KR101808398B1

KR101808398B1 - 스타필로코커스 아우레우스 항원의 안정한 면역원성 조성물

Info

Publication number: KR101808398B1
Application number: KR1020157031951A
Authority: KR
Inventors: 라크쉬미 칸드케; 아키히사 노노야마; 타마라 샤퍼 핫쥐; 샌딥 니마
Original assignee: 와이어쓰 엘엘씨
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2017-12-12
Also published as: PT2654784T; HUE047263T2; US20130259896A1; MX350170B; CN103826656A; CA2819120A1; AU2011346535A1; EP2654784B1; KR20150129071A; RU2570730C2; SI3150222T1; EP3150222A1; CA2819120C; BR112013016153A2; EP2654784A2; WO2012085872A3; DK2654784T3; ES2614815T3; MX2013006960A; HUE033072T2

Abstract

본 발명은 스타필로코커스 세균으로부터 단리된 1종 이상의 항원을 포함하는 동결건조된 또는 재구성된 다중항원 또는 다중성분 면역원성 조성물, 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

스타필로코커스 아우레우스 항원의 안정한 면역원성 조성물{STABLE IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS ANTIGENS}

인간은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(에스. 아우레우스)에 대한 천연 보균숙주이다. 건강한 개체는 지속적으로(10% 내지 35%), 간헐적으로(20% 내지 75%) 또는 관련된 질환을 갖지 않는 비보균 상태(5% 내지 70%)로 피부, 콧구멍 및 목에서 스타필로코커스 아우레우스에 의해 콜로니화될 수 있다. 문헌(Vandenbergh et al., J. Clin. Micro. 37:3133-3140 (1999))을 참조한다. 개체가 면역 장벽의 파괴, 예컨대, 수술 과정 동안, 유치 카테터 또는 다른 디바이스의 배치, 외상 또는 상처로 인해 면역손상된 경우, 질환이 후속적으로 발생한다. 발생된 스타필로코커스 아우레우스 감염은 경미한 피부 감염부터 높은 사망률을 동반하는 심내막염, 골수염, 세균혈증, 패혈증 및 다른 형태의 질환까지 광범위한 질환을 야기할 수 있다. 큰 인간 보균숙주는 적응된 병원성 클론 타입의 진화 및 전파에 대한 기회를 향상시킨다.

그람 양성 구균 스타필로코커스 아우레우스 및 스타필로코커스 에피데르미디스(S. epidermidis)로부터의 침습성 스타필로코커스 감염은 전세계적으로 증가하는 공중 보건 문제이기 때문에 특히 관심을 끈다. 구체적으로, 스타필로코커스 아우레우스는 대다수의 병원 획득(병원내) 감염의 원인이고, 지역사회 발병 감염에서의 그의 유병률은 증가하고 있다. 예를 들면, 침습성 메티실린 내성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)의 발생은 2005년 미국에서 18,650명의 사망을 포함하여 100,000명 당 31.8명으로 평가되었다. 문헌(Klevens R.M. et al., JAMA, 298:1763-71 (2007))을 참조한다.

스타필로코커스 질환은 최근 20년 동안 급격한 증가를 보였고, 이 증가는 혈관내 디바이스 및 침습성 수술의 이용과 평행하다. 질환 발생의 상승은 항생제 내성의 평행한 상승 때문에 더욱 문제가 되므로, 스타필로코커스 감염 및 관련 질환을 예방하거나 치료하기 위한 수단으로서 백신에 사용되거나 수동 면역을 제공하는 다중클론 또는 단일클론 항체를 이끌어내는 면역원성 조성물이 절실히 필요하다.

응괴 인자 A(ClfA)는 스타필로코커스와 피브리노겐 및 혈소판의 결합을 매개하는, 스타필로코커스 아우레우스 세포벽에 결합된 부착소(adhesin)이다. 상기 인자는 세균의 세포 표면 상에서 발현되고 여기서 조직 손상의 부위에 침착된 피브리노겐 및 피브린에 결합하여 발병을 촉진하는 것으로 생각된다. ClfA는 잘 보존되어 있고, 다양성이 가장 높은 형태(약 85% 동일성)조차도 단일클론 항체 및 다중클론 항체 둘다에 대한 광범위한 교차반응성을 나타낸다. 따라서, ClfA는 스타필로코커스 아우레우스에 대한 백신의 성분의 적당한 후보이다. 그러나, ClfA가 구조적 불안정성을 나타내는 한, 저장시 시간의 경과에 따라 용이하게 분해될 수 있기 때문에 ClfA의 제제화는 문제가 된다.

전장 ClfA는 여러 영역 및 도메인을 포함한다: N 말단 분비 도메인("S" 도메인); 이어서 3개의 도메인(N1, EF-핸드(hand) 모티프를 함유하는 N2, 및 N3)을 함유하는 리간드 결합 A 영역; 이어서 세린-아스파테이트 다이펩티드 반복부(repeat)를 함유하는 R 영역; 이어서 LPXTG 모티프를 함유하는 세포벽 결합 영역("W" 영역); 소수성 막 관통(membrane-spanning) 도메인("M" 영역); 및 양으로 하전된 아미노산을 함유하는 하전된 C 말단("C" 영역). N1 영역은 프로테아제(protease) 민감성 부위를 함유한다. ClfA의 불안정성 중 대부분이 N1 및 N2N3을 함유하는 단편을 발생시키는, N1에서의 ClfA의 절단에 기인한다. ClfA의 구조 및 기능은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 미국 특허출원 공개 제20070087014A1호(Pavliak et al., April 19, 2007)에 개시되어 있다.

침습성 질환을 야기할 수 있는 스타필로코커스 미생물은 일반적으로 상기 세균을 캡슐화하고 숙주 선천성 면역 시스템에 의한 제거에 대한 그의 내성을 향상시키는 캡슐 폴리사카라이드(CP)를 생산할 수도 있다. CP는 상기 세균이 식균작용 및 세포내 사멸에 대한 내성을 갖게 하는 보호 캡슐 내에 상기 세균 세포를 은폐시키는 작용을 한다. 캡슐을 결여하는 세균은 식균작용에 더욱 민감하다. 캡슐 폴리사카라이드는 종종 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 및 B군 스트렙토코커스를 포함하는 많은 세균 병원체에 대한 중요한 병독성 인자이다.

스타필로코커스 아우레우스의 대다수 임상 단리물은 혈청형 5 또는 8로 캡슐화되어 있다. 5형(CP5) 및 8형(CP8) 캡슐 폴리사카라이드는 N-아세틸 만노스아미뉴론산, N-아세틸 L-푸코스아민 및 N-아세틸 D-푸코스아민으로 구성된 유사한 트라이사카라이드 반복 유닛을 가진다. 문헌(Fournier, J.M. et al., Infect. Immun. 45:97-93 (1984)) 및 문헌(Moreau, M., et al., Carbohydrate Res. 201:285-297 (1990))을 참조한다. 동일한 당을 갖되 당 결합 및 O-아세틸화 부위에서 상이한 상기 2종의 CP는 각각 혈청학적으로 상이한 면역반응성 패턴을 생성한다.

스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질(단백질 305, P305, P305A 및 ORF305로서도 공지되어 있음)은 망간 ABC 수송체(transporter)의 성분이다. 이 단백질은 생체내에서 발현된다. 스타필로코커스 아우레우스는 호중구에서 스타필로코커스 아우레우스의 생존을 향상시키는 효소에 대한 보조인자로서 망간을 사용한다. 따라서, MntC는 감염 동안 스타필로코커스 아우레우스의 생체내 생존에 중요하다. 이 단백질도 ClfA처럼 용액에서 불안정하다. 그러나, 응집될 수 있거나 가수분해를 통해 절단될 수 있는 ClfA와 달리, MntC 분해의 일차 기작은 염기성 pH 및/또는 실온(약 25℃) 근처의 온도 또는 이보다 높은 온도에 노출되었을 때의 탈아미드화이다.

따라서, 스타필로코커스 아우레우스 감염에 대한 백신뿐만 아니라 특히 향상된 항원 안정성을 가진 백신이 절실히 필요하다.

본 발명은 스타필로코커스 세균으로부터 단리된 1종 이상의 항원을 포함하는 동결건조된 또는 재구성된 다중항원 또는 다중성분 면역원성 조성물에 관한 것이다. 폴리펩티드 및 폴리사카라이드인 상기 항원은 특히, 당업자에게 공지된 단리 절차를 이용하여 세균으로부터 직접 수득할 수 있거나, 합성 프로토콜을 이용하여 제조할 수 있거나, 당업자에게 공지된 유전공학 절차를 이용하여 재조합적으로 제조할 수 있거나, 또는 상기 방법들 중 임의의 방법을 병용하여 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 동결건조된 또는 재구성된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 동결건조된 또는 재구성된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5), 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8) 및 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질로부터 선택된 3종 이상의 항원을 포함한다. 또한, 본 발명은 스타필로코커스 세균에 대한 면역 반응을 유도하는 방법; 스타필로코커스 세균에 의해 야기된 질환을 예방하거나, 이 질환의 중증도를 감소시키거나, 또는 이 질환의 발병을 지연시키는 방법; 및 스타필로코커스 세균에 의한 감염에 의해 야기된 질환의 1종 이상의 증상을 예방하거나, 이 증상의 중증도를 감소시키거나, 또는 이 증상의 발병을 지연시키는 방법을 제공한다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5) 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)을 포함하는 동결건조된 또는 재구성된 면역원성 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5) 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)을 포함하는 동결건조된 또는 재구성된 면역원성 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5) 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)을 포함하는 동결건조된 또는 재구성된 면역원성 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5) 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)을 포함하는 동결건조된 또는 재구성된 면역원성 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5) 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)을 포함하는 동결건조된 또는 재구성된 면역원성 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A("ClfA") 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B("ClfB") 폴리펩티드, 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5)-단백질 접합체, 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)-단백질 접합체 및 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 3종 이상의 성분; (b) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제; 및 (c) 벌킹제(bulking agent)를 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 1개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A("ClfA") 폴리펩티드, (b) 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5)-단백질 접합체, (c) 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)-단백질 접합체, (d) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제 및 (e) 벌킹제를 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 1개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다.

한 실시양태에서, 동결건조된 면역원성 조성물은 이 면역원성 조성물의 총 중량의 3% 중량(% w/w) 미만으로 물을 포함하고, 이때 ClfA 폴리펩티드는 0.09% ± 0.027% 내지 0.85% ± 0.26% w/w이고, CP5-단백질 접합체는 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w이고, CP8-단백질 접합체는 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w이고, 완충제는 2.54% ± 0.76% w/w이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) ClfA 폴리펩티드; (b) CP5-단백질 접합체; (c) CP8-단백질 접합체; (d) 히스티딘 완충제(pH 6.0 ± 0.5); (e) 수크로스; (f) 폴리소르베이트 80; 및 (g) 물을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 3개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 0.09% ± 0.027% 내지 0.85% ± 0.26% w/w의 ClfA 폴리펩티드; (b) 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w의 CP5-단백질 접합체; (c) 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w의 CP8-단백질 접합체; (d) 2.54% ± 0.76% w/w의 히스티딘 완충제(pH 6.0 ± 0.5); (e) 97% ± 2.0% w/w의 수크로스; (f) 0.21% ± 0.04% w/w의 폴리소르베이트 80; 및 (g) 2% ± 1% w/w의 물을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 수성 희석제에서 본 발명의 동결건조된 면역원성 조성물을 재구성함으로써 제조된 액체 면역원성 3종-항원 조성물을 제공하고, 이때 상기 재구성된 조성물은 6.0 ± 0.5의 최종 pH를 가진다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖ 농도의 ClfA 폴리펩티드; (b) 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 농도의 CP5-단백질 접합체; (c) 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 농도의 CP8-단백질 접합체; (d) 10 mM ± 5 mM 농도의 히스티딘 완충제; (e) 0.1% ± 0.05% 중량/부피(w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (f) 9% ± 4.5% w/v 농도의 수크로스를 포함하는 본 발명의 동결건조된 면역원성 조성물을 재구성함으로써 제조된 액체 면역원성 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% 중량/부피(w/v)의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 재구성된 동결건조된 ClfA 폴리펩티드; (b) CP5-단백질 접합체; (c) CP8-단백질 접합체; (d) 히스티딘 완충제(pH 6.0 ± 0.5); (e) 폴리소르베이트 80; (f) 수크로스; 및 (g) 수성 희석제를 포함하는 액체 면역원성 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖ 농도의 재구성된 동결건조된 ClfA 폴리펩티드; (b) 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 농도의 CP5-단백질 접합체; (c) 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 농도의 CP8-단백질 접합체; (d) 10 mM ± 5 mM 농도의 히스티딘 완충제; (e) 0.1% ± 0.05% 중량/부피(w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; (f) 9% ± 4.5% w/v 농도의 수크로스; 및 (g) 수성 희석제를 포함하는 본 발명의 동결건조된 면역원성 조성물을 재구성함으로써 제조된 액체 면역원성 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% 중량/부피(w/v)의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) (i) ClfA 폴리펩티드, (ii) CP5-단백질 접합체, (iii) CP8-단백질 접합체, (iv) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제 및 (v) 벌킹제를 포함하는 수용액을 조합하는 단계; 및 (b) 단계(a)의 조합물을 동결건조하여 3% 중량 미만의 물을 포함하는 케이크(cake)를 형성하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (a)에서 (vi) 계면활성제를 조합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (b)의 동결건조 전에 단계 (a)의 조합물을 필터 멸균하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 수용액은 10 mM ± 1 mM의 히스티딘(pH 6.0 ± 0.5), 9% ± 4.5% w/v의 수크로스 및 0.1% ± 0.05% w/v의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% w/v의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 단계 (b)의 동결건조는 (i) -50℃ ± 5℃의 온도에 도달할 때까지 단계 (a)의 멸균된 조합물을 400 밀리바 ± 40 밀리바의 압력에서 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 동결시킨 후, 상기 조합물을 -50℃ ± 5℃에서 60분± 6분 동안 유지하는 단계; (ii) 온도를 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 -10℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 온도를 -10℃ ± 5℃에서 120분 ± 12분 동안 유지하고, 이어서 -50℃ ± 5℃의 온도에 도달할 때까지 온도를 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 감소시키고 온도를 -50℃ ± 5℃에서 180분 ± 18분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 어닐링시키는 단계; (iii) 압력을 50 밀리토르(mTorr)까지 감소시키고 30분 동안 유지하고, 이어서 온도를 분 당 0.2℃ ± 0.02℃의 속도로 -30℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 온도를 -30℃ ± 5℃에서 1,920분 ± 192분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 건조하는 단계; (iv) 온도를 분 당 0.2℃ ± 0.02℃의 속도로 30℃ ± 5℃까지 증가시키고 압력을 200 mTorr까지 증가시킨 후, 온도를 30℃ ± 5℃에서 720분 ± 72분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 더 건조하는 단계; 및 (v) 온도를 분 당 0.5℃ ± 0.05℃의 속도로 5℃ ± 5℃까지 감소시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조는 바이알 내에서 일어난다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조 후에 바이알의 마개를 닫는다. 일부 실시양태에서, 바이알의 마개를 닫기 전에 바이알을 질소 기체로 재충전한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 단계 (b)의 동결건조된 조합물을 수성 매질에서 재구성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 재구성된 조합물의 삼투질농도(osmolality)는 250 mOsM ± 25 mOsM 내지 300 mOsM ± 30 mOsM이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 면역원성 조성물을 제조하는 임의의 방법에 따라 제조된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, CP5-단백질 접합체, CP8-단백질 접합체 및 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 4종 이상의 성분; (b) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제; 및 (c) 벌킹제를 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 1개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드; (b) CRM₁₉₇에 접합된 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5-CRM₁₉₇); (c) CRM₁₉₇에 접합된 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8-CRM₁₉₇); (d) 단리된 MntC 폴리펩티드; (e) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제; 및 (f) 벌킹제를 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 1개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 면역원성 조성물의 총 중량의 3% 중량(% w/w) 미만으로 물을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공하고, 이때 ClfA 폴리펩티드는 0.09% ± 0.027% 내지 0.84% ± 0.25% w/w의 농도로 존재하고, CP5-CRM₁₉₇은 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w의 농도로 존재하고, CP8-CRM₁₉₇은 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w의 농도로 존재하고, MntC는 0.09% ± 0.027% 내지 0.84% ± 0.25% w/w의 농도로 존재하고, 완충제는 3.3% ± 0.99% w/w의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) ClfA 폴리펩티드; (b) CP5-CRM₁₉₇ 접합체; (c) CP8-CRM₁₉₇ 접합체; (d) MntC 폴리펩티드; (e) 히스티딘 완충제; (f) 수크로스; (g) 폴리소르베이트 80; 및 (h) 물을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 3개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 0.09% ± 0.027% 내지 0.84% ± 0.25% w/w의 ClfA 폴리펩티드; (b) 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체; (c) 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w의 CP8-CRM₁₉₇ 접합체; (d) 0.09% ± 0.027% 내지 0.84% ± 0.25% w/w의 MntC 폴리펩티드; (e) 3.3% ± 0.99% w/w의 히스티딘 완충제; (f) 95% ± 2% w/w의 수크로스; (g) 0.21% ± 0.063% w/w의 폴리소르베이트 80; 및 (h) 2% ± 1% w/w의 물을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 3개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 동결건조된 면역원성 조성물을 수성 희석제에서 재구성함으로써 제조된 액체 면역원성 4종-항원 조성물을 제공하고, 이때 상기 재구성된 조성물은 6.5 ± 0.5의 최종 pH를 가진다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖ 농도의 ClfA 폴리펩티드; (b) 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 농도의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체; (c) 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 농도의 CP8-CRM₁₉₇ 접합체; (d) 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖ 농도의 단리된 MntC 폴리펩티드; (e) 10 mM ± 5 mM 농도의 히스티딘 완충제; (f) 0.01% ± 0.005% 중량/부피(w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; 및 (g) 4.5% ± 1.5% w/v 농도의 수크로스를 포함하는 액체 면역원성 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% w/v의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 재구성된 동결건조된 ClfA 폴리펩티드; (b) CP5-CRM₁₉₇ 접합체; (c) CP8-CRM₁₉₇ 접합체; (d) MntC 폴리펩티드; (e) 히스티딘 완충제; (f) 폴리소르베이트 80; (g) 수크로스; 및 (h) 수성 희석제를 포함하는 액체 면역원성 조성물을 제공한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖ 농도의 재구성된 동결건조된 ClfA 폴리펩티드; (b) 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 농도의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체; (c) 20 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 농도의 CP8-CRM₁₉₇ 접합체; (d) 40 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖ 농도의 단리된 MntC 폴리펩티드; (e) 10 mM ± 5 mM 농도의 히스티딘 완충제; (f) 0.1% ± 0.05% 중량/부피(w/v) 농도의 폴리소르베이트 80; (g) 9% ± 4.5% w/v 농도의 수크로스; 및 (h) 수성 희석제를 포함하는 액체 면역원성 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% w/v의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) (i) ClfA 폴리펩티드, (ii) CP5-CRM₁₉₇ 접합체, (iii) CP8-CRM₁₉₇ 접합체, (iv) MntC 폴리펩티드, (v) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제 및 (vi) 벌킹제를 수용액에서 조합하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 조합물을 동결건조하여 3% 중량 미만의 물을 포함하는 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (a)에서 (vi) 계면활성제를 조합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (b)의 동결건조 전에 단계 (a)의 조합물을 필터 멸균하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 수용액은 10 mM ± 5 mM의 히스티딘(pH 6.0 ± 0.5), 9% ± 1% w/v의 수크로스 및 0.1% ± 0.02% w/v의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.001% w/v의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 0.45% w/v의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)의 동결건조는 (i) -50℃ ± 5℃의 온도에 도달할 때까지 단계 (a)의 멸균된 조합물을 400 밀리바 ± 40 밀리바의 압력에서 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 동결시킨 후, 상기 조합물을 -50℃ ± 5℃에서 60분± 6분 동안 유지하는 단계; (ii) 온도를 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 -10℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 온도를 -10℃ ± 5℃에서 120분 ± 12분 동안 유지하고, 이어서 -50℃ ± 5℃의 온도에 도달할 때까지 온도를 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 감소시키고 온도를 -50℃ ± 5℃에서 180분 ± 18분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 어닐링시키는 단계; (iii) 압력을 50 밀리토르(mTorr)까지 감소시키고 30분 동안 유지한 후, 온도를 분 당 0.2℃ ± 0.02℃의 속도로 -30℃ ± 5℃까지 증가시키고, 이어서 온도를 -30℃ ± 5℃에서 1,920분 ± 192분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 건조하는 단계; (iv) 온도를 분 당 0.2℃ ± 0.02℃의 속도로 30℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 압력을 200 mTorr까지 증가시키고 온도를 30℃ ± 5℃에서 720분 ± 72분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 건조하는 단계; 및 (v) 온도를 분 당 0.5℃ ± 0.05℃의 속도로 5℃ ± 5℃까지 감소시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조는 바이알 내에서 일어난다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조 후에 바이알의 마개를 닫는다. 일부 실시양태에서, 바이알의 마개를 닫기 전에 바이알을 질소 기체로 재충전한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 단계 (b)의 동결건조된 조합물을 수성 매질에서 재구성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)의 재구성된 조합물의 삼투질농도는 250 mOsM ± 25 mOsM 내지 300 mOsM ± 30 mOsM이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 면역원성 조성물을 제조하는 임의의 방법에 따라 제조된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 피브리노겐 도메인을 포함하는 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, (b) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제 및 (c) 벌킹제를 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 1개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다. 한 실시양태에서, 본 발명은 면역원성 조성물의 총 중량의 3% 중량(% w/w) 미만으로 물을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공하고, 이때 ClfA 폴리펩티드는 0.52% ± 0.46% w/w의 농도로 존재하고, 완충제는 0.28% ± 0.065% w/w의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 벌킹제는 97% ± 2.0% w/w의 수크로스이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 0.52% ± 0.46% w/w의 ClfA 폴리펩티드, (b) 0.28% ± 0.065% w/w의 석시네이트 완충제, (c) 97% ± 0.57% w/w의 수크로스, (d) 0.20% ± 0.042% w/w의 폴리소르베이트 80, 및 (e) 2.5% ± 0.5% w/w의 물을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 37℃에서 1개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 동결건조된 면역원성 조성물을 수성 희석제에서 재구성함으로써 제조된 액체 면역원성 ClfA 조성물을 제공하고, 이때 상기 재구성된 조성물은 6.0 ± 0.3의 최종 pH를 가진다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 동결건조된 면역원성 조성물을 수성 희석제에서 재구성함으로써 제조된 액체 면역원성 ClfA 조성물을 제공하고, 이때 상기 재구성된 조성물은 6.5 ± 0.3의 최종 pH를 가진다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 농도의 ClfA 폴리펩티드; (b) 10 mM ± 5 mM의 히스티딘 완충제; (c) 0.1% ± 0.05% 중량/부피(w/v)의 폴리소르베이트 80; 및 (d) 9% ± 4.5% w/v 농도의 수크로스를 포함하는 액체 면역원성 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% w/v의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (a) (i) 재조합 응괴 인자 A(rClfA) 폴리펩티드, (ii) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제 및 (iii) 벌킹제를 수용액에서 조합하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 조합물을 동결건조하여 3% 중량 미만의 물을 포함하는 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (a)에서 (vi) 계면활성제를 조합하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)의 동결건조 전에 단계 (a)의 조합물을 필터 멸균하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 수용액은 10 mM ± 1 mM의 히스티딘(pH 6.0 ± 0.5), 9% ± 1% w/v의 수크로스 및 0.1% ± 0.02% w/v의 폴리소르베이트 80을 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.001% w/v의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 0.45% w/v의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)의 동결건조는 (i) -50℃ ± 5℃의 온도에 도달할 때까지 단계 (a)의 멸균된 조합물을 400 밀리바 ± 40 밀리바의 압력에서 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 동결시킨 후, 상기 조합물을 -50℃ ± 5℃에서 60분 ± 6분 동안 유지하는 단계; (ii) 온도를 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 -10℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 온도를 -10℃ ± 5℃에서 120분 ± 12분 동안 유지하고, 이어서 -50℃ ± 5℃의 온도에 도달할 때까지 온도를 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 감소시킨 후, 온도를 -50℃ ± 5℃에서 180분 ± 18분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 어닐링시키는 단계; (iii) 압력을 50 mTorr까지 감소시키고 온도를 분 당 0.2℃ ± 0.02℃의 속도로 -25℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 온도를 25℃ ± 5℃에서 1,320분 ± 132분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 건조하는 단계; (iv) 온도를 분 당 0.2℃ ± 0.02℃의 속도로 30℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 압력을 200 mTorr까지 증가시키고, 온도를 30℃ ± 5℃에서 720분 ± 72분 동안 유지함으로써 상기 조합물을 건조하는 단계; 및 (v) 온도를 분 당 0.5℃ ± 0.05℃의 속도로 5℃ ± 5℃까지 감소시키는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조는 바이알 내에서 일어난다. 몇몇 실시양태에서, 동결 건조 후에 바이알의 마개를 닫는다. 일부 실시양태에서, 바이알의 마개를 닫기 전에 바이알을 질소 기체로 재충전한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (c) 단계 (b)의 동결건조된 조합물을 수성 매질에서 재구성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)의 건조된 조합물을 수성 매질에서 재구성하는 단계 (c)의 재구성된 조합물의 삼투질농도는 300 mOsM ± 30 mOsM이다. 일부 실시양태에서, 상기 수성 매질은 (a) 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, (b) 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5)-단백질 접합체, (c) 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)-단백질 접합체 및 (d) 스타필로코커스 아우레우스 MntC 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택된 2종 이상의 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용액은 CP5-단백질 접합체 및 CP8-단백질 접합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 수용액은 CP5-단백질 접합체, CP8-단백질 접합체 및 MntC 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본 발명의 면역원성 조성물을 제조하는 임의의 방법에 따라 제조된다.

일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 N 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 N1 도메인, N2 도메인 또는 N3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 N1 도메인, N2 도메인 및 N3 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, ClfA 폴리펩티드는 피브리노겐 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 피브리노겐 결합 도메인은 ClfA의 천연 피브리노겐 결합 도메인을 가진 피브리노겐에 대해 관찰된 결합에 비해 감소된 수준으로 피브리노겐에 결합하도록 변경되어 있다. 일부 실시양태에서, 피브리노겐 결합 도메인은 Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 및 Ile 387 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 가짐으로써 피브리노겐과의 감소된 결합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 및 Ile 387 중 하나 이상에 존재하는 아미노산 치환은 Ala 또는 Ser으로의 치환이다. 일부 실시양태에서, Tyr 338은 Ala으로 치환된다.

일부 실시양태에서, CP5-단백질 접합체는 CP5-CRM₁₉₇, CP5-뉴모라이신(pneumolysin) 또는 CP5-스트렙토코커스 C5a 펩티다제(peptidase)(SCP)이다. 일부 실시양태에서, CP8-단백질 접합체는 CP8-CRM₁₉₇, CP8-뉴모라이신 또는 CP8-스트렙토코커스 C5a 펩티다제(SCP)이다.

일부 실시양태에서, 동결건조된 면역원성 조성물의 완충제는 pH 6.0 ± 0.3의 석시네이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 완충제는 pH 6.5 ± 0.5의 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 완충제는 pH 6.0 ± 0.3의 히스티딘을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벌킹제는 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 글라이신 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 벌킹제는 수크로스이다. 일부 실시양태에서, 벌킹제는 96% ± 0.2% w/w의 수크로스이다. 일부 실시양태에서, 동결건조된 면역원성 조성물은 계면활성제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 계면활성제는 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터는 폴리소르베이트 80이다. 일부 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 ClfA 및 3종-항원 제제에 있어서 0.20% ± 0.041% w/w의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 4종-항원 제제에 있어서 0.1% ± 0.05% w/w의 농도로 존재한다. 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% w/v의 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 동결건조된 면역원성 조성물은 항원보강제(adjuvant)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원보강제는 이스코매트릭스(ISCOMATRIX)™이다.

