CN108836944B - 一种大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂及其制备方法 - Google Patents

一种大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂，它由以下重量配比的成分组成：大豆苷元1‑10％、蛋黄磷脂30‑65％、胆固醇5‑20％、DPPE‑MPEG2000 1‑10％、增溶剂1‑10％、冻干保护剂15‑40％。本发明提供的大豆苷元脂质体冻干制剂具有较高的包封率、较低的粒径和PDI分散指数，产品性状稳定，溶解性能好，贮存期长，药物不仅在体内能缓慢释放，而且具有较高的生物利用度高，能够增加药效，减少毒副作用，从而为临床提供了更加安全、有效的大豆苷元新剂型。

Description

一种大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，涉及一种大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂，本发明还涉及该制剂的制备方法。
背景技术
大豆苷元为异黄酮类化合物，主要存在豆科植物如大豆或葛根中，大豆苷元可对高血压引起的头痛、头晕、等症状有明显的疗效，尤以缓解头痛为显著，除此之外还具有抗心律失常，雌激素样活性，抗癌及其对癌细胞的分化诱导作用。大豆苷元呈平面分子结构，难溶于水，口服后存在很强的首过效应，导致原形药在血浆中浓度很低，口服生物利用度较差。
脂质体因其生物学和技术优势而受到重视，并且被认为是迄今已知的最成功的药物载体系统。已经有超过10个FDA批准的脂质体药物。脂质体能够提高水溶性与稳定性差的药物的跨膜能力与口服生物利用度。长循环脂质体跟传统脂质体相比在于脂质体表面含有天然或合成聚合物修饰(如聚乙二醇PEG)，PEG链通过在脂质体表面上构建保护性亲水膜来保护脂质体免于单核吞噬系统细胞。它们的存在阻止了脂质体与其它分子如各种血清成分的相互作用，从而延长药物在体内的驻留时间，提高半衰期和生物利用度。
目前已有大豆苷元微球、β-环糊精纳米粒、固体脂质纳米粒等新剂型的研究报道，但未见大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂的研究，已研究的大豆苷元口服制剂虽种类繁多,但是其口服生物利用低的难题依然没有完全解决，，限制了大豆苷元的应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂，该制剂具有缓释效果，能够延长大豆苷元在体内的驻留时间，延长半衰期，提高血药浓度，提高生物利用度，从而提高药效，减少毒副作用，减少服药次数，提高患者顺应性。
上述目的是通过以下技术方案实现的。
一种大豆苷元长循环脂质体口服制剂，由以下重量配比的成分组成：
Figure BDA0001766531920000021
优选地，所述成分的重量配比是：
Figure BDA0001766531920000022
最佳地，所述成分的重量配比是：
Figure BDA0001766531920000023
所述增溶剂为15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯(Kolliphor HS15)或聚氧乙烯蓖麻油或吐温80，优选为15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯。
所述冻干保护剂由甘露醇和乳糖组成，其质量比为1:1-5。
一种制备所述大豆苷元长循环脂质体口服制剂的方法，包括以下步骤：
1)脂质体混悬液的制备：将大豆苷元、蛋黄磷脂、胆固醇、DPPE-MPEG2000、增溶剂溶解于有机溶剂，按照常规工艺制备大豆苷元脂质体混悬液；
2)向大豆苷元脂质体混悬液中加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻、干燥两个阶段，每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-40～-20℃，保温5～10小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-10～0℃并保温5～10小时，再将物料温度升高到30～40℃，保温8～15小时。
所述大豆苷元脂质体混悬液可采用本领域技术人员所熟知的薄膜超声法、溶剂注入法、逆向蒸发法等方法进行制备，本发明优选的是薄膜超声法，采用该方法制备的脂质体包封率更高，粒径和PDI分散指数更低。具体步骤如下：将大豆苷元、蛋黄磷脂、胆固醇、DPPE-MPEG2000，增溶剂溶解到有机溶剂中，将混合溶液旋蒸除去有机溶剂直至在容器内壁形成一层薄膜，继续旋蒸除去残余有机溶剂，然后加入pH为6-9的PBS缓冲液，先在40-70℃条件下搅拌10-30min，随后在冰浴条件下超声10-30min，最后过微孔滤膜整粒得到脂质体混悬液。
