JP2012136518A - 黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）抗原の安定な免疫原性組成物 - Google Patents

黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）抗原の安定な免疫原性組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症に対するワクチンだけでなく、特に増強された抗原安定性を有するワクチンの提供。
【解決手段】（ａ）単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、５型莢膜多糖（ＣＰ５）−タンパク質のコンジュゲート、８型莢膜多糖（ＣＰ８）−タンパク質のコンジュゲート、および単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣポリペプチドからなる群から選択される少なくとも３つの構成要素、（ｂ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、ならびに（ｃ）充填剤を含み、前記ＣｌｆＡポリペプチドが、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる、凍結乾燥した免疫原性組成物。
【選択図】なし

Description
ヒトは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））の天然の貯蔵所である。健康な個体は、皮膚上、鼻腔および咽頭内の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に生着し、関連する疾患なしに持続的（１０〜３５％）、断続的（２０〜７５％）または非保菌状態（５〜７０％）であることができる。Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．、３７：３１３３〜３１４０（１９９９）を参照されたい。疾患は、手術中、留置カテーテルもしくは他の装置の留置中、外傷、または創傷などの免疫障壁の破壊が原因で個体が免疫無防備状態となった際に続いて起こる。生じる黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染は、緩和な皮膚感染症から心内膜炎、骨髄炎、菌血症、敗血症、および高い死亡率が付随する他の疾患形態の範囲の、広範囲の疾患を引き起こす可能性がある。大きなヒト貯蔵所は、進化の機会および適応した病原性クローン型の伝播を増強する。
グラム陽性球菌黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）からの侵襲性ブドウ球菌感染症は、世界中で増加している公衆衛生の問題であるため、特に懸念されている。具体的には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は病院で獲得した（院内の）感染症の大多数の原因であり、市中発症の感染症におけるその有病率は増加している。たとえば、侵襲性メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の発生率は１００，０００人あたり３１．８人であると推定され、これには米国における２００５年の１８，６５０件の死亡が含まれる。Ｋｌｅｖｅｎｓ Ｒ．Ｍ．ら、ＪＡＭＡ、２９８：１７６３〜７１（２００７）を参照。
ブドウ球菌性疾患は過去２０年間に劇的に増加しており、この増加は血管内装置および侵襲性手順の使用に平行している。疾患発生率の上昇は、抗生物質耐性の平行した上昇のためにより厄介となっており、したがって、ワクチン中で使用するため、またはブドウ球菌感染症および関連疾患を予防または処置する手段として受動免疫を与えるためにポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を誘発するための、免疫原性組成物の緊急の必要性が存在する。
クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）とは、ブドウ球菌とフィブリノーゲンおよび血小板との結合を媒介する、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞壁関連付着因子である。これは、細菌の細胞表面上で発現され、これは、ここで組織損傷部位に蓄積されるフィブリノーゲンおよびフィブリンと結合することによって病因を促進すると考えられている。ＣｌｆＡは十分に保存的であり、最も多様な形態（約８５％の同一性）でさえも、モノクローナルおよびポリクローナル抗体のどちらに対しても大規模な交差反応性を示す。したがって、ＣｌｆＡは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対するワクチンの構成要素の合理的な候補である。しかし、ＣｌｆＡの構造的な不安定性を考慮すると、ＣｌｆＡの配合物は、貯蔵中に時間と共に容易に分解される場合があるため、問題がある。
完全長ＣｌｆＡは、いくつかの領域およびドメイン、すなわち、Ｎ末端分泌ドメイン（「Ｓ」ドメイン）、次いで、３つのドメイン（Ｎ１、ＥＦ−ハンドモチーフを含有するＮ２、およびＮ３）を含有するリガンド結合Ａ領域、次いで、セリン−アスパラギン酸ジペプチド反復を含有するＲ領域、次いで、ＬＰＸＴＧモチーフを含有する細胞壁結合領域（「Ｗ」領域）、疎水性膜貫通ドメイン（「Ｍ」領域）、ならびに正荷電のアミノ酸を含有する帯電したＣ末端（「Ｃ」領域）を含む。Ｎ１領域はプロテアーゼ感受性部位を含有する。ＣｌｆＡの不安定性の多くは、Ｎ１でのＣｌｆＡのクリッピングに起因し、これはＮ１およびＮ２Ｎ３を含有する断片をもたらす。ＣｌｆＡの構造および機能は、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている米国特許出願公開第２００７００８７０１４Ａ１号（Ｐａｖｌｉａｋら、２００７年４月１９日）中に開示されている。
侵襲性疾患を引き起こすことができるブドウ球菌微生物は、一般に、細菌をカプセル封入し、宿主の生得的な免疫系によるクリアランスに対するその耐性を増強させる、莢膜多糖（ＣＰ）を生じることもできる。ＣＰは、細菌細胞を、細菌を貪食および細胞内死滅に耐性とする保護カプセル中に覆う役割を果たす。カプセルを欠く細菌は、貪食に対してより感受性がある。莢膜多糖はしばしば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびＢ群連鎖球菌を含めた多くの細菌病原体の重要な病原性因子である。
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のほとんどの臨床単離物は、５または８の血清型のどちらかでカプセル封入されている。５型（ＣＰ５）および８型（ＣＰ８）の莢膜多糖は、Ｎ−アセチルマンノサミンウロン酸、Ｎ−アセチルＬ−フコサミン、およびＮ−アセチルＤ−フコサミンからなる類似の三糖反復単位を有する。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、４５：９７〜９３（１９８４）およびＭｏｒｅａｕ，Ｍ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．、２０１：２８５〜２９７（１９９０）を参照されたい。同じ糖を有するが、糖連結およびＯ−アセチル化の部位が異なる２つのＣＰは、それぞれ血清学的に明確に異なる免疫反応性のパターンを生じる。
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質（タンパク質３０５、Ｐ３０５、Ｐ３０５Ａ、およびＯＲＦ３０５としても知られる）は、マンガンＡＢＣトランスポーターの構成要素である。このタンパク質はｉｎ ｖｉｖｏで発現される。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、マンガンを、好中球（ｎｅｕｔｒａｐｈｉｌ）中での黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の生存を増強させる酵素の補因子として使用する。したがって、ＭｎｔＣは、感染中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｉｎ ｖｉｖｏ生存に重要である。ＣｌｆＡと同様、このタンパク質も溶液中で不安定である。しかし、凝集または加水分解を介してクリッピングされることができるＣｌｆＡとは異なり、ＭｎｔＣ分解の主な機構は、塩基性のｐＨおよび／または室温（約２５℃）付近もしくはそれより高い温度に供された場合の脱アミド化である。
したがって、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症に対するワクチンだけでなく、特に増強された抗原安定性を有するワクチンの緊急の必要性が存在する。
本発明は、ブドウ球菌細菌から単離した少なくとも１つの抗原を含む、凍結乾燥または再構成した、複数抗原または複数構成要素の免疫原性組成物を対象とする。ポリペプチドおよび多糖である抗原は、とりわけ、当業者に知られている単離手順を用いて細菌から直接得られ得るか、もしくは合成プロトコルを用いて生成し得るか、もしくはやはり当業者に知られている遺伝子工学手順を用いて組換えにより産生させ得るか、または前述のものの任意の組合せによって得られ得る。特定の実施形態では、本発明の凍結乾燥または再構成した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）を含む。特定の実施形態では、本発明の凍結乾燥または再構成した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）、および単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質から選択される３つ以上の抗原を含む。さらに、本発明は、ブドウ球菌細菌に対する免疫応答を誘導する方法、ブドウ球菌細菌によって引き起こされる疾患を予防する、その重篤度を低下させる、もしくはその発症を遅延させる方法、およびブドウ球菌細菌の感染症によって引き起こされる疾患の少なくとも１つの症状を予防する、その重篤度を低下させる、もしくはその発症を遅延させる方法を提供する。
したがって、一実施形態では、本発明は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）を含む、凍結乾燥または再構成した免疫原性組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）を含む、凍結乾燥または再構成した免疫原性組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）を含む、凍結乾燥または再構成した免疫原性組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）を含む、凍結乾燥または再構成した免疫原性組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）を含む、凍結乾燥または再構成した免疫原性組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、（ａ）単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（「ＣｌｆＡ」）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（「ＣｌｆＢ」）ポリペプチド、５型莢膜多糖（ＣＰ５）−タンパク質のコンジュゲート、８型莢膜多糖（ＣＰ８）−タンパク質のコンジュゲート、および単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣポリペプチドからなる群から選択される少なくとも３つの構成要素、（ｂ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、ならびに（ｃ）充填剤を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。
一実施形態では、本発明は、（ａ）単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（「ＣｌｆＡ」）ポリペプチド、（ｂ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）−タンパク質のコンジュゲート、（ｃ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）−タンパク質のコンジュゲート、（ｄ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｅ）充填剤を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。
一実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物は、免疫原性組成物の全重量の３重量パーセント未満（％ｗ／ｗ）の水を含み、ＣｌｆＡポリペプチドは、０．０９％±０．０２７％〜０．８５％±０．２６％ｗ／ｗであり、ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲートは、０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗであり、ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲートは、０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗであり、緩衝液は、２．５４％±０．７６％ｗ／ｗである。
一実施形態では、本発明は、（ａ）ＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲート、（ｃ）ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、（ｄ）ヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０±０．５、（ｅ）スクロース、（ｆ）ポリソルベート８０、および（ｇ）水を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも３カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。
一実施形態では、本発明は、（ａ）０．０９％±０．０２７％〜０．８５％±０．２６％ｗ／ｗのＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗのＣＰ５−タンパク質のコンジュゲート、（ｃ）０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗのＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、（ｄ）２．５４％±０．７６％ｗ／ｗのヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０±０．５、（ｅ）９７％±２．０％ｗ／ｗのスクロース、（ｆ）０．２１％±０．０４％ｗ／ｗのポリソルベート８０、および（ｇ）２％±１％ｗ／ｗの水を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、本発明の凍結乾燥した免疫原性組成物を水性希釈剤中で再構成することによって製造された液体免疫原性三抗原組成物を提供し、前記再構成した組成物は、６．０±０．５の最終ｐＨを有する。
一実施形態では、本発明は、（ａ）４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度のＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ５−タンパク質のコンジュゲート、（ｃ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、（ｄ）１０ｍＭ±５ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液、（ｅ）０．１％±０．０５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｆ）９％±４．５％ｗ／ｖの濃度のスクロースを含む、本発明の凍結乾燥した免疫原性組成物を再構成することによって製造された液体免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
一実施形態では、本発明は、（ａ）再構成した凍結乾燥ＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲート、（ｃ）ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、（ｄ）ヒスチジン緩衝液、ｐＨ６．０±０．５、（ｅ）ポリソルベート８０、（ｆ）スクロース、および（ｇ）水性希釈剤を含む、液体免疫原性組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、（ａ）４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度の再構成した凍結乾燥ＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ５−タンパク質のコンジュゲート、（ｃ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、（ｄ）１０ｍＭ±５ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液、（ｅ）０．１％±０．０５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、（ｆ）９％±４．５％ｗ／ｖの濃度のスクロース、および（ｇ）水性希釈剤を含む、本発明の凍結乾燥した免疫原性組成物を再構成することによって製造された液体免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
一実施形態では、本発明は、（ａ）（ｉ）ＣｌｆＡポリペプチド、（ｉｉ）ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲート、（ｉｉｉ）ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、（ｉｖ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｖ）充填剤を含む水溶液を合わせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の組合せを凍結乾燥して、３重量パーセント未満の水を含むケークを形成するステップとを含む、免疫原性組成物を作製するプロセスを提供する。特定の実施形態では、このプロセスは、ステップ（ａ）で（ｖｉ）界面活性剤を合わせることをさらに含む。特定の実施形態では、このプロセスは、ステップ（ｂ）の凍結乾燥の前に、ステップ（ａ）の組合せを滅菌濾過するステップをさらに含む。特定の実施形態では、水溶液は、１０ｍＭ±１ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０±０．５、９％±４．５％ｗ／ｖのスクロースおよび０．１％±０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含む。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％ｗ／ｖの濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
特定の実施形態では、凍結乾燥ステップ（ｂ）は、（ｉ）滅菌したステップ（ａ）の組合せを、０．３℃±０．０３℃／分の速度で、−５０℃±５℃の温度に達するまで、４００ミリバール±４０ミリバールの圧力で凍結し、その後、組合せを−５０℃±５℃で６０分間±６分間保つステップと、（ｉｉ）温度を−１０℃±５℃まで０．３℃±０．０３℃／分の速度で増加させ、続いて、温度を−１０℃±５℃で１２０分間±１２分間保持し、次いで、温度を０．３℃±０．０３℃／分の速度で、−５０℃±５℃の温度に達するまで減少させ、温度を−５０℃±５℃で１８０分間±１８分間保つことによって、組合せを徐冷するステップと、（ｉｉｉ）圧力を５０ミリＴｏｒｒ（ｍＴｏｒｒ）まで減少させ、３０分間保持し、次いで、温度を−３０℃±５℃まで０．２℃±０．０２℃／分の速度で増加させ、続いて、温度を−３０℃±５℃で１，９２０分間±１９２分間保つことによって、組合せを乾燥させるステップと、（ｉｖ）温度を３０℃±５℃まで０．２℃±０．０２℃／分の速度で増加させ、圧力を２００ｍＴｏｒｒまで増加させ、続いて、温度を３０℃±５℃で７２０分間±７２分間保つことによって、組合せをさらに乾燥させるステップと、（ｖ）温度を５℃±５℃まで０．５℃±０．０５℃／分の速度で減少させるステップとを含む。一部の実施形態では、凍結乾燥はバイアル中で起こる。一部の実施形態では、バイアルを凍結乾燥後に共栓する。特定の実施形態では、バイアルを共栓する前に、バイアルを窒素ガスでバックフィルする。特定の実施形態では、このプロセスは、（ｃ）凍結乾燥したステップ（ｂ）の組合せを水性媒体中で再構成するステップをさらに含む。特定の実施形態では、再構成したステップ（ｃ）の組合せの重量モル浸透圧濃度は、２５０ｍＯｓＭ±２５ｍＯｓＭ〜３００ｍＯｓＭ±３０ｍＯｓＭである。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、本発明の免疫原性組成物を作製するための任意のプロセスに従って製造する。
一実施形態では、本発明は、（ａ）単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲート、ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、および単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣポリペプチドからなる群から選択される少なくとも４つの構成要素、（ｂ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、ならびに（ｃ）充填剤を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。
一実施形態では、本発明は、（ａ）単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、（ｂ）ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした５型莢膜多糖（ＣＰ５−ＣＲＭ１９７）、（ｃ）ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした８型莢膜多糖（ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）、（ｄ）単離したＭｎｔＣポリペプチド、（ｅ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｆ）充填剤を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。
一実施形態では、本発明は、免疫原性組成物の全重量の３重量パーセント未満（％ｗ／ｗ）の水を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供し、ＣｌｆＡポリペプチドは、０．０９％±０．０２７％〜０．８４％±０．２５％ｗ／ｗであり、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７は、０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗであり、ＣＰ８−ＣＲＭ１９７は、０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗであり、ＭｎｔＣは、０．０９％±０．０２７％〜０．８４％±０．２５％ｗ／ｗであり、緩衝液は、３．３％±０．９９％ｗ／ｗである。
一実施形態では、本発明は、（ａ）ＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｃ）ＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｄ）ＭｎｔＣポリペプチド、（ｅ）ヒスチジン緩衝液、（ｆ）スクロース、（ｇ）ポリソルベート８０、および（ｈ）水を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも３カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。
一実施形態では、本発明は、（ａ）０．０９％±０．０２７％〜０．８４％±０．２５％ｗ／ｗのＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗのＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｃ）０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗのＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｄ）０．０９％±０．０２７％〜０．８４％±０．２５％ｗ／ｗのＭｎｔＣポリペプチド、（ｅ）３．３％±０．９９％ｗ／ｗのヒスチジン緩衝液、（ｆ）９５％±２％ｗ／ｗのスクロース、（ｇ）０．２１％±０．０６３％ｗ／ｗのポリソルベート８０、および（ｈ）２％±１％ｗ／ｗの水を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも３カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。
一実施形態では、本発明は、本発明の凍結乾燥した免疫原性組成物を水性希釈剤中で再構成することによって製造された液体免疫原性四抗原組成物を提供し、前記再構成した組成物は、６．５±０．５の最終ｐＨを有する。
一実施形態では、本発明は、（ａ）４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度のＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｃ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｄ）４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度の単離したＭｎｔＣポリペプチド、（ｅ）１０ｍＭ±５ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液、（ｆ）０．０１％±０．００５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｇ）４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度のスクロースを含む、液体免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％ｗ／ｖの濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
一実施形態では、本発明は、（ａ）再構成した凍結乾燥ＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｃ）ＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｄ）ＭｎｔＣポリペプチド、（ｄ）ヒスチジン緩衝液、（ｅ）ポリソルベート８０、（ｆ）スクロース、および（ｇ）水性希釈剤を含む、液体免疫原性組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、（ａ）４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度の再構成した凍結乾燥ＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｃ）２０μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｄ）４０μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度の単離したＭｎｔＣポリペプチド、（ｅ）１０ｍＭ±５ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液、（ｆ）０．１％±０．０５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および（ｇ）９％±４．５％ｗ／ｖの濃度のスクロース、および（ｈ）水性希釈剤を含む、液体免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％ｗ／ｖの濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
一実施形態では、本発明は、（ａ）水溶液中で、（ｉ）ＣｌｆＡポリペプチド、（ｉｉ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｉｉｉ）ＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｉｖ）ＭｎｔＣポリペプチド、（ｖ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｖｉ）充填剤を合わせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の組合せを凍結乾燥して、３重量パーセント未満の水を含むケークを形成するステップとを含む、免疫原性組成物を作製するプロセスを提供する。特定の実施形態では、このプロセスは、ステップ（ａ）で（ｖｉ）界面活性剤を合わせることをさらに含む。特定の実施形態では、このプロセスは、ステップ（ｂ）の凍結乾燥の前に、ステップ（ａ）の組合せを滅菌濾過するステップをさらに含む。特定の実施形態では、水溶液は、１０ｍＭ±５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０±０．５、９％±１％ｗ／ｖのスクロースおよび０．１％±０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含む。他の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００１％ｗ／ｖの濃度であり、スクロースは、４．５％±０．４５％ｗ／ｖの濃度である。特定の実施形態では、凍結乾燥ステップ（ｂ）は、（ｉ）滅菌したステップ（ａ）の組合せを、０．３℃±０．０３℃／分の速度で、−５０℃±５℃の温度に達するまで、４００ミリバール±４０ミリバールの圧力で凍結し、その後、組合せを−５０℃±５℃で６０分間±６分間保つステップと、（ｉｉ）温度を−１０℃±５℃まで０．３℃±０．０３℃／分の速度で増加させ、その後、温度を−１０℃±５℃で１２０分間±１２分間保持し、その後、温度を０．３℃±０．０３℃／分の速度で、−５０℃±５℃の温度に達するまで減少させ、その後、温度を−５０℃±５℃で１８０分間±１８分間保つことによって、組合せを徐冷するステップと、（ｉｉｉ）圧力を５０ミリＴｏｒｒ（ｍＴｏｒｒ）まで減少させ、３０分間保持し、その後、温度を−３０℃±５℃まで０．２℃±０．０２℃／分の速度で増加させ、その後、温度を−３０℃±５℃で１，９２０分間±１９２分間保つことによって、組合せを乾燥させるステップと、（ｉｖ）温度を３０℃±５℃まで０．２℃±０．０２℃／分の速度で増加させ、その後、圧力を２００ｍＴｏｒｒまで増加させ、温度を３０℃±５℃で７２０分間±７２分間保つことによって、組合せを乾燥させるステップと、（ｖ）温度を５℃±５℃まで０．５℃±０．０５℃／分の速度で減少させるステップとを含む。一部の実施形態では、凍結乾燥はバイアル中で起こる。一部の実施形態では、バイアルを凍結乾燥後に共栓する。特定の実施形態では、バイアルを共栓する前に、バイアルを窒素ガスでバックフィルする。特定の実施形態では、このプロセスは、（ｃ）凍結乾燥したステップ（ｂ）の組合せを水性媒体中で再構成するステップをさらに含む。特定の実施形態では、再構成したステップ（ｃ）の組合せの重量モル浸透圧濃度は、２５０ｍＯｓＭ±２５ｍＯｓＭ〜３００ｍＯｓＭ±３０ｍＯｓＭである。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、本発明の免疫原性組成物を作製するための任意のプロセスに従って製造する。
一実施形態では、本発明は、（ａ）フィブリノーゲンドメインを含む単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、（ｂ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｃ）充填剤を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。一実施形態では、本発明は、免疫原性組成物の全重量の３重量パーセント未満（％ｗ／ｗ）の水を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供し、ＣｌｆＡポリペプチドは、０．５２パーセント±０．４６％ｗ／ｗであり、緩衝液は、０．２８％±０．０６５％ｗ／ｗである。特定の実施形態では、充填剤は、９７％±２．０％ｗ／ｗのスクロースである。
一実施形態では、本発明は、（ａ）０．５２％±０．４６％ｗ／ｗのＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）０．２８％±０．０６５％ｗ／ｗのコハク酸塩緩衝液、（ｃ）９７％±０．５７％ｗ／ｗのスクロース、（ｄ）０．２０％±０．０４２％ｗ／ｗのポリソルベート８０、および（ｅ）２．５％±０．５％ｗ／ｗの水を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物を提供する。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる。
一実施形態では、本発明は、本発明の凍結乾燥した免疫原性組成物を水性希釈剤中で再構成することによって製造された液体免疫原性ＣｌｆＡ組成物を提供し、前記再構成した組成物は、６．０±０．３の最終ｐＨを有する。
一実施形態では、本発明は、本発明の凍結乾燥した免疫原性組成物を水性希釈剤中で再構成することによって製造された液体免疫原性ＣｌｆＡ組成物を提供し、前記再構成した組成物は、６．５±０．３の最終ｐＨを有する。
一実施形態では、本発明は、（ａ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌの濃度のＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）１０ｍＭ±５ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｃ）０．１％±０．０５％重量対体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、および（ｄ）９％±４．５％ｗ／ｖの濃度のスクロースを含む、液体免疫原性組成物を提供する。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％ｗ／ｖの濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
一実施形態では、本発明は、（ａ）水溶液中で、（ｉ）組換えクランピング因子Ａ（ｒＣｌｆＡ）ポリペプチド、（ｉｉ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｉｉｉ）充填剤を合わせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の組合せを凍結乾燥して、３重量％未満の水を含むケークを形成するステップとを含む、免疫原性組成物を作製するプロセスを提供する。特定の実施形態では、このプロセスは、ステップ（ａ）で（ｖｉ）界面活性剤を合わせることをさらに含む。特定の実施形態では、このプロセスは、ステップ（ｂ）の凍結乾燥の前に、ステップ（ａ）の組合せを滅菌濾過するステップをさらに含む。特定の実施形態では、水溶液は、１０ｍＭ±１ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０±０．５、９％±１％ｗ／ｖのスクロースおよび０．１％±０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含む。他の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００１％ｗ／ｖの濃度であり、スクロースは、４．５％±０．４５％ｗ／ｖの濃度である。特定の実施形態では、凍結乾燥ステップ（ｂ）は、（ｉ）滅菌したステップ（ａ）の組合せを、０．３℃±０．０３℃／分の速度で、−５０℃±５℃の温度に達するまで、４００ミリバール±４０ミリバールの圧力で凍結し、その後、組合せを−５０℃±５℃で６０分間±６分間保つステップと、（ｉｉ）温度を−１０℃±５℃まで０．３℃±０．０３℃／分の速度で増加させ、その後、温度を−１０℃±５℃で１２０分間±１２分間保持し、その後、温度を０．３℃±０．０３℃／分の速度で、−５０℃±５℃の温度に達するまで減少させ、その後、温度を−５０℃±５℃で１８０分間±１８分間保つことによって、組合せを徐冷するステップと、（ｉｉｉ）圧力を５０ｍＴｏｒｒまで減少させ、温度を−２５℃±５℃まで０．２℃±０．０２℃／分の速度で増加させ、その後、温度を２５℃±５℃で１，３２０分間±１３２分間保つことによって、組合せを乾燥させるステップと、（ｉｖ）温度を３０℃±５℃まで０．２℃±０．０２℃／分の速度で増加させ、その後、圧力を２００ｍＴｏｒｒまで増加させ、温度を３０℃±５℃で７２０分間±７２分間保つことによって、組合せを乾燥させるステップと、（ｖ）温度を５℃±５℃まで０．５℃±０．０５℃／分の速度で減少させるステップとを含む。一部の実施形態では、凍結乾燥はバイアル中で起こる。一部の実施形態では、バイアルを凍結乾燥後に共栓する。特定の実施形態では、バイアルを共栓する前に、バイアルを窒素ガスでバックフィルする。特定の実施形態では、このプロセスは、（ｃ）凍結乾燥したステップ（ｂ）の組合せを水性媒体中で再構成するステップをさらに含む。特定の実施形態では、乾燥したステップ（ｂ）の組合せを水性媒体中で再構成することによる再構成したステップ（ｃ）の組合せの重量モル浸透圧濃度であり、再構成した組合せの重量モル浸透圧濃度は、３００ｍＯｓｍ±３０ｍＯｓｍである。特定の実施形態では、水性媒体は、（ａ）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、（ｂ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）−タンパク質のコンジュゲート、（ｃ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）−タンパク質のコンジュゲート、および（ｄ）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣポリペプチドからなる群から選択される少なくとも２つの構成要素を含む。特定の実施形態では、水溶液は、ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲートおよびＣＰ８−タンパク質のコンジュゲートを含む。特定の実施形態では、水溶液は、ＣＰ−５タンパク質のコンジュゲート、ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、およびＭｎｔＣポリペプチドを含む。特定の実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、本発明の免疫原性組成物を作製するための任意のプロセスに従って製造する。
特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、Ｎドメインを含む。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、Ｎ１、Ｎ２またはＮ３ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、Ｎ１、Ｎ２およびＮ３ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣｌｆＡポリペプチドは、フィブリノーゲン結合ドメインを含む。特定の実施形態では、フィブリノーゲン結合ドメインは、フィブリノーゲンとＣｌｆＡのネイティブフィブリノーゲン結合ドメインとの観察された結合と比較して低下したレベルでフィブリノーゲンと結合するように変更されている。特定の実施形態では、フィブリノーゲン結合ドメインは、Ｔｙｒ３３８、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｌｙｓ３８９、Ａｌａ２５４およびＩｌｅ３８７のうちの１つまたは複数でのアミノ酸置換を有することによって、フィブリノーゲンとの低下した結合を示す。特定の実施形態では、Ｔｙｒ３３８、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｌｙｓ３８９、Ａｌａ２５４およびＩｌｅ３８７のうちの１つまたは複数でのアミノ酸置換は、ＡｌａまたはＳｅｒへの置換である。特定の実施形態では、Ｔｙｒ３３８がＡｌａに置換されている。
特定の実施形態では、ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲートは、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７、ＣＰ５−ニューモリシン、またはＣＰ５−連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）である。特定の実施形態では、ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲートは、ＣＰ８−ＣＲＭ１９７、ＣＰ８−ニューモリシン、またはＣＰ８−連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）である。
特定の実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物の緩衝液は、ｐＨ６．０±０．３のコハク酸塩を含む。特定の実施形態では、緩衝液は、ｐＨ６．５±０．５のヒスチジンを含む。特定の実施形態では、緩衝液は、ｐＨ６．０±０．３のヒスチジンを含む。特定の実施形態では、充填剤は、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシンおよびソルビトールからなる群から選択される。特定の実施形態では、充填剤はスクロースである。特定の実施形態では、充填剤は、９６％±０．２％ｗ／ｗのスクロースである。特定の実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物は、界面活性剤をさらに含む。特定の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルからなる群から選択される。特定の実施形態では、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルはポリソルベート８０である。特定の実施形態では、ポリソルベート８０は、ＣｌｆＡおよび三抗原の配合物で０．２０％±０．０４１％ｗ／ｗである。特定の実施形態では、ポリソルベート８０は、四抗原配合物で０．１％±０．０５％ｗ／ｗである。他の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％ｗ／ｖの濃度である。