일부 실시양태에서, 액체 조성물의 수성 희석제는 물이다. 일부 실시양태에서, 수성 희석제는 저염 용액이다. 일부 실시양태에서, 저염 용액은 60 mM ± 10 mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 희석제는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수성 희석제는 항원보강제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원보강제는 이스코매트릭스™이다.

도 1은 다양한 형태의 재조합 ClfA 폴리펩티드의 개략도를 보여주고 서열번호 125 및 127 내지 129를 개시한다.
도 2는 다양한 조건 하에서 다양한 동결건조된(Lyo) ClfA 단백질 로트(lot)의 시간의 경과에 따른 농도 변화(ln[C]로서 표시됨)를 그들의 액체(Liq) 대응물과 비교하여 보여준다. 도 2a: 로트 번호 L36051-37-1 및 L36051-44. 도 2b: 로트 번호 L36051-72. 도 2c: 로트 번호 L36051-81-1. 도 2d: 로트 번호 36051-81-2.
도 3은 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 3개월 동안 저장된 케이크와 비교된, t = 0에서의 동결건조된 DS L40184-61의 크기 배제 크로마토그램을 보여준다.
도 4는 동결건조된(Lyo) 제제를 동결건조 전 액체(Liq) ClfA 로트 L36051-81-1과 비교하는 크기 배제 크로마토그램을 보여준다.
도 5는 다양한 시간 및 온도 조건에서 동결건조된 ClfA의 pH(도 5a), % 수분(도 5b) 및 광학 밀도(도 5c)(응집의 척도임)의 막대그래프를 보여준다.
도 6은 실온에서 24시간 동안 교반한 후 SE-HPLC에 의해 측정된 ClfA의 % 이량체(도 6a), % 단량체(도 6b) 및 % 분해물(절단)(도 6c)의 막대그래프를 보여준다. X 축은 상이한 농도의 폴리소르베이트 80(0.000%, 0.0100%, 0.005% 및 0.100% w/w) 및 수크로스(3%, 4.5% 및 6% w/w)를 함유하는 제제를 보여준다. PS80을 함유하지 않는 제제는 교반 후 % 이량체 형성의 증가를 나타내었다(도 6d).
도 7은 시간의 경과에 따라 다양한 벌킹제에 대해 SE-HPLC에 의해 측정된 ClfA의 % 분해물(절단)(도 7a), % 이량체(도 7b) 및 % 단량체(도 7c)의 막대그래프를 보여준다.
도 8은 고용량 동결건조된 케이크의 재구성 후 다양한 시간에서 ClfA의 순도(도 8a), CP5의 강도(항원성)(도 8b) 및 CP8의 강도(항원성)(도 8c)를 보여준다.
도 9는 저용량 동결건조된 케이크의 재구성 후 다양한 시간에서 ClfA의 순도(도 9a), CP5의 강도(항원성)(도 9b) 및 CP8의 강도(항원성)(도 9c)를 보여준다.
도 10은 재구성 후 실온에서 0시간, 4시간 및 24시간에서 ClfA의 농도(도 10a) 및 % 순도(도 10b), 및 CP5 및 CP6의 농도(도 10c)를 보여준다.
도 11은 1회, 2회 및 3회 동결-해동(F-T) 주기 후 ClfA의 농도(도 11a) 및 % 순도(도 11b), 및 CP5 및 CP6의 농도(도 11c)를 보여준다.
도 12는 pH 6.0(도 12a) 및 pH 7.0(도 12b)에서 다수의 rClfA 로트의 원편광이색법(CD) 스캔을 보여준다.
도 13은 다수의 rClfA 로트의 CD 용융을 pH의 함수로서 보여준다.
도 14는 rClfAm 및 rmClfA에 대한 고유 트립토판 형광(도 14a) 및 ANS 형광(도 14b) 용융을 pH의 함수로서 보여준다.
도 15는 rClfAm 및 rmClfA에 대한 시차 주사 열량측정법(DSC) 용융을 pH의 함수로서 보여준다.
도 16은 rmClfA의 OD₃₅₀ 용융을 pH의 함수로서 보여준다.
도 17은 25℃에서 6주 동안 rmClfA에 대한 크기 배제 HPLC를 pH의 함수로서 보여주고(도 17a), 액체 rmClfA 제제에 대한 pH 및 OD₃₅₀ 안정성을 보여준다(도 17b).
도 18은 MntC에 대한 고유 트립토판 형광 용융(도 18a) 및 T_m1의 추적(도 18b)을 보여준다.
도 19는 MntC에 대한 DSC 용융으로부터의 T_m1의 추적을 pH의 함수로서 보여주고(도 19a) 2종의 주요 열적 사건의 온도기록도를 보여준다(도 19b 및 도 19c).
도 20은 MntC의 OD₃₅₀ 용융을 pH의 함수로서 보여준다.
도 21은 안정성을 모니터링하기 위한 rmClfA(도 21a) 및 MntC(도 21b)의 크로마토그램을 보여준다.
도 22는 5℃(도 22a) 및 25℃(도 22b)에서 RP-HPLC에 의해 측정된 rmClfA의 안정성 결과, 및 5℃(도 22c) 및 25℃(도 22d)에서 IEX-HPLC에 의해 측정된 MntC의 안정성 결과를 보여준다.
도 23은 상이한 pH에서 비탁법(nephelometry)을 이용하여 측정한 5℃ 및 25℃에서의 CP5-CRM₁₉₇의 안정성 결과(각각 도 23a 및 도 23c), 및 5℃ 및 25℃에서의 CP8-CRM₁₉₇의 안정성 결과(각각 도 23b 및 도 23d)를 보여준다.
도 24는 다양한 벌킹제를 함유하는 락킹 후 샘플의 삼투질농도(도 24a) 및 OD₃₅₀(도 24b) 측정을 보여준다.
도 25는 고용량(도 25a) 동결건조된 제제 및 저용량(도 25b) 동결건조된 제제에 대한 RP-HPLC 데이터, 및 MntC 품질에 대한 IEX-HPLC 데이터(도 25c)를 이용한 안정성 시험을 벌킹제의 함수로서 보여준다.
도 26은 모든 4종의 항원의 교반 후 데이터를 보여준다: 항원 농도(도 26a에서 rmClfA 및 MntC; 도 26b에서 CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇), RP-HPLC에 의해 측정된 rmClfA 및 MntC의 순도(도 26b), IEX-HPLC에 의해 측정된 MntC의 순도(도 26c), pH(도 26d) 및 OD₃₅₀(도 26e).
도 27은 모든 4종의 항원의 동결건조 전 및 동결건조 후 데이터를 보여준다: rmClfA 및 MntC에 대한 RP-HPLC 데이터(도 27a), CP5-CRM₁₉₇(도 27b) 및 CP8-CRM₁₉₇(도 27c)에 대한 비탁법 결과, 4.5% 수크로스(도 27d) 및 4% 만니톨/1% 수크로스(도 27e)를 사용하는 MntC에 대한 CEX-HPLC 데이터, DSC 데이터(도 27f), 및 rmClfA(도 27g) 및 접합체(도 27h)의 % 효능.
도 28은 고용량 제제 및 저용량 제제의 삼투질농도를 보여준다.
도 29는 MntC(도 29a) 및 rmClfA(도 29b)에 대한 RP-HPLC 순도 데이터, MntC에 대한 IEX-HPLC 순도 데이터(도 29c), 및 MntC(도 29d) 및 rmClfA(도 29e) 분해의 재구성 후 반응속도를 보여준다.
도 30은 재구성 후 항원 농도(도 30a 내지 도 30d) 및 pH 안정성(도 30e)을 보여준다.
도 31은 동결건조 과정 후 회수 항원 농도(도 31a 및 도 31b) 및 순도(도 31c 및 도 31d)를 보여준다.
도 32는 재구성 후 rmClfA(도 32a) 및 MntC(도 32b) 순도, rmClfA(도 32c) 및 MntC(도 32d) 농도, CP5-CRM₁₉₇(도 32e) 및 CP8-CRM₁₉₇(도 32f) 농도, 및 pH 안정성(도 32g)을 보여준다.
도 33은 동결-해동 후 RP-HPLC에 의해 측정된 rmClfA 및 MntC 순도(도 33a), IEX-HPLC에 의해 측정된 MntC 순도(도 33b), 항원의 농도(도 33c 및 도 33d), 및 pH 안정성(도 33e)을 보여준다.
도 34는 교반 후 RP-HPLC에 의해 측정된 rmClfA 및 MntC 순도(도 34a), IEX-HPLC에 의해 측정된 MntC 순도(도 34b), 항원의 농도(도 34c 및 도 34d), pH(도 34e) 및 OD₃₅₀(도 34f)을 보여준다.
도 35는 24시간 후 CEX-HPLC에 의해 분석되었을 때 2℃ 내지 8℃(도 35a) 및 25℃(도 35b)에서 이스코매트릭스™로 재구성된 MntC의 분해, CEX-HPLC에 의해 분석되었을 때 이스코매트릭스™로 재구성된 rmClfA의 순도(도 35c 및 도 35d), RP-HPLC에 의해 분석되었을 때 2℃ 내지 8℃(도 35e) 및 25℃(도 35f)에서 이스코매트릭스™로 재구성된 MntC의 순도, 2℃ 내지 8℃(도 35g) 및 25℃(도 35h)에서 이스코매트릭스™로 재구성된 CP5-CRM₁₉₇ 접합체 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체의 농도, 및 2℃ 내지 8℃(도 35i) 및 25℃(도 35j)에서 이스코매트릭스™로 재구성된 rmClfA 및 MntC의 농도를 보여준다.
도 36은 재구성된 제제의 24시간에 걸친 2℃ 내지 8℃(도 36a) 및 25℃(도 36b)의 이스코매트릭스™ 농도, 이스코매트릭스™의 입자 크기(도 36c) 및 pH 안정성(도 36d)을 보여준다.
도 37은 4시간 후 RP-HPLC에 의해 분석되었을 때 이스코매트릭스™로 재구성된 MntC의 순도(도 37a) 및 탈아미드화(도 37b), 및 이스코매트릭스™로 재구성된 항원의 농도(도 37c 및 도 37d)를 보여준다.
도 38은 재구성된 제제의 4시간에 걸친 이스코매트릭스™ 입자 크기(도 38a) 및 pH 안정성(도 38b)을 보여준다.
도 39a 내지 39j는 스타필로코커스 아우레우스의 다양한 균주 사이의 ClfA의 정렬을 보여준다(기재된 순서대로 각각 서열번호 62, 64, 68, 84, 70, 104, 66, 78, 86, 88, 90, 72, 74, 76, 80, 94, 82, 92, 96, 98, 100, 102, 106 및 108).
도 40a 내지 40i는 스타필로코커스 아우레우스의 다양한 균주 사이의 ClfB의 정렬을 보여준다(기재된 순서대로 각각 서열번호 26, 28, 32, 18, 54, 34, 36, 30, 16, 20, 22, 24, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 56, 58 및 60).
도 41a 내지 41c는 스타필로코커스 아우레우스의 다양한 균주 사이의 MntC의 정렬을 보여준다(기재된 순서대로 각각 서열번호 2, 8, 10, 4, 6, 14 및 12).
도 42는 스타필로코커스 아우레우스의 다양한 균주의 ClfB 서열의 도표를 보여준다.
도 43은 스타필로코커스 아우레우스의 다양한 균주의 MntC 서열의 도표를 보여준다.

본 방법 및 치료 방법이 기재되기 전에, 기재된 특정 방법 및 실험 조건이 달라질 수 있기 때문에 본 발명이 이러한 방법 및 조건으로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해해야 한다.

본원에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이하에 기재되어 있다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌은 전체적으로 참고로 도입된다.

본원에서 사용된 용어는 당업자에게 인식되고 공지된 의미를 갖지만, 편의 및 완전함을 위해 구체적인 용어 및 이들의 의미가 이하에 기재되어 있다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 단수형 용어는 복수형 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "방법"의 언급은 본원에 기재된 유형의 1종 이상의 방법 및/또는 단계, 및/또는 본 개시내용 등을 읽었을 때 당업자에게 자명해질 1종 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다.

용어 "약" 또는 "대략"은 값의 통계적으로 유의한 범위 내에 있다는 것을 의미한다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 전형적으로 20% 이내, 보다 전형적으로 10% 이내, 훨씬 더 전형적으로 5% 이내에 있을 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포괄되는 허용가능한 편차는 연구되는 구체적인 시스템에 의해 좌우되고 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 인식될 수 있다. 본원 내에서 한 범위가 언급될 때마다, 상기 범위 내의 모든 전체 정수도 본 발명의 실시양태로서 고려된다.

"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 1개 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않은 한, 상기 용어는 온전한 다중클론 또는 단일클론 항체뿐만 아니라, 조작된 항체(예를 들면, 이펙터 기능, 안정성 및 다른 생물학적 활성을 변경시키기 위해 조작된 키메라, 인간화된 및/또는 유도체화된 항체) 및 이의 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일 쇄(ScFv) 및 도메인 항체(상어 항체 및 낙타 항체를 포함함), 및 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 다가 항체, 다중특이적 항체(예를 들면, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 이중특이적 항체) 및 본원에 기재된 항체 단편, 및 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 입체구조도 포괄하기 위한 것이다. 항체는 임의의 클래스, 예컨대, IgG, IgA 또는 IgM(또는 이들의 서브클래스)의 항체를 포함하고, 항체는 임의의 특정 클래스의 항체일 필요가 없다. 면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 인간에서 면역글로불린의 5종의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고 이들 중 몇몇은 서브클래스(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로서 지칭된다. 면역글로불린의 상이한 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원적 입체구조는 잘 공지되어 있다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 부분만을 포함하고, 이때 상기 부분은 바람직하게는 온전한 항체에 존재할 때 상기 부분과 통상적으로 관련되어 있는 기능 중 1종 이상의, 바람직하게는 대부분의 또는 모든 기능을 보유한다.

용어 "항원"은 일반적으로 생물학적 분자, 통상적으로 동족(cognate) 항체가 선별적으로 결합할 수 있는 1개 이상의 에피토프를 함유하는 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 지질 또는 접합체를 의미하거나; 몇몇 경우 동물 내로 주입되거나 흡수되는 조성물을 포함하는, 동물에서 항체의 생성 또는 T 세포 반응, 또는 이들 둘다를 자극할 수 있는 면역원성 물질을 의미한다. 면역 반응은 전체 분자, 또는 상기 분자의 1개 이상의 다양한 부분(예를 들면, 에피토프 또는 햅텐)에 대해 발생될 수 있다. 상기 용어는 개별 분자를 의미하거나 항원성 분자의 균질한 또는 불균질한 집단을 의미하기 위해 사용될 수 있다. 항원은 항체, T 세포 수용체, 또는 특이적 체액성 및/또는 세포성 면역의 다른 구성요소에 의해 인식된다. 용어 "항원"은 모든 관련된 항원성 에피토프를 포함한다. 소정의 항원의 에피토프는 당업계에 잘 공지되어 있는 임의의 수의 에피토프 맵핑(mapping) 기법을 이용함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J.)을 참조한다. 예를 들면, 선형 에피토프는 예를 들면, 고체 지지체 상에서 단백질 분자의 부분에 상응하는 많은 수의 펩티드를 동시적으로 합성하고 상기 펩티드가 상기 지지체에 여전히 부착되어 있는 동안 상기 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 확인될 수 있다. 이러한 기법은 당업계에 공지되어 있고 예를 들면, 미국 특허 제4,708,871호, 문헌(Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002) 및 문헌(Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715)(이들 모두 전체적으로 본원에 참고로 도입됨)에 기재되어 있다. 유사하게, 입체구조적 에피토프는 예컨대, X-선 결정학 및 2차원적 핵 자기 공명으로 아미노산의 공간적 입체구조를 결정함으로써 확인될 수 있다. 예를 들면, 상기 문헌(Epitope Mapping Protocols)을 참조한다. 나아가, 본 발명의 목적을 위해, "항원"은 천연 서열에 대한 변형, 예컨대, 결실, 부가 및 치환(일반적으로 성질 면에서 보존적 치환이지만 비보존적 치환일 수 있음)을 포함하되 면역학적 반응을 이끌어내는 능력을 유지하는 단백질을 의미하기 위해 사용될 수도 있다. 이들 변형은 부위 지정 돌연변이유발, 특정 합성 절차 또는 유전공학 방법을 통한 의도적 변형일 수 있거나, 예컨대, 항원을 생성하는 숙주의 돌연변이를 통한 우발적 변형일 수 있다. 나아가, 항원은 미생물, 예를 들면, 세균으로부터 유도되거나, 수득되거나 단리될 수 있거나, 또는 전체 유기체일 수 있다. 유사하게, 예컨대, 핵산 면역화 적용에 있어서 항원을 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드도 상기 정의에 포함된다. 합성 항원, 예를 들면, 폴리에피토프, 플랭킹(flanking) 에피토프, 및 다른 재조합 또는 합성적으로 유도된 항원도 포함된다(Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; Gardner et al. (1998) 12^th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998).

용어 "항원보강제"는 본원에 추가로 기재되고 예시된 바와 같이 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 화합물 또는 혼합물을 의미한다.

"세균혈증"은 혈액 중의 세균의 일시적 존재이다. 세균혈증은 균혈증 또는 패혈증으로 진행될 수 있고, 이 균혈증 또는 패혈증은 감염으로 간주될 것이고 관련 임상 징후/증상을 갖는 혈액 중의 세균의 영구적 존재이다. 모든 세균이 혈액에서 생존할 수 있는 것은 아니다. 혈액에서 생존할 수 있는 세균은 이 능력을 제공하는 특별한 유전 형질을 가진다. 또한, 숙주 인자도 중요한 역할을 수행한다.

"캡슐형 폴리사카라이드" 또는 "캡슐 폴리사카라이드"는 스타필로코커스의 대다수 단리물의 세포벽 외면에 존재하는 폴리사카라이드 캡슐을 의미한다. 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스는 유기체가 불리한 삼투 조건 하에서 생존할 수 있게 하는 펩티도글라이칸 복합체로 구성된 세포벽 성분을 포함하고 펩티도글라이칸에 연결된 독특한 테이코산(teichoic acid)도 포함한다. 세포벽 외면에 존재하는 얇은 폴리사카라이드 캡슐은 스타필로코커스 아우레우스의 대다수 단리물을 코팅한다. 혈청학적으로 상이한 이 캡슐은 스타필로코커스 아우레우스의 다양한 단리물을 혈청형으로 분류하는 데에 사용될 수 있다. 임상적으로 유의한 단리물들 중 대다수가 하기 2종의 캡슐형을 포함하는 것으로 밝혀졌다: 혈청형 5(CP5) 및 혈청형 8(CP8).

본원에서 사용된 바와 같이, "접합체"는 통상적으로 원하는 범위의 분자량을 가진 캡슐 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 포함하고, 이때 상기 캡슐 폴리사카라이드는 상기 담체 단백질에 접합되어 있다. 접합체는 일정한 양의 자유 캡슐 폴리사카라이드를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "자유 캡슐 폴리사카라이드"는 접합된 캡슐 폴리사카라이드-담체 단백질과 비공유적으로 연결되어 있는(비공유적으로 결합되어 있거나, 흡착되어 있거나, 또는 포획되어 있는) 캡슐 폴리사카라이드를 의미한다. 용어 "자유 캡슐 폴리사카라이드", "자유 폴리사카라이드" 및 "자유 사카라이드"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 동일한 의미를 전달하기 위한 것이다. 이것은, 담체 분자의 성질과 관계없이, 캡슐 폴리사카라이드에 직접적으로 또는 링커를 통해 접합될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "접합시키기 위한", "접합된" 및 "접합시키는"은 세균 캡슐 폴리사카라이드가 담체 분자에 공유부착되는 과정을 의미한다. 접합은 세균 캡슐 폴리사카라이드의 면역원성을 향상시킨다. 접합은 후술된 방법에 따라 수행될 수 있거나 당분야에서 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.

전술된 바와 같이, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 스타필로코커스 아우레우스 혈청형 5 캡슐 폴리사카라이드(CP5)를 포함하는 접합체, 및 담체 단백질에 접합된 스타필로코커스 아우레우스 혈청형 8 캡슐 폴리사카라이드(CP8)를 포함하는 접합체에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태는 담체 단백질에 접합된 스타필로코커스 아우레우스 혈청형 5 캡슐 폴리사카라이드 및 담체 단백질에 접합된 스타필로코커스 아우레우스 혈청형 8 캡슐 폴리사카라이드를 포함하는 접합체를 제공하고, 이때 5형 캡슐 폴리사카라이드는 50 kDa 내지 800 kDa의 분자량을 갖고; 8형 캡슐 폴리사카라이드는 50 kDa 내지 700 kDa의 분자량을 갖고; 면역원성 접합체는 약 1000 kDa 내지 약 5000 kDa의 분자량을 갖고; 상기 접합체는 총 폴리사카라이드를 기준으로 약 30% 미만의 자유 폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 접합체는 총 폴리사카라이드를 기준으로 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10% 또는 약 5% 미만의 자유 폴리사카라이드를 포함한다. 한 실시양태에서, 5형 또는 8형 폴리사카라이드는 약 20 kDa 내지 약 1000 kDa, 약 50 kDa 내지 약 500 kDa, 약 50 kDa 내지 약 200 kDa, 또는 약 75 kDa 내지 약 150 kDa의 분자량을 가진다.

한 실시양태에서, 상기 접합체는 약 50 kDa 내지 약 5000 kDa의 분자량을 가진다. 한 실시양태에서, 상기 접합체는 약 200 kDa 내지 약 5000 kDa의 분자량을 가진다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 접합체는 약 400 kDa 내지 약 2500 kDa의 분자량을 가진다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 접합체는 약 500 kDa 내지 약 2500 kDa의 분자량을 가진다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 접합체는 약 600 kDa 내지 약 2800 kDa의 분자량을 가진다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 접합체는 약 700 kDa 내지 약 2700 kDa의 분자량을 가진다. 한 실시양태에서, 상기 면역원성 접합체는 약 1000 kDa 내지 약 2000 kDa, 약 1800 kDa 내지 약 2500 kDa, 약 1100 kDa 내지 약 2200 kDa, 약 1900 kDa 내지 약 2700 kDa, 약 1200 kDa 내지 약 2400 kDa, 약 1700 kDa 내지 약 2600 kDa, 약 1300 kDa 내지 약 2600 kDa, 또는 약 1600 kDa 내지 약 3000 kDa의 분자량을 가진다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 접합체 내의 담체 단백질은 CRM₁₉₇이고, CRM₁₉₇은 카바메이트 결합, 아미드 결합 또는 이들 둘다를 통해 캡슐 폴리사카라이드에 공유결합된다. 캡슐 폴리사카라이드에 접합되게 되는 담체 단백질 내의 라이신 잔기의 수는 접합된 라이신의 범위로서 특징지워질 수 있다. 예를 들면, 주어진 면역원성 조성물에서, CRM₁₉₇은 캡슐 폴리사카라이드에 공유결합된 39개의 라이신 중 5개 내지 15개의 라이신을 포함할 수 있다. 이 파라미터를 표현하는 또 다른 방식은 CRM₁₉₇ 라이신 중 12% 내지 40%의 라이신이 캡슐 폴리사카라이드에 공유결합된다는 것이다. 몇몇 실시양태에서, CRM₁₉₇에 공유결합된 폴리사카라이드의 CRM₁₉₇ 부분은 상기 폴리사카라이드에 공유결합된 5개 내지 25개의 라이신을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, CRM₁₉₇에 공유결합된 폴리사카라이드의 CRM₁₉₇ 부분은 상기 폴리사카라이드에 공유결합된 5개 내지 20개의 라이신을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 담체 단백질에 공유결합된 폴리사카라이드의 CRM₁₉₇ 부분은 상기 폴리사카라이드에 공유결합된 10개 내지 25개의 라이신을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 담체 단백질에 공유결합된 폴리사카라이드의 CRM₁₉₇ 부분은 상기 폴리사카라이드에 공유결합된 8개 내지 15개의 라이신을 포함한다. 예를 들면, 주어진 면역원성 조성물에서, CRM₁₉₇은 캡슐 폴리사카라이드에 공유결합된 39개의 라이신 중 18개 내지 22개의 라이신을 포함할 수 있다. 이 파라미터를 표현하는 또 다른 방식은 CRM₁₉₇ 라이신 중 40% 내지 60%의 라이신이 캡슐 폴리사카라이드에 공유결합된다는 것이다. 몇몇 실시양태에서, CRM₁₉₇은 CP8에 공유결합된 39개의 라이신 중 5개 내지 15개의 라이신을 포함한다. 이 파라미터를 표현하는 또 다른 방식은 CRM₁₉₇ 라이신 중 12% 내지 40%의 라이신이 CP8에 공유결합된다는 것이다. 몇몇 실시양태에서, CRM₁₉₇은 CP5에 공유결합된 39개의 라이신 중 18개 내지 22개의 라이신을 포함한다. 이 파라미터를 표현하는 또 다른 방식은 CRM₁₉₇ 라이신 중 40% 내지 60%의 라이신이 CP5에 공유결합된다는 것이다.

상기 논의된 바와 같이, 캡슐 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질 내의 라이신 잔기의 수는 몰비로서 표현될 수 있는 접합된 라이신의 범위로서 특징지워질 수 있다. 예를 들면, CP8 면역원성 접합체에서 접합된 라이신 대 CRM₁₉₇의 몰비는 약 18:1 내지 약 22:1일 수 있다. 한 실시양태에서, CP8 면역원성 접합체에서 접합된 라이신 대 CRM₁₉₇의 몰비 범위는 약 15:1 내지 약 25:1일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, CP8 면역원성 접합체에서 접합된 라이신 대 CRM₁₉₇의 몰비의 범위는 약 14:1 내지 약 20:1, 약 12:1 내지 약 18:1, 약 10:1 내지 약 16:1, 약 8:1 내지 약 14:1, 약 6:1 내지 약 12:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 20:1 내지 약 26:1, 약 22:1 내지 약 28:1, 약 24:1 내지 약 30:1, 약 26:1 내지 약 32:1, 약 28:1 내지 약 34:1, 약 30:1 내지 약 36:1, 약 5:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 20:1, 약 10:1 내지 약 20:1, 또는 약 10:1 내지 약 30:1일 수 있다. 또한, CP5 면역원성 접합체에서 접합된 라이신 대 CRM₁₉₇의 몰비는 약 3:1 내지 25:1일 수 있다. 한 실시양태에서, CP5 면역원성 접합체에서 접합된 라이신 대 CRM₁₉₇의 몰비의 범위는 약 5:1 내지 약 20:1일 수 있다. 한 실시양태에서, CP5 면역원성 접합체에서 접합된 라이신 대 CRM₁₉₇의 몰비의 범위는 약 4:1 내지 약 20:1, 약 6:1 내지 약 20:1, 약 7:1 내지 약 20:1, 약 8:1 내지 약 20:1, 약 10:1 내지 약 20:1, 약 11:1 내지 약 20:1, 약 12:1 내지 약 20:1, 약 13:1 내지 약 20:1, 약 14:1 내지 약 20:1, 약 15:1 내지 약 20:1, 약 16:1 내지 약 20:1, 약 17:1 내지 약 20:1, 약 18:1 내지 약 20:1, 약 5:1 내지 약 18:1, 약 7:1 내지 약 16:1, 또는 약 9:1 내지 약 14:1일 수 있다.

