KR100496802B1

KR100496802B1 - 물에 난용성인 활성성분이 캡슐화 되어 있는 동결 건조된 리포솜들을 함유하는 약학적 제제 및 그 제제의 제조공정

Info

Publication number: KR100496802B1
Application number: KR10-1999-7007538A
Authority: KR
Inventors: 카발로지오반니; 마르치토레오나르도
Original assignee: 아지엔드 키미쉐 리유나이트 안젤리니 프란체스코 에이.씨.알.에이.에프. 에스.피.에이
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2005-06-22
Also published as: HK1026148A1; CZ295998B6; BG64580B1; TR199902025T2; AU744115B2; UA70296A; HUP0001464A3; HU225593B1; ES2235320T3; CZ292599A3; CA2288958C; EA001637B1; AU6496998A; CA2288958A1; PL190628B1; PT981332E; UA70296C2; CN1089581C; SK111099A3; ATE285754T1

Abstract

본 발명은 트레할로스(trehalose)와 생물학적 활성성분이 혼합되어 있는 지질 리포솜(lipid liposomes)을 함유하는 동결건조 조성물에 있어서, 생물학적 활성성분은 물에 난용성이고, 트레할로스:지질의 중량비는 1.5 이하이며, 모든 트레할로스는 동결건조 전에 이미 형성되어 있는 리포솜의 외부에 첨가되는 것을 특징으로 하는 동결건조 조성물에 관한 것이다.

Description

물에 난용성인 활성성분이 캡슐화 되어있는 동결건조된 리포솜들을 함유하는 약학적 제제 및 그 제제의 제조공정{Pharmaceutical Preparation comprising Lyophilized Liposomes encapsulating an active principle which is highly insoluble in water, and the process for preparing the said preparation}

본 발명은 물에 난용성인 생물학적 활성성분이 캡슐화 되어있는 동결건조된 리포솜들을 함유하는 약학적 제제 및 그 제제의 제조공정에 관한 것이다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 물에 난용성이고, 시간의 경과에도 안정한 생물학적 활성성분이 캡슐화 되어있는 동결건조된 리포솜들을 함유하는 약학적 제제에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명과 특허청구범위 사용된 "물에 난용성(highly insoluble in water)"이라는 표현은 물에 대한 용해도가 0.01%(w/v)이하인 모든 화합물을 지칭하기 위해 사용되었다.

리포솜을 의학적 치료의 용도로 사용하는데 있어서, 동결건조시와 시간의 경과에도 충분히 안정한 약학적 제제를 얻는 데는 많은 문제점들이 있다고 알려져 있다. 상기 문제점들은 리포솜을 파열시키거나 다량의 리포솜을 하나로 묶는 경우를 제외한 모든 리포솜들의 제조 시에 존재한다. 즉, 리포솜은 전체가 같이 있거나 서로 분리돼 있어야 한다는 것이다.

특히 리포솜의 활성성분(active principle)이 물에 난용성일 경우에는 구조적으로 완전해야 한다. 사실상, 동결건조시와/또는 보존시에 리포솜이 파열되면 환자에게 투여하기 전에 리포솜 수용액에 생리용액이 첨가되어 재구성될 때, 수용성인 활성성분이 용해되는 것을 막지 못한다. 한편, 물에 난용성인 활성성분들을 함유하는 리포솜이 파열되었을 경우에는, 라이오필리세이트(lyophilisate)가 재구성되어 실제로 요구되는 것보다 활성성분을 덜 함유하는 용액(a solution comprising less active principle)을 제공한다. 파열 리포솜의 양이 많을 수록, 용액 중에서의 이론적 활성성분의 양과 실제 활성성분의 양의 차이는 커진다.

수용성 생물학적 활성성분들을 함유하는 리포솜의 동결건조 방법은 미국 특허 제 4, 857,319호에 개시되어 있다. 이 문헌에는 바람직한 평균크기가 50~100㎚이고, 또한 보존제로써 이당류(disaccharide)를 리포솜의 내부에만(리포솜 내용물에 싸인 체로) 첨가하거나, 또는 리포솜의 외부에만 첨가하거나, 또는 리포솜의 내부와 외부 동시에 첨가하여 리포솜을 동결건조시키는 방법이 개시되어 있다. 이당류:지질의 중량비는 0.1:1~4:1 사이 이다. 이당류로써는 트레할로스(trehalose)가 바람직하다. 냉각단계는 액체질소의 온도(-195.8℃)에서 행해진다.

