JPH0610134B2 - アンホテリシンｂ／硫酸コレステロール組成物およびその製造方法 - Google Patents
アンホテリシンｂ／硫酸コレステロール組成物およびその製造方法Info
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- JPH0610134B2 JPH0610134B2 JP63502859A JP50285988A JPH0610134B2 JP H0610134 B2 JPH0610134 B2 JP H0610134B2 JP 63502859 A JP63502859 A JP 63502859A JP 50285988 A JP50285988 A JP 50285988A JP H0610134 B2 JPH0610134 B2 JP H0610134B2
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Description
【発明の詳細な説明】 １．発明の分野 本発明は，真菌感染症治療用のアンホテリシンＢ組成物
に関し，特に，高いLD50（50％致死量）と治療効力とを
有するアンホテリシンＢ組成物に関する。
に関し，特に，高いLD50（50％致死量）と治療効力とを
有するアンホテリシンＢ組成物に関する。
２．参照文献 1. Holz. R.W., in F.E. Hahn編, Antibiotics, vol.
2,Springer-Verlag, N.Y.(1979)。 2. Trembley, C.ら, Antimicrob Agents and Chemoth,
26(2):170(1984)。 3. Mehta, R.T. ら, Infection and Immunity,47(2):42
9(1985)。 4. Lopez-Berestein,G.ら, Cancer Drug Delivery, 1
(1):37(1983)。 5. New,R.R.C. ら, J Antimicrob Chemoth,8:371(198
1)。 6. Graybill, J.R.ら,J Infect Dis,145:5(1982)。 7. Lopez-Berestein, G., J Infect Dis, 150(2):278(1
984)。 8. Trembley, C.ら, Invest Opthalmol, 26:711(1985)。 9. Lopez-Berestein, G. ら, J Infect Dis, 151(4):70
4(1985)。 10. Juliano,R. ら, Biology of the Cell,4(39) (198
3)。 11. Mehta, R. ら,Biochem Biophys Acta, 770:230(198
4)。 12. Hopfer,R.L.ら, Antimicrob Agents and Chemoth,2
5 (3):387(1984)。 13. Brockerhoff, H. ら, Biochimica biphysica Acta
691:227(1982)。 14. Crowe,L. M.ら, Biochimica Biophysica Acta 769:
141(1984)。 15. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro,
A.R.編, Mack Publishing Company(1985).3。 発明の背景 アンホテリシンＢ(AMB)は，有効な抗真菌剤であり，現
在，最も重い全身性真菌感染症用に選択される薬剤であ
る（参照文献１）。この薬剤は，ヒト用に，AMBおよび
デオキシコール酸塩の凍結乾燥粉末〔「フンギゾン(Fun
gizone)」〕として，現在入手することができる。この
薬剤は，真菌膜の主要なステロール成分であるエルゴス
テロールと強く結合し，真菌膜に孔を形成し，その孔か
ら溶質分子を漏洩させる。また，この薬剤は，ほとんど
の哺乳類の細胞膜中に存在するステロールであるコレス
テロールに対しても強い結合親和性を有するので，宿主
細胞を破壊させ得る。
2,Springer-Verlag, N.Y.(1979)。 2. Trembley, C.ら, Antimicrob Agents and Chemoth,
26(2):170(1984)。 3. Mehta, R.T. ら, Infection and Immunity,47(2):42
9(1985)。 4. Lopez-Berestein,G.ら, Cancer Drug Delivery, 1
(1):37(1983)。 5. New,R.R.C. ら, J Antimicrob Chemoth,8:371(198
1)。 6. Graybill, J.R.ら,J Infect Dis,145:5(1982)。 7. Lopez-Berestein, G., J Infect Dis, 150(2):278(1
984)。 8. Trembley, C.ら, Invest Opthalmol, 26:711(1985)。 9. Lopez-Berestein, G. ら, J Infect Dis, 151(4):70
4(1985)。 10. Juliano,R. ら, Biology of the Cell,4(39) (198
3)。 11. Mehta, R. ら,Biochem Biophys Acta, 770:230(198
4)。 12. Hopfer,R.L.ら, Antimicrob Agents and Chemoth,2
5 (3):387(1984)。 13. Brockerhoff, H. ら, Biochimica biphysica Acta
691:227(1982)。 14. Crowe,L. M.ら, Biochimica Biophysica Acta 769:
141(1984)。 15. Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro,
A.R.編, Mack Publishing Company(1985).3。 発明の背景 アンホテリシンＢ(AMB)は，有効な抗真菌剤であり，現
在，最も重い全身性真菌感染症用に選択される薬剤であ
る（参照文献１）。この薬剤は，ヒト用に，AMBおよび
デオキシコール酸塩の凍結乾燥粉末〔「フンギゾン(Fun
gizone)」〕として，現在入手することができる。この
薬剤は，真菌膜の主要なステロール成分であるエルゴス
テロールと強く結合し，真菌膜に孔を形成し，その孔か
ら溶質分子を漏洩させる。また，この薬剤は，ほとんど
の哺乳類の細胞膜中に存在するステロールであるコレス
テロールに対しても強い結合親和性を有するので，宿主
細胞を破壊させ得る。
AMBを、遊離の形態で（すなわち，再形成されたAMB／デ
オキシコール酸塩複合体として）投与すると，赤血球細
胞の破壊による副作用が最初に認められ，続いて一層強
い心臓毒性，CNSおよび骨髄への副作用が起こる。身体
がこの薬剤を除去しようとすることが原因の腎臓毒性も
存在する。
オキシコール酸塩複合体として）投与すると，赤血球細
胞の破壊による副作用が最初に認められ，続いて一層強
い心臓毒性，CNSおよび骨髄への副作用が起こる。身体
がこの薬剤を除去しようとすることが原因の腎臓毒性も
存在する。
AMBの毒性が，リポソームに結合した形のこの薬剤を投
与することによって減少させ得ることは，いくつもの研
究により示されている（文献２〜12）。この薬剤をリポ
ソームの形で投与すると，一般に，この薬剤のLD50は，
遊離の薬剤の約２〜３mg/kg体重から約８〜15mg／kgま
で増大する。しかし，リポソーム形製剤の制限は，アン
ホテリシンＢ／リポソーム粒子を水性媒体中で貯蔵した
場合に、明らかに粒径が不安定なことである。約200〜3
00ｎｍの初期粒径分布を有するAMB含有リポソームは，
一般に，水性媒体中での長期間にわたる貯蔵中に，数ミ
クロンまでの大きなリポソーム構造を自然に形成す
る。、約１〜２ミクロンより大きい粒径を有するリポソ
ームは，非経口的に，すなわち血液中に投与すると，一
般に，小さなリポソームより毒性が大きい。血流中の大
きなリポソームの毒性は，肺胞毛細血管のリポソームに
よる閉鎖に，一部関連がある。また，比較的大きなリポ
ソームは肝臓に対してより大きな毒性があるという指摘
があり，これは恐らく網内細胞中へのリポソームの蓄積
が原因であろう。本願の譲受人が共有する米国特許出願
第781,395号（1985年９月27日出願）「アンホテリシン
Ｂリポソーム組成物」には，上記の粒径成長の問題を大
部分克服したAMBリポソームを調製し，貯蔵する新規な
方法が開示されている。
与することによって減少させ得ることは，いくつもの研
究により示されている（文献２〜12）。この薬剤をリポ
ソームの形で投与すると，一般に，この薬剤のLD50は，
遊離の薬剤の約２〜３mg/kg体重から約８〜15mg／kgま
で増大する。しかし，リポソーム形製剤の制限は，アン
ホテリシンＢ／リポソーム粒子を水性媒体中で貯蔵した
場合に、明らかに粒径が不安定なことである。約200〜3
00ｎｍの初期粒径分布を有するAMB含有リポソームは，
一般に，水性媒体中での長期間にわたる貯蔵中に，数ミ
クロンまでの大きなリポソーム構造を自然に形成す
る。、約１〜２ミクロンより大きい粒径を有するリポソ
ームは，非経口的に，すなわち血液中に投与すると，一
般に，小さなリポソームより毒性が大きい。血流中の大
きなリポソームの毒性は，肺胞毛細血管のリポソームに
よる閉鎖に，一部関連がある。また，比較的大きなリポ
ソームは肝臓に対してより大きな毒性があるという指摘
