Zur Verabreichung an Menschen in der heilenden Behandlung von Erkrankungszuständen oder zur Bildgebung wird der verschreibende Arzt letztlich die geeignete Dosierung für einen gegebenen menschlichen Patienten bestimmen, und es kann erwartet werden, daß die Dosis entsprechend dem Alter, Gewicht und der Reaktion des Individuums, ebenso wie der Natur und Schwere der Erkrankung des Patienten variieren wird. Die Dosierung des Arzneimittels in der Cephalosporin:Lipid-Komplex- Form oder für den iodierten Kontrastmittel:Lipid-Komplex wird wird im allgemeinen ungefähr derjenigen entsprechen, die für das freie Arzneimittel angewendet wird. In einigen Fällen kann es jedoch notwendig sein, Dosierungen außerhalb dieser Grenzen zu verabreichen.

Beispiel 1

Herstellung des Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplexes

In einem 50 ml Rundkolben wurden 92 µl einer 300 mg/ml Cefazolin-Natrium-Stammlösung durch Zugabe von 1,908 ml dH&sub2;O auf 2 ml verdünnt (insgesamt 26,2 mg Arzneimittel). 2 Ml 100%iges Ethanol wurden zusammen mit 2,5 ml einer 20 mg/ml Lipid(DPPC)-Stammlösung (insgesamt 50 mg Lipid) hinzugegeben. Der Kolben wurde in ein zirkulierendes Wasserbad von 37ºC eingetaucht, während ein Luftstrom verwendet wurde, um die resultierende Lösung zu rühren. Der Luftstrom wurde so eingestellt, daß er stark genug war, die Mischung während der Lösungsmittelentfernung sorgfältig zu mischen und zu rühren. Nach 1,5 bis 2 Minuten wechselte die Mischung von der dispergierten Biphase (trüb) zur Monophase (klar). Als die Lösungsmittelentfernung fortgesetzt wurde, wurde die Mischung opak und gelatinös oder gelartig. Der Gelzustand zeigte die fortdauernde Hydratation an. Das Abführen wurde für 5 Minuten bis zu dem Zeitpunkt fortgesetzt, an dem nur ein sehr schwacher Geruch von Ethanol wahrzunehmen war. An diesem Punkt war die Cephalosporin: Lipid-:wässrige Mischung dick und etwas gelatinös. Die Mischung wurde kurz in einem zirkulierenden Wasserbad von 51ºC erhitzt, bis sie sich verflüssigte; dies erforderte ca. 15 Sekunden. Die Mischung wurde dann in 2-1,5 ml konische Microfuge-Röhren überführt und bei 15000 upm in der Mikrofuge für 10 - 15 Minuten zentrifugiert, wobei sich ein Cephalosporin:Lipid-Komplex- Pellet bildete. Die wässrige Phase wurde von dem Pellet entfernt und 145 mM Salzlösung wurde hinzugegeben, um die Röhre zu füllen. Die Röhre wurde kurz verwirbelt, bis das Pellet sorgfältig resuspendiert war. Der Cephalosporin:Lipid-Komplex wurde erneut wie oben zentrifugiert und resuspendiert. Der resultierende Cephalosporin:Lipid-Komplex wurde zwei weitere Male gewaschen, entweder wie oben beschrieben oder für das anschließende Waschen mit anderen Materialien, einschließlich anderer Chargen des Cephalosporin:Lipid-Komplexes, kombiniert. Wenn die Komplexe zu kombinieren waren, wurde jeder in eine einzelne Corex -Röhre (Corning Glass Works, Corning, NY) nach der ersten erneuten Suspendierung überführt und bei 10000 g für 10 - 15 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde von dem Pellet entfernt und das Pellet wurde in der Salzlösung wie oben beschrieben erneut suspendiert. Das gewaschene Pellet wurde auf Arzneimittel, Lipid und zurückgebliebenes Ethanol untersucht. Die Ergebnisse dieser Tests offenbarten 18,1 mg Arzneimittel/ml, 32,3 mg/ml Lipid und 2% zurückgebliebenen Alkohol.

