JP3241720B2 - 封入すべき外来物質に対する取り込み容量が増加されたリポソームの製造方法 - Google Patents
封入すべき外来物質に対する取り込み容量が増加されたリポソームの製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、改善された経膜充填容量を有するリポソー
ムに関する。本発明はまた、そのようなリポソームの製
造方法および着目の物質による充填にも関する。
ムに関する。本発明はまた、そのようなリポソームの製
造方法および着目の物質による充填にも関する。
周知のように、リポソームは、閉じ込められた水性液
体相に満ちたコアを取り囲む層状脂質の膜壁により閉ざ
された小胞から成る。リポソーム小胞は薬剤のような外
来物質を充填することができ、従ってそのような封入さ
れた薬剤を体内の特定器官に選択的に運ぶために利用す
ることができる。リポソームは、水性担体中に懸濁させ
ると、非経口、経口、局所および吸入経路によって患者
に薬剤を運ぶのに特に適当である。リポソーム薬剤配合
物は治療効率を向上せしめ、長い薬剤放出と治療活性を
提供し、治癒率を増加させ、そして一定の種類の病気ま
たは疾患を治療するのに必要な薬剤の総量を減らすこと
ができる。概論については、Liposomes as Drug Carrie
rs,G.Gregoriadis著,Wiley ＆ Sons,New York（1988）
を参照のこと。
体相に満ちたコアを取り囲む層状脂質の膜壁により閉ざ
された小胞から成る。リポソーム小胞は薬剤のような外
来物質を充填することができ、従ってそのような封入さ
れた薬剤を体内の特定器官に選択的に運ぶために利用す
ることができる。リポソームは、水性担体中に懸濁させ
ると、非経口、経口、局所および吸入経路によって患者
に薬剤を運ぶのに特に適当である。リポソーム薬剤配合
物は治療効率を向上せしめ、長い薬剤放出と治療活性を
提供し、治癒率を増加させ、そして一定の種類の病気ま
たは疾患を治療するのに必要な薬剤の総量を減らすこと
ができる。概論については、Liposomes as Drug Carrie
rs,G.Gregoriadis著,Wiley ＆ Sons,New York（1988）
を参照のこと。
リポソームを調製しそしてそれらに着目の外来物質を
充填する多数の方法があるが、その大部分は水性担体液
体の中に分散された前記物質を含有する水性担体液体中
でリポソーム小胞を形成させることを含んで成る。リポ
ソーム形成中に、前記担体液体の一部が、もちろん封入
しようとする少量の所望の物質と一緒に、小胞内部に閉
じ込められるようになる。この技術は「受動取り込み」
と呼ばれる。受動的に閉じ込められた水相によるリポソ
ームの充填効率は、それが担体相の性質、特にその中に
溶解された物質の濃度に強く依存しており、これがリポ
ソーム形成の収率の影響を与え得るため、しばしば非常
に低い。しかしながら、ドラッグデリバリー目的では、
取り込まれなかった物質は回収して後で再利用すること
ができるため、充填効率（これは一般に封入に関与する
物質の合計重量に対する封入材料の重量として定義され
る）は通常は重要でない。ここで、重要な因子は、むし
ろ封入に使われる脂質、即ち、リポソーム膜の形成に関
わる脂質の重量に対する有用な封入材料の比である。明
らかに、注入またはその他による脂質死重を最小化する
こと、即ち患者に投与されるベクター薬剤担体の重量を
与えられた量の治療活性種について可能な最低レベルに
維持することは、新規医薬または診断試薬の開発の上で
大きなプラスとなる。明らかに、封入を行う脂質の重量
に対する封入材料の重量の比は、いわゆる捕捉容量、即
ちリポソーム脂質の重量あたりのリポソームコア中に閉
じ込められた水相の容量（μ/mg）に正比例する。
充填する多数の方法があるが、その大部分は水性担体液
体の中に分散された前記物質を含有する水性担体液体中
でリポソーム小胞を形成させることを含んで成る。リポ
ソーム形成中に、前記担体液体の一部が、もちろん封入
しようとする少量の所望の物質と一緒に、小胞内部に閉
じ込められるようになる。この技術は「受動取り込み」
と呼ばれる。受動的に閉じ込められた水相によるリポソ
ームの充填効率は、それが担体相の性質、特にその中に
溶解された物質の濃度に強く依存しており、これがリポ
ソーム形成の収率の影響を与え得るため、しばしば非常
に低い。しかしながら、ドラッグデリバリー目的では、
取り込まれなかった物質は回収して後で再利用すること
ができるため、充填効率（これは一般に封入に関与する
物質の合計重量に対する封入材料の重量として定義され
る）は通常は重要でない。ここで、重要な因子は、むし
ろ封入に使われる脂質、即ち、リポソーム膜の形成に関
わる脂質の重量に対する有用な封入材料の比である。明
らかに、注入またはその他による脂質死重を最小化する
こと、即ち患者に投与されるベクター薬剤担体の重量を
与えられた量の治療活性種について可能な最低レベルに
維持することは、新規医薬または診断試薬の開発の上で
大きなプラスとなる。明らかに、封入を行う脂質の重量
に対する封入材料の重量の比は、いわゆる捕捉容量、即
ちリポソーム脂質の重量あたりのリポソームコア中に閉
じ込められた水相の容量（μ/mg）に正比例する。
BANGHAMら〔J.Mol.Biol.12，（1965）,238〕により記
載された古典的受動取り込み方法では、着目の化合物を
含有する水相を、反応容器の壁に付着させた乾燥リン脂
質の薄膜と接触させる。機械的手段により攪拌すると、
脂質の膨潤が起こり、多層形小胞（MLV）が形成するだ
ろう。MLVの捕捉容量は低く、典型的には約２〜４μ/
mg脂質である。超音波処理によりMLVは小型単層形小胞
（SUV）に変換することができるが、その捕捉容量は更
に小さく、例えば0.5〜１μ/mg付近である。大きい捕
捉容量を有するリポソーム、特に大きい単層形小胞（LU
V）を提供する別の調製方法が記載されている。例え
ば、DEAMER ＆ BANGHAM〔Biochim.Biophys.Acta 443,
（1976）,629〕は、膜形成脂質をエーテル中に溶解し、
そしてまずエーテルを蒸発させて表面上に薄膜を形成さ
せ、その後この薄膜を封入しようとする水相と接触させ
る代わりに、エーテル溶液を前記水相中に直接注入し、
その後エーテルを蒸発させ、それによって14μ/mgの
捕捉容量を有するリポソームを得るという方法を記載し
ている。また、水不溶性有機溶媒中の脂質の溶液を水性
担体相中に乳化させ、次いで有機溶媒を減圧下で除去す
るというSZOKA ＆ PAPAHADJOPOULOS〔P.N.A.S.75，（19
78）,4194〕により記載された逆相蒸発（REV）法は、８
〜15μ/mg脂質の捕捉容量を有するリポームを与え
た。
載された古典的受動取り込み方法では、着目の化合物を
含有する水相を、反応容器の壁に付着させた乾燥リン脂
質の薄膜と接触させる。機械的手段により攪拌すると、
脂質の膨潤が起こり、多層形小胞（MLV）が形成するだ
ろう。MLVの捕捉容量は低く、典型的には約２〜４μ/
mg脂質である。超音波処理によりMLVは小型単層形小胞
（SUV）に変換することができるが、その捕捉容量は更
に小さく、例えば0.5〜１μ/mg付近である。大きい捕
捉容量を有するリポソーム、特に大きい単層形小胞（LU
V）を提供する別の調製方法が記載されている。例え
ば、DEAMER ＆ BANGHAM〔Biochim.Biophys.Acta 443,
（1976）,629〕は、膜形成脂質をエーテル中に溶解し、
そしてまずエーテルを蒸発させて表面上に薄膜を形成さ
せ、その後この薄膜を封入しようとする水相と接触させ
る代わりに、エーテル溶液を前記水相中に直接注入し、
その後エーテルを蒸発させ、それによって14μ/mgの
捕捉容量を有するリポソームを得るという方法を記載し
ている。また、水不溶性有機溶媒中の脂質の溶液を水性
担体相中に乳化させ、次いで有機溶媒を減圧下で除去す
るというSZOKA ＆ PAPAHADJOPOULOS〔P.N.A.S.75，（19
78）,4194〕により記載された逆相蒸発（REV）法は、８
〜15μ/mg脂質の捕捉容量を有するリポームを与え
た。
リポソームを連続した脱水と再水和処理にかけること
により、または凍結と解凍により、改良された受動取り
込みが達成されている。ここで脱水は蒸発または凍結乾
燥により行われた。この技術は、例えばKIRBY ＆ GREGO
RIADIS〔Biotech−nology,1984年11月,979−984〕によ
り記載されている。また、SHEW ＆ DEAMER〔Biochim.Bi
ophys.Acta 816（1985）,1−８〕は、音波処理により調
製したリポソームを、封入しようとする溶質を含む水溶
液中で混合し、そしてこの混合物を回転フラスコ中で窒
素下で乾燥することを指摘している。再水和により、前
記溶質のかなりの部分が封入された大きなリポソームが
製造される。
により、または凍結と解凍により、改良された受動取り
込みが達成されている。ここで脱水は蒸発または凍結乾
燥により行われた。この技術は、例えばKIRBY ＆ GREGO
RIADIS〔Biotech−nology,1984年11月,979−984〕によ
り記載されている。また、SHEW ＆ DEAMER〔Biochim.Bi
ophys.Acta 816（1985）,1−８〕は、音波処理により調
製したリポソームを、封入しようとする溶質を含む水溶
液中で混合し、そしてこの混合物を回転フラスコ中で窒
素下で乾燥することを指摘している。再水和により、前
記溶質のかなりの部分が封入された大きなリポソームが
製造される。
担体液体中高濃度の封入物質を使うことにより、リポ
ソーム中に取り込まれる物質の量を増加させる試みが更
に行われているが、ほとんど成功していない。実際、前
記のように、担体相中の溶質濃度が高いと捕捉容量がし
ばしば減少し、これは封入しようとする物質が高濃度で
存在すると捕捉容量に有害な影響を与えることを指摘す
る。例えば、SZOKAら（前掲）は、担体液体中のNaClの
濃度を増加させていくとシトシンアラビノシドの取り込
みが次第に減少することを報告している。同様な状況が
WO−Ａ−89/11272（MINCHEYら）において記載されてお
り、それによれば担体液体中の薬剤濃度を増加させると
セファロスポリン取り込み収率の大幅な減少が起こる。
ソーム中に取り込まれる物質の量を増加させる試みが更
に行われているが、ほとんど成功していない。実際、前
記のように、担体相中の溶質濃度が高いと捕捉容量がし
ばしば減少し、これは封入しようとする物質が高濃度で
存在すると捕捉容量に有害な影響を与えることを指摘す
る。例えば、SZOKAら（前掲）は、担体液体中のNaClの
濃度を増加させていくとシトシンアラビノシドの取り込
みが次第に減少することを報告している。同様な状況が
WO−Ａ−89/11272（MINCHEYら）において記載されてお
り、それによれば担体液体中の薬剤濃度を増加させると
セファロスポリン取り込み収率の大幅な減少が起こる。
外来の非脂質物質をリポソームに充填する別の方法に
よれば、そのような物質が小胞壁を通って小胞コア中に
浸透することができる条件が提供される。「経膜充填」
と呼ばれるこの技術は、リポーム小胞が形成された後で
封入しようとする物質をリポーム小胞中に取り込ませる
ことを含む。普通、外来物質（特にイオン性のもの）に
よる脂質膜の通過は、入ってくる物質が前記脂質の極性
基によりはね返されるため困難である。しかしながら、
この作用は脂質膜に「遮蔽」担体を組み込むことにより
最小にすることができる。例えば、脂質膜がアセチルア
セトンのような親油性担体を含む場合、室温でリポソー
ムにカオチンを充填することができる〔BEAUMIERら、J.
