DE69923181T2

DE69923181T2 - Temperatursensitive liposomale formulierung

Info

Publication number: DE69923181T2
Application number: DE69923181T
Authority: DE
Inventors: David Needham
Original assignee: University of Durham; Duke University
Current assignee: University of Durham; Duke University
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2019-06-10
Also published as: ATE286718T1; HK1035673A1; ES2238838T3; WO1999065466A1; CA2335250A1; AU749806B2; CA2335250C; JP4691253B2; DE69923181D1; JP2002518317A; US6200598B1; AU4556499A; EP1089713A1; JP2010138200A; EP1089713B1

Description

Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter der Bewilligung NIH GM40162 des "National Institutes of Health" und des "National Cancer Institute SPORE", Bewilligung P50-CA68438 gemacht. Die Regierung kann an dieser Erfindung gewisse Rechte besitzen.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft thermosensitive Liposome und insbesondere Liposome, welche Phospholipide und einen Oberflächenaktivstoff umfassen, worin die Liposome ihren Inhalt bei milden hyperthermischen Temperaturen freisetzten.
Hintergrund der Erfindung
Liposome bestehen aus mindestens einer Lipid-Doppelschichtmembran, die ein wässriges inneres Kompartiment einschließt. Liposome können durch Membran-Typ und Größe charakterisiert werden. Kleine unilamellare Vesikel (SUVs) habe eine einzelne Membran und gewöhnlich einen Durchmesser im Bereich zwischen 0,02 und 0,05 μm; große unilamellare Vesikel (LUVs) sind gewöhnlich größer als 0,05 μm. Oliglamellare große Vesikel und multilamellare große Vesikel haben mehrere, gewöhnlich konzentrische, Membranschichten und sind gewöhnlich größer als 0,1 μm. Liposome mit mehreren nicht konzentrischen Membranen, d. h. mehreren kleinen Vesikeln, die in einer größeren Vesikel enthalten sind, werden als mulitvesikuläre Vesikel bezeichnet.
Konventionelle Liposome werden zubereitet, um ein therapeutisches Agens, Arzneimittel oder andere aktive Agenzien zu transportieren, die entweder innerhalb des wässrigen Innenbereichs (wasserlösliche aktive Agenzien) oder verteilt in der Lipid-Doppelschicht (wasserunlösliche aktive Agenzien) enthalten sind. Die gleichzeitig an hängige US-Patentanmeldung SN 08/795,100 offenbart Liposome, die Cholesterin in der Lipid-Doppelschichtmembran enthalten, wobei ein aktives Agens mit einem Lipid-Oberflächenaktivstoff aggregiert ist, um Mizellen zu bilden und wobei die Mizellen im Innenbereich des Liposoms eingeschlossen sind.
Aktive Agenzien, die im Blutkreislauf kurze Halbwertszeiten haben, sind insbesondere geeignet, durch Liposome zugeführt zu werden. Beispielsweise ist von vielen anti-neoplastische Agenzien bekannt, dass sie im Blutkreislauf eine kurze Halbwertszeit haben, so dass ihre parenterale Verwendung nicht praktikabel ist. Jedoch ist die Verwendung von Liposomen zum ortsspezifischen Transport von aktiven Agenzien über den Blutkreislauf begrenzt durch die schnelle Clearance von Liposomen aus dem Blut durch Zellen des retikuloendothelialen Systems (RES).
Liposome sind normalerweise nicht undicht aber sie werden es, wenn ein Loch in der Liposommembran auftritt, wenn die Membran abgebaut wird oder sich auflöst oder wenn die Membrantemperatur auf die Phasenumwandlungstemperatur erhöht wird. Das Anheben der Temperatur (Hyperthermie) an einem Zielort in einem Subjekt, um die Liposom-Temperatur über die Phasenumwandlungstemperatur anzuheben und dadurch die Freisetzung des Liposominhalts zu bewirken, wurde, zur selektiven Zuführung von therapeutischen Agenzien angewendet. Yatvin et al., Science 204: 188 (1979). Diese Technik ist jedoch begrenzt, wenn die Phasenumwandlungstemperatur des Liposoms wesentlich höher ist als die normale Gewebstemperatur.
Es ist demgemäß wünschenswert, Liposom-Zubereitungen zu formulieren, die zur Zuführung therapeutischer Mengen aktiver Agenzien als Reaktion auf milde hyperthermische Bedingungen in der Lage sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Hinblick auf das Vorangehende ist ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Liposom, das ein aktives Agens enthält. Die Doppelschichtmembran des Liposoms enthält Phospholipide als primäre Lipid-Quelle; Lysolipide sind in der Doppelschichtmembran in einer Menge enthalten, welche den Prozentsatz des bei der Phasenumwandlungstemperatur freigesetzten aktiven Agens im Vergleich zu demjenigen erhöht, der in Abwesenheit des Lysolipids auftreten würde.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Liposom, das eine Lipid-Doppelschichtmembran besitzt, welche Phospholipide als primäre Lipid-Quelle und 2 mol.-% bis 30 mol.-%, bevorzugt 10 mol.-% bis 20 mol.-%, Lysolipid umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines aktiven Agens zur hyperthermischen Verabreichung. Das aktive Agens ist in einem Liposom eingeschlossen, das eine Lipid-Doppelschichtmembran besitzt, welche Phospholipide als primäre Lipid-Quelle und 1 mol.-% bis 30 mol.-% Lysolipid umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Liposom-Zubereitung, welche, eine Vielzahl von Liposomen, wie oben beschrieben, umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Liposomen, die ein aktives Agens im Liposominnenbereich enthalten. Es wird zuerst ein Phospholipidfilm, der Lysolipid enthält, hergestellt und dann mit einer wässrigen Zubereitung hydratisiert, welche das aktive Agens und eine äquilibrierende Menge Lysolipid-Monomer enthält. Das Lysolipid ist in der Liposommembran in einer Menge enthalten, die ausreichend ist, um den Prozentsatz aktives Agens zu erhöhen, das bei der Phasenumwandlungstemperatur der Liposommembran freigesetzt wird, verglichen mit dem, der in Abwesenheit des Lysolipids auftreten würde.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 repräsentiert schematisch ein Liposom, das eine Doppelschichtmembran besitzt, welche Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) als Phospholipid und Monopalmitoylphosphatidylcholin (MPPC) als Lysolipid enthält. Es wird die Orientierung der Lysolipid-Monomere und ihre Anwesenheit in sowohl der inneren als auch der äußeren Schicht der Lipid-Doppelschicht gezeigt.
2 stellt graphisch den Effekt des Extrusions-Durchgangs auf den mittleren Durchmesser von DPPC-Liposomen dar, die DPPC:MPPC (90:10) enthalten. Multilamellare Vesikel mit einer durchschnittlichen Größe von 700 nm wurden durch einen Stapel aus zwei Polycarbonatmembranen der Porengröße 0,1 mM unter einem Druck von 300–400 psi bei 45°C extrudiert.
3 stellt graphisch die Freisetzung von 6-Carboxyfluorescein (CF), das in Liposomen eingeschlossen ist, welche aus DPPC:MPPC (90:10) bestehen, in Anwesenheit von PBS bei 37° (leere Rechtecke) und 40°C (gefüllte Rechtecke) als Funktion der Zeit dar.
4 stellt graphisch die Freisetzung von CF aus DPPC:MPPC-Liposomen mit verschiedenen Konzentrationen, bei Temperaturen zwischen 20°C und 45°C in Anwesenheit von 10 mM PBS (pH = 7,4) dar. Die Liposome enthielten ausschließlich DPPC (leere Kreise), DPPC:MPPC 98:2 (gefüllte Rechtecke), DPPC:MPPC 96:4 (gefüllte Dreiecke
), DPPC:MPPC 94:6 (leere Dreiecke
), DPPC:MPPC 93:7 (gefüllte Karos), DPPC:MPPC 92:8 (leere Rechtecke), DPPC:MPPC 90:10 (gefüllte Kreise), DPPC:MPPC 80:20 (gefüllte Dreiecke
).
5A stellt ein Wärmefluss-Thermogramm dar, das den Effekt verschiedener MPPC-Konzentrationen auf die Phasenumwandlungstemperatur (Tc) von DPPC-Liposomen zeigt. Die Tc von lyophilisierten Liposom-Proben von DPPC, die MPPC (1–10 mol.-%) enthalten, wurde mittels Dif ferentialscanning-Kalorimetrie (DSC) zwischen 30°C–45°C mit einer Heizrate von 2°C/Minute gemessen.
5B stellt graphisch den Effekt der MPPC-Konzentration auf die Phasenumwandlungstemperatur (Tc) von DPPC-Liposomen dar, wie es oben für 5A beschrieben wurde. Der Graph zeigt den Anfangspunkt der Umwandlung (leerer Kreis), den Höchstwert der Enthalpie (gefüllter Kreis) und den Endpunkt der Umwandlung (leeres Dreieck).
6A vergleicht die Differentialscanning-Kalorimetrie-Profile (überschüssiger Wärmefluss; leere Rechtecke) von Liposomen (90:10 DPPC:MPPC) mit dem differentiellen Freisetzungsprofil (gefüllte Kreise) für die 6-Carboxyfluorescein (CF) Freisetzung, wie sie aus dem in 4 beschriebenen, kumulativen Freisetzungsversuch erhalten wurde.
6B stellt graphisch das differentielle Freisetzungsprofil von 90:10 DPPC:MPPC Liposomen dar, worin leere Kreise Wärmefluss und gefüllte Kreise differentielle Freisetzung von CF über Temperaturen von 25°C bis 45°C repräsentieren.
7 stellt graphisch die Freisetzung von eingeschlossenem Doxorubicin (DX) aus Liposomen (90:10 DPPC:MPPC) als Funktion der Zeit bei 37°C (gefüllte Kreise) und 40°C (leere Kreise) in Anwesenheit von PBS dar.
