JPH01502270A - アンホテリシンｂ／硫酸コレステロール組成物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

アンホーリシンＢＩＭ　コレステロール　およびその制御１里 １・主里坐立互 本発明は、真菌感染症治療用のアンホテリシンＢ組成物に関し、特に、高いＬＤ 、。（５０％致死量）と治療効力とを有するアンホテリシンＢ組成物に関する。 ２、皇皿ヱ藍 １、　ＨＯ１２，Ｒ，Ｗ、＋　ｉｎ　Ｆ、Ｅ、　Ｈａｈｎｉ、　Ａｎｔｉｂｉｏ ｔｉｃｓ、　ｖｏｌ、　２＋Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎ、Ｙ、　（ １９７９）。 ２、　Ｔｒｅｍｂｌｅｙ、　Ｃ，ら＋　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ　 ａｎｄ　Ｃｈｅａ＋ｏｔｈ。 ’！６（２）：１７０　（１９８４）。 ３、　Ｍｅｈｔａ、　Ｒ，Ｔ、ら＋　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ ｉｔｙ＋　４７（２）：４２９（１９８５）　。 ４、　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、　Ｇ、ら、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ 　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ＋　１（１）：３７　（１９８３）。 ５、　Ｎｅｗ、　Ｒ，Ｒ，Ｃ，ら、　Ｊ　Ａｎｔｉｇｅｉｃｒｏｂ　Ｃｈｅ＋＊ ｏｔｈ、　８：３７１　（１９８１）。 ６、　Ｇｒａｙｂｉｌｌ、　Ｊ、Ｒ，ら、　Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ、　１４ ５：５（１９８２）。 ７、　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、　Ｇ、、　Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉｓ 、　１５０（２）：２７８（１９８４）。 ８、Ｔｒｅｍｂｌｅｙ、　ｃ、ら、Ｉｎｖｅｓｔ　Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ、　２６ ：７１１　（１９８５）。 ９、　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、　Ｇ、ら、　Ｊ　Ｉｎｆｅｃｔ　Ｄｉ ｓ、　１５１（４）ニア０４（１９８５）。 １０、　Ｊｕｌｉａｎｏ、　Ｒ，ら、　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ １．４（３９）　（１９８３）。 １１、　Ｍｅｈｔａ、　Ｒ，ら、　Ｂｉｏｃｈｅｓ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ 、　７７０：２３０　（１９８４）。 １２、　Ｈｏｐｆｅｒ、　Ｒ，Ｌ、ら＊　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ　Ａｇｅｎｔｓ 　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈ、　２５（３）：３Ｂ？　（１９８４）。 １３、Ｂｒｏｃｋｅｒｈｏｆｆ、Ｂ、ら＋　Ｂｉｏｃｈｉｉ＊ｉｃａ　ｂｉｐｈ ｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　６９１：２２７　（１９８２）。 １４、　Ｃｒｏｎｅ、　Ｌ、　Ｍ、ら＋　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙ ｓｉｃａ　Ａｃｔａ　７６９：１４１（１９８４）　。 １５、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃ ｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ａ、Ｒ。 ＮＩＬ　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（１９８５）、Ｌ ３１Ｂγλ景 アンホテリシンＢ　（Ａ！ＩＢ）は、前動な抗真菌剤であり、現在。 最も重い全身性真菌感染症用に選択される薬剤である（参照文献１）、この薬剤 は、ヒト用に、ＡＭＢおよびデオキシコール酸塩の凍結乾燥粉末〔［フンギシン （Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）　Ｊ　］として、現在入手することができる。この薬剤 は、真菌膜の主要なステロール成分であるエルゴステロールと強く結合し、真菌 膜に孔を形成し、その孔から溶質分子を漏洩させる。また。 この薬剤は、はとんどの補乳類の細胞膜中に存在するステロールであるコレステ ロールに対しても強い結合親和性を有するので、宿主細胞を破壊させ得る。 ＡＭＢを、遊離の形態で（すなわち、再形成されたＡＭＢ／デオキシコール酸塩 複合体として）投与すると、赤血球細胞の破壊による副作用が最初に認められ、 続いて一層強い心臓毒性、ＣＮＳおよび骨髄への副作用が起こる。身体がこの薬 剤を除去しようとすることが原因の腎臓毒性も存在する。 ＡＭＢの毒性が、リポソームに結合した形のこの薬剤を投与することによって減 少させ得ることは、いくつもの研究により示されている（文献２〜１２）。この 薬剤をリポソームの形で投与すると、一般に、この薬剤のＬＤ、。は、遊離の薬 剤の約２〜３■／ｋｇ体重から約８〜１５■／ｋｇまで増大する。しかし。 リポソーム形製剤の制限は、アンホテリシンＢ／リポソーム粒子を水性媒体中で 貯蔵した場合に、明らかに粒径が不安定なことである。約２００〜３００ｎｍの 初期粒径分布を有するＡＭＢ含有リポソームは、一般に、水性媒体中での長期間 にわたる貯蔵中に、数ミクロンまでの大きなリポソーム構造を自然に形成する。 約１〜２ミクロンより大きい粒径を有するリポソームは、非経口的に、すなわち 血液中に投与すると、一般に。 小さなリポソームより毒性が大きい、血流中の大きなリポソームの毒性は、肺胞 毛細血管のリポソームによる閉鎖に、一部関連がある。