CZ292599A3

CZ292599A3 - Farmaceutický přípravek obsahující lyofilizované liposomy enkapsulující aktivní substanci, která je vysoce nerozpustná ve vodě a způsob přípravy tohoto přípravku

Info

Publication number: CZ292599A3
Application number: CZ19992925A
Authority: CZ
Inventors: Giovanni Cavallo; Leonardo Marchitto
Original assignee: Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A. C. R. A. F. S. P. A.
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2000-01-12
Also published as: HK1026148A1; CZ295998B6; BG64580B1; TR199902025T2; AU744115B2; UA70296A; HUP0001464A3; HU225593B1; ES2235320T3; CA2288958C; EA001637B1; AU6496998A; CA2288958A1; KR100496802B1; PL190628B1; PT981332E; UA70296C2; CN1089581C; SK111099A3; ATE285754T1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického přípravku obsahujícího lyofilizované liposomy enkapsulující biologicky aktivní substanci , která je vysoce nerozpustná ve vodě a způsobu přípravy tohoto přípravku.

Obzvláště se vynález týká farmaceutického přípravku obsahujícího lyofilizované liposomy enkapsulující biologicky aktivní substanci, která je vysoce nerozpustná ve vodě a stabilní v čase.

V předkládaném popisu a v patentových nárocích je termín vysoce nerozpustný ve vodě používán k popisu všech těch sloučenin, jejichž rozpustnost ve vodě je rovna nebo menší než 0,01% (hmotnost/objem).

Dosavadní stav techniky

Je známo, že používání liposomů v léčbě bylo ztěžováno obtížemi, které se vyskytují při získávání farmaceutických přípravků, které by byly dostatečně stabilní jak během lyofilizace, tak během času. Uvedené obtíže spočívají především v přípravě liposomů které ani nepraskají, ani se nespojují. Jinými slovy, liposomy by měly zůstat celé a vzájemně oddělené .

Strukturální integrita liposomů je také obzvláště důležitá v tom případě, kdy je aktivní substance vysoce neroz• · 4 4 4 4 • 4

44· • Λ • 4 4

4·4 444 »

• 4 · · pustná ve vodě. Praskání liposomů během lyofilizace a/nebo během konzervace není ve skutečnosti pro aktivní substance rozpustné ve vodě překážkou pro vstup do roztoku, když je vodný liposomální roztok rekonstituován před podáváním pacientovi přidáním fyziologického roztoku. Na druhou stranu v případě praskání liposomů obsahujících aktivní substance, které jsou vysoce nerozpustné ve vodě, rekonstituce lyofilizátu vede ke vzniku roztoku obsahujícího méně aktivní substance, než je vyžadováno. Čím je větší množství prasklých liposomů, tím je větší rozdíl mezi teoretickým a skutečným množstvím aktivní substance v roztoku.

Způsob lyofilizace liposomů obsahujících ve vodě rozpustné biologicky aktivní substance je popsán v US-A4 857 319. Tento dokument popisuje lyofilizaci liposomů nejlépe o průměrné velikosti okolo 50 až 100 nm s přídavkem disacharidu jako konzervačního činidla pouze na vnitřní straně (spolu s enkapsulovaným obsahem liposomů) nebo pouze na vnější straně nebo na vnitřní i vnější straně. Poměr hmotností disacharid/lipid se pohybuje v rozmezí 0,1:1 až 4:1. Výhodně disacharidem je trehalosa. Fáze mrazeni se provádí při teplotě kapalného dusíku (-195,8 °C).

Ve výše zmíněném patentu byly stabilitní charakteristiky během lyofilizace vyhodnocovány prostřednictvím měření zadržení aktivní substance enkapsulované v liposomech po rekonstituci lyofilizátu cestou rehydratace.

