DE69115682T2 - Verfahren zur herstellung von liposomen mit erhöhtem einschlussvermögen bezüglich zu verkapselnder fremdsubstanzen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von liposomen mit erhöhtem einschlussvermögen bezüglich zu verkapselnder fremdsubstanzenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Liposomen mit verbesserter Transmembranbeladungskapazität. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung solcher Liposomen und das Beladen der Liposomen mit interessierenden Substanzen.
- Es ist allgemein bekannt, daß Liposomen aus kleinen Vesikeln bestehen, die durch eine Membranwand aus lamellaren Lipiden begrenzt sind, welche einen mit einer eingeschlossenen wäßrigen Flüssigphase gefüllten Kern umgibt. Liposomale Vesikel können mit Fremdsubstanzen wie Arzneimitteln beladen und anschließend dazu verwendet werden, um solche eingeschlossenen Wirkstoffe selektiv zu ausgewählten Organen des Körpers zu transportieren. Liposomen als Suspension in wäßrigen Trägern sind besonders zur Verabreichung von Wirkstoffen an Patienten durch parenterale, perorale, topische Gabe und durch Inhalation geeignet. Liposoinale Wirkstofformnulierungen können die Wirkamkeit der Behandlung verbessern, eine verlängerte Wirkstofffreisetzung und therapeutische Aktivität gewährleisten, das therapeutische Verhältnis erhöhen und die Gesamtwirkstoffmenge reduzieren, die zur Behandlung eines gegebenen Leidens oder einer gegebenen Funktionsstörung erforderlich ist. Zur Übersicht siehe "Liposomes as Drug Carriers", G. Gregoriadis, Wiley & Sons, New York (1988).
- Es existieren viele Verfahren zur Herstellung von Liposomen und zu deren Beladung init interessierenden Fremdsubstanzen, wobei die meisten Verfahren die Bildung der liposomalen Vesikel innerhalb einer wäßrigen Trägerflüssigkeit umfassen, welche die Substanzen darin verteilt enthält. Während der Bildung der Liposomen wird ein Teil der Trägerflüssigkeit innerhalb der Vesikel eingeschlossen, natürlich zusammen init einer kleinen Menge der gewünschten einzuschließenden Substanzen. Diese Technik wird "passiver Einschluß" genannt. Die Effizienz des Beladens von Liposomen mit passiv eingeschlossenen wäßrigen Phasen ist häufig relativ gering, da sie stark von der Natur der Trägerphase und insbesondere der Konzentration der darin gelösten Substanzen abhängt, welche die Ausbeute der Liposomenbildung beeinflussen kann. Zu Wirkstofftransportzwecken ist jedoch die Beladungseffizienz (welche im allgemeinen als das Gewicht des eingeschlossenen Materials im Verhältnis zum Gesamtgewicht des am Einschluß beteiligten Materials definiert ist) gewöhnlich nicht kritisch, da das nicht eingeschlossene Material im allgemeinen wiedergewonnen und anschließend wiederverwendet werden kann; somit ist der wichtige Faktor eher das Verhältnis von nützlichem eingeschlossenem Material gegenüber dem Gewicht der zum Einschluß verwendeten Lipide, d.h. der an der Bildung der Liposomenmembran beteiligten Lipide. Die Minimierung des Lipidtodgewichts bei der Injektion oder bei einer anderen Verabreichung, d.h. das Halten des Gewichts des an die Patienten verabreichten vektoriellen Wirkstoffträgers auf dem geringstmöglichem Wert für eine gegebene Menge an therapeutisch aktiver Substanz ist eindeutig ein großer Vorteil bei der Entwicklung neuer pharmazeutischer oder diagnostischer Reagenzien. Nun steht offensichtlich das Verhältnis des Gewichts des eingeschlossenen Materials zum Gewicht der einschließenden Lipide in direkter Beziehung zu dein sogenannten eingeschlossenen Volumen, d.h. dem Volumen der im Kern der Liposomen eingeschlossenen wäßrigen Phase in Bezug zur Masse der Liposomenlipide (ul/mg).
- Bei einem klassischen passiven Einschlußverfahren, das von BANGHAM et al., (J. Mol. Biol. 12, (1965), 238) beschrieben wurde, wird die die interessierende Verbindung enthaltende wäßrige Phase in Kontakt mit einem Film getrockneter Phospholipide gebracht, welche an den Wänden des Reaktionsgefäßes abgeschieden sind. Beim Rühren mit mechanischen Mitteln quellen die Lipide und multilamellare Vesikel (multilamellar vesicles, MLV) werden gebildet. Das eingeschlossene Volumen der MLV's ist gering, typischerweise im Bereich von 2 bis 4 ul/mg Lipide. Durch Beschallen können die MLV's in kleine multilamellare Vesikel (small unilamellar vesicles, SUV) umgewandelt werden, deren eingeschlossenes Volumen noch kleiner ist, z.B. im Bereich von 0,5 bis 1 ul/mg. Andere Verfahren zur Herstellung, welche Liposomen mit größeren eingeschlossenen Voluinina ergeben, wurden beschrieben, insbesondere große unilamellare Vesikel (large unilamellar vesicles, LUV). Zum Beispiel haben DEAMER & BANGHAM (Biochem. Biophys. Acta 443, (1976), 629) ein Verfahren beschrieben, bei welchem Membranen bildende Lipide in Ether gelöst, die Etherlösung direkt in die wäßrige Phase injiziert und der Ether danach verdampft wird, anstatt den Ether zur Bildung eines dünnen Films auf einer Oberfläche zuerst zu verdampfen, und anschließend diesen Film in Kontakt mit einer einzuschließenden wäßrigen Phase zu bringen, wobei Liposomen mit eingeschlossenen Volumina von 14 ul/mg erhalten wurden. Auch das von SZOKA & PAPAHADJOPOULOS (P.N.A.S. 75, (1978), 4194) beschriebene Umkehrphasenverdampfungsverfahren (Reverse Phase Evaporation (REV) method) bei welchem eine Lösung von Lipiden in einem wasserunlöslichen organischen Lösungsmittel in einer wäßrigen Trägerphase emulgiert und das organische Lösungsmittel anschließend unter reduziertem Druck entfernt wird, ergab Liposomen mit eingeschlossenen Volumina von 8 bis 15 ul/mg Lipide.
- Ein verbessertes passives Einschließen wurde erreicht, indem Liposomen sukzessiven Dehydratations- und Rehydratationsbehandlungen oder dem Einfrieren und Auftauen unterworfen wurde; die Dehydratation wurde durch Verdampfen oder Gefriertrocknen ausgeführt. Diese Technik wird z.B. von KIRBY & GREGORIADIS (Biotechnology, November 1984, 979-984) offenbart. Auch SHEW & DEAMER (Biochim. et Biophys. Acta 816, (1985), 1-8) zeigen, daß durch Beschallung hergestellte Liposomen in wäßriger Lösung mit dem einzuschließenden gelösten Stoff gemischt und die Mischung unter Stickstoff in einem Rotationskolben getrocknet wird. Nach dem Rehydratisieren werden große Liposomen hergestellt, in welche eine signifikante Fraktion des gelösten Stoffes eingeschlossen wurde.