特定の実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。特定の実施形態では、アジュバントはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である。
特定の実施形態では、液体組成物の水性希釈剤は水である。特定の実施形態では、水性希釈剤は低塩溶液である。特定の実施形態では、低塩溶液は、６０ｍＭ±１０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。特定の実施形態では、水性希釈剤は、ポリソルベート８０を含む。特定の実施形態では、水性希釈剤は、アジュバントを含む。特定の実施形態では、アジュバントはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である。
組換えＣｌｆＡポリペプチドの様々な形態を示す模式図であり、配列番号１２５および１２７〜１２９を開示している。 様々な条件下における、凍結乾燥したＣｌｆＡタンパク質の様々なロットの濃度の経時的な変化を、その液体対応物と比較してｌｎ［Ｃ］として表す図である。パネルＡ：ロット番号Ｌ３６０５１−３７−１およびＬ３６０５１−４４。パネルＢ：ロット番号Ｌ３６０５１−７２。パネルＣ：ロット番号Ｌ３６０５１−８１−１。パネルＤ：ロット番号３６０５１−８１−２。 ２〜８℃、２５℃、および３７℃で３カ月間保管したケークと比較した、ｔ＝０での凍結乾燥したＤＳ Ｌ４０１８４−６１のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。 凍結乾燥した配合物を凍結乾燥前の液体ＣｌｆＡロットＬ３６０５１−８１−１と比較したサイズ排除クロマトグラムを示す図である。 様々な時間および温度の条件における、凍結乾燥したＣｌｆＡのｐＨ（パネルＡ）、パーセント水分（パネルＢ）および凝集の測度である光学密度（パネルＣ）のヒストグラムを示す図である。 室温で２４時間の攪拌後のＳＥ−ＨＰＬＣによって決定された、ＣｌｆＡのパーセント二量体（パネルＡ）、パーセント単量体（パネルＢ）、およびパーセント分解生成物（切断）（パネルＣ）ヒストグラムを示す図である。Ｘ軸は、様々な濃度のポリソルベート８０（０．０００、０．０１００、０．００５および０．１００％ｗ／ｗ）ならびにスクロース（３、４．５および６％ｗ／ｗ）を含有する配合物を示す。ＰＳ８０を含有しない配合物は、攪拌後にパーセント二量体形成の増加を示した（パネルＤ）。 様々な充填剤配合物の経時的なＳＥ−ＨＰＬＣによって決定された、ＣｌｆＡのパーセント分解生成物（切断）（パネルＡ）、パーセント二量体（パネルＢ）、およびパーセント単量体（パネルＣ）ヒストグラムを示す図である。 高用量の凍結乾燥したケークを再構成した後様々な時点での、ＣｌｆＡの純度（パネルＡ）、ＣＰ５の強度（抗原性）（パネルＢ）、およびＣＰ８の強度（抗原性）を示す図である。 低用量の凍結乾燥したケークを再構成した後の様々な時点での、ＣｌｆＡの純度（パネルＡ）、ＣＰ５の強度（抗原性）（パネルＢ）、およびＣＰ８の強度（抗原性）を示す図である。 室温で再構成の０、４および２４時間後での、ＣｌｆＡの濃度（パネルＡ）および純度パーセント（パネルＢ）ならびにＣＰ５およびＣＰ８の濃度（パネルＣ）を示す図である。 １、２および３回の凍結融解サイクル後の、ＣｌｆＡの濃度（パネルＡ）および純度パーセント（パネルＢ）ならびにＣＰ５およびＣＰ８の濃度（パネルＣ）を示す図である。 ｒＣｌｆＡの複数のロットのｐＨ６．０（パネルＡ）および７．０（パネルＢ）での円二色性（ＣＤ）走査を示す図である。 ｒＣｌｆＡの複数のロットのＣＤ融解をｐＨの関数として示す図である。 ｒＣｌｆＡｍおよびｒｍＣｌｆＡの固有のトリプトファン蛍光（パネルＡ）およびＡＮＳ蛍光（パネルＢ）融解をｐＨの関数として示す図である。 ｒＣｌｆＡｍおよびｒｍＣｌｆＡの示差走査熱量（ＤＳＣ）融解をｐＨの関数として示す図である。 ｒｍＣｌｆＡのＯＤ３５０融解をｐＨの関数として示す図である。 ６週間、２５℃でのｒｍＣｌｆＡのサイズ排除ＨＰＬＣをｐＨの関数として（パネルＡ）、ならびに液体ｒｍＣｌｆＡ配合物のｐＨおよびＯＤ３５０安定性（パネルＢ）を示す図である。 ＭｎｔＣの固有のトリプトファン蛍光融解（パネルＡ）およびＴｍ１の追跡（パネルＢ）を示す図である。 ＭｎｔＣのＤＳＣ融解からのＴｍ１の追跡をｐＨの関数として（パネルＡ）、ならびに２つの主な熱イベントの温度記録（パネルＢおよびＣ）を示す図である。 ＭｎｔＣのＯＤ３５０融解をｐＨの関数として示す図である。 安定性を監視するための、ｒｍＣｌｆＡ（パネルＡ）およびＭｎｔＣ（パネルＢ）のクロマトグラムを示す図である。 ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた５℃（パネルＡ）および２５℃（パネルＢ）でのｒｍＣｌｆＡ、ならびにＩＥＸ−ＨＰＬＣを用いた５℃（パネルＣ）および２５℃（パネルＤ）でのＭｎｔＣの安定性結果を示す図である。 ５℃および２５℃でのＣＰ５−ＣＲＭ１９７（それぞれパネルＡおよびＣ）ならびに５℃および２５℃でのＣＰ８−ＣＲＭ１９７（それぞれパネルＢおよびＤ）の、様々なｐＨでの比濁分析を用いた安定性結果を示す図である。 様々な充填剤を用いた遥動後の試料の重量モル浸透圧濃度（パネルＡ）およびＯＤ３５０（パネルＢ）の測定値を示す図である。 高用量（パネルＡ）および低用量（パネルＢ）の凍結乾燥した配合物のＲＰ−ＨＰＬＣデータを用いた充填剤の関数としての安定性試験、ならびにＭｎｔＣ品質のＩＥＸ−ＨＰＬＣデータ（パネルＣ）を示す図である。 ４つすべての抗原の攪拌後のデータを示す図である：抗原濃度（パネルＡはｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣ、パネルＢはＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７）、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度（パネルＢ）、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるＭｎｔＣの純度（パネルＣ）、ｐＨ（パネルＤ）ならびにＯＤ３５０（パネルＥ）。 ４つすべての抗原の凍結乾燥前および凍結乾燥後のデータを示す図である：ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣのＲＰ−ＨＰＬＣデータ（パネルＡ）、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７（パネルＢ）およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７（パネルＣ）の比濁分析結果、４．５％のスクロース（パネルＤ）および４％のマンニトール／１％のスクロース（パネルＥ）を用いたＭｎｔＣのＣＥＸ−ＨＰＬＣデータ、ＤＳＣデータ（パネルＦ）、ならびにｒｍＣｌｆＡ（パネルＧ）およびコンジュゲート（パネルＨ）のパーセント効力。 高および低用量の配合物の重量モル浸透圧濃度を示す図である。 ＭｎｔＣ（パネルＡ）およびｒｍＣｌｆＡ（パネルＢ）のＲＰ−ＨＰＬＣの純度データ、ＭｎｔＣのＩＥＸ−ＨＰＬＣの純度データ（パネルＣ）、ならびにＭｎｔＣ（パネルＤ）およびｒｍＣｌｆＡ分解（パネルＥ）の再構成後の動力学を示す図である。 再構成後の抗原濃度（パネルＡ〜Ｄ）およびｐＨ安定性（パネルＥ）を示す図である。 抗原濃度（パネルＡおよびＢ）ならびに純度（パネルＣおよびＤ）の、凍結乾燥プロセス後の回収率を示す図である。 再構成後のｒｍＣｌｆＡ（パネルＡ）およびＭｎｔＣの純度（パネルＢ）、ｒｍＣｌｆＡ（パネルＣ）およびＭｎｔＣの濃度（パネルＤ）、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７（パネルＥ）およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７（パネルＦ）の濃度、ならびにｐＨ安定性（パネルＧ）を示す図である。 凍結融解後の、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度（パネルＡ）、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるＭｎｔＣの純度（パネルＢ）、抗原の濃度（パネルＣおよびＤ）、ならびにｐＨ安定性（パネルＥ）を示す図である。 攪拌後の、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度（パネルＡ）、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるＭｎｔＣの純度（パネルＢ）、抗原の濃度（パネルＣおよびＤ）、ｐＨ（パネルＥ）、ならびにＯＤ３５０（パネルＦ）を示す図である。 ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で再構成したＭｎｔＣの、２４時間後にＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析した、２〜８℃（パネルＡ）および２５℃（パネルＢ）での分解、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析した、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で再構成したｒｍＣｌｆＡの純度（パネルＣおよびＤ）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で再構成したＭｎｔＣの、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した、２〜８℃（パネルＥ）および２５℃（パネルＦ）での純度、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いたＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの、２〜８℃（パネルＧ）および２５℃（パネルＨ）での濃度、ならびに、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いたｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの、２〜８℃（パネルＩ）および２５℃（パネルＪ）での濃度を示す図である。 再構成した配合物の、２〜８℃（パネルＡ）および２５℃（パネルＢ）での２４時間にわたるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の濃度、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の粒子径（パネルＣ）、ならびにｐＨ安定性（パネルＤ）を示す図である。 ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で再構成したＭｎｔＣの、４時間後にＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した純度（パネルＡ）および脱アミド化（パネルB）、ならびにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いた抗原濃度（パネルＣおよびＤ）を示す図である。 再構成した配合物の４時間にわたるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の粒子径（パネルＡ）およびｐＨ安定性（パネルＢ）を示す図である。 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＡのアラインメントを示す図である（出現順にそれぞれ配列番号６２、６４、６８、８４、７０、１０４、６６、７８、８６、８８、９０、７２、７４、７６、８０、９４、８２、９２、９６、９８、１００、１０２、１０６、および１０８）。 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＢのアラインメントを示す図である（出現順にそれぞれ配列番号２６、２８、３２、１８、５４、３４、３６、３０、１６、２０、２２、２４、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、および６０）。 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＭｎｔＣのアラインメントを示す図である（出現順にそれぞれ配列番号２、８、１０、４、６、１４および１２）。 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株からのＣｌｆＢ配列のチャートを示す図である。 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株からのＭｎｔＣ配列のチャートを示す図である。
本発明の方法および処置の方法論を記載する前に、方法および条件は変動し得るため、本発明は特定の方法および記載した実験条件に限定されないことを理解されたい。また、本明細書中で使用した専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しないことも理解されるであろう。
本明細書中に記載のものと類似または均等の、任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、以降、好ましい方法および材料を記載する。本明細書中で言及するすべての出版物は、その全体で参考として組み込まれている。
本明細書中で使用する用語は、当業者に認識および知られている意味を有するが、利便性および完全性のために、特定の用語およびその意味を以下に記載する。
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、内容により明らかにそうでないと指示される場合以外は、複数形への言及が含まれる。したがって、たとえば、「方法」への言及には、１つまたは複数の、方法、および／または本明細書中に記載の種類のステップ、および／または本開示を読んだ際に当業者に明らかとなるものなどが含まれる。
用語「約」または「およそ」とは、統計的に有意な値の範囲内を意味する。そのような範囲は、所与の値または範囲の一桁以内、典型的には２０％以内、より典型的にはさらに１０％以内、さらにより典型的には５％以内であることができる。用語「約」または「およそ」によって包含される、許容されるばらつきは、研究下にある特定の系に依存し、当業者は容易に理解できるであろう。本出願内で範囲を列挙する場合は必ず、その範囲内のすべての整数も本発明の一実施形態として企図される。
「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用する、内容によって別段に指定されない限りは、この用語には、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、操作した抗体（たとえば、キメラ、ヒト化および／またはエフェクター機能、安定性や他の生物活性を変更するために誘導体化したもの）、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、サメやラクダ科抗体を含めた単鎖（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体など、抗体部分、多価抗体、多特異性抗体（たとえば、所望の生物活性を示す限りは二重特異性抗体）および本明細書中に記載の抗体断片を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置も包含されることを意図する。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が含まれ、抗体は任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要な免疫グロブリンクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、たとえば、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２へとさらに分類し得る。様々な免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。様々な免疫グロブリンクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は周知である。
「抗体断片」とは、インタクトな抗体の一部分のみを含み、好ましくは、その一部分は、インタクトな抗体中に存在する場合にその部分と通常関連している機能の少なくとも１つ、好ましくはほとんどまたはすべてを保持している。
用語「抗原」とは、一般に、動物内に注射または吸収される組成物を含めた、同族抗体が選択的に結合することができる少なくとも１つのエピトープを含有する生体分子、通常はタンパク質、ペプチド、多糖、脂質またはコンジュゲート、または、一部の例では、動物において抗体の産生もしくはＴ細胞応答、または両方を刺激することができる免疫原性物質をいう。免疫応答は、分子全体、または分子の１つもしくは複数の様々な部分（たとえば、エピトープもしくはハプテン）に対して生じさせ得る。この用語は、抗原分子の個々の分子または同種もしくは異種の集団をいうために使用し得る。抗原は、抗体、Ｔ細胞受容体または特異的な液性および／もしくは細胞性免疫の他の要素によって認識される。用語「抗原」には、すべての関連する抗原性エピトープが含まれる。所与の抗原のエピトープは、当分野で周知の多数のエピトープマッピング技法を用いて同定することができる。たとえばＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい。たとえば、直鎖状エピトープは、たとえば、タンパク質分子の部分に対応する多数のペプチドを固体支持体上で同時合成し、ペプチドが支持体に付着されているままでペプチドを抗体と反応させることによって決定し得る。そのような技法は当分野で知られており、たとえば、すべてその全体で本明細書中に参考として組み込まれている、米国特許第４，７０８，８７１号、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３９９８〜４００２、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：７０９〜７１５に記載されている。同様に、コンホメーションエピトープは、たとえばＸ線結晶構造解析および二次元核磁気共鳴などによってアミノ酸の空間的コンホメーションを決定することによって同定し得る。たとえばＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、上記を参照されたい。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持している限りは、ネイティブ配列への欠失、付加および置換などの修飾（一般に保存的な性質であるが、非保存的であってもよい）が含まれるタンパク質をいうためにも使用し得る。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発、もしくは特定の合成手順、もしくは遺伝子工学手法によるものなどの意図的なものであってもよく、または、抗原を産生する宿主の突然変異によるものなどの偶発的なものであってもよい。さらに、抗原は、微生物、たとえば細菌に由来する、それから得る、もしくはそれから単離することができるか、または生物全体であることができる。同様に、核酸免疫化の応用におけるものなどの、抗原を発現するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドも、この定義に含まれる。また、合成抗原、たとえば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原も含まれる（Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：２７７７ ２７８１、Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７：３２４２ ３２４９、Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７５：４０２ ４０８、Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）１２ｔｈ Ｗｏｒｌｄ ＡＩＤＳ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、１９９８年６月２８日〜７月３日）。
用語「アジュバント」とは、本明細書中にさらに記載および例示する、抗原に対する免疫応答を増強させる化合物または混合物をいう。
「菌血症」とは、血液中における細菌の一過的な存在である。菌血症は敗血症（ｓｐｅｔｉｃｅｍｉａ）、または敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）に進行する場合があり、これは感染症とみなされ、臨床的徴候／症状が付随する血液中における細菌の持続的な存在である。すべての細菌が血液中で生存可能なわけではない。生存するものは、その能力をもたらす特別な遺伝形質を有する。また、宿主の因子も重要な役割を果たす。
「莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」または「莢膜多糖（ｃａｐｓｕｌｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは、ブドウ球菌のほとんどの単離物の細胞壁の外側にある多糖カプセルをいう。たとえば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）には、ペプチドグリカン複合体から構成される細胞壁構成要素が含まれ、これは、この生物が好ましくない浸透圧条件で生存することを可能にし、また、ペプチドグリカンと連結した独特なタイコ酸も含まれる。細胞壁の外側で、薄い多糖カプセルが黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のほとんどの単離物を被覆している。この血清学的に明確なカプセルは、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な単離物の血清型を決定するために使用することができる。臨床的に有意な単離物の多くには、２つの莢膜型、すなわち血清型５（ＣＰ５）および血清型８（ＣＰ８）が含まれることが示されている。
本明細書中で使用する「コンジュゲート」は、通常は所望の範囲である分子量の莢膜多糖および担体タンパク質を含み、莢膜多糖は担体タンパク質とコンジュゲートしている。コンジュゲートは、ある程度の量の遊離莢膜多糖を含有していても、していなくてもよい。本明細書中で使用する「遊離莢膜多糖」とは、コンジュゲートした莢膜多糖−担体タンパク質と非共有的に会合している（すなわち、非共有結合している、それに吸着しているまたはそれ内もしくはそれで捕捉されている）莢膜多糖をいう。用語「遊離莢膜多糖」、「遊離多糖」および「遊離糖」は、互換性があるように使用してよく、同じ意味を伝えることを意図する。担体分子の性質にかかわらず、これは、直接またはリンカーを介して莢膜多糖とコンジュゲートさせることができる。本明細書中で使用する「コンジュゲートさせる」、「コンジュゲートした」および「コンジュゲートする」とは、細菌莢膜多糖が担体分子と共有結合されるプロセスをいう。コンジュゲーションにより細菌莢膜多糖の免疫原性が増強される。コンジュゲーションは、以下に記載の方法に従って、または当分野で知られているプロセスによって行うことができる。
上述のように、本発明は、担体タンパク質とコンジュゲートした黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５の莢膜多糖（ＣＰ５）を含むコンジュゲート、および担体タンパク質とコンジュゲートした黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８の莢膜多糖（ＣＰ８）を含むコンジュゲートに関する。本発明の一実施形態は、担体タンパク質とコンジュゲートした黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型５の莢膜多糖および担体タンパク質とコンジュゲートした黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）血清型８の莢膜多糖を含むコンジュゲートを提供し、５型莢膜多糖は５０ｋＤａ〜８００ｋＤａの分子量を有しており、８型莢膜多糖は５０〜７００ｋＤａの分子量を有しており、免疫原性コンジュゲートは約１０００ｋＤａ〜約５０００ｋＤａの分子量を有しており、コンジュゲートは全多糖に対して約３０％未満の遊離多糖を含む。一実施形態では、コンジュゲートは、全多糖に対して約２５％未満、約２０％、約１５％、約１０％、または約５％の遊離多糖を含む。一実施形態では、５または８型の多糖は、約20ｋＤａ〜約１０００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約５００ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約２００ｋＤａ、および約７５ｋＤａ〜約１５０ｋＤａの分子量を有する。
一実施形態では、コンジュゲートは約５０ｋＤａ〜約５０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、コンジュゲートは約２００ｋＤａ〜約５０００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、免疫原性コンジュゲートは約４００ｋＤａ〜約２５００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、免疫原性コンジュゲートは約５００ｋＤａ〜約２５００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、免疫原性コンジュゲートは約６００ｋＤａ〜約２８００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、免疫原性コンジュゲートは約７００ｋＤａ〜約２７００ｋＤａの分子量を有する。一実施形態では、免疫原性コンジュゲートは、約１０００ｋＤａ〜約２０００ｋＤａ、約１８００ｋＤａ〜約２５００ｋＤａ、約１１００ｋＤａ〜約２２００ｋＤａ、約１９００ｋＤａ〜約２７００ｋＤａ、約１２００ｋＤａ〜約２４００ｋＤａ、約１７００ｋＤａ〜約２６００ｋＤａ、約１３００ｋＤａ〜約２６００ｋＤａ、約１６００ｋＤａ〜約３０００ｋＤａの分子量を有する。
したがって、一実施形態では、本発明の免疫原性コンジュゲート内の担体タンパク質はＣＲＭ１９７であり、ＣＲＭ１９７は、カルバミン酸結合、アミド結合、または両方を介して莢膜多糖と共有結合している。莢膜多糖とコンジュゲートされる担体タンパク質中のリシン残基の数は、コンジュゲートしたリシンの範囲として特徴づけることができる。たとえば、所与の免疫原性組成物中、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち５〜１５個の、莢膜多糖と共有結合したリシンを含み得る。このパラメータを表す別の方法は、１２％〜４０％のＣＲＭ１９７リシンが莢膜多糖と共有結合していることである。一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７と共有結合した多糖のＣＲＭ１９７部分は、５〜２５個の、多糖と共有結合したリシンを含む。一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７と共有結合した多糖のＣＲＭ１９７部分は、５〜２０個の、多糖と共有結合したリシンを含む。一部の実施形態では、担体タンパク質と共有結合した多糖のＣＲＭ１９７部分は、１０〜２５個の、多糖と共有結合したリシンを含む。一部の実施形態では、担体タンパク質と共有結合した多糖のＣＲＭ１９７部分は、８〜１５個の、多糖と共有結合したリシンを含む。たとえば、所与の免疫原性組成物中、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち１８〜２２個の、莢膜多糖と共有結合したリシンを含み得る。このパラメータを表す別の方法は、４０％〜６０％のＣＲＭ１９７リシンが莢膜多糖と共有結合していることである。一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち５〜１５個の、ＣＰ８と共有結合したリシンを含む。このパラメータを表す別の方法は、１２％〜４０％のＣＲＭ１９７リシンがＣＰ８と共有結合していることである。一部の実施形態では、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち１８〜２２個の、ＣＰ５と共有結合したリシンを含む。このパラメータを表す別の方法は、４０％〜６０％のＣＲＭ１９７リシンがＣＰ５と共有結合していることである。
上述のように、莢膜多糖とコンジュゲートした担体タンパク質中のリシン残基の数は、コンジュゲートしたリシンの範囲として特徴づけることができ、これはモル比として表し得る。たとえば、ＣＰ８免疫原性コンジュゲート中のコンジュゲートしたリシン対ＣＲＭ１９７のモル比は、約１８：１〜約２２：１であることができる。一実施形態では、ＣＰ８免疫原性コンジュゲート中のコンジュゲートしたリシン対ＣＲＭ１９７のモル比の範囲は、約１５：１〜約２５：１であることができる。一部の実施形態では、ＣＰ８免疫原性コンジュゲート中のコンジュゲートしたリシン対ＣＲＭ１９７のモル比の範囲は、約１４：１〜約２０：１、約１２：１〜約１８：１、約１０：１〜約１６：１、約８：１〜約１４：１、約６：１〜約１２：１、約４：１〜約１０：１、約２０：１〜約２６：１、約２２：１〜約２８：１、約２４：１〜約３０：１、約２６：１〜約３２：１、約２８：１〜約３４：１、約３０：１〜約３６：１、約５：１〜約１０：１、約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２０：１、または約１０：１〜約３０：１であることができる。また、ＣＰ５免疫原性コンジュゲート中のコンジュゲートしたリシン対ＣＲＭ１９７のモル比は、約３：１〜２５：１であることができる。一実施形態では、ＣＰ５免疫原性コンジュゲート中のコンジュゲートしたリシン対ＣＲＭ１９７のモル比の範囲は、約５：１〜約２０：１であることができる。一実施形態では、ＣＰ５免疫原性コンジュゲート中のコンジュゲートしたリシン対ＣＲＭ１９７のモル比の範囲は、約４：１〜約２０：１、約６：１〜約２０：１、約７：１〜約２０：１、約８：１〜約２０：１、約１０：１〜約２０：１、約１１：１〜約２０：１、約１２：１〜約２０：１、約１３：１〜約２０：１、約１４：１〜約２０：１、約１５：１〜約２０：１、約１６：１〜約２０：１、約１７：１〜約２０：１、約１８：１〜約２０：１、約５：１〜約１８：１、約７：１〜約１６：１、または約９：１〜約１４：１であることができる。
莢膜多糖とコンジュゲートした担体タンパク質中のリシン残基の数を表す別の方法は、コンジュゲートしたリシンの範囲としてである場合がある。たとえば、所与のＣＰ８免疫原性コンジュゲート中、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち５〜１５個の、莢膜多糖と共有結合したリシンを含み得る。あるいは、このパラメータをパーセンテージとして表すことができる。たとえば、所与のＣＰ８免疫原性コンジュゲート中、コンジュゲートしたリシンのパーセンテージは１０％〜５０％であることができる。一部の実施形態では、２０％〜５０％のリシンがＣＰ８と共有結合していることができる。あるいは、さらに、３０％〜５０％のＣＲＭ１９７リシンがＣＰ８と共有結合していることができ、１０％〜４０％のＣＲＭ１９７リシン、１０％〜３０％のＣＲＭ１９７リシン、２０％〜４０％のＣＲＭ１９７リシン、２５％〜４０％のＣＲＭ１９７リシン、３０％〜４０％のＣＲＭ１９７リシン、１０％〜３０％のＣＲＭ１９７リシン、１５％〜３０％のＣＲＭ１９７リシン、２０％〜３０％のＣＲＭ１９７リシン、２５％〜３０％のＣＲＭ１９７リシン、１０％〜１５％のＣＲＭ１９７リシン、または１０％〜１２％のＣＲＭ１９７リシンがＣＰ８と共有結合している。また、所与のＣＰ５免疫原性コンジュゲート中、ＣＲＭ１９７は、３９個のうち１８〜２２個の、莢膜多糖と共有結合したリシンを含み得る。あるいは、このパラメータをパーセンテージとして表すことができる。たとえば、所与のＣＰ５免疫原性コンジュゲート中、コンジュゲートしたリシンのパーセンテージは４０％〜６０％であることができる。一部の実施形態では、４０％〜６０％のリシンがＣＰ５と共有結合していることができる。あるいは、さらに、３０％〜５０％のＣＲＭ１９７リシンがＣＰ５と共有結合していることができ、２０％〜４０％のＣＲＭ１９７リシン、１０％〜３０％のＣＲＭ１９７リシン、５０％〜７０％のＣＲＭ１９７リシン、３５％〜６５％のＣＲＭ１９７リシン、３０％〜６０％のＣＲＭ１９７リシン、２５％〜５５％のＣＲＭ１９７リシン、２０％〜５０％のＣＲＭ１９７リシン、１５％〜４５％のＣＲＭ１９７リシン、１０％〜４０％のＣＲＭ１９７リシン、４０％〜７０％のＣＲＭ１９７リシン、または４５％〜７５％のＣＲＭ１９７リシンがＣＰ５と共有結合している。
莢膜多糖鎖と担体分子上のリシンとの付着の頻度が、莢膜多糖のコンジュゲートを特徴づけることための別のパラメータである。たとえば、一実施形態では、ＣＲＭ１９７と多糖との間の少なくとも１つの共有結合は、莢膜多糖の少なくとも５〜１０個の糖反復単位ごとに起こる。別の実施形態では、５〜１０個の糖反復単位ごと、莢膜多糖の２〜７個の糖反復単位ごと、３〜８個の糖反復単位ごと、４〜９個の糖反復単位ごと、６〜１１個の糖反復単位ごと、７〜１２個の糖反復単位ごと、８〜１３個の糖反復単位ごと、９〜１４個の糖反復単位ごと、１０〜１５個の糖反復単位ごと、２〜６個の糖反復単位ごと、３〜７個の糖反復単位ごと、４〜８個の糖反復単位ごと、６〜１０個の糖反復単位ごと、７〜１１個の糖反復単位ごと、８〜１２個の糖反復単位ごと、９〜１３個の糖反復単位ごと、１０〜１４個の糖反復単位ごと、１０〜２０個の糖反復単位ごと、５〜１０個の糖反復単位ごとに、ＣＲＭ１９７と莢膜多糖との間に少なくとも１つの共有結合が存在する。別の実施形態では、ＣＲＭ１９７と莢膜多糖との間の少なくとも１つの連結は、莢膜多糖の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の糖反復単位ごとに起こる。
多糖の化学的活性化および続く担体タンパク質とのコンジュゲーションは、慣用の手段によって達成し得る。たとえば、米国特許第４，６７３，５７４号および第４，９０２，５０６号を参照されたい。あるいは、他の活性化およびコンジュゲーションの方法を使用し得る。
本明細書中で使用する「担体タンパク質」または「タンパク質担体」とは、それに対する免疫応答が所望される抗原（莢膜多糖など）とコンジュゲートしていてもよい、任意のタンパク質分子をいう。多糖などの抗原と担体タンパク質とのコンジュゲーションは、抗原に免疫原性を与えることができる。担体タンパク質は、好ましくは、無毒性かつ非反応源性であり、十分な量および純度で得ることができるタンパク質である。担体タンパク質の例は、毒素、トキソイド、または、破傷風、ジフテリア、百日咳、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、および連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種からの毒素の任意の突然変異交差反応性材料（ＣＲＭ１９７）である。担体タンパク質は、標準のコンジュゲーション手順を受け入れられるものであるべきである。本発明の特定の実施形態では、ＣＲＭ１９７を担体タンパク質として使用する。
ＣＲＭ１９７（Ｗｙｅｔｈ／Ｐｆｉｚｅｒ、ノースカロライナ州Ｓａｎｆｏｒｄ）は、カザミノ酸および酵母抽出物に基づいた培地中で成長させたジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）Ｃ７株（β１９７）の培養物から単離したジフテリア毒素の、無毒性の変異体（すなわちトキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫安塩析、およびイオン交換クロマトグラフィーによって精製する。ＣＲＭ１９７タンパク質を産生するジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）Ｃ７株（１９７）の培養物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅに寄託されており、受託番号ＡＴＣＣ５３２８１が割り当てられている。また、他のジフテリアトキソイドも担体タンパク質としての使用に適している。
他の適切な担体タンパク質には、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（たとえば国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１号に記載）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＴ、および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からの外毒素Ａなどの、不活性化させた細菌毒素が含まれる。また、外膜タンパク質複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着因子タンパク質（ＰｓａＡ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のエンテロトキシン（毒素Ａ）および細胞毒素（毒素Ｂ）、またはインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄなどの、細菌外膜タンパク質、も使用することができる。また、連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）、卵白アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリン（ＰＰＤ）の精製したタンパク質誘導体などの他のタンパク質も、担体タンパク質として使用することができる。
莢膜多糖を担体タンパク質とコンジュゲーションさせた後、様々な技法によって多糖−タンパク質のコンジュゲートを精製する（多糖−タンパク質のコンジュゲートの量に関して濃縮する）。これらの技法には、たとえば、濃縮／ダイアフィルトレーション操作、沈降／溶出、カラムクロマトグラフィー、およびデプスフィルターが含まれる。以下の実施例を参照されたい。
個々のコンジュゲートを精製した後、これらを組み合わせて本発明の免疫原性組成物を配合してよく、これは、たとえばワクチン中で使用し得る。本発明の免疫原性組成物の配合は、当分野で認識されている方法を用いて達成することができる。
本開示中、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに付与された意味を有することができ、たとえば、これらは「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含められた（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含めた（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができることに注目されたい。そのような用語は、任意の他の成分を排除しない、特定の成分または成分の組の包含をいう。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語は、米国特許法においてそれらに付与された意味を有し、たとえば、本発明の新規または基本的な特徴を損ねずに追加の成分またはステップの包含を可能にする、すなわち、これらは本発明の新規または基本的な特徴を損ねる列挙していない追加の成分またはステップを排除し、また、特に本文書の目的は、特許性のある、たとえば、新規であり、自明でなく、従来技術、たとえば、本明細書中で引用したまたは本明細書中に参考として組み込まれている文書を超える進歩性がある実施形態を定義することであるため、これらは本明細書中で引用したまたは本明細書中に参考として組み込まれている当分野の文書などの従来技術の成分またはステップを排除する。また、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、米国特許法においてそれらに付与された意味を有する、すなわち、これらの用語は閉じている。したがって、これらの用語は、特定の成分または成分の組の包含およびすべての他の成分の排除をいう。
「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数を、類似の物理的および／または化学的特性を有する他のアミノ酸残基で置換することをいう。配列のアミノ酸を置換するものは、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。たとえば、無極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。芳香環構造を含有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）のアミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負荷電（酸性）のアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。そのような変更は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定される見かけの分子量、または等電点に影響を与えないと予想される。特に好ましい置換は、ＬｙｓでＡｒｇを置換およびその逆（正電荷が維持され得るように）、ＧｌｕでＡｓｐを置換およびその逆（負電荷が維持され得るように）、ＳｅｒでＴｈｒを置換（遊離−ＯＨを維持することができるように）、およびＧｌｎでＡｓｎを置換（遊離ＮＨ２を維持することができるように）である。
