DE69530124T2

DE69530124T2 - Liposomale antibakterielle zusammensetzung mit geringer festigkeit

Info

Publication number: DE69530124T2
Application number: DE69530124T
Authority: DE
Inventors: Jacqueline Lagace; Christian Beaulac; Sebastien Clement-Major
Original assignee: Universite de Montreal
Current assignee: Universite de Montreal
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-22
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2015-12-23
Also published as: ATE235229T1; EP0806941A1; WO1996019972A1; ES2196092T3; JPH10511363A; MX9704679A; NZ297364A; PT806941E; JP4523078B2; DK0806941T3; KR980700062A; DE69530124D1; EP0806941B1; BR9510423A; AU702463B2; CA2206296C; US5662929A; AU4251096A; KR100438657B1; CA2206296A1

Description

Hintergrund der Erfindung 1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Liposomenformulierung, ein antimikirobielles Mittel enthält. Darüber hinaus betrifft sie eine einzigartige Liposomenformulierung, die eine modulierte Freisetzung des antimikrobiellen Mittels über einen Zeitraum ermöglicht sowie eine erhöhte Penetration eines antimikrobiellen Mittels in bakterielle Zellen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Formulierung zur Behandlung bakterieller Infektionen in einem Tier.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Die Verkapselung bioaktiver Verbindungen in natürlichen odersynthetischen Matrizes wurde in den letzten Jahrzehnten ausführlich untersucht. Die Vorteile einer solchen Verabreichungs-Strategie sind zahlreich. Zum einen erlaubt sie einen Schutz der bioaktiven Verbindung gegen Inaktivierung oder Abbau. Zum zweiten regelt sie die Freisetzungskinetik der Verbindung und ermöglicht so die Optimierung des Blutkonzentrations-Profils. Dadurch werden die schädlichen Effekte bioaktiver Verbindungen mit kurzen Halbwertszeiten verringert. Zusätzlich ermöglicht es eine Verringerung der Toxizitätsrisikos.
Liposomen sind geschlossene mikroskopisch kleine Vesikel, die sich in Gegenwart eines Überschusses an Wasser spontan aus Phopholipiden oberhalb deren Übergangstemperatur bilden. Es können bei Vorliegen eines Überschusses an Wasser Vesikel mit einem Durchmesser von 20 Nanometer bis zu mehreren Mikrometern erzeugt werden. Mehrschichtige Liposomen werden aus konzentrischen Phospholipid-Doppelschichten hergestellt, die durch wässrige Schichten voneinander getrennt sind. Einschichtige Liposomen bestehen aus einer einzelnen Phospholipidschicht, die einen wässrigen Kern umgibt. Liposomen können hydrophile Moleküle in den wässrigen Bereichen und lipophile Moleküle in den Lipid-Doppelschichten beherbergen.
Das Potential von Liposomen als Vehikel therapeutischer Mittel, oder therapeutische Liposomenformulierungen, wurden von mehreren Forschern untersucht. Es sind erfolgreiche Behandlungen mit Liposomen gegen intrazelluläre Bakterien gezeigt worden (Lopez-Berenstein et al., 1987, J. Clin. Oncology, 5: 310–317; und Popescu et al., 1991, US 4,981,692 ). Eine Anzahl Studien hat außerdem gezeigt, dass Liposomen-eingeschlossene antibakterielle Mittel die therapeutischen Indizes dieser Mittel als Folge deren verringerte Toxizität, der Modifikation der Pharmakokinetik und der Gewebe-Verteilungsparameter erhöhen (Lagace et al., 1991, J. Mikroenkapsulation 8: 53–61 mit weiteren Referenzen; Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1090-1095).
Der meist verbreitete Typ antimikrobieller Mittel sind sicherlich die Antibiotika. Antibiotika können in verschiedene Gruppen unterteilt werden, umfassend die Q-Lactame, Aminoglykoside, Makrolide, Lincomycin, Clindamycin, Tetracycline, Chloramphenicol, Vancomycin, Rifampin, Chinolone und Sulfonamide.
Die Aminoglykoside sind alle starke bakterizide Mittel, die etwa dieselbe antibakterielle Wirkung und etwa dasselbe pharmakokinetische Verhalten aufweisen. Die Mitglieder der Gruppe werden gekennzeichnet durch das Vorkommen von Aminozuckern, die glykosidisch mit Aminocycliten verbunden sind. Die Hauptmittel fallen in eine von zwei Gruppen: Die kleine Gruppe bestehend aus Streptomycin und seinen nahen Verwandten; und die großen Gruppe, die unterteilt wird in die Neomycin-Gruppe, die Kanamycin-Gruppe, die wiederum unterteilt wird in die Kanamycin, Tobramycin und deren halbsynthetische Abkömmlinge Amikacin und Dibekacin und die wichtige Untergruppe der Gentamicine und deren Verwandte Netilmicin und Sissomicin.
Die Aminoglykoside inhibieren die Proteinsynthese in einer Vielzahl von Mikroorganismen und werden hauptsächlich verwendet zur Be handlung von Infektionen durch Organismen, die gegen andere Antibiotika resistent sind, insbesondere gram-negative Bakterien wie beispielsweise Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonds, Salmonella. In unterschiedlichem Maße sind die Aminoglykoside auch wirksam gegen Staphilococcus aureus, Staphilococcus epidermidis, Listeria und Bakterien aus den Genera Mycobakteria.
Da Aminoglykoside hochpolare kationische Verbindungen sind, ist die Diffusion durch die bakterielle Zellmembran sehr eingeschränkt und eine intrazelluläre Anreicherung der antibakteriellen Mittel wirr) durch aktiven Transport erreicht. Viele Organismen zeigen Resistenz gegen die älteren Aminoglykoside. Zusätzlich steigt die Resistenz vor Mikroorganismen gegen die in jüngerer Zeit eingeführten Aminoglykoside stetig an. Zunehmende Beweise legen nahe, dass eine erworbene Antibiotika-Resistenz häufig auf einem Gleichgewicht der Penetrationsrate der äußeren Membran und der anschließend Enzyminaktivierungsrate beruht. Die Barriere der äußeren Membran und die Antbiotikaabbauenden Enzyme sind deshalb sehr stark synergistisch. Drüber hinaus gilt für ein neueres Aminoglykosid, das zwar den bakteriellen Abbauenzymen nicht unterfällt, dass es gegen bestimmte Stämme wirkt, die gegen ältere Mittel der Gruppe resistent sind; die allgemeine Wirkung ist jedoch nicht vorhersagbar, da sich die Impermialibilät einer signifikanten Anzahl von Stämmen stark unterscheidet.
Obwohl Aminoglykoside nützlich zur Behandlung von Infektionen sind, kann ihre Verwendung durch Toxizität und Nebenwirkungen begleitet werden. Die wichtigsten toxischen Effekte sind Ototoxizität und Nephrotoxizität. Da Aminoglykoside Konzentrations-bezogene Oto- und Nephrotoxizität erzeugen können, ist es wichtig sicher zu stellen, dass ihre Plasmakonzentration keine toxischen Maßen überschreite. Es ist gleichermaßen sicher zu stellen, dass die Furcht vor Toxizität nicht zu therapeutisch unangemessenen Dosierungen führt.