Nucl.Med.32（1982）810〕。あるいは、脂質膜壁を通し
た浸透圧調節浸透により、リポソームに外来物質を取り
込ませることができる。例えば、リポソームによる外来
物質の取り込みは、J.Biol.Chem.260（1985）,802−808
により開示されたような膜内外イオン勾配、例えばNa+/
K+勾配により促進することができる。Biochim,Biophys.
Acta 857（1986）,123−126;WO−Ａ−89/04656およびPC
T/US 85/01501において言及されたように、経膜充填を
促進するのにpH勾配も有効である。しかしながら、この
技術は、Chem.Phys.Lipids 53（1990）,37において認め
られるように或る特定の範疇の薬剤に限定され、より詳
しくは弱塩基に限定される。更に、コア相のpHと異なる
pHの担体相中でリポソームを製造することは難しく、そ
の上、pHが低すぎたり高すぎたりすると早すぎる脂質の
加水分解を引き起こすため膜に損傷を与え得る。
よれば、そのような物質が小胞壁を通って小胞コア中に
浸透することができる条件が提供される。「経膜充填」
と呼ばれるこの技術は、リポーム小胞が形成された後で
封入しようとする物質をリポーム小胞中に取り込ませる
ことを含む。普通、外来物質（特にイオン性のもの）に
よる脂質膜の通過は、入ってくる物質が前記脂質の極性
基によりはね返されるため困難である。しかしながら、
この作用は脂質膜に「遮蔽」担体を組み込むことにより
最小にすることができる。例えば、脂質膜がアセチルア
セトンのような親油性担体を含む場合、室温でリポソー
ムにカオチンを充填することができる〔BEAUMIERら、J.
Nucl.Med.32（1982）810〕。あるいは、脂質膜壁を通し
た浸透圧調節浸透により、リポソームに外来物質を取り
込ませることができる。例えば、リポソームによる外来
物質の取り込みは、J.Biol.Chem.260（1985）,802−808
により開示されたような膜内外イオン勾配、例えばNa+/
K+勾配により促進することができる。Biochim,Biophys.
Acta 857（1986）,123−126;WO−Ａ−89/04656およびPC
T/US 85/01501において言及されたように、経膜充填を
促進するのにpH勾配も有効である。しかしながら、この
技術は、Chem.Phys.Lipids 53（1990）,37において認め
られるように或る特定の範疇の薬剤に限定され、より詳
しくは弱塩基に限定される。更に、コア相のpHと異なる
pHの担体相中でリポソームを製造することは難しく、そ
の上、pHが低すぎたり高すぎたりすると早すぎる脂質の
加水分解を引き起こすため膜に損傷を与え得る。
EP−Ａ−361.894（THE HEBREW UNIVERSITY）では、形
成後のpH勾配の調節下での経膜取り込みによりリポソー
ム小胞中に両親媒性薬剤を充填する技術が開示されてい
る。この技術の重要な特徴は、アンモニウム化合物の水
溶液が充填されそしてアンモニウム不含有担体媒質中に
置かれたリポソーム小胞のコアからのアンモニア（N
H3）の漏出に依存する。NH4 +からのNH3の漏出は、閉じ
込められた液体のpHの連続低下とリポソーム膜の内外の
pH勾配の連続成立と共にプロトンを放出し、即ち担体液
体がリポソームコアの内側内容物に比較してアルカリ性
になる。両親媒性化合物（例えば脱プロトン化されたア
ミン基を有する薬剤）を「アルカリ性になった」担体液
体に添加すると、系が再平衡化に向かい、そして脂質膜
を通したリポソームのコア中への前記両親媒性化合物の
拡散が起こるだろう。
成後のpH勾配の調節下での経膜取り込みによりリポソー
ム小胞中に両親媒性薬剤を充填する技術が開示されてい
る。この技術の重要な特徴は、アンモニウム化合物の水
溶液が充填されそしてアンモニウム不含有担体媒質中に
置かれたリポソーム小胞のコアからのアンモニア（N
H3）の漏出に依存する。NH4 +からのNH3の漏出は、閉じ
込められた液体のpHの連続低下とリポソーム膜の内外の
pH勾配の連続成立と共にプロトンを放出し、即ち担体液
体がリポソームコアの内側内容物に比較してアルカリ性
になる。両親媒性化合物（例えば脱プロトン化されたア
ミン基を有する薬剤）を「アルカリ性になった」担体液
体に添加すると、系が再平衡化に向かい、そして脂質膜
を通したリポソームのコア中への前記両親媒性化合物の
拡散が起こるだろう。
脱水されそして再水和されたリポソームを経膜充填に
かける技術もある。例えば、US−Ａ−4,673,567（SHION
OGI ＆ Co.）は、イオン不含有の水性担体液体中で「空
の」MLVリポソームを調製し、それらのリポソームを凍
結乾燥により脱水し、次いで乾燥したリポソームをフル
オロウラシル、セファレキシン等のような薬剤を含む担
体液体中に懸濁することにより再水和し、50℃で５分間
加熱することによりインキュベーションを行い、それに
よって担体液体中に溶解された薬剤のかなりの部分がリ
ポソーム中に閉じ込められるようになることを開示して
いる。このアプローチを支持する理論的解釈は、H.JIZO
MOTOらによりChem.Pharm.Bull.37（1989）3066−3069の
文献において認められるように、「リポソームを凍結乾
燥することで二重膜に構造的欠陥を生ぜしめ、そして転
移温度以上に加熱することでそれらの欠陥を除去する」
というものである。しかしながら、US−Ａ−4,673,567
に指摘されたように、担体液体がイオン性溶質を含む
時、この方法は捕捉容量の相当な減少により妨害され
る。例えば、この文書の表１の３行目に与えられたデー
タから、担体液体として等張のブラインまたは0.02リン
酸緩衝液を使うと経膜薬剤取り込みは事実上ごくわずか
であり、一方薬剤を純水中に溶解すると16.6μ/mg脂
質の捕捉容量値が報告された。更に、現行法では、高い
捕捉容量値は容易に獲得できないことを理解すべきであ
る。例えば、最近の文献:T.D.MADDENら、Chemistry and
Physics of Lipids 53（1990）,37−46の「プロトン勾
配を示す大きな単層形小胞中への薬剤の蓄積」（“The
accumulation of Drugs within large unilamellar ves
icles exhibiting a proton gradient"）と題する論文
では、見積られた捕捉容量が約１〜２μ/mgホスファ
チジルコリンを越えない。
かける技術もある。例えば、US−Ａ−4,673,567（SHION
OGI ＆ Co.）は、イオン不含有の水性担体液体中で「空
の」MLVリポソームを調製し、それらのリポソームを凍
結乾燥により脱水し、次いで乾燥したリポソームをフル
オロウラシル、セファレキシン等のような薬剤を含む担
体液体中に懸濁することにより再水和し、50℃で５分間
加熱することによりインキュベーションを行い、それに
よって担体液体中に溶解された薬剤のかなりの部分がリ
ポソーム中に閉じ込められるようになることを開示して
いる。このアプローチを支持する理論的解釈は、H.JIZO
MOTOらによりChem.Pharm.Bull.37（1989）3066−3069の
文献において認められるように、「リポソームを凍結乾
燥することで二重膜に構造的欠陥を生ぜしめ、そして転
移温度以上に加熱することでそれらの欠陥を除去する」
というものである。しかしながら、US−Ａ−4,673,567
に指摘されたように、担体液体がイオン性溶質を含む
時、この方法は捕捉容量の相当な減少により妨害され
る。例えば、この文書の表１の３行目に与えられたデー
タから、担体液体として等張のブラインまたは0.02リン
酸緩衝液を使うと経膜薬剤取り込みは事実上ごくわずか
であり、一方薬剤を純水中に溶解すると16.6μ/mg脂
質の捕捉容量値が報告された。更に、現行法では、高い
捕捉容量値は容易に獲得できないことを理解すべきであ
る。例えば、最近の文献:T.D.MADDENら、Chemistry and
Physics of Lipids 53（1990）,37−46の「プロトン勾
配を示す大きな単層形小胞中への薬剤の蓄積」（“The
accumulation of Drugs within large unilamellar ves
icles exhibiting a proton gradient"）と題する論文
では、見積られた捕捉容量が約１〜２μ/mgホスファ
チジルコリンを越えない。
以上の簡単な要約から明らかなように、リポソーム充
填の従来技術方法は複雑であり、費用がかかり、リポソ
ームを使って投与可能な全ての種類の薬剤および媒質に
一般的に適用できない。即ちイオン性種は一般に封入す
ることが困難である。従って、薄膜形成脂質の面倒で且
つ費用のかかる前処理〔例えば、H.JIZOMOTO,Chem.Phar
m.Bull.37（1989）,1895−1898により教示されるような
凍結乾燥〕を回避しながら、捕捉容量を有意に増加さ
せ、そして同時に、イオン性種を含む水性媒質中の実質
的に全ての種類の溶質に対して経膜充填容量を増加させ
るために膜形成脂質を効果的に状態調節することが本発
明者らのねらいであった。これは、浸透圧調節された浸
透方法に基づくと思われる添付の請求項に開示される方
法を具体化することにより達成された。
填の従来技術方法は複雑であり、費用がかかり、リポソ
ームを使って投与可能な全ての種類の薬剤および媒質に
一般的に適用できない。即ちイオン性種は一般に封入す
ることが困難である。従って、薄膜形成脂質の面倒で且
つ費用のかかる前処理〔例えば、H.JIZOMOTO,Chem.Phar
m.Bull.37（1989）,1895−1898により教示されるような
凍結乾燥〕を回避しながら、捕捉容量を有意に増加さ
せ、そして同時に、イオン性種を含む水性媒質中の実質
的に全ての種類の溶質に対して経膜充填容量を増加させ
るために膜形成脂質を効果的に状態調節することが本発
明者らのねらいであった。これは、浸透圧調節された浸
透方法に基づくと思われる添付の請求項に開示される方
法を具体化することにより達成された。
簡単に言えば、本発明によれば、利用可能な方法のい
ずれかによりリポソームを調製する。前記リポソームは
製造時は「空」である。「空」のリポソームとは、その
中に閉じ込められた水相が純水のみであるか、またはそ
うでなければ、非イオン性物質もしくは電解質の非常に
希薄な溶液から成ることを言う。一般的に言えば、新た
に調製された「空」のリポソームの封入相中に溶質が存
在する場合、その重量オスモル濃度は約0.2Osm/kgを越
えないだろう。溶質が電解質である場合、封入された液