また、比較的大きなリポ ソームは肝臓に対してより大きな毒性があるという指摘があり、これは恐らく網 内細胞中へのリポソームの蓄積が原因であろう０本願の譲受人が共存する米国特 許出願第７８１　、３９５号（１９８５年９月２７日出願）「アンホテリシンＢ リポソーム組成物」には、上記の粒径成長の問題を大部分克服したＡ？ＩＢリポ ソームを調製し、貯蔵する新規な方法が開示されている。 ＡＭＢを、コレステロールのポリエチレン誘導体（ＰＥＧ−コレステロール）と 複合させることによって形成したアンホテリシンＢ組成物も提案されている（国 際特許出！！１ＩＵｓ８４１００８５５）　。 この製剤は、ＡＭＢのＬＤｓ。を、フンギシンの３．８■／ｋｇから。 マウスでの１０．０■／聡まで増加させ、また細胞培養物における細胞毒性も低 下した。ＰＥＧ−コレステロールと複合しているＡＭＢは、どのようにインビボ で真菌感染症に対する治療効果を与えるのか、あるいはこの複合体が粒径安定形 で貯蔵し得るかどうかは知られていない。 ４・１里坐！１ 本発明の目的は、従来技術で報告されたＡ？ｌＢ製剤より充分に高いＬＤ、。値 を有し、かつインビボで真菌感染症を治療するのに著しく有効なＡＭＢ組成物を 提供することにある。 本発明の他の目的は、有意な粒径変化なしで数日間、懸濁形態で貯蔵可能であり 、かつ凍結乾燥調製物として長期間貯蔵可能なＡＭＢ製剤を提供することにある 。 本発明のさらに他の目的は、真菌感染症をＡＭＢで治療するための改良法を提供 することにある。 本発明には、　ＡＭＢおよび硫酸コレステロールの粒子を、　ＡＭＢ：硫酸コレ ステロールのモル比が約ｌ：１〜１：４で含有するＡＭＢ組成物が含まれる。該 組成物を水性媒体中、懸濁形態で調製する際、これら粒子は約１００〜４００ｎ ｍの間の粒径が好ましい、浸透膨潤および溶質捕捉の研究によると、これらの粒 子は非リポソーム的であることを示している。好ましい組成物は、ＡＭＢおよび 硫酸コレステロールを約１：１のモル比で含有しているが、数日間にわたって溶 液形態で貯蔵しても。 粒径がほとんど変化しないことを示している。 本発明のある局面によれば、この組成物は９モル比が１：１〜１：４の間のアン ホテリシンＢ／硫酸コレステロール粒子の水性懸濁液を１粒径が主として約１０ ０〜２００ｎｍの間にあり、光学的に透明に分散させることによって形成される 。得られた懸濁液は９次いで、ラクトースのような凍結防止剤の存在下で、実質 的な粒子径の増加が起こる前に凍結乾燥する。 水性媒体中で再形成した後１粒子径は、主として２００〜３００ｎｉｍの範囲内 にある。 本発明の組成物は、マウスにおいて、同じ動物モデル系におけるフンギシンの約 ３．２■／ｋｇというＬＤ、。に比べて、１５■／ｋｇより大きなＬＤ、。を有 し、１：１配合比の組成物は、３０〜４０■／ｋｇより大きなＬＤ、。を有する 。本発明のＡＭＢ／硫酸コレステロール組成物の治療効力は、全Ａｌ’ｌＢ投与 レベルに依存するが、インビボで真菌感染症を治療する際に、遊離のＡＭＢにつ いて観察される治療効力と同等またはそれ以上である。 また９本発明には、従来達成されていたよりも実質的に毒性が小さく、かつ治療 効力が大きな、ＡＭＢによる真菌症の治療方法が含まれる。本発明の方法には、 ＡＭＢ／硫酸コレステロールの上記のタイプの水性粒子懸濁液を処方し、該懸濁 液の治療上有効な量を投与する方法が含まれる。 本発明の上記および他の目的は、以下の本発明の詳細な説明によって充分に明ら かになる。 丞１Ｂλ匣皇１１咀 第１Ａ図〜第１Ｃ図は、　Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓで全身的に悪染さ せ１次いでＡＭＢを一度に注射投与して治療した動物の生存率を、感染後の日数 の関数として表したグラフである。第１Ａ図、第１Ｂ図、および第１Ｃ図は、そ れぞれＡＭＢを、０．５ｍｇ／ｋｈ／ｄｏｅｓ、　０．１２５　［／ｋｇ／ｄｏ ｅｓ、および０．０３１　ｒｉｒｇ／ｋｇ／ｄｏｅｓ投与した場合である ｌ旦■毘糧星脱ユ １、拉王皿底ｌΩ調星 Ａ０粒子懸濁液 本発明のＡＭＢ／硫酸コレステロールの粒子懸濁液を調製するために、ＡＩＩＢ と硫酸コレステロールを、Ａｌ’ｌＢ：硫酸コレステロールの選択されたモル比 の約ｌ：１〜１：４の間で、乾燥形態または溶液形態で混合する。好ましい方法 では、この２次分を、乾燥形態でかつ選択されたモル比で混合して９次いで適切 な溶媒、好ましくはメタノールのようなアルコールに溶解する。メタノール中に おけるＡＭＢおよび硫酸コレステロールは９合計モル濃度が５０μ５ｏｌｅ／ｄ であり、へｈＢ：硫酸コレステロールのモル比が１＝１と１：４との間であるの が適切である０例えば、１：１配合の製剤は、Ａ？ＩＢおよび硫酸コレステロー ルが共に、２５μｍｏｌｅ／ｍで存在することになる。 凍結防止剤を、好ましくは約５〜１５％の間の最終濃度で。 上記ＩＭＢ／硫酸コレステロール溶液に添加してもよい、この凍結防止剤は、後 の処理工程で、２つの目的に役立つものである。第１に、凍結防止剤は、混合物 中の溶媒が除去される際に、ＡＭＢおよび硫酸コレステロールの成分が、その上 に形成可能な結晶性で水溶性の充填剤（ｂｕｌｋｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）を与える 。 すなわち、凍結防止剤の乾燥結晶が、溶媒が除去される際に形成された脂質膜の 表面積を増大させ、その結果、水性媒体が乾燥混合物に添加される際に９粒子の 水和が容易になる。 第２に、水和された粒子を、下記のように凍結乾燥状態で貯蔵すると、凍結防止 剤が、凍結の際に起こり得る粒子の損傷を低減し、その結果、再水和された粒子 の粒径の増加を低下させる。適切な凍結防止剤は、トレハロース、ラクトース。 マルトース、セロビオース、スクロース、グルコース、フルクトース、ソルビト ール、ラフィノース、ミオ−イノシトール、およびグリセロールのような炭水化 物である（参照文献１４）、マルトデキストリン、塩類などのような各種の他の 水溶性充填剤は１粒子処理方法が凍結工程を含まない場合９例えば粒子が貯蔵の ために噴霧乾燥される場合には、凍結防止剤の代わりに用いることができる。 Ａ）ＩＢ／硫酸コレステロールの脂質溶液は、乾燥されて脂質膜になる。今説明 したように、この膜は、好ましくは充填剤を含有する溶液から形成され、脂質混 合物で被覆された充填剤の乾燥粒子を与える。