MXPA06003740A - Metodo de seleccion para evaluacion de la interaccion bicapa-farmaco en composiciones liposomicas. - Google Patents

Abstract

Se describe un metodo para generar una correlacion entre por lo menos una propiedad termica de un vehiculo liposomico en presencia de un agente terapeutico y una propiedad farmacocinetica para el agente terapeutico en el vehiculo liposomico y para utilizar la correlacion para predecir la propiedad farmacocinetica del vehiculo liposomico en presencia de cualquier agente terapeutico en un vehiculo liposomico.

Description

MÉTODO DE SELECCIÓN PARA EVALUACIÓN DE LA INTERACCIÓN BICAPA-FÁRMACO EN COMPOSICIONES LIPOSÓMICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a una técnica de selección para evaluar las interacciones fármaco-lípido utilizando mediciones térmicas, tal como con calorimetría de barrido diferencial (DSC) . Esta técnica correlaciona mediciones térmicas a los datos biofísicos de varios fármacos cargados en liposomas STEALTH® con sus datos farmacocinéticos respectivos. Se construye un modelo que predice el comportamiento farmacocinético in vivo de fármacos cargados en liposomas STEALTH®, o en circulación prolongada para seleccionar el potencial de un fármaco en un sistema de suministro lipídico, y provee una herramienta valiosa para predecir el comportamiento in vivo de un fármaco dado cuando se administra a partir de una plataforma liposómica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los liposomas son vesículas líquidas cerradas utilizadas para una variedad de propósitos, y en particular, para llevar agentes terapéuticos hacia una región o célula objetivo mediante administración sistémica de liposomas. Los liposomas han demostrado ser particularmente valiosos para amortiguar la toxicidad del fármaco y para alterar parámetros farmacocinéticos de los compuestos terapéuticos. Sin embargo, los liposomas convencionales están limitados en cuanto a su efectividad debido a su absorción rápida por parte de las células de macrófago del sistema inmune, predominantemente en el hígado y bazo. Con respecto al tiempo de vida media corto in vivo de los liposomas convencionales, un número de compañías han superado este obstáculo diseñando liposomas que sean no reactivos (estéricamente estabilizados) o polimórficos (catiónicos o fusogénicos) . Por ejemplo, el liposoma Stealth® (Alza Corporation, Mountain View, CA) está estéricamente estabilizado con una porción de lípido-polímero, típicamente una porción fosfolípido-polietilenglicol (PEG) , está incluida en la bicapa liposómica para evitar que los liposomas se adhieran entre sí y a las células sanguíneas o paredes vasculares. Estos liposomas parecen ser invisibles al sistema inmune y han demostrado resultados alentadores en terapia contra el cáncer (Haumann, Inform, 6 : 793-802, 1995) . Se ha demostrado que existe una correlación positiva entre la cantidad de acumulación de fármaco liposómico en tumores sólidos y el tiempo de vida media en circulación sanguínea de los liposomas. Sin embargo, un desafío con estos liposomas es que diferentes fármacos presentan perfiles de liberación de fármaco muy diferentes después de la administración intravenosa in vivo. Fármacos diferentes pueden presentar comportamientos farmacocinéticos diferentes incluso cuando se encapsulan dentro del mismo tipo de liposomas utilizando el mismo método de encapsulación. Las propiedades tanto de lípido como del fármaco contribuyen a la retención de fármaco y la circulación sanguínea hace que la predicción de retención del fármaco sea difícil. Sin embargo, hasta la fecha poco se sabe acerca de la manera en la cual los fármacos interactúan con las membranas lípidas, y además, acerca de la manera en la cual la naturaleza de la interacción afecta la liberación del fármaco. Por lo tanto, obtener circulación en sangre prolongada para la formulación liposómica es un objetivo primario en estudios de factibilidad de formulación, debido a que el tiempo de vida media en circulación se puede relacionar directamente con la eficacia del producto. Los estudios de factibilidad de formulación incluyen la preparación de liposomas con un agente terapéutico entrampado y evaluación de los datos farmacocinéticos (PK) para los liposomas. Los estudios farmacocinéticos están diseñados para identificar y describir uno o más de absorción, distribución, metabolismo y excreción de fármacos . Debido a que el comportamiento farmacocinético del fármaco libre es muy diferente de aquel del mismo fármaco entrampado en un liposoma, la evaluación de la información PK no es sencilla. Esta evaluación es un procedimiento prolongado y normalmente toma de 6 a 12 meses para que se complete. No se puede anticipar el resultado de la PK hasta que se finalice el estudio. Barenholtz y Cohén [ J Liposome Res . , 5(4):905-932 (1995) ) describen un modelo para identificar sistemas portadores apropiados y para predecir el desempeño de estos sistemas. Sin embargo, este sistema tiene poca utilidad debido a las tareas múltiples para medir los parámetros y no provee una predicción clara y directa del desempeño farmacocinético de las formulaciones liposómicas, incluso conociendo los valores de estos parámetros. Además, Hrynyk et al . proponen un modelo matemático que describe la distribución y eliminación de liposoma dependientes de la dosis y el tiempo para introducir un conjunto limitado de parámetros, el cual puede ser útil