JP2002518317A

JP2002518317A - 温度感受性リポソーム製剤

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Publication number: JP2002518317A
Application number: JP2000554346A
Authority: JP
Inventors: ニーダム，デイヴィッド
Original assignee: デューク・ユニヴァーシティ
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2002-06-25
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: JP4691253B2; DE69923181D1; US6200598B1; AU4556499A; ES2238838T3; HK1035673A1; DE69923181T2; WO1999065466A1; CA2335250A1; JP2010138200A; ATE286718T1; CA2335250C; EP1089713B1; AU749806B2; EP1089713A1

Abstract

(57)【要約】活性物質を含む温度感受性リポソームについて説明する。本リポソームは、リン脂質、およびリポソームの相転移温度でリポソームにより放出される活性物質の量を増加するリゾ脂質等の界面活性剤を含む。このようなリポソームは、穏やかな高体温条件を使用して有効物質を投与する方法において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、国立衛生研究所交付金ＮＩＨＧＭ４０１６および国立癌研究所Ｓ
ＰＯＲＥ交付金Ｐ５０−ＣＡ６８４３８の名のもとに米国政府の支援を受けて行
われた。米国政府は、本発明に対してある一定の権利を有する。

【０００２】発明の分野本発明は熱感受性リポソームに関し、さらに詳細には、リン脂質および界面活
性剤を含むリポソームであって、穏やかな高体温温度でその内容物を放出するリ
ポソームに関する。

【０００３】発明の背景リポソームは、水性の内部区画を封入する少なくとも１つの脂質二重層からな
る。リポソームは、膜のタイプおよびサイズにより特徴づけられる。小型単ラメ
ラ小胞（smalll unilamellar vesicle; ＳＵＶ）は、単一の膜を有し、一般に０
．０２〜０．０５μｍの範囲の直径を有する。大型単ラメラ小胞（large unilam
ellar vesicle; ＬＵＶ）は、一般に０．０５μｍより大きい。オリゴラメラ大
型小胞および多重ラメラ大型小胞は、複数の、通常は同心の膜層を有し、一般に
０．１μｍより大きい。幾つかの非同心膜を有するリポソーム、すなわち、１つ
の大型小胞内に含まれる幾つかの小型小胞は、多重小胞性小胞と呼ばれる。

【０００４】従来のリポソームは、水性の内部空間に含まれる（水溶性活性物質）か、脂質
二重層中に分配される（水不溶性活性物質）かのいずれかの、治療薬、薬剤また
は他の活性物質を輸送するように調剤される。同時係属出願ＳＮ０８／７９５
，１００号には、脂質ニ層膜内にコレステロールを含有するリポソームであって
、活性物質が脂質界面活性剤と一緒に凝集し、ミセルがリポソームの内部空間内
に捕捉された(entrapped)リポソームが開示されている。

【０００５】血流中で半減期が短い活性物質は、リポソームを介して配送するのに特に適す
る。たとえば、多くの抗腫瘍剤は、血流中で半減期が短く、従って、非経口使用
を実現できないことが知られている。しかし、リポソームは、細網内皮系（reti
culoendothelial system; ＲＥＳ）の細胞によってが血液から急速に除去される
のため、血流を介した活性物質の部位特異的配送にリポソームを使用することに
は制限がある。

【０００６】リポソームは、通常は漏出性ではないが、リポソーム膜に穴が発生すると、膜
が崩壊するか溶解すると、あるいは、膜の温度が相転移温度まで上昇すると、漏
出性になる。リポソーム温度を相転移温度より上まで上昇させ、その結果、リポ
ソーム内容物の放出を引き起こすための、対象者の標的部位における温度上昇（
高体温）が、治療薬の選択的配送に使用されてきた。Ｙａｔｖｉｎｅｔａｌ
．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０４：１８８（１９７９）。しかし、リポソームの相
転移温度が正常組織の温度より著しく高い場合、この技術は制限される。

【０００７】従って、穏やかな高体温条件に応答して、治療量の有効物質を配送できるリポ
ソーム製剤を考案することは望ましい。

【０００８】発明の概要前述の事項を考慮して、本発明の第１の態様は、活性物質を含有するリポソー
ムである。リポソームの脂質二層膜は一次脂質源としてリン脂質を含み、リゾ脂
質(lysolipid)が存在しない条件で発生するであろう場合と比較して、相転移温
度にて放出される活性物質のパーセンテージを高める量で、リゾ脂質が二層膜内
に含まれる。

【０００９】本発明のさらなる態様は、一次脂質源としてのリン脂質および２モル％〜３０
モル％のリゾ脂質を含む脂質二層膜を有するリポソームである。

【００１０】本発明のさらなる態様は、高体温投与向けの活性物質を調製する方法である。
この活性物質は、一次脂質源としてのリン脂質および１〜３０％のリゾ脂質を含
む脂質二層膜を有するリポソーム内に捕捉されている。

【００１１】本発明のさらなる態様は、上述の複数のリポソームを含むリポソーム製剤であ
る。

【００１２】本発明のさらなる態様は、リポソーム内部空間に活性物質を含むリポソームを
製造する方法である。リゾ脂質を含むリン脂質フィルムを最初に調製し、次いで
活性物質および平衡量のリゾ脂質モノマーを含む水性調製物で水分補給する。リ
ゾ脂質は、リゾ脂質が存在しない条件で生じるであろうものと比較して、リポソ
ーム膜の相転移温度で放出される活性物質のパーセンテージを高めるのに十分な
量でリポソーム膜に含まれる。

【００１３】発明の詳細な説明本発明は、周囲の環境の温度変化に感受性を有するリポソームを提供する。こ
のようなリポソームの温度感受性は、加熱されるか（たとえば、高体温の臨床手
法）身体の残りの部分より本質的に高温である（たとえば、炎症）、いずれかの
標的部位におけるリポソームの内部水性空間内に捕捉された化合物の放出、およ
び／または脂質二重層と関連した化合物の放出を可能にする。本発明のリポソー
ム二重層は、（一次すなわち主要脂質成分に加えて）リゾ脂質、または別の界面
活性剤を含む。リゾ脂質または別の界面活性剤をリポソーム二重層に含めると、
リポソーム温度が一次脂質成分のゲル−液体結晶相転移温度に達したとき、化合
物の放出が増強する。リゾ脂質（または他の界面活性剤）が存在しても、リン脂
質含むだけのリポソームで実現されるより僅かに低い温度で、リポソームからの
薬剤の放出が起こる。リポソームが、対象者の身体の予め選択された標的部位に
配送されるべき化合物を含む場合、本発明のリポソームは、薬剤配送に特に有用
である。標的部位は、ゲル−液体結晶相転移温度以上になるように人工的に加熱
される（高体温）か、自然発生的な原因（たとえば、炎症）のため、標的部位が
身体の非標的部位より高い温度であってもよい（この場合、その温度は、使用さ
れるリポソームのゲル−液体結晶相転移温度以上である）かのいずれかである。

【００１４】リポソームを構成する一次脂質のゲル−液体結晶相転移温度（transition tem
perature; Ｔｃ）の範囲内の温度にてリポソームを数分間インキュベートすると
、リポソーム二重層は透過性になり、リポソーム内に捕捉された溶質を周囲の溶
液中に放出する。このような温度感受性リポソームに加えた高体温の臨床使用が
提唱されている。たとえば、Ｙａｔｖｉｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２０２：１２９０（１９７８）を参照されたい。

【００１５】米国特許第５，０９４，８５４号（Ｏｇａｗａｅｔａｌ．）には、リポソ
ーム内に捕捉された薬剤含有溶液の浸透圧が、温血動物の体液より１．２〜２．
５倍高いリポソームが開示されている。リポソーム膜が放出物質を透過するよう
になる温度範囲は、４０℃〜４５℃の範囲であると述べられている。

【００１６】米国特許第５，７２０，９７６号（Ｋｉｍｅｔａｌ．）には、リポソーム
内に含まれる薬剤を放出させるために、リポソーム表面を被覆するためのＮ−イ
ソプロピルアクリルアミド／オクタデシルアクリレート／アクリル酸のコポリマ
ーの使用について開示されている。２８℃より高い（ヒトの平均体温より十分低
い）温度で、捕捉されている薬剤の放出が起きる。

