JP7079984B2 - エキソソームの凍結乾燥方法 - Google Patents

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Description

本発明は、エキソソームの凍結乾燥方法、エキソソームの凍結乾燥保護剤、及びエキソソームの凍結乾燥のための組成物に関する。
また、本発明は、凍結乾燥されたエキソソーム、又は凍結乾燥されたエキソソームと希釈剤とを含む組成物、及びその応用に関する。
凍結乾燥は、水分を含有する試料を凍結し、減圧下に置いて試料中の水分を昇華させて除去する乾燥法であり、植物や動物の細胞、組織、又は食品などの水を含む物質を長期間保存するために使用されている。
しかし、水を含む物質を凍結すると、凍結中に水の分子同士が氷の結晶（氷晶）を形成し、水を含む物質中での溶質や混入物の媒質が不均一に拡散される凍結濃縮が発生する。細胞内の凍結濃縮を防止するために、凍結保護剤であるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、アセトアミド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどを添加する方法が使用されている。凍結保護剤は、ガラス転移温度を高め、凍結過程で氷の結晶に起因する組織瓦解を防止し、組織の安定性を高める。
しかし、真核細胞の場合、凍結保護剤を使用しても、凍結乾燥時に細胞膜などの細胞構造の損傷なしに細胞を安定して保存するのが難しく、これにより細胞内の有効成分の機能を維持できなくなるという問題がある。
一方、最近、細胞分泌物（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）に細胞の行動（ｂｅｈａｖｉｏｒ）を調節する様々な生体活性因子が含まれているという研究が報告されており、特に細胞分泌物内には細胞間シグナル伝達機能を有する「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」が含まれており、その成分と機能に対する研究が活発に進められている。
細胞は、細胞外環境に様々な膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）タイプの小胞体を放出するが、通常、このような放出小胞体を細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）と呼んでいる。細胞外小胞は、細胞膜由来小胞体、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、シェディング小胞体（ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、エキソソーム等と呼ばれており、場合によっては、エキソソームとは区別されて用いられることもある。
エキソソームは細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートルの大きさの小胞体で内部にはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）などが含まれている。エキソソームカーゴには、広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体で、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。エキソソームは由来した細胞の性質及び状態に応じて特異的な遺伝物質と生体活性因子が含まれている。増殖する幹細胞由来のエキソソームの場合、細胞の移動、増殖及び分化のような細胞行動を調節し、組織再生に関する幹細胞の特性が反映されている（非特許文献１）。
つまり、細胞のアバターと呼ばれるエキソソームは、細胞と同様に成長因子のような生体活性因子が含まれているが、エキソソームを室温で保管する場合、生体活性因子の活性が低下する安定性の問題が発生する。また、エキソソームを単純冷蔵保管する場合にも保管時間及び方法などにより、全体的なエキソソームの物性及び安定性に変化が生じ、エキソソームに含まれる生体活性因子の活性も低下することがある。
しかし、エキソソームを利用した特定の疾患の治療に対する可能性提示など、様々な研究が行われているにもかかわらず、エキソソームを安定的に維持・保管することができる方法及び安定した剤形に関する応用技術の開発は、不十分な状況である。したがって、エキソソームとそれに含まれる生体活性因子を安定的に維持・保管することができる新たな方法と剤形の開発が必要である。
本発明者らは、エキソソームの凍結乾燥方法及びそのための凍結乾燥保護剤に対して鋭意研究を重ねていたところ、特定の糖類及びアミノ酸とともにエキソソームを特定の条件下で凍結乾燥すると、氷の結晶を形成することなく、多孔性のスポンジ形状を維持する性状に優れた凍結乾燥製品を得られることを確認して、本発明を完成した。
一方、前記した背景技術として説明された事項は、あくまで本発明の背景に対する理解を進めるためのものであり、本発明の「先行技術」として利用されうるという承認として引用したものではないことを理解すべきである。
Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００２（２）５６９－５７９ Ｖａｓｉｌｉｙ Ｓ． Ｃｈｅｒｎｙｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，"Ｓｉｚｅ ａｎｄ ｓｈａｐｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒａｔｅｄ ａｎｄ ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ"，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ， （２０１５） ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００２１６－０１５－８５３５－３
本発明の目的は、エキソソームの凍結乾燥方法、エキソソームの凍結乾燥保護剤、及びエキソソームの凍結乾燥のための組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、凍結乾燥されたエキソソーム、又は凍結乾燥されたエキソソームと希釈剤とを含む組成物、及びその応用を提供することにある。
しかし、前述したような本発明の課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が制限されるものではない。また、本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面によってより明確になる。
前記のような目的を達成するために、本発明は、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む凍結乾燥保護剤を用いて、エキソソームを凍結乾燥する方法を提供する。