cuando se evalúa el destino in vivo de un fármaco encapsulado en liposomas (Hrynyk et al., Cell Mol Biol Lett, (2) :285, 2002) . Por lo tanto, sería deseable predecir la farmacocinética para una formulación de fármaco liposómica. La presente invención presenta un modelo empírico, predictivo basado en una técnica analítica tal como calorimetría de barrido diferencial. Este modelo predictivo es útil para la selección de fármaco con el fin de seleccionar fármacos con un potencial elevado para circulación prolongada en formulaciones liposómicas así como para identificar candidatos de fármaco que sean potencialmente problemáticos. Otro uso del modelo es en el diseño apropiado de formulaciones lípidas para tiempo de circulación en sangre máximo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1A-1D son gráficas de termogramas de liposomas de DSPC que contienen doxorubicina (figura ÍA) , CKD602 (figura IB) , vincristina (figura 1C) , y paclitaxel (figura ID) en comparación con un control de DSPC a un pH de 3.6. Las figuras 2A-2D son gráficas de termogramas de liposomas de DSPC que contienen doxorubicina (figura 2A) , CKD602 (figura 2B) , vincristina (figura 2C) , y paclitaxel (figura 2D) en comparación con un control de DSPC a un pH de 7.0. La figura 3 es una gráfica de un termograma de DSC para DSPC. Las figuras 4A-4B son matrices de gráficas de dispersión de correlaciones de ?HVH y CU, respectivamente, contra tiempo de vida media de circulación en sangre en ratas (T?/2) para fármacos entrampados en liposomas a pH 3.6. Las figuras 5A-5B son matrices de gráfica de dispersión bivariantes de correlaciones de ?HvH contra tiempo de vida media en circulación (T_./2) para fármacos entrampados en liposoma a pH 7.0. Las figuras 6A-6B son matrices de gráficas de dispersión multi-variantes de correlaciones para fármacos entrampados en liposoma a pH 3.6 y 7.0, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Definiciones Los siguientes términos tienen los siguientes significados a menos que se indique de otra manera. "Liposomas" son vesículas constituidas por una o más bicapas de lípido concéntricas que contienen un volumen acuoso entrampado. Las bicapas están constituidas por dos monocapas de lípido que tienen una región de "cola" hidrofóbica y una región de "cabeza" hidrofílica, en la cual las regiones hidrofóbicas se orientan hacia el centro de la bicapa y las regiones hidrofílicas se orientan hacia la fase acuosa interior o exterior. "Lípidos formadores de vesícula" se refiere a lípidos antipáticos que tienen porciones de grupo de cabeza hidrofóbico y polar, y las cuales se pueden formar espontáneamente como vesículas de bicapa en agua, como queda ejemplificado por los fosfolípidos, o se incorporan de manera estable en bicapas de lípido, con la porción hidrofóbica en contacto con la región hidrofóbica, interior, de la membrana de bicapa, y la porción del grupo de cabeza polar orientada hacia la superficie polar, exterior, de la membrana. Los lípidos formadores de vesícula de este tipo típicamente incluyen una o dos cadenas de acil-hidrocarburo hidrofóbicas o un grupo esferoide, y pueden contener un grupo químicamente reactivo, tal como una amina, ácido, éster, aldehido o alcohol, en el grupo de cabeza polar. En esta clase están incluidos los fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina (PC) , fosfatidiletanolamina (PE) , ácido fosfatídico (PA) , fosfatidilinositol (Pl) , y esfingomielina (SM) , en los cuales las dos cadenas de hidrocarburo típicamente están entre 14-22 átomos de carbono de longitud aproximadamente, y tienen grados variables de instauración. También están incluidos dentro del alcance del término "lípidos formadores de vesícula" los glucolípidos, tales como cerebrósidos y gangliósidos . "Polímero hidrofílico" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a un polímero que tiene porciones solubles en agua, las cuales brindan al polímero cierto grado de solubilidad en agua a temperatura ambiente. Los polímeros hidrofílicos de ejemplo incluyen polivinilpirrolidona, éter polivinilmetílico, polimetiloxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropil-oxazolina, polihidroxipropil-metacrilamida, poli-metacrilamida, polidimetilacrilamida, polihidroxipropil-metacrilato, polihidroxietilacrilato, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polietilenglicol, poliaspartamida, copolímeros de los polímeros antes indicados, y copolímeros de óxido de polietileno-óxido de polipropileno. Las propiedades y reacciones con muchos de estos polímeros se describen en patentes E.U.A Nos. 5,395,619 y 5,631,018. Abreviaciones: DSC: calorimetría de barrido diferencial; PK: farmacocinética; T_./2 : tiempo de vida media de circulación en sangre; FTIR: espectroscopia en infrarrojo con transformadas de Fourier; Cp: Capacidad térmica; Tm: temperatura de transición de fase; ?HvH: entalpia de van't Hoff; CU: cooperatividad o unidad cooperativa; PC: fosfatidilcolina; PG: fosfatidilglicerol; PS: fosfatidilserina; PA: ácido fosfatídico; POPC: palmitoiloleoilfosfatidilcolina; HSPC: PC de soya completamente hidrogenada; PHEPC: PC-IV40 de huevo parcialmente hidrogenada; EPC: fosfatidilcolina de huevo; DOPC: dioleoilfosfatidilcolina; SOPC: estearoiloleoil-fosfatidilcolina; OPPC: oleolilpalmitoilfosfatidilcolina; OSPC: oleoil estearoilfosfatidilcolina; DOPG: dioleoilfosfatidilglicerol; DSPC: diestearoil-fosfatidilcolina; PEG: polietilenglicol.