溶媒の除去は、ｆＩｉ圧蒸発、ま たは窒素のような不活性ガスの気流中で行われる。乾燥脂質膜は。 不活性ガス中で貯蔵してもよいが、４°Ｃまたはそれ以下の温度が好ましい。 水性粒子懸濁液は、水性媒体を乾燥脂質混合物に添加することにより形成される 。実施例１に用いた。１０ｍＭ）リス−塩酸、　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＦ Ｉ　７．４を含有する媒体が適切である。添加される媒体の量は、ＡＭＨの最終 濃度が好ましくは約２５〜１００μｍｏｌｅ／ｄの間になるような量で充分であ る。 まず、上記脂質物質を、スパチュラまたは機械的な撹拌によって、あらかた懸濁 させて、脂質の固まりを水性媒体中に分離させてスラリー状混合物を形成させる 。得られた材料は。 超音波処理、均質化処理、フレンチプレスなどで高いエネルギーを与えることに よって１粒子系が微細になるまで分散させる。この分散処理は、所望の粒径、好 ましくは０．１〜１ミクロンの間の粒径が得られるまで行う、懸濁液は９分散処 理中加温してもよいが、不活性雰囲気下に保持すべきである。 実施例１に記載した方法では、懸濁液は、４５°Ｃで超音波処理を行い、光学的 に透明にする。最終的な粒径は０．１〜０．２ミクロンの間であった。ここで、 １ｍｏｌｅのＡＭＢあたり約１ｍ。１ｅを超えない硫酸コレステロールを含有す る製剤は、超音波処理しても光学的な透明性が得られず１粒子を分散するには。 少なくとも化学量論的な量の硫酸コレステロールが必要であることを示している ことが注目される。 粒子懸濁液は、モレキュラーシーブクロマトグラフィまたは透析などによって処 理し、ｙＭ跡量の混和していないＡＭＢを除去する。実施例１に示す透析条件が 適切である。分散された粒子懸濁液中のＡ？ＩＢの最終濃度は、懸濁液の一部を メタノールで稀釈し９分光光度計を用いて４０６ｎｍの波長でＡＭＨについて測 定することによって決定することができる０分散液調製の各工程における代表的 なＡＭＢ濃度を、以下の実施例１の表１に示す。 Ｂ、乾燥粒子懸濁液 本発明のある局面に従って３本発明のＡＭＢ／硫酸コレステロール粒子は、乾燥 形態で長期間貯蔵することができ、再水和する際に粒径が著しく増大しないこと が見い出された。 乾燥粒子製剤は、乾燥凍結または噴霧乾燥によって調製することができる。両方 法ともに、乾燥工程は、Ａ？ｌＢ／硫酸コレステロール粒子の粒径が実質的に増 大する前に行われる。 凍結乾燥法では、小さな粒子の懸濁液が２．速に凍結され、実施例１に記載して いるように、好ましくは２０°Ｃまたはそれ以下の貯蔵温度で凍結乾燥される０ 粒径に対する凍結乾燥の影響は、ＡＭＢ：硫酸コレステロールのモル比が１＝１ 〜１：４の間にある４つの製剤の各々について、実施例２の表２に示されている 。各々の場合について、平均粒径は、凍結乾燥前の約１００〜２００ｎｍから、 ！結乾燥して水で再水和した後の２００〜３００ｎｍの間に増大した。凍結乾燥 の前後の粒子の安定性については、以下の第ｎ節で考察する。 噴霧乾燥では１粒子懸濁液は従来の装置で乾燥される。これらの装置では、乾燥 すべき粒子が、エアロゾル化懸濁液の形態で、加熱された空気または不活性ガス の気流中に噴霧されてプレートコレクターの方に運ばれ、乾燥リポソームが収集 される。噴霧乾燥装置の一例は、ブチ（Ｂｕｃｈｉ）１９０ミニ噴霧乾燥機であ る。 乾燥温度は、少なくとも約３７°Ｃであり、好ましくは約４０〜５０℃の間であ る。収集チャンバーの温度は、一般的には加熱空気の温度より低く、典型的には 約３７℃である。乾燥された粒子は、収集され、不活性雰囲気下にて、脱水形態 で貯蔵される。 ■、煎３Ｊ○

【注 この節では１粒子のモル組成、懸濁媒体、および貯蔵時間に関する各種条件下に おける。ＡＭＢ：硫酸コレステロール粒子の懸濁液の粒径安定性について調べる 。 最初の試験は実施例３に報告したが、Ａ？ｌＢ：硫酸コレステロールのモル比が 、１：１，１：２，１：３．および１：４のＡＭＢ　：硫酸コレステロール粒子 を調製し、透析直後に４°Ｃで８日間貯蔵した。結果を実施例３の表３に示す０ モル比が１：１の製剤は、８日間の試験期間にわたって実質的に安定であったが 、他の製剤は、硫酸コレステロールのモル比が増加するにつれて９次第により大 きな粒径のものが増加することを示した。 同様の４つの製剤を凍結乾燥して再水和した後の粒径安定性を同様に試験して実 施例３に示した。８日間の試験による粒径安定性のデータを表３に示す、興味深 いことに、この４つの製剤には粒径安定性にほとんど差がなかった。そして。 各製剤の平均粒径は、８日間の試験期間で、せいぜい約２倍に増加しただけであ る。表２および表４の結果を組み合わせると、（ａ）凍結乾燥されたＡ？ＩＢ／ 硫酸コレステロール粒子は。 平均粒径と粒径分布とがほとんど増大することなく再形成し得ること、および（ ｂ）再形成された懸濁液中の粒子は、溶液中で数日間貯蔵した場合、比較的安定 であることが示される。 本発明の粒子の粒径特性に対する生理食塩水および血漿の影響を調べて実施例４ に示した。最初の試験では、上記の４つの透析後のＡ　ＰＩＢ　／　ｇ酸コレス テロール製剤を、０．９％の食塩水で稀釈し、直ちに粒径を測定した０表５の最 上段に示したように、１：１ｅ合の製剤はほとんど凝集しなかったが。 すべての粒子が大きな粒径増加を示した。凍結乾燥後の粒子について同様の試験 を行い、結果を、実施例４の表６の最上段に示した０表５および表６のデータを 比較すると、１：１ｅ合の製剤は、透析後よりも凍結乾燥後の方が９食塩水中で 。 粒径が著しく安定であることを示している。硫酸コレステロールのモル比が大き な他の３つの製剤は、凍結乾燥の前後に。 食塩水中で大きな粒径増加を示した。 第２の試験は、血漿中におけるＡ？ｌＢ／硫酸コレステロール粒子の粒径と９次 いで血漿媒体を懸濁緩衝剤で稀釈した場合後に、１０％ラクトースを含有する懸 濁緩衝液で稀釈した。粒径の測定は、稀釈直後に、および稀釈してから２０分後 に行った、これらの結果を、実施例４の表５および表６の下方の２段に示す。こ れらのデータを要約すると、血漿は、すべての製剤において粒径を増加させた。 最小の粒径増加は、１：１配合の製剤に認められた。その粒径は１ミクロン（１ ０００ｎｍ）より小さかった。血漿との接触によって生じた粒径増加は。 １：４配合の製剤以外の全ての製剤について、少なくとも部分的に可逆的であっ た。このことは、懸濁媒体中の稀釈形態で２０分間保持した後に９粒径が著しく 低下することによって示された。凍結乾燥の前後における粒子の粒径の挙動には 。 はとんど差がなかった。 上記のデータは２本発明のＡＭＢ／ｇ酸コレステロール製剤が、乾燥形態で長期 間貯蔵することができ、再水和時に粒径が著しく増加しないか、あるいは血漿中 における粒径安定性が著しく変化しないことを示している。これらの乾燥粒子に 観察された１つの重要な利点は、緩衝剤中で貯蔵した場合に。 粒径安定性が著しく大きかったということである。調べたＡＭＢ　：硫酸コレス テロールのモル比の範囲内では、１：１配合の製剤が１種々の試験条件下で、最 貰の粒径安定性と最小の平均粒径とを示した。 ■、豆三隻性 硫酸コレステロールは９時間を延長して（数時間）超音波処理することによって 、脂質の小胞またはリポソームを形成し得ることが報告されている（参照文献１ ３）。それゆえに。 本発明のＡＭＢ／硫酸コレステロール粒子がリポソーム状形態であるかどうかを 決定することは興味深いことである。これらの試験には、ｌ：４配合のＡＭＢ／ 硫酸コレステロール製剤を選んだ。その理由は、硫酸コレステロールの比率が比 較的高い方がリポソーム構造を形成しやすいからである。 リポソームの１つの特徴は、水溶液溶質分子を包み込むことが可能な連続した脂 質二重層である。糖類などの標識溶質のような多くの水溶性分子は、標識溶質を 含有する水溶性媒体中でリポソーム脂質を（分散させながら）調製することによ って、リポソーム中に容易に包み込まれる。また、糖類のような小さな標識分子 は１．脂質二重層の膜を徐々に通過する傾向がある。このことは、溶質が、包み こまれた水性領域と。 バルク相の水性領域との間で、数時間から数日間の溶質交換期間にわたって平衡 化することで示される。 Ａ？ｌＢ／硫酸コレステロール（１：　４）粒子がスクロースを包み込む能力を 試験するために、！４０スクロースを含有する媒体中に分散させて粒子を調製し た。光学的な透明度が得られるまで超音波処理をした後、ＡＭＢ／硫酸コレステ ロール粒子の粒径範囲にある粒子を排除する物質ふるい分はカラムを用いた分子 ふるいクロマトグラフィによって９粒子を懸濁媒体から分離した。試験の詳細は 実施例５に記載する。簡単に述べると、９５％のＡＭＢが、ボイドボリューム中 に溶出した粒子と結合していたが、放射能が全く検出できないピークは。 これらの粒子に関連していた。 この試験によれば、上記の粒子は、包み込んだ（リポソーム状）構造を形成しな いか、あるいは非常に漏洩しやすい構造を形成しているようである。後者の説明 は可能性が低い。 その理由は、（ａ）コレステロールは、小さな水溶性透過物のリポソーム透過性 を低下させ、および（ｂ）従来報告されている純粋なコレステロール誘導体リポ ソーム（参照文献１３）は、透過性が非常に小さいからである。ヘミコハク酸コ レステロールリポソームに関する研究でも、各種の小さな水溶性分子の安定した 包み込みが示されている（国際特許！１１ＷＯ８５１０５０３０）　。 リポソームの他の特徴は１等張性リポソームが低張性媒体に注入されると膨潤す るという性質である。このように、リポソームは、二重層膜を通過する溶質の勾 配に応じて、小さな浸透圧計のような作用をする０等張性リポソームの膨潤現象 は２種々のコレステロール誘導体（コレステロール−ＰＥＧ。 硫酸コレステロール（参照文献１３）、およびヘミコハク酸コレステロールリポ ソーム（国際特許１ｉ！！ＷＯ３５１０５０３０）を含む）で調製したリポソー ムについて観察されている。コレステロール誘導体リポソームは、従来のリン脂 質成分から形成されたリポソームはどに理想的な浸透圧計のような挙動は示さな いが、徐々に稀釈媒体に注入すると予想どおりの吸光度の上昇を示す。 上記（１：１．１：２．１：３．および１：４のモル比）の４つのＡ？ＩＢ／コ レステロール粒子組成物を、それぞれ１０％ラクトース中で調製した。透析前後 の粒子について、稀釈直後の粒径と、稀釈してから２０分後の粒径とを比較して 、蒸留水中の浸透膨潤特性とを試験した。これらの結果を実施例６の表７に示す 。いずれの粒子製剤にも膨潤は観察されなかった。この試験は１本発明のＡＭＢ ／硫酸コレステロール粒子が閉鎖された小胞構造を形成しないという上記の包み 込みに関する試験から得た知見を裏付けている。 ■、主！上皇里盈 ＡＭＢは、コクシジオイデス症、クリプトコックス症、全身性モニリア症、ヒス トプラズマ症、アスペルギルス症、ロードブトルーラ症、スポロトリクス症、フ ィコミコーシス症。 およびプラストミセス症を含む各種の全身性真菌感染症を治療するのに有用であ り、　Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ属のいくつかの種の菌に対しても有効である（参照 文献１５）、この薬剤は、現在入手し得る遊離形態では９強い副作用があるので 、一般的には。 進行性であり、致命的になる可能性がある全身性の真菌感染症の患者にのみ投与 される。また、この患者は、腎臓機能を常時モニターするため、この薬剤で治療 中は入院していなければならない。 この節では９本発明の製剤中におけるＡＭＨの毒性が低減し。 かつ効力が向上したことと、これに基づき薬剤として使用可能なより広範囲の用 途、特に癌の化学療法、免疫抑制薬剤。 または放射線治療を受けている患者のような、免疫欠乏状態または免疫無防備状 態の患者における日和見的真菌感染症を予防する用途とについて説明する。 Ａ、ＡＭＢ／硫酸コレステロールの毒性本発明の重要な特徴によって、ここに記 載されたＡＭＢ　：硫酸コレステロール組成物が、遊離のＡＭＢ　（フンギシン ）よりも著しく毒性が低いことが、はるかに高いＬＤ、。値を有することで裏付 けられて見い出された。さらに、この組成物は、報告されたＬＤ、。値との比較 から判断して、従来技術の項で述べられたリポソーム形または脂質複合体形のＡ ＩＩＢよりも毒性が著しく小さい０本発明の組成物のＬＤ、。値を測定する毒性 試験は実施例７に詳述されている。最初の試験では、フンギシンと１：４配合の ＡＭＢ／硫酸コレステロール粒子との致死毒性を調べた０表８に示すデータによ れば、遊離ＡＭＢ　（フンギシン）の組成物のＬＤｓ。は、１〜４■／ｋｇ動物 体重の間である。 