캡슐 폴리사카라이드에 접합된 담체 단백질 내의 라이신 잔기의 수를 표현하는 또 다른 방식은 접합된 라이신의 범위로서 표현하는 것일 수 있다. 예를 들면, 주어진 CP8 면역원성 접합체에서 CRM₁₉₇은 캡슐 폴리사카라이드에 공유결합된 39개의 라이신 중 5개 내지 15개의 라이신을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이 파라미터는 백분율로서 표현될 수 있다. 예를 들면, 주어진 CP8 면역원성 접합체에서 접합된 라이신의 백분율은 10% 내지 50%일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 20% 내지 50%의 라이신이 CP8에 공유결합될 수 있다. 대안적으로, 30% 내지 50%의 CRM₁₉₇ 라이신이 CP8에 공유결합될 수 있고, 10% 내지 40%의 CRM₁₉₇ 라이신, 10% 내지 30%의 CRM₁₉₇ 라이신, 20% 내지 40%의 CRM₁₉₇ 라이신, 25% 내지 40%의 CRM₁₉₇ 라이신, 30% 내지 40%의 CRM₁₉₇ 라이신, 10% 내지 30%의 CRM₁₉₇ 라이신, 15% 내지 30%의 CRM₁₉₇ 라이신, 20% 내지 30%의 CRM₁₉₇ 라이신, 25% 내지 30%의 CRM₁₉₇ 라이신, 10% 내지 15%의 CRM₁₉₇ 라이신, 또는 10% 내지 12%의 CRM₁₉₇ 라이신이 CP8에 공유결합된다. 또한, 주어진 CP5 면역원성 접합체에서, CRM₁₉₇은 캡슐 폴리사카라이드에 공유결합된 39개의 라이신 중 18개 내지 22개의 라이신을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이 파라미터는 백분율로서 표현될 수 있다. 예를 들면, 주어진 CP5 면역원성 접합체에서 접합된 라이신의 백분율은 40% 내지 60%일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 40% 내지 60%의 라이신이 CP5에 공유결합될 수 있다. 대안적으로, 30% 내지 50%의 CRM₁₉₇ 라이신이 CP5에 공유결합될 수 있고, 20% 내지 40%의 CRM₁₉₇ 라이신, 10% 내지 30%의 CRM₁₉₇ 라이신, 50% 내지 70%의 CRM₁₉₇ 라이신, 35% 내지 65%의 CRM₁₉₇ 라이신, 30% 내지 60%의 CRM₁₉₇ 라이신, 25% 내지 55%의 CRM₁₉₇ 라이신, 20% 내지 50%의 CRM₁₉₇ 라이신, 15% 내지 45%의 CRM₁₉₇ 라이신, 10% 내지 40%의 CRM₁₉₇ 라이신, 40% 내지 70%의 CRM₁₉₇ 라이신, 또는 45% 내지 75%의 CRM₁₉₇ 라이신이 CP5에 공유결합된다.

캡슐 폴리사카라이드 쇄가 담체 분자 상의 라이신에 부착되는 빈도는 캡슐 폴리사카라이드의 접합체를 특징짓는 또 다른 파라미터이다. 예를 들면, 한 실시양태에서, CRM₁₉₇과 폴리사카라이드 사이의 1개 이상의 공유결합은 캡슐 폴리사카라이드의 5개 내지 10개 이상의 사카라이드 반복 유닛마다 일어난다. 또 다른 실시양태에서, 캡슐 폴리사카라이드의 5개 내지 10개 사카라이드 반복 유닛마다, 2개 내지 7개 사카라이드 반복 유닛마다, 3개 내지 8개 사카라이드 반복 유닛마다, 4개 내지 9개 사카라이드 반복 유닛마다, 6개 내지 11개 사카라이드 반복 유닛마다, 7개 내지 12개 사카라이드 반복 유닛마다, 8개 내지 13개 사카라이드 반복 유닛마다, 9개 내지 14개 사카라이드 반복 유닛마다, 10개 내지 15개 사카라이드 반복 유닛마다, 2개 내지 6개 사카라이드 반복 유닛마다, 3개 내지 7개 사카라이드 반복 유닛마다, 4개 내지 8개 사카라이드 반복 유닛마다, 6개 내지 10개 사카라이드 반복 유닛마다, 7개 내지 11개 사카라이드 반복 유닛마다, 8개 내지 12개 사카라이드 반복 유닛마다, 9개 내지 13개 사카라이드 반복 유닛마다, 10개 내지 14개 사카라이드 반복 유닛마다, 10개 내지 20개 사카라이드 반복 유닛마다, 또는 5개 내지 10개 사카라이드 반복 유닛마다 CRM₁₉₇과 캡슐 폴리사카라이드 사이의 1개 이상의 공유결합이 존재한다. 또 다른 실시양태에서, CRM₁₉₇과 캡슐 폴리사카라이드 사이의 1개 이상의 결합은 캡슐 폴리사카라이드의 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 사카라이드 반복 유닛마다 일어난다.

폴리사카라이드의 화학적 활성화 및 담체 단백질에의 후속 접합은 통상적인 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,673,574호 및 제4,902,506호를 참조한다. 다른 활성화 및 접합 방법이 대안적으로 이용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "담체 단백질" 또는 "단백질 담체"는 면역 반응이 요구되는 항원(예컨대, 캡슐 폴리사카라이드)에 접합될 수 있는 임의의 단백질 분자를 의미한다. 항원, 예컨대, 폴리사카라이드와 담체 단백질의 접합은 항원이 면역원성을 갖게 할 수 있다. 담체 단백질은 바람직하게는 무독성 및 비반응유발성을 나타내고 충분한 양 및 순도로 수득될 수 있는 단백질이다. 담체 단백질의 예는 파상풍, 디프테리아, 백일해, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 이. 콜라이(E. coli), 스타필로코커스 종 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 종으로부터의 독소, 변성독소(toxoid), 또는 상기 독소의 임의의 돌연변이체 교차반응성 물질(CRM₁₉₇)이다. 담체 단백질은 표준 접합 절차에 의해 다루어질 수 있어야 한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, CRM₁₉₇이 담체 단백질로서 사용된다.

CRM₁₉₇(와이어스(Wyeth)/화이자(Pfizer), 미국 노쓰캐롤라이나주 샌드포드 소재)은 카사미노산 및 효모 추출물 기제 배지에서 증식된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7(β₁₉₇)의 배양물로부터 단리된 디프테리아 독소의 무독성 변이체(즉, 변성독소)이다. CRM₁₉₇은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제된다. CRM₁₉₇ 단백질을 생산하는 코리네박테리움 디프테리아 균주 C7(β₁₉₇)의 배양물은 어메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection)(미국 매릴랜드주 록빌 소재)에 기탁되었고 수탁번호 ATCC 53281을 배정받았다. 다른 디프테리아 변성독소도 담체 단백질로서 사용되기에 적합하다.

다른 적합한 담체 단백질은 불활성화된 세균 독소, 예컨대, 파상풍 변성독소, 백일해 변성독소, 콜레라 변성독소(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO2004/083251호에 기재됨), 이. 콜라이 LT, 이. 콜라이 ST, 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A를 포함한다. 세균 외막 단백질, 예컨대, 외막 단백질 복합체 c(OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴모라이신, 뉴모코커스 표면 단백질 A(PspA), 뉴모코커스 부착소 단백질(PsaA), 클로스트리듐 디피실(C. difficile) 장독소(독소 A) 및 세포독소(독소 B), 또는 해모필러스 인플루엔자 단백질 D도 사용될 수 있다. 다른 단백질, 예컨대, 스트렙토코커스 C5a 펩티다제(SCP), 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 튜버큘린(tuberculin)의 정제된 단백질 유도체(PPD)도 담체 단백질로서 사용될 수 있다.

캡슐 폴리사카라이드를 담체 단백질에 접합시킨 후, 폴리사카라이드-단백질 접합체를 다양한 기법으로 정제한다(폴리사카라이드-단백질 접합체의 양을 풍부하게 한다). 이들 기법은 예를 들면, 농축/정용여과 작업, 침전/용출, 컬럼 크로마토그래피 및 심층 여과를 포함한다. 하기 실시예를 참조한다.

개별 접합체를 정제한 후, 이들을 조합하여, 예를 들면, 백신에 사용될 수 있는 본 발명의 면역원성 조성물을 제제화할 수 있다. 당분야에서 인정된 방법을 이용하여 본 발명의 면역원성 조성물의 제제화를 달성할 수 있다.

본 개시내용에서, 용어, 예컨대, "포함한다", "포함된", "포함하는", "함유한다", "함유하는" 등은 미국 특허법에서 이들 용어에 부여된 의미를 가질 수 있는데, 예를 들면, 이들은 "포괄한다", "포괄된", "포괄하는" 등을 의미할 수 있다는 것을 인식해야 한다. 이러한 용어는 임의의 다른 성분을 배제하지 않으면서 특정 성분 또는 성분의 세트의 포함을 의미한다. 용어, 예컨대, "본질적으로 . . .로 구성된" 및 "본질적으로 . . .로 구성된다"는 미국 특허법에서 이들 용어에 부여된 의미를 갖는데, 예를 들면, 이들은 본 발명의 신규 또는 기본 특징을 벗어나지 않는 추가 성분 또는 단계의 포함을 허용한다(즉, 이들은 본 발명의 신규 또는 기본 특징으로부터 벗어나는 언급되지 않은 추가 성분 또는 단계를 배제하고, 특히 본 문헌의 목적이 종래기술, 예를 들면, 본원에서 인용되거나 본원에 참고로 도입되는 문헌에 비해 특허가능한, 예를 들면, 신규하고 자명하지 않고 발명적인 실시양태를 정의하는 것이기 때문에, 종래기술, 예컨대, 본원에서 인용되거나 본원에 참고로 도입되는 당분야의 문헌의 성분 또는 단계를 배제한다. 또한, 용어 "로 구성된다" 및 "로 구성된"은 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 가진다(즉, 이들 용어는 한정적이다). 따라서, 이들 용어는 특정 성분 또는 성분의 세트의 포함 및 모든 다른 성분의 배제를 의미한다.

"보존적 아미노산 치환"은 단백질의 1개 이상의 아미노산 잔기를 유사한 물리적 및/또는 화학적 성질을 가진 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 의미한다. 서열 내의 한 아미노산에 대한 치환체는 이 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 방향족 고리 구조를 함유하는 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이다. 극성 중성 아미노산은 글라이신, 세린, 쓰레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된(산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 이러한 변경은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점에 의해 측정되었을 때 겉보기 분자량에 영향을 미칠 것으로 예측되지 않을 것이다. 특히 바람직한 치환은 다음과 같다: 양 전하가 유지될 수 있도록 아르기닌 대신에 라이신(역의 경우도 성립됨); 음 전하가 유지될 수 있도록 Asp 대신에 Glu(역의 경우도 성립됨); 자유 --OH가 유지될 수 있도록 Thr 대신에 Ser; 및 자유 NH₂가 유지될 수 있도록 Asn 대신에 Gln.

"단편"은 보다 큰 단백질의 특정 도메인만이 포함되어 있는 단백질을 의미한다. 예를 들면, ClfA 단백질 및 ClfB 단백질은 각각 신호 서열이 포함되는 경우 8개만큼 많은 도메인을 함유한다. N1N2N3, N2N3, N1N2, N1, N2, 또는 N3 도메인에 상응하는 폴리펩티드는 각각 ClfA 또는 ClfB의 단편인 것으로 간주된다. "단편"은 모 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노산 서열의 4개 이상의 아미노산 잔기(바람직하게는, 10개 이상의 아미노산 잔기, 15개 이상의 아미노산 잔기, 20개 이상의 아미노산 잔기, 25개 이상의 아미노산 잔기, 40개 이상의 아미노산 잔기, 50개 이상의 아미노산 잔기, 60개 이상의 아미노산 잔기, 70개 이상의 아미노산 잔기, 80개 이상의 아미노산 잔기, 90개 이상의 아미노산 잔기, 100개 이상의 아미노산 잔기, 125개 이상의 아미노산 잔기 또는 150개 이상의 아미노산 잔기)로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드; 또는 모 핵산의 뉴클레오티드 서열의 10개 이상의 염기 쌍(바람직하게는 20개 이상의 염기 쌍, 30개 이상의 염기 쌍, 40개 이상의 염기 쌍, 50개 이상의 염기 쌍, 100개 이상의 염기 쌍 또는 200개 이상의 염기 쌍)으로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "기능 활성" 또는 "기능성 항체"는 최소한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 추가 기능은 당분야에 공지되어 있고, 예컨대, 옵소닌화(opsonization), ADCC 또는 보체 매개된 세포독성을 통한 병원체의 제거 또는 사멸을 수행하는 면역 시스템의 추가 성분을 포함할 수 있다. 항원 결합 후, 임의의 후속 항체 기능은 상기 항체의 Fc 영역을 통해 매개될 수 있다. 항체 옵소닌식균작용(opsonophagocytic) 분석(OPA)은 이펙터 세포(백혈구)를 이용하는 세균의 시험관내 Ig 보체 보조된 사멸을 측정하도록 디자인된 시험관내 분석이므로 생물학적 과정과 유사하다. 항체 결합은 이 항체가 결합하는 항원의 생물학적 기능을 직접적으로 억제할 수도 있다(예를 들면, ClfA에 결합하는 항체는 그의 효소 작용을 중화시킬 수 있다). 몇몇 실시양태에서, "기능성 항체"는 항체가 세균을 사멸시킨다는 것을 입증하는 동물 효능 모델 또는 옵소닌식균 사멸 분석에서 세균의 사멸에 의해 측정되었을 때 기능성을 가진 항체를 의미한다.

스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드의 분자량은 면역원성 조성물에서의 사용을 위한 고려사항이다. 예를 들면, 고분자량 캡슐 폴리사카라이드는 항원성 표면 상에 존재하는 에피토프의 높은 원자가로 인해 일부 항체 면역 반응을 유도할 수 있다. "고분자량 캡슐 폴리사카라이드"의 단리는 본 발명의 조성물 및 방법에서의 사용을 위해 고려된다. 예를 들면, 본 발명의 한 실시양태에서, 분자량 범위가 약 50 kDa 내지 약 800 kDa인 5형 고분자량 폴리사카라이드의 단리가 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분자량 범위가 약 20 kDa 내지 약 1000 kDa인 5형 고분자량 폴리사카라이드의 단리가 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분자량 범위가 약 50 kDa 내지 약 300 kDa인 5형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 70 kDa 내지 300 kDa인 5형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 90 kDa 내지 250 kDa인 5형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 90 kDa 내지 150 kDa인 5형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 90 kDa 내지 140 kDa인 5형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 80 kDa 내지 120 kDa인 5형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 본 발명의 방법에 의해 단리되고 정제될 수 있는 고분자량 혈청형 5 캡슐 폴리사카라이드의 다른 범위는 약 70 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 110 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 120 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 130 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 140 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 150 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 160 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 110 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 120 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 130 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 140 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 150 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 160 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 110 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 120 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 130 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 140 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 150 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 160 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 120 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 130 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 140 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 150 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 160 kDa의 분자량 크기 범위 및 유사한 원하는 분자량 범위를 포함한다.

상기 논의된 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드의 분자량은 면역원성 조성물에서의 사용을 위한 고려사항이다. 예를 들면, 고분자량 캡슐 폴리사카라이드는 항원성 표면 상에 존재하는 에피토프의 높은 원자가로 인해 일부 항체 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분자량 범위가 약 20 kDa 내지 약 1000 kDa인 8형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분자량 범위가 약 50 kDa 내지 약 700 kDa인 8형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분자량 범위가 50 kDa 내지 300 kDa인 8형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 70 kDa 내지 300 kDa인 8형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 90 kDa 내지 250 kDa인 8형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 90 kDa 내지 150 kDa인 8형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 90 kDa 내지 120 kDa인 8형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 한 실시양태에서, 분자량 범위가 80 kDa 내지 120 kDa인 8형 고분자량 캡슐 폴리사카라이드의 단리 및 정제가 고려된다. 본 발명의 방법에 의해 단리되고 정제될 수 있는 고분자량 혈청형 8 캡슐 폴리사카라이드의 다른 범위는 약 70 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 110 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 120 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 130 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 140 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 150 kDa의 분자량 크기 범위, 70 kDa 내지 160 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 110 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 120 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 130 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 140 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 150 kDa의 분자량 크기 범위, 80 kDa 내지 160 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 110 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 120 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 130 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 140 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 150 kDa의 분자량 크기 범위, 90 kDa 내지 160 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 120 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 130 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 140 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 150 kDa의 분자량 크기 범위, 100 kDa 내지 160 kDa의 분자량 크기 범위 및 유사한 원하는 분자량 범위를 포함한다.

면역원성 조성물에 대한 "면역 반응"은 대상체에서 관심 있는 조성물에 존재하는 분자(예를 들면, 항원, 예컨대, 단백질 또는 폴리사카라이드)에 대한 체액성 면역 반응 및/또는 세포 매개된 면역 반응의 발생이다. 본 발명의 목적을 위해, "체액성 면역 반응"은 항체 매개된 면역 반응이고 본 발명의 면역원성 조성물에 존재하는 항원에 대한 친화성을 가진 항체의 발생을 수반하는 반면, "세포 매개된 면역 반응"은 T 림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개된 면역 반응이다. "세포 매개된 면역 반응"은 주조직적합성 복합체(MHC)의 클래스 I 또는 클래스 II 분자와 결합된 항원성 에피토프의 제시에 의해 유발된다. 이것은 항원 특이적 CD4+ T 헬퍼 세포 또는 CD8+ 세포독성 T 림프구 세포("CTL")를 활성화시킨다. CTL은 주조직적합성 복합체(MHC) 또는 CD1에 의해 코딩되고 세포의 표면 상에서 발현된 단백질과 결합된 상태로 제시되는 펩티드 또는 지질 항원에 대한 특이성을 가진다. CTL은 세포내 미생물의 세포내 파괴 또는 이러한 미생물로 감염된 세포의 용해를 유도하고 촉진하는 것을 돕는다. 세포성 면역의 또 다른 양태는 헬퍼 T 세포에 의한 항원 특이적 반응을 수반한다. 헬퍼 T 세포는 세포 표면 상에서 고전적 또는 비고전적 MHC 분자와 결합된 펩티드 항원을 디스플레이하는 세포에 대한 비특이적 이펙터 세포의 기능을 자극하고 이 이펙터 세포의 활성을 집중시키는 것을 돕는 작용을 한다. 또한, "세포 매개된 면역 반응"은 활성화된 T 세포 및/또는 다른 백혈구에 의해 생성된 사이토카인, 케모카인 및 다른 이러한 분자(CD4+ 및 CD8+ T 세포로부터 유도된 분자를 포함함)의 생성을 의미한다. 세포 매개된 면역학적 반응을 자극하는 특정 항원 또는 조성물의 능력은 다수의 분석, 예컨대, 림프증식(림프구 활성화) 분석, CTL 세포독성 세포 분석, 감작된 대상체에서 항원에 대해 특이적인 T 림프구의 분석, 또는 항원에 의한 재자극에 반응한 T 세포에 의한 사이토카인 생성의 측정에 의해 측정될 수 있다. 이러한 분석은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌(Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199) 및 문헌(Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376)을 참조한다.

용어 "면역원성"은 체액성 면역 반응 또는 세포 매개된 면역 반응, 또는 이들 둘다를 유발하는 항원 또는 백신의 능력을 의미한다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 "면역원성 양", 또는 "면역학적 유효량" 또는 "용량"은 일반적으로 당업자에게 공지된 표준 분석에 의해 측정되었을 때 면역 반응, 즉 세포성(T 세포) 또는 체액성(B 세포 또는 항체) 반응, 또는 이들 둘다를 유발하기에 충분한 항원 또는 면역원성 조성물의 양을 의미한다.

조성물 중의 특정 접합체의 양은 일반적으로 총 폴리사카라이드(그 접합체에 대한 접합된 폴리사카라이드 및 비접합된 폴리사카라이드)를 기준으로 계산된다. 예를 들면, 20%의 자유 폴리사카라이드를 가진 CP5 접합체는 100 mcg의 CP5 폴리사카라이드 용량 중에 약 80 mcg의 접합된 CP5 폴리사카라이드 및 약 20 mcg의 비접합된 CP5 폴리사카라이드를 가질 것이다. 접합체에의 단백질 기여는 접합체의 용량을 계산할 때 통상적으로 고려되지 않는다. 접합체의 양은 스타필로코커스 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 각각의 용량은 0.01 mcg 내지 100 mcg의 폴리사카라이드, 구체적으로 0.1 mcg 내지 10 mcg, 보다 구체적으로 1 mcg 내지 10 mcg의 폴리사카라이드를 포함할 것이다. 면역원성 조성물 중의 상이한 폴리사카라이드 성분의 "면역원성 양"은 달라질 수 있고, 각각 0.01 mcg, 0.1 mcg, 0.25 mcg, 0.5 mcg, 1 mcg, 2 mcg, 3 mcg, 4 mcg, 5 mcg, 6 mcg, 7 mcg, 8 mcg, 9 mcg, 10 mcg, 15 mcg, 20 mcg, 30 mcg, 40 mcg, 50 mcg, 60 mcg, 70 mcg, 80 mcg, 90 mcg 또는 약 100 mcg의 임의의 특정 폴리사카라이드 항원을 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 단백질 성분의 "면역원성 양"은 약 10 mcg 내지 약 300 mcg의 각각의 단백질 항원일 수 있다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물 중의 단백질 성분의 "면역원성 양"은 약 20 mcg 내지 약 200 mcg의 각각의 단백질 항원일 수 있다. 면역원성 조성물 중의 상이한 단백질 성분의 "면역원성 양"은 달라질 수 있고, 각각 10 mcg, 20 mcg, 30 mcg, 40 mcg, 50 mcg, 60 mcg, 70 mcg, 80 mcg, 90 mcg, 100 mcg, 125 mcg, 150 mcg, 175 mcg 또는 약 200 mcg의 임의의 특정 단백질 항원을 포함할 수 있다.

면역원으로서의 항원의 효능은 면역분석, 면역침전 분석, 기능성 항체 분석, 예컨대, 시험관내 옵소닌 분석 및 당분야에 공지된 많은 다른 분석을 이용하여 혈청 중의 항원에 대해 특이적인 순환 항체의 수준을 측정하여 B 세포 활성의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. T 세포 면역원으로서의 항원의 효능은 증식 분석 또는 세포용해 분석, 예컨대, 특정 표적 세포를 용해하는 T 세포의 능력을 측정하는 크롬 방출 분석에 의해 측정될 수도 수 있다. 나아가, 본 발명에서, "면역원성 양"은 본원에 기재된 바와 같이 항원의 투여 후 유도된 항원 특이적 항체의 혈청 수준을 측정하거나 특정 백혈구의 옵소닌식균작용 능력을 향상시키는 유도된 항체의 능력을 측정함으로써 정의될 수도 있다. 면역 반응의 보호 수준은 면역화된 숙주를 주입된 항원으로 챌린징함으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 면역 반응이 요구되는 항원이 세균인 경우, "면역원성 양"의 상기 항원에 의해 유도된 보호 수준은 동물을 세균 세포로 챌린징한 후 % 생존율 또는 % 사망률을 검출함으로써 측정될 수 있다. 한 실시양태에서, 보호의 양은 세균 감염과 관련된 1종 이상의 증상, 예를 들면, 상기 감염과 관련된 발열을 측정함으로써 측정될 수 있다. 다중항원 또는 다중성분 백신 또는 면역원성 조성물 중의 항원 각각의 양은 각각의 다른 성분과 관련하여 달라질 것이고 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 면역원성 및/또는 생체내 효능을 측정하는 절차를 포함할 것이다.

용어 "면역원성 조성물"은 대상체에서 면역 반응을 유발하는 데에 사용될 수 있는, 항원, 예를 들면, 미생물 또는 이들의 성분을 함유하는 임의의 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 면역원성 조성물은 전신 경피 또는 점막 경로를 통해 상기 면역원성 조성물을 투여함으로써 스타필로코커스 아우레우스 감염에 민감한 인간을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 이들 투여는 근육내(i.m.), 복강내(i.p.), 피내(i.d.) 또는 피하 경로를 통한 주입; 패치 또는 다른 경피 전달 장치에 의한 도포; 또는 구강/소화관, 호흡관 또는 비뇨생식관에의 점막 투여를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스의 비인두 보균을 치료하거나 예방하여 그의 초기 단계에서 감염을 약화시키기 위해 비강내 투여가 이용된다. 한 실시양태에서, 면역원성 조성물은 백신의 제조에 사용될 수 있거나 동물을 수동적으로 보호하거나 치료하는 데에 사용될 수 있는 다중클론 또는 단일클론 항체의 유발에 사용될 수 있다.

특정 면역원성 조성물에 대한 성분의 최적 양은 대상체에서 적절한 면역 반응을 관찰하는 단계를 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상체는 적절한 간격을 두고 1회 또는 수회 부스터(booster) 면역화를 제공받을 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 동결건조된 면역원성 조성물은 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 단편(N1N2N3 또는 이들의 조합물)을 포함한다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 동결건조된 면역원성 조성물은 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 단편, CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함하다.

본 발명의 면역원성 조성물은 체액성 면역 및/또는 세포 매개된 면역의 상향조절 또는 하향조절이 관찰되도록 면역 시스템을 교란시키거나 변경하는 물질인 1종 이상의 추가 "면역조절제를 추가로 포함할 수 있다. 한 특정 실시양태에서, 면역 시스템의 체액성 아암(arm) 및/또는 세포 매개된 아암의 상향조절이 바람직하다. 일부 면역조절제의 예에는 특히, 예를 들면, 항원보강제 또는 사이토카인, 또는 미국 특허 제5,254,339호에 기재된 이스코매트릭스™(씨에스엘 리미티드(CSL Limited), 호주 파크빌 소재)가 포함된다. 본 발명의 백신에 사용될 수 있는 항원보강제의 비한정적 예에는 RIBI 항원보강제 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.), 미국 몬타나주 해밀톤 소재), 명반, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄 겔, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 예컨대, 프로인트 완전 항원보강제 및 불완전 항원보강제, 블록 공중합체(사이트알엑스(CytRx), 미국 조지아주 아틀란타 소재), QS-21(캠브리지 바이오텍 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc.), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재), SAF-M(키론(Chiron), 미국 캘리포니아주 에머리빌 소재), 암피젠(AMPIGEN)^® 항원보강제, 사포닌, 퀼 A 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 및 애브리딘 지질-아민 항원보강제가 포함된다. 본 발명의 백신에 유용한 수중유 에멀젼의 비한정적 예에는 변형된 SEAM62 및 SEAM 1/2 제제가 포함된다. 변형된 SEAM62는 5%(v/v) 스쿠알렌(시그마(Sigma)), 1%(v/v) SPAN^® 85 세제(아이씨아이 서펙턴츠(ICI Surfactants), 0.7%(v/v) 폴리소르베이트 80 세제(아이씨아이 서펙턴츠), 2.5%(v/v) 에탄올, 200 ㎍/㎖ 퀼 A, 100 ㎍/㎖ 콜레스테롤 및 0.5%(v/v) 레시틴을 함유하는 수중유 에멀젼이다. 변형된 SEAM 1/2는 5%(v/v) 스쿠알렌, 1%(v/v) SPAN^® 85 세제, 0.7%(v/v) 폴리소르베이트 80 세제, 2.5%(v/v) 에탄올, 100 ㎍/㎖ 퀼 A 및 50 ㎍/㎖ 콜레스테롤을 포함하는 수중유 에멀젼이다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 다른 "면역조절제"는 예를 들면, 1종 이상의 인터류킨, 인터페론 또는 다른 공지된 사이토카인 또는 케모카인을 포함한다. 한 실시양태에서, 항원보강제는 사이클로덱스트린 유도체 또는 다가음이온성 중합체, 예를 들면, 각각 미국 특허 제6,165,995호 및 제6,610,310호에 기재된 유도체 또는 중합체일 수 있다. 사용될 면역조절제 및/또는 항원보강제는 백신 또는 면역원성 조성물이 투여될 대상체, 주입 경로 및 제공되는 주입 횟수에 의해 좌우될 것임을 이해해야 한다.

