DE69923315T2

DE69923315T2 - Verfahren zur herstellung von liposomen

Info

Publication number: DE69923315T2
Application number: DE69923315T
Authority: DE
Inventors: Gregory Gregoriadis; Brahim Zadi; Nalaka Pramukh JAYASEKERA
Original assignee: UK Secretary of State for Defence
Current assignee: UK Secretary of State for Defence
Priority date: 1998-06-18
Filing date: 1999-06-16
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2019-06-17
Also published as: GB0030767D0; GB9813100D0; RU2216315C2; US9675554B1; KR100658956B1; DE69923315D1; CA2335183A1; AU749499B2; NO20006442L; EP1087754B1; EP1087754A1; GB2354166B; ZA200007507B; GB2354166A; WO1999065465A1; CN1312707A; NZ508960A; AU4518099A; ATE287258T1; KR20010053006A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bilden von Liposomen, Liposomen, die dadurch erhalten werden, und ihre Verwendung insbesondere bei pharmazeutischen Anwendungen.
Die Verwendung von Liposomen ist auf einer breiten Vielzahl von Gebieten gut bekannt, einschließlich der pharmazeutischen und kosmetischen Gebiete, wo sie als Träger für Arzneimittel und andere Reagentien verwendet werden, die zum Aufbringen auf die Haut geeignet sind.
Zur Herstellung von Liposomen sind verschiedene Verfahren bekannt. Beispielsweise können sie durch eine Dehydrierungs-/Rehydrierungstechnik hergestellt werden, wobei ein Lipid in einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, Dichlormethan, oder einem Alkohol, wie Methanol oder Ethanol, gelöst wird. Anschließend wird die Lösung beispielsweise unter Verwendung eines Rotationsverdampfers getrocknet, um einen Lipidfilm auf der Wand des Verdampfergefäßes zu bilden. Die Zugabe von Wasser oder einer wässrigen Lösung, wie ein Puffer, zu dem trockenen Film führt zur Bildung von multilamellaren Liposomen. Dies bildet einen ersten Schritt bei der Herstellung von Vesikeln unter Anwendung verschiedener Verfahren. Die anschließende Behandlung kann zur Dehydrierung/Rehydrierung von Vesikeln oder DRVs führen (Kirby und Gregoriadis, Biotechnology (1984) 2, 979–984). Die anschließende Behandlung durch Ultrabeschallung der Lipidsuspensionen unter Bildung von beispielsweise unilamellaren Liposomen ist eine Alternative (A. D. Bangham et al., J. Mol. Biol. 13, 238 (1965)).
Weitere Verfahren, die alle in der Technik gut dokumentiert sind, umfassen Detergens-Entfernung (Y. Kagawa et al., J. Biol. Chem. (1971 246, 5477), Umkehrphasen-Eindampfen (F. Szoka und D. Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1978) 75, 4194) und Etherinjektion (D. Deamer et al., Biochim. Biophys. Acta, (1976) 433, 629) sowie Gefriertrocknungsverfahren (siehe z.B. Ohsawa et al., Chem. Pharm. Bull, (1984) 32, 2442–5 und Kirby und Gregoriadis (1984) supra) und Frost-Tau-Prozesse (D. D. Lasic "Liposomes: from Physics to Application, Elsevier, 1993, S. 98).
Die verschiedenen Herstellungsverfahren führen zu Liposomen unterschiedlicher Größe und anderer Merkmale. Liposomen können zur Einkapselung von Materialien, wie biologisch aktive Materialien, wie Pharmazeutika, einschließlich von Impfstoffen sowie nicht pharmazeutischen Mitteln, wie Materialien, die Einfluss auf die Haut nehmen, wie künstliche Bräunungspräparate oder andere Schönheitsmittel, verwendet werden. Die Einkapselungstechniken variieren je nach Natur des einzukapselnden Reagens und Größe und Merkmalen des erzeugten Liposoms.
Die Größe der Liposomen ist hinsichtlich ihrer Anwendung wichtig. Bei einigen Fällen können große Liposomen erforderlich sein, beispielsweise wo Teilchen, die Mikroorganismen wie Bakterien einschließen, beispielsweise zum Impfstoffgebrauch, wie in der WO 95/09610 beschrieben, einzukapseln sind.
Für viele Anwendungen sind allerdings kleine Liposomen bevorzugt. Der Grund hierfür besteht darin, dass kleine Liposomen im Vergleich zu großen Liposomen (über 200 nm groß) durch das reticuloendotheliale System (RES) weniger schnell und zu einem geringeren Ausmaß entfernt werden. Die Aufnahme durch das RES erhöht sich mit der Größe der Vesikel. Außerdem sind große Liposomen, die in tramuskulär injiziert werden, nicht in der Lage, die regionalen Lymphknoten mit guter Effizienz zu erreichen und Impfstoffe und andere Mittel an diesen Stellen abzugeben (Gregoriadis G. Liposomes as Drug Carriers: Recent Trends and Progress, Wiley Chichester 1988).
Liposomen-Formulierungen verschiedener Arzneimittel können bezüglich Arzneimittelgehalt, Stabilität, Biodistributionsmustern und Zellaufnahme durch Veränderung der physiochemischen Parameter der Liposomen, wie Phasenübergangstemperatur, Größe, Größenverteilung, Oberflächenladung, Oberflächenhydratation mit Verbindungen, die lipophile Gruppen tragen, und Größenverteilung, optimiert werden.
Die Liposomengröße ist ein Parameter, der die durch das RES beseitigte Fraktion festlegt (Senior et al., Biochem. Biophys. Acta (1985) 839, 1–8; Nagayasu et al., Biol. Pharm. Bull. (1995), 18 (7), 1020–1023). Kleine Liposomen können unter Verwendung von Hochdruckhomogenisatoren hergestellt werden (Talsma et al., Drug Development and Industrial Pharmacy (1989), 15 (2), 197–207, Vemuri S. et al., Drug Development and Industrial Pharmacy (1990) 16 (15), 2243–2256), allerdings wurden bisher große Mengen an Lipiden verwendet, um ein annehmbares eingeschlossenes Arzneimittel-zu-Lipid-Masseverhältnis zu erreichen. Ein anderer Weg (Gregoriadis et al., Int. J. Pharm. 65 (1990) 235–242), die Mikrofluidisierung von multilamellaren dehydrierten/rehydrierten Vesikeln (DRVS) in Gegenwart eines nicht eingekapselten Arzneimittels, erzeugte Vesikel mit Größen von weniger als 200 nm, wobei Mengen des ursprünglich eingeschlossenen gelösten Stoffs beibehalten wurden.
Die Vesikel-Stabilisierungswirkung der Zugabe von Zucker nach der Herstellung von Liposomen wurde bereits bewiesen (Crowe L. M. et al., Arch. Biochem. Biophys. 242 (1985) 240–247, Hauser et al., Biochem. Biophys. Acta (1987) 897, 331–334), beispielsweise wenn Arzneimittel enthaltende Liposomen zur Aufbewahrung gefriergetrocknet und sodann zur Verwendung rehydratisiert werden.
WO-A-9735561 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung eines Reagens, wobei das Verfahren die Schritte umfasst