Beispiel 2

Herstellung des Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplexes

In einem 50 ml Rundkolben wurden 217 µl einer 300 mg/ml Cefazolin-Natrium-Stammlösung (insgesamt 65,1 mg des Arzneimittels) durch Zugabe von 1,783 ml dH&sub2;O auf 2 ml verdünnt. 2 Ml 100%iges Ethanol wurden zusammen mit 2,5 ml einer 20 mg/ml Lipid(DPPC)-Stammlösung (insgesamt 50 mg des Lipids) hinzugegeben. Der Kolben wurde in ein zirkulierendes Wasserbad von 37ºC eingetaucht, während ein Luftstrom verwendet wurde, um die resultierende Lösung zu rühren. Der Luftstrom wurde so eingestellt, daß er stark genug war, die Mischung während der Lösungsmittelentfernung sorgfältig zu mischen und zu rühren. Nach 1,5 bis 2 Minuten wechselte die Mischung von einer dispergierten Biphase (trüb) zu einer Monophase (klar). Als die Lösungsmittelentfernung fortgesetzt wurde, wurde die Mischung opak und gelatinös oder gelartig. Der Gelzustand zeigte die fortdauernde Hydratation an. Das Abführen wurde für 5 Minuten bis zu dem Zeitpunkt fortgesetzt, an dem nur ein sehr schwacher Geruch von Ethanol wahrzunehmen war. An diesem Punkt war die Cephalosporin :Lipid:wässrige Mischung dick und etwas gelatinös. Die Mischung wurde kurz in einem zirkulierenden Wasserbad von 51ºC erhitzt, bis sie sich verflüssigte; dies erforderte ca. 15 Sekunden. Die Mischung wurde dann in 2-1,5 ml konische Mikro-fuge-Röhren überführt und bei 15000 upm in der Mikrofuge für 10 - 15 Minuten zentrifugiert, wobei sich ein Cephalosporin:Lipid-Komplex- Pellet bildete. Die wässrige Phase wurde von dem Pellet entfernt und 145 mM Salzlösung wurden hinzugegeben, um die Röhre zu füllen. Die Röhre wurde kurz verwirbelt, bis das Pellet sorgfältig resuspendiert war. Der Cephalosporin:Lipid-Komplex wurde erneut, wie oben zentrifugiert und resuspendiert. Der resultiernde Cephalosporin:Lipid-Komplex wurde zwei weitere Male gewaschen, entweder wie oben beschrieben oder für das anschließende Waschen mit anderen Materialien kombiniert, einschließlich anderer Chargen des Cephalosporin:Lipid-Komplexes. Wenn die Komplexe zu kombinieren waren, wurde jeder in eine einzelne Corex -Röhre (Corning Glass Works, Corning, NY) nach der ersten erneuten Suspendierung überführt, und bei 10000 g für 10 - 15 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde von dem Pellet entfernt und das Pellet wurde in Salzlösung, wie oben beschrieben, erneut suspendiert. Das gewaschene Pellet wurde auf Arzneimittel, Lipid und zurückgebliebenes Ethanol untersucht. Die Ergebnisse dieser Tests offenbarten 11,5 mg Arzneimittel/ml, 14,9 mg/ml Lipid und 2% zurückgebliebenen Alkohol. Der Einschlußkoeffizient des Cephalosporins betrug 74% und das endgültige Cephalosporin:Lipid-Verhältnis betrug 0,77:1.