があり，これは恐らく網内細胞中へのリポソームの蓄積
が原因であろう。本願の譲受人が共有する米国特許出願
第781,395号（1985年９月27日出願）「アンホテリシン
Ｂリポソーム組成物」には，上記の粒径成長の問題を大
部分克服したAMBリポソームを調製し，貯蔵する新規な
方法が開示されている。
AMBを，コレステロールのポリエチレン誘導体（PEG−コ
レステロール）と複合させることによって形成したアン
ホテリシンＢ組成物も提案されている（国際特許出願US
84/00855）。この製剤は，AMBのLD50を，フンギゾンの
3.8mg/kgから，マウスでの10.0mg/kgまで増加させ，ま
た細胞培養物における細胞毒性も低下した。PEG−コレ
ステロールと複合しているAMBは，どのようにインビボ
で真菌感染症に対する治療効果を与えるのか，あるには
この複合体が粒径安定形で貯蔵し得るかどうかは知られ
ていない。
レステロール）と複合させることによって形成したアン
ホテリシンＢ組成物も提案されている（国際特許出願US
84/00855）。この製剤は，AMBのLD50を，フンギゾンの
3.8mg/kgから，マウスでの10.0mg/kgまで増加させ，ま
た細胞培養物における細胞毒性も低下した。PEG−コレ
ステロールと複合しているAMBは，どのようにインビボ
で真菌感染症に対する治療効果を与えるのか，あるには
この複合体が粒径安定形で貯蔵し得るかどうかは知られ
ていない。
４．発明の要旨 本発明の目的は，従来技術で報告されたAMB製剤より充
分に高いLD50値を有し，かつインビボで真菌感染症を治
療するのに著しく有効なAMB組成物を提供することにあ
る。
分に高いLD50値を有し，かつインビボで真菌感染症を治
療するのに著しく有効なAMB組成物を提供することにあ
る。
本発明の他の目的は，有意な粒径変化なしで数日間，懸
濁形態で貯蔵可能であり，かつ凍結乾燥調製物として長
期間貯蔵可能なAMB製剤を提供することにある。
濁形態で貯蔵可能であり，かつ凍結乾燥調製物として長
期間貯蔵可能なAMB製剤を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は，真菌感染症をAMBで治療す
るための改良法を提供することにある。
るための改良法を提供することにある。
本発明には，AMBおよび硫酸コレステロールの粒子を，A
MB：硫酸コレステロールのモル比が約１：１〜１：４で
含有するAMB組成物が含まれる。該組成物を水性媒体
中，懸濁形態で調製する際，これら粒子は約100〜400ｎ
ｍの間の粒径が好ましい。浸透膨潤および溶質捕捉の研
究によると，これらの粒子は非リポソーム的であること
を示している。好ましい組成物は，AMBおよび硫酸コレ
ステロールを約１：１のモル比で含有しているが，数日
間にわたって溶液形態で貯蔵しても，粒径がほとんど変
化しないことを示している。
MB：硫酸コレステロールのモル比が約１：１〜１：４で
含有するAMB組成物が含まれる。該組成物を水性媒体
中，懸濁形態で調製する際，これら粒子は約100〜400ｎ
ｍの間の粒径が好ましい。浸透膨潤および溶質捕捉の研
究によると，これらの粒子は非リポソーム的であること
を示している。好ましい組成物は，AMBおよび硫酸コレ
ステロールを約１：１のモル比で含有しているが，数日
間にわたって溶液形態で貯蔵しても，粒径がほとんど変
化しないことを示している。
本発明のある局面によれば，この組成物は，モル比が
１：１〜１：４の間のアンホテリシンＢ／硫酸コレステ
ロール粒子の水性懸濁液を，粒径が主として約100〜200
ｎｍの間にあり，光学的に透明に分散させることによっ
て形成される。得られた懸濁液は、次いで、ラクトース
のような凍結防止剤の存在下で，実質的な粒子径の増加
が起こる前に凍結乾燥する。水性媒体中で再形成した
後，粒子径は，主として200〜300ｎｍの範囲内にある。
１：１〜１：４の間のアンホテリシンＢ／硫酸コレステ
ロール粒子の水性懸濁液を，粒径が主として約100〜200
ｎｍの間にあり，光学的に透明に分散させることによっ
て形成される。得られた懸濁液は、次いで、ラクトース
のような凍結防止剤の存在下で，実質的な粒子径の増加
が起こる前に凍結乾燥する。水性媒体中で再形成した
後，粒子径は，主として200〜300ｎｍの範囲内にある。
本発明の組成物は，マウスにおいて，同じ動物モデル系
におけるフンギゾンの約3.2mg/kgというLD50に比べて，
15mg/kgより大きなLD50を有し，１：１配合比の組成物
は，30〜40mg/kgより大きなLD50を有する。本発明のAMB
／硫酸コレステロール組成物の治療効力は，全AMB投与
レベルに依存するが，インビボで真菌感染症を治療する
際に，遊離のAMBについて観察される治療効力と同等ま
たはそれ以上である。
におけるフンギゾンの約3.2mg/kgというLD50に比べて，
15mg/kgより大きなLD50を有し，１：１配合比の組成物
は，30〜40mg/kgより大きなLD50を有する。本発明のAMB
／硫酸コレステロール組成物の治療効力は，全AMB投与
レベルに依存するが，インビボで真菌感染症を治療する
際に，遊離のAMBについて観察される治療効力と同等ま
たはそれ以上である。
また，本発明には，従来達成されていたよりも実質的に
毒性が小さく，かつ治療効力が大きな，AMBによる真菌
症の治療方法が含まれる。本発明の方法には，AMB／硫
酸コレステロールの上記のタイプの水性粒子懸濁液を処
方し，該懸濁液の治療上有効な量を投与する方法が含ま
れる。
毒性が小さく，かつ治療効力が大きな，AMBによる真菌
症の治療方法が含まれる。本発明の方法には，AMB／硫
酸コレステロールの上記のタイプの水性粒子懸濁液を処
方し，該懸濁液の治療上有効な量を投与する方法が含ま
れる。
本発明の上記および他の目的は，以下の本発明の詳細な
説明によって充分に明らかになる。
説明によって充分に明らかになる。
図面の簡単な説明 第１Ａ図〜第１Ｃ図は，Candida albicansで全身的に感
染させ，次いでAMBを一度に注射投与して治療した動物
の生存率を，感染後の日数の関数として表したグラフで
ある。第１Ａ図，第１Ｂ図，および第１Ｃ図は，それぞ
れAMBを，0.5mg/kh/does，0.125mg/kg/does，および0.0
31mg/kg/does投与した場合である 発明の詳細な説明 Ｉ．粒子組成物の調製 Ａ．粒子懸濁液 本発明のAMB／硫酸コレステロールの粒子懸濁液を調製
するために，AMBと硫酸コレステロールを，AMB：硫酸コ
レステロールの選択されたモル比の約１：１〜１：４の
間で，乾燥形態または溶液形態で混合する。好ましい方
法では，この２成分を，乾燥形態でかつ選択されたモル
比で混合して，次いで適切な溶媒，好ましくはメタノー
ルのようなアルコールに溶解する。メタノール中におけ
るAMBおよび硫酸コレステロールは，合計モル濃度が50
μmole/mlであり，AMB：硫酸コレステロールのモル比が
１：１と１：４との間であるのが適切である。例えば，
１：１配合の製剤は，AMBおよび硫酸コレステロールが
共に，25μmole/mmで存在することになる。
染させ，次いでAMBを一度に注射投与して治療した動物
の生存率を，感染後の日数の関数として表したグラフで
ある。第１Ａ図，第１Ｂ図，および第１Ｃ図は，それぞ
れAMBを，0.5mg/kh/does，0.125mg/kg/does，および0.0
31mg/kg/does投与した場合である 発明の詳細な説明 Ｉ．粒子組成物の調製 Ａ．粒子懸濁液 本発明のAMB／硫酸コレステロールの粒子懸濁液を調製
するために，AMBと硫酸コレステロールを，AMB：硫酸コ
レステロールの選択されたモル比の約１：１〜１：４の
間で，乾燥形態または溶液形態で混合する。好ましい方
法では，この２成分を，乾燥形態でかつ選択されたモル
比で混合して，次いで適切な溶媒，好ましくはメタノー
ルのようなアルコールに溶解する。メタノール中におけ
るAMBおよび硫酸コレステロールは，合計モル濃度が50
μmole/mlであり，AMB：硫酸コレステロールのモル比が
１：１と１：４との間であるのが適切である。例えば，
１：１配合の製剤は，AMBおよび硫酸コレステロールが
共に，25μmole/mmで存在することになる。
凍結防止剤を，好ましくは約５〜15％の間の最終濃度
で，上記AMB／硫酸コレステロール溶液に添加してもよ
い。この凍結防止剤は，後の処理工程で，２つの目的に
役立つものである。第１に，凍結防止剤は，混合物中の
溶媒が除去される際に，AMBおよび硫酸コレステロール
の成分が，その上に形成可能な結晶性で水溶性の充填剤
（bulking agent）を与える。すなわち，凍結防止剤の
乾燥結晶が，溶媒が除去される際に形成された脂質膜の
表面積を増大させ，その結果，水性媒体が乾燥混合物に
添加される際に，粒子の水和が容易になる。第２に，水
和された粒子を，下記のように凍結乾燥状態で貯蔵する
と，凍結防止剤が，凍結の際に起こり得る粒子の損傷を
低減し，その結果，再水和された粒子の粒径の増加を低
下させる。適切な凍結防止剤は，トレハロース，ラクト
ース，マルトース，セロビオース，スクロース，グルコ
ース，フルクトース，ソルビトール，ラフィノース，ミ
オ−イノシトール，およびグリセロールのような炭水化
物である（参照文献14）。マルトデキストリン，塩類な
どのような各種の他の水溶性充填剤は，粒子処理方法が
凍結工程を含まない場合，例えば粒子が貯蔵のために噴
霧乾燥される場合には，凍結防止剤の代わりに用いるこ
とができる。
で，上記AMB／硫酸コレステロール溶液に添加してもよ
い。この凍結防止剤は，後の処理工程で，２つの目的に
役立つものである。第１に，凍結防止剤は，混合物中の
