KR100438657B1

KR100438657B1 - 저치밀성리포솜항균조성물

Info

Publication number: KR100438657B1
Application number: KR1019970703952A
Authority: KR
Inventors: 쟈끌린 라가스; 크리스띠앙 보락; 세바스띠앙 끌레망-마죠르
Original assignee: 위니베흐시떼 드 몽트레알
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-22
Publication date: 2004-08-18
Also published as: JPH10511363A; MX9704679A; DE69530124T2; WO1996019972A1; BR9510423A; NZ297364A; US5662929A; JP4523078B2; BRPI9510423B8; PT806941E; KR980700062A; EP0806941A1; EP0806941B1; DE69530124D1; ATE235229T1; DK0806941T3; AU4251096A; ES2196092T3; CA2206296A1; CA2206296C

Abstract

본 발명은 항생제와 같은 적어도 하나의 치료제를 함유하는 리포솜 제제와, 이러한 제제의 투여를 통한 세균 감염의 치료방법에 관한 것이다. 콜레스테롤이 없으며, 중성 지질, 음이온성 지질 및 적어도 하나의 치료제를 함유하고, 리포솜 제제가 박테리아 세포 내부로의 상기 치료제의 침투를 증진시키는 것을 특징으로 하는 저 치밀성 다층판성 리포솜 제제가 제공된다. 바람직한 지질의 조합은, 전체 지질 농도가 5 내지 85mM의 범위를 지니면서, 10:1 내지 15:1의 비율로 존재하는 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholin)(DPPC):디미리스토일포스파티딜글리세롤(dimirystoylphosphatidylglycerol)(DMPG)이다.

Description

저 치밀성 리포솜 항균 조성물{LOW RIGIDITY LIPOSOMAL ANTIBACTERIAL COMPOSITION}

발명의 배경

1.발명의 분야

본 발명은 치료제를 함유하는 리포솜 조성물에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 박테리아 세포내로 항생제와 같은 치료제의 침투를 증가시킬 수 있도록 할 뿐만 아니라, 장시간에 걸쳐 치료제의 방출을 조절할 수 있도록 하는 고유의 리포솜 제제에 관한 것이다. 더우기, 본 발명은 본 발명에 따른 제제를 투여함으로서 동물에서 박테리아 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다.

2.종래기술의 설명

천연 또는 합성 기질 내에서의 생체활성 화합물의 캡슐화에 대해서는 지난 수십년간 광범위하게 연구되어 왔다. 이와 같은 투여 전략의 장점은 매우 다양하다. 첫째, 상기한 투여 전략은 생체활성 화합물의 불활성화 또는 분해를 막을 수 있다. 둘째, 화합물 방출을 제어함으로써, 혈액 농도 프로파일의 최적화를 이룰 수 있도록 한다. 이는 짧은 반감기로 생체활성 화합물의 악영향을 감소시키고, 더우기, 이는 독성의 위험을 저감시키도록 한다.

리포솜은 과량의 물의 존재하에서 그것의 전이 온도 이상에서 인지질로부터 자발적으로 형성되는 폐쇄된 현미경적인 소포이다. 20 나노미터에서 수 마이크로미터에 이르는 직경을 갖는 소포가 제조될 수 있다. 다층판성의(multilamellar) 리포솜은 수용성 층에 의해 분리된 동심의 인지질 이중층으로 이루어진다. 단일 판성(unilamellar)의 리포솜은 수용성 코어를 둘러싸는 단일의 인지질 층으로 이루어진다. 리포솜은 수용성 공간에서는 친수성 분자를 수용할 수 있으며 지질 이중층에서는 지방친화성 분자를 수용할 수 있다.

치료제용 매개체로서의 리포솜의 가능성, 즉 치료적 리포솜 제제에 대하여는 다양한 연구자들에 의해 연구되어 왔다. 세포내 박테리아에 대한 리포솜의 성공적인 처리가 판명된 바 있다(Lopez-Berestein et al., 1987, J. Clin. Oncology, 5:310-317; Popescu et al., 1991, US 4,981,692). 또한, 다수의 연구에 의하면 리포솜-포획 항균제는 독성이 감소되고 , 약역학 및 조직 분포인자가 변형됨으로서 이들 약제의 치료 지수를 증가시킨다는 것이 밝혀졌다(Lagac

et al., 1991, J. Microencapsulation8: 53-61 및 참고문헌; Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother.38: 1090-1095).

가장 널리 사용되는 형태의 항균제는 항생제이다. 이러한 항생제들은 β- 락탐, 아미노글리코시드, 매크로라이드(macrolides), 린코마이신, 클린다마이신 (clindamycin), 테트라사이클린, 클로람페니콜(chloramphenicol), 밴코마이신 (vancomycin), 리팜핀(rifampin), 퀴놀론 및 술폰아미드를 포함하는 서로 다른 그룹으로 분류된다.

그중에서, 아미노글리코시드는 동일한 포괄적인 범위의 항균 활성과 약역학 작용을 갖는 효능있는 항균제이다. 이들 그룹의 구성원들은 아미노사이클리톨(aminocyclitol)에 글리코시드식으로 결합된 아미노당의 존재로서 대표된다. 상기 주 제제는, 스트렙토마이신과 그것의 밀접한 관련물로 이루어진 소 그룹과; 네오마이신 그룹, 카나마이신, 토브라마이신 및 그들의 반합성 유도체인 아미카신 및 디베카신으로 더 나뉘어지는 카나마이신 그룹, 가장 중요한 서브 그룹인 겐타마이신 및 그들의 관련물, 네틸마이신과 시소마이신(sissomicin)으로 나뉘는 대 그룹의 2개의 그룹으로 분류된다.

상기 아미노글리코시드는 다양한 미생물에 있어서 단백질 합성을 저해하며, 다른 항생제에 내성을 갖는 생물체, 특히 대장균(Escherichia), 엔테로박터 (Enterobacter), 클레브시엘라(Klebsiella), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella)의 종과 같은 그러나 거기에 한정되지 않는 그램 음성 박테리아(gram-negative bacteria)에 의해 기인된 감염을 치료하는데 주로 사용된다. 정도의 차이는 있지만, 상기 아미노글리코시드는 황색 포도상구균(Staphilococcus aureus), 표피 포도상구균(Staphilococcus epidermidis), 리스테리아(Listeria)과 미코박테리아(Mycobacteria)으로부터 유래된 박테리아에 대해서도 활성을 갖는다.

상기 아미노클리코시드는 매우 높은 극성의 양이온성 화합물이기 때문에, 박테리아 세포막을 통한 확산이 매우 제한되고, 항균제의 세포내 축적은 능동수송에 의해 야기된다. 많은 생물체들은 오래된 아미노글리코시드에 대해 내성을 나타낸다. 더우기, 최근에 도입된 아미노클리코시드에 대한 미생물의 내성의 증가가 점차적으로 상승하고 있다. 획득된 항생제에 대한 내성은 종종 외막의 침투속도와 이에 수반되는 효소의 불활성화 속도 사이의 균형에 기인한다는 것이 수많은 증거로부터밝혀지고 있다. 따라서, 외막 장벽과 항생제 분해 효소는 강력하게 상승 작용을 한다. 더구나, 최근의 아미노글리코시드는 박테리아 분해 효소에 대하여 감수성이 없어 그 그룹의 오래된 구성원에 대해 내성을 갖는 균주에 대해 활성을 지니지만, 상당수의 균주에 상대적 불침투성의 관점에서 일반적으로 그것의 활성을 예측하는데 사용될 수 없다.

비록, 상기 아미노글리코시드는 감염의 치료에 유용하지만, 그들의 사용은 독성과 부작용을 수반할 수 있다. 가장 중요한 독성은 내이신경독성(ototoxicity)과 신독성(nephrotoxocity)이다. 아미노글리코시드는 농도 관련 내이신경독성과 신독성을 생성할 수 있기 때문에, 그것의 원형질 농도가 독성 레벨을 넘지 않도록 하는 것이 중요하다. 또한, 독성 공포가 치료적으로 부적합한 투여량이 되지 않도록 확보하는 것이 중요하다.