- Weitere Versuche zur Erhöhung der Menge der in die Liposomen eingeschlossenen Substanz durch Verwendung höherer Konzentrationen der Substanz in der Trägerflüssigkeit wurden mit wenig Erfolg durchgeführt. Wie bereits oben erwähnt wurde, nimmt das eingeschlossene Volumen tatsächlich bei hohen Konzentrationen des gelösten Stoffes in der Trägerphase ab, was zeigt, daß die Anwesenheit der einzuschließenden Substanzen in hohen Konzentrationen einen nachteiligen Effekt auf die eingeschlossenen Volumina hat. Zum Beispiel haben SZOKA et al. (Fundstelle wurde zitiert) eine progressive Abnahme beim Einschluß von Cytosinarabinosid mit steigenden Konzentrationen von NaCl in der Trägerflüssigkeit berichtet. Ein ähnlicher Befund wird in der WO-A- 89/11272 (MINCHEY et al.) beschrieben, gemäß der eine drastische Abnahme der Cephalosporin-Einschlußausbeute mit Erhöhung der Wirkstoffkonzentration in der Trägerflüssigkeit auftritt.
- Gemäß einem anderen Weg zum Füllen von Liposomen mit fremden, nicht-lipidischen Substanzen werden Bedingungen geschaffen, unter welchen solche Substanzen durch die Wände in den Vesikelkern penetrieren können; diese Technik, genannt "Transmembranbeladen", umfaßt das Verinnerlichen der einzuschließenden Substanzen von den liposomalen Vesikeln nachdem diese gebildet worden sind. Normalerweise ist das Durchschreiten der Lipidmembran für Fremdsubstanzen (insbesondere ionischen) schwierig, da die hereinkommenden Substanzen von den polaren Gruppen der Lipide abgestoßen werden. Dieser Effekt kann jedoch durch den Einbau von "Schutz"-Trägersubstanzen in die Lipidmembran minimiert werden. Zum Beispiel können Liposomen bei Raumtemperatur mit Kationen beladen werden, wenn die Lipidmembranen eine lipophile Trägersubstanz wie Acetylaceton enthalten (BEAUMIER et al., J. Nucl. Med. 32, (1982), 810). Im übrigen können Fremdsubstanzen von Liposomen durch osmotisch kontrollierte Permeation durch die Lipidmembranwand verinnerlicht werden. Zum Beispiel kann die Aufnahme von Fremdsubstanzen durch die Liposomen durch einen ionischen Transmembrangradienten, z.B. einem Na&spplus;/K&spplus;-Gradienten, gefördert werden, wie in J. Biol. Chem. 260, (1985), 802-808 offenbart wird. Ein pH-Gradient ist ebenfalls zur Förderung des Transmembranbeladens geeignet, wie in Biochem. Biophys. Acta 857, (1986), 123-126, WO-A-89/04656 und PCT/US85/01501 erwähnt wird. Jedoch ist diese Technik auf einige spezifische Kategorien von Wirkstoffen, genauer schwache Basen, begrenzt, wie in Chem. Phys. Lipids 53, (1990), 37 angegeben wird. Darüber hinaus ist das Herstellen von Liposomen in einer Trägerphase mit einem pH- Wert, der von demjenigen der Kernphase verschieden ist, schwierig, und zusätzlich kann ein zu geringer oder zu hoher pH-Wert eine Beschädigung der Membran durch vorzeitige Hydrolyse der Lipide bewirken.
- In der EP-A-361 894 (THE HEBREW UNIVERSITY) wird eine Technik offenbart, bei welcher amphiphile Drogen in liposomale Vesikel durch Transmembran-Verinnerlichung unter Kontrolle eines nachträglich erzeugten pH-Gradienten geladen werden. Das Schlüsselmerkmal dieser Technik basiert auf dem Ausströmen von Ammoniak (NH&sub3;) aus dem Kern der liposomalen Vesikel, welche mit einer wäßrigen Lösung einer Ammoniumverbindung beladen sind und welche in ein Ammonium-freies Trägermedium eingebracht werden. Das Aus strömen von NH&sub3; aus NH&sub4;&spplus; setzt ein Proton frei, welches fortlaufend den pH der eingeschlossenen Flüssigkeit senkt und fortlaufend einen pH-Gradienten über die liposomale Membran bildet, d.h. die Trägerflüssigkeit wird relativ zum inneren Geahalt des Liposomenkerns alkalisch. Wenn der "alkalisch gemachten" Trägerflüsslgkeit eine amphiphile Verbindung (z.B. einen Wirkstoff mit einer deprotonierten Amingruppe) zugefügt wird, tendiert das System dazu, zu reäquilibrieren und eine Diffusion der amphiphilen Verbindung durch die Lipidmembranwand in den Kern der Liposomen setzt ein.
- Techniken, bei welchen dehydratisierte und rehydratisierte Liposomen dem Transmembranbeladen unterworfen werden, existieren ebenfalls. Zum Beispiel offenbart die US-A-4 673 567 (SHIONOGI & Co.) die Herstellung "leerer" MLV-Liposomen in einer ionenfreien, wäßrigen Trägerflüssigkeit sowie das Dehydratisieren dieser Liposomen durch Lyophilisieren; dann werden die getrockneten Liposomen durch Suspendieren in einer Trägerflüssigkeit rehydratisiert, welche einen Wirkstoff wie Fluoruracil, Cefalexin oder dergleichen enthält. Das Inkubieren wird durch Erhitzen für 5 Minuten auf 50 ºC durchgeführt, wobei ein signifikanter Anteil des in der Trägerflüssigkeit gelösten Wirkstoffs in den Liposomen eingeschlossen wird. Die Gründe hinter diesem Ansatz sind, daß das "Gefriertrocknen von Liposomen strukturelle Defekte in der Doppelschichtmembran produziert und das Erhitzen über die Übergangstemperatur diese Defekte entfernt", wie in einem Artikel von JIZOMOTO et al. in Chem. Pharm. Bull. 37, (1989), 3066-3069 angegeben wird. Wie in der US-A-4 673 567 angegeben wird, wird dieses Verfahren jedoch durch eine beträchtliche Verminderung des eingeschlossenen Volumens erschwert, wenn die Trägerflüssigkeit ionische gelöste Stoffe enthält. Zum Beispiel zeigen die in Spalte 3 von Tabelle 1 dieses Dokuments aufgeführten Werte, daß die Transmembran-Wirkstoffaufnahme praktisch vernachlässigbar war, wenn eine isotonische Kochsalzlösung oder 0,02 Phosphatpuffer als Trägerflüssigkeit verwendet wurde, während ein Wert von 16,6 ul/mg Lipid für das eingeschlossene Volumen gefunden wurde, wenn der Wirkstoff in reinem Wasser gelöst war. Weiterhin sollte man sich bewußt sein, daß bei der gegenwärtigen Praxis hohe Werte für das eingeschlossene Volumen nicht leicht erreichbar sind. Zum Beispiel überschreiten in einem jüngeren Übersichtsartikel, "The accumulation of drugs within large unilamellar vesicles exhibiting a proton gradient" ["Die Anhäufung von Wirkstoffen in großen unilamellaren Vesikeln, welche einen Protonengradienten aufweisen"], von T.D. MADDEN & al. in Chemistry and Physics of Lipids 53, (1990), 37-46, die aufgeführten eingeschlossenen Werte etwa 1 bis 2 ul/mg Phosphatidylcholin nicht.