본 발명의 추가 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 동결건조된 면역원성 조성물은 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 단편, CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 5형, CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 8형 및 재조합 MntC 단백질(rP305A로서도 공지되어 있음)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, MntC 단백질은 지질화되어 있다. 다른 실시양태에서, MntC 단백질은 지질화되어 있지 않다. 또 다른 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 면역원성 조성물은 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 단편(N1N2N3, 또는 이들의 조합물), 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB)(N1N2N3, 또는 이들의 조합물), CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 8형으로 구성된 멸균 제제(액체, 동결건조된, DNA 백신 또는 피내 제제)이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 면역원성 조성물은 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 단편(N1N2N3, 또는 이들의 조합물), 스타필로코커스 아우레우스 철 결합 단백질 MntC, CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 한 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 면역원성 조성물은 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자(ClfA) 단편(N1N2N3, 또는 이들의 조합물), 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 단편(N1N2N3, 또는 이들의 조합물), 스타필로코커스 아우레우스 철 결합 단백질 MntC, CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 8형으로 구성된 멸균 제제(액체, 동결건조된, DNA 백신 또는 피내 제제)이다.

본 발명의 한 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 면역원성 조성물은 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 단편(N1N2N3, 또는 이들의 조합물), CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 면역원성 조성물은 재조합 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 단편(N1N2N3, 또는 이들의 조합물), 스타필로코커스 아우레우스 철 결합 단백질 MntC, CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 스타필로코커스 아우레우스 면역원성 조성물은 스타필로코커스 아우레우스 철 결합 단백질 MntC, CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 CRM₁₉₇에 접합된 단리된 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다.

스타필로코커스 아우레우스 "침습성 질환"은 정상적 멸균 부위로부터의 세균의 단리이고, 이때 질환의 관련 임상 징후/증상이 존재한다. 정상적 멸균 신체 부위는 혈액, CSF, 흉막액, 심낭액, 복수액, 관절/활막액, 골, 내부 신체 부위(림프절, 뇌, 심장, 간, 비장, 유리체액, 신장, 췌장, 난소) 또는 다른 정상적 멸균 부위를 포함한다. 침습성 질환을 특징짓는 임상 상태는 균혈증, 폐렴, 연조직염, 골수염, 심내막염, 패혈증성 쇼크 등을 포함한다.

용어 "단리된"은 물질이 그의 원래의 환경(예를 들면, 상기 물질이 천연적으로 발생하는 경우 천연 환경, 또는 상기 물질이 재조합 물질이거나 한 환경으로부터 상이한 환경으로 옮겨진 경우 그의 숙주 유기체)로부터 회수되는 것을 의미한다. 예를 들면, "단리된" 캡슐 폴리사카라이드, 단백질 또는 펩티드는 상기 단백질이 유래된 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포 물질 또는 다른 오염 단백질을 실질적으로 갖지 않거나, 또는 화학적으로 합성되었거나 화학반응의 부분으로서 혼합물에 존재하는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않는다. 본 발명에서, 단백질 또는 폴리사카라이드는 이들이 면역원성 조성물의 제조에 유용한 형태로 제공되도록 세균 세포 또는 세포 데브리스(debris)로부터 단리될 수 있다. 용어 "단리된" 또는 "단리하는"은 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 또는 캡슐 폴리사카라이드의 정제 방법을 포함하는 정제 단계 또는 정제를 포함할 수 있다. 표현 "세포 물질을 실질적으로 갖지 않는"은 폴리펩티드/단백질의 단리 또는 재조합 제조에 사용된 세포의 세포 성분으로부터 분리되어 있는 상기 폴리펩티드/단백질의 제제를 포함한다. 따라서, 세포 물질을 실질적으로 갖지 않는 캡슐 폴리사카라이드, 단백질 또는 펩티드는 (건조 중량을 기준으로) 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% 미만의 오염 단백질 또는 폴리사카라이드, 또는 다른 세포 물질을 가진 캡슐 폴리사카라이드, 단백질 또는 펩티드의 제제를 포함한다. 폴리펩티드/단백질은 재조합적으로 제조되는 경우 바람직하게는 배양 배지도 실질적으로 갖지 않는다(즉, 배양 배지는 단백질 제제의 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 미만을 차지한다). 폴리펩티드/단백질 또는 폴리사카라이드는 화학적 합성에 의해 제조되는 경우, 바람직하게는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않는다(즉, 상기 단백질 또는 폴리사카라이드의 합성에 수반된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리되어 있다). 따라서, 폴리펩티드/단백질 또는 폴리사카라이드의 이러한 제제는 관심 있는 폴리펩티드/단백질 또는 폴리사카라이드 단편 이외에 (건조 중량을 기준으로) 약 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만의 화학적 전구체 또는 화합물을 가진다.

"비보존적 아미노산 치환"은 상기 정의된 특징을 이용하여 단백질의 1개 이상의 아미노산 잔기를, 유사하지 않은 물리적 및/또는 화학적 성질을 가진 다른 아미노산 잔기로 치환시키는 것을 의미한다.

용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 인간 및 비인간 포유동물을 포함하는 동물에서의 사용에 대해 연방정부 또는 주정부의 규제 관청 또는 다른 규제 관청에 의해 승인받았거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열된 담체를 의미한다. 용어 "담체"는 약학 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약학 담체는 멸균 액체, 예컨대, 물 및 오일(석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 물 및 오일을 포함함)일 수 있다. 물, 식염수 용액, 및 수성 덱스트로스 및 글라이세롤 용액이 액체 담체로서, 특히 주입 용액으로서 사용될 수 있다. 적합한 약학 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글라이세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글라이세롤, 프로필렌 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 원하는 경우, 조성물은 소량의 습윤화제, 벌킹제, 에멀젼화제 또는 pH 완충제도 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 지속 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 적합한 약학 담체의 예는 문헌("Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin)에 기재되어 있다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.

용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 의미하고 생성물의 최소 길이로 한정되지 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등이 이 정의에 포함된다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘다가 이 정의에 포함된다. 또한, 상기 용어는 바람직하게는 단백질이 이 단백질을 투여받은 동물 내에서 면역학적 반응을 유발하는 능력을 유지하도록 천연 서열에 대한 변형, 예컨대, 결실, 부가 및 치환(일반적으로 성질 면에서 보존적 치환이지만 비보존적 치환일 수 있음)을 포함한다. 발현 후 변형, 예를 들면, 글라이코실화, 아세틸화, 지질화, 인산화 등도 포함된다.

"보호" 면역 반응은 감염으로부터 대상체를 보호하는 데에 기여하는 체액성 또는 세포 매개된 면역 반응을 유발하는 면역원성 조성물의 능력을 의미한다. 제공된 보호는 대조군 대상체 집단, 예를 들면, 백신 또는 면역원성 조성물을 투여받지 않은 감염된 동물에 비해 통계적으로 유의한 개선이 있는 경우 절대적일 필요는 없다(즉, 감염이 완전히 예방되거나 박멸될 필요는 없다). 보호는 감염의 증상의 중증도 또는 발병의 신속도의 경감으로 한정될 수 있다. 일반적으로, "보호 면역 반응"은 50% 이상의 대상체에서 특정 항원에 대해 특이적인 항체 수준의 증가의 유도(각각의 항원에 대한 일정한 수준의 측정가능한 기능성 항체 반응을 포함함)를 포함할 것이다. 특정 상황에서, "보호 면역 반응"은 50% 이상의 대상체에서 특정 항원에 대해 특이적인 항체 수준의 2배 증가 또는 항체 수준의 4배 증가의 유도(각각의 항원에 대한 일정한 수준의 측정가능한 기능성 항체 반응을 포함함)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 옵소닌화 항체는 보호 면역 반응과 상관관계를 갖는다. 따라서, 보호 면역 반응은 옵소닌식균작용 분석, 예를 들면, 이하에 기재된 분석에서 세균 수의 % 감소를 측정함으로써 분석될 수 있다. 바람직하게는, 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 세균 수 감소가 존재한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합"은 단순히 유전공학 방법에 의해 제조된 임의의 단백질, 폴리펩티드, 또는 관심 있는 유전자를 발현하는 세포를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 제조된 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명의 면역원성 조성물에 사용된 단백질은 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나 유전공학 방법에 의해 제조될 수 있고, 예를 들면, 재조합 ClfA, 재조합 ClfB 또는 재조합 MntC일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합"은 그의 기원 또는 조작에 의해 천연 상태에서 그와 결합되어 있는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 부분과 결합되어 있지 않은 핵산 분자도 기술한다. 숙주 세포와 관련하여 사용된 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 숙주 세포를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 ClfA(rClfA) 및 재조합 ClfB(rClfB)는 본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 ClfA 또는 ClfB의 형태를 의미한다. 일부 실시양태에서, rClfA는 1개 이상의 N 도메인, 예를 들면, N1N2N3, N2N3, N2 또는 N3을 포함하는 ClfA의 단편이고 본원에서 "재조합 ClfA" 또는 "rClfA"로서 지칭된다. 한 실시양태에서, rClfB는 ClfB의 1개 이상의 N 도메인, 예를 들면, N1N2N3, N2N3, N2 또는 N3을 포함하는 ClfB의 단편이고 본원에서 "재조합 ClfB" 또는 "rClfB"로서 지칭된다.

용어 "대상체"는 포유동물, 조류, 어류, 파충류 또는 임의의 다른 동물을 의미한다. 용어 "대상체"는 인간도 포함한다. 용어 "대상체"는 가정 애완동물도 포함한다. 가정 애완동물의 비한정적 예에는 개, 고양이, 돼지, 토끼, 래트, 마우스, 게르빌루스쥐, 햄스터, 기니아 피그, 흰담비, 조류, 뱀, 도마뱀, 어류, 거북이 및 개구리가 포함된다. 용어 "대상체"는 가축 동물도 포함한다. 가축 동물의 비한정적 예에는 알파카, 들소, 낙타, 소, 사슴, 돼지, 말, 라마, 노새, 당나귀, 양, 염소, 토끼, 순록, 야크, 닭, 거위 및 칠면조가 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료"(이의 어미변화, 예를 들면, "치료한다" 또는 "치료된"을 포함함)는 하기 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나 이상을 의미한다: (i) 전통적인 백신에서와 같이 감염 또는 재감염의 예방, (ii) 증상의 중증도의 감소 또는 증상의 제거, 및 (iii) 해당 병원체 또는 질환의 실질적인 또는 완전한 제거. 따라서, 치료는 (감염 전에) 예방적으로 또는 (감염 후에) 치유적으로 수행될 수 있다. 본 발명에서, 예방적 또는 치유적 치료가 이용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에 따라, 미생물(예를 들면, 세균, 예컨대, 스타필로코커스 종) 감염으로부터 숙주 동물을 치료하는(예방적 및/또는 치유적 면역화를 포함함) 조성물 및 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 예방적 및/또는 치유적 면역성을 대상체에게 부여하는 데에 유용하다. 본 발명의 방법은 생체의학 연구 응용을 위해 대상체에 대해 실시될 수도 있다.

상호교환적으로 사용되는 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 동물에서 면역 반응을 유도하는 1종 이상의 면역원성 조성물을 포함하는 약학 조성물을 의미한다.

일반적 설명

본 발명은 스타필로코커스 유기체, 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스의 항원을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 동결건조된 면역원성 조성물은 ClfA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 동결건조된 면역원성 조성물은 3종 이상의 항원을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 동결건조된 면역원성 조성물은 4종 이상의 항원을 포함한다. 상기 항원을 생화학적 단리 절차를 이용하여 유기체로부터 단리할 수 있거나 합성 또는 재조합 수단으로 제조할 수 있다. 상기 항원은 폴리펩티드, 폴리사카라이드 또는 이들의 조합물일 수 있다. 이들 면역원성 조성물은 스타필로코커스 유기체에 의해 야기된 감염에 대해 대상체를 면역화시키는 백신의 제조에 사용될 수 있다. 이들 조성물에 사용될 적합한 성분은 이하에 더 상세히 기재되어 있다.

스타필로코커스 면역원성 조성물

스타필로코커스 아우레우스는 표면적인 피부 감염부터 생명을 위협하는 상태, 예컨대, 폐렴, 패혈증 및 심내막염에 이르는 광범위한 인간 질환의 병인 물질이다. 문헌(Lowy N. Eng. J. Med. 339:580-532(1998))을 참조한다. 침습성 질환의 경우, 스타필로코커스 아우레우스는 혈액, 뇌척수액(CSF), 흉막액, 심낭액, 복수액, 관절/활막액, 골, 내부 신체 부위(림프절, 뇌, 심장, 간, 비장, 유리체액, 신장, 췌장, 난소) 또는 다른 정상적 멸균 부위를 포함하는 정상적 멸균 신체 부위로부터 단리될 수 있다. 이것은 생명을 위협하는 임상 상태, 예컨대, 세균혈증, 폐렴, 연조직염, 골수염, 심내막염 및 패혈증성 쇼크를 초래할 수 있다. 성인 환자, 노인 환자 및 소아 환자는 스타필로코커스 아우레우스 감염에 대한 위험에 가장 많이 노출되어 있다.

본 발명의 실시양태는 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 및 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질을 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물 중의 선택된 항원 또는 항원들을 기술한다. 동결건조된 면역원성 조성물의 몇몇 제제는 ClfA 단백질의 증가된 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다. 동결건조된 면역원성 조성물의 몇몇 제제는 MntC 단백질의 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 동결건조된 조성물의 몇몇 제제는 CP5-단백질 접합체 및 CP8-단백질 접합체가 동결건조 후 안정하도록 보장하는 것으로 확인되었다.

따라서, 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드를 포함한다. 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질, 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 담체 단백질에 접합된 단리된 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드 8형을 포함한다. 한 동결건조된 면역원성 조성물은 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드, 단리된 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 B(ClfB) 폴리펩티드 및 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 상기 조합물은 하기 항원들 중 하나 이상을 추가로 포함한다: EkeS, DsqA, KesK, KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN, KnkA, SdrC, SdrD, SdrE, Opp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdB, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi, 알파-헤모라이신(hla), 베타-헤모라이신, 피브로넥틴 결합 단백질 A(fnbA), 피브로넥틴 결합 단백질 B(fnbB), 코아귤라제(coagulase), Fig, map, 판톤-발렌틴 류코시딘(pv1), 알파-독소 및 이의 변이체, 감마-독소(hlg) 및 이의 변이체, ica, 면역우성 ABC 수송체, Mg² ⁺ 수송체, Ni ABC 수송체, RAP, 오토라이신, 라미닌 수용체, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, SasA, SasF, SasH, EFB(FIB), SBI, Npase, EBP, 골 시알로 결합 단백질 II, 아우레오라이신(aureolysin) 전구체 (AUR)/Sepp1, Cna, 및 이들의 단편, 예컨대, M55, TSST-1, mecA, 폴리-N-아세틸글루코스아민(PNAG/dPNAG) 엑소폴리사카라이드, GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, 비트로넥틴 결합 단백질, HarA, EsxA, EsxB, 장독소 A, 장독소 B, 장독소 C1, 및 신규 오토라이신.

항원보강제

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 동결건조된 면역원성 조성물은 1종 이상의 항원보강제도 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항원보강제는 건조된 동결건조된 조성물의 한 성분이다. 다른 실시양태에서, 항원보강제는 상기 조성물을 환자에게 투여하기 전에 재구성된 동결건조된 조성물에 첨가될 수 있다. 항원보강제는 면역원 또는 항원과 함께 투여되었을 때 면역 반응을 향상시키는 물질이다. 인터류킨 1-α, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12(예를 들면, 미국 특허 제5,723,127호 참조), 13, 14, 15, 16, 17 및 18(및 이의 돌연변이체 형태); 인터페론-α, 인터페론-β 및 인터페론-γ; 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)(예를 들면, 미국 특허 제5,078,996호 및 ATCC 수탁번호 39900 참조); 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF); 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF); 및 종양 괴사 인자 α 및 β를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다수의 사이토카인 또는 림포카인이 면역 조절 활성을 가진 것으로 밝혀져 있으므로 항원보강제로서 유용하다. 본원에 기재된 면역원성 조성물에 유용한 다른 항원보강제는 MCP-1, MIP-1α, MIP-1β 및 RANTES를 포함하나 이들로 한정되지 않는 케모카인; 부착 분자, 예컨대, 셀렉틴(selectin), 예를 들면, L-셀렉틴, P-셀렉틴 및 E-셀렉틴; 뮤신(mucin) 유사 분자, 예를 들면, CD34, GlyCAM-1 및 MadCAM-1; 인테그린 패밀리의 구성원, 예컨대, LFA-1, VLA-1, Mac-1 및 p150.95; 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원, 예컨대, PECAM, ICAM, 예를 들면, ICAM-1, ICAM-2 및 ICAM-3, CD2 및 LFA-3; 보조자극 분자, 예컨대, B7-1, B7-2, CD40 및 CD40L; 혈관 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, PDGF, BL-1 및 혈관 내피 성장 인자를 포함하는 성장 인자; Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 및 DR6을 포함하는 수용체 분자; 및 캐스파제(Caspase)(ICE)를 포함한다.

면역 반응을 향상시키기 위해 사용되는 적합한 항원보강제는 미국 특허 제4,912,094호에 기재된 MPL™(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A, 코릭사(Corixa), 미국 몬타나주 해밀톤 소재)을 추가로 포함하나 이것으로 한정되지 않는다. 코릭사(Corixa)(미국 몬타나주 해밀톤 소재)로부터 입수될 수 있고 미국 특허 제6,113,918호에 기재되어 있는 합성 지질 A 유사체 또는 아미노알킬 글루코스아민 포스페이트 화합물(AGP), 또는 이들의 유도체 또는 유사체도 항원보강제로서 사용되기에 적합하다. 이러한 AGP 중 하나는 529(이전에 RC529로서 공지됨)로서도 공지된 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸-2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일-아미노]-b-D-글루코피라노사이드이다. 이 529 항원보강제는 수성 형태(AF) 또는 안정한 에멀젼(SE)으로서 제제화된다.

다른 항원보강제는 뮤라밀 펩티드, 예컨대, N-아세틸-뮤라밀-L-쓰레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닌-2-(1'2'-다이팔미토일-sn-글라이세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(MTP-PE); 수중유 에멀젼, 예컨대, MF59(미국 특허 제6,299,884호)(5% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.5% SPAN™ 85(임의적으로 다양한 양의 MTP-PE를 함유함)를 함유하고 마이크로유동화제(microfluidizer), 예컨대, 모델 110Y 마이크로유동화제(마이크로플루이딕스(Microfluidics), 미국 매사추세츠주 뉴톤 소재)의 이용을 통해 서브마이크론 입자로 제제화되어 있음), 및 SAF(10% 스쿠알렌, 0.4% 폴리소르베이트 80, 5% 플루로닉 차단된 중합체 L121 및 thr-MDP를 함유하고 서브마이크론 에멀젼으로 마이크로유동화되어 있거나 보다 큰 입자 크기 에멀젼을 발생시키도록 볼텍싱되어 있음); 불완전 프로인트 항원보강제(IFA); 알루미늄 염(명반), 예컨대, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산알루미늄; 암피젠; 애브리딘; L121/스쿠알렌; D-락타이드-폴리락타이드/글라이코사이드; 플루로닉 폴리올; 사멸된 보르데텔라(Bordetella); 사포닌, 예컨대, 미국 특허 제5,057,540호에 기재된 스티뮬론(STIMULON)™ QS-21(안티제닉스(Antigenics), 미국 매사추세츠주 프래밍햄 소재), 미국 특허 제5,254,339호에 기재된 이스코매트릭스™(씨에스엘 리미티드, 호주 파크빌 소재), 및 면역자극 복합체(이스코매트릭스™); 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis); 세균 리포폴리사카라이드; 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대, CpG 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오티드(예를 들면, 미국 특허 제6,207,646호); 유럽 특허 제1,296,713호 및 제1,326,634호에 기재된 IC-31(인터셀 아게(Intercell AG), 오스트리아 비엔나 소재); 백일해 독소(PT) 또는 이의 돌연변이체, 콜레라 독소 또는 이의 돌연변이체(예를 들면, 미국 특허 제7,285,281호, 제7,332,174호, 제7,361,355호 및 제7,384,640호); 또는 이. 콜라이 열 불안정성 독소(LT) 또는 이의 돌연변이체, 특히 LT-K63, LT-R72(예를 들면, 미국 특허 제6,149,919호, 제7,115,730호 및 제7,291,588호)를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 항원보강제는 이스코매트릭스™이다(예를 들면, 문헌(Davis et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci., 2004, 101(29):10697-10702) 참조).

후보 항원:

ClfA: 도메인 구성

응괴 인자 A(ClfA)는 피브리노겐 결합 부위를 통한 숙주 매트릭스 단백질과의 결합과 관련된 스타필로코커스 아우레우스 표면 단백질이다. ClfA는 단백질이 세포 표면에 공유결합되게 하는 카복실 말단 LPXTG(서열번호 125) 모티프를 함유하는 단백질 패밀리의 구성원이다. ClfA는 숙주 단백질, 예컨대, 피브리노겐(ClfA에 의해 결합됨), 피브로넥틴 결합 단백질(FnbA 및 FnbB), 콜라겐 결합 단백질(Cna) 등과의 결합과 관련된 또 다른 단백질 패밀리(부착 매트릭스 분자를 인식하는 미생물 표면 성분, 또는 MSCRAMM)에도 속한다. 이들 단백질은 모두 세포 표면으로의 수송을 매개하는 아미노 말단 신호 서열을 공유한다. MSCRAMM은 리간드(예를 들면, 피브리노겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 케라틴) 결합을 위한 활성 부위를 함유하는 기능성 영역인 A 도메인도 포함한다. A 도메인에 이어서, 펩티도글라이칸 층에 걸쳐 있는 것으로 생각되는 세린 아스파테이트 반복부(SD 반복부)로 구성된 영역이 존재한다. SD 반복부에 이어서, 단백질과 펩티도글라이칸의 공유결합을 위한 LPXTG(서열번호 125) 모티프를 포함하는 막 관통 영역이 존재하다. ClfA는 미국 특허 제6,008,341호에 기재되어 있다.

A 도메인의 N1N2N3을 포함하는 ClfA의 리간드 결합 영역(도 1)은 아미노산 40 내지 559에 걸쳐 있다. ClfA의 N 도메인은 다음과 같이 배정되었다: N1은 잔기 45 내지 220을 포함하고, N2는 잔기 229 내지 369를 포함하고, N3은 잔기 370 내지 559를 포함한다. 문헌(Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002))을 참조한다. 용이한 참조를 위해, N1N2N3 도메인은 N123으로서 지칭될 수 있고, 마찬가지로 N2N3은 N23으로서 지칭될 수 있다. 재조합 N1N2N3의 제제에서, N1 도메인은 프로테아제 민감성을 나타내는 것으로 발견되었고 용이하게 절단되거나 가수분해되어 안정한 리간드 결합 재조합 단편으로서 N2N3을 남긴다. 문헌(Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002))을 참조한다. ClfA A 도메인의 피브리노겐 결합 N2N3 단편의 결정 구조는 N2 및 N3 둘다가 역평행 베타 가닥을 특징으로 한다는 것을 보여주었다. 역평행 베타 가닥 이외에, N2 도메인은 단일 회전 알파 나선 및 2개의 3₁₀ 나선을 함유하고, N3 도메인은 3개의 3₁₀ 나선을 함유한다. 문헌(Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002))을 참조한다. N2와 N3의 서열 정렬은 그들의 길이에 걸쳐 단지 13%의 서열 동일성 및 36%의 서열 유사성을 나타낸다. 문헌(Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002))을 참조한다. N2 도메인 및 N3 도메인의 위상기하학은 고전적인 IgG 폴드(fold)와 유사하고, IgG 폴드의 신규 변이체인 것으로 제안되었다. 문헌(Deivanayagam et al. EMBO J. 21:6660-6672 (2002))을 참조한다.

면역원성 조성물 또는 백신으로서 유용한, 안정한 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A("ClfA") 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법이 본원에 개시되어 있다. 면역원성 조성물 또는 백신으로서 유용한, 안정한 ClfA 폴리펩티드, CP5 접합체 및 CP8 접합체("3종-항원")를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법도 본원에 개시되어 있다. 면역원성 조성물 또는 백신으로서 유용한, 안정한 ClfA 폴리펩티드, CP5 접합체, CP8 접합체 및 MntC 폴리펩티드("4종-항원")를 포함하는 조성물, 및 이의 제조 방법도 본원에 개시되어 있다. ClfA는 N1 도메인과 N2 도메인 사이에서 용이하게 절단되는 불안정한 단백질인 것으로 공지되어 있다. 본원은 ClfA N1N2N3이 가속화 스트레스(stress) 조건 하에서 3개월 이상 동안 실질적으로 비분해된 상태로 유지되게 하는 ClfA 제제에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 제제는 3% 미만의 물을 포함하는 동결건조된 조성물이다. 용어 "동결건조된 조성물"은 3% 미만의 물을 가진 제제를 의미하고, 상기 조성물을 이 조성물의 제조 방법, 예를 들면, 동결건조 또는 임의의 다른 혼합물 건조 방법, 또는 건조 성분 배합으로 한정하기 위한 것이 아니다. 가속화 스트레스 조건은 제제의 안정성을 시험하는 데에 일반적으로 이용되는 극한 온도, pH 및/또는 이온 강도의 조건(예컨대, 37℃에서 수주 이상 동안)을 의미한다.

따라서, 한 실시양태에서, 본원은 실질적으로 비분해된 ClfA 단백질 및 3% 미만의 물을 포함하는 안정한 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본원은 실질적으로 비분해된 ClfA 단백질, 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5) 접합체, CP8 접합체 및 3% 미만의 물을 포함하는 안정한 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본원은 실질적으로 비분해된 ClfA 단백질, 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5) 접합체, CP8 접합체, MntC 단백질 및 3% 미만의 물을 포함하는 안정한 조성물에 관한 것이다. ClfA 단백질은 임의의 스타필로코커스 균주로부터 단리될 수 있거나 재조합 폴리펩티드일 수 있다. 재조합 ClfA 폴리펩티드는 야생형 서열을 가질 수 있거나, 1개 이상의 돌연변이를 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 면에서 야생형 서열과 90% 이상 동일할 수 있다. 표 1은 여러 스타필로코커스 아우레우스 균주 및 이들 각각의 ClfA DNA 및 단백질 서열을 보여준다.