本明細書において、用語「エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）」は、細胞膜の構造と同じ二重リン脂質膜からなる数十ないし数百ナノメートル（好ましくは約３０～２００ｎｍ）サイズの小胞体を意味する（ただし、分離対象となる細胞の種類、分離方法及び測定方法に従って、エキソソームの粒子サイズは可変でありうる）（非特許文献２）。エキソソームにはエキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）と呼ばれるタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）等が含まれている。エキソソームカーゴには広範囲のシグナル伝達要素（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）が含まれており、これらのシグナル伝達要素は、細胞タイプに特異的で分泌細胞の環境に応じて異なるように調節されることが知られている。エキソソームは細胞が分泌する細胞間のシグナル伝達媒体であり、これにより伝達された様々な細胞シグナルは、標的細胞の活性化、成長、移動、分化、脱分化、死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を含む細胞の行動を調節すると知られている。
本明細書において、用語、「生物学的溶液」は、生物起源の液体溶液としてエキソソームが分散、懸濁、沈殿、浮遊又は混合されている溶液を意味し、例えば、細胞培養液、細胞培養上清、幹細胞培養液、幹細胞培養上清、全血、血清、臍帯血、血漿、腹水液、脳及び脳脊髄液、胎盤抽出液、及び骨髄穿刺物等を挙げることができる。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、様々な動物、植物、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、菌類（ｆｕｎｇｉ）、藻類（ａｌｇａｅ）等、様々な生物起源の溶液を排除するものではないことは言うまでもない。「生物学的溶液」は、エキソソームを放出及び／又は分泌させる条件下で培養又はインキュベーションされてもよく、冷凍及び解凍されてもよい。
一方、本明細書で使用される「エキソソーム」という用語は、様々な動物、植物、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、菌類（ｆｕｎｇｉ）、藻類（ａｌｇａｅ）等の細胞から分泌され、細胞外空間に放出されたナノサイズのベシクル構造を有しており、エキソソームと類似の組成を有するベシクル（例えば、エキソソーム様ベシクル）もすべて含むことを意味する。
本発明を限定しない一つの例として、前記生物学的溶液は、幹細胞培養液であってもよい。前記幹細胞の種類は限定されないが、好ましくは、間葉系幹細胞、例えば脂肪、骨髄、臍帯又は臍帯血由来の幹細胞であってもよく、より好ましくは、脂肪由来幹細胞であってもよい。前記脂肪由来幹細胞の種類は、病原体による感染の危険性がなく、免疫拒否反応を起こさないものであれば制限されないが、好ましくはヒト脂肪由来幹細胞であってもよい。
しかし、本発明の凍結乾燥対象となるエキソソームは、前述したようなエキソソームに制限されるものではなく、当業界で使用されているか、今後使用されうる様々なエキソソームを使用できることは言うまでもない。したがって、後述する実施例の分離方法によって分離された幹細胞由来のエキソソームは、本発明に使用することができるエキソソームの一例として理解されるべきであり、本発明はこれに限定されるものではないことを明らかにしておく。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥保護剤は、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む。前記凍結乾燥保護剤は、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む水溶液の形態で使用することができる。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥保護剤において、前記水溶液中のメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの濃度は、それぞれ約５～１５ｍｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは約９ｍｇ／ｍＬであってもよい。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥のための組成物は、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む凍結乾燥保護剤と、エキソソームとを含む。前記凍結乾燥保護剤は、アスコルビン酸及びレチノールを含む水溶液に添加してもよい。前記水溶液は注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、又は脱イオン水であってもよい。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥のための組成物において、前記水溶液中のメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの濃度は、それぞれ約５～１５ｍｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは約９ｍｇ／ｍＬであってもよい。また、例えば、前記水溶液中のアスコルビン酸及びレチノールの濃度は、それぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬであってもよい。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥方法は、（ａ）エキソソームを準備するステップと、（ｂ）前記準備されたエキソソームをメチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む凍結乾燥保護剤で処理するステップと、（ｃ）前記凍結乾燥保護剤で処理されたエキソソームを凍結乾燥させるステップとを含む。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥方法において、前記（ｂ）ステップは、前記凍結乾燥保護剤と、前記エキソソームを混合することを特徴とする。前記凍結乾燥保護剤は、アスコルビン酸及びレチノールを含む水溶液に添加してもよい。前記水溶液は、注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、又は脱イオン水であってもよい。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥方法において、前記水溶液中のメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの濃度は、それぞれ約５～１５ｍｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは約９ｍｇ／ｍＬであってもよい。また、例えば、前記水溶液中のアスコルビン酸及びレチノールの濃度は、それぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬであってもよい。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥方法において、前記（ｃ）ステップは、大気圧状態で－５０℃で１０時間～１５時間の凍結、真空状態で－５０℃で５０時間～６０時間の１次乾燥、真空状態で－２０℃で１時間～３時間の２次乾燥した後、真空状態で１０℃で３０分～２時間の３次乾燥することを特徴とする。