전술한 특허에 있어서, 동결건조 공정시의 안정특성은 재수화(rehydration) 공정을 거친 라이오필리세이트(lyophilisate)의 재구성 후, 리포솜에 싸여 있는 활성성분의 잔류량을 측정해서 평가되었다.

전술한 특허의 표 2는 트레할로스:지질의 비율이 1.76보다 크고, 트레할로스가 리포솜의 내부와 외부에 동시에 존재할 때만 잔류량이 높다(99~100%)는 것을 나타낸다. 상기 비율이 각각 0.11과 0.19일 때는, 비록 트레할로스가 리포솜의 내부와 외부에 동시에 존재하여도 잔류량이 각각 22%와 49%가 된다. 반대로, 트레할로스가 단지 외부에만 있을 때는, 매우 많은 양의 트레할로스가 존재하여도 남아 있는 활성성분의 양은 급격하게 감소된다는 것을 알 수 있다. 실제로, 트레할로스:지질 비율이 3.9일 때의 잔류량은 26% 뿐이었다.

그럼에도 불구하고, 생물학적 활성성분이 물에 난용성일 때는 상기 결과는 재현할 수조차 없다. 사실상, 리포솜의 제조시, 지질 소포(lipid vesicle) 속에 활성성분을 싸기 위해 트레할로스를 첨가할 경우, 불균질의 압출 불가능한 현탁액(non-homogeneous, non-extrudible suspension)이 얻어졌다(비교예 1과 2의 제조).

그러나 놀랍게도, 물에 난용성인 생물학적 활성성분을 함유하는 리포솜의 경우는 단지 동결건조 전에 적은 양의 트레할로스를 리포솜에 첨가하면 동결건조동안 실질적으로 파열되지 않고 남아 있다는 것을 발견하였다. 그리고, 상기 동결건조는 냉각단계를 -5℃~-70℃의 온도에서 행할 때 효과가 있다는 것을 발견하였다.

본 발명의 목적은 트레할로스와 생물학적 활성성분이 혼합되어 있는 지질 리포솜을 함유하는 동결건조 조성물에 있어서, 생물학적 활성성분은 물에 난용성이고, 트레할로스:지질의 중량비는 1.5 이하이며, 모든 트레할로스는 동결건조 전에 이미 형성되어 있는 리포솜의 외부에 첨가되는 것을 특징으로 하는 동결건조 조성물을 제공하는 것이다.

재수화로 재구성(reconstitution) 된 후, 상기 조성물은 물에 난용성인 생물학적 활성성분을 용액 속에 95% 이상 잔류시킨다(실시예 1, 2, 3).

물에 난용성인 생물학적 활성성분의 대표적인 예로는 로니다민(lonidamine), 멜라토닌(melatonin), 사이크로스포린 A(cyclosporin A)와 빈다릿(bindarit)을 들 수 있다.

본 발명에 따른 동결 건조 공정에 사용되는 리포솜 조성물의 지질들은 포스포글리세리드(phosphoglycerides), 글리세리드(glycerides), 디글리세리드(diglycerides), 트리글리세리드(triglycerides), 인지질(phospholipids), 갈락토스와 글루코스 지질(galactosyl and glucosyl lipids), 콜레스트롤 및 그의 유도체, 스핑고리피드(sphingolipids) 및 이들의 혼합물들로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 바람직한 지질은 인지질이다. 또한, 트레할로스:지질의 중량비는 1:2~1:1이 바람직하다.

리포솜의 평균크기는 50~250㎚이며, 바람직하게는 50~100㎚이다.

본 발명의 두 번째 목적은,

1) 평균크기가 50~250㎚이며, 물에 난용성인 생물학적 활성성분을 함유하는 리포솜을 포함하는 수용성 리포솜 조성물의 지질 1중량부당 트레할로스 0.2~1.5 중량부를 첨가시키는 단계;

2) 상기 조성물을 동결건조기 냉각판(lyophilizer chilling-plate)을 이용해 -5~-70℃의 온도로, 0.5~2.0℃/분의 냉각속도로 냉각시키는 단계;

3) 특정 냉각 온도에 도달하면, 상기 조성물을 그 냉각온도에서 2~5시간 동안 유지시키는 단계;

4) 5×10^-1~8×10^-2밀리바(millibar)의 진공을 적용하고, 냉각판의 온도를 2)단계에서 정의한 냉각온도로 2~5시간 동안 유지시키는 단계;

5) 냉각판의 온도를 -15℃로 한 후, 물이 완전히 제거될 때까지 그곳에 유지시키는 단계;

로 이루어진 것을 특징으로 하는 동결건조공정을 제공하는 것이다.

