DK174871B1 - Amphotericin-B/cholesterolsulfat-sammensætning og fremgangsmåde til fremstilling af samme - Google Patents
Amphotericin-B/cholesterolsulfat-sammensætning og fremgangsmåde til fremstilling af samme Download PDFInfo
- Publication number
- DK174871B1 DK174871B1 DK198805983A DK598388A DK174871B1 DK 174871 B1 DK174871 B1 DK 174871B1 DK 198805983 A DK198805983 A DK 198805983A DK 598388 A DK598388 A DK 598388A DK 174871 B1 DK174871 B1 DK 174871B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- amb
- cholesterol
- amphotericin
- particles
- suspension
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
DK 174871 B1
Teknisk område
Den foreliggende opfindelse angår en amphotericin-B-sammensætning til behandling af svampeinfektioner, og navnlig angår den en amphotericin-B-5 sammensætning, som både har et højt LDøq og en stor terapeutisk virkning.
Referencer 1. Holz, R.W., i F.E. Hahn, ed., Antibiotics, vol 2, Springer Verlag, N.Y.
10 (1979) 2. Trembley, C., et al., Antimicrob Agents and Chemoth, 26(2):170 (1984) 3. Mehta, R.T., et al., Infection and Immunity, 47(2):429 (1985) 15 4. Lopez-Berestein, G., et al., Cancer Drug Delivery, 1(1):37 (1983) 5. New, R.R.C., et al., J Antimicrob Chemoth, 8:371 (1981) 20 6. Braybill, J.R., et al., J Infect Dis, 145:5 (1982) 7. Lopez-Berestein, G., J Infect Dis, 150(2):278 (1984) 8. Trembley, C., et al., Invest Opthalmol, 26:711 (1985) 25 9. Lopez-Berestein, G., et al., J Infect Dis, 151(4):704 (1985) 10. Juliano, R., et al., Biology of the Cell, 4(39) (1983) 30 11, Mehta, R., et al., Biochem Biophys Acta, 770:230 (1984) 12. Hopfer, R.L., et al., Antimicrob Agents and Chemoth, 25(3):387 (1984) 2 DK 174871 B1 13. Brockerhoff, H., et al., Biochimica biphysica Acta 691:227 (1982) 14. Crowe, L.M., et al., Biochimica Biophysica Acta 769:141 (1984) 5 15. Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, A.R., ed., Mack Pub lishing Company (1985).3.
Opfindelsens baaarund 10 Amphotericin-B (AMB) er et effektivt antisvampemiddel, og for tiden er det det foretrukne medikament i forbindelse med de fleste alvorlige systemiske svampeinfektioner (reference 1). Medikamentet er for tiden til rådighed til anvendelse til mennesker som et lyofiliseret pulver af AMB og deoxycholat ("Fungizone"). Stoffet bindes stærkt til ergosterol, der er hovedsterolkompo-15 nenten i svampemembraner, og danner porer i membranerne, hvilket foranlediger udsivning af opløste molekyler. Stoffet har også en stærk bindingsaffinitet for cholesterol, der er en sterol, som forekommer i de fleste pattedyr-cellemembraner, og det er derfor i stand til at sprænge værtscellerne.
20 Når AMB administreres i fri form (dvs. som et rekonstitueret AMB/de-oxycholat-kompleks) observeres der bivirkninger, der fremkommer som resultat af sprængninger af røde blodlegemer, og efterfølges af mere alvorlig cardiotoksicitet, CNS- og knoglemarvspåvirkninger. Renal toksicitet, som følge af legemets forsøg på at udskille stoffet, forekommer også.
25
Adskillige undersøgelser har vist, at AMB-toksiciteten kan nedsættes ved indgivelse af medikamentet i liposombundet form (referencerne 2-12). Typisk øges medikamentets LDgQ-værdi fra ca. 2-3 mg/kg legemsvægt for det frie medikament og op til ca. 8-15 mg/kg, når medikamentet indgives i liposom-30 form. En begrænsning ved liposomformulationerne er imidlertid den øjensynlige størrelses-instabilitet for amphotericin-B/liposom-partik!er, når de opbevares i et vandigt medium. Typisk vil AMB-holdige liposomer med en initiel størrelsesfordeling mellem ca. 200 og 300 nm spontant danne store liposom- 3 DK 174871 B1 strukturer på op til adskillige pm ved langvarig opbevaring i et vandigt medium. Liposomer med størrelser på mere end ca. 1-2 pm er generelt mere toksiske end mindre liposomer ved parenteral administration, dvs. indgivelse i blodstrømmen. Toksiciteten af store liposomer i blodstrømmen skyldes delvis 5 liposomblokering af alveolære kapillarer. Der er også indikationer, der tyder på, at forholdsvis store liposomer er mere toksiske for leveren, formodentlig på grund af liposomakkumulering i reticuloendothelialceller. I beskrivelsen til US patent nr. 4,766,046, indleveret 27. september 1985 med benævnelsen "Amphotericin B Liposome Composition" er der beskrevet en ny fremgangs-10 måde til fremstilling og opbevaring af AMB-liposomer, som i stor udstrækning overvinder ovennævnte problem med størrelsesvækst.
En amphotericin-B-sammensætning dannet ved at komplekse AMB med et polyethylenderivat af cholesterol (PEG-cholesterol) er også blevet foreslået 15 (WO 85/05030). Formulationen øgede LDgQ-værdien for AMB til 10,0 mg/kg i mus fra 3,8 mg/kg for "Fungizone", og var også mindre toksisk i cellekulturer.
Det vides ikke, hvorledes og hvorvidt AMB-kompieksdannelse med PEG-cholesterol påvirker den terapeutiske virkning på svampeinfektioner in vivo, og heller ikke om komplekset kan opbevares i en størrelsesstabil form.
20
Kort beskrivelse af oofindelsenn
Et formål med opfindelsen er at tilvejebringe en AMB-sammensætning, som har en væsentlig højere LD50 encl d® ker>dte AMB-formulationer, der er ble-25 vet rapporteret, og endvidere er væsentlig mere effektiv ved behandling af svampeinfektioner in vivo.
Et andet formål med opfindelsen er at tilvejebringe AMB-formulation, som kan opbevares i suspensionsform i en periode på adskillige dage uden væ-30 sentlig ændring af partikelstørrelsen, og som kan opbevares i lang tid som et lyofili seret præparat.
DK 174871 B1 4
Opfindelsen angår en AMB-sammensætning, der indeholder partikler af AMB og cholesterolsulfat i et molforhold mellem AMB og cholesterolsulfat på mellem ca. 1:1 og 1:4. Ved fremstilling i suspensionsform i et vandigt medium har partiklerne fortrinsvis størrelser mellem ca. 100 og 400 nm. Undersøgel-5 ser over osmotisk kvældning og indslutning af opløste stoffer indicerer, at partiklerne ikke er liposomagtige. En foretrukket sammensætning, der indeholder AMB og cholesterolsulfat i et molforhold på ca. 1:1, udviser en meget lille ændring af partikelstørrelsen, når den opbevares i opløsningsform over en periode på adskillige dage.
10
Ifølge et aspekt af opfindelsen dannes sammensætningen ved dispergering af en vandig suspension af amphotericin-B/cholesteroisulfat-partikler i et molforhold på mellem 1:1 og 1:4 indtil opnåelse af optisk klarhed, hvor partikel-størrelserne overvejende er på ca. 100-200 nm. Suspensionen lyofiliseres 15 derpå i nærværelse af et kryobeskyttelsesmiddel, såsom lactose, inden der indtræder væsentlig forøgelse af partikelstørrelsen. Efter rekonstituering i et vandigt medium ligger partikelstørrelserne overvejende i området 200-300 nm.
20 Sammensætningen har en LDsg-værdi på mere en 15 mg/kg i mus, hvilket skal sammenlignes med ca. 3,2 mg/kg for "Fungizone" i det samme dyremodelsystem, og sammensætningen med enhedsforholdet 1:1 har en LD50 på mere end 30-40 mg/kg. Den terapeutiske virkning af AMB/cholesterolsulfat-sammensætningen ved behandling af svampeinfektioner in vivo er sammen-25 lignelig med eller større end den, der iagttages for fri AMB i afhængighed af det totale AMB-doseringsniveau.
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af amphotericin-B i en form, der har en LD50 på mere end ca. 15 mg/kg, og som kan rekonstitue-30 res med et vandigt medium til partikelstørrelser på mellem ca. 100-400 nm. Fremgangsmåden omfatter formulering af en vandig partikelsuspension af AMB/cholesterolsulfat af den ovenfor beskrevne type og indgivelse af suspensionen i en terapeutisk effektiv mængde.