8 stellt graphisch die kumulativen Freisetzungsprofile von eingeschlossenem DX aus Liposomen dar, die aus 90:10 DPPC:MPPC bestehen, fünf Minuten lang inkubiert bei Temperaturen zwischen 25°C und 45°C in Anwesenheit von PBS.
9A stellt graphisch die Freisetzung von eingeschlossenem 6-Carboxyfluorescein (CF) aus Liposomen dar (90:10 DPPC:MPPC inkorporiert mit 5 mol.-% DSPE-PEG2000) in Anwesenheit von PBS und als Funktion der Temperatur dar (37°C – leere Kreise, 38°C – gefüllte Rechtecke, 39°C – gefüllte Dreiecke, 39,5°C – leere Dreiecke und 40°C – gefüllte Kreise).
9B stellt graphisch die Freisetzung von eingeschlossenem 6-Carboxyfluorescein (CF) aus Liposomen dar (bestehend aus 90:10 DPPC:MPPC und inkorporiert mit 5 mol.-% DSPE-PEG2000) in Anwesenheit von 50% Bovinserum und als Funktion der Temperatur (37°C – leere Kreise, 38°C – gefüllte Rechtecke, 39°C – gefüllte Dreiecke, 39,5°C – leere Dreiecke und 40°C – gefüllte Kreise).
10 stellt graphisch die kumulative Freisetzung von eingeschlossenem 6-Carboxyfluorescein (CF) aus Liposomen, bestehend aus 90:10 DPPC:MPPC, bei verschiedenen Temperaturen von 25° bis 45°C in Anwesenheit von PBS (gefüllte Kreise) oder 50% Bovinserum (leere Kreise) dar.
11A zeigt die chemische Struktur von 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC).
11B zeigt die chemische Struktur von 1-Palmitoyl-2-hydoxy-sn-glycero-3-phosphocholin (MPPC).
11C zeigt die chemische Struktur von 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[poly(ethylenglycol)2000] (DSPE-PEG2000).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Liposome bereit, die gegenüber Änderungen der Temperatur in ihrer Umgebung empfindlich sind. Die Temperaturempfindlichkeit solcher Liposome gestattet die Freisetzung von Verbindungen, die im wässrigen Innenbereich des Liposoms eingeschlossen sind, und/oder die Freisetzung von Verbindungen, die mit der Lipid-Doppelschicht assoziiert sind, an einem Zielort, der entweder erhitzt wird (wie beim klinischen Verfahren der Hyperthermie) oder der eine intrinsisch höhere Temperatur besitzt als der Rest des Körpers (wie bei einer Entzündung). Erfindungsgemäße Liposom-Doppelschichten schließen (zusätzlich zu einer primären oder Lipid- Hauptkomponente) Lysolipid oder einen anderen Oberflächenaktivstoff(e) ein. Der Einschluss von Lysolipid oder einem anderen Oberflächenaktivstoff in der Liposom-Doppelschicht verstärkt die Freisetzung von Verbindungen, wenn die Liposom-Temperatur die Gel-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur der primären Lipid-Komponente erreicht. Die Anwesenheit von Lysolipid (oder eines anderen Oberflächenaktivstoff) bewirkt auch, dass das Liposom das Arzneimittel bei einer etwas geringeren Temperatur freisetzt als bei der, welche man mit Liposomen erreicht, die ausschließlich aus Phospholipiden bestehen. Erfindungsgemäße Liposome sind insbesondere bei der Zuführung von Arzneimitteln nützlich, wenn die Liposome eine Verbindung enthalten, die einem vorher ausgewählte Zielort im Körper eines Subjekts zugeführt werden soll. Der Zielort wird entweder künstlich erhitzt (Hyperthermie), so dass er auf oder über der Gel-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur ist, oder der Zielort kann auf einer höheren Temperatur sein als Nicht-Zielorte im Körper aufgrund natürlicher Ursachen (z. B. Entzündung), wo die Temperatur bei oder über der Gel-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur des eingesetzten Liposoms liegt.
Wenn Liposome mehrere Minuten lang bei Temperaturen inkubiert werden, die im Bereich der Gel-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur (Tc) des primären Lipids liegen, aus dem die Lioposome bestehen, wird die Liposom-Doppelschicht durchlässig und setzt innerhalb des Liposoms eingeschlossene gelöste Substanzen in die umgebende Lösung frei. Die klinische Anwendung von Hyperthermie mit solchen thermisch empfindlichen Liposomen ist vorgeschlagen worden. Siehe z. B. Yatvin et al., Science 202: 1290 (1978).
US-Patent Nr. 5,094,854 (Ogawa et al.) offenbart Liposome, in welchen der osmotische Druck der das Arzneimittel enthaltenden Lösung, die in Liposomen eingeschlos sen ist, 1,2–2,5-mal höher ist als der der Körperflüssigkeit von warmblütigen Tieren. Es wird angegeben, dass der Temperaturbereich, in welchem die Liposommembran für die Freisetzung von Material durchlässig wird, im Bereich von 40°C bis 45°C liegt.
US-Patent Nr. 5,720,976 (Kim et al.) offenbart die Verwendung eines Copolymers aus N-Isopropylacrylamid/Octadecylacrylat/Acrylsäure zur Beschichtung der Liposom-Oberfläche, damit die Freisetzung der im Liposom enthaltenen Agenzien bewirkt wird. Die Freisetzung des eingeschlossenen Agens tritt bei Temperaturen oberhalb 28°C ein (leicht unterhalb der durchschnittlichen menschlichen Temperatur).
Verfahren zur Erhitzung des Körpers eines Subjekts zu therapeutischen Zwecken oder um die Zuführung von therapeutischen oder diagnostischen Agenzien zu unterstützen, sind im Stand der Technik bekannt. Unter Hyperthermie versteht man das Erhitzen erkrankter Stellen, wie solider Tumore, auf Temperaturen, die höher sind als die physiologische Temperatur (z. B. von ungefähr 38°C auf ungefähr 45°C), und wird gegenwärtig hauptsächlich als Adjunkt der Strahlentherapie verwendet (Bates und Mc Killop Cancer Res. 46: 5477 (1986); Herman, Cancer Res. 43, 511 (1983)).
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "Hyperthermie" die Anhebung der Körpertemperatur eines Subjekts oder eines Teils des Körpers eines Subjekts, verglichen mit der normalen Temperatur des Subjekts. Eine solche Anhebung kann das Ergebnis eines natürlichen Prozesses (wie einer Entzündung) oder für therapeutische oder diagnostische Zwecke künstlich induziert sein. Bei Säugetieren wird eine normale Körpertemperatur normalerweise aufgrund des thermoregulatorischen Zentrums im vorderen Hypothalamus aufrechterhalten, welcher bewirkt, dass die Wärmebildung der Körpergewebe mit dem Wärmeverlust ausbalanciert wird. "Hyperthermie" bezieht sich auf die Anhebung der Körpertemperatur über den hypothalamischen Sollwert, aufgrund unzureichender Wärmeableitung. Im Gegensatz zur Hyperthermie bezieht sich "Fieber" auf eine Anhebung der Körpertemperatur aufgrund einer Änderung im thermoregulatorischen Zentrum. Der allgemeine Temperaturmittelwert im Mund ist für einen Menschen im Alter von 18–40 Jahren 36,8 ± 0,4°C (98,2 ± 0,7°F). Siehe z. B. "Harrison's Principles of Internal Medicine" (Fauci et al, Eds.) 14^th Edition, McGraw-Hill, New York, S. 84 (1998).
Die Anwendung von Hyperthermie mit thermisch sensitiven Liposomen ist beispielsweise für die Behandlung von Tumoren vorgeschlagen worden (Yatvin et al., Science 202: 1290 (1978)). Die Anwendung lokalisierter Hyperthermie und thermisch sensitiver Liposome, damit anti-neoplastische Agenzien auf den Ort eines Tumors in einem Subjekt abzielen, bewirkt, dass unerwünschte Nebenwirkungen des Agens vermindert werden und therapeutische Ergebnisse verbessert werden. Jedoch hängt die Wirksamkeit von Liposomen, die mittels Hyperthermie auf erkrankte Stellen ausgerichtet werden, von der Stabilität des Liposoms im Blutkreislauf (wenn Liposome in das Kreislaufsystem verabreicht werden) und von der Menge des aktiven Agens ab, das von dem Liposom am Zielort freigesetzt wird. Zum Beispiel setzen die von Yatvin et al., Science 202: 1290 (1978), beschriebenen Liposome bei hyperthermischen Temperaturen nur einen Teil des Arzneimittels frei, das von dem Liposom mitgeführt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "hyperthermische Verabreichung" eines aktiven Agens auf dessen Verabreichung in Verbindung mit der Anwendung von klinischer Hyperthermie bei einem Subjekt an einem vorher ausgewählten Zielort, um dem Zielort eine größere Menge des aktiven Agens zuzuführen, verglichen mit der, die aus der Verabreichung des aktiven Agens in Abwesenheit von Hyperthermie resultieren würde.
Erfindungsgemäße Liposome umfassen ein Lipid, das eine Gel-zu-flüssigkristallin Umwandlungstemperatur im hyperthermischen Bereich besitzt (z. B. dem Bereich von ungefähr 38°C bis ungefähr 45°C). Bevorzugt sind Phospholipide mit einer Phasenumwandlungstemperatur von ungefähr 38°C bis ungefähr 45°C, und stärker bevorzugt sind Phospholipide deren Acylgruppen gesättigt sind. Ein insbesondere bevorzugtes Phospholipid ist Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC). DPPC ist ein gängiges Phospholipid mit gesättigter Kette (C16) mit einer Doppelschichtumwandlung von 41,5°C (Blume, Biochemistry 22: 5436 (1983); Albon und Sturtevant, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 2258 (1978)). Thermosensitive Liposome, die DPPC und andere Lipide enthalten, welche eine ähnliche oder höhere Umwandlungstemperatur besitzen, und die sich ideal mit DPPC mischen (wie 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)](DPPC)(Tc = 41,5°C) und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (DSPC)(Tc = 55,1°C)) sind untersucht worden. Kastumi Iga et al., Intl. J. Pharmaceutics, 57: 241 (1989); Bassett et al., J. Urology, 135: 612 (1985); Gaber et al., Pharmacol. Res. 12: 1407 (1995). Thermosensitive Liposome, die DPPC und Cholesterin enthalten, sind auch beschrieben worden. Demel und De Kruyff, Biochim. Biophys. Acta, 457: 109 (1976).