【００１７】治療目的で、あるいは治療薬または診断薬の配送を助けるために対象者の身体
を加熱する方法は、当技術分野で周知である。高体温は、充実性腫瘍等の疾患部
位を生理学的温度（たとえば、約３８℃〜約４５℃）より高い温度まで加熱する
ことからなり、現在、主として放射線療法の補助療法として使用されている（Ｂ
ａｔｅｓａｎｄＭｃＫｉｌｌｏｐＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４６：５４
７７（１９８６）、Ｈｅｒｍａｎ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４３，５１１（
１９８３））。

【００１８】本明細書で使用する用語「高体温(hyperthermia)」は、対象者の通常の温度と
比較した対象者の身体、または対象者の身体の一部の温度の上昇を指す。このよ
うな上昇は、自然経過（炎症等）の結果であってもよく、治療目的もしくは診断
目的で人工的に誘導された結果であってもよい。哺乳動物の場合、通常は、体組
織による熱産生と熱損失との平衡を保つように作用する前視床下部の体温調節中
枢により正常な体温が維持される。「高体温」は、熱消散不十分による、視床下
部の設定点より高い体温の上昇を指す。高体温と対照的に、「発熱」は、体温調
節中枢の変化に起因する体温の上昇を指す。１８〜４０才の健常者の総体的平均
口腔温度は、３６．８±０．４℃（９８．２±０．７°Ｆ）である。たとえば、
Ｈａｒｒｉｏｓｎ’ｓＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅ
ｄｉｃｉｎｅ（Ｆａｕｃｉｔｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．）１４ｔｈＥｄｉ
ｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐ．８４（１９
９８）を参照されたい。

【００１９】たとえば、腫瘍の治療用に、熱感受性リポソームと高体温の併用が提唱されて
いる（Ｙａｔｖｉｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０２：１２９０（１
９７８））。局部高体温および熱感受性リポソームを使用して、抗腫瘍薬に対象
者の腫瘍部位を標的とさせることにより、薬剤の望ましくない副作用を減少させ
、治療成績を高めることができる。しかし、高体温による、疾患部位を標的とし
たリポソームの効力は、血流中でのリポソームの安定性（リポソームが循環系に
投与されるとき）、および標的部位でリポソームにより放出される活性物質の量
によって左右される。たとえば、Ｙａｔｖｉｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２０２：１２９０（１９７８）に記載のリポソームは、高体温の温度にてリ
ポソームにより輸送される薬剤の一部を放出しただけであった。

【００２０】本明細書で使用する活性物質の「高体温投与」は、高体温の存在しない条件で
活性物質を投与して得られるであろう結果と比較して大量の活性物質を標的部位
に配送するために、対象者の予め選択された標的部位における臨床的高体温の使
用と併用した活性物質の投与を指す。

【００２１】本発明のリポソームは、高体温範囲内（たとえば、約３８℃から約４５℃まで
の範囲）のゲル−液体結晶転移温度を有する脂質を含む。約３８℃〜約４５℃の
相転移温度を有するリン脂質が好ましく、アシル基が飽和されているリン脂質が
さらに好ましい。特に好ましいリン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリ
ン（ＤＰＰＣ）である。ＤＰＰＣは、二層転移が４１．５℃の、一般的な飽和鎖
（Ｃ１６）リン脂質である。（Ｂｌｕｍｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２２
：５４３６（１９８３）、ＡｌｂｏｎａｎｄＳｔｕｒｔｅｖａｎｔ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：２２５８）。ＤＰ
ＰＣおよび類似した転移温度または高い転移温度を有し、且つ（１，２−ジパル
ミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（
ＤＰＰＧ）（Ｔｃ＝４１．５℃）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセ
ロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）（Ｔｃ＝５５．１℃）のような）ＤＰＰＣと
理想的に混合する他の脂質を含有する熱感受性リポソームについて、研究が行わ
れてきた。ＫａｓｔｕｍｉＩｇａｅｔａｌ，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，５７：２４１（１９８９）、Ｂａｓｓｅｔｔｅｔ
ａｌ，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１３５：６１２（１９８５）、Ｇａｂｅｒ
ｅｔａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２：１４０７（１９９５）
。ＤＰＰＣおよびコレステロールを含有する熱感受性リポソームも記載されてい
る。ＤｅｍｅｌａｎｄＤｅＫｒｕｙｆｆ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ａｃｔａ．４５７：１０９（１９７６）。

【００２２】本明細書で使用するリポソーム二重層中の「一次脂質」は、リポソーム二重層
物質の主要脂質成分である。したがって、７０モル％のリン脂質および３０％の
リゾ脂質を含むリポソーム二重層の場合、リン脂質が一次脂質である。

【００２３】本発明のリポソームは、リゾ脂質等の、比較的水溶性の界面活性剤を、主とし
て、二鎖リン脂質（たとえば、ＤＰＰＣ）等の比較的水溶性の分子を含む二重層
に含む。界面活性剤が一次脂質成分のゲル相に含まれると、一次脂質のゲル−液
体結晶相転移温度まで加熱したとき、結果として得られるリポソームからの内容
物の放出が増強される。好ましい界面活性剤はリゾ脂質であり、特に好ましい界
面活性剤はモノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）である。適切な
界面活性剤は、二重層の一次脂質と適合するものであり、且つ脂質が溶解して液
相になると脱着するのものである。リン脂質二重層に使用するのに適したさらな
る界面活性剤としては、パルミトイルアルコール類、ステアロイルアルコール類
、パルミトイル、ステアロイル、ポリエチレングリコール、グリセリルモノパル
ミテート、グリセリルモノオレアート、セラミド類、ＰＥＧ−セラミド類、およ
び治療用脂質などが挙げられる。治療用脂質としては、たとえば、Ｃ−１８エー
テル結合リゾホスファチジルコリンなどがある。

【００２４】本発明の好ましいリポソームは、二重層適合性リゾ脂質をリン脂質二重層に含
み、脂質のみを含む（すなわち、リゾ脂質を含まない）リポソームを使用して達
成されるであろう内容物の放出と比較して、リポソームからの内容物（たとえば
、活性物質または治療薬）の放出を増強するのに十分な濃度のリゾ脂質が二重層
中に存在する。内容物は、リポソームの内部に含まれてもよく、リポソーム膜内
に含まれてもよい。「増強された放出」は、（ａ）所与の温度において、その温
度でリン脂質のみを含む二重層を有するリポソームにより放出される内容物の量
と比較して、より大きい割合の内容物が放出されるか、（ｂ）リン脂質のみを含
む二重層を有するリポソームを使用したときに内容物の放出が起こるであろう温
度より低い温度で、リポソームの内部に捕捉されている内容物が放出されるかの
いずれかを意味する。

【００２５】本発明は、穏やかな高体温を使用した臨床環境で達成することができる温度に
て、捕捉されている内容物を放出するリポソームを提供する。本発明は、体温（
３７℃）で極めて安定であるが、約３９℃を超えた温度で不安定になり、且つ捕
捉されている化合物の増強された放出を示すリポソーム（ＴＨＥＲＭＯＳＯＭＥ
Ｓ^TM）を提供する。この温度範囲は、４２℃より高い温度で顕著な放出を示すに
過ぎなかった多くの以前のリポソーム製剤より２〜３℃低い。さらに、本リポソ
ーム製剤の、脂質と適合性リゾ脂質との組み合せは、純粋な脂質のみと比較して
、僅かに低いゲル液体結晶相転移温度を有するが、ゲル液体結晶相転移温度はリ
ゾ脂質を含むことにより広がらない、脂質／リゾ脂質混合物を提供する。

【００２６】本発明の好ましいリポソームは、主として脂質を含み、且つ、リン脂質のみを
含む二重層と比較して二重層のゲル液体結晶相転移温度を低下させる量のリゾ脂
質を含む、二重層を有する。本発明の特に好ましいリポソームは、一次リン脂質
としてのＤＰＰＣおよびリゾ脂質としてのＭＰＰＣを含み、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ
の比率は、約９９：１、９８：２、９７：３、９６：４、９５：５、９０：１０
から、約８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、また
は５１：４９までである（モル比による）。

【００２７】本発明は、狭い温度範囲にわたって活性物質が担体から放出される、脂質担体
中の活性物質を配送するための斬新なシステムを提供する。穏やかに高体温の温
度（すなわち、３９℃〜４１℃）まで標的部位を局所加熱することにより、活性
物質を疾患部位に優先的に配送することが可能である。活性物質をゆっくり放出
するにすぎず、熱感受性ではない従来のリポソームと比較して、あるいは、４２
℃以上の温度に達するまで活性物質を放出しない熱感受性リポソームと比較して
、本リポソームは、高体温と併用して、活性物質を疾患部位に向けて進めるのに
適する。