Tabulka 2 výše uvedeného patentu ukazuje, že zadržení je vysoké (99 až 100%) pouze v případě, kdy poměr trehalosa/lipid je větší než 1,76 a kdy je trehalosa přítomna jak uvnitř, tak na vně liposomů. Když je uvedený poměr roven 0,11 a 0,19, je zadržení rovno 22 % respektive 49 % i když • · · ·« · je trehalosa přítomna jak uvnitř, tak vně liposomů. Oproti tomu, když je trehalosa přítomna pouze vně, je množství zadržené aktivní substance drasticky sníženo dokonce i když je použito velmi velké množství trehalosy. Pokud je poměr trehalosa/lipid 3,9 pak je ve skutečnosti množství zadržené substance pouze 26 %.

Výše zmíněné výsledky nejsou nicméně reprodukovatelné je-li biologicky aktivní substance vysoce nerozpustná ve vodě. Když je trehalosa přidána během přípravy liposomů, aby byla enkapsulována uvnitř lipidových vesikul, ve skutečnosti se získá nehomogenní, neextrudovatelná suspenze (přípravky pro srovnání 1 a 2).

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že liposomy obsahující biologicky aktivní substanci, která je vysoce nerozpustná ve vodě, zůstávají v průběhu lyofilizace v podstatě celé, pokud se k liposomům pouze před lyofilizací přidá trehalosa v malém množství a uvedená lyofilizace se provádí tak, že fáze mrazení probíhá při teplotách v rozmezí -5 až -70 °C.

Předmětem předloženého vynálezu je poskytnutí lyofilizované směsi obsahující trehalosu a lipidové liposomy, v nichž je zahrnuta biologicky aktivní substance, vyznačující se tím, že biologicky aktivní substance je vysoce nerozpustná ve vodě, hmotnostní poměr trehalosa/lipid je roven nebo menší než 1,5 a veškerá trehalosa byla před lyofilizací přidána vně již vytvořených liposomů.

Po rekonstituci rehydratací, zadržuje uvedená směs • · · · « · ♦ · · • « ·

• · · «· · · • 1 v i i · · « • · · · · · · • » ·· ·«· ··· • » 1 1 9 • 9 « · * » * 9· v roztoku více než 95 % biologicky aktivní substance, která je vysoce nerozpustná ve vodě (příklady 1, 2 a 3).

Typickými příklady biologicky aktivních substancí, které jsou vysoce nerozpustné ve vodě jsou lonidamin, melatonin, cyklosporin A a bindarit.

Lipidy liposomové směsi, která má být vystavena procesu lyofilizace podle tohoto vynálezu, jsou výhodně zvoleny ze skupiny zahrnující fosfoglyceridy, glyceridy, diglyceridy, triglyceridy, fosfolipidy, galaktosyllipidy a glukosyllipidy, cholesterol a jeho deriváty, sfingolípidy a jejich směsi. Výhodnými lipidy jsou fosfolipidy. Výhodný hmotnostní poměr trehalosa/lipid leží mezi 1:2 a 1:1.

Průměrná velikost liposomů může být v rozmezí 50 až 250 nm. Nejvhodnější je v rozmezí 50 až 100 nm.

Druhým předmětem tohoto vynálezu je způsob lyofilizace, který se vyznačuje tím že:

1) od 0,2 až do 1,5 dílů hmotnostních treahalosy se přidá na každý díl hmotnostní lipidů vodné liposomální směsi, v níž průměrná velikost liposomů leží v rozmezí 50 až 250 nm, a uvedené liposomy obsahují biologicky aktivní substanci, která je vysoce nerozpustná ve vodě,

2) uvedená směs se ochladí prostřednictvím chladicí desky lyofilizeru na teplotu v rozmezí -5 až -70 °C, rychlostí chlazení mezi 0,5 až 2 °C/min

3) jakmile je dosažena předem určená teplota, na niž má být směs ochlazena, uvedená směs se udržuje po dobu mezi 2 až 5 hodinami při této teplotě,

4) směs se vystaví podtlaku v rozmezí 50 až 8 Pa, při9 9 · ··· ¢9 9 · · · 9 · * • · '9 · 9 9 » ·»··»·

9 9 9 9 9 čemž teplota chladicí desky se ponechá na hodnotě stanovené v bodě 2) po dobu trvající mezi 2 až 5 hodina mi,

5) teplota chladicí desky se upraví na -15 °C a udržuje se do té doby, dokud se voda zcela neodstraní.