II . Método de selección A. Medición de las propiedades térmicas Muchos de los métodos analíticos y dispositivos para medir o determinar las propiedades térmicas son conocidos y utilizados de manera rutinaria en la técnica. Los métodos representativos se discuten con mayor detalle más adelante; sin embargo, se apreciará que en la presente invención se puede utilizar cualquier técnica analítica que provea datos térmicos para una composición. 1. Calorimetría de barrido diferencial La calorimetría de barrido diferencial (DSC) es un método conocido en la técnica utilizado para medir la cantidad de energía (como calor) absorbida o liberada por una muestra a medida que ésta se calienta, enfría, o mantiene a una temperatura constante. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "mediciones de DSC" incluye también cálculos utilizando una propiedad medida de la muestra. Un método de ejemplo de medición de DSC utiliza un calorímetro de barrido diferencial. Cualquier calorímetro es adecuado en tanto que el intervalo de temperatura del calorímetro sea apropiado para las mediciones de la muestra. Un calorímetro de ejemplo es el calorímetro de barrido diferencial VP-DSC disponible de MicroCal (Northampton, MA, E.U.A.). Las aplicaciones típicas utilizando el calorímetro de barrido diferencial incluyen determinación de la temperatura de punto de fusión y/o el calor de fusión, medición de la temperatura de transición de vidrio, estudios de curado y cristalización, e identificación de transformaciones de fase. En la modalidad que utiliza un calorímetro de barrido diferencial para medir las propiedades termodinámicas de una suspensión lípida, el flujo térmico al interior de una muestra normalmente queda contenido en una celda para muestra y se mide en forma diferencial, es decir comparando el flujo térmico de la muestra con el flujo térmico en una celda de referencia que contiene un volumen igual de agua o el componente acuoso de la muestra. El flujo térmico se puede considerar como la cantidad de calor (q) suministrada por unidad de tiempo (t) , o q/t . Típicamente, ambas celdas se asientan dentro de una camisa metálica con una resistencia térmica (K) conocida (calibrada) . La temperatura del calorímetro se eleva linealmente con el tiempo (se barre) , en el cual la velocidad de calentamiento (ß = dT/dt) de las celdas se mantiene constante y consistente una con respecto a la otra. Se puede utilizar cualquier velocidad de calentamiento, sin embargo la velocidad de calentamiento de la muestra y de las celdas de referencia deben permanecer iguales, o similares. La temperatura se puede controlar en forma manual o automática. En una modalidad preferida, el control de temperatura está automatizado o computarizado. El calor fluye hacia el interior de las celdas mediante conducción desde una fuente térmica tal como un radiador. El flujo térmico hacia la celda de la muestra es más grande debido a la capacidad térmica (Cp) adicional de la muestra durante el curso de la transición de fase. La capacidad térmica se refiere al flujo de calor dividido entre la velocidad de calentamiento o Cp = q/?T, en la cual q es el calor, y ?T es el incremento en la temperatura. La diferencia en el flujo térmico (dq/dt) induce una diferencia de temperatura (dT) entre la muestra y las celdas de referencia. Esta diferencia de temperatura se mide utilizando cualquier detector apropiado, tal como un termopar, y se genera una señal representativa de la diferencia. La figura 3 muestra el termograma de flujo térmico contra temperatura (°C) para vesículas lípidas de DSPC sin un fármaco entrampado que muestra la transición gel-líquido-cristal, denominada también como la transición de fase principal. En esta figura, en un barrido de calentamiento, un evento endotérmico da como resultado una desviación positiva (ascendente) desde la línea basal. El pico principal (Tm = 54.4°C) está asociado con la transición de fase principal (es decir transición de fase gel-a líquido-cristal) . El pico más pequeño (identificado con Tp) es la pre-transición. La temperatura de fusión se observa en la gráfica de flujo térmico como un pico debido a que el calor es absorbido por la muestra hasta que se completa la transición de fase. Como será apreciado por los expertos en la técnica, la transición de fase principal se extiende a lo largo de un intervalo de temperatura, aunque este pico típicamente es muy agudo para la mayoría de lípidos formadores de vesícula, tales como DSPC, la Tm se puede reportar como el inicio de la transición, como el punto medio de la transición, la temperatura pico, o cualquier punto apropiado en tanto que se definan los parámetros. La Tm se reporta típicamente ya sea como la altura de pico máxima de la transición o un punto en el cual se presenta cierto porcentaje de la transición de fase, por ejemplo se presenta 40%, 50%, ó 60% de la transición de fase. Se apreciará que el por ciento exacto de transición de fase no es importante en tanto que éste sea definido. En casos en los que se utiliza una relación, sería deseable utilizar la misma relación para cada muestra para ayudar en la comparación entre las muestras. En los estudios reportados en la presente invención, la Tm se reporta como el pico máximo del intervalo de transición. Con referencia adicional a la figura 3, por encima de la Tm, las moléculas de la muestra se funden debido a que las cadenas de hidrocarburo del lípido están cambiando desde un estado tipo gel hacia un estado fluido. La capacidad térmica máxima del liposoma (Cpmax) se refiere a la función de capacidad térmica a la temperatura pico, Tm. El calor latente de fusión, o la entalpia de transición de fase calorimétrica (?Hca?) se puede determinar determinando primero el área (A) bajo el pico de conformidad con la siguiente fórmula: A = (calor en calorías) (temperatura en °Kelvin) / (tiempo en segundos) (masa en moles) .