Wie hierin verwendet, ist das "primäre Lipid" in einer Liposom-Doppelschicht dasjenige, welches die Haupt-Lipidkomponente des Liposom-Doppelschichtmaterials ist. Demgemäß ist in einer Liposom-Doppelschicht, die aus 70 mol.-% Phospholipid und 30 mol.-% Lysolipid besteht, das Phospholipid das primäre Lipid.
Erfindungsgemäße Liposome inkorporieren einen relativ wasserlöslichen Oberflächenaktivstoff, wie ein Lysolipid, in eine Doppelschicht, die in erster Linie aus einem relativ wasserunlöslichen Molekül, wie einem Doppelketten-Phospholipid (z. B. DPPC), besteht. Die Inkorporation des Oberflächenaktivstoffs in die Gelphase der primären Lipidkomponente steigert die Freisetzung von Inhalt aus dem resultierenden Liposom, wenn es auf die Gel-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur des primären Lipids erhitzt wird. Bevorzugte Oberflächenaktivstoffe sind Lysolipide und ein besonders bevorzugter Oberflächenaktivstoff ist Monopalmitoylphosphatidylcholin (MPPC). Geeignete Oberflächenaktivstoffe sind jene, die mit dem primären Lipid der Doppelschicht kompatibel sind und die desorbieren, wenn das Lipid zur flüssigen Phase schmilzt. Zusätzliche geeignete Oberflächenaktivstoffe zur Verwendung in Phospholipid-Doppelschichten schließen Palmitoylalkohole, Stearoylalkohole, Palmitoyl, Stearoyl, Polyethylenglykol, Glycerylmonopalmitat, Glycerylmonooleat, Ceramide, PEG-Ceramide und therapeutische Lipide ein. Therapeutische Lipide schließen beispielsweise C-18-etherverbrücktes Lysophoshpatidylcholin ein.
Ein bevorzugtes Liposom der vorliegenden Erfindung inkorporiert ein mit der Doppelschicht kompatibles Lysolipid in einer Phospholipid-Doppelschicht, wobei das Lysolipid in der Doppelschicht in einer Konzentration vorliegt, die ausreichend ist, um die Freisetzung des Inhalts (z. B. aktives Agens oder therapeutisches Agens) aus dem Liposom zu erhöhen, verglichen mit der Freisetzung des Inhalts, die bei Verwendung eines Liposoms erreicht werden würde, das ausschließlich aus einem Lipid besteht (d. h. ohne Lysolipid). Der Inhalt kann im Inneren des Liposoms enthalten sein oder in der Liposommembran. Mit "erhöhter Freisetzung" ist gemeint, dass entweder (a) ein größerer Prozentsatz des Inhalts bei einer vorgegebenen Temperatur freigesetzt wird, verglichen mit der Menge an Inhalt, die bei dieser Temperatur von einem Liposom mit einer Doppelschicht freigesetzt wird, die ausschließlich aus Phospholipid besteht; oder (b) der im Inneren des Liposoms eingeschlossene Inhalt wird einer niedrigeren Temperatur als der Temperatur freigesetzt, bei welcher die Freisetzung des Inhalts bei Verwendung eines Liposoms mit einer Doppelschicht eintreten würde, die ausschließlich aus einem Phospholipid besteht.
Die vorliegende Erfindung stellt Liposome bereit, welche den eingeschlossenen Inhalt bei Temperaturen freisetzen, die im klinischen Rahmen unter Anwendung milder Hyperthermie erreicht werden können. Die vorliegende Erfindung stellt Liposome bereit (THERMOSOMES^TM), die bei Körpertemperatur (37°C) äußerst stabil sind, aber instabil werden und erhöhte Freisetzung von eingeschlossenen Verbindungen bei Temperaturen oberhalb von ungefähr 39°C zeigen. Dieser Temperaturbereich liegt einige Grad unter dem vieler vorangehender Liposom-Zubereitungen, die nur bei Temperaturen von mehr als 42°C eine signifikante Freisetzung zeigten. Zusätzlich stellt die Kombination aus Lipid und kompatiblem Lysolipid der vorliegenden Liposom-Zubereitung eine Lipid/Lysolipid-Mischung bereit, mit einer leicht niedrigeren Gel-zu-flüssigkristallin Umwandlungstemperatur, verglichen mit der des reinen Lipids allein, jedoch ist die Gel-zu-flüssigkristallin Umwandlungstemperatur nicht durch die Einlagerung eines Lysolipids verbreitert.
Ein bevorzugtes Liposom der vorliegenden Erfindung hat eine Doppelschicht, die hauptsächlich aus einem Phospholipid besteht, und enthält Lysolipid in einer Menge, welche die Gel-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur der Doppelschicht herabsetzt, verglichen mit einer Doppelschicht, die ausschließlich aus Phospholipid besteht. Ein insbesondere bevorzugtes Liposom der vorliegenden Erfindung umfasst ein DPPC als primäres Phospholipid und MPPC als Lysolipid, wobei das Verhältnis von DPPC:MPPC ungefähr 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 90:10, bis ungefähr 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40 oder sogar 51:49 (als Molverhältnis) ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues System zur Zuführung aktiver Agenzien in einen Lipidträger bereit, worin aktive Agenzien aus dem Träger über einen schmalen Temperaturbereich freigesetzt werden. Lokales Erwärmen der Zielpunkte auf milde hyperthermische Temperaturen (d. h. 39°C bis 41°C) ermöglicht die bevorzugte Zuführung des aktiven Agens an die erkrankte Stelle. Die vorliegenden Liposome sind zur Verwendung in Kombination mit Hyperthermie geeignet, um aktive Agenzien auf erkrankte Stellen auszurichten, verglichen mit konventionellen Liposomen, die aktive Agenzien nur langsam freisetzen und die nicht thermosensitiv sind, oder verglichen mit thermosensitiven Liposomen, welche die aktiven Agenzien nicht freisetzen, bevor Temperaturen von 42°C oder darüber erreicht werden.
Obwohl es nicht beabsichtigt ist, auf irgendeine einzige Theorie der Wirkung festgelegt zu werden, glauben die gegenwärtigen Erfinder, dass der Mechanismus, durch den Lysolipide (oder andere Oberflächenaktivstoffe) die Freisetzung des Inhalts aus Liposomen erhöhen, welche hauptsächlich aus Phospholipid bestehen, mit dem Weg zusammenhängt, auf welchem das Lysolipid größtenteils ideal vermischt ist in der gemischten Gelphasen-Doppelschicht, aber Defekte auf der mikrostrukturellen Ebene erzeugt (Mikrodomänengrenzen) wenn es desorbiert von der Membran aufgrund des Schmelzens der Doppelschicht bei der Umwandlungstemperatur der primären Acylkette (d. h. bei der Umwandlungstemperatur des primären Doppelschicht-Lipids). Die Einlagerung eines Oberflächenaktivstoffs wie eines Lysolipids verringert die Phasenumwandlungstemperatur einer Phospholipid-Membran, im Vergleich zu der Phasenumwandlungstemperatur einer Membran, die ausschließlich aus dem Phospholipid besteht. Bei einem Liposom, das aus DPPC und MPPC besteht, wird die Phasenumwandlungstemperatur in Abhängigkeit von der Menge an in die Gelphasen-Doppelschicht inkorporiertem MPPC verringert; die Verringerung der Phasenumwandlungstemperatur, die erreicht werden kann, ist durch die Menge an MPPC begrenzt, die stabil in der Doppelschicht enthalten sein kann. Aus DPPC bestehende Membrane können stabil 1 mol.-% MPPC bis zu ungefähr 20% mol.-% MPPC, 30% mol.-% MPPC, 40 mol.-% MPPC oder sogar 50 mol.-% MPPC enthalten, in Abhängigkeit von anderen Bedingungen, wie dem in dem Liposom enthaltenen aktiven Agens.
Bei Liposom-Doppelschichten, die Phospholipid und einen Oberflächenaktivstoff wie ein Lysolipid enthalten, ist es bevorzugt, dass der Oberflächenaktivstoff in beiden Schichten der Doppelschicht enthalten ist. Dieses Konzept wird in 1 veranschaulicht, welche schematisch ein Liposom repräsentiert, das aus DPPC und MPPC besteht. Die Moleküle des MPPC liegen sowohl in der äußeren als auch inneren Schicht der Liposommembran-Doppelschicht vor. In einem Liposom, das nur in einer Schicht der Doppelschicht Oberflächenaktivstoff enthält, wird die Redistribution des Oberflächenaktivstoffs auf beide Schichten der Doppelschicht im Laufe der Zeit bei Temperaturen über der Gel-Umwandlungstemperatur (z. B. in der flüssigkristallinen Phase) eintreten.