体のイオン強度は約0.1を越えないだろう。いわゆる
「空」のリポソームが製造されたら、封入しようとする
１または複数の着目の物質を含む担体液体中にそれらを
懸濁し、そして経膜浸透により効率的な小胞充填を保証
するのに十分な時間の間、転移温度Tcよりも高い温度で
系をインキュベートする。
ずれかによりリポソームを調製する。前記リポソームは
製造時は「空」である。「空」のリポソームとは、その
中に閉じ込められた水相が純水のみであるか、またはそ
うでなければ、非イオン性物質もしくは電解質の非常に
希薄な溶液から成ることを言う。一般的に言えば、新た
に調製された「空」のリポソームの封入相中に溶質が存
在する場合、その重量オスモル濃度は約0.2Osm/kgを越
えないだろう。溶質が電解質である場合、封入された液
体のイオン強度は約0.1を越えないだろう。いわゆる
「空」のリポソームが製造されたら、封入しようとする
１または複数の着目の物質を含む担体液体中にそれらを
懸濁し、そして経膜浸透により効率的な小胞充填を保証
するのに十分な時間の間、転移温度Tcよりも高い温度で
系をインキュベートする。
この段階で本発明の主要な因子の１つが、特に溶質が
電解質である時には、最初にリポソームが調製される水
相中に溶質が無いことまたはごく少量しか存在しないこ
とに関することを強調しなければならない。この場合、
リポソーム小胞の「質」、即ちできるだけ高い捕捉容量
を生じるそれらの能力の程度は、この水性液体相のイオ
ン強度に強く依存することが認められており、当然、こ
の水相はリポソームを形成する時点で初期の「空」のリ
ポソームのコア中に閉じ込められるものでもある。この
状況は、捕捉容量がリポソーム小胞の外側に存在するイ
オン、即ち脱水後にリポソームがインキュベートされる
担体液体中のイオンによってのみ影響を受ける従来技術
（例えばUS−Ａ−4,673,567）の方法とは大きく異な
る。本発明者らによって新たに発見された意外な基本的
特徴は、新たに調製されたリポソームの膜の一時的透過
性が主として最初に「空」のリポソームを調製した液体
の性質に依存し、インキュベーション後の処理に使用す
る液体には依存しないことである。実際、空のリポソー
ムを調製するのに使われる液体中の電解質の濃度とその
後に封入される外来物質の捕捉容量との間には反比例の
関係がある。この液体を薄くすればするほど捕捉容量が
高くなる。
電解質である時には、最初にリポソームが調製される水
相中に溶質が無いことまたはごく少量しか存在しないこ
とに関することを強調しなければならない。この場合、
リポソーム小胞の「質」、即ちできるだけ高い捕捉容量
を生じるそれらの能力の程度は、この水性液体相のイオ
ン強度に強く依存することが認められており、当然、こ
の水相はリポソームを形成する時点で初期の「空」のリ
ポソームのコア中に閉じ込められるものでもある。この
状況は、捕捉容量がリポソーム小胞の外側に存在するイ
オン、即ち脱水後にリポソームがインキュベートされる
担体液体中のイオンによってのみ影響を受ける従来技術
（例えばUS−Ａ−4,673,567）の方法とは大きく異な
る。本発明者らによって新たに発見された意外な基本的
特徴は、新たに調製されたリポソームの膜の一時的透過
性が主として最初に「空」のリポソームを調製した液体
の性質に依存し、インキュベーション後の処理に使用す
る液体には依存しないことである。実際、空のリポソー
ムを調製するのに使われる液体中の電解質の濃度とその
後に封入される外来物質の捕捉容量との間には反比例の
関係がある。この液体を薄くすればするほど捕捉容量が
高くなる。
例えば、本発明の一態様では、膜形成脂質を、水性液
体担体、例えば所望により希薄な緩衝剤および／または
非イオン性安定剤、例えば糖または他のポリオールを含
むことがある、１〜12のpH、好ましくは中性付近のpHの
水と混合し、次いで担体を水和された脂質の結晶／液体
転移温度（Tc）より数℃高い温度に或る時間維持する。
狭い温度範囲内が好ましい。この範囲の幅は約20℃であ
ることができ、最も好ましい温度はこの範囲の中点の付
近、即ちTcより約４〜10℃高い温度である。効率的なリ
ン脂質の水和と状態調節に必要な時間は、担体相中の脂
質の均一溶液または分散液を得るのに必要な時間と一致
する。攪拌してもよい。一般に、液体の穏和な渦動が均
一化を保証するのに十分であるが、所望であればより速
い攪拌も可能である。脂質の水和と状態調節中に形成す
るリポソームの平均サイズは攪拌の速度と方法に依存す
るだろう。一般に、非常に遅い攪拌は、より激しい攪拌
下で操作した時よりも大きな平均サイズと内容積のリポ
ソームを形成する。リポソームの充填容量を増加させる
ため従来技術において推奨される脂質の前処理、即ち凍
結乾燥、解凍、実験用フラスコの壁上での溶液から薄膜
への蒸発、および他の類似の前処理の全てが本発明の方
法において全く不要である；しかしながら、それらの前
処理は有害でないので、所望であれば行うことができ
る。
体担体、例えば所望により希薄な緩衝剤および／または
非イオン性安定剤、例えば糖または他のポリオールを含
むことがある、１〜12のpH、好ましくは中性付近のpHの
水と混合し、次いで担体を水和された脂質の結晶／液体
転移温度（Tc）より数℃高い温度に或る時間維持する。
狭い温度範囲内が好ましい。この範囲の幅は約20℃であ
ることができ、最も好ましい温度はこの範囲の中点の付
近、即ちTcより約４〜10℃高い温度である。効率的なリ
ン脂質の水和と状態調節に必要な時間は、担体相中の脂
質の均一溶液または分散液を得るのに必要な時間と一致
する。攪拌してもよい。一般に、液体の穏和な渦動が均
一化を保証するのに十分であるが、所望であればより速
い攪拌も可能である。脂質の水和と状態調節中に形成す
るリポソームの平均サイズは攪拌の速度と方法に依存す
るだろう。一般に、非常に遅い攪拌は、より激しい攪拌
下で操作した時よりも大きな平均サイズと内容積のリポ
ソームを形成する。リポソームの充填容量を増加させる
ため従来技術において推奨される脂質の前処理、即ち凍
結乾燥、解凍、実験用フラスコの壁上での溶液から薄膜
への蒸発、および他の類似の前処理の全てが本発明の方
法において全く不要である；しかしながら、それらの前
処理は有害でないので、所望であれば行うことができ
る。
イオン荷電した成分にかかわりなく、本発明において
使用することができる脂質または脂質の混合物は、実質
的に、リポソームの分野においてよく使われる全ての化
合物、即ちグリセロリン脂質、非リン酸化グリセリド、
糖脂質、ステロール、およびリポソーム膜に改良性質を
付与するための他の添加剤を包含する。好ましくは、そ
れらは、少なくとも１種の分極性成分（少量であっても
よい）、即ちカチオンまたはアニオン機能を担持してい
る脂質またはイオン化できる界面活性剤、例えば脂肪ア
ルコール二リン酸エステル、例えばリン酸ジセチル（DC
P）または高級アルキルアミン、例えばステアリルアミ
ン（SA）である。荷電リン脂質、即ち天然源からのまた
は合成のホスファチジル酸（PA）、ホスファチジルグリ
セロール（PG）、ホスファチジルイノシトール（PI）、
ホルファチジルセリン（PS）、〔例えばジパルミトイル
ホスファチジル酸（DPPA）、ジパルミトイルホスファチ
ジルグリセロール（DPPG）等〕のような脂肪酸グリセリ
ドホスファチドが極性脂質成分として便利である。グリ
セロリン脂質としては、例えば次の合成化合物を挙げる
ことができる：ジパルミトイルホスファチジルコリン
（DPPC）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン（DPPE）並びに対応するジステアロイル−およびジ
ミリスチル−ホスファチジル−コリンおよび−エタノー
ルアミン（DSPC;DSPE;DMPCおよびDMPE）。リン脂質に
は、より高度のまたはより低度の水素化を受けている天
然のリン脂質、例えば卵および大豆のホスファチジルコ
リンも含まれる。
使用することができる脂質または脂質の混合物は、実質
的に、リポソームの分野においてよく使われる全ての化
合物、即ちグリセロリン脂質、非リン酸化グリセリド、
糖脂質、ステロール、およびリポソーム膜に改良性質を
付与するための他の添加剤を包含する。好ましくは、そ
れらは、少なくとも１種の分極性成分（少量であっても
よい）、即ちカチオンまたはアニオン機能を担持してい
る脂質またはイオン化できる界面活性剤、例えば脂肪ア
ルコール二リン酸エステル、例えばリン酸ジセチル（DC
P）または高級アルキルアミン、例えばステアリルアミ
ン（SA）である。荷電リン脂質、即ち天然源からのまた
は合成のホスファチジル酸（PA）、ホスファチジルグリ
セロール（PG）、ホスファチジルイノシトール（PI）、
ホルファチジルセリン（PS）、〔例えばジパルミトイル
ホスファチジル酸（DPPA）、ジパルミトイルホスファチ
ジルグリセロール（DPPG）等〕のような脂肪酸グリセリ
ドホスファチドが極性脂質成分として便利である。グリ
セロリン脂質としては、例えば次の合成化合物を挙げる
ことができる：ジパルミトイルホスファチジルコリン
（DPPC）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールア
ミン（DPPE）並びに対応するジステアロイル−およびジ
ミリスチル−ホスファチジル−コリンおよび−エタノー
ルアミン（DSPC;DSPE;DMPCおよびDMPE）。リン脂質に
は、より高度のまたはより低度の水素化を受けている天
然のリン脂質、例えば卵および大豆のホスファチジルコ
リンも含まれる。
糖脂質としては、セレブロシド、ガラクトセレブロシ
ド、グルコセレブロシド、スフィンゴミエリン、スルフ
ァチド並びにモノ−、ジ−およびトリ−ヘキソシドによ
り誘導体化されたスフィンゴリピドが挙げられる。膜透
過を過度に妨害するため倹約して使用すべきであるステ
ロールは、コレステロール、エルゴステロール、コプロ
スタノール、コレステロールエステル、例えばヘミスク
シネート（CHS）、トコフェロールエステル等を包含す
る。
ド、グルコセレブロシド、スフィンゴミエリン、スルフ
ァチド並びにモノ−、ジ−およびトリ−ヘキソシドによ
り誘導体化されたスフィンゴリピドが挙げられる。膜透
過を過度に妨害するため倹約して使用すべきであるステ
ロールは、コレステロール、エルゴステロール、コプロ
スタノール、コレステロールエステル、例えばヘミスク
シネート（CHS）、トコフェロールエステル等を包含す
る。
本発明の方法を実施するために、脂質または脂質の混
合物の一部を、添加剤と共にまたは添加剤を伴わずに、
一定容量の非イオン性水性液体（またはイオン強度が0.