탈수-재수화 소포(dehydration-rehydration vesicle: DRV)법에 의한 리포솜 제제 내로의 아미노글리코시드 및 β-락탐의 캡슐화에 대해 기술된 바 있다(Lagac

et al., 1991, J. Microencapsulation8: 53-61). 디스테로일 포스파티딜콜린 (disteroyl phosphatidylcholin)(DSPC) 및 디미리스토일 포스파티딜-글리세롤 (dimirystoyl phosphatidylglycerol)(DMPG)와 같은 2가지 합성 인지질이 10:1의 몰비로, 16.5 μmol/ml의 지질 농도로 사용되었다. 동일한 리포솜 제제를 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로 만성 폐감염된 동물 모델에서 " 생체 정상부위에(in situ)" 실험하였으며, 폐에서 항생제의 잔류시간이 현저하게 증가하고 항균제의 흡수가 감소되도록 하였다. 그럼에도 불구하고, 이러한 리포솜의 아미노글리코시드제제는 유리 항생제 및 다른 대조군에 비하여 살균 활성에 있어서의 향상을 나타내지 않았다(Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother.38:1090-1095).

또 다른 연구자들이 아미노글리코시드 리포솜 제제에 대해 개시한 바 있다(Da Cruz et al., 1993, WO 93/23015 및 Proffitt et al., 1994, WO 94/12155). 그러나, 개시된 제제는 유리 형태에서의 활성에 비해 항생제의 치료 활성에서 강력한 증진을 나타내지는 않는다. 그중에서, 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholin: PC), 콜레스테롤 및 포스파티딜-이노시톨(phosphatidyl-inositol: PI)을 함유하는 다 크루즈 등(Da Cruz et al.)의 바람직한 아미노글리코시드(네틸마이신) 리포솜 제제만이 리포솜 제제의 일부로서 아미노글리코시드를 가지면서 유리 아미노글리코시드에 비해 (기껏해야 3배 정도) 약간 증가된 생체내 활성을 나타내었다. 프로피트 등 (Proffitt et al.)은 PC, 콜레스테롤 및 디스테아로일 포스파티딜글리세롤(distearoyl phosphatidylglycerol)(DSPG)을 함유하는 또 다른 아미노클리코시드(아미카신)리포솜 제제를 개시하였다. 비록, 프로피트 등의 제제는 다 크루즈의 제제에 비해 아미노글리코시드의 생체내 치료 활성을 증진시키는 점에서 우월한 것으로 나타났지만, 이러한 증가는 여전히 상대적으로 낮고 조직에 의한다 (비장의 경우에는 10배 증가, 간의 경우에는 5배 증가, 폐의 경우에는 2배 증가). 더욱 중요한 것은, 박테리아 감염을 치료하는데 사용되는 가능한 리포솜 제제는 박테리아 막을 통한 치료제의 통과를 현저하게 증가시키지 않는 것으로 나타났다.

낭종성 섬유증(cystic fibrosis: CF)은 인체내에서 가장 일반적인 치명적인유전병 중 하나이다. CF의 진전은 환자에 따라 크게 다르지만, 폐 관련 정도에 의해 거의 결정된다. CF에 있어서는, 병의 악화는 피할 수 없으며 점차적으로 사망에 이른다. 비록, CF 환자의 예후는 금세기의 후반기에 대폭적으로 향상되었지만, 평균 생존은 30세 정도에 지니지 않는다. 중요한 것은, 슈도모나스의 빠른 군집화와 CF 환자의 악성 예후 사이에 상관관계가 관찰되었다는 점이다. 더우기, 녹농균에 의한 만성 폐 감염은 낭종성 섬유증에 걸린 환자의 발병 및 사망의 주 원인이다(Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother.38:1090-1095; Merck manual, 1992, 16th Edition, Merck Res. Lab.). CF 환자에 있어서는, 황색 포도상구균과, 또 다른 그램 음성 균주인 인풀루엔자균(Haemophilus influenza)이 대체로 조기에 분리된 병원체이다. 대부분의 경우에, CF 환자에 있어서 그러한 박테리아 감염은 항생제로 효과적으로 치료된다. 다수의 항생제가 단독으로 또는 조합하여 항균 치료를 위해 사용된다. 특정한 항생제 요법의 선정은 미생물의 내성/감수성 프로파일 이외에 감염의 환부 및 심각성을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 중요한 것은 CF 환자에 있어서 항생제 치료를 장기간 요할 뿐 아니라 항생제, 특히 아미노글리코시드를 높게 투여해야 한다는 사실이다.

녹농균은 90% 이상의 CF 청년들을 군집화한다. 녹농균에 대항하는 효과적인 치료는 여전히 어렵고 논쟁의 대상으로 남아 있다(Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother.38:1090-1095). 이러한 미생물로 군집화된 CF 환자에 대한 통상적인 표준 치료는 아미노글리코시드 또는 β-락탐을 단독으로 또는 조합하여 사용하는 것을 포함한다. 이러한 항균제는 혈청 내에, 특히 녹농균의 뮤코이드(mucoid)표현형에 의해 형성된 생체막 세포에 대해 치료적으로 효과적인 농도를 얻기 위하여 빈번하게 높은 투여량의 비경구 투여를 요한다. 녹농균의 외막(outer-membrane: OM) 투과성은 항균 투과속도에 의해 평가될 때 대장균의 외막 투과성의 1～8% 정도에 불과하다(Yoshimura et al., 1982, J. Bacteriol.152:636-642; Nicas et al., 1983, J. Bacteriol.153:281-285; Angus et al., 1984, Antimicrob., Agents Chemother.14:349-357). 또한, 항생제의 지속되고 반복된 치료는 이 생물체의 감수성을 점차적으로 감소시키고 이들 환자에서의 항생제의 제거를 가속화시키는 것과 관련이 있는 것으로 보고된 바 있다(Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother.38:1090-1095 및 참고문헌). 따라서, 비록 항생제용 매개체로서의 리포솜의 사용은 " 시험관내" 실험에서는 녹농균의 치료에 대한 유망한 수단인 것으로 나타났지만(Lagac

et al., 1991, J. Microencapsulation8:53-61; Nacucchio et al., 1988, J. Microencapsulation5:303-309), 박테리아 세포 내부에의 침투가 상당히 개량될 뿐만 아니라 항생제의 활성이 상당히 향상되는 리포솜 제제의 설계는 아직까지 나타나지 않고 있다. 이와 같은 리포솜 제제의 설계는 CF 환자에 있어서의 박테리아 감염의 치료 및/또는 예방에 있어서, 또한 아마 이들 환자의 예후에 있어서 매우 중요한 의미를 갖는다.

비록, 항생제에 대한 미생물의 내성이 오랫동안 인식되어 왔지만, 그것은 전세계적으로 계속적으로 중요한 건강 문제가 되고 있다. 더욱이, 항생제에 대한 수많은 균주의 상대적인 불투과성에 의해, 균주에 기초한 효소 분해를 극복할 수 있는, 더 새롭고 더 효과적인 이형의 설계도 항생제가 박테리아의 불투과성 막 또는박테리아의 외다당류(exopolysacharide)층을 통하여 그것의 작용 부위에 이르도록 하는 중대한 장애물을 여전히 해결하지 못하고 있다. 더구나, 항생제에 대한 증가된 내성의 문제는 이들 약제의 오용에 의해 복합화된다(Merck manual, 1992, 16th Edition, Merck Res. Lab.). 예를 들어, 오래된 형태의 항생제에 대해 더 심각한 미생물의 항생제 내성 때문에, 실무자들이 더 새로운 세대의 항생제를 사용하도록 자주 촉구됨으로써, 새로운 세대의 항생제에 대하여 미생물의 내성은 더욱 증가되게 된다. 젖소를 포함하는 동물에서의 항생제의 대량 사용과 우유 또는 환경내 이들 항생제의 존재 또한 항생제에 대한 미생물의 내성을 증가시키는데 또 다른 기여자로서의 역할을 한다.

크리스 W.M. 그랜트 등(Chris W.M. Grant et al.) (1989, Biochimica et Biophysica Acta984(1):11-20)은 0-25 mol%의 앰포테리신(amphotericin) B를 함유하는 DPPC 및 DEPC와 비교하여 DMPC/DMPG로 이루어진 앰포테린(amphoterin) B 리포솜을 특정하기 위하여 (35℃ 및 22℃에서의) 열역학적 및 동결 에칭(freeze-etch) 전자현미경 연구 결과를 기술한 바 있다. 이 문헌에 따르면, 23℃의 Tc를 갖는 DMPC/DMPG로 이루어진 유체 리포솜은 특히 높은 약물 농도에서 상당한 분열을 나타내는 것으로 판명되었다. 다음으로, 그랜트 등은 치밀한 인지질에 대한 앰포테리신 B의 상대적인 불용성에 기인한 문제점을 해결하려고 노력하였다. 최종적으로, 그들의 연구는, 유동성 단독으로는 앰포테리신 B의 독성에 대한 인지질 이중층의 보호적 특성을 설명할 수 없다는 것을 시사한다.