Die Phasenkompatibilität der zwei (oder mehr) Komponenten der vorliegenden Erfindung beeinflusst die Verarbeitung und Stabilität der Lipid-Doppelschichtstruktur. Bei Liposomen, die primär aus DPPC bestehen (ein zweikettiges Phospholipid), ist MPPC ein bevorzugtes Lysolipid, um die Kompatibilität zu maximieren und den schmalen Schmelzbereich des Haupt-Phospholipids zu erhalten, weil es mit dem zweikettigen Phospholipid identisch ist, mit der Ausnahme, dass es nur eine Acylkette besitzt (11A und 11B). Die gegenwärtigen Erfinder entdeckten, dass die Einlagerung dieses mit der Doppelschicht kompatiblen Lysolipids in geringen Konzentrationen (bevorzugt 2–20 mol.-%), Liposome, die hauptsächlich aus DPPC bestehen, stärker "durchlässig" an dem Punkt macht, bei welchem das primäre Lipid zu schmelzen beginnt (d. h. Solidus-Linie der Hauptphasenumwandlung), verglichen mit ausschließlich aus DPPC bestehenden Liposomen. Obwohl sie nicht auf eine einzige Erklärung festgelegt werden möchten, glauben die gegenwärtigen Erfinder, dass Gelphasen-Doppelschichten aus mikrokristallinen Domänen bestehen; wenn die Temperatur sich der Gel-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlung der Lipid-Doppelschicht nähert, steigt die Membrandurchlässigkeit für das eingeschlossene Arzneimittel an den Korngrenzen der Mikrostruktur. Bei der Umwandlungstemperatur steigert die Desorption des in der Gelphasen-Mikrostruktur gelösten Lysolipids die Membrandurchlässigkeit. Ein zusätzlicher Vorteil der Inkorporation eines kompatiblen Moleküls in die Liposom-Doppelschicht ist, dass die Phasenumwandlungstemperatur des primären Lipids nicht verbreitert ist aber um ungefähr ein Grad oder mehr erniedrigt ist (abhängig von der Lysolipid-Konzentration in der Doppelschicht).
Das Verfahren zur Bildung der erfindungsgemäßen Mischkomponenten-Liposome schließt die Herstellung von Gelphasen-Liposomen ein, die ein Phospholipid, einen geeigneten Oberflächenaktivstoff (wie ein Lysolipid) und ein interessierendes aktives Agens enthalten. Andere phasenkompatible Komponenten wie DSPE-PEG können optional eingeschlossen sein, wie weiter unten diskutiert wird. Die Zusammensetzung enthält einen Prozentsatz Lysolipid, so dass der Oberflächenaktivstoff die Membran nicht destabilisiert, weder bei den Verarbeitungstemperaturen, bei welchen die Doppelschicht in der flüssigen Phase ist, noch bei physiologischen Temperaturen, wenn die Doppelschicht in der Gelphase ist. Die Doppelschicht wird instabil und durchlässig bei Temperaturen knapp über der normalen menschlichen Körpertemperatur und setzt schnell eingeschlossenes Material aus dem Liposominneren frei.
Erfindungsgemäße Liposome können mittels irgendeiner der Vielzahl von Techniken hergestellt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,235,871; veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 96/14057; New RRC, Liposome: A practical approach, IRL Press, Oxford (1990), Seiten 33–104; D. D. Lasic, Liposome from physics to applications, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1993; Liposome, Marcel Dekker, Inc., New York (1983). Der Einschluss eines aktiven Agens innerhalb der erfindungsgemäßen Liposome kann auch unter Verwendung jedes konventionellen Verfahrens des Standes der Technik durchgeführt werden. Bei der Herstellung erfindungsgemäßer Liposom-Zusammensetzungen können Stabilisatoren wie Antioxidationsmittel und andere Additive verwendet werden, so lange sie nicht den Zweck der Erfindung stören.
Die Menge an Oberflächenaktivstoff (wie Lysolipid), die in Liposomen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist, reicht nicht aus, um die Membran in der flüssigen Phase zu destabilisieren, die während der Verarbeitung der Liposome auftritt (vor dem Kühlen um ein Gelphasenprodukt zu erzeugen). Bei der Herstellung erfindungsgemäßer Liposome ist es bevorzugt während der Verarbeitung der Flüssigphasen-Membranen sowohl innerhalb als auch außerhalb des Liposoms eine Konzentration an Oberflächenaktivstoff-Monomer aufrecht zu erhalten, um einen Konzentrationsgradienten zu verhindern, der die Lysolipid-Konzentration in der Membran abreichern würde. Das kann erreicht werden, indem die Liposom-Suspension aus einer vorgemischten Mischung in einem wässrigen Medium hergestellt wird, das eine ausreichende Menge Oberflächenaktivstoff in monomerer Form enthält (z. B. bei der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) des Oberflächenaktivstoffs).
Ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Liposom-Zubereitung umfasst das Mischen der Doppelschicht-Komponenten in geeigneten Anteilen in einem geeigneten organischen Lösemittel, wie im Stand der Technik bekannt ist. Das Lösemittel wird dann abgedampft, wodurch sich ein getrockneter Lipidfilm bildet. Der Film wird (bei Temperaturen oberhalb der Phasenumwandlungstemperatur der Lipid-Mischung), unter Verwendung einer wässrigen Lösung, die eine äquilibrierende Menge Oberflächenaktivstoff und einen gewünschtes aktives Agens enthält, rehydratisiert. Die nach der Rehydratisierung gebildeten Liposome können extrudiert werden, um Liposome einer gewünschten Größe zu bilden, wie dies im Stand der Technik bekannt ist. Wenn beispielsweise Liposome hergestellt werden, die aus 80:20 DPPC:MPPC bestehen, dann wird die Rehydratisierung bei einer Temperatur oberhalb der Phasenumwandlungstemperatur dieser speziellen Lipid-Mischung durchgeführt (oberhalb 39°C). Die wässrige Lösung, die verwendet wird, um den Lipidfilm zu rehydratisieren, umfasst ein äquilibrierende Menge Lysolipid-Monomere (z. B. eine Konzentration, die gleich der kritischen Mizellekonzentration von MPPC ist).
Konventionelle Liposome unterliegen einer relativ kurzen Halbwertszeit im Blutkreislauf aufgrund ihrer schnellen Aufnahme durch Makrophagen der Leber und Milz (Organe des retikuloendothelialen Systems oder RES) und reichern sich deshalb nicht im „undichten" Tumorgewebe an. Liposom-Zubereitungen sind entwickelt worden, welche die schnelle RES-Aufnahme verhindern und welche erhöhte Zirkulationszeiten haben. STEALTH^® Liposome (Sequus Inc., Menlo Park CA) schließen Polyethylenglykol-(PEG)-gepfropfte Lipide zu ungefähr 5 mol.-% in der Lipid-Doppelschicht ein. Siehe z. B. Allen, UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology, 89: 405 (1989); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1066: 29 (1991); Klibanov et al., FEBS Letters 268: 235 (1990); Needham et al., Biochim. Biophys. Acta 1108: 40 (1992); Papahadjopoulos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 11460 (1991); Wu et al., Cancer Research 53: 3765 (1993); Klibanov und Huang, Liposome Research 2: 321 (1992); Lasic und Martin, Stealth Liposome, In: Pharmacology and Toxicology, CRC Press, Bo ca Raton, Florida (1995). Siehe auch US-Patent Nr. 5,225,212 von Martin et al.; US-Patent Nr. 5,395,619 von Zalipsky et al. bezüglich Liposomen, die Polymer-gepfropfte Lipide in der Vesikelmembran enthalten. Die Anwesenheit von Polymeren an der äußeren Liposom-Oberfläche vermindert die Aufnahme von Liposomen durch die Organe des RES.
Erfindungsgemäße Liposome können so zubreitet werden, dass sie Polymer-gepfropfte Lipide enthalten, wie es im Stand der Technik bekannt ist, um die Liposom-Aufnahme durch das RES zu vermindern und dadurch die Zirkulationszeit der Liposome zu erhöhen. Geeignete Polymere schließen hydrophile Polymere wie Polyethylenglykol, Polyessigsäure, Polyglykolsäure, Copolymere von Polyessigsäure und Polyglykolsäure und Polyvinylalkohole ein.
Aktive Agenzien
Wie hierin verwendet, ist ein aktives Agens "im Inneren" des Liposoms oder "eingeschlossen im" Liposom, eines, das im Innenbereich des Liposoms enthalten ist, im Vergleich zu dem, das in der Lipid-Doppelschicht verteilt ist und in der Vesikelmembran selbst enthalten ist. Wie hierin verwendet wird ein aktives Agens 'innerhalb' oder 'eingeschlossen innerhalb' der Lipid-Doppelschicht des Liposoms als Teil der Lipid-Doppelschicht mitgeführt, im Gegensatz dazu, wenn es im Innenbereich des Liposoms enthalten ist. Aktive Agenzien können in jeder Form vorliegen, die zur Verwendung in Liposomen geeignet ist, wie im Stand der Technik bekannt, einschließlich aber nicht begrenzt auf, wässrige Lösungen aktiver Agenzien. Wässrige Lösungen aktiver Agenzien innerhalb der erfindungsgemäßen Liposome können den gleichen osmotischen Druck besitzen wie die Körperflüssigkeit des bestimmungsgemäßen Subjekts oder einen erhöhten osmotischen Druck besitzen (siehe US-Patent Nr. 5,094,854); die wässrigen Lösungen können auch etwas ausgefallenes aktives Agens enthalten, wie im Stand der Technik bekannt ist. Ein bevorzugtes aktives Agens zum Einschluss in das Liposominnere ist jedes wasserlösliche, schwach basische Agens.
Die Inkorporation bestimmter aktiver Agenzien (wie einiger Anästhetika) in erfindungsgemäße Liposome kann zusätzlich die Freisetzung des Inhalts aus dem Liposom verändern (steigern oder hemmen) oder die Umwandlungstemperatur des Liposoms ändern, im Vergleich zu der, die man in einem ähnlichen Liposom beobachten würde, das nicht das aktive Agens enthält.
Es ist über die Verabreichung von antineoplastischen oder Antitumor-Arzneimitteln wie Doxorubicin, Cisplatin und Methotrexat unter Verwendung thermosensitiver Liposome in Kombination mit Hyperthermie an dem gewünschten Zielort berichtet worden. Siehe z. B. Magin und Weinstein In: Liposome Technology, Vol. 3, (G. Gregoriadis, Herausgeber) S. 137, CRC Press, Boca Raton, FL (1993); Gaber et al., Intl. J. Radiation Oncology, Biol. Physics, 36 (5): 1177 (1996).