5 DK 174871 B1
Disse og andre formål og træk ved opfindelsen vil fremgå mere tydeligt af den efterfølgende detaljerede beskrivelse af opfindelsen.
5 Kort beskrivelse af tegningen
Figur 1A-1C viser afbildninger af procent overlevelser som funktion af dage efter infektion af dyr, der er blevet inficeret systemisk med Candida albicans og derefter behandlet med bolusinjektionsdoser på 0,5 mg/kg/dosis (figur 1A) 10 0,125 mg/kg/dosis (figur 1B) eller 0,031 mg/kg/dosis (fig 1 C) AMB.
Detaljeret beskrivelse af opfindelsen I. Fremstilling af oartikelsammensætnina 15 A, Partikelsuspension.
Til fremstilling af en AMB/cholesterolsulfat-partikelsuspension ifølge opfindelsen forenes AMB og cholesterolsulfat i tør eller opløst form i det valgte mol-20 forhold mellem AMB og cholesterolsulfat på mellem ca. 1:1 og 1:4. Ved en foretrukket fremgangsmåde blandes de to komponenter i tør form i det valgte molforhold og opløses derpå i et egnet opløsningsmiddel, fortrinsvis en alkohol, såsom methanol. En samlet molaritet af AMB og cholesterolsulfat i methanolen på 50 pm/ml i molforholdsområdet mellem 1:1 og 1:4 for AMB i 25 forhold til cholesterol er passende. I en 1:1 formulation vil både AMB og cholesterol for eksempel forekomme med 25 pmol/ml.
Et kryobeskyttelsesmiddel kan tilsættes AMB/cholesterolsulfat-opløsningen i en foretrukket slutkoncentration på ca. 5-15%. Kryobeskyttelsesmidlet har to 30 formål i de efterfølgende behandlingstrin. For det første tilvejebringer det et krystallinsk, vandopløseligt fyldmiddel, på hvilket AMB og cholesterolsulfat-komponenterne kan afsættes, når opløsningsmidlet i blandingen fjernes. Det vil sige, de tørre krystaller af kryobeskyttelsesmidlet øger overfladearealet af 6 DK 174871 B1 lipidfilm, som dannes ved fjernelse af opløsningsmidlet, og dette letter parti-kelhydratisering, når der sættes et vandigt medium til den tørrede blanding.
For det andet, når de hydratiserede partikler opbevares i lyofiliseret tilstand, som det diskuteres nærmere nedenfor, kan kryobeskyttelsesmidlet mindske 5 den partikelbeskadigelse, der kan fremkomme ved frysning, og derved mindske partikelvæksten af de rehydratiserede partikler. Egnede kryobeskyttel-sesmidler er carbohydrater, såsom trehalose, lactose, maltose, cellobiose, saccharose, glucose, fructose, sorbitol, raffinose, myo-inositol og glycerol (reference 14). Forskellige andre vandopløselige fyldmidler, såsom maltodex-10 trin, salte og lignende kan erstatte kryobeskyttelsesmidlet, når partikelbehandlingen ikke omfatter et frysetrin, såsom når partiklerne tørres med henblik på opbevaring ved sprøjtetørring.
Lipidopløsningen af AMB/cholesterolsulfatet tørres til en lipidfilm. Som netop 15 anført dannes filmen fortrinsvis ud fra en opløsning, der indeholder et fyldmiddel, og derved resulterer i tørre partikler af midlet belagt med lipidblan-dingen. Fjernelsen af opløsningsmidlet sker ved vakuumfordampning eller under en strøm af inert gas, for eksempel nitrogen. Den tørrede lipidfilm kan opbevares under en inert gas, fortrinsvis ved 4 °C eller derunder.
20
En vandig partikelsuspension dannes ved tilsætning af et vandigt medium til den tørrede lipidblanding. Det i eksempel 1 benyttede medium, der indeholder 10 mM tris-HCI, 0,1 mM EDTA, pH 7,4, er egnet. Den tilsatte mængde medium er tilstrækkelig til at frembringe en AMB-slutkoncentration på for-25 trinsvis ca. 25-100 pmol/ml.
Indledningvis suspenderes lipidmaterialet groft ved omrøring med spatel eller mekanisk omrøring indtil lipidklumperne er opløst i det vandige medium under dannelse af en opslæmningsagtig blanding. Dette materiale dispergeres 30 derefter til en fin partikelstørrelse ved lydbehandling, homogenisering, "fransk presning" eller andre højenergimetoder. Dispergeringen fortsættes indtil der er opnået en ønsket partikelstørrelse på fortrinsvis mellem 0,1 og 1 pm. Suspensionen kan opvarmes under dispergeringen og bør holdes under en inert 7 DK 174871 B1 atmosfære. Ved den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde lydbehandles suspensionen ved 45 °C indtil optisk klarhed. Slutpartikelstørrelseme lå mellem 0,1 og 0,2 pm. Det bemærkes, at formulationer, som indeholder mindre end ca. 1 mol cholesterol sulfat per mol AMB ikke kan lydbehandles til optisk 5 klarhed, hvilket indicerer, at partikeldispersionen kræver i det mindste en støkiometrisk mængde cholesterolsulfat.
Partikelsuspensionen kan behandles, såsom ved molekylsigtekromatografi eller ved dialyse til fjernelse af spor af ikke-inkorporeret AMB. De i eksempel 10 1 angivne dialyseforhold kan anvendes. Slutkoncentrationen af AMB i den dispergerede partikelsuspension kan bestemmes ved fortynding af prøven af suspensionen i methanol og spektrofotometrisk måling af AMB ved 406 nm.
Typiske AMB-koncentrationer på forskellige trin af fremstillingen af dispersionen er anført i tabel 1 i nedenstående eksempel 1.
15 B. Tørret partikelsuspension.
Ifølge et aspekt af den foreliggende opfindelse er det blevet opdaget, at AMB/cholesterolsulfatpartiklerne ifølge opfindelsen kan opbevares i lang tid i 20 tørret form uden væsentlig forøgelse af partikelstørrelsen ved rehydratise- ring.
Den tørrede partikelformulation kan enten fremstilles ved lyofilisering eller ved sprøjtetørring. I begge tilfælde udføres tørringstrinnet inden 25 AMB/cholesterolsulfat-partiklerne vokser væsentligt i størrelse. Ved lyofilise-ringsfremgangsmåden fryses småpartikelsuspensionen hurtigt og lyofiliseres ved en bakketemperatur på fortrinsvis 20 °C eller mindre, som det er beskrevet i eksempel 1. Virkningen af lyofiliseringen på partikelstørrelsen fremgår af tabel 2 i eksempel 2 for hver af fire formulationer med et AMBxholesterol-30 sulfat-molforhold på mellem 1:1 og 1:4. I hvert enkelt tilfælde vokser middelparti kel størrelsen fra ca. 100-200 nm inden lyofiliseringen til mellem 200-300 efter lyofilisering og hydratisering med vand. Partiklernes stabilitet før og efter lyofilisering er beskrevet i afsnit II nedenfor.
8 DK 174871 B1
Ved sprøjtetørring tørres partikelsuspensionen i et konventionelt apparat, i hvilket de partikler, der skal tørres, sprøjtes i aerosolsuspensionsform ind i en strøm af opvarmet luft eller inert gas, og de små aerosoldråber tørres i gas-5 strømmen, medens de føres mod en pladekollektor, hvor de tørrede liposo-mer opsamles. Et eksempel på et sprøjtetørringsapparat er en Buehi 190 minisprøjtetørrer.
Tørringstemperaturen er på mindst ca. 37 °C og fortrinsvis mellem ca. 40-50 10 °C. Temperaturen i opsamlingskammeret er almindeligvis lavere end tempe raturen i den opvarmede luft, typisk ca. 37 °C. De tørrede partikler tørres og opbevares i dehydratiseret form under en inert atmosfære.
II. Størrelsesstabilitet 15 I dette afsnit undersøges størrelsesstabiliteten af AMB/cholesterol-partikelsuspensioner under forskellinge forhold, hvad angår molsammensætningen af partiklerne, suspensionsmediet og opbevaringstiden.
20 Ved en første undersøgelse, der er rapporteret i eksempel 3, blev der fremstillet AMB/cholesterolsulfat-partikler med et molforhold for AMBxholesterolsulfat på 1:1, 1:2, 1:3 og 1:4, og umiddelbart efter dialysering blev partiklerne opbevaret i perioder på op til 8 dage ved 4 °C. Resultaterne er anført i tabel 3 i eksempel 3. 1:1 Formulationen var i alt væsentligt stabil 25 over den 8 dages undersøgelsesperiode, medens de andre formulationer udviste gradvis øget størrelsesvækst ved stigende molforhold mellem cholesterol og sulfat.
