HU225594B1

HU225594B1 - Aqueous pharmaceutical composition comprising an active ingredient which is highly insoluble in water

Info

Publication number: HU225594B1
Application number: HU0000910A
Authority: HU
Inventors: Giovanni Cavallo; Leonardo Marchitto
Original assignee: Acraf
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2007-05-02
Also published as: CA2285985A1; AU6398798A; JP4299369B2; KR100515249B1; SK282905B6; US6337087B1; ZA981354B; KR20000075480A; AU740619B2; WO1998036735A1; DK0973505T3; CN1255057A; ITMI970363A1; DE69821001D1; HUP0000910A3; CA2285985C; PL190987B1; PT973505E; PL335208A1; EA199900750A1

Description

(54) Nagyon kis vízoldhatóságú hatóanyagot tartalmazó vizes gyógyszerkészítmény (57) Kivonat

A találmány liposzómákban diszpergált, legfeljebb 0,01 tömeg/térfogat% vízoldhatóságú hatóanyagot tartalmazó vizes gyógyszerkészítményekre vonatkozik, amelyekre az jellemző, hogy a hatóanyag lonidamin vagy bindarit.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás liposzómákban diszpergált, legfeljebb 0,01 tömeg/térfogat% vízoldhatóságú hatóanyagot tartalmazó vizes gyógyszerkészítmények előállítására, amelynek során

a) a hatóanyagot 20 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten lipidekben diszpergálják;

b) a diszperziót egy vizes fázisban szuszpendálják;

c) a szuszpenziót 0-48 órán keresztül környezeti hőmérsékleten tartják;

d) 10-40 percen keresztül 30-75 °C-on melegítik;

e) -150/-200 °C-on fagyasztják;

f) legalább kétszer és legfeljebb nyolcszor megismétlik a d) és e) fázist;

g) 500-1000 nm pórusátmérőjű szűrőmembránon át szűrik;

h) 50-400 nm pórusátmérőjű membránon át extrudálják; és ezzel egyidejűleg

i) a be nem fogott hatóanyagot eliminálják.

HU 225 594 Β1

A leírás terjedelme 6 oldal

HU 225 594 Β1

A találmány nagyon kis vízoldhatóságú hatóanyagot tartalmazó vizes gyógyszerkészítményekre vonatkozik. Közelebbről a találmány olyan gyógyszerkészítményekre vonatkozik, amelyekben a hatóanyag liposzómákban van diszpergálva.

A gyógyszerészet területén jelentős kutatási feladatot jelent az új liposzómakészítmények kifejlesztése. A fejlesztést azonban számos a munka során felmerülő probléma nehezíti, különösen, ha a hatóanyagok nagyon kis vízoldhatóságúak, azaz ha a hatóanyagok vízoldhatósága nem haladja meg 0,01 tömeg/térfogat%-ot.

A kis vízoldhatóságú hatóanyagokat tartalmazó liposzómák előállítására jelenleg alkalmazott eljárások során

a) a hatóanyagot és az előre kiválasztott foszfolipideket egy alkalmas szerves oldószerben, például kloroformban oldják;

b) az oldószert csökkentett nyomás alatt lepárolva egy hatóanyag/foszfolipid filmet nyernek;

c) hozzáadnak egy második szerves oldószert, például terc-butil-alkoholt;

d) az így nyert oldatot a cseppfolyós nitrogén hőmérsékletén fagyasztják;

e) a fagyasztott oldatot liofilizálják;

f) a liofilizált oldatot egy pufferoldattal hidratálva multilamellás liposzómák (MLV) szuszpenzióját nyerik; és

g) a szuszpenziót ultrahanggal kezelve kisebb liposzómák (SUV) szuszpenzióját állítják elő.

Az egyik ilyen eljárást Sharma és munkatársai ismertették [A. Sharma et al., Pharmaceutical Research, 2(6), 889-896(1994)].

Ennek a módszernek azonban az a hátránya, hogy egyrészt rendkívül munkaigényes, másrészt pedig a liposzómákban nyomnyi mennyiségekben jelen vannak a szerves oldószerek.