- Aus der vorangehenden kurzen Zusammenfassung kann entnommen werden, daß die Techniken des Standes der Technik zum Beladen von Liposomen kompliziert, teuer und nicht allgemein für alle Typen von Wirkstoffen und Medien anwendbar sind, welche durch Liposomen verabreicht werden können, insbesondere ionische Substanzen sind im allgemeinen schwer einzuschließen. Es war daher ein Ziel der gegenwärtigen Erfinder, das eingeschlossene Volumen beträchtlich zu erhöhen, wobei aber mühsame und teuere Vorbehandlungen der filmbildenden Lipide (z.B. das Lyophilisieren wie von H. JIZOMOTO in Chem. Pharm. Bull. 37, (1989), 1895-1898 beschrieben) vermieden werden, und gleichzeitig die membranbildenden Lipide zur Erhöhung der Transmembranbeladungskapazität hinsichtlich im wesentlichen aller Arten von gelösten Stoffen in wäßrigen Medien einschließlich ionischer Stoffe effizient zu konditionieren. Dies wurde durch Verkörperung des in den anhängenden Ansprüchen offenbarten Verfahren erreicht, welches auf einem osmotisch kontrollierten Permeationsverfahren zu basieren scheint.
- Kurz gesagt stellt man bei der vorliegenden Erfindung Liposomen durch irgendein verfügbares Verfahren her, wobei die so hergestellten Liposomen "leer" sind. Mit "leeren" Liposomen soll ausgedrückt werden, daß die darin eingeschlossene wäßrige Phase nur aus reinem Wasser besteht oder alternativ aus sehr verdünnten Lösungen von nichtionischen Substanzen oder Elektrolyten hergestellt ist. Allgemein gesagt, wenn gelöste Stoffe in der eingeschlossenen Phase der neu hergestellten "leeren" Liposomen vorhanden sind, sollte deren Osmomolalität nicht etwa 0,2 Osm/kg überschreiten; wenn die gelösten Stoffe Elektrolyte sind, sollte die ionische Stärke der eingeschlossenen Flüssigkeit nicht etwa 0,1 überschreiten. Dann, sobald die sogenannten "leeren" Liposomen hergestellt worden sind, werden sie in einer Trägerflüssigkeit suspendiert, welche eine oder mehrere interessierende einzuschließende Substanzen enthält, und man fährt mit dem Inkubieren des Systems bei einer Temperatur oberhalb der Übergangstemperatur Tc für eine Zeit fort, die ausreichend ist, um eine wirksame Beladung der Vesikel durch Transmembranpermeation sicherzustellen.
- Es sollte an dieser Stelle betont werden, daß einer der Hauptfaktoren der Erfindung die Abwesenheit oder das Vorhandensein nur kleinster Mengen von gelösten Stoffen in der wäßrigen Phase in der die Liposomen anfangs hergestellt werden betrifft, insbesondere wenn es sich bei den gelösten Stoffen um Elektrolyte handelt. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, daß die "Qualität" der liposomalen Vesikel, daß ist das Ausmaß ihrer Fähigkeit, ein möglichst hohes eingeschlossenes Volumen zu bilden, stark von der ionischen Stärke dieser wäßrigen Flüssigphase abhängt; natürlich handelt es sich bei dieser wäßrigen Phase auch um die Phase, welche im Kern der entstehenden "leeren" Liposomen zu der Zeit, zu der sie gebildet werden, eingeschlossen wird. Diese Situation steht in starkem Kontrast zu der Lehre des Stands der Technik (z.B. US-A-4 673 567, wo das eingeschlossene Volumen nur durch die Ionen beeinflußt wird, welche außerhalb der liposomalen Vesikel vorhanden sind, d.h. die Ionen innerhalb der Trägerflüssigkeit, in welcher die Liposomen nach der Dehydratation inkubiert werden. Das grundlegende unerwartete Merkmal, das jetzt von den gegenwärtigen Erfindern entdeckt wurde, ist somit, daß die vorübergehende Permeabilität der Membran der neu hergestellten Liposomen hauptsächlich auf der Natur der Flüssigkeit basiert, in welcher die "leeren" Liposomen anfangs hergestellt worden sind, nicht der der Flüssigkeit, die zur Behandlung nach der Inkubation verwendet wird. Tatsächlich besteht eine inverse Beziehung zwischen der Elektrolytkonzentration in der zur Herstellung der leeren Liposomen verwendeten Flüssigkeit und dem eingeschlossenen Volumen von nachfolgend eingeschlossenen Fremdsubstanzen. Je verdünnter diese Flüssigkeit ist, desto höher ist das eingeschlossene Volumen.
- Zum Beispiel werden gemäß einer Ausführungsform der Erfindung membranbildende Lipide mit einem wäßrigen flüssigen Träger gemischt, zum Beispiel Wasser mit einein pH von 1 bis 12, vorzugsweise im Bereich der Neutralität, welcher gegebenenfalls verdünnte Puffer und/oder nichtionische Stabilisierungsmittel wie Zucker oder andere Polyole enthält, und der Träger wird für einen Zeitraum bei einer Temperatur von einigen wenigen Grad Celsius oberhalb der Kristall/Flüssig-Übergangstemperatur (Tc) der hydratisierten Lipide gehalten, wobei dies vorzugsweise innerhalb eines engen Temperaturbereichs geschieht. Die Spannweite dieses Bereiches kann etwa 20 ºC betragen, die am meisten bevorzugte Temperatur liegt in der Nähe des Mittelpunktes dieses Bereichs, d.h. etwa 4 bis 10 ºC oberhalb von Tc. Die zur Bewirkung einer effektiven Hydratation und Konditionierung der Lipide erforderliche Zeit entspricht der Zeit, die erforderlich ist, um eine homogene Lösung oder Dispersion der Lipide in der flüssigen Phase zu erhalten, wobei ein Bewegen der Flüssigkeit optional ist. Im allgemeinen ist ein leichtes Wirbeln der Flüssigkeit ausreichend, um Homogenisierung sicherzustellen, aber schnelleres Bewegen ist ebenfalls möglich, wenn es erwünscht ist. Es ist zu beachten, daß die durchschnittliche Größe der während der Hydratation und Konditionierung der Lipide gebildeten Liposomen von der Rate und der Art des Bewegens abhängen kann. Im allgemeinen führt sehr langsames Bewegen zu Liposomen mit einer größeren durchschnittlichen Größe und inneren Kapazität als das Arbeiten bei stärkerer Bewegung. Es ist auch festzustellen, daß alle Vorbehandlungen der Lipide, welche gemäß dem Stand der Technik empfohlen werden, um die Beladungskapazität der Liposomen zu erhöhen, d.h. Gefriertrocknen, Tauen, Abdampfen einer Lösung zu dünnen Filmen an den Wänden eines Laborkolbens und andere ähnliche Vorbehandlungen, obwohl unschädlich, bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung absolut unnötig sind; da diese Vorbehandlungen jedoch nicht schädlich sind, können sie, falls gewünscht, durchgeführt werden.
- Ungeachtet der ionisch geladenen Komponente, umfassen die Lipide oder Mischungen von Lipiden zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung im wesentlichen alle Komponenten, welche gewöhnlich auf dem Gebiet der Liposomen verwendet werden, d.h. Glycerophospholipide, nicht-phosphorylierte Glyceride, Glykolipide, Steroide und andere Additive, die dazu dienen, den liposomalen Membranen modifizierte Eigenschaften zu verleihen. Vorzugsweise enthalten sie mindestens eine polarisierbare Komponente (selbst in kleinerer Menge), nämlich ein Lipid, das eine kationische oder anionische Funktion trägt, oder ein ionisierbares Tensid wie einen Fettsäurealkoholdiphosphatester, z.B. Dicetylphosphat (DCP) oder ein höheres Alkylamin wie Stearylamin (SA). Geladene Phospholipide, d.h. Fettsäureglyceridphosphatide wie Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylserin (PS) aus natürlichen Quellen oder synthetische Stoffe (wie z.B. Dipalmitoylphosphatidsäure (DPPA), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), usw.) stellen geeignete polarisierbare Lipidkomponenten dar. Die Glycerophospholipide können zum Beispiel die folgenden synthetischen Verbindungen einschließen: Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Dipalmitoylphosphatidyiethanolamin (DPPE) und das entsprechende Distearoylund Dimyristylphosphatidylcholin und -ethanolamin (DSPC; DSPE; DMPC und DMPE). Phospholipide können auch natürliche Phospholipide einschließen, welche einer mehr oder weniger extensiven Hydrierung unterworfen wurden, zum Beispiel Ei- oder Sojaphosphatidylcholin.