ClfA 서열

ClfA로서 표기된 응괴 인자 단백질 A에 대한 유전자는 클로닝되었고 서열분석되었고 분자 수준에서 상세히 분석되었다(McDevitt et al., Mol. Microbiol. 11: 237-248 (1994); McDevitt et al., Mol. Microbiol. 16:895-907 (1995)). 111종의 스타필로코커스 아우레우스 질환 야기 단리물의 ClfA의 아미노산 서열에 대한 서열 식별번호는 표 1에 표시되어 있다. 스타필로코커스 아우레우스 균주 PFESA0237의 (신호 서열을 포함하는) 전장 야생형 ClfA의 아미노산 서열은 서열번호 130으로 표시되어 있다. 이 서열은 ClfA의 돌연변이된 형태에서 알라닌으로 변경된 위치 338의 티로신을 보여준다. N123 영역, 반복부 영역 및 고착제(anchor) 영역을 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스 균주 PFESA0237의 야생형 ClfA를 코딩하는 전장 유전자는 서열번호 131로 표시되어 있다. ClfA의 Y338A 돌연변이된 형태의 아미노산 서열은 서열번호 123으로 표시되어 있다. 그러나, 서열번호 130의 위치 338에서 야생형 ClfA에서 일어나는 티로신의 알라닌으로의 변경(Y338A로서 표기됨)은 서열번호 123의 ClfA의 돌연변이된 형태에서 위치 310에서 표시되어 있다는 것을 인식해야 한다. 나아가, 서열번호 123의 아미노산 서열에서 표시된 ClfA의 돌연변이된 형태는 신호 서열을 갖지 않는 ClfA의 성숙 형태이므로, 이것이 서열번호 130과 서열번호 123 사이의 이 돌연변이 위치의 차이를 설명한다.

한 실시양태에서, ClfA 단백질은 피브리노겐 결합을 제거하는 Y388A 돌연변이를 포함하는 서열번호 123의 서열을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, ClfA 단백질은 전장 단백질일 필요가 없고 (서열번호 130에 따라 넘버링될 때(그러나, 임의의 ClfA 단백질에 기초하여 넘버링될 수 있음)) 아미노산 50 내지 597로 구성될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, ClfA 단백질은 N1 도메인, N2 도메인 및 N3 도메인을 포함하거나 본질적으로 이들 도메인으로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, ClfA 단백질은 N 도메인을 포함한다. N 도메인은 N1 도메인, N2 도메인 또는 N3 도메인을 의미한다.

ClfA 단백질, 및 이의 제조 방법 및 사용 방법은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 공동계류 특허출원인 미국 특허출원 제61/219,134호(2009년 6월 22일 출원)에 기재되어 있다. ClfA 단백질은 전체적으로 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 제PCT/US2010/039510호에도 기재되어 있다.

"안정한"은 ClfA가 가속화 또는 다른 스트레스 조건 하에서 연장된 시간에 걸쳐, 예컨대 저장시 실질적으로 비분해된 상태로 유지된다는 것을 의미한다. "실질적으로 비분해된"은 ClfA 폴리펩티드의 총 누적 집단의 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상이 N1 서열, 및 N2 및/또는 N3의 추가 서열을 포함하는 폴리펩티드를 함유한다는 것을 의미한다. "온전한"은 ClfA 단백질이 적어도 N1 도메인, N2 도메인 및 N3 도메인을 함유한다는 것을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, ClfA는 37℃에서 2주 이상, 1개월 이상 또는 3개월 이상 동안 안정한 상태로 유지된다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 동결건조된 면역원성 조성물의 총 중량의 1% 중량(1% [w/w]) 미만의 양으로 온전한 ClfA를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, ClfA는 0.09% ± 0.027% 내지 0.85% ± 0.26%의 양으로 존재한다.

ClfB: 도메인 구성

ClfB는 피브리노겐 결합 활성을 가진 스타필로코커스 아우레우스 단백질이고 스타필로코커스 아우레우스가 혈장의 존재 하에서 응괴를 형성하는 것을 유발한다. ClfB는 MSCRAMM 단백질이고 리간드(예를 들면, 피브리노겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 케라틴) 결합을 위한 활성 부위를 함유하는 기능성 영역인 A 도메인을 포함하는 특징적인 MSCRAMM 도메인 구성을 나타낸다. A 도메인에 이어서, 펩티도글라이칸 층에 걸쳐 있는 것으로 생각되는 세린 아스파테이트 반복부(SD 반복부)로 구성된 영역이 존재한다. SD 반복부에 이어서, 단백질과 펩티도글라이칸의 공유결합을 위한 LPXTG(서열번호 125) 모티프를 포함하는 막 관통 영역이 존재하다. ClfB는 국제 특허출원 공개 제WO 99/27109호 및 미국 특허 제6,680,195호에 기재되어 있다.

ClfB N 말단 A 도메인의 내부 구성은 ClfA에서 발견된 구성과 매우 유사하다. 상기 A 도메인은 3개의 서브도메인 N1, N2 및 N3으로 구성된다. A 도메인의 N1N2N3을 포함하는 ClfB의 리간드 결합 영역은 아미노산 44 내지 585에 걸쳐 있다. 용이한 참조를 위해, N1N2N3 도메인은 N123으로서 지칭될 수 있고, 마찬가지로 N2N3은 N23으로서 지칭될 수 있다. ClfB의 N 도메인은 다음과 같이 배정되었다: N1은 잔기 44 내지 197을 포함하고, N2는 잔기 198 내지 375를 포함하고, N3은 잔기 375 내지 585를 포함한다. ClfA에서, A 도메인의 결정 구조는 면역글로불린 폴드의 독특한 버전을 가진 것으로 발견되었고, 유사하게 이것은 ClfB의 경우에도 추측될 수 있다. 문헌(Deivanayagam et al., EMBO J. 21:6660-6672 (2002))을 참조한다. ClfB의 A 도메인과 ClfA의 A 도메인의 구성이 유사하지만, 서열 동일성은 단지 26%이다. 문헌(Ni Eidhin et al., Mol. Microbiol. 30:245-257 (2002))을 참조한다.

ClfB 서열

ClfB를 코딩하는 유전자는 코어 부착 유전자로서 분류되어 있다. 다수의 질환 상태와 관련된 92종의 스타필로코커스 아우레우스 균주의 ClfB 서열이 도 42에 요약되어 있다. 추가 서열은 진뱅크(GenBank)로부터 입수되었다.

다른 MSCRAMMS

본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 다른 MSCRAMMS가 고려될 수 있다. 예를 들면, 세린 아스파테이트 반복부(Sdr) 단백질, SdrC, SdrD 및 SdrE는 일차 서열 및 구조적 구성에 있어서 ClfA 및 ClfB 단백질과 관련되어 있고 세포 표면 상에 위치되어 있다. SdrC, SdrD 및 SdrE 단백질은 N 말단의 신호 서열 및 LPXTG(서열번호 125) 모티프, 소수성 도메인 및 C 말단의 양으로 하전된 잔기를 가진 세포벽 결합된 단백질이다. 상기 단백질 각각은 리간드 결합 도메인 영역 A가 세포 표면 상에서 효율적으로 발현되게 하기에 충분한 길이의 R 영역을 함유하는 SD 반복부를 B 모티프와 함께 가진다. 세포 표면 상에 위치한 SdrC, SdrD 및 SdrE 단백질의 A 영역을 통해 상기 단백질은 혈장 중의 단백질, 세포외 매트릭스 또는 숙주 세포의 표면 상의 분자와 상호작용할 수 있다. Sdr 단백질은 ClfA 및 ClfB와 일부 한정된 아미노산 서열 유사성을 공유한다. ClfA 및 ClfB와 마찬가지로, SdrC, SdrD 및 SdrE도 세포외 매트릭스 단백질의 양이온 의존적 리간드 결합을 나타낸다.

sdr 유전자들은 밀접하게 연관되어 있고 직렬로 배열되어 있다. (SdrC, SdrD, SdrE, ClfA 및 ClfB의) Sdr 단백질은 A 영역을 특징적으로 포함하고, 이 영역에는 컨센서스 TYTFTDYVD(서열번호 126) 모티프를 유도하는 데에 사용될 수 있는 고도로 보존된 아미노산 서열이 존재한다. 상기 모티프는 상이한 단백질들 사이에 약간의 변이를 나타낸다. 이 변이는 상기 모티프의 컨센서스 서열과 함께 미국 특허 제6,680,195호에 기재되어 있다. Clf-Sdr 단백질에서, 이 모티프는 고도로 보존되어 있다. 상기 모티프는 면역원성 조성물에 사용되어 세균 감염에 대한 광범위한 면역을 부여할 수 있고 단일클론 또는 다중클론 항체의 제조에서 항원으로서 사용될 수도 있다. 이러한 항체는 광범위한 수동 면역을 부여하기 위해 사용될 수 있다.

Sdr 단백질은 A 영역과 R 영역 사이에 위치한 2개 내지 5개의 추가 110 내지 113 잔기 반복 서열(B 모티프)을 가짐으로써 ClfA 및 ClfB와 구별된다. 각각의 B 모티프는 진핵 단백질에서 통상적으로 발견되는 컨센서스 Ca² ⁺ 결합 EF-핸드 루프를 함유한다. SdrD의 5개 B 반복부를 포함하는 재조합 단백질의 구조적 통합성은 bisANS 형광 분석에 의해 Ca² ⁺에 의존하는 것으로 밝혀졌고, 이것은 상기 EF-핸드가 기능성을 가진다는 것을 암시한다. Ca² ⁺이 제거되었을 때, 구조는 비폴딩된 입체구조로 붕괴되었다. 원래의 구조는 Ca² ⁺의 첨가에 의해 회복되었다. Sdr 단백질의 C 말단 R 도메인은 132개 내지 170개의 SD 잔기를 함유한다. 이들에 이어서, 그람 양성 세균의 많은 표면 단백질의 특징인 보존된 벽 고착 영역이 존재한다.

Sdr 및 Clf 단백질에서, 이 B 모티프는 고도로 보존되어 있지만, 피브로넥틴 결합 MSCRAMMS 및 콜라겐 결합 단백질 Cna에서는 축퇴 버전이 발생한다. R 영역과 함께 B 모티프는 세포 표면으로부터 다소 떨어진 위치에서 리간드 결합 도메인을 디스플레이하는 데에 필요하다. 반복된 B 모티프는 본원에 기재된 SD 반복 단백질의 하위군의 한 공통분모이다. 이 모티프는 균주 PFESA0237의 3종의 Sdr 단백질에서 상이한 수로 발견된다. 개별 B 모티프들 사이에 분명한 차이가 존재한다. 가장 보존된 유닛은 R 영역에 인접하여 위치하는 유닛(SdrC B2, SdrD B5 및 SdrE B3)이다. 이들은 여러 부위, 특히 C 말단 절반에서 나머지와 구별된다. 주목할만한 구조적 세부사항은 인접한 B 반복부가 C 말단 영역에 존재하는 프롤린 잔기에 의해 항상 분리되어 있지만, 프롤린이 마지막 B 반복부와 R 영역 사이에는 결코 존재하지 않는다는 것이다. 대신에 이 링커는 짧은 산성 스트레치(stretch)를 특징으로 한다. 이들 차이점은 말단 유닛이 다른 B 모티프에 비해 상이한 구조적 또는 기능적 역할을 가진다는 증거이다. SdrD의 N 말단 B 모티프와 SdrE의 N 말단 B 모티프는 서로 떨어져 있고, 작은 삽입 및 결실을 포함하는 다수의 아미노산 변경이 존재하는 반면, 나머지 내부 B 모티프는 더 고도로 보존되어 있다. 3종의 Sdr 단백질 각각이 각각의 종류의 1개 이상의 B 모티프를 가진다는 것을 주목한다.

Sdr 단백질의 C 말단 R 도메인은 132개 내지 170개의 SD 잔기를 함유한다. 이들에 이어서, 그람 양성 세균의 많은 표면 단백질의 특징인 보존된 벽 고착 영역이 존재한다.

본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 다른 후보 SdrD 분자는 유기체의 다양한 종으로부터 유래할 수 있고, 이들 중 몇몇은 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래한 하기 SdrD를 포함한다: 균주 USA300 FPR3757(단백질 수탁번호 SAUSA300 0547); 균주 NCTC8325(단백질 수탁번호 SAOUHSC 00545); 균주 MW2(단백질 수탁번호 MW0517); 균주 MSSA476(단백질 수탁번호 SAS0520); 및 균주 Mu50(단백질 수탁번호 SAV0562).

본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 것으로 고려될 수 있는 추가 MSCRAMMS는 EkeS, DsqA, KesK, KrkN, KrkN2, RkaS, RrkN 및 KnkA를 포함한다. 이들 MSCRAMMS는 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공개 제WO 02/102829호에 기재되어 있다. 진뱅크 수탁번호에 의해 확인된 추가 MSCRAMMS는 NP_373261.1, NP_373371.1, NP_374246.1, NP_374248.1, NP_374841.1, NP_374866.1, NP_375140.1, NP_375614.1, NP_375615.1, NP_375707.1, NP_375765.1 및 NP_375773.1을 포함한다.

캡슐 폴리사카라이드 5형 및 8형

침습성 질환을 야기할 수 있는 스타필로코커스 미생물도 일반적으로 세균을 캡슐화하고 숙주 선천성 면역 시스템에 의한 제거에 대한 그의 내성을 향상시키는 캡슐 폴리사카라이드(CP)를 생성할 수 있다. CP는 상기 세균이 식균작용 및 세포내 사멸에 대한 내성을 갖게 하는 보호 캡슐 내에 상기 세균 세포를 은폐시키는 작용을 한다. 캡슐을 결여하는 세균은 식균작용에 더욱 민감하다. 캡슐 폴리사카라이드는 종종 해모필러스 인플루엔자, 스트렙토코커스 뉴모니아 및 B군 스트렙토코커스를 포함하는 많은 세균 병원체에 대한 중요한 병독성 인자이다.

캡슐 폴리사카라이드는 특정 세균 종을 혈청형으로 분류하는 데에 사용될 수 있다. 분류는 통상적으로 캡슐 폴리사카라이드의 특징인 특이적 구조 또는 독특한 에피토프에 대해 발생된 특이적 항혈청 또는 단일클론 항체와의 반응에 의해 달성된다. 캡슐화된 세균은 매끄러운 콜로니로 증식하는 경향을 나타내는 반면, 그들의 캡슐을 상실한 세균의 콜로니는 매끄럽지 않게 보인다. 점액 외관을 생성하는 콜로니는 고도로 캡슐화되어 있는 것으로서 공지되어 있다. 스타필로코커스 아우레우스의 1형 및 2형은 고도로 캡슐화되어 있고 질환과 거의 관련되어 있지 않다.

스타필로코커스 아우레우스의 대다수 임상 단리물은 혈청형 5 또는 8로 캡슐화되어 있다. 5형(CP5) 및 8형(CP8) 캡슐 폴리사카라이드는 N-아세틸 만노스아미뉴론산, N-아세틸 L-푸코스아민 및 N-아세틸 D-푸코스아민으로 구성된 유사한 트라이사카라이드 반복 유닛을 가진다. 문헌(Fournier, J.M. et al., Infect. Immun. 45:97-93 (1984)) 및 문헌(Moreau, M., et al., Carbohydrate Res. 201:285-297 (1990))을 참조한다. 상기 2종의 CP는 동일한 당을 갖되 당 결합 및 O-아세틸화 부위에서 상이하여 혈청학적으로 상이한 면역반응성 패턴을 생성한다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 혈청형 5 및/또는 8 캡슐 폴리사카라이드는 O-아세틸화되어 있다. 몇몇 실시양태에서, 5형 캡슐 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드의 O-아세틸화 정도는 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 50% 내지 90%, 60% 내지 90%, 70% 내지 90%, 또는 80% 내지 90%이다. 몇몇 실시양태에서, 8형 캡슐 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드의 O-아세틸화 정도는 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 50% 내지 90%, 60% 내지 90%, 70% 내지 90%, 또는 80% 내지 90%이다. 몇몇 실시양태에서, 5형 및 8형 캡슐 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드의 O-아세틸화 정도는 10% 내지 100%, 20% 내지 100%, 30% 내지 100%, 40% 내지 100%, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 50% 내지 90%, 60% 내지 90%, 70% 내지 90%, 또는 80% 내지 90%이다.

상기 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드의 O-아세틸화 정도는 당분야에서 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 양성자 NMR(문헌(Lemercinier and Jones 1996, Carbohydrate Research 296; 83-96), 문헌(Jones and Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247), 및 국제 특허출원 공개 제WO 05/033148호 또는 제WO 00/56357호)에 의해 측정될 수 있다. 또 다른 통상적으로 이용되는 방법은 문헌(Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261)에 기재되어 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 혈청형 5 및/또는 8 캡슐 폴리사카라이드는 항체가 세균을 사멸시킨다는 것을 입증하는 동물 효능 모델 또는 옵소닌식균작용 사멸 분석에서 세균의 사멸에 의해 측정되었을 때 기능성을 가진 항체를 발생시키는 데에 사용된다. 이러한 기능성은 항체의 발생만을 모니터링하는 분석을 이용하였을 때 관찰될 수 없는데, 이것은 효능에 있어서 O-아세틸화의 중요성을 표시하지 않는다.

캡슐 역학

임상 단리물의 모니터링을 통해 특정 캡슐 혈청형과 질환을 관련시킬 수 있다. 확인된 스타필로코커스 아우레우스의 8종의 상이한 혈청형들 중에서 혈청형 1 및 2만이 고도로 캡슐화되어 있고, 이들은 거의 단리되지 않는다. 스타필로코커스 아우레우스의 캡슐 폴리사카라이드에 대해서는 문헌(p. 285-293, In J.B. Robbins, J.C. Hill and J.C. Sadoff (ed.), Seminars in infectious disease, vol. 4, Bacterial Vaccines. Thieme Stratton, Inc. New York)을 참조한다. 약 85% 내지 90%의 스타필로코커스 아우레우스 임상 단리물이 CP5 또는 CP8을 발현한다는 것이 조사에 의해 밝혀졌다(Arbeit RD, et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis. (1984) Apr;2(2):85-91; Karakawa WW, et al., J. Clin. Microbiol. (1985) Sep;22(3):445-7; Essawi T, et al., Trop. Med. Int. Health. (1998) Jul;3(7):576-83; Na'was T, et al., J. Clin. Microbiol. (1998) 36(2):414-20). 분류불가능한 CP5 및 CP8 균주들 중 대다수가 유전적으로 cap5 /8 좌위 내에 돌연변이를 함유하는 5형 또는 8형이다(Cocchiaro, Gomez et al., (2006), Mol. Microbiol. Feb. 59(3):948-960). 몇몇 균주의 경우 캡슐화가 시험관내에서 수회의 계대배양 동안 신속히 상실되고, 이것은 임상 진단에 사용된 배지 중의 높은 포스페이트 농도가 캡슐 생성에 대한 억제 효과를 나타내기 때문이다. 비캡슐화된 단리물이 소를 통한 계대배양 후 캡슐 발현을 회복한다는 것도 보고되었다. 문헌(Opdebeck, J.P. et al., J. Med. Microbiol. 19:275-278 (1985))을 참조한다. 몇몇 분류불가능한 균주는 적절한 증식 조건 하에서 캡슐 양성을 나타내게 된다.

CP5 및 CP8 구조

CP5 및 CP8 둘다의 반복 유닛은 2-아세트아미도-2-데옥시-D-만뉴론산, 2-아세트아미도-2-데옥시-L-푸코스 및 2-아세트아미도-2-데옥시-D-푸코스로 구성된다. 문헌(C. Jones et al., Carbohydr. Res. 340:1097-1106 (2005))을 참조한다. CP5 및 CP8이 동일한 당 조성을 갖지만, 이들은 면역학적으로 상이하다는 것이 입증되었다. 이들은 글라이코사이드 결합 및 유론산의 O-아세틸화 부위에서 상이하다. FucNAc 잔기들 중 하나의 균주 의존적 불완전 N-아세틸화가 관찰되었다. 문헌(Tzianabos et al., PNAS V98: 9365(2001))을 참조한다.

면역원성 조성물 중의 스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드

스타필로코커스 아우레우스 캡슐 폴리사카라이드의 분자량은 면역원성 조성물에서의 사용을 위한 중요한 고려사항이다. 고분자량 캡슐 폴리사카라이드는 항원성 표면 상에 존재하는 에피토프의 높은 원자가로 인해 일부 항체 면역 반응을 유도할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 종래 입수될 수 있었던 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 8형보다 훨씬 더 높은 분자량을 가진 캡슐 폴리사카라이드 5형 및 8형의 단리 및 정제를 제공한다.

MntC / SitC /타액 결합 단백질

MntC/SitC/타액 결합 단백질은 ABC 수송체 단백질이고 스타필로코커스 에피데르미디스 및 스타필로코커스 아우레우스에서 상동체(homologue)를 가진다. 상기 단백질은 본 발명에서 MntC로서 지칭된다. 이 단백질은 32 kDa의 지단백질이고 세균 세포벽에 위치한다. 문헌(Sellman et al., and Cockayne et al., Infect. Immun. 66: 3767(1998))을 참조한다. 스타필로코커스 에피데르미디스에서, 상기 단백질은 철에 의해 조절되는 오페론의 한 성분이다. 상기 단백질은 스트렙토코커스 파라상귀스(S. parasanguis)의 FimA를 포함하는 두 부착소에 대한 상당한 상동성, 및 입증된 또는 추정되는 금속 철 수송체 기능을 가진 ABC 수송체 패밀리의 지단백질에 대한 상당한 상동성을 보인다. (스타필로코커스 아우레우스의 균주 및 서열에 대해서는 표 2를 참조한다.)

스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질

MntC의 스타필로코커스 아우레우스 상동체는 타액 결합 단백질로서 공지되어 있고 미국 특허 제5,801,234호에 개시되었고 본 발명의 면역원성 조성물에 포함될 수 있다. MntC/SitC/타액 결합 단백질의 스타필로코커스 아우레우스 상동체에 대한 단백질 서열은 균주 Mu50(SAV0631로서도 공지되어 있음)에 대한 진뱅크 수탁번호 NP_371155에서 발견된다. 서열 식별번호는 서열번호 134이다. 균주 Mu50의 완전한 게놈에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 수탁번호는 NC_002758.2이다. 진뱅크 수탁번호 NP_371155에서 발견된 단백질 서열에 대한 코딩 DNA 서열에 대한 대응물은 704988-705917(서열번호 135)이다. 일부 실시양태에서, MntC의 N 말단은 서열번호 119(폴리펩티드 서열) 및 서열번호 136(폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)에 표시된 바와 같이 절단된다. 스타필로코커스 아우레우스의 상이한 균주의 MntC 서열은 도 43에 요약되어 있다.

스트렙토코커스 에피데르미디스 SitC 단백질

MntC/SitC/타액 결합 단백질의 스트렙토코커스 에피데르미디스 상동체는 SitC로서 공지되어 있고 문헌(Sellman et al., Infect. Immun. 2005 October; 73(10): 6591-6600)에 개시되었다. MntC/SitC/타액 결합 단백질의 스트렙토코커스 에피데르미디스 상동체에 대한 단백질 서열은 진뱅크 수탁번호 YP_187886.1(SERP0290으로서도 공지되어 있음)에서 발견된다. 서열 식별번호는 서열번호 132이다.

균주 RP62A의 완전한 게놈에 대한 뉴클레오티드 서열에 대한 수탁번호는 NC_002976이다. 진뱅크 수탁번호 YP_187886.1에서 발견된 단백질 서열의 코딩 DNA 서열에 대한 대응물은 293030-293959(서열번호 133)이다. SitC의 상응하는 N 말단 절두된 버전은 서열번호 121(폴리펩티드 서열) 및 서열번호 137(폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열)에 표시되어 있다. 본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 다른 후보 SitC 분자는 유기체의 다양한 종으로부터 유래할 수 있고, 이들 중 몇몇은 하기 표 2에 나열되어 있다.

스타필로코커스 아우레우스 철 결합 단백질

본 발명의 면역원성 조성물에 사용될 것으로 고려되는 또 다른 잠재적 후보 항원은 스타필로코커스 아우레우스 표면 단백질 철 표면 결정인자 B(IsdB)를 포함한다. 이 MSCRAMM은 문헌(Mazmanian, SK et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:2293-2298 (2002))에 기재되었고, 문헌(Kuklin, NA, et al. Infection and Immunity, Vol. 74, No. 4, 2215-2223, (2006))의 연구진에 의해 추후에 시험되었고 뮤린 감염 모델 및 붉은털 원숭이(rhesus macaque) 면역원성 연구에서 백신 후보로서 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이 IsdB 분자는 균주 MRSA252(단백질 수탁번호 CAG40104.1), 균주 뉴만(Newman)(단백질 수탁번호 BAF67312.1), 균주 MSSA476(단백질 수탁번호 CAG42837.1), 균주 Mu3(단백질 수탁번호 BAF78003.1) 및 균주 RF122(단백질 수탁번호 CAI80681.1)를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스의 다양한 균주에 존재한다.

후보 항원:

본 발명의 면역원성 조성물은 하기 항원들 중 1종 이상의 항원도 포함할 수 있다: Opp3a, DltD, HtsA, LtaS, IsdA, IsdC, SdrF, SdrG, SdrH, SrtA, SpA, Sbi, 알파-헤모라이신(hla), 베타-헤모라이신, 피브로넥틴 결합 단백질 A(fnbA), 피브로넥틴 결합 단백질 B(fnbB), 코아귤라제, Fig, map, 판톤-발렌틴 류코시딘(pvl), 알파-독소 및 이의 변이체, 감마-독소(hlg) 및 이의 변이체, ica, 면역우성 ABC 수송체, Mg² ⁺ 수송체, Ni ABC 수송체, RAP, 오토라이신, 라미닌 수용체, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, SasA, SasF, SasH, EFB(FIB), SBI, Npase, EBP, 골 시알로 결합 단백질 II, 아우레오라이신 전구체(AUR)/Sepp1, Cna, 및 이의 단편, 예컨대, M55, TSST-1, mecA, 폴리-N-아세틸글루코스아민(PNAG/dPNAG) 엑소폴리사카라이드, GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2, HBP, 비트로넥틴 결합 단백질, HarA, EsxA, EsxB, 장독소 A, 장독소 B, 장독소 C1, 및 신규 오토라이신. 본 발명의 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 CP5 및/또는 CP8의 일부 형태를 포함하는 경우 PNAG를 추가로 포함할 수 없다.

면역원성 조성물 제제

한 실시양태에서, 본 발명의 동결건조된 면역원성 조성물은 1종 이상의 항원보강제, 완충제, 냉동보호제, 염, 2가 양이온, 비이온성 세제, 자유 라디칼 산화의 억제제, 벌킹제 또는 담체를 추가로 포함한다.

본 발명의 면역원성 조성물은 복수의 스타필로코커스 단백질 항원 및 캡슐 폴리사카라이드-단백질 접합체 이외에 1종 이상의 방부제를 추가로 포함할 수 있다. FDA는 다회 용량(멀티용량) 바이알 내의 생물학적 제품이 몇 가지 예외를 제외하고 방부제를 함유할 것을 요구한다. 방부제를 함유하는 백신 제품은 벤즈에토늄 클로라이드(탄저병), 2-페녹시에탄올(DTaP, HepA, 라임, 소아마비(비경구)), 페놀(폐렴, 장티푸스(비경구), 백시니아), 및 티메로살(DTaP, DT, Td, HepB, Hib, 인플루엔자, JE, 수막염, 폐렴, 광견병)을 함유하는 백신을 포함한다. 주입가능한 약물에 사용되도록 승인받은 방부제는 예를 들면, 클로로부탄올, m-크레졸, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 2-페녹시에탄올, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤조산, 벤질 알코올, 페놀, 티메로살 및 페닐수은 니트레이트를 포함한다.