Aktive Agenzien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen therapeutische Arzneimittel und pharmakologisch aktive Agenzien, Nahrungsmoleküle, kosmetische Agenzien, diagnostische Agenzien und Kontrastmittel zur Bildgebung ein. Wie hierin verwendet schließt aktives Agens pharmakologisch verträgliche Salze aktiver Agenzien ein. Geeignete therapeutische Agenzien schließen zum Beispiel Antineoplastika, Antitumormittel, Antibiotika, Antimykotika, Entzündungshemmer, Immunosuppressiva, Antiinfektiosa, antivirale Mittel, anthelminthische und antiparasitische Verbindungen ein. Verfahren zur Herstellung lipophiler Arzneimittel-Derivate, die für Liposom-Zubereitungen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt (siehe US-Patent Nr. 5,534,499 von Ansell, das kovalente Bindung von therapeutischen Agenzien an ein Fettsäurekette eines Phospholipids beschreibt).
Bei der Behandlung von Tumoren oder neoplastischem Wachstum, können geeignete Verbindungen Anthracyclin-Antibiotika (wie Doxorubicin, Daunorubicin, Carinomycin, N-Acetyladriamycin, Rubidazon, 5-Imidodaunomycin, N30 Acetyldaunomycin und Epirubicin) und Pflanzenalkaloide (wie Vincristin, Vinblastin, Etoposid, Ellipticin und Camptothecin) einschließen. Andere geeignete Agenzien schließen Paclitaxel (TAXOL^®, ein aus der Rinde der Eibe isoliertes Diterpen und ein Vertreter einer neuen Klasse therapeutischer Agenzien, die eine Taxan-Ringstruktur besitzen) und Docetaxol (Taxoter), Mitotan, Cisplatin und Phenesterin ein.
Entzündungshemmende therapeutische Agenzien, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Steroide und nicht-steroidale entzündungshemmende Verbindungen, wie Prednison, Methylprednisolon, Paramethazon, 11-Fludrocortison, Triamciniolon, Betamethason und Dexamethason, Ibuprofen, Piroxicam, Beclomethason, Methotrexat, Azaribin, Etretinat, Anthralin, Psoralins, Salicylate wie Aspirin und Immunosuppressiva wie Cyclosporin ein. Entzündungshemmende Corticosteroide und das entzündungshemmende und immunosuppressive Agens Cyclosporin sind beide höchst lipophil und zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Zusätzlich schließen pharmakologische Agenzien, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Liposomen geeignet sind, Anästhetika (wie Methoxyfluran, Isofluran, Enfluran, Halothan und Benzocain), Antiulkus-Mittel (wie Cimetidin); Antikrampf-Mittel wie Barbiturat; Azothioprin (ein Immunosuppressivum und antirheumatisches Mittel); und Muskelrelaxanzien (wie Dantrolen und Diazepam) ein.
Bildgebungsmittel, die zur Verwendung in den vorliegenden Liposom-Zubereitungen geeignet sind, schließen Ultraschall-Kontrastmittel, Radiokontrastmittel (wie Radioisotope oder Verbindungen, die Radioisotope enthalten, einschließlich Iodoctanen, Halogenkohlenwasserstoffen, und Renografin), oder magnetische Kontrastmittel (wie paramagnetische Verbindungen) ein.
Nahrungsmittel, die zur Inkorporation in erfindungsgemäße Liposome geeignet sind, schließen Aromastoffe (z. B. Citral, Xylitol), Aminosäuren, Zucker, Proteine, Kohlenhydrate, Vitamine und Fett ein. Kombinationen von Nahrungsmitteln sind auch geeignet.
Verabreichung und Liposom-Größe
Erfindungsgemäße Liposome können unter Anwendung von Verfahren verabreicht werden, die einem Durchschnittsfachmann bekannt sind, einschließlich aber nicht begrenzt auf Zuführung in den Blutkreislauf eines Subjekts oder subkutane Verabreichung von Liposomen. Wenn erfindungsgemäße Liposome in Verbindung mit Hyperthermie verabreicht werden, können die Liposome durch jedes geeignete Mittel verabreicht werden, das zu einer Zuführung der Liposome an den Behandlungsort führt. Beispielsweise können Liposome intravenös verabreicht werden und damit an den Ort eines Tumors mittels des normalen Blutflusses gebracht werden; erhitzen dieser Stelle resultiert darin, dass die Liposommembranen auf die Phasenumwandlungstemperatur erhitzt werden, so dass der Liposominhalt bevorzugt am Ort des Tumors freigesetzt wird.
Wenn die Behandlung eines Tumors oder Neoplasmas gewünscht wird, erfordert die wirksame Zuführung eines im Liposom eingeschlossenen Agens über den Blutkreislauf, dass das Liposom in der Lage ist, die durchgehende (aber "undichte") Endothelschicht und darunterliegende Basalmembran zu durchdringen, welche die Blutgefäße umgibt, die einen Tumor mit Blut versorgen. Es hat sich gezeigt, dass Liposome mit kleinerer Größe effektiver sind bei der Extravasation in Tumore durch die Endothelzellen-Barriere und darunterliegende Basalmembran, welche eine Kapillare von Tumorzellen trennt. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,213,804 von Martin et al.
Wie hierin verwendet, sind "solide Tumore" solche, die an einer anderen anatomischen Stelle als dem Blutkreislauf wachsen (im Gegensatz zu durch das Blut übertragene Tumore wie Leukämien). Solide Tumore benötigen die Bildung kleiner Blutgefäße und Kapillare um das wachsende Tumorgewebe zu ernähren.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird das Antitumormittel oder Antineoplastikum der Wahl in einem erfindungsgemäßen Liposom eingeschlossen; die Liposome werden derart zubereitet, dass sie eine Größe besitzen, von der man weiß, dass sie Endothel- und Basalmembran-Barrieren durchdringen kann. Die resultierende Liposom-Zubereitung kann einem Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf, parenteral verabreicht werden, bevorzugt mittels intravenöser Verabreichung. Tumore, die durch einen akuten Anstieg der Durchlässigkeit des Gefäßsystems in der Tumowachstumsregion gekennzeichnet sind, sind insbesondere für die Behandlung mittels der vorliegenden Verfahren geeignet. Der Verabreichung von Liposomen folgt das Erhitzen des Behandlungsortes auf eine Temperatur, die zur Freisetzung des Liposominhalts führt.
Wenn eine ortsspezifische Behandlung von Entzündungen gewünscht wird, erfordert der effektive Liposom-Transport eines aktiven Agens, dass das Liposom eine lange Halbwertszeit im Blut hat und in der Lage ist, die durchgehende Endothelzellenschicht und darunterliegende Basalmembran zu durchdringen, welche die Blutgefäße in Nachbarschaft des Enzündungsorts umgibt. Es hat sich gezeigt, dass Liposome kleinerer Größe effektiver bei Extravasation durch die Endothelzellen-Barriere und in die dazugehörigen entzündeten Bereiche eindringen können. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,356,633 von Woodle et al.. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird das entzündungshemmende Mittel der Wahl in einem erfindungsgemäßen Liposom eingeschlossen; die Liposome werden derart zubereitet, dass sie eine Größe besitzen, von der man weiß, dass sie Endothel- und Basalmembran-Barrieren durchdringen kann. Die resultierende Liposom-Zubereitung kann einem Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf, parenteral verabreicht werden, bevorzugt mittels intravenöser Verabreichung. Entzündete Bereiche, die durch einen akuten Anstieg der Durchlässigkeit des Gefäßsystems im Bereich der Entzündung und durch einen lokalisierten Anstieg der Temperatur gekennzeichnet sind, sind besonders für die Behandlung mittels der vorliegenden Verfahren geeignet.
Es wird weiterhin begrüßt werden, dass die erfindungsgemäßen Liposome eingesetzt werden können, um Antiinfektiosa über den Blutkreislauf an Infektionsorte zu transportieren. Die Verwendung von Liposomen, die ein Vesikel-bildendes Lipid enthalten, das mit einem hydrophilen Polymer derivatisiert ist, und eine Größe haben, die im Bereich zwischen 0,07 und 0,2 Mikron liegt, zum Transport therapeutischer Agenzien an Infektionsorte, ist in der veröffentlichten PCT-Patentanmeldung WO 93/19738 beschrieben worden. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird das Antiinfektiosum der Wahl in einem Liposom eingeschlossen, das eine erfindungsgemäße Membran besitzt, und die resultierende Liposom-Zubereitung wird einem Subjekt parenteral verabreicht, bevorzugt mittels intravenöser Verabreichung. Wenn gewünscht kann lokalisierte Hyperthermie am Infektionsort induziert werden, um die bevorzugte Freisetzung des Liposominhalts an dieser Stelle zu bewirken.
Die Größe von Liposomen in einer Zubereitung kann von dem darin enthaltenen Wirkstoff und/oder dem beabsichtigten Zielort abhängen. Es ist berichtet worden, dass Liposome mit einem Durchmesser zwischen 0,05 bis 0,3 Mikron für die Tumor-Verabreichung geeignet sind. (US-Patent Nr. 5,527,528 von Allen et al.). Die Einstellung der Größe der erfindungsgemäßen Liposome kann gemäß im Stand der Technik bekannter Verfahren und unter Berücksichtigung des darin enthaltenen aktiven Agens und dem gewünschten Effekt durchgeführt werden (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,225,212 von Martin et al.; US-Patent Nr. 5,527,528 von Allen et al.). Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ein Liposom mit weniger als 10 Mikron im Durchmesser, oder eine Liposom-Zubereitung, die eine Vielzahl von Liposomen enthält mit weniger als 10 Mikron im Durchmesser; oder eine Liposom-Zubereitung, die ein Vielzahl von Liposomen mit weniger als 10 Mikron im Durchmesser enthält. In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind die Liposome von ungefähr 0,05 Mikron oder ungefähr 0,1 Mikron im Durchmesser, bis ungefähr 0,3 Mikron oder ungefähr 0,4 Mikron im Durchmesser. Liposom-Zubereitungen können Liposome unterschiedlicher Größe enthalten.