Tilsvarende blev størrelsesstabiliteten af de samme fire formulationer under-30 søgt efter lyofilisering og rehydratisering som rapporteret i eksempel 3. Størrelsesstabilitetsdata for 8 dages afprøvningen er anført i tabel 3. Interessant nok var der kun en lille forskel mellem størrelsesstabiliteten for de fire formulationer, og for hver formulation voksede den gennemsnitlige partikelstørrelse 9 DK 174871 B1 højst med en faktor 2 i løbet af den 8 dages undersøgelsesperiode. De samlede resultater fra tabel 2 og 4 viser, (a) at lyofiliserede AMB/cholesterol-partikler kan rekonstitueres med ringe forøgelse af den gennemsnitlige størrelse og størrelsesfordelingen til følge, og (b) at partiklerne i den rekonstitue-5 rede suspension er forholdsvis stabile ved opbevaring i opløsning over en periode på nogle dage.
Virkningen af saltvandsopløsning af fysiologisk styrke og plasma på partiklernes størrelseskarakteristika blev undersøgt som rapporteret i eksempel 4, I 10 en første undersøgelse blev de fire AMB/cholesterolsulfat-formulationer efter dialyse fortyndet med 0,9% saltvandsopløsning, og partikelstørrelserne blev undersøgt umiddelbart herefter. Som vist i den øverste række af tabel 5 udviste alle partiklerne en stor størrelsesforøgelse, omend 1:1 formulationen var mindre aggregeret. En tilsvarende undersøgelse af partikler efter lyofilisering 15 blev også udført under opnåelse af de resultater, der er angivet i den øverste række af tabel 6 i eksempel 4. En sammenligning af data fra tabel 5 og 6 viser, at 1:1 formulationen er væsentlig mere størrelsesstabil i saltvandsopløsning efter lyofilisering end efter dialyse. De andre tre formulationer med større cholesterolsulfat molforhold udviste store størrelsesforøgelser i saltvands-20 opløsninger, både og efter lyofilisering.
En anden undersøgelse blev udformet med henblik på undersøgelse af AMB/cholesterolsulfat-partikelstørrelsen i blodplasma og virkningen af efterfølgende fortynding af plasmamediummet med suspensionspuffer. Indled-25 ningvis blev hver af de 4 prøver (både før og efter lyofiliseringen) fortyndet 1:1 med human-plasma, derpå fortyndet efter nogle få minutter med suspensionpuffer, som indeholdt 10% lactose. Størrelsesmålinger blev udført straks efter fortyndingen og igen 20 minutter senere. Resultaterne er angivet i de to nederste rækker af tabel 5 og 6 i eksempel 4. Sammenfatning af dataene 30 viser, at plasma forårsagede en størrelsesforøgelse i alle formulationeme.
Den mindste størrelsesforøgelse blev iagttaget i 1:1 formulationen, hvor partikelstørrelserne var mindre end 1 pm (1000 nm). Den ved kontakt med plasma frembragte størrelsesforøgelse var i det mindste delvis reversibel for alle 10 DK 174871 B1 alle formulationer med undtagelse af 1:4 formulationen, som det fremgår af den betydelige reduktion af partikelstørrelsen efter 20 minutters inkubation i fortyndet form i suspensionsmedium. Der var kun lille forskel i størrelsesad-færen for partikler i præ- og postlyofiliserede formulationer.
5
Ovenstående data viser, at ABM/cholesterolsulfat-formulationen ifølge den foreliggende opfindelse kan opbevares i tørret form i lang tid uden væsentlig størrelsesforøgelse ved rehydratisering eller væsentlig ændring af størrelsesstabiliteten i plasma. En væsentlig fordel ved de tørrede partikler, som 10 blev observeret, var den væsentlig større størrelsesstabilitet ved opbevaring i puffer. Inden for det område af AMB/cholesterolsulfat-molforho!d, som blev undersøgt, gav 1:1 formulationen størst størrelsesstabilitet og de mindste gennemsnitlige partikelstørrelser under de forskellige betingelser, der blev undersøgt.
15 III. Partikelkarakteristika
Det er blevet rapporteret, at cholesterolsulfat er i stand til at danne lipidve-sikler eller liposomer ved længerevarig (nogle timer) lydbehandling (referen-20 ce 13). Det var derfor af interesse at afgøre, om AMB/cholesterolsulfat-partiklerne ifølge den foreliggende opfindelse er af liposomal form. Til disse undersøgelser blev der valgt en 1:4 AMB/cholesterolsulfat-formulation, eftersom en forholdsvis høj andel af cholesterolsulfat er mere sandsynligt tilbøjelig til at danne liposomstrukturer.
25
Et karakteristikum for liposomer er et kontinuert lipiddobbeltlag, som er i stand til at indeslutte vandopløselige opløste molekyler. Mange vandopløselige molekyler, såsom sukkerarter og andre opløste mærkestoffer, indesluttes let i liposomer ved fremstilling (dispergering) af liposomlipiderne i et vandigt 30 medium, der indeholder det opløste markørstof. Mindre markørmolekyler, såsom sukkerarter, har også tendens til langsomt at passere gennem lipid-dobbeltlagsmembranerne, som det tilkendegives ved ækvilibrering af det opløste stof mellem de indesluttede og de omgivende, vandige hovedfaseom- 11 DK 174871 B1 råder i løbet af en periode fra nogle timer til nogle dage med udveksling af opløst stof.
Til undersøgelse af (1:4) AMB/cholesterolsulfat-partiklernes evne til at inde-5 slutte saccharose blev partiklerne fremstillet ved dispergering i et medium, der indeholdt14C-saccharose. Efter lydbehandling til optisk klarhed blev partiklerne fraskilt suspensionsmediet ved molekylsigtekromografi under anvendelse af en kolonne med sigtemateriale, som udelukkede partikler i AMB/cholesterolsulfat-partiklernes størrelsesområde. Detaljer vedrørende 10 undersøgelserne er anført i eksempel 5. Sammenfattet var 95% af AMB’et associeret med de partikler, som elueredes i det frie volumen, men nogen detekterbar top af radioaktivitet var ikke associeret med partiklerne.
På basis af denne undersøgelse ser det ud til, at partiklerne ikke danner in-15 desluttende (liposomal) strukturer eller alternativt, at partiklerne danner meget lækkende strukturer. Den sidste forklaring er usandsynlig da (a) cholesterol har tendens til at nedsætte permeabiliteten i liposomer til små vandopløselige permeationsstoffer, og (b) de rene cholesterolderivatliposomer, som er blevet beskrevet (reference 13), har meget lav permeabilitet. Undersøgelser 20 over cholesterol-hemisuccinatliposomer har også demonstreret stabil indeslutning af forskellige små, vandopløselige molekyler (PCT patentansøgningspublikation nr. WO 85/05030).
Et andet karakteristisk træk ved liposomer er isotoniske liposomers evne til at 25 kvælde ved indsprøjtning i et hypotont medium. Heri fungerer liposomerne som små osmometre i respons på gradienter af opløst stof på tværs af dobbeltlagsmembranerne. Isoton liposomkvældning er blevet iagttaget i liposomer, der er fremstillet ud fra forskellige cholestorolderivater, herunder cho-lesterol-PEG og cholesterolsulfat (reference 13) og cholesterolhemisuccinat-30 liposomer (PCT patentansøgningspublikation nr. W085/05030). Cholesterolderivatliposomer udviser den forventede øgede absorbans, når de indsprøjtes i stadig mere fortyndede medier, omend disse liposomer opfører sig min- 12 DK 174871 B1 dre som ideale osmometre end liposomer, der er fremstillet ud fra sædvanlige phospholipidkomponenter.
Hver af ovennævnte fire AMB/cholesterol-partikelsammensætninger (1:1, 5 1:2, 1:3 og 1:4 molforhold) blev fremstillet i 10% lactose. Både præ- og post- dialysepartikler blev undersøgt for osmotisk kvældning i destilleret vand, idet partikelstørrelsen umiddelbart efter fortyndingen blev sammenlignet med partikelstørrelsen 20 minutter efter fortyndingen. Resultaterne er anført i tabel 7 i eksempel 6. Der blev ikke iagttaget nogen kvældning i nogen af partikelfor-10 mulationerne. Denne undersøgelse understøtter resultaterne af ovenstående indeslutningsundersøgelser, nemlig at AMB/cholesterolsulfat-partiklerne ifølge opfindelsen ikke danner lukkede vesikelstrukturer.