「断片」とは、より大きいタンパク質の特定のドメインのみが含まれるタンパク質をいう。たとえば、ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢタンパク質は、シグナル配列が含まれる場合はそれぞれ８個ものドメインを含有する。Ｎ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３、Ｎ１Ｎ２、Ｎ１、Ｎ２、またはＮ３ドメインに対応するポリペプチドは、それぞれＣｌｆＡまたはＣｌｆＢの断片であるとみなされる。また、「断片」とは、親タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも４個のアミノ酸残基（好ましくは、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも２５個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０個のアミノ酸残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基、少なくとも９０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも１２５個のアミノ酸残基、もしくは少なくとも１５０個のアミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチド、または、親核酸のヌクレオチド配列の少なくとも１０個の塩基対（好ましくは少なくとも２０個の塩基対、少なくとも３０個の塩基対、少なくとも４０個の塩基対、少なくとも５０個の塩基対、少なくとも５０個の塩基対、少なくとも１００個の塩基対、少なくとも２００個の塩基対）のヌクレオチド配列を含む核酸のどちらかもいう。
本明細書中で使用する抗体の「機能的活性」または「機能的抗体」とは、最低でも抗原と特異的に結合することができる抗体をいう。追加の機能が当分野で知られており、オプソニン化、ＡＤＣＣまたは補体媒介性細胞毒性によるものなどの病原体のクリアランスまたは死滅をもたらす、免疫系の追加の構成要素が含まれ得る。抗原結合後、任意の続く抗体機能は抗体のＦｃ領域を介して媒介されることができる。抗体オプソニン化貪食作用アッセイ（ＯＰＡ）とは、したがって生物学的プロセスを模倣する、エフェクター細胞（白血球）を用いた細菌のｉｎ ｖｉｔｒｏのＩｇ補体支援死滅を測定するように設計されたｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイである。また、抗体結合は、それが結合する抗原の生物学的機能を直接阻害する場合もあり、たとえば、ＣｌｆＡと結合する抗体はその酵素機能を中和することができる。一部の実施形態では、「機能的抗体」とは、動物有効性モデルまたは抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン化貪食作用死滅アッセイにおける細菌の死滅によって測定して、機能的である抗体をいう。
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物中での使用における検討事項である。たとえば、高分子量莢膜多糖は、抗原表面上に存在するより高いエピトープ結合価が原因で、特定の抗体免疫応答を誘導できる場合がある。「高分子量莢膜多糖」の単離が、本発明の組成物および方法における使用に企図される。たとえば、本発明の一実施形態では、約５０〜約８００ｋＤａの分子量の範囲の５型高分子量多糖の単離が企図される。本発明の一実施形態では、約２０〜約１０００ｋＤａの分子量の範囲の５型高分子量多糖の単離が企図される。本発明の一実施形態では、約５０〜約３００ｋＤａの分子量の範囲の大きさの５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、７０ｋＤａ〜３００ｋＤａの分子量の範囲の５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａの分子量の範囲の５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、９０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量の範囲の５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量の範囲の５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、８０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量の範囲の５型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。本発明の方法によって単離および精製することができる高分子量の血清型５の莢膜多糖の他の範囲には、約７０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１１０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１６０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１１０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１６０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１１０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１６０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１６０ｋＤａの分子量、および同様の所望の分子量範囲の、大きさの範囲が含まれる。
上述のように、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物中での使用における検討事項である。たとえば、高分子量莢膜多糖は、抗原表面上に存在するより高いエピトープ結合価が原因で、特定の抗体免疫応答を誘導できる場合がある。本発明の一実施形態では、約２０ｋＤａ〜約１０００ｋＤａの分子量の範囲の８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。本発明の一実施形態では、約５０ｋＤａ〜約７００ｋＤａの分子量の範囲の８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。本発明の一実施形態では、５０ｋＤａ〜３００ｋＤａの分子量の範囲の８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、７０ｋＤａ〜３００ｋＤａの分子量の範囲の８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、９０ｋＤａ〜２５０ｋＤａの分子量の範囲の８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、９０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量の範囲の８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、９０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量の範囲の８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。一実施形態では、８０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量の範囲の８型高分子量莢膜多糖の単離および精製が企図される。本発明の方法によって単離および精製することができる高分子量の血清型８の莢膜多糖の他の範囲には、約７０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１１０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量、７０ｋＤａ〜１６０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１１０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量、８０ｋＤａ〜１６０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１１０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量、９０ｋＤａ〜１６０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１２０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１３０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１４０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１５０ｋＤａの分子量、１００ｋＤａ〜１６０ｋＤａの分子量、および同様の所望の分子量範囲の、大きさの範囲が含まれる。
免疫原性組成物に対する「免疫応答」とは、対象における、対象組成物（たとえば、タンパク質または多糖などの抗原）中に存在する分子に対する液性および／または細胞媒介性免疫応答の発生である。本発明の目的のために、「液性免疫応答」とは、抗体媒介性免疫応答であり、本発明の免疫原性組成物中に存在する抗原に対して親和性を有する抗体の作製を含む一方で、「細胞媒介性免疫応答」とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球によって媒介されるものである。「細胞媒介性免疫応答」は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはクラスＩＩ分子と会合した抗原性エピトープの提示によって誘発される。これは、抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球細胞（「ＣＴＬ」）を活性化させる。ＣＴＬは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）またはＣＤ１によってコードされているタンパク質と会合して提示されるペプチドまたは脂質抗原に対して特異性を有し、細胞の表面上で発現される。ＣＴＬは誘導を助け、細胞内微生物の細胞内破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を促進する。細胞性免疫の別の側面は、ヘルパーＴ細胞による抗原に特異的な応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、その表面上の古典的または非古典的ＭＨＣ分子と会合したペプチド抗原を提示している細胞に対する、非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、その活性を集中させることを助けるように作用する。また、「細胞媒介性免疫応答」とは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含めた、活性化されたＴ細胞および／または他の白血球によって産生されるサイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の産生もいう。細胞媒介性免疫学的応答を刺激する、特定の抗原または組成物の能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイ、感作化した対象において抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイすること、または抗原を用いた再刺激に応答したＴ細胞によるサイトカイン産生を測定することなどの、いくつかのアッセイによって決定し得る。そのようなアッセイは当分野で周知である。たとえば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９、Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６を参照されたい。
用語「免疫原性」とは、液性もしくは細胞媒介性のどちらか、または両方の免疫応答を誘発する、抗原またはワクチンの能力をいう。
そのそれぞれを本明細書中で互換性があるように使用する「免疫原性量」、または「免疫学的に有効な量」または「用量」とは、一般に、当業者に知られている標準のアッセイによって測定された、細胞性（Ｔ細胞）もしくは液性（Ｂ細胞や抗体）応答のどちらか、または両方の免疫応答を誘発するために十分な、抗原または免疫原性組成物の量をいう。
組成物中の特定のコンジュゲートの量は、一般に、そのコンジュゲートについてコンジュゲートしたおよびコンジュゲートしていない全多糖に基づいて計算する。たとえば、２０％の遊離多糖を有するＣＰ５コンジュゲートは、１００ｍｃｇのＣＰ５多糖用量中に約８０ｍｃｇのコンジュゲートしたＣＰ５多糖および約２０ｍｃｇのコンジュゲートしていないＣＰ５多糖を有する。コンジュゲートの用量を計算する際、コンジュゲートへのタンパク質の寄与は、通常は考慮しない。コンジュゲートの量は、ブドウ球菌の血清型に応じて変化する場合がある。一般に、それぞれの用量は、０．０１〜１００ｍｃｇの多糖、詳細には０．１〜１０ｍｃｇ、より詳細には１〜１０ｍｃｇを含む。免疫原性組成物中の様々な多糖構成要素の「免疫原性量」は発散する場合があり、それぞれが、０．０１ｍｃｇ、０．１ｍｃｇ、０．２５ｍｃｇ、０．５ｍｃｇ、１ｍｃｇ、２ｍｃｇ、３ｍｃｇ、４ｍｃｇ、５ｍｃｇ、６ｍｃｇ、７ｍｃｇ、８ｍｃｇ、９ｍｃｇ、１０ｍｃｇ、１５ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇ、４０ｍｃｇ，５０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ、７０ｍｃｇ、８０ｍｃｇ、９０ｍｃｇ、または約１００ｍｃｇの任意の特定の多糖抗原を含み得る。
別の実施形態では、免疫原性組成物中のタンパク質構成要素の「免疫原性量」は、約１０ｍｃｇ〜約３００ｍｃｇのそれぞれのタンパク質抗原の範囲であり得る。特定の実施形態では、免疫原性組成物中のタンパク質構成要素の「免疫原性量」は、約２０ｍｃｇ〜約２００ｍｃｇのそれぞれのタンパク質抗原の範囲であり得る。免疫原性組成物中の様々なタンパク質構成要素の「免疫原性量」は発散する場合があり、それぞれが、１０ｍｃｇ、２０ｍｃｇ、３０ｍｃｇ、４０ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、６０ｍｃｇ、７０ｍｃｇ、８０ｍｃｇ、９０ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１２５ｍｃｇ、１５０ｍｃｇ、１７５ｍｃｇまたは約２００ｍｃｇの任意の特定のタンパク質抗原を含む。
免疫原としての抗原の有効性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニンアッセイおよび当分野で知られている多くの他のアッセイなどの免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、機能的抗体アッセイを用いて、血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによってＢ細胞活性のレベルを測定することによって、測定することができる。Ｔ細胞免疫原としての抗原の有効性の別の測度は、増殖アッセイ、その特異的な標的細胞を溶解するＴ細胞の能力を測定するための、クロム放出アッセイなどの細胞溶解性アッセイのいずれかによって測定することができる。さらに、本発明では、「免疫原性量」は、本明細書中に記載のように、抗原の投与後に誘導された抗原特異的抗体の血清レベルを測定することによって、または、そのように誘導された抗体の、特定の白血球のオプソニン化貪食作用能力を増強する能力を測定することによっても定義し得る。免疫応答の保護のレベルは、注射した抗原で免疫化された宿主を免疫誘発することによって測定し得る。たとえば、それに対する免疫応答が所望される抗原が細菌である場合、「免疫原性量」の抗原によって誘導された保護のレベルは、動物を細菌細胞で免疫誘発した後のパーセント生存率またはパーセント死亡率を検出することによって測定することができる。一実施形態では、保護の量は、細菌感染症に関連する少なくとも１つの症状、たとえば感染症に関連する発熱を測定することによって測定し得る。複数抗原または複数構成要素のワクチンまたは免疫原性組成物中の抗原のそれぞれの量は、他の構成要素のそれぞれに対して変動し、当業者に知られている方法によって決定することができる。そのような方法には、たとえば、免疫原性および／またはｉｎ ｖｉｖｏ有効性を測定するための手順が含まれるであろう。
用語「免疫原性組成物」とは、抗原、たとえば微生物、またはその構成要素を含有する任意の医薬組成物に関し、組成物は、対象において免疫応答を誘発するために使用することができる。本発明の免疫原性組成物は、全身性、経皮または粘膜の経路を介して免疫原性組成物を投与することによって、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症に感受性のあるヒトを処置するために使用することができる。これらの投与には、筋肉内（ｉ．ｍ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、皮内（ｉ．ｄ．）もしくは皮下の経路を介した注射、パッチもしくは他の経皮送達装置による塗布、または口道／消化管、気道もしくは尿生殖路への粘膜投与を介したものが含まれることができる。一実施形態では、鼻腔内投与は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の鼻咽頭保菌を処置または予防することで、感染をその最初期段階で減弱させるために使用する。一実施形態では、免疫原性組成物は、動物を受動的に保護または処置するために使用することができるワクチンの製造またはポリクローナルもしくはモノクローナル抗体の誘発において使用し得る。
特定の免疫原性組成物のための最適な量の構成要素は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準の研究によって確認することができる。最初のワクチン接種後、対象は、十分に間隔を空けた１回または複数回のブースター免疫化を受けることができる。
本発明の一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の凍結乾燥した免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、またはその組合せ）を含む。本発明のさらなる実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の凍結乾燥した免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）断片、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した５型莢膜多糖およびＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した８型莢膜多糖を含む。
本発明の免疫原性組成物は、液性および／または細胞媒介性免疫の上方制御または下方制御のどちらかが観察されるように、免疫系を撹乱または変更する薬剤である１つまたは複数の追加の「免疫調節物質」をさらに含むことができる。特定の一実施形態では、免疫系の液性および／または細胞媒介性の作用（ａｒｍ）の上方制御が好ましい。特定の免疫調節物質の例には、たとえば、アジュバントもしくはサイトカイン、またはとりわけ米国特許第５，２５４，３３９号に記載されているＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ、オーストラリアＰａｒｋｖｉｌｌｅ）が含まれる。本発明のワクチン中で使用することができるアジュバントの非限定的な例には、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．、モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの鉱物ゲル、水中油乳濁液、油中水乳濁液、たとえば、フロイント完全および不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）、ＳＡＦ−Ｍ （Ｃｈｉｒｏｎ、カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａまたは他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにＡｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチン中で有用な水中油乳濁液の非限定的な例には、改変ＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２配合物が含まれる。改変ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクワレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗剤（ＩＣＩ界面活性剤）、０．７％（ｖ／ｖ）のポリソルベート８０洗剤（ＩＣＩ界面活性剤）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、１００μｇ／ｍｌのコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含有する水中油乳濁液である。改変ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクワレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗剤、０．７％（ｖ／ｖ）のポリソルベート８０洗剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００μｇ／ｍｌのＱｕｉｌ Ａ、および５０μｇ／ｍｌのコレステロールを含む水中油乳濁液である。本発明の組成物中に含めることができる他の「免疫調節物質」には、たとえば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知のサイトカインもしくはケモカインが含まれる。一実施形態では、アジュバントは、それぞれ米国特許第６，１６５，９９５号および第６，６１０，３１０号に記載されているものなどのシクロデキストリン誘導体またはポリアニオンポリマーであり得る。使用する免疫調節物質および／またはアジュバントは、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与する対象、注射の経路、および与える注射の回数に依存することを理解されたい。
本発明のさらなる実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の凍結乾燥した免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）断片、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した５型莢膜多糖、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した８型莢膜多糖、および組換えＭｎｔＣタンパク質（ｒＰ３０５Ａとしても知られる）を含む。一部の実施形態では、ＭｎｔＣタンパク質は脂質付加されている。他の実施形態では、ＭｎｔＣタンパク質は脂質付加されていない。別の実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子（ＣｌｆＡ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、またはその組合せ）、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、またはその組合せ）、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した５型莢膜多糖およびＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した８型莢膜多糖の無菌的な配合物（液体、凍結乾燥、ＤＮＡワクチン、皮内調製物）である。
本発明の一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、またはその組合せ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質ＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した５型莢膜多糖およびＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した８型莢膜多糖を含む。一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子（ＣｌｆＡ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、またはその組合せ）、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、またはその組合せ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質ＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した５型莢膜多糖およびＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した８型莢膜多糖の無菌的な配合物（液体、凍結乾燥、ＤＮＡワクチン、皮内調製物）である。
本発明の一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、またはその組合せ）、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した５型莢膜多糖およびＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した８型莢膜多糖を含む。本発明の一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫原性組成物は、組換え黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）断片（Ｎ１Ｎ２Ｎ３、またはその組合せ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質ＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した５型莢膜多糖およびＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した８型莢膜多糖を含む。本発明の一実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫原性組成物は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質ＭｎｔＣ、ＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した５型莢膜多糖およびＣＲＭ１９７とコンジュゲートした単離した８型莢膜多糖を含む。
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）「侵襲性疾患」とは、正常では無菌的な部位からの細菌の単離であり、疾患の関連する臨床的徴候／症状が存在する。正常では無菌的な身体部位には、血液、ＣＳＦ、胸膜液、心膜液、腹膜液、関節／潤滑液、骨、身体内部部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎臓、膵臓、卵巣）、または他の正常では無菌的な部位が含まれる。侵襲性疾患を特徴づける臨床的状態には、菌血症、肺炎、蜂窩織炎、骨髄炎、心内膜炎、敗血症性ショックなどが含まれる。
用語「単離した」とは、その元の環境から取り出されていることを意味する（たとえば、天然に存在するものである場合は天然環境、もしくは組換え実体である場合はその宿主生物から、または１つの環境から異なる環境へと移されている）。たとえば、「単離した」莢膜多糖、タンパク質またはペプチドは、タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞物質もしくは他の汚染タンパク質を実質的に含まない、または、化学合成の場合に、もしくは化学反応の一部として他の様式で混合物中に存在する、化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。本発明では、タンパク質または多糖は、免疫原性組成物の製造に有用な形態で提供されるように、細菌細胞または細胞細片から単離し得る。用語「単離した」または「単離すること」には、たとえば、本明細書中に記載のタンパク質または莢膜多糖を精製する方法を含めた、精製することまたは精製が含まれ得る。言葉「細胞物質を実質的に含まない」には、ポリペプチド／タンパク質が、それを単離または組換えにより産生させた細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチド／タンパク質の調製物が含まれる。したがって、細胞物質を実質的に含まない莢膜多糖、タンパク質またはペプチドには、約３０％未満、２０％、１０％、５％、２．５％、または１％（乾重量で）の汚染タンパク質もしくは多糖または他の細胞物質しか有さない莢膜多糖、タンパク質またはペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチド／タンパク質を組換えにより産生させる場合も、培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満、１０％、または５％しか表さないことが好ましい。ポリペプチド／タンパク質または多糖を化学合成によって生成する場合、化合物前駆体または他の化合物を実質的に含まない、すなわち、タンパク質または多糖の合成に関与している化合物前駆体または他の化合物から分離されていることが好ましい。したがって、ポリペプチド／タンパク質または多糖のそのような調製物は、約３０％未満、２０％、１０％、５％（乾重量で）の化合物前駆体または対象のポリペプチド／タンパク質もしくは多糖断片以外の化合物しか有さない。
「非保存的アミノ酸置換」とは、上記定義した特徴を用いて、タンパク質のアミノ酸残基のうちの１つまたは複数を、類似でない物理的および／または化学的特性を有する他のアミノ酸残基で置換することをいう。
用語「薬学的に許容できる担体」とは、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めた動物で使用するために、連邦政府、州政府の規制機関、もしくは他の規制機関によって認可されている、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に記載されている担体を意味する。用語「担体」とは、医薬組成物を共に投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。そのような医薬担体は、石油、動物、植物または合成起源のものを含めた、水および油などの無菌的な液体であることができる。水、生理食塩水ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール溶液を、液体担体として、特に注射用液剤のために用いることができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。所望する場合は、組成物は、少量の湿潤剤、増量剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、持続放出配合物などの形態をとることができる。適切な医薬担体の例は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。配合物は投与様式に適しているべきである。
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、生成物の最小の長さに制限されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義内に含まれる。完全長タンパク質およびその断片はどちらもこの定義によって包含される。また、この用語には、好ましくは、タンパク質が、タンパク質を投与する動物内で免疫学的応答を誘発する能力を維持しているような、ネイティブ配列への欠失、付加および置換などの修飾（一般に保存的な性質であるが、非保存的であってもよい）も含まれる。また、発現後修飾、たとえば、グリコシル化、アセチル化、脂質化、リン酸化なども含まれる。
「保護」免疫応答とは、対象を感染症から保護する役割を果たす、液性または細胞媒介性のどちらかの免疫応答を誘発する免疫原性組成物の能力をいう。もたらされる保護は絶対的である必要はない、すなわち、感染症は、対照対象集団、たとえば、ワクチンまたは免疫原性組成物を投与していない感染した動物と比較して統計的に有意な改善が存在する場合は、完全に予防または根絶される必要はない。保護は、感染症の症状の発症の重篤度または迅速性の軽減に限定され得る。一般に、「保護免疫応答」には、それぞれの抗原に対する、一定レベルの測定可能な機能的抗体の応答を含めた、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的な抗体のレベルの増加の誘導が含まれるであろう。特定の状況では、「保護免疫応答」には、それぞれの抗原に対する、一定レベルの測定可能な機能的抗体の応答を含めた、対象の少なくとも５０％における特定の抗原に特異的な抗体のレベルの２倍の増加または抗体レベルの４倍の増加の誘導が含まれることができる。特定の実施形態では、オプソニン化抗体は保護免疫応答と相関する。したがって、保護免疫応答は、オプソニン化貪食作用アッセイ、たとえば以下に記載のものにおいて細菌数のパーセント減少を測定することによってアッセイし得る。好ましくは、少なくとも１０％、２５％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多い細菌数の減少が存在する。
本明細書中で使用する用語「組換え」とは、単純に、遺伝子工学方法によって生成された、任意のタンパク質、ポリペプチド、または、対象遺伝子を発現する細胞をいう。タンパク質またはポリペプチドに関して使用する用語「組換え」とは、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。本発明の免疫原性組成物中で使用するタンパク質は、たとえば、組換えＣｌｆＡ、組換えＣｌｆＢまたは組換えＭｎｔＣなど、天然源から単離するか、または遺伝子工学方法によって生成し得る。本明細書中で使用する「組換え」とは、さらに、その起源または操作により、それが天然で会合しているポリヌクレオチドの全部または一部分と会合していない核酸分子を説明する。宿主細胞に関して使用する用語「組換え」とは、それ内に組換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を意味する。
本明細書中で使用する組換えＣｌｆＡ（ｒＣｌｆＡ）および組換えＣｌｆＢ（ｒＣｌｆＢ）とは、本発明の免疫原性組成物中で使用するためのＣｌｆＡまたはＣｌｆＢの形態をいう。特定の実施形態では、ｒＣｌｆＡとは、Ｎドメインのうちの１つまたは複数、たとえば、Ｎ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３、Ｎ２またはＮ３を含むＣｌｆＡの断片であり、本明細書中で「組換えＣｌｆＡ」または「ｒＣｌｆＡ」と呼ぶ。一実施形態では、ｒＣｌｆＢとは、ＣｌｆＢのＮドメインのうちの１つまたは複数、たとえば、Ｎ１Ｎ２Ｎ３、Ｎ２Ｎ３、Ｎ２またはＮ３を含むＣｌｆＢの断片であり、本明細書中で「組換えＣｌｆＢ」または「ｒＣｌｆＢ」と呼ぶ。
用語「対象」とは、哺乳動物、鳥、魚、爬虫類、または任意の他の動物をいう。また、用語「対象」にはヒトも含まれる。また、用語「対象」には家庭のペットも含まれる。家庭のペットの非限定的な例には、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、モルモット、フェレット、鳥、ヘビ、トカゲ、魚、カメ、およびカエルが含まれる。また、用語「対象」には家畜動物も含まれる。家畜動物の非限定的な例には、アルパカ、バイソン、ラクダ、畜牛、鹿、ブタ、ウマ、ラマ、ラバ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、トナカイ、ヤク、ニワトリ、ガチョウ、およびシチメンチョウが含まれる。
本明細書中で使用する「処置」（その変形、たとえば「処置する」または「処置した」が含まれる）とは、以下のうちの任意の１つまたは複数をいう：（ｉ）伝統的なワクチンなどにおける、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の重篤度の低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原体または障害の実質的または完全な排除。したがって、処置は、予防的（感染前）または治療的（感染後）にもたらし得る。本発明では、予防的または治療的な処置を使用することができる。本発明の特定の実施形態によれば、宿主動物を、微生物感染（たとえばブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種などの細菌）に対して、予防的および／または治療的な免疫化を含めて処置するための、組成物および方法が提供される。本発明の方法は、対象に予防的および／または治療的免疫を与えるために有用である。また、本発明の方法は、生物医学的研究の応用のために、対象で実施することもできる。
互換性があるように使用する用語「ワクチン」または「ワクチン組成物」とは、動物において免疫応答を誘導する少なくとも１つの免疫原性組成物を含む医薬組成物をいう。
一般的な説明
本発明は、ブドウ球菌生物、たとえば黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からの抗原を含む、凍結乾燥した免疫原性組成物に関する。一部の実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物はＣｌｆＡを含む。一部の実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物は少なくとも３つの抗原を含む。一部の実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物は少なくとも４つの抗原を含む。抗原は、生化学的単離手順を用いて生物から単離し得るか、合成もしくは組換え手段によって生成し得る。抗原は、ポリペプチド、もしくは多糖、またはその組合せであり得る。これらの免疫原性組成物は、対象をブドウ球菌生物によって引き起こされる感染症に対して免疫化するためのワクチンの製造に使用し得る。これらの組成物中での使用に適した構成要素を、以下にさらに詳述する。
ブドウ球菌免疫原性組成物
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、表在性の皮膚感染症から肺炎、敗血症および心内膜炎などの生命を脅かす状態までの範囲の多様多種のヒト疾患の原因物質である。Ｌｏｗｙ、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３９：５８０〜５３２（１９９８）を参照されたい。侵襲性疾患の場合、血液、脳脊髄液ＣＳＦ、胸膜液、心膜液、腹膜液、関節／潤滑液、骨、身体内部部位（リンパ節、脳、心臓、肝臓、脾臓、硝子体液、腎臓、膵臓、卵巣）、または他の正常では無菌的な部位を含めた、正常では無菌的な身体部位から黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を単離することができる。これは、菌血症、肺炎、蜂窩織炎、骨髄炎、心内膜炎、および敗血症性ショックなどの、生命を脅かす臨床的状態をもたらす場合がある。成人、高齢者および小児患者が、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染症の危険性が最も高い。
本発明の実施形態は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、および単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質を含めた、凍結乾燥した免疫原性組成物中の選択された抗原または抗原を記載する。凍結乾燥した免疫原性組成物の一部の配合物を、ＣｌｆＡタンパク質の増加した安定性を実証するために試験した。凍結乾燥した免疫原性組成物の一部の配合物を、ＭｎｔＣタンパク質の安定性を実証するために試験した。また、凍結乾燥した組成物の一部の配合物を、ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲートおよびＣＰ８−タンパク質のコンジュゲートが凍結乾燥後に安定であったことを保証するためにも試験した。
したがって、１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチドを含む。１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖を含む。１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖を含む。１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖を含む。１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖を含む。１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖を含む。１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖を含む。１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質、担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５型莢膜多糖、および担体タンパク質とコンジュゲートした単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）８型莢膜多糖を含む。１つの凍結乾燥した免疫原性組成物は、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、および単離した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質を含む。
一部の実施形態では、上記組合せは、以下の抗原のうちの少なくとも１つをさらに含む：ＥｋｅＳ、ＤｓｑＡ、ＫｅｓＫ、ＫｒｋＮ、ＫｒｋＮ２、ＲｋａＳ、ＲｒｋＮ、ＫｎｋＡ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、Ｏｐｐ３ａ、ＤｌｔＤ、ＨｔｓＡ、ＬｔａＳ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳｒｔＡ、ＳｐＡ、Ｓｂｉ、アルファ−溶血素（ｈｌａ）、ベータ−溶血素、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）、フィブロネクチン結合タンパク質Ｂ（ｆｎｂＢ）、コアグラーゼ、Ｆｉｇ、ｍａｐ、パントン−バレンタインロイコシジン（ｐｖｌ）、アルファ−毒素およびその変異体、ガンマ−毒素（ｈｌｇ）および変異体、ｉｃａ、免疫優性ＡＢＣトランスポーター、Ｍｇ２＋トランスポーター、Ｎｉ ＡＢＣトランスポーター、ＲＡＰ、自己溶菌酵素、ラミニン受容体、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＩｓａＢ／ＰｉｓＢ、ＳＰＯＩＩＩＥ、ＳｓａＡ、ＥｂｐＳ、ＳａｓＡ、ＳａｓＦ、ＳａｓＨ、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、Ｎｐａｓｅ、ＥＢＰ、骨シアロ結合タンパク質ＩＩ、オーレオリシン前駆体（ＡＵＲ）／Ｓｅｐｐ１、Ｃｎａ、およびその断片、たとえばＭ５５、ＴＳＳＴ−１、ｍｅｃＡ、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ／ｄＰＮＡＧ）菌体外多糖、ＧｅｈＤ、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、ＨａｒＡ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ１、ならびに新規自己溶菌酵素。