더 바람직한 작동 조건은 다음과 같다:

단계 2

냉각온도: -20℃에서 -30℃

냉각속도: 0.77℃/분

단계 3

시간: 3시간

단계 4

진공: 6×10^-2 밀리바

단계 5

a) 냉각온도(단계 2)가 -15℃ 미만일 경우, 냉각판의 온도는 0.5℃~2℃의 냉각속도로 -15℃까지 상승하고, 동결건조는 20시간 동안 이루어지며; 그 다음 냉각판의 온도를 -10℃로 올라가게 하고, 한시간 후에는 +5℃로 올라가게 하면, 동결건조는 16시간 동안 일어난다.

b) 냉각온도(단계 2)의 냉각온도가 -15℃ 이상이면, 동결건조는 20시간 동안 지속되고, 냉각판의 온도가 5℃로 올라간 후에는 동결건조가 16시간 동안 일어난다.

본 발명에 의한 특히 바람직한 리포솜 조성물은 다음과 같다.

구성성분	%(w/w)
포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)	: 94
리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine)	: 3
N-아실-에탄올아민(N-acyl-ethanolamine)	: 1
포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine)	: 0.1
트리글리세리드	: 1
유리 지방산(free fatty acids)	: 0.75
DL-α-토코페롤	: 0.15

일반적으로 본 발명의 수용성 약학적 리포솜 조성물은,

a) 물에 난용성인 생물학적 활성성분을 20℃~30℃의 온도에서 지질에 분산시키는 단계;

b) 상기 분산액을 수상(aqueous phase)에 현탁시키는 단계;

c) 상기 현탁액을 0~48시간 동안 실온(ambient temperature)에서 방치하는 단계;

d) 30~75℃로 10~40분 동안 가열하는 단계;

e) -150~-200℃로 냉각하는 단계;

f) 단계 d)와 단계 e)를 적어도 2번 이상, 8번 이하로 반복하는 단계;

g) 구멍의 직경이 500~1000㎚인 여과막(filtering membrane)을 통해 여과하는 단계;

h) 구멍의 직경이 50~400㎚인 막으로 압출하는 단계; 및

i) 트랩되지 않은 활성성분을 제거하는 단계;

에 의해 제조된다.

단계 c)에 걸리는 시간은 리포솜에 트랩되어야 하는 물에 난용성인 활성성분의 양에 따라 달라진다. 이 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이라면 간단한 일상적인 실험을 통해서 각종 활성성분 및 리포솜 조성물을 위한 적당한 시간을 결정하는데 큰 어려움을 겪지는 않을 것이다.

수상은 0.05~0.9%(w/v)의 NaCl 수용액으로 이루어져 있는 것이 보다 바람직하다. 일반적으로, 사용되는 지질의 양은 수용액의 1중량부당 0.01~0.4중량부이다. 또한, 활성성분의 양은 일반적으로 지질 1중량부당 0.01~0.3중량부이다.

일반적으로, 압출은 압축된 공기(compressed air)나 질소, 헬륨 및 아르곤으로 이루어진 군에서 선택된 비활성 기체를 압출기체로 사용할 때 효과적이다. 비활성 기체인 헬륨이 바람직하다. 압출단계의 압력은 바람직하게 500~5500kPa이고, 온도는 20~75℃가 바람직하며, 보다 더 바람직하게는 40~65℃이다. 적합한 압출기의 대표적인 예로는 Lipex Biomembranes Thermobarrel Extruder Type, 또는 구멍의 직경이 50~600㎚인 Costar^TM 폴리카보네이트 막을 가지고 있는 Emulsiflex CC Avestin이 있다.