この値は、ＡＭＢ／［酸コレステロール組成物では、１５〜２５■／ｋｇの間に 増大する。このＬＤ、。値は、従来技術の項に記載されたリポソーム形または脂 質複合体形のＡＭＢ製剤について以前に報告された値より実質的に高い値である 。 追加の試験（実施例８に示されている）では、上記の４つの異なるモル比のＡＭ Ｂ製剤の致死毒性を、　４０■／ｋｇまでの投与量で調べた。この実施例に示し たように、ＡＭＢ／ＣＨ３０，の・製剤は、４０■／ｋｇまでのＬＤ、。値を示 した。これらのデータは。 他の３つの製剤のＬＤ、。が、２０■／ｋｇより小さく、少なくとも１：４の配 合の製剤は１５〜２０■／ｋｇの間であることを示している。 また１本発明の組成物は、硫酸コレステロールが、広く動物内に見い出される天 然のコレステロール成分であるという利点を有している。このコレステロール化 合物については。 全く毒性は知られておらず１体内でコレステロールスルファターゼによって代謝 される。 最後に、毒性は１粒径が大きくなるにつれて増大すると予想されるので、注射す ることが可能な安定で比較的小さな粒子が毒性の減少に寄与する。 （以下余白） Ｂ、効力 このＡＭＢ／硫酸コレステロール組成物の他の重要な特徴は。 全身性真菌感染症を治療する際の著しく増強された薬剤効力である。この発明を 支持する目的で行った効力の試験が実施例９に詳述されている。この実施例では 、静脈注射によって。 Ｃ，ａｌｂｉｃａｎｓに感染させた動物を、０．３〜０．９■／ｋｇ　（体重） の投与量のＦｕｎｇｉｚｏｎｅ、または０．３〜２．０　ｍｇ／ｋｇ　（体重） の投与量のＡＩＩＢ／硫酸コレステロール（配合１：４）で治療した。 薬剤の効力を、薬剤を投与してから２５日後の生存率で測定した０表１１に示す データにより、ＡＭＢ／［酸コレステロール組成物を用いると、０．３〜０．９ ■／ｋｇの各投与レベルにおいて。 有意に高い生存率が得られることが示される。２．０■／ｋｇの投与では１本発 明の製剤で治療された動物がすべて生存した。 第２の効力試験では（実施例９に記載されている）、Ｃ。 ａｌｂｉｃａｎｓを感染させたマウスに０．０３１．０．１２５および０．５■ ／眩の投与レベルで、各動物に、感染させた日に２回、およびその翌日に２回投 与した場合の生存率（％）を比較した。そのデータを第１Ａ図〜第１Ｃ図にグラ フとして示す。丸印は対照、四角印は遊離のＡＭＢ、三角印はＡ？！Ｂ／ＣＨＳ Ｏ，（１：　４　）　。 そしてダイヤモンド印はＡＭＢ／ＣＨ３０ａ（１：　１　）を示し、各々上記の ３種の異なるレベルで投与した。２種の低レベルでの投与（第１Ｂ図および第１ Ｃ図）においては、２種のＡＭＢ／ＣＨ３Ｏ４製剤は、遊離のＡ？ＩＢと同等の 治療効力を示した。最高ＣＨ３０，製剤は、遊離のＡ？ＩＢまたは１：４配合の ＩＭＢ／硫酸コレステロール製剤が６０〜８０％の生存率であるのに比べて、１ ００％の生存率を示した。 本発明は、脱水されたＡ？ｌＢ組成物を提供する。この脱水されたＡＭＢ組成物 は、長期間貯蔵後に再水和した際に、約１ミクロン未満の選択された粒径範囲を 有するＡＭＢ粒子の懸濁液を形成する０粒子は、無水で不活性な環境下に貯蔵で きるので、毒性；および気体／液体界面での酸化反応および機械的損傷に関連す る脂質および薬物の分解の問題が最少となる。 非経口用途２例えば、静脈投与用には、この組成物は、上記方法で製造し得るよ うな約０．１〜０．４　ミクロンの粒径のＡＭＢリポソームで製造するのが好ま しい、このＡ？ｌＢ／脂質組成物は、典型的には約５０〜２００■／ｄの選択さ れたＡＩＩＢｆｉ度に水和され、そして、１〜５■ＡＭＢ／ｋｇ　（体重）の濃 度で投与される。投与は、ＩＶＢ／ＣＨＳＯ，粒子が実質的に粒径を増大する前 に行われる。 筋肉内注射する場合には、薬剤を注射部位から徐々に放出するために９組成物は 、より高濃度に再水和するのが好ましく、このようにして組成物を注射部位に、 好都合に局在させることができる。 上記のことから９本発明のいかに種々の目的および特徴が達成されるかがわかる 。この発明は、従来の遊離のＡ？ｌＢもしくはＡＭＢ脂質製剤に比べて毒性が実 質的に低く、そして、遊離のＡＭＢを含む報告された従来のＡＭＢ製剤と少なく とも同等の薬物の効力を有するＡＭＢ組成物を提供する。この薬物は。 増強された治療指数、特に減少した毒性に関する上記指数によって、この薬剤の 用途が一層拡大される。例えば、免疫無防備状態の患者の予防治療、および全身 性活性真菌感染症の治療におけるより大きな治療が効果が付与される。 この組成物は、容易に調製され、そして、硫酸コレステロール成分は、精製され た状態で比較的安価であり、非経口投与の場合は、そのままで利用される。この 製剤は、乾燥状態で容易に貯蔵され得、再水和すると９選択された小粒径を有す る粒子懸濁液が得られる。 次の実施例は、ＡＭＢ／硫酸コレステロール組成物の製法。 特徴および用途を例示している。これらの実施例は本発明の範囲を限定するもの ではない。 見料 Ｃ）ＩｓＯ，（コレステロール３−サルフェート、ナトリウム塩）は、　Ｓｉｇ ＩＩｌａ　Ｃｈｅｒａｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から ：ＡｎＢＣアンホテリシンＢ、１型）は、　Ｅ、Ｒ，５ｑｕｉｂｂ　＆　５ｏｎ ｓ＋　Ｉｎｃ、ら寄贈された（Ｂａｔｃｈ　＆２Ｏ−９１４−５９７８−００１ ）。他のすべての材料は。 、試薬グレードのものであるがまたは市販のものよりも優れたものである。 １隻±１ Ａ？ＩＢ／ＣＨＳＯ，虻　のｈ制 乾燥粉末形態のＡ？ｌＢおよびＣＨ３０，を計量し、下記表１に示す４種のＡ！ ’ＩＢ　、硫酸コレステロールのモル比のうちの１つを調製するように混合した 。添加したＡ？ｌＢおよび硫酸コレステロールの量は１粒子懸濁物中に、約５０ μｌｌ１ｏｌｅ／−のＡＭＢおよび硫酸コレステロールの最終濃度を形成するの に充分な量である。 乾燥メタノールをＡ？ＩＢ／硫酸コレステロール粉末に加えて。 ＡＭＢの最終濃度を０．２〜０．６■／ｄとし、得られた懸濁物を。 粉末全部が溶解するまで撹拌した。この溶液にラクトースを加えて、最終水性生 成物中に１０％（ｗ／ｖ）のラクトースを含有する溶液を調製した。得られた溶 液を減圧乾燥し、親油性ＡＭＢ／ｇ酸コレステロールフィルムで被覆された乾燥 ラクトース粒子を得た。 １０１１Ｍトリス−塩酸、　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する緩衝懸濁液ｐＨ７ ，４゜６７ａ＋Ｏｓｍ、を上記乾燥混合物に、ＡｌＩＢと硫酸コレステロールと の合計の最終濃度が５０μｍｏｌｅ／ｄになるのに充分な量で添加した。この懸 濁物を、ウルトラソニック　リキッド　プロセンサー（Ｌｌｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｓ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）（Ｈｅａｔ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ 。 Ｉｎｃ、、　Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ＋　ＮＹ　）モデルＷ−８００，プローブ 　ソニケーターで懸濁液が光学的に透明になるまで超音波処理した。（この処理 は、懸濁液を湯浴で４５°Ｃに加温すれば容易に行なわれる）、超音波処理は窒 素ガス雰囲気下で行なった。 超音波処理したＡｌＩＢ／ＣＨＳＯ，粒子を、　６０００〜８０００（７）分子 量カットオフの透析チューブを用いて透析して痕跡量の取り込まれていないＡＭ Ｂを除去した。得られた物質を、ｌＯｍＭ）リス−塩酸、　Ｏ，ｂｎＭ　ＥＤＴ Ａ、　１０％（ｗ／ｖ）ラクトース含有の緩衝液（ｐＨ７，４）　（３００１１ １０ＳＲ＋）に対して透析した。透明な懸濁液を、ドライアイス／イソプロパツ ール混合物中で急速に凍結し、−夜一２５°Ｃの貯蔵温度で凍結乾燥し、さらに ２時間２５°Ｃで乾燥した（１５ＳＲＣ−Ｘ　ＬｙｏｐｈｉｌｔｚｅｒＨＶｉｒ ｔｉｓ、　Ｇａｒｄｉｎｅｒ＋　ＮＹ）　＊凍結乾燥した試料に、同容量の水を 加えてゆるやかに撹拌することによって再形成した。次の表１は１種々の調製工 程における４種の組成物のＡＭＢの濃度を示す。 表Ｉ　Ａ？ＩＢの濃度（■／ｄ） １　：　１　２３．１０　２０．６６　２４．２０　２１．５２１　：　２　１ ５．４０　１０．８０　１６．４６　１５．１９１　：　３　１１．５５　１１ ．０２　１２．１９　１１．６０１　：　４　９．２４　９．４９　１０．１２ 　８．７９斐施班ｌ −に・−る　の≦ Ｎ１ｃｏａ＋ｐモデル２００サイザー（Ｎｉｃｏｍｐ　Ｉｎ５ｔｒｕｔｒｒｅｎ ｔｓ　Ｉｎｃ、。 Ｇｏｌｅｔａ、　ＣＡ）を用い、動的レーザー光分散法（ｄｙｎａｍｉｃ　ｌａ ｓｅｒ−１ｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によって測定した。この測定用で は、　１０ｍＭ）リス／塩酸、　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０！（Ｗ／Ｖ）ラ クトースを含有する緩衝液（ｐＨ７，４）を用い、典型的には、試料を０．３　 ｐ　ｍｏｌｅ／ｄに希釈した。実施例１で得た４種の組成物の平均粒径と標準偏 差（Ｓ、Ｄ、）とを下記表２に示す。表かられかるように、４種の組成物はすべ て、凍結乾燥前は約１３０〜１８０　ｒａ＋の平均粒径を有し、そして凍結乾燥 後は約２１０〜２８０　ｎｍの平均粒径を有する。 表２ 粒径（平均値±Ｓ、Ｄ、（ｎ園）） １：１１３８±５４　２６８±１３７ １：２　１４Ｂ±６６　２１１±１０５１：３　１７２±８９　２６５±１４７ １：４　１３８±６１　２７４±１５１災五貫主 ｒ′を　したときのｔ　に・する≦ 実施例１による４種の試料は、　ＡＭＢと硫酸コレステロールとの合計の濃度が 約５０μｍｏｌｅ／　ｘｒｆｌであり、これらを８日間まで４°Ｃにて保持した 。０，２．６および８日目に、各？Ａ濁液の一部を採取し、約０．３μｍｏｌｅ ／　ｗｌに希釈し、実施例２と同様にして粒径分布を調べた。その結果を次の表 ２に示す、ｌ：１配合の組成物は１粒径変化については安定であるが、硫酸コレ ステロールのモル比が高い組成物は、貯蔵によって安定性が次第に低下する。 （以下余白） 表３ ０１３８立５４　１４８−！：６６　１７２±８９　１３８±６１２１９３±９ ８　３３６±１９４　５２７±２９９　３３４±１９２６１６１±８２　４６２ ±２６５６７９±３７７　８２３±４８１８１７９出９５　５１２±２９６９６ ８±５５１　１０３４±５８７実施例１で行ったのと同様に、凍結乾燥し、蒸留 水で再生した後の同一組成物について同様に安定性試験を行った。結果を表４に 示す、この結果から次のことがわかる：　（ａ）　４種の組成物の各々について 、８日間にわたる試験により、比較的小さなサイズの粒子が増加していること、 および（ｂ）粒径変化に対する。硫酸コレステロールのモル量の影響はほとんど ない。 表４ ０２６８±１３７２１１±１０５２６５±１４７　２７９±１５１２３０４±１ ５３３３１±１７７５４１±２９３　５５４±３０３６３４０±１７１　４１８ ″：２２４　５１５±２８３　４７８出２４２８３７１±１８８４３６出２２８ ５７０±３１４　４８７±２５８亥】ｌ糺り 一　に・　る　Ｆ！ａ　および　將のヅ実施例１で得られた４種の試料を、０． ９％（Ｗ／Ｖ）の生理食塩水で希釈して約０．３μ＋ｎｏｌｅ／＋ｍｌ　とし、 実施例２と同様Ｇこしてそれぞれの粒径を測定した。この結果を下記表５の量上 夕１ｊに示す。各製剤について、生理食塩水により、平均粒径力（１０倍を越え て増大した。１：１配合組成物の粒径の成長番よ、硫酸コレステロール量が多い その他の３種の組成物よりも有意に少なかった。 ４種の試料をまた。ヒト血漿で１：１（Ｖハ）に希釈し、続いて（ヒト血漿と接 触してから数分以内に）　、　１０ｍＭ　）　’Ｊス／塩酸、　０．Ｉ　ＩＩＩ Ｍ　ＥＤＴＡ、１０％ラクトース（Ｗ／Ｖ）を含有する緩衝液後に行った。デー タによって２次のことが示された。つまり。 １：１の配合製剤が、血漿と接触した際に粒径変化につし）では最も鈍感であり 、また希釈媒質中で２０分間保持することに゛より、すべての製剤において粒径 がいくらか小さくなった。 表５ 生理食塩水＝よる希釈　３３２８立１９９０１３２０９：８２８８　６７８９″ ：４２７６１１０７２±６６１８血’５トノ混合、　ｐ、　７２８”＝　３３４ 　１２００：　６２８　４０１７立１９５１　１９４２＋１０４３濁緩衝液によ る希釈 ２０分経過後　３５８−＝　１６９　８２３＝　４５７　１７４５±１００７　 １６６７と９４２実施例１と同様に、凍結乾燥して蒸留水で再水和した後のＡ？ ＩＢ　／硫酸コレステロール粒子について、０．