本発明は、エキソソームと、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースとを有効成分として含むエキソソームの凍結乾燥製剤を提供する。例えば、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの重量比は、１：１：１である。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥製剤は、アスコルビン酸及びレチノールをさらに含有してもよい。例えば、メチオニン、マンニトール、トレハロース、アスコルビン酸及びレチノールの重量比は、９：９：９：０．５：０．５である。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥製剤は、希釈剤によって混合された溶液として使用することができる。例えば、前記希釈剤は、注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、又は脱イオン水であってもよい。また、前記希釈剤は、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）をさらに含むことができる。
本発明の一具体例のエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む組成物は、薬学組成物、化粧料組成物又は皮膚外用剤であってもよい。例えば、エキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む組成物は、注射剤として製造することができる。
本発明は、前述したように、凍結乾燥されたエキソソームと希釈剤を含むエキソソームの懸濁液を提供する。希釈剤としては、注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、脱イオン水、ヒアルロン酸、又はそれらの組み合わせなどを用いることができ、下記に例示されたものを含め、当業界で希釈剤として知られているものを用いることができる。
本発明の一具体例の凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物は、薬学組成物として製造することができる。本発明の一具体例の凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物が薬学組成物として製造される場合、本発明の一具体例による薬学組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。
本発明の一具体例の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤等を含むことができる。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱物油などを挙げることができ、これに限定されない。本発明の一具体例の薬学組成物は、通常の方法によって散剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、エマルジョン、シロップ、顆粒剤、エリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）、エアロゾルなどの経口投与用製剤、外用剤、坐剤、又は滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用することができる。
本発明の一具体例の薬学組成物の投与は、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記薬学組成物の投与経路は、薬物が目的の組織に到達することができる限り、あらゆる一般的な経路を通じて投与することができる。例えば、本発明の一具体例の薬学組成物は、経口又は非経口投与することができ、非経口投与には、経皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、動脈内投与、リンパ内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、局所投与、直腸内投与などを挙げことができる。しかし、これに制限されるものではなく、当業界で知られている様々な投与方法を排除しない。また、本発明の一具体例の薬学組成物は、活性物質が標的組織又は細胞に移動することができる任意の装置によって投与することができる。また、本発明の一具体例の薬学組成物の有効量は、治療効果を期待するために投与に要求される量を意味する。
本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、又は坐剤であってもよい。本発明の一具体例の薬学組成物の非経口投与用製剤は、注射剤として製造されてもよい。本発明の一具体例の注射剤は、水性注射剤、非水性注射剤、水性懸濁注射剤、非水性懸濁注射剤、もしくは溶解又は懸濁して使用する固形注射剤などであってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の一具体例の注射剤は、その種類に応じて注射用蒸留水、植物油（例えば、落花生油、ごま油、ツバキ油等）、モノグリセリド、ジグリセリド、プロピレングリコール、カンフル、安息香酸エストラジオール、次サリチル酸ビスマス、アルセノベンゾールナトリウム、又は硫酸ストレプトマイシンの少なくとも１種を含むことができ、選択的に安定剤や防腐剤を含むことができる。
本発明の一具体例の薬学組成物の配合比率は、前述のような追加成分の種類や量、形態などに応じて適当に選択することができる。例えば、注射剤全量に対して、本発明の薬学組成物は、約０．１～９９重量％、好ましくは約１０～９０重量％程度含まれてもよい。また、本発明の一具体例の薬学組成物の適切な投与量は、患者の疾患の種類、疾患の軽重、剤形の種類、製剤化方法、患者の年齢、性別、体重、健康状態、食餌、排泄率、投与時間及び投与方法によって調節することができる。例えば、成人に本発明の一具体例の薬学組成物を投与する場合、一日に０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの用量で１回～数回に分けて投与することができる。