溶媒が除去される際に，AMBおよび硫酸コレステロール
の成分が，その上に形成可能な結晶性で水溶性の充填剤
（bulking agent）を与える。すなわち，凍結防止剤の
乾燥結晶が，溶媒が除去される際に形成された脂質膜の
表面積を増大させ，その結果，水性媒体が乾燥混合物に
添加される際に，粒子の水和が容易になる。第２に，水
和された粒子を，下記のように凍結乾燥状態で貯蔵する
と，凍結防止剤が，凍結の際に起こり得る粒子の損傷を
低減し，その結果，再水和された粒子の粒径の増加を低
下させる。適切な凍結防止剤は，トレハロース，ラクト
ース，マルトース，セロビオース，スクロース，グルコ
ース，フルクトース，ソルビトール，ラフィノース，ミ
オ−イノシトール，およびグリセロールのような炭水化
物である（参照文献14）。マルトデキストリン，塩類な
どのような各種の他の水溶性充填剤は，粒子処理方法が
凍結工程を含まない場合，例えば粒子が貯蔵のために噴
霧乾燥される場合には，凍結防止剤の代わりに用いるこ
とができる。
AMB／硫酸コレステロールの脂質溶液は，乾燥されて脂
質膜になる。今説明したように，この膜は，好ましくは
充填剤を含有する溶液から形成され，脂質混合物で被覆
された充填剤の乾燥粒子を与える。溶媒の除去は，減圧
蒸発，または窒素のような不活性ガスの気流中で行われ
る。乾燥脂質膜は，不活性ガス中で貯蔵してもよいが，
４℃またはそれ以下の温度が好ましい。
質膜になる。今説明したように，この膜は，好ましくは
充填剤を含有する溶液から形成され，脂質混合物で被覆
された充填剤の乾燥粒子を与える。溶媒の除去は，減圧
蒸発，または窒素のような不活性ガスの気流中で行われ
る。乾燥脂質膜は，不活性ガス中で貯蔵してもよいが，
４℃またはそれ以下の温度が好ましい。
水性粒子懸濁液は，水性媒体を乾燥脂質混合物に添加す
ることにより形成される。実施例１に用いた，10mMトリ
ス−塩酸，0.1mM EDTA,pH7.4を含有する媒体が適切であ
る。添加される媒体の量は，AMBの最終濃度が好ましく
は約25〜100μmole/mlの間になるような量で充分であ
る。
ることにより形成される。実施例１に用いた，10mMトリ
ス−塩酸，0.1mM EDTA,pH7.4を含有する媒体が適切であ
る。添加される媒体の量は，AMBの最終濃度が好ましく
は約25〜100μmole/mlの間になるような量で充分であ
る。
まず，上記脂質物質を，スパチユラまたは機械的な攪拌
によって，あらかた懸濁させて，脂質の固まりを水性媒
体中に分離させてスラリー状混合物を形成させる。得ら
れた材料は，超音波処理，均質化処理，フレンチプレス
などで高いエネルギーを与えることによって，粒子系が
微細になるまで分散させる。この分散処理は，所望の粒
径，好ましくは0.1〜１ミクロンの間の粒径が得られる
まで行う。懸濁液は，分散処理中加温してもよいが，不
活性雰囲気下に保持すべきである。実施例１に記載した
方法では，懸濁液は，45℃で超音波処理を行い，光学的
に透明にする。最終的な粒径は0.1〜0.2ミクロンの間で
あった。ここで，１moleのAMBあたり約１moleを超えな
い硫酸コレステロールを含有する製剤は，超音波処理し
ても光学的な透明性が得られず，粒子を分散するには，
少なくとも化学量論的な量の硫酸コレステロールが必要
であることを示していることが注目される。
によって，あらかた懸濁させて，脂質の固まりを水性媒
体中に分離させてスラリー状混合物を形成させる。得ら
れた材料は，超音波処理，均質化処理，フレンチプレス
などで高いエネルギーを与えることによって，粒子系が
微細になるまで分散させる。この分散処理は，所望の粒
径，好ましくは0.1〜１ミクロンの間の粒径が得られる
まで行う。懸濁液は，分散処理中加温してもよいが，不
活性雰囲気下に保持すべきである。実施例１に記載した
方法では，懸濁液は，45℃で超音波処理を行い，光学的
に透明にする。最終的な粒径は0.1〜0.2ミクロンの間で
あった。ここで，１moleのAMBあたり約１moleを超えな
い硫酸コレステロールを含有する製剤は，超音波処理し
ても光学的な透明性が得られず，粒子を分散するには，
少なくとも化学量論的な量の硫酸コレステロールが必要
であることを示していることが注目される。
粒子懸濁液は，モレキュラーシーブクロマトグラフィま
たは透析などによって処理し，痕跡量の混和していない
AMBを除去する。実施例１に示す透析条件が適切であ
る。分散された粒子懸濁液中のAMBの最終濃度は，懸濁
液の一部をメタノールで稀釈し，分光光度計を用いて40
6ｎｍの波長でAMBについて測定することによって決定す
ることができる。分散液調製の各工程における代表的な
AMB濃度を，以下の実施例１の表１に示す。
たは透析などによって処理し，痕跡量の混和していない
AMBを除去する。実施例１に示す透析条件が適切であ
る。分散された粒子懸濁液中のAMBの最終濃度は，懸濁
液の一部をメタノールで稀釈し，分光光度計を用いて40
6ｎｍの波長でAMBについて測定することによって決定す
ることができる。分散液調製の各工程における代表的な
AMB濃度を，以下の実施例１の表１に示す。
Ｂ．乾燥粒子懸濁液 本発明のある局面に従って，本発明のAMB／硫酸コレス
テロール粒子は，乾燥形態で長期間貯蔵することがで
き，再水和する際に粒径が著しく増大しないことが見い
出された。
テロール粒子は，乾燥形態で長期間貯蔵することがで
き，再水和する際に粒径が著しく増大しないことが見い
出された。
乾燥粒子製剤は，乾燥凍結または噴霧乾燥によって調製
することができる。両方法ともに，乾燥工程は，AMB／
硫酸コレステロール粒子の粒径が実質的に増大する前に
行われる。凍結乾燥法では，小さな粒子の懸濁液が急速
に凍結され，実施例１に記載しているように，好ましく
は20℃またはそれ以下の貯蔵温度で凍結乾燥される。粒
径に対する凍結乾燥の影響は，AMB：硫酸コレステロー
ルのモル比が１：１〜１：４の間にある４つの製剤の各
々について，実施例２の表２に示されている。各々の場
合について，平均粒径は，凍結乾燥前の約100〜200ｎｍ
から，凍結乾燥して水で再水和した後の200〜300ｎｍの
間に増大した。凍結乾燥の前後の粒子の安定性について
は，以下の第II節で考察する。
することができる。両方法ともに，乾燥工程は，AMB／
硫酸コレステロール粒子の粒径が実質的に増大する前に
行われる。凍結乾燥法では，小さな粒子の懸濁液が急速
に凍結され，実施例１に記載しているように，好ましく
は20℃またはそれ以下の貯蔵温度で凍結乾燥される。粒
径に対する凍結乾燥の影響は，AMB：硫酸コレステロー
ルのモル比が１：１〜１：４の間にある４つの製剤の各
々について，実施例２の表２に示されている。各々の場
合について，平均粒径は，凍結乾燥前の約100〜200ｎｍ
から，凍結乾燥して水で再水和した後の200〜300ｎｍの
間に増大した。凍結乾燥の前後の粒子の安定性について
は，以下の第II節で考察する。
噴霧乾燥では，粒子懸濁液は従来の装置で乾燥される。
これらの装置では，乾燥すべき粒子が，エアロゾル化懸
濁液の形態で，加熱された空気または不活性ガスの気流
中に噴霧され，そしてエアロゾル化された液滴が，ガス
気流中で乾燥されてプレートコレクターの方に運ばれ，
乾燥リポソームが収集される。噴霧乾燥装置の一例は，
ブチ（Buchi）190ミニ噴霧乾燥機である。
これらの装置では，乾燥すべき粒子が，エアロゾル化懸
濁液の形態で，加熱された空気または不活性ガスの気流
中に噴霧され，そしてエアロゾル化された液滴が，ガス
気流中で乾燥されてプレートコレクターの方に運ばれ，
乾燥リポソームが収集される。噴霧乾燥装置の一例は，
ブチ（Buchi）190ミニ噴霧乾燥機である。
乾燥温度は，少なくとも約37℃であり，好ましくは約40
〜50℃の間である。収、集チヤンバーの温度は，一般的
には加熱空気の温度より低く，典型的に約37℃である，
乾燥された粒子は，収集され，不活性雰囲気下にて，脱
水形態で貯蔵される。
〜50℃の間である。収、集チヤンバーの温度は，一般的
には加熱空気の温度より低く，典型的に約37℃である，
乾燥された粒子は，収集され，不活性雰囲気下にて，脱
水形態で貯蔵される。
II．粒径安定性 この節では，粒子のモル組成，懸濁媒体，および貯蔵時
間に関する各種条件下における，AMB：硫酸コレステロ
ール粒子の懸濁液の粒径安定性について調べる。
間に関する各種条件下における，AMB：硫酸コレステロ
ール粒子の懸濁液の粒径安定性について調べる。
最初の試験は実施例３に報告したが，AMB：硫酸コレス
テロールのモル比が，１：１，１：２，１：３，および
１：４のAMB：硫酸コレステロール粒子を調製し，透析
直後に４℃で８日間貯蔵した。結果を実施例３の表３に
示す。モル比が１：１の製剤は，８日間の試験期間にわ
たって実質的に安定であったが，他の製剤は，硫酸コレ
ステロールのモル比が増加するにつれて，次第により大
きな粒径のものが増加することを示した。
テロールのモル比が，１：１，１：２，１：３，および
１：４のAMB：硫酸コレステロール粒子を調製し，透析
直後に４℃で８日間貯蔵した。結果を実施例３の表３に
示す。モル比が１：１の製剤は，８日間の試験期間にわ
たって実質的に安定であったが，他の製剤は，硫酸コレ
ステロールのモル比が増加するにつれて，次第により大
きな粒径のものが増加することを示した。
同様の４つの製剤を凍結乾燥して再水和した後の粒径安
定性を同様に試験して実施例３に示した。８日間の試験
による粒径安定性のデータを表３に示す。興味深いこと
に，この４つの製剤には粒径安定性にほとんど差がなか
った。そして，各製剤の平均粒径は，８日間の試験期間