Az említett szerzők említést tesznek arról, hogy megvizsgáltak különféle módszereket az MLV liposzómák előállítására, például a száraz lipidfilmek (kézi rázogatással végzett) hidratálasát, fagyasztás/olvasztási és egyéb különféle technikákat, például extrudálást, valamint ultrahangos kezelést a liposzómák méretének (utólagos) csökkentésére (MLV -> SUV), és megállapították, hogy a fenteikben részletezett és az a)-g) fázisokat magában foglaló eljárás bizonyult a legelfogadhatóbbnak (idézett mű 890. oldal, jobb hasáb, 51-57. sor). Azonban a szerzők nem utalnak arra, hogy az MLV liposzómák előállítására szolgáló első módszereket és a liposzómák méretének csökkentésére szolgáló második módszereket hogyan kombinálták egymással.

A WO 96/40064 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentésben, a 0 578 629 számú európai szabadalmi bejelentésben, valamint a 4 038 075 és a 4 430 593 számú német szövetségi köztársasági szabadalmi bejelentésben gyógyszerkészítményeket ismertetnek, ahol egy vízben oldhatatlan hatóanyagot liposzómákban diszpergálnak. Ilyen hatóanyag a ciklosporin A, a melatonin és a taxol.

Azonban az előbbiekben említett dokumentumok egyike sem ismertet vizes liposzómakompozíciók előállítására olyan eljárást, amely a fagyasztási és olvasztási technikát extrudálással kombinálja.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az extrudálással kombinált fagyasztási és olvasztási technika bármilyen szerves oldószer alkalmazása nélkül lehetőséget nyújt olyan hatóanyagok vizes liposzómakompozícióinak az előállítására is, amely hatóanyagok vízoldhatósága <0,01 tömeg/térfogat%.

A jelen leírásban és igénypontokban alkalmazott „nagyon kis vízoldhatóságú” kifejezés azokat a vegyületeket jelöli, amelyek vízoldhatósága <0,01 tömeg/térfogat%.

Ezért a találmány tárgyát az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmények előállítása képezi.

A nagyon kis vízoldhatóságú hatóanyagok jellegzetes példái közé tartoznak a következő vegyületek: lonidamin (oldhatóság: 3*10“® g/ml), melatonin [„gyakorlatilag oldhatatlan”, G. S. Shida ef al., J. Pineal Rés., 16, 198-201 (1994)], ciklosporin A [„vízben oldhatatlan”, Analytical Profiles of Drug Substances, 16, 163 (1987)], és bindarit (oldhatóság: IxlO^-4 g/ml).

A találmány szerinti kompozíciók liposzómái előnyösen egy, a következő csoportból kiválasztott komponensből épülnek fel: foszfogliceridek, gliceridek, digliceridek, trigliceridek, foszfolipidek, galaktozil- és glükozillipidek, koleszterin és koleszterinszármazékok, szfingolipidek, valamint az előbbiek keverékei. Még előnyösebben a liposzómák foszfolipidekből állnak.

A találmány szerinti liposzómakompozíciók egyik jellegzetes példája foszfatidil-kolint, lizofoszfatidil-kolint, W-acil-foszfatidil-kolint, foszfatidil-etanol-amint, foszfatidil-szerint, szfingomielint, nempoláris lipideket, triglicerideket, szabad zsírsavakat, D,L-a-tokoferolt tartalmaz.

Az előnyös találmány szerinti liposzómakompozí-

ciók az alábbi összetétellel rendelkeznek:
Komponens	Tömeg%
foszfatidil-kolin	85-97
llzofoszfatidil-kolin	0-5
W-acil-etanol-amin	0-4
foszfatidil-etanol-amin	0-10
trigliceridek	0-1
szabad zsírsavak	0-3
D,L-a-tokoferol	0-1
Egy különösen előnyös találmány szerinti liposzó-
makompozició az alábbi összetétellel rendelkezik:
Komponens	Tömeg%
foszfatidil-kolin	94
lizofoszfatidil-kolin	3
W-acil-etanol-amin	1
foszfatidil-etanol-amin	0,1
trigliceridek	1
szabad zsírsavak	0,75
D.L-a-tokoferol	0,15

A találmány szerinti liposzómák mérete jellegzetesen kisebb mint 500 nm, előnyösen 50-250 nm.