(i) Bilden von leeren Liposomen
(ii) Mischen der Liposomen aus Schritt (i) mit einer Zuckerlösung und einem Reagens; und
(iii) Trocknen des Gemisches aus Schritt (ii).

EP 0800822 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung aus einem Regens, wobei das Verfahren umfasst

(i) Bilden von leeren Liposomen
(ii) Mischen mit einem Reagens und Füllen der Liposomen
(iii) Mischen der gefüllten Liposomen mit einer Zuckerlösung
(iv) Trocknen des Gemisches.

US 4,883,665 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung eines Reagens, wobei das Verfahren umfasst

(i) Bilden von gefüllten Liposomen, die Zucker und Reagens enthalten
(ii) Mischen der gefüllten Liposomen mit einer Zuckerlösung
(iii) Trocknen des Gemisches aus (ii).

WO86/01103 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung aus einem Reagens, wobei das Verfahren umfasst

(i) Bilden von leeren Liposomen
(ii) Mischen mit einer Zuckerlösung
(iii) Trocknen des Gemisches aus (ii)
(iv) Mischen mit einem in die Liposomen einzufüllenden Reagens.

Die Anmelder haben einen verbesserten Weg der Herstellung von Liposomen und insbesondere von kleinen Liposomen gefunden, der die Anzahl der Herstellungsschritte vermindert und stabile Liposomen mit hoher Einschlusseffizienz bildet.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Herstellung einer Liposomen-Zubereitung bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(i) Bilden von leeren Liposomen;
(ii) Mischen der Liposomen aus Schritt (i) mit einer Zuckerlösung und einem Wirkstoff; und
(iii) Trocknen des Gemisches aus Schritt (ii);