1を越えず且つ重量オスモル濃度が0.2Osm/kgを越えない
水性液体）中に混合し、混合物が均一になるまで該脂質
の水和を進行させると、その時までに所望のリポソーム
小胞が形成されるだろう。液相が本質的に水である時、
脂質と水性液体との相対比率は重要でないが、明らか
に、その中での脂質の分散を保証するために最小量の液
体が必要である。通常、１重量部の脂質または脂質と膜
形成性添加剤との混合物について、少なくとも20重量部
の液相が使用される。しかしながら、脂質対液体の重量
比を小さくすると、例えば0.1〜１％のオーダーにする
と、優れた結果が観察される。空のリポソームを作るの
に使われる水性液体がその後インキュベーション用の担
体相として使用される場合（即ち、封入すべき物質が単
にリポソームが製造された液体に添加される場合）、脂
質に対する液体の量は多すぎない方が明らかに好まし
い。脂質に対する液体の量が多すぎると、封入すべき物
質の無益な希釈および低い取り込み収率を引き起こし得
るからである。それにもかかわらず、リポソーム分散液
が薄すぎる場合、液体の遠心（103〜105gの範囲）もし
くは部分蒸発により、または適当に孔径決定された半透
膜を通した限外濾過により、小胞の濃縮を行うことがで
きる。
合物の一部を、添加剤と共にまたは添加剤を伴わずに、
一定容量の非イオン性水性液体（またはイオン強度が0.
1を越えず且つ重量オスモル濃度が0.2Osm/kgを越えない
水性液体）中に混合し、混合物が均一になるまで該脂質
の水和を進行させると、その時までに所望のリポソーム
小胞が形成されるだろう。液相が本質的に水である時、
脂質と水性液体との相対比率は重要でないが、明らか
に、その中での脂質の分散を保証するために最小量の液
体が必要である。通常、１重量部の脂質または脂質と膜
形成性添加剤との混合物について、少なくとも20重量部
の液相が使用される。しかしながら、脂質対液体の重量
比を小さくすると、例えば0.1〜１％のオーダーにする
と、優れた結果が観察される。空のリポソームを作るの
に使われる水性液体がその後インキュベーション用の担
体相として使用される場合（即ち、封入すべき物質が単
にリポソームが製造された液体に添加される場合）、脂
質に対する液体の量は多すぎない方が明らかに好まし
い。脂質に対する液体の量が多すぎると、封入すべき物
質の無益な希釈および低い取り込み収率を引き起こし得
るからである。それにもかかわらず、リポソーム分散液
が薄すぎる場合、液体の遠心（103〜105gの範囲）もし
くは部分蒸発により、または適当に孔径決定された半透
膜を通した限外濾過により、小胞の濃縮を行うことがで
きる。
脂質を液相に添加した後、時折振盪しながらまたは一
定の攪拌下で系を放置することによって均一化させる。
この操作を行う時の温度は既に以前に限定されている。
脂質を添加する前または後で液体を所望の温度に高めて
もよい。好ましい温度は使用する脂質または脂質混合物
の種類に依存するが、最も汎用される脂質および脂質混
合物については、水和および均一化温度は約40℃〜80℃
の範囲内で選択されるだろう。
定の攪拌下で系を放置することによって均一化させる。
この操作を行う時の温度は既に以前に限定されている。
脂質を添加する前または後で液体を所望の温度に高めて
もよい。好ましい温度は使用する脂質または脂質混合物
の種類に依存するが、最も汎用される脂質および脂質混
合物については、水和および均一化温度は約40℃〜80℃
の範囲内で選択されるだろう。
本発明に含まれるリポソーム小胞が作製される液相の
組成は非常に多数ある。純水の他に、無機塩のような電
解質の希溶液、またはグリコールもしくはポリオール安
定剤のような非イオン種の溶液を使うことができる。例
えば、次の非イオン性安定剤を挙げることができる：シ
ュクロース、グルコース、ラクトースおよびマルトース
のような糖；グリコール、グリセロール、ソルビトー
ル、マンニトール、ポリエチレングリコール、デキスト
ラン、キサンタン等のようなポリオール。
組成は非常に多数ある。純水の他に、無機塩のような電
解質の希溶液、またはグリコールもしくはポリオール安
定剤のような非イオン種の溶液を使うことができる。例
えば、次の非イオン性安定剤を挙げることができる：シ
ュクロース、グルコース、ラクトースおよびマルトース
のような糖；グリコール、グリセロール、ソルビトー
ル、マンニトール、ポリエチレングリコール、デキスト
ラン、キサンタン等のようなポリオール。
脂質の水和および顕著な封入性質のリポソーム小胞へ
の状態調節を達成するのに必要な時間は、所望の温度で
数分から数時間まで異なることができるが、加熱時間は
約30〜60分を越えないのが通常好ましい。
の状態調節を達成するのに必要な時間は、所望の温度で
数分から数時間まで異なることができるが、加熱時間は
約30〜60分を越えないのが通常好ましい。
当然、本発明の方法は、単に成分を一緒に混合する以
外に、脂質と水性担体を接触させるための初期条件にも
適用する。例えば、前に言ったように、リポソームを製
造する別のルートも適用することができ、例えばまず表
面（丸底フラスコもしくはガラスビーズの表面、または
針金状材料の束の隙間表面のような）上で脂質薄膜を形
成させ、次いで脂質薄膜の水和が有効になるまで前記脂
質薄膜上に水相を接触させるかまたは循環させる。所望
により、音波処理による水和を行うことができる。しか
しながら、本発明の最も単純な調製の実施態様が最高の
取り込み量を有するリポソームを与えることが観察され
た。
外に、脂質と水性担体を接触させるための初期条件にも
適用する。例えば、前に言ったように、リポソームを製
造する別のルートも適用することができ、例えばまず表
面（丸底フラスコもしくはガラスビーズの表面、または
針金状材料の束の隙間表面のような）上で脂質薄膜を形
成させ、次いで脂質薄膜の水和が有効になるまで前記脂
質薄膜上に水相を接触させるかまたは循環させる。所望
により、音波処理による水和を行うことができる。しか
しながら、本発明の最も単純な調製の実施態様が最高の
取り込み量を有するリポソームを与えることが観察され
た。
本発明に従って得られるリポソーム小胞は、通常約80
nm〜約５μｍのサイズの範囲であり、注入による療法ま
たは診断適用を考慮する時、300〜2000nm付近のサイズ
が好ましい。それらのリポソームは好ましくはMLV型の
ものであるが、作業パラメーターの選択に応じて他の種
類のリポソームも製造することができる。それらのリポ
ソームのサイズ分布は普通広いが、狭いサイズ分布を所
望する場合、微孔質膜を通した圧力下での濾過または押
出しといった寸法規制技術を好結果に適用することがで
きる。この点で、空のリポソームの寸法規制が充填済リ
ポソームの寸法規制よりも有利であることに注目すべき
である。というのは、まだリポソーム中に物質が閉じ込
められていないので、押出し中に物質の漏出が起こらな
いためである。空のリポソームの押出しは、それらの内
部粘度（インヘレント粘度）が低いために容易である。
よって押出しは、好ましくはTcより下の温度で、例えば
室温でまたは室温より下の温度で行われる。これは次の
経膜充填段階において最適の取り込み収率（高い捕捉容
量）を提供する。更に、本発明では、空のリポソームの
型、サイズおよび濃度をインキュベーション前の要望に
従って調節することができ、それらの作業中は封入され
る物質の損失を全く伴わない。
nm〜約５μｍのサイズの範囲であり、注入による療法ま
たは診断適用を考慮する時、300〜2000nm付近のサイズ
が好ましい。それらのリポソームは好ましくはMLV型の
ものであるが、作業パラメーターの選択に応じて他の種
類のリポソームも製造することができる。それらのリポ
ソームのサイズ分布は普通広いが、狭いサイズ分布を所
望する場合、微孔質膜を通した圧力下での濾過または押
出しといった寸法規制技術を好結果に適用することがで
きる。この点で、空のリポソームの寸法規制が充填済リ
ポソームの寸法規制よりも有利であることに注目すべき
である。というのは、まだリポソーム中に物質が閉じ込
められていないので、押出し中に物質の漏出が起こらな
いためである。空のリポソームの押出しは、それらの内
部粘度（インヘレント粘度）が低いために容易である。
よって押出しは、好ましくはTcより下の温度で、例えば
室温でまたは室温より下の温度で行われる。これは次の
経膜充填段階において最適の取り込み収率（高い捕捉容
量）を提供する。更に、本発明では、空のリポソームの
型、サイズおよび濃度をインキュベーション前の要望に
従って調節することができ、それらの作業中は封入され
る物質の損失を全く伴わない。
しかしながら、本発明に従って得られるリポソームの
根本的利点は、封入すべき大部分の外来物質に対する驚
くべき充填能に関する。この充填は、封入すべき物質
を、リポソームが形成された液体または空のリポソーム
がその後に懸濁される別の液体（この液体は封入すべき
物質とのインキュベーション用の担体相として働く）中
に単に配合することにより容易に実施することができ
る。封入すべき物質はニートであるかまたは溶液の形態
にされる。次いで、一定時間、脂質転移温度Tcより高い
温度で系のインキュベーションが行われる。封入すべき
物質がニートで使われる時、それはまず担体として働く
液体中に溶解し、それから膜を通して透過し、そしてリ
ポソームコア中に浸透するだろう。外来物質が溶液状態
で添加される場合も同様な過程が起こるだろう。ただ
し、この場合には、インキュベーション担体液体がまず
前記溶液により希釈され、そして溶解した物質が上述の
ようにしてリポソーム中に浸透するだろう。従来技術と
は異なり、本発明の固有の小胞経膜充填方式は、インキ
ュベーションに使用する担体液体中にイオンが存在した
時でさえも、十分に起こることに注目することが特に重
要である。ここで前記イオンはインキュベーション担体
自体（緩衝液または塩溶液）の構成成分であるかまたは
封入すべき着目の物質の構成成分である。リポソーム小
胞により最初に捕捉される水が純水であるかまたは低濃
度の物質を含む時、従来技術において認められる浸透の
阻害が回避されることは明らかである。本発明において
特に驚くべきことは、一旦インキュベーション中にイオ
ン性物質の一部が膜を透過すれば、それが担体液体中に
まだ存在する残りの部分の透過を阻害しないことであ
る。
根本的利点は、封入すべき大部分の外来物質に対する驚