임상의에게 있어서는 항생제의 활성을 증가시킴으로서 목표로 하는 항균 작용을 얻는데 필요한 투여량을 낮추도록 할 수 있는 것이 극히 중요한 사항이다. 더욱이, 이러한 항생제 활성의 증가는 더 효과적인 구세대 항생제의 사용을 허용하도록 함으로써 신세대 항생제에 대한 미생물 내성의 증가를 경감시킬 수 있다.

증가된 순환시간 및 낮은 독성 때문만 아니라, 이 제제가 박테리아 세포 내에 약제의 침투를 획기적으로 향상시키는 인지질을 함유하고 있기 때문에, 리포솜 제제가 약제의 항균 활성을 대폭적으로 증진시키는, 항생제와 같은 항균제를 함유한 리포솜 제제를 사용할 수 있도록 하는 것은 임상의, 수의사 등에게 매우 중요한 이득이 될 수 있다. 더욱이, 상기 제제가, 외막(OM)과, 녹농균의 뮤코이드 변종과 같은 박테리아의 뮤코이드 변종에 의해 분비된 것과 같은 뮤코이드 외다당류를 통한 항균성 약제 침투를 대폭적으로 증가시킨다면 더욱 유리할 것이다.

더욱이, 외부막의 조성에 있어서 상당한 변형을 나타내는 넓은 배열의 박테리아 균주에 대해 효과적인 항균 리포솜 제제를 제공하는 것이 유익할 것이다.

최종적으로, 상기 제제의 조성물이 장시간에 걸쳐 치료 약제의 방출이 조절되게 함으로써 약제의 부작용을 줄이고 약제의 활성을 연장시킬 수 있도록 하는 치료적 리포솜 제제에 접근할 수 있도록 하는 것이 극히 유익할 것이다.

발명의 요약

캡슐화 효율, 목표로 하는 기관 내의 연장된 항생제 잔류시간과 낮은 독성을 유지하면서, 리포솜 아미노글리코시드의 " 생체내" 살균 효능을 촉진시키기 위하여, 인지질의 물리화학적 특성에 근거하여, 수많은 신규한 리포솜 제제가 설계되었다. 이들 신규한 리포솜 제제에 대해 서로 다른 " 시험관내" 및 " 생체내" 시험을수행하였다.

본 발명은 일 실시예에 따라 아미노글리코시드를 함유하고, 유리 항생제에 비하여 매우 효과적인 " 생체내" 살균 활성을 나타내며, 다음과 같은 또 다른 요구사항: 장시간에 걸친 치료제의 조절된 방출, 치료제 캡슐화 효율의 유지, 목표로 하는 기관 내부에서의 연장된 항생제 잔류시간 및 저독성을 충족시키는 리포솜 제제의 성공적인 설계에 관한 것이다.

더욱이, 본 발명은 치료제를 함유하며, 박테리아 세포 내부와 박테리아의 뮤코이드 외다당류를 통한 치료제의 증가된 침투를 허용하는 고유 제제인 것을 특징으로 하는 리포솜에 관한 것이다. 상기 치료제의 일례는 항생제이나 이에 한정되지는 않는다. 박테리아 세포에의 침투가 증가됨으로서, 본 발명의 리포솜 제제는 " 생체내" 살균 효능이 뛰어나게 향상되는 한편, 유리 항생제는 살균 활성이 전혀 나타나지 않거나 거의 나타나지 않는다.

또한, 본 발명은 박테리아 감염의 예방 또는 치료에 있어서의 본 발명에 따른 리포솜 제제의 약학적 또는 수의학적 용도에 관한 것이다.

본 발명의 목적은, 제제의 성분 사이의 상호작용이 장시간에 걸친 느리지만 일정한 치료제의 방출과 함께 박테리아 세포 내부로의 약제의 침투가 개량된 저 치밀성의 리포솜 제제를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 리포솜 제제가 치료제와 함께 지질의 조합을 함유하는 박테리아 감염의 치료용 리포솜 제제를 제공함에 있다.

더욱이, 본 발명의 또 다른 목적은, 외부막 및/또는 박테리아의 벽 조성에있어서 상당한 변형을 갖는 박테리아 균주에 대해 효과적인 항균성 리포솜 제제를 제공함에 있다.

본 발명의 리포솜 제제에 대해서는 종래기술에서 명확히 기술된 바 없다.

비록, 이러한 제제가 WO 93/23015, WO 94/12155, US 4,235,871 및 US 4,981,692의 청구범위에 넓은 의미로 속하는 것으로 보이지만, 이것들에 대해서는 거기에서 명확하게 확인되어 있지 않고, 고유의 어떠한 특별한 활성에 대해서는 제시되지 않았다.

더욱이, 본 발명의 적절한 제제를 얻기 이전에, WO 93/23015, WO 94/12155, US 4,235,871 및 US 4,981,692에 개략적으로 기술된 다수의 제제를 제조하였다. 이것들은 15:1 및 10:1의 몰비로, 콜레스테롤이 함유(1의 몰비로, 즉 10:1:1로)되거나 함유되지 않은 DSPC:DMPG, DSPC:DPPC, DPPC:DMPC를 포함한다. 토브라마이신도 함유하는 이들 제제의 어느 것도 유리 토브라마이신에 비해 항균 활성의 획기적인 향상을 나타내지 않았다. 더구나, 이들 실험은, 치료적 리포솜 제제 내부의 콜레스테롤의 존재가 제제의 희망하는 치료 활성을 불리하게 하는 방식으로 리포솜의 안정성을 증진시킨다는 것을 제시하였다.

결국, 본 발명의 목적은, 상기 제제의 희망하는 치료 활성과 리포솜으로부터의 치료제 방출의 희망하는 반응론에 영향을 미칠 수 있는 안정제가 없는 리포솜 제제를 제공함에 있다.

본 발명의 일면에 따라, 중성 지질, 음이온성 지질 및 적어도 하나의 치료제를 함유하고, 리포솜 제제가 박테리아 세포 내부로의 치료제의 침투를 증진시키는,콜레스테롤이 없는 저 치밀성 다층판성 리포솜 제제가 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 약학적으로 또는 수의학적으로 적절한 투여량의 상기 리포솜 제제의 투여를 포함하는, 동물에 있어서의 박테리아 감염을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 박테리아의 외다당류 층을 통한 포획된 치료제의 침투를 허용하는 리포솜 제제가 제공된다. 따라서, 본 발명의 리포솜 제제는 뮤코이드 박테리아의 치료에 증진된 효능을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 상기 제제의 약학적으로 또는 수의학적으로 적절한 형태를 투여하는 것을 포함하는, 동물에 있어서의 박테리아 감염의 치료, 예방 또는 진단용으로서의 리포솜 제제의 용도가 제공된다.

다수의 치료제가 본 발명의 리포솜 내에 포획될 수 있기 때문에, 본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서는, 치료제라는 용어는 항생제와, 단백질 또는 그 일부, 핵산 또는 그 일부, 아미노산 유사체 또는 뉴클레오시드 유사체와 같은 생체활성 분자 이외에도, 대조 물질(예를 들면, 색소) 및 진단 물질과 같은 여타의 약학적으로 또는 수의학적으로 유용한 약제뿐만 아니라, 성장 인자와 부신 피질 스테로이드(corticosteroid) 등과 같은 호르몬을 함유하도록 그러나 이들에 한정되지 않도록 설계된 것으로 해석되어야 할 것이다. 더욱이, 치료제라는 용어는 적어도 2가지의 치료제의 조합을 포함하도록 넓은 의미로 해석되어야 할 것이다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 있어서는, 지질-치료제 조성이 박테리아 세포 내부로의 치료제의 침투 및/또는 그것의 조절된 방출과 양립할 수 있는 유동성/안정성을 나타낸다면, 지질이라는 용어는 포화 또는 불포화 지질이나 합성 또는 천연의 발생원으로부터 유도된 지질을 포함하도록 그러나 이들에 한정되지 않도록 설계된다.