进一步优选地，所述有机溶剂为体积比为5-10:1的甲醇-氯仿混合溶剂。
进一步优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
为进一步提高冻干制剂的性状外观和稳定性，改善其复溶性，提高缓释效果和生物利用度，本发明进一步优选地，所述冷冻干燥每个阶段的操作步骤如下：预冻：先将物料温度迅速降至-35℃，保温6小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-6℃并保温6小时，再将物料温度升高到38℃，保温12小时。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供的大豆苷元脂质体冻干制剂具有较高的包封率、较低的粒径和PDI分散指数，产品性状稳定，溶解性能好，贮存期长。
2.本发明能够在体内缓慢释放，从而有利于延长药物在体内的驻留时间，减少服药次数。
3.本发明具有较高的血药浓度和较长的半衰期，药物吸收快，生物利用度高，从而增加了药效，减少了毒副作用，为临床提供了更加安全、有效、作用持久的大豆苷元新剂型。
4.与其它给药途径相比，口服给药更加便于服用，提高患者用药顺应性。
附图说明
图1是模拟胃酸环境中的累积释放率曲线图。
图2是大鼠灌胃给药后的血浆药物浓度-时间曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细地说明。以下实施例中，大豆苷元，纯度≥98％通过市售途径购买。
实施例1
大豆苷元长循环脂质体冻干口服制剂，成分组成如下：
Figure BDA0001766531920000041
制备方法：
1)脂质体混悬液的制备：称取大豆苷元5g、蛋黄磷脂50g、胆固醇15g、DPPE-MPEG2000 5g，Kolliphor HS15 5g溶解到到5L甲醇-氯仿混合有机溶剂(7:1，v/v)中，将混合溶液在40℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂直至在容器内壁形成一层薄膜，继续旋蒸1h以除去残余有机溶剂，然后加入2000ml pH为8.5的PBS缓冲液，先在60℃条件下搅拌水化15min，随后在冰浴条件下超声(功率100W)20min，最后过微孔滤膜(0.45μm)整粒得到大豆苷元脂质体混悬液。
2)冻干剂的制备：向大豆苷元脂质体混悬液中加入冻干保护剂——甘露醇和乳糖(1:3，w/w)共20g，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻、干燥两个阶段，每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-35℃，保温6小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-6℃并保温6小时，再将物料温度升高到38℃，保温12小时。
冻干结束后即得大豆苷元长循环脂质体口服制剂，密封储存备用。
实施例2
大豆苷元长循环脂质体冻干口服制剂，成分组成如下：
Figure BDA0001766531920000042
Figure BDA0001766531920000051
制备方法：
1)脂质体混悬液的制备：称取大豆苷元5g、蛋黄磷脂30g、胆固醇20g、DPPE-MPEG2000 10g，Kolliphor HS15 2g溶解到到4L甲醇-氯仿混合有机溶剂(5:1，v/v)中，将混合溶液在50℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂直至在容器内壁形成一层薄膜，继续旋蒸以除去残余有机溶剂，然后加入1500ml pH为6.5的PBS缓冲液，先在40℃条件下搅拌水化30min，随后在冰浴条件下超声(功率300W)10min，最后过微孔滤膜(0.45μm)整粒得到大豆苷元脂质体混悬液。
2)冻干剂的制备：向大豆苷元脂质体混悬液中加入冻干保护剂——甘露醇和乳糖(1:2，w/w)共33g，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻、干燥两个阶段，每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-40℃，保温5小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-10℃并保温10小时，再将物料温度升高到30℃，保温15小时。
冻干结束后即得大豆苷元长循环脂质体口服制剂，密封储存备用。
实施例3
大豆苷元长循环脂质体冻干口服制剂，成分组成如下：
Figure BDA0001766531920000052
制备方法：