IV. Terapeutiske anvendelser 15 AMB Er anvendelig til behandling for forskellige systemiske svampeorganismer, herunder coccidiomycosis, cryptococcosis, systemisk moniliasis, histoplasmosis, aspergillosis, rhodoptorulosis, sporotrichosis, phycomycosis og blastomycosis, og det er også effektivt mod visse arter af Leishmania (re-20 ference 15). På grund af de alvorlige bivirkninger ved medikamentet i dets for tiden tilgængelige frie form, gives det almindeligvis kun til patienter med pro-gredierende, potentielt fatale, systemiske svampeinfektioner, og patienten må forblive hospitaliseret under medikamentbehandlingen med konstant overvågning af nyrefunktionen.
25 I dette afsnit beskrives den nedsatte toksicitet og forbedrede effektivitet af AMB i den foreliggende formulation og dermed muligheden for bredere anvendelse af medikamentet, navnlig til profylaktisk brug ved bekæmpelse af tilfældige svampeinfektioner i immun-deficiente eller immun-kompromitterede 30 patienter, såsom de, der modtager cancerkemoterapi, immunosuppresive medikamenter eller stråleterapi.
13 DK 174871 B1 A. AMB/cholesterolsulfat-toksicitet.
Ifølge et vigtigt aspekt ved den foreliggende opfindelse er det blevet opdaget, 5 at den heri beskrevne AMB/cholesterolsulfat-sammensætning er væsentligt mindre toksisk end fri AMB ("Fungizone"), som det indiceres af en meget højere LD^Q-værdi. Endvidere er sammensætningen væsentlig mindre toksisk end liposomale eller lipidkomplekse former for AMB, der er blevet beskrevet i den kendte litteratur, som bedømt ved en sammenligning med de rapporte-10 rede LD5Q-værdier. Toksicitetundersøgelser til bestemmelse af LD50-værdier for sammensætningen ifølge opfindelsen er beskrevet nærmere i eksempel 7. En indledningvis undersøgelse vedrørte den letale toksicitet af "Fungizone" og 1:4 AMB/cholesterolsulfat-partikler. Baseret på de i tabel 1 anførte data ligger LD50 for den frie AMB-sammensætning ("Fungizone") 15 mellem 1-4 mg/kg dyrevægt. Denne værdi øges til mellem 15-25 mg/kg for AMB/cholesterolsulfat-sammensætningen. LD5ø-Værdien er væsentligt højere end de tidligere rapporterede værdier for liposomale eller lipidkomplekse AMB-formulationer, som er beskrevet i den kendte litteratur.
20 I yderligere undersøgelser, som også er rapporteret i eksempel 8, blev den letale toksicitet af de ovenfor beskrevne fire AMB-formulationer med forskellige molforhold undersøgt for en dosis på op til 40 mg/kg. Som rapporteret i eksemplet gav AMB/CHSC^-formulationen en LDgg-værdi på op til 40 mg/kg. Dataene viser, at LDøq for de andre tre formulationer er mindre end 25 20 mg/kg og i det mindste for 1:4 formulationen ligger den derfor mellem 15- 20 mg/kg.
Kompositionen drager også fordel af, at cholesterolsulfat er en naturlig cho-lesterolkomponent, som findes i vid udstrækning i dyr. Cholesterolforbindel-30 sen har ingen kendt toksicitet, og den metaboliseres i legemet af cholesterol-sulfatase.
14 DK 174871 B1
Endelig kan de stabile og forholdsvis små partikler, der kan injiceres, bidrage til nedsat toksicitet, eftersom toksiciteten forventes at vokse med større partikelstørrelse.
5 B. Virkningseffektivitet.
Et andet vigtigt træk ved AMB/cholesterolsulfat-sammensætningen er en væsentligt øget medikamentvirkning ved behandling af systemiske svampeinfektioner. En undersøgelse af virkningseffektiviteten, som blev udført i for-10 bindelse med den foreliggende opfindelse, er beskrevet detaljeret i eksempel 9. I dette eksempel blev forsøgsdyr, der var blevet inficeret intravenøst med C. albicans, behandlet med "Fungizone" i doser på mellem 0,3 og 0,9 mg/kg legemsvægt eller med 1:4 AMB/cholesterolsulfat i doser på mellem 0,3 og 2,0 mg/kg. Medikamenteffektiviteten blev bestemt ved overlevelsen 25 dage 15 efter medikamentindgivelsen. De i tabel 11 anførte data viser, at AMB/cho-lesterolsulfat-sammensætningen giver væsentligt højere overlevelsesfrekvens ved alle dosisniveauer mellem 0,3 og 0,9 mg/kg. Ved 2,0 mg/kg overlevede alle de med formulationen ifølge opfindelsen behandlede dyr.
20 En anden undersøgelse af virkningseffektiviteten, der også er rapporteret i eksempel 9, sammenligner overlevelsesprocenten for mus, der er inficeret med C. albicans, ved dosisniveauer på 0,031, 0,125 og 0,5 mg/kg, idet hvert dyr modtog to doser på infektionsdagen og to doser på den følgende dag. Dataene er afbildet i figur 1A-1C for kontrolforsøgene (cirkler), frit AMB (kva-25 drater), AMB/CHSO4 (1:4) (trekanter) og AMB/CHSO4 (1:1) (rhomber) for hver af de tre forskellige dosisniveauer, Ved de to lavere dosisniveauer (figurer 1B og 1C) var de to AMB/CHSO^formulationer sammenlignelige med frit AMB med hensyn til behandlingseffektivitet. På det højeste dosisniveau (figur 1A) gav 1:1 AMB/CHSC>4-formulationen en 100% overlevelse, som skal 30 sammenlignes med 60-80% overlevelsen for både frit AMB og 1:4 AMB/CHS04-formulationen.
15 DK 174871 B1 C. Administrationsmåder.
Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en dehydratiseret AMB-sammensætning, som, når den rehydratiseres efter en længere opbeva-5 ringsperiode, danner en suspension af AMB-partikler med et valgt størrelsesområde på mindre end ca. 1 pm. Som følge af, at partiklerne kan opbevares i et vandfrit, inert miljø gøres toksicitets- og lipid- og medikamentnedbrydningsproblemer, der er forbundet med oxidation og mekanisk beskadigelse ved gas/væske grænsefladen, mindst mulige. Ved parenteral anven-10 delse, for eksempel intravenøs indgivelse, fremstilles sammensætningen fortrinsvis ud fra AMB-liposomer med størrelser på mellem ca. 0,1 og 0,4 pm, som de kan fremstilles ved ovennævnte fremgangsmåder. AMB/Lipidsammensætningen hydratiseres typisk til en valgt AMB-koncentration på mellem ca. 50 og 200 mg/ml og indgives i en koncentration 15 på mellem 1 og 5 mg AMB/kg legemsvægt. Indgivelsen udføres inden AMB/CHSO^partiklemes størrelse øges væsentligt. Når medikamentet indgives intramuskulært for at frembringe langsom medikamentfrigivelse fra injektionsstedet rehydratiseres sammensætningen fortrinsvis til en mere koncentreret form, som bekvemt kan lokaliseres på injektionsstedet.
20
Af det foranstående vil det forstås, hvorledes forskellige formål med og træk ved opfindelsen opnås. Opfindelsen tilvejebringer en AMB-formulation, som har væsentlig nedsat toksicitet i forhold til hidtil kendte, frit AMB- eller AMB-lipidformulationer og en medikamentvirkningseffektivitet, som er mindst lige 25 så stor som den for hidtil kendte AMB-formulationer rapporterede, herunder frit AMB. Det øgede terapeutiske indeks for medikamentet, navnlig hvad angår den mindskede toksicitet, muliggør en meget bredere anvendelse af medikamentet, f.eks. til profylaktisk behandling af immunkompromitterede patienter og tilvejebringer også større terapeutisk virkningseffektivitet ved be-30 handling af aktive, systemiske svampeinfektioner.
Sammensætningen er let at fremstille, og cholesterolsulfatkomponenten er forholdsvis billig i ren form og udnyttes på naturlig måde, når det indgives 16 DK 174871 B1 parenteralt. Formulationen er let at opbevare i tør form, og når den rehydrati-seres, giver den en partikelsuspension med udvalgte små partikelstørrelser.
De efterfølgende eksempler illustrerer fremgangsmåder til fremstilling, karak-5 terisering og anvendelse af AMB/cholesterolsulfat-sammensætningen ifølge opfindelsen. Eksemplerne har på ingen måde til formål at begrænse rækkevidden af opfindelsen.
Materialer 10 CHSO4 (Cholesterol-3-sulfat, natriumsalt) blev opnået fra Sigma Co., St.
Louis, MO; AMB (amphotericin-B, type 1) blev foræret af E R. Squibb &
Sons, Inc. (Batch nr. 20-914-5978-001); alle andre materialer er af reagenskvalitet eller mere fra kommercielle kilder.
