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Die
Erfindung bezieht sich auf eine wäßrige pharmazeutische Zusammensetzung,
die einen Wirkstoff umfaßt,
der in Wasser hoch unlöslich
ist. Sie bezieht sich insbesondere auf eine pharmazeutische Zusammensetzung,
in der der Wirkstoff in Liposomen dispergiert ist.
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Derzeit
wird ein großer
Forschungsaufwand betrieben, um neue Liposomenpräparate auf dem pharmazeutischen
Gebiet zu finden. Allerdings sind viele Schwierigkeiten insbesondere
in bezug auf Wirkstoffe, die in hohem Maß wasserunlöslich sind, aufgetreten. Dies
gilt insbesondere für
solche, mit einer Löslichkeit
in Wasser von ≤0,01%
(G/V).
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Die
derzeit angewandte Technik zur Herstellung von Liposomen, die Wirkstoffe
mit geringer Wasserlöslichkeit
umfassen, umfaßt:
- a) Solubilisieren des Wirkstoffs und der vorher
ausgewählten
Phospholipide in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z. B. Chloroform;
- b) Verdampfen dieses Lösungsmittel
bei reduziertem Druck unter Erhalt eines Wirkstoff/Phospholipid-Films;
- c) Zugeben eines zweiten organischen Lösungsmittels, z. B. tert-Butylalkohol;
- d) Gefrieren der erhaltenen Lösung bei der Temperatur von
flüssigem
Stickstoff;
- e) Lyophilisieren der gefrorenen Lösung;
- f) Hydratisieren der lyophilisierten Lösung mit einer Pufferlösung unter
Erhalt einer Suspension multilamellarer Liposome (MLV); und
- g) Behandlung dieser Suspension mit Ultraschall unter Erhalt
einer Suspension kleinerer Liposome (SUV).
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Ein
Beispiel für
dieses Verfahren wird von A. Sharma et al. "Pharmaceutical Research", 2 (6), 889–896 (1994)
beschrieben.
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Allerdings
hat diese Technik den Nachteil, daß sie sehr aufwendig ist und
zum Vorliegen von Spuren organischer Lösungsmittel in den Liposomen
führt.
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Diese
Autoren beschreiben jedoch, daß sie
verschiedene Techniken zur Herstellung von MLV-Liposomen, z. B.
die Hydratisierung der trockenen Lipidfilme (Schütteln von Hand), Gefrieren-Tauen
und verschiedener Techniken wie Extrudieren und Behandlung mit Ultraschall,
um dann die Größe der Liposomen
(MLV → SUV)
(Nachbehandlung) zu reduzieren, durchgeführt haben und ziehen den Schluß, daß das oben
im Detail beschriebene Verfahren, das die Phasen a) bis g) umfaßt, sich
als das akzeptabelste erwiesen hat (loc. cit. Seite 890, rechte
Spalte, Zeilen 51–57).
Allerdings geben die Autoren nicht an, wie diese ersten Techniken
zur Herstellung von MLV-Liposomen und die zweiten Techniken, die
die Größe der Liposomen
reduzieren, miteinander kombiniert wurden.
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WO-A-96/40064,
EP-A-0 578 629, DE-A-038 075 und DE-A-44 30 593 offenbaren pharmazeutische Zusammensetzungen,
in denen ein in Wasser unlöslicher
Wirkstoff in Liposomen dispergiert wird. Ein derartiger Wirkstoff
ist Cyclosporin A, Melatonin bzw. Taxol.
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Allerdings
beschreibt keines der oben genannten Dokumente ein Verfahren zur
Herstellung einer wäßrigen Liposomen-Zusammensetzung,
das die Gefrier- und Auftau-Technik mit Extrusion kombiniert.
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Überraschenderweise
wurde nun gefunden, daß die
Gefrier- und Auftau-Technik
kombiniert mit Extrusion die Herstellung von wäßrigen Liposomen-Zusammensetzungen
von Wirkstoffen mit einer Löslichkeit
in Wasser von ≤0,01%
(G/V) ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels erlaubt.
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In
dieser Beschreibung und den Ansprüchen, die folgen, sind Wirkstoffe
mit einer Löslichkeit
in Wasser von ≤0,01%
(G/V) als "in hohem
Maße in
Wasser unlöslich" definiert.