Die Verkapselung von Aminoglykosiden und β-Laktam-Antibiotika in Liposomenformulierungen durch das Dehydration-Rehyiration- Vesikel-(DRV)-Verfahren ist beschrieben worden (Lagace et al, 1991, J. Mikroencapsulation 8: 53–61 ). Disteroylphosphatidylcholin (DSPC) und Dimyrisoylphosphatidylglycerin (DMPG), zwei synthetische Phospholipide, wurden in einem Molverhältnis von 10 : 1 und bei einer Lipidkonzentration von 16,5 μmol/ml verwendet. Die gleiche Lipsomenformulierung wurde „in situ" in einem Tiermodell chronischer pulmorarer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa und ermöglichte eine erhebliche Verlängerung der Residenzzeit des Antibiotikums in Lungen und eine verringerte systemische Absorption des antimikrobiellen Mittels. Dessen ungeachtet zeigte diese liposomale Aminoglykosid-Formulierung keine Verbesserung in der bakteriziden Wirkung im Vergleich zu freien Antibiotika und anderen Kontrollen (Omri et al, 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1090–1995). Andere Gruppen haben liposomale Aminoglykosid-Formulierungen offenbart (Da Cruz et al, 1993, WO 93/23015 und Proffitt et al, 1994, WO 94/12155). Dessen ungeachtet konnten die offenbarten Formulierungen keine sehr drastische Verbesserung der therapeutische Wirkung des Antibiotikums im Vergleich zu dessen Wirkung in freier Form zeigen. So zeigt in der Tat die bevorzugte Aminoglykosid-(Netilmicin)-Liposomenformulierung von Da Cruz et al, die Phosphatidylcholin (PC), Cholesterin und Phosphatidyl-Inositol (PI) umfasst, nur eine geringe Steigerung der Wirkung in vivo, wobei das Aminoglykosid Teil der Liposomenformulierung ist, im Vergleich zum freien Aminoglykosid (bestenfalls um einen Faktor 3). Proffitt et al. offenbaren eine andere Aminoglykosid-(Amikacin)-Liposomenformulierung enthaltend PC, Cholesterin und listeraroylphosphatidylglycerin (DSPG). Obwohl die Formulierung nach Proffitt et al. anscheinend im Steigern der in vivo-therapeutischen Wirkung des Aminoglykosids der von Da Cruz überlegen ist, ist die Steigerung noch immer verhältnismäßig gering und gewebeabhängig (10-fache Steigerung in Milz, 5-fache in Leber und nur 2-fache in Lunge). Es ist wichtig, dass die verfügbaren Liposomenformulierungen zur Verwendung bei der Behandlung bakterieller Infektionen anscheinend den Durchtritt des therapeutischen Mittels durch die bakterielle Membran nicht signifikant erhöhen.
Zystische Fibrose (Mukoviszidose) (CF) ist eine der am meisten verbreiteten tödlichen genetischen Krankheiten des Menschen. Während der Verlauf von CF von Patient zu Patient höchst unterschiedlich ist, wird er doch großteils durch den Grad der Lungenbetroffenheit bestimmt. Bei der CF scheint der Verfall unvermeidbar und führt schließlich zum Tode. Obwohl die Prognose eines CF-Patienten in der zweiten Hälfte des Jahrhunderts drastisch verbessert wurde, beträgt das Überlebensalter nur 30 Jahre. Es ist wichtig, dass ein Zusammenhang zwischen einer frühen Besiedlung durch Pseudomonas und einer schlechteren Prognose für CF-Patienten beobachtet wurde. Zusätzlich ist die chronische Lungeninfektion durch Pseudomonas aeruginosa die Hauptursache der Morbidität und Sterblichkeit von Patienten mit zystischer Fibrose (Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1090-1095; und Merck Manual, 1992, 16. Auflage, Merok Res. Lab.). Bei CF-Patienten werden Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza und andere gram-negative Stämme als frühe Pathogene isoliert. Solche bakteriellen Infektionen von CF-Patienten werden zumeist wirksam durch Antibiotika behandelt. Eine Anzahl von Antibiotika wird für die antibakterielle Therapie verwendet, entweder allein oder in Kombination. Die Wahl einer bestimmten Antibiotika-Kur hängt von einer Reihe Faktoren ab, einschließlich dem Ort und der Schwere der Infektion sowie dem Resistenz-/Sensitivitätsprofil des Mikroorganismus. Die Tatsache ist wichtig, dass hohe Dosierungen an Antibiotika, insbesondere Aminoglykoside, sowie eine Langzeit-Antibiotikabehandlung bei CF-Patienten oft indiziert ist.
Pseudomonas aeruginosa besiedelt mehr als 90% aller erwachsenen CF-Patienten. Eine wirksame, gegen Pseudomonas aeruginosa gerichtete Therapie bleibt schwierig und kontrovers (Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1090–1095). Die gewöhnliche Standardtherapie für CF-Patienten, die mit diesem Mikroorganismus besiedelt sind, schließt die Verwendung eines Aminoglykosids oder β-Lactams allein oder in Kombination ein. Diese antibakteriellen Mittel bedingen eine häufige, hochdosierte parenterale Verabreichung, um therapeutisch wirksame Konzentrationen im Serum zu erzeugen, ins besondere gegen Biofilm-Zellen, die durch den mukoiden Phänotyp von P. aeruginosa gebildet werden. Es ist bemerkenswert, oass die Permeabilität der äußeren Membran (OM) von P. aeruginosa nur etwa 1 bis 8% derjenigen von E. co1i beträgt, wie auch Antibiotika-Penetrationsraten bestimmt wurde (Yoshimura et al., 1982, J. Bacteriol. 152: 636–642; Nicas et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 281–285; und Angus et al., 1984, Antimicrob. Agents Chemother. 14: 349–357). Es ist auch berichtet worden, dass verlängerte oder wiederholte Behandlungen mit Antibiotika verbunden ist mit einer allmählichen Abnahme der Suszeptibilität dieses Organismus und einem beschleunigtem Abbau des Antibiotikums in diesen Patienten (Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1090-1095; mit weiteren Referenzen). Obwohl die Verwendung von Liposomen als Antibiotika-Vehikel in „in vitro"-Experimenten als ein vielversprechender Weg zur Behandlung von P. aeruginosa aufgezeigt wurde (Lagace et al., 1991, J. Microencapsulation 8: 53–61; und Nacucchio et al., 1988, J. Microencapsulation 5: 303-309) muss also die Gestaltung einer Liposomenformulierung, die einer signifikante Verbesserung der Wirksamkeit des Antibiotikums sowie eine signifikant verbesserte Penetration in der bakteriellen Zelle ermöglicht, noch gefunden werden. Die Gestaltung einer solchen Liposomenformulierung wäre von erheblicher Bedeutung bei der Bechandlung und/oder Prophylaxe von bakteriellen Infektionen bei CF-Patienten, und möglicherweise auch bei der Prognose für diese Patienten.
Obwohl die Resistenz von Mikroorganismen gegen Antibiotika seit langem bekannt ist, stellt sie nach wie vor weltweit einen erhebliches Gesundheitsproblem dar. Wegen der relativen Impermeabilität einer Vielzahl von Stämmen gegen Antibiotika ist darüber hinaus mit dem Gestalten neuer und effizienterer Antibiotika, die den stammahängigen enzymatischen Abbau überwinden können, noch nicht die signifikante Hürde genommen, das Antibiotikum durch die impermeable Membran oder durch eine Exopolysaccharidschicht der Bakterien und zu seiner Wirkungsstätte zu bringen. Darüber hinaus wird das Problem der erhöhten Resistenz gegen Antibiotika verschlimmert durch den Missbrauch dieser Mittel (Merck Manual, 1992, 16. Auflage, Merck Res. Lab.). Beispielsweise werden Ärzte wegen der Antibiotikaresistenz von Mikroorganismen, die bei alten Antibiotika-Typen verbreiteter ist, häufig aufgefordert, eine neuere Antibiotika-Generation zu verwenden, was zur erhöhten Resistenz von Mikroorganismen gegen die Antibiotika der neueren Generation beiträgt. Der große Umfing der Verwendung von Antibiotika in Tieren, einschließlich aber nicht begrenzt auf Milchkühe, und die Anwesenheit dieser Antibiotika in Milch oder in der Umgebung, ist ein weiterer Faktor, der zum Ansteigen der Antibiotikaresistenzen von Mikroorganismen beiträgt.
Chris W. M. Grant et al. (1989, Biochimica et Biophysica Acta 984(1): 11–20) beschreibt das Ergebnis von thermodynamischen (bei 35°C und 22°C) und Gefrierätzungs-Elektronenmikroskopie-Studien, um Amphoterin-B-Liposomen zu charakterisieren, die aus DPMC/DPMG hergestellt wurden, verglichen mit DPPC und DEPC enthaltend 0–25 Mol % Amphotericin B. Es wurde in dieser Veröffentlichung gezeigt, dass fluide Liposomen aus DPMC/DPMG mit einer T_c von 23°C erhebliche Risse insbesondere bei hohen Wirkstoffkonzentrationen aufweisen. Zweitens haben Grant et al. versucht, das Problem der relativen Unmischbarkeit von Amphotericin B mit steifem Phospholipid zu lösen. Schlussendlich legt ihre Studie nahe, dass die Fließfähigkeit allein die schützende Natur von Phospholipid-Doppelschichten gegen die Amphotericin-B-Toxizität nicht erklären kann.