El calor latente de fusión, es decir la entalpia calorimétrica, se puede determinar después mediante la siguiente ecuación: ?Hcal = (A/(q/t) )m, en la cual m es la masa de la muestra (moles) . En otras palabras, ?Hcal, se define como el área bajo el pico después de efectuar la sustracción de la línea basal, normalización de la velocidad de barrido, y normalización de la concentración. Las mediciones obtenidas mediante DSC se pueden utilizar de manera adicional para determinar o calcular parámetros termodinámicos útiles para la muestra, incluyendo la entalpia de van't Hoff (?HVH) y la unidad de cooperatividad (CU) . La entalpia de van't Hoff se calcula a partir de la siguiente ecuación ?HvH = (4R-Tm2Cpma?)?Hca?, en la cual Cpmax (kcal moles-1 K"1) es la función de capacidad térmica en el pico de transición de fase después de sustracción de línea basal y normalización de la concentración, Tm (K) es la temperatura pico, ?Hca? es la entalpia calorimétrica definida como la integral de la función de capacidad térmica después de sustracción de línea basal, y R es la constante de los gases (1.987 cal mol-1 K_1) (Biocalorimetery: Applications of Calorimetrv in the Biological Sciences, Ladbury y Chowdhry, Eds . , John Wiley & Sons) . La cooperatividad o unidad cooperativa (CU) se calcula con la siguiente ecuación: CU = ?HvH/?Hcal.

Como se ilustra más adelante, tanto CU como ?HVH son útiles para comparar el efecto de entrampar fármacos en un liposoma sobre las propiedades termodinámicas de la bicapa lípida. Como se indicó anteriormente, las bicapas de lípido son macro-estructuras que se auto-ensamblan, constituidas por una multitud de moléculas similares (lípidos) . La transición de fase después de calentar o enfriar la bicapa de lípido es un suceso cooperativo entre las moléculas de lípido. La CU se puede considerar como una medida de la libertad de comunicación entre las moléculas de lípido de la bicapa lípida. Se apreciará que se pueden determinar otros datos a partir de las mediciones de DSC incluyendo, pero sin limitarse a, la anchura de la transición de fase a la mitad de la altura (?Tm_./2) , la anchura de transición de fase completa (?Tm) , la temperatura de transición y la entalpia de la pre-transición (Tp y ?HP) , etc. En una modalidad preferida, se utilizan instrumentos de DSC de alta sensibilidad debido a que estos pueden proveer perfiles de transición de fase más sensibles y exactos del lípido. Esto puede ser importante cuando las interacciones del fármaco y el lípido son débiles y los instrumentos de DSC de baja sensibilidad podrían no ser adecuados para resolver los cambios finos en el perfil de transición de fase. 2. Espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier La espectroscopia infrarroja con transformadas de Fourier (FTIR) es una técnica analítica utilizada típicamente para identificar materiales orgánicos e inorgánicos. Esta técnica mide la absorción de diversas longitudes de onda de luz infrarroja por el material de interés. Esta técnica se utiliza para identificar información térmica para el material de interés, tal como la temperatura de transición de fase principal y la anchura de la transición de fase. 3. Espectroscopia de electrón para análisis químico La espectroscopia de electrón para análisis químico (ESCA) , también conocida como espectroscopia de foto-electrón de rayos X o XPS, es una técnica de análisis de superficie utilizada para obtener información química acerca de las superficies de los materiales sólidos. El método utiliza un haz de rayos X para excitar una muestra lo que da como resultado la emisión de foto-electrones. Un análisis de energía de estos foto-electrones provee datos térmicos para la muestra (http://www.innovatechlabs.com). Se apreciará que son apropiadas cualquier número de otras técnicas o dispositivos analíticos para medir o determinar la propiedad térmica, incluyendo, pero sin limitarse a, un analizador térmico simultáneo (STA) , un analizador termo-mecánico (TMA) , un dilatómetro, termo-gravimetría (TG o TGA) , resonancia para magnética electrónica (EPR) , y un analizador mecánico dinámico (DMA) .

B. Correlación de mediciones térmicas En una modalidad, el presente método es útil para generar una correlación entre por lo menos una propiedad térmica de un vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico y una propiedad farmacocinética (PK) . En una modalidad preferida, el método es útil para generar una correlación entre por lo menos una propiedad térmica de un vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico y el tiempo de vida media in vivo. En otra modalidad, el método es útil para generar una correlación entre el tiempo de vida media in vivo de un vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico y la entalpia de van't Hoff, la unidad cooperativa y/o la anchura del pico de temperatura de transición de fase principal. Se apreciará que el experto en la técnica está muy familiarizado con la determinación de propiedades farmacocinéticas a través de estudios farmacocinéticos. A continuación se describen brevemente los estudios farmacocinéticos. Los estudios farmacocinéticos están diseñados para identificar y evaluar uno o más de los conceptos farmacológicos básicos: absorción (para administración extravascular) , distribución, metabolismo, y excreción. Se apreciará que no se determinan las propiedades de absorción de un fármaco mediante métodos de administración intravasculares, incluyendo administración intravenosa, debido a que el fármaco se administra directamente a la sangre y por lo tanto, no se absorbe en el torrente sanguíneo. Además, se puede estudiar la relación entre dosis, concentración en plasma, y efectos terapéuticos o tóxicos. Los estudios farmacocinéticos se utilizan para evaluar la eficacia y toxicidad de un agente terapéutico así como para determinar la dosificación, vía de administración, y programación para tratamiento. Los estudios farmacocinéticos de la velocidad de absorción, distribución, metabolismo, y excreción por lo general se pueden determinar a partir de datos de concentración en plasma/sangre con respecto al tiempo después de la administración. Sin estar limitado a la teoría, se cree que los agentes terapéuticos que muestran interacción incrementada con el lípido afectan el tiempo de vida media in vivo de la composición liposómica. El mecanismo de liberación de fármaco a partir de los liposomas STEALTH® se puede entender utilizando la ley de difusión de Fick: J = -D * D C/Dx, en la cual J es la salida de fármaco y D es el coeficiente de difusión. Con el fin de prolongar la circulación en sangre (es decir, para reducir la salida de fármaco, J) , una opción es reducir el valor del coeficiente de difusión, D, lo cual se puede lograr utilizando lípidos que formen bicapas sólidas. Para una composición de lípido y condiciones internas liposómicas dadas, el coeficiente de difusión del fármaco queda determinado por la naturaleza intrínseca de las interacciones fármaco-lípido. La otra opción para prolongar la circulación en sangre es la de reducir al mínimo la concentración de fármaco libre dentro de los liposomas, lo cual se puede lograr formando precipitados de fármaco utilizando reactivos fuertes para precipitación . Como se explica en forma más detallada en el ejemplo 2, los liposomas de DSPC que contienen varios fármacos (doxorubicina, CKD602, vincristina, ciprofloxacina, o paclitaxel) se miden utilizando VP-DSC. Como se observa en las figuras 1A-1D, se compara el efecto sobre la transición de fase de entrampar cada uno de doxorubicina, CKD602, vincristina, ciprofloxacina, o paclitaxel en liposomas de DSPC (línea continua) con un termograma para liposomas de DSPC vacíos como un control (línea punteada) . De debe indicar que los liposomas preparados de conformidad con la presente invención se formulan utilizando lípidos puros para reducir la interferencia proveniente de elementos adicionales . Se utiliza DSPC en este estudio, debido a que todos los liposomas STEALTH® se preparan ya sea con DSPC o HSPC como el lípido principal formador de bicapa (excepto para paclitaxel) . El compuesto HSPC (PC de soya completamente hidrogenada) es muy similar a DSPC con respecto a sus propiedades físicas y químicas. Se pueden obtener conclusiones similares si se utiliza HSPC con base al ejemplo de DSPC. En este estudio también se excluye al colesterol debido a que se sabe que el colesterol amplia de manera significativa el pico de transición de fase de los fosfolípidos de modo tal que el efecto de la presencia del fármaco se pierde totalmente. Sin embargo, el uso de estas formulaciones de lípido puro es predictiva de formulaciones típicas que incluyen esteróles tales como colesterol y de formulaciones que incluyen lípidos transformados en derivados con un polímero hidrofílico. El tiempo de vida media de circulación en sangre in vivo (T?/2) en ratas después de la inyección intravenosa para cada uno de los fármacos entrampados en liposomas STEALTH® se conoce y se presenta en el siguiente cuadro 1 junto con las composiciones de lípido. Los datos del termograma para las mezclas acuosas de fármaco-DSPC se presentan en los cuadros 2a y 2b.