で，せいぜい約２倍に増加しただけである。表２および
表４の結果を組み合わせると，(a)凍結乾燥されたAMB／
硫酸コレステロール粒子は，平均粒径と粒径分布とがほ
とんど増大することなく再形成し得ること，および(b)
再形成された懸濁液中の粒子は，溶液中で数日間貯蔵し
た場合，比較的安定であることが示される。
定性を同様に試験して実施例３に示した。８日間の試験
による粒径安定性のデータを表３に示す。興味深いこと
に，この４つの製剤には粒径安定性にほとんど差がなか
った。そして，各製剤の平均粒径は，８日間の試験期間
で，せいぜい約２倍に増加しただけである。表２および
表４の結果を組み合わせると，(a)凍結乾燥されたAMB／
硫酸コレステロール粒子は，平均粒径と粒径分布とがほ
とんど増大することなく再形成し得ること，および(b)
再形成された懸濁液中の粒子は，溶液中で数日間貯蔵し
た場合，比較的安定であることが示される。
本発明の粒子の粒径特性に対する生理食塩水および血漿
の影響を調べて実施例４に示した。最初の試験では，上
記の４つの透析後のAMB／硫酸コレステロール製剤を，
0.9％の食塩水で稀釈し，直ちに粒径を測定した。表５
の最上段に示したように，１：１配合の製剤はほとんど
凝集しなかったが，すべての粒子が大きな粒径増加を示
した。凍結乾燥後の粒子について同様の試験を行い，結
果を，実施例４の表６の最上段に示した。表５および表
６のデータを比較すると，１：１配合の製剤は、透析後
よりも凍結乾燥後の方が，食塩水中で，粒径が著しく安
定であることを示している。硫酸コレステロールのモル
比が大きな他の３つの製剤は，凍結乾燥の前後に，食塩
水中で大きな粒径増加を示した。
の影響を調べて実施例４に示した。最初の試験では，上
記の４つの透析後のAMB／硫酸コレステロール製剤を，
0.9％の食塩水で稀釈し，直ちに粒径を測定した。表５
の最上段に示したように，１：１配合の製剤はほとんど
凝集しなかったが，すべての粒子が大きな粒径増加を示
した。凍結乾燥後の粒子について同様の試験を行い，結
果を，実施例４の表６の最上段に示した。表５および表
６のデータを比較すると，１：１配合の製剤は、透析後
よりも凍結乾燥後の方が，食塩水中で，粒径が著しく安
定であることを示している。硫酸コレステロールのモル
比が大きな他の３つの製剤は，凍結乾燥の前後に，食塩
水中で大きな粒径増加を示した。
第２の試験は，血漿中におけるAMB／硫酸コレステロー
ル粒子の粒径と、次いで血漿媒体を懸濁緩衝剤で稀釈し
た場合の影響とを調べるように設計した。まず，（凍結
乾燥の前後の）４つの各試料をヒト血漿で１：１に稀釈
し、次いで数分後に，10％ラクトースを含有する懸濁緩
衝液で稀釈した。粒径の測定は，稀釈直後に，および稀
釈してから２０分後に行った。これらの結果を，実施例
４の表５および表６の下方の２段に示す。これらのデー
タを要約すると，血漿は，すべての製剤において粒径を
増加させた。最小の粒径増加は，１：１配合の製剤に認
められた，その粒径は１ミクロン（1000ｎｍ）より小さ
かった。血漿との接触によって生じた粒径増加は，１：
４配合の製剤以外の全ての製剤について，少なくとも部
分的に可逆的であった。このことは，懸濁媒体中の稀釈
形態で20分間保持した後に，粒径が著しく低下すること
によって示された。凍結乾燥の前後における粒子の粒径
の挙動には，ほとんど差がなかった。
ル粒子の粒径と、次いで血漿媒体を懸濁緩衝剤で稀釈し
た場合の影響とを調べるように設計した。まず，（凍結
乾燥の前後の）４つの各試料をヒト血漿で１：１に稀釈
し、次いで数分後に，10％ラクトースを含有する懸濁緩
衝液で稀釈した。粒径の測定は，稀釈直後に，および稀
釈してから２０分後に行った。これらの結果を，実施例
４の表５および表６の下方の２段に示す。これらのデー
タを要約すると，血漿は，すべての製剤において粒径を
増加させた。最小の粒径増加は，１：１配合の製剤に認
められた，その粒径は１ミクロン（1000ｎｍ）より小さ
かった。血漿との接触によって生じた粒径増加は，１：
４配合の製剤以外の全ての製剤について，少なくとも部
分的に可逆的であった。このことは，懸濁媒体中の稀釈
形態で20分間保持した後に，粒径が著しく低下すること
によって示された。凍結乾燥の前後における粒子の粒径
の挙動には，ほとんど差がなかった。
上記のデータは，本発明のAMB／硫酸コレステロール製
剤が，乾燥形態で長期間貯蔵することができ，再水和時
に粒径が著しく増加しないか，あるいは血漿中における
粒径安定性が著しく変化しないことを示している。これ
らの乾燥粒子に観察された１つの重要な利点は，緩衝剤
中で貯蔵した場合に，粒径安定性が著しく大きかったと
いうことである。調べたAMB：硫酸コレステロールのモ
ル比の範囲内では，１：１配合の製剤が，種々の試験条
件下で，最高の粒径安定性の最小の平均粒径とを示し
た。
剤が，乾燥形態で長期間貯蔵することができ，再水和時
に粒径が著しく増加しないか，あるいは血漿中における
粒径安定性が著しく変化しないことを示している。これ
らの乾燥粒子に観察された１つの重要な利点は，緩衝剤
中で貯蔵した場合に，粒径安定性が著しく大きかったと
いうことである。調べたAMB：硫酸コレステロールのモ
ル比の範囲内では，１：１配合の製剤が，種々の試験条
件下で，最高の粒径安定性の最小の平均粒径とを示し
た。
III．粒子特性 硫酸コレステロールは，時間を延長して（数時間）超音
波処理することによって，脂質の小胞またはリポソーム
を形成し得ることが報告されている（参照文献13）。そ
れゆえに，本発明のAMB／硫酸コレステロール粒子がリ
ポソーム状形態であるかどうかを決定することは興味深
いことである。これらの試験には，１：４配合のAMB／
硫酸コレステロール製剤を選んだ。その理由は，硫酸コ
レステロールの比率が比較的高い方がリポソーム構造を
形成しやすいからである。
波処理することによって，脂質の小胞またはリポソーム
を形成し得ることが報告されている（参照文献13）。そ
れゆえに，本発明のAMB／硫酸コレステロール粒子がリ
ポソーム状形態であるかどうかを決定することは興味深
いことである。これらの試験には，１：４配合のAMB／
硫酸コレステロール製剤を選んだ。その理由は，硫酸コ
レステロールの比率が比較的高い方がリポソーム構造を
形成しやすいからである。
リポソームの１つの特徴は，水溶液溶質分子を包み込む
ことが可能な連続した脂質二重層である。糖類などの標
識溶質のような多くの水溶性分子は，標識溶質を含有す
る水溶性媒体中でリポソーム脂質を（分散させながら）
調製することによって，リポソーム中に容易に包み込ま
れる。また，糖類のような小さな標識分子は，脂質二重
層の膜を徐々に通過する傾向がある。このことは，溶質
が，包みこまれた水性領域と，バルク相の水性領域との
間で，数時間から数日間の溶質交換期間にわたって平衡
化することで示される。
ことが可能な連続した脂質二重層である。糖類などの標
識溶質のような多くの水溶性分子は，標識溶質を含有す
る水溶性媒体中でリポソーム脂質を（分散させながら）
調製することによって，リポソーム中に容易に包み込ま
れる。また，糖類のような小さな標識分子は，脂質二重
層の膜を徐々に通過する傾向がある。このことは，溶質
が，包みこまれた水性領域と，バルク相の水性領域との
間で，数時間から数日間の溶質交換期間にわたって平衡
化することで示される。
AMB／硫酸コレステロール（１：４）粒子がスクロース
を包み込む能力を試験するために，１４Ｃスクロースを
含有する媒体中に分散させて粒子を調製した。光学的な
透明度が得られるまで超音波処理をした後，AMB／硫酸
コレステロール粒子の粒径範囲にある粒子を排除する物
質ふるい分けカラムを用いた分子ふるいクロマトグラフ
ィによって，粒子を懸濁媒体から分離した。試験の詳細
な実施例５に記載する。簡単に述べると，95％のAMB
が，ボイドボリューム中に溶出した粒子と結合していた
が，放射能が全く検出できないピークは，これらの粒子
に関連していた。
を包み込む能力を試験するために，１４Ｃスクロースを
含有する媒体中に分散させて粒子を調製した。光学的な
透明度が得られるまで超音波処理をした後，AMB／硫酸
コレステロール粒子の粒径範囲にある粒子を排除する物
質ふるい分けカラムを用いた分子ふるいクロマトグラフ
ィによって，粒子を懸濁媒体から分離した。試験の詳細
な実施例５に記載する。簡単に述べると，95％のAMB
が，ボイドボリューム中に溶出した粒子と結合していた
が，放射能が全く検出できないピークは，これらの粒子
に関連していた。
この試験によれば，上記の粒子は，包み込んだ（リポソ
ーム状）構造を形成しないか，あるいは非常に漏洩しや
すい構造を形成しているようである。後者の説明は可能
性が低い。その理由は，(a)コレステロールは，小さな
水溶性透過物のリポソーム透過性を低下させ，および
(b)従来報告されている純粋なコレステロール誘導体リ
ポソーム（参照文献13）は，透過性が非常に小さいから
である。ヘミコハク酸コレステロールリポソームに関す
る研究でも，各種の小さな水溶性分子の安定した包み込
みが示されている（国際特許願WO85/05030）。
ーム状）構造を形成しないか，あるいは非常に漏洩しや
すい構造を形成しているようである。後者の説明は可能
性が低い。その理由は，(a)コレステロールは，小さな
水溶性透過物のリポソーム透過性を低下させ，および
(b)従来報告されている純粋なコレステロール誘導体リ
ポソーム（参照文献13）は，透過性が非常に小さいから
である。ヘミコハク酸コレステロールリポソームに関す
る研究でも，各種の小さな水溶性分子の安定した包み込
みが示されている（国際特許願WO85/05030）。