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Daher
besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung
eines Verfahren für
die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch
1.
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Das
folgende sind typische Beispiele für Wirkstoffe, die in Wasser
in hohem Maße
unlöslich
sind: Ionidamin (Löslichkeit:
3 × 10–6/ml),
Melatonin ["praktisch
unlöslich", G. S. Shida et
al., "J. Pineal
Res.", 16, 198–201 (1994)],
Cyclosporin-A ["in
Wasser unlöslich", Monographie über Cyclosporin-A
in "Analytical Profiles of
Drug Substrances",
16, 163 (1987)] und Bindarit (Löslichkeit:
1 × 10–4 g/ml).
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Die
Liposome der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
werden vorzugsweise aus einer Komponente gebildet, die aus der Gruppe
ausgewählt
ist, welche Phosphoglyceride, Glyceride, Diglyceride, Triglyceride,
Phospholipide, Galactosyl- und Glucosyl-Lipide, Cholesterin und
seine Derivate, Sphingolipide und Gemische davon umfaßt. Bevorzugter
werden sie aus Phospholipiden hergestellt.
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Ein
typisches Beispiel für
die Liposomen-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung
umfaßt
Phosphatidylcholin, Lysophosphatidylcholin, N-Acyl-phosphatidylcholin,
Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Sphingomyelin, nicht-polare
Lipide, Triglyceride, freie Fettsäuren, DL-α-Tocopherol.
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Eine
bevorzugte Liposomen-Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfaßt:
| Komponente | %
(G/G) |
| Phosphatidylcholin | :
85–97 |
| Lysophosphatidylcholin | :
0–5 |
| N-Acyl-ethanolamin | :
0–4 |
| Phosphatidylethanolamin | :
0–10 |
| Triglyceride | :
0–4 |
| Freie
Fettsäuren | :
0–3 |
| DL-α-Tocopherol | 0–1 |
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Eine
besonders bevorzugte Liposomen-Zusammensetzung gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt:
| Komponente | %
(G/G) |
| Phosphatidylcholin | :
94 |
| Lysophosphatidylcholin | :
3 |
| N-Acyl-ethanolamin | :
1 |
| Phosphatidylethanolamin | :
0,1 |
| Triglyceride | :
1 |
| Freie
Fettsäuren | :
0,75 |
| DL-α-Tocopherol | :
0,15 |
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Typischerweise
ist die Größe der Liposomen
gemäß der Erfindung
kleiner als 500 nm. Vorzugsweise ist sie 50 bis 250 nm.
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Die
Dauer der Phase c) hängt
von der Menge des Wirkstoffs ab, der in hohem Maße in Wasser unlöslich ist
und in den Liposomen eingeschlossen werden soll. Der Fachmann wird
daher keine Schwierigkeiten haben, durch einfache Routineexperimente
für jeden
Typ des Wirkstoffs und der Liposomen-Zusammensetzung die genaue Zeit bestimmen
werden.
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Die
wäßrige Phase
soll vorzugsweise aus einer wäßrigen Natriumchlorid-Lösung mit
0,05% bis 0,9% (G/V) bestehen.
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Typischerweise
ist die verwendete Menge an Lipid zwischen 0,01 bis 0,4 Gew.-Teilen
für jeden Gew.-Teil
wäßrige Lösung. Umgekehrt
ist die Menge des Wirkstoffs typischerweise zwischen 0,01 und 0,3 Gew.-Teilen
für jeden
Gew.-Teil Lipid.
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Typischerweise
ist das Dispergiergerät
ein Homogenisator des UltraturraxTM-Typs.
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Typischerweise
wird die Extrusion unter Verwendung von komprimierter Luft oder
einem Inertgas, ausgewählt
aus der Gruppe umfassend Luft, Stickstoff, Helium und Argon, als
Extrusionsgas, durchgeführt.
Das bevorzugte Inertgas ist Helium. In der Extrusionsphase soll
der Druck vorzugsweise zwischen 500 und 5500 kPa liegen und die
Temperatur soll vorzugsweise zwischen 20 und 75°C und bevorzugter zwischen 40
und 65°C
liegen. Typische Beispiele für
geeigneten Extruder sind die vom Typ Lipex Biomembranes Thermobarrel oder
vom Typ Emulsiflex CC Avestin mit Filtern mit Polycarbonat CostarTM-Membranen, die Poren zwischen 50 und 600
nm haben.