くべき充填能に関する。この充填は、封入すべき物質
を、リポソームが形成された液体または空のリポソーム
がその後に懸濁される別の液体（この液体は封入すべき
物質とのインキュベーション用の担体相として働く）中
に単に配合することにより容易に実施することができ
る。封入すべき物質はニートであるかまたは溶液の形態
にされる。次いで、一定時間、脂質転移温度Tcより高い
温度で系のインキュベーションが行われる。封入すべき
物質がニートで使われる時、それはまず担体として働く
液体中に溶解し、それから膜を通して透過し、そしてリ
ポソームコア中に浸透するだろう。外来物質が溶液状態
で添加される場合も同様な過程が起こるだろう。ただ
し、この場合には、インキュベーション担体液体がまず
前記溶液により希釈され、そして溶解した物質が上述の
ようにしてリポソーム中に浸透するだろう。従来技術と
は異なり、本発明の固有の小胞経膜充填方式は、インキ
ュベーションに使用する担体液体中にイオンが存在した
時でさえも、十分に起こることに注目することが特に重
要である。ここで前記イオンはインキュベーション担体
自体（緩衝液または塩溶液）の構成成分であるかまたは
封入すべき着目の物質の構成成分である。リポソーム小
胞により最初に捕捉される水が純水であるかまたは低濃
度の物質を含む時、従来技術において認められる浸透の
阻害が回避されることは明らかである。本発明において
特に驚くべきことは、一旦インキュベーション中にイオ
ン性物質の一部が膜を透過すれば、それが担体液体中に
まだ存在する残りの部分の透過を阻害しないことであ
る。
インキュベーション時間は、封入すべき物質に特有な
脂質中への浸透速度、担体相中のリポソームの性質およ
び濃度、並びにインキュベーション温度に関連して異な
ることができる。一般にインキュベーション時間の終点
を決定するであろう因子は、封入物質の濃度がリポソー
ムの内側と外側で同じである状態である。ちょうどこの
時、平衡に達しており、インキュベーションの延長は無
駄である。もちろん、温度を高くすればするほど、より
速く平衡が樹立される。しかしながら、温度が高すぎる
と、リポソームの性質、即ち比封入容量、即ち脂質の重
量に対するコア容積の比、に対して有害な影響となるこ
とがある。よって、インキュベーション温度は約Tcから
約150−200℃までの範囲であり、より好ましい温度は約
40〜130℃である。ここで、インキュベーション温度が
与えられた範囲の高位、即ち100〜150℃にある場合、イ
ンキュベーションと同時にリポソームの実質的滅菌が起
こるであろう。あるいは、滅菌とインキュベーションを
個別に且つ順次に行うこともできる。リポソームと封入
すべき生成物をインキュベーション温度にする加熱手段
は当業界で常用のものであり、もちろんマイクロ波加熱
手段を含む。しかしながら、幾つかの態様では、リポソ
ーム形成のための最初の脂質の水和および状態調節の温
度とインキュベーション温度は同一であることができる
けれども、両者を混同してはならないことに気付くべき
である。実際、水和温度範囲はインキュベーション温度
範囲よりもずっと狭い。水和と状態調節を与えられた温
度範囲の外側、例えば45〜55℃付近のTcを有する脂質ま
たは脂質混合物を使って約80℃で行った場合、低品質の
リポソーム、即ちより低い封入容量とより低い容積対重
量比を有するリポソームが得られるだろう。
脂質中への浸透速度、担体相中のリポソームの性質およ
び濃度、並びにインキュベーション温度に関連して異な
ることができる。一般にインキュベーション時間の終点
を決定するであろう因子は、封入物質の濃度がリポソー
ムの内側と外側で同じである状態である。ちょうどこの
時、平衡に達しており、インキュベーションの延長は無
駄である。もちろん、温度を高くすればするほど、より
速く平衡が樹立される。しかしながら、温度が高すぎる
と、リポソームの性質、即ち比封入容量、即ち脂質の重
量に対するコア容積の比、に対して有害な影響となるこ
とがある。よって、インキュベーション温度は約Tcから
約150−200℃までの範囲であり、より好ましい温度は約
40〜130℃である。ここで、インキュベーション温度が
与えられた範囲の高位、即ち100〜150℃にある場合、イ
ンキュベーションと同時にリポソームの実質的滅菌が起
こるであろう。あるいは、滅菌とインキュベーションを
個別に且つ順次に行うこともできる。リポソームと封入
すべき生成物をインキュベーション温度にする加熱手段
は当業界で常用のものであり、もちろんマイクロ波加熱
手段を含む。しかしながら、幾つかの態様では、リポソ
ーム形成のための最初の脂質の水和および状態調節の温
度とインキュベーション温度は同一であることができる
けれども、両者を混同してはならないことに気付くべき
である。実際、水和温度範囲はインキュベーション温度
範囲よりもずっと狭い。水和と状態調節を与えられた温
度範囲の外側、例えば45〜55℃付近のTcを有する脂質ま
たは脂質混合物を使って約80℃で行った場合、低品質の
リポソーム、即ちより低い封入容量とより低い容積対重
量比を有するリポソームが得られるだろう。
本発明のもう１つの利点は、インキュベーションに使
う水性担体中の脂質の濃度が、前記水性担体に添加され
る外来物質に対するリポソームの取り込み容量および効
率に全く有意な影響を与えないことであることに注目す
べきである。よって、水性担体中のリポソームを濃縮す
ることにより、即ち脂質対担体の重量比を増加させるこ
とにより、取り込み収率に好ましい影響を与えることが
でき、そして回収され後で再利用される残りの未封入物
質の量を減らすことができる。これは、リポソームコア
中の外来物質の最終濃度がインキュベーション担体液体
中のそれの初期濃度にのみ依存し、封入に使われる外来
物質の合計重量には依存しないことにより説明すること
ができる。よって、一定濃度についてインキュベーショ
ンに使用する液体の量を減らすことによりこの合計重量
を減らすことができ、そして反対に、担体相中の脂質の
濃度を増加させると封入収率の増加を引き起こすだろ
う。
う水性担体中の脂質の濃度が、前記水性担体に添加され
る外来物質に対するリポソームの取り込み容量および効
率に全く有意な影響を与えないことであることに注目す
べきである。よって、水性担体中のリポソームを濃縮す
ることにより、即ち脂質対担体の重量比を増加させるこ
とにより、取り込み収率に好ましい影響を与えることが
でき、そして回収され後で再利用される残りの未封入物
質の量を減らすことができる。これは、リポソームコア
中の外来物質の最終濃度がインキュベーション担体液体
中のそれの初期濃度にのみ依存し、封入に使われる外来
物質の合計重量には依存しないことにより説明すること
ができる。よって、一定濃度についてインキュベーショ
ンに使用する液体の量を減らすことによりこの合計重量
を減らすことができ、そして反対に、担体相中の脂質の
濃度を増加させると封入収率の増加を引き起こすだろ
う。
本発明に従ってリポソーム中に封入することができる
物質としては、想像可能な任意の療法的にまたは診断的
に活性な化合物を包含する。そのようなものとして、鎮
痛剤、麻酔剤、抗生物質、スルファミド、ステロイド、
Ｘ線不透明剤、NMR造影剤等のような薬剤を挙げること
ができる。Ｘ線不透明剤としては、例えば有機ヨウ素化
化合物、例えばN,N′−ビス〔２−ヒドロキシ−１−
（ヒドロキシメチル）エチル〕−５−〔（２−ヒドロキ
シ−１−オキソプロピル）アミノ〕−2,4,6−トリヨー
ド−1,3−ベンゼンジカルボキシアミド（イオパミドー
ル）；メトリザミド；ジアトリゾイン酸；ジアトリゾイ
ン酸ナトリウム；メグルミンジアトリゾエート；アセト
リゾイン酸およびその可溶性塩；ジプロトリゾイン酸；
ヨーダミド；ヨージパミドナトリウム；メグルミンジオ
パミド；ヨード馬尿酸およびその可溶性塩；ヨードメタ
ム酸；ヨードピラセットヨード−２−ピリドン−Ｎ−酢
酸;3,5−ジヨード−４−ピリドン−Ｎ−酢酸（ヨードピ
ラセット）およびそのジエチルアンモニウム塩；ヨータ
ラム酸；メトリゾイン酸およびその塩；ヨーパノ酸、ヨ
ーセタム酸、ヨーフェノキシ酸およびそれらの塩；チロ
パノエートナトリウム；オピデートナトリウム並びに他
の同様なヨウ素化化合物が挙げられる。
物質としては、想像可能な任意の療法的にまたは診断的
に活性な化合物を包含する。そのようなものとして、鎮
痛剤、麻酔剤、抗生物質、スルファミド、ステロイド、
Ｘ線不透明剤、NMR造影剤等のような薬剤を挙げること
ができる。Ｘ線不透明剤としては、例えば有機ヨウ素化
化合物、例えばN,N′−ビス〔２−ヒドロキシ−１−
（ヒドロキシメチル）エチル〕−５−〔（２−ヒドロキ
シ−１−オキソプロピル）アミノ〕−2,4,6−トリヨー
ド−1,3−ベンゼンジカルボキシアミド（イオパミドー
ル）；メトリザミド；ジアトリゾイン酸；ジアトリゾイ
ン酸ナトリウム；メグルミンジアトリゾエート；アセト
リゾイン酸およびその可溶性塩；ジプロトリゾイン酸；
ヨーダミド；ヨージパミドナトリウム；メグルミンジオ
パミド；ヨード馬尿酸およびその可溶性塩；ヨードメタ
ム酸；ヨードピラセットヨード−２−ピリドン−Ｎ−酢
酸;3,5−ジヨード−４−ピリドン−Ｎ−酢酸（ヨードピ
ラセット）およびそのジエチルアンモニウム塩；ヨータ
ラム酸；メトリゾイン酸およびその塩；ヨーパノ酸、ヨ
ーセタム酸、ヨーフェノキシ酸およびそれらの塩；チロ
パノエートナトリウム；オピデートナトリウム並びに他
の同様なヨウ素化化合物が挙げられる。
次の実施例は本発明を説明する。
実施例１ クロロホルム（250ml）中の溶液においてリン脂質〔9
/1モル比の水素化大豆レシチン（NATTERMANN−PHOSPHOL
IPID GabH,Kln,GermanyからのPhospholipon 100H）と
ジパルミトイルホスファチジル酸二ナトリウム塩（DPP
A）〕30gを極微量の14C−標識トリパルミチン（Amersha
m）と共に10の反応フラスコに導入した。減圧下でク
ロロホルムを蒸発させた後、55〜60℃の蒸留水６を添
加し（示差走査熱量分析により測定すると水和脂質の転
移温度は54℃であった）、時折穏やかに攪拌しながら固
形脂質を水和させて液体中に均一に分散させると、それ
によってMLV型のリポソームが高収率で形成した。約１
時間後、5mg/mlの脂質を含むリポソーム懸濁液を、２μ
ｍのポリカーボネート膜（Nuclepore）を通して60℃に
て押出し、そして室温に冷却した後、0.22μｍのミクロ