リポソームの他の特徴は，等張性リポソームが低張性媒
体に注入されると膨潤するという性質である。このよう
に，リポソームは，二重層膜を通過する溶質の勾配に応
じて，小さな浸透圧計のような作用をする。等張性リポ
ソームの膨潤現象は，種々のコレステロール誘導体（コ
レステロール−PEG，硫酸コレステロール（参照文献1
3），およびヘミコハク酸コレステロールリポソーム
（国際特許願WO85/05030）を含む）で調製したリポソー
ムについて観察されている。コレステロール誘導体リポ
ソームは，従来のリン脂質成分から形成されたリポソー
ムほどに理想的な浸透圧計のような挙動は示さないが，
徐々に稀釈媒体に注入すると予想どおりの吸光度の上昇
を示す。
体に注入されると膨潤するという性質である。このよう
に，リポソームは，二重層膜を通過する溶質の勾配に応
じて，小さな浸透圧計のような作用をする。等張性リポ
ソームの膨潤現象は，種々のコレステロール誘導体（コ
レステロール−PEG，硫酸コレステロール（参照文献1
3），およびヘミコハク酸コレステロールリポソーム
（国際特許願WO85/05030）を含む）で調製したリポソー
ムについて観察されている。コレステロール誘導体リポ
ソームは，従来のリン脂質成分から形成されたリポソー
ムほどに理想的な浸透圧計のような挙動は示さないが，
徐々に稀釈媒体に注入すると予想どおりの吸光度の上昇
を示す。
上記（１：１，１：２，１：３，および１：４のモル
比）の４つのAMB／コレステロール粒子組成物を，それ
ぞれ10％ラクトース中で調製した。透析前後の粒子につ
いて，稀釈直後の粒径と，稀釈してから20分後の粒径と
を比較して，蒸留水中の浸透膨潤特性とを試験した。こ
れらの結果を実施例６の表７に示す。いずれの粒子製剤
にも膨潤は観察されなかった。この試験は，本発明のAM
B／硫酸コレステロール粒子が閉鎖された小胞構造を形
成しないという上記の包み込みに関する試験から得た知
見を裏付けている。
比）の４つのAMB／コレステロール粒子組成物を，それ
ぞれ10％ラクトース中で調製した。透析前後の粒子につ
いて，稀釈直後の粒径と，稀釈してから20分後の粒径と
を比較して，蒸留水中の浸透膨潤特性とを試験した。こ
れらの結果を実施例６の表７に示す。いずれの粒子製剤
にも膨潤は観察されなかった。この試験は，本発明のAM
B／硫酸コレステロール粒子が閉鎖された小胞構造を形
成しないという上記の包み込みに関する試験から得た知
見を裏付けている。
IV．治療上の用途 AMBは，コクシジオイデス症，クリプトコックス症，全
身性モニリア症，ヒストプラズマ症，アスペルギルス
症，ロードプトルーラ症，スポロトリクス症，フィコミ
コーシス症，およびブラストミセス症を含む各種の全身
性真菌感染症を治療するのに有用であり，Leishmania属
のいくつかの種の菌に対しても有効である（参照文献1
5）。この薬剤は，現在入手し得る遊離形態では，強い
副作用があるので，一般的には，進行性であり，致命的
になる可能性がある全身性の真菌感染症の患者にのみ投
与される。また，この患者は，腎臓機能を常時モニター
するため，この薬剤で治療中は入院していなければなら
ない。
身性モニリア症，ヒストプラズマ症，アスペルギルス
症，ロードプトルーラ症，スポロトリクス症，フィコミ
コーシス症，およびブラストミセス症を含む各種の全身
性真菌感染症を治療するのに有用であり，Leishmania属
のいくつかの種の菌に対しても有効である（参照文献1
5）。この薬剤は，現在入手し得る遊離形態では，強い
副作用があるので，一般的には，進行性であり，致命的
になる可能性がある全身性の真菌感染症の患者にのみ投
与される。また，この患者は，腎臓機能を常時モニター
するため，この薬剤で治療中は入院していなければなら
ない。
この節では，本発明の製剤中におけるAMBの毒性が低減
し，かつ効力が向上したことと，これに基づき薬剤とし
て使用可能なより広範囲の用途，特に癌の化学療法，免
疫抑制薬剤，または放射線治療を受けている患者のよう
な，免疫欠乏状態または免疫無防備状態の患者における
日和見的真菌感染症を予防する用途とについて説明す
る。
し，かつ効力が向上したことと，これに基づき薬剤とし
て使用可能なより広範囲の用途，特に癌の化学療法，免
疫抑制薬剤，または放射線治療を受けている患者のよう
な，免疫欠乏状態または免疫無防備状態の患者における
日和見的真菌感染症を予防する用途とについて説明す
る。
Ａ．AMB／硫酸コレステロールの毒性 本発明の重要な特徴によって，ここに記載されたAMB：
硫酸コレステロール組成物が，遊離のAMB（フンギゾ
ン）よりも著しく毒性が低いことが，はるかに高いLD50
値を有することで裏付けられて見い出された。さらに，
この組成物は，報告されたLD50値との比較から判断し
て，従来技術の項で述べられたリポソーム形または脂質
複合体形のAMBよりも毒性が著しく小さい。本発明の組
成物LD50値を測定する毒性試験は実施例７に詳述されて
いる。最初の試験では，フンギゾンと１：４配合のAMB
／硫酸コレステロール粒子との致死毒性を調べた。表８
に示すデータによれば，遊離AMB（フンギゾン）の組成
物のLD50は，１〜４mg/kg動物体重の間である。この値
は，AMB／硫酸コレステロール組成物では，15〜25mg/kg
の間に増大する。このLD50値は，従来技術の項に記載さ
れたリポソーム形または脂質複合体形のAMB製剤につい
て以前に報告された値より実質的に高い値である。
硫酸コレステロール組成物が，遊離のAMB（フンギゾ
ン）よりも著しく毒性が低いことが，はるかに高いLD50
値を有することで裏付けられて見い出された。さらに，
この組成物は，報告されたLD50値との比較から判断し
て，従来技術の項で述べられたリポソーム形または脂質
複合体形のAMBよりも毒性が著しく小さい。本発明の組
成物LD50値を測定する毒性試験は実施例７に詳述されて
いる。最初の試験では，フンギゾンと１：４配合のAMB
／硫酸コレステロール粒子との致死毒性を調べた。表８
に示すデータによれば，遊離AMB（フンギゾン）の組成
物のLD50は，１〜４mg/kg動物体重の間である。この値
は，AMB／硫酸コレステロール組成物では，15〜25mg/kg
の間に増大する。このLD50値は，従来技術の項に記載さ
れたリポソーム形または脂質複合体形のAMB製剤につい
て以前に報告された値より実質的に高い値である。
追加の試験（実施例８に示されている）では，上記の４
つの異なるモル比のAMB製剤の致死毒性を，40mg/kgまで
の投与量で調べた。この実施例に示したように，AMB／C
HSO4の製剤は，40mg/kgまでのLD50値を示した。これら
のデータは，他の３つの製剤のLD50が，20mg/kgより小
さく，少なくとも１：４の配合の製剤は15〜20mg/kgの
間であることを示している。
つの異なるモル比のAMB製剤の致死毒性を，40mg/kgまで
の投与量で調べた。この実施例に示したように，AMB／C
HSO4の製剤は，40mg/kgまでのLD50値を示した。これら
のデータは，他の３つの製剤のLD50が，20mg/kgより小
さく，少なくとも１：４の配合の製剤は15〜20mg/kgの
間であることを示している。
また，本発明の組成物は，硫酸コレステロールが，広く
動物内に見い出される天然のコレステロール成分である
という利点を有している。このコレステロール化合物に
ついては，全く毒性は知られておらず，体内でコレステ
ロールスルファターゼによって代謝される。
動物内に見い出される天然のコレステロール成分である
という利点を有している。このコレステロール化合物に
ついては，全く毒性は知られておらず，体内でコレステ
ロールスルファターゼによって代謝される。
最後に，毒性は，粒径が大きくなるにつれて増大すると
予想されるので，注射することが可能な安定で比較的小
さな粒子が毒性の減少に寄与する。
予想されるので，注射することが可能な安定で比較的小
さな粒子が毒性の減少に寄与する。
Ｂ．効力 このAMB／硫酸コレステロール組成物の他の重要な特徴
は，全身性真菌感染症を治療する際の著しく増強された
薬剤効力である。この発明を支持する目的で行った効力
の試験が実施例９に詳述されている。この実施例では，
静脈注射によって，C. albicansに感染させた動物を，
0.3〜0.9mg/kg（体重）の投与量のFungizone，または0.
3〜2.0mg/kg（体重）の投与量のAMB／硫酸コレステロー
ル（配合１：４）で治療した。薬剤の効力を，薬剤を投
与してから25日後の生存率で測定した。表11に示すデー
タにより，AMB／硫酸コレステロール組成物を用いる
と，0.3〜0.9mg/kgの各投与レベルにおいて，有意に高
い生存率が得られることが示される。2.0mg/kgの投与で
は，本発明の製剤で治療された動物がすべて生存した。
は，全身性真菌感染症を治療する際の著しく増強された
薬剤効力である。この発明を支持する目的で行った効力
の試験が実施例９に詳述されている。この実施例では，
静脈注射によって，C. albicansに感染させた動物を，
0.3〜0.9mg/kg（体重）の投与量のFungizone，または0.
3〜2.0mg/kg（体重）の投与量のAMB／硫酸コレステロー
ル（配合１：４）で治療した。薬剤の効力を，薬剤を投
与してから25日後の生存率で測定した。表11に示すデー
タにより，AMB／硫酸コレステロール組成物を用いる
と，0.3〜0.9mg/kgの各投与レベルにおいて，有意に高
い生存率が得られることが示される。2.0mg/kgの投与で
は，本発明の製剤で治療された動物がすべて生存した。
第２の効力試験では（実施例９に記載されている），C.