15
Eksempel 1
Fremstilling af AMB/CHSO/ppartikler 20 AMB og CHSO4 i tør pulverform blev afvejet og kombineret til frembringelse af en af de fire AMB/cholesterolsulfat-molforhold, der er anført i nedenstående tabel 1. Mængden af tilsat AMB og cholesterolsulfat var tilstrækkelig til at frembringe en AMB- plus cholesterolsulfat-slutkoncentration i partikelsuspen-25 sionen på ca. 50 pmol/ml.
Tør methanol blev sat til AMB/cholesterolsulfatpulveret til en AMB-slutkoncentration på mellem 0,2-0,6 mg/ml, og suspensionen blev omrørt indtil alt pulveret var blevet opløst. Lactose blev sat til denne opløsning til 30 frembringelse af en 10% (vægt/volumen) lactoseopløsning i det vandige slutprodukt. Opløsningen blev tørret i vakuum under frembringelse af tørre lacto-separtikler belagt med en lipofil AMB/cholesterolsulfat-film.
17 DK 174871 B1
En suspensionspuffer, der indeholdt 10 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA, pH 7,4, 67 mOsm, blev sat til den tørre blanding i en mængde, der var tilstrækkelig til at frembringe en AMB- plus cholesterolsulfat-slutkoncentration på 50 pmol/ml. Suspensionen blev lydbehandlet med en "Ultrasonic Liquid Proces-5 sor" (Heat Ultrasonics, Inc., Farmingdale, NV), model W-800, lydbehandlingssonde, indtil suspensionen blev optisk klar. (Denne proces fremmes, hvis suspensionen opvarmes til 45 °C i et vandbad). Lydbehandlingen blev udført under nitrogengas.
10 De lydbehandlede AMB/CHSO^partikler blev dialyseret til fjernelse af spor af ikke-inkorporeret AMB under anvendelse af en dialyseslange med 6000-8000 molekylvægtsafskæring. Materialet blev dialyseret mod en puffer, der indeholdt 10 mM Tris-HCI, 0,1 mM EDTA, 10% (vægt/volumen) lactose, pH
7,4, 300 mOsm. Den klare suspension blev tørret ved hurtig frysning i en tør-15 is/isopropanol-blanding og lyofiliseret natten over ved en bakketemperatur på -25 °C efterfulgt af yderligere to timers ophold ved 25 °C (15 SRC-X lyofilise-ringsapparat; Virtis, Gardiner, NY). Lyofiliserede prøver blev rekonstitueret ved tilsætning af et lige så stort volumen vand og blandet forsigtigt i nedenstående tabel 1 er anført AMB-koncentrationerne for de fire 20 sammensætninger på forskellige trin af fremstillingen.
Tabel 1 AMB-koncentration (mg/ml) 25 Mol- Før Efter Efter lyofilisering/ forhold Teoretisk dialyse dialyse rehydratiserino 1:1 23,10 20,66 24,20 21,52 1:2 15,40 10,80 16,46 15,19 30 1:3 11,55 11,02 12,19 11,60 1:4 9,24 9,49 10,12 8,79 18 DK 174871 B1
Eksempel 2
Virkning af Ivofiliserina på partikelstørrelsen 5 Partikelstørrelsen blev bestemt ved dynamisk laser-lysspredning under anvendelse af en Nicomp model 200 størrelsesanalysator (Nicomp Instruments Inc., Goleta, CA). Prøver blev ved denne bestemmelse typisk fortyndet til 0,3 pmol/ml under anvendelse af 10 mM Tris/HCI, 0,1 mM EDTA, 10% (vægt/volumen) lactosepuffer, pH 7,4. De gennemsnitlige partikelstørrelser 10 og standardafvigelser (S.D.) for de fire sammensætninger fra eksempel 1 er anført i nedenstående tabel 2. Som det ses, havde alle fire sammensætninger en gennemsnitlig partikelstørrelse mellem ca. 130-180 nm inden lyofilise-ring og mellem ca. 210-280 nm efter lyofilisering.
15 Tabel 2
Partikeldiameter (genn. + S.D. nm)
Molforhold Partikler straks Partikler efter lyofilise- 20 AMB/CHSO4 efter dialysering ring/rehydratisering 1.1 138+54 268+137 1:2 148+66 211+105 1:3 172+89 265+147 25 1:4 138+61 274+151
Eksempel 3
Virkning af opbevaring i opløsning på partikelstørrelsen 30
De fire prøver fra eksempel 1, hver med en AMB- plus cholesterolsulfat-koncentration på ca. 50 pmol/ml, blev inkuberet ved 4 °C i op til 8 dage. På dag 0, 2, 6 og 8 blev der fra hver suspension udtaget en prøve, som blev for- 19 DK 174871 B1 tyndet til ca. 0,3 pmol/ml og undersøgt med hensyn til partikelstørrelsesfordeling som i eksempel 2. Resultaterne er anført i ovenstående tabel 2. Det ses, at 1:1 sammensætningen er stabil med hensyn til partikelstørrelsesændring, medens de sammensætninger, der indeholder større molmængder og cho-5 lesterolsulfat er stadigt mindre stabile ved opbevaring.
Tabel 3
Opbevaret i Partikeldiameter (genn. + S.D. nm) som funktion af dage AMB/CHSO^molforholdet (efter dialyse) 10 - - 1:1 1:2 1:3 1:4 0 138+54 148+66 172+89 138+61 2 193+98 336+194 527+299 334+192 15 6 161+82 462+265 679+377 823+481 8 179+95 512+296 968+551 1034+587
En tilsvarende stabilitetsundersøgelse blev udført på de samme sammensætninger efter lyofilisering og rekonstituering med destilleret vand som i ek-20 sempel 1. Resultaterne, der er anført i tabel 4, viser (a) en forholdsvis lille størrelsesvækst i løbet af den otte dages undersøgelse for hver af de fire sammensætninger, og (b) en lille virkning på størrelsesændringer hidrørende fra den molære mængde od cholesterolsulfat.
Tabel 4 20 DK 174871 B1
Opbevaret Partikelstørrelse (genn, + S.D. nm) som funktion af dage AMB/CHS04-molforholdet (efter lyofilisering) 5 - - 1:1 1:2 1:3 1:4 0 268+137 211+105 265+147 279+151 2 304+153 331+177 541+293 554+303 10 6 340+188 436+224 515+283 478+242 8 371+188 436+228 570+314 487+258
Eksempel 4 15 Virkning af saltvandsopløsnina oa plasma på partikelstørrelsen
De fire prøver fra eksempel 1 blev fortyndet til ca, 0,3 pmol/ml med 0,9% (vægt/volumen) saltvandsopløsning, og deres partikelstørrelser blev bestemt som i eksempel 2. Resultaterne er angivet i den øverste linie i nedenstående 20 tabel 5. For hver formulation frembragte saltvandsopløsningen en mere end 10 gange forøgelse af den gennemsnitlige partikelstørrelse. Størrelsesvæksten var for 1:1 sammensætningen var væsentlig mindre end den for de tre sammensætninger med større mængder cholesterolsulfat.
25 De fire prøver blev også fortyndet 1:1 (volumen/volumen) med humanplasma og efterfølgende (i løbet af nogle få minutters kontakt med plasmaet) fortyndet med 10 mM Tris/HCI. 0,1 mM EDTA, 10% (vægt/volumen) lactose-puffer, pH 7,4, med henblik på størrelsesbestemmelse. Størrelsesbestemmelserne, der er rapporteret i nedenstående tabel 5, blev udført straks efter 30 fortyndingen og 20 minutter efter fortyndingen. Dataene indicerer, at 1:1 for-mulationen er mindst følsom for størrelsesændringer ved kontakt med plasma, og at for alle formulationer frembragte inkubation i det fortyndede medium i 20 minutter nogen størrelsesformindskelse.
Tabel 5 21 DK 174871 B1
Partikeldiameter (genn. + S.D. nm) som funktion af Behandling AMB/CHSC^-molforholdet (efter dialyse) 5 - - 1:1 1:2 1:3 1:4
Fortyndeti 3328+1990 13209+8288 6789+4276 11072+6618 saltvand 10 Blanding + 728+334 1200+628 4017+1951 1942+1043 plasma, fortynding + suspensionspuffer 15 20 minutter 358+169 823+457 1745+1007 1667+942 senere
Tilsvarende størrelsesbestemmelser efter blanding med 0,9% salt-20 vandsopløsning eller plasma blev udført på AMB/cholesterolsulfatpartikler efter lyofilisering og rehydratisering med destilleret vand som i eksempel 1. Resultaterne er anført i nedenstående tabel 6. Der blev observeret størrelsesændringer svarende til dem, der blev observeret for prælyofiliserede partikler (tabel 5 data).