1)脂质体混悬液的制备：称取大豆苷元5g、蛋黄磷脂60g、胆固醇8g、DPPE-MPEG20002g，Kolliphor HS15 8g溶解到到6L甲醇-氯仿混合有机溶剂(10:1，v/v)中，将混合溶液在45℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂直至在容器内壁形成一层薄膜，继续旋蒸以除去残余有机溶剂，然后加入2500ml pH为9的PBS缓冲液，先在65℃条件下搅拌水化10min，随后在冰浴条件下超声(功率50W)30min，最后过微孔滤膜(0.45μm)整粒得到大豆苷元脂质体混悬液。
2)冻干剂的制备：向大豆苷元脂质体混悬液中加入冻干保护剂——甘露醇和乳糖(1:5，w/w)共17g，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻、干燥两个阶段，每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-20℃，保温10小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到0℃并保温5小时，再将物料温度升高到40℃，保温8小时。
实施例4
大豆苷元长循环脂质体冻干口服制剂，成分组成如下：
Figure BDA0001766531920000061
制备方法：
1)脂质体混悬液的制备：称取大豆苷元5g、蛋黄磷脂45g、胆固醇10g、DPPE-MPEG2000 8g，吐温80 4g溶解到到5.5L甲醇-氯仿混合有机溶剂(9:1，v/v)中，将混合溶液在55℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂直至在容器内壁形成一层薄膜，继续旋蒸以除去残余有机溶剂，然后加入2000ml pH为7.5的PBS缓冲液，先在60℃条件下搅拌水化10min，随后在冰浴条件下超声(功率100W)20min，最后过微孔滤膜(0.45μm)整粒得到大豆苷元脂质体混悬液。
2)冻干剂的制备：向大豆苷元脂质体混悬液中加入冻干保护剂——甘露醇和乳糖(1:1，w/w)共28g，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻、干燥两个阶段，每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-30℃，保温8小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-8℃并保温8小时，再将物料温度升高到35℃，保温10小时。
实施例5
大豆苷元长循环脂质体冻干口服制剂，成分组成如下：
Figure BDA0001766531920000071
制备方法：
1)脂质体混悬液的制备：称取大豆苷元5g、蛋黄磷脂40g、胆固醇5g、DPPE-MPEG200010g，聚氧乙烯蓖麻油6g溶解到到5L甲醇-氯仿混合有机溶剂(6:1，v/v)中，将混合溶液在50℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂直至在容器内壁形成一层薄膜，继续旋蒸以除去残余有机溶剂，然后加入1800ml pH为7的PBS缓冲液，先在45℃条件下搅拌水化25min，随后在冰浴条件下超声(功率200W)15min，最后过微孔滤膜(0.45μm)整粒得到大豆苷元脂质体混悬液。
2)冻干剂的制备：向大豆苷元脂质体混悬液中加入冻干保护剂——甘露醇和乳糖(1:4，w/w)共34g，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻、干燥两个阶段，每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-28℃，保温7小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-7℃并保温8小时，再将物料温度升高到33℃，保温12小时。
实施例6
大豆苷元长循环脂质体冻干口服制剂，成分组成如下：
Figure BDA0001766531920000072
制备方法：
1)脂质体混悬液的制备：称取大豆苷元5g、蛋黄磷脂50g、胆固醇15g、DPPE-MPEG2000 5g溶解到到5L甲醇-氯仿混合有机溶剂(7:1，v/v)中，将混合溶液在40℃条件下减压旋转蒸发除去有机溶剂直至在容器内壁形成一层薄膜，继续旋蒸1h以除去残余有机溶剂，然后加入2000ml pH为8.5的PBS缓冲液，先在60℃条件下搅拌水化15min，随后在冰浴条件下超声(功率100W)20min，最后过微孔滤膜(0.45μm)整粒得到大豆苷元脂质体混悬液。