CUADRO 1 Tiempo de vida media de circulación en sangre para liposomas STEALTH® con diversos fármacos cargados y liposomas de placebo con lxlIn como la marca radioactiva CUADRO 2a Tiempo de vida media de circulación en sangre de formulaciones de liposoma STEALTH® y parámetros termodinámicos para DSPC con varios fármacos y liposomas de placebo con radio-marca 11:LIn a pH 3 . 6 .

CUADRO 2a (cont.) CUADRO 2b Tiempo de vida media de circulación en sangre de formulaciones de liposoma STEALTH® y parámetros termodinámicos para DSPC con varios fármacos y liposomas de placebo con radio-marca 11:LIn a pH 7.0.

Como se observa en la figura 1A, una comparación de los termogramas muestra una curva de transición de fase similar para la mezcla de DSPC/doxorubicina (línea continua) y los liposomas de control (línea punteada) lo que indica que doxorubicina mantiene una interacción débil con la bicapa. Estos datos son consistentes con el tiempo de vida media in vivo para formulaciones STEALTH® cargadas con doxorubicina de aproximadamente 26.5+4.6 horas (un promedio obtenido a partir de por lo menos 4 estudios separados), véase cuadro 1. De igual manera, como se observa en la figura ID, la curva de transición de fase para la mezcla de DSPC/paclitaxel (línea continua) muestra desviación significativa de la DSPC de control (línea punteada) , lo que indica interacción significativa de placitaxel con la bicapa de lípido. Esta desviación es reflejada por un tiempo de vida media más bajo in vivo de 0.2 horas. Por lo tanto, la desviación de la curva de la muestra a partir de un control indica una interacción más fuerte del fármaco con la bicapa de lípido. Como se observa en las figuras IB y 1C, los datos de termograma para mezclas de DSPC con CKD602, o vincristina (línea continua) muestran grados variables de desviación a partir del control de DSPC (línea punteada) que las de liposomas cargados con doxorubicina, pero una desviación menor que la de liposomas cargados con paclitaxel. Estos datos indican que CKD602 y vincristina presentan cada uno cierta interacción con la bicapa de lípido. Esta desviación intermedia se refleja en un tiempo de vida media in vivo entre aquel conocido para liposomas cargados con doxorubicina y liposomas cargados con paclitaxel. Se espera que, en la mayoría de los casos, una mayor desviación a partir del control indique una mayor interacción del fármaco con la bicapa. De aquí en adelante, se discute la correlación de los datos de DSC con el tiempo de vida media in vivo . Sin embargo, se apreciará que la correlación de los datos de DSC con otro parámetro farmacocinético tal como ABC (área bajo la curva) , eliminación o el volumen aparente de distribución está dentro del alcance del presente método y dentro de la habilidad del experto en la técnica. En una modalidad, el método incluye generar una correlación entre por lo menos una propiedad térmica de un vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico y el tiempo de vida media de circulación en sangre in vivo del vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico. En esta modalidad, el método incluye medir por lo menos una propiedad térmica de vehículos liposómicos similares en presencia de por lo menos dos agentes terapéuticos, por separado. Se genera por lo menos una referencia que correlaciona un intervalo de circulación en sangre in vivo con por lo menos una propiedad térmica. En una modalidad preferida, la propiedad térmica se mide mediante calorimetría de barrido diferencial. Se apreciará que se puede utilizar una correlación generada para un vehículo liposómico para predecir las propiedades farmacocinéticas de un vehículo liposómico diferente en casos en los cuales los vehículos liposómicos son similares en cuanto a estructura y propiedades. Como se describe en el ejemplo 3, se forman formulaciones de liposoma de DSPC que contienen paclitaxel, vincristina, CKD602, ciprofloxacina, o doxorubicina. Las mediciones de DSC se utilizan para determinar la temperatura de transición de fase principal (Tm) , entalpia (?Hcal) , capacidad térmica (Cp) , y anchura de pico de transición a la mitad de la altura (?Tml/2) . La entalpia de van't Hoff (?HVH) y la unidad de cooperatividad (CU) se calculan a partir de las mediciones de DSC. Las mediciones de DSC se efectúan a dos condiciones de regulación de pH (pH 3.6 y pH 7.0) utilizando la misma relación molar fármaco a lípido de 1:5 para cada composición de liposoma. Las mediciones de DSC se efectúan en un intervalo de temperatura entre 30-65 °C a una velocidad de barrido de 20°C/hora y los resultados se muestran en los cuadros 2a y 2b. Para los datos de DSC de los cuadros 2a y 2b, se efectúan correlaciones bivariantes para T1/2 conocido y la Tm, ?Hca?, Cpma?, ?Tm_./2, ?HvH/- y la CU y los resultados se muestran en el cuadro 3 y 4, respectivamente. Se apreciará que se pueden hacer correlaciones multi-variantes para cualquiera de los datos térmicos obtenidos con cualquier propiedad farmacocinética.