Bei Rehydratation des getrockneten Materials aus Schritt (iii) werden Liposomen gebildet, die den Wirkstoff einkapseln. Die Zunahme in der Größe der so erhaltenen Liposomen im Vergleich mit den in Schritt (i) erhaltenen Liposomen ist viel geringer im Vergleich zu den Liposomen in Zubereitungen, die keinen Zucker einschließen. Die Notwendigkeit weiterer Extrusions-, Mikrofluidisierungs-, oder Homogenisierungsschritte, wie vorstehend ausgeführt, kann somit vermieden werden.
Es wurde bewiesen, dass während des Trocknens in Gegenwart von entsprechenden Konzentrationen an Zuckern die Kondensation und Aggregation von Liposomen in einem gewissen Ausmaß durch die Bildung eines amorphen Glases (Crowe et al., Arch. Biochem. Biophys. 242 (1985) 240–247) und die Wechselwirkung des Zuckers mit den Phospholipid-Kopfgruppen (Crowe et al., Cryobiology 31 (1994) 355–366) verhindert wird. Bei früheren Studien wurde die Dehydratation/Rehydratation von Vesikeln (DRV) ohne Verwendung von Zuckern als Stabilisatoren durchgeführt, wobei das Verfahren auf der Auslösung der Kondensation/Aggregation der hergestellten kleinen unilamellaren Vesikel unter kontrollierter Rehydratation beruhte (Kirby Gregoriadis, 1984). Auf dieser Grundlage konnte vorhergesagt werden, dass die Gesamtstabilisierung von kleinen unilamellaren Vesikeln durch die Gegenwart entsprechender Mengen von Zuckern bei der Rekonstitution zu den unsprünglichen SUV zu einem sehr geringen Einschluss führt.
Unerwarteterweise wurde gefunden, dass dies nicht der Fall ist. Obwohl wie bei sämtlichen Liposomen der Reagens-Einschlussgrad zu einem gewissen Ausmaß von dem Verhältnis Lipid:Reagens in dem System abhängt, wird erwartet, dass die Menge des Reagens, das in den Liposomen eingekapselt ist, die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden, gut ist.
Außerdem ist die physikalische und chemische Stabilität der Liposomen für ihre Anwendung als Arzneimittelabgabesystem erforderlich. Liposomen im Zustand von wässrigen Dispersionen unterliegen der Hydrolyse und physikalischen Änderungen während der Lagerung, einschließlich Auslecken der eingekapselten Arzneimittel und Änderungen in der Vesikelgröße auf Grund von Aggregation oder Kondensation. Die physikalische und chemische Stabilität der Liposomen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden, ist erwartungsgemäß gut.
Somit ergibt sich durch dieses Verfahren die Möglichkeit, kleine, hoch beladene Vesikel oder Liposomen zu erhalten, die, wie vorstehend ausgeführt, besonders bei der Bildung von pharmazeutischen Zusammensetzungen brauchbar sein können. Somit kann dieses Verfahren zur Herstellung eingekapselter Materialien vielerlei Arten verwendet werden.
Es ist allerdings besonders zur Herstellung von kleinen Liposomen zum pharmazeutischen Einsatz geeignet. In diesem Fall umfassen die bei dem Verfahren verwendeten Reagentien ein biologisch aktives Material, wie ein Pharmazeutikum oder ein Arzneimittel. Für diesen Zweck sind die in Schritt (i) erhaltenen Liposomen zweckmäßigerweise kleine unilamellare Vesikel mit einer mittleren Größe beispielsweise im Bereich von 25–90 nm, vorzugsweise im Bereich von 50–90 nm und zweckmäßigerweise von 70–90 nm. Liposomen, die schließlich durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden, sind immer noch klein, mit einer mittleren Größe von weniger als 500 nm, üblicherweise von 100–200 nm.
Die in Schritt (i) verwendeten Liposomen sind leere Liposomen, die durch jedes der herkömmlichen Verfahren erhalten werden, beispielsweise unter Verwendung eines klassischen Verfahrens, wie vorstehend beschrieben. Alle hergestellten Liposomen mit einer mittleren Größe, die für den gewünschten Zweck zu groß ist, können beispielsweise unter Verwendung von Ultraschall-, Homogenisierungs-, Extrusions- oder Mikrofluidisierungstechniken, wie aus der Technik bekannt, verkleinert werden.
Die Lipide, die bei der Herstellung von Liposomen verwendet werden, sind aus der Technik gut bekannt. Sie umfassen beispielsweise Lecithine, wie Phosphatidylcholin (PC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) oder geladene Lipide, insbesondere anionische Lipide, wie Phosphatidinsäure oder kationische Lipide, wie Stearylamin, gegebenenfalls in Gegenwart von Cholesterin. Ein weiteres bevorzugtes Lipid ist DSPC. Die Wahl des Lipids hängt zu einem gewissen Ausmaß von der Natur des wirksamen Mittels und von dem beabsichtigten Zweck des Liposoms ab.
Geeignete Zuckerlösungen zur Verwendung in Schritt (ii) umfassen wässrige Lösungen von Monosacchariden, wie Glucose und Fructose, Disacchariden, wie Lactose und Saccharose, sowie Polysacchariden. Ein besonders bevorzugter Zucker zur Verwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein Disaccharid, wie Saccharose oder Lactose, oder ein Monosaccharid, wie Glucose. Insbesondere ist der Zucker Saccharose.
Die Menge des in Schritt (ii) verwendeten Zuckers ist so, dass das Masseverhältnis von Zucker zu Lipid im Bereich von 1:1 bis 5:1 Gew./Gew. liegt. Es wurde festgestellt, dass je größer die vorhandene Menge an Zucker ist, desto geringer die Zunahme in der Größe der nach Rehydratation erhaltenen Liposomen im Vergleich zu denjenigen, die in Schritt (i) erhalten werden, ist. Allerdings kann der Einschlussgrad des Reagens geringer sein. Somit hängt die genaue Wahl der angewendeten Verhältnisse von der erforderlichen Endanwendung ab, wobei ein Gleichgewicht zwischen Einschlussgrad für einen gegebenen Lipidgehalt und Liposomengröße festgelegt wird. Der Unterschied, den dies für die Liposomenbildung ausmacht, variiert zu einem gewissen Ausmaß, in Abhängigkeit von dem bestimmten eingesetzten Reagens, wie im Folgenden erläutert. Zweckmäßigerweise ist die vorhandene Menge an Zucker geringer als 10% Gew./Vol. der Zusammensetzung.