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Typischerweise
wird die Phase h) zumindest zweimal und nicht mehr als 8-mal wiederholt;
bevorzugt sind 6-mal.
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Die
folgenden Beispiele erläutern
die vorliegende Erfindung ohne sie in irgendeiner Weise zu beschränken.
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BEISPIEL 1
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100
mg Melatonin wurden in 1 g Phospholipid bei 30°C 10 Minuten unter Verwendung
eines UltraturraxTM-Homogenisators dispergiert.
Unmittelbar danach wurde die Dispersion in 10 ml wäßriger Natriumchlorid-Lösung mit
0,9% (G/V) unter Verwendung dieses Homogenisators suspendiert und
dann 20 Minuten in einem Wasserbad mit 55°C erwärmt.
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Die
auf diese Weise erhaltene Suspension wurde dem folgenden Kühl- und Erwärmungs-Zyklus
unterworfen:
- – Kühlen in flüssigem Stickstoff für 1 Minute,
- – Erwärmen auf
55°C bis
die Phospholipide vollständig
flüssig
sind.
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Dieser
Zyklus wurde 6-mal wiederholt.
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Die
Suspension wurde zweimal durch ein 0,6 μm-Filter geleitet, und zwar
mit Hilfe der Lipex-Biomembrane-Apparatur.
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Auf
diese Weise wurde eine "Multilamellare
große
Vesikel" (MLV)-Suspension erhalten,
die 6 Zyklen einer kontinuierlichen Extrusion unter Verwendung eines
10 ml-Extruders vom Typ Lipex Biomembranes Extruder Thermobarrel
mit 0,1 μm
Polycarbonat CostarTM-Filtern bei 55°C unterworfen,
wobei Helium als Extrusionsgas bei einem Druck zwischen 1000 und
4800 kPa verwendet wurde.
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Unter
Anwendung der oben beschriebenen Vorgehensweise wurden drei Chargen
des Produktes (LM/186, LM/188 und LM/190) hergestellt.
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An
den Chargen wurden die folgenden Test durchgeführt:
- – Melatonin-Menge
in der wäßrigen Liposomen-Zusammensetzung
(HPLC-Analyse);
- – Liposomengröße;
- – Melatonin-Menge,
die in den Liposomen eingeschlossen war.
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Die
folgende Tabelle zeigt die gemessenen Parameter und ihre Bedeutung:
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Die
erhaltenen Daten sind in Tabelle 1 angegeben, welche zeigt:
- – die
Konzentration an Melatonin, die in der wäßrigen Liposomen-Formulierung erreicht
wurde, war, ausgedrückt
als Mittelwert für
drei Chargen, 8,05 × 10–3 g/ml;
- – die
durchschnittliche Größe der Liposomen
für die
drei Chargen war 93 nm;
- – die
eingeschlossene Menge, ausgedrückt
als Durchschnittswert für
die drei Chargen, war 80,5 μg/mg;
- – die
Formulierungen zeigten kein Liposomenaggergations-Phänomen.
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Für die HPLC-Analyse
wurde das folgende Verfahren verwendet:
- – Festphase:
Säule mit
Umkehrphase PKB-100 (250 × 4,6
mm; 5 μm
Supelco);
- – Mobile
Phase: Wasser : Acetonitril 80 : 20 (V/V);
- – Detektion:
UV 254 nm.
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Für die Analyse
der durchschnittlichen Größe der Liposome
wurden zwei Apparaturen verwendet:
- 1) DELSA
440-Coulter,
- 2) NICOMP-Submikron-Partikelgrößenbestimmungsgerät, Modell
370.
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Das
Verfahren war wie folgt:
- a) für die Tests,
die mit Apparatur 1) durchgeführt
wurden, wurde 1 ml Liposomensuspension mit 10 ml einer wäßrigen Natriumchlorid-Lösung mit
0,9% (G/V) verdünnt;
- b) für
Tests, die mit Apparatur 2) durchgeführt wurden, wurden 0,5 ml Lösung a)
mit wäßriger Natriumchlorid-Lösung mit
0,9% (G/V) auf 10 ml verdünnt.