A c) fázis időtartama a liposzómákba befogandó nagyon kis vízoldhatóságú hatóanyag mennyiségétől függ. Az ezen a területen jártas szakember számára nem okoz nehézséget, hogy néhány rutinkísérlet segít2

HU 225 594 Β1 ségével meghatározza az különféle típusú hatóanyagok és liposzómakompozíciók esetén megfelelő időtartamokat.

Előnyösen a vizes fázis egy 0,05-0,9 tömeg/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldatból áll.

A vizes oldat minden egyes tömegegységére számítva a lipideket jellegzetesen 0,01-0,4 tömegrész mennyiségben alkalmazzuk. A hatóanyagot viszont a lipidek minden egyes tömegrészére vonatkoztatva 0,01-0,3 tömegrész mennyiségben alkalmazzuk.

A diszpergátor jellegzetesen egy Ultraturrax™ típusú homogenizátor.

Az extrudálást általában egy extrudálógáz, például sűrített levegő vagy egy, a nitrogén, hélium és argon közül kiválasztott inért gáz alkalmazásával végezzük. Előnyösen a hélium az inért gáz. Az extrudálási fázisban a nyomás előnyösen 500-5500 kPa közötti értékű, és a hőmérséklet előnyösen 20-75 °C, még előnyösebben 40-65 °C. Az alkalmas extruderek jellegzetes példái közé tartozik az 50-600 nm pórusátmérőjű Costar® polikarbonátmembránnal ellátott Lipex Biomembranes Thermobarral Extruder és az Emulsiflex CC Avestin típus.

A h) fázist legalább kétszer és legfeljebb nyolcszor, előnyösen hatszor megismételjük.

Az alábbi példák a találmány illusztrálására szolgálnak, a példák a találmány oltalmi körét, illetve terjedelmét nem korlátozzák.

1. példa

Ultraturrax™ típusú homogenizátor segítségével 100 mg melatonint 10 percen keresztül 30 °C-on 1 g foszfolipidben diszpergáltunk. Közvetlenül ezután a diszperziót az említett homogenizátor alkalmazásával 10 ml 0,9 tömeg/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldatban szuszpendáltuk, majd 20 percen keresztül 55 °C-os vízfürdőben melegítettük.

Az így nyert szuszpenziót az alábbi hűtési és melegítési ciklusnak vetettük alá:

- hűtés cseppfolyós nitrogénben 1 percen keresztül;

- melegítés 55 °C-on a foszfolipidek komplett fluidizációjáig.

Az előbbi ciklust hatszor megismételtük.

A szuszpenziót Lipex Biomembranes berendezés alkalmazásával kétszer átjutattuk egy 0,6 pm-es szűrőn.

A így nyert MLV („Multilamellar Large Vesicle) szuszpenziót egy 0,1 pm Costar™ polikarbonátszűrőkkel ellátott 10 ml-es Lipex Biomembranes Thermobarral típusú extruder és 1000-4800 kPa nyomású hélium extrudálógáz alkalmazásával 55 °C-on 6 folyamatos extrudálásnak vetettük alá.

A fentiekben ismertetett műveletek végrehajtásával a termék három sarzsát (LM/186, LM/188 és LM/190) állítottuk elő.

A sarasokkal a következő vizsgálatokat végeztük el:

- a vizes liposzómakompozícióban lévő melatonin mennyisége (HPLC-analízis);

- liposzómaméret;

- a liposzómákba befogott melatonin mennyisége.

Az alábbi táblázatokban bemutatjuk a mért paramétereket és jelentésüket.