Es wurde ferner gefunden, dass eine Erhöhung des Volumens der bei dem Verfahren eingesetzten Zuckerlösung durch Herabsetzung der Konzentration der Zuckerlösung den Einschluss erhöht. Geeignete Konzentrationen der Zuckerlösungen betragen 20–60 mM, vorzugsweise 30–150 mM.
Zusätzlich wurde festgestellt, dass wenn die anschließende Rehydratation bei erhöhten Temperaturen, beispielsweise von 30–80°C, insbesondere von 40–65°C, und insbesondere bei etwa 60°C, durchgeführt wird, die Einschlusswerte erhöht werden können. Es wurde festgestellt, dass dies für Liposomen zutrifft, die PC und CHOL einschließen und in der Regel bei Raumtemperatur gebildet werden. Im Vergleich zu den Ausgangsliposomen kann bei Anwendung erhöhter Temperaturen auf diese Weise eine gewisse Größenzunahme erfolgen, und darum sollte dies bei der Wahl der speziellen Bedingungen, die zur Herstellung der Liposomen eingesetzt werden, von Fall zu Fall berücksichtigt werden.
Weitere Faktoren, von denen eine Beeinflussung des Einschlusses festgestellt wurde, umfassen die spezielle Natur des Reagens, wie des Arzneimittels, das eingekapselt wird, und insbesondere seine Löslichkeit und die Menge des vorhandenen Reagens. Die Löslichkeit des Reagens kann in einigen Fällen die Menge einschränken, die in Schritt (ii) gelöst und somit in das Liposom eingeschlossen werden kann. Weitere Faktoren, die die Menge der Reagentien, die eingeschlossen werden, beeinflussen, umfassen die Wechselwirkungen des Reagens mit den das Liposom bildenden Lipiden und die Permeabilität des Liposoms für das Reagens.
Wo in der Lösung, die in Schritt (ii) der Reaktion verwendet wird, hohe Reagens-Konzentrationen vorhanden sind, kann der prozentuale Einschluss geringer sein. Darum kann es aus wirtschaftlichen Gründen ein Vorteil sein, die Menge des verwendeten Reagens herabzusetzen.
Die Wahl der Bedingungen, die Liposomen von gewünschter Größe und Beladung, einschließlich des Zuckers, ergeben: Lipidmasse verhältnis, Wahl des Lipids, Konzentration der verwendeten Zuckerlösung, Menge des Reagens, das in die Lösung eingeschlossen ist, und Temperatur der Rehydratation, kann unter Anwendung von Routineverfahren für ein bestimmtes Reagens bestimmt werden.
Der Trocknungsschritt (iii), vorstehend, kann unter Anwendung herkömmlicher Verfahren, beispielsweise durch Gefriertrocknen, Sprühtrocknen, Schnellkristallisation, Luftstromtrocknen (beispielsweise auf einem Wirbelbett), Vakuumtrocknen, Ofentrocknen, oder jedes andere aus der Technik bekannte Verfahren durchgeführt werden. Obwohl die mechanischen Eigenschaften der Produkte dieser beiden Verfahren unterschiedlich sein können, wobei das Produkt eines Sprühtrocknungsverfahrens ein diskretes und häufig fließfähiges Pulver ist, und das Gefriertrocknen einen festen Kuchen erzeugt, sind die Eigenschaften der Liposomen bei der Rehydratation bezüglich ihrer Stabilität und ihres Einschlusses weitgehend ähnlich.
Für viele Anwendungen, einschließlich der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, kann das Sprühtrocknen auf Grund der zweckmäßigen mechanischen Eigenschaften des Produkts zur weiteren Verarbeitung bevorzugt sein.
Das Produkt des Gefriertrocknens umfasst einen Block von porösem Kuchen, der relativ schlechte mechanische Eigenschaften aufweist. Der Einsatz des Strahlmahlens des Kuchens zum Erreichen von besseren Eigenschaften kann durchgeführt werden, allerdings kann bei diesem zusätzlichen Schritt eine Beschädigung auftreten.
Das Sprühtrocknen kann ein trockenes Produkt mit guten mechanischen Eigenschaften ergeben, das durch Inhalation oder Rekonstitution in Wasser und Verabreichung auf parenteralem Weg abgegeben werden kann.
Der anschließende Rehydratationsschritt kann während des Herstellungsverfahrens durchgeführt werden, oder alternativ kann die Zusammensetzung im trockenen Zustand bereitgestellt und am Ort der beabsichtigten Verwendung rehydratisiert werden, beispielsweise im Krankenhaus oder in der Apotheke, wo den Patienten ein eingekapseltes Pharmazeutikum zu verabreichen ist.
Die erhaltenen Liposomen besitzen eine gute Stabilität, was eine lange Lagerungsdauer des Produkts bewirkt. Dies ist beispielsweise für Kosmetika, Toilettenartikel und Pharmazeutika von Bedeutung.
Wie vorstehend besprochen, ist das Verfahren besonders bei der Herstellung relativ kleiner Liposomen mit hoher Reagensbeladung geeignet. Dies ist besonders für pharmazeutische Anwendungen, wie Abgabe von Materialien, wie polymere oder proteinartig Arzneimitteln, DNA-Impfstoffe, Gentherapie, Vektoren oder Chemikalien wünschenswert. Geeignete Chemikalien umfassen Antibiotika, wie Oxitetracycline, β-Lactam-Antibiotika, wie Penicilline, wie Penicillin G, Ampicillin oder Amoxicillin oder Cephalosporine, Antikrebsarzneimittel, Hormone, immuntherapeutische Mittel, antivirale Mittel, antiinflammatorische Verbindungen etc.
Die unter Anwendung des oben beschriebenen Verfahrens erhaltenen Liposomenprodukte können als pharmazeutische Zusammensetzungen beispielsweise durch ihre Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Trägern oder Hilfsstoffen formuliert sein. Die Formulierungen können zur oralen, parenteralen, insbesondere intravenösen oder topischen Anwendung, beispielsweise auf der Haut oder Schleimhautoberfläche geeignet sein. Eine besonders geeignete erfindungsgemäße Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, die für die Anwendung über ein Aerosol oder durch eine Inhalationsvorrichtung geeignet ist. Für diesen Zweck wurde festgestellt, dass neutrale Liposomen auf Lipidbasis mit hohem Phasenübergang, wie die aus Gemischen von DSPC und Cholesterin gebildeten, geeignet sind. Bei erfindungsgemäßer Herstellung braucht die Extrusion vor dem Trocknen nicht notwendig sein.