실제 물에 대한 용해도는 로니다민이 3×10^-3㎎/㎖이고, 빈다릿이 1×10^-1㎎/㎖, 멜라토닌은 물에 불용(G. S. Shida et al. "J. Pineal Res." 1994, 16, 198-201)이고, 사이클로스포린 A도 물에 불용["Insoluble in Water", a monograph of cyclosporin A in "Analytical Profiles of Drug Substances", 16, 163, (1987)) 인 것에 반해, 전술한 방법에 의해 얻어진 수용성 리포솜 조성물들은 약 8㎎/㎖의 멜라토닌, 3.8㎎/㎖의 로니다민, 1㎎/㎖의 사이클로스포린 A와 4㎎/㎖의 빈다릿을 함유한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1

물에 난용성인 생물학적 활성성분들을 함유하는 리포솜 조성물은 하기의 방법으로 제조되었다.

멜라토닌 100㎎을 인지질 1g에 Ultraturrax^TM-Type 호모게나이저를 사용해서, 30℃에서 10분 동안 분산시켰다. 그 다음, 상기 분산액을 0.9%(w/v)의 NaCl 수용액 10㎖에 상기 호모게나이저를 이용해 현탁시키고, 55℃의 물중탕으로 20분 동안 가열하였다.

얻어진 현탁액은 다음의 냉각과 가열 순환 공정을 6회 반복하였다.

- 액체 질소에서 1분 동안 냉각,

- 인지질의 완전한 유동화가 될 때까지 55℃로 가열.

현탁액을 Lipex Biomembranes 장치를 사용해 0.6㎛ 필터를 두 번 통과시켰다.

얻어진 "다층판의 큰 소포(Multilamellar Large Vesicle)"(MLV) 현탁액은 0.1㎛의 Costar^TM 폴리카보네이트 필터를 가진 10-㎖ Lipex Biomembranes Thermobarrel 타입 압출기를 사용하여 6회의 연속-압출 순환공정을 거쳤는데, 이때의 온도는 55℃, 압출기체로는 헬륨을 사용하고 압력은 1000 ~ 4800 kPa이었다.

제조예 2

인지질 1g과 멜라토닌 100㎎ 대신에 인지질 2g과 로니다민 50㎎을 사용한 것 이외에는 제조예 1과 같은 공정을 행하였다.

제조예 3

인지질 1g과 멜라토닌 100㎎ 대신에 인지질 2g과 멜라토닌 200㎎을 사용한 것 이외에는 제조예 1과 같은 공정을 행하였다.

제조예 4

압출시 0.1㎛ 폴리카보네이트막 대신에 0.2㎛ 폴리카보네이트막을 사용하는 것 이외에는 제조예 2와 같은 공정을 행하였다.

제조예 5

사이클로스포린 A 30㎎을 인지질 2g에 Ultraturrax^TM-Type 호모게나이저를 사용해서, 30℃에서 10분 동안 분산시켰다. 그 다음, 상기 분산액을 0.9%(w/v)의 NaCl 수용액에 상기 호모게나이저를 이용해 현탁시키고, 실온에 24시간 동안 방치하였다. 이렇게 해서 얻어진 현탁액을 65℃의 물중탕으로 20분 동안 가열하였다.

- 액체 질소에서 1분 동안 냉각,

- 인지질의 완전한 유동화가 될 때까지 65℃로 가열.

이를 통해 얻어진 "다층판의 큰 소포(Multilamellar Large Vesicle)"(MLV) 현탁액은 0.1㎛의 Costar^TM 폴리카보네이트 필터를 가진 10-㎖ Lipex Biomembranes Thermobarrel 타입 압출기을 사용하여 6회의 연속-압출 순환공정을 거쳤는데, 이때의 온도는 65℃, 압출기체로는 헬륨을 사용하고, 압력은 1000 ~ 4800 kPa이었다.

제조예 6

인지질 1g과 멜라토닌 100㎎ 대신에 인지질 2g과 빈다릿 50㎎을 사용한 것 이외에는 제조예 1과 같은 공정을 행하였다.

비교예 1의 제조

제조예 1A

멜라토닌 100㎎과 트레할로스 1g을 인지질 1g에 Ultraturrax^TM-Type 호모게나이저를 사용해서, 30℃에서 10분 동안 분산시켰다. 그 다음, 상기 분산액을 0.9%(w/v)의 NaCl 수용액 10㎖에 상기 호모게나이저를 이용해 현탁시키고, 55℃의 물중탕으로 20분 동안 가열했다.

- 액체 질소에서 1분 동안 냉각,

- 인지질의 완전한 유동화가 될 때까지 55℃로 가열.