- Die Glykolipide können Cerebroside, Galaktocerebroside, Glukocerebroside, Sulfatide und Sphingolipide enthalten, die mit Mono-, Di- und Trihexosiden derivatisiert sind. Die Steroide, welche mit Vorsicht verwendet werden sollten, da zuviel davon die Membranpermeation behindern kann, umfassen Cholesterin, Ergosterin, Coprostanol, Cholesterinester wie Hemisuccinat (CHS), Tocopherolester und dergleichen.
- Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird ein Anteil der Lipide oder der Mischung von Lipiden mit oder ohne Additive einem Volumen einer nichtionischen wäßrigen Flüssigkeit (oder einer wäßrigen Flüssigkeit, deren ionische Stärke 0,1 und deren Osmomolalität 0,2 Osm/kg nicht übersteigt) zugefügt und die Hydratation der Lipide fortgesetzt, bis die Mischung homogen ist, wobei sich in dieser Zeit die gewünschten liposomalen Vesikel bilden. Wenn es sich bei der Flüssigphase im wesentlichen um Wasser handelt, sind die relativen Anteile der Lipide und der wäßrigen Flüssigkeit nicht kritisch, aber es ist offensichtlich ein Minimum an Flüssigkeit erforderlich, um eine korrekte Dispersion der Lipide darin zu gewährleisten. Gewöhnlich werden für 1 Gewichtsteil Lipid oder Lipidmischung und membranbildende Additive mindestens 20 Teile der Flüssigphase verwendet. Ausgezeichnete Ergebnisse werden jedoch bei kleineren Gewichtsverhältnissen von Lipid zu Flüssigkeit beobachtet, z.B. im Bereich von 0,1 bis 1 %. Wenn die zur Herstellung der leeren Liposomen verwendete wäßrige Flüssigkeit anschließend als Trägerphase für die Inkubation verwendet wird (d.h. die einzuschließende Substanz wird einfach zu der Flüssigkeit hinzugefügt, in welcher die Liposomen hergestellt wurden), ist es offensichtlich bevorzugt, daß die Menge der Flüssigkeit relativ zu den Lipiden nicht zu groß ist, da dies zu einer nutzlosen Verdünnung der einzuschließenden Substanz und zu geringeren Einschlußausbeuten führen würde. Trotzdem kann im Fall, daß die Liposomendispersion zu verdünnt ist, die Konzentration der Vesikel durch Zentrifugation (im Bereich von 10³ bis 10&sup5; g), durch teilweises Verdampfen der Flüssigkeit oder durch Ultrafiltration durch geeignet kalibrierte semipermeable Membranen erhöht werden.
- Nachdem die Lipide der Flüssigphase zugefügt wurden, läßt man das System durch Stehen bei gelegentlichem Umrühren oder bei konstanterem Rühren homogenisieren. Die Temperatur, bei welcher diese Operation durchgeführt wird, wurde bereits vorher definiert. Die Flüssigkeit kann vor oder nach der Zugabe der Lipide auf die gewünschte Temperatur erhitzt werden. Die bevorzugte Temperatur hängt natürlich von der Art der verwendeten Lipide oder Mischung von Lipiden ab; jedoch wird für die am meisten verwendeten Lipide und Lipidmischungen die Hydratations- und Homogenisierungstemperatur im Bereich von etwa 40 ºC bis 80 ºC gewählt.
- Die Zusammensetzungen der Flüssigphasen, in welchen die liposomalen Vesikel zur Verwendung gemäß der Erfindung hergestellt werden, sind sehr vielfältig. Neben reinem Wasser können Lösungen von verdünnten Elektrolyten wie Mineralsalzen oder von nichtionischen Stoffen wie Glykolen oder Polyolstabilisatoren verwendet werden. Zum Beispiel können die folgenden nichtionischen Stabilisatoren aufgezählt werden: Zucker wie Saccharose, Glukose, Lactose und Maltose, Polyole wie Glykole, Glycerin, Sorbitol, Mannitol, Polyethylenglykol, Dextran, Xanthan und dergleichen.
- Die zur Erreichung der Hydratation und Konditionierung der Lipide in liposomale Vesikel mit außergewöhnlichen Einschlußeigenschaften notwendige Zeit kann von einigen Minuten bis zu einigen Stunden bei der gewünschten Temperatur variieren, jedoch sind Erhitzungszeiten, die etwa 30 bis 60 Minuten nicht überschreiten, im allgemeinen bevorzugt.
- Natürlich findet das Verfahren der Erfindung auch auf die anfänglichen Bedingungen für das Inkontaktbringen der Lipide und der wäßrigen Träger und nicht nur für das Zusammenmischen der Komponenten Anwendung. Zum Beispiel können wie bereits gesagt andere Wege zur Herstellung von Liposomen ebenfalls angewendet werden, z.B. das Bilden eines Lipidfilms auf Oberflächen (wie denjenigen eines Rundkolbens oder von Glasperlen oder den zwischenräumlichen Oberflächen eines Bündels von drahtähnlichen Materialien), gefolgt von dem Kontaktieren des Lipidfilms mit einer wäßrigen Phase oder dem Umschwenken einer wäßrigen Phase auf dem Lipidfilm bis die Hydratation des letzteren stattgefunden hat. Falls erwünscht, kann die Hydratation durch Beschallung bewirkt werden. Es wurde jedoch beobachtet, daß die einfachsten Ausführungs formen zur Herstellung der Erfindung zu Liposomen mit der höchsten Einschlußkapazität führen.
- Die gemäß der Erfindung erhaltenen liposomalen Vesikel liegen im allgemeinen im Größenbereich von etwa 80 nm bis etwa 5 um, Größen im Bereich von 300 bis 2000 nm sind für therapeutische oder diagnostische Anwendungen durch Injektion bevorzugt. Die Liposomen sind vorzugsweise vom MLV-Typ, aber andere Arten von Liposomen können abhängig von der Wahl der Verfahrensparameter ebenfalls hergestellt werden. Die Größenverteilung dieser Liposomen ist gewöhnlich relativ groß, aber wenn eine engere Größenverteilung gewünscht wird, können Kalibrierungstechniken wie die Filtration unter Druck oder die Extrusion durch mikroporöse Membranen erfolgreich angewendet werden. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, daß das Kalibrieren von leeren Liposomen im Vergleich zu dem von beladenen Liposomen vorteilhaft ist, da, weil noch keine Substanzen in die Liposomen eingeschlossen sind, kein Auslaufen der Substanzen während der Extrusion stattfinden kann. Aufgrund ihrer inhärent geringen Viskosität ist die Extrusion leerer Liposomen außerdem leicht. Somit wird die Extrusion vorzugsweise unterhalb von TQ zum Beispiel bei Raumtemperatur oder darunter durchgeführt, was zu optimalen Einschlußausbeuten (hohe eingeschlossene Volumina) in den nachfolgenden Transmembranbeladungsschritten führt. Darüber hinaus kann bei der vorliegenden Erfindung der Typ, die Größe und die Konzentration der leeren Liposomen an die Erfordernisse vor der Inkubation angepaßt werden, wobei kein Verlust von eingeschlossener Substanz während dieser Operationen stattfindet.