アジュバント
また、特定の実施形態では、本明細書中に記載した凍結乾燥した免疫原性組成物は、１つまたは複数のアジュバントも含む。一部の実施形態では、アジュバントは、乾燥した凍結乾燥組成物の構成要素である。他の実施形態では、アジュバントは、組成物を患者に投与する前に、再構成した凍結乾燥組成物に加えることができる。アジュバントとは、免疫原または抗原と一緒に投与した場合に免疫応答を増強させる物質である。いくつかのサイトカインまたはリンホカインが免疫変調活性を有し、したがってアジュバントとして有用であることが示されており、それだけには限定されないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（たとえば米国特許第５，７２３，１２７号を参照）、１３、１４、１５、１６、１７や１８（およびその突然変異体）、インターフェロン−α、βおよびγ、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（たとえば、米国特許第５，０７８，９９６号およびＡＴＣＣ受託番号３９９００を参照）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ならびに腫瘍壊死因子αおよびβが含まれる。本明細書中に記載の免疫原性組成物で有用なさらに他のアジュバントには、それだけには限定されないがＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳを含めたケモカイン、接着分子、たとえばセレクチン、たとえば、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチン、ムチン様分子、たとえば、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１、インテグリンファミリーのメンバー、たとえば、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、たとえば、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ、たとえば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２やＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３、共刺激分子、たとえば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１、および血管内皮成長因子を含めた成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＤＲ６を含めた受容体分子、ならびにカスパーゼ（ＩＣＥ）が含まれる。
免疫応答を増強させるために使用する適切なアジュバントには、さらに、それだけには限定されないが、米国特許第４，９１２，０９４号に記載されているＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ、Ｃｏｒｉｘａ、モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）が含まれる。また、Ｃｏｒｉｘａ（モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ）から入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている合成脂質Ａ類似体もしくはアミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはその誘導体もしくは類似体も、アジュバントとしての使用に適している。１つのそのようなＡＧＰは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシ−テトラデカノイル−アミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシ−テトラデカノイル−アミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、これは５２９としても知られている（以前はＲＣ５２９として知られていた）。この５２９アジュバントは、水性形態（ＡＦ）または安定な乳濁液（ＳＥ）として配合される。
さらに他のアジュバントには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシ−ホスホリル−オキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などのムラミルペプチド、ＭＦ５９（米国特許第６，２９９，８８４号）（５％のスクワレン、０．５％のポリソルベート８０、および０．５％のＳＰＡＮ（商標）８５を含有し（様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有していてもよい）、モデル１１０Ｙ微小流動化装置（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、マサチューセッツ州Ｎｅｗｔｏｎ）などの微小流動化装置を用いてサブミクロンの粒子へと配合）、およびＳＡＦ（１０％のスクワレン、０．４％のポリソルベート８０、５％のｐｌｕｒｏｎｉｃ遮断ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、サブミクロンの乳濁液へと微小流動化するか、または渦攪拌してより大きな粒子径の乳濁液を作製）などの水中油乳濁液、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクワレン、Ｄ−ラクチド−ポリ乳酸／グリコシド、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、死滅させたボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、米国特許第５，０５７，５４０号に記載のＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、マサチューセッツ州Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）、米国特許第５，２５４，３３９号に記載のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）（ＣＳＬ Ｌｉｍｉｔｅｄ、オーストラリアＰａｒｋｖｉｌｌｅ）、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標））などのサポニン、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、細菌リポ多糖、ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（たとえば米国特許第６，２０７，６４６号）、欧州特許第１，２９６，７１３号および第１，３２６，６３４号に記載のＩＣ−３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ ＡＧ、オーストリアＶｉｅｎｎａ）、百日咳毒素（ＰＴ）もしくはその突然変異体、コレラ毒素もしくはその突然変異体（たとえば、米国特許第７，２８５，２８１号、第７，３３２，１７４号、第７，３６１，３５５号および第７，３８４，６４０号）、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の熱不安定な毒素（ＬＴ）もしくはその突然変異体、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２（たとえば、米国特許第６，１４９，９１９号、第７，１１５，７３０号および第７，２９１，５８８号）が含まれる。
一部の実施形態では、アジュバントはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である（たとえばＤａｖｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、２００４、１０１（２９）：１０６９７〜１０７０２を参照）。
候補抗原：
ＣｌｆＡ：ドメインの編成
クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）は、フィブリノーゲン結合部位を介した宿主基質タンパク質との結合に関連している黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）表面タンパク質である。ＣｌｆＡは、タンパク質が細胞表面と共有結合されることを可能にするカルボキシル末端ＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフを含有するタンパク質ファミリーのメンバーである。また、ＣｌｆＡは、フィブリノーゲン（ＣｌｆＡによって結合）、フィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎｂＡおよびＦｎｂＢ）、コラーゲン結合タンパク質（Ｃｎａ）などの宿主タンパク質との結合に関連している別のタンパク質ファミリー（微生物表面構成要素認識接着性基質分子、またはＭＳＣＲＡＭＭ）にも属する。これらのタンパク質はすべて、細胞表面への輸送を媒介するアミノ末端シグナル配列を共有している。また、ＭＳＣＲＡＭＭには、リガンド結合の活性部位を含有する機能的領域であるＡドメインも含まれる（たとえば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、ケラチン）。Ａドメインに次いで、ペプチドグリカン層にまたがると考えられているセリンアスパラギン酸の反復（ＳＤ反復）から構成される領域が存在する。ＳＤ反復に次いで、タンパク質とペプチドグリカンとの共有結合のためのＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフが含まれる膜貫通領域が存在する。ＣｌｆＡは、米国特許第６，００８，３４１号に記載されている。
ＡドメインのＮ１Ｎ２Ｎ３を含むＣｌｆＡのリガンド結合領域（図１）は、アミノ酸４０〜５５９にわたる。ＣｌｆＡのＮドメインは、以下のように割り当てられている：Ｎ１は残基４５〜２２０を包含し、Ｎ２は残基２２９〜３６９を包含し、Ｎ３は残基３７０〜５５９を包含する。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。参照を容易にするために、Ｎ１Ｎ２Ｎ３ドメインはＮ１２３と呼ぶ場合があり、同様に、Ｎ２Ｎ３はＮ２３と呼ぶ場合がある。組換えＮ１Ｎ２Ｎ３の調製物では、Ｎ１ドメインは、プロテアーゼ感受性であり、容易に切断または加水分解されてＮ２Ｎ３を安定なリガンド結合組換え断片として残すことが判明している。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。ＣｌｆＡのＡドメインのフィブリノーゲン結合Ｎ２Ｎ３断片の結晶構造により、Ｎ２およびＮ３がどちらも逆平行ベータ鎖によって支配されていることが明らかとなった。逆平行ベータ鎖に加えて、Ｎ２ドメインは１つの単巻きのアルファヘリックスおよび２つの３１０ヘリックスを含有し、Ｎ３ドメインは３つの３１０ヘリックスを含有する。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。Ｎ２およびＮ３の配列アラインメントでは、その全長にわたって１３％の配列同一性および３６％の配列類似度しかないことが明らかとなっている。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。Ｎ２およびＮ３ドメインのトポロジーは古典的なＩｇＧの折り畳みに類似しており、ＩｇＧの折り畳みの新規変異体であると提案されている。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。
本明細書中には、免疫原性組成物またはワクチンとして有用な、安定な黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（「ＣｌｆＡ」）ポリペプチドを含む組成物、およびその作製方法が開示されている。また、本明細書中には、免疫原性組成物またはワクチンとして有用な、安定なＣｌｆＡポリペプチド、ＣＰ５コンジュゲート、およびＣＰ８コンジュゲート（「三抗原」）を含む組成物、ならびにその作製方法も開示されている。さらに、本明細書中には、免疫原性組成物またはワクチンとして有用な、安定なＣｌｆＡポリペプチド、ＣＰ５コンジュゲート、ＣＰ８コンジュゲート、およびＭｎｔＣポリペプチド（「四抗原」）を含む組成物、ならびにその作製方法が開示されている。ＣｌｆＡは、Ｎ１とＮ２ドメインとの間のクリッピングを容易に受ける不安定なタンパク質であることが知られている。本出願は、ＣｌｆＡのＮ１Ｎ２Ｎ３が加速ストレス条件下で少なくとも３カ月間の間実質的に分解されずに保たれることを可能にするＣｌｆＡ配合物を対象とする。一部の実施形態では、配合物は、３パーセント未満の水を含む、凍結乾燥した組成物である。用語「凍結乾燥した組成物」とは、３％未満の水を有する配合物をいい、組成物を、組成物を作製した方法、たとえば、凍結乾燥もしくは混合物を乾燥させる任意の他の方法、または乾燥成分の配合に限定することを意味しない。加速ストレス条件とは、たとえば３７℃を数週間またはそれより長くなどの、一般に配合物の安定性を試験するために使用する、極限の温度、ｐＨおよび／またはイオン強度の条件を意味する。
したがって、一実施形態では、本出願は、実質的に分解されていないＣｌｆＡタンパク質および３パーセント未満の水を含む、安定な組成物を対象とする。一実施形態では、本出願は、実質的に分解されていないＣｌｆＡタンパク質、５型莢膜多糖（ＣＰ５）コンジュゲート、ＣＰ８コンジュゲート、および３パーセント未満の水を含む、安定な組成物を対象とする。一実施形態では、本出願は、実質的に分解されていないＣｌｆＡタンパク質、５型莢膜多糖（ＣＰ５）コンジュゲート、ＣＰ８コンジュゲート、ＭｎｔＣタンパク質、および３パーセント未満の水を含む、安定な組成物を対象とする。ＣｌｆＡタンパク質は、任意のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）株から単離することができるか、または組換えポリペプチドであることができる。組換えＣｌｆＡポリペプチドは、野生型配列を有し得るか、１つもしくは複数の突然変異を有し得るか、またはアミノ酸配列が野生型配列に対して少なくとも９０％同一であり得る。表１は、いくつかの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株ならびにそのそれぞれのＣｌｆＡのＤＮＡおよびタンパク質の配列を示す。
ＣｌｆＡ配列
ＣｌｆＡと命名されたクランピング因子タンパク質Ａの遺伝子は、クローニングされ、配列決定され、分子レベルで詳細に分析されている（ＭｃＤｅｖｉｔｔら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１１：２３７〜２４８（１９９４）、ＭｃＤｅｖｉｔｔら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１６：８９５〜９０７（１９９５））。１１１個の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）疾患を引き起こす単離物とＣｌｆＡのアミノ酸配列との配列の識別要素は、表１に示されている。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２３７株からの完全長（シグナル配列が含まれる）野生型ＣｌｆＡのアミノ酸配列は、配列番号１３０に示されている。この配列は位置３３８にチロシンを示し、これは、ＣｌｆＡの変異型ではアラニンに変化している。Ｎ１２３領域、反復領域およびアンカー領域を含む、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２３７株からの野生型ＣｌｆＡをコードしている完全長遺伝子は、配列番号１３１に示されている。ＣｌｆＡのＹ３３８Ａ変異型のアミノ酸配列は、配列番号１２３に示されている。しかし、野生型ＣｌｆＡにおいて配列番号１３０の位置３３８で起こり、Ｙ３３８Ａと命名されている、チロシンからアラニンへの変化は、ＣｌｆＡの変異型において、配列番号１２３中の位置３１０に示されていることに注目されたい。さらに、配列番号１２３のアミノ酸配列に示されているＣｌｆＡの変異型は、シグナル配列を有さないＣｌｆＡの成熟形態であり、したがって、配列番号１３０と配列番号１２３との間のこの突然変異の位置の相違を説明している。
一実施形態では、ＣｌｆＡタンパク質は、フィブリノーゲン結合を無効にするＹ３８８Ａ突然変異を含む、配列番号１２３の配列を含む。
一部の実施形態では、ＣｌｆＡタンパク質は完全長である必要はなく、アミノ酸５０〜５９７からなり得る（配列番号１３０に従って符番するが、任意のＣｌｆＡタンパク質に基づくことができる）。
一部の実施形態では、ＣｌｆＡタンパク質は、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、およびＮ３ドメインを含む、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＣｌｆＡタンパク質は、Ｎドメインを含む。Ｎドメインとは、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、またはＮ３ドメインを意味する。
ＣｌｆＡタンパク質、その作製および使用方法は、本明細書中にその全体で参考として組み込まれている、２００９年６月２２日に出願の同時係属特許出願である米国特許出願第６１／２１９，１３４号に記載されている。また、ＣｌｆＡタンパク質は、本明細書中にその全体で参考として組み込まれている国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３９５１０号にも記載されている。
安定とは、ＣｌｆＡが、加速または他のストレス条件下および貯蔵中などの長期間の間、実質的に分解されずに保たれることを意味する。実質的に分解されていないとは、ＣｌｆＡポリペプチドの全累積集団の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％または９９％が、Ｎ１配列ならびにＮ２および／またはＮ３の付加配列を含むポリペプチドを含有することを意味する。インタクトとは、ＣｌｆＡタンパク質が少なくともＮ１、Ｎ２、およびＮ３ドメインを含有することを意味する。一部の実施形態では、ＣｌｆＡは、少なくとも２週間、少なくとも１カ月間、または少なくとも３カ月間の間、３７℃で、安定に保たれる。
一部の実施形態では、本発明の凍結乾燥した組成物は、凍結乾燥した免疫原性組成物の全重量の１重量パーセント未満（１％［ｗ／ｗ］）の量の、インタクトなＣｌｆＡを含有する。一部の実施形態では、ＣｌｆＡは、０．０９％±０．０２７％〜０．８５％±０．２６％の量である。
ＣｌｆＢ：ドメインの編成
ＣｌｆＢは、フィブリノーゲン結合活性を有し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が血漿の存在下でクランプを形成することを始動する、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）タンパク質である。ＣｌｆＢはＭＳＣＲＡＭＭタンパク質であり、リガンド結合の活性部位を含有する機能的領域であるＡドメインを含めた、特徴的なＭＳＣＲＡＭＭドメインの編成を表示する（たとえば、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、ケラチン）。Ａドメインに次いで、ペプチドグリカン層にまたがると考えられているセリンアスパラギン酸の反復（ＳＤ反復）から構成される領域が存在する。ＳＤ反復に次いで、タンパク質とペプチドグリカンとの共有結合のためのＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフが含まれる膜貫通領域が存在する。ＣｌｆＢは、ＷＯ９９／２７１０９号および米国特許第６，６８０，１９５号に記載されている。
ＣｌｆＢのＮ末端Ａドメインの内部編成は、ＣｌｆＡ中に見つかる編成に非常に類似している。Ａドメインは、３つのサブドメイン、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３から構成される。ＡドメインのＮ１Ｎ２Ｎ３を含むＣｌｆＢのリガンド結合領域は、アミノ酸４４〜５８５にわたる。参照を容易にするために、Ｎ１Ｎ２Ｎ３ドメインはＮ１２３と呼ぶ場合があり、同様に、Ｎ２Ｎ３はＮ２３と呼ぶ場合がある。ＣｌｆＢのＮドメインは、以下のように割り当てられている：Ｎ１は残基４４〜１９７を包含し、Ｎ２は残基１９８〜３７５を包含し、Ｎ３は残基３７５〜５８５を包含する。ＣｌｆＡ中では、Ａドメインの結晶構造は免疫グロブリンの折り畳みの独特のバージョンを有することが判明したが、それから類推して、同じことがＣｌｆＢの場合にも推測され得る。Ｄｅｉｖａｎａｙａｇａｍら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２１：６６６０〜６６７２（２００２）を参照されたい。ＣｌｆＢおよびＣｌｆＡのＡドメインの編成は類似しているが、配列同一性は２６％しかない。Ｎｉ Ｅｉｄｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３０：２４５〜２５７（２００２）を参照されたい。
ＣｌｆＢ配列
ＣｌｆＢをコードしている遺伝子は、コア接着遺伝子として分類される。複数の病状に関連している９２個の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の株からのＣｌｆＢ配列を図４２中に要約する。付加配列はＧｅｎＢａｎｋから入手した。
他のＭＳＣＲＡＭＭ
他のＭＳＣＲＡＭＭを、本発明の免疫原性組成物中で使用するために検討し得る。たとえば、セリン−アスパラギン酸反復（Ｓｄｒ）タンパク質、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、およびＳｄｒＥは、一次配列および構造編成がＣｌｆＡおよびＣｌｆＢタンパク質に関連しており、細胞表面上に局在している。ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤおよびＳｄｒＥタンパク質は細胞壁関連タンパク質であり、Ｎ末端にシグナル配列を有し、Ｃ末端にＬＰＸＴＧ（配列番号１２５）モチーフ、疎水性ドメインおよび正荷電残基を有する。また、それぞれは、Ｂモチーフと共に、細胞表面上でのリガンド結合ドメイン領域Ａの効率的な発現を可能にする、十分な長さの領域Ｒを含有するＳＤ反復を有する。ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤおよびＳｄｒＥタンパク質のＡ領域が細胞表面上に位置しているため、このタンパク質は、血漿中のタンパク質、細胞外基質または宿主細胞の表面上の分子と相互作用することができる。Ｓｄｒタンパク質は、ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢと一部の限定的なアミノ酸配列の類似度を共有する。ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢと同様、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤおよびＳｄｒＥも、細胞外基質タンパク質の陽イオン依存性リガンド結合を示す。
ｓｄｒ遺伝子は密に連結しており、タンデムに配置されている。Ｓｄｒタンパク質（ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ、ＣｌｆＡ、およびＣｌｆＢ）は、コンセンサスなＴＹＴＦＴＤＹＶＤ（配列番号１２６）モチーフを誘導するために使用することができる高度に保存的なアミノ酸配列が存在するＡ領域を特徴的に含む。このモチーフは、異なるタンパク質間でわずかな変動を示す。この変動は、モチーフのコンセンサス配列と共に米国特許第６，６８０，１９５号に記載されている。Ｃｌｆ−Ｓｄｒタンパク質中では、このモチーフは高度に保存的されている。このモチーフは、細菌感染に対する幅広い範囲の免疫を与えるために免疫原性組成物中で使用することができ、また、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生において抗原として使用することもできる。そのような抗体は、幅広い範囲の受動免疫を与えるために使用することができる。
Ｓｄｒタンパク質は、領域ＡおよびＲ−領域の間に位置する２〜５個の追加の１１０〜１１３個の残基の反復配列（Ｂ−モチーフ）を有することによって、ＣｌｆＡおよびＣｌｆＢとは異なる。それぞれのＢ−モチーフは、通常は真核タンパク質中に見つかるコンセンサスなＣａ２＋結合ＥＦ−ハンドループを含有する。５個のＳｄｒＤ Ｂ−反復を含む組換えタンパク質の構造的完全性は、ビスＡＮＳ蛍光分析によってＣａ２＋依存性であることが示され、これは、ＥＦ−ハンドが機能的であることを示唆している。Ｃａ２＋を除去した際、構造が折り畳まれていないコンホメーションへと崩壊した。Ｃａ２＋を加えることによって元の構造が修復された。Ｓｄｒタンパク質のＣ末端Ｒ−ドメインは、１３２〜１７０個のＳＤ残基を含有する。次いで、グラム陽性細菌の多くの表面タンパク質に特徴的な、保存的な壁アンカー領域が存在する。
ＳｄｒおよびＣｌｆタンパク質中では、このＢモチーフは高度に保存的である一方で、フィブロネクチン結合ＭＳＣＲＡＭＭ、およびコラーゲン結合タンパク質Ｃｎａ中では変性バージョンが生じる。Ｂモチーフは、Ｒ領域と併せて、細胞表面から一定の距離でリガンド結合ドメインを表示するために必要である。反復Ｂモチーフは、本明細書中に記載のＳＤ反復タンパク質の部分群の１つの共通点である。これらのモチーフは、ＰＦＥＳＡ０２３７株からの３つのＳｄｒタンパク質中で様々な数で見つかる。個々のＢモチーフ間には明らかな相違が存在する。最も保存的な単位は、Ｒ領域に隣接して位置するものである（ＳｄｒＣ Ｂ２、ＳｄｒＤ Ｂ５およびＳｄｒＥ Ｂ３）。これらは、いくつかの部位、特にＣ末端半分中で、残りのものと異なる。注目すべき構造的な詳細は、隣接するＢ反復は、Ｃ末端領域中に存在するプロリン残基によって必ず隔てられているが、プロリンは、最後のＢ反復およびＲ領域の間に存在することはない。その代わりに、このリンカーは短い酸性のストレッチによって特徴づけられている。これらの相違は、末端の単位が他のＢモチーフと比較して異なる構造的または機能的な役割を有するという証拠である。ＳｄｒＤおよびＳｄｒＥのＮ末端Ｂモチーフは他のものから離れており、小さな挿入および欠失を含めた数々のアミノ酸の変更が存在する一方で、残りの内部Ｂモチーフはより高度に保存されている。３つのＳｄｒタンパク質のそれぞれは、それぞれの種類のＢモチーフを少なくとも１つずつ有することに注目されたい。
Ｓｄｒタンパク質のＣ末端Ｒ−ドメインは、１３２〜１７０個のＳＤ残基を含有する。次いで、グラム陽性細菌の多くの表面タンパク質に特徴的な、保存的な壁アンカー領域が存在する。
他の候補ＳｄｒＤ分子は、本発明の免疫原性組成物中で使用するために様々な生物種に由来していてよく、その一部には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からの以下のＳｄｒＤが含まれる：ＵＳＡ３００ ＦＰＲ３７５７株（タンパク質受託番号ＳＡＵＳＡ３００ ０５４７）、ＮＣＴＣ８３２５株（タンパク質受託番号ＳＡＯＵＨＳＣ ００５４５）、ＭＷ２株（タンパク質受託番号ＭＷ０５１７）、ＭＳＳＡ４７６株（タンパク質受託番号ＳＡＳ０５２０、およびＭｕ５０株（タンパク質受託番号ＳＡＶ０５６２）。
本発明の免疫原性組成物中で使用するために考慮し得るさらなるＭＳＣＲＡＭＭには、ＥｋｅＳ、ＤｓｑＡ、ＫｅｓＫ、ＫｒｋＮ、ＫｒｋＮ２、ＲｋａＳ、ＲｒｋＮ、およびＫｎｋＡが含まれる。これらのＭＳＣＲＡＭＭは、本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ０２／１０２８２９号に記載されている。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって同定された追加のＭＳＣＲＡＭＭには、ＮＰ＿３７３２６１．１、ＮＰ＿３７３３７１．１、ＮＰ＿３７４２４６．１、ＮＰ＿３７４２４８．１、ＮＰ＿３７４８４１．１、ＮＰ＿３７４８６６．１、ＮＰ＿３７５１４０．１、ＮＰ＿３７５６１４．１、ＮＰ＿３７５６１５．１、ＮＰ＿３７５７０７．１、ＮＰ＿３７５７６５．１、およびＮＰ＿３７５７７３．１が含まれる。
莢膜多糖の５型および８型
侵襲性疾患を引き起こすことができるブドウ球菌微生物は、一般に、細菌をカプセル封入し、宿主の生得的な免疫系によるクリアランスに対するその耐性を増強させる、莢膜多糖（ＣＰ）を生じることもできる。ＣＰは、細菌細胞を、細菌を貪食および細胞内死滅に耐性とする保護カプセル中に覆う役割を果たす。カプセルを欠く細菌は、貪食に対してより感受性がある。莢膜多糖はしばしば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびＢ群連鎖球菌を含めた多くの細菌病原体の重要な病原性因子である。
莢膜多糖は、特定の細菌種の血清型を決定するために使用することができる。型の決定は、通常、莢膜多糖の特定の構造または独特なエピトープ特徴に対して産生された特異的な抗血清またはモノクローナル抗体との反応によって達成する。カプセル封入された細菌は滑らかなコロニーで成長する傾向がある一方で、そのカプセルを失った細菌のコロニーは粗く見える。粘液様の外見を生じるコロニーは、重度にカプセル封入されているとして知られている。１および２型の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は重度にカプセル封入されており、疾患に関連していることは稀である。
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のほとんどの臨床単離物は、血清型５または８のどちらかでカプセル封入されている。５型（ＣＰ５）および８型（ＣＰ８）の莢膜多糖は、Ｎ−アセチルマンノサミンウロン酸、Ｎ−アセチルＬ−フコサミン、およびＮ−アセチルＤ−フコサミンからなる類似の三糖反復単位を有する。Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、４５：９７〜９３（１９８４）およびＭｏｒｅａｕ，Ｍ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．、２０１：２８５〜２９７（１９９０）を参照されたい。２つのＣＰは同じ糖を有するが、糖連結およびＯアセチル化部位が異なって、血清学的に明確に異なる免疫反応性のパターンを生じる。
一部の実施形態では、本発明の血清型５および／または８の莢膜多糖はＯ−アセチル化されている。一部の実施形態では、５型の莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の度合は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％。６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。一部の実施形態では、８型の莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の度合は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％。６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。一部の実施形態では、５型および８型の莢膜多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の度合は、１０〜１００％、２０〜１００％、３０〜１００％、４０〜１００％、５０〜１００％。６０〜１００％、７０〜１００％、８０〜１００％、９０〜１００％、５０〜９０％、６０〜９０％、７０〜９０％または８０〜９０％である。
多糖またはオリゴ糖のＯ−アセチル化の度合は、当分野で知られている任意の方法、たとえば、プロトンＮＭＲによって決定することができる（ＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒおよびＪｏｎｅｓ、１９９６、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２９６、８３〜９６、ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ、２００２、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、３０、１２３３〜１２４７、ＷＯ０５／０３３１４８号またはＷＯ００／５６３５７）。別の一般的に使用されている方法は、Ｈｅｓｔｒｉｎ（１９４９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１８０、２４９〜２６１によって記載されている。
一部の実施形態では、本発明の血清型５および／または８の莢膜多糖を使用して、動物有効性モデルにおける細菌死滅または抗体が細菌を死滅させることを実証するオプソニン化貪食作用死滅アッセイによって測定して、機能的である抗体を産生させる。そのような機能性は、有効性におけるＯ−アセチル化の重要性の指標ではない、抗体の産生を単独で監視するアッセイ使用しても観察されない場合がある。
カプセルの疫学
特定のカプセル血清型と疾患との関連づけは、臨床単離物の監視によって可能である。同定されている黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の８つの異なる血清型のうち（ＫａｒａｋａｗａおよびＶａｎｎ（１９８２））、血清型１および２のみが重度にカプセル封入されており、これらが単離されることは稀である。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）の莢膜多糖、頁２８５〜２９３、Ｊ．Ｂ．Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｊ．Ｃ．ＨｉｌｌおよびＪ．Ｃ．Ｓａｄｏｆｆ（編）、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ、第４巻、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．、Ｔｈｉｅｍｅ Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。調査により、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）臨床単離物のおよそ８５〜９０％がＣＰ５またはＣＰ８を発現することが示されている（Ａｒｂｅｉｔ ＲＤら、Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９８４）４月、２（２）：８５〜９１、Ｋａｒａｋａｗａ ＷＷら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）９月、２２（３）：４４５〜７、Ｅｓｓａｗｉ Ｔら、Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｉｎｔ．Ｈｅａｌｔｈ．（１９９８）７月、３（７）：５７６〜８３、Ｎａ’ｗａｓ Ｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９８）３６（２）：４１４〜２０）。ＣＰ５およびＣＰ８の型決定できない株のほとんどは、遺伝子的に、ｃａｐ５／８座位に突然変異を含有する５型または８型である（Ｃｏｃｃｈｉａｒｏ、Ｇｏｍｅｚら、（２００６）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２月、５９（３）：９４８〜９６０）。一部の株のカプセル封入は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで数継代以内に迅速に失われ、これは、カプセル産生の臨床診断で使用される培地中の高いリン酸濃度の抑制効果が原因である。また、カプセル封入されていない単離物は、ウシを通した後にカプセル発現を回復することも報告された。Ｏｐｄｅｂｅｃｋ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９：２７５〜２７８（１９８５）を参照されたい。一部の型決定できない株は、適切な成長条件下でカプセル陽性となる。
ＣＰ５およびＣＰ８の構造
ＣＰ５およびＣＰ８のどちらの反復単位も、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−マンヌロン酸、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｌ−フコースおよび２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−フコースから構成される。Ｃ．Ｊｏｎｅｓら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、３４０：１０９７〜１１０６（２００５）を参照されたい。ＣＰ５およびＣＰ８は同じ糖組成を有するが、これらは免疫学的に明確に異なることが実証されている。これらは、ウロン酸のグリコシド結合およびＯ−アセチル化部位が異なる。ＦｕｃＮＡｃ残基のうちの１つの、株依存性の不完全なＮ−アセチル化が観察された。Ｔｚｉａｎａｂｏｓら、ＰＮＡＳ、Ｖ９８：９３６５（２００１）を参照されたい。
免疫原性組成物中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）莢膜多糖の分子量は、免疫原性組成物中で使用するための重要な検討事項である。高分子量莢膜多糖は、抗原表面上に存在するより高いエピトープ結合価が原因で、特定の抗体免疫応答を誘導できる。本明細書中に記載の方法は、以前に可能であったよりもはるかに高い分子量の莢膜多糖５型および８型の単離および精製をもたらす。
ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質
ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質はＡＢＣトランスポータータンパク質であり、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に相同体を有する。これは本発明においてＭｎｔＣと呼ぶ。このタンパク質は３２ｋＤａのリポタンパク質であり、細菌細胞壁中に位置する。Ｓｅｌｌｍａｎら、およびＣｏｃｋａｙｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６６：３７６７（１９９８）を参照されたい。表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）中では、これは鉄に調整されるオペロンの構成要素である。これは、エス・パラサンギス（Ｓ．ｐａｒａｓａｎｇｕｉｓ）のＦｉｍＡを含めた付着因子、および証明されたまたは推定上の金属鉄輸送機能を有するＡＢＣトランスポーターファミリーのリポタンパク質のどちらに対しても、相当の相同性を示す。（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の株および配列には、表２を参照されたい。）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質
ＭｎｔＣの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相同体は唾液結合タンパク質として知られており、米国特許第５，８０１，２３４号に開示されており、本発明の免疫原性組成物中に含めることができる。ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）相同体のタンパク質配列は、Ｍｕ５０株ではＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿３７１１５５中に見つかる（ＳＡＶ０６３１としても知られる）。配列識別要素は配列番号１３４である。Ｍｕ５０株の完全ゲノムのヌクレオチド配列の受託番号は、ＮＣ＿００２７５８．２である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿３７１１５５中に見つかるタンパク質配列の、コードＤＮＡ配列の座標は、７０４９８８〜７０５９１７である（配列番号１３５）。特定の実施形態では、ＭｎｔＣのＮ末端は、配列番号１１９（ポリペプチド配列）および配列番号１３６（ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列）に示されるように切断されている。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株からのＭｎｔＣ配列は、図４３に要約されている。
表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）ＳｉｔＣタンパク質
ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質の表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）相同体はＳｉｔＣとして知られており、Ｓｅｌｌｍａｎら（Ｓｅｌｌｍａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、２００５年１０月、７３（１０）：６５９１〜６６００）に開示されていた。ＭｎｔＣ／ＳｉｔＣ／唾液結合タンパク質の表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）相同体のタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿１８７８８６．１中に見つかる（ＳＥＲＰ０２９０としても知られる）。配列識別要素は配列番号１３２である。
ＲＰ６２Ａ株の完全ゲノムのヌクレオチド配列の受託番号は、ＮＣ＿００２９７６である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿１８７８８６．１中に見つかるタンパク質配列の、コードＤＮＡ配列の座標は、２９３０３０〜２９３９５９である（配列番号１３３）。ＳｉｔＣの対応するＮ末端切断型は、配列番号１２１（ポリペプチド配列）および配列番号１３７（ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列）に示されている。他の候補ＳｉｔＣ分子は、本発明の免疫原性組成物中で使用するために様々な生物種に由来していてよく、その一部を以下の表２に記載する。