2)冻干剂的制备：向大豆苷元脂质体混悬液中加入冻干保护剂——甘露醇和乳糖(1:3，w/w)共25g，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻、干燥两个阶段，每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-35℃，保温6小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-6℃并保温6小时，再将物料温度升高到38℃，保温12小时。
冻干结束后即得大豆苷元长循环脂质体口服制剂，密封储存备用。
试验例
1.包封率检测
采用透析法测定脂质体冻干制剂的包封率，即取1mL冻干剂复溶后的脂质体置于透析袋(截留分子量8000-14000)中，用20mL水作为透析介质，透析24h。按色谱条件：Phenomenex ODS色谱柱为(150mm×4.6mm，5μm)接保护柱(30mm×10mm，3μm)；以甲醇-水(含10mmol乙酸铵)为流动相；梯度洗脱，检测波长为240nm；柱温40℃；流速1mL/min；总运行时间6min；进样量10μL，测定透析介质中的大豆苷元浓度，并计算出包封率。结果见表1。
表1大豆苷元脂质体冻干剂的包封率检测结果
实施例 包封率(％)
实施例1 89.3
实施例2 81.4
实施例3 85.6
实施例4 72.4
实施例5 75.5
实施例6 43.2
通过以上试验结果可以看出，本发明制备的脂质体冻干制剂的包封率高达70％以上，最高可接近90％，处于同类产品较高水平。影响包封率的因素主要有原料配比、增溶剂种类、脂质体混悬液的工艺参数以及冻干工艺，其中最主要的因素是增溶剂，从表中的数据可以看出，实施例6由于没有加入增溶剂，包封率很低；以Kolliphor HS15为增溶剂，能够显著提高脂质体冻干制剂的包封率。
2.粒径分析及电位测定
将制备的脂质体冻干剂复溶，取样1ml，采用马尔文ZS90纳米激光粒度分析仪进行粒度分析及Zeta电位测定，样品重复测试3次，取均值。结果见表2。
表2大豆苷元脂质体粒径分布检测结果
试验例 粒径(nm) PDI
实施例1 156.5 0.229
实施例2 172.7 0.246
实施例3 163.6 0.239
实施例4 170.3 0.257
实施例5 173.3 0.262
实施例6 187.5 0.309
通过以上试验结果可以看出，本发明制备的脂质体冻干制剂具有较小的粒径和PDI分散指数，有利于提高药物的吸收和质量稳定性。
3.加速稳定性试验
各组样品置于40±2℃、相对湿度为75±5％条件下观察6个月，分别于1、2、3、6个月取样，检测产品的外观性状和复溶性，结果表明实施例1-5在6个月的加速试验观察期内产品性状稳定，没有结块、萎缩等现象发生，加水振摇后可立即完全溶解，没有可见异物与不溶性微粒。而实施例6的复溶时间较长，溶液澄清度较差，有少量异物与不溶性微粒，且随着时间延长，产品复溶效果有逐渐降低的趋势。
4.体外释放实验
采用透析法测定大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂的体外释放情况，透析介质为含0.5％的吐温80的0.1M HCl，pH为1.2，来模拟胃酸环境。取0.5mL的脂质体冻干剂加入截留量8000-14000的透析袋中，置于20mL的透析介质中，摇床恒温37℃，震荡速度100r·min-1。在1、2、4、6、12、24、48小时分别吸取1mL透析溶液，检测大豆苷元的含量并计算累积释放率，同等体积的新鲜释放介质补充到透析介质中。同时以大豆苷元1mg/ml的DMSO溶液作为对照，同样置于以上透析介质中，同法测定48小时内的累积释放率，结果见表3和图1。
表3大豆苷元脂质体冻干制剂的体外累积释放度
试验例 1 2 4 6 12 24 48
实施例1 9.8 13.4 27.9 43.7 58.4 88.2 89.1
实施例2 12.5 19.2 30.2 52.5 61.7 83.6 82.7
实施例3 18.7 28.4 39.8 63.6 86.4 88.1 87.2
实施例4 10.4 14.6 23.4 50.2 62.3 87.1 85.3
实施例5 22.3 39.4 46.8 58.6 77.1 79.6 80.3
实施例6 11.4 18.3 29.5 49.5 63.4 77.3 77.1
对照 86.4 85.7 85.1 86.3 88.2 87.5 93.3
从以上结果可以看出，对照由于没有进行脂质体包埋，因此大豆苷元的释放速度很快，1小时检测时就已经接近峰值，而实施例1、2、4、6都是在24小时达到累积释放度峰值，实施例3和5在12小时达到峰值，而且实施例1-6的累积释放度在达到峰值前都是呈缓慢增加的趋势。其中实施例1的增加幅度最平稳，没有突释现象发生，而且累积释放率相对较高。
因此，本发明制备的大豆苷元脂质体冻干制剂在体外具有缓释效果，药物能在体内缓慢释放出来，从而有利于延长药物在体内的驻留时间，减少服药次数。
5.体内药代动力学实验