유사하게, 박테리아 감염이라는 용어는 살모넬라 또는 슈도모나스와 같은 그램 음성 박테리아 또는 미코박테리아와 같은 그램 양성 박테리아를 포함하는 것으로 그러나 이들에 한정되지 않는 것으로 해석되어야 할 것이다.

본 발명의 다른 특징 및 장점들은 이하에서 설명되는 바람직한 실시예에 대한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 본 발명이 속한 기술분야의 당업자에게 있어서 자명하기 때문에, 이하의 상세한 설명은 본 발명의 바람직한 실시예를 나타내지만, 단지 예시를 위하여 주어진 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1은 서로 다른 조건에서 프로테오스 펩톤(proteose peptone) (MIC > 60 μg/ml) 내의 녹농균 (429)의 박테리아 계수를 나타낸 그래프이고,

도 2는 서로 다른 조건에서 프로테오스 펩톤 (MIC > 26 μg/ml) 내의 부르크 홀데리아 세파시아(Burkholderia capacia) (LSPQ ID 28369)의 박테리아 계수를 나타낸 그래프이고,

도 3은 서로 다른 조건에서 프로테오스 펩톤 (MIC > 5 μg/ml) 내의 대장균 (nnm 88 1061)의 박테리아 계수를 나타낸 그래프이고,

도 4는 서로 다른 조건에서 프로테오스 펩톤 (MIC > 9 μg/ml) 내의 황색 포도상구균 (LSPQ 2499)의 박테리아 계수를 나타낸 그래프이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 박테리아 세포 내부 및 박테리아 뮤코이드 외다당류를 통해 치료제의 증진된 침투를 허용하는 치료적 리포솜 제제를 제공한다. 상기 리포솜 제제는 동결건조, 재수화 및 가압하에서의 압출에 의해 제조된다. 바람직한 실시예에 따른 리포솜은 0.6㎛ 내지 0.2㎛의 평균 크기를 지니며, 중성 지질과 음으로 하전된 지질로 이루어진다. 음으로 하전된 지질의 몰 양은 전체 지질의 6.5% 내지 11%이며, 캡슐화 효율은 일반적으로 20%보다 크다. 동물에서 생체 정상부위에 투여되었을 때, 상기 리포솜 치료제 제제는 치료제의 잔류 시간을 연장시키고 그것의 독성을 감소시킬 뿐 아니라, 그것의 치료 활성을 증가시킨다. 이와 같은 제제의 일 실시예는 치료제로서 항생제를 함유한다. 또 다른 실시예에 있어서는, 상기 리포솜 제제는 박테리아 감염의 치료에 대한 기능을 수행하며, 치료제와 함께, 10:1 내지 15:1의 비율로 포스파티딜콜린, 중성 인지질과 포스파티딜글리세롤, 음이온성 인지질의 조합을 함유한다.

또 다른 바람직한 실시예에 있어서는, 상기 제제는 항생제로서 아미노글리코시드를 함유한다. 아미노글리코시드의 일례는 토브라마이신이다. 이와 같은 리포솜 아미노글리코시드 제제는, (1) 포유류에서의 항생요법 중에 내성을 갖는 미생물에 대해 높은 살균 활성과, (2) 높은 치료제 캡슐화 효율과, (3) 타겟이 되는 기관 내부에서의 연장된 항생제 잔류시간과, (4) 저 독성과, (5) 장시간에 걸친 캡슐화된 치료제의 조절된 점차적인 방출을 나타낸다.

또한, 본 발명은 장시간에 걸쳐 치료제의 조절된 방출을 허용하여 치료제의 우수하게 제어된 방출을 허용하는 치료적 리포솜 제제를 제공한다. 또한, 본 발명은 진단 도구로서의 기능을 수행할 수 있는 리포솜 제제를 제공한다. 특정한 조직 또는 세포 형태를 목표로 정하기 위하여, 예를 들어 항체와 같이, 수많은 형태의 생체활성 약제가 본 발명의 리포솜에 결합될 수 있다. 타겟의 검출은, 예를 들어 방사성이거나 방사성이 아닌 라벨 또는 리포솜 내부에 포획된 색소의 사용을 포함하는 공지의 방법에 따라 평가될 수 있다. 본 발명의 리포솜 제제의 진단적 이용에 대한 수많은 실시예들 중 하나는, 전이(metastases)의 존재를 검출, 정량화 및 분석하기 위하여, 항원에 대해 특이적인 항체를 통해 종량 항원을 타겟으로 정하는 것이다.

치료제는 감염을 일으킨 생물체에 의존하여 선택된다. 적합한 항생제는, 페니실린, 암피실린, 네타실린, 카벤실린, 테트라사이클린, 테트라사이클린 하이드로클로리드, 옥스테트라사이클린 하이드로클로리드, 클로테트라사이클린 하이드로클로리드(chlortetracycline hydrochloride), 7-클로로-6-디메틸테트라사이클린, 독시사이클린, 독시사이클린 모노하이드레이트, 메타사이클린 하이드로클로리드, 미노사이클린 하이드로클로리드, 로리테트라사이클린(rolitetracycline), 디하이드로스트렙토마이신, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 에리스로마이신, 카보마이신, 올레안도마이신(oleandomycin), 트롤레안도마이신 (troleandomycin), 폴리마이신 B, 콜리스틴(collistin), 세파로신 나트륨, 세파로리딘(cephaloridine), 세파로글리신 디하이드레이트 및 세팔렉신 모노하이드레이트를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

만일, 감염 또는 통증 부위가 외부에 있거나 접근가능한 경우에는, 리포솜 포획된 치료제는 국소적으로 적용될 수 있다.

본 발명에서 고려되는 박테리아 약제는, 모락셀라(Moraxella) spp., 코스트리듐(Costridium) spp., 코리네박테리움(Corynebacterium) spp., 디플로코커스 (Diplococcus) spp., 플라보박테리움(Flavobacterium) spp., 헤모필루스 (Hemophilus) spp., 클레브시엘라(Klevsiella) spp., 렙토스피라(Leptospira) spp., 미코박테리움(Mycobacterium) spp., 나이세리아(Neisseria) spp., 프로피오니박테리움(Propionibacterium) spp., 프로테우스(Proteus) spp., 슈도모나스 (Pseudomonas) spp., 세라시아(Serratia) spp., 에스케리키아(Escherichia) spp., 스타필로코커스(Staphylococcus) spp., 스트렙토코커스(Streptococcus) spp.와 미코플라스마(Mycoplasma) spp. 및 리켓챠(Rickettsia) spp.를 포함하는 박테리아와 유사한 생물체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

아미노클리코시드는, 스트렙토마이신, 디하이드로스트렙토마이신, 토브라마이신, 네오마이신 B, 파로마이신, 리보스트라마이신, 리비도마이신, 카나마이신 A 및 B, 비오마이신(viomycin), (C₁, C_1a및 C₂를 포함하는) 겐타마이신, 시소마이신 및 네틸리마이신 및 아미카신을 포함하는 아미노글리코시드, 유사체 및 그것의 유도체를 의미하는 것으로 이해될 것이다.

β-락탐은, 합성, 반합성 및 천연 페니실린, 세팔로스포린, 모노박탐과, 옥사실린(oxacillin), 세파피린(cephapirin), 아즈트레오남(aztreonam) 및 이미페넴 (imipenem)과 같은 티나마이신(thinamycin)을 일컫는 것으로 이해될 것이다.