９％生理食塩水または血漿を混 合した後、同様の粒径測定を行った。結果を下記の表６に示す、凍結乾燥前の粒 子について観察されたのと同様の粒径変化（表５のデータ参照）が観察された。 表６ 生理食塩水による希釈　１７３８立１００７　８４０５±５５４９　１３１５８ ±８６２５　９８１６立６２６５血漿との混合、懸濁　９５５±４４６　１０３ ０立５５０　１７６６±９７６　２４６７″：１２３３１１医ｌ −のカプセル　。 ＡＭＢ　／硫酸コレステロール粒子の、放射能標識マーカーを包みこむ性能を試 験した。乾燥ＡＭＢ　／硫酸コレステロール混合物を懸濁させるのに使用するト リス緩衝媒体が１μＣｉのｌ　４（−スクロースを含有すること以外、実施例１ と同様にしてＣｌｌ５Ｏ，／Ａ？ＩＢが４：１のモル此の配合粒子を調製した。 この懸濁液を。 １０５Ｍ　トリス／塩酸、　０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）　ラク トース含有の緩衝液（ｐＨ７，４）により、平衡化させたセファデックスＧ５０ ゲル排除カラムにかけ９次いで同じ緩衝液で溶出した。粒子はボイドボリューム で溶出し、それは２Ｂ０　ｎｍの紫外線吸収によってモニターされた。試料を収 集し９通常のシンチレーション計数法で、放射能を測定した。ＡＭＢの９５％が 粒子ピーク内にあったが、この領域に、１４Ｃ−スクロースの検知し得るピーク は見い出されなかった。 （以下余白） 亥ｌＩΔ団 授１１１牡り乞に狡 ＡＭＢと硫酸コレステロールとのモル比の異なる４種のＣＨ３０ａ／Ａ？ＩＢ製 剤を、実施例１と同様にして調製した（１０％のラクトースを含有する通常の？ Ａ濁媒体中に調製）。これらの試料を。 下記表７では透析後（Ｐ、Ｄ、　）懸濁液と呼んでいる。各試料の一部（１０％ ラクトース含有）を凍結乾燥し、蒸留水で再生して得られた試料を下記の表では 凍結乾燥および再生試料（Ｌ、Ｒ，）と呼んでいる。 Ｐ、Ｄ、およびり、Ｒ，の各試料を蒸留水で希釈し、　Ｑ、３　μａ＋ｏｌｅ１ ０＋１の濃度とし、低張の媒体で希釈直後、および希釈してから２０分後の粒□ 子の粒径分布を、実施例２と同様にして測定した。 結果を下記の表７に示す。表から明らかなように、２０分間のインキュベーショ ンの時間にわたり、明確な膨潤現象は見られなかった。このことは、試験された 何れの試料についても。 平均粒径が増加することによって裏付けられる。 （以下余白） 表７ 亥１１］− 叶ハ；゛の　・（ＬＤｏ） 異系交配した雄のスイス／ウェブスター系マウスをＳｉｍｏｎｓｅｎＪａｂｓ、 　Ｉｎｃ、から入手した。この動物の処理日の体重は約１５〜４５ｇで４〜８週 令であった。動物は、試験前の少な（とも３日間は隔離し、隔離期間中健康であ ったマウスだけを使用した。動物には、餌と水とを不断給餌した。 第１の試験では、動物の群を、滅菌生理食塩水に懸濁させたフンギシン（Ｆｕｎ ｇｉｚｏｎｅ；　５ｑｕｉｂｂ　）または実施例１と同様にして調製した１：４ の配合割合のＡＭＢ　／硫酸コレステロール組成物で処理した。各々の場合にお いて、　Ａ？ＩＢ　濃度は９選択された投与量のＡｌＩＢ　（表８に示す）が最 終容量０．２ｄで投与できるように調整された。４〜８匹の動物を各投与量の群 に用いた。試験物質は２尾の側方の動脈を介して、−回の静脈注射で投与した。 各投与量は約１．５分で投与した。 毒性の徴候があるか否か、および死亡したかについて、動物を処理した日は少な くとも３回（処理してから１．２および４時間後に）観察した。５日間のうちの 残りの観察期間では、毎日朝と午後とに動物を調べた。試験結果を表８に示す。 この表では、５日目の生存数：処理された動物の合計数、が示されている。−フ ンキシンのＬＤ、。値は９通常の方法で算出され、その値は３．２■／ｋｇであ る。Ａ？ｌＢ　／硫酸コレステロール組成物のＬＤ、、値は１５〜２０■／ｋｇ である。 表８ ＣＨＳＯ４／ＡＭＢ　（４：１） 第２の毒性試験では、実施例１で得られた４種のＡＭＢ　／硫酸コレステロール 製剤のうちのひとつの２抛ｇ／ｋｇの投与量でマウスを処理した。薬物の投与法 と動物のモニター法は上記と同様である。結果を下記の表９に示す、この表では 、１：１の配合割合の製剤は、２０■／ｋｇより高いＬＤ、。値を有することが 示される。 表９ 第３の毒性試験は、　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗ ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ。 ＭＡ）から入手した雄のＣｒＬ　：　ＣＤ−１（ＩＣＲ）　ＢＲマウス（１Ｂ　 〜２０ｇ）を用いて、独立した実験室で行った。ＡＭＢ　：硫酸コレステロール のモル比が１：４または１：１のＡＭＢ／ＣＨ３０，製剤を上記と同様にして調 製した。フンキシンＴＭと遊離のＡＭＢとを１発熱因子を含有しない水で可溶化 し、室温で１０分間超音波処理をした。全薬物製剤を、適当な希釈用緩衝液で所 望の濃度に希釈した。 感染していないマウスに、　Ａ？ｌＢ組成物のひとつの単一投与量を、ゆっくり と一度に静脈注射した。　ＡＭＢ／ＣＨＳＯ，硫酸コレステロール製剤の投与量 は、　３０．１５．７．５　、３．７５．１．８８および０．９４■Ａ？ＩＢ／ ｋｇ体重であった。またフンキシン丁”および遊離（７）ＩＭＢ（７）投与量は 、８．４．２，１，０．５および０．２５ｍｇＡｈＢ／ｋｇ体重であった。死亡 率を、処理に続く５日間の間記録が、各製剤の５０％致死量（ＬＤｓ。）を標準 的な方法で計算した。その結果を表１０に示す０表かられかるように、ｌ：１お よび１：４の配合（７）ＡＭＢ／ＣＨ３０，製剤ノＬＤｓａは、遊離（７）　Ａ ＭＢもしくはフンキシン丁にのＬＤ、。よりも数倍高い値である。１：１の割合 で配合ＬＪ：Ａ？ＩＢ／ＣＨ３０，製剤ハ、　３０ｍｇ／ｋｇ製剤比ルＬＤ、。 値を示す。 表１０ 遊離のＡ？ｌＢ　４．９（３，７，６，５）フンキシン　４．３（３，１，６， ０）ＡＭＢ／ＣＨＳＯａ（４：１）　１６．１（１０，９，２３，８）ＡＭＢ／ Ｃ）ＩｓＯ，（１：　１）　＞３０より最近、１：４および１：１の割合で配合 されたＡＭＢ／ＣＨＳＯ。 製剤の毒性が、他の研究所で試験された。そこでは、　４０■Ａ、？Ｉ　Ｂ　／ 　ｋｇ体重までを一度に注射して試験した。この試験により。 １：１配合（７）ＡＭＢ／ＣＨ３０，製剤ＯＬＤ、、値が４０ｗ：　／　ｋｇよ り大きいことがわかった。 １旌■主 ＡＭＢ　硫　コレステロール畔　のｔ ２０〜２５ｇのＣｒｌ：ＣＦＷ（ＳＷ）ＢＲマウスを、　Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉ ｖｅｒ　ＢｒｅｅｄｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、餌と水を不断 給餌した。カンジダアルヒカンス（ｊ＝　紅ｕ並且）菌株３０を、５ＤＡ（サボ ロードーデキトロースー寒天）上にて、３５℃で１８時間増殖させ、菌体を集め 、滅菌してパイロジエンを含まない生理食塩水で希釈し、　０．２　ｄ容量の単 位を形成する約７Ｘ１０”個のコロニー混合物０．２　ｄずつを注射した。上記 真菌を感染させて２日後に、動物にフンキシンもしくは実施例１と同様にして調 製したＡ？ＩＢ　／硫酸コレステロール（１：４）を２段階的に投与量を変えて 注射した。Ａ？ＩＢ製剤は、各動物が尾の静脈を通じて静脈注射される全容量が 、ａｌｌ！となるようにその濃度が調整された。投与されたＡ？ＩＢの量は、薬 物（ｍｇ）　／動物の体重（ｋｇ）によって表され９表１０の左側に示しである 。動物は薬物投与後２５日間観察した。試験動物の総数に対する２５日目の生存 数を、２種のＡｌＩＢ製剤、および対照の緩衝液について表１１に示す。 （以下余白） 表１１ 薬物投与２５日目の生存数／注射した動物の総数役亙ｌ　遊３１１■　健逓〃Ｔ ｌ→ｄ丸皿０．０ｍｇ／ｋｇ　Ｏ／１１ ０．３０ｇ／ｋｇ　２／１０　５／１０　−０、６＋ｇ／ｋｇ　１／１０　９／ １０　−０、９ｍｇ／ｋｇ　３／１０　９／１０　−２．０＋ｅｇ／ｋｇ　１０ ／１０　− 第２の研究では、１８〜２０ｇの雄のＣｒｌ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）ＢＲマウスに 、　０．１　ｄのＣ，ａｌｂｉｃａｎｓ（１０’個の細胞／動物）を感染させ。 １グループ当り１０匹の動物の治療グループに分けた。遊離のＡＭＢと、１：１ および１：４に配合したＡ？ｌＢ／ＣＨ３０，製剤トラ。 実施例７および実施例１と同様にして調製した。感染させたマウスに、各薬物製 剤の投与を、感染させた日に２回とさらに次の日に２回の合計４回、静脈ルート で行なった。各試験グループに対する単一投与ＡＭＢレベルは、　０．５　、０ ．１２５および０．０３１■　Ａ？ＩＢ／ｋｇ体重／回であった。対照のグルー プは希釈緩衝液だけを投与した。感染させてから３０日間、マウスが死亡するか 否かを観察した。５０％保護投与量（ＰＤｓ。）を、生存数データから通常の方 法により算出した。 表１２に、２種のＡＷＢ／ＣＨＳＯ，製剤と遊離のＡＭＢとについて得たＰＤ、 。のデータをまとめて示す、　ＡＭＢ／ＣＨ３Ｏ４製剤は両者とも。 真菌感染症の治療に、遊離ＡＭＢと同等に有効であった。 表１２ 遊離のＡＭＢ　０．２５（０，１１，０，５５）Ａ門Ｂ／ＣＨＳＯ，（４：１） 　０．２５（０，１４，０，４５）ＡＭＢ／ＣＨＳＯａ（１：１）　０．２２（ ０，１６，０，２９）上記の試験から作成した生存曲線を、上記で考察したよう に、第１Ａ〜ＩＣ図に示す。これらの曲線により２次のことが示される。つまり 、特に、１：１に配合したＡ？ＩＢ／ＣＨ３０，製剤により、遊ｇｌＡ？ｌＨに より達成される治療効力よりも高い治本発明は、特定の実施例、用途および調製 法について記載され説明されているが、この発明の範囲から逸脱することなく種 々の変更および改変が行なわれ得ることは明らかである。 ０．１２５　ｒｒ＋ｃ３／ｋＢ る粂稜のθ孜 薄粂後の　四挾 持表平１−５０２２７０　（１１）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．アンホテリシンＢの粒子を含有するアンホテリシンＢの組成物であって，該 アンホテリシンＢの粒子は，アンホテリシンＢと硫酸コレステロールとのモル比 が約１：１から１：４の間の割合で硫酸コレステロールを含む。
2. ２．前記粒子が，水性媒体中に懸濁しており，主として約１００〜４００ｎｍの 間の範囲の粒径を有する，請求の範囲第１項に記載の組成物。
3. ３．次の工程により製造される請求の範囲第２項に記載の組成物： （ａ）アンホテリシンＢおよび硫酸コレステロールの１：１から１：４の間のモ ル比の水性懸濁液を分散させて，光学的に透明にする工程， （ｂ）該懸濁液を，該懸濁液中の粒子径が実質的に増大する前に，凍結保護物質 の存在下で凍結乾燥する工程，および（ｃ）凍結乾燥された物質を水性媒体で再 生する工程。
4. ４．アンホテリシンＢと硫酸コレステロールとのモル比が約１：１である請求の 範囲第１項に記載の組成物。
5. ５．真菌感染症を治療するためにアンホテリシンＢを投与する方法であって，次 の工程を包含する方法：アンホテリシンＢと硫酸コレステロールとを約１：１か ら１：４の間のモル比で，水性粒子懸濁液として製剤化する工程，および 該懸濁液を，治療するのに有効な量で投与する工程。
6. ６．前記アンホテリシンＢ／硫酸コレステロールの懸濁粒子が，主として約１０ ０〜４００ｎｍの間の粒径を有する請求の範囲第５項に記載の方法。
7. ７．前記製剤化法が次の工程を包含する請求の範囲第６項に記載の方法： （ａ）アンホテリシンＢと硫酸コレステロールとのモル比が１：１から１：４の 間である，アンホテリシンＢと硫酸コレステロールとの水性懸濁液を分散させて ，光学的に透明にする工程， （ｂ）該懸濁液を，該懸濁液中の粒子径が実質的に増大する前に，凍結保護物質 の存在下で凍結乾燥する工程，および（Ｃ）凍結乾燥された物質を水性媒体で再 生する工程。
8. ８．アンホテリシンＢと硫酸コレステロールとのモル比が約１：１である請求の 範囲第５項に記載の方法。
9. ９．ＬＤ５０が約１５ｍｇ／ｋｇより大きく，水性媒体中で約１００〜４００ｎ ｍの粒径に再生することのできる形態のアンホテリシンＢを調製する方法であっ て，次の工程を包含する：（ａ）アンホテリシンＢおよび硫酸コレステロールの １：１から１：４の間のモル比の水性懸濁液を分散させて，光学的に透明にする 工程，および （ｂ）該懸濁液を，該懸濁液中の粒子径が実質的に増大する前に，凍結保護物質 の存在下で凍結乾燥する工程。
10. １０．前記懸濁液中のアンホテリシンＢとコレステロールとのモル比が，約１： １である請求の範囲第１項に記載の方法。