【００２８】１つの作用理論に拘束されたくないが、本発明者は、主としてリン脂質を含む
リポソームからの内容物の放出をリゾ脂質（または他の界面活性剤）が増強する
機序は、リゾ脂質は一般に混合ゲル相二重層内で理想的に混合されるが、一次ア
シル鎖転移温度で（すなわち、一次二重層脂質の転移温度で）二重層が溶解する
とすぐにリゾ脂質が膜から脱着するため、微細構造レベル（微細領域境界）で欠
陥が生じる方法と関連があると考える。リゾ脂質等の界面活性剤を含めると、リ
ン脂質を含むだけの膜の相転移温度と比較して、リン脂質膜の相転移温度が低下
する。ＤＰＰＣおよびＭＰＰＣを含むリポソームの場合、相転移温度は、ゲル相
二重層内に含まれるＭＰＰＣの量によって低下し、達成することができる相転移
温度の低下は、二重層中に安定して含めることが可能なＭＰＰＣの量によって制
限される。ＤＰＰＣを含む膜は、１モル％のＭＰＰＣから、最高約２０モル％の
ＭＰＰＣまで、リポソーム内に含まれる活性物質等の他の条件によっては、３０
モル％のＭＰＰＣ、４０モル％のＭＰＰＣ、あるいは５０モル％のＭＰＰＣでも
安定して含むことができる。

【００２９】リン脂質およびリゾ脂質等の界面活性剤を含むリポソーム二重層の場合、二重
層の両相に界面活性剤が含まれることが好ましい。この概念を、ＤＰＰＣおよび
ＭＰＰＣを含むリポソームを概略的に表す図１に示す。ＭＰＰＣの分子は、リポ
ソーム膜二重層の外相にも内相にも存在する。二重層の１つの相のみに界面活性
剤を含むリポソームの場合、ゲル転移温度より高い温度にて時が経つと、（たと
えば、液体結晶相において）二重層の両相への界面活性剤の再分配が起こる。

【００３０】本発明の２（またはそれより多い）成分の相相溶性は、液体二重層構造の処理お
よび安定性に影響を及ぼす。主としてＤＰＰＣ（二鎖リン脂質）を含むリポソー
ムの場合、主要リン脂質の相溶性を最高に高め、且つ狭い溶解範囲を保持するた
めに好ましいリゾ脂質はＭＰＰＣであるが、それは、ＭＰＰＣが１つのアシル鎖
のみを有すること以外は二鎖リン脂質と同じであるためである（図１１Ａおよび
１１Ｂ）。本発明者は、この二重層相溶性リゾ脂質を低濃度（好ましくは２〜２
０モル％）で含めると、ＤＰＰＣのみを含むリポソームと比較して、主としてＤ
ＰＰＣを含むリポソームは、一次脂質が溶解しはじめる点（すなわち、主要相転
移の固相線）でさらに「漏出性」になることを発見した。１つの説明に拘束され
たくないが、本発明者は、ゲル相二重層は微小結晶領域を含み、温度が脂質二重
層のゲル−液体結晶相転移温度に近づくにつれて、微細構造の極微境界において
、捕捉されている薬剤の膜透過性が高くなると考える。転移温度において、ゲル
相微細構造内に溶解したリゾ脂質の脱着が、膜透過性を高める。相溶性分子をリ
ポソーム二重層内に組み込むさらなる利点は、一次脂質の相転移温度が広がらず
に、（二重層中のリゾ脂質濃度に応じて）約１℃以上低下することである。

【００３１】本発明の混合成分リポソームを形成する方法は、リン脂質、適当な界面活性剤
（たとえば、リゾ脂質）、および関心のある活性物質を含むゲル相リポソームの
製作を含む。後述の通り、他の相相溶性成分、たとえば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧを任
意に含めてもよい。本組成物は、二重層が脂質相である場合、処理温度にて、二
重層がゲル相である場合、生理学的温度にて、界面活性剤が膜を不安定にしない
ようなパーセンテージのリゾ脂質を含む。正常なヒト体温より僅かに高い温度で
二重層は不安定且つ透過性になり、捕捉されている物質をリポソーム内部から急
速に放出する。

【００３２】本発明によるリポソームは、当技術分野で周知の様々な技術のいずれかによっ
て製作することができる。たとえば、米国特許第４，２３５，８７１号、ＰＣＴ
出願公告ＷＯ９６／１４０５７号；ＮｅｗＲＲＣ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：
Ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆ
ｏｒｄ（１９９０），ｐａｇｅｓ３３−１０４；ＬａｓｉｃＤＤ，Ｌ
ｉｐｏｓｏｍｅｓｆｒｏｍｐｈｙｓｉｃｓｔｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔ
ｅｒｄａｍ，１９９３；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅ
ｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８３）を参照されたい。当技術分野
における従来の方法を使用して、本発明のリポソーム内に活性物質を捕捉するこ
とが可能である。本発明の目的を妨げない限り、本発明のリポソーム組成物を製
作する際に、酸化防止剤当の安定剤および他の添加物を使用してもよい。

【００３３】本発明のリポソーム中に含まれる界面活性剤（たとえば、リゾ脂質）の量は、
（ゲル相生成物を生成するための冷却前の）リポソームの処理中に生じる液相で
、膜を不安定にするのに不十分である。本発明によるリポソームを生成する際に
、膜中のリゾ脂質濃度を激減させるであろう濃度勾配を避けるために、液相膜の
処理中、リポソーム内外の界面活性剤モノマーの濃度を維持することが好ましい
。これは、モノマー型の界面活性剤を十分量含む（たとえば、界面活性剤の臨界
ミセル濃度（ＣＭＣ）の）水性媒体中で、予め混合した混合物からリポソーム懸
濁液を調製することによって達成される。

【００３４】本発明のリポソーム製剤を作る方法は、当技術分野で周知の適当な有機溶剤中
で、二重層成分を適切な比率で混合することを含む。次いで、この溶剤を蒸発さ
せて、乾燥した脂質フィルムを生成する。平衡量の界面活性剤および所望の活性
物質を含む水溶液を使用して、このフィルムに（脂質混合物の相転移温度より高
い温度にて）再度水分を加える。水分を加えた後に生成されるリポソームを押し
出し、当技術分野で周知の所望のサイズのリポソームを形成する。たとえば、８
０：２０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含むリポソームを製造する場合、この脂質混合
物の相転移温度（３９℃）より高い温度で、再度水分を加える。脂質フィルムに
再度水分を加えるのに使用される水溶液は、リゾ脂質モノマーの平衡量（たとえ
ば、ＭＰＰＣの臨界ミセル濃度に等しい濃度）を含む。

【００３５】従来のリポソームは、肝臓および脾臓（網内系すなわちＲＥＳの器官）のマク
ロファージにより速やかに取り込まれるため、血液循環中で半減期が比較的短い
という難点があり、したがって、漏出しやすい腫瘍組織に蓄積しない。急速なＲ
ＥＳ取り込みを逃れ、循環時間が増加したリポソーム調製品が考案された。ＳＴ
ＥＡＬＴＨ（登録商標）リポソーム（ＳｅｑｕｕｓＩｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ
ＰａｒｋＣＡ）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がグラフトされた脂質
を脂質二重層中に約５モル％含む。たとえば、Ａｌｌｅｎ，ＵＣＬＡＳｙｍ
ｐｏｓｉｕｍｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙ，８９：４０５（１９８９）；Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０６６：２９（１９９１）；
Ｋｌｉｂａｎｏｖｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ２６８：２３
５（１９９０）；Ｎｅｅｄｈａｍｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１１０８：４０（１９９２）；Ｐａｐａｈａｄｊｏ
ｐｏｕｌｏｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ８８：１１４６０（１９９１）；Ｗｕｅｔａｌ．，Ｃａｎ
ｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ５３：３７６５（１９９３）；Ｋｌｉｂａｎｏｖ
ａｎｄＨｕａｎｇ，Ｊ．ＬｉｐｏｓｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ２：３
２１（１９９２）；ＬａｓｉｃａｎｄＭａｒｔｉｎ，Ｓｔｅａｌｔｈ
Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｉｎ：ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＴｏｘｉ
ｃｏｌｏｇｙ，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉ
ｄａ（１９９５）を参照されたい。ポリマーがグラフトされた脂質を小胞膜中に
含むリポソームに関する、Ｍａｒｔｉｎらに付与された米国特許第５，２２５，
２１２号、Ｚａｌｉｐｓｋｙらに付与された米国特許第５，３９５，６１９号も
参照されたい。リポソーム外面上にポリマーが存在すると、ＲＥＳの器官による
リポソーム取り込みが減少する。