albicansを感染させたマウスに0.031,0.125および0.5m
g/kgの投与レベルで，各動物に，感染させた日に２回，
およびその翌日に２回投与した場合の生存率(%)を比較
した。そのデータを第１Ａ図〜第１Ｃ図にグラフとして
示す。丸印は対照，四角印は遊離のAMB，三角印はAMB/C
HSO4（１：４），そしてダイヤモンド印はAMB/CHSO
4（１：１）を示し，各々上記の３種の異なるレベルで
投与した。２種の低レベルでの投与（第１Ｂ図および第
１Ｃ図）においては，２種のAMB/CHSO4製剤は，遊離のA
MBと同等の治療効力を示した。最高レベルでの投与（第
１Ａ図）においては，１：１配合のAMB/CHSO4製剤は，
遊離のAMBまたは１：４配合のAMB／硫酸コレステロール
製剤が60〜80％の生存率であるのに比べて，100％の生
存率を示した。
albicansを感染させたマウスに0.031,0.125および0.5m
g/kgの投与レベルで，各動物に，感染させた日に２回，
およびその翌日に２回投与した場合の生存率(%)を比較
した。そのデータを第１Ａ図〜第１Ｃ図にグラフとして
示す。丸印は対照，四角印は遊離のAMB，三角印はAMB/C
HSO4（１：４），そしてダイヤモンド印はAMB/CHSO
4（１：１）を示し，各々上記の３種の異なるレベルで
投与した。２種の低レベルでの投与（第１Ｂ図および第
１Ｃ図）においては，２種のAMB/CHSO4製剤は，遊離のA
MBと同等の治療効力を示した。最高レベルでの投与（第
１Ａ図）においては，１：１配合のAMB/CHSO4製剤は，
遊離のAMBまたは１：４配合のAMB／硫酸コレステロール
製剤が60〜80％の生存率であるのに比べて，100％の生
存率を示した。
本発明は，脱水されたAMB組成物を提供する。この脱水
されたAMB組成物は，長期間貯蔵後に再水和した際に，
約１ミクロン未満の選択された粒径範囲を有するAMB粒
子の懸濁液を形成する。粒子は，無水で不活性な環境下
に貯蔵できるので，毒性；および気体／液体界面での酸
化反応および機械的損傷に関連する脂質および薬物の分
解の問題が最少となる。非経口用途，例えば，静脈投与
用には，この組成物は，上記方法で製造し得るような約
0.1〜0.4ミクロンの粒径のAMBリポソームで製造するの
が好ましい。このAMB／脂質組成物は，典型的には約50
〜200mg/mlの選択されたAMB濃度に水和され，そして，
１〜５mg AMB/kg（体重）の濃度で投与される。投与
は，AMB/CHSO4粒子が実質的に粒径を増大する前に行わ
れる。
されたAMB組成物は，長期間貯蔵後に再水和した際に，
約１ミクロン未満の選択された粒径範囲を有するAMB粒
子の懸濁液を形成する。粒子は，無水で不活性な環境下
に貯蔵できるので，毒性；および気体／液体界面での酸
化反応および機械的損傷に関連する脂質および薬物の分
解の問題が最少となる。非経口用途，例えば，静脈投与
用には，この組成物は，上記方法で製造し得るような約
0.1〜0.4ミクロンの粒径のAMBリポソームで製造するの
が好ましい。このAMB／脂質組成物は，典型的には約50
〜200mg/mlの選択されたAMB濃度に水和され，そして，
１〜５mg AMB/kg（体重）の濃度で投与される。投与
は，AMB/CHSO4粒子が実質的に粒径を増大する前に行わ
れる。
筋肉内注射する場合には，薬剤を注射部位から徐々に放
出するために，組成物は，より高濃度に再水和するのが
好ましく，このようにして組成物を注射部位に，好都合
に局在させることができる。
出するために，組成物は，より高濃度に再水和するのが
好ましく，このようにして組成物を注射部位に，好都合
に局在させることができる。
上記のことから，本発明のいかに種々の目的および特徴
が達成されるかがわかる。この発明は，従来の遊離のAM
BもしくはAMB脂質製剤に比べて毒性が実質的に低く，そ
して，遊離のAMBを含む報告された従来のAMB製剤と少な
くとも同等の薬物の効力を有するAMB組成物を提供す
る。この薬物は，増強された治療指数，特に減少した毒
性に関する上記指数によって，この薬剤の用途が一層拡
大される。例えば，免疫無防備状態の患者の予防治療，
および全身性活性真菌感染症の治療におけるより大きな
治療効果が付与される。
が達成されるかがわかる。この発明は，従来の遊離のAM
BもしくはAMB脂質製剤に比べて毒性が実質的に低く，そ
して，遊離のAMBを含む報告された従来のAMB製剤と少な
くとも同等の薬物の効力を有するAMB組成物を提供す
る。この薬物は，増強された治療指数，特に減少した毒
性に関する上記指数によって，この薬剤の用途が一層拡
大される。例えば，免疫無防備状態の患者の予防治療，
および全身性活性真菌感染症の治療におけるより大きな
治療効果が付与される。
この組成物は，容易に調製され，そして，硫酸コレステ
ロール成分は，精製された状態で比較的安価であり，非
経口投与の場合は，そのままで利用される。この製剤
は，乾燥状態で容易に貯蔵され得，再水和すると，選択
された小粒径を有する粒子懸濁液が得られる。
ロール成分は，精製された状態で比較的安価であり，非
経口投与の場合は，そのままで利用される。この製剤
は，乾燥状態で容易に貯蔵され得，再水和すると，選択
された小粒径を有する粒子懸濁液が得られる。
次の実施例は，AMB／硫酸コレステロール組成物の製
法，特徴および用途を例示している。これらの実施例は
本発明の範囲を限定するものではない。
法，特徴および用途を例示している。これらの実施例は
本発明の範囲を限定するものではない。
材料 CHSO4（コレステロール３−サルフェート，ナトリウム
塩）は，Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)から；AMB
（アンホテリシンＢ，１型）は，E.R.Squibb &Sons,In
c.ら寄贈された（Batch Ｎｏ．20-914-5978-001）。他
のすべての材料は，試薬グレードのものであるかまたは
市販のものよりも優れたものである。
塩）は，Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)から；AMB
（アンホテリシンＢ，１型）は，E.R.Squibb &Sons,In
c.ら寄贈された（Batch Ｎｏ．20-914-5978-001）。他
のすべての材料は，試薬グレードのものであるかまたは
市販のものよりも優れたものである。
実施例１ AMB/CHSO4粒子の調製 乾燥粉末形態のAMBおよびCHSO4を計量し，下記表１に示
す４種のAMB；硫酸コレステロールのモル比のうちの１
つを調製するように混合した。添加したAMBおよび硫酸
コレステロールの量は，粒子懸濁物中に，約50μmole/m
lのAMBおよび硫酸コレステロールの最終濃度を形成する
のに充分な量である。
す４種のAMB；硫酸コレステロールのモル比のうちの１
つを調製するように混合した。添加したAMBおよび硫酸
コレステロールの量は，粒子懸濁物中に，約50μmole/m
lのAMBおよび硫酸コレステロールの最終濃度を形成する
のに充分な量である。
乾燥メタノールをAMB／硫酸コレステロール粉末に加え
て，AMBの最終濃度を0.2〜0.6mg/mlとし，得られた懸濁
物を，粉末全部が溶解するまで攪拌した。この溶液にラ
クトースを加えて，最終水性生成物中に10％(w/v)のラ
クトースを含有する溶液を調製した。得られた溶液を減
圧乾燥し，親油性AMB／硫酸コレステロールフィルムで
被覆された乾燥ラクトース粒子を得た。
て，AMBの最終濃度を0.2〜0.6mg/mlとし，得られた懸濁
物を，粉末全部が溶解するまで攪拌した。この溶液にラ
クトースを加えて，最終水性生成物中に10％(w/v)のラ
クトースを含有する溶液を調製した。得られた溶液を減
圧乾燥し，親油性AMB／硫酸コレステロールフィルムで
被覆された乾燥ラクトース粒子を得た。
10mMトリス−塩酸，0.1mM EDTAを含有する緩衝懸濁液pH
7.4,67m0sm，を上記乾燥混合物に，AMBと硫酸コレステ
ロールとの合計の最終濃度が50μmole/mlになるのに充
分な量で添加した。この懸濁物を，ウルトラソニック
リキッド プロセッサー(Ultrasonics Liquid Processo
r)(Heat Ultrasonics,Inc.,Farmingdale,NY）モデルＷ
−800，プローブ ソニケーターで懸濁液が光学的に透
明になるまで超音波処理した。（この処理は，懸濁液を
湯浴で45℃に加温すれば容易に行なわれる）。超音波処
理は窒素ガス雰囲気下で行なった。
7.4,67m0sm，を上記乾燥混合物に，AMBと硫酸コレステ
ロールとの合計の最終濃度が50μmole/mlになるのに充
分な量で添加した。この懸濁物を，ウルトラソニック
リキッド プロセッサー(Ultrasonics Liquid Processo
r)(Heat Ultrasonics,Inc.,Farmingdale,NY）モデルＷ
−800，プローブ ソニケーターで懸濁液が光学的に透
明になるまで超音波処理した。（この処理は，懸濁液を
湯浴で45℃に加温すれば容易に行なわれる）。超音波処
理は窒素ガス雰囲気下で行なった。
超音波処理したAMB/CHSO4粒子を，6000〜8000の分子量
カットオフの透析チューブを用いて透析して痕跡量の取
り込まれていないAMBを除去した。得られた物質を，10m
Mトリス−塩酸，0.1mM EDTA,10％(w/v)ラクトース含有
の緩衝液（pH7.4）（300m0sm）に対して透析した。透明
な懸濁液を，ドライアイス／イソプロパノール混合物中
で急速に凍結し，一夜−25℃の貯蔵温度で凍結乾燥し，
さらに２時間25℃で乾燥した（15SRC-X Lyophilizer;Vi
rtis,Gardiner,NY）。凍結乾燥した試料に，同容量の水
を加えてゆるやかに攪拌することによって再形成した。
次の表１は，種々の調製工程における４種の組成物のAM
Bの濃度を示す。
カットオフの透析チューブを用いて透析して痕跡量の取
り込まれていないAMBを除去した。得られた物質を，10m
Mトリス−塩酸，0.1mM EDTA,10％(w/v)ラクトース含有
の緩衝液（pH7.4）（300m0sm）に対して透析した。透明
な懸濁液を，ドライアイス／イソプロパノール混合物中
で急速に凍結し，一夜−25℃の貯蔵温度で凍結乾燥し，
さらに２時間25℃で乾燥した（15SRC-X Lyophilizer;Vi
rtis,Gardiner,NY）。凍結乾燥した試料に，同容量の水
を加えてゆるやかに攪拌することによって再形成した。
次の表１は，種々の調製工程における４種の組成物のAM
Bの濃度を示す。
実施例２ 粒径に対する凍結乾燥の影響 Nicompモデル200サイザー〔Nicomp Instruments Inc.,G
oleta,CA）を用い，動的レーザー光分散法（dynamic la
ser-light scattering）によって測定した。この測定用
では，10mMトリス／塩酸，0.1mM EDTA,10％(W/V)ラクト
ースを含有する緩衝液（pH7.4）を用い，典型的には，
試料を0.3μmole/mlに希釈した。実施例１で得た４種の
組成物の平均粒径と標準偏差（S.D.）とを下記表２に示
す。表からわかるように，４種の組成物はすべて，凍結
乾燥前に約130〜180ｎｍの平均粒径を有し，そして凍結
乾燥後は約210〜280ｎｍの平均粒径を有する。
oleta,CA）を用い，動的レーザー光分散法（dynamic la
