JP7079984B2 - エキソソームの凍結乾燥方法 - Google Patents
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Description
また、本発明は、凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物を皮膚外用剤及び/又は化粧料組成物に応用することに関するものである。本発明の一具体例の凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物が皮膚外用剤及び/又は化粧料組成物として製造される場合、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常、化粧品や皮膚外用剤に用いられる成分、例えば保湿剤、酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、乳化剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
また、本発明により凍結乾燥されたエキソソーム又はそれを含む組成物は、薬学組成物、皮膚外用剤及び化粧料組成物への応用が可能である。例えば、本発明の凍結乾燥されたエキソソームは、希釈剤と簡単に混合した溶液として使用することができる。
当該発明の属する技術分野で公知の細胞培養方法により、5%CO2、37℃の条件で脂肪由来幹細胞を培養した。次に、リン酸緩衝溶液(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientificから購入)で洗浄した後、無血清、無フェノールレッド培地に交換して、1日~10日間培養し、その上清(以下、培養液)を回収した。
<実施例2:TFF法によるエキソソームの分離及び精製>
実施例1で0.22μmフィルタでろ過された培養液からエキソソームを分離、濃縮、脱塩とバッファー交換(diafiltration)をするためにTFF(Tangential Flow Filtration)法を使用した。TFF法のためのフィルタとしては、カートリッジフィルタ(cartridge filter、別名hollow fiber filter;GE Healthcareから購入)、又はカセットフィルタ(cassette filter;Pall又はSartorius又はMerck Milliporeから購入)を使用した。TFFフィルタは、様々な分画分子量(molecular weight cutoff;MWCO)によって選択されてもよい。選択されたMWCOによって選別的にエキソソームを分離、濃縮し、MWCOよりも小さい粒子やタンパク質、脂質、核酸、低分子化合物等は除去した。
<実施例3:分離されたエキソソームの特性の分析>
分離されたエキソソームは、ナノ粒子トラッキング解析(nanoparticle tracking analysis:NTA;Malvernから購入)によって粒子の大きさと濃度を測定した。分離されたエキソソームの均一性と大きさは、透過型電子顕微鏡(transmitted electron microscopy:TEM)を用いて分析した。本発明の一具体例の分離方法により分離されたエキソソームのNTA、TEM分析の結果は、図1A及び図1Bに示した。
<実施例4:エキソソームの凍結乾燥>
<実施例4-1:凍結乾燥条件>
エキソソームの凍結乾燥のためにメチオニン、マンニトール、及びトレハロースを含む凍結乾燥保護剤を準備した。アスコルビン酸及びレチノールをそれぞれ0.5mg/mLで含有している1mLの水溶液[(株)バイオエフディエンシー(大韓民国全羅南道和順郡所在)で外注製作]に前記凍結乾燥保護剤を添加した水溶液を準備した。本実施例では、凍結乾燥保護剤をアスコルビン酸及びレチノールを含有している溶液に添加したが、注射用水、精製水、生理的食塩水、又は脱イオン水に凍結乾燥保護剤を添加して水溶液を準備することもできる。前記水溶液中のメチオニン、マンニトール、及びトレハロースの濃度は、それぞれ9mg/mLになるようにした。
<実施例4-2:凍結乾燥保護剤の成分による凍結乾燥エキソソームの性状比較>
一方、メチオニン、マンニトール、及びトレハロース(以下、凍結乾燥保護剤成分という)のうちの少なくとも1種を含む、様々な凍結乾燥保護剤を使用してエキソソームを凍結乾燥した場合のエキソソームの性状を比較した。前記実施例4-1に記載された方法により凍結乾燥保護剤成分単独、2つの成分の組み合わせ、又は3つの成分の組み合わせを添加した7種類の水溶液を準備した。前記水溶液中で、各凍結乾燥保護剤成分の濃度は、9mg/mLになるようにした。前記実施例4-1の凍結乾燥条件及び方法により、凍結乾燥保護剤成分の各組み合わせが含有された水溶液に、実施例2で準備されたエキソソーム(5×108粒子)を混合した後、凍結乾燥を行った。
<実施例5:炎症性サイトカインの生成減少効果の確認>
マウスマクロファージ細胞株であるRAW264.7細胞で実施例2の幹細胞由来のエキソソームと実施例4-1の幹細胞由来のエキソソームの凍結乾燥製剤の炎症性サイトカインの生成減少効果を次のように確認した。
Claims (16)
- メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせを含む、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥保護剤。
- メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせを含む凍結乾燥保護剤と、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームとを含む、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥のための組成物。
- 前記凍結乾燥保護剤は、アスコルビン酸及びレチノールを含む水溶液に添加されることを特徴とする、請求項2に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥のための組成物。
- (a)二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームを準備するステップと、
(b)前記準備されたエキソソームを、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせを含む凍結乾燥保護剤で処理するステップと、
(c)前記凍結乾燥保護剤で処理されたエキソソームを凍結乾燥させるステップとを含む、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥方法。 - 前記(b)ステップは、前記凍結乾燥保護剤と、前記エキソソームとを混合することを特徴とする、請求項4に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥方法。
- 前記凍結乾燥保護剤は、アスコルビン酸及びレチノールを含む水溶液に添加されることを特徴とする、請求項5に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥方法。
- 前記(c)ステップは、大気圧状態で-50℃で10時間~15時間の凍結、真空状態で-50℃で50時間~60時間の1次乾燥、真空状態で-20℃で1時間~3時間の2次乾燥した後、真空状態で10℃で30分~2時間の3次乾燥することを特徴とする、請求項4~6のいずれか一項に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥方法。
- 二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームと、メチオニン、マンニトール、及びトレハロースの組み合わせと、を有効成分として含む、二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
- アスコルビン酸及びレチノールをさらに含有する、請求項8に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
- 希釈剤によって混合した溶液で使用される、請求項8に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
- 前記希釈剤は、注射用水、生理的食塩水、リン酸緩衝溶液、精製水、又は脱イオン水であることを特徴とする、請求項10に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
- 前記希釈剤は、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸塩をさらに含む、請求項11に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤。
- 請求項8~12のいずれか一項に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む組成物を含む、薬学組成物。
- 注射剤であることを特徴とする、請求項13に記載の薬学組成物。
- 請求項8~12のいずれか一項に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む組成物を含む、化粧料組成物。
- 請求項8~12のいずれか一項に記載の二重リン脂質膜構造を有する細胞外小胞であるエキソソームの凍結乾燥製剤又はそれを含む組成物を含む、皮膚外用剤。
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