CUADRO 3 Correlación bivariante a pH 3.6 analizada utilizando el software JMP 5.0.1a (SAS) CUADRO 4 Correlación bivariante a pH 7.0 analizada utilizando el software JMP 5.0.1a (SAS) Como se observa a partir de los cuadros anteriores, ?HV__.- CU, ?Tm_?2, y Cpmax muestran cada uno correlación significativa con el tiempo de vida media in vivo conocido a pH 3.6. Sin estar limitado a la teoría, esto puede indicar que el paso limitativo de liberación de fármaco desde los liposomas es la partición de las moléculas de fármaco en la membrana de bicapa desde el centro acuoso interno liposómico. Como se observa en las figuras 4A-5B, se preparan gráficas de dispersión bivariantes para el T?/2 contra ?HvH y CU, respectivamente a pH 3.6 ó 7.0. Los resultados indican que T_./2 tiene la mejor correlación con ?HVH al pH bajo. Esta correlación se puede utilizar para predecir el tiempo de vida media in vivo de un agente terapéutico desconocido si se carga en liposomas STEALTH® tomando como base los datos de ?HVH generados para liposomas de DSPC que incluyen un agente entrampado, en el cual se conoce el tiempo de vida media in vivo. Se apreciará que se pueden correlacionar una o más propiedades térmicas con los datos de PK para los propósitos de esta invención. Como se observó anteriormente existe también una correlación excelente entre CU y T_./2 para los liposomas preparados en el ejemplo 3. También se apreciará que otros métodos para generar la correlación entre la propiedad térmica y los datos de PK están dentro de la habilidad del experto en la técnica. Como se observa en las figuras 6A y 6B, se preparan gráficas de dispersión multi-variantes para el T_?2 contra los datos de DSC para cada uno de los liposomas preparados en el ejemplo 3. Como se observa en las figuras 4A-5B, o de manera más clara en los resultados en el ejemplo 3, una gráfica del tiempo de vida media in vivo de PK (en horas) contra cualquiera del ?HvH o la CU produce correlaciones lineales . T1/2 = -16.43 + 0.056 ?HvH T12 = -8.054 + 0.429 CU Se apreciará que el cálculo de la pendiente de cualquier correlación generada está dentro de la habilidad del experto en la técnica tomando como base la ordenada al origen "y" utilizando la ecuación y = mx + b, en la cual x y "y" son las coordenadas de un punto en la línea y b es la ordenada al origen "y". En una modalidad, la invención contempla la generación de un intervalo tomando como base la pendiente de la línea. En una modalidad, este intervalo se desvía (+ y/o -) 10% aproximadamente de la pendiente real de la línea. En otras modalidades, este intervalo puede desviarse (+ y/o -) 15%, 20%, 25% o más aproximadamente, de la pendiente de la línea. Como se puede observar a partir de las gráficas, mientras más alto sea el valor de ?HvH, o CU, mayor será el tiempo de vida media observado. Esta curva, lineal o de alguna otra forma, se puede utilizar para predecir el tiempo de vida media in vivo para el vehículo liposómico potencial en presencia del agente terapéutico. Esta bien establecido que la transición de bicapa lípida se presenta sustancialmente al unísono a diferencia de la transición de proteína en la cual la transición se presenta en forma monomérica dando origen a un pico de transición amplio. En el caso de la transición de bicapa, se cree que las moléculas de lípido efectúan la transición desde forma de gel a líquido cristalino colectivamente y cualquier desviación en la transición indica la presencia de una interacción fuerte de las bicapas con "materia extraña" en el sistema. Como se observa en las figuras 5A y 5B, los datos para pH 7.0 muestran correlación menos significativa en comparación con los datos para pH 3.6, sin embargo, aún se pueden obtener cierto entendimiento con respecto a la interacción entre la bicapa de lípido y el fármaco a partir de los datos así como una correlación lineal para predicción de las propiedades farmacocinéticas. Sin desear estar limitado a la teoría, puede ser que la disociación de fármaco desde la superficie externa del liposoma desempeña una función menor o más débil en la liberación o retención de fármaco . En otra modalidad, la invención contempla un método para predecir el tiempo de vida media de circulación en sangre in vivo de un vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico. En esta modalidad, se selecciona un vehículo liposómico y por lo menos se determina una propiedad térmica del vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico mediante calorimetría de barrido diferencial. Se genera una correlación para el vehículo liposómico. Después de esto, se pueden comparar las mediciones de DSC para un vehículo liposómico subsiguiente en presencia de un agente terapéutico con la correlación generada para predecir el tiempo de vida media in vivo con base en la correlación. Se apreciará que la correlación se puede generar como se describió anteriormente, o mediante cualesquiera medios apropiados.

III. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran pero no pretenden de ninguna manera limitar la invención Materiales y métodos DSPC se obtiene a partir de Avanti Polar Lipids, (Birmingham, AL) .

EJEMPLO 1 Preparación de liposomas Los liposomas se pueden preparar utilizando una variedad de técnicas, tales como aquellas detalladas en Szoka, F. , Jr., et al . , (Ann . Rev. Biophys . Bioeng. ): 467 (1980) ) . Típicamente, los liposomas son vesículas multi-laminares (MLV) , las cuales se pueden formar mediante técnicas sencillas de hidratación de película lípida. En este procedimiento, se disuelven una mezcla de lípidos formadores de liposomas, incluyendo un lípido formador de vesícula transformado en derivado con un polímero hidrofílico cuando se desee, en un solvente orgánico apropiado, el cual se evapora en un recipiente para formar una película delgada seca. La película se cubre después con un medio acuoso para formar las MLV, típicamente con tamaños entre 0.1 a 10 mieras aproximadamente. Los ejemplos de métodos para preparar lípidos transformados en derivados y para formar liposomas revestidos con polímero se describen en las patente E.U.A. mancomunadas Nos. 5,013,556, 5,631,018 y 5,395,619, de las cuales todas se incorporan para referencia en la presente invención. El agente terapéutico se puede incorporar en los liposomas utilizando métodos estándar, incluyendo (i) entrampamiento pasivo de un compuesto lipofílico hidratando una película lípida que contiene al agente, (ii) cargar un fármaco ionizable contra un gradiente de ion de liposoma interior/exterior, denominado carga remota como se describe en las patentes E.U.A Nos. 5,192,549 y 6,355,268, de las-cuales ambas se incorporan en la presente invención para referencia y (iii) cargar un fármaco contra un gradiente de pH interior/exterior. Si la carga de fármaco no es efectiva para agotar sustancialmente el medio externo de fármaco libre, la suspensión de liposomas se puede tratar, después de cargar el fármaco, para eliminar el fármaco no encapsulado .

EJEMPLO 2 Preparación de liposomas de DSPC Se preparan liposomas constituidos por fosfolípido saturado DSPC utilizando el método de hidratación de película delgada como el descrito en el ejemplo 1. Brevemente, se pesan 6.3 mM de lípido en un matraz y se disuelven en mezclas de cloroformo :metanol (9:1 v/v) y la mezcla de solvente se evapora a 70°C aproximadamente, al vacío utilizando un evaporador giratorio para formar una película delgada uniforme de lípido. La película de lípido se mantiene durante la noche bajo un vacío elevado para asegurar la remoción completa de los vestigios de solvente. La película lípida se hidrata a 60 °C utilizando 20 mM de una solución reguladora de fosfatos para obtener los liposomas de control. Para la preparación de liposomas cargados con doxorubicina, CKD602, vincristina, y ciprofloxacina (fármacos solubles en agua) el fármaco se disuelve en la solución reguladora para hidratación de modo tal que los liposomas resultantes tengan una relación de lípido : fármaco de 1:5 (mol/mol) . Para la preparación de liposomas cargados con paclitaxel (insoluble en agua) , el lípido y el fármaco se disuelven en forma conjunta en la mezcla de solvente de modo tal que los liposomas resultantes tengan una relación lípido: fármaco de 1:5 (mol/mol) . Los liposomas resultantes tienen una relación molar de fármaco a lípido de 1 a 5. El fármaco libre no se elimina de la suspensión.

EJEMPLO 3 Mediciones de calorimetría de barrido diferencial y análisis estadístico Se preparan liposomas constituidos únicamente por DSPC como se describe en el ejemplo 2 con CKD602, doxorubicina, vincristina, ciprofloxocina, o paclitaxel entrampados . Las mediciones de DSC se obtienen con un aparato VP-DSC disponible de MicroCal (Northampton, MA) a una velocidad de calentamiento de 20°C/hora. Los datos se analizan utilizando software de origen y software estadístico JMP5.0.1. Las mediciones se efectúan a partir de los liposomas asociados a fármaco sin remover el fármaco libre. Las mediciones de DSC y los termogramas se registran en condiciones de pH acidas y neutras, en específico, pH 3.6 y pH 3.0 con el fin de simular las condiciones interna y externas del liposoma. Se miden la temperatura de transición de fase principal (Tm) , entalpia (?H) , capacidad térmica (Cpl/2) anchura del pico de temperatura de transición de fase (Tm_./2) , y temperatura del pico de temperatura de fase (Tp) y se calculan la entalpia de van't Hoff (?HVH) y cooperatividad (Coop) . Estos resultados se presentan en forma detallada en los cuadros 4 y 5, respectivamente.

CUADRO 4 Parámetros de DSC de las MLV de DSPC con diversos fármacos a pH 3.6 CUADRO 5 Parámetros de DSC de las MVL de DSPC con diversos fármacos Se efectúa el análisis estadístico de ?HH y CU para correlacionar los datos con T_./2 utilizando el programa JMP5.0.1. Los resultados se muestran en las figuras 4A-5B.