Výhodné pracovní podmínky jsou následující:

fáze 2 teplota mrazení: -20 až - 30°C rychlost chlazení: 0,77 °C/min fáze 3 čas: 3 hodiny fáze 4 podtlak: 6 Pa fáze 5

a) Je-li teplota mrazení (fáze 2) pod -15 °C, zvýši se teplota chladicí desky na -15 °C rychlostí 0,5 až 2 °C a lyofilizace probíhá 20 hodin, potom se teplota chladicí desky upraví na -10 °C a po hodině na +5 °C a lyofilizace probíhá 16 hodin.

b) Je-li teplota mrazení (fáze 2) vyšší nebo rovna

-15 °C, pokračuje lyofilizace 20 hodin, po jejichž uplynutí se teplota chladicí desky upraví na +5 °C a lyofilizace probíhá 16 hodin.

Obzvláště výhodné složení liposomu podle tohoto vyná lezu obsahuje:

Složka % hmotnostní

9 9

9 9 9 9 9 * 9

9 «9 fosfatidylcholin lysofosfatidylcholin

N-acyl-ethanolamin fosfatidylethanolamin triglyceridy volné mastné kyseliny

DL- -tokoferol

0,1

0,75

0,15

Typicky se vodná farmaceutická liposomální směs podle tohoto vynálezu připravuje tak, že:

a) biologicky aktivní substance, která je vysoce nerozpustná ve vodě, se disperguje v lipidech při teplotě v rozmezí 20 až 30 °C,

b) uvedená disperze se suspenduje ve vodné fázi,

c) uvedená suspenze se nechá stát při teplotě místnosti po dobu 0 až 48 hodin,

d) zahřívá se na 30 až 75 °C po dobu 10 až 40 minut,

e) zmrazí se na -150 až -200 °C,

f) fáze d) a e) se opakují přinejmenším dvakrát a ne více než osmkrát,

g) zfiltruje se na filtrační membráně s póry o průměru 500 až 1000 nm,

h) podrobí se extruzi na membráně s póry o průměru 50 • φ * φ φ φ ♦ · φ

φφφφ « φφ φφφ φ • φ β φ « φ φ φφφ φφφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ·φ φφφ » · • · φ φ až 400 nm, a současně

i) se odstraňuje aktivní substance, která nebyla zachycena.

Trvání fáze c) závisí na množství aktivní substance, která je vysoce nerozpustná ve vodě, jež má být v liposomech zachycena. Odborník v oboru nebude tedy při použití několika jednoduchých rutinních experimentů mít žádné potíže při určování vhodného času pro každý typ aktivní substance a liposomální směsi.

Nejvhodnější složení vodné fáze je 0,05 až 0,9 % (hmotnost/objem) vodného roztoku chloridu sodného. Typicky je množství použitých lipidů 0,01 až 0,4 dílů hmotnostních na každý díl hmotnostní vodného roztoku. Množství aktivní substance obecně naopak leží v rozmezí 0,01 až 0,3 dílu hmotnostního na každý díl hmotnostní lipidů.

Extruze se obecně provádí za použití extruzního plynu, jímž je buď stlačený vzduch nebo inertní plyn ze skupiny plynů zahrnující dusík, helium a argon. S výhodou inertním plynem je helium. Tlak v extruzní fázi je nejvhodnější v rozmezí 500 až 5500 kPa, nejvhodnější teplota leží v rozmezí 20 až 75 °C, ještě vhodnější je rozmezí teplot 40 až 65 °C. Typickými příklady vhodných extrudérů jsou extrudéry typu Lipex Biomembranes Thermobarrel Extruder nebo Emulsiflex CC Avestin s polykarbonátovou membránou Costar™ s póry o průměru mezi 50 až 600 nm.