Die Erfindung wird nun insbesondere an Hand des Beispiels unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungsdiagramme beschrieben. Es zeigen:
1 einen Graph, der die Größenentwicklung von Dipalmitoylphosphatidylcholin(DPPC)- und Cholesterin(CHOL)-Liposomen von Ultrabeschallung bis Gefriertrocknung in Gegenwart von 0,375 M Saccharose und bei Rehydratation zeigt;
2 einen Graph, der die Wirkung der Molarität von Saccharose auf die PC:CHOL-Liposomen, die FITC-Albumin einschließen, auf die Größenverteilung (% Verteilung:Intensität), erhalten nach Gefriertrocknen und Rehydratation, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt;
3 einen Graph, der die Wirkung der Saccharose-Molarität auf die Größenverteilung nach der Rehydratation von PC:CHOL-Liposomen, die den epidermal growth factor (EGF) einschließen, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt;
4 einen Graph, der einen Vergleich der Größenverteilung von extrudierten und rehydratisierten PC:CHOL-Liposomen, die erfindungsgemäß hergestellt wurden und FITC-Albumin einschließen, zeigt;
5 einen Graph, der die Größenverteilung von extrudierten und gefriergetrockneten Liposomen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wurden und Carboxyfluorescein (CF) einschließen, zeigt; und
6 einen Graph, der die Größenverteilung verschiedener erfindungsgemäßer Liposomenzusammensetzungen zeigt.
In den folgenden Beispielen wurden Ei-Phosphatidylcholin (PC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) und Distearoylphosphatidincholin (DSPC) von Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany; Cholesterin, Carboxyfluorescein (CF), Fluoresceinisothiocyanat markiertes Albumin (FITC-Albumin), Riboflavin, Daunorubicin, Doxorubicin, Triton X-100, Saccharose, Glucose und Natriumdodecylsulfat (SDS) von der Firma Sigma, London bezogen. Der epidermal growth factor (EGF) war ein Geschenk vom Center of Biological Sciences Havana, Cuba. Na¹²⁵I, ¹⁴C-markiertes Hydroxypropylbetacyclodextrin, ¹⁴C-markiertes Penicillin wurden von der Firma Amersham International (Amersham, UK) bezogen. Das Markieren von EGF mit ¹²⁵I erfolgte nach dem Chloramin-T-Verfahren. Alle anderen Reagentien waren analysenrein.
Beispiel 1
Gefriertrocknungsverfahren
DRV-Liposomen, die gelösten Stoff enthielten, wurden wie folgt hergestellt: verschiedene Lipidgemische, insbesondere Gemische von PC:CHOL und DPPC:CHOl, in einem Molverhältnis von 1:1 wurden in Chloroform gelöst. Nach dem Eindampfen des Lösungsmittels an einem Rotationsverdampfer bei 37°C bildete sich an der Wand eines Rundkolbens ein Film. Multilamellare Vesikel (MLV) wurden durch Dispersion des Lipidfilms bei Temperaturen über der Lipidübergangstemperatur (> Tc) (welche in einigen Fällen Raumtemperatur war) mit bidestilliertem Wasser erzeugt. Die Suspension wurde entspre chend ultrabeschallt, um kleine unilamellare Vesikel (SUV) herzustellen, die zur Entfernung der Metallteilchen zentrifugiert wurden.
Anschließend wurde die SUV-Suspension in ein Röhrchen übergeführt, in dem die gewünschte Menge eines gewählten Arzneimittels (entweder FITS-Albumin (1 mg), CF (1 mg), Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (2 mg) oder EGF (150 μg)) in Lösung sowie 0,0357 M Saccharose vorgelegt waren, und Wasser wurde zugesetzt, so dass die gewünschte Molarität der Saccharose erreicht wurde.
Dann wurde die Zubereitung eingefroren und anschließend lange genug (je nach Endvolumen) gefriergetrocknet. Der trockene Kuchen wurde sodann durch Zugabe von 100 μl destilliertem Wasser der kontrollierten Rehydratation bei einer Temperatur > Tc (z.B. 60°C) 15 min unterzogen. Die Zubereitung wurde in PBS verdünnt, damit ein spezifisches Gewicht vorliegt, das die Abtrennung des freien Arzneimittels von den Liposomen durch Ultrazentrifugation erlaubt.
Die Liposomengröße nach der Rehydratation wurde durch Photonenkorrelationsspektroskopie unter Verwendung eines 2C-Malvern-Autosizer (Malvern Instruments UK), ausgestattet mit einem 25 mW Helium/Neon-Laser, bestimmt. Der mittlere Durchmesser und die Größenverteilung wurden erhalten.
Die Mittelwertsdurchmesser Z, die kumulative und differentielle Polydispersitätsindexverteilung, wurden als Funktion der Saccharosemolarität oder, wo die DRV extrudiert wurden, nach ihrer Größe aufgezeichnet. Für die Zubereitungen, die große Größen aufwiesen, (bis zu 6 Micron) wurde ein Mastersizer (Malvern) verwendet.
Die Einschlusswerte für die Arzneimittel wurden nach Ultrazentrifugation der Liposomen bei 40000 × g bestimmt. Die Menge an einge kapseltem Material wurde in % von insgesamt verwendetem CF, FITC-Albumin, EGF oder Hydroxypropyl-β-cyclodextrin berechnet.
Die gesamte und die eingekapselte Menge von Carboxyfluorescein und FITX-Albumin wurden durch Fluoreszenzphotometrie bei λ_Emission = 486 nm und λ_Anregung = 514 nm für CF und λ_Emission = = 495 nm und λ_Anreung = 520 nm für FITC-Albumin aus dem mit Triton oder SDS (5% Endkonzentration) gelösten Pellet gemessen. Die ¹⁴C-Emission von markiertem Hydroxypropyl-β-cyclodextrin wurde durch einen Radioaktivitätstest in einem β-Scintillationszähler gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt: Tabelle 1