- Der fundamentale Vorteil der Liposomen, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden, betrifft jedoch ihre überraschende Beladungskapazität hinsichtlich der meisten einzuschließenden Fremdsubstanzen. Das Beladen kann einfach durch das Einbringen der einzuschließenden Substanz in die Flüssigkeit durchgeführt werden, in welcher die Liposomen gebildet wurden, oder in eine andere Flüssigträger, in welcher die leeren Liposomen anschließend suspendiert werden, wobei die Flüssigkeit als Trägerphase zur Inkubation mit den einzuschließenden Substanzen dient. Die zu verkapselnden Substanzen werden entweder rein oder in Form von Lösungen eingesetzt. Anschließend wird die Inkubation des Systems für einen Zeitraum bei einer Temperatur oberhalb der Lipid-Übergangstemperatur Tc durchgeführt. Wenn die zu verkapselnde Substanz in reiner Form verwendet wird, löst sie sich erst in der als Träger dienenden Flüssigkeit und durchdringt dann die Membran und dringt in den Liposomenkern ein. Ein ähnlicher Prozeß findet statt, wenn die Fremdsubstanz als Lösung zugefügt wird; hier wird die Trägerflüssigkeit der Inkubation zuerst durch diese Lösung verdünnt und dann dringt die gelöste Substanz wie oben beschrieben in die Liposomen ein. Es ist besonders interessant festzustellen, daß im Gegensatz zum Stand der Technik der Transmembranbeladungsmechanismus der Vesikel, welcher der vorliegenden Erfindung inhärent ist, selbst dann zufriedenstellend abläuft, wenn in der zur Inkubation verwendeten Trägerflüssigkeit Ionen vorhanden sind, wobei die Ionen entweder Bestandteile des Inkubationsträgers selbst (Puffer oder Salzlösung) oder der zu verkapselnden interessierenden Substanzen sein können. Es scheint, daß die im Stand der Technik beschriebene Inhibierung der Permeation überwunden wird, wenn das anfangs in den liposomalen Vesikeln eingeschlossene Wasser entweder rein ist oder Substanzen in geringer Konzentration enthält. Besonders überraschend an dieser Erfindung ist, daß sobald ein Teil einer ionischen Substanz die Membran während der Inkubation durchdrungen hat, dieser nicht die Penetration des übrigen noch in der Trägerflüssigkeit befindlichen Anteils inhibiert.
- Die Inkubationszeit kann als Funktion der für die zu verkapselnden Substanzen typischen Permeationsraten in Lipide, der Natur und Konzentrationen der Liposomen in der Trägerphase und der Temperatur der Inkubation variieren. Der Faktor, der im allgemeinen das Ende der Inkubationszeit bestimmt, ist der Zustand, an dem die Konzentrationen der verkapselten Substanzen innerhalb und außerhalb der Liposomen gleich sind. Zu diesem Zeitpunkt ist ein Gleichgewicht erreicht und ein Fortsetzen der Inkubation hat keinen weiteren Zweck. Natürlich wird das Gleichgewicht um so schneller erreicht, je höher die Temperatur ist; jedoch können zu hohe Temperaturen nachteilig für die Eigenschaften der Liposomen sein, nämlich für die spezifische Einschlußkapazität, d.h. das Verhältnis von Kernvolumen zum Gewicht der Lipide; somit können die Inkubationstemperaturen von etwa Tc bis etwa 150 bis 200 ºC reichen, wobei der bevorzugte Bereich von etwa 40 bis 130 ºC beträgt. In diesem Zusammenhang ist festzustellen, daß eine weitgehende Sterilisierung der Liposomen gleichzeitig mit der Inkubation stattfindet, wenn die Inkubationstemperatur im oberen Teil des angegebenen Bereiches, d.h. zum Beispiel bei 100 bis 150 ºC liegt. Alternativ kann das Sterilisieren und Inkubieren unabhängig und nacheinander durchgeführt werden. Die Erhitzungsmittel, um die Liposomen und die zu verkapselnden Produkte auf die Inkubationstemperaturen zu bringen, sind auf dem Gebiet üblich und schließen natürlich Mikrowellenerhitzungsmittel ein. Es ist jedoch zu bemerken, daß die Temperatur des anfänglichen Hydratisierens und Konditionierens der Lipide zur Liposomenbildung nicht mit der Inkubationstemperatur zu verwechseln ist, obwohl beide bei bestimmten Ausführungs formen identisch sein können. Tatsächlich ist der Temperaturbereich der Hydratation sehr viel enger als der Temperaturbereich der Inkubation; wenn die Hydratisierung und die Konditionierung außerhalb des angegebenen Bereiches durchgeführt werden, z.B. bei etwa 80 ºC mit Lipiden oder Mischungen daraus, die eine Tc im Bereich von 45 bis 55 ºC aufweisen, werden Liposomen mit minderwertiger Qualität erhalten, d.h. mit geringerer Einschlußkapazität und geringerem Verhältnis von Volumen zu Gewicht.
- Es ist festzustellen, daß ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß die Konzentration der Lipide in dem zur Inkubation verwendeten wäßrigen Träger keinen signifikanten Einfluß auf die Verinnerlichungskapazität und die Effizienz der Liposomen hinsichtlich von Fremdsubstanzen hat, die dem wäßrigen Träger zugesetzt wurden. Somit kann man durch das Konzentrieren der Liposomen in dem wäßrigen Träger, d.h. durch Erhöhung des Gewichtsverhältnisses von Lipid zu Träger, die Einschlußausbeute vorteilhaft beeinflussen und die Menge von zurückbleibender nicht-eingeschlossener Substanz reduzieren, die zurückzugewinnen und danach wieder zu verwenden ist. Dies kann durch die Bemerkung verdeutlicht werden, daß die Endkonzentration der Fremdsubstanzen im Liposomenkern lediglich von deren Anfangskonzentra tion in der Trägerflüssigkeit der Inkubation, nicht von dem Gesamtgewicht der zur Verkapselung verwendeten Fremdsubstanzen abhängt. Somit kann das Gesamtgewicht für eine gegebene Konzentration durch die Verringerung der zur Inkubation verwendeten Flüssigkeitsmenge reduziert werden und umgekehrt führt die Erhöhung der Konzentration der Lipide in der Trägerphase zu einer Erhöhung der Einschlußausbeute.
- Die gemäß der Erfindung in die Liposomen einzuschließenden Substanzen umfassen jede vorstellbare therapeutisch oder diagnostisch aktive Verbindung. Als solche können Wirkstoffe wie Analgetika, Narkotika, Antibiotika, Sulfonamide, Steroide, Röntgenkontrastmittel, NMR-Kontrastmittel und dergleichen genannt werden. Röntgenkontrastmittel umfassen zum Beispiel organische iodierte Verbindungen wie N,N'-Bis [2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)ethyl]-5-[ (2-hydroxy-1-oxopropyl)-amino]-2,4,6-triiod-1,3-benzol-dicarboxyamid (Iopamidol); Metrizamid; Diatrizoesäure; Natriumdiatrizoat; Meglumindiatrizoat; Acetrizoesäure und ihre löslichen Salze; Diprotrizoesäure; Iodamid; Natriumiodipamid; Meglumindiopamid; Iodhippursäure und die löslichen Salze davon; Iodmethamsäure; Iodpyracetiod-2-pyridon-N-essigsäure; 3,5-Diiod- 4-pyridon-N-essigsäure (Iodpyracet) und seine Diethylammoniumsalze; Iotalminsäure; Metrizoinsäure und ihre Salze; die Iopan-, Iodcetamin- und Iophenoxysäuren und ihre Salze; Natriumtyropanoat; Nariumopidat und andere ähnliche iodierte Verbindungen.
- Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
- 30 g Phospholipide (hydriertes Sojalecithin (Phospholipon 100H von der NATTERAANN-PHOSPHOLIPID GmbH, Köln, Deutschland) und Dipalmitoylphosphatidsäure, Dinatriumsalz (DPPA) mit einer Indikatormenge an ¹&sup4;C-markiertem Tripalmitin (Amersham), molares Verhältnis 9/1) gelöst in Chloroform (250 ml) wurden in einen 10 l Reaktionskolben eingebracht. Nach dem Abdampfen des Chloroforms unter vermindertem Druck wurden 6 l destilliertes Wasser bei 55 bis 60 ºC hinzugefügt (die Übergangstemperatur der verwendeten hydrierten Lipide betrug 54 ºC, bestimmt durch Differentialscanningkalorimetrie), und man ließ die festen Lipide hydratisieren und sich bei gelegentlichem leichtem Schütteln homogen in der Flüssigkeit verteilen, wobei Liposomen des MLV-Typs in hoher Ausbeute gebildet wurden. Nach etwa 1 Stunde wurde die 5 mg/ml Lipide enthaltende Liposomensuspension bei 60 ºC durch eine 2 um Polycarbonatmembran (Nucleopore) extrudiert und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur durch Mikrofiltration unter Verwendung eines 0,22 um Mikrofilters (Millipore) auf 30 mg/ml konzentriert.
- Zu der konzentrierten Liposomenlösung wurde 1 l einer wäßrigen Lösung hinzugefügt, die 1040 g (S)-N,N'-Bis-[2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-ethyl]-2,4,6-triiod-5-lactamido-isophthalamid (Iopamidol, ein von BRACCO INDUSTRIA CHIMICA, Mailand, hergestelltes Röntgenkontrastmittel), d.h. 520 g/l kovalentes Iod bei 60 ºC enthielt. Die resultierende Mischung (2 l) wies eine Iodkonzentration von 260 g/l auf und wurde für etwa 30 Minuten bei 60 ºC inkubiert, nach dieser Zeit war die Iodkonzentration außerhalb und innerhalb des Liposomenkerns ausgeglichen. Die resultierende Präparation wurde auf 30 g Lipide/l konzentriert (Präparation A).
- Präparation A wurde auf Lipide und eingeschlossenes Iod analysiert. Hierzu wurde ein Aliquot (1 ml) gegen Salzlösung (0,9 % NaCl in Wasser) dialysiert bis alles Iopamidol außerhalb der liposomalen Vesikel entfernt worden war (etwa 24 Stunden mit viermaligem Wechsel des Dialysemediums). Die Probe wurde dann bei 50 ºC mit 1/10 ihres Volumens einer 10%igen Natriumdodecylsulfatlösung in Wasser behandelt und das freigesetzte Iopamidol spektrophotometrisch bei 260 nm gemessen. Die entsprechende Menge Lipide wurde durch Zählen mit einem Scintillationszähler unter Verwendung der restlichen Radioaktivität des Tripalmitinmarkers gemessen. Die Ergebnisse der vorangehenden Analyse zeigten, daß die Einschlußkapazität gemessen als das Verhältnis von Iod zu Lipid (I/L) durchweg im Bereich von 3 bis 5 mg (oder mehr) eingeschlossenes Iod/mg Lipid lag, was bedeutet, daß das durchschnittliche innere eingeschlossene Volumen der liposomalen Vesikel (berechnet auf der Basis einer Iodkonzentration von 260 mg/ml) etwa 12 bis 19 ul/mg Lipid (oder mehr) betrug.
- Ein Teil der Präparation A der mit Kontrastmittel beladenen Liposomen dieses Beispiels wurde gegen gepufferte Salzlösung (0,9 % NaCl, 10 mM Tris.HCl, pH 7,2) enthaltend Na&sub2;Ca EDTA (0,9 mM) unter Verwendung einer 0,22 um Membran (Millipore) diafiltriert. Die resultierende Zubereitung (Präparation B) sowie die Präparation A waren für die direkte Injektion in dem Blutstrom von Versuchstieren geeignet, wobei beide eine Röntgenkontrastierung der Blutgefäße und Organe (z.B. Leber und Milz) mit ausgesprochen vorteilhaften Ergebnissen ergaben.
- Wenn in dem vorangehenden Beispiel das Iopamidol durch Iomeprol (N,N'-Bis-(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiod-5-glykolamidoisophthalamid), einem anderen iodierten Kontrastmittel von BRACCO INDUSTRIA CHIMICA (Mailand), ersetzt wurde, wurden ähnliche Einschlußergebnisse erzielt. Wenn in dem vorgenannten Beispiel das Iopamidol durch 817500, einem von BRACCO hergestellten, experimentellen ionischen Dimer ersetzt wurde, wurden I/L-Werte oberhalb von 6, die gelegentlich 7 überschritten, erhalten. Annliche Ergebnisse wurden mit Iotrolan, einem von der SCHERING AG hergestellten, nichtionischen Dimer beobachtet.
- REV-Liposomen wurden gemäß dem Verfahren von Szoka et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, (1978), 4194) hergestellt. In Kürze, hydriertes Sojalecithin (Phospholipon 90H von der NATTERMANN PHOSPHOLIPID Gmbh, 912,2 mg) und DPPA (92,9 mg) wurden in 80 ml einer 1 : 1 Mischung von Chloroform und Isopropylether gelöst. Hierzu wurden 30 ml destilliertes Wasser hinzugefügt und die Mischung unter Verwendung eines Branson Probe Sonifiers durch Beschallung emulgiert (5 x 1 Minute), während die Temperatur bei 45 ºC gehalten wurde. Dann wurde die Emulsion bei 45 ºC unter reduziertern Druck in einem Rotationsverdampfer eingedampft.
- Nachdem die restlichen Lösungsmittel vollständig abgedampft worden waren und eine kleine Menge destilliertes Wasser hinzugefügt worden war, wurde eine Suspension von REV-Liposomen mit 33 mg Lipid/ml und einer durchschnittlichen Größe von 0,4 um erhalten. Iopamidol (1,4 g) wurde in 2 ml der Suspension gelöst und die Lösung für 1 Stunde bei 80 ºC inkubiert. Es wurden I/L- Werte (gemessen wie in Beispiel 1 beschrieben) von 2,1 bis 2,3 erhalten.
- Geringere Einschlußausbeuten wurden erhalten, wenn zum Vergleich eine Iopamidollösung (30 ml, 260 mg Iod/ml) anstelle des reinen Wassers zur anfänglichen Emulgierung mit der organischen Lipidlösung verwendet wurde.