また、本発明は、凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物を皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物に応用することに関するものである。本発明の一具体例の凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物が皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物として製造される場合、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧品や皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
また、本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物以外に、その作用（例えば、抗炎症、保湿効果など）を損なわない限度で、従来から使用された抗炎症剤及び／又は保湿剤をともに混合して使用することができる。例えば、本発明の凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物は、ハイドロゲル、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム等）、又はヒアルロン酸ゲルのうち少なくとも１種に担持又は混合されてもよい。本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物において、前記ハイドロゲルの種類は限定されないが、ゲル化ポリマーを多価アルコールに分散させて得られたハイドロゲルであることが好ましい。前記ゲル化ポリマーは、プルロニック（登録商標）、精製寒天、アガロース、ゲランガム、アルギン酸、カラギーナン、カシアガム、キサンタンガム、ガラクトマンナン、グルコマンナン、ペクチン、セルロース、グアーガム、及びローカストビーンガムからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよく、前記多価アルコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、イソブチレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、キシリトール、及びグリセリンからなる群から選ばれた少なくとも１種であってもよい。
本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、例えば、パッチ、マスクパック、シートマスク、クリーム、トニック、軟膏、懸濁液、乳濁液、ペースト、ローション、ゲル、オイル、パック、スプレー、エアゾール、ミスト、ファンデーション、パウダー、油紙などの様々な形態に適用することができる。例えば、前記皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、パッチ、マスクパック又はシートマスクの少なくとも一面に塗布又は浸漬することができる。
本発明の一具体例の皮膚外用剤が化粧料組成物として製造される場合、例えば、抗炎症、保湿等の目的で使用することができ、化粧品剤形は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形でも製造することができる。例えばパッチ、マスクパック、シートマスク、柔軟化粧水、栄養化粧水、収斂化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、アイクリーム、クレンジングクリーム、エッセンス、アイエッセンス、クレンジングローション、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、サンスクリーン、口紅、石鹸、シャンプー、界面活性剤含有クレンジング、入浴剤、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、ボディ洗浄剤、染毛剤、ヘアトニックなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。
本発明の一具体例の皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物は、皮膚外用剤及び／又は化粧品に通常的に用いられる成分を含み、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料のような通常の補助剤そして担体を含むことができる。また、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物に対するそれぞれの剤形において、他の成分は、皮膚外用剤及び／又は化粧料組成物の種類又は使用目的などによって、当業者が困難なく、適宜選定して配合することができる。
本発明により凍結乾燥されたエキソソームは、氷の結晶を形成することなく、多孔性のスポンジ形状を維持する良好な性状を示す。
また、本発明により凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物は、薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物への応用が可能である。例えば、本発明の凍結乾燥されたエキソソームは、希釈剤と簡単に混合した溶液として使用することができる。
一方、前述のような効果によって、本発明の範囲が制限されるものではない。
本発明の一具体例により得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、ＮＴＡ（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ）により得られた粒子サイズ分布と粒子数を示す。 本発明の一具体例により得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、ＴＥＭ（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）により撮影された粒子イメージの写真である。 本発明の一具体例により得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、本発明の一具体例により得られたエキソソームのポジティブマーカーに対するウエスタンブロットの結果を示す。 本発明の一具体例により得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、本発明の一具体例により得られたエキソソームのネガティブマーカーに対するウエスタンブロットの結果を示す。 本発明の一具体例により得られたエキソソームの物理的特性の分析結果を示したものであり、本発明の一具体例により得られたエキソソームに対するマーカー分析においてＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 本発明の一具体例の方法により凍結乾燥されたエキソソームの良好な性状を示す写真である。 凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。 凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。 凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。 凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。 凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。 凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。 凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせを異なるようにして凍結乾燥を行った後、凍結乾燥保護剤の成分の組み合わせ別に凍結乾燥エキソソームの性状を撮影した写真である。 マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製したエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ－１βの生成量がエキソソームの濃度依存的に減少することを示す。 マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製したエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ－６の生成量がエキソソームの濃度依存的に減少することを示す。 マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製したエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ－２７の生成量がエキソソームの濃度依存的に減少することを示す。 マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製したエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＦＮ－βの生成量がエキソソームの濃度依存的に減少することを示す。 マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例４－１で準備された幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ－１βの生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に顕著に減少することを示す。 マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例４－１で準備された幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ－６の生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に顕著に減少することを示す。 マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例４－１で準備された幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ－２７の生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に顕著に減少することを示す。 マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカインの分析結果を示したグラフであり、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに実施例４－１で準備された幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＦＮ－βの生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に顕著に減少することを示す。
以下、本発明を下記の実施例でより詳細に記述する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の権利範囲を制限したり限定するものではない。本発明の詳細な説明及び実施例から、本発明が属する技術分野の通常の技術者が容易に類推できることは本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明に引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。
明細書全体で、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは特に反対となる記載がない限り、他の構成要素を除外するのではなく、他の構成要素をさらに含みうることを意味する。
＜実施例１：細胞の培養＞
当該発明の属する技術分野で公知の細胞培養方法により、５％ＣＯ２、３７℃の条件で脂肪由来幹細胞を培養した。次に、リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）で洗浄した後、無血清、無フェノールレッド培地に交換して、１日～１０日間培養し、その上清（以下、培養液）を回収した。
エキソソームの分離過程で粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るために培養液にトレハロースを２重量％添加した。トレハロースを添加した後、培養液を０．２２μｍフィルタでろ過して細胞残骸物、老廃物及び巨大粒子等の不純物を除去した。ろ過された培養液は、すぐに分離過程を経てエキソソームを分離した。また、ろ過された培養液は、冷蔵庫（１０℃以下）で保管した後、エキソソーム分離に使用した。また、ろ過された培養液は、－６０℃以下の超低温冷凍庫で凍結保管してから解凍した後、エキソソームの分離を行った。その後、培養液からタンジェント流ろ過装置（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＴＦＦ）を用いて、エキソソームを分離した。
＜実施例２：ＴＦＦ法によるエキソソームの分離及び精製＞