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BEISPIEL 2
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Es
wurde wie in Beispiel 1 oben beschrieben vorgegangen, wobei 2 g
Phospholipid und 50 mg Ionidamin anstelle von 1 g Phospholipid und
100 mg Melatonin verwendet wurden.
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Auf
diese Weise wurden drei Chargen des Produktes (LM/195, GN/1L und
GN/2L) hergestellt. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 2 angegeben,
welche zeigt:
- – die Konzentration von Ionidamin
in der wäßrigen Zusammensetzung,
die vom Anfangslöslichkeitswert
von 3 × 10–6 g/ml
zu einem Durchschnittswert für
die drei Chargen von 3,83 × 10–3 g/ml
reicht;
- – die
durchschnittliche Größe der Liposomen
für die
drei Chargen war 79,6 nm;
- – die
eingeschlossene Menge, ausgedrückt
als Durchschnittswert für
die drei Chargen, war 19,2 μg/mg;
- – die
Formulierungen zeigten kein Liposomenaggregations-Phänomen.
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BEISPIEL 3
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Es
wurde wie in Beispiel 1 oben verfahren, wobei 2 g Phospholipid und
200 mg Melatonin anstelle von 1 g Phospholipid und 100 mg Melatonin
verwendet wurden.
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Auf
diese Weise wurden drei Chargen des Produktes (GN/1M, GN/2M und
GN/3M) hergestellt. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 3 angegeben
und zeigen:
- – die Konzentration an Melatonin
in der wäßrigen Liposomen-Formulierung, ausgedrückt als
Mittelwert für die
drei Chargen, war 13,5 × 10–3 g/ml);
- – die
durchschnittliche Größe der Liposomen
für die
drei Chargen war 92,6 nm;
- – die
eingeschlossene Menge, ausgedrückt
als Mittelwert für
die drei Chargen, war 67,6 μg/mg;
- – die
Formulierungen zeigten kein Liposomenaggregations-Phänomen.
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BEISPIEL 4
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Es
wurde wie in Beispiel 2 oben vorgegangen, außer daß die Extrusion durch eine
Polycarbonat-Membran mit 0,2 μm
anstatt mit 0,1 μm
durchgeführt
wurde.
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Auf
diese Weise wurden drei Chargen des Produktes (GN/3L, GN/4L und
GN/5L) hergestellt.
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Die
erhaltenen Daten sind in Tabelle 4 angegeben, die zeigt, daß durch
Erhöhung
des Ionidamins von 20 mg auf 50 mg, der Menge an Phospholipid von
1 auf 2 g und indem mit einer 0,2 μm- anstelle mit einer 0,1 μm-Membran extrudiert
wurde, eine deutliche Erhöhung
bei der Konzentration an Ionidamin in der wäßrigen Zusammensetzung in Beispiel
2 erhalten wurde. Tatsächlich
wurde ein durchschnittlicher Wert von 4,47 × 10–3 g/ml
für die
Ionidamin-Konzentration erhalten.
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BEISPIEL 5
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20
mg Cyclosporin-A wurden in 1 g Phospholipid bei 30°C für 10 Minuten
unter Verwendung eines Homogenisators von Typ UltraturraxTM dispergiert. Unmittelbar danach wurde
die Dispersion in einer wäßrigen Natriumchlorid-Lösung mit
0,9% (G/V) unter Verwendung des Homogenisators suspendiert und dann
für 20 Minuten
in einem Wasserbad mit 65°C
erwärmt.
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Die
auf diese Weise erhaltene Suspension wurde dem folgenden Kühlungs-
und Erwärmungs-Zyklus unterworfen:
- – Kühlen in
flüssigem
Stickstoff für
1 Minute,
- – Erwärmen auf
65°C, bis
die Phospholipide vollständig
flüssig
sind.
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Dieser
Zyklus wurde 6-mal wiederholt.
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Die
Suspension wurde zweimal mit der Lipex Biomembrane-Apparatur durch
ein 0,6 μm-Filter
geleitet.
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Auf
diese Weise wurde eine "Multilamellare
große
Vesikel" (MLV)-Suspension erhalten,
die 6 Zyklen einer kontinuierlichen Extrusion unterworfen wurde,
wobei ein 10 ml-Extruder vom Typ Lipex Biomembrane Extruder Thermobarrel
mit 0,1 μm
Polycarbonat CostarTM-Filtern bei 65°C unter Verwendung
von Helium als Extrusionsgas mit einem Druck von 1000 bis 4800 kPa
verwendet wurde.