In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung sind die Liposome von ungefähr 50 nm, 100 nm, 120 nm, 130 nm, 140 nm oder 150 nm, bis zu ungefähr 175 nm, 180 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm oder 500 nm im Durchmesser.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Liposome derart hergestellt, dass sie im Wesentlichen eine homogene Größe in einem ausgewählten Größenbereich haben. Ein effektives Verfahren zur Einstellung der Größe schließt extrudieren einer wässrigen Suspension der Liposome durch eine Reihe von Polycarbonatmembranen ein, die eine ausgewählte einheitliche Porengröße haben; die Porengröße der Membran wird ungefähr mit der größten Größe der Liposome korrespondieren, die durch Extrusion durch diese Membran erzeugt werden. Siehe z. B. US-Patent Nr. 4,737,323 (12. April 1988).
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Liposome in physiologischer Kochsalzlösung oder PBS dispergiert, um eine wässrige Liposom-Zubereitung bereitzustellen. Die wässrige Zubereitung kann weiterhin eine äquilibrierende Menge des Oberflächenaktivstoffs einschließen, der in der Liposom-Doppelschicht enthalten ist, um den Verlust des Oberflächenaktivstoffs aus der Liposom-Doppelschicht in die Lösung zu reduzieren oder zu verhindern. Liposome, die aus DPPC:MPPC bestehen, können in physiologischer Kochsalzlösung oder PBS enthalten sein, das von ungefähr 1 mmM bis ungefähr 5 mM MPPC-Monomer enthält.
Die Menge des aktiven Agens, das in den erfindungsgemäßen Liposomen eingeschlossen oder von diesen transportiert werden soll, wird in Abhängigkeit von der therapeutischen Dosis und der Einzeldosis des aktiven Agens abhängen, was einem Durchschnittsfachmann offensichtlich sein wird. Allgemein wird die Liposom-Zubereitung jedoch so ausgelegt, dass die größtmögliche Menge des aktiven Agens von dem Liposom befördert wird. Erfindungsgemäße Liposome können von jedem Typ sein, jedoch sind LUVs besonders bevorzugt.
Bewertung der Freisetzung von Liposominhalten
Die Charakterisierung thermosensitiver Liposome mittels der Freisetzung einer eingeschlossenen Fluoreszenz-Sonde, 6-Carboxyfluorescein (CF), wurde in Merlin, Eur. J. Cancer 27 (8): 1031 (1979) berichtet. CF war in Liposomen in einer löschenden Konzentration (50 mM) eingeschlossen; bei in dem Liposom eingeschlossenem CF wurde keine Fluoreszenz beobachtet. Intensive Fluoreszenz entwickelte sich jedoch durch die Freisetzung der Sonde aus den Liposomen aufgrund der Verdünnung des CF in der Suspension. Die Menge der aus den Liposomen freigesetzten Sonde bei verschiedenen Temperaturen konnte demnach, basierend auf der Fluoreszenz, quantifiziert werden. Merlin, Eur. J. Cancer., 27 (8): 1031, (1991), untersuchten thermisch empfindliche Liposome, die Doxorubicin (DX) einschließen, und pegylierte Lipide in der Doppelschicht inkorporiert haben, um ihre Zirkulationszeit im Blutkreislauf, im Vergleich zu konventionellen thermosensitiven Liposomen zu erhöhen. Siehe auch Maruyama et al., Biochem. Biophys. Acta, 1149: 17 (1993)).
Die folgenden Beispiele werden dargelegt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen.
BEISPIEL 1
Herstellung von Temperatur-empfindlichen Liposomen
DPPC-Liposome, die verschiedene Konzentrationen des Lysolipids Monopalmitoylphosphatidylcholin (MPPC) enthielten, wurden hergestellt und charakterisiert. Die wässrige Fluoreszenz-Sonde 6-Carboxyfluorescein (CF) wurde in den Liposomen eingeschlossen, um als Marker für die Veränderung der Membrandurchlässigkeit zu fungieren; CF wurde in die Liposome unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren inkorporiert (Siehe z. B. Liposomes: A Practical Approach, (1990), Herausgeber: R. R. C. New, IRL Press, Oxford, NY). Die Liposom-Komponenten wurden in Chloroform gelöst (ein geeignetes organisches Lösemittel) und das Lösemittel wurde unter Vakuum bei 45°C unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingedampft, wodurch ein einheitlicher dünner Lipidfilm an der Innenwand eines Rundkolbens erhalten wurde. Der Lipidfilm wurde weiter unter Vakuum 25 Stunden lang getrocknet, um das vollständige Entfernen von Chloroformspuren sicherzustellen.
Der Lipidfilm wurde bei 45°C mit einer wässrigen Lösung aus 10 mM PBS (pH = 7,4), die 50 mM CF und 1 mM MPPC enthielt, hydratisiert. Zur effizienten Hydratation wurde eine TEFLON^®-Perle verwendet, um die Lipide in Anwesenheit von wässrigem Medium sanft anzuätzen, um eine trübe Suspension multilamellarer Vesikel (MLVs) zu bilden. Die somit gebildeten MLVs hatten eine durchschnittliche Größe von 700 nm und wurden durch einen Stapel aus zwei Poly carbonat-Membranfilter von 0,1 Mikrometer unter 300–400 psi Druck bei 45°C extrudiert (d. h. oberhalb der Gelflüssigkristallin Temperatur des Lipids oder der Lipid-Mischung) wie es in dem von Hope et al. entwickelten Verfahren beschrieben worden ist (Biochem. Biophys. Acta 812: 55–65 (1985)), um große unilamellare Vesikel (LUVETs) mittels Extrusionstechnik in der gewünschten Größe von 140 nm zu erhalten. Der mittlere Durchmesser der Vesikel wurde mittels eines Photon-Korrelations-Spektrometers (PCS, Coulter, N4 plus) nach dem Extrusionsdurchgang gemessen.
Wie in 2 gezeigt, nimmt die Größe der Liposome mit sukzessiven Durchgängen durch die Membran ab und erreicht nach drei Durchgängen die minimale Größe.
BEISPIEL 2
Freisetzung von Liposominhalten
Die In-vitro-Stabilität und Thermosensitivität der Liposom-Zubereitungen, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, und verschiedene Molenbrüche MPPC enthielten, wurde durch die Messung der prozentualen Freisetzung von eingeschlossenem wasserlöslichen Fluoreszenzmolekül, CF, aus dem wässrigen Inneren des Vesikels in die umgebende Lösung als Funktion der Inkubationstemperatur (25–45°C) in Anwesenheit von PBS bewertet. Die Fluoreszenz von in den Liposomen eingeschlossenem CF wurde aufgrund von dessen hoher Konzentration selbst gelöscht, aber durch die Freisetzung aus dem Liposom und die Verdünnung in dem suspendierenden Medium, entwickelte CF eine intensive Fluoreszenz. Nach der Inkubation wurde die Fluoreszenzintensität der Proben bei Anregungswellenlänge (λex) = 470 nm und Emissionswellenlänge (λem) = 520 nm nach geeigneter Verdünnung gemessen, um die Menge des aus den Liposomen freigesetzten CF zu messen. Die relative prozentuale Fluoreszenzintensität aufgrund der Inkubation bei einer bestimmten Temperatur wurde berechnet durch den Vergleich mit der Gesamtfreisetzung von eingeschlossenem Material, die nach der Spaltung der Liposom-Proben durch Hinzugabe von 10% Triton X-100 erhalten wurde.
Dieser Versuch wurde für Liposome, die aus reinem DPPC bestehen und für Liposome, die aus DPPC:MPPC-Mischungen bestehen, die 2, 4, 6, 7, 8, 10 oder 20 mol.-% MPPC enthalten, über den Temperaturbereich 20°C bis 45°C, durchgeführt.
Die Menge eingeschlossenes CF, das aus erfindungsgemäßen Liposomen freigesetzt wurde, wurde als Funktion der Zeit bei physiologischer (37°C) und hyperthermischer (40°C) Temperatur gemessen. Liposome wurden in PBS verschiedene Zeitintervalle lang inkubiert und die Freisetzung von CF wurde fluorimetrisch bei λex = 470 nm und λem = 520 nm gemessen. In 3 werden typische Erwärmungsdurchläufe für die 90:10 DPPC:MPPC-Zusammensetzung gezeigt. Bei 37°C war die prozentuale Freisetzung von CF vernachlässigbar. Durch Inkubation bei 40°C wurden jedoch ungefähr 60% des eingeschlossenen CF innerhalb von fünf Minuten freigesetzt; die zusätzliche Freisetzung von Inhalt erhöhte sich durch weitere Inkubation bei dieser Temperatur nur schwach. Folglich wird das Meiste des Inhalts bei einer gegebenen Temperatur innerhalb der ersten fünf bis zehn Minuten des Erwärmens freigesetzt
4 zeigt die Freisetzung von CF aus Liposomen, die fünf Minuten lang bei Temperaturen von 20°C bis 45°C in Anwesenheit von 10 mM PBS (pH = 7,4) inkubiert wurden. Die Freisetzung von CF wurde fluorimetrisch bei λex = 470 nm und λem = 520 nm gemessen. Der Prozentsatz freigesetztes CF wurde durch den Vergleich der erhaltenen Werte mit denen, die man nach der vollständigen Freisetzung von CF erhält, berechnet (erreicht durch die Zugabe von Triton X-100 zu der Liposom-Probe um das Liposom aufzulösen und alles eingeschlossene CF freizusetzen). Reine DPPC-Liposome waren bis 39,5°C stabil, wurden aber nahe der Umwandlungstemperatur des Phospholipids durchlässig, wodurch die Freisetzung von etwas CF bewirkt wurde. Die Menge von CF, das aus dem reinen DPPC-Liposom freigesetzt wurde, war jedoch nur ungefähr 20% des Gesamtinhalts. Im Gegensatz dazu zeigten die Liposome mit steigender Konzentration an MPPC in den DPPC-Doppelschichten eine steigende Freisetzung von CF, wobei die maximalen Freisetzung bei Liposomen auftritt, welche Doppelschichten besitzen, die 10 mol.-% und 20 mol.-% MPPC enthalten.
Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die Inkorporation von nur 10 mol.-% MPPC in die Membranen von DPPC-Liposomen die Menge freigesetztes CF um den Faktor 4 erhöht (verglichen mit der Freisetzung, die man bei Liposomen mit ausschließlich DPPC beobachtet), wodurch eine Freisetzung von bis zu 90% des Liposominhalts ermöglicht wird.
Die Temperatur-Freisetzungsprofile zeigen einen zusätzlichen Vorteil der Inkorporation von MPPC in DPPC-Liposommembranen, weil die Temperatur für das Einsetzen der Freisetzung zu etwas niedrigeren Temperaturen verschoben ist, beginnend bei ungefähr 38°C für Liposome, die 10 mol.-% und 20 mol.-% MPPC enthalten. Das Freisetzungsprofil für diese Liposome ist scharf und die maximale Menge CF wird nach der Anhebung der Temperatur von nur etwa einem Grad freigesetzt, d. h. bei zwischen 38,5°C und 40°C für die 10% MPPC-Liposome.
Diese Versuche demonstrieren, dass der Einschluss von MPPC in Liposom-Doppelschichten, die aus DPPC bestehen, die Menge des aus dem Liposominneren freigesetzten Inhalts erhöht und den Temperaturbereich, über welchen Freisetzung eintritt, in den Bereich von 38,5°C–40°C verschiebt, welcher der milde hyperthermische Bereich ist.
In DPPC-Liposomen, die MPPC-Konzentrationen von mehr als 20 mol.-% enthalten, wurden die Liposome intrinsisch instabil und waren deshalb unfähig, eingeschlossenes Material bei Temperaturen oberhalb der Lipid-Phasenumwandlung (d. h. in der flüssigen Phase der Lipid-Doppelschicht, die während der Verarbeitung der Liposome auftritt) zurückzuhalten. Solche hohen Konzentrationen von MPPC können auch die Gelphasen-Doppelschichten bei Temperaturen destabilisieren, die unterhalb der Umwandlungstemperatur liegen. Wie vorher demonstriert, sinkt die mechanische Stärke von Membranen, wenn mehr und mehr MPPC eingebunden wird (Needham et al., Biophys. J. 73: 2615 (997)), und die Doppelschichten erfahren letztendlich eine Umwandlung zu einer reinen Mizellen-Suspension, wenn das Molverhältnis von MPPC zu Phospholipid über 50 mol.-% hinausgeht (Zhelev et al., Biophys. J. (in press; 1998)). Ein bevorzugtes Molverhältnis von thermisch sensitiven Liposomen ist 90:10 DPPC:MPPC.
BEISPIEL 3
Phasenumwandlungsverhalten von DPPC/MPPC-Mischungen und Korrelation mit Freisetzungstemperaturen
Um den biophysikalischen Mechanismus zu untersuchen, der an der Permeabilität der erfindungsgemäßen Liposome beteiligt ist, wurden Differentialscanning-kalorimetrische (DSC) Untersuchungen durchgeführt, um differentielle kalorimetrische Thermogramme der vorliegenden Liposome zu erzeugen, damit die Phasenumwandlungstemperatur bestimmt werden konnte. Diese Ergebnisse wurden verglichen mit den Freisetzung- gegen Temperaturscans, die aus kumulativen Freisetzungsprofilen erhalten wurden (gezeigt in 4). Die 5A und 5B zeigen die Wärmeflussthermogramme von Liposom-Zubereitungen, welche steigende Konzentrationen MPPC in DPPC-Doppelschichten enthalten. Diese Thermogramme zeigen, dass die Umwandlungstemperatur unverbreitert bleibt, sogar wenn bis zu 10% MPPC in der Doppelschicht eingebunden sind. Bei einem höheren Auflö sungsgrad zeigt 5B die Änderung im Höchstwert der Umwandlungstemperatur von 41,9°C zu 41,04°C, wenn die MPPC-Zusammensetzung von Null auf 10 mol.-% in DPPC-Doppelschichten erhöht wird. Es wird auch die Breite des Umwandlung gezeigt, dargestellt als Start- und Endpunkt der Umwandlung, d. h. die Solidus- und Liquidus-Linien unter und über dem Höchstwert des Wärmefluss-Überschusses.
Das Differentialscanning-Thermogramm der erfindungsgemäßen Liposome kann verglichen werden mit differentiellen Freisetzungsprofilen. 6A zeigt das kumulative Freisetzungsprofil für die CF-Freisetzung aus den DPPC:MPPC 90:10 Liposomen gegen die Temperatur und das Wärmeflussdiagramm über den gleichen Temperaturbereich. 6B zeigt die differentielle Freisetzung, welche die Schärfe des Freisetzungsprofils und die Temperatur hervorhebt, bei welcher in Relation zu dem Wärmefluss-Thermogramm die maximale Freisetzung eintritt. Bemerkenswert an diesem Vergleich ist, dass der Höchstwert der Freisetzung des Inhalts, der aus dem differentiellen Freisetzungsprofil erhalten wurde, um 0,9°C niedriger ist als der Höchstwert der Umwandlungsenthalpie, der mittels DSC erhalten wurde. Die Freisetzung des eingeschlossenen Materials bei der Temperatur vor Tc kann der Tatsache zugeschrieben werden, dass die Freisetzung bei der "Solidus"-Linie des Thermogramms eintritt und nicht beider Temperatur des Höchstwertes. Eine Erklärung für ein solches Verhalten ist, dass die Freisetzung von eingeschlossenem Material eintritt sobald die "ersten Defekte" (Schmelzdefekte) in den Mikrodomänen-Grenzen des Doppelschicht Netzwerks erscheinen; genau hier kann das Lysolipid seinen Effekt ausüben. Obwohl sie nicht auf eine einzige Theorie festgelegt werden möchten, vermuten die gegenwärtigen Erfinder, dass wenn man sich der Umwandlungstemperatur nähert, sich die ersten Teile der Mikrostruktur, welche schmelzen, an den Korngrenzen der festen Mem bran befinden. Wenn es von einer Lysolipid-freien wässrigen Phase umgeben ist, sitzt das Lysolipid in der Gelphase fest, kann aber desorbieren, wenn die Membran zu schmelzen beginnt; wenn es dies tut dann erhöht es die Defekt-Durchlässigkeit und der Inhalt wird effektiver freigesetzt als in Liposomen aus ausschließlich reinem Lipid.
BEISPIEL 4
Einschluss und Freisetzung von Doxorubicin
Doxorubicin (DX) wurde im inneren wässrigen Volumen der erfindungsgemäßen Liposome (DPPC:MPPC 90:10) unter Verwendung pH-Gradienten gesteuerten Einschlussprotokolls eingeschlossen (L. D. Mayer et al (1989) Cancer Res., 42: 4734.). Kurz gesagt, wurde eine Lipid-Zusammensetzung aus 90:10 DPPC:MPPC in Chloroform gelöst und das Lösemittel wurde unter Vakuum bei 45°C unter Verwendung eines Rotationsverdampfers eingedampft. Der Lipidfilm, der nach weiterem Trocknen im Vakuumexsikkator über Nacht erhalten wurde, wurde mit 300 mM Citratpuffer (pH 4,00) hydratisiert und die gebildeten multilamellaren Vesikel wurden sieben Ausfrierzyklen ausgesetzt. Die resultierende Suspension wurde durch zwei Polycarbonat-Membranfilter der Porengröße 0,1 μM bei 50°C unter Anwendung von 300–400 psi Druck extrudiert. Man ließ die extrudierten Liposome auf Raumtemperatur abkühlen und der pH wurde unter Verwendung von 0,5 M Na₂CO₃-Lösung auf 7,5–8,0 angehoben.
Die extrudierten Liposome wurden vor dem Hinzufügen von vorgewärmtem DX zu der Suspension bei 60°C fünf Minuten lang inkubiert. Proben wurden 10 Minuten lang bei 60°C mit zeitweiligen Vortexing weiter erhitzt. Das nicht eingeschlossene Arzneimittel wurde mittels Minisäulen-Zentrifugieren unter Verwendung von Sephadex G-50 Gel entfernt.
Die Liposomen mit eingeschlossenem DX wurden charakterisiert durch die Freisetzung von DX aus den Liposomen in Anwesenheit von PBS als Funktion der Zeit bei 37° und 40°C, wie auch mittels der kumulativen Freisetzungsprofile von eingeschlossenem DX aus dem Liposomen bei verschiedenen Temperaturen zwischen 25°–45°C. 7 zeigt die Freisetzung von eingebettetem DX aus Liposomen als Funktion der Zeit bei 37°C und 40°C. Die Liposome wurden bei 37° und 40°C 30 Minuten lang inkubiert und es wurde die Fluoreszenzintensität des freigesetzten DX nach geeigneten Verdünnungen bei λex = 470 nm und λem = 585 nm gemessen. Die prozentuale Freisetzung wurde mittels eines Vergleichs dieser Werte mit Werten für die Gesamtfreisetzung von 6-Carboxyfluorescein (erhalten durch die Zugabe von Triton X-100 zu der Liposom-Probe) berechnet. Wie man aus 7 erkennen kann, wurden ungefähr 14% des DX bei 37°C nach 30 Minuten Inkubation freigesetzt, wohingegen 73% des Arzneimittels bei 40°C nach 30 Minuten freigesetzt wurden.