25
Tabel 6 22 DK 174871 B1
Partikelstørrelse (genn. + S.D. nm) som funktion af AMB/CHS04-molforholdet 5 Behandling i efter Ivofiliserinq/hvdratiseringl_ 1:1 1:2 1:3 1:4
Fortyndeti 1738+1007 8405+5549 13158+8625 9813+6265 10 saltvand
Blanding + 955+446 1030+550 1766+976 2467+1233 plasma, fortynding + sus-15 pensionspuffer 20 minutter 534+267 776+378 1147+643 2661+1374 senere 20 Eksempel 5
Undersøgelser over partikelindeslutning AMB/cholesterolsulfat-partiklernes evne til at indeslutte en radioaktivt mærket 25 markør blev undersøgt. Partikler med 4:1 CHSO^AMB-molforhold blev fremstillet som i eksempel 1 med undtagelse af, at det til suspendering af den tørrede AMB/cholesterolsulfat-blanding benyttede Tris-puffermedium indeholdt 1 pCi ^C-saccharose. Suspensionen blev overført på en Sephadex G50 gel-eksklusionskolonne, der var ækvilibreret med 10 mM Tris/HCI, 0,1 30 mM EDTA, 10% (vægt/volumen) lactosepuffer, pH 7,4, og det overførte materiale blev elueret med samme puffer. Partiklerne blev elueret i det frie volumen, som blev overvåget ved UV-absorption ved 280 nm. Prøverne blev opsamlet og undersøgt for radioaktivitet ved sædvanlig scintiilationstælling.
23 DK 174871 B1
Det blev konstateret, at 95% af AMB'et fandtes i partikeltoppen, medens der ikke forekom nogen detekterbar top af 14C-$accharose i dette område.
Eksempel 6 5
Undersøgelser over osmotisk kvældnino CHSO^AMB-formulationer med de fire forskellige molforhold af AMB og cho-lesterolsulfat blev fremstillet som i eksempel 1 {i det sædvanlige suspen-10 si'onsmediun, der indeholdt 10% lactose). Disse prøver er betegnet som post-dialyse-suspensioner (P.D. suspensioner) i nedenstående tabel 7. En del af hver prøve (indeholdende 10% lactose) blev lyofiliseret og rekonstitueret med destilleret vand, og disse prøver er betegnet som lyofiliserede og rekonstituerede (L.R.) i tabellen.
15 P.D. og L.R. prøverne blev hver fortyndet til 0,3 pmol/ml med destilleret vand, og størrelsesfordelingen af partiklerne blev bestemt som i eksempel 2 straks efter fortyndingen i hypotont medium og 20 minutter efter fortyndingen. Resultaterne er anført i nedenstående tabel 7. Som det ses, er der ingen væ-20 sentlig kvældning i løbet af en 20 minutters inkubationperiode, som indiceret ved forøgelse af den gennemsnitlige partikelstørrelse, i nogen af de undersøgte prøver.
Tabel 7 24 DK 174871 B1
Molforhold Prøve efter dialyse Tid Partikelstørrelse AMB/CHSO4 (PD) eller efter (min) (genn. + S.D nm) 5 I y ofil i seri ng/rehy- ___dratiserina (LR1_ 1:1 PD 0 109+42 20 114+45 10 1:1 LR 0 212+107 20 212+105 1:2 PD 0 126+59 20 134+64 1:2 LR 0 170+81 15 20 184+89 1:3 PD 0 124+58 20 131+61 1:3 LR 0 205+117 20 204+107 20 1:4 PD 0 161+86 20 185+100 1.4 LR 0 228+116 20 236+122 25 Eksempel 7
Partikelsuspensionernes toksicitet (LD50)
Udavlede schweiziske/Webster hanmus blev opnået fra Simonsen Labs, Inc.
30 Dyrene vejede ca. 15-45 g på behandlingsdagen og var 4-8 uger gamle. Dyrerne blev sat i karantæne i mindst tre dage inden undersøgelsen, og kun mus, som forblev sunde under karantæneperioden, blev benyttet. Dyrene blev givet foder og vand ad libitum.
25 DK 174871 B1 I en første undersøgelse blev dyregrupperne behandlet med enten "Fungizone" (Squibb) suspenderet i sterilt saltvand eller 1:4 AMB/cholesterolsulfatsammensætning fremstillet ifølge eksempel 1. I hvert 5 tilfælde blev AMB-koncentrationen justeret således, at den valgte dosis AMB (anført i tabel 8) kunne indgives i et slutvolumen på 0,2 ml. Til hver dosisgruppe blev der benyttet 4-8 dyr. Forsøgsmaterialet blev indgivet i form af en enkelt, intravenøs injektion via den laterale halevene. Hver dosis blev indgivet i løbet 1,5 minutter.
10
Dyrene blev observeret for tegn på toksicitet og død i det mindste tre gange (1, 2 og 4 timer efter behandlingen) på behandlingsdagen. I den resterende observationsperiode på fem dage blev dyrene undersøgt dagligt om morgenen og om eftermiddagen. Forsøgsresultaterne udtrykt som forholdet mellem 15 antallet af overlevende på den 5. dag divideret med det totale behandlede antal dyr er angivet i tabel 8. LDgQ-værdien for "Fungizone" beregnet ved de sædvanlige metoder er 3,2 mg/kg. LD50 For AMB/cholesterolsulfat-sammensætningen ligger mellem 15-20 mg/kg.
20 Tabel 8
Antal overlevende på dag 5 (efter injektion/antal Behandling injicerede dvr ialt)_
25 FUNGIZONE
0,5 mg/kg 8/8 1.0 mg/kg 8/8 2.0 mg/kg 8/8 30 4,0 mg/kg 2/8 6.0 mg/kg 0/8 8.0 mg/kg 0/4 26 DK 174871 B1 CHSO4/AMB (4:1) 10 mg/kg 3/3 15 mg/kg 3/4 5 20 mg/kg 2/5 25 mg/kg 1/3 I en anden toksicitetsundersøgelse blev mus behandlet med 20 mg/kg af en af de fire AMB/cholesterolsulfat-formulationer fra eksempel 1, idet medika-10 mentindgivelsen og dyreovervågningen blev udført som ovenfor. De i nedenstående tabel 9 anførte resultater viser, at 1:1 formulationen har en LD^q-værdi på mere end 20 mg/Kg.
Tabel 9 15 Behandling Antal overlevende på dag 5 (efter injektion/antal (AMB/CHSO4) injicerede dyr ialt) 1:1 molforhold 6/6 1:2 molforhold 0/5 20 1:3 molforhold 1/5 1.4 molforhold 0/5
En tredie toksicitetsundersøgelse blev udført af et uafhængigt laboratorium under anvendelse af Cr1:CD-1(ICR)BR hanmus, 18-20 gram og opnået fra 25 Charles River Laboratory (Wilmington, MA). Der blev fremstillet AMB/CHSC^-formulationer, som indeholdt AMB og cholesterolsulfat i et molforhold på enten 1:4 eller 1:1. ,,Fungizone,‘ og frit AMB blev opløst i pyrogen-frit vand og lydbehandlet i 10 minutter ved stuetemperatur. Alle medikamentpræparater blev fortyndet til den ønskede koncentration med en passende 30 fortyndingspuffer.
Ikke-inficerede mus blev injiceret intravenøst med en enkelt dosis af en af AMB-præparaterne. Dosis af AMB/CHS04-cholesteroisulfatformulationerne 27 DK 174871 B1 var 30, 15, 7,5, 3,75, 1,88 og 0,94 mg AMB/kg legemsvægt. Dosis af "Fungizone" og frit AMB var 8, 4, 2, 1, 0,5, og 0,25 mg AMB/kg legemsvægt. Dødeligheden blev registreret over en periode på fem dage efter behandlingen, og 50% letal dosis (LDgg) for hvert præparat blev beregnet ved standardmeto-5 der. Resultaterne er anført i tabel 10. Som det ses var LDgg-værdien for 1:1 og 1:4 AMB/CHS04-formulationerne adskillige gange højere end værdien for frit AMB eller "Fungizone", hvorhos 1:1 formulationen havde en LD5g-værdi på mere end 30 mg/kg.
Tabel 10 10 LD50 (mg/kg/dosis) AMB form (95% konfidensinterval)
Frit AMB 4.9(3,7,6,5) "Fungizone" 4,3 (3,1, 6,0) 15 AMB/CHSO4 (4:1) 16.1(10,9,23,8) AMB/CHSO4 (1:1) >30
Endnu senere er toksiciteten af 1:4 og 1:1 AMB/CHSC^-formulationeme blevet undersøgt af et andet uafhængigt laboratorium, hvor bolusinjektioner på 20 op til 40 mg AMB/kg legemsvægt blev undersøgt. Undersøgelsen gav en LDso-værdi for 1:1 AMB/CHSC^-formulationen på mere end 40 mg/kg.