Es wäre für den Kliniker von erheblicher Bedeutung, wenn es gelänge, die Wirksamkeit von Antibiotika zu erhöhen und es dadurch möglicherweise zu erlauben, die Dosierung zu erniedrigen, die zum Erreichen der angestrebten antibakteriellen Wirkung erforderlich sind. Zudem würde eine solche Erhöhung der antimikrobiellen Wirkung eine effizientere Verwendung von Antibiotika älterer Generationen ermöglichen, wodurch das Anwachsen der Resistenz von Mikroorganismen gegen Antibiotika neuerer Generationen verlangsamt würde.
Für den Kliniker, Veterinär oder dergleichen wäre die Möglichkeit von erheblichem Vorteil, eine Liposomenformulierung verwenden zu können die ein antibakterielles Mittel wie ein Antibiotikum enthält, wobei die Liposomenformulierung die antibakterielle Wirkung des Mittels signifikant verbessert, nicht nur durch die vergrößerte Zirkulationszeit und niedrigere Toxizität, sondern auch, weil diese Formulierung Phaspholipide umfasst, die die Penetration des Mittels in eine bakterielle Zelle markant verbessern. Es wäre ferner ein großer Vorteil, wenn es die Formulierung ebenfalls erlaubte, die Penetration des antibakteriellen Mittels durch die äußere Membran (OM) und mukoide Exopolysaccharide wie solche, die durch mukoide Varianten von Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa ausgeschieden werden, markant zu erhöhen. Zusätzlich wäre es vorteilhaft, eine antibakterielle Liposomenformulierung bereitzustellen, die wirksam ist gegen eine große Vielzahl bakterieller Stämme, die sich in ihrer Zusammensetzung der äußeren Membran signifikant unterscheiden.
Schließlich wäre es auch ein erheblicher Vorteil, Zugang zu einer therapeutischen Liposomenformulierung zu haben, wobei die Zusammensetzung der Formulierung es erlaubt, dass therapeutische Mittel über einen Zeitraum moduliert freizusetzen, wodurch Nebenwirkungen reduziert und die Wirkung des Mittels verlängert würde.
Zusammenfassung der Erfindung
Ausgehend von physikochemischen Eigenschaften von Phospholipiden wurden zahlreiche neue Liposomenformulierungen entwickelt, um die „in vivo"-bakterizide Wirksamkeit liposomaler Aminoglykoside zu verbessern, wobei die Verkapselungseffizienz beibehalten werden sollte und die Residenzzeit des Antibiotikums in dem als Ziel gesetzten Organ verlängert und die Toxizität gering sein sollte. Solche neuen Liposomenformulierungen wurden verschiedenen „in vitro" und „in vivo"-Tests unterworfen.
Die vorliegende Erfindung betrifft das erfolgreiche Entwerten von Liposomenformulierungen, die in einer Ausführungsform ein Aminoglykosid enthalten, eine sehr effektive „in vivo"-bakterizide Wirksamkeit im Vergleich zu freien Antibiotika entfalten und die anderen, folgenden Bedürfnisse erfüllen: Modulierte Freisetzung des therapeutischen Mittels über einen Zeitraum, Aufrechterhalten der Verkapselungseffizienz des therapeutischen Mittels, verlängerte Residenzzeit des Antibiotikums im als Ziel gesetzten Organ und niedrige Toxizität.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Liposomen enthaltend ein antimikrobielles Mittel, gekennzeichnet durch eine einzigartige Formulierung, die die erhöhte Penetration des antimikrobiellen Mittels in bakterielle Zellen und durch bakterielle mukoide Exopolysaccherideermöglicht. Durch die erhöhte Penetration der bakteriellen Zellen wiesen die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen eine erhebliche Verbesserung der „in vivo"-bakteriziden Wirksamkeit auf, während freie Antibiotika keine oder nur geringe bakterizide Wirkung zeigen.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung die pharmazeutische oder veterinärmedizinische Verwendung der erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen zum Herstellen eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe bakterieller Infektionen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Liposomenformulierung mit geringer Steife umfassend ein antimikrobielles Mittel anzugeben, wobei die Wechselwirkung zwischen den Bestandteilen der Formulierung eine langsame aber konstante Freisetzung de antimikrobiellen Mittels über einen Zeitraum sowie eine verstärkte Penetration des Mittels in eine bakterielle Zelle ermöglicht.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine Liposomenformulierung zur Behandlung bakterieller Infektionen anzugeben, wobei die Liposomenformulierung eine Kombination von Lipiden mit einem antimikrobiellen Mittel umfasst.
Zusätzlich dazu ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, eine antibakterielle Liposomenformulierung anzugeben, die wirksam ist gegen Bakterienstämme, die sich in der Zusammensetzung ihrer äußeren Membran und/oder bakteriellen Wand unterscheiden.
Die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen sind im einzelnen nicht im Stand der Technik beschrieben worden. Obwohl solche Formulierungen anscheinend ganz allgemein in den Schutzbereich der Ansprüche der WO 93/23015, WO 94/12155, US 4,235,871 Und US 4,981,692 fallen, sind sie darin nicht aufgezeigt und es gibt keinen Hinweis auf eine ihnen eigene besondere Wirksamkeit.
Hinzu kommt, dass vor dem Erreichen der erfindungsgemäßen ordentlichen Formulierungen eine große Anzahl von Formulierungen hergestellt wurden, die allgemein beschrieben sind in der WO 93/23015, WO 94/12155, US 4,235,871 und US 4,981,692 . Diese umfassen DSPC : DMPG, DSPC : DPPC, DPPC : DMPC, in einem Molverhältnis von 15 : 1 und 10 : 1, mit oder ohne Cholesterin (in einem Molverhältnis von 1, also 10 : 1 : 1). Keine dieser Formulierungen, die auch Tobramycin umfassen, zeigte eine markante Verbesserung der antibakteriellen Wirkung im Vergleich zu freiem Tobramycin. Darüber hinaus würden diese Experimente andeuten, dass die Anwesenheit von Cholesterin in den therapeutischen Liposomenformulierungen die auf eine Weise verbessert, die der beabsichtigten therapeutischen Wirkung der Formulierung widerstrebt.
Deshalb ist es eine Aufgabe der Erfindung, eine Liposomenformulierung anzugeben, die frei von Stabilisierungsmitteln ist, die die angestrebte therapeutische Wirkung der Formulierung und die gewünschte Freisetzungkinetik des therapeutischen Mittels aus den Liposomen beeinträchtigen würde.
In Übereinstimmung mit einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine mehrschichtige Liposomenformulierung mit niedriger Steife angegeben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie frei von Cholesterin und Phospholipiden mit einer hohen Phasenübergangstemperatur (T_c) ist, und wobei die Formulierung eine negativ geladene Mischung enthält, die neutrale und anionische Phospholipide in einem Molverhältnis von 5 : 1 bis 20 : 1 umfasst, wobei der mittlere T_c-Wert unter der Körpertemperatur eines zu behandelnden Tieres liegt, und die zumindest ein antimikrobielles Mittel enthält.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung der zuvor angegebenen Formulierung zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung oder Vorbeugung eine mukoiden Variante einer bakteriellen Infektion von Säugetieren angegeben.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Liposomenformulierung angegeben, die den Durchtritt des eingeschlossenen antimikrobiellen Mittels durch die Exopolysaccharidschicht eines Bakteriums ermöglicht. Dadurch stellt die erfindungsgemäße Liposomenformulierung eine erhöhte Wirksamkeit bei der Behandlung mukoider Bakterien bereit.
In Übereinstimmung mit noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Liposomenformulierung angegeben zur Behandlung oder Vorbeugung gegen eine bakterielle Infektion eines Tiers, umfassend ein Verabreichen einer pharmazeutisch oder veterinärmedizinisch geeigneten Form der Formulierung.
In der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen schließt der Ausdruck „Lipid" folgendes ein, ohne dass dies als Einschränkung zu verstehen wäre: Gesättigte oder ungesättigte Lipide, oder synthetische oder solche aus natürlichen Quellen, vorausgesetzt, dass die Zusammensetzung von Lipid und antimikrobiellen Mittel eine Fluidität/Stabilität aufweist, die kompatibel ist mit der Penetration des antimikrobiellen Mittels in eine bakterielle Zelle und/oder seiner modulierten Freisetzung.