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）鉄結合タンパク質
本発明の免疫原性組成物中で使用するために考慮する別の潜在的な候補抗原には、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）表面タンパク質鉄表面決定因子Ｂ（ＩｓｄＢ）が含まれる。このＭＳＣＲＡＭＭは、Ｍａｚｍａｎｉａｎら（Ｍａｚｍａｎｉａｎ，ＳＫら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９９：２２９３〜２２９８（２００２））によって記載され、続いて、Ｋｕｋｌｉｎら（Ｋｕｋｌｉｎ，ＮＡら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第７４巻、第４号、２２１５〜２２２３（２００６））によって、感染症のネズミモデルおよびアカゲザル免疫原性研究においてワクチン候補として試験され、有効であることが示されている。このＩｓｄＢ分子は、ＭＲＳＡ２５２株（タンパク質受託番号ＣＡＧ４０１０４．１）、Ｎｅｗｍａｎ株（タンパク質受託番号ＢＡＦ６７３１２．１）、ＭＳＳＡ４７６株（タンパク質受託番号ＣＡＧ４２８３７．１）、Ｍｕ３株（タンパク質受託番号ＢＡＦ７８００３．１）、ＲＦ１２２株（タンパク質受託番号ＣＡＩ８０６８１．１）を含めた、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株中に存在する。
候補抗原：
また、本発明の免疫原性組成物には、以下の抗原のうちの１つまたは複数も含まれ得る：Ｏｐｐ３ａ、ＤｌｔＤ、ＨｔｓＡ、ＬｔａＳ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＣ、ＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、ＳｄｒＨ、ＳｒｔＡ、ＳｐＡ、Ｓｂｉ、アルファ−溶血素（ｈｌａ）、ベータ−溶血素、フィブロネクチン結合タンパク質Ａ（ｆｎｂＡ）、フィブロネクチン結合タンパク質Ｂ（ｆｎｂＢ）、コアグラーゼ、Ｆｉｇ、ｍａｐ、パントン−バレンタインロイコシジン（ｐｖｌ）、アルファ−毒素およびその変異体、ガンマ−毒素（ｈｌｇ）および変異体、ｉｃａ、免疫優性ＡＢＣトランスポーター、Ｍｇ２＋トランスポーター、Ｎｉ ＡＢＣトランスポーター、ＲＡＰ、自己溶菌酵素、ラミニン受容体、ＩｓａＡ／ＰｉｓＡ、ＩｓａＢ／ＰｉｓＢ、ＳＰＯＩＩＩＥ、ＳｓａＡ、ＥｂｐＳ、ＳａｓＡ、ＳａｓＦ、ＳａｓＨ、ＥＦＢ（ＦＩＢ）、ＳＢＩ、Ｎｐａｓｅ、ＥＢＰ、骨シアロ結合タンパク質ＩＩ、オーレオリシン前駆体（ＡＵＲ）／Ｓｅｐｐ１、Ｃｎａ、およびその断片、たとえばＭ５５、ＴＳＳＴ−１、ｍｅｃＡ、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ／ｄＰＮＡＧ）菌体外多糖、ＧｅｈＤ、ＥｂｈＡ、ＥｂｈＢ、ＳＳＰ−１、ＳＳＰ−２、ＨＢＰ、ビトロネクチン結合タンパク質、ＨａｒＡ、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、エンテロトキシンＡ、エンテロトキシンＢ、エンテロトキシンＣ１、ならびに新規自己溶菌酵素。本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物が特定の形態のＣＰ５および／またはＣＰ８を含む場合は、これはＰＮＡＧをさらに含み得ない。
免疫原性組成物の配合物
一実施形態では、本発明の凍結乾燥した免疫原性組成物は、アジュバント、緩衝液、凍結保護剤、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、フリーラジカル酸化阻害剤、充填剤、または担体のうちの少なくとも１つをさらに含む。
本発明の免疫原性組成物は、複数のブドウ球菌タンパク質抗原および莢膜多糖−タンパク質のコンジュゲートに加えて、１つまたは複数の保存料をさらに含み得る。ＦＤＡは、わずか数件の例外を除いて、複数用量（多用量）バイアル中の生物学的生成物は保存料を含有することを要求している。保存料を含有するワクチン生成物には、塩化ベンゼトニウム（炭疽）、２−フェノキシエタノール（ＤＴａＰ、ＨｅｐＡ、ライム病、ポリオ（非経口））、フェノール（ニューモ（Ｐｎｅｕｍｏ）、腸チフス（非経口）、ワクシニア）およびチメロサール（ＤＴａＰ、ＤＴ、Ｔｄ、ＨｅｐＢ、Ｈｉｂ、インフルエンザ、ＪＥ、メニング（Ｍｅｎｉｎｇ）、ニューモ（Ｐｎｅｕｍｏ）、狂犬病）を含有するワクチンが含まれる。注射用薬物中での使用が認可されている保存料には、たとえば、クロロブタノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、２−フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、ベンジルアルコール、フェノール、チメロサールおよび硝酸フェニル水銀が含まれる。
本発明の配合物は、緩衝液、塩、二価陽イオン、非イオン性洗剤、糖などの凍結保護剤、充填剤、およびフリーラジカル捕捉剤またはキレート化剤などの抗酸化剤、またはその任意の複数の組合せのうちの１つまたは複数をさらに含み得る。任意の１つの構成要素、たとえばキレート剤の選択により、別の構成要素（たとえば捕捉剤）が望ましいかどうかが決定され得る。投与用に配合された最終組成物は、無菌的および／または発熱物質を含まないべきである。当業者は、所要の特定の貯蔵および投与の条件などの様々な要因に応じて、これらおよび他の構成要素のどの組合せが、本発明の保存料含有免疫原性組成物中に包含させるために最適であるかを経験的に決定し得る。
一部の実施形態では、凍結乾燥した組成物は、さらに、６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液を３％未満（ｗ／ｗ）の量で含有する。特定の実施形態では、配合物は、約６．０〜約９．０、好ましくは約７．５〜約７．５のｐＨ範囲以内に緩衝されている。一部の実施形態では、緩衝液は２．５４％±０．７６％（ｗ／ｗ）の濃度である。一部の実施形態では、緩衝液は、ｐＨ６．０±０．６のコハク酸塩を含む。一部の実施形態では、緩衝液は、ｐＨ６．０±０．６のヒスチジンを含む。一部の実施形態では、緩衝液は、ｐＨ６．５±０．６のヒスチジンを含む。表３は、本発明の実施において使用し得る一部の非限定的な緩衝液の例を記載している。
特定の実施形態では、本発明の凍結乾燥した免疫原性組成物または配合物のｐＨを調節することが望ましい場合がある。本発明の配合物のｐＨは、当分野の標準の技法を用いて調節し得る。配合物のｐＨは、３．０〜８．０となるように調節し得る。特定の実施形態では、配合物のｐＨは、３．０〜６．０、４．０〜６．０、５．０〜７．０、または５．０〜８．０であり得るか、またはそうなるように調節し得る。他の実施形態では、配合物のｐＨは、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約５．８、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０であり得るか、またはそうなるように調節し得る。特定の実施形態では、ｐＨは、４．５〜７．５、または４．５〜６．５、５．０〜５．４、５．４〜５．５、５．５〜５．６、５．６〜５．７、５．７〜５．８、５．８〜５．９、５．９〜６．０、６．０〜６．１、６．１〜６．２、６．２〜６．３、６．３〜６．４、６．４〜６．５、６．５〜６．６、６．６〜６．７、６．７〜６．８、６．８〜６．９、６．９〜７．０、６．５〜７．０、７．０〜７．５もしくは７．５〜８．０の範囲であり得るか、またはそうなるように調節し得る。具体的な実施形態では、配合物のｐＨは約６．０である。具体的な実施形態では、配合物のｐＨは約６．５である。
一部の実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物は、充填剤を含む。充填剤は、一般に、組成物に嵩を与える、薬物の乾燥ペレットが目に見えないもしくは辛うじてしか見えないほどに１用量あたりの量が一般に低い、薬物の可視化を促進する役割を果たす、および／または、凍結乾燥中などに活性成分がバイアルから吹き飛ばされることを防止する役割を果たす。また、充填剤は、薬物剤の沈殿を促進する役割を果たすこともできる。また、充填剤は、凍結保護剤としても役割を果たすことができる。様々な凍結保護剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２巻、第１９版（１９９５）などの慣用の教科書に記載されている。
充填剤の非限定的な例には、アルジトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、およびポリエチレングリコールなどの糖アルコール、アルドン酸、ウロン酸、およびアルダル酸などの糖酸、ならびに炭水化物、たとえば、アルドース、ケトース、アミノ糖、アルジトール、イノシトール、アルドン酸、ウロン酸、アルダル酸、モノ−、ジ−、またはポリ−炭水化物、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、五炭糖、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、六炭糖、イドース、マンノース、タロース、七炭糖、グルコース、フルクトース、グルコン酸、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、メチルａ−グルコピラノシド、マルトース、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、ラクトン、ソルボース、グルカル酸、エリトロース、トレオース、アラビノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、スクロース、トレハロース、ノイラミン酸、アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロナン、グルカン、マンナン、キシラン（たとえばイヌリンなど）、レバン、フコイダン、カラゲナン、ガラクトカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンチンガム、またはデンプンが含まれる。
一部の実施形態では、充填剤は、スクロース、マンニトール、グリシンおよびソルビトールのうちの任意の１つまたは複数である。一部の実施形態では、充填剤はスクロースである。一部の実施形態では、スクロースは９１％（ｗ／ｗ）よりも多い。一部の実施形態では、スクロースは９６％±２．０％（ｗ／ｗ）である。
特定の実施形態では、非経口投与に適合した凍結乾燥または再構成した凍結乾燥組成物の配合物は、それだけには限定されないが、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２を含めた１つまたは複数の二価陽イオンを、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲、好ましくは約５ｍＭまでの濃度で含む。
特定の実施形態では、非経口投与に適合した凍結乾燥または再構成した凍結乾燥組成物の配合物は、非経口投与の際に対象に生理的に許容されるイオン強度で存在し、最終配合物中で選択されたイオン強度または容積モル浸透圧濃度を生じる最終濃度で含められる、それだけには限定されないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、および硫酸カリウムを含めた１つまたは複数の塩を含む。配合物の最終イオン強度または重量モル浸透圧濃度は、複数の構成要素（たとえば、イオン緩衝化合物（複数可）および他の非緩衝塩からのイオン）によって決定される。好ましい塩であるＮａＣｌは、約２５０ｍＭまでの範囲で存在し、塩濃度は、配合物の最終全容積モル浸透圧濃度が非経口投与（たとえば、筋肉内または皮下注射）に適合しており、免疫原性組成物の配合物の免疫原性構成要素の様々な温度範囲にわたる長期的安定性が促進されるように、他の構成要素（たとえば糖）を補完するように選択される。無塩配合物は、所望の最終容積モル浸透圧濃度レベルを維持するために１つまたは複数の選択された凍結保護剤の増加した範囲を耐用する。
特定の実施形態では、非経口投与に適合した凍結乾燥または再構成した凍結乾燥組成物の配合物は、それだけには限定されないが、二糖（たとえば、ラクトース、マルトース、スクロースまたはトレハロース）およびポリヒドロキシ炭化水素（たとえば、ズルシトール、グリセロール、マンニトールおよびソルビトール）から選択される１つまたは複数の凍結保護剤を含む。
特定の実施形態では、再構成した凍結乾燥配合物の容積モル浸透圧濃度は、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌの範囲であり、好ましい範囲は、約２５０ｍＯｓ／Ｌ〜約５００ｍＯｓ／Ｌ、または約３００ｍＯｓ／Ｌ〜約４００ｍＯｓ／Ｌである。再構成した凍結乾燥配合物は、たとえば、約０％〜約２５％のスクロース、約３％〜約１５％、および約５〜約１０％のスクロースを含有し得る。あるいは、再構成した凍結乾燥配合物は、たとえば約３％〜約１２％のソルビトールを含有し得る。塩化ナトリウムなどの塩を加える場合は、スクロースまたはソルビトールの有効な範囲を相対的に減少させても、させなくてもよい。これらおよび他のそのような重量モル浸透圧濃度および容積モル浸透圧濃度の検討事項は、当分野の技術範囲内に十分ある。
特定の実施形態では、非経口投与に適合した本発明の凍結乾燥または再構成した凍結乾燥配合物は、１つまたは複数のフリーラジカル酸化阻害剤および／またはキレート化剤を含む。様々なフリーラジカル捕捉剤およびキレート剤が当分野で知られており、本明細書中に記載の配合物および使用方法に適用される。例には、それだけには限定されないが、エタノール、ＥＤＴＡ、ＥＤＴＡ／エタノールの組合せ、トリエタノールアミン、マンニトール、ヒスチジン、グリセロール、クエン酸ナトリウム、イノシトールヘキサホスフェート、トリポリホスフェート、アスコルビン酸／アスコルビン酸塩、コハク酸／コハク酸塩、リンゴ酸／マレイン酸塩、ｄｅｓｆｅｒａｌ、ＥＤＤＨＡおよびＤＴＰＡ、ならびに上記のうちの２つ以上の様々な組合せが含まれる。特定の実施形態では、少なくとも１つの非還元フリーラジカル捕捉剤は、配合物の長期的安定性を有効に増強させる濃度で加え得る。また、１つまたは複数のフリーラジカル酸化阻害剤／キレート剤を、捕捉剤および二価陽イオンなどの様々な組合せでも加え得る。キレート剤の選択により、捕捉剤の添加が必要であるかどうかが決定される。
一部の実施形態では、凍結乾燥した免疫原性組成物は、０．５％（ｗ／ｗ）未満の界面活性剤を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は０．２１％±０．０４％（ｗ／ｗ）である。界面活性剤は、配合物中で、たとえば、アジュバントとして、乳化剤としておよび可溶化剤としてを含めた、複数の非限定的な役割を有する。たとえば、一部の実施形態では、界面活性剤は、原薬、すなわちＣｌｆＡタンパク質が、容器またはシリンジの壁に貼り付き、それにより回収または送達されないことを防止するための可溶化剤として作用する。また、界面活性剤は、たとえば、ＣｌｆＡタンパク質が共栓からのシリコン潤滑剤と接触することがあった場合などに起こる、潜在的な凝集を防止するために使用する。免疫原性組成物およびワクチン中で使用するための界面活性剤は、ＡｓｃａｒａｔｅｉｌおよびＤｕｐｕｉｓ、Ｖａｃｃｉｎｅ、２４（２００６）：Ｓ８３〜Ｓ８５に記載されている。手短に述べると、非限定的な界面活性剤には、リポ多糖（ＬＰＳ）、サポニン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、ブロックポリマー、または酸化エチレン（ＥＯ）と酸化プロピレン（ＰＯ）とのランダムポリマーであるポロキサマー、モノまたはトリオレイン酸ソルビタンであることができ、エステル結合によって連結されたソルビトールとオレイン酸から作製されるソルビタンエステル、およびエトキシ化されたもの（すなわち、ポリソルベート、たとえばポリソルベート８０）、レシチンなどのリン脂質、ならびにオレイン酸とマンニトールとのエステルであるオレイン酸マンニドが含まれる。
一部の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー、それだけには限定されないがＢｒｉｊ５８、Ｂｒｉｊ３５、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、ＮＰ４０、Ｓｐａｎ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃの非イオン性界面活性剤シリーズ（たとえばＰｌｕｒｏｎｉｃ１２１）などの他のものを含めたポリオキシエチレンアルキルエーテル、ならびにポリソルベートを含めたポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのうちの任意の１つまたは複数である。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ６０）、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、またはポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ２０）である。一部の実施形態では、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）は０．２０％±０．０４２％（ｗ／ｗ）である。
一部の実施形態では、特に凍結乾燥した組成物がアジュバントを含有しないものでは、水性希釈剤がアジュバントを含む。一部の実施形態では、アジュバントはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である。
一部の実施形態では、特に凍結乾燥した組成物が界面活性剤を含有しないものでは、希釈剤がたとえばポリソルベート８０などの界面活性剤を含む。
一部の実施形態では、液体免疫原性組成物は、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌ（たとえば、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌが含まれる）の濃度の、本明細書中に記載のインタクトなｒＣｌｆＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、液体免疫原性組成物は、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度のインタクトなＣｌｆＡポリペプチドを含む。一部の実施形態では、液体免疫原性組成物は、（ａ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌ（たとえば、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌが含まれる）の濃度の、本明細書中に記載のインタクトなｒＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ（たとえば、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ±１０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌが含まれる）のＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート（ｃ）１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ（たとえば、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ±１０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌが含まれる）のＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｄ）約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、および約５ｍＭ〜約１５ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｅ）約０．０５％〜約０．５％、約０．０７５％〜約０．２５％、および約０．１％〜約０．２％重量対体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに（ｆ）約０％〜約２５％のスクロース、約３％〜約１５％、および約５〜約１０％ｗ／ｖの濃度のスクロースを含む。他の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。一部の実施形態では、液体免疫原性組成物は、（ａ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌ（たとえば、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌが含まれる）の濃度の、本明細書中に記載のインタクトなｒＣｌｆＡポリペプチド、（ｂ）１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ（たとえば、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ±１０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌが含まれる）のＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｃ）１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ（たとえば、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ±１０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌが含まれる）のＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｄ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌ（たとえば、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌが含まれる）のＭｎｔＣポリペプチド、（ｅ）約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２５ｍＭ、および約５ｍＭ〜約１５ｍＭのヒスチジン緩衝液、（ｆ）約０．０５％〜約０．５％、約０．０７５％〜約０．２５％、および約０．１％〜約０．２％重量対体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに（ｇ）約０％〜約２５％のスクロース、約３％〜約１５％、および約５〜約１０％ｗ／ｖの濃度のスクロースを含む。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
一部の実施形態では、特に凍結乾燥した組成物も希釈剤もどちらもアジュバントを含有しない場合では、液体免疫原性をアジュバントと合わせる。
一実施形態では、本発明は、（ａ）水性媒体中で、（ｉ）クランピング因子Ａポリペプチド（「ｒＣｌｆＡ」）ポリペプチド、（ｉｉ）約６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｉｉｉ）充填剤を合わせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の組合せを凍結乾燥して、３重量％未満の水を含有するケークを形成するステップとを含む、免疫原性組成物を作製するプロセスを提供する。一実施形態では、本発明は、（ａ）水性媒体中で、（ｉ）クランピング因子Ａポリペプチド（「ｒＣｌｆＡ」）ポリペプチド、（ｉｉ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｉｉｉ）ＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｉｖ）約６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｖ）充填剤を合わせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の組合せを凍結乾燥して、３重量％未満の水を含有するケークを形成するステップとを含む、免疫原性組成物を作製するプロセスを提供する。一実施形態では、本発明は、（ａ）（ｉ）クランピング因子Ａポリペプチド（「ｒＣｌｆＡ」）ポリペプチド、（ｉｉ）ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｉｉｉ）ＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、（ｉｖ）単離したＭｎｔＣポリペプチド、（ｖ）約６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、および（ｖｉ）充填剤を含む水溶液を合わせるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の組合せを凍結乾燥して、３重量％未満の水を含有するケークを形成するステップとを含む、免疫原性組成物を作製するプロセスを提供する。本発明の免疫原性組成物は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）感染症の予防または処置に有用である。一部の実施形態では、ケークの色は白色であり、海綿状の質感を有する。
「凍結乾燥」とは、材料を凍結乾燥（冷温乾燥）するプロセスを意味する。一般に、凍結乾燥プロセスは、材料を凍結し、その後、周囲圧力を低下させ、材料中の凍結した水の昇華を可能にするために十分な熱を与えることを含む。一部の事例では、凍結乾燥には、最初の凍結ステップ、一次乾燥（昇華）ステップ、残った最後の微量の水を排除することを目的とする二次乾燥が含まれる。一部の事例では、ケークの特徴を改善させ、昇華を改善させるために徐冷ステップを含める。凍結乾燥のより詳細な記述には、Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｈｅｎｒｙ ＣｏｓｔａｔｉｎｏおよびＭｉｃｈａｅｌ Ｐｉｋａｌ編、ＡＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ ＶＡ、２００４を参照されたい。
「ケーク」とは、一般に、凍結乾燥プロセス後に残る乾燥した材料を意味する。ケークの外見は凍結によって形成された固体のマトリックス構造に依存し、凍結乾燥手順中の様々なパラメータによって影響を受ける。徐冷ステップを凍結乾燥手順に加えることで、多くの場合はより均一なケークの外見をもたらすことができる。
一部の実施形態では、たとえばポリソルベート８０などの界面活性剤を、ステップ（ａ）でｒＣｌｆＡ、緩衝液および充填剤と合わせる。一部の実施形態では、界面活性剤は約０．１％±０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度を有する。他の実施形態では、界面活性剤は０．０１％±０．００５％ｗ／ｖの濃度を有する。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）で形成される水性の組合せは、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌ（たとえば、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌが含まれる）の濃度のインタクトなｒＣｌｆＡポリペプチドを含有する。一部の実施形態では、ステップ（ａ）で形成される水性の組合せは、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌ（たとえば、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌが含まれる）の濃度のインタクトなｒＣｌｆＡポリペプチド、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ（たとえば、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ±１０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌが含まれる）のＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ（たとえば、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ±１０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌが含まれる）のＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、１０ｍＭ±５ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．１％±０．０５％重量対体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに９％±４．５％ｗ／ｖの濃度のスクロースを含有する。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％ｗ／ｖの濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
一部の実施形態では、ステップ（ａ）で形成される水性の組合せは、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌ（たとえば、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌが含まれる）の濃度のインタクトなｒＣｌｆＡポリペプチド、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ（たとえば、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ±１０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌが含まれる）のＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌ（たとえば、１０μｇ／ｍｌ±１μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ±１０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、および４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌが含まれる）のＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌ（たとえば、４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ±２０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ±６０μｇ／ｍｌ、および８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌが含まれる）のＭｎｔＣポリペプチド、１０ｍＭ±５ｍＭのヒスチジン緩衝液、０．１％±０．０５％重量対体積（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、ならびに９％±４．５％ｗ／ｖの濃度のスクロースを含有する。別の実施形態では、ポリソルベート８０は、０．０１％±０．００５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度であり、スクロースは、４．５％±１．５％ｗ／ｖの濃度である。
一部の実施形態では、凍結乾燥ステップは、（ｉ）水性の組合せを凍結するステップと、（ｉｉ）水性の組合せを徐冷するステップと、（ｉｉｉ）組合せを２つの段階で乾燥させるステップとを含む。一実施形態では、（ｉ）凍結は、水性の組合せの温度を、０．３℃±０．０３℃／分のステップで、−５０℃±５℃の温度に達するまで、４００ミリバール±４０ミリバールの圧力で低下させ、その後、６０分間±６分間保つことによって行い、（ｉｉ）徐冷は、温度を−１０℃±５℃まで０．３℃±０．０３℃／分の速度で増加させ、次いで、温度を−１０℃±５℃で１２０分間±１２分間保持し、次いで、温度を０．３℃±０．０３℃／分の速度で、−５０℃±５℃の温度に達するまで減少させ、その後、温度を−５０℃±５℃で１８０分間±１８分間保つことによって行い、（ｉｉｉ）乾燥の第１段階は、圧力を５０ｍＴｏｒｒまで減少させ、３０分間±３分間保持し、次いで、温度を−３０℃±５℃まで０．２℃±０．０２℃／分の速度で増加させ、その後、その温度で１，９２０分間±１９２分間保つことによって行い、（ｉｖ）乾燥の第２段階は、温度を３０℃±５℃まで０．２℃±０．０２℃／分の速度で増加させ、次いで、圧力を２００ｍＴｏｒｒまで増加させ、温度を３０℃±５℃で７２０分間±７２分間保つことによって行う。特定の実施形態では、凍結は約１０１３ｍｂａｒ（１ａｔｍ）で行う。特定の実施形態では、凍結は１０１３ｍｂａｒ（１ａｔｍ）までで行う。特定の実施形態では、乾燥時間は約２，６００分間であることができる。特定の実施形態では、乾燥時間は２，６００分間までであることができる。特定の実施形態では、乾燥温度は、４０℃±５℃、５０℃±５℃、または６０℃±５℃である。最終乾燥ステップ後、凍結乾燥した組成物の温度を、５℃±５℃まで０．５℃±０．０５℃／分の速度で減少させる。特定の実施形態では、凍結乾燥はバイアル中で起こる。一部の実施形態では、バイアルを凍結乾燥後に共栓する。一部の実施形態では、共栓する前バイアルを窒素でバックフィルし、６０％の大気圧などの部分的真空の元で共栓する。
一実施形態では、このプロセスは、凍結乾燥した組成物を水性希釈剤中で再構成するステップも含み、再構成した組合せの重量モル浸透圧濃度は３００ｍＯｓｍ±３０ｍＯｓｍである。一部の実施形態では、水性希釈剤は水である。一部の実施形態では、水性希釈剤は６０ｍＭのＮａＣｌである。
一実施形態では、本出願は、上述のプロセスに従って製造された免疫原性組成物を提供する。
特定の実施形態では、本発明の配合物は、非経口投与に適した１つまたは複数の追加の安定化剤、たとえば、少なくとも１つのチオール（−ＳＨ）基を含む還元剤（たとえば、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、還元グルタチオン、チオグリコール酸ナトリウム、チオスルフェート、モノチオグリセロール、またはその混合物）を含む。あるいは、または任意選択で、本発明の保存料含有の免疫原性組成物の配合物は、貯蔵容器から酸素を除去すること、配合物を光から保護すること（たとえばアンバーガラス製の容器を使用することによる）によって、さらに安定化させ得る。
本発明の保存料含有の免疫原性組成物の配合物は、それ自体では免疫応答を誘導しない任意の賦形剤を含めた、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体または賦形剤を含み得る。適切な賦形剤には、それだけには限定されないが、タンパク質、糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、２００１、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２１１８）、トレハロース、ラクトースおよび脂質凝集体（油の液滴またはリポソームなど）等の巨大分子が含まれる。そのような担体は当業者に十分に知られている。薬学的に許容できる賦形剤は、たとえばＧｅｎｎａｒｏ、２０００、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２に記述されている。
一実施形態では、本発明は、本明細書中に記載した凍結乾燥した免疫原性組成物を水性希釈剤で再構成することによって製造される、液体免疫原性組成物を提供する。一部の実施形態では、水性希釈剤は水である。他の実施形態では、水性希釈剤は低塩溶液である。低塩溶液とは、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ〜約１００ｍＭの塩濃度を有する水溶液を意味する。一部の実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。一部の実施形態では、低塩溶液は６０ｍＭ±６ｍＭの塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、液体免疫原性組成物は６．０±０．６のｐＨを有する。一部の実施形態では、液体免疫原性組成物は６．５±０．６のｐＨを有する。
用語「希釈剤」の使用は、任意の物質を懸濁、希釈または溶かすことができる液体を意味する。一部の実施形態では、物質は、ＣｌｆＡポリペプチドを含有する凍結乾燥した組成物である。一部の実施形態では、希釈剤は水性であり、凍結乾燥した組成物を溶かす。
本発明の再構成した凍結乾燥免疫原性組成物を対象に直接送達することは、非経口投与（筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、もしくは組織の間質腔）、または直腸、経口、経膣、局所、経皮、鼻腔内、眼球、耳、肺もしくは他の粘膜の投与によって達成し得る。好ましい実施形態では、非経口投与は、たとえば対象の大腿または上腕への、筋肉内注射によるものである。注射は針（たとえば皮下注射針）を介したものであり得るが、無針注射を代わりに使用してもよい。典型的な筋肉内用量は０．５ｍＬである。本発明の組成物は、様々な形態、たとえば、液体の液剤または懸濁剤のどちらかとしての注射用に調製し得る。
特定の免疫原性組成物の構成要素の最適な量は、対象における適切な免疫応答の観察を含む標準の研究によって確認し得る。最初のワクチン接種後、対象は、十分に間隔を空けた１回または複数回のブースター免疫化を受けることができる。
梱包および剤形
本発明の免疫原性組成物は、単位用量または多用量の形態（たとえば２回用量、４回用量、もしくはそれ以上）で梱包し得る。特定の実施形態では、用量は、凍結乾燥した免疫原性組成物を再構成した後に０．５ｍＬの用量である。たとえば、本明細書中に参考として組み込まれている国際特許出願ＷＯ２００７／１２７６６８号を参照されたい。
組成物は、針と共にまたは針なしで供給し得る、バイアルもしくは他の適切な貯蔵容器中で提示し得るか、または事前に充填された送達装置、たとえば、単一もしくは複数の構成要素のシリンジ中で提示し得る。シリンジは、単一用量の本発明の保存料含有免疫原性組成物を典型的には含有するが、必ずしもそうである必要はなく、多用量の事前に充填されたシリンジも想定される。同様に、バイアルには単一用量が含まれ得るが、代わりに複数の用量が含まれていてもよい。
有効用量体積はルーチン的に確立することができるが、注射用の再構成した凍結乾燥組成物の典型的な用量は０．５ｍＬの体積を有する。特定の実施形態では、用量は、ヒト対象に投与するために配合されている。特定の実施形態では、用量は、成人、ティーンエイジャー、青年、幼児または乳児（すなわち１歳未満）のヒト対象に投与するために配合されており、好ましい実施形態では注射によって投与し得る。
本発明の免疫原性組成物は、たとえば当分野で周知の多数の凍結乾燥方法のうちの１つを用いて凍結乾燥および再構成して、これらを調製するために使用する正確な方法を変動させることによって選択および制御し得る、平均直径などの粒子特徴を有する、ミクロペレットまたはミクロスフェアなどの乾燥した規則的な形状（たとえば球状）の粒子を形成し得る。免疫原性組成物は、別のミクロペレットまたはミクロスフェアなどの乾燥した規則的な形状（たとえば球状）の粒子を用いて調製した、またはそれに含有されていてもよい、アジュバントをさらに含み得る。一実施形態では、本発明はさらに、本発明の１つまたは複数の保存料をさらに含んでいてもよい、凍結乾燥した免疫原性組成物が含まれる第１の構成要素、および第１の構成要素を再構成するための無菌的な水溶液を含む第２の構成要素を含む、免疫原性組成物のキットを提供する。特定の実施形態では、水溶液は、１つまたは複数の保存料を含み、少なくとも１つのアジュバントを含んでいてもよい（たとえばＷＯ２００９／１０９５５０号（本明細書中に参考として組み込まれている）を参照。
さらに別の実施形態では、多用量様式の容器は、それだけには限定されないが、一般実験用ガラス器具、フラスコ、ビーカー、メスシリンダー、発酵槽、バイオリアクター、チューブ、パイプ、バッグ、ジャー、バイアル、バイアルの栓（たとえば、ゴム栓、ねじ式の蓋）、アンプル、シリンジ、二チャンバまたは多チャンバのシリンジ、シリンジ共栓、シリンジプランジャー、ゴム栓、プラスチック栓、ガラス栓、カートリッジおよび使い捨てのペンなどからなる群のうちの１つまたは複数から選択される。本発明の容器は製造の材料によって制限されず、ガラス、金属（たとえば、鋼、ステンレス鋼、アルミニウムなど）およびポリマー（たとえば、熱可塑性、エラストマー、熱可塑性エラストマー）などの材料が含まれる。特定の実施形態では、様式の容器は、ブチル共栓を備えた５ｍＬのＳｃｈｏｔｔタイプ１ガラスバイアルである。当業者には、上述の様式は決して網羅的なリストではなく、単に本発明で利用可能な様々な様式に関して当業者への手引きとして役割を果たすことを理解されよう。本発明での使用が企図される追加の様式は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｃｏｒｐ．（オハイオ州Ｌｉｍａ）、ＶＷＲなどの実験器具の販売業者および製造者からの公開カタログ中に見つかり得る。
免疫原性組成物の評価
一実施形態では、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生物からの少なくとも１つの抗原を含む免疫原性組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生物からの少なくとも３つの抗原を含む免疫原性組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）生物からの少なくとも４つの抗原を含む免疫原性組成物を提供する。
様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を用いて、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を評価することができる。たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏオプソニンアッセイは、ブドウ球菌細胞、問題の抗原に対する特異的抗体を含有する熱失活させた血清、および外因性の補体源の混合物を一緒にインキュベートすることによって実施することができる。オプソニン化貪食作用は、新しく単離した多形核細胞（ＰＭＮ）またはＨＬ６０などの分化したエフェクター細胞および抗体／補体／ブドウ球菌細胞の混合物のインキュベーションの間に進行する。抗体および補体でコーティングされた細菌細胞は、オプソニン化貪食作用の際に死滅される。オプソニン化貪食作用から回収された生存細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）は、アッセイ混合物をプレートすることによって決定することができる。力価は、アッセイ対照との比較によって決定された、５０％の細菌死滅をもたらす最高希釈率の逆数として報告する。