実施例１で０．２２μｍフィルタでろ過された培養液からエキソソームを分離、濃縮、脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）をするためにＴＦＦ（Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法を使用した。ＴＦＦ法のためのフィルタとしては、カートリッジフィルタ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ｆｉｌｔｅｒ、別名ｈｏｌｌｏｗ ｆｉｂｅｒ ｆｉｌｔｅｒ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）、又はカセットフィルタ（ｃａｓｓｅｔｔｅ ｆｉｌｔｅｒ；Ｐａｌｌ又はＳａｒｔｏｒｉｕｓ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入）を使用した。ＴＦＦフィルタは、様々な分画分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ；ＭＷＣＯ）によって選択されてもよい。選択されたＭＷＣＯによって選別的にエキソソームを分離、濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい粒子やタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等は除去した。
エキソソームを分離、濃縮するためにＭＷＣＯ １００，０００Ｄａ（Ｄａｌｔｏｎ）、３００，０００Ｄａ、又は５００，０００ＤａのＴＦＦフィルタを使用した。培養液をＴＦＦ法を用いて１／１００～１／２５程度の体積になるまで濃縮し、ＭＷＣＯよりも小さい物質は除去してエキソソームを分離した。
分離、濃縮されたエキソソーム溶液はＴＦＦ法を用いて、さらに脱塩とバッファー交換（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。このとき、脱塩とバッファー交換は連続的に実行（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）又は断続的に実行（ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、開始体積（ｓｔａｒｔｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）に対して少なくとも４倍、好ましくは６倍～１０倍以上、より好ましくは１２倍以上の体積を有する緩衝溶液を用いて行った。緩衝溶液には、粒子サイズ分布が均一で純度の高いエキソソームを得るためにＰＢＳに溶かした２重量％のトレハロースを添加した。
＜実施例３：分離されたエキソソームの特性の分析＞
分離されたエキソソームは、ナノ粒子トラッキング解析（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｔｒａｃｋｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ：ＮＴＡ；Ｍａｌｖｅｒｎから購入）によって粒子の大きさと濃度を測定した。分離されたエキソソームの均一性と大きさは、透過型電子顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）を用いて分析した。本発明の一具体例の分離方法により分離されたエキソソームのＮＴＡ、ＴＥＭ分析の結果は、図１Ａ及び図１Ｂに示した。
図１Ｃは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームのポジティブマーカーに対するウエスタンブロットを行った結果であり、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１、Ａｌｉｘ及びＴＳＧ１０１マーカーの存在を確認した。各マーカーに対する抗体には、それぞれ抗ＣＤ６３、抗ＣＤ９、抗ＣＤ８１、抗Ａｌｉｘ及び抗ＴＳＧ１０１を使用した。
図１Ｄは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームのネガティブマーカーに対するウエスタンブロットを行った結果である。各マーカーに対する抗体には、それぞれ抗ＧＭ１３０及び抗カルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）を使用した。ＧＭ１３０及びカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）は、エキソソームの特性分析時にエキソソームに存在してはならないネガティブマーカーである。図１Ｄに示すように、ＧＭ１３０及びカルネキシン（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）は、脂肪幹細胞の破砕物には存在することが確認されたが、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームには存在しないことが確認された。したがって、図１Ｃ及び図１Ｄの結果を総合すると、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームは、ポジティブマーカー及びネガティブマーカーの特性分析を満足するエキソソームであることがわかる。
図１Ｅは、本発明の一具体例の分離方法によって分離されたエキソソームに対してフローサイトメトリーを用いて分析した結果としてＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１マーカーの存在を確認した。ＣＤ８１に対して陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）であるエキソソームを分離するためにエキソソームヒューマンＣＤ８１分離／検出キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）をメーカーの方法に従って使用し、ＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ９（ＰＥ－Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ９）（ＢＤから購入）、ＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ６３（ＰＥ－ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ６３）（ＢＤから購入）及びＰＥ―マウス抗ヒトＣＤ８１（ＰＥ－ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ８１）（ＢＤから購入）を使用してマーカーを染色した後、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
一方、本発明の凍結乾燥方法に使用されるエキソソームは、前述のような実施例のエキソソームに制限されるものではなく、当業界で使用されているか、今後使用されうる様々なエキソソームを使用できることは言うまでもない。前記実施例により分離されたエキソソームは、本発明の凍結乾燥方法に使用することができるエキソソームの一例として理解されるべきであり、本発明はこれに限定されるものではないことを明らかにしておく。
＜実施例４：エキソソームの凍結乾燥＞
＜実施例４－１：凍結乾燥条件＞