In vergleichbarer Weise sollte der Ausdruch „bakterielle Infektionen" so ausgelegt werden, dass er umfasst, ohne beschränkt zu sein auf: Gram-negative Bakterien wie die Genera Salmonella, oder Pseudomonas, bis hin zu Gram positiven Bakterien wie die Genera Mycobacteria.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Endung werden, wie in der Beschreibung und in den bevorzugten Ausführungsformen angegeben, offenkundig. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die in der ausführlichen Beschreibung angegebenen bevorzugten Ausführungsbeispiele lediglich als Illustration angegeben werden, da zahlreiche Änderungen und Modifikationen innerhalb des Bereichs der Endung für den Fachmann erkennbar sind.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine grafische Darstellung der bakteriellen Zellzahlen von Pseudomonas aeruginosa (429) in Proteose-Pepton (MIC > 60 μg/ml) unter verschiedenen Bedingungen;
2 zeigt eine grafische Darstellung der Bakterienzahlen von Burkholderia cepacia (LSPQ ID 28369) in Proteose-Pepton (MIC > 26 μg/ml) unter verschiedenen Bedingungen;
3 zeigt eine grafische Darstellung der Bakterienzahlen von Escherichia coli (nm 88 1061) in Proteose-Pepton (MIC > 5 μg/ml) unter verschiedenen Bedingungen;
4 zeigt eine graphische Darstellung der Bakterienzahlen von Staphylococcus aureus (LSPQ 2499) in Proteose-Pepton (MIC > 9 μg/ml) unter verschiedenen Bedingungen;
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellt eine therapeutische Liposomenformulierung bereit, die eine erhöhte Penetration eines antimikrobiellen Mittels in bakteriellen Zellen und durch bakterielle mukoide Exopolysaccharide ermöglicht. Die Liposomenformulierung wird hergestellt Lyophilisation, Rehydratation und Extrusion unter Druck. Liposomen haben in einer bevorzugten Ausführungsform eine mittlere Größe von 0,6 μm bis 0,2 μm und sind zusammengesetzt aus einem neutralen Lipid und einem negativ geladenen Lipid. Die molare Menge des negativ geladenen Lipids beträgt 6,5% bis 11% des Gesamtlipids und die Verkapselungseffizienz ist üblicherweise größer als 20%. Wenn das liposomale antimikrobielle Mittel „in situ" Tieren verabreicht wird, verlängert es nicht nur die Residenzzeit des antimikrobiellen Mittels und verringert dessen Toxizität, sondern erhöht auch seine therapeutische Wirkung. In einer Ausführungsform dient die Liposomenformulierung zur Behandlung bakterieller Infektionen und umfasst eine Kombination von Phosphatidylcholin, einem neutralen Phospholipid, und Phosphatidylglycerin, einem anionischen Phospholipid, in einem Verhältnis von 10 : 1 bis 15 : 1, zusammen mit einem antimikrobiellen Mittel.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Formulierung ein Aminoglykosid als Antibiotikum. Ein Beispiel eines Aminoglykosids ist Tobramycin. Eine solche liposomale Aminoglykosid-Formulierung zeigt: 1) Eine hohe bakterizide Wirkung gegen Mikroorganismen, die in einer Antibiotherapie in Säugetieren resistent sind; 2) eine hohe Verkapselungseffizienz des therapeutischen Mittels; 3) eine verlängerte Residenzzeit des Antibiotikums in dem als Ziel gewählten Organ; 4) niedrige Toxizität; und 5) eine modulierte, allmähliche Freisetzung des verkapselten therapeutischen Mittels im Laufe der Zeit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine therapeutische Liposomenformulierung bereit, die eine modulierte Freisetzung des antimikrobiellen Mittels über eine Zeit erlaubt und entsprechend eine wohlgeregelte Freisetzung des antimikrobiellen Mittels erlaubt.
Das ausgewählte antimikrobielle Mittel wird von dem die Infektion auslösendem Organismus abhängen. Geeignete Antibiotika umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Penicillin, Ampicillin, Netacillin, Carbencillin, Tetracyclin, Tetracyclinhydrochlorid, Oxtetracyclinhydrochlorid, Chlortetracyclinhydrochlorid, 7-chloro-6-dimethyltetracyclin, Doxycyclin, Doxycyclin-monohydrat, Methacyclinhydrochlorid, Minocyclinhydrochlorid, Rolitetracyclin, Dihydrostreptomycin, Streptomycin, Gentamicin, Kanamycin, Neomycin, Erythromycin, Carbomycin, Oleandomycin, Troleandomycin, Polymysin B, Collistin, Natrium-Cephalothin, Cephaloridin, Cephaloglycindehydrat und Cephalexinmonohydrat.
Wenn die Infektionsstelle oder betroffene Stelle äußerlich oder zugänglich ist, kann das Liposomen-verkapselte therapeutische Mittel topisch appliziert werden.
Bakterielle Mittel, die im Rahmen dieser Erfindung in Erwägung gezogen werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein: Moraxella spp., Clostridium spp., Corynebakterium spp., Diplococcus spp., Flavobakterium spp., Hemophilus spp., Klebsiella spp., Leptospira spp., Mycobakterium spp., Neisseria spp., Propionibakterium spp., Proteus spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Eseherichia spp., Siaphylococcus spp., Streptococcus spp. und bakterienartige Organismen einschließlich Mykoplasma spp. und Rickettsia spp.
Aminoglykoside sollen verstanden werden als Aminoglykoside und deren Analoge und Derivate, einschließlich Streptomycin, die Dehydrostreptomycin, Tobramycin, Neomycin B, Paromycin, Ribostramycin, Lividomycin, Kanamycin A und B, Viomycin, Gentamic n (einschließlich C₁, c₁ _a und C₂), Sisomicin, Netilimicin und Amikacin.
β-Lactame sollen verstanden werden als Ausdrücke, die sich beziehen auf synthetische, halbsynthetische und natürliche Penicilline, Cephalosporine, Monobactame, und Thinamycine wie Oxacilin, Cephapirin, Aztreonam und Imipenem.
Je nach Ziel der Gabe kann die Liposomenformulierung auf eine Reihe von Wegen verabreicht werden: Beim Menschen und Tier umfassen diese, ohne darauf beschränkt zu sein, Injektion (beispielsweise intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intraaurikolar, intramammal, intrauretral usw.), topische Applikation (beispielsweise auf betroffene Gebiete), und durch Absorption durch Epitel- oder Schleimhäute (beispielsweise Okularepitele, orale Schleimhäute, rektale und vaginale Epitele, Epitele des Atmungstraktes, nasopharyngeale Schleimhäute, intestinale Schleimhäute usw.).
Die Art der Verabreichung der Zubereitung kann die Orte und Zellen des Organismus bestimmen, an die die Verbindung abgegeben wird. Liposomen sollen allein verabreicht werden, werden aber im Allgemeinen in Mischung mit einem pharmazeutischen Träger gegeben werden, der unter Berücksichtigung des beabsichtigten Verabreichungsweges und der üblichen pharmazeutischen Praxis ausgewählt wird. Die Zubereitungen sollen parenteral injiziert werden, beispielsweise intraperitoneal, intraarterial oder intravenös. Die Zubereitungen sollen auch über orale, subkutane, intramuskuläre und, natürlich, intramammale Wege verabreicht werden. Zur parenteralen Verabreichen können sie beispielsweise in der Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, die weitere gelöste Stoffe enthalten kann, beispielsweise genug Salze oder Glukose, um die Lösung isotonisch zu machen. Andere Verwendungen, abhängend von den jeweiligen Eigenschaften der Zubereitung, können durch die Fachleute vorgesehen werden. Die Gabe der Liposomenformulierung im Wege eine Aerosols ist ebenfalls als bevorzugte Verabreichungsweise vorgesehen. Beispielsweise, aber nicht darauf beschränkt, können die erfindungsgemäßen Formulierungen bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen verwendet werden. Eine der zahlreichen Krankheiten, für die diese Formulierungen verwendet werden könnten, ist Asthma.