フィルター（Millipore）を使った微小濾過により30mg/
mlに濃縮した。
/1モル比の水素化大豆レシチン（NATTERMANN−PHOSPHOL
IPID GabH,Kln,GermanyからのPhospholipon 100H）と
ジパルミトイルホスファチジル酸二ナトリウム塩（DPP
A）〕30gを極微量の14C−標識トリパルミチン（Amersha
m）と共に10の反応フラスコに導入した。減圧下でク
ロロホルムを蒸発させた後、55〜60℃の蒸留水６を添
加し（示差走査熱量分析により測定すると水和脂質の転
移温度は54℃であった）、時折穏やかに攪拌しながら固
形脂質を水和させて液体中に均一に分散させると、それ
によってMLV型のリポソームが高収率で形成した。約１
時間後、5mg/mlの脂質を含むリポソーム懸濁液を、２μ
ｍのポリカーボネート膜（Nuclepore）を通して60℃に
て押出し、そして室温に冷却した後、0.22μｍのミクロ
フィルター（Millipore）を使った微小濾過により30mg/
mlに濃縮した。
濃縮したリポソーム溶液に、1040gの（Ｓ）−N,N′−
ビス〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エチ
ル〕−2,4,6−トリヨード−５−ラクトアミドイソフタ
ルアミド（イオパミドール;BRACCO INDUSTRIA CHIMICA,
Milanoにより製造されたＸ線造影剤）を含む水溶液１
、即ち520g/の共有結合ヨウ素を60℃にて添加し
た。生じた混合物（２）は260g/のヨウ素濃度を有
し、これを60℃で約30分間インキュベートした後、リポ
ソームコアの外側と内側のヨウ素濃度が等しくなった。
得られた調製物を30g脂質／に濃縮した（調製物
Ａ）。
ビス〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）エチ
ル〕−2,4,6−トリヨード−５−ラクトアミドイソフタ
ルアミド（イオパミドール;BRACCO INDUSTRIA CHIMICA,
Milanoにより製造されたＸ線造影剤）を含む水溶液１
、即ち520g/の共有結合ヨウ素を60℃にて添加し
た。生じた混合物（２）は260g/のヨウ素濃度を有
し、これを60℃で約30分間インキュベートした後、リポ
ソームコアの外側と内側のヨウ素濃度が等しくなった。
得られた調製物を30g脂質／に濃縮した（調製物
Ａ）。
調製物Ａを脂質および封入されたヨウ素について分析
した。このために、アリコート（1ml）を、リポソーム
小胞の外側のイオパミドールが全て除去されるまで（４
回の透析溶媒の交換を伴い約24時間）食塩溶液（水中0.
9％NaCl）に対して透析した。次いで試料を50℃におい
てその容量の1/10の10％トデシル硫酸ナトリウム水溶液
で処理し、そして遊離したイオパミドールを260nmにお
いて分光光度的に測定した。トリパルミチントレーサー
の残留放射能を使ってシンチレーションカウンター中で
計測することにより、対応する脂質の量を測定した。上
記分析の結果は、ヨウ素対脂質の比（I/L）として測定
された封入容量が一貫して脂質1mgあたり封入ヨウ素３
〜5mg（またはそれ以上）の範囲であったことを示し
た。これは、リポソーム小胞の平均内部捕捉容量（260m
g/mlのヨウ素濃度に基づいて算出した）が約12〜19μ
/mg脂質（またはそれ以上）であったことを意味する。
した。このために、アリコート（1ml）を、リポソーム
小胞の外側のイオパミドールが全て除去されるまで（４
回の透析溶媒の交換を伴い約24時間）食塩溶液（水中0.
9％NaCl）に対して透析した。次いで試料を50℃におい
てその容量の1/10の10％トデシル硫酸ナトリウム水溶液
で処理し、そして遊離したイオパミドールを260nmにお
いて分光光度的に測定した。トリパルミチントレーサー
の残留放射能を使ってシンチレーションカウンター中で
計測することにより、対応する脂質の量を測定した。上
記分析の結果は、ヨウ素対脂質の比（I/L）として測定
された封入容量が一貫して脂質1mgあたり封入ヨウ素３
〜5mg（またはそれ以上）の範囲であったことを示し
た。これは、リポソーム小胞の平均内部捕捉容量（260m
g/mlのヨウ素濃度に基づいて算出した）が約12〜19μ
/mg脂質（またはそれ以上）であったことを意味する。
この実施例の造影剤充填リポソームの調製物Ａの一部
を、0.22μｍ膜（Millipore）を使って、Na2Ca EDTA
（0.9mM）を含む緩衝化塩溶液（0.9％NaCl,10mM Tris−
HCl,pH7.2）に対して透析した。得られた調製物（調製
物Ｂ）並びに調製物Ａは、実験動物の血流中への注入に
直接使用することができた。それらは共に、血管および
臓器（例えば肝臓や脾臓）のＸ線不透明化に非常に好ま
しい結果を提供した。
を、0.22μｍ膜（Millipore）を使って、Na2Ca EDTA
（0.9mM）を含む緩衝化塩溶液（0.9％NaCl,10mM Tris−
HCl,pH7.2）に対して透析した。得られた調製物（調製
物Ｂ）並びに調製物Ａは、実験動物の血流中への注入に
直接使用することができた。それらは共に、血管および
臓器（例えば肝臓や脾臓）のＸ線不透明化に非常に好ま
しい結果を提供した。
上記実施例において、イオパミドールをBRACCO INDUS
TRIACHIMICA（Milano）からの別のヨウ素化造影剤であ
るイオメプロール〔N,N′−ビス（2,3−ジヒドロキシプ
ロピル）−2,4,6−トリヨード−５−グリコールアミド
イソフタルイミド〕により置き換えた時、同様な取り込
み結果が得られた。上記実施例において、イオパミドー
ルをBRACCOにより製造された実験用非イオン性二量体で
あるB17500により置き換えた時、６より大きく時々７を
越えるI/L値が得られた。SCHERING AGにより製造された
非イオン性二量体であるイオトロランを使った場合も同
様な結果が観察された。
TRIACHIMICA（Milano）からの別のヨウ素化造影剤であ
るイオメプロール〔N,N′−ビス（2,3−ジヒドロキシプ
ロピル）−2,4,6−トリヨード−５−グリコールアミド
イソフタルイミド〕により置き換えた時、同様な取り込
み結果が得られた。上記実施例において、イオパミドー
ルをBRACCOにより製造された実験用非イオン性二量体で
あるB17500により置き換えた時、６より大きく時々７を
越えるI/L値が得られた。SCHERING AGにより製造された
非イオン性二量体であるイオトロランを使った場合も同
様な結果が観察された。
実施例２ Szokaら〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75（1978）,419
4〕の方法に従ってREVリポソームを調製した。簡単に言
えば、水素化大豆レシチン（NATTERMANN PHOSPHOLIPID
GmbHからのPhospholipon 90H,912.2mg）とDPPA（92.9m
g）をクロロホルムとイソプロピルエーテルの1:1混合物
80mlに溶解した。これに、30mlの蒸留水を添加し、温度
を45℃に維持しながらBransonプローブ型超音波照射装
置を使った超音波処理（５×１分）により混合物を乳化
せしめた。次いで乳液を回転式エバポレーター中で45℃
にて減圧下で蒸発させた。残留溶媒の蒸発が完了し、少
量の蒸留水を添加した後、33mg脂質/mlおよび0.4μｍの
平均サイズを有するREVリポソームの懸濁液が得られ
た。イオパミドール（1.4g）を2mlの前記懸濁液に溶解
し、この溶液を80℃で１時間インキュベートした。2.1
〜2.3のI/L値（実施例１に記載の通りに測定）が得られ
た。
4〕の方法に従ってREVリポソームを調製した。簡単に言
えば、水素化大豆レシチン（NATTERMANN PHOSPHOLIPID
GmbHからのPhospholipon 90H,912.2mg）とDPPA（92.9m
g）をクロロホルムとイソプロピルエーテルの1:1混合物
80mlに溶解した。これに、30mlの蒸留水を添加し、温度
を45℃に維持しながらBransonプローブ型超音波照射装
置を使った超音波処理（５×１分）により混合物を乳化
せしめた。次いで乳液を回転式エバポレーター中で45℃
にて減圧下で蒸発させた。残留溶媒の蒸発が完了し、少
量の蒸留水を添加した後、33mg脂質/mlおよび0.4μｍの
平均サイズを有するREVリポソームの懸濁液が得られ
た。イオパミドール（1.4g）を2mlの前記懸濁液に溶解
し、この溶液を80℃で１時間インキュベートした。2.1
〜2.3のI/L値（実施例１に記載の通りに測定）が得られ
た。
比較のため、最初に脂質の有機溶液を乳化させるのに
純水の代わりにイオパミドール溶液（30ml、260mgヨウ
素/ml）を使った時、低い封入収率が得られた。
純水の代わりにイオパミドール溶液（30ml、260mgヨウ
素/ml）を使った時、低い封入収率が得られた。
ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）とジパ
ルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）（モル
比9/1）を使ってそして水相として蒸留水を使って調製
したREVリポソームを用いてそれらの実験を繰り返し、
次いでジアトリゾエートナトリウム（215または21.5mg
ヨウ素/ml）と共に60℃にて20分間インキュベートし
た。比較のために、最初の水性相として蒸留水の代わり
にジアトリゾエートナトリウム溶液（それぞれ215また
は21.5mgヨウ素/ml）を使って同じリン脂質を用いてREV
リポソームを調製した。この２つのアプローチにおいて
同じ低度の大きさの封入収率、即ち215mgヨウ素/mlおよ
び21.5mgヨウ素/mlそれぞれにおいては約１および0.2の
I/L比が得られた。空のリポソームを使って出発する技
術の方がより良好な結果を与えた。
ルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG）（モル
比9/1）を使ってそして水相として蒸留水を使って調製
したREVリポソームを用いてそれらの実験を繰り返し、
次いでジアトリゾエートナトリウム（215または21.5mg
ヨウ素/ml）と共に60℃にて20分間インキュベートし