이 방법으로 매우 농도가 짙은 물질이 얻어졌는데, 이 얻어진 물질을 55℃에서 압출기체로 헬륨기체를 사용하고 1000 ~ 4800kPa의 압력하에서 0.1㎛의 Costar^TM 폴리카보네이트 필터를 가진 10-㎖ Lipex Biomembranes Thermobarrel 타입 압출기를 이용해 압출하고자 하였으나 실패하였다.

제조예 1B

멜라토닌을 뺀 것을 제외하고는 제조예 1A와 같은 공정을 행하였다. 이 공정을 통해 얻어진 "다층판의 큰 소포(Multilamellar Large Vesicle)"(MLV) 현탁액은 0.1㎛의 Costar^TM 폴리카보네이트 필터를 가진 10-㎖ Lipex Biomembranes Thermobarrel 타입 압출기를 통해 완벽하게 압출될 수 있음이 판명되었는데, 이때의 온도는 55℃, 압출기체로는 헬륨을 사용하고 압력은 1000 ~ 4800 kPa이었다.

비교예 2의 제조

제조예 2A

인지질 1g 대신에 인지질 2g을 사용한 것을 제외하고는 비교예 1A의 제조와 같은 공정을 행하였다. 이 경우 또한 제조예 1A에서처럼, 매우 농도가 짙고, 압출할 수 없는 물질이 얻어졌다.

제조예 2B

인지질 1g 대신에 인지질 2g을 사용한 것을 제외하고는 비교예 1B의 제조와 같은 공정을 행하였다. 이 경우 또한 제조예 1B에서처럼, 완벽하게 압출할 수 있는 MLV 현탁액이 얻어졌다.

실시예 1

제조예 2에서 얻어진 용액을 1-㎖씩의 부분표본으로 나누고, 각각의 부분표본에 표 1a에 주어진 트레할로스:지질의 중량비에 따라서 트레할로스를 첨가했다.

동결건조는 동결건조판(plate lyophilizer)에서 하기의 방법으로 행하였다;

1) 0.77℃/min의 속도로 -25℃까지 냉각;

2) 상기온도(-25℃)를 3시간 동안 유지;

3) 진공(6×10^-2 밀리바)의 적용과 상기온도(-25℃)를 2시간 동안 유지;

4) 6×10^-2 밀리바의 진공에서 -15℃로 20시간 동안 가열;

5) 6×10^-2 밀리바의 진공에서 -10℃로 2시간 동안 가열;

6) 6×10^-2 밀리바의 진공에서 +5℃로 20시간 동안 가열;

7) 진공을 닫고;

8) 공기주입.

삭제

1㎖의 라이오필리세이트를 1㎖의 증류수(distilled water)로 재수화시키고, 리포솜이 충분히 재구성될 수 있도록 실온에서 30분 동안 유지하였다.

상기 용액 0.5㎖를 10㎖ 생리용액(physiological solution)으로 다시 한번 희석하여 NICOMP 370 장치로 리포솜의 평균크기를 측정하고, 그 결과를 표 1a에 나타내었다.

동결건조 전, 후의 리포솜의 평균크기

배치	트레할로스 : 지질(중량비;w/w)	동결건조 전	동결건조 후
LM/302	0	102	911.7
	1:2	102	115.9
	1:1	102	109.7
	2:1	102	167.9
LM/303	0	99.2	911.7
	1:2	99.2	98.7
	1:1	99.2	109.8
	2:1	99.2	291.3
LM/304	0	98.6	911.8
	1:2	98.6	94.9
	1:1	98.6	105.8
	2:1	98.6	794

표1a에서 트레할로스가 없을 때, 리포솜의 평균크기가 증가한 것으로 보아, 일정 정도의 리포솜의 융합(fusion)이 수반됨을 알 수 있다. 놀랍게도, 트레할로스의 양이 증가(트레할로스 : 지질의 중량비가 2:1일 때)시에도 또한 일정 정도의 융합을 일으켜 평균크기의 증가를 가져왔다.

제조예 4의 경우 또한 유사한 결과를 얻었다.

상술한 방법에 의해 갓 제조한 몇 개의 표본으로부터 리포솜의 평균크기와 로니다민의 양을 측정했다. 그 후, 그 표본들을 5℃ 냉장고에 다시 넣고 일정 간격으로 표본추출 했으며, 활성물질의 양과 리포솜의 평균크기를 측정하기 위해 재수화시켰고, 그 결과를 표 1b에 나타내었다.