Beispiel 3

Herstellung des Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplexes

In einem 50 ml Rundkolben wurden 434 µl einer 300 mg/ml Cefazolin-Natrium-Stammlösung (insgesamt 130 mg des Arzneimittels) durch Zugabe von 1,566 ml dH&sub2;O auf 2 ml verdünnt. 2 ml 100%iges Ethanol wurden zusammen mit 2,5 ml einer 20 mg/ml Lipid(DPPC)-Stammlösung (insgesamt 50 mg des Lipids) hinzugegeben. Der Kolben wurde in ein zirkulierendes Wasserbad von 37ºC eingetaucht, während ein Luftstrom verwendet wurde, um die resultierende Lösung zu rühren. Der Luftstrom wurde so eingestellt, daß er stark genug war, die Mischung während der Lö-Sungsmittelentfernung sorgfältig zu mischen und zu rühren. Nach 1,5 bis 2 Minuten wechselte die Mischung von einer dispergiertten Biphase (trüb) zu einer Monophase (klar). Als die Lösungsmittelentfernung fortgesetzt wurde, wurde die Mischung opak und gelatinös oder gelartig. Der Gelzustand zeigte die fortdauernde Hydratation an. Das Abführen wurde für 5 Minuten bis zu dem Zeitpunkt fortgesetzt, an dem nur ein sehr schwacher Geruch von Ethanol wahrzunehmen war. An diesem Punkt war die Cephalosporin-:Lipid:wässrige Mischung dick und etwas gelatinös. Die Mischung wurde kurz in einem zirkulienden Wasserbad von 51 ºC erhitzt bis sie sich verflüssigte; dies erforderte ca. 15 Sekunden. Die Mischung wurde dann in 2-1,5 ml konische Mikrofuge-Röhren überführt und bei 15000 upm in der Mikrofuge für 10 - 15 Minuten zentrifugiert, wobei sich ein Cephalosporin:Lipid-Komplex- Pellet bildete. Die wässrige Phase wurde von dem Pellet entfernt und 145 mM Salzlösung wurde hinzugegeben, um die Röhre zu füllen. Die Röhre wurde kurz vermischt, bis das Pellet sorgfältig resuspendiert war. Der Cephalosporin:Lipid-Komplex wurde erneut wie oben zentrifugiert und resuspendiert. Der resultierende Cephalsoporin:Lipid-Komplexes wurde zwei weitere Male gewaschen, entweder wie oben beschrieben oder für das anschließende Waschen mit anderen Materialien, einschließlich anderer Chargen des Cephalosporin:Lipid-Komplexes kombiniert. Wenn die Komplexe zu kombinieren waren, wurde jeder in eine einzelne Corex - Röhre (Schweraufgaben-Glasröhre) (Corning Glass Works, Corning, NY) nach der ersten erneuten Suspendierung überführt und bei 10000 g für 10 - 15 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde von dem Pellet entfernt und das Pellet wurde in der Salzlösung, wie oben beschrieben, erneut suspendiert. Das gewaschene Pellet wurde auf Arzneimittel, Lipid und zurückgebliebenes Ethanol untersucht. Die Ergebnisse dieser Tests offenbarten 19 mg Arzneimittel/ml, 13,9 mg/ml Lipid und 2% zurückgebliebenen Alkohol. Der Einschlußkoeffizient des Cephalosporins betrug 60% und das endgültige Cephalosporin: Lipid-Verhältnis betrug 1,43:1.

Beispiel 4

Cephalosporin:Lipid-Herstellung

2,5 ml einer 50 mg/ml Cephapirin-Natrium-Lösung wurden verwendet, um 200 mg CHStris unter mechanischem Rühren zu dispergieren und zu hydratisieren. Nach dem Rühren der resultierenden Suspension für 1 Minute wurde die Suspension für 3 Stunden bei 4ºC auf einen Schaukelrahmen gegeben. Die Suspension wurde einheitlich in ihrer Erscheinung und dann auf 3 ml mit phosphatgepufferter Salzlösung (Mg²&spplus;- und Ca²&spplus;-frei) bei pH 7,4 verdünnt. Die endgültige Suspension enthielt 40 mg Cephapirin/ml, bestimmt durch den Agar-Diffusionstest.