た。比較のために、最初の水性相として蒸留水の代わり
にジアトリゾエートナトリウム溶液（それぞれ215また
は21.5mgヨウ素/ml）を使って同じリン脂質を用いてREV
リポソームを調製した。この２つのアプローチにおいて
同じ低度の大きさの封入収率、即ち215mgヨウ素/mlおよ
び21.5mgヨウ素/mlそれぞれにおいては約１および0.2の
I/L比が得られた。空のリポソームを使って出発する技
術の方がより良好な結果を与えた。
実施例３ 実施例１に記載したように蒸留水中で調製したMLVリ
ポソームの懸濁液を、Bransonプローブ型音波照射装置
を使って60℃にて15分間音波処理することによりSUV型
のリポソームを得た。10,000gで10分間遠心した後に得
られた上清をイオパミドール（260mgヨウ素/mlの最終濃
度）と共に60℃にて20分間インキュベートした。0.16μ
/mg脂質の捕捉容量に相当する0.16〜0.17mg/ヨウ素/m
g脂質のI/L値（実施例１に記載の通りに測定）が得られ
た。
ポソームの懸濁液を、Bransonプローブ型音波照射装置
を使って60℃にて15分間音波処理することによりSUV型
のリポソームを得た。10,000gで10分間遠心した後に得
られた上清をイオパミドール（260mgヨウ素/mlの最終濃
度）と共に60℃にて20分間インキュベートした。0.16μ
/mg脂質の捕捉容量に相当する0.16〜0.17mg/ヨウ素/m
g脂質のI/L値（実施例１に記載の通りに測定）が得られ
た。
実施例４ 実施例１に記載したように蒸留水中でMLVリポソーム
を調製した。押し出す前に、リポソーム懸濁液をMayer
らの方法〔Biochim.Biophys.Acta 817（1985）,193〕に
従って凍結（−75℃で）と解凍（40℃で）を４回繰り返
した。押出したリポソーム懸濁液（２μｍ）と押出して
いないリポソーム懸濁液の両方を調製し、イオパミドー
ル溶液（260mgヨウ素/ml）と共に60℃で30分間インキュ
ベートした。押出したリポソームは５のI/L値を与え、
一方押出していないリポソームは6.3のI/L値を与えた。
変形として、脂質転移温度より下の、例えば室温から50
℃までの温度で押出しを行った時、より高い取り込み収
率（I/L＝８またはそれ以上）が記録された。
を調製した。押し出す前に、リポソーム懸濁液をMayer
らの方法〔Biochim.Biophys.Acta 817（1985）,193〕に
従って凍結（−75℃で）と解凍（40℃で）を４回繰り返
した。押出したリポソーム懸濁液（２μｍ）と押出して
いないリポソーム懸濁液の両方を調製し、イオパミドー
ル溶液（260mgヨウ素/ml）と共に60℃で30分間インキュ
ベートした。押出したリポソームは５のI/L値を与え、
一方押出していないリポソームは6.3のI/L値を与えた。
変形として、脂質転移温度より下の、例えば室温から50
℃までの温度で押出しを行った時、より高い取り込み収
率（I/L＝８またはそれ以上）が記録された。
実施例５ 温度の影響。
様々な温度、即ち55,60,65,70および80℃において実
施例１に記載したように蒸留水中でMLVリポソームを調
製した。それらをイオパミドール（最終濃度260mgヨウ
素/ml）と共に60℃で30分間インキュベートした。下記
のI/L値が得られた。
施例１に記載したように蒸留水中でMLVリポソームを調
製した。それらをイオパミドール（最終濃度260mgヨウ
素/ml）と共に60℃で30分間インキュベートした。下記
のI/L値が得られた。
リポソーム形成の最適温度が60℃、即ち使用した脂質
混合物（9:1のモル比でのPhospholipon 100HとDPPA）の
転移温度の６℃上であることがわかる。
混合物（9:1のモル比でのPhospholipon 100HとDPPA）の
転移温度の６℃上であることがわかる。
インキュベーション温度の影響は次のようにして測定
した。60℃にて実施例１に記載したように蒸留水中でML
Vリポソームを調製した。次いでアリコートを様々な温
度でイオパミドール溶液（最終濃度260mgヨウ素/ml）と
共にインキュベートした。下記のI/L値が得られた。
した。60℃にて実施例１に記載したように蒸留水中でML
Vリポソームを調製した。次いでアリコートを様々な温
度でイオパミドール溶液（最終濃度260mgヨウ素/ml）と
共にインキュベートした。下記のI/L値が得られた。
インキュベーションの最適温度は55〜60℃の範囲内、
即ち使用した脂質混合物の転移温度の１〜６℃上であ
る。
即ち使用した脂質混合物の転移温度の１〜６℃上であ
る。
実施例６ 様々な脂質濃度を使って、実施例１と同様に60℃にて
蒸留水中でMLVリポソームを調製し、次いでそれらをイ
オパミドール溶液（260mgヨウ素/ml）と共に60℃で30分
間インキュベートした。アリコートを様々な時間130℃
に加熱し次いで迅速に室温に冷却した。下記のI/L値が
測定された。
蒸留水中でMLVリポソームを調製し、次いでそれらをイ
オパミドール溶液（260mgヨウ素/ml）と共に60℃で30分
間インキュベートした。アリコートを様々な時間130℃
に加熱し次いで迅速に室温に冷却した。下記のI/L値が
測定された。
本発明のリポソームは滅菌温度への暴露によりそれら
の充填量が変更されないと結論づけることができる。
の充填量が変更されないと結論づけることができる。
実施例７ 脂質濃度の影響。
様々な脂質濃度を使って、実施例１に記載したように
60℃にて蒸留水中でMLVリポソームを調製した。次いで
実施例１に記載したようにそれらをイオパミドール溶液
（最終濃度260mgヨウ素/ml）と共にインキュベートし
た。下記のI/L値が得られた。
60℃にて蒸留水中でMLVリポソームを調製した。次いで
実施例１に記載したようにそれらをイオパミドール溶液
（最終濃度260mgヨウ素/ml）と共にインキュベートし
た。下記のI/L値が得られた。
最良の結果は2.5〜10mg/mlの脂質濃度で得られる。
5mg/mlの脂質濃度を使って60℃にて蒸留水中でMLVリ
ポソームを調製した。次いで実施例１に記載したように
濃縮し（５〜35mg脂質/ml）、イオパミドール溶液（260
mgヨウ素/ml）と共にインキュベートした。下記のI/L値
が得られた。
ポソームを調製した。次いで実施例１に記載したように
濃縮し（５〜35mg脂質/ml）、イオパミドール溶液（260
mgヨウ素/ml）と共にインキュベートした。下記のI/L値
が得られた。
従ってイオパミドールとのインキュベーション中の脂
質濃度は取り込み量に全く影響を与えない。
質濃度は取り込み量に全く影響を与えない。
実施例８ 実施例１に記載したように蒸留水中でMLVリポソーム
を調製し、２μｍの膜を通して押出し、そして35mg脂質
/mlに濃縮した。濃縮したリポソーム懸濁液の1mlアリコ
ート（ただし調製物Ａの場合は3ml）に下記の溶液の1ml
アリコートを添加した。
を調製し、２μｍの膜を通して押出し、そして35mg脂質
/mlに濃縮した。濃縮したリポソーム懸濁液の1mlアリコ
ート（ただし調製物Ａの場合は3ml）に下記の溶液の1ml
アリコートを添加した。
調製物A:極微量の153Gdにより標識されたGd−DPTA（17m
M）。
M）。
調製物B:NaOHでpH7.2に調整された水中の４％リドカイ
ンHCl溶液。
ンHCl溶液。
調製物C:ジアトリゾエートナトリウム溶液（215mgヨウ
素/ml）。
素/ml）。
調製物D:蒸留水中のシスプラチン溶液（10mg/ml）。
調製物E:pH7.5に調整された水性インスリン溶液（20mg/
ml）。
ml）。
インキュベーションを80℃（調製物Ａ、調製物Ｂおよ
び調製物Ｃ）または60℃（調製物Ｄおよび調製物Ｅ）に
おいて30分間行った。透析後、放射能計測（調製物
Ａ）、HPLC（調製物Ｂ）、分光光度分析（調製物Ｃ）、
原子吸光（調製物Ｄ）により取り込まれた化合物を測定
した。調製物Ｅについては、取り込まれなかったインス
リンをDEAE−Ａ−50セファデックス上でのカラムクロマ
トグラフィーにより除去し、取り込まれた物質の量をタ
ンパク質分析（Lowry法）により測定した。次の充填量
と対応する捕捉容量が得られた。
び調製物Ｃ）または60℃（調製物Ｄおよび調製物Ｅ）に
おいて30分間行った。透析後、放射能計測（調製物
Ａ）、HPLC（調製物Ｂ）、分光光度分析（調製物Ｃ）、
原子吸光（調製物Ｄ）により取り込まれた化合物を測定
した。調製物Ｅについては、取り込まれなかったインス
リンをDEAE−Ａ−50セファデックス上でのカラムクロマ
トグラフィーにより除去し、取り込まれた物質の量をタ
ンパク質分析（Lowry法）により測定した。次の充填量
と対応する捕捉容量が得られた。
試験した全ての生成物について高い捕捉容量が観察さ
れた。BRACCOにより開発されたMRI用の新規造影剤であ
るGd−BOPTAメグルミン塩（コードＢ−19030;式:3−フ
ェニルメトキシ−２−Ｎ−〔２′−Ｎ′−｛２″−Ｎ″
−ビス（カルボキシメチル）アミノエチル｝−Ｎ′−
（カルボキシメチル）アミノエチル〕−Ｎ−（カルボキ
シメチル）アミノプロピオン酸）によりGd−DPTAを置き
換えることにより調製Ａを繰り返すと、同様な結果が得
られた。
れた。BRACCOにより開発されたMRI用の新規造影剤であ
るGd−BOPTAメグルミン塩（コードＢ−19030;式:3−フ
ェニルメトキシ−２−Ｎ−〔２′−Ｎ′−｛２″−Ｎ″
−ビス（カルボキシメチル）アミノエチル｝−Ｎ′−
（カルボキシメチル）アミノエチル〕−Ｎ−（カルボキ
シメチル）アミノプロピオン酸）によりGd−DPTAを置き
換えることにより調製Ａを繰り返すと、同様な結果が得
られた。
実施例９ 脂質組成の影響。
実施例１に記載のように実施した一連の実験において
様々なリン脂質混合物を評価した。下記のI/L値が得ら
れた。脂質組成（モル比） I/L Phospholipon 100H/DPPA・Na2（9.9/0.1） 3.0 Phospholipon 100H/DPPA・Na2（9.5/0.5） 3.7 Phospholipon 100H/DPPA・Na2（9.25/0.75） 4.2 Phospholipon 100H/DPPA・Na2（9/1） 4.9 Phospholipon 100H/DPPG（9/1） 4.8 Phospholipon 100H/コレステロール/DPPA・Na2（4.5/4.