트레할로스:지질(중량비;w/w)=1:2

배치	시간(개월)	HPLC양(㎎/㎖)	평균크기(㎚)
LM/328	t₀	3.3	107
	1	3.2	110
	3	3.2	114
	6	3.1	127.2
LM/329	t₀	3.2	103.3
	1	3.2	101
	3	3.2	110.5
	6	3.1	115
LM/330	t₀	3.3	99.2
	1	3.4	99.5
	3	3.2	100.5
	6	3.1	113.6

실시예 2

제조예 3을 상기 실시예 1과 같이 동결건조시키고, 동결건조 전과 후의 리포솜의 평균크기를 측정하여, 그 결과를 표 2a에 나타내었고, 갓 제조한 리포솜 및 그 표본을 5℃에서 보관하면서 상기한 실시예의 방법과 같이 리포솜의 평균크기와 멜라토닌의 양을 측정하고, 그 결과를 표 2b에 나타내었다.

동결건조 전, 후의 리포솜의 평균크기

배치	트레할로스 : 지질(중량비;w/w)	동결건조 전	동결건조 후
LM/336	0	92	16953
	1:2	92	6875
	1:1	92	96.5
	2:1	92	109.7
LM/337	1:2	92	146.3
	1:1	92	98.8
	2:1	92	8319.8
LM/338	1:2	92	179.7
	1:1	92	225.7
	2:1	92	2984

제조예 1에서도 유사한 결과를 얻었다.

트레할로스:지질(중량비;w/w)=1:1

배치	시간(개월)	HPLC양(㎎/㎖)	평균크기(㎚)
LM/359	t₀	6	104
	1	6	103.2
	3	5.8	109.5
LM/360	t₀	6.5	107.2
	1	6.5	106.3
	3	6.7	113.6
LM/361	t₀	6.2	98.4
	1	6.3	99
	3	6	100.5

실시예 3

제조예 6을 상기 실시예 1과 같이 동결건조시키고, 동결건조 전과 후의 리포솜의 평균크기를 측정하여, 그 결과를 표 3a에 나타내었고, 갓 제조한 리포솜의 평균크기와 빈다릿의 양 및 그 표본을 5℃에서 보관하면서 리포솜의 평균크기와 빈다릿의 양을 상기한 실시예의 방법과 같이 측정하고, 그 결과를 표 3b에 나타내었다.

동결건조 전, 후의 리포솜의 평균크기

배치	트레할로스 : 지질(중량비;w/w)	동결건조 전	동결건조 후
LM/342	0	102.7	7524.1
	1:2	102.7	928
	1:1	102.7	109
	2:1	102.7	140
LM/343	1:2	102.7	546.6
	1:1	102.7	112.3
	2:1	102.7	1559.2
LM/344	1:2	102.7	194.9
	1:1	102.7	112.2
	2:1	102.7	4722

트레할로스:지질(중량비;w/w)=1:1

배치	시간(개월)	HPLC양(㎎/㎖)	평균크기(㎚)
LM/356	t₀	3.2	135.4
	1	3.1	128
	3	3.2	131.3
LM/357	t₀	3.1	122
	1	3.1	121
	3	3.2	126.2
LM/358	t₀	3.1	126
	1	3.1	122.8
	3	2.9	121.8

비교실시예 1

제조예 2에서 얻어진 용액을 1㎖씩의 부분표본으로 나누고, 각각의 부분표본에 비교표 1에 주어진 트레할로스:지질의 중량비에 따라서 트레할로스를 첨가했다.

이렇게 해서 준비된 것들을 액체질소의 온도(-195.8℃)에서 냉동시키고, 외부 온도 조절없이 20시간 동안 동결건조시켰다.

1㎖의 라이오필리세이트를 1㎖의 증류수로 재수화시키고, 실온에서 2시간 동안 방치하였다.

상기 용액 0.5㎖를 10㎖ 생리용액으로 다시 한번 희석하고 NICOMP 370 장치를 사용해 리포솜의 평균크기를 측정하고, 그 결과를 하기 비교표 1에 나타내었다.