약물전달의 목적에 따라, 상기 리포솜 제제는 다양한 경로를 통해 투여될 수 있는데, 인체 및 동물의 경우에는, 이들 경로는, 주사[예를 들면, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 심이내(intraauricular), 유방내, 요도내 등], 국소적 적용(예를 들어, 통증 영역 상에)과, 상피 또는 점막피부의 내막을 통한 흡수(예를 들면, 안구 상피, 구강 점막, 직장 및 질의 상피 내막, 호흡기 통로 내막, 비인두 점막, 장내 점막)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

상기 제제의 투여 방식은 화합물이 전달되는 생물체 내부의 위치 및 세포를 결정할 수 있다. 리포솜은 단독으로 투여될 수도 있으나, 일반적으로 의도된 투여 경로 및 표준 약학적 실무에 대해 선택된 약학적 담체(carrier)와의 혼합물로 투여될 수 있다. 상기 제제는 비경구적으로, 예를 들어 복강내, 동맥내 또는 정맥내로 주입될 수 있다. 또한, 상기 제제는 경구, 피하, 근육내는 물론, 유방내 경로를 통해 투여될 수도 있다. 비경구 투여를 위해서는, 그것들은, 예를 들어 용액을 등장액으로 만들기 위해 충분한 염 또는 글루코오스와 같은 다른 용질을 함유한 무균성 수용액의 형태로 사용될 수 있다. 상기 제제의 특정한 특성에 의존하는 또 다른 용도는 본 발명이 속한 기술분야의 당업자에 의해 예상될 수 있다. 분무액을 이용한 상기 리포솜 제제의 전달도 바람직한 하나의 투여방식으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 그러나 여기에 한정되지 않으면서, 본 발명의 제제는 호흡기 질환의 치료에 사용될 수 있다. 천식은 이들 제제가 사용될 수 있는 수많은 질병 중의 하나이다.

질병 상태의 치료에 있어서 인간을 포함하는 동물에의 투여에 대해서는, 처방을 하는 약학 전문가는 궁극적으로 일정한 대상자를 위한 적절한 투여량을 결정하게 되며, 이는 질병의 본질 및 심각성뿐만 아니라 동물의 약제, 체중 및 응답성에 따라 변화하는 것으로 예측될 수 있다. 본 발명에 따른 리포솜 형태로의 치료제의 투여량은 유리 치료제에 대해 사용된 것보다 낮을 수 있다. 그러나, 몇몇 경우에는, 동일하거나 더 높은 투여량을 투여할 수도 있다. 또한, 주기적인 치료 또는 서로 다른 주기의 치료가 유익할 것으로 고려된다.

또한, 리포솜의 전달 경로는 신체 내에서의 그들의 분포에 영향을 미친다. 리포솜의 수동 전달은, 예를 들어 정맥내, 피하 및 국소적 투여와 같은 다양한 투여 경로의 사용을 포함한다. 각각의 경로는 리포솜의 국소화에 있어서의 차이를 발생한다. 선택된 타겟 영역에 리포솜을 능동적으로 향하게 하기 위해 사용되는 2가지 일반적인 방법은 리포솜의 표면에 항체 또는 특정한 수용체 리간드를 결합시키는 것이다. 항체는 그것의 대응되는 항원에 대해 높은 특이성을 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 리포솜의 표면에 결합됨으로써, 리포솜 캡슐화된 약물의 타겟 특이성을 증진시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.

아울러, 본 발명은, 바람직하게는, 토브라마이신과 다음과 같은 합성 지질, 즉 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholin)(DPPC) 및 디미리스토일포스파티딜글리세롤(dimyrystoylphosphatidylglycerol)(DMPG)을 함유하는 리포솜 아미노글리코시드 또는 β-락탐 제제를 제공한다. 또 다른 적당한 포스파티딜콜린 및 포스파티딜글리세롤은 콩, 달걀 및 식물 공급원으로부터 얻어진 것 또는 부분적으로 합성적인 것을 포함한다. 희망하는 응용분야에 따라, 전달의 목적, 전달 경로, 타겟, 상기 제제의 사용과 관련된 여타의 인자, 리포솜의 크기가 공지된 방법에 따라 채택될 수 있다. 예를 들어, 큰 리포솜은 국소적 적용에 대해 더 적절한 반면에, 작은 리포솜은 정맥내 투여가 바람직하다는 것은 잘 알려져 있다.

더욱이, 리포솜의 크기는 대식세포에 의해 식작용되는 용량에 영향을 미친다. 따라서, 리포솜의 크기는 투여 경로를 유리하게 하거나, 망상 내피계 기관에서의 잔류를 유리하게 하거나, (예를 들어, 대식세포 내부의 박테리아를 처리하기 위한) 식작용을 유지하게 하도록 변형될 수 있다. 고려되어지는 리포솜의 크기는 나노미터에서 미크론까지, 바람직하게는 100nm 내지 1㎛의 범위에 이른다. 바람직한 실시예에 있어서 상기 리포솜의 크기는 대략 200nm 내지 600nm이다. 이와 같은 리포솜 제제는 동물의 폐로의 전달을 위한 상기 제제의 분무액 투여와 양립가능하다.

바람직한 제제는, 리포솜이 0.2㎛ 내지 0.6㎛의 평균 크기를 갖는 다층판성 소포인, 캡슐화된 아미노글리코시드를 포함하는 리포솜을 함유한다. DPPC:DMPG의 바람직한 비율은 약 5:1 내지 20:1이며, 전체 지질에 대한 치료제의 바람직한 비율은 약 1:1 내지 1:10이다. 또 다른 바람직한 제제는, 0.01 내지 20의 몰비로 개별적으로 또는 혼합물로 존재하는 포스파티딜콜린 및 포스파티딜글리세롤과 같은 적절한 지질을 포함한다. 또 다른 바람직한 제제는 전체 지질에 대한 치료제의 비율이 1:10 내지 1:1인 제제를 포함한다.

본 발명에 따르면, 상기 다층판성 리포솜의 제조방법은 5개의 주요 단계로 구분될 수 있다. 지질을 클로로포름(약 1mg 지질/ml 클로로포름 또는 그 이상)에용해시키고, 실온 및 60℃ 사이에서 용액을 증발시켜 지질 필름을 형성한다. 상기 지질 혼합물은 바람직하게는 음으로 하전되며, 결과적으로 얻어지는 지질 농도는 5 mM 내지 130 mM이다. 상기 리포솜 제제는 일반적으로 리포솜 제제의 각 성분이 각각 40-90% 및 5-60%의 몰비로 존재하는 포스파티딜콜린과 포스파티딜글리세롤과 같이 음으로 하전된 분자의 2가지 성분 또는 그 이상의 혼합물이다. 바람직한 조합은, 전체 지질 농도가 5 내지 85 mM이면서, 10:1 내지 15:1의 비율인 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholin)(DPPC):디미리스토일포스파티딜글리세롤(dimyrystoylphosphatidylglycerol)(DMPG)이다. 결과적으로 얻어진 음으로 하전된 지질은 높은 항생제 캡슐화 효율을 유도하는 한편, 지질 제제는 박테리아 세포 내부로의 항생제의 증가된 침투를 촉진시킨다. 상기 지질 필름을 항생제의 수용액 또는 1:20으로 희석된 인산완충 식염수(PBS)로 수화시킨다. 항생제의 농도는 0.01mg/ml 내지 150mg/ml의 범위에서 변경될 수 있다. 바람직한 농도는 10mg/ml 내지 40mg/ml이다. 바람직하게는, 상기 항생제는 본 명세서에서 언급된 아미노글리코시드 또는 β-락탐이지만, 다른 항생제나 비항생제 치료제도 본 발명의 제조과정으로부터 이득을 얻을 수 있다.

상기 지질 필름의 수화와 다층판성 리포솜의 형성이 이루어진 후에는, 상기 제제를 액체 질소(-170℃) 내에서 또는 2시간 동안 심부 동결기(-70℃)에서 동결시킨 다음, 24시간 동안 5 mtorr에서 동결 건조기 내에서 동결 건조시킨다. 동결 건조된 시료는 사용할 때까지 -70℃ 또는 -20℃에서 보존한다. 사용시에는, 격렬하게 교반시키면서 분말을 초기 용적의 1/8 부분에서 항생제 용액(10mg/ml 내지40mg/ml)으로 재수화시키고, 10분마다 교반시키면서 65℃에서 60분간 배양시킨다. 그후, 현탁액을 완충 식염 용액으로 50%의 초기 부피로 만들고 다시 격렬하게 교반한다. 바람직하게는, 다층판성 소포가 1㎛으로부터 0.2㎛에 이르거나 리포솜 크기에 있어서의 점진적인 감소를 얻기 위해 요구되는 더 작은 구멍의 폴리카보네이트 막을 통해 연속적으로 압출한다. 최종적으로, 크기가 정해진 혼합물을 5,000g에서 20분간 2회 원심분리하고, 펠렛을 염 용액에서 재현탁시킨다. 리포솜 내부의 토브라마이신의 측정은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 수행하였다. 본 발명의 특히 중요한 실시예는, 박테리아 세포 내부로의 항생제의 대폭적으로 증가된 침투를 허용하는 리포솜/아미노글리코시드 제제를 제공한다. 본 실시예에 있어서는, 지질 혼합물은, 전체 지질 농도가 5 내지 85 mM이면서, 10:1 내지 15:1의 비율인 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholin)(DPPC):디미리스토일포스파티딜글리세롤(dimyrystoylphosphatidylglycerol)(DMPG)이다. 최종적으로 얻어지는 리포솜/아미노글리코시드 제제는 약 0.4 μM의 직경을 가지며, 20%의 캡슐화 효율과 1:1의 치료제 지질 비율을 갖는다. 결과적인 개량된 살균 효능은, 상기 치료제가 리포솜 내부에 통합되어 있을 뿐 아니라, 박테리아 세포 내부 및 녹농균에 의해 분비된 뮤코이드 외다당류를 통한 치료제의 침투를 대폭적으로 증진시키는 인지질 고유의 조합 내부에 통합되어 있다는 사실과 관련된다.