【００３６】ＲＥＳによるリポソーム取り込みを減少させ、その結果、リポソームの循環時
間を増加させるために、当技術分野で周知の通り、ポリマーがグラフトされた脂
質を含むように、本発明のリポソームを製剤することが可能である。適当なポリ
マーとしては、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳
酸とポリグリコール酸とのコポリマー、およびポリビニルアルコール等の親水性
ポリマーが挙げられる。

【００３７】活性物質本明細書で使用される、リポソーム「内部の」活性物質またはリポソーム「内
に捕捉された」活性物質は、脂質二重層内に分配されて、小胞膜それ自身の内部
に含まれるものと比較して、リポソームの内部空間に含まれるものである。本明
細書で使用される、リポソームの脂質二重層「内部の」活性物質または脂質二重
層「内に捕捉された」活性物質は、リポソームの内部空間に含まれているのと対
照的に、脂質二重層の一部として輸送される。活性物質は、当技術分野で周知の
通り、活性物質の水溶液を含むがその限りではない、リポソームに使用するのに
適したいずれの形態であってもよい。本発明のリポソーム内の活性物質の水溶液
は、所期の対象者の体液と同じ浸透圧であってもよく、高い浸透圧であってもよ
く（米国特許第５，０９４，８５４号参照）、当技術分野で周知の通り、この水
溶液は、沈殿した活性物質を多少含んでもよい。リポソームの内部に封入するの
に好ましい活性物質は、水溶性の弱塩基の薬剤である。

【００３８】ある一定の活性物質（たとえば、麻酔薬）を本発明のリポソーム内に組み込む
と、活性物質を含まない類似したリポソームで見られるであろうものと比較して
、リポソームからの内容物の放出がさらに変化（増強もしくは抑制）したり、リ
ポソームの転移温度が変化する可能性がある。

【００３９】所望の標的部位における高体温と熱感受性リポソームを併用したドキソルビシ
ン、シスプラチンおよびメトトレキサート等の抗新生物薬または抗腫瘍薬の投与
が報告されている。たとえば、ＭａｇｉｎａｎｄＷｅｉｎｓｔｅｉｎＩｎ
：ＬｉｐｏｓｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，（Ｇｒｅｇｏ
ｒｉａｄｉｓＧ．，ｅｄ．）ｐ．１３７，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９３）；Ｇａｂｅｒｅｔａｌ．，Ｉｎｔｌ
．Ｊ．ＲａｄｉａｔｉｏｎＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓｉ
ｃｓ，３６（５）：１１７７（１９９６）を参照されたい。

【００４０】本発明で使用するのに適した活性物質としては、治療薬および薬理学的活性物
質、栄養補給用分子、化粧品、診断用剤および画像用造影剤などがある。本明細
書で使用される活性物質は、活性物質の薬理学的に許容できる塩類を含む。適当
な治療薬としては、たとえば、抗新生物薬、抗腫瘍薬、抗生物質、抗真菌薬、抗
炎症薬、免疫抑制薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、駆虫薬、および抗寄生虫化合物
などが挙げられる。リポソーム製剤に適した親油性薬誘導体の調製方法は当技術
分野で周知である（たとえば、治療薬の、リン脂質の脂肪酸鎖への共有結合につ
いて記述している、Ａｎｓｅｌｌに付与された米国特許第５，５３４，４９９号
を参照）。

【００４１】腫瘍もしくは新生物成長の治療において、適当な化合物はアントラサイクリン
系抗生物質（たとえば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、カリノマイシン、Ｎ
−アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、５−イミドダウノマイシン、Ｎ３０
アセチルダウノマイシン、およびエピルビシン）および植物アルカロイド類（
ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、エリプチシンおよびカンプトテ
シン）を含んでもよい。他の適当な薬剤としては、パクリタキセル（ＴＸＯＬ（
登録商標）；イチイの樹皮から単離されたジテルペン類であり、タキサン環構造
を有する新しいクラスの治療薬の代表である）およびドセタキソル(docetaxol)
（タキソテール）、ミトタン、シスプラチン、およびフェネステリンなどが挙げ
られる。

【００４２】本発明に使用するのに適した炎症治療薬としては、ステロイド類および非ステ
ロイド系抗炎症性化合物、たとえば、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、パラ
メタゾン、１１−フルドロコルチゾール、トリアムシノロン、ベタメタゾンおよ
びデキサメタゾン、イブプロフェン、ピロキシカム、ベクロメタゾン；メトトレ
キサート、アザリビン、エトレチナート、ソラリン；アスピリン等のサリチル酸
エステル類、およびサイクロスポリン等の免疫抑制薬が挙げられる。抗炎症性コ
ルチコステロイド類および抗炎症性免疫抑制薬サイクロスポリンは共に極めて親
油性であり、本発明に使用するに適している。

【００４３】本発明のリポソームに使用するのに適したさらなる薬理学的物質としては、麻
酔薬（たとえば、メトキシフルラン、イソフルラン、エンフルラン、ハロタン、
およびベンゾカイン）、抗潰瘍薬（たとえば、シメチジン）、バルビツール酸塩
等の抗痙攣薬、アゾチオプリン（免疫抑制薬および抗リウマチ薬）、筋弛緩薬（
たとえば、ダントロレンおよびジアゼパム）などがある。

【００４４】本リポソーム調製品に使用するのに適した撮像剤としては、超音波造影剤、放
射性造影剤（たとえば、放射性同位元素または放射性同位元素を含有する化合物
、ヨードオクタン類、ハロカーボン類、およびレノグラフィン）、または磁気造
影剤（たとえば、常磁性化合物）などがある。

【００４５】本発明のリポソームに組み込むのに適した栄養剤としては、香味化合物（たと
えば、シトラール、キシリトール）、アミノ酸類、糖類、タンパク質、炭水化物
、ビタミン類および脂肪などがある。栄養剤の組み合せも適する。

【００４６】投与およびリポソームサイズリポソームの、対象者の血流中への配送または皮下投与を含むがその限りでは
ない当業者に周知の方法を使用して、本発明のリポソームを投与することが可能
である。本発明によるリポソームが高体温と一緒に使用される場合、リポソーム
を治療部位に配送する結果となる任意の適当な方法でリポソームを投与すること
が可能である。たとえば、リポソームを静脈内投与し、それによって、正常な血
流により腫瘍の部位に導くことが可能である。この部位を加熱すると、リポソー
ム膜が相転移温度に加熱され、その結果、腫瘍の部位にてリポソーム内容物が優
先的に放出される。

【００４７】腫瘍または新生物の治療が望ましい場合、リポソームに封入された活性物質の
血流を介した効果的な配送には、リポソームが連続した（しかし「漏出性の」）
内皮層、およびその下にある、腫瘍に血液を供給する血管を取り囲む基底膜を貫
通できることが必要である。小さいサイズのリポソームは、内皮細胞関門、およ
び下にある、毛細管を腫瘍細胞と隔てる基底膜を通って腫瘍中に浸出する時に有
効なことが確認されている。たとえば、Ｍａｒｔｉｎらに付与された米国特許第
５，２１３，８０４号を参照されたい。

【００４８】本明細書で使用される「充実性腫瘍」は、（白血病等の、血液原性腫瘍と対照
的に）血流以外の解剖学的部位で成長するものである。充実性腫瘍は、成長して
いる腫瘍組織に栄養を与えるために、小血管および毛細管の形成を必要とする。

【００４９】本発明によれば、選り抜きの抗腫瘍薬または抗新生物薬が本発明によるリポソ
ーム内に捕捉され、このリポソームは、内皮関門および基底膜関門を貫通するこ
とが判っているサイズになるように調剤される。このようにして得られるリポソ
ーム製剤を、このような治療を必要としている対象者に、非経口的に、好ましく
は静脈内投与により、投与することができる。腫瘍成長領域内の血管系の透過性
の急性増大を特徴とする腫瘍が、本方法による治療に特に適する。リポソームの
投与に続いて、リポソーム内容物を放出する結果になる温度まで、治療部位を加
熱する。