Podle postupu uvedeného výše se získají vodné liposomální směsi obsahující okolo 8 mg/ml melatoninu, 3,8 mg/ml lonidaminu, 1 mg/ml cyklosporinu A a 4 mg/ml bindaritu, při• · © · · · © · · © © • ř>

49 9 © čemž rozpustnost těchto látek ve vodě je 3 x 10“³ mg/ml (lonidamin), 1 x 10^_x mg/ml (bindarit) a prakticky absolutně nerozpustné jsou melatonin (G.S. Shida a kol., J. Pineal Res., 16, 198 - 201, (1994).) a cyklosporin A [Insoluble in Water, monografie o cyklosporinu A v Analytical Profiles of Drug Substances, 16., 163 (1987)].

Následující příklady slouží k ilustraci předloženého vynálezu, aniž by jej však omezovaly.

Příklady provedení vynálezu

Přípravek I

Podle níže uvedeného popisu byla připravena liposomová směs obsahující biologicky aktivní substanci, která je vysoce nerozpustná ve vodě.

100 mg melatoninu se 10 minut disperguje v 1 g fosfolipidů při teplotě 30 °C pomocí homogenizátoru typu Ultraturrax™. Ihned poté se uvedená disperze pomocí uvedeného homogenizátoru suspenduje v 10 ml 0,9% (hmotnost/objem) vodného roztoku chloridu sodného a potom se 20 minut zahřívá na vodní lázni při teplotě 55 °C.

Takto získaná suspenze se vystaví následujícímu cyklu ochlazování a zahřívání:

- ochlazování v tekutém dusíku po 1 minutu,

- zahřívání na 55 °C dokud fosfolipidy nebudou zcela fluidizovány.

Uvedený cyklus se opakuje šestkrát.

4 4 ·4 44 *·

4444 444 4 • 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4« 444 444

4 4 · · «44 44 · · 4 »

Suspenze se dvakrát zfiltruje filtrem o průměru pórů 0,6 m za použití přístroje Lipex Biomembranes.

Takto byla získána suspenze multilamelárních velkých vesikul” [Multilamellar Large Vesicle (MLV)] a ta byla podrobena 6 kontinuálním cyklům extruzí za použití lOml extrudéru typu Lipex Biomembranes Thermobarrel s polykarbonátovými filtry Costar™ o průměru pórů 0,1 m při teplotě 55°C za použití helia jako extruzního plynu při tlaku v rozmezí 1000 až 4800 kPa.

Přípravek II

Postupuje se tak, jak je popsáno u přípravku I s tím rozdlem, že se použijí 2 g fosfolipidů a 50 mg lonidaminu místo 1 g fosfolipidů a 100 mg melatoninu.

Přípravek III

Postupuje se tak, jak je popsáno u přípravku I s tím rozdílem , že se použijí 2 g fosfolipidů a 200 mg lonidaminu místo 1 g fosfolipidů a 100 mg melatoninu.

Přípravek IV

Postupuje se tak, jak je popsáno u přípravku II s tím rozdílem, že extruze probíhá za použití polykarbonátové membrány s póry o průměru 0,2 m místo 0,1 m.

• » ··*· • · » • * • 9 • 9 · · 0 * «« 89

8 9 9 8 8

8 9 8 8 8

8 ί 998 8 9 9

9 9 8

989 88 0 8

Přípravek V mg cyklsporinu A se 10 minut disperguje ve 2 g fosfolipidů při 30 °C pomocí homogenizátoru typu Ultraturrax™. Ihned potom se uvedená disperze suspenduje v 0,9% (hmotnost/objem) vodném roztoku choridu sodného za použití uvedeného homogenizátoru a nechá se stát 24 hodin při teplotě místnosti. Poté se získaná suspenze zahřívá 20 minut na vodné lázni při teplotě 65 °C.