Eksempel 8 25 Virkningseffektivitet af AMB/cholesterolsulfat-formulationer
Cr1:CFW(SW)BR mus, der vejede 20-25 gram, blev indkøbt fra Charles Ri- ver Breeding Laboratories og blev tildelt foder og vand ad libitum. C. albicans
Stamme 30 blev dyrket ved 35 °C på SDA (Sabourand Dextrose A gas) i 18 30 timer, og organismen blev indvundet og fortyndet med sterilt, ikke-pyrogent saltvand til opnåelse af ca. 7 x 108 kolonidannende enheder i et 0.2 ml volumen.
28 DK 174871 B1 8-10 Dyr blev injiceret i halevenen med hver 0,2 ml af ovennævnte C. albi-cans-blanding. To dage efter svampeinfektionen blev dyrene injiceret med graduerede doser af "Fungizone" eller (1:4) AMB/cholesterolsulfat fremstillet 5 som i eksempel 1. AMB-Præparaterne blev justeret med hensyn til koncentration, således at hvert dyr blev givet et totalvolumen på 0,2 ml, som blev indgivet intravenøst gennem halevenen. Mængden af indgivet AMB udtrykt som mg medikament/kg legemsvægt for dyret er anført til venstre i tabel 10.
Dyrene blev overvåget i 25 dage efter medikamentindgivelsen. Antallet af 10 overlevende efter 25 dage i forhold til det samlede antal forsøgsdyr er anført i tabellen for de to AMB-præparater og en kontrolpuffer.
Tabel 11
Antal overlevende efter 25 dage/antal injicerede dyr 15 Dosis Frit AMB CHCO4/AMB = 4:1 Kontrol 0,0 mg/kg - - 0/11 0,3 mg/kg 2/10 5/10 0,6 mg/kg 1/10 9/10 20 0,9 mg/kg 3/10 9/10 2,0 mg/kg - 10/10 I en anden undersøgelse blev Cr1:CD-1(ICR)BR hanmus, der vejede 18-20 gram, inficeret med 0,1 ml. C. albicans (10® celler/dyr) og delt i behandlings-25 grupper med 10 dyr/gruppe. Fri AMB og 1:1 samt 1:4 AMB/CHSO4-formulationer blev fremstillet som i eksempel 7 og eksempel 1. Inficerede mus blev givet to doser af hvert medikamentpræparat på infektionsdagen og yderligere to doser på den følgende dag , ialt fire doser ad intravenøs vej. Størrelsen af den enkelte dosis AMB var for hver forsøgsgruppe 0,5, 0,125 30 og 0,031 mg AMB/kg legemsvægt/dosis. En kontrolgruppe blev kun indgivet fortyndingspufferen. Musenes dødelighed blev overvåget i en periode på 30 dage efter infektionen. 50% Beskyttelsesdosis (PD5Q) blev beregnet ud fra overlevelsedataene ved sædvanlige metoder.
29 DK 174871 B1
Tabel 12 sammenfatter de for de to AMB/CHSC^-formulationer og frit AMB opnåede PDgQ-data. Begge AMB/CHS04-formulationerne var lige så effektive som frit AMB ved behandlingen af svampeinfektionen.
5
Tabel 12 PD50 (mg/kg/dosis)
Amphotericin-B-form (95% konfidensintervah 10
Frit AMB 0,25(0,11.0,55) AMB/CHSO4 (4:1) 0,25 (0,14, 0,45) AMB/CHSO4 (1:1) 0,22(0,16,0,29) 15 Overlevelseskurver baseret på ovenstående undersøgelse er vist i figurerne 1A-1C som omtalt ovenfor. Kurverne viser specielt den større behandlingseffektivitet, der er opnåelig med 1:1 AMB/CHS04-formulationen ved større AMB-dosisniveauer i forhold til frit AMB.
20 Selvom opfindelsen er blevet beskrevet og illustreret i forbindelse med specifikke udførelsesformer, anvendelser og fremgangsmåder til fremstilling af præparater, vil det forstås, at forskellige ændringer og modifikationer kan foretages uden at afvige fra opfindelsens rækkevidde.
t
Claims (7)
1. Amphotericin-B-sammensætning, kendetegnet ved, at den omfatter partikler af amphotericin-B, der indeholder cholesterolsulfat i et 5 molforhold mellem amphotericin B og cholesterolsulfat på fra ca. 1:1 til 1:4.
2. Sammensætning ifølge krav l.kendetegnet ved, at partiklerne er suspenderet i et vandigt medium og overvejende har partikelstørrelser mellem ca. 100-400 nm. 10
3. Sammensætning ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den er fremstillet ved: (a) dispergering af en vandig suspension af amphotericin-B og cho- 15 lesterolsulfat i et molært forhold på fra 1:1 til 1:4 indtil opnåelse af optisk klarhed, (b) lyofilisering af suspensionen i nærværelse af et kryobeskyttel-sesmiddel inden partikelstørrelserne i suspensionen øges væ- 20 sentligt, og (c) rekonstituering af det lyofiliserede materiale med et vandigt medium.
4. Sammensætning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mol- forholdet mellem amphotericin-B og cholesterolsulfat er ca. 1:1.
5. Fremgangsmåde til fremstilling af amphotericin-B i en form, der har en LDgg på mere end ca. 15 mg/kg, og som kan rekonstitueres med et 30 vandigt medium til partikelstørrelser på mellem ca. 100-400 nm, kendetegnet ved, at DK 174871 B1 (a) at en vandig suspension af amphotericin-B og cholesterolsul-fat dispergeres i et molforhold på fra 1:1 til 1:4 indtil opnåelse af optisk klarhed, og 5 (b) at suspensionen lyofiliseres i nærværelse af et kryobeskyttel- sesmiddel inden størrelsen af partiklerne i suspensionen øges væsentligt.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det 10 lyofiliserede materiale rekonstitueres med et vandigt medium.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 5 eller 6, kendetegnet ved, at molforholdet mellem amphotericin-B og cholesterol i suspensionen er ca. 1:1.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US07/019,575 US4822777A (en) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | Amphotericin B/cholesterol sulfate composition |
US1957587 | 1987-02-27 | ||
PCT/US1988/000599 WO1988006450A1 (en) | 1987-02-27 | 1988-02-26 | Amphotericin b/cholesterol sulfate composition and method |
US8800599 | 1988-02-26 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK598388D0 DK598388D0 (da) | 1988-10-27 |
DK598388A DK598388A (da) | 1988-10-27 |
DK174871B1 true DK174871B1 (da) | 2004-01-12 |
Family
ID=21793937
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198805983A DK174871B1 (da) | 1987-02-27 | 1988-10-27 | Amphotericin-B/cholesterolsulfat-sammensætning og fremgangsmåde til fremstilling af samme |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4822777A (da) |
EP (1) | EP0303683B1 (da) |
JP (1) | JPH0610134B2 (da) |
AT (1) | ATE88348T1 (da) |
AU (1) | AU599779B2 (da) |
CA (1) | CA1336890C (da) |
DE (1) | DE3880397T2 (da) |
DK (1) | DK174871B1 (da) |
FI (1) | FI884889A (da) |
HK (1) | HK80596A (da) |
NO (1) | NO884741D0 (da) |
WO (1) | WO1988006450A1 (da) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0825869B2 (ja) * | 1987-02-09 | 1996-03-13 | 株式会社ビタミン研究所 | 抗腫瘍剤包埋リポソ−ム製剤 |
US5032582A (en) * | 1987-02-27 | 1991-07-16 | Liposome Technology, Inc. | Method for treating fungal infections with amphotericin B/cholesterol sulfate composition |
US5616334A (en) * | 1987-03-05 | 1997-04-01 | The Liposome Company, Inc. | Low toxicity drug-lipid systems |
US6406713B1 (en) | 1987-03-05 | 2002-06-18 | The Liposome Company, Inc. | Methods of preparing low-toxicity drug-lipid complexes |
US5194266A (en) * | 1989-08-08 | 1993-03-16 | Liposome Technology, Inc. | Amphotericin B/cholesterol sulfate composition and method |
WO1992008467A1 (en) * | 1990-11-16 | 1992-05-29 | Nippon Shinyaku Co., Ltd. | Dispersion preparation |
WO1993003737A1 (en) * | 1991-08-14 | 1993-03-04 | Liposome Technology, Inc. | Hiv-treatment method with low-toxicity amphotericin b |
US5264220A (en) * | 1991-11-12 | 1993-11-23 | Long David M Jr | Method of extending the vascular dwell-time of particulate therapeutic and particulate diagnostic agents |
WO1994008599A1 (en) * | 1992-10-14 | 1994-04-28 | The Regents Of The University Of Colorado | Ion-pairing of drugs for improved efficacy and delivery |