Paraméter	Jelentés
Liposzómaméret	- stabilitás a készítményben (idő)
Melatoninmennyiség	- a melatonin koncentrációja a vizes liposzómakompozícióban - az üregek „fúziójának” mérése

Az így nyert adatokat az 1. táblázatban foglaljuk össze, amelyek azt mutatják, hogy

- a vizes liposzómakompozícióban kapott melatoninkoncentráció - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 8,05* 10^-3 g/ml volt;

- a három sarzs esetén az átlagos méret 93 nm volt;

- a befogott mennyiség - a három saras átlagértékeként kifejezve - 80,5 pg/mg volt;

- a készítmények liposzómaaggregációs jelenséget nem mutattak.

1. táblázat

	HPLC- mennyiség (mg/ml)	Átlagos méret (nm)	Befogott mennyiség (pg/mg) *
LM/186	7,8	85	78
LM/188	8,46	97	84,6
LM/190	7,9	98	79

*: pg hatóanyag/mg alkalmazott foszfolipidek

A HPLC-analízist a következő eljárás alkalmazásával végeztük:

-rögzített fázis: inverz fázisban lévő PKB-100 (250*4,6 mm; 5 pm Supelco) kolonna;

- mozgófázis: 80:20 térfogatarányú víz/acetonitril oldószerelegy;

- detektálás: 254 nm UV.

A liposzómák átlagos méretének az analíziséhez a következő két részből álló berendezést használtuk:

1. DELSA 440 Coulter,

2. NICOMP Submicron részecskeméret-meghatározó (370-es modell).

Az eljárást az alábbiaknak megfelelően hajtottuk végre:

a) az 1. berendezéssel végzett vizsgálatokhoz 1 ml liposzómaszuszpenziót meghígítottunk 10 ml 0,9 tömeg/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldattal;

b) a 2. berendezéssel végzett vizsgálatokhoz 0,5 ml a) oldatot meghígítottunk 10 ml 0,9 tömeg/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldattal.

2. példa

Megismételtük az 1. példában ismertetett eljárást, azzal az eltéréssel, hogy ebben az esetben 1 g foszfolipid helyett 2 g foszfolipidet, és 100 mg melatonin helyett 50 mg lonidamint alkalmaztunk.

HU 225 594 Β1

Előállítottuk a termék három sarzsát (LM/195, GN/1L és GN/2L). Az így nyert adatokat a 2. táblázatban foglaljuk össze, amelyek azt mutatják, hogy

- a vizes kompozícióban a lonidamin koncentrációja a kezdeti 3*10“® g/ml oldhatósági értékről - a három sarzs átlagértékeként kifejezve 3,83* 10^-3 g/ml-re növekedett;

- a három sarzs esetén a liposzómák átlagos mérete 79,6 nm volt;

- a befogott mennyiség - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 19,2 pg/mg volt;

- a készítmények liposzómaaggregációs jelenséget nem mutattak.

2. táblázat

	HPLC- mennyiség (mg/ml)	Átlagos méret (nm)	Befogott mennyiség (gg/ml) *
LM/195	3,66	103	18,3
GN/1L	3,31	53	16,5
GN/2L	4,54	76	22,7

*: pg hatóanyag/mg alkalmazott foszfolipidek

3. példa

Megismételtük az 1. példában ismertetett eljárást, azzal az eltéréssel, hogy ebben az esetben 1 g foszfolipid helyett 2 g foszfolipidet, és 100 mg melatonin helyett 200 mg melatonint alkalmaztunk.

Előállítottuk a termék három sarzsát (GN/1M, GN/2M és GN/3M). Az így nyert adatokat a 3. táblázatban foglaljuk össze, amelyek azt mutatják, hogy

- a vizes liposzómakompozicióban a melatonin koncentrációja - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 13,5*10^-3 g/ml volt;

- a három sarzs esetén a liposzómák átlagos mérete 92,6 nm volt;

- a befogott mennyiség - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 67,6 pg/mg volt;

- a készítmények liposzómaaggregációs jelenséget nem mutattak.