Zum Verabreichen an Tiere einschließlich Menschen bei der kurativen Behandlung eines Krankheitszustandes wird der verschreibende professionelle Mediziner letzten Endes die angemessene Dosis für einen jeweiligen Patienten bestimmen, diese kann je nach Mittel, Gewicht und Antwort des Tieres sowie der Natur und Schwere der Krankheit unterschiedlich sein. Die Dosis des antimikrobiellen Mittels in Liposomenform kann erfindungsgemäß niedriger sein als die für das freie antimikrobielle Mittel verwendete. In einigen Fällen kann es jedoch notwendig sein, gleiche oder höhere Dosierungen zu verabreichen. Es ist ebenfalls vorgesehen, dass periodische Behandlungen oder andere Behandlungszyklen vorteilhaft sein könnten.
Der Verabreichungsweg von Liposomen kann auch ihre Verteilung im Körper beeinflussen. Die passive Gabe von Liposomen beinhaltet die Verwendung verschiedener Verabreichungswege, beispielsweise intravenös, subkutan und topisch. Jede Weg führt zu unterschiedlichen Lokalisierungen der Liposomen. Zwei übliche Methoden zum aktiven Lenken der Liposomen auf ausgewählte Zielgebiete sind, entweder Antikörper oder spezifische Rezeptorliganden an die Oberfläche der Liposomen zu binden. Antikörper besitzen bekanntermaßen eine hohe Spezifität für ihr jeweiliges Antigen und konnten nachweislich an die Oberfläche von Liposomen gebunden werden, wodurch die Zielspezifität der liposomenverkapselten Droge erhöht wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner liposomale Aminoglykosid- oder β-Lactam-Formulierungen bereit, die vorzugsweise Tobramycin und die folgenden synthetischen Lipide enthalten: Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG). Andere geeignete Phosphatidylcholine und Phosphatidylglycerine umfassen jene aus Soja, Ei oder Pflanzenquellen oder jene, die teilweise synthetisch sind.
Je nach gewünschter Anwendung, dem Zweck der Verabreichung, dem Verabreichungsweg, dem Ziel und anderen, die Verwendung der Formulierung betreffenden Parametern kann die Größe der Liposomen nach wohlbekannten Verfahren angepasst werden. Beispielsweise ist es wohlbekannt, dass große Liposomen besser geeignet sind für eine topische Anwendung, während kleinere Liposomen für die intravenöse Anwendung bevorzugt sind. Ferner beeinflusst die Größe der Liposomen ihre Fähigkeit, von Makrophagen phagozytiert zu werden. Dementsprechend kann die Liposomengröße angepasst werden, um einen Verabreichungsweg zu bevorzugen, um Retention in dem reticuloendothelialen Organen zu bevorzugen oder um die Phagocytose zu bevorzugen (beispielsweise, um Bakterien im Inneren von Makrophagen zu bekämpfen). Die Größe der Liposomen wird erwogen im Bereich vom Nanometer zum Mikrometer, vorzugsweise zwischen 100 nm und 1 um. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Liposomengröße zwischen etwa 200 nm und 600 nm. Eine solche Liposomenformulierung ist verträglich mit einer Verabreichung als Aerosol zur Gabe für die Lungen eines Tieres.
Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst Liposomen, die ein verkapseltes Aminoglykosid enthalten, wobei die Liposomen mehrschichtige Vesikel sind mit einer durchschnittlichen Größe zwischen 0,2 um und 0,6 um. Ein bevorzugtes Verhältnis von DPPC : DMPG ist etwa 5 : 1 bis 20 : 1, und das bevorzugte Verhältnis eines therapeutischen Mittels zur Gesamtlipid beträgt von etwa 1 : 1 bis 1 : 10. Andere bevorzugte Formulierungen enthaltend geeignete Lipide wie Phosphatidylcholin und/oder Phosphatidylglycerin, die einzeln oder in Mischung vorliegen, in einem Molverhältnis von etwa 0,01 bis 20. Andere bevorzugte Formulierungen umfassen Formulierungen, bei denen das Verhältnis von therapeutischen Mittel zu Gesamtlipid von 1 : 10 bis 1 : 1 reicht.
Erfindungsgemäß kann das Verfahren zum Herstellen der mehschichtigen Liposomen in fünf Hauptschritte unterteilt werden. Lipide werden in Chloroform gelöst (etwa 1 mg Lipid/ml Chloroform oder mehr) und die Lösung wird verdampft, um einen Lipidfilm zwischen Raumtemperatur und 60°C zu bilden. Die Lipidmischung ist vorzugsweise negativ geladen und die entstehende Lipidkonzentration reicht von etwa 5 mM bis 130 mM. Die liposomalen Zubereitungen sind üblicherweise Mi schungen aus zwei oder mehr Komponenten: Eine Phosphatidylcholin und ein negativ geladenes Molekül wie beispielsweise ein Phosphatidylglycerin, wobei die Komponenten der liposomalen Zubereitung jeweils in Molverhältnissen von 40–90% und 5–60% vorliegen. Eine bevorzugte Kombination ist Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) : Dimyristoylphosphatglycerin (DMPG) in einem Verhältnis von 10 : 1 bis 15 : 1, wobei die Gesamtlipidkonzentration von 5 bis 85 mM reicht. Das hieraus hervorgehende negativ geladene Lipid führt zu hohen Antibiotika-Verkapselungeffizienzen, während die lipidische Formulierung die erhöhte Penetration von Antibiotika in bakterielle Zellen fördert. Der lipidische Film geht mit einer wässrigen Antibiotikalösung oder mit 1 : 20 verdünnter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) hydriert. Die Antibiotikakonzentration kann von 0,01 mg/ml bis 150 mg/ml variieren. Die bevorzugte Konzentration ist 10 mg/ml bis zu 40 mg/ml. Das Antibiotikum ist vorzugsweise ein Aminoglykosid wie hierin zitiert oder ein β-Lactam, aber andere Antibiotika können ebenfalls von den erfindungsgemäßen Verfahren profitieren.
Nach der Hydratation des Lipidfilms und der Bildung mehrschichtiger Liposomen wird die Zubereitung eingefroren, entweder in flüssigem Stickstoff (–170°C) oder zwei Stunden lang in einem Tiefkühler (–70°C), gefolgt durch Lyophilisierung in einem Gefriertrockner bei 5 mtorr für 24 Stunden. Lyophilisierte Proben werden bei –70°C oder –20°C bis zur Verwendung gelagert. Zur Verwendung wird das Pulver rehydratisiert mit einer Antibiotikalösung (10 mg/ml bis 40 mg/ml) bei 1/8 des ursprünglichen Volumens unter heftigem Vortexen gefolgt von einer 60-minütigen Inkubation bei 65°C, wobei alle 10 Minuten gevortext wird. Die Suspension wird dann mit gepufterter Salzlösung auf 50% des Ursprungsvolumens gebracht und erneut kräftig gevortext. Vorzugsweise werden mehrschichtige Vesikel extrudiert durch suksessiv kleinporigere Polycarbonatmembranen von 1 um bis hinunter zu 0,2 um oder wie gewünscht, um eine allmähliche Verringerung der Liposomengröße zu erzielen. Die auf Größe gebrachte Mischung wird schließlich 2 Mal 20 Minuten lang bei 5.000 g zentrifugiert und das Pellet in Salzlösung resuspendiert. Die Bestimmung von Tobramycin in Liposomen wurde durch High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) vorgenommen.
Eine besondere wichtige Ausführungsform der Erfindung erzeügt eine Liposomen-Aminoglykosid-Formulierung, die eine deutlich gesteigerte Penetration des Antibiotikums in bakterielle Zellen ermöglicht; Dieser Ausführungsform ist die Lipidmischung Dipalmitoylphosphaticylcholin (DPPC) : Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) in einem Verhältnis von 1 : 10 und 1 : 15, wobei die Gesamtlipidkonzentration von 5 bis 85 mM reicht. Die liposomale Aminoglykosid-Formulierung hatte am Ende einen Durchmesser von etwa 0,4 um und besaß eine Verkapselungseffizienz von 20% und ein Verhältnis des antimikrobiellen Mittels zum Lipid von 1 : 1. Die verbesserte bakterizide Wirksamkeit, die dadurch erreicht wird, ist verwandt zu der Tatsache, dass das antimikrobielle Mittel nicht nur in die Liposomen eingebaut wird, sondern auch in eine einzigartige Kombination von Phospholipiden, was die Penetration des therapeutischen Mittels in bakterielle Zellen und durch mukoide Exopolysaccharide, die von Pseudomonas aeruginosa ausgeschieden werden, merklich verbessert.