[비교표 1]

동결건조 전, 후의 리포솜의 평균크기

배치	트레할로스 : 지질(중량비;w/w)	동결건조 전	동결건조 후
LM/302	0	102	911.8
	1:2	102	254.8
	1:1	102	219.3
	2:1	102	773.7
LM/303	0	99.2	911.8
	1:2	99.2	349.9
	1:1	99.2	180.4
	2:1	99.2	717.2
LM/304	0	98.6	911.8
	1:2	98.6	722.5
	1:1	98.6	161.1
	2:1	98.6	150

비교표 1을 통해 ,액체질소의 온도에서 동결건조가 행해질 때는 트레할로스가 없을 때나 또는 상기 표에서 주어진 중량비로 트레할로스가 있을 때나 리포솜의 평균크기가 증가하는 것으로 보아, 일정 정도의 리포솜의 융합(fusion)이 일어남을 알 수 있다. 더구나, 상기 데이터로부터 액체질소의 온도에서 동결건조가 행해질 때는 동결건조 공정 자체(같은 조성물의 제조예들)가 항상 같은 결과를 재현하는 것은 아님을 알 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제공된 동결건조된 리포솜 제제는 물에 거의 불용성이고, 시간의 경과에도 안정한 활성성분을 함유하고 있어서 의학적 치료의 용도로 사용될 수 있을 것이다.

Claims

트레할로스(trehalose)와 생물학적 활성성분이 혼합되어 있는 지질 리포솜(lipid liposomes)을 함유하는 동결건조 조성물에 있어서, 상기 생물학적 활성성분은 로니다민(lonidamine), 멜라토닌(melatonin), 사이클로스포린(cyclosporine) 및 빈다릿(bindarit)으로 이루어진 군에서 선택된 것이고, 트레할로스:지질의 중량비는 1.5 이하이며, 모든 상기의 트레할로스는 동결건조 전에 이미 형성되어 있는 리포솜의 외부에 첨가되는 것을 특징으로 하는 동결건조 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기의 지질은 포스포글리세리드(phosphoglycerides), 글리세리드(glycerides), 디글리세리드(diglycerides), 트리글리세리드(triglycerides), 인지질(phospholipids), 갈락토스와 글루코스 지질(galactosyl and glucosyl lipids), 콜레스트롤 및 그의 유도체, 스핑고리피드(sphingolipids) 및 그들의 혼합물들로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 동결건조 조성물.
제 3항에 있어서, 지질은 인지질임을 특징으로 하는 동결건조 조성물.
제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 트레할로스:지질의 중량비가 1:2~1:1임을 특징으로 하는 동결건조 조성물.
제 1항, 제 3항 및 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜의 평균크기가 50 ~ 250㎚임을 특징으로 하는 동결건조 조성물.
제 6항에 있어서, 리포솜의 평균크기가 50 ~ 100㎚임을 특징으로 하는 동결건조 조성물.
트레할로스와 생물학적 활성성분이 섞인 지질 리포솜을 함유하는 조성물의 동결건조 공정에 있어서,

a) 평균크기가 50~250㎚이며, 로니다민(lonidamine), 멜라토닌(melatonin), 사이클로스포린(cyclosporine) 및 빈다릿(bindarit)으로 이루어진 군에서 선택된 생물학적 활성성분을 함유하는 리포솜을 포함하는 수용성 리포솜 조성물의 지질 1중량부당 트레할로스 0.2~1.5 중량부를 첨가시키는 단계;

b) 상기 조성물을 동결건조기 냉각판을 이용해 -5~-70℃의 온도로, 0.5~2.0℃/분의 냉각속도로 냉각시키는 단계;

c) 특정 냉각 온도에 도달하면, 상기 조성물을 그 냉각온도에서 2~5시간 동안 유지시키는 단계;

d) 5×10^-1~8×10^-2밀리바(millibar)의 진공을 적용하고, 냉각판의 온도를 b)단계에서 정의한 냉각온도로 2~5시간 동안 유지시키는 단계;

e) 냉각판의 온도를 -15℃로 한 후, 물이 완전히 제거될 때까지 그곳에 유지시키는 단계;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 동결건조공정.
제 8항에 있어서, 단계 (b)에서의 동결온도는 -20℃~-30℃임을 특징으로 하는 동결건조공정.
제 8항에 있어서, 단계 (b)에서의 냉각속도는 0.77℃/min 임을 특징으로 하는 동결건조공정.
제 8항 내지 10항중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서의 시간은 3시간임을 특징으로 하는 동결건조공정.
제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)에서의 진공은 6×10^-2 밀리바(millibar)임을 특징으로 하는 동결건조공정.