본 발명의 제제는 1종 이상의 완충제, 염, 2가 양이온, 비이온성 세제, 냉동보호제, 예컨대, 당, 벌킹제 및 항산화제, 예컨대, 자유 라디칼 스캐빈저 또는 킬레이팅제, 또는 이들의 임의의 다중 조합물을 추가로 포함할 수 있다. 임의의 한 성분, 예를 들면, 킬레이터의 선택은 또 다른 성분(예를 들면, 스캐빈저)이 바람직한지를 결정할 수 있다. 투여용으로 제제화된 최종 조성물은 멸균 및/또는 발열원 무함유 조성물이어야 한다. 당업자는 다양한 인자, 예컨대, 요구되는 구체적인 저장 및 투여 조건에 따라 이들 성분 및 다른 성분의 어떤 조합물이 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물에 포함되기에 가장 적합할지를 실험적으로 결정할 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 동결건조된 조성물은 3% (w/w) 미만의 양으로 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제를 추가로 함유한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 6.0 내지 약 9.0, 바람직하게는 약 7.5 내지 약 7.5의 pH 범위 내의 pH로 완충된다. 몇몇 실시양태에서, 완충제는 2.54% ± 0.76% (w/w)의 농도로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 완충제는 pH 6.0 ± 0.6의 석시네이트를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 완충제는 pH 6.0 ± 0.6의 히스티딘을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 완충제는 pH 6.5 ± 0.6의 히스티딘을 포함한다. 표 3은 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 완충제의 몇몇 비한정적 예를 나열한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 동결건조된 면역원성 조성물 또는 제제의 pH를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 제제의 pH는 당분야의 표준 기법을 이용함으로써 조절될 수 있다. 상기 제제의 pH는 3.0 내지 8.0이 되도록 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 3.0 내지 6.0, 4.0 내지 6.0, 5.0 내지 7.0, 또는 5.0 내지 8.0의 범위 내에 있을 수 있거나 이들 범위 내에 있도록 조절될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.8, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5 또는 약 8.0일 수 있거나 이들 값이 되도록 조절될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 pH는 4.5 내지 7.5, 4.5 내지 6.5, 5.0 내지 5.4, 5.4 내지 5.5, 5.5 내지 5.6, 5.6 내지 5.7, 5.7 내지 5.8, 5.8 내지 5.9, 5.9 내지 6.0, 6.0 내지 6.1, 6.1 내지 6.2, 6.2 내지 6.3, 6.3 내지 6.4, 6.4 내지 6.5, 6.5 내지 6.6, 6.6 내지 6.7, 6.7 내지 6.8, 6.8 내지 6.9, 6.9 내지 7.0, 6.5 내지 7.0, 7.0 내지 7.5, 또는 7.5 내지 8.0의 범위 내에 있을 수 있거나 이들 범위 내에 있도록 조절될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 약 6.0이다. 특정 실시양태에서, 상기 제제의 pH는 약 6.5이다.

몇몇 실시양태에서, 동결건조된 면역원성 조성물은 벌킹제를 포함한다. 벌킹제는 일반적으로 조성물에 용적을 제공하고, 일반적으로 약물의 건조 펠렛이 눈에 보이지 않거나 거의 눈에 보이지 않을 정도로 낮은 (용량 당) 양으로 존재하는 약물의 가시화를 촉진하는 작용을 하고/하거나, 예컨대, 동결건조 동안 바이알로부터의 활성 성분의 분출을 방지한다. 벌킹제는 약제의 침전을 용이하게 하는 작용을 할 수도 있다. 벌킹제는 냉동보호제로서도 작용할 수 있다. 다양한 냉동보호제가 보편적인 교제, 예컨대, 문헌(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Vol. 2, 19th edition (1995))에 기재되어 있다.

벌킹제의 비한정적 예에는 당 알코올, 예컨대, 알디톨, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨 및 폴리에틸렌 글라이콜, 당산, 예컨대, 알돈산, 유론산 및 알다르산, 및 탄수화물, 예컨대, 알도스, 케토스, 아미노 당, 알디톨, 이노시톨, 알돈산, 유론산, 알다르산, 모노탄수화물, 다이탄수화물, 폴리탄수화물, 글라이세르알데하이드, 아라비노스, 릭소스(lyxose), 펜토스, 리보스, 자일로스, 갈락토스, 글루코스, 헥소스, 이도스(idose), 만노스, 탈로스(talose), 헵토스, 글루코스, 프럭토스, 글루콘산, 소르비톨, 락토스, 만니톨, 메틸 a-글루코피라노사이드, 말토스, 이소아스코르브산, 아스코르브산, 락톤, 소르보스, 글루카르산, 에리쓰로스, 트레오스, 아라비노스, 알로스, 알트로스, 굴로스(gulose), 이도스, 탈로스, 에리쓰룰로스, 리불로스, 자일룰로스, 사이코스(psicose), 타가토스(tagatose), 글루큐론산, 글루콘산, 글루카르산, 갈락튜론산, 만뉴론산, 글루코스아민, 갈락토스아민, 수크로스, 트레할로스, 뉴라민산, 아라비난, 프럭탄, 푸칸, 갈락탄, 갈락튜로난(galacturonan), 글루칸, 만난, 자일란(예를 들면, 이뉼린(inulin)), 레반(levan), 푸코이단(fucoidan), 카라기난, 갈락토카롤로스, 펙틴, 펙트산, 아밀로스, 풀루란(pullulan), 글라이코겐, 아밀로펙틴, 셀룰로스, 덱스트란, 푸스튤란(pustulan), 키틴, 아가로스, 케라틴, 콘드로이틴, 데르마탄(dermatan), 하이알루론산, 알긴산, 잔틴 검, 또는 전분이 포함된다.

몇몇 실시양태에서, 벌킹제는 수크로스, 만니톨, 글라이신 및 소르비톨 중 어느 하나 이상이다. 몇몇 실시양태에서, 벌킹제는 수크로스이다. 몇몇 실시양태에서, 수크로스는 91% (w/w) 초과의 농도로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 수크로스는 96% ± 2.0% (w/w)의 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 동결건조된 제제 또는 재구성된 동결건조된 조성물의 제제는 약 0.1 mM 내지 약 10 mM의 농도(약 5 mM 이하가 바람직함)로 1종 이상의 2가 양이온(MgCl₂, CaCl₂ 및 MnCl₂를 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 동결건조된 제제 또는 재구성된 동결건조된 조성물의 제제는 비경구 투여시 대상체에게 생리학적으로 허용가능한 이온 강도로 존재하고 최종 제제에서 선택된 이온 강도 또는 삼투질농도를 생성하는 최종 농도로 포함된 1종 이상의 염(염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨 및 황산칼륨을 포함하나 이들로 한정되지 않음)을 포함한다. 제제의 최종 이온 강도 또는 삼투질농도는 다수의 성분(예를 들면, 완충 화합물(들) 및 다른 비완충 염으로부터의 이온)에 의해 결정될 것이다. 바람직한 염인 NaCl은 약 250 mM 이하로 존재하고, 이때 염 농도는 다른 성분(예를 들면, 당)을 보충하여, 제제의 최종 총 삼투질농도가 비경구 투여(예를 들면, 근육내 또는 피하 주입)에 적합하고 다양한 온도 범위에 걸쳐 면역원성 조성물 제제의 면역원성 성분의 장기간 안정성을 촉진하도록 선택된다. 염 무함유 제제는 1종 이상의 선택된 냉동보호제의 증가된 범위를 견뎌내어 원하는 최종 삼투질농도 수준을 유지할 것이다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 동결건조된 제제 또는 재구성된 동결건조된 조성물의 제제는 다이사카라이드(예를 들면, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 트레할로스) 및 폴리하이드록시 탄화수소(예를 들면, 둘시톨, 글라이세롤, 만니톨 및 소르비톨)로부터 선택된(그러나, 이들로 한정되지 않는) 1종 이상의 냉동보호제를 포함한다.

일부 실시양태에서, 재구성된 동결건조된 제제의 삼투질농도는 약 200 mOs/ℓ 내지 약 800 mOs/ℓ의 범위, 바람직하게는 약 250 mOs/ℓ 내지 약 500 mOs/ℓ, 또는 약 300 mOs/ℓ 내지 약 400 mOs/ℓ의 범위 내에 있다. 재구성된 동결건조된 제제는 예를 들면, 약 0% 내지 약 25%의 수크로스, 약 3% 내지 약 15%, 또는 약 5% 내지 약 10%의 수크로스를 함유할 수 있다. 대안적으로, 재구성된 동결건조된 제제는 예를 들면, 약 3% 내지 약 12%의 소르비톨을 함유할 수 있다. 염, 예컨대, 염화나트륨이 첨가되는 경우, 수크로스 또는 소르비톨의 효과적인 범위는 상대적으로 감소될 수 있거나 감소되지 않을 수 있다. 이들 및 다른 이러한 삼투질농도 및 삼투질농도 고려는 당업계의 기술 내에 있다.

일부 실시양태에서, 비경구 투여에 적합한 동결건조된 제제 또는 재구성된 동결건조된 제제는 1종 이상의 자유 라디칼 산화 억제제 및/또는 킬레이팅제를 포함한다. 다양한 자유 라디칼 스캐빈저 및 킬레이터가 당업계에 공지되어 있고 본원에 기재된 제제 및 사용 방법에 적용된다. 예에는 에탄올, EDTA, EDTA/에탄올 조합물, 트라이에탄올아민, 만니톨, 히스티딘, 글라이세롤, 시트르산나트륨, 이노시톨 헥사포스페이트, 트라이폴리포스페이트, 아스코르브산/아스코르베이트, 석신산/석시네이트, 말산/말레에이트, 데스페랄(desferal), EDDHA 및 DTPA, 및 이들 중 둘 이상의 다양한 조합물이 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 비환원 자유 라디칼 스캐빈저가 제제의 장기간 안정성을 효과적으로 향상시키는 농도로 첨가될 수 있다. 1종 이상의 자유 라디칼 산화 억제제/킬레이터도 다양한 조합물, 예컨대, 스캐빈저와 2가 양이온의 조합물로 첨가될 수 있다. 킬레이터의 선택은 스캐빈저의 첨가가 필요한지를 결정할 것이다.

몇몇 실시양태에서, 동결건조된 면역원성 조성물은 0.5% (w/w) 미만으로 계면활성제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 0.21% ± 0.04% (w/w)의 농도로 존재한다. 계면활성제는 제제에서 다수의 비한정적 역할(예를 들면, 항원보강제로서의 역할, 에멀젼화제로서의 역할 및 가용화제로서의 역할을 포함함)을 수행한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 약제, 즉 ClfA 단백질이 용기 또는 주사기의 벽에 부착되어 회수되지 않거나 전달되지 않는 것을 방지하기 위한 가용화제로서 작용한다. 계면활성제는 예를 들면, ClfA 단백질이 마개의 실리콘 윤활제와 접촉되게 될 때 가능한 응집이 일어나는 것을 방지하는 데에도 사용된다. 면역원성 조성물 및 백신에 사용될 계면활성제는 문헌(Ascarateil and Dupuis, Vaccine, 24(2006): S83-S85)에 기재되어 있다. 요약하건대, 비한정적 계면활성제는 리포폴리사카라이드(LPS), 사포닌, 다이메틸 다이옥타데실 암모늄 브로마이드(DDAB), 블록 중합체 또는 폴록사머(에틸렌 옥사이드(EO)와 프로필렌 옥사이드(PO)의 랜덤 중합체), 소르비탄 에스터(소르비탄 모노올레에이트 또는 트라이올레에이트일 수 있고 에스터 결합 및 에톡실화된 결합에 의해 연결된 소르비톨 및 올레산으로 만들어짐)(즉, 폴리소르베이트, 예를 들면, 폴리소르베이트 80)), 인지질, 예컨대, 레시틴, 및 만나이드 올레에이트(올레산과 만니톨의 에스터임)를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 폴록사머; Brij 58, Brij 35, 및 기타, 예컨대, 트라이톤 X-100, 트라이톤 X-114, NP40, Span 85 및 플루로닉 계열의 비이온성 계면활성제(예를 들면, 플루로닉 121)를 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르; 및 폴리소르베이트를 포함하는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터 중 어느 하나 이상이다. 몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트 80(트윈 80), 폴리소르베이트 60(트윈 60), 폴리소르베이트 40(트윈 40) 또는 폴리소르베이트 20(트윈 20)이다. 몇몇 실시양태에서, 폴리소르베이트 80(트윈 80)은 0.20% ± 0.042% (w/w)의 농도로 존재한다.

몇몇 실시양태에서, 특히 동결건조된 조성물이 항원보강제를 함유하지 않는 경우, 수성 희석제가 항원보강제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항원보강제는 이스코매트릭스™이다.

몇몇 실시양태에서, 특히 동결건조된 조성물이 계면활성제를 함유하지 않는 경우, 희석제가 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 80을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 액체 면역원성 조성물은 예를 들면, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖를 포함하는 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 본원에 기재된 바와 같은 온전한 rClfA 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 액체 면역원성 조성물은 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖의 농도로 존재하는 온전한 ClfA 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 액체 면역원성 조성물은 (a) 예를 들면, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖를 포함하는 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 본원에 기재된 바와 같은 온전한 rClfA 폴리펩티드; (b) 예를 들면, 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ ± 10 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체; (c) 예를 들면, 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ ± 10 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖의 CP8-CRM₁₉₇ 접합체; (d) 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM의 히스티딘 완충제; (e) 약 0.05% 내지 약 0.5%, 약 0.075% 내지 약 0.25%, 또는 약 0.1% 내지 약 0.2% 중량/부피(w/v)의 폴리소르베이트 80; 및 (f) 약 0% 내지 약 25% w/v, 약 3% 내지 약 15% w/v, 또는 약 5 내지 약 10% w/v 농도의 수크로스를 포함한다. 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% 중량/부피(w/v)의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 액체 면역원성 조성물은 (a) 예를 들면, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖를 포함하는 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖의 농도로 존재하는, 본원에 기재된 바와 같은 온전한 rClfA 폴리펩티드; (b) 예를 들면, 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ ± 10 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체; (c) 예를 들면, 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ ± 10 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖의 CP8-CRM₁₉₇ 접합체; (d) 예를 들면, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖를 포함하는 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖의 MntC 폴리펩티드; (e) 약 5 mM 내지 약 50 mM, 약 5 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 15 mM의 히스티딘 완충제; (f) 약 0.05% 내지 약 0.5%, 약 0.075% 내지 약 0.25%, 또는 약 0.1% 내지 약 0.2% 중량/부피(w/v)의 폴리소르베이트 80; 및 (g) 약 0% 내지 약 25% w/v, 약 3% 내지 약 15% w/v, 또는 약 5 내지 약 10% w/v 농도의 수크로스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% 중량/부피(w/v)의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

몇몇 실시양태에서, 특히 동결건조된 조성물 또는 희석제가 항원보강제를 함유하지 않는 경우, 액체 면역원성 조성물은 항원보강제와 조합된다.

한 실시양태에서, 본 발명은 (i) 응괴 인자 A("rClfA") 폴리펩티드, (ii) 약 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제, 및 (iii) 벌킹제를 수성 매질에서 조합하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 조합물을 동결건조하여 3% 중량 미만의 물을 함유하는 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (i) 응괴 인자 A("rClfA") 폴리펩티드, (ii) CP5-CRM₁₉₇ 접합체, (iii) CP8-CRM₁₉₇ 접합체, (iv) 약 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제, 및 (v) 벌킹제를 수성 매질에서 조합하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 조합물을 동결건조하여 3% 중량 미만의 물을 함유하는 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 (i) 응괴 인자 A("rClfA") 폴리펩티드, (ii) CP5-CRM₁₉₇ 접합체, (iii) CP8-CRM₁₉₇ 접합체, (iv) 단리된 MntC 폴리펩티드, (v) 약 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제, 및 (vi) 벌킹제를 포함하는 수성 매질을 조합하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 조합물을 동결건조하여 3% 중량 미만의 물을 함유하는 케이크를 형성하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 면역원성 조성물은 스타필로코커스 아우레우스 감염의 예방 또는 치료에 유용하다. 몇몇 실시양태에서, 케이크는 백색 색채 및 스폰지 질감을 가진다.

"동결건조"는 물질을 동결하고 건조하는(냉동건조하는) 공정을 의미한다. 일반적으로, 동결건조 공정은 물질을 동결시키는 단계, 이어서 주변 압력을 감소시키는 단계, 및 상기 물질 중의 동결된 물이 승화되게 하기에 충분한 열을 제공하는 단계를 포함한다. 몇몇 경우, 동결건조는 초기 동결 단계, 일차 건조(승화) 단계, 및 잔존하는 최종 미량의 물을 제거하기 위한 이차 건조 단계를 포함한다. 몇몇 경우, 어닐링 단계는 케이크 특징을 개선하고 승화를 개선하기 위해 포함된다. 동결건조의 보다 상세한 논의에 대해서는 문헌(Lyophilization of Biopharmaceuticals, Henry Costatino and Michael Pikal, eds., AAPS Press, Arlington VA, 2004)을 참조한다.

"케이크"는 일반적으로 동결건조 공정 후 잔존하는 건조된 물질을 의미한다. 케이크 외관은 동결에 의해 형성된 고체 매트릭스 구조에 의해 좌우되고 동결건조 절차 동안 다양한 파라미터에 의해 영향을 받는다. 어닐링 단계를 동결건조 절차에 부가하여 종종 보다 균일한 케이크 외관을 발생시킬 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 80은 단계 (a)에서 rClfA, 완충제 및 벌킹제와 조합된다. 몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 약 0.1% ± 0.05% (w/v)의 농도를 가진다. 다른 실시양태에서, 계면활성제는 0.01% ± 0.005% w/v의 농도를 가진다.

몇몇 실시양태에서, 단계 (a)에서 형성된 수성 조합물은 예를 들면, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖를 포함하는 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖의 농도로 온전한 rClfA 폴리펩티드를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 단계 (a)에서 형성된 수성 조합물은 예를 들면, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖를 포함하는 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖ 농도의 온전한 rClfA 폴리펩티드; 예를 들면, 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ ± 10 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체; 예를 들면, 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ ± 10 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖의 CP8-CRM₁₉₇ 접합체; 10 mM ± 5 mM의 히스티딘 완충제; 0.1% ± 0.05% 중량/부피(w/v)의 폴리소르베이트 80; 및 9% ± 4.5% w/v 농도의 수크로스를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% w/v의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

몇몇 실시양태에서, 단계 (a)에서 형성된 수성 조합물은 예를 들면, 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖를 포함하는 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖ 농도의 온전한 rClfA 폴리펩티드; 예를 들면, 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ ± 10 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체; 예를 들면, 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ ± 2 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ ± 10 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖를 포함하는 10 ㎍/㎖ ± 1 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖ ± 40 ㎍/㎖의 CP8-CRM₁₉₇ 접합체; 예를 들면, 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ ± 20 ㎍/㎖, 600 ㎍/㎖ ± 60 ㎍/㎖ 및 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖를 포함하는 40 ㎍/㎖ ± 4 ㎍/㎖ 내지 800 ㎍/㎖ ± 80 ㎍/㎖의 MntC 폴리펩티드; 10 mM ± 5 mM의 히스티딘 완충제; 0.1% ± 0.05% 중량/부피(w/v)의 폴리소르베이트 80; 및 9% ± 4.5% w/v 농도의 수크로스를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 폴리소르베이트 80은 0.01% ± 0.005% 중량/부피(w/v)의 농도로 존재하고, 수크로스는 4.5% ± 1.5% w/v의 농도로 존재한다.

몇몇 실시양태에서, 동결건조 단계는 (i) 수성 조합물을 동결시키는 단계, (ii) 수성 조합물을 어닐링시키는 단계, 및 (iii) 상기 조합물을 2 단계로 건조하는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, (i) 동결건조는 -50℃ ± 5℃의 온도에 도달할 때까지 수성 조합물의 온도를 400 밀리바 ± 40 밀리바의 압력에서 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 감소시킨 후 60분± 6분 동안 유지함으로써 수행되고; (ii) 어닐링은 온도를 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 -10℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 온도를 -10℃ ± 5℃에서 120분 ± 12분 동안 유지하고, 이어서 -50℃ ± 5℃의 온도에 도달할 때까지 온도를 분 당 0.3℃ ± 0.03℃의 속도로 감소시킨 후, 온도를 -50℃ ± 5℃에서 180분 ± 18분 동안 유지함으로써 수행되고; (iii) 제1 단계 건조는 압력을 50 mTorr까지 감소시키고 30분 ± 3분 동안 유지하고, 이어서 온도를 분 당 0.2℃ ± 0.02℃의 속도로 -30℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 상기 온도를 1,920분 ± 192분 동안 유지함으로써 수행되고; (iv) 제2 단계 건조는 온도를 분 당 0.2℃ ± 0.02℃의 속도로 30℃ ± 5℃까지 증가시킨 후, 압력을 200 mTorr까지 증가시키고 온도를 30℃ ± 5℃에서 720분 ± 72분 동안 유지함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 동결은 약 1013 mbar(1 atm)에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 동결은 1013 mbar(1 atm) 이하에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 건조 시간은 약 2,600분일 수 있다. 일부 실시양태에서, 건조 시간은 2,600분 이하일 수 있다. 일부 실시양태에서, 건조 온도는 40℃ ± 5℃, 50℃ ± 5℃, 또는 60℃ ± 5℃이다. 최종 건조 단계 후, 동결건조된 조성물의 온도는 분 당 0.5℃ ± 0.05℃의 속도로 5℃ ± 5℃까지 감소된다. 일부 실시양태에서, 동결건조는 바이알 내에서 일어난다. 몇몇 실시양태에서, 동결건조 후 바이알의 마개를 닫는다. 몇몇 실시양태에서, 바이알은 마개를 닫기 전에 질소로 재충전되고 부분 진공, 예컨대, 60% 대기압 하에서 마개를 닫는다.

한 실시양태에서, 본 방법은 동결건조된 조성물을 수성 희석제에서 재구성하는 단계도 포함하고, 이때 재구성된 조합물의 삼투질농도는 300 mOsm ± 30 mOsm이다. 몇몇 실시양태에서, 수성 희석제는 물이다. 몇몇 실시양태에서, 수성 희석제는 60 mM NaCl이다.

한 실시양태에서, 본원은 전술된 방법에 따라 제조된 면역원성 조성물을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제제는 비경구 투여에 적합한 1종 이상의 추가 안정화제, 예를 들면, 1개 이상의 티올(-SH) 기를 포함하는 환원제(예를 들면, 시스테인, N-아세틸 시스테인, 환원된 글루타티온, 티오글라이콜산나트륨, 티오설페이트, 모노티오글라이세롤, 또는 이들의 혼합물)를 포함한다. 대안적으로 또는 임의적으로, 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물 제제는 저장 용기로부터 산소를 제거하거나 (예를 들면, 앰버 유리 용기를 이용하여) 광으로부터 상기 제제를 보호함으로써 추가로 안정화될 수 있다.

본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물 제제는 그 자체가 면역 반응을 유도하지 않는 임의의 부형제를 포함하는 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 적합한 부형제는 거대분자, 예컨대, 단백질, 사카라이드, 폴리락트산, 폴리글라이콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 수크로스(Paoletti et al, 2001, Vaccine, 19:2118), 트레할로스, 락토스 및 지질 응집체(예컨대, 오일 소적 또는 리포좀)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제는 예를 들면, 문헌(Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20^th edition, ISBN:0683306472)에 논의되어 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 동결건조된 면역원성 조성물을 수성 희석제에서 재구성함으로써 제조된 액체 면역원성 조성물을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 수성 희석제는 물이다. 다른 실시양태에서, 수성 희석제는 저염 용액이다. 저염 용액은 염 농도가 약 1 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 100 mM인 수용액을 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 염은 염화나트륨이다. 몇몇 실시양태에서, 저염 용액은 60 mM ± 6 mM의 염화나트륨을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 액체 면역원성 조성물의 pH는 6.0 ± 0.6이다. 몇몇 실시양태에서, 액체 면역원성 조성물의 pH는 6.5 ± 0.6이다.

용어 "희석제"는 임의의 물질을 현탁하거나, 희석하거나 가용화시킬 수 있는 액체를 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물질은 ClfA 폴리펩티드를 함유하는 동결건조된 조성물이다. 몇몇 실시양태에서, 희석제는 수성 희석제이고 동결건조된 조성물을 가용화시킨다.

본 발명의 재구성된 동결건조된 면역원성 조성물을 대상체에게 직접적으로 전달하는 것은 비경구 투여(근육내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 또는 조직의 간질 공간으로의 투여)에 의해, 또는 직장, 경구, 질, 국소, 경피, 비강내, 안, 귀, 폐 또는 다른 점막 투여에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 비경구 투여는 근육내 주사에 의해, 예를 들면, 대상체의 넓적다리 또는 상부 팔에 주사함으로써 달성된다. 주사는 바늘(예를 들면, 피하 바늘)을 통해 달성될 수 있으나, 대안적으로 바늘 부재 주사가 이용될 수 있다. 전형적인 근육내 용량은 0.5 ㎖이다. 본 발명의 조성물은 다양한 형태, 예를 들면, 주사용 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있다.

특정 면역원성 조성물에 대한 성분의 최적 양은 대상체에서 적절한 면역 반응을 관찰하는 것을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 대상체는 적절한 간격을 두고 1회 또는 수회 부스터 면역화를 제공받을 수 있다.

포장 및 제형

본 발명의 면역원성 조성물은 유닛 용량 또는 다회 용량(예를 들면, 2회 용량, 4회 용량 또는 그 이상의 용량) 제형으로 포장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량은 동결건조된 면역원성 조성물의 재구성 후 0.5 ㎖ 용량이다. 예를 들면, 본원에 참고로 도입되는 국제 특허출원 공개 제WO2007/127668호를 참조한다.

조성물은 바이알 또는 다른 적합한 저장 용기 내에 함유된 상태로 제공될 수 있거나, 또는 바늘을 구비할 수 있거나 구비하지 않을 수 있는 예비충전된 전달 장치, 예를 들면, 단일 또는 다중 성분 주사기 내에 함유된 상태로 제공될 수 있다. 주사기는 전형적으로 본 발명의 방부제 함유 면역원성 조성물의 단회 용량을 함유하지만(그러나, 반드시 그러할 필요는 없음), 다회 용량의 예비충전된 주사기도 예상된다. 마찬가지로, 바이알은 단회 용량을 포함할 수 있으나 대안적으로 다회 용량을 포함할 수 있다.

효과적인 용량 부피는 상용적으로 확립될 수 있지만, 주사될 재구성된 동결건조된 조성물의 전형적인 용량은 0.5 ㎖의 부피를 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 용량은 인간 대상체에게 투여되도록 제제화된다. 일부 실시양태에서, 상기 용량은 성인, 십대, 청소년, 유아 또는 영아(즉, 1세 이하) 인간 대상체에게 투여되도록 제제화되고 바람직한 실시양태에서 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 면역원성 조성물을 당업계에 잘 공지되어 있는 다수의 동결건조 방법들 중 한 방법을 이용하여 동결건조하고 재구성함으로써, 예를 들면, 입자의 제조에 이용되는 정확한 방법의 변경에 의해 선택되고 조절될 수 있는 입자 특성, 예컨대, 평균 직경 크기를 가진 건조된 규칙적인 형태(예를 들면, 구형)의 입자, 예컨대, 마이크로펠렛 또는 마이크로스피어를 형성할 수 있다. 면역원성 조성물은 임의적으로 별도의 건조된 규칙적인 형태(예를 들면, 구형)의 입자, 예컨대, 마이크로펠렛 또는 마이크로스피어와 함께 제조될 수 있거나 상기 입자에 함유될 수 있는 항원보강제를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 임의적으로 본 발명의 1종 이상의 방부제를 추가로 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물을 포함하는 제1 성분, 및 상기 제1 성분의 재구성을 위한 멸균 수용액을 포함하는 제2 성분을 포함하는 면역원성 조성물 키트를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 수용액은 1종 이상의 방부제를 포함하고 임의적으로 1종 이상의 항원보강제를 포함할 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공개 제WO2009/109550호(본원에 참고로 도입됨) 참조).