Takto získaná suspenze se vystaví následujícímu cyklu chlazení a zahříváni:

- ochlazování v tekutém dusíku po 1 minutu,

- zahřívání na 65 °C dokud fosfolipidy nebudou zcela fluidizovány.

Uvedený cyklus se opakuje šestkrát.

Takto byla získána suspenze multilamelárních velkých vesikul¹¹ [Multilamellar Large Vesicle (MLV)] a ta byla podrobena 6 kontinuálním cyklům extruzí za použití 10 ml extrudéru typu Lipex Biomembranes Thermobarrel s polykarbonátovými filtry Costar™ o průměru pórů 0,1 m při teplotě 65°C za použití helia jako extruzního plynu při tlaku v rozmezí 1000 až 4800 kPa.

• 0 0 0··

000 0000 000 0 0 · · *

0 0 V 0 0 0

0 0· ·00 00·

0 0 · ·

000 00 0« «0

Přípravek VI

Postupuje se tak, jak je popsáno u přípravku I s tím rozdílem, že se použijí 2 g fosfolipidů a 50 mg bindaritu místo 1 g fosfolipidů a 100 mg melatoninu.

Přípravek pro srovnání 1

Přípravek IA

100 mg melatoninu a 1 g trehalosy se 10 minut disperguje v 1 g fosfolipidů při teplotě 30 °C pomocí homogenizátoru typu Ultraturax™. Ihned poté se uvedená disperze pomocí uvedeného homogenizátoru suspenduje v 10 ml 0,9% (hmotnost/objem) vodného roztoku chloridu sodného a potom se 20 minut zahřívá na vodní lázni při teplotě 55 ^θ<?.

- ochlazování v tekutém dusíku po 1 minutu,

- zahřívání na 55 °C dokud fosfolipidy nebudou zcela fluidizovány.

Uvedený cyklus se opakuje šestkrát.

Takto byla získána velmi hustá hmota. Pokus o její extruzi za použití 10 ml extrudéru typu Lipex Biomembranes Thermobarrel s polykarbonátovými filtry Costar™ o průměru pórů 0,1 m při teplotě 55°C za použití helia jako extruzní• 0 0 0 · ·

0 0 0

0 0000 0

00 00 0· 000 0 0 »0 ·

0 0 0 0 0 0

0 00 ·00 00·

0 0 0 ·

00» 00 0 ♦ * » ho plynu při tlaku v rozmezí

1000 až 4800 kPa byl neúspěšný.

Přípravek pro srovnání 2

Přípravek 2A

Postupuje se tak, jak bylo popsáno pro účely přípravku pro srovnání IA s tím rozdílem, že namísto 1 g fosfolipidů se použily gramy 2.

V tomto případě se rovněž získala velmi hustá, neextrudovatelná hmota.

Přípravek 2B

Postupuje se tak, jak bylo popsáno u přípravku pro srovnání 1B s tou výjimkou, že namísto 1 g fosfolipidů se použily gramy 2.

V tomto případě se rovněž získala dokonale extrudovatelná MVL suspenze.

Příklad 1

Přípravek II se rozdělí na alikvotní části o objemu 1 ml a ke každé z nich se přidá trehalosa podle hmotnostního poměru trehalosa/lipid uvedeného v tabulce 1/1.

Lyofilizace se provádí na deskovém lyofilizátoru násle

4 · * · · • 4 ·

4 · 4 4 4 • 44 4« «· «4· 4 · ♦ * · • 4 4 »444

4 44 444 444

4 4 · ·

444 44 »· » * dujícím způsobem:

1) chladí se na -25 °C rychlostí 0,77 °C/min,

2) uvedená teplota (-25 °C) se udržuje po 3 hodiny,

3) vystaví se podtlaku (6 Pa) a udržuje se 2 hodiny na uvedené teplotě (-25 °C),

4)	20	hodin	se	zahřívá	na	-15	°C za podtlaku	6 Pa,
5)	2	hodiny	se	zahřívá	na	-10	°C za podtlaku	6 Pa,
6)	20	hodin	se	zahřívá	na	+5 '	^aC za podtlaku 6	Pa,

7) ukonči se podtlak a

8) vpustí se vzduch.