IT1283149B1 (it) * | 1996-07-12 | 1998-04-07 | Prodotti Antibiotici Spa | Complessi di n'-dimetilaminoacetilpartricina a dimetilaminoetilamide, o suoi sali, e colesterol 3-solfato |
US6613352B2 (en) | 1999-04-13 | 2003-09-02 | Universite De Montreal | Low-rigidity liposomal formulation |
US8404217B2 (en) | 2000-05-10 | 2013-03-26 | Novartis Ag | Formulation for pulmonary administration of antifungal agents, and associated methods of manufacture and use |
KR100743404B1 (ko) | 2000-12-21 | 2007-07-30 | 넥타르 테라퓨틱스 | 폴리엔 항균제의 폐 전달 |
TWI332943B (en) * | 2001-07-10 | 2010-11-11 | Synta Pharmaceuticals Corp | Taxol enhancer compounds |
TWI252847B (en) * | 2001-07-10 | 2006-04-11 | Synta Pharmaceuticals Corp | Synthesis of taxol enhancers |
TWI297335B (en) | 2001-07-10 | 2008-06-01 | Synta Pharmaceuticals Corp | Taxol enhancer compounds |
TWI330079B (en) * | 2003-01-15 | 2010-09-11 | Synta Pharmaceuticals Corp | Treatment for cancers |
TWI249408B (en) * | 2003-12-10 | 2006-02-21 | Ind Tech Res Inst | New antifungal formulation and manufacturing method thereof |
RS52999B (en) * | 2004-06-23 | 2014-02-28 | Synta Pharmaceuticals Corp. | BIS (AMIDIDA TIO-HYDRAZIDE) Salts for Cancer Treatment |
AU2006236378B2 (en) * | 2005-04-15 | 2010-12-02 | Synta Pharmaceuticals Corp. | Combination cancer therapy with bis(thiohydrazide) amide compounds |
US7678832B2 (en) * | 2005-08-16 | 2010-03-16 | Synta Pharmaceuticals Corp. | Bis(thio-hydrazide amide) formulation |
US8609720B2 (en) | 2006-08-21 | 2013-12-17 | Synta Pharmaceuticals Corp. | Compounds for treating proliferative disorders |
EP2076254A2 (en) * | 2006-08-31 | 2009-07-08 | Synta Pharmaceuticals Corporation | Combination with bis(thiohydrazide amides) for treating cancer |
TW200829543A (en) * | 2006-09-15 | 2008-07-16 | Synta Pharmaceuticals Corp | Purification of bis(thiohydrazide amides) |
US20100068251A1 (en) * | 2006-10-10 | 2010-03-18 | Jina Pharmaceuticals, Inc. | Aqueous Systems For The Preparation Of Lipid Based Pharmaceutical Compounds; Compositions, Methods, And Uses Thereof |
DE102015102210A1 (de) * | 2015-02-16 | 2016-08-18 | Heraeus Medical Gmbh | Antimykotischer polymerisierbarer Knochenzement und ein Verfahren zu seiner Herstellung |
AU2018225546A1 (en) * | 2017-02-21 | 2019-08-29 | Satellos Bioscience Inc. | Solid oral formulations of amphotericin B |
CN110305926B (zh) * | 2019-05-27 | 2021-02-26 | 浙江工业大学 | 一种基于两性霉素b代谢途径的发酵方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4002741A (en) * | 1974-04-24 | 1977-01-11 | Valter Osvaldovich Kulbakh | Meglumine complex fungicidal polyene macrolide antibiotic compositions and treatment method |
US4468513A (en) * | 1980-09-22 | 1984-08-28 | Eli Lilly And Company | 2'-N-Acylated and 2'-N-alkylated derivatives of 4-O-substituted-2-deoxystreptamine aminoglycosides |
PT78628B (en) * | 1984-05-02 | 1986-06-18 | Liposome Co Inc | Pharmaceutical composition with reduced toxicity |
US4707470A (en) * | 1985-05-17 | 1987-11-17 | Smithkline Beckman Corporation | Polyene antibiotic emulsion formulation |
-
1987
- 1987-02-27 US US07/019,575 patent/US4822777A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-02-26 WO PCT/US1988/000599 patent/WO1988006450A1/en active IP Right Grant
- 1988-02-26 AT AT88902717T patent/ATE88348T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 DE DE8888902717T patent/DE3880397T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-02-26 JP JP63502859A patent/JPH0610134B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-02-26 EP EP88902717A patent/EP0303683B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-26 AU AU14826/88A patent/AU599779B2/en not_active Ceased
- 1988-02-29 CA CA000560142A patent/CA1336890C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-10-21 FI FI884889A patent/FI884889A/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-10-25 NO NO884741A patent/NO884741D0/no unknown
- 1988-10-27 DK DK198805983A patent/DK174871B1/da not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-05-09 HK HK80596A patent/HK80596A/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK80596A (en) | 1996-05-17 |
ATE88348T1 (de) | 1993-05-15 |
EP0303683A4 (en) | 1989-12-28 |
FI884889A0 (fi) | 1988-10-21 |
NO884741L (no) | 1988-10-25 |
DE3880397T2 (de) | 1993-07-29 |
AU599779B2 (en) | 1990-07-26 |
JPH0610134B2 (ja) | 1994-02-09 |
DK598388D0 (da) | 1988-10-27 |
NO884741D0 (no) | 1988-10-25 |
FI884889A (fi) | 1988-10-21 |
JPH01502270A (ja) | 1989-08-10 |
WO1988006450A1 (en) | 1988-09-07 |
DE3880397D1 (de) | 1993-05-27 |
EP0303683A1 (en) | 1989-02-22 |
DK598388A (da) | 1988-10-27 |
US4822777A (en) | 1989-04-18 |
EP0303683B1 (en) | 1993-04-21 |
CA1336890C (en) | 1995-09-05 |
AU1482688A (en) | 1988-09-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK174871B1 (da) | Amphotericin-B/cholesterolsulfat-sammensætning og fremgangsmåde til fremstilling af samme | |
US5194266A (en) | Amphotericin B/cholesterol sulfate composition and method | |
US5032582A (en) | Method for treating fungal infections with amphotericin B/cholesterol sulfate composition | |
DK175201B1 (da) | Kompositioner omfattende antineoplastiske anthracyclinmidler indkapslet i micellulære phospholipidpartikler og fremgangsmåder til fremstilling deraf | |
US5077057A (en) | Preparation of liposome and lipid complex compositions | |
US5089181A (en) | Method of dehydrating vesicle preparations for long term storage | |
AU740111B2 (en) | Hyaluronic drug delivery system | |
JP3267611B2 (ja) | リポソーム−ポリエンプレリポソーム粉末とその製造方法 | |
JP2009507049A (ja) | リン脂質のポリエチレングリコール誘導体に包み込まれたビンカアルカロイド系制癌剤のナノミセル製剤 | |
EP0981332B1 (en) | Pharmaceutical preparation comprising lyophilized liposomes encapsulating an active principle which is highly insoluble in water, and the process for preparing the said preparation | |
Chandraprakash et al. | Pharmacokinetic evaluation of surfactant vesicle-entrapped methotrexate in tumor-bearing mice | |
AU775038B2 (en) | A liposome composition having resistance to freeze/thaw damage | |
AU638245B2 (en) | Preparation of liposome and lipid complex compositions | |
CN112137958A (zh) | 一种含阿霉素与免疫佐剂组合药物脂质体及其制备方法 | |
CN107320716B (zh) | 碱性成纤维细胞生长因子囊泡及其制备方法 | |
Machluf et al. | Characterization of microencapsulated liposome systems for the controlled delivery of liposome-associated macromolecules | |
Crommelin et al. | Physical stability on long-term storage | |
CA1321351C (en) | Method of dehydrating vesicle preparations for long-term storage | |
Sirisha et al. | Liposomes-the potential drug carriers | |
Nounou et al. | Influence of different sugar cryoprotectants on the stability and physico-chemical characteristics of freeze-dried 5-fluorouracil plurilamellar vesicles | |
AU664857B2 (en) | HIV-treatment method with low-toxicity amphotericin B | |
CN108836944B (zh) | 一种大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂及其制备方法 | |
Soujanya et al. | A Review on Novel Vesicular Drug Delivery System: Proniosomes. | |
WO1992002208A1 (en) | Stable doxorubicin/liposome composition | |
Higgins et al. | A comparative investigation of glycinebetaine and dimethylsulphoxide as liposome cryoprotectants |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PBP | Patent lapsed |
Country of ref document: DK |