【００５０】炎症の部位特的治療が望ましい場合、活性物質の効果的なリポソーム配送には
、リポソームが長い血液半減期を有すること、ならびに連続した内皮細胞層、お
よび下にある、炎症部位に近接する血管を取り囲む基底膜を貫通できることが必
要である。小さいサイズのリポソームは、内皮細胞関門を通って関連した炎症領
域に内に浸出する時に有効なことが確認されている。たとえば、Ｗｏｏｄｌｅら
に付与された米国特許第５，３５６，６３３号を参照されたい。本発明によれば
、選り抜きの抗炎症薬が本発明によるリポソーム内に捕捉され、このリポソーム
は、内皮関門および基底膜関門を貫通することが判っているサイズになるように
調剤される。このようにして得られるリポソーム製剤を、このような治療を必要
としている対象者に、非経口的に、好ましくは静脈内投与により、投与すること
ができる。炎症領域内の血管系の透過性の急性増大を特徴とし、且つ温度の局所
上昇を特徴とする炎症が、本方法による治療に特に適する。

【００５１】さらに、本発明のリポソームを使用して、血流を介して抗感染薬を感染部位に
配送できることも十分に理解されるであろう。ＰＣＴ特許出願公告ＷＯ９３／
１９７３８号には、親水性ポリマーを用いて誘導される小胞形成性脂質を含み、
且つ０．０７〜０．２μｍの範囲のサイズを有するリポソームが記載されている
。本発明によれば、本発明による膜を有するリポソーム内に選り抜きの抗感染薬が
捕捉され、結果として得られるリポソーム製剤が対象者に非経口的に、好ましく
は静脈内投与により、投与される。必要に応じて、感染部位にて局所高体温を誘
導し、その部位にて、リポソーム内容物を優先的に放出させることが可能である
。

【００５２】調製物におけるリポソームのサイズは、中に含まれる活性物質および／または
所期の標的によって異なってもよい。直径０．０５〜０．３μｍのリポソームは
、腫瘍投与に適していると報告されている（Ａｌｌｅｎらに付与された米国特許
第５，５２７，５２８号）。当技術分野で周知の方法に従って、また、中に含ま
れる活性物質および所望の作用を考慮に入れて、本発明によるリポソームのサイ
ジングを実施することが可能である（たとえば、Ｍａｒｔｉｎらに付与された米
国特許第５，２２５，２１２号、Ａｌｌｅｎらに付与された米国特許第５，５２
７，５２８号を参照）。本発明の好ましい実施形態は、直径１０μｍ未満のリポ
ソーム、または直径１０μｍ未満の複数のリポソームを含むリポソーム調製物で
ある。本発明のさらに好ましい実施形態では、リポソームは直径約０．０５μｍ
または約０．１μｍから、直径約０．３μｍまたは約０．４μｍまでである。リ
ポソーム調製物は、異なるサイズのリポソームを含んでもよい。

【００５３】本発明の別の好ましい実施形態では、リポソームは、直径約５０ｎｍ、１００
ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍまたは１５０ｎｍから、約１７５ｎ
ｍ、１８０ｎｍ、２００ｎｍ、２５０ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎ
ｍ、５００ｎｍまでである。

【００５４】本発明の１つの態様では、選択されたサイズ範囲内で、実質的に一様なサイズ
を有するように、リポソームを調製する。１つの効果的なサイジング方法は、選
択された孔の大きさを有する一連のポリカーボネート膜を通過させてリポソーム
の水性懸濁液を押し出すことを含み、膜の孔の大きさは、膜を通して押出される
ことにより生じるリポソームの最大サイズとおおよそ一致する。たとえば、米国
特許第４，７３７，３２３号（１９８８年４月１２日）を参照されたい。

【００５５】本発明のさらなる態様では、リポソームの水性調製物を提供するために、リポ
ソームを生理食塩水またはＰＢＳ中に分散する。界面活性剤がリポソーム二重層
から溶液中に失われるのを減少させるかまたは防止するために、水性調製物は、
リポソーム二重層に含まれる平衡量の界面活性剤をさらに含んでもよい。ＤＰＰ
Ｃ：ＭＰＰＣを含むリポソームは、約１ｍＭ〜約５ｍＭのＭＰＰＣモノマーを含
む生理食塩水またはＰＢＳ中に含まれてもよい。

【００５６】本発明によるリポソーム内に捕捉されるか、本発明によるリポソームにより輸
送される有効物質の量は、当業者に明白になるであろうが、治療用量および活性
物質の単位用量によって変化する。しかし、一般に、本発明のリポソーム調製物
は、可能な活性物質の最大量がリポソームによって輸送されるように設計される
。本発明のリポソームは、どんなタイプのものであってもよいが、ＬＵＶが特に
好ましい。

【００５７】リポソーム内容物の放出の評価捕捉された蛍光プローブ、６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の放出によ
る熱感受性リポソームの特性決定が、Ｍｅｒｌｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎ
ｃｅｒ２７（８）：１０３１（１９７９）に報告されている。消光濃度（５０
ｍＭ）にてＣＦをリポソーム内に捕えると、リポソーム内に捕捉されたＣＦに関
する蛍光は全く認められなかった。しかし、ＣＦが懸濁液で希釈されることによ
りプローブがリポソームから放出されると、強い蛍光が現れた。このようにして
、様々な温度でリポソームから放出されるプローブの量を、蛍光に基づいて定量
することが可能である。Ｍｅｒｌｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．，
２７（８）：１０３１（１９７９）は、ドキソルビンシン（ＤＸ）を封入してい
る熱感受性リポソームについて研究し、従来の熱感受性リポソームと比較して、
血流中での循環時間を増加させるために、二重層中にＰＥＧを付加した(pegylat
ed)脂質を組み込んだ。Ｍａｒｕｙａｍａｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１４９：１７（１９９３）も参照されたい
。

【００５８】以下の実施例は、本発明を説明するために述べるものであって、本発明を制限
するものと考えてはならない。

【００５９】例１温度感受性リポソームの調製様々なモル濃度のリゾ脂質モノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ
）を含むＤＰＰＣリポソームを調製して特性決定した。膜透過性変化に関するマ
ーカーの役割を果たすために、水性蛍光プローブ６−カルボキシフルオレセイン
（ＣＦ）を、リポソーム内に捕えた。当技術分野で周知の方法を使用して、リポ
ソーム内にＣＦを組み込んだ（たとえば、Ｌｉｐｏｓｐｍｅｓ：ＡＰｒａｃ
ｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（１９９０），Ｅｄｉｔｏｒ：Ｒ．Ｒ．Ｃ．
Ｎｅｗ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＮＹを参照されたい）。
リポソーム成分をクロロホルム（適当な有機溶剤）に溶解し、回転式蒸発器を使
用して、真空下、４５℃にて溶剤を蒸発させ、丸底フラスコの内壁上に、脂質の
均質な薄いフィルムを形成した。脂質フィルムを、真空下で、さらに２５時間乾
燥させ、確実に、痕跡量のクロロホルムを完全に除去した。

【００６０】５０ｍＭのＣＦおよび１ｍＭのＭＰＰＣを含む１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ＝７．
４）の水溶液で、４５℃にて、この脂質フィルムに水分を補給した。効率的に水
分補給をするために、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズを使用して、水性媒体の
存在下で脂質を穏やかに腐食し、多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）の濁った懸濁液を生
成した。このようにして生成されたＭＬＶは、７００ｎｍという平均サイズを有
しており、Ｈｏｐｅｅｔａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ８１２：５５−６５（１９８５））によって開発された方法に説明され
ている通りに、３００〜４００ｐｓｉの圧力下、４５℃にて（すなわち、脂質も
しくは脂質混合物のゲル−液体結晶温度より高い）、０．１μｍの２つのポリカ
ーボネート膜フィルターのスタックを通して押し出すと、所望の１４０ｎｍサイ
ズの押出技術による大型単ラメラ小胞（ＬＵＶＥＴ）が得られた。各押出通過
後に、ＰｈｏｔｏｎＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐ
ＣＳ，Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｎ４ｐｌｕｓ）で小胞の平均直径を測定した。

【００６１】図２からわかるように、リポソームのサイズは、連続した膜通過と共に減少し
、３回通過後に最小サイズに達した。

【００６２】リポソーム内容物の放出ＰＢＳの存在下、インキュベーション温度（２５〜４５℃）の関数として、捕
捉された水溶性蛍光分子（ＣＦ）の、小胞の水性内部から周囲の溶液への％放出
を測定することにより、例１に記載の通りに調製された、様々なモル分率のＭＰ
ＰＣを含むリポソーム製剤のｉｎｖｉｔｒｏ安定性および熱感受性を評価した
。リポソーム内に捕えられたＣＦの蛍光は、高濃度のために自己消光したが、リ
ポソームから放出されて懸濁媒体で希釈されると、ＣＦは強い蛍光を発した。イ
ンキュベーション後、リポソームから放出されたＣＦの量を決定するために適当
に希釈した後、励起波長（λｅｘ）=４７０ｎｍおよび発光波長（λｅｍ）＝５
２０ｎｍにて試料の蛍光強度を測定した。１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加
えることにより、リポソーム試料を崩壊した後に得られる、捕えられた物質の放
出総量と比較することによって、個々の温度におけるインキュベーションによる
相対的％蛍光強度を算出した。