* bezeichnet ein aus einem Gemisch von 32:32 μmol PC:CHOL gebildetes Liposom;
# = 16:16 μmol PC:CHOL;
** + = 64:64 μmol PC:CHOL; und
⊕ = 16:16 μmol DPPC:CHOL

Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem mäßigen Stabilisierungsgrad durch Saccharose die Rekonstitution, die einen gewissen Grad an Kondensation erlaubt (1), zu einem recht hohen prozentualen Einschlußgehalt führen kann.
Obwohl eine ähnliche prozentuale Einkapselung von FITC-Albumin in Gegenwart oder Abwesenheit von 40 mM Saccharose (87% bzw. 84%) erreicht werden kann, war die Endgröße für die Zubereitung unter Verwendung von Saccharose viel kleiner.
Durch Variation der Molarität von Saccharose in den verschiedenen Zubereitungen von FITC-Albumin enthaltenden Liposomen (Tabelle 1) konnten verschiedene Größenverteilungen der Liposomen erhalten werden (2), obwohl die Einschlusswerte mit zunehmender Molarität abnahmen.
Die Einkapselung von EGF und CF wurde in Gegenwart von Saccharose bei verschiedenen Molaritäten durchgeführt. Die prozentualen Einschlusswerte entsprachen denjenigen, die mit anderen Zubereitungen unter Verwendung der gleichen Menge an Lipiden, allerdings unter Durchführung in Abwesenheit von Saccharose, erhalten wurden (c.f. Tabelle 1). In diesem Fall beeinflusste die Molarität der Saccharose nicht die prozentualen Einschlusswerte, sondern nahm doch Einfluss auf die Größen und die Größeverteilung (3).
Die Mittelwertsdurchmesser Z der DRV-Liposomen, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Saccharose erzeugt wurden, sind in Tabelle 1 angegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass eine kleinere Vesikelgröße erzielt wird, wenn die Saccharose bei hoher Molarität verwendet wird, entsprechend einer engeren Größeverteilung und somit mäßigen prozentualen Einschlusswerten. Die Werte des prozentualen Einschlusses sind proportional zur Größe und Größenverteilungsbreite.
Bei zwei verschiedenen Saccharose-Molaritäten können wir fast die zwei gleichen gemittelten Durchmesser zweier Vesikel-Populationen, die verschiedene Breiten aufweisen, messen (3).
Für Liposomen, die EGF einschließen, hergestellt bei 35,70 mM und 126 mM Saccharose, betrugen die zwei gemittelten Durchmesser nach der Rehydratation 144,8 ± 32 nm bzw. 146,4 ± 1,3 nm.
Bei Betrachten der Größenverteilung stellen wir fest, dass sie für die 126-mM-Saccharose-Zubereitung enger ist. Die Abnahme der Größe der Liposomen und eine Verengung der Größenverteilung unter Verwendung von hoch molarer Saccharose (über 36 mM) hatten keine niedrigen Einschlusswerte zur Folge. Unter Verwendung von zwei verschiedenen Saccharose-Konzentrationen (35,7 mM und 135 mM) wurde festgestellt, dass Liposomen, die die gleiche Menge an CF einschließen (etwa 30%), mit engerer Größenverteilung (PDI = 0,13) hergestellt werden konnten als Liposome, die bei 135 mM Saccharose hergestellt wurden.
Beispiel 2
Vergleich der erfindungsgemäßen Liposomen mit extrudierten Liposomen
Um das erfindungsgemäße Verfahren mit demjenigen der Extrusion zu vergleichen, das ebenfalls eine Vesikelgrößenverminderung bewirkt, verwendeten wir einen Extruder, um DRV-Liposomen, die ohne Verwendung von Saccharose hergestellt wurden, zu behandeln. Die Liposomen, die hergestellt wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden mit denjenigen verglichen, die durch ein Extrusionsverfahren erhalten wurden.
Die ohne Saccharose hergestellten DRV-Liposomen wurden unter Verwendung einer Hochdruckfilterfassung einer Extrusion unterzogen. Die Liposomen wurden vor der Beseitigung von nicht eingeschlossenem gelöstem Stoff über Polycarbonatmembranen passiert, deren Porengröße 1,2 μm, 0,4 μm, 0,2 μm und 0,1 μm betrug. Bei jedem Extrusionsschritt wurden 5 Durchgänge durch die gleichen Membranen durchgeführt.
Sodann wurde der freie gelöste Stoff durch Ultrazentrifugation von den extrudierten Vesikeln abgetrennt. Das Pellet wurde in 1 ml PBS (pH 7,4) suspendiert.
Anschließend wurde die Größe der Liposomen wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen. Die Größenverteilung wurde mit derjenigen von ähnlichen Liposomen verglichen, die erhalten wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ergebnisse sind in den 4 und 5 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass die extrudierten Liposomen eine engere Verteilung der Vesikelgrößen zeigten.
Der Materialeinschluss in den Vergleichsliposomen wurde sowohl vor als auch nach der Extrusion gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Die mittleren Durchmesser und Einschlusswerte sind in Tabelle 2 angegeben. Sie zeigen, dass für die extrudierten Liposomen geringe Einschlusswerte und eine enge Größenverteilung (PDI ≤ 0,1) erhalten werden. Die geringen Einschlusswerte in Verbindung mit dem Erfordernis eines zusätzlichen Schritts (Extrusion) für die Herstellung von Liposomen kleiner Größe vermindert die praktische Anwendungsmöglichkeit dieses Verfahrens wesentlich.
5 zeigt eine übereinander gelegte Größenverteilung von extrudierten Liposomen, die CF einschließen (6% Einschluss), und von gefriergetrockneten Liposomen in Gegenwart von 135 mM Saccharose mit 30% eingekapseltem CF.
Die enge Größenverteilung der durch die Extrusion erhaltenen Vesikelgröße ist nicht von hauptsächlicher Bedeutung, da die entsprechenden prozentualen Einschlusswerte schlecht sind.
Beispiel 3
Größenverteilung der erfindungsgemäßen Liposomen
Durch die Verwendung von Phospholipiden mit hoher Phasenübergangstemperatur kann sich diese Technik, die die Größenverteilungsbreite betrifft, verbessern lassen. Dies wurde erreicht, wenn äquimolare DPPC:CHOL-Liposomen, die EGF einschließen, wie in Beispiel 1 beschrieben, in Gegenwart von 35,71 mM Saccharose formuliert wurden. Die EGF-Einschlusswerte betrugen 25%. Allerdings zeigten die Liposomen eine engere Größenverteilung (Mittelwert Z = 128 nm) als die entsprechende PC:CHOL-Zubereitung. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Somit scheint es, dass in diesem Fall die Wahl der Lipide mit hohen Phasenübergangstemperaturen bevorzugt ist, um Liposomen mit engerer Größenverteilung zu erzielen.
Beispiel 4
Hohe Einschluss-Ausbeute an Riboflavin in kleinen Liposomen