- Diese Experimente wurden mit REV-Liposomen wiederholt, die unter Verwendung von Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG) (molares Verhältnis 9/1) mit destilliertem Wasser als wäßriger Phase hergestellt wurden, gefolgt von einer Inkubation mit Natriumdiatrizoat (215 oder 21,5 mg Iod/ml) für 20 Minuten bei 60 ºC. Zum Vergleich wurden REV-Liposomen mit den gleichen Phospholipiden unter Verwendung von Natriumdiatrizoatlösungen (215 bzw. 21,5 mg Iod/ml) anstelle von destilliertem Wasser als der anfänglichen wäßrigen Phase hergestellt. Obwohl mit beiden Ansätzen Einschlußausbeuten in derselben Größenordnung erhalten wurden, d.h. I/L-Werte von etwa 1 bzw. 0,2 bei 215 bzw. 21,5 ml Iod/ml, ergab die mit leeren Liposomen beginnende Technik immer noch bessere Ergebnisse.
- Liposomen des SUV-Typs wurden durch Beschallen einer Suspension von MLV-Liposomen, die wie in Beispiel 1 beschrieben in destilliertem Wasser hergestellt wurde, für 15 Minuten bei 60 ºC unter Verwendung eines Branson Probe Sonifiers hergestellt. Der nach Zentrifugation für 10 Minuten bei 10 000 g erhaltene Überstand wurde mit Iopamidol (Endkonzentration 260 mg Iod/ml) für 20 Minuten bei 60 ºC inkubiert. Ein I/L-Wert (gemessen wie in Beispiel 1 beschrieben) von 0,16 bis 0,17 mg Iod/mg Lipid wurde erhalten, was einem eingeschlossenen Volumen von 0,6 ul/mg Lipid entspricht.
- MLV-Liposomen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in destilliertem Wasser hergestellt. Vor der Extrusion wurde die Liposomensuspension viermal gemäß dem Verfahren von Mayer et al. (Biochim. Biophys. Acta 817, (1985), 193) eingefroren (bei -75 ºC) und aufgetaut (bei 40 ºC). Sowohl extrudierte (2 um) und nichtextrudierte Liposomensuspensionen wurden hergestellt und bei 60 ºC für 30 Minuten mit einer Iopamidollösung (260 mg Iod/ml) inkubiert. Die extrudierten Liposomen ergaben einen I/L-Wert von 5, während die nicht-extrudierten Liposomen einen I/L-Wert von 6,3 ergaben. Wenn in einer Variante die Extrusion unterhalb der Lipidübergangstemperatur, z.B. im Bereich von Raumtemperatur bis 50 ºC durchgeführt wurde, wurden höhere Einschlußausbeuten (I/L = 8 oder mehr) erhalten.
- Einfluß der Temperatur.
- MLV-Liposomen wurden gemäß Beispiel 1 bei verschiedenen Temperaturen, d.h. 55, 60, 65, 70, 80 ºC in destilliertem Wasser hergestellt. Sie wurden mit Iopamidol (Endkonzentration 260 mg Iod/ml) bei 60 ºC für 30 Minuten inkubiert. Es wurden die folgenden I/L-Werte erhalten:
- Es ist zu sehen, daß die optimale Temperatur zur Bildung von Liposomen 60 ºC beträgt, d.h. 6º oberhalb der Übergangstemperatur der verwendeten Lipidmischung (Phospholipon 100H und DPPA in einem molaren Verhältnis von 9 : 1).
- Der Einfluß der Temperatur auf die Inkubation wurde wie folgt bestimmt: MLV-Liposomen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in destilliertem Wasser bei 60 ºC hergestellt. Aliquots wurden dann bei verschiedenen Temperaturen mit einer Iopamidollösung (Endkonzentration 260 mg Iod/ml) inkubiert. Es wurden die folgenden I/L-Werte erhalten:
- Die optimale Temperatur zur Inkubation liegt im Bereich von 55 bis 60 ºC, d.h. 1 bis 60 oberhalb der Übergangstemperatur der verwendeten Lipidmischung.
- MLV-Liposomen wurden gemäß Beispiel 1 mit verschiedenen Lipidkonzentrationen in destilliertem Wasser bei 60 ºC hergestellt und dann für 30 Minuten bei 60 ºC mit einer Iopamidollösung (260 mg Iod/ml) wie in Beispiel 1 beschrieben inkubiert. Aliquots wurden für verschiedene Zeiträume (siehe unten) auf 130 ºC erhitzt und dann schnell auf Raumtemperatur abgekühlt. Die folgenden I/L-Werte wurden gemessen:
- Es kann geschlossen werden, daß die Liposomen gemäß der Erfindung hinsichtlich ihrer Beladungskapazität durch das Erhitzen auf Sterilisationstemperaturen nicht verändert werden.
- Einfluß der Lipidkonzentration.
- MLV-Liposomen wurden wie in Beispiel 1 unter Verwendung verschiedener Lipidkonzentrationen bei 60 ºC in destilliertem Wasser hergestellt. Dann wurden sie mit einer Iopamidollösung (260 mg Iod/ml) wie in Beispiel 1 beschrieben inkubiert. Die folgenden I/L-Werte wurden erhalten:
- Die besten Ergebnisse wurden bei Lipidkonzentrationen von 2,5 bis 10 mg/ml erhalten.
- MLV-Liposomen wurden in destilliertem Wasser bei 60 ºC bei einer Lipidkonzentration von 5 mg/ml hergestellt. Sie wurden konzentriert (zwischen 5 und 35 mg Lipid/ml) und dann mit einer Iopamidollösung (260 mg Iod/ml) wie in Beispiel 1 beschrieben inkubiert. Die folgenden I/L-Werte wurden erhalten:
- Es wurde kein Einfluß der Lipidkonzentration während der Inkubation mit Iopamidol auf die Einschlußkapazität festgestellt.
- MLV-Liposomen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in destilliertein Wasser hergestellt, durch eine 2 Bin Membran extrudiert und auf 35 mg Lipid/ml konzentriert. Zu 1 ml Aliquots der konzentrierten Liposomsuspension (jedoch 3 ml im Fall von Präparation A) wurden 1 ml Aliquots der folgenden Lösungen hinzugefügt:
- Präparation A: Gd-DTPA (117 mM), markiert mit einer Indikatormenge von ¹&sup5;³Gd.
- Präparation B: 4 % Lidocain HCl-Lösung in Wasser, mit NaOH auf pH 7,2 eingestellt.
- Präparation C: Natriumdiatrizoatlösung (250 mg Iod/ml).
- Präparation D: Cis-Platinlösung in destilliertem Wasser (10 mg/ml).
- Präparation E: Wäßrige Insulinlösung (20 mg/ml) mit einem auf 57,5 eingestellten pH.
- Die Inkubationen wurden bei 80 ºC (Präparation A, Präparation B und Präparation C) oder 60 ºC (Präparation D und Präparation E) für 30 Minuten durchgeführt. Die eingeschlossenen Verbindungen wurden nach Dialyse durch Messen der Radioaktivität (Präparation A), durch HPLC (Präparation B), spektrophotometrisch (Präparation C), oder durch Atomabsorption (Präparation D) bestimmt. Im Fall von Präparation E wurde das nicht-eingeschlossene Insulin durch Säulenchromatographie an DEAE-A-50 Sephadex entfernt und die Menge des eingeschlossenen Materials durch Proteinanalyse gemessen (Methode von Lowry) - Die folgenden Beladungen und entsprechenden Einschlußvolumina wurden erhalten:
- Hohe eingeschlossene Volumina wurden für alle getesteten Produkte beobachtet. Präparation A wurde wiederholt, wobei Gd-DTPA durch Gd-BOPTA Megluminsalz, einem neuen Kontrastmittel für das MRI (Code B-19030; Formel: 3-Phenylmethoxy-2-N-[2'-N'-{2"-N"- bis-(carboxymethyl)-aminomethyl}-N'-(carboxymethyl)-aminoethyl]- N-(carboxymethyl)-aminopropionsäure), das sich bei BRACCO in der Entwicklung befindet, wiederholt, und ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.