ser-light scattering）によって測定した。この測定用
では，10mMトリス／塩酸，0.1mM EDTA,10％(W/V)ラクト
ースを含有する緩衝液（pH7.4）を用い，典型的には，
試料を0.3μmole/mlに希釈した。実施例１で得た４種の
組成物の平均粒径と標準偏差（S.D.）とを下記表２に示
す。表からわかるように，４種の組成物はすべて，凍結
乾燥前に約130〜180ｎｍの平均粒径を有し，そして凍結
乾燥後は約210〜280ｎｍの平均粒径を有する。
実施例３ 溶液を貯蔵したときの粒径に対する影響 実施例１による４種の試料は，AMBと硫酸コレステロー
ルとの合計の濃度が約50μmole/mlであり，これらを８
日間まで４℃にて保持した。０，２，６および８日目
に，各懸濁液の一部を採取し，約0.3μmole/mlに希釈
し，実施例２と同様にして粒径分布を調べた。その結果
を次の表２に示す。１：１配合の組成物は，粒径変化に
ついては安定であるが，硫酸コレステロールのモル比が
高い組成物は，貯蔵によって安定性が次第に低下する。
ルとの合計の濃度が約50μmole/mlであり，これらを８
日間まで４℃にて保持した。０，２，６および８日目
に，各懸濁液の一部を採取し，約0.3μmole/mlに希釈
し，実施例２と同様にして粒径分布を調べた。その結果
を次の表２に示す。１：１配合の組成物は，粒径変化に
ついては安定であるが，硫酸コレステロールのモル比が
高い組成物は，貯蔵によって安定性が次第に低下する。
実施例１で行ったのと同様に，凍結乾燥し，蒸留水で再
生した後の同一組成物について同様に安定性試験を行っ
た。結果を表４に示す。この結果から次のことがわか
る：(a)４種の組成物の各々について，８日間にわたる
試験により，比較的小さなサイズの粒子が増加している
こと，および(b)粒径変化に対する，硫酸コレステロー
ルのモル量の影響はほとんどない。
生した後の同一組成物について同様に安定性試験を行っ
た。結果を表４に示す。この結果から次のことがわか
る：(a)４種の組成物の各々について，８日間にわたる
試験により，比較的小さなサイズの粒子が増加している
こと，および(b)粒径変化に対する，硫酸コレステロー
ルのモル量の影響はほとんどない。
実施例４ 粒径に対する生理食塩水および血漿の影響 実施例１で得られた４種の試料を，0.9％(W/V)の生理食
塩水で希釈して約0.3μmole/mlとし，実施例２と同様に
してそれぞれの粒径を測定した。この結果を下記表５の
最上列に示す。各製剤について，生理食塩水により，平
均粒径が10倍を越えて増大した。１：１配合組成物の粒
径の成長は，硫酸コレステロール量が多いその他の３種
の組成物よりも有意に少なかった。
塩水で希釈して約0.3μmole/mlとし，実施例２と同様に
してそれぞれの粒径を測定した。この結果を下記表５の
最上列に示す。各製剤について，生理食塩水により，平
均粒径が10倍を越えて増大した。１：１配合組成物の粒
径の成長は，硫酸コレステロール量が多いその他の３種
の組成物よりも有意に少なかった。
４種の試料をまた，ヒト血漿で１：１(V/V)に希釈し，
続いて（ヒト血漿と接触してから数分以内に），10mMト
リス／塩酸，0.1mM EDTA,10％ラクトース(W/V)を含有す
る緩衝液（pH7.4）で希釈し粒径を測定した。粒径測定
の結果を，下記の表５に示す。この測定は，希釈直後お
よび希釈してから20分後に行った。データによって，次
のことが示された。つまり，１：１の配合製剤が，血漿
と接触した際に粒径変化については最も鈍感であり，ま
た希釈媒質中で20分間保持することにより，すべての製
剤において粒径がいくらか小さくなった。
続いて（ヒト血漿と接触してから数分以内に），10mMト
リス／塩酸，0.1mM EDTA,10％ラクトース(W/V)を含有す
る緩衝液（pH7.4）で希釈し粒径を測定した。粒径測定
の結果を，下記の表５に示す。この測定は，希釈直後お
よび希釈してから20分後に行った。データによって，次
のことが示された。つまり，１：１の配合製剤が，血漿
と接触した際に粒径変化については最も鈍感であり，ま
た希釈媒質中で20分間保持することにより，すべての製
剤において粒径がいくらか小さくなった。
実施例１と同様に，凍結乾燥して蒸留水で再水和した後
のAMB／硫酸コレステロール粒子について，0.9％生理食
塩水または血漿を混合した後，同様の粒径測定を行っ
た。結果を下記の表６に示す。凍結乾燥前の粒子につい
て観察されたのと同様の粒径変化（表５のデータ参照）
が観察された。
のAMB／硫酸コレステロール粒子について，0.9％生理食
塩水または血漿を混合した後，同様の粒径測定を行っ
た。結果を下記の表６に示す。凍結乾燥前の粒子につい
て観察されたのと同様の粒径変化（表５のデータ参照）
が観察された。
実施例５ 粒子のカプセル化試験 AMB／硫酸コレステロール粒子の，放射能標識マーカー
を包みこむ性能を試験した。乾燥AMB／硫酸コレステロ
ール混合物を懸濁させるのに使用するトリス緩衝媒体が
１μCiの14C−スクロースを含有すること以外，実施例
１と同様にしてCHSO4／AMBが４：１のモル比の配合粒子
を調製した。この懸濁液を，10mMトリス／塩酸，0.1mM
EDTA,10％(w/v)ラクトース含有の緩衝液（pH7.4）によ
り，平衡化させたセファデックスG50ゲル排除カラムに
かけ，次いで同じ緩衝液で溶出した。粒子はボイドボリ
ュームで溶出し，それは280ｎｍの紫外線吸収によって
モニターされた。試料を収集し，通常のシンチレーショ
ン計数法で，放射能を測定した。AMBの95％が粒子ピー
ク内にあったが，この領域に，14C−スクロースの検知
し得るピークは見い出されなかった。
を包みこむ性能を試験した。乾燥AMB／硫酸コレステロ
ール混合物を懸濁させるのに使用するトリス緩衝媒体が
１μCiの14C−スクロースを含有すること以外，実施例
１と同様にしてCHSO4／AMBが４：１のモル比の配合粒子
を調製した。この懸濁液を，10mMトリス／塩酸，0.1mM
EDTA,10％(w/v)ラクトース含有の緩衝液（pH7.4）によ
り，平衡化させたセファデックスG50ゲル排除カラムに
かけ，次いで同じ緩衝液で溶出した。粒子はボイドボリ
ュームで溶出し，それは280ｎｍの紫外線吸収によって
モニターされた。試料を収集し，通常のシンチレーショ
ン計数法で，放射能を測定した。AMBの95％が粒子ピー
ク内にあったが，この領域に，14C−スクロースの検知
し得るピークは見い出されなかった。
実施例６ 浸透膨潤性の試験 AMBと硫酸コレステロールとのモル比の異なる４種のCHS
O4／AMB製剤を，実施例１と同様にして調製した（10％
のラクトースを含有する通常の懸濁媒体中に調製）。こ
れらの試料を，下記表７では透析後（P.D.）懸濁液と呼
んでいる。各試料の一部（10％ラクトース含有）を凍結
乾燥し，蒸留水で再生して得られた試料を下記の表では
凍結乾燥および再生試料（L.R.）と呼んでいる。
O4／AMB製剤を，実施例１と同様にして調製した（10％
のラクトースを含有する通常の懸濁媒体中に調製）。こ
れらの試料を，下記表７では透析後（P.D.）懸濁液と呼
んでいる。各試料の一部（10％ラクトース含有）を凍結
乾燥し，蒸留水で再生して得られた試料を下記の表では
凍結乾燥および再生試料（L.R.）と呼んでいる。
P.D.およびL.R.の各試料を蒸留水で希釈し，0.3μmole/
mlの濃度とし，低張の媒体で希釈直後，および希釈して
から20分後の粒子の粒径分布を，実施例２と同様にして
測定した。結果を下記の表７に示す。表から明らかなよ
うに，20分間のインキュベーションの時間にわたり，明
確な膨潤現象は見られなかった。このことは，試験され
た何れの試料についても，平均粒径が増加することによ
って裏付けられる。
mlの濃度とし，低張の媒体で希釈直後，および希釈して
から20分後の粒子の粒径分布を，実施例２と同様にして
測定した。結果を下記の表７に示す。表から明らかなよ
うに，20分間のインキュベーションの時間にわたり，明
確な膨潤現象は見られなかった。このことは，試験され
た何れの試料についても，平均粒径が増加することによ
って裏付けられる。
実施例７ 粒子懸濁液の毒性（LD50） 異系交配した雄のスイス／ウェブスター系マウスをSimo
nsen labs,Inc.から入手した。この動物の処理日の体重
は約15〜45gで４〜８週令であった。動物は，試験前の
少なくとも３日間は隔離し，隔離期間中健康であったマ
ウスだけを使用した。動物には，餌と水とを不断給餌し
た。
nsen labs,Inc.から入手した。この動物の処理日の体重
は約15〜45gで４〜８週令であった。動物は，試験前の
少なくとも３日間は隔離し，隔離期間中健康であったマ
ウスだけを使用した。動物には，餌と水とを不断給餌し
た。
第１の試験では，動物の群を，滅菌生理食塩水に懸濁さ
せたフンギゾン（Fungizone:Squibb）または実施例１と
同様にして調製した１：４の配合割合のAMB／硫酸コレ
ステロール組成物で処理した。各々の場合において，AM
B濃度は，選択された投与量のAMB（表８に示す）が最終
容量0.2mlで投与できるように調整された。４〜８匹の
動物を各投与量の群に用いた。試験物質は，尾の側方の
動脈を介して，一回の静脈注射で投与した。各投与量は
約1.5分で投与した。
せたフンギゾン（Fungizone:Squibb）または実施例１と
同様にして調製した１：４の配合割合のAMB／硫酸コレ
ステロール組成物で処理した。各々の場合において，AM
B濃度は，選択された投与量のAMB（表８に示す）が最終
容量0.2mlで投与できるように調整された。４〜８匹の
動物を各投与量の群に用いた。試験物質は，尾の側方の
動脈を介して，一回の静脈注射で投与した。各投与量は
約1.5分で投与した。
毒性の微候があるか否か，および死亡したかについて，
動物を処理した日は少なくとも３回（処理してから１，
２および４時間後に）観察した。５日間のうちの残りの
観察期間では，毎日朝と午後とに動物を調べた。試験結
果を表８に示す。この表では，５日目の生存数：処理さ
れた動物の合計数，が示されている。フンギゾンのLD50
値は，通常の方法で算出され，その値は3.2mg/kgであ
る。AMB／硫酸コレステロール組成物のLD50値は15〜20m
g/kgである。
動物を処理した日は少なくとも３回（処理してから１，
２および４時間後に）観察した。５日間のうちの残りの
観察期間では，毎日朝と午後とに動物を調べた。試験結
果を表８に示す。この表では，５日目の生存数：処理さ
れた動物の合計数，が示されている。フンギゾンのLD50
値は，通常の方法で算出され，その値は3.2mg/kgであ
る。AMB／硫酸コレステロール組成物のLD50値は15〜20m
g/kgである。
第２の毒性試験では，実施例１で得られた４種のAMB／
硫酸コレステロール製剤のうちのひとつの20mg/kgの投
与量でマウスを処理した。薬物の投与法と動物のモニタ
ー法は上記と同様である。結果を下記の表９に示す。こ
の表では，１：１の配合割合の製剤は，20mg/kgより高
いLD50値を有することが示される。
硫酸コレステロール製剤のうちのひとつの20mg/kgの投
与量でマウスを処理した。薬物の投与法と動物のモニタ
ー法は上記と同様である。結果を下記の表９に示す。こ
の表では，１：１の配合割合の製剤は，20mg/kgより高
いLD50値を有することが示される。