Un resumen de los resultados para ?HVH a pH 3.6 se presenta en los siguientes cuadros 6a-6b. En los cuadros 7a-7c, siguientes, se presenta un resumen de los resultados para ?HvH a pH 7.0.

Se preparan matrices de gráfica de dispersión bivariantes de correlaciones de ?HvH o CU contra el tiempo de vida media de circulación (T_./2) para fármacos entrampados en liposoma a pH 3.6 y 7.0 y se presentan en las figuras 4A-4B y en las figuras 5A-5B, respectivamente. Se preparan matrices de gráfica dispersión ulti-variantes de las correlaciones de los parámetros de DSC y el tiempo de vida media de circulación (T1/2) para fármacos entrampado en liposomas a pH 3.6 y 7.0 y se presentan en las figuras 6A-6B, respectivamente.

Ajuste lineal para la figura 4A 12 = -16.43 + 0.056 ?HvH CUADRO 6a Resumen del ajuste para pH 3.6 Raíz cuadrada 0.889218 Raíz cuadrada ajustada 0.852291 CUADRO 6a (cont.) Error de la raíz cuadrada de la media 3.546925 Promedio de respuesta 15.67 Observaciones (o pesos de la suma) 5 CUADRO 6b Análisis de varianza para pH 3.6 Fuente DF Suma de Cuadrado de Relación F cuadrados la media Modelo 1 302.94598 302.946 24.0803 Error 3 37.74202 12.581 Prob > F C. 4 340.68800 0.0162 Total CUADRO 6c Parámetros estimados para pH 3.6 Término Estimación Error Relación t prob >|t estándar Intersección -16.42733 6.730503 -2.44 0.0924 Delta 0.56263 0.011465 4.91 0.0162 HvH Ajuste lineal para la figura 4B T1/2 = -8.054+ 0.429 CU CUADRO 7a Resumen del ajuste para pH 7.0 Raíz cuadrada 0.920349 Raíz cuadrada ajustada 0.893799 Error de la raíz cuadrada de la media 3.007548 Promedio de respuesta 15.67 Observaciones (o pesos de la suma) 5 CUADRO 7b Análisis de varianza para pH 7.0 Fuente DF Suma de Cuadrado de Relación '. cuadrados la media Modelo 1 313.55196 313.552 34.6644 Error 3 27.13604 9.045 Prob > F C. 4 340.68800 0.0098 Total CUADRO 7c Parámetros estimados para pH 7.0 Término Estimación Error Relación t Prob >|t estándar Intersección -8.054354 4.248061 -1.90 0.1542 CU 0.4289318 0.072853 5.89 0.0098 Aunque la invención anterior se ha descrito con respecto a modalidades particulares, será evidente para los expertos en la técnica que se pueden efectuar varios cambios y modificaciones sin alejarse de la invención.

Claims (12)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. - Un método para generar una correlación entre por lo menos una propiedad térmica de un vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico y una propiedad farmacocinética para el vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico que comprende: medir por lo menos una propiedad térmica de dicho vehículo liposómico en presencia de un primer agente terapéutico; medir por lo menos una propiedad térmica de dicho vehículo liposómico en presencia de un segundo agente terapéutico; generar por lo menos una referencia que correlaciona un intervalo de valores para la propiedad farmacocinética con dicha por lo menos una propiedad térmica.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha propiedad farmacocinética es un tiempo de vida media in vivo . 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicha medición incluye determinar la propiedad térmica con una técnica analítica. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque dicha técnica analítica es una calorimetría de barrido diferencial. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 3 6 4, caracterizado porque dicha propiedad térmica es una temperatura de transición de fase. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque dicha transición de fase (Tm) se mide a la altura del pico. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la integral bajo el pico para la transición de fase, para el agente terapéutico mezclado con el lípido modelo en una relación de alrededor de a 1:5 molar, un pH 3.6 aproximadamente, y una velocidad de barrido de DSC de 20°C/hora aproximadamente, y (2) calcular el ?H, a partir de la ecuación: [(4*R*T 2*Cpmax)]/?Hcal], en la cual R es la constante de los gases (1.9872 cal/mol*K) y la entalpia corresponde a la integral. 8. - Un método para predecir una propiedad farmacocinética de un vehículo liposómico en presencia de un agente terapéutico, comprende: seleccionar el vehículo liposómico; determinar por lo menos una propiedad térmica del vehículo liposómico en presencia del agente terapéutico utilizando una técnica analítica; comparar dicha por lo menos una propiedad térmica con una correlación generada para dicho vehículo liposómico; y determinar la propiedad farmacocinética del vehículo liposómico en presencia del agente terapéutico. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque dicha propiedad farmacocinética es un tiempo de vida media de circulación en sangre in vivo . 10.- El método de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque dicha técnica analítica es calorimetría de barrido diferencial. 11.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque dicho por lo menos una propiedad térmica es un valor de entalpia de van't Hoff (?HVH) calculado. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque ?HvH, se calcula a partir de la ecuación [ (4*R*Tm2*Cpma?) ] /?Hca?] , en la cual R es la constante universal de los gases (1.9872 cal/mol*K) , Tm es la transición de fase del agente terapéutico en presencia del lípido, Cpmax es la capacidad térmica en el pico de la transición y la entalpia calorimétrica, ?Hca? es la integral bajo el pico para la transición de fase y Tm, Cpmax/- y ?HCai, se determinan a partir de un trazo de calorimetría de barrido diferencial para una mezcla del agente terapéutico y del vehículo liposómico, a pH 3.6 y a una velocidad de barrido de 20°C/hora.