Beispiel 5

Cephalosporin:Lipid-Komplex-Herstellung

2 g CHStris und 1,075 g Cephapirin-Natrium wurden ausgewogen und in einen 125 ml Erlenmeyerkolben überführt. 20 ml destilliertes Wasser wurden zu dem Kolben gegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei 4ºC geschüttelt. 35 ml phosphatgepufferte Salzlösung (Mg²&spplus;- und Ca²&spplus;-frei) bei pH 7,4 wurde zu der Mischung gegeben, die dann in 2 30 ml Corex -Röhren überführt und für 30 Minuten bei 10000 g zentrifugiert wurde. Die überstehende Lösung wurde dekantiert und das Pellet des Cephalosporin:Lipid-Komplexes wurde erneut in 20 ml phosphatgepufferter Salzlösung pro Röhre suspendiert und die Röhren wurde erneut wie oben zentrifugiert. Das endgültige Pelletvolumen betrug 22 ml. Die endgültige Arzneimittelkonzentration in dem Pellet betrug 17,1 mg/ml, bestimmt durch den Agardiffusionstest. Das endgültige Cephalosporin:Lipid-Verhältnis betrug 6:1.

Beispiel 6

Cephalosporin:Lipid-Komplex-Herstellung

20 ml einer Stammlösung von EPC bei 100 mg/ml in CHCl&sub3; wurden mit 100%igem Ethanol in einem 500 ml Rundkolben auf 200 ml verdünnt. 1,075 g Cephapirin-Natrium, gelöst in soviel destilliertem Wasser, daß das endgültige Volumen 6 ml betrug, wurden hinzugegeben. Eine klare, gelbe Monophase entstand. Die Monophase wurde auf einen Rotationsverdampfer mit einem 40ºC- Wasserbad und einem Druck von 740 mmHg gegeben, bis die Monophase als trockener Lipid/Arzneimittel-Film erschien und kein Ethanolgeruch mehr nachweisbar war. Die Rotationsverdampfung erforderte 30 +/- 5 Minuten. Der Film wurde erneut in 30 ml phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert und in 2 30 ml Corex -Röhren überführt. Die Röhren wurden bei 10000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Die überstehenden Lösungen wurden dekantiert, die Pellets erneut in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung suspendiert und erneut wie oben zentrifugiert. Das endgültige Volumen des Cephalosporin:Lipid-Komplexes betrug 12 ml. Die endgültige Arzneimittelkonzentration betrug 15,7 mg/ml, bestimmt durch den Agardiffusionstest, und das endgültige Cephalosporin:Lipid-Verhältnis betrug 11:1 (w/w).

Beispiel 7

Cephalosporin:Lipid-Komplex - Verlängerte Serumaktivität

Die Cephapirin-Aktivität im Serum von Mäusen wurde in Intervallen nach subkutaner oder intravenöser Verabreichung des freien oder komplexierten Arzneimittels bestimmt. Fig. 8 zeigt die Resultate eines typischen Experimentes. Die maximale Aktivität wurde im Serum von Mäusen, denen freies Cephapirin (über jeden Weg) gegeben worden war, an den frühesten untersuchten Zeitpunkten (eine halbe bis eine Stunde nach der Injektion) gefunden. Die Halbwertszeit des freien Arzneimittels wurde auf ca. 20 Minuten für beide, die intravenöse und die subkutane Verabreichung bestimmt. Für das freie Arzneimittel war nach 3 Stunden oder später keine Aktivität messbar. Tieren, denen ähnliche Dosierungen von ungewaschenem CHS-tris-Cephapirin (mit ca. 30% der verabreichten Dosis eingeschlossen) subkutan verabreicht worden war, zeigten eine verlängerte Serumaktivität mit noch vorhandenen Niveaus von ca. 0,2 ug/ml (0,01% der ursprünglichen Dosis) 24 Stunden nach der Injektion. Mäuse, die den gewaschenen EPC-Komplex (worin 100% der verabreichten Dosis eingeschlossen war) durch die intravenöse Route erhielten, zeigten ebenfalls eine verlängerte Serumaktivität. Mit einer 200 mg/kg-Dosis betrugen die Serumniveaus 10 µg/ml oder mehr für 24 Stunden nach der Injektion. In beiden Cephalosporin :-Lipid-Komplex-Fällen war die offensichtliche Halbwertzeit des Arzneimittels im Serum größer als vier Stunden.
Die intravenöse Verabreichung von 200 mg/kg des freien Cephapirins führte zu einer nachweisbaren Aktivität in der Leber und der Niere eine Stunde nach der Injektion (Tabelle 1). Keine Aktivität wurde nach 3 Stunden oder später nachgewiesen. Mäuse, die den EPC-Cephalosporin:Lipid-Komplex erhalten hatten, zeigten eine Aktivität in der Niere für 24 Stunden nach der Injektion. Die Milz und die Leber zeigten eine außerordentlich erhöhte Aktivität, die für mindestens 24 Stunden andauerte.