3. táblázat

	HPLC- mennyiség (mg/ml)	Átlagos méret (nm)	Befogott mennyiség (pg/ml)*
GN/1M	10,66	104	53,3
GN/2M	13,90	76	69,5
GN/3M	16,03	98	80,15

*: gg hatóanyag/mg alkalmazott foszfolipidek

4. példa

Megismételtük a 2. példában ismertetett eljárást, azzal az eltéréssel, hogy ebben az esetben az extrudálást 0,1 pm polikarbonátmembrán helyett 0,2 pm polikarbonátmembránnal végeztük.

Előállítottuk a termék három sarzsát (GN/3L, GN/4L és GN/5L).

Az így nyert adatokat a 4. táblázatban foglaljuk össze, amelyek azt mutatják, hogy a lonidamin mennyiségét 20 mg-ról 50 mg-ra növelve, a foszfolipid mennyiségét 1 g-ról 2 g-ra emelve, valamint az extrudálást 0,1 pm membrán helyett 0,2 pm membránnal végezve a 2. példában nyert vizes kompozícióban lévő lonidamin koncentrációja szignifikáns mértékben emelkedett. A lonidamin koncentrációjára 4,47*10^-3 g/ml átlagértéket kaptunk.

4. táblázat

	HPLC- mennyíség (mg/ml)	Átlagos méret (nm)	Befogott mennyiség (pg/ml) *
GN/3L	4,23	134	21,15
GN/4L	4,44	129	22,20
GN/5L	4,75	109	23,75

*: pg hatóanyag/mg alkalmazott foszfolipidek

5. példa

Ultraturrax™ típusú homogenizátor segítségével 20 mg ciklosporin A-t 10 percen keresztül 30 °C-on 1 g foszfolipidben diszpergáltunk. Közvetlenül ezután a diszperziót az említett homogenizátor alkalmazásával 0,9 tömeg/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldatban szuszpendáltuk, ezt követően 24 órán át környezeti hőmérsékleten állni hagytuk, majd az így nyert szuszpenziót 20 percen keresztül 65 °C-os vízfürdőben melegítettük.

- hűtés cseppfolyós nitrogénben 1 percen keresztül;

- melegítés 65 °C-on a foszfolipidek komplett fluidizációjáig.

Az előbbi ciklust hatszor megismételtük.

A így nyert MLV („Multilamellar Large Vesicle”) szuszpenziót egy 0,1 pm Costar™ polikarbonátszűrőkkel ellátott 10 ml-es Lipex Biomembranes Thermobarral típusú extruder és 1000-4800 kPa nyomású hélium extrudálógáz alkalmazásával 65 °C-on 6 folyamatos extrudálási ciklusnak vetettük alá.

Előállítottuk a termék három sarzsát (LM/416A, LM/416B és LM/416C).

Az így nyert adatokat az 5. táblázatban foglaljuk össze, amelyek azt mutatják, hogy

- a vizes liposzómakompozicióban a ciklosporin A koncentrációja - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 0,96* 10^-3 g/ml volt;

- a három sarzs esetén a liposzómák átlagos mérete 103 nm volt;

- a befogott mennyiség - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 9,6 pg/mg volt;

- a készítmények liposzómaaggregációs jelenséget nem mutattak.

HU 225 594 Β1

5. táblázat

	HPLC- mennyiség (mg/ml)	Átlagos méret (nm)	Befogott mennyiség (pg/ml)*
LM/416A	0,96	103	9,6
LM/416B	0,94	99	9,4
LM/416C	0,98	107	9,8

*: pg hatóanyag/mg alkalmazott foszfolipidek

6. példa

Megismételtük az 1. példában ismertetett eljárást, azzal az eltéréssel, hogy ebben az esetben 1 g foszfolipid helyett 2 g foszfolipidet, és 100 mg melatonin helyett 50 mg bindaritot alkalmaztunk.

Előállítottuk a termék három sarzsát (LM/356, LM/357 és LM/358).

Az így nyert adatokat a 6. táblázatban foglaljuk össze, amelyek azt mutatják, hogy

- a vizes kompozícióban a bindarit koncentrációja a kezdeti 1^10^-4 g/ml oldhatósági értékről - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 4 mg/ml-re növekedett;

- a három sarzs esetén a liposzómák átlagos mérete 108,3 nm volt;

- a befogott mennyiség - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 20,2 pg/mg volt;

- a készítmények liposzómaaggregációs jelenséget nem mutattak.