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Auf
diese Weise wurden drei Chargen des Produktes LM/416A, LM/416B und
LM/416C) hergestellt.
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Die
erhaltenen Daten sind in Tabelle 5 angegeben und zeigen:
- – die
Konzentration an Cyclosporin-A in der wäßrigen Liposomen-Formulierung, ausgedrückt als
Durchschnittswert für
die drei Chargen, war 0,96 × 10–3 g/ml;
- – die
durchschnittliche Größe der Liposomen
für die
drei Chargen war 103 nm;
- – die
eingeschlossene Menge, ausgedrückt
als Durchschnittswert für
die drei Chargen, war 9,6 μg/mg;
- – die
Formulierungen zeigten kein Liposomenaggregations-Phänomen.
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BEISPIEL 6
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Es
wurde wie in Beispiel 1 oben vorgegangen, wobei 2 g Phospholipide
und 50 mg Bindarit anstelle von 1 g Phospholipiden und 100 mg Melatonin
verwendet wurden.
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Auf
diese Weise wurden drei Chargen des Produktes (LM/356, LM/357 und
LM/358) hergestellt.
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Die
erhaltenen Daten sind in Tabelle 6 angegeben und zeigen:
- – die
Konzentration an Bindarit in der wäßrigen Liposomen-Zusammensetzung ging
vom Anfangslöslichkeitswert
von 1 × 10–4 g/ml
zu einem Durchschnittswert für
die drei Chargen von 4 mg/ml;
- – die
Durchschnittsgröße der Liposomen
für die
drei Chargen war 108,3 nm;
- – die
eingeschlossene Menge, ausgedrückt
als Durchschnittswert für
die drei Chargen, war 20,2 μg/mg;
- – die
Formulierungen zeigten kein Liposomenaggregations-Phänomen.
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BEISPIEL 7
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30
mg Cyclosporin-A wurden in 2 g Phospholipid bei 30°C für 10 Minuten
unter Verwendung eines Homogenisators vom UltraturraxTM-Typ
dispergiert. Unmittelbar danach wurde diese Dispersion in einer
wäßrigen Natriumchlorid-Lösung mit
0,9% (G/V) unter Verwendung des Homogenisators suspendiert und für 24 Stunden bei
Umgebungstemperatur ruhen gelassen. Dann wurde die erhaltene Suspension
für 20
Minuten in einem Wasserbad mit 65°C
erwärmt.
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Die
auf diese Weise erhaltene Suspension wurde dem folgenden Abkühlungs-
und Erwärmungs-Zyklus
unterworfen:
- – Kühlen in flüssigem Stickstoff für 1 Minute,
- – Erwärmen auf
65°C, bis
die Phospholipide vollständig
flüssig
sind.
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Dieser
Zyklus wurde 6-mal wiederholt.
-
Die
Suspension wurde zweimal durch ein 0,6 μm-Filter mit der Lipex Biomembrane-Apparatur
geführt.
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Auf
diese Weise wurde eine "Multilamellare
große
Vesikel" (MLV)-Suspension erhalten,
die 6 Zyklen einer kontinuierlichen Extrusion unter Verwendung eines
Extruders des Typs 10 ml Lipex Biomembrane Extruder Thermobarrel
mit 0,1 μm
Polycarbonat CostarTM-Filter bei 65°C unterworfen,
wobei Helium als Extrusionsgas mit einem Druck von 1000 bis 4800
kPa verwendet wurde.
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Auf
diese Weise wurden drei Chargen des Produktes (LM/422a, LM/422b
und LM/422c) hergestellt.
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Die
erhaltenen Daten sind in Tabelle 7 angegeben und zeigen:
- – die
Konzentration an Cyclosporin-A in der wäßrigen Liposomen-Formulierung, ausgedrückt als
Durchschnittswert für
drei Chargen, war 3 mg/ml;
- – die
durchschnittliche Größe der Liposomen
für die
drei Chargen war 119,5 nm;
- – die
eingeschlossene Menge, ausgedrückt
als Durchschnittswert für
die drei Chargen, war 15 μg/ml;
- – die
Formulierungen zeigten kein Liposomenaggregations-Phänomen.
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