Beispiel 8

Cephalosporin:Lipid-Komplex - Verlängerte Serumaktivität

Die intravenöse Injektion einer einfachen 100 mg/kg-Dosis von freiem Cefazolin-Natrium in Mäusen führte zu einer durchschnittlichen Serumkonzentration von von 8 bis 20 µg/ml eine Stunde nach der Dosierung (Fig. 9). Das Serumniveau nahm rasch auf 2 µg/ml nach 2 Stunden ab und ist 3 Stunden nach der Verabreichung unter der Nachweisgrenze. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die den Cephalosporin:Lipid-Komplex mit der gleichen 100 mg/kg-Dosis Cefazolin erhalten hatten, Serumkonzentrationen von 55 bis 80 µg/ml nach einer Stunde, und hatten noch Niveaus von 2 bis 3 ug/ml 12 Stunden nach der Dosierung.

Beispiel 9

Cephalosporin:Lipid-Komplex

Prophylaxe der lokalisierten Staphylokokkeninfektion

Um die Wirkung der Behandlung auf die Abszeßentwicklung zu bestimmen, wurde Mäusen eine einfache intravenöse oder subkutane Injektion von freien oder komplexierten Cephapirin zu verschiedenen Zeiten vor oder nach der Infektion gegeben. Fig. 10 zeigt, daß die Behandlung mit einer einfachen Dosis (200 mg/kg) von freiem Cephapirin (über jede Route) keine Wirkung auf die Abszeßgröße hatte, wenn es vier Stunden vor der Infektion gegeben wurde. Die Behandlung eine Stunde vor der Infektion verringerte die Abszeßgröße etwas, während die Behandlung eine Stunde nach der Infektion die Abszeßentwicklung signifikant verringerte oder verhinderte. Im Gegensatz dazu ergab die Behandlung mit Cephalosporin:Lipid-Komplex-Cephapirin (entweder iv mit EPC-Komplex oder sc mit CHSt-Komplex) einen signifikanten Schutz gegen die Abszeßentwicklung, wenn es bis zu vier Stunden vor der Infektion ebenso wie eine Stunde nach der Infektion verabreicht wurde. Eine zusätzliche Untersuchung ergab, daß leere iv-verabreichte EPC-Liposome oder leere sc- verabreichte CHSt-Liposome keinen Einfluß auf die Abszeßgröße hatten, und daß die Verabreichung von leeren EPC-Liposomen plus freiem Arzneimittel ähnliche Resultate wie das freie Arzneimittel allein ergab.

Beispiel 10

Cephalosporin: Lipid-Komplex

Prophylaxe der systemischen Staphylokokkeninfektion

Die Wirkung von freiem und CHStris-Cephalosporin:Lipid- Komplex-Cephapirin wurde in einem akuten Staphylococcus- Septikämie-Modell verglichen. Tabelle 2 zeigt, daß 70 bis 80% der unbehandelten Tiere innerhalb von 72 Stunden nach der Infektion starben. Mäuse, die mit freiem oder Cephalosporin :-Lipid-Komplex eine Stunde vor der Infektion behandelt worden waren, lebten bis zum Ende des Experiments (14 Tage). Die Behandlung 4 Stunden vor der Infektion mit dem Cephalosporin :-Lipid-Komplex, schützte die Mehrzahl der Mäuse, während die Behandlung mit dem freien Arzneimittel zu dieser Zeit keinen Einfluß auf das Überleben hatte.