5/1）ａ 1.3 Phospholipon 100H/コレステロール/DPPA・Na2（6.75/
2.23/1）ｂ 2.2 Phospholipon 100H 1.4 Phospholipon 100H/ステアリルアミン（9/1） 1.7 DPPC/DPPA・Na2（9/1）ｃ 4.0 DPPC/DMPC/DPPA・Na2（4.5/4.5/1）ｄ 3.6 Phospholipon 100H/DCP・Na（9/1） 3.0 Phospholipon 90H/DSPA・Na2（9/1） 凡例:DPPG:ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
ナトリウム塩 DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン DMPC:ジミリストイルホスファチジルコリン DCP・Na:ジセチルホスフェートナトリウム塩 次の温度でリポソームを調製した。
様々なリン脂質混合物を評価した。下記のI/L値が得ら
れた。脂質組成（モル比） I/L Phospholipon 100H/DPPA・Na2（9.9/0.1） 3.0 Phospholipon 100H/DPPA・Na2（9.5/0.5） 3.7 Phospholipon 100H/DPPA・Na2（9.25/0.75） 4.2 Phospholipon 100H/DPPA・Na2（9/1） 4.9 Phospholipon 100H/DPPG（9/1） 4.8 Phospholipon 100H/コレステロール/DPPA・Na2（4.5/4.
5/1）ａ 1.3 Phospholipon 100H/コレステロール/DPPA・Na2（6.75/
2.23/1）ｂ 2.2 Phospholipon 100H 1.4 Phospholipon 100H/ステアリルアミン（9/1） 1.7 DPPC/DPPA・Na2（9/1）ｃ 4.0 DPPC/DMPC/DPPA・Na2（4.5/4.5/1）ｄ 3.6 Phospholipon 100H/DCP・Na（9/1） 3.0 Phospholipon 90H/DSPA・Na2（9/1） 凡例:DPPG:ジパルミトイルホスファチジルグリセロール
ナトリウム塩 DPPC:ジパルミトイルホスファチジルコリン DMPC:ジミリストイルホスファチジルコリン DCP・Na:ジセチルホスフェートナトリウム塩 次の温度でリポソームを調製した。
a:40℃ b:50℃ c:50℃（即ちリン脂質混合物の転移温度の６℃上） d:40℃（即ちリン脂質混合物の転移温度の４℃上） 実施例10 実施例１に記載したように蒸留水中でMLVリポソーム
を調製した。押出しおよび濃縮後、それらをNaClの非存
在下（系列Ａ）または存在下（系列Ｂ）において様々な
濃度のイオパミドールと共にインキュベートした。系列
Ｃの実験では、様々な濃度のNaClの存在下でイオパミド
ール溶液中で直接MLVリポソームを調製した。下記のI/L
値が得られた。
を調製した。押出しおよび濃縮後、それらをNaClの非存
在下（系列Ａ）または存在下（系列Ｂ）において様々な
濃度のイオパミドールと共にインキュベートした。系列
Ｃの実験では、様々な濃度のNaClの存在下でイオパミド
ール溶液中で直接MLVリポソームを調製した。下記のI/L
値が得られた。
イオパミドール濃度を増加させると充填量が増加する
が、捕捉容量には全く重大な影響を与えなかった（系列
Ａ）。NaClの存在は充填量と捕捉容量の両方を減少させ
た（系列Ｂ）。それにもかかわらず、古典的なMLV技術
（系列Ｃ）に比較すると本発明の技術では高い充填量が
達成される。
が、捕捉容量には全く重大な影響を与えなかった（系列
Ａ）。NaClの存在は充填量と捕捉容量の両方を減少させ
た（系列Ｂ）。それにもかかわらず、古典的なMLV技術
（系列Ｃ）に比較すると本発明の技術では高い充填量が
達成される。
実施例11 様々な水溶液（蒸留水の代わりに）中で60℃にてMLV
リポソームを調製し、次いで押出しおよび濃縮後、それ
らをイオパミドール溶液（260mgヨウ素/ml）（実施例１
参照）と共に60℃にて30分間インキュベートした。下記
のI/L値が得られた。
リポソームを調製し、次いで押出しおよび濃縮後、それ
らをイオパミドール溶液（260mgヨウ素/ml）（実施例１
参照）と共に60℃にて30分間インキュベートした。下記
のI/L値が得られた。
それらの実験から認められるように、既に溶質を含む
媒質中で小胞を形成させるとイオパミドールの取り込み
の減少が観察される。0.1より大きいイオン強度におけ
るNaClのようなイオン種の存在または200mOsm/kgより大
きい重量オスモル濃度における非電解質の存在は特に有
害な影響を及ぼす。
媒質中で小胞を形成させるとイオパミドールの取り込み
の減少が観察される。0.1より大きいイオン強度におけ
るNaClのようなイオン種の存在または200mOsm/kgより大
きい重量オスモル濃度における非電解質の存在は特に有
害な影響を及ぼす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヤサントゥ，ローラン フランス国，エフ―74140 オーボンヌ （番地なし) (72)発明者 ギロ，クリスチャン フランス国，エフ―74160 ル シャブ ル―ボーモン，レ エプラーヌ （番地 なし) (72)発明者 ラミ，ベルナール スイス国，ツェーハー―1202 ジュネー ブ，リュ デ リラ，７ (56)参考文献 特開 平１−75418（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−7934（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−500192（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／5636（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 9/127 A61K 49/00 - 49/22 B01J 13/02
Claims (13)
- 【請求項１】水性担体液体中に懸濁されたリポソーム小
胞に封入すべき物質を充填する方法であって、前記リポ
ソーム小胞は層状リン脂質と場合により非リン脂質両親
媒性化合物を含む膜形成成分の１または複数の膜により
取り囲まれた水性液体相に満ちたコアから成り、前記方
法は前記封入すべき物質を前記担体液体中に導入しそし
て均一に分散させ、膜脂質転移温度Tcよりも高い温度に
おいて一定時間の間インキュベートすることを含んで成
り、それによって前記封入すべき物質が経膜透過により
前記小胞のコア中に浸透する方法であって、充填前の小
胞内部コア相中に含まれる液体相の重量オスモル濃度が
200mOsm/kgを越えないことを特徴とする方法。 - 【請求項２】少なくとも１つの成分がイオン的に荷電し
ているリポソーム形成脂質の混合物が、前記脂質を水和
させそして積層化させるのに十分な時間の間水性液体相
と接触した状態に置かれ、前記接触は、攪拌しながらま
たは攪拌せずに１重量部の粉砕された形の前記脂質混合
物が少なくとも20重量部の前記水性液体相中に導入され
そして均一に分散される段階において行われ、そしてこ
の段階中は前記液体相の温度が前記水和形の脂質の転移
温度（Tc）より４〜10℃上の温度範囲に維持されること
を特徴とし、それによって高い比率の液体相が中に封入
され且つ経膜充填容量が増加されたリポソーム小胞が形
成する、請求項１の方法。 - 【請求項３】前記リポソーム小胞のコアを満たす水性液
体が、リポソームが懸濁される水性担体液体も構成す
る、請求項１の方法。 - 【請求項４】前記封入すべき物質がイオン性または非イ
オン性である、請求項１の方法。 - 【請求項５】前記リポソーム分散液を、リポソームの外
側とそのコアの内側の担体相中の溶解物質の濃度が実質
的に平衡になるまでの時間、Tcと150℃の間の温度に加
熱することによりインキュベーションが行われる、請求
項１の方法。 - 【請求項６】前記加熱温度が100℃より高く、そして加
熱時間がリポソームの滅菌を保証するのに十分である、
請求項５の方法。 - 【請求項７】リポソーム内部コア中に取り込まれる容量
対リポソーム小胞壁を構成する脂質の重量の比が５μ
/mg以上である、請求項２の方法。 - 【請求項８】前記担体相中に脂質を分散する段階が攪拌
下で行われ、こうして得られるリポソーム小胞の平均サ
イズが前記攪拌の程度に反比例する、請求項２の方法。 - 【請求項９】前記リポソームが形成される水性液体が純
水であり、それによって形成するリポソームが水のみを
含む空のリポソームである、請求項１の方法。 - 【請求項１０】繰り返し凍結−解凍段階および／または
脱水−再水和段階によりリポソーム内部コア中に取り込
まれる容量が増加される、請求項２の方法。 - 【請求項１１】前記小胞のサイズ分布を均一化するため
に前記リポソーム分散液が孔径調整された多孔質膜を通
して押し出される、請求項２の方法。 - 【請求項１２】前記封入すべき物質が一般の薬剤および
注入可能な診断薬から選択される、請求項１の方法。 - 【請求項１３】前記診断薬が有機ヨウ素化Ｘ線造影剤で
あって、該薬剤が、脂質1mgあたりのヨウ素のmg（I/L）
により表わされる充填効率が３より大きい値に達するこ
とができる程度にインキュベーションの間にリポソーム
内に充填される、請求項12の方法。
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