- Einfluß der Lipidzusammensetzung. Verschiedene Phospholipidmischungen wurden in einer Serie von Experimenten untersucht, die wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt wurden. Die folgenden I/L-Werte wurden erhalten:
- Legende: DPPC : Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Natriumsalz
- DPPC : Dipalmitoylphosphatidylcholin
- DMPC : Dimyristoylphosphatidylcholin
- DCP Na: Dicetylphosphatnatriumsalz
- Die Liposomen wurden bei den folgenden Temperaturen hergestellt:
- a: 40 ºC
- b: 50 ºC
- c: 50 ºC (d.h. 6 ºC oberhalb der Übergangstemperatur der Phospholipidmischung)
- d: 40 ºC (d.h. 4 ºC oberhalb der Übergangstemperatur der Mischung)
- MLV-Liposomen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben in destilliertem Wasser hergestellt. Nach der Extrusion und dem Konzentrieren wurden sie mit verschiedenen Konzentrationen von Iopamidol in Abwesenheit (Serie A) oder Anwesenheit (Serie B) von NaCl inkubiert. In den Experimenten der Serie C wurden MLV-Liposomen direkt in der Iopamidollösung in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an NaCl hergestellt. Die folgenden I/L-Werte wurden erhalten:
- Steigende Iopamidolkonzentrationen resultierten in einer steigenden Beladung ohne größeren Einfluß auf das eingeschlossene Volumen (Serie A). Die Anwesenheit von Salz reduzierte sowohl die Beladung als auch das eingeschlossene Volumen (Serie B). Trotzdem werden mit der Technik gemäß der Erfindung höhere Beladungen im Vergleich zu der klassischen MLV-Technik erreicht (Serie C).
- MLV-Liposomen wurden in verschiedenen wäßrigen Lösungen (anstelle von destilliertem Wasser) bei 60 ºC hergestellt und dann nach Extrusion und Konzentrieren für 30 Minuten bei 60 ºC mit einer Iopamidollösung (260 mg Iod/ml) inkubiert (siehe Beispiel 1). Die folgenden I/L-Werte wurden erhalten:
- Diese Experimente zeigen, daß eine Verringerung im Einschluß von Iopamidol in allen Fällen beobachtet wird, in denen die Vesikel in einem Medium gebildet werden, das bereits eine gelöste Substanz enthält. Die Anwesenheit von ionischen Stoffen wie NaCl bei ionischen Stärken oberhalb von 0,1 oder von Nicht-Elektrolyten bei Osmomolalitäten von mehr als 200 mosm/kg sind besonders nachteilig.
Claims (13)
1. Verfahren zum Beladen von in einer wäßrigen
Trägerflüssigkeit suspendierten liposomalen Vesikeln mit zu verkapselnden
Substanzen, wobei die liposomalen Vesikel aus einem mit
einer wäßrigen flüssigen Phase gefüllten Kern bestehen, der
von einer oder mehreren Membranen einer filmbildenden
Komponente einschließlich lamellarer Phospholipide und
gegebenenfalls nicht-phospholipider amphiphiler Verbindungen
umgeben ist, welches das Einbringen in die und das homogene
Verteilen der zu verkapselnden Substanzen in der
Trägerflüssigkeit und das Inkubieren bei einer Temperatur oberhalb der
Membranlipid-Übergangstemperatur Tc für einen Zeitraum
umfaßt, wobei die zu verkapselnden Substanzen durch
Transmembranpermeation in den Kern der Vesikel eindringen, dadurch
gekennzeichnet, daß die Osmolalität der Flüssigphase, die in
der inneren Kernphase der Vesikel enthalten ist, vor dem
Beladen nicht über 200 mOsm/kg liegt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem eine Mischung aus
liposomenbildenden Lipiden, von denen mindestens eine
Komponente ionisch geladen ist, für einen Zeitraum mit einer
wäßrigen Flüssigphase in Kontakt gebracht wird, der
ausreichend ist, um das Lipid zu hydratisieren und lamellisieren,
dadurch gekennzeichnet, daß das in Berührungbringen in einem
Schritt bewirkt wird, in welchem 1 Gewichtsteil der
Lipidmischung in zerkleinerter Form mit oder ohne Rühren in
mindestens 20 Teile der wäßrigen Flüssigphase eingebracht und
homogen darin verteilt wird, und dadurch, daß die Temperatur
der Flüssigphase während dieses Schrittes innerhalb eines
Bereiches von einigen ºC oberhalb der Übergangstemperatur
(Tc) der hydratisierten Form des Lipids gehalten wird, wobei
sich liposomale Vesikel mit einem hohen Anteil an darin
eingeschlossener flüssiger Phase und mit einer erhöhten
Transmembranbeladungskapazität bilden.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die wäßrige
Flüssigkeit, welche den Kern der liposomalen Vesikel füllt, auch
die wäßrige Trägerflüssigkeit bildet, in welcher die
Liposomen suspendiert sind.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die zu verkapselnde
Substanz ionisch oder nichtionisch ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die Inkubation durch
Erhitzen der liposomalen Dispersion auf eine Temperatur
zwischen Tc und etwa 150 ºC für einen Zeitraum fortgesetzt
wird, bis die Konzentrationen der gelösten Substanz in der
Trägerphase außerhalb der Liposomen und innerhalb des Kerns
im wesentlichen ausgeglichen sind.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei welchem die
Erhitzungstemperatur oberhalb 100 ºC liegt und die Erhitzungszeit
ausreichend ist, um eine Sterilisation der Liposomen
sicherzustellen.
7. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem das Verhältnis des
im inneren Kern der Liposomen eingeschlossenen Volumens zum
Gewicht der Lipide, welche die Wände der liposomalen Vesikel
bilden, nicht kleiner als 5 ul/mg ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 2, in welchem der Schritt der
Verteilung der Lipide in der Trägerphase unter Rühren bewirkt
wird, wobei die durchschnittliche Größe der so erhaltenen
liposomalen Vesikel umgekehrt proportional zum Grad des
Rührens ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die wäßrige
Flüssigkeit, in der die Liposomen gebildet werden, reines Wasser
ist, wobei die gebildeten Liposomen leere Liposomen sind,
die nur Wasser enthalten.
10. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem das im inneren Kern
der Liposomen eingeschlossene Volumen durch wiederholte
Gefrier- und Auftauschritte und/oder
Dehydratisierungs-/Rehydratisierungsschritte vergrößert wird.
11. Verfahren gemäß Anspruch 2, bei welchem die
Liposomendispersion durch eine kalibrierte poröse Membran gepreßt wird,
um die Größenverteilung der Vesikel zu homogenisieren.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die zu verkapselnden
Substanzen aus Arzneistoffen im allgemeinen und
injizierbaren diagnostischen Reagentien ausgewählt sind.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, bei welchem das diagnostische
Reagens ein organisches iodiertes Röntgenkonstrastmittel
ist, das während der Inkubation in einem Ausmaß in die
Liposomen eingebracht wird, das die in mg Iod/mg Lipid
ausgedrückte Beladungseffizienz (I/L) Werte über 3 erreichen
kann.
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