Beispiel 11

Cephalosporin:Lipid-Komplex

Therapie der systemischen Salmonellose

Mäusen (in Gruppen von 10), denen intravenös 700 CFU S.Typhimurium inokuliert wurde, und die keine Behandlung erhielten, starben innerhalb von 6 bis 8 Tagen nach der Infektion (Fig. 11). Die Behandlung an den Tagen 2 und 4 nach der Inokulation mit freiem Cephapirin durch die subkutane oder I.V.- Route verlängerte das Überleben nicht. Die intravenöse Behandlung mit Cephapirin in einem ungewaschenen stearylaminenthaltenden EPC-Komplex erhöhte das Überleben. In diesem Fall war die Cephalosporin:Lipid-Komplex-Herstellung nicht gewaschen, so daß 30% der verabreichten Dosis eingeschlossen war.

Beispiel 12

Kontrastmittel:Lipid-Komplex-Herstellung

Zwei ml Amidotrizoat (Renografin-76 , Squibb, Princeton, N.Y.) in der Form der Natrium- und Megluminsalze bei 370 mg/ml, wurden in einen 100 ml Rundkolben gegeben. Dazu wurde unter Rühren 2 ml absolutes Ethanol gegeben, gefolgt von der Zugabe von 50 mg hydriertem Soyaphosphatidylcholin in 2,5 ml Chloroform. Das Material in dem Kolben wurde durch heftiges Schütteln des Kolbens unter Bildung einer Emulsion vermischt. Die chloroformorganische-Lösungsmittelphase wurde, um das Material zu rühren, unter Verwendung eines Stickstoffstroms mit einer Fließgeschwindigkeit zwischen ca. 5 bis 10 Lpm entfernt, während der Kolben in einem 30ºC-Wasserbad eingetaucht war. Die Lösungsmittelentfernung wurde für 10 Minuten fortgesetzt. Dann wurden 7 ml einer 0,9%igen Salzlösung zu dem Kolben gegeben, und das Mischen wurde durch Schütteln vollendet. Das Material wurde dann in eine 15 ml Corex -Röhre überführt und bei ungefähr 10000 x g für 15 Minuten bei 20ºC zentrifugiert. Die überstehende Lösung wurde entfernt und das Pellet erneut in 10 ml 0,9%iger Salzlösung suspendiert und die Waschprozedur wurde noch zweimal wiederholt. Der resultierende Kontrastmittel :-Lipid-Komplex enthielt 58,7 mg/ml Iod (94,7 mg Amidotrizoat) und 20,8 mg/ml Phospholipid für ein endgültiges Iod:Lipid- Verhältnis von 2,8:1. TABELLE 1 Gewebeverteilung der Cephapirin-Aktivität nach intravenöser Verabreichung der freien oder EPC-Komplex-Formulierung Gewebe Formulierung Niere Milz Leber frei EPC-Komplex a) Die eingegebenen Werte sind Durchschnittswerte von 3 bis 5 Mäusen +/- S.E.M. TABELLE 2 Wirkung von freiem und CHS-tris-Komplex-eingeschlossenem Cephapirin auf das Überleben von Mäusen mit akuter staphylococcaler Septikämie % Überleben nach 72 Stunden a) Zeit der Behandlung Dosis (mg/kg) freies Cephapirin CHSt-Cephapirin Stunden keine Behandlung a) Die Mäuse wurden subkutan 1 Stunde oder 4 Stunden vor der intraperitonealen Injektion von 2 x 10&sup8; CFU S. Aureus behandelt. Es waren 10 Mäuse in jeder Gruppe. TABELLE 3 Wirkung von freiem und CHS-tris-Komplex- eingeschlossenem-Cephapirin auf das Überleben von Mäusen mit akuter staphylococcaler Septikämie mgI dosiert mg/kg Iod mg Lipid dosiert mg/kg Lipid mgI/g Leber