6. táblázat

	HPLC- mennyiség (mg/ml)	Átlagos méret (nm)	Befogott mennyiség (pg/ml) *
LM/356	4,1	109,4	20,5
LM/357	4	109,7	20
LM/358	4	106	20

*: μg hatóanyag/mg alkalmazott foszfolipidek

7. példa

Ultraturrax™ típusú homogenizátor segítségével 30 mg ciklosporin A-t 10 percen keresztül 30 °C-on 2 g foszfolipidben diszpergáltunk. Közvetlenül ezután a diszperziót az említett homogenizátor alkalmazásával 0,9 tömeg/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldatban szuszpendáltuk, ezt követően 24 órán át környezeti hőmérsékleten állni hagytuk, majd az így nyert szuszpenziót 20 percen keresztül 65 °C-os vízfürdőben melegítettük.

- hűtés cseppfolyós nitrogénben 1 percen keresztül;

- melegítés 65 °C-on a foszfolipidek komplett fluidizációjáig.

Az előbbi ciklust hatszor megismételtük.

Előállítottuk a termék három sarzsát (LM/422a, LM/422b és LM/422C).

Az így nyert adatokat a 7. táblázatban foglaljuk össze, amelyek azt mutatják, hogy

- a vizes liposzómakompozícióban a ciklosporin A koncentrációja - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 3 mg/ml volt;

- a három sarzs esetén a liposzómák átlagos mérete 119,5 nm volt;

- a befogott mennyiség - a három sarzs átlagértékeként kifejezve - 15 pg/mg volt;

- a készítmények liposzómaaggregációs jelenséget nem mutattak.

7. táblázat

	HPLC- mennyiség (mg/ml)	Átlagos méret (nm)	Befogott mennyiség (pg/ml) *
LM/422a	3,2	121,5	16
LM/422b	3	117,9	15
LM/422C	2,8	119	14

*: pg hatóanyag/mg alkalmazott foszfolipidek

Claims

1. Eljárás egy liposzómákban diszpergált, legfeljebb 0,01 tömeg/térfogat% vizoldhatóságú hatóanyagot tartalmazó vizes gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) a hatóanyagot 20 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten lipidekben diszpergáljuk;

b) a diszperziót egy vizes fázisban szuszpendáljuk;

c) a szuszpenziót 0-48 órán keresztül környezeti hőmérsékleten tartjuk;

d) 10-40 percen keresztül 30-75 °C-on melegítjük;

e) -150/-200 °C-on fagyasztjuk;

f) legalább kétszer és legfeljebb nyolcszor megismételjük a d) és e) fázist;

g) 500-1000 nm pórusátmérőjű szűrőmembránon át szűrjük;

h) 50-400 nm pórusátmérőjű membránon át extrudáljuk; és ezzel egyidejűleg

i) a be nem fogott hatóanyagot elimináljuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vizes fázis egy 0,05-0,9 tömeg/térfogat%-os vizes nátrium-klorid-oldatból áll.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a víz minden egyes tömegrészére vo5

HU 225 594 Β1 natkoztatva a lipideket 0,01 tömegrész és 0,4 tömegrész közötti menynyiségben alkalmazzuk.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lipidek minden egyes tömegrészére vonatkoztatva a hatóanyagot 0,01 tömegrész és 0,3 tömegrész közötti mennyiségben alkalmazzuk.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a h) fázisban egy, a levegő, a nitrogén, a hélium és az argon közül kiválasztott extrudálógázt alkalmazunk.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az extrudálógáznak a nyomása 500 kPa és 5500 kPa közötti értékű.

7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 5 azzal jellemezve, hogy a h) fázist 20 °C és 75 °C közötti hőmérséklet-tartományban hajtjuk végre.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hőmérséklet értéke 40 °C-tól 65 °C-ig terjed.

9. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, 10 azzal jellemezve, hogy a h) fázist legalább kétszer és legfeljebb nyolcszor megismételjük.