【００６３】純粋なＤＰＰＣを含むリポソームおよび２、４、６、８、１０または２０モル
％のＭＭＰＣを含むＤＰＰＣ：ＭＣＣＰ混合物を含むリポソームについて、２０
℃〜４５℃の温度範囲全域で、この実験を実施した。

【００６４】生理学的温度（３７℃）および高体温温度（４０℃）で、本発明のリポソーム
から時間の関数として放出された、捕えられたＣＦの量を測定した。リポソーム
を、ＰＢＳ中で様々な時間間隔でインキュベートし、蛍光強度測定法により、λ
ｅｘ=４７０ｎｍおよびλｅｍ＝５２０ｎｍにてＣＦの放出を測定した。９０：
１０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ組成物の代表的な加熱を図３に示す。３７℃で、ＣＦ
の％放出は無視できるほど僅かであった。しかし、４０℃でインキュベーション
を続けると、捕えられたＣＦの約６０％が５分以内に放出され、この温度でさら
にインキュベーシトしたとき、さらなる内容物の放出は、僅かに増加しただけで
あった。したがって、所与の温度で、加熱の５〜１０分以内に、内容物のほとん
どが放出される。

【００６５】図４は、１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）の存在下、２０℃〜４０℃の温度
で５分間インキュベートしたリポソームからのＣＦの放出を示す図である。蛍光
強度測定法により、λｅｘ=４７０ｎｍおよびλｅｍ＝５２０ｎｍにて、ＣＦの
放出を測定した。得られた値を、ＣＦの全放出（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００をリ
ポソーム試料に加えてリポソームを溶解し、捕えられた全てのＣＦを放出させる
ことにより実行される）後に得られる値と比較することにより、放出されたＣＦ
の％を算出した。純ＤＰＰＣリポソームは３９．５℃まで安定であったが、リン
脂質の転移温度付近で透過性になり、ＣＦの一部の放出を引き起こした。しかし
、純ＤＰＰＣリポソームから放出されたＣＦの量は、全内容物の約２０％に過ぎ
なかった。対照的に、ＤＰＰＣ二重層中のＭＰＰＣ濃度が上昇するにつれて、リ
ポソームはＣＦの放出増加を示し、１０モル％および２０モル％のＭＰＰＣを含
む二重層を有するリポソームで、最大の放出が起きた。

【００６６】以上の結果から、１０モル％という少量のＭＰＰＣをＤＰＰＣリポソームの膜
イ組み込むと、放出されるＣＦの量は、（ＤＰＰＣのみのリポソームで見られる
放出と比較して）４という係数で増加することがわかる。

【００６７】放出開始温度が僅かに低い温度に移動し、１０モル％および２０モル％のＭＰ
ＰＣを含むリポソームの場合、約３８℃で開始するため、温度放出プロフィール
から、ＭＰＰＣをＤＰＰＣリポソーム膜に組み込むさらなる利点もわかる。これ
らのリポソームでは、放出プロフィーが鋭く、１℃程度、すなわち、１０％ＭＰ
ＰＣリポソームの場合、３８．５℃〜４０℃の間の温度上昇後に最大量のＣＦが
放出される。

【００６８】以上の実験から、ＤＰＰＣで作られたリポソーム二重層にＭＰＰＣを含めると
、リポソームの内部から放出される内容物の量が増加し、放出が起きる温度範囲
が、穏やかな高体温範囲である３８．５℃〜４０℃の範囲に移動することがわか
る。

【００６９】２０モル％を超えるＭＰＰＣ濃度を含むＤＰＰＣリポソームでは、リポソーム
は本質的に不安定になり、したがって、脂質相転移より高い温度で（すなわち、
リポソームの処理中に生じる脂質二重層の液相で）、捕えられた物質を保持でき
なくなる。このように高濃度のＭＰＰＣは、転移温度より低い温度で、ゲル相二
重層も不安定にする可能性がある。先に示した通り、ＭＰＰＣが多く含まれるに
つれて、膜の機械的強度が低下し（Ｎｅｅｄｈａｍｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｊ．７３：２６１５（９９７））、リン脂質に対するＭＰＰＣのモ
ル比が５０モル％を超えると、二重層は、ついには純粋なミセル懸濁液に変化す
る（Ｚｈｅｌｅｖｅｔａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．（印刷中、１９９
８））。熱感受性リポソームの１つの好ましい比率は、９０：１０ＤＰＰＣ：
ＭＰＰＣである。

【００７０】例３ＤＰＰＣ／ＭＰＰＣ混合物の相転移挙動および放出温度との相関関係本発明のリポソームの透過性に関係した生物物理学的機序を研究するために示
差走査熱量測定（ＤＳＣ）研究を実施し、本リポソームの示唆熱量測定的サーモ
グラムを作成して、相転移温度を決定した。これらの結果を、累積放出プロフィ
ール（図４に示す）から得られる放出対温度走査と比較した。図５Ａおよび５Ｂ
は、ＤＰＰＣ二重層中に含まれるＭＰＰＣ濃度が増加するリポソーム調製物に関
する熱移動サーモグラムを表す図である。これらのサーモグラムから、最高１０
％のＭＰＰＣが二重層に含まれても、転移温度は依然として広がらないままであ
ったことがわかる。より高いレベルの分析では、図５Ｂは、ＤＰＰＣ二重層にお
けるＭＰＰＣ組成が零から１０モル％に増加すると、転移温度のピークが４１．
９℃から４１．０４℃まで変化することを示す。転移の開始点と終点、すなわち
過剰の熱移動ピーク線より下および上の固相線および液相線として表される転移
の幅も示す。

【００７１】本発明の示差走査サーモグラムを、示差放出プロフィールと比較することが可
能である。図６Ａは、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９０：１０リポソームからの累積放
出プロフィール対温度、および同じ温度範囲に関する熱移動サーモグラムを示す
図である。図６Ｂは、放出プロフィールの鋭さおよび熱移動サーモグラムに関連
して最大放出が起きる温度を強調する、示差放出を示す図である。この比較に関
して顕著なものは、示差放出プロフィールから得られた内容物のピーク放出が、
ＤＳＣで得られた転移エンタルピーにおけるピークより０．９℃低かったことで
ある。Ｔｃ以前の温度における捕えられた物質の放出は、ピーク温度ではなくサ
ーモグラムの「固相」線で放出が起きていることに原因があると考えられる。こ
のような挙動の１つの理由は、二重層ネットワークの微小領域境界に「第1の欠
陥」（溶解欠陥）が出現するとすぐに、捕えられた物質の放出が起きることであ
る。１つの理論に拘束されたくないが、本発明者は、転移温度が近づくと、溶解
する微小構造の第1の部分は、固体膜の粒状境界にあると推測する。リゾ脂質を
含まない水性層に取り囲まれると、リゾ脂質はゲル層内に捕捉されるが、膜が溶
解し始めると脱着することができる。そうすると、欠陥透過性を強化し、純粋な
脂質のみのリポソームより効果的に内容物が放出される。

【００７２】例４ドキソルビシンの捕捉および放出ｐＨ勾配駆動封入プロトコール（Ｌ．Ｄ．Ｍａｙｅｒｅｔａｌ（１９８
９）ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，４２：４７３４）を使用して、本発明のリポソ
ーム（ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９０：１０）の内部水性容量内にドキソルビシン（
ＤＸ）を捕捉した。簡単に説明すると、９０：１０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣの脂質
組成物をクロロホルムに溶解し、真空下、４５℃で、回転式蒸発器を使用して、
溶剤を蒸発させた。さらに真空デシケータ内で一晩乾燥させた後で得られる脂質
フィルムに、３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．００）で水分補給し、生じた
多重ラメラ小胞を、５０℃にて、３００〜４００ｐｓｉの圧力を使用して、孔の
大きさが０．１μＭの２つのポリカーボネート膜フィルターを通過させて押し出
した。押し出されたリポソームを室温まで冷却し、０．５ＭＮａ₂ＣＯ₃溶液を
使用して、ｐＨを７．５〜８．０に上げた。