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid-Komplexes, der ein Lipid und ein aktives Mittel umfaßt, wobei das Verfahren umfaßt:

a. Bereitstellen des aktiven Mittels in einer Monophase, die eine erste wässrige Phase, ein Wasser-mischbares organisches Lösungsmittel und ein Lipid umfaßt;

b. Abdampfen des organischen Lösungsmittels aus der Monophase, während das aktive Mittel und das Lipid in hydratisierter Form erhalten wird; und

c. Zugeben einer zweiten wässrigen Phase zu der eingedampften Monophase von Schritt (b), um Liposome zu bilden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt des Bereitstellens des aktiven Mittels in einer Monophase umfaßt: Anfängliches Bereitstellen des aktiven Mittels in einer biphasischen Mischung, wobei die biphasische Mischung eine erste wässrige Phase, ein Wasser-mischbares organisches Lösungsmittel, ein nicht Wasser-mischbares organisches Lösungsmittel und ein Lipid umfaßt; und Eindampfen der biphasischen Mischung, um die genannte Monophase zu bilden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die genannte biphasische Mischung ungefähr gleiche Mengen (v/v) des (i) in der ersten wässrigen Phase gelösten aktiven Mittels, (ii) des genannten Wasser-mischbaren organisches Lösungsmittels und (iii) des im genannten nicht Wasser-mischbaren organischen Lösungsmittel gelösten Lipids umfaßt, worin genanntes Wassermischbares organisches Lösungmittel Ethanol ist, und genanntes nicht Wasser-mischbares organisches Lösungsmittel Chloroform ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Lipid ein rigides Lipid und das aktive Mittel ein Cephalosporin ist, worin der resultierende Cephalosporin:Lipid-Komplex mindestens 20% (w/w) Cephalosporin ist, und worin wahlweise das Abdampfen bei Überdruck bei 30 bis 37ºC stattfindet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Cephalosporin im resultierenden Cephalosporin:Lipid-Komplex mindestens 30% (w/w), wahlweise mindestens 40% (w/w) und weiter wahlweise mindestens 50% (w/w) beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, worin das Lipid eine Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten umfaßt, wobei die Ketten gesättigt und von einer Länge von wenigstens 16 Kohlenstoffeinheiten sind, worin das Lipid wahlweise Dipalmitoylphosphatidylcholin ist, und worin weiter genanntes Dipalmitoylphosphatidylcholin wahlweise bis zu 80% (w/w) des Komplexes umfaßt.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 4 bis 6, worin das Cephalosporin Cefazolin, Cephapirin, Cephalotin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium ist.

8. Hochverhältnis-Cephalosporin:Lipid-Komplex, der ein Lipid und ein Cephalosporin umfaßt, und worin wahlweise das genannte Lipid eine rigides Lipid ist, und worin der Cephalosporin:Lipid-Komplex wenigstens 20% (w/w) Cephalosporin ist.

9. Komplex nach Anspruch 8, worin das Cephalosporin wenigstens 30% (w/w), wahlweise wenigstens 40% (w/w) und weiter wahlweise wenigstens 50% (w/w) ist.

10. Komplex nach Anspruch 8 oder 9, worin das Lipid eine Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten umfaßt, wobei genannte Ketten gesättigt und von einer Länge von wenigstens 16 Kohlenstoffeinheiten sind, worin das Lipid wahlweise Dipalmitoylphosphatidylcholin ist, und worin weiter genanntes Dipalmitoylphosphatidylcholin wahlweise bis zu 80% (w/w) des Komplexes umfaßt.

11. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 10, worin das Cephalosporin Cefazolin, Cephapirin, Cephalothin, Cefaclor, Cephaloridin, Cephoxazol, Cefoxitin, Cephradin, Cephalexin, Cephaloglycin, Cefuroxim, Cefmenoxim oder Cephalonium ist.