エキソソームの凍結乾燥のためにメチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む凍結乾燥保護剤を準備した。アスコルビン酸及びレチノールをそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬで含有している１ｍＬの水溶液［（株）バイオエフディエンシー（大韓民国全羅南道和順郡所在）で外注製作］に前記凍結乾燥保護剤を添加した水溶液を準備した。本実施例では、凍結乾燥保護剤をアスコルビン酸及びレチノールを含有している溶液に添加したが、注射用水、精製水、生理的食塩水、又は脱イオン水に凍結乾燥保護剤を添加して水溶液を準備することもできる。前記水溶液中のメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの濃度は、それぞれ９ｍｇ／ｍＬになるようにした。
凍結乾燥保護剤を含有した水溶液に、実施例２で準備されたエキソソーム（５×１０８粒子／ｍＬ）を混合した後、凍結乾燥装置（メーカー：ＶＩＲＴＩＳ、ＩＴＥＭ Ｎｏ．：３４４４２４）を用いて、下記の表１の条件で凍結乾燥を行った。凍結乾燥は、下記の表１の条件１、２、３、４、５、６、７、及び８の順で行った。
Figure 0007079984000001
メチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む凍結乾燥保護剤を処理してエキソソームを凍結乾燥した後、性状を確認した結果、色は乳白色であり、多孔性のスポンジ形状を維持する良好な性状を示すことが確認できた（図２）。すなわち、本発明のエキソソームの凍結乾燥方法では、減圧下での乾燥時間を長くして、凍結乾燥保護剤をメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせで構成することにより、優れた性状を示す凍結乾燥製品を得ることができる。
＜実施例４－２：凍結乾燥保護剤の成分による凍結乾燥エキソソームの性状比較＞
一方、メチオニン、マンニトール、及びトレハロース（以下、凍結乾燥保護剤成分という）のうちの少なくとも１種を含む、様々な凍結乾燥保護剤を使用してエキソソームを凍結乾燥した場合のエキソソームの性状を比較した。前記実施例４－１に記載された方法により凍結乾燥保護剤成分単独、２つの成分の組み合わせ、又は３つの成分の組み合わせを添加した７種類の水溶液を準備した。前記水溶液中で、各凍結乾燥保護剤成分の濃度は、９ｍｇ／ｍＬになるようにした。前記実施例４－１の凍結乾燥条件及び方法により、凍結乾燥保護剤成分の各組み合わせが含有された水溶液に、実施例２で準備されたエキソソーム（５×１０８粒子）を混合した後、凍結乾燥を行った。
凍結乾燥されたエキソソーム製品に対する外形性状を撮影して評価した（図３Ａ～図３Ｇ）。凍結乾燥されたエキソソーム製品のケーキ形状の良し悪しにより最も良いものは５点とし、最も悪いものは１点として外形性状を相対評価した。凍結乾燥保護剤成分の組み合わせ別に、凍結乾燥エキソソーム製品の性状を評価した結果を下記の表２に示す。
Figure 0007079984000002
図３Ａ～図３Ｇ及び前記表２で確認されるように、本発明のメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせで構成された凍結乾燥保護剤を使用してエキソソームを凍結乾燥した場合が、製品の外形性状が最も良好であり、前記３つの成分のうち１つ又は２つの成分が抜けた組み合わせで凍結乾燥したエキソソームは、製品の外形性状が本発明の場合よりも良くないことがわかった。
＜実施例５：炎症性サイトカインの生成減少効果の確認＞
マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞で実施例２の幹細胞由来のエキソソームと実施例４－１の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤の炎症性サイトカインの生成減少効果を次のように確認した。
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）培地に懸濁させた後、９６ウェルプレートに２．５×１０４細胞／ウェルの密度で接種し、実施例２で準備された幹細胞由来のエキソソーム（幹細胞培養液から分離・精製されたエキソソーム）を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。また、前述した幹細胞由来のエキソソーム処理方式と同じように、ＲＡＷ２６４．７細胞に実施例４－１の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤（５×１０９粒子／ｖｉａｌ）を培養培地と混合して希釈した水溶液を濃度別（ｍＬ当たりの粒子数基準）で処理した後、処理されたＲＡＷ２６４．７細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。一方、陽性対照群の物質としては、デキサメタゾンを使用した（図４～図１１にＤＥＸと表記される）。
そして、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａから購入）を処理し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養してＲＡＷ２６４．７細胞の活性化を誘導した。
培養が終わったＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を回収し、培養上清中のＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－２７及びＩＦＮ－βの生成量をＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘＴＭビードベースの免疫測定法（ｂｅａｄ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｎｎｏａｓｓａｙ）のマウス炎症パネル（ｍｏｕｓｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｐａｎｅｌ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入）及びノボサイトフローサイトメーター（ＮｏｖｏＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）（ＡＣＥＡから購入）を用いて測定して、抗炎症効果を確認した。
また、幹細胞由来のエキソソームと、本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤による細胞生存率の変化の測定と、それによるサイトカイン生成量補正のためにＭＴＴアッセイを行った。培養が終わったＲＡＷ２６４．７細胞の培養培地を０．５ｍｇ／ｍＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａから購入）を含むＤＭＥＭ培地に交換し、１時間培養した。その後、細胞培養プレートの底に形成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）が散らばらないように上清を除去し、ジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）（ＡＭＲＥＳＣＯから購入）に溶解させた後、５７０ｎｍで吸光度を測定して、細胞生存率を確認した。そして、それぞれのサイトカイン（ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－２７及びＩＦＮ－β）の生成量を細胞生存率に補正した。