본 발명의 상기 리포솜/항생제 제제는 단클론성 항체 또는 다른 분자들로 박테리아 세포와 같은 특정한 조직 또는 세포로 타겟이 정해질 수 있다.

아미노글리코시드 캡슐화에 대한 본 공정은, 저농도의 캡슐화된 아미노글리코시드가 10⁷c.f.u.의 유리 항생제가 산출되면서 박테리아를 살균시키기 때문에, 캡슐화된 아미노글리코시드를 사용하는 이전의 프로토콜에 비해 상당한 진보된 것이다(후술하는 내용을 참조하라).

실시예 1

토브라마이신 리포솜 제제

이하의 실시예는 상술한 바와 같이 제조된 리포솜 아미노글리코시드 제제의 분석을 기술한 것으로, 이때, 아미노글리코시드는 토브라마이신이고, 지질 혼합물은 전체 지질 농도가 5 내지 85 mM이면서, 10:1 내지 15:1의 비율인 디팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholin)(DPPC):디미리스토일포스파티딜글리세롤(dimyrystoylphosphatidylglycerol)(DMPG)이었다. 1;20으로 희석된 인산완충 식염수로 수화를 시킨 후, -70℃에서 동결시키고 동결건조시켰다. 초기 용적의 1/8 부분으로 항생제 용액(10 mg/ml)을 가하여 재수화시킨 후, 인산완충 식염수로 50%의 초기 부피로 충전시켰다. 먼저, 리포솜을 1 ㎛의 필터를 통해 압출한 다음, 0.6 및 0.4 ㎛의 폴리카보네이트 막을 통해 압출하고, 5,000 x g에서 20분간 2회 원심분리한 후, PBS에 재현탁시켰다.

실시예 2

다양한 토브라마이신-리포솜 제제의 물리적 생물학적 특성

상기 실시예 1에 따라 다양한 종류의 리포솜 제제를 제조하고, 시차주사 열량계를 사용하여 분석하였다. 시차주사 열량계를 사용하여, 하기 표 1에 나열된 토브라마이신-리포솜 제제에 대해 상전이 온도(Tc)를 산출하였다. 그 후, 리포솜으로부터 항생제의 방출 반응론을 평가하기 위하여 이들 모든 제제들을 시험관내 실험하였다. 아울러, 폐 내부에서의 리포솜의 잔류를 평가하기 위하여 전술한 바와 같이 (Omri et al., 1994, Antimicrob., Agents Chemother.38:1090-1095) 비감염된 마우스 모델에서 시험하였다. (표 1에 나타낸) DPPC/DMPG 10:1, 15:1과, DSPC(Disteroylphosphatidylcholin)/DMPC(dimyrystoylphosphatidylcholine) 15:1 리포솜 제제 만이 다음과 같은 특성, 즉 그들의 유동성/안정성 특성에 의한 점진적이고 적절한 양의 항생제 방출을 나타낸다. 항균 효능을 검사하기 위하여, 이들 리포솜 제제를 만성 폐 감염된 동물 모델에서 추가로 시험하였다. 2가지 DPPC/DMPG 제제와 달리, 상기 DSPC/DMPC 제제는 이러한 동물 모델에서 불활성인 것으로 나타났다.

더욱이, 2가지 DPPC/DMPG 제제의 상전이 온도에 필적한 상전이 온도를 나타내는 몇몇 제제는 비록 요구되는 유동성/안정성 특성을 나타내기는 하지만, 비감염된 동물 모델에 있어서는 효과가 없는 것으로 나타났다. 주목할만한 것은, 하기 표 1에 기재된 제제에 대한 콜레스테롤의 첨가는 Tc를 60℃의 최소치로 상승시킨다는 것이다. 이러한 제제는 점진적인 항생제 방출의 조절 및 박테리아와의 적절한 상호작용과 양립할 수 없었다. 따라서, 상기 리포솜 제제의 요구되는 특성을 유지하기 위해서는, 저 치밀성의 리포솜이 필요한 것으로 보인다. 이러한 저 치밀성은 (제제가 투여되는 동물의 체온 이하로) 낮은 상전이 온도를 유지하고 제제 내에서 콜레스테롤의 사용을 피함으로써 얻어질 수 있다.

[표 1]

상전이 온도 (다양한 토브라마이신 리포솜 제제의 Tc)

실시예 3

치료제의 폐 잔류

상기 실시예 2에서 간략하게 언급한 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 것과 같은 10:1 몰비의 DPPC:DMPG로 제조된 리포솜으로 BALB/c 마우스(Charles River) 내에서 유리 토브라마이신을 대조군으로 사용하여 실험을 수행하였다. 전술한 바와 같이 (Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother.38:1090-1095) 유리 및 리포솜 토브라마이신 제제의 50μl (200μg)의 한 번의 투여량으로 안구접종 주사를 행하고, 폐, 콩팥 및 혈액을 고정된 시간마다 수집하였다(표 2). 폐 및 콩팥을 무균적으로 제거하고 무게를 측정한 다음, 폴리트론(Polytron) 동질화기로 30초간 냉각된 멸균 PBS(40% [wt/vol])로 균질화시켰다. 균질화된 조직 및 혈청 내부의 토브라마이신 레벨을 HPLC로 측정하였다. 각각의 시간 값에 대해 3마리의 마우스로 이루어진 그룹을 사용하였다.

[표 2]

마우스에 유리 및 리포솜 포획된 토브라마이신을 투여한 후의 항생제 농도의 비교

본 발명에 따라 제조된 리포솜 아미노글리코시드 제제의 투여는, 유리 치료제의 그것에 비하여, 폐에서 캡슐화된 형태의 토브라마이신의 폐 잔류 시간이 연장된다. 그러나, 상기 표 2에 나타낸 DPPC:DMPG 제제에서는 시간에 따라 토브라마이신의 농도가 감소하는 것을 주목해야 한다. 이 결과는, 시간이 경과하여도 일정한 토브라마이신 농도를 나타내어 리포솜의 높은 안정성을 나타내는 DSPC:DMPG(10:1)의 결과와 대조적이다(Omri et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother.38:1090-1095, 또한 이하의 내용도 참조하라).

실시예 4

리포솜 캡슐화된 토브라마이신의 살균 활성에 대한 생체내 분석

본 발명에 따라 제조된 리포솜 아미노글리코시드 제제의 살균 효능을 평가하기 위하여, 숫컷의 병원체에 감염이 되지 않은 175 내지 225g 중량의 스프랙-돌리 쥐(Sprague-Dawley rat)(Charles River)를 사용하였다. 한천 비드 내에서 제조된5x10⁵CFU의 녹농균 PA 508(뮤코이드 표현형)의 기관내 투여로 만성 폐 감염을 일으켰다. 만성 폐 감염에 대한 이러한 쥐 모델은 인체 CF 환자 내의 만성 폐 감염에 대한 가장 적절한 동물 모델로 널리 인식되어 있다는 것이 지적되어야 한다. 3일 후에, 3회 투여량 (600μg)의 유리 또는 리포솜 포획된 토브라마이신을 16시간의 간격으로 기관내로 제공하였다. 지질 혼합물은 몰비가 10:1인 DPPC:DMPG (처방 1) 및 몰비가 15:1인 DPPC:DMPC (처방 2)이었다. 최종 치료후 16시간 후에, 동물을 희생시키고, 마우스에 대해 전술한 바와 같이 폐 전체를 무균적으로 제거하여 무게를 재고, 균질화시켰다. 냉각된 PBS 내에서 일련의 10배의 균등액 희석액을 형성하고, 프로테오스 펩톤 한천 판 위에 3겹으로 펼쳤다. 녹농균의 식별을 특정한 배양균에 의해 확인하였다. 37℃에서 5% CO₂하에서의 24시간 배양 후에 CFU를 계수하였다. 계수는 한쌍의 폐 당 log CFU로 표시하였다. PBS와 PBS-리포솜을 대조군으로 사용하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

감염된 쥐의 폐 조직 내부의 녹농균에 미치는 리포솜 토브라마이신의 살균 효과

본 발명에 따라 제조된 리포솜 토브라마이신 제제의 살균 효과를 연구하기 위한 2번째 실험을 다음과 같이 변형하여, 즉, 1) DPPC:DMPG (처방 3)의 15:1의 몰비로 리포솜을 제조하고, 2) 2회 투여량의 240μg의 유리 또는 리포솜 포획된 토브라마이신 만을 쥐에게 투여하여 상기 표 3에 대해서와 같이 수행하였다.