12. Zusammensetzung zur Verwendung in der Prophylaxe bakterieller Infektionen in einem Tier einschließlich Menschen, die eine wirksame Menge des Cephalosporin:Lipid-Komplexes nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11 umfaßt.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, worin die bakterielle Infektionsprophylaxe gegen Bakteriämie; eine disseminierte bakterielle Infektion, die das retikuloendotheliale System, die Bakterie Mycobacterium sp beinhaltet; oder Osteomyelitis ist.

14. Verfahren zur Herstellung eines Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid-Komplexes nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das aktive Mittel ein iodiertes Kontrastmittel ist, worin das Iod zu Lipid-Verhältnis des Komplexes größer als 1:1 (w/w) ist, und worin das Eindampfen wahlweise bei Überdruck bei 30 bis 75ºC erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das Iod zu Lipid- Verhältnis des Komplexes mindestens 2:1 (w/w), wahlweise mindestens 4:1 (w/w) und weiter wahlweise mindestens 8:1 (w/w) beträgt.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin das Lipid ein rigides Lipid umfaßt, worin das Lipid wahlweise eine Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten umfaßt, wobei die genannten Ketten gesattigt und von einer Länge von mindestens 16 Kohlenstoffeinheiten sind, und weiter worin genanntes Lipid wahlweise Dipalmitoylphosphatidylcholin ist, genanntes Dipalmitoylphosphatidylcholin wahlweise so wenig wie 20% bis 7 % (w/w) des Komplexes umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, worin das Lipid Phosphatidylcholin umfaßt.

18. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17, worin das Kontrastmittel Amidotrizoat, Iocetaminsäure, Iodamid, Iodoxamat (Iodoximat), Iopamid, Iopamidol, Iopansäure, Iofendylat, Iothalamat, Iotalaminsäure, Calciumiopodat, Natriumiopodat, Metrizamid oder Tyropanoat (Tyropanat) oder Salze davon ist.

19. Hochverhältnis-iodiertes Kontrastmittel:Lipid-Komplex, der ein Lipid und ein iodiertes Kontrastmittel umfaßt, worin das Iod zu Lipid-Verhältnis größer als 1:1 (w/w) ist.

20. Komplex nach Anspruch 19. worin genanntes Lipid ein rigides Lipid ist, worin das Lipid wahlweise eine Kopfgruppe und zwei Kohlenstoffketten umfaßt, worin die genannten Ketten gesättigt und von einer Länge von wenigstens 16 Kohlenstoffeinheiten sind, und worin weiter genanntes Lipid wahlweise Dipalmitoylphosphatidylcholin ist, wobei genanntes Dipalmitoylphosphatidylcholin wahlweise so wenig wie 20 bis 7% (w/w) des Komplexes umfaßt.

21. Komplex nach Anspruch 19, worin das Lipid Phosphatidylcholin ist.

22. Komplex nach irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21, worin das Iod zu Lipid-Verhältnis des Komplexes mindestens 2:1 (w/w), wahlweise mindestens 4:1 (w/w), und weiter wahlweise mindestens 8:1 (w/w) beträgt.

23. Komplex nach jedem der Ansprüche 19 bis 22, worin das Kontrastmittel Amidotrizoat, Amidotrizoesäure, Iocetaminsäure, Iodamid, Iodoxamat (Iodoximat), Iohexol, Iopamid, Iopamidol, Iopansäure, Iofendylat, Iothalamat, Iotalaminsäure, Iopodat, Metrizamid oder Tyropanoat (Tyropanat) oder Salze davon ist.

24. Zusammensetzung, die einen iodiertes Kontrastmittel :-Lipid-Komplex umfaßt, zur Verwendung zur Steigerung der Röntgenstrahlen-Dichte in einem Tier einschließlich Menschen, der eine wirksame Menge des Hochverhältnis-aktives Mittel:Lipid- Komplexes nach den Ansprüchen 19 bis 23 umfaßt.