Lyofilizát (1 ml) se rehydratuje 1 ml destilované vody a 30 minut se udržuje za teploty místnosti, aby se umožnila účinná rekonstrukce liposomů.

0,5 ml uvedeného roztoku se dále naředí 10 ml fyziologického roztoku, aby se mohla pomocí přístroje NICOMP 370 změřit průměrná velikost liposomů.

Tabulka 1/1 ukazuje získané výsledky.

« 9

Tabulka 1/1

Průměrná velikost liposomů před a po lyofilizaci
Šarže	Trehalosa/lipidy (hmotnostně)	Před	Po
LM/302	0	102	911,7
	1:2	102	115,9
	1:1	102	109,7
	2:1	102	167,9
LM/303	0	99,2	911,7
	1:2	99,2	98,7
	1:1	99,2	109,8
	2:1	99,2	291,3
LM/304	0	98,6	911,8
	1:2	98,6	94,9
	1:1	98,6	105,8
	2:1	98,6	794

V tabulce 1/1 můžeme vidět, že absence trehalosy vede k jistému stupni fúze liposomů, již lze doložit vzestupem jejich průměrné velikosti. Vzestup množství trehalosy (trehalosa/lipidy 2:1) překvapivě také způsobuje jistý stupeň fúze s následným vzestupem průměrné velikosti.

Podobné výsledky byly rovněž získány s přípravkem IV.

Průměrná velikost liposomů a množství lonidaminu byly stanoveny z jistého počtu vzorků,^- čerstvě připravených tak, jak bylo popsáno výše. Vzorky byly následně umístěny do chladničky při 5 °C a odebírány v daných intervalech, rehydratovány, aby se stanovilo množství aktivní substance a průměrná «999 velikost liposomů. Takto získané výsledky ukazuje tabulka 1/2.

Tabulka 1/2

Hmotnostní poměr trehalosa/lipid 1:2

Šarže	Čas (měsíce)	HPLC množství (mg/ml)	Průměrná velikost (nm)
LM3 28	t o	3,3	107
	1	3,2	110
	3	3,2	114
	6	3,1	127,2
LM/329	t o	3,2	103,3
	1	3,2	101
	3	3,2	110,5
	6	3,1	115
LM/330	t o	3,3	99,2
	1	3,4	99,5
	3	3,2	100,5
	6	3,1	113,6

Příklad 2

Přípravek II se lyofilizoval tak, jak bylo popsáno v příkladě 1 uvedeném výše a průměrná velikost liposomů před a po lyofilizaci (tabulka 2/1), stejně jako průměrná velikost liposomů a množství melatoninu v čerstvých přípravcích a v těch, které byly udržovány při 5 °C, se stanoví tak, jak je popsáno v dříve zmíněném příkladě (tabulka 2/2).

·· ···· ··

9 · « • ·

9 9

9

9999 9 9

99

9 9 9

999 999

9

9 9 9

Tabulka 2/1

Průměrná velikost liposomů před a po lyofilizaci

Šarže	Trehalosa/lipidy (hmotnostně)	Před	Po
LM/336	0	92	16953
	1:2	92	6875
	1:1	92	96,5
	2:1	92	109,7
LM/337	1:2	92	146,3
	1:1	92	98,8
	2:1	92	8319,8
LM/338	1:2	92	179,7
	1:1	92	225,7
	2:1	92	2984
Podobné výsledky byly také	dosaženy s	přípravkem 1.
Tabulka 2/2
Hmotnostní	poměr trehalosa/lipid	1:1

Šarže	Čas (měsíce)	HPLC množství (mg/ml)	Průměrná velikost (nm)
LM/359	t o	6	104
	1	6	103,2
	3	5,8	109,5
LM/360	t O	6,5	107,2
	1	6,5	106,3
	3	6,7	113,6