第３の毒性試験は，Charles River Laboratory(Wilming
ton,MA）から入手した雄のCrL:CD-1(ICR)BRマウス（18
〜20g）を用いて，独立した実験室で行った。AMB：硫酸
コレステロールのモル比が１：４または１：１のAMB/CH
SO4製剤を上記と同様にして調製した。フンギゾンＴＭ
と遊離のAMBとを，発熱因子を含有しない水で可溶化
し，室温で10分間超音波処理をした。全薬物製剤を，適
当な希釈用緩衝液で所望の濃度に希釈した。
ton,MA）から入手した雄のCrL:CD-1(ICR)BRマウス（18
〜20g）を用いて，独立した実験室で行った。AMB：硫酸
コレステロールのモル比が１：４または１：１のAMB/CH
SO4製剤を上記と同様にして調製した。フンギゾンＴＭ
と遊離のAMBとを，発熱因子を含有しない水で可溶化
し，室温で10分間超音波処理をした。全薬物製剤を，適
当な希釈用緩衝液で所望の濃度に希釈した。
感染していないマウスに，AMB組成物のひとつの単一投
与量を，ゆっくりと一度に静脈注射した。AMB/CHSO4硫
酸コレステロール製剤の投与量は，３０，１５，7.5，
3.75，1.88および0.94mgAMB/kgの体重であった。またフ
ンギゾンＴＭおよび遊離のAMBの投与量は，８，４，
２，１，0.5および0.25mgAMB/kg体重であった。死亡率
を，処理に続く５日間の間記録か，各製剤の50％致死量
（LD50）を標準的な方法で計算した。その結果を表10に
示す。表からわかるように，１：１および１：４の配合
のAMB/CHSO4製剤のLD50は，遊離のAMBもしくはフンギゾ
ンＴＭのLD50よりも数倍高い値である。１：１の割合で
配合したAMB/CHSO4製剤は，30mg/kgを超えるLD50値を示
す。
与量を，ゆっくりと一度に静脈注射した。AMB/CHSO4硫
酸コレステロール製剤の投与量は，３０，１５，7.5，
3.75，1.88および0.94mgAMB/kgの体重であった。またフ
ンギゾンＴＭおよび遊離のAMBの投与量は，８，４，
２，１，0.5および0.25mgAMB/kg体重であった。死亡率
を，処理に続く５日間の間記録か，各製剤の50％致死量
（LD50）を標準的な方法で計算した。その結果を表10に
示す。表からわかるように，１：１および１：４の配合
のAMB/CHSO4製剤のLD50は，遊離のAMBもしくはフンギゾ
ンＴＭのLD50よりも数倍高い値である。１：１の割合で
配合したAMB/CHSO4製剤は，30mg/kgを超えるLD50値を示
す。
より最近，１：４および１：１の割合で配合されたAMB/
CHSO4製剤の毒性が，他の研究所で試験された。そこで
は，40mg AMB/kg体重までを一度に注射して試験した。
この試験により，１：１配合のAMB/CHSO4製剤のLD50値
が40mg/kgより大きいことがわかった。
CHSO4製剤の毒性が，他の研究所で試験された。そこで
は，40mg AMB/kg体重までを一度に注射して試験した。
この試験により，１：１配合のAMB/CHSO4製剤のLD50値
が40mg/kgより大きいことがわかった。
実施例８ AMB／硫酸コレステロール製剤の効力 20〜25gのCrl:CFW(SW)BRマウスを，Charles River Bree
ding Leboratoriesから入手し，餌と水を不断給餌し
た。カンジダアルビカンス（C. albicans）菌株30を，S
DA（サボロード−デキトロース−寒天）上にて，35℃で
18時間増殖させ，菌体を集め，滅菌してパイロジェンを
含まない生理食塩水で希釈し，0.2ml容量の単位を形成
する約7×108個のコロニーを得た。
ding Leboratoriesから入手し，餌と水を不断給餌し
た。カンジダアルビカンス（C. albicans）菌株30を，S
DA（サボロード−デキトロース−寒天）上にて，35℃で
18時間増殖させ，菌体を集め，滅菌してパイロジェンを
含まない生理食塩水で希釈し，0.2ml容量の単位を形成
する約7×108個のコロニーを得た。
８〜10匹の動物に，尾の静脈から，上記のC. albicans
の混合物0.2mlずつを注射した。上記真菌を感染させて
２日後に，動物にフンギゾンもしくは実施例１と同様に
して調製したAMB／硫酸コレステロール（１：４）を，
段階的に投与量を変えて注射した。AMB製剤は，各動物
が尾の静脈を通じて静脈注射される全容量が， mlとな
るようにその濃度が調整された。投与されたAMBの量
は，薬物（mg）／動物の体重（kg）によって表され，表
10の左側に示してある。動物は薬物投与後25日間観察し
た。試験動物の総数に対する25日目の生存数を，２種の
AMB製剤，および対照の緩衝液について表11に示す。
の混合物0.2mlずつを注射した。上記真菌を感染させて
２日後に，動物にフンギゾンもしくは実施例１と同様に
して調製したAMB／硫酸コレステロール（１：４）を，
段階的に投与量を変えて注射した。AMB製剤は，各動物
が尾の静脈を通じて静脈注射される全容量が， mlとな
るようにその濃度が調整された。投与されたAMBの量
は，薬物（mg）／動物の体重（kg）によって表され，表
10の左側に示してある。動物は薬物投与後25日間観察し
た。試験動物の総数に対する25日目の生存数を，２種の
AMB製剤，および対照の緩衝液について表11に示す。
第２の研究では，18〜20gの雄のCrl:CD-1(ICR)BRマウス
に，0.1mlのC. albicans（106個の細胞／動物）を感染
させ，１グループ当り10匹の動物の治療グループに分け
た。遊離のAMBと，１：１および１：４に配合したAMB/C
HSO4製剤とを，実施例７および実施例１と同様にして調
製した。感染させたマウスに，各薬物製剤の投与を，感
染させた日に２回とさらに次の日に２回の合計４回，静
脈ルートで行なった。各試験グループに対する単一投与
AMBレベルは，0.5，0.125および0.031mg AMB/kg体重／
回であった。対照のグループは希釈緩衝液だけを投与し
た。感染させてから30日間，マウスが死亡するか否かを
観察した。50％保護投与量（PD50）を，生存数データか
ら通常の方法により算出した。
に，0.1mlのC. albicans（106個の細胞／動物）を感染
させ，１グループ当り10匹の動物の治療グループに分け
た。遊離のAMBと，１：１および１：４に配合したAMB/C
HSO4製剤とを，実施例７および実施例１と同様にして調
製した。感染させたマウスに，各薬物製剤の投与を，感
染させた日に２回とさらに次の日に２回の合計４回，静
脈ルートで行なった。各試験グループに対する単一投与
AMBレベルは，0.5，0.125および0.031mg AMB/kg体重／
回であった。対照のグループは希釈緩衝液だけを投与し
た。感染させてから30日間，マウスが死亡するか否かを
観察した。50％保護投与量（PD50）を，生存数データか
ら通常の方法により算出した。
表12に，２種のAMB/CHSO4製剤と遊離のAMBとについて得
たPD50のデータをまとめて示す。AMB/CHSO4製剤は両者
とも，真菌感染症の治療に，遊離AMBと同等に有効であ
った。
たPD50のデータをまとめて示す。AMB/CHSO4製剤は両者
とも，真菌感染症の治療に，遊離AMBと同等に有効であ
った。
上記の試験から作成した生存曲線を，上記で考察したよ
うに，第１Ａ〜１Ｃ図に示す。つまり，特に，１：１に
配合したAMB/CHSO4製剤により，遊離AMBにより達成され
る治療効力よりも高い治療効力が，より高いAMB投与レ
ベルで達成されることを示している。
うに，第１Ａ〜１Ｃ図に示す。つまり，特に，１：１に
配合したAMB/CHSO4製剤により，遊離AMBにより達成され
る治療効力よりも高い治療効力が，より高いAMB投与レ
ベルで達成されることを示している。
本発明は，特定の実施例，用途および調製法について記
載され説明されているが，この発明の範囲から逸脱する
ことなく種々の変更および改変が行なわれ得ることは明
らかである。
載され説明されているが，この発明の範囲から逸脱する
ことなく種々の変更および改変が行なわれ得ることは明
らかである。
Claims (6)
- 【請求項１】抗真菌活性を有するアンホテリシンＢの粒
子を含有するアンホテリシンＢの組成物であって、該ア
ンホテリシンＢの粒子は、アンホテリシンＢと硫酸コレ
ステロールとのモル比が１：１から１：４の間の割合で
硫酸コレステロールを含む。 - 【請求項２】前記粒子が、水性媒体中に懸濁しており、
主として100〜400ｎｍの間の範囲の粒径を有する、請求
の範囲第１項に記載の組成物。 - 【請求項３】次の工程により製造される請求の範囲第２
項に記載の組成物： (a)アンホテリシンＢおよび硫酸コレステロールの１：
１から１：４の間のモル比の水性懸濁液を分散させて、
光学的に透明にする工程、 (b)該懸濁液を、該懸濁液中の粒子径が実質的に増大す
る前に、凍結保護物質の存在下で凍結乾燥する工程、お
よび (c)凍結乾燥された物質を水性媒体で再生する工程。 - 【請求項４】アンホテリシンＢと硫酸コレステロールと
のモル比が１：１である請求の範囲第１項に記載の組成
物。 - 【請求項５】LD50が15mg/kgより大きく、水性媒体中で1
00〜400ｎｍの粒径に再生することのできる形態のアン
ホテリシンＢを調製する方法であって、次の工程を包含
する： (a)アンホテリシンＢおよび硫酸コレステロールの１：
１から１：４の間のモル比の水性懸濁液を分散させて、
光学的に透明にする工程、および (b)該懸濁液を、該懸濁液中の粒子径が実質的に増大す
る前に、凍結保護物質の存在下で凍結乾燥する工程。 - 【請求項６】前記懸濁液中のアンホテリシンＢと硫酸コ
レステロールとのモル比が、１：１である請求の範囲第
５項に記載の方法。
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| DK (1) | DK174871B1 (ja) |
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| US6406713B1 (en) | 1987-03-05 | 2002-06-18 | The Liposome Company, Inc. | Methods of preparing low-toxicity drug-lipid complexes |
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| US7678832B2 (en) | 2005-08-16 | 2010-03-16 | Synta Pharmaceuticals Corp. | Bis(thio-hydrazide amide) formulation |
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| WO2008027445A2 (en) * | 2006-08-31 | 2008-03-06 | Synta Pharmaceuticals Corp. | Combination with bis(thiohydrazide amides) for treating cancer |
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-
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