Die erfindungsgemäßen liposomalen antibiotischen Formulierungen können mit monoclonalen Antikörpern oder anderen Molekülen gerichtet werden auf ein bestimmtes Gewebe oder Zelle, beispielsweise eine bakterielle Zelle.
Das vorliegende Verfahren zur Aminoglykosid-Verkapselung ist eine sehr signifikante Verbesserung gegenüber früheren Verfahren, bei denen verkapselten Aminoglykoside verwendet wurden, da niedrige Konzentrationen des verkapselten Aminoglykosids Bakterien tötet, während bei freiem Antiobiotikum 10⁷ koloniebildende Einheiten (c. f. u.) gezählt werden (siehe unten).
Beispiel 1
Tobramycin-Liposomen-Formulierung
Die folgenden Beispiele beschreiben Analysen von Liposomen-Aminoglykosid-Formulierungen, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wobei das Aminoglykosid Tobramycin war und die Lipidmischung Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) : Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) in einem Verhältnis von 10 : 1 oder 15 : 1 war, wobei die Gesamtlipidkonzentration von 5 bis 85 mM reicht. Die Hydratation erfolgte mit 1 : 20 verdünnter Phosphat-gepufferter Salzlösung, gefolgt durch Einfrieren bei –70°C und Lyophilisierung. Die Rehydratation erfolgte durch Zugabe der Antibiotikumlösung (10 mg/ml) zu 1/8 Anteil des ursprünglichen Volumens, gefolgt vom Auffüllen auf 50% des ursprünglichen Volumens mit Phosphat-gepufferter Salzlösung. Liposomen wurden als erstes durch einen 1 um Filter extrudiert, gefolgt von Extrusionen durch 0,6 und 0,4 um Polycarbonatmembranen, und bei zwei Mal bei 5.000 × g 20 Minuten lang zentrifugiert und in PBS resuspendiert.
Beispiel 2
Physikalische und biologische Eigenschaften verschiedener Tobramycin-Liposomen-Formulierungen
Verschiedene Liposomenformulierungen wurden gemäß Beispiel 1 hergestellt und durch Differentialscan-Colorimetrie analysiert. Bei Verwendung von Differentialscan-Calorimetrie wurde die Phasenübergangstemperatur (T_c) für die in Tabelle 1 aufgeführten Tobramycin-Liposomen-Formulierungen berechnet. All diese Formulierungen wurden dann in vitro getestet, um die Freisetzungskinetik des Antibiotikums aus den Liposomen zu beurteilen. Zusätzlich wurden diese Formulierungen in einem nicht-infizierten Mausmodell wie zuvor beschrieben (Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1090-1095) getestet, um die Persistenz der Liposomen in der Lunge zu beurteilen. Nur die Liposomenformulierungen DPPC/DMPG 10 : 1, 15 : 1 und DSPC (Disteroylphosphatidylcholin)/DMPC (Dimyristoylphosphatidilcholin) 15 : 1 (in Tabelle 1 gezeigt) zeigten die folgenden Eigenschaften: Freisetzung von allmählichen und günstigen Antibiotikamengen aufgrund ihrer Fluiditäts-/Stabilitäts-Eigenschaften. Die Liposomenformulierungen wurden weiter in einem Tiermodell chronischer pulmonarer Infektion getestet, um die antibakterielle Wirksamkeit zu untersuchen. Im Gegensatz zu den beiden DPPC/DMPG-Formulierungen wurde gezeigt, dass die DSPC/DMPC-Formulierung in diesem Tiermodell unwirksam war. Zusätzlich zeigten einige Formulierungen eine Phasenübergangstemperatur vergleichbar zu der der beiden DPPC/DMPG-Formulierungen, obwohl die angestrebten Fluiditäts-/Stabilitäts-Eigenschaften nachweislich im nicht-infizierten Tiermodell ineffizient waren. Bemerkenswerterweise brachte die Zugabe von Cholesterin zu den in Tabelle 1 beschriebenen Formulierungen die T_c auf einen Mindestwert von 60°C. Solche Formulierungen waren unverträglich mit der Modulierung einer allmählichen Antibiotikumsfreisetzung und geeigneten Wechselwirkung mit Bakterien. Um die gewünschte Eigenschaft der Liposomenformulierung beizubehalten, scheint deshalb eine niedrigere Steife der Liposomen benötigt zu werden. Diese niedrige Steife kann durch Beibehalten einer niedrigen Phasenüberganstemperatur (unterhalb der Körpertemperatur des Tieres, dem die Formulierung verabreicht werden soll) und Vermeidung der Verwendung von Cholesterin in der Formulierung erreicht werden.
Tabelle 1 Phasenübergangstemperatur (T_c verschiedener Tobramycin-Liposomen-Formulierungen
Beispiel 3
Pulmonare Retention des therapeutischen Mittels
Wie kurz im Beispiel 2 angedeutet wurden pulmonaren Retentionsstudien mit Liposomen durchgeführt, die mit einem 10 : 1-Molverhältnis von DPPC : DMPG hergestellt wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, BALB/c-Mäusen (Charles River), und wobei freies Tobramycin Is Kontrolle verwendet wurde. Den Tieren wurde wie zuvor beschriebe n (Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1090–1095) eine Dosis von 50 ul (200 ug) der freien und lipomosalen Tobramycin-Zubereitungen intracheal injiziert und Lungen, Nieren und Blut wurden zu festgelegten Zeitpunkten gesammelt (Tabelle 2). Lungen und Nieren wurden aseptisch entnommen, gewogen und dann in kaltem sterilen PBS (40 Gew.-%) 30 Sekunden lang mit einem Polytron-Homogenisieren homogenisiert. Die Tobramycinmengen sowohl in homogenisierten Geweben als auch in Seren wurden durch HPLC gemessen. Gruppen aus drei Mäusen wurden für jeden Zeitpunkt verwendet.
Tabelle 2 Vergleich der Antibiotikakonzentrationen folgend auf die Verbreichung von freiem und Liposomen-verkapselten Tobramycin in Mäusen
Die Verabreichung der liposomalen Aminoglykosid-Formulierung wie erfindungsgemäß hergestellt führte zu einer verlängerten pulmonaren Retentionszeit der verkapselten Form von Tobramycin in Lungen im Vergleich zu der des freien therapeutischen Mittels. Es ist jedoch anzumerken, dass die Tobramycin-Konzentratin im Laufe der Zeit; mit der DPPC : DMPG-Formulierung wie in Tabelle 2 angegeben abnimmt. Dieses Ergebnis steht im Gegensatz zu dem, dass eine DSPC : DMPG (10 : 1)-Formulierung eine konstante Tobramycin-Konzentration über die Zeit aufweist, und dementsprechend eine hohe Liposomenstabilität besitzt (Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 1090-1095, siehe auch unten).