また、全細胞ＥＬＩＳＡアッセイを用いてもｉｎ ｖｉｔｒｏの免疫原性および抗原の表面曝露を評価することができ、ここでは、対象の細菌株（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））を９６ウェルプレートなどのプレート上にコーティングし、免疫化された動物からの試験血清を細菌細胞と反応させる。試験抗原に特異的な任意の抗体が抗原の表面曝露されたエピトープと反応性を有する場合は、当業者に知られている標準の方法によってこれを検出することができる。
その後、所望のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を実証する任意の抗原をｉｎ ｖｉｖｏ動物免疫誘発モデルで試験することができる。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、当業者に知られている免疫化の方法および経路（たとえば、鼻腔内、非経口、経口、直腸、経膣、経皮、腹腔内、静脈内、皮下など）によって、動物（たとえばマウス）の免疫化に使用することができる。動物を特定のブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．の免疫原性組成物で免疫化した後、動物をブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．で免疫誘発し、ブドウ球菌感染症に対する耐性についてアッセイする。
一実施形態では、病原体を有さないマウスを免疫化し、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）で免疫誘発することができる。たとえば、マウスを、１つまたは複数の用量の、免疫原性組成物中の所望の抗原で免疫化する。続いて、マウスを黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）で免疫誘発し、免疫誘発後に生存を経時的に監視する。
免疫化方法
また、ブドウ球菌感染症を予防するために宿主を免疫化する方法も提供される。好ましい実施形態では、宿主はヒトである。したがって、宿主または対象に、免疫原性量の、本明細書中に記載の免疫原性組成物を投与する。免疫原性量の免疫原性組成物は、対象を徐々に増加する量の免疫原性組成物で免疫化し、免疫応答を分析して最適な用量を決定する、用量応答研究を行うことによって決定することができる。研究の開始点は動物モデルの免疫化データから推測することができる。投薬量は、個体の具体的な状態に応じて変動する場合がある。量は、当業者に知られている手段によるルーチン的な試行において決定することができる。一部の実施形態では、ブドウ球菌感染症、疾患または状態を予防するために宿主を免疫化する方法は、ヒト、獣医学的、動物、または農業的な処置を含む。別の実施形態は、対象においてブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．に関連するブドウ球菌感染症、疾患または状態を予防するために宿主を免疫化する方法を提供し、この方法は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を本明細書中に記載の免疫原性組成物から作製し、前記抗体調製物を用いて対象に受動免疫を与えることを含む。
適切な回数の用量の免疫学的に有効な量の免疫原性組成物を対象に投与して、免疫応答を誘発させる。処置した個体は、ブドウ球菌感染症のより重篤な臨床徴候を示さないはずである。投薬量は、年齢および重量などの個体の具体的な状態に応じて変動する場合がある。この量は、当業者に知られている手段によるルーチン的な試行において決定することができる。
一実施形態では、本発明の免疫原性組成物を投与している患者は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の保菌率の低下を示す。免疫原性組成物を投与した後の、そのような保菌率の低下または非保菌者として過ごす時間間隔の延長は、医療の必要性の観点から顕著である。たとえば、保菌者における全体的な黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の保菌率の低下が、１回の用量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の複数抗原ワクチンの後に評価され得る。たとえば、免疫原性組成物を投与する１日前に、１８〜５０歳の年齢の成人群を経鼻および咽頭のスワブによって保菌率についてスクリーニングし、次いで培養してその保菌状態を決定し得る。次に、この群に、対照を受ける群と共に本発明の免疫原性組成物を投与することができる。経鼻および咽頭のスワブを週に１回、１２週間の期間にわたって行い、月に１回、免疫原性組成物の投与後の６カ月間までも行い、プラセボと比較する。１つの主なエンドポイントは、免疫原性組成物の投与後の患者対プラセボにおける保菌率を、免疫化後の３カ月間隔で比較することである。
ブドウ球菌感染症の動物モデル
本明細書中に記載の免疫原性組成物のうちの任意の１つの有効性を評価する際に使用するために、いくつかの動物モデルを以下に記載する。
ネズミ敗血症モデル（受動または能動）
受動免疫化モデル
マウスを、免疫ＩｇＧまたはモノクローナル抗体を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）で受動免疫化する。続いて、マウスを２４時間後に致死的用量の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）で免疫誘発する。すべての生存が抗体と細菌との特異的なｉｎ ｖｉｖｏ相互作用に起因すると考えることができることを確実にするために、細菌の免疫誘発は静脈内投与（ｉ．ｖ．）またはｉ．ｐ．である。細菌の免疫誘発の用量は、免疫化していない対照マウスのおよそ２０％で致死的な敗血症が達成されるために必要な用量であると決定されている。生存研究の統計的評価は、カプラン−マイヤー分析によって実施することができる。
能動免疫化モデル
このモデルでは、マウス（たとえばスイスウェブスターマウス）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）または皮下（ｓ．ｃ．）で、標的抗原を用いて、０、３および６週間（または他の同様の適切な間隔を空けたワクチン接種スケジュール）に能動免疫化し、続いて、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を用いて８週間目に静脈内経路によって免疫誘発する。細菌の免疫誘発の用量は、１０〜１４日間の期間にわたって対照群においておよそ２０％の生存が達成されるように較正されている。生存研究の統計的評価は、カプラン−マイヤー分析によって実施することができる。
感染性心内膜炎モデル（受動または能動）
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）によって引き起こされる感染性心内膜炎（ＩＥ）の受動免疫化モデルを以前に使用して、ＣｌｆＡが保護免疫を誘導できることが示されている。Ｖｅｒｎａｃｈｉｏら、Ａｎｔｍｉｃｒｏ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏ．、５０：５１１〜５１８（２００６）を参照されたい。このＩＥモデルでは、ウサギまたはラットを用いて、臨床的感染症を刺激し、これには中心静脈カテーテル、菌血症、および遠位臓器への血行性播種が含まれる。無菌的な大動脈弁の疣形成を有するカテーテル挿入したウサギまたはラットに、単一または複数の、標的抗原に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体の静脈内注射を投与する。続いて、動物を、ｉ．ｖ．で黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）株を用いて免疫誘発する。その後、免疫誘発後、心臓、心臓疣形成、および腎臓を含めた追加の組織、ならびに血液を採取し、培養する。その後、心臓組織、腎臓、および血液中のブドウ球菌感染症の頻度を測定する。１つの研究では、動物をＭＲＳＥ ＡＴＣＣ３５９８４またはＭＲＳＡ６７−０のどちらかで免疫誘発した際、ＣｌｆＡに対するポリクローナル抗体調製物またはモノクローナル抗体のどちらを用いても、感染率の有意な低下が示された。Ｖｅｒｎａｃｈｉｏら、Ａｎｔｍｉｃｒｏ．Ａｇｅｎｔｓ＆Ｃｈｅｍｏ．、５０：５１１〜５１８（２００６）を参照されたい。
また、感染性心内膜炎モデルは、ウサギおよびラットの両方における能動免疫化の研究にも適応されている。ウサギまたはラットを筋肉内または皮下で標的抗原を用いて免疫化し、２週間後に静脈内経路を介して黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）で免疫誘発する。
腎盂腎炎モデル
腎盂腎炎モデルでは、マウスを、０、３および６週目に（または他の適切な間隔を空けた免疫化スケジュールで）、標的抗原を用いて免疫化する。続いて、動物をｉ．ｐ．またはｉ．ｖ．で黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＰＦＥＳＡ０２６６を用いて免疫誘発する。４８時間後、腎臓を採取し、細菌ＣＦＵを数える。
抗体および抗体組成物
本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物の１つまたは複数の抗原に特異的かつ選択的に結合する抗体および抗体組成物を提供する。一部の実施形態では、抗体は、対象に本発明の免疫原性組成物を投与した際に産生される。一部の実施形態では、本発明は、本発明の免疫原性組成物の抗原のうちの１つまたは複数に向けられた、精製または単離した抗体を提供する。一部の実施形態では、本発明の抗体は、動物有効性モデルまたはオプソニン化貪食作用死滅アッセイのどちらかにおいて細菌を死滅させることによって測定して、機能的である。一部の実施形態では、本発明の抗体は対象に受動免疫を与える。本発明はさらに、本発明の抗体または抗体断片をコードしているポリヌクレオチド分子、および細胞または細胞系（抗体を組換え産生するのためのハイブリドーマ細胞または他の操作した細胞系など）、ならびに当業者に周知の技法を用いて本発明の抗体または抗体組成物を産生するトランスジェニック動物を提供する。
本発明の抗体または抗体組成物は、対象においてブドウ球菌感染症、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．に関連する疾患または状態を処置または予防する方法で使用してよく、この方法は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体調製物を産生させ、前記抗体または抗体組成物を用いて対象に受動免疫を与えることを含む。また、本発明の抗体は、診断方法、たとえば、本発明の免疫原性組成物の１つまたは複数の抗原の存在の検出またはそのレベルの定量においても有用であり得る。
実施例
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態を実証する。しかし、これらの実施例は例示目的のためのみであり、本発明の条件および範囲に関して完全に決定的であることを主張または意図しないことを理解されたい。典型的な反応条件（たとえば、温度、反応時間など）を与えた場合、指定した範囲を超えるまたは下回る条件をどちらも、一般には利便性が低下するが、使用できることを理解されたい。別段に指定しない限りは、本明細書中で言及するすべての部およびパーセントは重量に基づいており、すべての温度は摂氏で表現している。
さらに、以下の実施例は、別段に詳述した場合以外は、当業者に周知かつルーチン的である標準の技法を用いて実施した。以下の実施例は例示目的のために提示し、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ワクチンまたは免疫原性組成物として開発された、組換えクランピング因子Ａ（ｒＣｌｆＡ）、５型莢膜多糖コンジュゲート（ＣＰ５−ＣＲＭ１９７）および８型莢膜多糖コンジュゲート（ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）を含む安定な凍結乾燥した三抗原配合物が開示されている。特定の一実施形態では、ｒＣｌｆＡは、フィブリノーゲンとのその結合親和性を減少させるために操作した、表面発現病原性因子の変異型である（Ｙ３８８Ａ）（ｒＣｌｆＡｍ）。ＣＰ５およびＣＰ８は臨床単離物中に見つかる共通の多糖であり、このワクチン中では、担体タンパク質ＣＲＭ１９７とコンジュゲートしている。
視覚的に適切である凍結乾燥したケークを作製し、凍結乾燥したケークを再構成した際に活性構成要素は安定であった。さらに、実時間（２〜８℃）および加速（２５℃および３７℃）温度での、凍結乾燥した配合物の複数のロット（高および低用量を一括（ｂｒａｃｋｅｔ））の１カ月間の貯蔵により、凍結乾燥した三抗原配合物が安定に保たれたことが示された。さらに、３回の凍結融解サイクルおよび再構成後に室温で実施した２４時間の安定性試験は、それぞれ、これらの条件下で活性成分の安定性を示した。
また、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ワクチンまたは免疫原性組成物として開発された、組換えＣｌｆＡ、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７、ＣＰ８−ＣＲＭ１９７、およびＭｎｔＣを含む安定な凍結乾燥した四抗原配合物も開示されている。特定の一実施形態では、ＣｌｆＡは、フィブリノーゲンとのその結合親和性を減少させるために操作した、表面発現病原性因子の変異型である（Ｙ３８８Ａ）。特定の一実施形態では、ＭｎｔＣは脂質付加されていない。特定の一実施形態では、ＭｎｔＣは組換えである。三抗原配合物と同様、凍結乾燥した四抗原配合物は、同じ抗原を含む液体配合物と比較して大きく増加した安定性を有していた。
本発明の一部の実施形態は例示によって記載されているが、多くの改変、変形および適応を用いて、数々の均等物または当業者の範囲内にある代替の解決策を使用し、本発明の精神から逸脱せずに、または特許請求の範囲を超えずに、本発明を実施できることが明らかであろう。
すべての出版物、特許および特許出願は、それぞれの個々の出版物、特許または特許出願が、その全体で参考として組み込まれていると具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
プレフォーミュレーションの方法論
様々な生物物理学的ツール（微分ＵＶ吸光分光分析、蛍光分光分析、円二色性（ＣＤ）および示差走査熱量（ＤＳＣ））を使用して、構造的安定性のコンテキストにおける黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質の固有の特徴を検査した。温度およびｐＨが、ＣｌｆＡタンパク質の固有の構造的挙動の特徴づけを助けるためにタンパク質にストレスを与えるために使用した可変パラメータであった。その後、このデータを使用して、タンパク質に追加の安定性をもたらし得る賦形剤についてスクリーニングした。さらに、ＡｌＰＯ４およびＡｌ（ＯＨ）３に対するＣｌｆＡの用量およびｐＨ依存性親和性を評価するための結合研究を行った。本明細書中に開示されているデータを使用して、たとえばワクチンまたは免疫原性組成物としてなどの生物医学的な応用で使用するためのＣｌｆＡの配合物に到達した。
本発明は、任意かつすべてのクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）タンパク質およびＣｌｆＡ含有配合物を対象とするが、以下の実施例では、ＣｌｆＡのＮ１Ｎ２Ｎ３ドメインを含み、また、完全長ＣｌｆＡの位置３３８に対応するチロシンを置換したアラニンを含み、フィブリノーゲンと結合する能力を欠く、Ｙ３３８Ａ置換を有する、ＣｌｆＡ変異体を使用した。
最初の生物物理学的な特徴づけのために調製した試料は、１５０ｍＭのＮａＣｌ中の１０ｍＭの緩衝液（酢酸塩、コハク酸塩またはリン酸塩）から構成されていた。ＣｌｆＡの概ねの標的濃度は、蛍光では０．１ｍｇ／ｍＬ、円二色性（ＣＤ）では０．２ｍｇ／ｍＬ、およびＵＶ吸光分光分析では０．５ｍｇ／ｍＬであった。
タンパク質濃度は、市販の改変ローリータンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｌｏｗｒｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９３：２６５〜２７５［１９５１］）またはＵＶ吸光分光分析を用いて決定した。
円二色性（ＣＤ）を、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８１０分光旋光計を用いて行って、免疫原性組成物またはワクチン中のＣｌｆＡタンパク質の二次構造を評価した。タンパク質を５．０から８．０のｐＨ間隔で配合した場合のＣＤスペクトルの定性的な相違を観察することによって、ＣｌｆＡの構造に対するｐＨの効果を検査した。さらに、二次構造の観点からタンパク質のコンホメーション安定性を観察するために、温度撹乱実験を１０℃〜８５℃、２１８ｎｍで行った。２１８ｎｍの波長は、ＣｌｆＡの知られているＮ２Ｎ３構造は大量のβ−シート構造を含むために選択した。ＣＤ走査の実験パラメータには、１９０〜２６０ｎｍの波長範囲、２０ｎｍ／分の走査速度、２秒間の応答時間、１ｎｍの帯域、および３回の蓄積が含まれていた。温度撹乱実験は、Ｊａｓｃｏソフトウェアの可変温度モードを用いて、１５℃／時の温度勾配速度、１秒間の応答、および１ｎｍの帯域を使用して行った。
固有のトリプトファン蛍光発光分光分析を使用して、ＣｌｆＡタンパク質の三次構造の変化を温度の関数として監視した。また、方法を用いて、タンパク質構造の変化を実時間および加速研究中でも観察した。蛍光スペクトルは、２９５ｎｍの励起を用いてＰＴＩ ＱＭ−１（ニュージャージー州Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）蛍光光度計で記録した。使用したタンパク質の濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬであった。１ｃｍの経路長の石英キュベットを用いて、トリプトファンに特徴的な発光スペクトルを３２０〜３５０ｎｍで監視した。蛍光データが１０℃〜８５℃（２．５℃の間隔）、４．０〜８．０の一連のｐＨ値で得られた。バックグラウンド補正のために、緩衝液をブランクとして用いて対照実験を行った。機器の設定には、それぞれ４ｎｍおよび３ｎｍの励起および発光帯域、１秒間の積分時間、ならびに２９０ｎｍ〜４００ｎｍのデータ収集波長範囲が含まれていた。ＡｌＰＯ４を含有する配合物では、試料の濁度の限界を回避するために正面（三角形）キュベットの幾何学を使用した。データの分析は、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）７．０を用いて、平滑化のために二次多項式の１１点サビツキー（Ｓａｖｉｔｓｋｙ）−ゴーレイ関数を使用して行った。
二次微分ＵＶ吸光分光分析を用いた温度撹乱実験を、固有のタンパク質安定性を評価するためのＣｌｆＡの三次構造の検査の別の方法として使用した。Ｐｅｌｔｉｅｒ温度制御装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ８４５３ ＵＶ可視ダイオードアレイ分光計を用いて、多波長ＵＶ可視吸収スペクトルが２００ｎｍ〜４００ｎｍで得られた。１００μＬの体積を有する１ｃｍの経路長の石英キュベットをすべての実験で使用した。融解実験では、それぞれの温度変化後に４分間を許容し、これは平衡に達するために十分であるとみなされた。また、ＣｌｆＡタンパク質の潜在的な凝集を監視するために、３５０ｎｍでの光学密度データも温度の関数として収集した。
スペクトルの分析は、ＣＨＥＭＳＴＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行った。二次微分スペクトルは９点データフィルターを用いて得て、三次サビツキー−ゴーレイ多項式に当てはめた。それぞれの１ナノメートルの間隔の間に９９個のデータ点を用いて微分スペクトルを内挿し、非凝集条件下においておよそ０．０１ｎｍの有効な解像度が提供された。ＭＩＣＲＯＣＡＬ ＯＲＩＧＩＮ（商標）６．０を用いて微分スペクトルのピーク位置を選択した。アミノ酸残基フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンに対応するピーク位置を同定し（Ｋｕｅｌｔｚｏら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．、２００３、９２（９）：１８０５〜１８２０の方法に基づく）、温度の関数としてプロットした。
サイズ排除クロマトグラフィーは、ＴＯＳＯＨ ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、５μｍ、パート番号０８５４１を使用して、以下の条件を使用して実施した：流速、０．５ｍＬ／分、最大圧力、６０Ｂａｒ、実行時間、３０分間、移動相、Ｃｅｌｌｇｒｏ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、注入体積、１００μＬ、検出器、ＵＶ２８０、２６０、２１４ｎｍ、すべてに４ｎｍの帯域、参照、３４０ｎｍ、帯域の１６ｎｍ、温度、２５℃。
ＣｌｆＡタンパク質の融解温度（Ｔｍ）は示差走査熱量（ＤＳＣ）によって決定した。ＣｌｆＡ試料のＤＳＣプロフィールを、ＣｌｆＡ試料と同時に調製した、原薬（ＣｌｆＡ）によって占有されるはずの体積を緩衝液で置き換えた以外は対応する緩衝液に対して測定した。機器の設定は以下のとおりであった：走査速度、２００℃／時、走査範囲、１０〜９０℃、フィルター期間、８秒間、フィードバックモード／ゲイン、中。それぞれの走査の後、ＤＳＣセルおよびシリンジを注射用水（ＷＦＩ）で３〜５回すすいた。再走査実験を行う場合は、次の実行のために浄化されたセルを確実にするために、セルの浄化サイクルには１０％のＣｏｎｔｒａｄ（Ｄｅｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、英国Ｅａｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ）の使用が含まれていた。
微量熱量測定毛細ＤＳＣを、賦形剤をスクリーニングするための高スループットのプラットフォームとして使用した。それぞれの賦形剤のスクリーニング実験において、１０ｍＭのコハク酸塩緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中のＣｌｆＡをＴｍの変化の計算の基礎として用いた。見かけのＴｍを２つ組のＤＳＣ試料で得て、その後、平均Ｔｍを、同じＤＳＣの実行における賦形剤を含まない配合物の平均Ｔｍと比較した。それぞれの賦形剤／濃度の効果を、Ｔｍの変化の効果によって比較した。賦形剤の存在下におけるＴｍの正の変化は、ＣｌｆＡの熱安定性に対する正の効果であるとみなされた。ΔＧの計算には、ΔＣＰを手動で選択した転移前および後のベースラインから計算し、その後、曲線およびベースラインの間の面積を積分することによってΔＨおよびＴｍを計算した。ΔＧの曲線はＭｉｃｒｏｃａｌ ＤＳＣソフトウェアを用いて計算した。
ＣｌｆＡ薬物製品のプレフォーミュレーション：結果
温度（１０〜８５℃）およびｐＨ（４．０〜８．０）の薬学的に関連性のあるストレスを薬物製品（液体の配合したＣｌｆＡ）および原薬（液相中の配合していないＣｌｆＡタンパク質）に与えて、その感受性を同定した。
固有のトリプトファン蛍光熱融解研究をｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の様々なｐＨでＣｌｆＡ試料に対して実施し、蛍光発光曲線を作成した。これらの実験では、ＣｌｆＡは一般に０．１ｍｇ／ｍｌ〜０．２ｍｇ／ｍｌの濃度であった。それぞれの曲線の変曲点は融解温度（Ｔｍ）であると同定され、表４に一覧表にした。１０℃では、より高いｐＨ値の試料はより高い波長でピーク位置を示し、トリプトファン残基が溶媒により曝露されていたことを示唆している。さらに、より高いｐＨ値では、ＣｌｆＡはより低いＴｍ値を示し、これは、ｐＨ５．５および６．０などのより低いｐＨ値と比較してより低い安定性を示している。ｐＨ５．５から６．５の、０．２のより細かい増量のｐＨパネル（表５）により、ｐＨの減少に伴ってＴｍが徐々に増加することが示された。
円二色性（ＣＤ）分光分析を用いて、ＣｌｆＡの二次構造をｐＨの関数として検査した。特に、ｐＨ７．０およびｐＨ８．０で得られたスペクトルは、約２００ｎｍおよび２２０ｎｍで明確に定義された最小値を示した。この観察の１つの可能性の高い解釈は、約２２０ｎｍでの最小値は、知られているＮ２Ｎ３構造のβ−シート構成要素が原因である可能性があり、約２００ｎｍでの最小値は、通常は１９５ｎｍ付近で見られるランダムコイルの最小値に近づいていることである。これらの観察は、ＣｌｆＡタンパク質がｐＨ７．０およびｐＨ８．０でわずかにより折り畳まれていないという蛍光データを支持している。
ｐＨ４．０〜８．０のＣｌｆＡのＣＤ融解を１０℃〜８５℃で行い、それぞれのｐＨ点でのモル楕円率を吸光度の関数を示す曲線を作成した。様々なｐＨ値にわたる曲線の形状を観察した。ｐＨ６．０以上でのデータはすべて、５５℃付近であると視覚的に推定することができる、同様の転移を有するように見えた。ｐＨ５．０および５．５での曲線は、より高い転移を有する。さらに、ｐＨ５．０は最大の程度の変化を示し（楕円率の値で）、これは、β−シート含有量の最大の増加を示している。増加したβ−シートは凝集した試料中で典型的であるため、ｐＨ５．０で、ＣｌｆＡタンパク質が高温での自己会合の傾向が最も高いことを示している可能性がある。
Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３ ＵＶ可視分光光度計を用いて３５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ３５０）を測定し、Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの分光蛍光光度計を用いて直角光散乱を温度の関数として測定して、シグナル強度の増加に対応しており、ＣｌｆＡタンパク質の凝集に相関している可能性のある粒子径の増加を観察した。注目に値する転移がｐＨ４．０、５．０および５．５での温度追跡で観察され、ｐＨ４．０が最大の程度の変化（最大の凝集）を有していた。対照的に、ｐＨ６．０以上では小さな徐々の上昇変化しか示されず、これは少量の自己会合現象を示している。
直角光散乱は、オリゴマー化（凝集）の検出においてＯＤ３５０よりも感受性のある技法である。この技法から得られたデータによれば、ＣｌｆＡの凝集の最も早い開始はｐＨ５．０および５．５で見られた一方で、より高いｐＨ値では、粒子径の増加に１５℃までもの遅延が示された。
ＣｌｆＡの構造的安定性は、ｋｃａｌ／モル／℃で測定されたエンタルピーの変化を測定する、示差走査熱量（ＤＳＣ）によって特徴づけられた。ＤＳＣ分析によれば、ＣｌｆＡの展開は可逆的であることが観察され、単一の転移が約５５．５℃で注目された。この転移のエンタルピーは、およそ１０ｋＣａｌ／モルであると計算された。
また、ＣｌｆＡのＴｍも濃度の関数として測定し、これは０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬから一貫して決定することができる。ＣｌｆＡのＴｍはタンパク質濃度の増加に伴って変化しないことが観察され、これは、ＣｌｆＡがほとんど単量体として存在することを示している。この観察は、本明細書中以下に開示するサイズ排除クロマトグラフィーのデータと一貫している。
また、ＣｌｆＡのＴｍは、毛細ＤＳＣによってｐＨの関数としても決定した（表６）。これらの実験では、ＣｌｆＡのＴｍは、ｐＨ５．０〜８．０で約５５〜５６℃にプラトーに達することが観察されたが、ＴｍはｐＨが増加するにつれて下降する傾向にある。ｐＨ４．０でのＣｌｆＡのＴｍは５０．８℃でしかなく、これは、このｐＨでのＣｌｆＡの構造的な不安定性を示している。これらのＤＳＣ実験では、ＣｌｆＡの濃度は１．０ｍｇ／ｍｌであった。また、ＤＳＣによって決定されたＣｌｆＡのＴｍをトリプトファン（Ｔｒｐ）蛍光ピークシフト（上記）によって決定されたＴｍとも比較した。Ｔｒｐ蛍光によって決定されたＴｍは、ｐＨ４．０〜ｐＨ５．５でＤＳＣによって決定されたＴｍと一貫していた。しかし、Ｔｒｐ蛍光によって決定されたＴｍは、ｐＨが６．０から８．０に増加した際に急激に減少した。可能性のある説明は、ｐＨが６．０から８．０に増加するにつれてＮ３ドメインが展開されることである。ＣｌｆＡ中には２個のトリプトファンしか存在せず、これらはどちらもＮ３ドメイン上に位置している。６．０から８．０のｐＨの増加に伴った、Ｔｒｐ蛍光によるＴｍの急激な減少は、これらの残基がより極性の環境に曝露されたことを示しており、これは通常、タンパク質の展開の指標である。
ＣｌｆＡ薬物製品は、事前にシリコン処理された、事前に充填されたシリンジ中で送達することができる。注射筒およびプランジャー上のシリコン油によって引き起こされるタンパク質凝集を防止するため、ならびにとりわけガラス表面へのタンパク質の吸着を防止するために、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）をしばしば最終薬物製品の配合物中に含める。ＰＳ８０は、タンパク質を潜在的に不安定化させる可能性がある洗剤であるため、ＣｌｆＡのＴｍをＰＳ８０の存在下で評価した。表７は、ポリソルベート８０の存在または非存在下における１．０ｍｇ／ｍｌのＣｌｆＡを用いた毛細ＤＳＣ実験の結果を要約しており、これはＰＳ８０の存在がＣｌｆＡのＴｍを約１℃減少させたことを示しており、これは、ＰＳ８０を含まないＣｌｆＡのＴｍ配合物とは統計的に有意に異なっている。
ＣｌｆＡのＴｍに対するＡｌＰＯ４の効果も評価した。ＡｌＰＯ４と結合したＣｌｆＡのＴｍを測定するために、０．１ｍｇ／ｍＬのＣｌｆＡをコハク酸塩−生理食塩水を用いてｐＨ５．０で配合し、その溶液中、ＣｌｆＡのほとんどはアルミニウムと結合していた。結合したＣｌｆＡのＴｍを、同じ濃度のリン酸アルミニウムを含有する対応する緩衝液に対して測定した。その実験の結果により、ＣｌｆＡのＴｍは、リン酸アルミニウムと結合していないＣｌｆＡ（すなわち、５６．３４℃±０．１５℃）と比較して、結合した場合に特に変化しなかったことが示された（すなわち、５６．１６℃±０．１２℃）。
薬物製品の緩衝液の種類、濃度およびイオン強度の選択を支持するために、Ｔｍの変化を高／低塩の配合物ならびに様々な濃度のヒスチジンおよびコハク酸塩緩衝液の配合物で決定した。表８により、ＮａＣｌの濃度またはコハク酸塩緩衝液の濃度の増加に伴ってＣｌｆＡのＴｍが増加したことが示された。しかし、ＣｌｆＡのＴｍは、試験したヒスチジン−生理食塩水の緩衝液の配合物のいずれにおいても増加しなかった。
糖、ポリ−オール、およびアミノ酸などの知られている医薬的安定化剤の賦形剤を、基本配合物（１０ｍＭのコハク酸塩緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０中の０．６ｍｇ／ｍＬのＣｌｆＡ）と比較した、ＣｌｆＡのＴｍに対するその影響についてスクリーニングした。表９は、ＣｌｆＡのＴｍの増加がＣａＣｌ２、トレハロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、およびグルタミン酸の濃度に依存していることを示している。しかし、アルギニンはＣｌｆＡのＴｍを減少させた。プロリンはＣｌｆＡのＴｍに対して有意な効果を与えなかった。タンパク質に対する賦形剤の効果はタンパク質依存性であり、したがって、当業者は、賦形剤が有する効果を経験的に知っているであろう。スクロース、ソルビトール、ＣａＣｌ２および高濃度のＮａＣｌは、Ｔｍを増加させただけでなく、４℃でΔＧも増加させた。表１０は、ＰＳ８０の存在下においても、ＣｌｆＡのＴｍを２℃〜３℃上昇させる、賦形剤の相加効果を示す。
ＣｌｆＡおよびＡｌＰＯ４の実効表面荷電を、結合の予測材料として使用する４．０〜８．０のｐＨの関数として得た。研究に使用した緩衝系は、酢酸塩（ｐＨ４．０〜５．０）、コハク酸塩（ｐＨ５．５〜６．５）およびリン酸（ｐＨ７．０〜８．０）であった。ＣｌｆＡのゼータ電位プロフィールは、ｐＨ４．０〜５．０の間のどこかでゼロ荷電の点と交差する。（ゼータ電位はコロイド系中の薬剤の界面動電位の測度である。Ｌｙｋｌｅｍａ，Ｊ．、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第２巻、頁３、２０８、１９９５を参照。）これは、ＣｌｆＡが４の前半のｐＩ値を保有するということと一貫している。さらに、ＡｌＰＯ４のゼータ電位プロフィールも、約５．５〜５．８のそのｐＩと一貫していることが判明した。したがって、最良の結合は、２つの実体がおよそｐＨ４．５〜５．５で逆の実効電荷を有する場合に起こるであろう。ローリーアッセイにより、最良の結合は、０．０２０および０．１００ｍｇ／ｍＬのＣｌｆＡの濃度のどちらにおいてもｐＨ５．０で起こったことが示された。Ａｌ（ＯＨ）３の曲線では逆の傾向が当てはまり、ｐＨ５．０が最低の結合を示した。Ａｌ（ＯＨ）３は、試験したどのｐＨ値でも１００％の結合を達成することはなかった。
ＡｌＰＯ４の濃度滴定（０．２５、０．５０、０．７５ｍｇ／ｍＬ）結合実験を、ＣｌｆＡを用いてｐＨ５．０、５．５、および６．０で実施した。これらの実験によれば、ＣｌｆＡはｐＨ６．０でタンパク質濃度に非感受性であると見られ、一貫して約５０％の結合を達成した一方で、ｐＨ５．０のタンパク質は、ＡｌＰＯ４の増加に付随する結合の増加を示した。ＣｌｆＡは、ｐＨ５．０およびより低いタンパク質濃度で最良の結合を達成することが観察され、濃度が増加するにつれて結合は減少した。さらに、ｐＨ５．５および６．０はどちらも同じ傾向を示したが、結合はこれらのｐＨ値のどちらでも、最低の用量でさえも十分ではなかった。
ｐＨ６．０での結合を改善させる試みにおいて、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのグリシン、３００ｍＭのリシン、２０ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＥＤＴＡを含めたいくつかの賦形剤を、様々なＮａＣｌ濃度と共に試験するために選択した。ｐＨ６．０ではＣｌｆＡおよびＡｌＰＯ４はどちらも負荷電であるため、賦形剤の多くはその陽イオン性特徴が原因で選択された。改変ローリーアッセイを用いてパーセント結合タンパク質を試験した。このアッセイによれば、どの賦形剤も、１５０ｍＭのＮａＣｌ対照と比較して顕著な改善を示すことが観察されなかった。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：要約
ＣｌｆＡは一般に不安定なタンパク質であるとみなされており、これは、これがＮ１ドメインおよびＮ２ドメインの間の加水分解または「クリッピング」を容易に受けて、１つがＮ１ドメインを含有し、別のものがＮ２Ｎ３ドメインを含有する、少なくとも２つの断片を生じることを意味する。安定性とは、たとえばＮ１およびＮ２Ｎ３ペプチド断片が含まれる分解生成物と比較して実質的に分解されていないＣｌｆＡを含有する、加水分解されていないＣｌｆＡの相対量を意味する。実質的に分解されていないＣｌｆＡの相対量が多ければ多いほど、タンパク質はより安定である。
サイズ排除ＨＰＬＣで見られるように、液体配合物中のＣｌｆＡタンパク質（上記）は、Ｎ１およびＮ２Ｎ３ドメインの間のクリッピングを受けたことが観察された。注意深く選択した賦形剤を用いたスクリーニングの後、液体の不安定性に基づいて、凍結乾燥を液体配合物の代替として調査した。注射用水（ＷＦＩ）（ＮａＣｌがわずかまたは存在しない）中の１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、０．０１％のポリソルベート８０、および４．５％のスクロース（充填剤）の改変した凍結乾燥配合物を用いて、４つのＣｌｆＡ原薬のロットを検査した。４つすべてのロットの結果により、ＣｌｆＡの凍結乾燥した配合物は、３カ月間まで、実時間および加速（３７℃）温度でタンパク質をクリッピングから安定化させることに成功したことが示された。逆相ＨＰＬＣを用いた配合物の分析により、凍結乾燥が、観察した時点全体にわたって脱アミド化および酸化などの他の修飾を防止したことが実証された。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力試験（すなわちＢＩＯＶＥＲＩＳ試験）により、ＣｌｆＡが３カ月間にわたってその効力を維持していたことが明らかとなった。
また、配合物（薬物製品）およびタンパク質自体（原薬）に対する凍結乾燥の効果を監視するために、凍結乾燥した薬物製品を、生物物理学的（ｐＨ、カールフィッシャー電量分析による水分［Ｓｃｈｏｌｚ、Ｅｕｇｅｎ、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ、Ｊ．ｏｆ Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、３４８（４）：２６９〜２７１、１９９４年４月を参照］、ＯＤ３５０、重量モル浸透圧濃度、円二色性、ＵＶ吸光分光分析、示差走査熱量）方法、分離方法（ＨＰＬＣ）、および効力（ＢＩＯＶＥＲＩＳ）方法によっても特徴づけた。複数の方法を用いた分析により、タンパク質の特徴が凍結乾燥の前および後で同様であったことが示唆された。さらに、凍結乾燥配合物の予備最適化として、攪拌、凍結融解、および賦形剤スクリーニングの実験を行った。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：凍結乾燥
凍結乾燥前に、バイアルを６５０μｌの液体配合物で充填した。凍結乾燥後、分注体積にシリンジ内のデッドスペースが考慮されるように、シリンジを用いた再構成体積を決定することが必要であった。この実験では、シリンジに０．５５、０．６０、０．６５、および０．７０ｍＬの希釈剤を充填した。希釈剤を凍結乾燥したバイアル内に押し出し、再構成された液体をシリンジ内に引いて戻した。その後、液体を分注して秤で秤量した。液体の密度がおよそ１ｇ／ｍＬであると仮定し、およそ０．５ｍＬのワクチンを患者に送達するために、バイアルはおよそ０．６５ｍＬのワクチンを含有していなければならないと決定された。０．５ｍＬを超える体積は許容されるが、およそ０．５ｍＬ未満の体積は好ましくない。
２つの凍結乾燥前の液体配合物のロット、Ｌ３６０５１−８１−１およびＬ３６０５１−８１−２の濾過回収をＳＥ−ＨＰＬＣによって監視した。使用したフィルターはＭｉｌｌｉｐｏｒｅの０．２２μｍのＰＶＤＦ膜であった。ＣｌｆＡの回収はどちらのロットでも＞９９％であった。
Ｖｉｒｔｉｓ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＥＬ３５凍結乾燥機を、本明細書中で報告したすべての配合物で使用した。例示的かつ非限定的な凍結乾燥実行サイクルのパラメータを表１１に示す。ロットＬ３６０５１−４４（ＤＳ Ｌ３５８１２−５９）には徐冷ステップが含まれなかった一方で、残りの３つのロットは徐冷ステップを用いて調製した。
水分は、試料オーブンに接続したＢｒｉｎｋｍａｎｎ電量計を用いて、カールフィッシャー化学によって測定した。乾燥窒素ガスを使用して水分を試料からカールフィッシャーセル内に運んだ。５．５％の乾燥水分標準を用いて系の性能を監視する。オーブンを用いて、水標準を２３０℃で測定し、凍結乾燥した試料を１１５℃で測定する。一般に、成功した凍結乾燥サイクルは、すべての他の望ましい生成物の特徴を保持したままで最少量の水を含有する。
１０個のランダムな凍結乾燥後の配合物のバイアルをそれぞれのロットから検査し、視覚的特徴について評価した。ロット間のケークの品質は比較できるほどであったが、徐冷ステップを用いずに調製したロットＬ３６０５１−４４は、徐冷ステップが含まれていた他のロットよりも大きな縮みを示した。全体的に、ケークは白色および海綿状であり、良好な構造的完全性を示していた。１つの特定の配合物ロット（徐冷を用いたもの）の１０個の個々の凍結乾燥生成物の視覚的特徴を表１２に示す。
配合物の物理的属性を凍結乾燥の前および後に特徴づけた。試料を凍結乾燥後におよそ６３０μｌの生理食塩水で再構成した（ロット４４は１５０ｍＭのＮａＣｌで再構成した一方で、他のロットは５０ｍＭのＮａＣｌで再構成した）。再構成後の重量モル浸透圧濃度は、５０ｍＭのＮａＣｌを使用した場合に約２９０ｍＯｓｍの生理的標的に近かった。凍結乾燥したケークを希釈剤で再構成した場合にｐＨ値は６．０±０．３に保たれたことが観察された。さらに、すべてのロットの再構成時間は３０秒間未満であった。共栓中の窒素のバックフィルの結果として、希釈剤をケークに加えた際に一過性の微小気泡が生じた。
ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの改変ＤＳＣ機器を用いて、凍結乾燥前の液体のガラス転移温度（Ｔｇ’）を特徴づけた。Ｔｇ’は、非晶質の固体が冷却の際に高レベルの水素結合形成を伴って脆性のガラス質状態に達する温度として定義される。Ｔｇ’より高い温度では、より高い分子流動性が可能となる。Ｔｇ’の実験的取得は、高品質のケークおよび安定な生成物を達成するための凍結乾燥サイクルの最適化に重要である。零下の温度で走査するその能力のために、改変ＤＳＣ機器をＴｇ’の測定に使用した。
ケークのガラス転移（Ｔｇ’）および水分含有率を凍結乾燥手順の最適化中に考慮した。凍結乾燥の徐冷段階中に試料がそのガラス転移よりも高いことが重要である。凍結乾燥の徐冷ステップは−１０℃であり、これはすべての配合物で−３４．６℃±０．８℃のＴｇ’よりも高い。また、タンパク質および水が反応し、それにより生成物の安定性および貯蔵寿命が低下することを防止するために、凍結乾燥手順によりケークが十分に乾燥されることも重要である。凍結乾燥手順の結果、すべての配合物で１％未満（すなわち、０．４２％±０．１９％）の水がもたらされた。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：熱安定性
ＭＩＣＲＯＣＡＬ ＶＰ−示差走査熱量計（ＤＳＣ）を使用して、ＣｌｆＡの固有の熱安定性を特徴づけた。１０℃〜１００℃の熱勾配により、タンパク質が融解する温度（Ｔｍ）および展開（融解）現象に必要なエンタルピーの変化（ΔＨ）が明らかとなった。これにより、タンパク質の折畳み特徴（すなわち二次および三次構造）ならびにコンホメーションが凍結乾燥後に変化されたかどうかに関する情報が提供される。
Ｍｉｃｒｏｃａｌ毛細ＤＳＣを用いた示差走査熱量（ＤＳＣ）を凍結乾燥の前および後のＣｌｆＡのロットで行って、配合物の融解温度（Ｔｍ）を比較した。すべての試験したロットで凍結乾燥の前および後で類似のＴｍ値および展開エンタルピー（ΔＨ）が明らかとなり、これは、タンパク質の全体的な折畳みが凍結乾燥の前と後で変化しないことを示唆している。凍結乾燥前の平均Ｔｍは５５．２℃±０．１４℃であり、それと比較して、凍結乾燥後では５５．２℃±０．１６℃であった。凍結乾燥前の平均ΔＨは１．９０×１０６±０．１２×１０６ｃａｌ／モル／℃であり、それと比較して、凍結乾燥後では１．９０×１０６±０．１１×１０６ｃａｌ／モル／℃であった。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：抗原の二次構造