4···

44 44

4 4 4 4 4

44 444 444

4 4 4

44 44 44

Tabulka 2/2 (pokračování

Hmotnostní poměr trehalosa/lipid 1:1

Šarže	Čas (měsíce)	HPLC množství (mg/ml)	Průměrná velikost (nm)
LM/361	t o	6,2	98,4
	1	6,3	99
	3	6	100,5

Přiklad 3

Přípravek IV se lyofilizuje tak, jak je popsáno v příkladě 1 uvedeném výše a průměrná velikost liposomů před a po lyofilizací (tabulka 3/1), stejně jako průměrná velikost liposomů a množství bindaritu v čerstvých přípravcích a v těch, které byly udržovány při 5 °C, se stanoví tak, jak je popsáno v dříve zmíněném příkladě (tabulka 3/2).

Tabulka 3/1

Průměrná velikost liposomů před a po lyofilizací

Šarže	Trehalosa/lipidy (hmotnostně)	Před	Po
LM/342	0	102,7	7524,1
	1:2	102,7	928
	1:1	102,7	109
	2 :1	102,7	140

- 18 • · 0 0 0 · • · 0 0 0 0 • 0 0 0·· 000

0 · ·

000 ·0 ··

Tabulka 3/1 (pokračování)

Průměrná velikost liposomů před a po lyofilizaci

Šarže	Trehalosa/lipidy (hmotnostně)	Před	Po
LM/343	1:2	102,7	546,6
	1:1	102,7	112,3
	2:1	102,7	1559,2
LM/344	1:2	102,7	194,9
	1:1	102,7	112,2
	2:1	102,7	4722

Tabulka 3/2

Hmotnostní poměr trehalosa/lipid 1:1

Šarže	Čas (měsíce)	HPLC množství (mg/ml)	Průměrná velikost (nm)
LM/356	t o	3,2	135
	1	3,1	128
	3	3,2	131,3
LM/357	t O	3,1	122
	1	3,1	121
	3	3,2	126,2
LM/358	t O	3,1	126
	1	3,1	122,8
	3	2,9	121,8

φφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ • φ φφφ» • · φφφφ φ φφ φφφ φφφ φ φ · · φφ φφ φφ

Příklad pro srovnání 1

Přípravek II se rozdělí na alikvotní části o objemu 1 ml a ke každé z nich se přidá trehalosa podle hmotnostního poměru trehalosa/lipid uvedeného ve srovnávací tabulce 1.

Přípravek se pak zmrazí na teplotu kapalného dusíku (-195,8 °C) a 20 hodin lyofilizuje, přičemž teplota není zvenčí ovládána.

Lyofilizát (1 ml) se rehydratuje 1 ml destilované vody a 2 hodiny se nechá při teplotě místnosti.

0,5 ml uvedeného roztoku se dále naředí 10 ml fyziologického roztoku, aby se pomocí přístroje NICOMP 370 mohla změřit průměrná velikost liposomů.

Získané výsledky jsou ilustrovány ve srovnávací tabulce 1 uvedené níže.

Srovnávací tabulka 1

Průměrná velikost liposomů před a po lyofilizaci

Šarže Trehalosa/lipidy Před (hmotnostně)

Po

LM/302

LM/303

0	102	911,8
1:2	102	254,8
1:1	102	219,3
2:1	102	773,7
0	99,2	911,8
1:2	99,2	349,9
1:1	99,2	180,4

• to totototo • to • ·

Srovnávací tabulka 1 (pokračování)

Průměrná velikost liposomů před a po lyofilizaci

Šarže	Trehalosa/lipidy (hmotnostně)	Před	Po
	2:1	99,2	717,2
LM/304	0	98,6	911,8
	1:2	98,6	722,5
	1:1	98,6	161,1
	2:1	98,6	150