Beispiel 4
In vivo-Analyse der bakteriziden Wirkung von Liposomen-verkapseltem Tobramycin
Um die bakterizide Wirksamkeit einer erfindungsgemäß hergestellten liposomalen Aminoglykosid-Formulierung zu bewerten, wurden männliche pathogenfreie Sprague-Dawly-Ratten mit einem Gewicht von 175 bis 225 g (Charles River) verwendet. Chronische Lungeninfektionen wurden intratracheale Verabreichung von 5 × 10⁵ CFU Pseudomonas aeruginosa PA 508 (mukoider Phenotyp) erzeugt, die auf Agar-Beads zubereitet wurden. Es ist darauf hinzuweisen, dass dieses Rattenmodell für chronische pulmonare Infektion weithin anerkannt ist Hals das am besten geeigneten Tiermodell für chronische pulmonare Infektionen in menschlichen CF-Patienten. Nach drei Tagen wurden drei Dosen (600 μg) von freiem oder liposomen-verkapselten Tobamycin intratracheal in 16 Stunden Abstand verabreicht. Die Lipidmischungen waren DPPC : DMPG in einem Molverhältnis 10 : 1 (Formel 1) und DPPC : DMPC in einem Molverhältnis von 15 : 1 (Formel 2). 16 Stunden nach der letzten Behandlung wurden die Tiere getötet und die ganzen Lungen aseptisch entnommen, gewogen und wie zuvor für Mäuse beschrieben homogenisiert. Es ist wurden serielle 10-fach Verdünnungen der Homogenate in kaltem PBS hergestellt und in Triplikaten auf Proteose-Pepton-Agarplatten ausgestrichen. Die Identifizierung von P. aeruginosa wurde für einzelne Kulturen bestätigt. Koloniebildende Einheiten wurden nach 24-stündigen Inkubationen bei 37°C unter 5% CO² gezählt. Die Zählergebnisse wurden in log CFU pro Lungenpaar angegeben. PBS und PBS-Liposomen wurden als Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3 Bakterizide Wirkung von liposomalen Tobramycin auf P. aeruginosa in infiziertem Rattenlungengewebe
38: 1090–1095) mit einem Molverhältnis von 10 : 1 DSPC : DMPC, repräsentiert andere Liposomenformulierungen ohne verbesserte bakterizide Wirksamkeit im Vergleich zur Wirksamkeit des freien Antibiotikums gegen P. aeruginosa.
Ein zweites Experiment zum Untersuchen der bakteriziden Wirkung der erfindungsgemäß hergestellten liposomalen Tobramycin-Zubereitung wurde wie zu Tabelle 3 beschrieben mit den folgenden Abweichungen ausgeführt: 1) Liposomen wurden mit einem 15 : 1 Molverhältnis von DPPC : DMPG (Formel Nr. 3) zubereitet; und 2) nur zwei Dosen von 240 ug an freiem oder Liposomen-verkapselten Tubramycin wurden den Ratten verabreicht.
Tabelle 4 Bakterizide Wirkung von liposomalem Tobramycin auf P. aeruginosa in infiziertem Rattenlungengewebe
Die Ergebnisse der Experimente zeigen, dass die „in situ" Verabreichung niedriger Dosen Tobramycin in Lungen deutlich die bakterizide Wirksamkeit des verkapselten Aminoglykosids im Vergleich zum freien therapeutischen Mittel erhöht. Der sehr starke Anstieg der bakteriziden Wirksamkeit des verkapselten Tobramycins zeigt an, dass die Liposomenformulierung eine verbesserte Diffusion durch die bakterielle Zellmembran und eine verbesserte intrazellulare Anreicherung des therapeutischen Mittels ermöglicht. Der deutliche Anstieg an antibakterieller Wirksamkeit relativ geringer Dosen Tobramycin als Teil der Liposomenformulierung im Vergleich zum freien Tobramycin legt ferner nahe, dass die Lipide der Formulierungen eine Fusion zwischen dem Liposom und bakteriellen Zellen fördern. Die erfindungsgemäß hergestellte jeweilige Liposomenformulierung zeigt einzigartige Eigenschaften, die nicht von früheren Liposomenformulierungen geteilt werden. Ein Punkt hierbei ist die signifikante bakterizide Aktivität der Tobramycin-Liposomen-Formulierung auf den verwendeten mukoiden P. aeruginosa-Stamm. Die erfindungsgemäßen Formulierungen scheine n also nicht nur den Durchtritt des Antibiotikums durch die OM der Bakterien zu erhöhen, sondern auch durch deren Exopolysaccharide. Demnach können die vorliegenden Liposomenformulierungen erfolgreich verwendet werden für die Behandlung nicht-mukoider und mukoider Bakterienformen. Die Tatsache, dass niedrige Aminoglykosiddosen für eine starke bakterizide Wirksamkeit ausreichen, führt zu einer verringerten Toxizität des antibakteriellen Mittels. Tatsächlich zeigten die Ergebnisse der Tabellen 3 und 4 eine erhebliche bakterizide Wirkung des Antibiotikum-Liposomen-Formulierung bei einer so geringen Menge 1,37 mg Tobramycin/kg des Tieres. Früher offenbarte Formulierungen verwendeten 35 bis 120 mg/kg des Antibiotikums bei erheblich geringerer bakterieller Wirkung (WO 94/12155 und US 4,981,692 ). Hinzu kommt, dass die erfindungsgemäßen therapeutischen liposomalen Formulierungen nicht ausschließlich auf die Phagocytose von Makrophagen angewiesen sind wie die von Popescu et al. ( US 4,981,692 ), die spezifisch für die Behandlung intrazellularer Infektionen entworfen wurden. Da zudem beobachtet wurde, dass die Tobramycin- Konzentrationen in Nieren bei verkapselten Antibiotika im Vergleich zu freien Antibiotika verringert sind, ist eine verringerte Toxizität indiziert.
Bei CF-Patienten ist Burkholderia cepacia das bekanntermaßen am meisten resistente Bakterium. Es ist den frühen 1980ern berichtet worden, dass B. cepacia (ehemals Pseudomonas) eine beschleunigte und tödliche Schädigung der Lungenfunktion, Fieber, nekrotisierende Lungenentzündung und, in einigen Fällen, Septicaemie bei CF-Patienten auslöst (Govan et al., 1993, Royal Soc. Med. Suppl. Nr. 20, 86: 11–18). Eine der klinisch wichtigen Eigenschaften von B. cepacia ist seine ihm innewohnende Resistenz gegen strukturell nicht verwandte antimikrobielle Mittel (Gotoh et al., 1994, Microbiol. 140: 3285-3291). Wichtige Unterschiede betreffend ihre äußere Membran wurden zwischen P. aeruginosa und B. cepacia beobachtet (Gotoh et al., 1994).
Xanthomonas maltophila ist eine weitere Sorte Bakterien, die gegen übliche Behandlungen sehr widerstandsfähig ist. Zwischen X. maltophila und B. cepacia kann eine Parallele gezogen werden hinsichtlich ihrer innewohnenden Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Da sie relativ impermeabel sind, führen Infektionen mit X. maltophila oft zum Tode.
Die bakteriellen Wände von E. co1i und S. aureus zeigen sehr unterschiedliche Eigenschaften im Vergleich zu denen von Pseudomonas. Die äußere Membran von Enterobakteriacaen wie E. coli besitzen einzelne Porine und die Lipopolysaccharid-Seitenketten sind quervernetzt, wodurch eine ungewöhnlich niedrige Permeabilität im Bereich der Lipiddoppelschicht der äußeren Membran gegenüber hydrophoben gelösten Substanzen bewirkt wird (Nikaido, 1988, Rev. Infect. Jis. 10, Sup. 2: S279–S281). Die Zellwand Gram-positiver Bakterien wie S. aureus besteht aus Peptidoglycan, Polysacchariden und Polymeren wie Teichonsäure, anders als die Zellwand Gram-negativer Bakterien, die lipidisches Material enthält, ist die der Gram-positiven Bakterien wie beispielsweise S. aureus frei von lipidischen Material. Die Porosität von Zubereitungen Gram-positiver Zellwände ist offenbar noch nicht mit modernen Verfahren analysiert worden, aber es ist vernünftig anzunehmen, dass sie eher porös sind (Nikaido, 1994, J.-M. Ghuysen und R. Hakenbeck (Eds.) Bacterial Cell Wall).