【００７３】押し出されたリポソームを６０℃で５分間インキュベートした後、その懸濁液
に、予熱したＤＸを加えた。さらに、間欠的に渦巻き攪拌しながら、試料を６０
℃にて１０分間加熱した。捕えられなかった薬剤を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５
０ゲルを使用したミニカラム遠心分離により除去した。

【００７４】ＰＢＳの存在下、３７℃および４０℃における、時間の関数としての、ＤＸの
リポソームからの放出、ならびに、２５〜４５℃の間の様々な温度における、捕
えられたＤＸのリポソームからの累積放出プロフィールにより、ＤＸを捕えたリ
ポソームを特性決定した。図７は、３７℃および４０℃における、捕えられたＤ
Ｘのリポソームからの放出を、時間の関数として表す図であり、リポソームを３
７℃および４０℃で３０分間インキュベートし、適当に希釈した後、λｅｘ＝４
７０ｎｍおよびλｅｍ＝５８５ｎｍで、放出されたＤＸの蛍光強度を測定した。
これらの値を、６−カルボキシフルオレセイン（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００をリ
ポソーム試料に加えることにより得られる）の放出総量に関する値と比較するこ
とによって、％放出を算出した。図７からわかる通り、３７℃にて３０分インキ
ュベートした後、ＤＸの約１４％が放出され、４０にて３０分インキュベートし
た後、ＤＸの７３％が放出された。

【００７５】図８に示す通り、ＣＦを使用した上記研究（例１〜３）の場合と同様、２５〜
４５℃の間の様々な温度で試料を５分間インキュベートし、放出されたＤＸを蛍
光強度測定法で測定することにより、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９０：１０リポソー
ムに捕えられたＤＸの累積放出を測定した。結果から、３９℃までは、ＤＸの約
２３％を放出し、４０℃で６５％の放出を達成することがわかった。

【００７６】例５リポソーム二重層におけるＰＥＧ包含本発明のリポソームを改変して、ＲＥＳにより認識されにくくし、その結果、
それらの血液循環中における半減期を高めた。

【００７７】５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ（分子量２０００）をリポソーム組成物中に組み
込むことにより、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９０：１０を含むリポソームの表面を改
変した（図１１Ｃ）。したがって、これらのリポソームの改変された組成物は、
ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（８５．９３５：９．５４５
：４．５２０）であった。

【００７８】例６リポソーム内容物の放出に与える体液の影響ＰＢＳまたは５０％ウシ血清のいずれかが存在する条件下、水性内部リポソー
ム領域内に捕えられたＣＦの放出プロフィールを研究することにより、例５に記
載の、表面が改変されたリポソームを特性決定した。例３に記載の通りに、放出
されたＣＦの蛍光強度をλｅｘ＝４７０ｎｍおよびλｅｍ＝５２０ｎｍで測定し
、％放出を算出した。

【００７９】図９Ａは、ＰＢＳの存在下、３７℃および４０℃で、捕えられたＣＦの時間の
関数としての放出を示す図である。図９Ｂは、５０％ウシ血清の存在下、３７℃
および４０℃で、捕えられたＣＦの時間の関数としての放出を示す図である。本
発明の、表面が改変されたリポソーム製剤は、ＰＢＳおよび血清の存在下、生理
学的温度（３７℃）で安定であり、それぞれ、１％および７％のＣＦ放出を示し
た。しかし、これらのリポソームを４０℃でインキュベートすると、５分間イン
キュベートした後、捕えられたＣＦの６４％（ＰＢＳ中）および７６％（血清中
）の放出を示し、３０分間インキュベートした後、７７％（ＰＢＳ中）および９
２％（血清中）の放出を達成した。ＰＢＳおよび５０％ウシ血清の存在下、捕え
られたＣＦのリポソームからの累積放出プロフィ−ルは、それぞれ５８％および
７３％の放出を示した（図１０）。１つの理論に拘束されたくないが、血清の存
在下で増強されたＣＦ放出は、血清中のある特定のの低分子量血液成分とリポソ
ーム表面との相互作用に原因があると考えることができた。

【００８０】前述の例は本発明を説明するものであって、本発明を制限するものと考えては
ならない。本発明を、上記のクレーム、および中に含まれるクレームの等価物に
よって説明する。

【図面の簡単な説明】

【図１】リン脂質としてのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびリ
ゾ脂質としてのモノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）を含む二層
膜を有するリポソームを概略的に表す図である。リゾ脂質モノマーの配向ならび
に脂質二重層の内層および外層の両者にそれらが存在することを示す。

【図２】ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ（９０：１０）を含有するＤＰＰＣリポソームの平均直径
に及ぼす、押出通過の影響を示すグラフである。孔の大きさが０．１ｍＭの２つ
のポリカーボネート膜のスタックを、４５℃にて３００〜４００ｐｓｉの圧力で
通過させると、平均サイズが７００ｎｍである多重ラメラ小胞が押し出された。

【図３】ＰＢＳの存在下、３７℃（白抜きの円）および４０℃（中黒の正方形）におけ
る、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ（９０：１０）を含むリポソーム内に捕えられた６−カ
ルボキシフルオレセイン（ＣＦ）の放出を時間の関数として示すグラフである。

【図４】１０ｍＭＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）の存在下、２０℃〜４５℃の温度における
、様々な濃度のＤＰＰＣ：ＭＰＰＣリポソームからのＣＦの放出を示すグラフで
ある。リポソームは、ＤＰＰＣのみ（白抜きの円）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９８
：２（中黒の正方形）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９６：４（中黒の三角）、ＤＰＰ
Ｃ：ＭＰＰＣ９４：６（白抜きの三角）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９３：７（中
黒のダイアモンド形）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ９２：８（白抜きの正方形）、Ｄ
ＰＰＣ：ＭＰＰＣ９０：１０（中黒の円）、ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ８０：２０
（中黒の三角）を含んでいた。

【図５Ａ】様々なＭＰＰＣ濃度がＤＰＰＣリポソームの相転移温度（Ｔｃ）に及ぼす影響
を表す、熱移動サーモグラムを示す図である。３０℃〜４５℃の間で、２℃／分
の加熱速度で、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）により、ＭＰＰＣ（１〜１０モル
％）を含有するＤＰＰＣの凍結乾燥試料のＴｃを測定した。

【図５Ｂ】５Ａについて上述した通り、ＭＰＰＣ濃度がＤＰＰＣリポソームの相転移温度
（Ｔｃ）に及ぼす影響を示すグラフである。このグラフは、転移の開始点（白抜
きの円）、エンタルピーのピーク（中黒の円）、および転移の終点（白抜きの三
角）を表す。

【図６Ａ】リポソーム（９０：１０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣ）の示差走査熱量測定法のプロ
フィールと、図４に記載の累積放出実験で得られた６−カルボキシフルオレセイ
ン（ＣＦ）放出に関する示差放出プロフィール（中黒の円）とを比較するグラフ
である（過剰の熱移動：白抜きの正方形）。

【図６Ｂ】９０：１０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣリポソームからの示差放出プロフィールを
示すグラフであって、白抜きの円は熱移動を表し、中黒の円は２５℃〜４５℃の
温度でのＣＦの示差放出を表す。

【図７】ＰＢＳの存在下、３７℃（中黒の円）および４０℃（白抜きの円）における、
捕捉されたドキソルビシン（ＤＸ）のリポソーム（９０：１０ＤＰＰＣ：ＭＰ
ＰＣ）からの放出を時間の関数として示すグラフである。

【図８】ＰＢＳの存在下、２５〜４５℃の温度で５分間インキュベートした、９０：１
０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含むリポソームからの、捕捉されたＤＸの累積放出プ
ロフィールを示すグラフである。

【図９Ａ】ＰＢＳの存在下で、捕捉された６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）のリポ
ソーム（５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を組み込んだ９０：１０ＤＰＰ
Ｃ：ＭＰＰＣ）からの放出を温度の関数として示すグラフである（３７℃−白抜
きの円、３８℃−中黒の正方形、３９℃−中黒の三角、３９．５℃−白抜きの三
角、および４０℃−中黒の円）。

【図９Ｂ】５０％ウシ血清の存在下で、捕捉された６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ
）の、リポソーム（５モル％のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を組み込んだ９０：１
０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含む）からの放出を温度の関数として示すグラフであ
る（３７℃−白抜きの円、３８℃−中黒の正方形、３９℃−中黒の三角、３９．
５℃−白抜きの三角、および４０℃−中黒の円）。