Ve srovnávací tabulce l může být vidět, že pokud se lyofilizace provádí při teplotě kapalného dusíku, buď za nepřítomnosti trehalosy nebo za její přítomnosti v poměrech uvedených v tabulce nahoře, dochází k určitému stupni fúze liposomů, což je doloženo vzrůstem jejich průměrné velikosti. Výše uvedené údaje navíc ukazují, že pokud je lyofilizace prováděna při teplotě kapalného dusíku, pak samotný průběh lyofilizace (pro přípravky téhož složení) ne vždy vede k reprodukovatelně stejným výsledkům.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Lyofilizovaná směs obsahující trehalosu a lipidové liposomy, v nichž je inkorporována biologicky aktivní substance, vyznačující se tím, že ona biologicky aktivní substance je vysoce nerozpustná ve vodě, hmotnostní poměr trehalosa/lipid je roven nebo menší než 1,5 a veškerá trehalosa byla přidána vně již vytvořených liposomů před lyofilizací.
2. Lyofilizovaná směs podle nároku 1, vyznačující se t í m, že biologicky aktivní substance, která je vysoce nerozpustná ve vodě, je zvolena ze skupiny zahrnující lonidamin, melatonin, cyklosporin A a bindarit.
3. Lyofilizovaná směs podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že lipidy jsou zvoleny ze souboru zahrnujícího fosfoglyceridy, glyceridy, diglyceridy, triglyceridy, fosfolipidy, galaktosyllipidy a glukosyllipidy, cholesterol a jeho deriváty, sfingolipidy a jejich směsi.
4. Lyofilizovaná směs podle nároku 3,vyznačující se t í m, že lipidy jsou fosfolipidy.
5. Lyofilizovaná amSs podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, Že hmotnostní poměr trehalosa/lipid je v rozmezí od 1:2 do 1:1.
6. Lyoíi 1izovaná směs podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že průměrná velikost liposomů je 50 až 250 nm.

•9 9999

99 99 99

99 9 99 99 9999

99 999 999· _— 99 _ 99 9 9999 999 999

99 999 99

9999 9 999 99 99 99
7. Lyofilizovaná směs podle nároku 6, vyznačující se t í m, že průměrná velikost liposomů je 50 až 100 nm
8. Způsob lyofilizace směsi obsahující trehalosu a lipidové liposomy, do nichž byla inkorporována biologicky aktivní substance, vyznačující se tím, že:

a) od 0,2 až do 1,5 dílů hmotnostních treahalosy se přidá na každý díl hmotnostní lipidů vodného liposomálního přípravku, v němž průměrná velikost liposomů leží mezi 50 až 250 nm, a uvedené liposomy obsahují biologicky aktivní substanci, která je vysoce nerozpustná ve vodě,

b) uvedený přípravek se ochladí prostřednictvím chladicí desky lyofilizeru na teplotu v rozmezí -5 až -70 °C rychlostí chlazení mezi 0,5 až

2 °C/min,

c) jakmile je dosažena předem určená teplota, na niž má být přípravek ochlazen uvedená směs se udržuje po dobu mezi 2 až 5 hodinami při této teplotě,

d) přípravek se vystaví podtlaku v rozmezí 50 až 8 Pa, přičemž teplota chladicí desky se ponechá na hodnotě stanovené v bodě b) po dobu trvající mezi 2 až

5 hodinami,

e) teplota chladicí desky se upraví na -15 °C a udržuje se do té doby, dokud se voda zcela neodstraní.
9. Způsob lyoíilizace podle nároku 8, vyznačující se tím, že ve fázi b) je teplota chlazení mezi -20 až -30 “C.
10. Způsob lyofilizace podle nároku 8 nebo 9, v y z n a čující se tím, že ve fázi b) je rychlost chlazení 0,77 °C/min.

·· ··*·
11*Způsob lyofilizace podle některého z nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že čas ve fázi c) je 3 hodiny.
12.Způsob lyofilizace podle některého z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že podtlak je 6 Pa.