Wie bei den obigen Untersuchungen (Beispiele 1–3) unter Verwendung von CF, wurde die kumulative Freisetzung von DX gemessen, das in DPPC:MPPC 90:10 Liposomen eingeschlossen war, mittels fünf Minuten langer Inkubation der Proben bei verschiedenen Temperaturen zwischen 25°–45°C und fluorimetrischer Messung des freigesetzten DX, wie in 8 gezeigt wird. Die Ergebnisse zeigten ungefähr 23% Freisetzung von DX bis 39°C und es wurden 65% Freisetzung bei 40°C erreicht.
BEISPIEL 5
Einschluss von PEG in Liposom-Doppelschichten
Erfindungsgemäße Liposome wurden modifiziert, um sie für das RES schwerer erkennbar zu machen, wodurch ihre Halbwertszeit im Blutkreislauf erhöht wird.
Die Oberflächen von Liposomen, die DPPC:MPPC 90:10 enthielten, wurden mittels Inkorporation von 5 mol.-% DSPE-PEG (MW 2000)(11C) in die Liposom-Zusammensetzung modifiziert. Dementsprechend war die modifizierte Zusammensetzung dieser Liposome DPPC:MPPC:DSPE-PEG-2000 (85,935:9,545:4,520).
BEISPIEL 6
Einfluss von biologischen Flüssigkeiten auf die Freisetzung des Liposominhalts
Oberflächen-modifizierte Liposome, wie in Beispiel 5 beschrieben, wurden durch die Untersuchung der Freisetzungsprofile von CF, das in dem wässrigen Liposominneren in Anwesenheit von entweder PBS oder 50% Bovinserum eingeschlossen war, charakterisiert. Die Fluoreszenzintensität von freigesetztem CF wurde bei λex = 470 nm und λem = 520 nm gemessen und die prozentuale Freisetzung wurde wie in Beispiel 3 beschrieben berechnet.
9A zeigt die Freisetzung von eingeschlossenem CF bei 37° bis 40°C als Funktion der Zeit, in Anwesenheit von PBS. 9B zeigt die Freisetzung von eingeschlossenem CF bei 37° bis 40°C als Funktion der Zeit, in Anwesenheit von 50% Bovinserum. Die Zubereitung des Oberflächen-modifizierten Liposoms der vorliegenden Erfindung war bei physiologischer Temperatur (37°C) in Anwesenheit von PBS und Serum stabil; sie zeigte 1% beziehungsweise 7% CF-Freisetzung. Jedoch zeigte die Inkubation dieser Liposome bei 40°C 64% (in PBS) und 76% (in Serum) Freisetzung von eingeschlossenem CF nach fünf Minuten Inkubation und erreichte 77% (in PBS) und 92% (in Serum) nach 30 Minuten Inkubation. Kumulative Freisetzungsprofile von eingeschlossenem CF aus Liposomen in Anwesenheit von PBS und 50% Bovinserum zeigten 58% beziehungsweise 73% Freisetzung (10). Obwohl nicht gewünscht wird auf eine einzige Theorie festgelegt zu wer den, könnte die erhöhte Freisetzung von CF in Anwesenheit von Serum auf die Wechselwirkung bestimmter kleinmolekularer Blutkomponenten im Serum mit der Liposom-Oberfläche zurückzuführen sein.

Claims

Liposom das ein aktives Agens enthält, dieses Liposom hat eine Phospholipid und Lysolipid enthaltende Doppelschichtmembran, worin die Phospholipide der primäre Lipidausgangsstoff für die Lipiddoppelschichtmembran sind und worin Lysolipid in der Doppelschichtmembran in einer Menge enthalten ist, die ausreichend ist, um den prozentualen Anteil des aktiven Agens, der bei der Phasenumwandlungstemperatur freigesetzt wird, verglichen zu der, die ohne dieses Lysolipid vorkommen würde, zu vergrößern.
Liposom nach Anspruch 1, worin Phospholipid und Lysolipid in der Doppelschichtmembran in einem molaren Verhältnis von 99:1 bis 70:30 enthalten sind.
Liposom nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Phospholipid gesättigte Acyl-Gruppen enthält.
Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das aktive Agens in dem Liposominneren eingeschlossen ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das aktive Agens in der Lipid-Doppelschichtmembran eingeschlossen ist.
Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem Durchmesser von ungefähr 50 Nanometern bis ungefähr 500 Nanometern.
Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem Durchmesser von ungefähr 50 Nanometern bis ungefähr 400 Nanometern.
Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Liposomdoppelschicht ferner ein durch ein hydrophiles Polymer derivatisiertes Phospholipid enthält.
Liposom nach Anspruch 8, worin das hydrophile Polymer aus Polyethylenglykol, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Copolymeren der Polymilchsäure und Polyglykolsäure und Polyvinylalkohol ausgewählt ist.
Liposom mit einer ein Phospholipid und von 2 Molprozent bis 30 Molprozent Lysolipid enthaltenden Lipid-Doppelschichtmembran, worin Phospholipide der primäre Lipidausgangsstoff der Lipid-Doppelschichtmembran sind.
Liposom nach Anspruch 10, worin die Lipid-Doppelschichtmembran von 10 Molprozent bis 20 Molprozent Lysolipid enthält.
Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Phospholipid Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) ist und das Lysolipid Monopalmitoylphosphatidylcholin (MPPC) ist.
Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das aktive Agens ein pharmakologisch aktives Agens, ein aromatisierendes Agens, ein diagnostisches Agens oder ein Nahrungsmittel ist.
Liposom nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das aktive Agens ein pharmakologisch aktives Agens ist, ausgewählt aus Antikrebsmitteln, entzündungshemmende Agenzien, Cytostatika, immunosuppressiven Agenzien, antibiotischen Agenzien und antiinfektiven Agenzien.
Liposom nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das aktive Agens ausgewählt wird aus Methotrexat, Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Vincristin, Vinblastin, Etoposid, Ellipticin, Camptothecin, Paclitaxel, Docetaxol, Cisplatin, Prednison, Methylprednison und Ibuprofen.
Verfahren zur Herstellung eines aktiven Agens zur hyperthermischen Applikation, enthaltend das Einschließen eines aktiven Agens in einem Liposom mit einer Lipid-Doppelschichtmembran, welche ein Phospholipid und von 1 mol.-% bis 30 mol.-% Lysolipid enthält, wobei Phospholipide der primäre Lipidausgangsstoff für die Lipid-Doppelschichtmembran sind.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die Lipid-Doppelschichtmembran zwischen 5 mol.-% bis 20 mol.-% Lysolipid enthält.
Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, worin das aktive Agens in dem Liposominneren eingeschlossen ist.
Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, worin das aktive Agens in der Lipid-Doppelschichtmembran eingeschlossen ist.
Verfahren nach Anspruch 19, worin die Liposomdoppelschicht ferner ein durch ein hydrophiles Polymer derivatisertes Phospholipid enthält.
Verfahren nach Anspruch 20, worin das hydrophile Polymer ausgewählt wir aus Polyethylenglykol, Polymilchsäure, Polyglykolsäure, Copolymeren der Polymilchsäure und Polyglykolsäure und Polyvinylalkohol.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, worin das Phospholipid Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und das Lysolipid Monopalmitoylphosphatidylcholin (MPPC) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, worin das aktive Agens ein pharmakologisch aktives Agens, ein aromatisierendes Agens, ein diagnostisches Agens oder ein Nahrungsmittel ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, worin das aktive Agens ein pharmakologisch aktives Agens ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antikrebsmitteln, entzündungshemmende Agenzien, Cytostatika, immunosuppressive Agenzien, antibiotische Agenzien und antiinfektiven Agenzien ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, worin das aktive Agens ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Methotrexat, Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Vincristin, Vinblastin, Etoposid, Ellipticin, Camptothecin, Paclitaxel, Docetaxol, Cisplatin, Prednison, Methylprednison und Ibuprofen.
Liposomzubereitung, welche eine Vielzahl von Liposomen nach einem der Ansprüche 1 bis 15 enthält.
Liposomzubereitung nach Anspruch 26, worin die Liposomen in physiologischer Salzlösung dispergiert sind.
Liposomzubereitung nach Anspruch 27, ferner ein Lysolipidmonomer in Lösung enthaltend.
Liposomzubereitung nach einem der Ansprüche 26 bis 28, worin die Liposome zwischen 50 nm im Durchmesser und 500 nm im Durchmesser sind.
Liposomzubereitung nach einem der Ansprüche 26 bis 28, worin die Liposomen zwischen 50 nm im Durchmesser und 400 nm im Durchmesser sind.
Liposomzubereitung nach einem der Ansprüche 26 bis 28, worin die Liposome zwischen 100 nm im Durchmesser und 200 nm im Durchmesser sind.
Verfahren zur Herstellung von Liposomen, in deren Liposomeninnerraum ein aktives Agens eingeschlossen ist, welches folgendes umfasst: a) Herstellen eines Lysolipid enthaltenden Phospholipidfilms; b) Hydratisieren des Phospholipidfilm mit einer wässrigen Zubereitung, welche ein aktives Agens und eine äquilibrierende Menge des Lysolipidmonomers, um Liposome herzustellen, enthält; worin Lysolipid in der Liposommembran in einer ausreichenden Menge enthalten ist, um den prozentualen Gehalt des aktiven Agens bei der Phasenumwandlungstemperatur von der Liposmmembran, verglichen mit der, die bei Abwesenheit des Lysolipid auftritt, zu vergrößern.
Verfahren nach Anspruch 32, worin der Hydratisierungsschritt bei einer Temperatur über der Gel-zu-flüssigkristallin Phasenumwandlungstemperatur der Lipidmischung ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 32 oder Anspruch 33, ferner umfassend ein Extrudieren der Liposome, die in Schritt (b) hergestellt werden, um Liposome der gewünschten Größe zu bilden.
Verfahren zur Herstellung von Liposomen nach einem der Ansprüche 32 bis 34, worin der Phospholipidfilm ferner ein aktives Agens enthält.