[표 4]

실험 결과는, 폐 내부에 저 투여량의 토브라마이신의 " 생체 정상부위에의" 투여는 유리 치료제에 비하여 캡슐화된 아미노글리코시드의 살균 효능을 현저하게 증가시킨다는 것을 나타낸다. 상기 캡슐화된 토브라마이신의 살균 효능에 있어서의 매우 강한 상승은, 상기 리포솜 제제가 박테리아 세포막을 통한 치료제의 증가된 분산과 치료제의 세포내 축적이 이루어지도록 한다는 것을 시사한다. 유리 토브라마이신과 비교할 때 상기 리포솜 제제의 일부로서의 상대적으로 낮은 투여량의 토브라마이신에 대한 항균 활성을 현저한 증가는, 상기 제제의 지질이 리포솜과 박테리아 세포 사이의 융합을 촉진시킨다는 것을 더 시사한다. 본 발명에 따라 제조된 특정한 리포솜 제제는 다른 이전의 리포솜 제제가 소유하지 못한 고유의 특성을 나타낸다. 사용된 뮤코이드 녹농균 균주에 미치는 토브라마이신 리소솜 제제의 현저한 살균 활성을 적절한 예로 들 수 있다. 따라서, 본 발명의 제제는 박테리아의 OM을 통한 항생제의 통과를 증진시킬 뿐 아니라, 그것의 외다당류를 통한 항생제의통과를 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 결국, 본 발명의 리포솜 제제는 비뮤코이드 (non-mucoid) 및 뮤코이드 형태의 박테리아를 치료하는데 성공적으로 사용될 수 있다. 저 투여량의 아미노글리코시드가 강력한 살균 효능을 나타내는데 충분하다는 사실은 항균성 약제의 독성을 감소시킨다. 실제로, 표 3 및 표 4의 결와는, 동물 kg 당 1.37mg의 토브라마이신과 같은 아주 작은 양으로 현저한 살균 활성을 지닌다는 것을 나타내고 있다. 이전에 개시된 제제는 실질적으로 더 작은 박테리아 활성을 지니면서도 35-120 mg/kg의 항생제를 사용하였다 (WO 94/12155 및 US 4,981,692). 더우기, 본 발명의 치료적 리포솜 제제는, 세포내 감염의 치료를 위해 특별히 설계된 포페스큐 등(Popescu et al.) (US 4,981,692)의 것과 같이 대식세포에 의한 식작용에 엄격하게 의존하지 않는다. 더우기, 캡슐화된 항생제가 유리 항생제와 비교하여 사용되었을 때, 콩팥에서 관찰된 토브라마이신 농도가 저하되었다는 사실은 저하된 독성을 나타낸다.

CF 환자에 있어서, 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia capacia)는 가장 큰 내성을 지닌 박테리아로 인식되어 왔다. 1980년대 초기에 부르크홀데리아 세파시아(이전에는 슈도모나스속)는 폐기능의 치명적인 악화가 촉진되고, 열병, 괴사성 폐렴과, 몇몇 경우에 낭종성 섬유증 환자에서 폐혈증을 일으키는 것으로 보고된 바 있다(Govan et al., 1993, Royal Soc. Med. Suppl. no. 20,86:11-18). 부르크홀데리아 세파시아에 대한 임상적으로 중요한 특성의 하나는 구조적으로 무관한 항균성 약제에 대한 그 자체의 고유의 내성이다(Gotoh at al., 1994, Microbiol.140: 3285-3291). 녹농균과 부르크홀데리아 세파시아 사이에는 그들의 외부막에 있어서중요한 차이점이 관찰되었다(Gotoh et al., 1994).

칸토모나스 말토필리아(Xanthomonas maItophilia)는 통상적인 치료에 대해 매우 무반응적인 또 다른 형태의 박테리아이다. 칸토모나스 말토필리아와 부르크홀데리아 세파시아 사이에 항균제에 대한 그들 고유의 내성에 관해 유사성이 도출될 수 있다. 상대적으로 비투과성을 지니지만, 칸토모나스 말토필리아에의 감염으로 종종 사망하게 된다.

대장균 및 황색 포도상구균의 박테리아 벽은 슈도모나스 속의 그것에 비해 매우 다른 특성을 나타낸다. 대장균과 같은 장내균과(Enterobacteriacae)의 외부 막은 독특한 포린(porin)을 갖고 있으며, 지방다당류의 측쇄가 가교되어 있으므로, 소수성 용질에게 상기 외부막의 지질 이중층 영역에 대한 예외적으로 낮은 투과성을 부여한다(Nikaido, 1988, Rev. Infect. Dis.10, Sup, 2:S279-S281). 황색 포도상구균과 같은 그램 양성 박테리아의 세포벽은 펩티도글리칸(peptidoglycan), 다당류 및 테이코산(teichoic acid)과 같은 중합체로 구성된다. 지질 물질을 함유하는 그램 음성 박테리아의 세포벽과 대조적으로, 황색 포도상구균과 같은 그램 양성 박테리아의 세포벽은 지질 물질이 결핍되어 있다. 상기 그램 양성 세포벽 제제의 다공성은 현대기술로 명백히 분석되지는 않았지만, 그들이 상당히 다공성을 갖는다고 가정하는 것이 합리적이다(Nikaido, 1994, J.-M. Ghuysen and R. Hakenbeck (Eds.) Bacterial Cell Wall).

모든 종의 그램 음성 박테리아의 외부막은 포린 채널을 함유한 것으로 밝혀진 바 있다. 일정한 한계치 이하의 크기를 갖는 친수성 분자들은 포린이라 불리는단백질의 물이 충전된 채널을 통과할 수 있다. 다중 양이온성(polycationic) 항생제인 아미노글리코시드의 경우에, 외부막을 통한 흡수 메카니즘은 녹농균 및 대장균에 대해 서로 다른 것으로 제안된 바 있다. 녹농균에 대해서는, 아미노글리코시드는 자기촉진(self-promoted) 흡수 경로를 거쳐 흡수된다(Hancock et al., 1981, Antimicrob. Agents Chemother.19:777-785; Nicas et al., 1980, J. Bacteriol.143:872-878). 이러한 경로에 있어서는, 다중양이온은 인접한 지방다당류 (lipopolysaccharide: LPS) 분자들을 교차결합하는 2가 양이온은 치환함으로써, 이들 중요한 외부막 안정화 위치를 붕괴시킨다. 비록, 본 발명은 특정한 이론에 한정되는 것은 아니지만, 이것은 번갈아 외부막을 투과할 수 있으며, 상기 투과할 수 있는 다중 양이온의 다른 분자들의 흡수를 촉진시킨다. 이는 3 내지 5의 양전하를 지닌 아미노글리코시드의 다중 양이온성 특성과 일치한다. 대장균의 포린은 3합체의 배치가 단일의 물이 충전된 채널로 모이는 3개의 작은 구멍을 형성하기 때문에 특히 복잡한 것으로 보인다(Engel et al., 1985, Nature (London)317:643-645). 다음과 같은 2가지 방식의 아미노글리코시드 침투가 대장균에 대해 제안된 바 있다: (1) 아미노글리코시드가 포린 경로에 의해 흡수된다. (2) 아미노글리코시드의 침투가 OmpF(포린 F) 상의 2가 양이온 결합위치에서의 상호작용에 의해 중재된 OmpF의 응집-분리에 기인한다(Hancock et al., 1991, Antimicrob. Agents Chemother.35: 1309-1314).