【図１０】ＰＢＳ（中黒の円）または５０％ウシ血清（白抜きの円）の存在下、２５〜４
５℃の様々な温度における、捕捉された６−カルボキシフルオレセイン（ＣＦ）
の、９０：１０ＤＰＰＣ：ＭＰＰＣを含むリポソームからの累積放出を示すグ
ラフである。

【図１１Ａ】１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）の
化学構造を示す図である。

【図１１Ｂ】１−パルミトイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｍ
ＰＰＣ）の化学構造を示す図である。

【図１１Ｃ】１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ
−［ポリ（エチレングリコール）２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の化
学構造を示す図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年６月３０日（２０００．６．３０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/517 Ａ６１Ｋ 31/517 31/573 31/573 31/704 31/704 33/24 33/24 45/00 45/00 47/24 47/24 47/34 47/34 Ａ６１Ｐ 29/00 Ａ６１Ｐ 29/00 31/04 31/04 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｆターム(参考） 4C076 AA21 AA95 CC04 CC07 CC27 DD23 DD63 EE06 EE23 EE24 FF16 FF31 FF32 GG41 4C084 AA17 AA24 AA27 MA24 NA12 NA13 ZB082 ZB112 ZB262 ZB352 4C086 AA01 AA02 BA02 BC45 CB05 DA10 DA32 EA08 MA03 MA05 MA24 NA12 NA13 ZB08 ZB11 ZB26 ZB35 4C206 AA01 AA02 DA24 MA03 MA05 MA44 NA12 NA13 ZB11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】活性物質を含むリポソームであって、リン脂質およびリゾ脂
質を含む脂質二層膜を有し、リン脂質が脂質二層膜の一次脂質源であり、前記リ
ゾ脂質が存在しない条件で生じるものと比較して、相転移温度で放出される活性
物質のパーセンテージを増加させるのに十分な量で、リゾ脂質が二層膜中に含ま
れるリポソーム。
【請求項２】リン脂質およびリゾ脂質が、モル重量基準で９９：１〜７０
：３０の比率で前記二層膜中に含まれる請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】前記リン脂質が、飽和アシル基を含む請求項１に記載のリポ
ソーム。
【請求項４】前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ｄ
ＰＰＣ）であり、前記リゾ脂質がモノパルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰ
ＰＣ）である請求項１に記載のリポソーム。
【請求項５】前記活性物質が、リポソーム内部に捕捉されている請求項１
に記載のリポソーム。
【請求項６】前記活性物質が、脂質二層膜内に捕捉されている請求項１に
記載のリポソーム。
【請求項７】約５０ナノメートル〜約４００ナノメートルの直径を有する
請求項１に記載のリポソーム。
【請求項８】前記リポソーム二重層が、親水性ポリマーを用いて誘導され
るリン脂質をさらに含む請求項１に記載のリポソーム。
【請求項９】前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸
、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、およびポリ
ビニルアルコールからなる群から選択される請求項８に記載のリポソーム。
【請求項１０】前記活性物質が、薬理学的活性物質、香味用剤、診断用剤
または栄養補給用剤である請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１１】前記薬理学的活性物質が、抗新生物薬、抗炎症薬、抗腫瘍
薬、免疫抑制薬、抗生物質および抗感染薬からなる群から選択される請求項１に
記載のリポソーム。
【請求項１２】前記活性物質が、メトトレキサート、ドキソルビシン、エ
ピルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、
エリプチシン、カプトテシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスプラチン、
プレドニゾン、メチルプレドニゾンおよびイブプロフェンからなる群から選択さ
れる請求項１に記載のリポソーム。
【請求項１３】前記活性物質が、パクリタキセルである請求項１に記載の
リポソーム。
【請求項１４】前記活性物質が、カプトテシンである請求項１に記載のリ
ポソーム。
【請求項１５】リン脂質および２モル％〜３０モル％のリゾ脂質を含み、
リン脂質が脂質二層膜の一次脂質源である脂質二層膜を有するリポソーム。
【請求項１６】前記リン脂質ががジパルミトイルホスファチジルコリン（
ＤＰＰＣ）であり、前記リゾ脂質がモノパルミトイルホスファチジルコリン（Ｍ
ＰＰＣ）である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１７】前記脂質二層膜が、１０モル％〜２０モル％のリゾ脂質を
含む請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項１８】前記活性物質が、薬理学的活性物質、香味用剤、診断用剤
または栄養補給用剤である請求項１８に記載のリポソーム。
【請求項１９】前記活性物質が、抗新生物薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、免疫
抑制薬、抗生物質および抗感染薬からなる群から選択される前記薬理学的活性物
質である請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２０】前記活性物質が、メトトレキサート、ドキソルビシン、エ
ピルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、
エリプチシン、カプトテシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスプラチン、
プレドニゾン、メチルプレドニゾンおよびイブプロフェンからなる群から選択さ
れる請求項１５に記載のリポソーム。
【請求項２１】前記活性物質が、パクリタキセルである請求項１５に記載
のリポソーム。
【請求項２２】前記活性物質が、カプトテシンである請求項１５に記載の
リポソーム。
【請求項２３】リン脂質および１〜３０％のリゾ脂質を含む脂質二層膜有
するリポソーム中に活性薬剤を捕捉することを含む高体温投与用の活性物質の調
整方法であって、リン脂質が脂質二層膜の一次脂質源である調製方法。
【請求項２４】前記脂質二層膜が、５モル％〜２０モル％のリゾ脂質を含
む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】前記活性物質が、リポソーム内部に捕捉される請求項２３
に記載の方法。
【請求項２６】前記活性物質が、脂質二層膜内に捕捉される請求項２３に
記載の方法。
【請求項２７】前記前記リポソーム二重層が、親水性ポリマーを用いて誘
導されるリン脂質をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリ乳
酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸とのコポリマー、およびポ
リビニルアルコールからなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】前記リン脂質が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（
ＤＰＰＣ）であり、前記リゾ脂質がモノパルミトイルホスファチジルコリン（Ｍ
ＰＰＣ）である請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】前記活性物質が、薬理学的活性物質、香味用剤、診断用剤
または栄養補給用剤である請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】前記活性物質が、抗新生物薬、抗炎症薬、抗腫瘍薬、免疫
抑制薬、抗生物質および抗感染薬からなる群から選択される薬理学的活性物質で
ある請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】前記活性物質が、メトトレキサート、ドキソルビシン、エ
ピルビシン、ダウノルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、
エリプチシン、カプトテシン、パクリタキセル、ドセタキソル、シスプラチン、
プレドニゾン、メチルプレドニゾンおよびイブプロフェンからなる群から選択さ
れる請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】前記活性物質が、パクリタキセルである請求項２３に記載
の方法。
【請求項３４】前記活性物質が、カプトテシンである請求項２３に記載の
リポソーム。
【請求項３５】請求項１または請求項１５のいずれかに記載の複数のリポ
ソームを含むリポソーム調製物。
【請求項３６】前記リポソームが、生理食塩水中に分散されている請求項
３５に記載のリポソーム調製物。
【請求項３７】リゾ脂質モノマーを溶液中にさらに含む請求項３６に記載
のリポソーム調製物。
【請求項３８】前記リポソームが、直径約５０ｎｍ〜直径約４００ｎｍで
ある請求項３５に記載のリポソーム調製物。
【請求項３９】前記リポソームが、直径約１００ｎｍ〜直径約２００ｎｍ
である請求項３５に記載のリポソーム調製物。
【請求項４０】リポソーム内部空間内に捕捉された活性物質を含むリポソ
ームを製造する方法であって、（ａ）リゾ脂質を含むリン脂質フィルムを調製するステップと、（ｂ）活性物質および平衡量のリゾ脂質モノマーを含む水性調製物により前記
リン脂質フィルムに水分補給して、リポソームを生成するステップとを含み、前記リゾ脂質が存在しない条件で生じるものと比較して、相転移温度で放出さ
れる活性物質のパーセンテージを増加させるのに十分な量のリポソーム膜にリゾ
脂質が含まれることを特徴とする方法。
【請求項４１】前記水分補給ステップが、脂質混合物のゲル−液体結晶相
転移温度より高い温度で実施される請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】所望のサイズのリポソームを形成するステップ（ｂ）によ
って製造された前記リポソームを押し出すステップをさらに含む、請求項４０に
記載の方法。
【請求項４３】前記リン脂質フィルムが、活性物質をさらに含む請求項４
０に記載の方法。