円二色性（ＣＤ）を用いて、凍結乾燥の前および後のそれぞれの配合物中のタンパク質の二次構造を評価した。すべての実験はＪａｓｃｏ Ｊ−８１０分光旋光計で行った。ＣＤ走査の実験パラメータには、１９０ｎｍ〜２６０ｎｍの波長範囲、２０ｎｍ／分の走査速度、２秒間の応答時間、１ｎｍの帯域、および３回の蓄積が含まれていた。コハク酸塩、スクロースおよびＮａＣｌを含有する同一の緩衝液基質をバックグラウンドの減算に使用した。
円二色性（ＣＤ）は、α−ヘリックスおよびβ−シートなどのタンパク質の二次構造のスペクトルの指紋を提供する。凍結乾燥の前および後のＣｌｆＡのロットの比較により、凍結乾燥の前および後のスペクトルの全体的な形状は変化しなかったことが示され、これは、すべてのロットが凍結乾燥および再構成の手順の間中ずっと、その二次構造を維持していたことを示唆している。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：抗原の三次構造
二次微分ＵＶ吸光分光分析を、凍結乾燥の前および後の固有のタンパク質安定性を評価するための抗原の三次構造の検査の別の方法として使用した。Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３ ＵＶ可視ダイオードアレイ分光計を用いて、多波長ＵＶ可視吸収スペクトルが２００ｎｍ〜４００ｎｍで得られた。１００μＬの体積を有する１ｃｍの経路長の石英キュベットをすべての実験で使用した。
スペクトルの分析は、ＣＨＥＭＳＴＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行った。二次微分スペクトルは９点データフィルターを用いて得て、三次サビツキー−ゴーレイ多項式に当てはめた。それぞれの１ナノメートルの間隔の間に９９個のデータ点を用いて微分スペクトルを内挿し、非凝集条件下においておよそ０．０１ｎｍの有効な解像度が提供された。ＭＩＣＲＯＣＡＬ ＯＲＩＧＩＮ（商標）６．０を用いて微分スペクトルのピーク位置を選択した。アミノ酸残基フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンに対応するピーク位置を同定し、温度の関数としてプロットした。
４つのロットのうちの３つで（ロット−４４、−８１−１および−８１−２）、フェニルアラニン／チロシン領域（２６０ｎｍ〜２７０ｎｍ）中の一部の相違が凍結乾燥後に見られた。しかし、ロット−７２は良好なオーバーレイを示した。このロットは最も高い残留ＮａＣｌを含有していた（バルク基質からの持ち越し）。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：構造的安定性：Ｎ１のクリッピング
サイズ排除ＨＰＬＣを用いて、安定性研究のために一定期間にわたって様々な温度に保持した、凍結乾燥前の薬物製品、再構成した凍結乾燥後の薬物製品、および再構成した薬物製品の初期品質を評価した。この方法では、単量体、二量体、オリゴマー（二量体より大きい）および分解生成物（Ｎ１とＮ２Ｎ３ドメインとの間の切断による）を含めた様々な大きさのＣｌｆＡ種を検出することができ、したがって、これを、凍結乾燥前の液体配合物およびその凍結乾燥した対応物の安定性を比較するための主な技法のうちの１つとして使用した。
２〜８℃、２５℃、および３７℃におけるＣｌｆＡの液体および凍結乾燥した配合物の安定性を、２つのＨＰＬＣ方法によって監視した。サイズ排除ＨＰＬＣを用いてＮ１およびＮ２Ｎ３ドメインの切断を検出した一方で、逆相ＨＰＬＣを用いてタンパク質の任意の化学分解（すなわち、脱アミド化、酸化）を経時的に監視した。
図２のパネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤは、すべて２〜８℃、２５℃および３７℃でインキュベーションし、ＳＥ−ＨＰＬＣによって経時的に監視した、４つのＣｌｆＡの凍結乾燥したロットの一次動力学的プロットを、液体対応物と比較して例示する。結果はｌｎ［Ｃ］対時間としてプロットし、Ｃは、切断された分解生成物を排除したインタクトな抗原（二量体＋単量体）の濃度である。３カ月間までの最小限のＣ変化によって示されるように、４つのロットはすべて、３つのインキュベーション温度すべてにおいて凍結乾燥した生成物の一貫した安定性を示す。対照的に、凍結乾燥前の液体試料は、温度の増加に伴って比例した速度の分解の増加を示す。ロットＬ３６０５１−４４液体対応物（Ｌ３６０５１−３７−１）は、１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、０．０１％のポリソルベート８０および１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する液体配合物（凍結乾燥前の配合物に対抗）であることに注目されたい（図２Ａ）。しかし、ロット−３７−１の温度の関数としての全体的な傾向は、凍結乾燥前の液体のものに類似している。
図３は、２〜８℃、２５℃、および３７℃で３カ月間保管したケークと比較した、ｔ＝０での凍結乾燥したＤＳ Ｌ４０１８４−６１の代表的なＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを例示している。積み重ねたクロマトグラムのプロフィールは同一に見え、二量体または分解生成物のピークの明らかな増加は存在しない。他の３つの凍結乾燥したロットは同様の結果を示した。
液体（凍結乾燥前）および凍結乾燥したＣｌｆＡ配合物のロットの比較を実施した。２〜８℃、２５℃、および３７℃で４週間保管した後の、凍結乾燥した配合物を凍結乾燥前の液体と比較した、代表的なＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。凍結乾燥した試料は、３つすべての貯蔵温度にわたって、特に主単量体ピークのすぐ右の分解生成物領域付近で良好なオーバーレイを示した。対照的に、液体配合物は、分解生成物のピークに顕著な増加を示した（図４、丸印）。さらに、凍結乾燥したピークはオリゴマーピークのわずかな存在を示し（主単量体ピークの左側、図４）、これはすべての凍結乾燥したロットに共通した属性である。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：構造的安定性：タンパク質の修飾
逆相ＨＰＬＣは、タンパク質の品質および完全性の特徴づけを提供するためにしばしば使用される分析方法である。分析物の分離は、タンパク質間でわずかに変動し得る、様々な種の疎水性の相違に基づいている。その結果、逆相ＨＰＬＣアッセイは、典型的には、対象のタンパク質と、たとえば、タンパク質分解生成物、配列修飾（脱アミド化や酸化など）を有するタンパク質、および残留宿主細胞タンパク質不純物、ならびに切断物との間の良好な分離を提供することができる。このアッセイを用いて、安定性研究においてタンパク質の品質に関するデータを経時的に提供した。
ＳＥ−ＨＰＬＣデータと同様、逆相クロマトグラムは、３７℃、２５℃および２〜８℃で３カ月後に、新しく作製した配合物と比較して、凍結乾燥した生成物で類似のプロフィールを示す。
凍結乾燥した安定性研究の過程中、ｐＨ、水分、およびＯＤ３５０を監視した。ｐＨ値は標的ｐＨの±０．０３単位以内に保たれるべきであり、水分は＜３％であるべきである。ＯＤ３５０は、凝集した粒子によって散乱された光の測度である。典型的には、検出可能な凝集体の非存在は＜０．０３のＯＤ３５０値を返す。図５のパネルＡ、ＢおよびＣは、複数の凍結乾燥したロットから合わせたデータであり、３つパラメータがすべて３カ月間にわたって良好な安定性を示すことを実証している。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：ＢＩＯＶＥＲＩＳによって決定された効力
ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力アッセイを用いて、安定性研究中の選択された時点でのＣｌｆＡタンパク質の機能的エピトープの持続性を評価した。ＢＩＯＶＥＲＩＳプラットフォームをこの目的に使用した。このアッセイでは、１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ１２−９）を使用して抗原を捕捉し、異なるエピトープに対して産生させた別のモノクローナル抗体（ｍＡｂ１５ＥＣ６）を使用して抗原の存在をＥＣＬ検出で検出した、サンドイッチ様式を用いた。モノクローナル抗体１２−９は、ＣｌｆＡのＮ３ドメインを認識してそれと結合する抗体であり、一方で、ｍＡｂ１５ＥＣ６は、ＣｌｆＡのＮ２ドメインを認識してそれと結合する。
ＢＩＯＶＥＲＩＳ抗体競合アッセイ系を用いて、ロットＬ３６０５１−８１−１（ＤＳ Ｌ４０１８４−６１）およびＬ３６０５１−８１−２（ＤＳ Ｌ４０１８４−６２）におけるＣｌｆＡの効力を３カ月間まで監視した。凍結乾燥した、および凍結乾燥前の液体配合物はどちらも、２〜８℃、２５℃、および３７℃で３カ月の期間にわたって効力の減少を示さなかった。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：賦形剤の効果
ＣｌｆＡの安定性が確立された後、（１）配合物の構成要素の規格を設定するため、（２）ケークの化粧性を最適化するための賦形剤をスクリーニングするため、（３）プロセス設計のコンテキストにおいて配合手順を理解するため、ならびに（４）原薬および薬物製品の凍結融解耐容性を検査するために、さらなる研究を計画した。
０．２ｍｇ／ｍｌのＣｌｆＡおよび１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０を含有する凍結乾燥緩衝液基質中で、スクロース含有率を３％〜４．５％〜６％ｗ／ｖに変動させながら、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）の滴定を行った。ＰＳ８０濃度の範囲は０〜０．００５％〜０．０１％ｖ／ｖであった。この実験は、（１）凍結乾燥前の液体配合物中でのポリソルベートの必要性を決定するため、（２）凍結乾燥前の液体配合物中でのポリソルベートの規格濃度を設定するため、および（３）凍結乾燥前の液体配合物中でのスクロース濃度の規格を設定するために行った。
様々なＰＳ８０およびスクロース濃度を用いて攪拌実験を行った。図６のパネルＡ、ＢおよびＣは、Ｌ４０１８４−６１（２００μｇ／ｍｌのＣｌｆＡ、６％のスクロース、１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、０．００５％のＰＳ８０）およびＬ４０１８４０−６２（２００μｇ／ｍｌのＣｌｆＡ、４．５％のスクロース、１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、０．０１％のＰＳ８０）の配合物の、室温で２４時間の攪拌後の、ＳＥ−ＨＰＬＣによる、パーセント二量体、パーセント単量体、およびパーセント分解生成物（切断）の結果を示す。ＰＳ８０を含有しない配合物は、ｔ＝０試料と比較して攪拌後にパーセント二量体形成の増加を示した（図６Ｄ）。最も低い量のＰＳ８０（０．００５％）の存在下でさえも、二量体化の量はｔ＝０よりも少なく、これは、ＰＳ８０が配合物に有益であったことを示唆している。さらに、「ＰＳ８０なし」の対照のＳＥ−ＨＰＬＣ分析により、攪拌後により高次のオリゴマー（二量体より大きい）の存在が示された一方で、ＰＳ８０を含有する試料では示されなかった。したがって、ポリソルベート８０の推奨は０．０１±０．００５％で確立された。様々な量のスクロース（３、４．５、および６％）は、ＳＥＣデータの相違をまったく示さなかった。また、パーセント単量体および分解生成物は、ＰＳ８０の存在もしくは非存在、または様々な量のスクロースによって大きく影響を受けるように見えなかった。
混合研究を実施して、様々な賦形剤が、製造プロセスの配合／混合段階中にＣｌｆＡに有害作用を与えるかどうかを決定した。様々な賦形剤には、０％および５％のスクロース、０％および５％のトレハロース、ならびに４％のスクロースおよび１％のマンニトールのスクロースとマンニトールとの組合せが含まれていた。賦形剤は、凍結乾燥におけるその一般的な使用に基づいて選択した。これらの実験では、配合物基剤には、０．３ｍｇ／ｍｌのＣｌｆＡ、１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、および０．０１％のポリソルベート８０が含まれていた。試料を配合し、終夜２〜８℃で保管し、研究を翌朝に開始した。配合物を、Ｗｅｓｔ４４３２灰色ブチル共栓を備えた３０ｍＬのＳｃｈｏｔｔ１型ガラスバイアルに入れ、ＶＷＲマイクロプレート振盪器上に載せた。バイアルを連続的な５００ＲＰＭで、室温で混合し、ｔ＝０、２、４、８、および２４時間に試料採取し、ＳＥ−ＨＰＬＣを主アッセイとして使用した。
いくつかのロット（Ｌ３６０５１−９６−１、Ｌ３６０５１−９６−２、Ｌ３６０５１−９６−３、Ｌ３６０５１−９６−４、Ｌ３６０５１−１００−１、およびＬ３６０５１−１００−２）を混合研究において検査して、スクロース、トレハロースおよびスクロース／マンニトールが、２４時間、室温で混合した場合に、ＣｌｆＡの安定性に対して影響を与えるかどうかを決定した。図７のパネルＡ、ＢおよびＣは、一定期間にわたる、それぞれの配合物についてＳＥ−ＨＰＬＣによって報告されたパーセント分解生成物（切断）、パーセント二量体、およびパーセント単量体を表す。スクロース単独およびスクロース／マンニトール試料では、主要な分解は見られなかったが、トレハロースの配合物は、分解の顕著な増強を示した。二量体化の速度は、スクロース単独を用いたＣｌｆＡのどちらのＤＳロットでも比較できるほどであったが、ロット依存性の二量体の増加がトレハロースおよびスクロース／マンニトールで見られた。単量体の変化は、分解生成物および二量体の変化を反映していた。
スクロース、メチオニン、グリシン、およびマンニトールの様々な組合せをＣｌｆＡと共に配合し、続いて、加速安定性試験によってＣｌｆＡの安定性について試験した。加速安定性試験は、配合物（液体または凍結乾燥）を予定される貯蔵温度よりも高い温度で保管し、ＣｌｆＡタンパク質を分解の兆候について経時的に監視することを含む。凍結乾燥したＣｌｆＡの場合、推奨される貯蔵温度は２〜８℃であり、したがって、２５℃および３７℃は「加速」条件とみなされる。それぞれが０．３００ｍｇ／ｍｌのＣｌｆＡ、１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、およびポリソルベート８０を含有し、かつスクロース、メチオニン、グリシン、およびマンニトールの様々な組合せを含有する、８つの配合物（表１３を参照）を作製して、（１）ＣｌｆＡの凍結乾燥前の液体安定性、（２）凍結乾燥したケークの安定性、および（３）凍結乾燥したケークの化粧性に対するその効果を検査した。メチオニンはタンパク質の酸化を防止するその能力、グリシンは排除体積を介したその一般的な安定化属性、マンニトールはケークの化粧性を改善させるその性向のために選択された。液体配合物を加速安定性上に配置し、１週間にわたってＳＥ−ＨＰＬＣによって、および２週間目にＲＰ−ＨＰＬＣで監視した。凍結乾燥したケークは２〜８℃および３７℃で保管し、２カ月目に監視した。ケークの化粧性は、スクロースのみの配合物と比較して視覚的に評価した。
２〜８℃、２５℃、および３７℃で１週間後の液体試料のサイズ排除データにより、検査した賦形剤はどれも、スクロース単独の対照（配合物−１０９−１）と比較してＣｌｆＡの安定性（切断に関して）を改善させなかったことが示された。ｔ＝０では、すべての配合物は非常に類似したプロフィールを有していた。すべての配合物は、分解生成物によって引き起こされた、主ピークに隣接するより小さなピークの同時発生的な増加に連関して、主ピーク高のわずかな損失を温度の関数として示した。様々な賦形剤の存在は、スクロース単独の配合物を超えるどのような顕著な改善も示さなかったことが観察された。
さらに、配合物を凍結乾燥し、ケークの化粧性について検査した。スクロースのみの対照と比較して、試験した割合の賦形剤はどれも、ケークの視覚的品質のどのような改善も提供しなかった。また、凍結乾燥したケークを安定性試験にも供し、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて２〜８℃および３７℃で２カ月間後の分解（切断）について検査した。結果により、すべての配合物が安定であったことが示された。
ＣｌｆＡ凍結乾燥薬物製品の配合物：凍結融解
凍結融解研究をいくつかのＣｌｆＡタンパク質のロット（すなわち、Ｌ４０１８４−６３、−６４および−６５）で行った。配合物は、０．２ｍｇ／ｍｌのＣｌｆＡ、１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、４．５％のスクロースｗ／ｖおよび０．０１％のポリソルベート８０ｖ／ｖを含んでいた。研究は３つの部門に分割した：（１）配合していないＣｌｆＡ（原薬）の３×凍結融解、（２）配合したＣｌｆＡ（薬物製品）の３×凍結融解、および（３）原薬を３回凍結融解し、それぞれの解凍後に薬物製品に配合した。分析はＳＥ−ＨＰＬＣを用いて行った。
研究の目的は、複数の凍結融解後にタンパク質の安定性を原薬および薬物製品として評価することであった。ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて試料をそれぞれの解凍後に分析して、ＣｌｆＡの分解（切断）の任意の変化を検出した。３つの凍結融解現象は、検査した３つのロットうちの２つで、３回目の解凍までに分解の増加を示さなかったことが観察された。１つのロットは特に、他のものよりも大きな分解の変化を示した。
ＣｌｆＡ／ＣＰ５／ＣＰ８（三抗原）の凍結乾燥薬物製品の配合物
凍結乾燥によるＣｌｆＡの安定化の成功に基づいて、ＣｌｆＡをＣＰ５およびＣＰ８ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）抗原ならびにＣＲＭコンジュゲートと合わせることによって、さらなる薬物製品を配合した。液体配合物（凍結乾燥前または再構成後）の一部の実施形態は、０．５ｍｌの生成物あたり２００μｇのｒＣｌｆＡｍならびにそれぞれ１００μｇのＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを含有する。一部の実施形態では、液体配合物は、０．５ｍｌの生成物あたり１００μｇのｒＣｌｆＡｍならびにそれぞれ５０μｇのＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートを含有する。
スクロース、マンニトールおよびトレハロースを含めた様々な充填剤を評価した。混合研究、ケークの化粧性および短期的な液体安定性に基づいて、スクロースが最良の安定性をもたらすことが観察された。
３つのロットに基づいた様々なｐＨでの液体配合物の短期的な加速安定性により、ｐＨ６．０が最適であることが示唆された。ＣＰ５−およびＣＰ８−のＣＲＭ１９７コンジュゲートは、５．０〜７．０のｐＨ範囲内で安定であった。
コハク酸塩およびヒスチジンを含めた、ｐＨ６付近を緩衝する様々な緩衝系を試験した。ヒスチジンまたはコハク酸塩緩衝液を用いてｒＣｌｆＡｍの融解温度（Ｔｍ）の相違は観察されなかった。どちらの緩衝液も、ＣＰ５およびＣＰ８のＣＲＭ１９７コンジュゲートのどちらにも適合していた。１０ｍＭのコハク酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）を選択して、先に進めた。
ポリソルベート８０（ＰＳ８０）を攪拌研究において潜在的な安定化剤として試験した。攪拌研究は、一般に二量体またはより高次のオリゴマーの増加をもたらす場合がある、輸送の剪断およびストレスを模倣する。これらの実験の結果は、ＰＳ８０がＣｌｆＡの凝集を防止することを示唆している。０．０１％（０．００５〜０．１５％）のポリソルベート８０を選択して、先に進めた。
凍結乾燥した生成物の再構成には、生理的な重量モル浸透圧濃度（すなわち２５０〜３００ｍＯｓＭ）を達成する希釈剤を選択した。一実施形態では、６０ｍＭのＮａＣｌを希釈剤として選択した。再構成後に０．５ｍＬの用量を送達する能力に基づいて、０．６４〜０．６６ｍＬ／バイアルの充填体積を選択した。０．５ｍＬの用量を送達するために０．６４〜０．６６ｍＬの再構成体積を確実にするために、０．６６〜０．６８ｍＬ／シリンジの充填体積を選択した。
凍結乾燥した三抗原ケークを再構成して約３００ｍＯｓＭのほぼ生理的な重量モル浸透圧濃度を達成するために、希釈剤の配合は６０ｍＭで最適であると決定された。配合物中の４．５％のスクロースは、液体薬物製品の重量モル浸透圧濃度に顕著に寄与し、追加の塩をまったく用いずに約２００ｍＯｓＭの重量モル浸透圧濃度を与える。
凍結乾燥のパラメータは、メルトバックまたは縮みのない、６０ｍＭのＮａＣｌで再構成した際にｐＨ６．０±０．３を有する透明な溶液をもたらす、白色かつ綿毛状のケークが作製されるように選択した。
三抗原薬物製品の配合プロセス
１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、４．５％のスクロース、および０．０１％のポリソルベート８０を含む例示的な液体配合物を作製し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの０．２２μｍのＰＶＤＦ膜で濾過し、６５０μＬ／２ｍＬのバイアルで分注し、以下に記載のサイクルを用いて凍結乾燥した。凍結乾燥したケークを、希釈剤として６０ｍＭのＮａＣｌで事前に充填されたシリンジを用いて再構成した。
一実施形態では、液体配合物を以下のように構築した：（ａ）２５％のスクロース、１００ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、１％のＰＳ８０、およびＷＦＩを合わせて、１０ｍＭのコハク酸塩、４．５％のスクロースおよび０．０１％のＰＳ８０を得た。（ｂ）適切な量のｒＣｌｆＡｍ、ＣＰ５コンジュゲートおよびＣＰ８コンジュゲートを（ａ）の混合物に加え、その後、これを（ｃ）０．２２μｍフィルターに通して滅菌した。（ｄ）凍結乾燥バイアルをそれぞれ０．６５ｍｌ±０．１ｍｌの濾過した溶液で充填し、（ｅ）表１４のパラメータに従って凍結乾燥し、（ｆ）共栓し、（ｇ）密封し、（ｈ）ラベル貼付した。凍結乾燥した薬物製品は２〜８℃で保管した。
２つの実験設計を実施して、配合プロセス、濾過後の回収率、および凍結乾燥に対する活性および不活性成分の影響を決定した。主要な変数は、ｒＣｌｆＡｍならびにＣＰ５およびＣＰ８コンジュゲートの濃度であった（標的の±３０％）。配合から凍結乾燥までのこれらの構成要素の全体的な回収率は、すべての配合物で９５％を超えることが示された。データ分析（ＤＥＳＩＧＮ ＥＸＰＥＲＴソフトウェアを使用）により、以下のことが示唆された：（ａ）ｒＣｌｆＡｍの純度はアッセイ限界内のｒＣｌｆＡｍの濃度によって影響されず、低用量（７０μｇ／ｍｌ）は約９３％の最大の測定純度を示し、高用量（５２０μｇ／ｍｌ）は約９７％の最大の測定純度を示した、（ｂ）ＣＰ５およびＣＰ８コンジュゲートの濃度は個々のコンジュゲートの回収率に影響を与える場合があるが、それにもかかわらず、アッセイ能力内に保たれる、および（ｃ）３つの構成要素はすべてＰＳ８０の濃度によって影響を受けない。結果を表１５に示す。
他の実験では、ｐＨ（５．７〜６．３の範囲、標的は６．０）、コハク酸塩（５ｍＭ〜１５ｍＭ、標的は１０ｍＭ）、ポリソルベート８０（０．００５％〜０．１５％、標的は０．０１％）、およびスクロース（３．０％〜６．０％、標的は４．５％）を配合物中で変動させた。表１６に示す結果は、活性薬物製品の許容基準（ｒＣｌｆＡｍ（３９７±６．７μｇ／ｍＬ）、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７コンジュゲート（１７９．８±６４．０μｇ／ｍＬ）、およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート（１８８．２±１０．５μｇ／ｍＬ））が制御範囲内にあることを示している。
代表的な配合物ロットのデータを表１７および１８に示す。３つの代表的なロットを高用量（４００μｇ／ｍＬのｒＣｌｆＡｍ、それぞれ２００μｇ／ｍＬのＣＰ５−およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート）で、２つを低用量（２００μｇ／ｍＬのｒＣｌｆＡｍ、それぞれ５０μｇ／ｍＬのＣＰ５−およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲート）で配合、充填および凍結乾燥した。配合物は、純度、強度、水分、外見およびｐＨについて十分に標的の許容基準内にある。これらのデータを用いて中レベルの用量を一括した。
三抗原薬物製品の安定性
安定性アッセイを６つの凍結乾燥した三抗原配合物のロットで行った。主要なアッセイの一部は、ｒＣｌｆＡｍの強度および純度のための逆相クロマトグラフィー（たとえばＲＰ−ＨＰＬＣ）、ならびにＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７の強度のための比濁分析であった。凍結乾燥したケークを２℃〜８℃、２５℃および３７℃に置き、選択された時点で分析した。ケークは試験の直前に再構成した。試験結果では、乾燥した形態で４週間後に、ｒＣｌｆＡｍの強度（濃度）または純度およびコンジュゲートの強度（抗原性）に変化は見られなかった（図８および９）。また、ｒＣｌｆＡｍの濃度および純度、ならびにＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７の濃度（抗原性）も、３カ月間もの期間の間、それぞれＲＰ−ＨＰＬＣおよび比濁分析によって決定した。２℃〜８℃で保管した試料で行った直線回帰分析により、試料が最低６カ月間は安定であることが示されている（図８および９）。試料は、高（Ｌ３６６８６−３−１およびＬ３６６８６−２５）ならびに低（Ｌ３６６８６−３−２およびＬ３６０５１０１９５−２）用量の両方で試験した（表１９〜２２）。
また、短期的安定性アッセイも行った。凍結乾燥した三抗原配合物を６０ｍＭのＮａＣｌ希釈剤で再構成し、室温で様々な時間の間インキュベーションし、ｔ＝０、４時間および２４時間の時点を、ｒＣｌｆＡｍの強度および純度、ならびにＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７の強度について分析した（表２３〜２５）。高用量（４００μｇ／ｍＬのｒＣｌｆＡｍ、２００μｇ／ｍＬのＣＰ５−ＣＲＭ１９７および２００μｇ／ｍＬのＣＰ８−ＣＲＭ１９７）ならびに低用量（２００μｇ／ｍＬのｒＣｌｆＡｍ、５０μｇ／ｍＬのＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７）の配合物を検査した。図１０に見られるように、どちらの用量も、室温で２４時間での構成要素の安定性を示す（再構成後）。
また、凍結融解研究も行った。高用量の三抗原薬物製品（４００μｇ／ｍＬのｒＣｌｆＡｍ、２００μｇ／ｍＬのＣＰ５−ＣＲＭ１９７および２００μｇ／ｍＬのＣＰ８−ＣＲＭ１９７）を３回の凍結融解サイクルに供し、ｒＣｌｆＡｍの強度および純度、ならびにＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７の強度について分析した。それぞれの構成要素で濃度の変化は事実上観察されず、これは、薬物製品の活性構成要素が３回のサイクルにわたって安定であることを示唆している（図１１、表２６）。
ＣｌｆＡ／ＣＰ５／ＣＰ８／ＭｎｔＣ（四抗原）薬物製品：ＣｌｆＡの特徴づけ
三抗原配合物中のＣｌｆＡの安定化の成功は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣタンパク質をさらに含む配合物の開発に通じた。さらに、クランピング因子Ａは、Ｔ７タグ付けした型（ｒＣｌｆＡｍ）からタグを有さないもの（ｒｍＣｌｆＡ）へと更新された。ＣＰ５−およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７は、担体タンパク質および糖反復単位に関して同じに保たれた。
薬物製品の構成要素への様々な変化が原因で、４つの活性構成要素すべてに適合した新しい薬物製品を配合するために、系統的かつ合理的な手法を採った。活動には、抗原のプレフォーミュレーション特徴づけ、配合物の構成要素の理論的根拠の開発、配合された薬物製品の安定性および頑健性の実証、ならびに配合プロセスの開発が含まれていた。研究は、以下の用量を中心として設計した：
１．４００／４００／２００／２００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７、および
２．２００／２００／１００／１００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７。
複数の直交法（円二色性、蛍光、毛細示差走査熱量およびＯＤ３５０）を用いた生物物理学的な特徴づけを、２つのｒＣｌｆＡｍのロット（Ｌ４０１８４−７７およびＬ４０２５６−２６、基質：１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．０、２０ｍＭのＮａＣｌ）ならびに２つのｒｍＣｌｆＡのロット（Ｌ４０２２７−３６およびＬ４０２５６−２８、基質：１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５）で行った。生じるデータにより、１）ｒＣｌｆＡｍおよびｒｍＣｌｆＡの間の比較可能性、２）それぞれのｒＣｌｆＡ構築体内のロット間の一貫性が示され、３）ｐＨ作業範囲のフレームワークが提供され、先に進めた。
円二色性（ＣＤ）は、様々なｒＣｌｆＡのロットをｐＨ６．０および７．０で比較するためのツールとして使用した（図１２）。両方のｐＨでのＣＤ走査により、スペクトルのオーバーレイに基づいて、すべての試験したｒＣｌｆＡｍおよびｒｍＣｌｆＡのロットが類似の二次構造を有することが示された。さらに、タンパク質のＣＤ融解を行って、ロットの熱安定性をｐＨの関数として比較した。図１３に見られる結果は、すべてのロットが二次構造のコンテキストで比較可能であることを示している。また、結果は、この方法に基づいてｐＨ５．０〜７．０が最適な配合範囲であることも示唆している。
固有のトリプトファン蛍光を用いて、ｒＣｌｆＡｍおよびｒｍＣｌｆＡの三次構造に関する情報を得た。両方のタンパク質のロットをｐＨの関数としての蛍光融解に供して、熱安定性を評価した。ｒＣｌｆＡはタンパク質の同じＮ３ドメイン上に位置する２つのトリプトファンを保有しており、したがって、この方法によって供給されるデータはこの領域に局在化されていることに注目することが重要である。図１４Ａは、すべての試験したｒＣｌｆＡのロットが比較可能な熱安定性を保有していることを示しており、構造も類似していることを暗示している。また、外的蛍光融解も、複数のｒＣｌｆＡロットで、疎水性色素、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホネート（ＡＮＳ）を用いて行った。タンパク質構造が温度の増加に伴って展開されるにつれて、ＡＮＳが新しく曝露されたタンパク質の疎水性パッチと結合し、発光強度が増加する。図１４Ｂでは、ＡＮＳシグナルに基づく融解温度は、試験したすべてのタンパク質ロットにおいてｐＨの関数として類似である。ＤＳＣデータにより、すべての試験したｒＣｌｆＡのロットの融解温度がｐＨの関数として類似であったこと（図１５）、およびｐＨ５〜７が良好な範囲であることが確認され、先に進めた。また、ＯＤ３５０を用いて、凝集も温度およびｐＨの関数として監視した（図１６）。ｒｍＣｌｆＡロットＬ４０２５６−２９（基質：１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５）のｐＨの関数としての融解により、この方法によって検出された凝集現象は、ｐＨ４．０でのものだけであったことが示された。
２つの原薬ロット（Ｌ４０２５６−２８、Ｌ４０２５６−２９）を使用して、コハク酸塩ではなくヒスチジン中のｒｍＣｌｆＡの液体安定性をｐＨの関数として評価した。この配合物は、４００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ、１０ｍＭのヒスチジン（５．５〜７．５のｐＨ範囲）、４．５％のスクロースおよび０．０１％のポリソルベート８０からなっていた。２つの追加の配合物は、ヒスチジン、ｐＨ６．５との比較としての１０ｍＭのコハク酸塩、ｐＨ６．５、および高ｐＨの検査としての１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ８．０からなっていた（どちらの配合物も、４．５％のスクロースおよび０．０１％のＰＳ８０も含有していた）。サイズ排除ＨＰＬＣを用いて、ｒｍＣｌｆＡの切断を６週間、２５℃で監視した。結果により、ヒスチジン、ｐＨ約６．５が、−２８および−２９のどちらのロットにおいても最も遅い分解速度を示したことが示された（図１７Ａ）。この速度は、コハク酸塩、ｐＨ６．６の配合物のそれと一致しており、ヒスチジンがコハク酸塩と同程度にｒｍＣｌｆＡに適合していることを示している。さらに、研究全体にわたってすべての配合物のｐＨは安定に保たれ、ＯＤ３５０によって凝集は検出可能でなかった（図１７Ｂ）。
四抗原薬物製品：ＭｎｔＣの特徴づけ
加水分解を介した分解を受けやすいＣｌｆＡとは異なり、ＭｎｔＣは脱アミド化によって分解される。したがって、一定範囲のｐＨにわたってＭｎｔＣの安定性を決定することが重要であった。ＭｎｔＣを用いて行った固有のトリプトファン蛍光実験により２つの主要な現象が起こっていたことが示され、Ｔｍ１は４０〜５５℃であり、Ｔｍ２は６５〜７５℃であった（図１８）。Ｔｍ１を追跡すると、ｐＨ５．０および６．０が最高であり、次いでｐＨ７．０であった。データにより、５．０〜７．０の作業ｐＨ範囲が示された。また、代表的なＭｎｔＣのロットを用いたＤＳＣも行った。代表的な温度記録は２つの主な熱イベントを例示しており、これをさらに逆重畳することができる（図１９）。第１の融解温度（Ｔｍ１）を追跡すると、ｐＨ５．０および６．０が最高の熱安定性を有しており、次いでｐＨ７．０であることが明らかである（図１９）。蛍光結果と一致して、これらのデータは５．０〜７．０の作業ｐＨ範囲を示唆している。ＯＤ３５０データもこれらの観察を支持している（図２０）。ＩＥＸ−ＨＰＬＣによる脱アミド化の分析により、高いｐＨおよび高温がＭｎｔＣの脱アミド化の速度を増加させたことが確認された。
四抗原薬物製品：配合物の開発（緩衝液）
上述の三抗原配合物中では、ＣＰ５およびＣＰ８コンジュゲートの原薬はｐＨ７．０のコハク酸塩中で提供した。しかし、コハク酸塩緩衝系は、より低いｐＨでは良好な緩衝能力を提供しなかった。したがって、ＣＰ５およびＣＰ８コンジュゲートをｐＨ６．７の１０ｍＭのヒスチジン中で再配合した実験を行った。コンジュゲートの原薬はｐＨ＜６．５で良好に濾過されず、遅い濾過およびコンジュゲートしたタンパク質の損失をもたらすため、６．５よりも高いｐＨが好ましかった。これが、ヒスチジン中のｒｍＣｌｆＡ、ＭｎｔＣ、および薬物製品の配合物を均質性について評価するための駆動力となった。
プレフォーミュレーション特徴づけ研究から、ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣのどちらのｐＨの作業範囲も５〜７であったことが確認された。コンジュゲートのＤＳ基質をヒスチジンに変えたことで、薬物製品においてこの緩衝系を評価することが必要となった。抗原の分解速度を、四抗原配合物として、時間の関数として評価して、最適な配合ｐＨを確立した。攪拌実験を実施して、配合物中の界面活性剤の必要性を決定した。凍結乾燥に目を向けて、安定化剤および充填剤を抗原との適合性について評価した。
４００／４００／２００／２００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７からなる高用量の四抗原配合物を、ｐＨの関数としてヒスチジン緩衝液中で調製した。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてｒｍＣｌｆＡタンパク質の分解を検出し、ＩＥＸ−ＨＰＬＣを用いてＭｎｔＣの脱アミド化を検出した。図２１は、２つのタンパク質の代表的なクロマトグラムおよびこれらをどのようにして分解された種について監視したかを例示している。ｒｍＣｌｆＡでは、切断されたタンパク質断片は主なタンパク質ピークの右側に現れた一方で、ＭｎｔＣでは、脱アミド化されたピークは主ピークの左側に見つけることができる。どちらのタンパク質も、図２１中に２５℃で経時的に分解されると示されている。
配合物の安定性を、２〜８℃で０、１および２週間、ならびに２５℃で０、３および７日間の間監視した。２５℃で、ｒｍＣｌｆＡは、ｐＨの増加がタンパク質の切断の速度を減少させたことを示した（図２２ＡおよびＢ）。逆に、ｐＨの増加はＭｎｔＣの脱アミド化の速度を減少させた（図２２ＣおよびＤ）。どちらの機構も２〜８℃で顕著に抑制されたが、ｐＨ依存性の傾向は一貫して保たれたままであった。
ＣＰ５−およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの抗原性を、様々なｐＨで、２〜８℃および２５℃で、比濁分析を用いて監視した。２〜８℃では、どちらのコンジュゲートでも、実験の２週間の期間の間抗原性が維持された（図２３ＡおよびＢ）。２５℃では、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７は１週間後に変化を示さなかったが、しかし、ＣＰ８−ＣＲＭ１９７はｐＨ５．５でおよそ１８％の抗原性の減少を示した（図２３ＣおよびＤ）。
四抗原薬物製品：配合物の開発（充填剤）
４００／４００／２００／２００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７を含み、１）４．５％のスクロース、２）４．５％のトレハロース、３）３％のマンニトール／１％のスクロース、４）３％のマンニトール／１％のトレハロース、５）３％のグリシン／１％のトレハロース、６）３％のグリシン／１％のトレハロースおよび７）４．５％のスクロース、ＰＳ８０なしを含有する配合物を、安定性について試験した。すべての配合物は、１０ｍＭのヒスチジンおよび０．０１％のポリソルベート８０を含有しており（配合物７は例外）、配合物の測定ｐＨは６．３であった。配合物をＦｌｕｒｏｔｅｃでコーティングした４４３２／５０共栓を備えたＳｃｈｏｔｔ１型２ｍＬのバイアルに分注し、バイアルを６日間、室温で穏やかに遥動した。
すべての遥動後の試料のＯＤ３５０測定値は、凝集した種の増加を示さなかった（図２４Ｂ）。重量モル浸透圧濃度の測定値により、グリシン含有配合物が２９０ｍＯｓｍの生理的な重量モル浸透圧濃度を超えた値を有していたことが明らかとなった（図２４Ａ）。回収率は、ＣｌｆＡおよびＭｎｔＣは＞９８％、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７は＞９５％、およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７は＞９３％であり、これらはすべて、アッセイのばらつきの範囲内であった。ＭｎｔＣの脱アミド化を監視するためのＩＥＸ−ＨＰＬＣ分析は、６日間の遥動後に増加を示したが、すべての配合物が同様の速度を示し、どの特定の賦形剤または賦形剤の組合せがプロセスを改善も加速もしないことを示している。最後に、ＭｎｔＣおよびｒｍＣｌｆＡのＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、クロマトグラムプロフィールの顕著な変化を示さなかった。
高い重量モル浸透圧濃度が原因で、グリシン含有試料は賦形剤候補のリストから排除した。表２７中の配合物によって記載されているように、スクロース、トレハロース、マンニトールおよびグリシンを凍結乾燥した生成物として評価した。配合物を凍結乾燥し、それぞれを２〜８℃、２５℃、３７℃および５０℃での安定性について試験した。図２５Ａの高用量のＲＰ−ＨＰＬＣデータは、２〜８℃、２５℃および３７℃で１カ月後に変化を示さなかった。５０℃では、ｒｍＣｌｆＡは前方の肩ピークに増加を示し、マンニトール／スクロースの構成が最も大きな変化を示した。さらに、ＭｎｔＣの前方の肩ピークもマンニトール／スクロースの配合物中で増加した。低用量では、どちらのｒｍＣｌｆＡの前方の肩ピークにおいても変化が見られたが、ここでも、マンニトール／スクロースの配合物でより大きな増加が実証された（図２５Ｂ）。
また、ＩＥＸ−ＨＰＬＣを使用してＭｎｔＣの品質も監視した。図２５Ｃでは、高用量の２〜８℃の安定性試料は、１カ月後にどの配合物でも変化を示さない。２５および３７℃に保持した試料は同様の結果を生じた（示さず）。しかし、５０℃では、高および低用量はどちらも、マンニトール／スクロースの組合せでプロフィールの最大の変化を示した。ＣＰ５およびＣＰ８コンジュゲートの比濁分析結果は、１カ月後にどの温度でも抗原性のどのような変化も示さなかった。
スクロースがこれらの実験のリード賦形剤候補であったため、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５および０．０１％のＰＳ８０を一定に保ち、スクロースの濃度を２．０〜７．０％の範囲にわたって変動させた薬物製品基質を配合し、凍結乾燥した。主要な読取り値は、一次乾燥ステップの乾燥時間、外見、および水分であった。試験結果により、三抗原配合物中で使用した３〜６％のスクロース濃度範囲が四抗原配合物でも許容できることが示された。
四抗原薬物製品：配合物の開発（ポリソルベート８０）
１）ポリソルベート８０の必要性を決定するため、および２）配合物の頑健性を確認するために、攪拌実験を設計した。表２８に記載のように、一価およびＳＡ４ａｇの配合物を、０、０．０１、および０．０３％のＰＳ８０を用いて評価した。試料をｆｌｕｒｏｔｅｃでコーティングした４４３２／５０共栓を備えたＳｃｈｏｔｔ１型２ｍＬのバイアル内に分注し、２４時間、室温で、ＶＷＲ渦攪拌器（モデルＤＶＸ−２５００、５００ＲＰＭのパルスモード）を用いて攪拌した。攪拌した試料と並行して、攪拌していない対照を室温に２４時間置いた。それぞれの配合物について複数のバイアルをプールして分析した。
抗原の濃度を、攪拌後の回収率について検査した。４つすべての抗原の攪拌後のデータは濃度の変化を示さず、これは、ＰＳ８０を含有しない配合物を含めたどの試料でも損失がなかったことが実証されている（図２６ＡおよびＢ）。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いたｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度の分析により、攪拌後にどちらのタンパク質でも変化がないことが明らかとなった（図２６Ｃ）。ＩＥＸ−ＨＰＬＣを用いたＭｎｔＣの純度により、ＰＳ８０のレベルを比較した場合に一価配合物の攪拌の減少が示された（脱アミド化による）（図２６Ｄ）。ＭｎｔＣのＩＥＸ−ＨＰＬＣの純度データからの１つの興味深い観察は、一価配合物として、分解の速度（脱アミド化に対応する）が四抗原配合物中のＭｎｔＣと比較して顕著であることである。すべての配合物が同じ緩衝液基質を共有していたことを考慮すると、ＭｎｔＣが別の抗原と相互作用し、これがタンパク質の脱アミド化速度を遅くした可能性がある。また、配合物のｐＨ値も一定に保たれ（図２６Ｅ）、ＯＤ３５０測定値により攪拌後の凝集の増加は明らかとならなかった（図２６Ｆ）。
四抗原薬物製品：凍結乾燥
ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの改変示差走査熱量計（ｍＤＳＣ）を用いて凍結乾燥前の液体配合物のガラス転移を得て、Ｔｇ’値を表２９中に報告する。ロットＬ４４１３０−３９−１および３９−２は、４．５％のスクロースを含有する高および低用量の標的配合物を表す。ロットＬ４４１３０−４５試料は標的スクロース濃度を一括し、３％または６％の賦形剤を含有する。これらの試料は、Ｌ４４１３０−３９−１の高および低用量（＋３０％および−３０％）を一括したＣｌｆＡ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７／ＭｎｔＣの濃度を含有する。すべての配合物は−３３〜−３５℃のＴｇ’値を与え、これは、文献に報告されているようにスクロースに典型的である。