또 다른 실시양태에서, 다회 용량 포맷의 용기는 일반적인 실험 유리용기, 플라스크, 비이커, 눈금이 매겨진 실린더, 발효기, 생물반응기, 튜빙, 파이프, 가방, 병, 바이알, 바이알 밀폐기(예를 들면, 고무 마개, 덮개 상의 나사), 앰플, 주사기, 이중 또는 다중 챔버 주사기, 주사기 마개, 주사기 플런저, 고무 밀폐기, 플라스틱 밀폐기, 유리 밀폐기, 카트리지 및 일회용 펜 등으로 구성되어 있으나 이들로 한정되지 않는 1개 이상의 군으로부터 선택된다. 본 발명의 용기는 제조 재료에 의해 한정되지 않고 재료, 예컨대, 유리, 금속(예를 들면, 강철, 스테인레스 강철, 알루미늄 등) 및 중합체(예를 들면, 열가소성 물질, 탄성체, 열가소성 탄성체)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 포맷의 용기는 부틸 마개를 가진 5 ㎖ 쇼트(Schott) 1형 유리 바이알이다. 당업자는 전술된 포맷이 결코 완전한 목록이 아니고 단지 본 발명을 위해 이용가능한 다양한 포맷에 대한 지침을 당업자에게 제공하기 위한 것임을 인식할 것이다. 본 발명에서 사용될 것으로 고려되는 추가 포맷은 실험 장치 공급자 및 제조자, 예컨대, 유나이티드 스테이츠 플라스틱 코포레이션(United States Plastic Corp.)(미국 오하이오주 리마 소재), VWR 등으로부터의 공개된 카달로그에서 발견될 수 있다.

면역원성 조성물의 평가

한 실시양태에서, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스 유기체의 1종 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스 유기체의 3종 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스 유기체의 4종 이상의 항원을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

다양한 시험관내 시험을 이용하여 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 평가할 수 있다. 예를 들면, 스타필로코커스 세포, 해당 항원에 대한 특이적 항체를 함유하는 열 불활성화된 혈청 및 외래 보체 공급원으로 구성된 혼합물을 함께 항온처리함으로써 시험관내 옵소닌 분석을 수행할 수 있다. 옵소닌식균작용은 새로 단리된 다형핵 세포(PMN) 또는 분화된 이펙터 세포, 예컨대, HL60과 항체/보체/스타필로코커스 세포 혼합물의 항온처리 동안 진행된다. 항체 및 보체로 코팅된 세균 세포는 옵소닌식균작용시 사멸된다. 옵소닌식균작용으로부터 회수된 생존 세균의 콜로니 형성 유닛(cfu)은 분석 혼합물의 플레이팅에 의해 측정될 수 있다. 역가는 분석 대조군과의 비교에 의해 측정될 때 50% 세균 사멸을 제공하는 최고 희석의 역수로서 보고된다.

전체 세포 ELISA 분석을 이용하여 항원의 시험관내 면역원성 및 표면 노출을 평가할 수도 있고, 이때 관심 있는 세균 균주(스타필로코커스 아우레우스)를 플레이트, 예컨대, 96웰 플레이트 상에 코팅하고, 면역화된 동물로부터 수득된 시험 혈청을 상기 세균 세포와 반응시킨다. 시험 항원에 대해 특이적인 임의의 항체가 상기 항원의 표면 노출된 에피토프와 반응하는 경우, 이것을 당업자에게 공지된 표준 방법으로 검출할 수 있다.

그 다음, 원하는 시험관내 활성을 나타내는 임의의 항원을 생체내 동물 챌린지 모델에서 시험할 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 당업자에게 공지된 면역화 방법 및 경로(예를 들면, 비강내, 비경구, 경구, 직장, 질, 경피, 복강내, 정맥내, 피하 등)에 의한 동물(예를 들면, 마우스)의 면역화에 사용될 수 있다. 동물을 특정 스타필로코커스 종 면역원성 조성물로 면역화시킨 후, 상기 동물을 스타필로코커스 종으로 챌린지하고 스타필로코커스 감염에 대한 내성에 대해 분석한다.

한 실시양태에서, 병원체 무함유 마우스를 스타필로코커스 아우레우스로 면역화시키고 챌린지할 수 있다. 예를 들면, 마우스를 면역원성 조성물 중의 원하는 항원의 1회 이상의 투약으로 면역화시킨다. 그 후, 상기 마우스를 스타필로코커스 아우레우스로 챌린지하고, 챌린지 후 시간의 경과에 따라 생존을 모니터링한다.

면역화 방법

숙주를 면역화시켜 스타필로코커스 감염을 예방하는 방법도 제공된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 숙주는 인간이다. 따라서, 본원에 기재된 면역원성 양의 면역원성 조성물을 숙주 또는 대상체에게 투여한다. 대상체를 점진적으로 증가하는 양의 면역원성 조성물로 면역화시키고 면역 반응을 분석하여 최적 용량을 결정하는 용량 반응 연구를 수행함으로써 면역원성 조성물의 면역원성 양을 결정할 수 있다. 상기 연구를 위한 출발점을 동물 모델에서의 면역화 데이터로부터 유추할 수 있다. 용량은 개체의 구체적인 상태에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 당업자에게 공지된 수단에 의해 상용적인 시험에서 결정될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 숙주를 면역화시켜 스타필로코커스 감염, 질환 또는 병태를 예방하는 방법은 인간 치료, 수의학 치료, 동물 치료 또는 농학 치료를 포함한다. 또 다른 실시양태는 숙주를 면역화시켜 대상체에서 스타필로코커스 종과 관련된 스타필로코커스 감염, 질환 또는 병태를 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 면역원성 조성물로부터 다중클론 또는 단일클론 항체 제제를 발생시키는 단계, 및 상기 항체 제제를 사용하여 수동 면역을 상기 대상체에게 부여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

면역학적 유효량의 면역원성 조성물을 적절한 투약 횟수로 대상체에게 투여하여 면역 반응을 유발한다. 치료된 개체는 스타필로코커스 감염의 보다 심각한 임상 증상을 나타내지 않아야 한다. 용량은 개체의 구체적인 상태, 예컨대, 연령 및 체중에 따라 달라질 수 있다. 이 양은 당업자에게 공지된 수단에 의해 상용적인 시험에서 결정될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물을 투여받은 환자는 스타필로코커스 아우레우스 보균율의 감소를 보인다. 면역원성 조성물의 투여 후 이러한 보균율 감소 또는 비보균자로서 보낸 연장된 시간 간격은 의학적 필요 관점에서 유의하다. 예를 들면, 스타필로코커스 아우레우스 다중항원 백신의 1회 투약 후 보균자에서 전체 스타필로코커스 아우레우스 보균율의 감소를 평가할 수 있다. 예를 들면, 면역원성 조성물의 투여 1일 전, 18세 내지 50세 연령의 성인 군을 코 및 목 면봉으로 보균에 대해 스크리닝한 후 배양하여 그들의 보균 상태를 확인할 수 있다. 그 다음, 본 발명의 면역원성 조성물을 상기 군에게 투여할 수 있고, 이때 대조물을 제공받는 군이 존재한다. 코 및 목 면봉 스크리닝은 12주 기간에 걸쳐 주마다 수행하고 면역원성 조성물의 투여 후 최대 6개월까지 월마다 수행하고 플라세보와 비교한다. 일차 목적 중 하나는 면역원성 조성물의 투여 후 환자의 보균율을 면역화 후 3개월 간격으로 플라세보 투여 후 환자의 보균율과 비교하는 것이다.

스타필로코커스 감염의 동물 모델

본원에 기재된 면역원성 조성물들 중 어느 하나의 효능을 평가하는 데에 사용될 여러 동물 모델이 이하에 기재되어 있다.

뮤린 패혈증 모델(수동 또는 능동)

수동 면역화 모델

마우스를 면역 IgG 또는 단일클론 항체로 복강내(i.p.)로 수동 면역화시킨다. 24시간 후, 상기 마우스를 치사량의 스타필로코커스 아우레우스로 챌린지한다. 이 세균 챌린지는 임의의 생존이 상기 항체와 상기 세균의 특이적 생체내 상호작용에 기인할 수 있도록 정맥내(i.v.) 또는 복강내로 투여된다. 상기 세균 챌린지 용량은 비면역화된 대조군 마우스의 약 20%의 치명적인 패혈증을 달성하기 위해 요구되는 용량이 되도록 측정된다. 생존 연구의 통계적 평가를 카플란-메이에르(Kaplan-Meier) 분석으로 수행할 수 있다.

능동 면역화 모델

이 모델에서, 마우스(예를 들면, 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스)를 0주, 3주 및 6주(또는 다른 적절하게 간격을 둔 유사한 백신접종 스케쥴)에 표적 항원으로 복강내(i.p.)로 또는 피하(s.c.)로 능동 면역화시킨 후, 8주에 정맥내 경로를 통해 스타필로코커스 아우레우스로 챌린지한다. 세균 챌린지 용량은 10일 내지 14일 기간에 걸쳐 대조군에서 약 20%의 생존을 달성하도록 보정된다. 생존 연구의 통계적 평가를 카플란-메이에르 분석으로 수행할 수 있다.

감염성 심내막염 모델(수동 또는 능동)

스타필로코커스 아우레우스에 의해 야기된 감염성 심내막염(IE)에 대한 수동 면역화 모델은 ClfA가 보호 면역을 유도할 수 있다는 것을 보이기 위해 이전에 사용되었다. 문헌(Vernachio et al., Antmicro. Agents & Chemo. 50:511-518 (2006))을 참조한다. 이 IE 모델에서, 중추 정맥 카테터, 세균혈증 및 원위 장기로의 혈행 시딩을 포함하는 임상 감염을 모의하기 위해 토끼 또는 래트를 이용한다. 표적 항원에 대해 특이적인 단일클론 또는 다중클론 항체의 단회 또는 다회 정맥내 주사를, 멸균 대동맥 판막 세균증식물을 가진 카테터 삽입된 토끼 또는 래트에게 투여한다. 그 후, 상기 동물을 스타필로코커스 아우레우스 또는 스타필로코커스 에피데르미디스 균주로 정맥내로 챌린지한다. 그 다음, 챌린지 후, 심장, 심장 세균증식물 및 추가 조직(신장을 포함함), 및 혈액을 회수하고 배양한다. 그 다음, 심장 조직, 신장 및 혈액에서 스타필로코커스 감염의 빈도를 측정한다. 한 연구에서, 동물을 MRSE ATCC 35984 또는 MRSA 67-0으로 챌린지하였을 때, ClfA에 대한 다중클론 항체 제제 또는 단일클론 항체를 사용하여 감염률의 상당한 감소를 보였다. 문헌(Vernachio et al., Antmicro. Agents & Chemo. 50:511-518 (2006))을 참조한다.

감염성 심내막염 모델은 토끼 및 래트 둘다에서의 능동 면역화 연구에도 응용되었다. 토끼 또는 래트를 표적 항원으로 근육내 또는 피하 면역화시키고 2주 후 정맥내 경로를 통해 스타필로코커스 아우레우스로 챌린지한다.

신우신염 모델

신우신염 모델에서, 마우스를 0주, 3주 및 6주(또는 다른 적절하게 간격을 둔 백신접종 스케쥴)에 표적 항원으로 면역화시킨다. 그 후, 동물을 스타필로코커스 아우레우스 PFESA0266으로 복강내로 또는 정맥내로 챌린지한다. 48시간 후, 신장을 회수하고, 세균 CFU의 수를 센다.

항체 및 항체 조성물

본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물의 1종 이상의 항원에 특이적으로 및 선별적으로 결합하는 항체 및 항체 조성물을 추가로 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하였을 때 항체가 발생한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역원성 조성물의 1종 이상의 항원에 대해 유도된 정제된 또는 단리된 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 동물 효능 모델 또는 옵소닌식균작용 사멸 분석에서의 세균 사멸에 의해 측정될 때 기능성을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 수동 면역을 대상체에게 부여한다. 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자, 및 당업자에게 잘 공지된 기법을 이용하였을 때 본 발명의 항체 또는 항체 조성물을 생성하는 세포 또는 세포주(예컨대, 항체의 재조합 제조용 하이브리도마 세포 또는 다른 조작된 세포주) 및 형질전환 동물을 추가로 제공한다.

본 발명의 항체 또는 항체 조성물은 다중클론 또는 단일클론 항체 제제를 발생시키는 단계, 및 상기 항체 또는 항체 조성물을 사용하여 수동 면역을 대상체에게 부여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 스타필로코커스 종과 관련된 스타필로코커스 감염, 질환 또는 병태의 치료 또는 예방 방법에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 진단 방법, 예를 들면, 본 발명의 면역원성 조성물의 1종 이상의 항원의 존재를 검출하거나 상기 항원의 수준을 정량하는 진단 방법에 유용할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 몇몇 실시양태를 입증한다. 그러나, 이들 실시예는 예시를 위한 것일 뿐이고 본 발명의 조건 및 범위에 대한 전반적인 한정을 주장하지 않고 이러한 한정을 위한 것도 아니라는 것을 이해해야 한다. 전형적인 반응 조건(예를 들면, 온도, 반응 시간 등)이 주어졌을 때, 일반적으로 덜 편리할지라도 특정된 범위 초과의 조건 및 특정된 범위 미만의 조건 둘다가 이용될 수도 있다는 것을 인식해야 한다. 달리 특정되어 있지 않은 한, 본원에서 언급된 모든 부 및 %는 중량을 기준으로 한 것이고 모든 온도는 섭씨도로 표현된다.

나아가, 달리 상세히 기재되어 있는 경우를 제외하고, 당업자에게 잘 공지되어 있고 상용적인 기법인 표준 기법을 이용하여 하기 실시예를 실시하였다. 하기 실시예는 예시 목적으로 제공되고 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다.

스타필로코커스 아우레우스 백신 또는 면역원성 조성물로서 개발된, 재조합 응괴 인자 A(rClfA), 캡슐 폴리사카라이드 5형 접합체(CP5-CRM₁₉₇) 및 캡슐 폴리사카라이드 8형 접합체(CP8-CRM₁₉₇)를 포함하는 안정한 동결건조된 3종-항원 제제를 개시한다. 한 특정 실시양태에서, rClfA는 피브리노겐에 대한 그의 결합 친화성을 감소시키도록 조작된(Y388A) 표면 발현된 병독성 인자의 돌연변이된 형태(rClfAm)이다. CP5 및 CP8은 임상 단리물에서 발견되는 공통된 폴리사카라이드이고, 이 백신에서 담체 단백질 CRM₁₉₇에 접합되어 있다.

만들어진 동결건조된 케이크는 시각적으로 적합하였고, 활성 성분은 동결건조된 케이크의 재구성시 안정하였다. 더욱이, 동결건조된 제제의 (고용량 및 저용량을 브래키팅(bracketing)함) 다수의 로트를 실시간 온도(2℃ 내지 8℃) 및 가속화 온도(25℃ 및 37℃)에서 1개월 동안 저장하였을 때, 동결건조된 3종-항원 제제가 안정한 상태로 유지되었다는 것이 확인되었다. 또한, 재구성 후 3회 동결-해동 주기 및 실온에서 수행된 24시간 안정성 시험 각각은 상기 조건 하에서의 활성 성분의 안정성을 보여주었다.

스타필로코커스 아우레우스 백신 또는 면역원성 조성물로서 개발된, 재조합 ClfA, CP5-CRM₁₉₇, CP8-CRM₁₉₇ 및 MntC를 포함하는 안정한 동결건조된 4종-항원 제제도 개시한다. 한 특정 실시양태에서, ClfA는 피브리노겐에 대한 그의 결합 친화성을 감소시키도록 조작된(Y388A) 표면 발현된 병독성 인자의 돌연변이된 형태이다. 한 특정 실시양태에서, MntC는 지질화되어 있지 않다. 한 특정 실시양태에서, MntC는 재조합 MntC이다. 3종-항원 제제와 마찬가지로, 동결건조된 4종-항원 제제는 동일한 항원을 포함하는 액체 제제에 비해 크게 증가된 안정성을 가졌다.

본 발명의 몇몇 실시양태가 예시적으로 기재되어 있지만, 본 발명의 기술사상을 벗어나거나 특허청구범위를 초과하지 않으면서 당업자의 기술 범위 내에 있는 많은 변형, 변경 및 개조, 및 다수의 등가물 또는 대안적 해법을 이용하여 본 발명을 실시할 수 있다는 것이 자명할 것이다.

모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 각각의 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 전체적으로 참고로 도입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되어 있는 것과 동일한 정도로 전체적으로 본원에 참고로 도입된다.

실시예 1: 예비제제화 방법

다양한 생물물리학적 수단(도함수 UV 흡수 분광분석법, 형광 분광분석법, 원편광이색법(CD) 및 시차 주사 열량측정법(DSC))을 이용하여 구조적 안정성 면에서 스타필로코커스 아우레우스 응괴 인자 A(ClfA) 단백질의 고유 특징을 조사하였다. 온도 및 pH는 ClfA 단백질의 고유 구조적 거동을 특징규명하는 것을 돕기 위해 상기 단백질에 대한 스트레스를 발휘하는 데에 이용된 가변 파라미터이었다. 그 다음, 이 데이터를 이용하여, 상기 단백질에 대한 추가 안정성을 제공할 수 있는 부형제를 스크리닝하였다. 나아가, 결합 연구를 수행하여 AlPO₄ 및 Al(OH)₃에 대한 ClfA의 용량 및 pH 의존적 친화성을 평가하였다. 본원에서 개시된 데이터를 이용하여 생체의학 응용, 예를 들면, 백신 또는 면역원성 조성물로서 사용될 ClfA에 대한 제제화에 도달하였다.

본 발명이 임의의 모든 응괴 인자 A(ClfA) 단백질, 및 ClfA를 함유하는 제제에 관한 것이지만, 하기 실시예는 ClfA의 N1N2N3 도메인을 포함하고 전장 ClfA의 위치 338에 상응하는 티로신 대신에 치환된 알라닌을 포함하고 피브리노겐에 결합하는 능력을 결여하는 ClfA 변이체를 사용하였다.

초기 생물물리학적 특징규명을 위해 준비된 샘플은 150 mM NaCl 중의 10 mM 완충제(아세테이트, 석시네이트 또는 포스페이트)로 구성되었다. ClfA의 대략적인 목표 농도는 형광의 경우 0.1 mg/㎖이었고, 원편광이색법(CD)의 경우 0.2 mg/㎖이었고, UV 흡수 분광분석법의 경우 0.5 mg/㎖이었다.

상업적으로 입수가능한 변형된 로우리(Lowry) 단백질 분석(피어스(Pierce); Lowry et al. J. Biol. Chem.; 193:265-275 [1951]) 또는 UV 흡광도 분광분석법을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다.

자스코(Jasco) J-810 분광편광계를 이용하여 원편광이색법(CD)을 수행함으로써 면역원성 조성물 또는 백신 중의 ClfA 단백질의 이차 구조를 평가하였다. 상기 단백질을 5.0 내지 8.0의 pH 간격으로 제제화한 경우 CD 스펙트럼의 정성적 차이를 관찰하여 ClfA의 구조에 대한 pH의 효과를 조사하였다. 나아가, 10℃부터 85℃까지의 온도 변동 실험을 218 nm에서 수행하여 이차 구조 관점에서 단백질의 입체구조적 안정성을 관찰하였다. ClfA의 공지된 N2N3 구조가 다량의 β-시트 구조를 포함하기 때문에 218 nm의 파장을 선택하였다. CD 스캔에 대한 실험 파라미터는 190 nm 내지 260 nm의 파장 범위, 20 nm/분의 스캔 속도, 2초의 반응 시간, 1 nm의 밴드폭 및 3의 축적을 포함하였다. 상기 온도 변동 실험을, 15℃/시간의 온도 상승 속도, 1초의 반응 시간 및 1 nm의 밴드폭을 이용하여 자스코 소프트웨어에서 가변 온도 모드로 수행하였다.

고유 트립토판 형광 방출 분광분석법을 이용하여 ClfA 단백질의 삼차 구조의 변화를 온도의 함수로서 모니터링하였다. 또한, 상기 방법을 이용하여 실시간으로 및 가속화 연구 동안 단백질 구조의 변화를 관찰하였다. 295 nm 여기를 이용하는 PTI QM-1(브룬스윅크(Brunswick), 미국 뉴저지주 소재) 형광측정기 상에서 형광 스펙트럼을 기록하였다. 사용된 단백질의 농도는 약 0.1 mg/㎖이었다. 1 cm 경로길이 석영 큐벳을 이용하여 320 nm 내지 350 nm에서 트립토판의 방출 스펙트럼 특징을 모니터링하였다. 4.0 내지 8.0의 일련의 pH 값에 대한 형광 데이터를 10℃ 내지 85℃(2.5℃ 간격)로부터 획득하였다. 배경 보정에 대한 블랭크로서 완충제를 사용하여 대조 실험을 수행하였다. 기구 셋팅은 각각 4 nm 및 3 nm의 여기 밴드 폭 및 방출 밴드폭, 1초의 노출 시간 및 290 nm 내지 400 nm의 데이터 수집 파장 범위를 포함하였다. AlPO₄를 함유하는 제제의 경우, 전면 (삼각형) 큐벳 기하구조를 이용하여 샘플의 탁도 한계를 피하였다. 평활화를 위해 이차 다항 11점 사비츠키 골레이(Savitsky Golay) 함수를 이용하는 오리진(Origin)^®7.0을 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.

이차 도함수 UV 흡수 분광분석법을 이용하는 온도 변동 실험을, ClfA 삼차 구조를 조사하는 또 다른 방법으로서 이용하여 고유 단백질 안정성을 평가하였다. 펠티어(Peltier) 온도 조절기를 갖춘 아질런트(Agilent) 8453 UV 가시광선 다이오드 배열 분광계를 이용하여 200 nm 내지 400 nm로부터 다중파장 UV 가시광선 흡수 스펙트럼을 수득하였다. 부피가 100 ㎕인 1 cm 경로길이 석영 큐벳을 모든 실험에 사용하였다. 용융 실험의 경우, 각각의 온도 변화 후 4분(평형에 도달하기에 충분한 시간으로서 간주됨)이 허용되었다. ClfA 단백질의 잠재적 응집을 모니터링하기 위해 350 nm에서의 광학 밀도 데이터도 온도의 함수로서 수집하였다.

켐스테이션(CHEMSTATION)™ 소프트웨어(아질런트)를 이용하여 스펙트럼 분석을 수행하였다. 9점 데이터 필터를 이용하여 이차 도함수 스펙트럼을 획득하여 3-도 사비츠키 골레이 다항식에 피팅하였다. 도함수 스펙트럼을 각각 1 nm 간격 사이의 99개 데이터 점으로 내삽하여 비응집 조건 하에서 약 0.01 nm의 효과적인 해상을 제공하였다. 마이크로칼 오리진(MICROCAL ORIGIN)™ 6.0을 이용하여 도함수 스펙트럼의 피크 위치를 선택하였다. 아미노산 잔기 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판에 상응하는 피크 위치를 (문헌(Kueltzo et al., J Pharm Sci. 2003; 92(9): 1805-1820)의 방법에 기초하여) 확인하여 온도의 함수로서 작도하였다.

TOSOH TSK-GEL G3000SWx1 컬럼(7.8 mm x 30 cm, 5 ㎛, 부품 번호 08541) 및 하기 조건을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다: 유속, 0.5 ㎖/분; 최대 압력, 60 Bar; 실행 시간, 30분; 이동상, 셀그로(Cellgro) PBS(pH 7.4); 주입 부피, 100 ㎕; 검출기 UV 280 nm, 260 nm 및 214 nm, 모두에 대한 4 nm 밴드폭; 기준, 340 nm, 16 nm 밴드폭; 온도, 25℃.

ClfA 단백질의 용융 온도(T_m)를 시차 주사 열량측정법(DSC)으로 측정하였다. 약제(ClfA)에 의해 점유될 부피가 완충제로 대체되었다는 점을 제외하고 ClfA 샘플과 동일한 시간에 제조된 매칭(matching) 완충제에 대한 ClfA 샘플의 DSC 프로파일을 측정하였다. 기구 셋팅은 다음과 같았다: 스캔 속도, 200℃/Hr; 스캔 범위 10℃ 내지 90℃; 여과 시간, 8초; 피드백 모드/게인(Feedback mode/Gain), 중간. 각각의 스캔 후, DSC 셀 및 주사기를 주사용수(WFI)로 3회 내지 5회 세정하였다. 임의의 재스캔 실험의 경우, 셀 세정 주기는 다음 실행을 위한 깨끗한 셀을 보장하기 위해 10% 콘트라드(Contrad)(데콘 레이보레이토리스 리미티드(Decon Laboratories Ltd.), 영국 이스트 서섹스 소재)의 사용을 포함하였다.

미세열량측정 모세관 DSC를 부형제의 스크리닝을 위한 고효율 플랫폼으로서 사용하였다. 각각의 부형제 스크리닝 실험에서, 10 mM 석시네이트 완충제(150 mM NaCl, pH 6.0) 중의 ClfA를 T_m 변화의 계산을 위한 기초로서 사용하였다. 중복 DSC 샘플에 대한 겉보기 T_m을 획득한 후, 평균 T_m을 동일한 DSC 실행에서 부형제를 갖지 않는 제제의 평균 T_m과 비교하였다. 각각의 부형제/농도의 효과를 T_m 변화의 효과로 비교하였다. 부형제의 존재 하에서 T_m의 양성 변화는 ClfA의 열안정성에 대한 양성 효과로서 간주되었다. ΔG 계산을 위해, 수동으로 선택된 전이 전 기준 및 전이 후 기준으로부터 ΔC_P를 계산한 후, 곡선과 상기 기준 사이의 면적의 적분으로 ΔH 및 T_m을 계산하였다. 마이크로칼 DSC 소프트웨어를 이용하여 ΔG 곡선을 계산하였다.

실시예 2: ClfA 약물의 예비제제화: 결과

약학적으로 관련된 온도(10℃ 내지 85℃) 및 pH(4.0 내지 8.0) 스트레스를 약물(액체로 제제화된 ClfA) 및 약제(액체상 중의 비제제화된 ClfA 단백질)에 대해 발휘하여 그들의 민감성을 확인하였다.

고유 트립토판 형광 열 용융 연구를 pH 4.0 내지 pH 8.0의 다양한 pH에서 ClfA 샘플에 대해 수행하였고 형광 방출 곡선을 발생시켰다. 이들 실험의 경우, ClfA는 일반적으로 0.1 mg/㎖ 내지 0.2 mg/㎖의 농도로 존재하였다. 각각의 곡선의 변곡점은 용융 온도(T_m)인 것으로 확인되었고 표 4에 요약되어 있다. 10℃에서, 보다 높은 pH 값의 샘플은 보다 높은 파장에서 피크 위치를 보였는데, 이것은 트립토판 잔기가 용매에 더 많이 노출되었다는 것을 암시한다. 더욱이, 보다 높은 pH 값에서 ClfA는 보다 낮은 T_m 값을 나타내었는데, 이것은 보다 낮은 pH 값, 예컨대, pH 5.5 및 6.0에 비해 보다 낮은 안정성을 암시한다. pH 5.5부터 6.5까지 0.2의 보다 미세한 증가에서 pH 패널(표 5)은 pH의 감소에 따라 T_m의 점진적인 증가를 보였다.