Zur Herstellung kleiner unilamellarer Vesikel (SUV) durch Ultraschall wurden äquimolares Phosphatidylcholin (390 μmol) und Cholesterin verwendet. Die SUV wurden sodann mit Riboflavin (12 mg) und steigenden Mengen von Saccharose (0–5 mg pro mg Gesamtlipid) vermischt. Die Gemische wurden sprühgetrocknet und sodann rehydratisiert. Der Arzneimittel-Einschluss wurde in den suspendierten Pellets der zentrifugierten Zubereitungen gemessen. Die Größe der SUV in den Vesikel-Endzubereitungen wurde durch Photokorrelationsspektroskopie oder in einem Mastersizer gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.
Tabelle 3
Es scheint, dass das Sprühtrocknen von kleinen Liposomen (SUF) in Gegenwart von Arzneimittel und Saccharose (1 mg/1 mg Lipid) zu relativ kleinen Liposomen führt, die nahezu die Hälfte (47,5%) der Menge des verwendeten Arzneimittels einschließen. Durch Erhöhen der Menge an vorhandener Saccharose wird die Vesikelgröße weiter vermindert, allerdings mit einer gleichzeitigen Herabsetzung der Einschlusswerte.
Beispiel 5
Liposomen, die Glucose enthalten
Die Verfahrensweise von Beispiel 1 wurde wiederholt, allerdings unter Verwendung von Riboflavin als wirksames Mittel in einer Menge, um eine Konzentration von 1 mg (insgesamt in 1 ml) in der Lösung zu ergeben und in einigen Fällen unter Verwendung von Glucose anstelle von Saccharose. Die Liposomengröße bei der Rehydratation wurde wie in Beispiel 1 beschrieben, gemessen. Die Riboflavin-Einkapselungseffizienz wurde durch Messen des gesamten und des eingekapselten Riboflavins durch Fluoreszenzphotometrie bei Emissionswellenlänge = 480 nm und Anregungswellenlänge = 520 nm berechnet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 angegeben.
Tabelle 4
Tabelle 5
Hinsichtlich der Qualität erzeugte die Zugabe von Glucose statt von Saccharose zu den SUV-Liposomen die gleiche Stabilisierungswirkung. Die Einschlusswerte von Riboflavin waren bei beiden Lipid-zu-Zucker-Verhältnissen von 3 g/g und 5 g/g von Glucose oder Saccharose ähnlich (Tabelle 5).
Die durch Zugabe der äquivalenten Menge an Glucose hergestellten Liposomen zeigten bei Rehydratation im Vergleich zu den in Gegenwart von Saccharose hergestellten Proben eine größere Vesikelgröße (Tabelle 4).
Beispiel 6
Wirkung der Rehydratationstemperatur auf die Liposomenbildung
Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Verwendung von äquimolaren PC:CHOl-Liposomen, einer Saccharoselösung (68,7 mM) und 5 mg ¹⁴C-Penicillin (Pen G) als wirksames Mittel wiederholt. In diesem Fall allerdings wurde die Rehydratation bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Insbesondere wurden einige Zubereitungen bei Raumtemperatur rehydratisiert, während andere 15 min bei 60°C erwärmt wurden.
Die Einschlusseffizienz wurde nach der Ultrazentrifugation der hergestellten Liposomen bei 40000 g bestimmt, und sodann wurde die Radioaktivität von ¹⁴C-Penicillin als Prozentgehalt der Gesamtmenge in Überstand und Pellet ausgedrückt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6
In der obigen Tabelle sowie in den folgenden Tabellen stellt "AV" die mittlere Liposomengröße dar, "SD" ist die Standardabweichung, und "PDI" stellt die Größenverteilung oder den Polydispersitätsindex dar.
Liposomen, die bei Raumtemperatur rehydratisiert wurden, zeigten nur eine leichte Zunahme in der Größe von 68 nm (ultrabeschalltes SUV) auf durchschnittlich nur 90 nm, gestatteten allerdings im Durchschnitt eine Einkapselung von 6,5% des ursprünglich zugesetzten Penicillins. Auch bei hohen Konzentrationen an Saccharose konnte ein Grad an Einkapselung erreicht werden. Die 100-nm-Vesikel zeigen eine prozentuale Einkapselung von 14%.
Das Erwärmen ähnlicher Zubereitungen während des Rehydratationsschrittes führt zu größeren Vesikeln. Liposomen eines mittleren Durchmessers von 230 nm konnten 24% des ursprünglich zugesetzten ¹⁴C-Penicillins einkapseln (Verhältnis von 3 g Saccharose/g Lipid). Die Erhöhung der Saccharosemenge durch Erhöhen des Masseverhältnis von Zucker/Lipid von 3 auf 5 bewirkt etwas größere Vesikel, die eine geringere prozentuale Einkapselung zeigen.
Beispiel 7
Einkapselung von ¹⁴C-Penicillin bei verschiedenen Saccharosekonzentrationen
Das Verfahren von Beispiel 6 wurde unter Verwendung von äquimolaren PC:CHOL-Liposomen und ¹⁴C-Penicillin (5 mg) als wirksames Mittel, allerdings entweder mit einer hoch molaren Saccharoselösung (68,78 mM) oder einer verdünnteren Saccharoselösung (35 mM), wiederholt.
Die Ergebnisse sind zusammen mit den Ergebnissen für die bereits in Tabelle 6 gezeigte 25-°C-Rehydratation in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
Die unter Verwendung einer niedermolaren Zuckerlösung hergestellten Liposomen zeigten eine mittlere Größe von ca. 200 nm, die größer war als bei denjenigen, die unter Verwendung einer hochmolaren Zuckerlösung hergestellt wurden. Allerdings waren die Einschlusswerte höher und der Polydispersitätsindex geringer.
Darum scheint es, dass die Herabsetzung der Molarität der Saccharose während der Liposomenhersellung eine bessere Alternative zur Anwendung von hohen Temperaturen (c.f. Beispiel 6) während des Rehydratationsschrittes ist, um den Einschluss zu erhöhen. Obwohl eine vergleichbare prozentuale Einkapselung erreicht wird, behalten die Liposomen bei Verwendung von niedermolarer Saccharose kleinere Größen bei.
Beispiel 8
DSPC-Liposomen-Zubereitung
Das Verfahren von Beispiel 6 wurde unter Verwendung von DSPC und äquimolarem Cholesterin zur Herstellung von Liposomen wiederholt. Bei diesem Experiment wurden eine hohe Saccharosemolarität (71 mM) und Penicillin (5 mg) verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.
Tabelle 8
Die Ergebnisse zeigen, dass die Erhöhung der Saccharose-Menge zu einer Herabsetzung der Einschlusswerte von ¹⁴C-Penicillin und des mittleren Durchmessers führte. DSPC:CHOL-Liposomen zeigten im Vergleich zu PC:CHOL-Liposomen höhere Einschlusswerte und kleinere Größen. Dies kann auf der hohen Phasenübergangstemperatur (TC) von DSPC beruhen, was eine höhere Stabilität beim Erwärmen ermöglichte.
Beispiel 9
Doxorubicin-Einkapselung
dDoxorubicin enthaltende Liposomen wurden unter Verwendung der in Tabelle 9 ausgeführten experimentellen Bedingungen hergestellt.
Tabelle 9
Experimentelle Bedingungen