凍結乾燥した試料のＴｇ値を表３０に報告する。凍結乾燥したケークが大気から水分を獲得することを防止するために、試料を開封し、乾燥グローブボックス中のアルミニウム気密性ＤＳＣパンに移して密封した。測定された値は６５〜７０℃の範囲内であり、これはスクロース配合物に典型的である。
２つの配合物は類似しており、どちらもスクロースを充填剤として使用しているため、凍結乾燥サイクルは、ＳＡ３ａｇ薬物製品で使用したサイクルに基づくものであった。表３１は、四抗原配合物の生成に使用した凍結乾燥サイクルの範囲を定義している。
凍結乾燥研究は、以下のパラメータを比較することによって行った：
１．４．５％のスクロース対４％のマンニトール／１％のスクロース、および
２．保守的な凍結乾燥サイクル対より速い積極的なサイクル。
試料を一価の薬物製品の配合物および四抗原配合物のどちらとしても評価した。すべての配合物には、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５、および０．０１％のＰＳ８０が含まれていた。用量は、ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣでは４００μｇ／ｍＬ、ＣＰ５−およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートでは２００μｇ／ｍＬであった。凍結乾燥の前および後の配合物を、以下のアッセイを用いて比較した：外見、ｐＨ、ＭｎｔＣの脱アミド化のためのＣＥＸ−ＨＰＬＣ、ＭｎｔＣおよびｒｍＣｌｆＡの純度のためのＲＰ−ＨＰＬＣ、コンジュゲートの回収率のための比濁分析、水分、沈殿物を検出するためのＯＤ３５０、ならびに構造的評価のための示差走査熱量（ＤＳＣ）。使用したサイクルは表３２および表３３に記載されている。
ケークの外見を表３４に記載する。すべてのマンニトール含有ケークは、どちらのサイクルでも視覚的に洗練されたケークを与えた。スクロース配合物は、長いサイクルでは予想どおり許容できるケークを示したが、短い積極的なサイクルでは、部分的に崩壊したケークを生じた。ケークの水分含有率のデータにより、すべての配合物が＜１％であったことが明らかとなったが、しかし、マンニトール含有試料は、一般にスクロース単独よりも低い水分を有していた。図２７ＡのＲＰ−ＨＰＬＣのオーバーレイは、凍結乾燥の前および後でｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度の変化を示さず、また、比濁分析結果も、サイクルまたは賦形剤にかかわらず、凍結乾燥後のＣＰ５−ＣＲＭ１９７（図２７Ｂ）およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７（図２７Ｃ）の抗原性に変化がないことを明らかにした。図２７ＤおよびＥは、ＭｎｔＣの脱アミド化された種が四抗原配合物で凍結乾燥後に約２．５％に維持されることを実証している。ｐＨは凍結乾燥後に同じに保たれ、どの凍結乾燥後の試料でも注目に値するＯＤ３５０増加は検出されず、これは沈殿物の非存在を示している。しかし、ＯＤ３５０では小さな可溶性の凝集体の発生は検出されないことに注目することが重要である。ＤＳＣデータにより、融解温度の変化を欠くことによって証明されるように、抗原（ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣ）の構造的な撹乱は、どちらのサイクルの結果としても促進されないことが示された（図２７Ｆ）。コンジュゲートは、強力な融解シグナルを生じないため、監視しなかった。最後に、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを用いて抗原の％ｉｎ ｖｉｔｒｏ相対的効力を凍結乾燥の前および後で比較した。ｒｍＣｌｆＡを一価および四抗原の配合物のどちらでもアッセイしたが、四抗原の組合せは干渉を生じたため、コンジュゲートは一価配合物としてのみアッセイした。結果により、すべての分析した試料（マンニトールおよびスクロース）は凍結乾燥の前および後を比較した場合に十分にアッセイの誤差範囲内に（遅いおよび速いサイクルのどちらでも）、また、ｒｍＣｌｆＡ（図２７Ｇ）およびコンジュゲート（図２７Ｈ）がこれらの条件下で安定であったことが示された。
四抗原薬物製品：再構成
再構成希釈剤は、注射用水（ＷＦＩ）中の６０ｍＭのＮａＣｌであることを選択した。図２８は、この希釈剤で再構成した場合に、高用量（４００／４００／２００／２００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）および低用量（２００／２００／１００／１００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）がどちらも生理的な範囲の重量モル浸透圧濃度を示すことを実証している。選択した再構成体積は０．７ｍＬであり、その結果、０．７３ｍＬの最終体積が生じる。
６０ｍＭのＮａＣｌで再構成した後、高および低用量の四抗原ワクチンを安定性研究のために２〜８℃および２５℃で４８時間保持した。図２９Ａのデータは、ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出されたＭｎｔＣの純度が、２〜８℃および２５℃で４８時間の間変化せずに保たれたことを示す。ｒｍＣｌｆＡは２〜８℃で４８時間安定であったが、２５℃では、純度が２４時間の時点で減少した（図２９Ｂ）。ＩＥＸ−ＨＰＬＣを用いてＭｎｔＣの純度を監視し、その減少は脱アミド化の増加を示す（図２９Ｃ）。タンパク質は２〜８℃で安定に保たれ、名目上の純度の減少は＜２％であった。２５℃では、ＭｎｔＣは４時間の間安定に保たれたが、２４時間後に純度が顕著に減少した（９０％未満）。データの動力学的分析により、以下が示された：ＭｎｔＣでは２〜８℃および２５℃でそれぞれ０．０３％および０．２６％の分解／時（図２９Ｄ）、ならびにｒｍＣｌｆＡでは２〜８℃および２５℃でそれぞれ０．０１％および０．１６％の分解／時（図２９Ｅ）。追加のデータにより、抗原の濃度が４８時間後にいずれの温度でも変化しなかったことが示された（図３０Ａ〜Ｄ）。また、ｐＨも４８時間の間、同じに保たれた（図３０Ｅ）。
再構成後のワクチンは、４つすべての抗原について、再構成後のワクチンの分析に基づいて、室温で４時間の間および２〜８℃で２４時間まで安定であった。
四抗原薬物製品：凍結乾燥後の回収率
四抗原配合物の凍結乾燥プロセス後の回収率は、２組の研究（２つの高用量および２つの低用量）を用いて評価し、プロセスは、配合、濾過、充填、および凍結乾燥からなっていた。図３１ＡおよびＢは、凍結乾燥後に抗原のいかなる損失も存在しなかったことを示している。同様に、図３１ＣおよびＤは、凍結乾燥後の試料中のｒｍＣｌｆＡまたはＭｎｔＣの純度に変化が存在しなかったことを示している。
四抗原薬物製品：配合物の安定性
１）４００／４００／２００／２００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７、
２）２００／２００／１００／１００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７、または
３）４０／４０／２０／２０μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７
を用いた四抗原配合物を、２〜８℃、２５℃、および３７℃で安定性について試験した。配合物（１）および（２）は３つの温度で６カ月間安定であった。配合物（３）は２〜８℃で５カ月間の安定性を実証した（表３５）。この研究に使用した原薬は、ｒｍＣｌｆＡはＬ４０２５６−３０（四抗原の代表的なロット）、ＭｎｔＣはＬ４４１２４−６４（四抗原の代表的なロット）、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７は７ＣＰ５Ｃ−１００２（三抗原の代表的なロット）およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７はＧ−Ｃ８−３−９（三抗原の代表的なロット）であった。
表３６は、安定性を研究するために使用した四抗原の凍結乾燥した配合物のロットを記載している。
表３７および表３８は、それぞれ高および低用量の６カ月間の安定性データの要約を示す。６カ月後、どちらの用量も同じケークの外見を維持しており、希釈剤で迅速に再構成され、ｐＨは６．５±０．３に保たれており、水分は＜１．５％に保たれていた。ｒｍＣｌｆＡ、ＭｎｔＣ、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７の強度は変化しなかった。さらに、ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度値はｔ＝０に対して維持されていた。四抗原の高および低用量の配合物は、長期的および加速の貯蔵条件で３カ月間の間安定であると示される。同様に、２つの用量レベルでの第２の配合物の組は、２〜８℃、２５℃、および３７℃で６カ月間の間安定を示した（表３９および表４０）。データに基づいて、これらの試料の提案された貯蔵寿命は１２カ月間である。
２〜８℃での凍結乾燥した薬物製品基質の、６カ月間の安定性試験により、試験したすべてのパラメータが研究の期間にわたって保たれたことが示された（表４１）。薬物製品基質の提案された貯蔵寿命は１２カ月間である。
凍結乾燥した四抗原の毒性学的な高用量（Ｌ４４１３０−３９−１）および低用量（Ｌ４４１３０−３９−２）配合物を０．７ｍＬの６０ｍＭのＮａＣｌ希釈剤で再構成し、２〜８℃および２５℃で安定性について試験した。試料をｔ＝０、４および２４時間に分析した。重大なアッセイは、ｐＨ、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡの純度、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるＭｎｔＣの純度、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの強度、ならびに比濁分析によるＣＰ５／ＣＰ８コンジュゲートの抗原性であった。監視した分解の主な機構は、ｒｍＣｌｆＡのタンパク質切断およびＭｎｔＣの脱アミド化であった。図３２ＡおよびＢでは、どちらの組換えタンパク質の純度も、どちらの用量でも２〜８℃で２４時間の間維持される。２５℃でのインキュベーションでは、どちらのタンパク質の純度も４時間の間変化せずに保たれたが、２４時間で減少した。また、タンパク質（図３２Ｃ、Ｄ）およびコンジュゲート（図３２Ｅ、Ｆ）の強度、ならびにｐＨ（図３２Ｇ）も、２〜８および２５℃で２４時間後に一定であった。要するに、再構成後の配合物の分析に基づいて、４つすべての抗原の配合物は、再構成後に、室温で４時間の間および２〜８℃で２４時間の間安定であった。
四抗原薬物製品：エッジ研究
配合物の頑健性を実証するために高および低配合物の構成要素を一括するために、エッジ研究を設計した。表４２に配合物を詳述する。活性構成要素は、高用量（４００／４００／２００／２００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）よりも３０％高い、および低用量（２００／２００／１００／１００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ＭｎｔＣ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）よりも３０％低いとして変動させた。不活性構成要素は、ｐＨは６．０〜７．０、ヒスチジンは５〜１５ｍＭ、スクロースは３〜６％、およびＰＳ８０は０．００５〜０．０１５％の範囲で変動させた。
エッジ配合物を凍結乾燥し、２〜８℃、２５℃および３７℃で安定性を保った。表４３〜４６に示す結果は、すべてのエッジ配合物が３つの温度で３カ月間の間安定であったことを示しており、四抗原配合物の頑健性を確認している。
四抗原薬物製品：凍結融解安定性
四抗原の高用量（Ｌ４４１３０−８８−１）および低用量（Ｌ４４１３０−８８−２）の凍結乾燥前の液体配合物を、Ｓｃｈｏｔｔ１型バイアル中で４回のサイクルで凍結融解した。試料を毎回少なくとも２４時間、−７０℃で凍結し、その後、室温で解凍した。解凍サイクル中、解凍された液体配合物が室温で長時間放置されないように、バイアルを綿密に監視した。これは、配合物が室温でインキュベートされた結果としてのｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの脱アミド化のいかなるクリッピングもデータに反映されないことを確実にするために、行った。それぞれの凍結融解の組（３つ組で行った）をプールし、ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度にはＲＰ−ＨＰＬＣ、ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの濃度にはＩＥＸ−ＨＰＬＣ、ＭｎｔＣの純度にはＩＥＸ−ＨＰＬＣ、ならびにＣＰ５およびＣＰ８コンジュゲートの濃度には比濁分析によって分析した。４回の凍結融解サイクル後、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度（図３３Ａ）ならびにＩＥＸ−ＨＰＬＣによるＭｎｔＣの純度（図３３Ｂ）は変化しなかった。同様に、抗原の濃度（図３３ＣおよびＤ）およびｐＨ（図３３Ｅ）は、４回の凍結融解サイクル後に一貫して保たれた。
四抗原薬物製品：攪拌後の安定性
攪拌後の安定性を測定する研究の目的は、０．０１％のポリソルベート８０を含有する四抗原配合物が、容器施栓系へのいかなる吸着の問題も示さないことを確実にすることであった。高用量の凍結乾燥前の四抗原配合物（Ｌ４４１３０−１００）を、０、０．０１％、および０．０３％のポリソルベート８０を用いて調製し、試料を２４時間、室温で、凍結乾燥バイアル／共栓容器施栓中で攪拌した。対照試料は、攪拌せずに同じ周囲温度に置いた。攪拌には、ＶＷＲ ＤＶＸ−２５００マルチチューブ渦攪拌器を５００ＲＰＭのパルスモードに設定した。ポリソルベート８０の濃度は０〜０．０３％の範囲にわたって一括した。
主要なアッセイには以下が含まれいた：ｒｍＣｌｆＡの切断およびＭｎｔＣの分解（脱アミド化を除く）の検出のためのＲＰ−ＨＰＬＣ、ＭｎｔＣの脱アミド化の監視のためのＩＥＸ−ＨＰＬＣ、４つの抗原の濃度、ならびにｐＨおよびＯＤ３５０。図３４ＡおよびＢは、ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度が攪拌後に同様に保たれていたことを示す。また、図３４ＣおよびＤには、４つすべての抗原が攪拌後に回収されたことも示されている。ｐＨは維持されており（図３４Ｅ）、ＯＤ３５０によって監視されるように、攪拌は抗原の凝集を促進しない（図３４Ｅ）。すべてのデータは、配合物が凍結乾燥の容器施栓系に適合していることを示している。
凍結乾燥の容器施栓はシリコンを含有しないが、配合物は、ワクチンを再構成および送達するために使用されるガラスシリンジの共栓上のシリコンと接触する。
四抗原薬物製品：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）研究
高用量の四抗原配合物（４００／４００／２００／２００μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ｒＰ３０５Ａ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）の安定性を、２０単位／ｍＬのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を含む１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５中で、６０ｍＭのＮａＣｌを用いてまたは用いずに再構成した後に分析した。安定性を２〜８℃および２５℃で２４時間にわたって監視した。ＭｎｔＣの純度をＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析した。２５℃では、ＮａＣｌを含むＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）および塩を含む対照ＮａＣｌは類似の脱アミド化速度を示す（図３５Ｂ）。塩を含まないＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）は、より遅い脱アミド化速度を示した。５℃では、脱アミド化の速度が劇的に低下した（図３５Ａ）。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）からの干渉が原因で、ｒｍＣｌｆＡの純度を直接定量することは可能でなかった（図３５Ｃ）。代表的な時間経過オーバーレイの分析により、ｒｍＣｌｆＡの主ピークが変化していなかったことが示され、これは、２５℃で２４時間にわたる安定性を示している（図３５Ｄ）。同様の結果がすべての試料について２〜８℃で見られた。２〜８℃（図３５Ｅ）および２５℃（図３５Ｆ）で２４時間後にＲＰ−ＨＰＬＣ（図３５Ｃ）によってＭｎｔＣの純度の変化は検出されなかった。２〜８℃（図３５Ｇ）および２５℃（図３５Ｈ）で２４時間後にＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの濃度の変化は観察されなかった。２〜８℃（図３５Ｉ）および２５℃（図３５Ｊ）で２４時間後にｒｍＣｌｆＡまたはＭｎｔＣの濃度の変化は観察されなかった。
ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の濃度は、２〜８℃（図３６Ａ）および２５℃（図３６Ｂ）で２４時間にわたって変化しなかった。ＮａＣｌを含むＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の粒子径は約５０ｎｍまで大きさが増加し、ＮａＣｌを含まないものは約６０ｎｍまで大きさが増加した（図３６Ｃ）。すべての集団は単分散であった（＜０．２）。再構成した配合物のｐＨは安定性研究の間中ずっと一定に保たれていた（図３６Ｄ）。
低用量の四抗原配合物低用量（４０／４０／２０／２０μｇ／ｍＬのｒｍＣｌｆＡ／ｒＰ３０５Ａ／ＣＰ５−ＣＲＭ１９７／ＣＰ８−ＣＲＭ１９７）の安定性を、２０単位／ｍＬのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を含む１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．５中で、６０ｍＭのＮａＣｌを用いてまたは用いずに再構成した後に分析した。２〜８℃で４時間後にＲＰ−ＨＰＬＣによってＭｎｔＣの純度の変化は検出されなかった（図３７Ａ）。ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって２〜８℃で４時間後にＭｎｔＣの脱アミド化の増加は検出されなかった（図３７Ｂ）。４つすべての抗原濃度は、研究の間中ずっと一定に保たれていた（図３７ＣおよびＤ）。
ＮａＣｌを含むＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の粒子径は４時間後に増加し、ＮａＣｌを含まないものは一定に保たれたが、どちらの場合でも、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）単独よりも大きかった（図３８Ａ）。再構成した試料は多分散であった（約０．３）。再構成した配合物のｐＨは４時間後に一定に保たれていた（図３８Ｂ）。
四抗原薬物製品：希釈剤の比較
四抗原配合物中の低、中、および高用量のＭｎｔＣを用いて短期的安定性研究を実施して、希釈剤としての６０ｍＭのＮａＣｌ、水中の４．５％のスクロース、および水を比較した。それぞれの配合物は、４．５％のスクロース、０．０１％のＰＳ８０、および表４７中に提供した抗原の濃度をｐＨ６．５で含有していた。
バイアルは、実験の開始前に２〜８℃で保管し、５℃および２５℃で２および７日後に安定性について試験した。配合物は以下のアッセイを用いて比較した：ＭｎｔＣの脱アミド化および純度にはＣＥＸ−ＨＰＬＣ、ＭｎｔＣおよびＣｌｆＡの純度にはＲＰ−ＨＰＬＣ、ＭｎｔＣおよびＣｌｆＡの濃度にはＩＥＸ、ならびにコンジュゲートの濃度には比濁分析。結果の詳細を表４８〜５６に提供する。ＭｎｔＣの脱アミド化速度は、６０ｍＭのＮａＣｌで再構成した３つすべての配合物でより高く、高用量のＭｎｔＣが３つの用量レベルのうちで最高の脱アミド化速度を有していた。すべての他の結果は比較できるほどであった。
四抗原薬物製品：代替配合物
表５７に示すように、四抗原薬物製品のいくつかの異なる配合物で安定性アッセイを行った。
凍結乾燥した配合物を０．７ｍＬの水で再構成し、５℃および２５℃で１、３、および６カ月間後、ならびに４０℃で１および３カ月間後に、安定性について試験した。以下のアッセイを用いて配合物を比較した：カールフィッシャー水分、透明性、色、粒子の検出、ＭｎｔＣの脱アミド化および純度にはＣＥＸ−ＨＰＬ、ＭｎｔＣおよびＣｌｆＡの純度にはＲＰ−ＨＰＬＣ、ＭｎｔＣおよびＣｌｆＡの濃度にはＩＥＸ、ならびにコンジュゲートの濃度には比濁分析。パーセント水分は、４５ｍｇ／ｍｌのスクロースを用いた配合物中でより高かった。ケーク中の水の量は、ケークの全質量のパーセンテージである。したがって、９０ｍｇ／ｍｌのスクロースのケークは、スクロースの質量の量が２倍であったため、水分のパーセントにおいてより頑強であった。結果の詳細を表５８〜６６に提供する。
ＡＴＣＣ ５３２８１
ＡＴＣＣ ３９９００
ＡＴＣＣ ３５９８４
組換えＣｌｆＡポリペプチドの様々な形態を示す模式図であり、配列番号１２５および１２７〜１２９を開示している。 様々な条件下における、凍結乾燥したＣｌｆＡタンパク質の様々なロットの濃度の経時的な変化を、その液体対応物と比較してｌｎ［Ｃ］として表す図である。パネルＡ：ロット番号Ｌ３６０５１−３７−１およびＬ３６０５１−４４。パネルＢ：ロット番号Ｌ３６０５１−７２。パネルＣ：ロット番号Ｌ３６０５１−８１−１。パネルＤ：ロット番号３６０５１−８１−２。 ２〜８℃、２５℃、および３７℃で３カ月間保管したケークと比較した、ｔ＝０での凍結乾燥したＤＳ Ｌ４０１８４−６１のサイズ排除クロマトグラムを示す図である。 凍結乾燥した配合物を凍結乾燥前の液体ＣｌｆＡロットＬ３６０５１−８１−１と比較したサイズ排除クロマトグラムを示す図である。 様々な時間および温度の条件における、凍結乾燥したＣｌｆＡのｐＨ（パネルＡ）、パーセント水分（パネルＢ）および凝集の測度である光学密度（パネルＣ）のヒストグラムを示す図である。 室温で２４時間の攪拌後のＳＥ−ＨＰＬＣによって決定された、ＣｌｆＡのパーセント二量体（パネルＡ）、パーセント単量体（パネルＢ）、およびパーセント分解生成物（切断）（パネルＣ）ヒストグラムを示す図である。Ｘ軸は、様々な濃度のポリソルベート８０（０．０００、０．０１００、０．００５および０．１００％ｗ／ｗ）ならびにスクロース（３、４．５および６％ｗ／ｗ）を含有する配合物を示す。ＰＳ８０を含有しない配合物は、攪拌後にパーセント二量体形成の増加を示した（パネルＤ）。 様々な充填剤配合物の経時的なＳＥ−ＨＰＬＣによって決定された、ＣｌｆＡのパーセント分解生成物（切断）（パネルＡ）、パーセント二量体（パネルＢ）、およびパーセント単量体（パネルＣ）ヒストグラムを示す図である。 高用量の凍結乾燥したケークを再構成した後様々な時点での、ＣｌｆＡの純度（パネルＡ）、ＣＰ５の強度（抗原性）（パネルＢ）、およびＣＰ８の強度（抗原性）を示す図である。 低用量の凍結乾燥したケークを再構成した後の様々な時点での、ＣｌｆＡの純度（パネルＡ）、ＣＰ５の強度（抗原性）（パネルＢ）、およびＣＰ８の強度（抗原性）を示す図である。 室温で再構成の０、４および２４時間後での、ＣｌｆＡの濃度（パネルＡ）および純度パーセント（パネルＢ）ならびにＣＰ５およびＣＰ８の濃度（パネルＣ）を示す図である。 １、２および３回の凍結融解サイクル後の、ＣｌｆＡの濃度（パネルＡ）および純度パーセント（パネルＢ）ならびにＣＰ５およびＣＰ８の濃度（パネルＣ）を示す図である。 ｒＣｌｆＡの複数のロットのｐＨ６．０（パネルＡ）および７．０（パネルＢ）での円二色性（ＣＤ）走査を示す図である。 ｒＣｌｆＡの複数のロットのＣＤ融解をｐＨの関数として示す図である。 ｒＣｌｆＡｍおよびｒｍＣｌｆＡの固有のトリプトファン蛍光（パネルＡ）およびＡＮＳ蛍光（パネルＢ）融解をｐＨの関数として示す図である。 ｒＣｌｆＡｍおよびｒｍＣｌｆＡの示差走査熱量（ＤＳＣ）融解をｐＨの関数として示す図である。 ｒｍＣｌｆＡのＯＤ３５０融解をｐＨの関数として示す図である。 ６週間、２５℃でのｒｍＣｌｆＡのサイズ排除ＨＰＬＣをｐＨの関数として（パネルＡ）、ならびに液体ｒｍＣｌｆＡ配合物のｐＨおよびＯＤ３５０安定性（パネルＢ）を示す図である。 ＭｎｔＣの固有のトリプトファン蛍光融解（パネルＡ）およびＴｍ１の追跡（パネルＢ）を示す図である。 ＭｎｔＣのＤＳＣ融解からのＴｍ１の追跡をｐＨの関数として（パネルＡ）、ならびに２つの主な熱イベントの温度記録（パネルＢおよびＣ）を示す図である。 ＭｎｔＣのＯＤ３５０融解をｐＨの関数として示す図である。 安定性を監視するための、ｒｍＣｌｆＡ（パネルＡ）およびＭｎｔＣ（パネルＢ）のクロマトグラムを示す図である。 ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた５℃（パネルＡ）および２５℃（パネルＢ）でのｒｍＣｌｆＡ、ならびにＩＥＸ−ＨＰＬＣを用いた５℃（パネルＣ）および２５℃（パネルＤ）でのＭｎｔＣの安定性結果を示す図である。 ５℃および２５℃でのＣＰ５−ＣＲＭ１９７（それぞれパネルＡおよびＣ）ならびに５℃および２５℃でのＣＰ８−ＣＲＭ１９７（それぞれパネルＢおよびＤ）の、様々なｐＨでの比濁分析を用いた安定性結果を示す図である。 様々な充填剤を用いた遥動後の試料の重量モル浸透圧濃度（パネルＡ）およびＯＤ３５０（パネルＢ）の測定値を示す図である。 高用量（パネルＡ）および低用量（パネルＢ）の凍結乾燥した配合物のＲＰ−ＨＰＬＣデータを用いた充填剤の関数としての安定性試験、ならびにＭｎｔＣ品質のＩＥＸ−ＨＰＬＣデータ（パネルＣ）を示す図である。 ４つすべての抗原の攪拌後のデータを示す図である：抗原濃度（パネルＡはｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣ、パネルＢはＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７）、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度（パネルＢ）、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるＭｎｔＣの純度（パネルＣ）、ｐＨ（パネルＤ）ならびにＯＤ３５０（パネルＥ）。 ４つすべての抗原の凍結乾燥前および凍結乾燥後のデータを示す図である：ｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣのＲＰ−ＨＰＬＣデータ（パネルＡ）、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７（パネルＢ）およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７（パネルＣ）の比濁分析結果、４．５％のスクロース（パネルＤ）および４％のマンニトール／１％のスクロース（パネルＥ）を用いたＭｎｔＣのＣＥＸ−ＨＰＬＣデータ、ＤＳＣデータ（パネルＦ）、ならびにｒｍＣｌｆＡ（パネルＧ）およびコンジュゲート（パネルＨ）のパーセント効力。 高および低用量の配合物の重量モル浸透圧濃度を示す図である。 ＭｎｔＣ（パネルＡ）およびｒｍＣｌｆＡ（パネルＢ）のＲＰ−ＨＰＬＣの純度データ、ＭｎｔＣのＩＥＸ−ＨＰＬＣの純度データ（パネルＣ）、ならびにＭｎｔＣ（パネルＤ）およびｒｍＣｌｆＡ分解（パネルＥ）の再構成後の動力学を示す図である。 再構成後の抗原濃度（パネルＡ〜Ｄ）およびｐＨ安定性（パネルＥ）を示す図である。 抗原濃度（パネルＡおよびＢ）ならびに純度（パネルＣおよびＤ）の、凍結乾燥プロセス後の回収率を示す図である。 再構成後のｒｍＣｌｆＡ（パネルＡ）およびＭｎｔＣの純度（パネルＢ）、ｒｍＣｌｆＡ（パネルＣ）およびＭｎｔＣの濃度（パネルＤ）、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７（パネルＥ）およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７（パネルＦ）の濃度、ならびにｐＨ安定性（パネルＧ）を示す図である。 凍結融解後の、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度（パネルＡ）、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるＭｎｔＣの純度（パネルＢ）、抗原の濃度（パネルＣおよびＤ）、ならびにｐＨ安定性（パネルＥ）を示す図である。 攪拌後の、ＲＰ−ＨＰＬＣによるｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの純度（パネルＡ）、ＩＥＸ−ＨＰＬＣによるＭｎｔＣの純度（パネルＢ）、抗原の濃度（パネルＣおよびＤ）、ｐＨ（パネルＥ）、ならびにＯＤ３５０（パネルＦ）を示す図である。 ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で再構成したＭｎｔＣの、２４時間後にＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析した、２〜８℃（パネルＡ）および２５℃（パネルＢ）での分解、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによって分析した、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で再構成したｒｍＣｌｆＡの純度（パネルＣおよびＤ）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で再構成したＭｎｔＣの、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した、２〜８℃（パネルＥ）および２５℃（パネルＦ）での純度、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いたＣＰ５−ＣＲＭ１９７およびＣＰ８−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの、２〜８℃（パネルＧ）および２５℃（パネルＨ）での濃度、ならびに、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いたｒｍＣｌｆＡおよびＭｎｔＣの、２〜８℃（パネルＩ）および２５℃（パネルＪ）での濃度を示す図である。 再構成した配合物の、２〜８℃（パネルＡ）および２５℃（パネルＢ）での２４時間にわたるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の濃度、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の粒子径（パネルＣ）、ならびにｐＨ安定性（パネルＤ）を示す図である。 ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）で再構成したＭｎｔＣの、４時間後にＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した純度（パネルＡ）および脱アミド化（パネルB）、ならびにＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）を用いた抗原濃度（パネルＣおよびＤ）を示す図である。 再構成した配合物の４時間にわたるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）の粒子径（パネルＡ）およびｐＨ安定性（パネルＢ）を示す図である。 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＡのアラインメントを示す図である。出現順にそれぞれ配列番号６２、６４、６８、８４、７０、１０４、６６、７８、８６、８８、９０、７２、７４、７６、８０、９４、８２、９２、９６、９８、１００、１０２、１０６、および１０８である。（アミノ酸番号1〜60（パネルA）、アミノ酸番号61〜120（パネルB）、アミノ酸番号121〜180（パネルC）、アミノ酸番号181〜240（パネルD）、アミノ酸番号241〜300（パネルE）、アミノ酸番号301〜360（パネルF）、アミノ酸番号361〜420（パネルG）、アミノ酸番号421〜480（パネルH）、アミノ酸番号481〜540（パネルI）、アミノ酸番号541〜559（パネルJ）） 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＣｌｆＢのアラインメントを示す図である。出現順にそれぞれ配列番号２６、２８、３２、１８、５４、３４、３６、３０、１６、２０、２２、２４、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５６、５８、および６０である。（アミノ酸番号1〜60（パネルA）、アミノ酸番号61〜120（パネルB）、アミノ酸番号121〜180（パネルC）、アミノ酸番号181〜240（パネルD）、アミノ酸番号241〜300（パネルE）、アミノ酸番号301〜360（パネルF）、アミノ酸番号361〜420（パネルG）、アミノ酸番号421〜480（パネルH）、アミノ酸番号481〜542（パネルI）） 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株間のＭｎｔＣのアラインメントを示す図である。出現順にそれぞれ配列番号２、８、１０、４、６、１４および１２である。（アミノ酸番号1〜120（パネルA）、121〜240（パネルB）、241〜322（パネルC）） 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株からのＣｌｆＢ配列のチャートを示す図である。 黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の様々な株からのＭｎｔＣ配列のチャートを示す図である。

Claims (28)

  1. （ａ）単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）ポリペプチド、５型莢膜多糖（ＣＰ５）−タンパク質のコンジュゲート、８型莢膜多糖（ＣＰ８）−タンパク質のコンジュゲート、および単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣポリペプチドからなる群から選択される少なくとも３つの構成要素、
    （ｂ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、ならびに
    （ｃ）充填剤
    を含み、前記ＣｌｆＡポリペプチドが、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる、凍結乾燥した免疫原性組成物。
  2. （ａ）単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）ポリペプチド、
    （ｂ）５型莢膜多糖（ＣＰ５）−タンパク質のコンジュゲート、
    （ｃ）８型莢膜多糖（ＣＰ８）−タンパク質のコンジュゲート、
    （ｄ）６．０±０．６のｐＫａを有する緩衝液、ならびに
    （ｅ）充填剤
    を含み、前記ＣｌｆＡポリペプチドが、少なくとも１カ月間、３７℃で実質的に分解されずに保たれる、凍結乾燥した免疫原性組成物。
  3. 単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＭｎｔＣポリペプチドをさらに含む、請求項２に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  4. 単離した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）クランピング因子Ｂ（ＣｌｆＢ）をさらに含む、請求項２または請求項３に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  5. ＣｌｆＡポリペプチドがＮドメインを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  6. ＣｌｆＡポリペプチドがフィブリノーゲン結合ドメインを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  7. フィブリノーゲン結合ドメインが、フィブリノーゲンとＣｌｆＡのネイティブフィブリノーゲン結合ドメインとの観察された結合と比較して低下したレベルでフィブリノーゲンと結合するように変更されている、請求項１から６のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  8. フィブリノーゲン結合ドメインが、Ｔｙｒ３３８、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｌｙｓ３８９、Ａｌａ２５４およびＩｌｅ３８７のうちの１つまたは複数でのアミノ酸置換を有することによって、フィブリノーゲンとの低下した結合を示す、請求項１から７のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  9. Ｔｙｒ３３８、Ｔｙｒ２５６、Ｐｒｏ３３６、Ｌｙｓ３８９、Ａｌａ２５４およびＩｌｅ３８７のうちの１つまたは複数でのアミノ酸置換が、ＡｌａまたはＳｅｒへの置換である、請求項８に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  10. Ｔｙｒ３３８がＡｌａに置換されている、請求項９に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  11. ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲートが、ＣＰ５−ＣＲＭ１９７、ＣＰ５−ニューモリシン、またはＣＰ５−連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  12. ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲートが、ＣＰ８−ＣＲＭ１９７、ＣＰ８−ニューモリシン、またはＣＰ８−連鎖球菌Ｃ５ａペプチダーゼ（ＳＣＰ）である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  13. 免疫原性組成物の全重量の３重量パーセント未満（％ｗ／ｗ）の水を含み、ＣｌｆＡポリペプチドが０．０９％±０．０２７％〜０．８５％±０．２６％ｗ／ｗであり、ＣＰ５−タンパク質のコンジュゲートが０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗであり、ＣＰ８−タンパク質のコンジュゲートが０．０４％±０．０１３％〜０．４２±０．１３％ｗ／ｗであり、緩衝液が２．５４％±０．７６％ｗ／ｗである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  14. 緩衝液がｐＨ６．０±０．５のヒスチジンを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  15. 充填剤が、スクロース、トレハロース、マンニトール、グリシン、およびソルビトールからなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  16. 充填剤がスクロースである、請求項１５に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  17. 充填剤が９６％±０．０６０％ｗ／ｗのスクロースである、請求項１６に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  18. 界面活性剤をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  19. 界面活性剤が、ポロキサマー、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルからなる群から選択される、請求項１８に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  20. ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルがポリソルベート８０である、請求項１９に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  21. ポリソルベート８０が０．２０％±０．０４１％ｗ／ｗである、請求項２０に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  22. アジュバントをさらに含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  23. アジュバントがＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（商標）である、請求項２２に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物。
  24. 請求項１から２３のいずれか一項に記載の凍結乾燥した免疫原性組成物を水性希釈剤で再構成することによって調製される、６．０±０．５の最終ｐＨを有する液体免疫原性組成物。
  25. 水性希釈剤が水である、請求項２４に記載の液体免疫原性組成物。
  26. （ａ）４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度のＣｌｆＡポリペプチド、
    （ｂ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ５−タンパク質のコンジュゲート、
    （ｃ）２０μｇ／ｍｌ±２μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌ±４０μｇ／ｍｌの濃度のＣＰ８−タンパク質のコンジュゲート、
    （ｄ）１０ｍＭ±５ｍＭの濃度のヒスチジン緩衝液、
    （ｅ）０．１％±０．０５％重量対体積（ｗ／ｖ）の濃度のポリソルベート８０、および
    （ｆ）９％±４．５％ｗ／ｖの濃度のスクロース
    を含む、請求項２４または請求項２５に記載の液体免疫原性組成物。
  27. ４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度のＭｎｔＣポリペプチドをさらに含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の液体免疫原性組成物。
  28. ４０μｇ／ｍｌ±４μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ±８０μｇ／ｍｌの濃度のＣｌｆＢポリペプチドをさらに含む、請求項２４から２７のいずれか一項に記載の液体免疫原性組成物。
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