10只雄性SD大鼠随机分成大豆苷元给药组(灌胃30mg/kg)与大豆苷元脂质体冻干剂给药组(灌胃30mg/kg)，每组5只。灌胃给药后，大豆苷元给药组于3、5、10、15、30、60、120、180、240、360、480、600、720、1440、2160min，大豆苷元脂质体给药组于3、5、10、15、30、60、120、180、240、360、480、600、720、1440、2160minmin，经眼底静脉丛取血约0.5mL，LC-MS/MS法检测大豆苷元。
大豆苷元的血浆药物浓度-时间曲线如图2所示，血药浓度数据运用DAS3.0软件(中国药理学会专业委员)以非房室模型进行拟合、统计矩法计算得到的药动学参数见表4。结果表明，与游离大豆苷元相比，等剂量大豆苷元脂质体与游离大豆苷元相比在大鼠体内的结果显示，等剂量大豆苷元脂质体在SD大鼠体内的AUC0-∞增大了2.5倍，有显著性差异(p<0.05)，表示大豆苷元长循环脂质体的生物利用度提高了2.5倍，药效变高。MRT0-t与t1/2分别延长了1.6倍和1.8倍，有显著性差异，表示大豆苷元在体内的驻留时间延长，应用于临床则可以减少服药次数。
表4大豆苷元脂质体冻干剂的药代动力学试验数据
参数 单位 游离组 脂质体组
AUC<sub>0-t</sub> ug/L*h 647.95±166.43* 1515.52±532.40
AUC<sub>0-∞</sub> ug/L*h 650.33±166.53* 1606.64±554.69
MRT<sub>0-t</sub> h 7.81±1.12* 12.51±2.63
t<sub>1/2z</sub> h 4.83±1.06* 8.70±3.342
T<sub>max</sub> h 0.20±0.045* 0.12±0.053
C<sub>max</sub> ug/L*h 316.39±87.76 355.05±38.96

Claims (8)

1.一种大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂，其特征在于由以下重量配比的成分组成：
Figure FDA0002486864390000011
所述增溶剂为15-羟基硬脂酸聚乙二醇酯或聚氧乙烯蓖麻油或吐温80。
2.如权利要求1所述的大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂，其特征在于由以下重量配比的成分组成：
Figure FDA0002486864390000012
3.如权利要求1所述的大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂，其特征在于：所述冻干保护剂由甘露醇和乳糖组成，其质量比为1:1-5。
4.一种制备权利要求1-3任何一项所述大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将大豆苷元、蛋黄磷脂、胆固醇、DPPE-MPEG2000、增溶剂溶解于有机溶剂，按照常规工艺制备大豆苷元脂质体混悬液；
2)向大豆苷元脂质体混悬液中加入冻干保护剂，进行冷冻干燥，所述冷冻干燥包括预冻、干燥两个阶段，每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-40～-20℃，保温5～10小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-10～0℃并保温5～10小时，再将物料温度升高到30～40℃，保温8～15小时。
5.如权利要求4所述大豆苷元长循环脂质体口服冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述大豆苷元脂质体混悬液的制备采用的是薄膜超声法，具体步骤如下：将大豆苷元、蛋黄磷脂、胆固醇、DPPE-MPEG2000，增溶剂溶解到有机溶剂中，将混合溶液旋蒸除去有机溶剂直至在容器内壁形成一层薄膜，继续旋蒸除去残余有机溶剂，然后加入pH为6-9的PBS缓冲液，先在40-70℃条件下搅拌10-30min，随后在冰浴条件下超声10-30min，最后过微孔滤膜整粒得到脂质体混悬液。
6.如权利要求5所述大豆苷元长循环脂质体口服制剂的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为体积比为5-10:1的甲醇-氯仿混合溶剂。
7.如权利要求5所述大豆苷元长循环脂质体口服制剂的制备方法，其特征在于：所述微孔滤膜的孔径为0.45μm。
8.如权利要求4所述大豆苷元长循环脂质体口服制剂的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥每个阶段的操作步骤如下：
预冻：先将物料温度迅速降至-35℃，保温6小时；
干燥：控制真空度在15帕以下，先将物料温度升高到-6℃并保温6小时，再将物料温度升高到38℃，保温12小时。
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