図４～図７に示すように、マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカイン分析の結果、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに幹細胞由来のエキソソームを処理した場合、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－２７及びＩＦＮ－βの生成量が、幹細胞由来のエキソソームの濃度依存的に減少することが確認できた。また、図８～図１１に示されたように、マルチプレックスパネルを用いた炎症性サイトカイン分析の結果、ＲＡＷ２６４．７細胞に対してＬＰＳとともに、本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤を処理した場合にも、ＬＰＳによって誘導されるＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－２７及びＩＦＮ－βの生成量が凍結乾燥製剤の濃度依存的に著しく減少することが確認できた。
このような結果から、本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤は、有効成分として含有している幹細胞由来のエキソソームの抗炎症効能を安定して維持しており、凍結乾燥、保管及び流通過程で幹細胞由来のエキソソームの物性変化がないことがわかる。したがって、本発明の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤は、幹細胞由来のエキソソームを商業的に活用できるように安定化させることができる。
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく修正、変更をすることができ、このような修正と変更も本発明に属するものであることがわかるであろう。

Claims (16)

  1. メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせを含む、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥保護剤。
  2. メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせを含む凍結乾燥保護剤と、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームとを含む、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥のための組成物。
  3. 前記凍結乾燥保護剤は、アスコルビン酸及びレチノールを含む水溶液に添加されることを特徴とする、請求項２に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥のための組成物。
  4. （ａ）二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームを準備するステップと、
    （ｂ）前記準備されたエキソソームを、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせを含む凍結乾燥保護剤で処理するステップと、
    （ｃ）前記凍結乾燥保護剤で処理されたエキソソームを凍結乾燥させるステップとを含む、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥方法。
  5. 前記（ｂ）ステップは、前記凍結乾燥保護剤と、前記エキソソームとを混合することを特徴とする、請求項４に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥方法。
  6. 前記凍結乾燥保護剤は、アスコルビン酸及びレチノールを含む水溶液に添加されることを特徴とする、請求項５に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥方法。
  7. 前記（ｃ）ステップは、大気圧状態で－５０℃で１０時間～１５時間の凍結、真空状態で－５０℃で５０時間～６０時間の１次乾燥、真空状態で－２０℃で１時間～３時間の２次乾燥した後、真空状態で１０℃で３０分～２時間の３次乾燥することを特徴とする、請求項４～６のいずれか一項に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥方法。
  8. 二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームと、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせと、を有効成分として含む、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
  9. アスコルビン酸及びレチノールをさらに含有する、請求項８に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
  10. 希釈剤によって混合した溶液で使用される、請求項８に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
  11. 前記希釈剤は、注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、又は脱イオン水であることを特徴とする、請求項１０に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
  12. 前記希釈剤は、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩をさらに含む、請求項１１に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
  13. 請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む組成物を含む、薬学組成物。
  14. 注射剤であることを特徴とする、請求項１３に記載の薬学組成物。
  15. 請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む組成物を含む、化粧料組成物。
  16. 請求項８～１２のいずれか一項に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む組成物を含む、皮膚外用剤。
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