Es ist gezeigt worden, dass die äußere Membran aller Gram-negativen Bakterien Porin-Kanäle enthält. Hydrophile Moleküle mit Größen unterhalb einer gegebenen Ausschlussgrenze können die wassergefüllten Kanäle der Porin-genannten Proteine durchtreten. Im Falle der Aminoglykoside, einem polykationischen Antibiotikum, ist angedeutet worden, dass der Aufnahmemechanismus durch die äußere Membran bei P. aeruginosa und E. coli unterschiedlich ist. Bei P. aeruginosa werden Aminoglykoside über den selbst angetriebenen Aufnahmeweg aufgenommen (Hancock et al., 1981, Antimicrob. Agents Chemother. 19: 777–878; und Nicas et al., 1980, J. Bacteriol. 143: 872–878); In diesem Weg verdrängen die Polykationen kompetitiv divalente Kationen, die angrenzende Lipopolysaccharid-(LPS)-Moleküle verbinde n, und zerstören so diese wichtigen Stabilisierungsstellen der äußeren Membran. Obwohl diese Erfindung nicht auf eine bestimmte Theorie beschränkt ist wird angenommen, dass dies wiederum die Permabilität der äußeren Membran erhöht und die Aufnahme weiterer Moleküle des permeabilisierenden Polykations fördert. Dies steht in Übereinstimmung mit der polykationischen Natur der Aminoglykoside, die drei bis fünf positive Ladungen tragen. Die Porine von E. coli scheinen besonders komplex zu sein, da trimere Anordnungen drei kleine Poren bilden, die in einen einzelnen wassergefüllten Kanal münden (Engel et al., 1985, Nature (London) 317: 643–645). Zwei Arten der Aminoglykosid-Penetration wurden für E. co1i vorgeschlagen: (1) Aminoglykoside werden über dem Porin-Weg aufgenommen; und (2) die Penetration der Aminoglykoside kann auf die Aggregation und Disaggregation von OmpF (Porin F) zurückgehen, die durch die Wechselwirkung an einer Bindungsstelle für divalente Kationen auf OmpF gesteuert wird (Hancock et al., 1991, Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1309–1314).
Um zu zeigen, dass die erfindungsgemäß hergestellten Liposomenformulierungen wirksam sind gegen ein breites Spektrum bakterieller Stämme wurden die Bakterienabtötungstests mit P. aeruginosa, P. cepacia, E. coli, S. aureus und X. maltophila durchgeführt.
Beispiel 5
In vitro bakterizide Wirkung gegen unterschiedliche Bakterienfamilien
Um die bakterizide Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten liposomalen Tobramycin-Formulierung (DPPC/DMPG) zu beurteilen, wurden in vitro-Tests gegen verschieden klinische Stämme durchgeführt: Pseudomonas aeruginosa (Stamm 429) MIC ≥ 60 ug/ml, Burkholderia cepacia (Stamm ID-28369) MIC ≥ 27 ug/ml, Escherichia co1i (Stamm 1061 mit 88) MIC ≥ 5 ug/ml, Staphylococcus aureus (Stamm LSPQ 2499) MIC ≥ 9 ug/ml und Xanthomonas maltophila MIC ≥ 5 ug/ml. Zu Proteose-Peptol-haltigen Kulturröhrchen (29 ml) wurde eine Mindestzahl von 10⁸ CFU der Bakterien in logarithmischer Phase (1 ml) zugegeben, und eine der folgenden Zubereitungen (100 μl) wurde zum Zeitpunkt 0 zugegeben: Freies Tobramycin, Liposomen-verkapseltes Tobramycin, Kontroll-Liposomen oder PBS. Die Experimente wurden in Triplikaten durchgeführt. Zu den Zeitpunkten 1, 3, 6 und 16 Stunden nach Zugabe des Antibiotikums oder der Kontrolle wurden 2 ml Proben gesammelt und serielle 10fach-Verdünnungen wurden angefertigt und in Triplikaten auf Proteose-Pepton-Agarplatten für Gram-negative und auf MacConkey-Agarplatten für S. aureus ausplattiert. Nach 24 Stunden und 48 Stunden Inkubation bei 37°C unter 5% CO₂ wurden die CFU bestimmt. Die Zahlen wurden ausgedrückt in log CFU/ml Kulturmedium. Die Ergebnisse sind den 1 bis 4 und Tabelle 5 wiedergegeben. Wie darin beobachtet werden kann, war die Menge verkapselten Tobramycins bei jeder der fünf Bakterienfamilien in jedem Experiment niedriger als der MIC der verwendeten Bakterien.
Tabelle 5 Zellzahlen lebensfähiger Bakterien (cfu) von Xanthomonas maltophila auf Proteose-Pepton (MIC > 5 ug/ml)
Die in den 1–4 und Tabelle 5 widergegebenen Ergebnisse zeigen eine signifikante bakterizide Wirksamkeit der liposomalen Tobramycin-Formulierungen im Vergleich zu freiem Tobramycin bei den fünf verwendeten verschiedenen Bakterien, und dass die antibakterielle Eigenschaft dieser Formulierung nicht auf einen bestimmten Typ bakterieller Zellwand beschränkt ist. Sie deuten zudem darauf hin, dass die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen wirksam zur Behandlung von bakteriellen Infektionen im allgemeinen verwendet werden könnten.
Zusammengefasst bieten die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen eine sehr signifikante Verbesserung bei der Gabe therapeutischer Mittel im Vergleich zu denen des Standes der Technik. Diese Formulierungen könnten in zahlreichen Tiersystemen mit bakteriellen Infektionen verwendet werden. Die bakterizide Wirksamkeit des Liposomen-verkapselten Tobramycins gegen verschiedene Bakterienfamilein, wie in 1–4 und Tabelle 5 demonstriert, zeigt, dass die erfindungsgemäße Liposomenformulierung gegen einen große Zahl von Bakterien wirksam ist, die wichtige Variationen in ihrer äußeren; Membran aufweisen. Ferner bieten die vorliegenden Liposomenformulierungen eine vielversprechende Alternative zur Behandlung chronischer pulmonarer Infektionen von CF-Patienten.
Auch wenn die Erfindung mit besonderem Bezug auf die illustrierte Ausführungsform beschrieben wurde, versteht es sich, dass der Fachmann zahlreiche Modifikationen hieran vorsehen kann. Dementsprechend sollten die Beschreibung und die begleitenden Zeichnungen als Illustration der Erfindung und nicht in einem einschränkenden Sinn verstanden werden.

Claims

Mehrschichtige Liposomenformulierung mit niedriger Steife, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie frei von Cholesterin und Phospholipiden mit einer hohen Phasenübergangstemperatur (T_c) ist, wobei diese Formulierung eine negativ geladene Mischung umfassende neutrale und anionische Phospholipide in einem Molverhältnis von 5 : 1 bis 20 : 1, wobei der mittlere T_c-Wert unter der Körpertemperatur eines zu behandelnden Tieres liegt, sowie mindestens ein antimikrobielles Mittel enthält.
Liposomenformulierung nach Anspruch 1, die in pulverförmigem Zustand vorliegt.
Liposomenformulierung nach Anspruch 1, bei der das neutrale Phospholipid und das anionisches Phospholipid in einem Verhältnis von 7,5 : 1 bis 17,5 : 1 vorliegen.
Liposomenformulierung nach Anspruch 1, bei der das neutrale Phospholipid und das anionische Phospholipid in einem Verhältnis von 10 : 1 bis 15 : 1 vorliegen.
Liposomenformulierung nach Anspruch 4, bei der es sich bei dem neutralen Phospholipid um Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und bei dem anionischen Phospholipid um Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG) handelt.
Liposomenformulierung nach Anspruch 1, bei der es sich bei dem antimikrobiellen Mittel um Tobramycin in einer Konzentration von 10 mg/ml bis 40 mg/ml handelt.
Liposomenformulierung nach Anspruch 4, bei der es sich bei dem antimikrobiellen Mittel um Tobramycin in einer Konzentration von 10 mg/ml bis 40 mg/ml handelt.
Liposomenformulierung nach Anspruch 5, bei der es sich bei dem antimikrobiellen Mittel um Tobramycin in einer Konzentration von 10 mg/ml bis 40 mg/ml handelt.
Verwendung einer Liposomenformulierung nach Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Vorbeugung einer mukoiden Variante einer bakteriellen Infektion von Säugetieren.
Verwendung nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Vorbeugung von Pseudomonas aeruginosa-Infektion bei einem Menschen, der an Mukoviszidose oder einer chronischen Infektion leidet.
Verwendung der Liposomenformulierung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung oder Vorbeugung einer bakteriellen Infektion von Säugetieren.
Antibakterielle Formulierung, enthaltend eine Liposomenformulierunga nach Anspruch 1, in einer antimikrobiellen Dosis für die Behandlung oder Vorbeugung von bakteriellen Infektionen.
Antibakterielle Formulierung nach Anspruch 12, bei der die Bakterien aus der Gruppe Pseudomonas, Burkholderia, Escherichia, Staphylococcus und Xanthomonas stammen.
Antibakterielle Formulierung nach Anspruch 13, bei der die Bakterien aus der Gruppe Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Escherichia co1i, Staphylococcus aureus und Xanthomonas maltophila stammen.