본 발명에 따라 제조된 리포솜 제제가 광범위한 배열의 박테리아 균주에 대해 효과적이라는 것을 입증하기 위하여, 녹농균, 부르크홀데리아 세파시아, 대장균, 황색 포도상구균 및 칸토모나스 말토필리아를 사용하여 살균 시험을 수행하였다.

실시예 5

다른 박테리아 패밀리에 대한 시험관내 살균 활성

본 발명에 따라 제조된 리포솜 토브라마이신 제제(DPPC/DMPG)의 살균 효능을 평가하기 위하여, 다음과 같은 다양한 임상 균주에 대해 시험관내 실험을 수행하였다: 녹농균(균주 429) MIC≥60 μg/ml, 부르크홀데리아 세파시아 (균주 ID-28369) MIC ≥27 μg/ml, 대장균 (균주 1061 mn 88) MIC ≥5 μg/ml, 황색 포도상구균(균주 LSPQ 2499) MIC ≥9 μg/ml 및 칸토모나스 말토필리아 MIC > 5 μg/ml. 프로테오스 펩톤(29ml)을 함유한 배양 튜브에, 대수기(logarithmic phase)에 있는 최소수의 10⁸cfu의 박테리아(1 ml)와 다음과 같은 제제, 즉 유리 토브라마이신, 리포솜 포획된 토브라마이신, 대조군인 리포솜 또는 PBS 중의 하나(100 μl)를 시간 제로에서 가하였다. 실험을 3회 실시하였다. 항생제 또는 대조군의 첨가 1, 3, 6 및 16시간후에, 2ml의 시료를 채취하고 연속적인 10배의 희석액을 제조한 후, 그램 음성 균주에 대해서는 프로테오스 펩톤 한천 플레이트 위에, 황색 포도상구균에 대해서는 맥콩키(MacConkey) 한천 플레이트 상에 3겹으로 펼쳤다. 5% CO₂의 분위기 하에서 37℃에서 24시간 또는 48시간 배양 후, CFU를 계수하였다. 계수치는 ml 배지 당 log CFU로 나타내었다. 결과를 도 1～도 4와 하기 표 5에 나타내었다. 도면 및 표로부터 관찰할 수 있는 것과 같이, 모든 5가지의 박테리아 패밀리에 대해, 각 실험에서의 캡슐화된 토브라마이신의 양은 사용된 박테리아의 MIC에 비해 떨어졌다.

[표 5]

프로테오스 펩톤 내의 칸토모나스 말토필리아(MIC > 5 μg/ml)의 생균수 계수치(cfu)

5가지의 서로 다른 박테리아를 사용하여 상기 리포솜 토브라마이신 제제의 유리 토브라마이신에 비해 뛰어난 살균 효능을 나타내는 도 1～도 4와 상기 표 5에서 보여지는 결과는, 본 제제의 항균성이 특정한 형태의 박테리아 세포 벽에 제한되지 않는다는 것을 나타내며, 본 발명의 리포솜 제제는 박테리아 감염의 치료에 일반적이면서도 효과적으로 사용될 수 있다는 것을 시사한다.

요약하면, 본 발명의 리포솜 제제는 종래의 제제와 비교할 때 치료제의 전달에 있어서 매우 뛰어난 개선점을 제공한다. 이들 제제는 박테리아 감염된 수많은 동물계에 사용될 수 있다. 도 1～도 4와 표 5에서 입증된 바와 같이 서로 다른 패밀리의 박테리아에 대한 리포솜 캡슐화된 토브라마이신의 살균 효능은, 본 발명의 리포솜 제제가 그들의 외부막에 있어서 중요한 변형을 나타내는 다수의 박테리아에 대해 효과적이라는 것을 나타낸다. 더우기, 본 발명의 리포솜 제제는 낭종성 섬유증 환자의 만성 폐 감염의 치료에 대해 유망한 대체물을 제공한다.

비록, 예시된 실시예를 특정하게 참조하여 본 발명을 기술하였지만, 본 발명이 속한 기술분야의 당업자에 있어서 수많은 변형이 가해질 수 있다는 것은 자명하다. 따라서, 상기한 설명 및 첨부도면은 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 제한의 의미로 해석되어서는 안될 것이다.

Claims

콜레스테롤 및 인지질이 없으며, 5:1 내지 20:1의 몰비에서 Tc의 평균치가 37℃ 이하이거나 치료되는 동물의 체온 이하인 중성 및 음이온성 인지질과, 하나 또는 그 이상의 항균제를 함유한 것을 특징으로 하는 저 치밀성 다층판성 리포솜 제제.
제 1 항에 있어서,

상기 제제는 분말 상태로 존재하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 1 항에 있어서,

상기 중성 인지질과 음이온성 인지질은 5:1 내지 20:1의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 3 항에 있어서,

상기 중성 인지질과 음이온성 인지질은 7.5:1 내지 17.5:1의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 3 항에 있어서,

상기 중성 인지질과 음이온성 인지질은 10:1 내지 15:1의 비율로 존재하는것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 5 항에 있어서,

상기 중성 인지질과 음이온성 인지질은 음으로 하전된 지질 혼합물을 형성하는 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 5 항에 있어서,

상기 중성 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린 (dipalmitoylphosphatidylcholin)(DPPC)이고, 상기 음이온성 인지질은 디미리스토일포스파티딜글리세롤(dimyrystoylphosphatidylglycerol)(DMPG)인 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 1 항에 있어서,

상기 항균제는 10 mg/ml 내지 40 mg/ml의 농도로 존재하는 토브라마이신인 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 5 항에 있어서,

상기 항균제는 10 mg/ml 내지 40 mg/ml의 농도로 존재하는 토브라마이신인 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 7 항에 있어서,

상기 항균제는 10 mg/ml 내지 40 mg/ml의 농도로 존재하는 토브라마이신인 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
제 1 항에 있어서,

상기 제제는 박테리아와의 직접적인 상호작용에 의해 적어도 하나의 박테리아 외부막과 외다당류 층을 통한 적어도 하나의 항균제의 통과를 증진시키는 것을 특징으로 하는 리포솜 제제.
항균적으로 적절한 투여량의 제 1항의 리포솜 제제로 이루어지고, 포유류에 투여하기에 적합한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
적절하게 수용가능한 형태의 제 10항의 리포솜 제제를 투여하는 것을 포함하는, 포유류에 있어서의 박테리아 감염의 뮤코이드 변종의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제 13 항에 있어서,

상기 박테리아 감염은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)이고, 상기 포유류는 낭종성 섬유증 또는 만성 감염에 걸린 인체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 12 항에 있어서,

상기 박테리아 감염은 슈도모나스(Pseudomonas), 부르크홀데리아 (Burkholderia), 대장균(Escherichia), 포도상구균(Staphylococcus) 및 칸토모나스 (Xanthomonas)로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 형태의 박테리아에 의해 일어나는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 15 항에 있어서,

상기 감염은 하나 또는 그 이상의 형태의 박테리아에 의해 일어나고, 상기 형태의 박테리아는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 부르크홀데리아 세파시아 (Burkholderia capacia), 대장균(Escherichia coli), 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 및 칸토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia)로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
포유류에 항균에 적절한 양의 제제를 투여하는 것을 포함하는, 포유류에 있어서의 박테리아 감염의 치료 또는 예방용으로 사용되는 제 1항의 리포솜 제제.
포유류에 있어서의 박테리아 감염의 치료 및 예방용 약제를 제조하기 위하여 사용되는 제 1항의 리포솜 제제.
박테리아 감염의 치료 또는 예방을 위해 항균적 투여량으로 제 1항의 리포솜제제를 함유한 항균제.
제 19 항에 있어서,

상기 박테리아는 슈도모나스(Pseudomonas), 부르크홀데리아(Burkholderia), 대장균(Escherichia), 포도상구균(Staphylococcus) 및 칸토모나스(Xanthomonas)로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항균제.
제 20 항에 있어서,

상기 박테리아는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 부르크홀데리아 세파시아 (Burkholderia capacia), 대장균(Escherichia coli), 황색 포도상구균 (Staphylococcus aureus) 및 칸토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia)로 구성된 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 항균제.