Doxorubicin (1,3 mg/ml)
Doxorubicin-Test bei einer Anregungs- bzw. Emissionswellenlänge von 480 nm bzw. 560 nm.

Liposomen-Zusammensetzungen
Die Größe der rehydratisierten Liposomen wurde bestimmt, wie in den vorherigen Beispielen beschrieben. Die Einschlusswerte für Doxorubicin wurden nach der Ultrazentrifugation bestimmt, wie vorstehend beschrieben. Das gesamte und das eingekapselte Doxorubicin wurden durch Fluoreszenzphotometrie bei einer Emissionswellenlänge von 490 nm und einer Anregungswellenlänge von 560 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 10
Doxorubicin wurde erfolgreich in kleinen Liposomen eingekapselt. Äquimolare PC:CHOL-Liposomen, hergestellt mit 5 g Saccharose auf 1 g Lipid, zeigten eine Größe von 160 nm und eine Einkapselungseffizienz von 45%. Eine Erhöhung des Saccharose-zu-Lipidverhältnisses beeinflusste die prozentuale Einkapselung nicht nennenswert. Der Ersatz von PC mit DSPC erzeugte Liposomen, die eine höhere prozentuale Einkapselung zeigten.
Beispiel 10
Auswirkungen zunehmender Saccharosekonzentration
Das Verfahren von Beispiel 4 wurde unter Verwendung von schrittweise höheren Saccharosekonzentrationen wiederholt. Die verwendeten Konzentrationen zusammen mit den Riboflavin-Einschlusswerten und die Liposomengröße-Ergebnisse sind in Tabelle 11 gezeigt.
Tabelle 11 Auswirkung der Saccharosekonzentration auf den Einschluss von Riboflavin
Die Ergebnisse zeigen, dass bei hohen Saccharose/Lipid-Masseverhältnissen, insbesondere über 10% Gew./Vol. Saccharose, die Einschlusswerte gering sind, obwohl die Stabilisierungswirkungen auf die Größe der Liposomen gut sind.
Beispiel 11
Desoxyfructo-serotonin(DFS)-Einkapselung
Liposomen, die DFS enthalten, wurden unter Verwendung der in Tabelle 12, nachstehend, zusammengefassten Bedingungen hergestellt. Die Ergebnisse umfassen die Einschlusswerte, und in dieser Tabelle ist auch die Größe nach der Rehydratation gezeigt.
Tabelle 12
In diesem Beispiel wurden gute Einschlussniveaus sowie eine annehmbare Größenstabilisierung erzielt.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung eines Wirkstoffs, das die Schritte umfasst: (i) Bilden von leeren Liposomen (ii) Mischen der Liposomen aus Schritt (i) mit einer Zuckerlösung und einem Wirkstoff; und (iii) Trocknen des Gemisches von Schritt (ii), dadurch gekennzeichnet, dass das in Schritt (ii) verwendete Massenverhältnis Zucker zu Lipid 1:1 bis 5:1 G/G beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem den Schritt der Rehydratisierung des Gemisches von Schritt (iii) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die in Schritt (i) gebildeten Liposomen kleine unilamellare Vesikel sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Vesikel eine mittlere Größe von 25–100 nm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Vesikel eine mittlere Größe von 70–90 nm aufweisen.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Konzentration der in Schritt (ii) verwendeten Zuckerlösung 20–200 mM beträgt.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Konzentration der Zuckerlösung 30–150 mM beträgt.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der in Schritt (ii) verwendete Zucker ein Disaccharid ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Zucker Saccharose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der in Schritt (ii) verwendete Zucker ein Monosaccharid ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei der Zucker Glucose ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei Schritt (iii) durch Gefriertrocknen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–12, wobei Schritt (iii) durch Sprühtrocknen durchgeführt wird.