원편광이색법(CD) 분광분석을 이용하여 ClfA의 이차 구조를 pH의 함수로서 조사하였다. 특히, pH 7.0 및 pH 8.0에서 수득된 스펙트럼은 약 200 nm 및 220 nm에서 잘 정의된 최소치를 보였다. 이 관찰결과의 한 가지 가능한 해석은 약 220 nm에서의 최소치가 공지된 N2N3 구조의 β-시트 성분으로 인한 것일 수 있고 약 200 nm에서의 최소치가 약 195 nm에서 통상적으로 관찰된 랜덤 코일 최소치에 근접한다는 것이다. 이들 관찰결과는 ClfA 단백질이 pH 7.0 및 pH 8.0에서 약간 더 비폴딩되어 있다는 것을 보여주는 형광 데이터를 뒷받침한다.

pH 4.0 내지 8.0의 ClfA의 CD 용융을 10℃ 내지 85℃에서 수행하였고, 각각의 pH 점에 대한 흡광도의 함수로서 몰 타원율을 보여주는 곡선을 발생시켰다. 상이한 pH 값에 걸쳐 곡선의 형태를 관찰하였다. pH 6.0 이상에서의 데이터는 약 55℃에서 시각적으로 평가될 수 있는 유사한 전이를 가진 것으로 보였다. pH 5.0 및 5.5에서의 곡선은 보다 높은 전이를 가진다. 더욱이, pH 5.0은 (타원율 값에서의) 가장 큰 정도의 변화를 나타내었는데, 이것은 β-시트 함량의 가장 큰 증가를 암시한다. 증가된 β-시트가 응집된 샘플에서 전형적인 특징이기 때문에, pH 5.0은 ClfA 단백질이 승온에서 자가결합할 경향이 가장 강하다는 것을 보여줄 수 있다.

아질런트 8453 UV 가시광선 분광광도계를 이용하여 350 nm에서의 광학 밀도(OD₃₅₀)를 측정하였고, 포톤 테크놀로지 인터네이셔날(Photon Technology International) 분광형광계를 이용하여 온도의 함수로서 직각 광 산란을 측정함으로써, 신호 강도의 증가에 상응할 것이고 가능하게는 ClfA 단백질의 응집과 상호관련되어 있을 입자 크기의 증가를 관찰하였다. pH 4.0, 5.0 및 5.5에서 온도 기록에서 주목할만한 전이를 관찰하였고, 이때 pH 4.0이 가장 큰 정도의 변화(가장 많은 응집)를 가졌다. 대조적으로, pH 6.0 이상은 소량의 자가결합 사건을 표시하는 작은 점진적인 상향 변화만을 나타내었다.

직각 광 산란은 올리고머화(응집)의 검출에 있어서 OD₃₅₀보다 더 민감한 기법이다. 이 기법으로부터 수득된 데이터에 따르면, ClfA의 응집의 최초 발생은 pH 5.0 및 5.5에서 관찰되었지만, 보다 더 높은 pH 값은 입자 크기 증가에서 15℃ 지연만큼 많은 지연을 보였다.

kcal/mole/℃로 측정되는 엔탈피 변화를 측정하는 시차 주사 열량측정법(DSC)으로 ClfA의 구조적 안정성을 특징규명하였다. DSC 분석에 따르면, ClfA의 비폴딩은 약 55.5℃에서 인지된 단일 전이를 가진 가역적 반응이라는 것을 관찰하였다. 이 전이의 엔탈피는 약 10 kcal/mole인 것으로 계산되었다.

또한, ClfA의 T_m을 0.1 mg/㎖부터 1.0 mg/㎖까지 일관되게 측정될 수 있는 농도의 함수로서 측정하였다. ClfA의 T_m은 단백질 농도의 증가에 따라 변화하지 않는 것을 관찰하였는데, 이것은 ClfA가 주로 단량체로서 존재한다는 것을 암시한다. 이 관찰결과는 하기 본원에 개시된 크기 배제 크로마토그래피 데이터와 일치한다.

또한, ClfA의 T_m을 pH의 함수로서 모세관 DSC로 측정하였다(표 6). 이들 실험에서, ClfA의 T_m은 pH 5.0 내지 8.0 및 약 55℃ 내지 56℃에서 안정기에 도달한다는 것을 관찰하였지만, T_m은 pH의 증가에 따라 하향하는 경향을 나타낸다. pH 4.0에서 ClfA의 T_m은 단지 50.8℃이었는데, 이것은 이 pH에서 ClfA의 구조적 불안정성을 암시한다. 이들 DSC 실험에서, ClfA의 농도는 1.0 mg/㎖이었다. 또한, DSC에 의해 측정된 ClfA의 T_m을 트립토판(Trp) 형광 피크 변동(상기)에 의해 측정된 T_m과 비교하였다. Trp 형광에 의해 측정된 T_m은 pH 4.0 내지 pH 5.5에서 DSC에 의해 측정된 T_m과 일치하였다. 그러나, Trp 형광에 의해 측정된 T_m은 pH가 6.0에서 8.0으로 증가하였을 때 급격히 감소되었다. 가능한 설명은 pH가 6.0에서 8.0으로 증가하였을 때 N3 도메인이 비폴딩된다는 것이다. ClfA에는 2개의 트립토판만이 존재하는데, 이들 둘다가 N3 도메인 상에 위치한다. pH가 6.0에서 8.0으로 증가하였을 때 Trp 형광에 의해 측정된 T_m의 급격한 감소는 이들 잔기가 통상적으로 단백질 비폴딩을 표시하는 보다 강한 극성 환경에 노출되었다는 것을 암시하였다.

ClfA 약물은 예비실리콘화된 예비충전된 주사기로 전달될 수 있다. 주사기 원통 및 플런저 상의 실리콘 오일에 의해 야기되는 단백질 응집을 방지하고 특히 유리 표면에의 단백질 흡착을 방지하기 위해, 폴리소르베이트 80(PS80)이 종종 최종 약물 제제 내에 포함된다. PS80은 단백질을 잠재적으로 불안정화시킬 수 있는 세제이기 때문에, ClfA의 T_m을 PS80의 존재 하에서 평가하였다. 표 7은 폴리소르베이트 80의 존재 또는 부재 하에서 1.0 mg/㎖ ClfA를 사용한 모세관 DSC 실험의 결과를 요약하는데, 이 결과는 PS80의 존재가 PS80을 함유하지 않는 ClfA 제제의 T_m과 통계적으로 유의하게 상이한 온도인 약 1℃까지 ClfA의 T_m을 감소시켰다는 것을 보여주었다.

ClfA의 T_m에 대한 AlPO₄의 효과도 평가하였다. AlPO₄에 결합된 ClfA의 T_m을 측정하기 위해, 0.1 mg/㎖ ClfA를 pH 5.0의 석시네이트-식염수로 제제화하였는데, 이때 대부분의 ClfA가 알루미늄에 결합되었다. 동일한 농도의 인산알루미늄을 함유하는 매칭 완충제에 대한 결합된 ClfA의 T_m을 측정하였다. 이 실험의 결과는 ClfA의 T_m이 비결합된 ClfA(즉, 56.34℃ ± 0.15℃)에 비해 인산알루미늄에 결합되었을 때(즉, 56.16℃ ± 0.12℃) 현저히 변화하지 않았다는 것을 보여주었다.

완충제 종류, 및 약물의 농도 및 이온 강도의 선택을 뒷받침하기 위해, 고염/저염 제제, 및 상이한 농도의 히스티딘 및 석시네이트 완충제의 제제에서 T_m의 변화를 측정하였다. 표 8은 NaCl 농도 또는 석시네이트 완충제 농도가 증가함에 따라 ClfA의 T_m이 증가하였다는 것을 보여주었다. 그러나, ClfA의 T_m은 시험된 히스티딘-식염수 완충제 제제들 중 어느 제제에서도 증가하지 않았다.

ClfA의 T_m에 대한 공지된 약학적 안정화제의 부형제, 예컨대, 당, 폴리올 및 아미노산의 영향을 기본 제제(10 mM 석시네이트 완충제(150 mM NaCl, pH 6.0) 중의 0.6 mg/㎖ ClfA)와 비교하여 스크리닝하였다. 표 9는 ClfA의 T_m의 증가가 CaCl₂, 트레할로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨 및 글루탐산의 농도에 의해 좌우된다는 것을 보여준다. 그러나, 아르기닌은 ClfA의 T_m을 감소시켰다. 프롤린은 ClfA의 T_m에 대한 유의한 효과를 나타내지 않았다. 단백질에 대한 부형제의 효과는 단백질에 의해 좌우되므로, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자는 부형제가 나타낼 효과가 무엇인지를 직관적으로 알지 못할 것이다. 수크로스, 소르비톨, CaCl₂ 및 고농도의 NaCl은 T_m을 증가시켰을 뿐만 아니라 4℃에서 ΔG도 증가시켰다. 표 10은 PS80의 존재 하에서조차 ClfA T_m을 2℃ 내지 3℃ 상승시키는 데 있어서 부형제의 부가적 효과를 보여준다.

결합의 예측자로서 사용될, ClfA 및 AlPO₄의 순 표면 전하를 4.0 내지 8.0의 pH의 함수로서 수득하였다. 본 연구용으로 이용된 완충제 시스템은 아세테이트(pH 4.0 내지 5.0의 경우), 석시네이트(pH 5.5 내지 6.5의 경우) 및 포스페이트(pH 7.0 내지 8.0의 경우)이었다. ClfA의 제타 전위 프로파일은 pH 4.0과 5.0 사이의 어딘가에서 0 전하의 점과 교차한다. (제타 전위는 콜로이드 시스템에서 물질의 계면동전위의 척도이다. 문헌(J. "Fundamentals of Interface and Colloid Science", vol.2, page.3.208, 1995)을 참조한다.) 이것은 ClfA가 낮은 4s에서 pI 값을 보유한다는 사실과 일치한다. 나아가, AlPO₄의 제타 전위 프로파일은 약 5.5 내지 5.8의 그의 pI와도 일치한다는 것을 발견하였다. 따라서, 2종의 물질이 대략 pH 4.5 내지 5.5의 반대 순 전하를 가진 경우 가장 우수한 결합이 일어날 것이다. 로우리 분석은 가장 우수한 결합이 0.020 mg/㎖ 및 0.100 mg/㎖ ClfA 농도 둘다에서 pH 5.0에서 일어났다는 것을 보여주었다. pH 5.0이 가장 낮은 결합을 나타낸 Al(OH)₃ 곡선의 경우에는 반대 경향이 적용되었다. Al(OH)₃은 시험된 임의의 pH 값에서 100% 결합을 결코 달성하지 못하였다.

pH 5.0, 5.5 및 6.0에서 ClfA를 사용하여 AlPO₄ 농도 적정(0.25 mg/㎖, 0.50 mg/㎖, 0.75 mg/㎖) 결합 실험을 수행하였다. 이 실험에 따르면, pH 6.0에서 ClfA는 일관되게 약 50% 결합을 달성함으로써 단백질 농도에 민감하지 않은 것으로 보인 반면, pH 5.0에서 단백질은 AlPO₄의 증가에 수반된 결합의 증가를 보였다. ClfA는 pH 5.0 및 보다 낮은 단백질 농도에서 가장 우수한 결합을 달성한다는 것을 관찰하였고, 이때 결합은 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 나아가, pH 5.5 및 pH 6.0 둘다가 동일한 경향을 보였지만, 결합은 가장 낮은 용량에서조차 이들 pH 값들 중 어느 값에도 적당하지 않았다.

pH 6.0에서 결합을 개선하기 위한 시도에서, 150 mM NaCl, 500 mM NaCl, 300 mM 글라이신, 300 mM 라이신, 20 mM MgCl₂ 및 1 mM EDTA를 포함하는 몇몇 부형제를 선택하여 다양한 NaCl 농도와 함께 시험하였다. pH 6.0에서 ClfA 및 AlPO₄ 둘다가 음으로 하전되기 때문에 부형제들 중 대다수가 그들의 양이온성 특징으로 인해 선택되었다. 변형된 로우리 분석을 이용하여 % 결합된 단백질에 대해 시험하였다. 상기 분석에 따르면, 부형제들 중 어느 부형제도 150 mM NaCl 대조군에 비해 현저한 개선을 보이지 않는다는 것을 관찰하였다.

실시예 3: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 요약

ClfA는 일반적으로 불안정한 단백질인 것으로 간주되는데, 이것은 상기 단백질이 N1 도메인과 N2 도메인 사이에서 용이하게 가수분해되거나 "절단"되어 2개 이상의 단편(N1 도메인을 함유하는 단편 및 N2N3 도메인을 함유하는 또 다른 단편)을 발생시킨다는 것을 의미한다. 안정성은 예를 들면, N1 펩티드 단편 및 N2N3 펩티드 단편을 포함하는 분해 생성물에 비해 실질적으로 비분해된 ClfA를 함유하는 비가수분해된 ClfA의 상대적 양을 의미한다. 실질적으로 비분해된 ClfA의 상대적 양이 많을수록 상기 단백질이 보다 더 안정하다.

(상기) 액체 제제 중의 ClfA 단백질은 크기 배제 HPLC에서 관찰된 바와 같이 N1 도메인과 N2N3 도메인 사이에서 절단되었다는 것을 관찰하였다. 조심스럽게 선택된 부형제를 사용하여 스크리닝한 후, 동결건조를 액체 불안정성에 기초하여 액체 제제화에 대한 대안으로서 연구하였다. 주사용수(WFI)(NaCl을 거의 또는 전혀 함유하지 않음) 중의 10 mM 석시네이트(pH 6.0), 0.01% 폴리소르베이트 80 및 4.5% 수크로스(벌킹제)의 변형된 동결건조 제제를 사용하여 ClfA 약제의 4개 로트를 조사하였다. 모든 4개 로트에 대한 결과는 ClfA의 동결건조된 제제가 실시간 온도 및 가속화 온도(37℃)에서 최대 3개월 동안 상기 단백질을 절단으로부터 성공적으로 안정화시켰다는 것을 보여주었다. 역상 HPLC를 이용한 상기 제제의 분석은 동결건조가 관찰된 시점 전체에서 다른 변형, 예컨대, 탈아미드화 및 산화를 방지하였다는 것을 입증하였다. 또한, 시험관내 효능 시험(즉, 바이오베리스(BIOVERIS) 시험)은 ClfA가 3개월에 걸쳐 그의 효능을 유지하였다는 것을 보여주었다.

또한, 생물물리학적 방법(pH 측정, 칼 피셔 전량측정법에 의한 수분 측정(예를 들면, 문헌(Scholz, Eugen, Fresenius' J. of Anal. Chem., 348 (4): 269-271, Apr. 1994) 참조), OD₃₅₀ 측정, 삼투질농도 측정, 원편광이색법, UV 흡광도 분광분석법, 시차 주사 열량측정법), 분리 방법(HPLC), 및 제제(약물) 및 단백질 자체(약제)에 대한 동결건조의 효과를 모니터링하는 효능(바이오베리스) 시험 방법을 이용하여 동결건조된 약물을 특징규명하였다. 다수의 방법을 이용한 분석은 상기 단백질 특징이 동결건조 전과 동결건조 후에 유사하였다는 것을 암시하였다. 추가로, 교반, 동결-해동 및 부형제 스크리닝 실험을 동결건조 제제화에 대한 예비 최적화로서 수행하였다.

실시예 4: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 동결건조

동결건조 전, 바이알을 650 ㎕의 액체 제제로 충전하였다. 동결건조 후, 분배 부피가 주사기 내의 죽은 공간을 고려하도록 재구성 부피를 주사기로 결정할 필요가 있었다. 이 실험에서, 주사기를 0.55 ㎖, 0.60 ㎖, 0.65 ㎖ 및 0.70 ㎖의 희석제로 충전하였다. 희석제를 동결건조된 바이알 내로 압출하고, 재구성된 액체를 주사기 내로 다시 뽑아내었다. 그 다음, 상기 액체를 분배하고 저울 상에서 중량을 측정하였다. 액체의 밀도가 약 1 g/㎖라고 가정하였을 때, 약 0.5 ㎖의 백신을 환자에게 전달하기 위해서는 상기 바이알이 약 0.65 ㎖의 백신을 함유해야 한다는 것을 확인하였다. 0.5 ㎖ 초과의 부피는 허용가능하지만, 약 0.5 ㎖ 미만의 부피는 바람직하지 않다.

2개의 로트 L36051-81-1 및 L36051-81-2의 동결건조 전 액체 제제의 여과 회수를 SE-HPLC로 모니터링하였다. 이용된 필터는 밀리포어(Millipore) 0.22 ㎛ PVDF 막이었다. 상기 2개의 로트에 대한 ClfA의 회수는 99% 초과의 수준이었다.

본원에서 보고된 모든 제제에 대해 버티스 제네시스(Virtis Genesis) EL35 동결건조기를 이용하였다. 예시적 및 비한정적 동결건조 실행 주기의 파라미터는 표 11에 기재되어 있다. 로트 L36051-44(DS L35812-59)는 어닐링 단계를 포함하지 않는 반면, 나머지 3개의 로트는 어닐링 단계로 제조되었다.

샘플 오븐에 연결된 브린크만(Brinkmann) 전량계를 이용하는 칼 피셔 화학반응을 이용하여 수분을 측정하였다. 건조 질소 기체를 사용하여 수분을 샘플로부터 칼 피셔 셀 내로 운반하였다. 5.5% 건조 수분 표준물을 이용하여 시스템 성능을 모니터링하였다. 상기 오븐을 이용하여 수분 표준물을 230℃에서 측정하였고, 동결건조된 샘플을 115℃에서 측정하였다. 일반적으로, 성공적인 동결-건조 주기는 모든 다른 바람직한 생성물 특징을 보유하면서 최소량의 물을 함유한다.

동결건조 후 제제의 10개 무작위 바이알을 각각의 로트로부터 조사하였고 시각적 특징에 대해 평가하였다. 로트들 사이의 케이크 품질은 유사하였으나, 어닐링 단계를 이용하지 않고 제조한 로트 L36051-44는 어닐링 단계를 포함하는 다른 로트보다 더 큰 수축을 보였다. 전체적으로, 케이크는 우수한 구조 통합성을 나타내는 백색 스폰지처럼 보였다. 1개의 특정 제제 로트(어닐링 단계를 이용함)의 10개 개별 동결건조 생성물의 시각적 특징은 표 12에 묘사되어 있다.

제제의 물리적 특성을 동결건조 전 및 후에 특징규명하였다. 동결건조 후 샘플을 약 630 ㎕ 식염수로 재구성하였다(로트 44를 150 mM NaCl로 재구성한 반면, 다른 로트를 50 mM NaCl로 재구성하였다). 50 mM NaCl을 사용하였을 때 재구성 후 삼투질농도는 약 290 mOsm의 생리학적 목표치에 가까웠다. 동결건조된 케이크를 희석제로 재구성하였을 때 pH 값은 6.0 ± 0.3으로 유지되었다는 것을 관찰하였다. 나아가, 모든 로트의 재구성 시간은 30초 미만이었다. 희석제를 상기 케이크에 첨가하였을 때, 마개를 닫는 동안 질소 재충전의 결과로서 일시적인 미세기포가 발생하였다.

TA 기구 조절된 DSC 기구(TA Instruments Modulated DSC instrument)를 이용하여 동결건조 전 액체의 유리 전이 온도(T_g')를 특징규명하였다. T_g'는 비결정질 고체가 냉각시 높은 수준의 수소결합을 가진 깨지기 쉬운 유리질 상태를 달성하는 온도로서 정의된다. T_g' 초과의 온도에서 보다 높은 분자 유동이 가능하다. T_g'의 실험적 획득은 고품질의 케이크 및 안정한 생성물을 달성하기 위해 동결건조 주기의 최적화에 중요하다. 조절된 DSC 기구는 0℃ 미만의 온도에서 스캔하는 그의 능력으로 인해 T_g' 측정에 이용되었다.

케이크의 유리 전이 온도(T_g') 및 수분 함량은 동결건조 절차의 최적화 동안 고려되었다. 샘플은 동결건조의 어닐링 단계 동안 그의 유리 전이 온도 초과의 온도에서 존재하는 것이 중요하다. 동결건조를 위한 어닐링 단계는 모든 제제에 대해 -34.6℃ ± 0.8℃의 T_g'를 초과하는 -10℃에서 수행되었다. 동결건조 절차가 케이크를 적절히 건조함으로써, 생성물의 안정성 및 저장 수명을 감소시키는 단백질과 물 사이의 반응을 방지하는 것도 중요하다. 동결건조 절차는 모든 제제에서 물이 1% 미만(즉, 0.42% ± 0.19%)으로 존재하게 하였다.

실시예 5: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 열안정성

마이크로칼 VP-시차 주사 열량계(DSC)를 이용하여 ClfA의 고유 열안정성을 특징규명하였다. 10℃부터 100℃까지의 열적 상승은 단백질이 용융하는 온도(T_m), 및 비폴딩(용융) 사건에 필요한 엔탈피의 변화(ΔH)를 보여주었다. 이것은 단백질의 폴딩 특징(즉, 이차 구조 및 삼차 구조), 및 입체구조가 동결건조 후 변화되었는지에 대한 정보를 제공한다.

마이크로칼 모세관 DSC를 이용하는 시차 주사 열량측정법(DSC)을 ClfA의 동결건조 전 로트 및 동결건조 후 로트에 대해 수행하여 제제의 용융 온도(T_m)를 비교하였다. 모든 시험된 로트는 동결건조 전과 동결건조 후에 유사한 T_m 값 및 비폴딩 엔탈피(ΔH)를 보였는데, 이것은 상기 단백질의 전체 폴딩이 동결건조 전후에 변화하지 않는다는 것을 암시한다. 동결건조 전 평균 T_m은 동결건조 후 55.2℃ ± 0.16℃의 평균 T_m에 비해 55.2℃ ± 0.14℃이었다. 동결건조 전 평균 ΔH는 동결건조 후 1.90x10⁶ ± 0.11x10⁶ cal/mole/℃의 평균 ΔH에 비해 1.90x10⁶ ± 0.12x10⁶ cal/mole/℃이었다.

실시예 6: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 항원 이차 구조

원편광이색법(CD)을 이용하여 동결건조 전 및 동결건조 후 각각의 제제에서 단백질의 이차 구조를 평가하였다. 모든 실험을 자스코 J-810 분광편광계 상에서 수행하였다. CD 스캔에 대한 실험 파라미터는 190 nm 내지 260 nm의 파장 범위, 20 nm/분의 스캔 속도, 2초의 반응 시간, 1 nm의 밴드폭 및 3의 축적을 포함하였다. 석시네이트, 수크로스 및 NaCl을 함유하는 동일한 완충제 매트릭스를 배경 차감용으로 사용하였다.

원편광이색법(CD)은 단백질 이차 구조, 예컨대, α-나선 및 β-시트의 스펙트럼 지문(fingerprint)을 제공한다. ClfA의 동결건조 전 로트와 동결건조 후 로트의 비교는 동결건조 전과 동결건조 후에 스펙트럼의 전체 형태가 변화하지 않았다는 것을 보여주었는데, 이것은 모든 로트가 동결건조 및 재구성 절차 전체에서 그들의 이차 구조를 유지하였다는 것을 암시한다.

실시예 7: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 항원 삼차 구조

항원 삼차 구조를 조사하는 또 다른 방법으로서 이차 도함수 UV 흡수 분광분석법을 이용하여 동결건조 전 및 동결건조 후 고유 단백질 안정성을 평가하였다. 아질런트 8453 UV 가시광선 다이오드 배열 분광계를 이용하여 다중파장 UV 가시광선 흡수 스펙트럼을 200 nm 내지 400 nm로부터 수득하였다. 부피가 100 ㎕인 1 cm 경로길이 석영 큐벳을 모든 실험에 사용하였다.

켐스테이션™ 소프트웨어(아질런트)를 이용하여 스펙트럼 분석을 수행하였다. 9점 데이터 필터를 이용하여 이차 도함수 스펙트럼을 획득하여 3도 사비츠키 골레이 다항식에 피팅하였다. 도함수 스펙트럼을 각각 1 nm 간격 사이의 99개 데이터 점으로 내삽하여 비응집 조건 하에서 약 0.01 nm의 효과적인 해상을 제공하였다. 마이크로칼 오리진™ 6.0을 이용하여 도함수 스펙트럼의 피크 위치를 선택하였다. 아미노산 잔기 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판에 상응하는 피크 위치를 확인하고 온도의 함수로서 작도하였다.

4개의 로트 중 3개의 로트(로트 -44, -81-1 및 -81-2)에서, 페닐알라닌/티로신 영역(260 nm 내지 270 nm)의 약간의 차이를 동결건조 후에 관찰하였다. 그러나, 로트 -72는 우수한 오버레이(overlay)를 보였다. 이 로트는 (벌크 매트릭스로부터 운반된) 가장 높은 잔류 NaCl을 함유하였다.

실시예 8: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 구조적 안정성: N1 절단

크기 배제 HPLC를 이용하여 동결건조 전 약물, 재구성된 동결건조 후 약물, 및 안정성 연구 시간에 걸쳐 상이한 온도에서 유지된 재구성된 약물의 초기 품질을 평가하였다. 이 방법은 단량체, 이량체, (이량체보다 더 큰) 올리고머 및 (N1 도메인과 N2N3 도메인 사이에서의 절단으로 인한) 분해물을 포함하는 상이한 크기의 ClfA 종을 검출할 수 있으므로, 동결건조 전 액체 제제의 안정성을 그들의 동결건조된 대응물의 안정성과 비교하는 일차 기법들 중 하나로서 이용되었다.

2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 ClfA의 액체 제제 및 동결건조된 제제의 안정성을 2종의 HPLC 방법으로 모니터링하였다. 크기 배제 HPLC를 이용하여 N1 도메인과 N2N3 도메인의 절단을 검출한 반면, 역상 HPLC를 이용하여 시간의 경과에 따른 상기 단백질의 임의의 화학적 분해(즉, 탈아미드화, 산화)를 모니터링하였다.

도 2a, 2b, 2c 및 2d는 모두 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 항온처리되고 시간의 경과에 따라 SE-HPLC에 의해 모니터링된 4개의 동결건조된 ClfA 로트의 일차 반응속도 도표를 그들의 액체 대응물과 비교하여 보여준다. 결과를 ln[C] 대 시간으로서 작도하였고, 이때 C는 절단된 분해물을 제외한 온전한 항원(이량체 + 단량체)의 농도이다. 모든 4개의 로트는 C의 최소 변화에 의해 표시되는 바와 같이 최대 3개월 동안 상기 모든 세 항온처리 온도에서 동결건조된 생성물의 일관된 안정성을 보인다. 대조적으로, 동결건조 전 액체 샘플은 온도의 증가에 따라 분해의 비례적인 속도 증가를 보인다. 로트 L36051-44 액체 대응물(L36051-37-1)은 10 mM 석시네이트(pH 6.0), 0.01% 폴리소르베이트 80 및 150 mM NaCl을 함유하는 액체 제제(동결건조 전 제제와 대조됨)라는 것을 인식해야 한다(도 2a). 그러나, 온도의 함수로서 로트 -37-1의 전체 경향은 동결건조 전 액체의 전체 경향과 유사하다.

도 3은 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 3개월 동안 저장된 케이크에 비해 t = 0에서 동결건조된 DS L40184-61의 대표적 SE-HPLC 크로마토그램을 보여준다. 적층된 크로마토그램의 프로파일은 이량체 또는 분해물 피크의 겉보기 증가를 갖지 않으면서 동일한 것처럼 보인다. 다른 3개의 동결건조된 로트는 유사한 결과를 보였다.

액체(동결건조 전) ClfA 제제 로트와 동결건조된 ClfA 제제의 비교를 수행하였다. 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 4주 동안 저장된 후 동결건조된 제제를 동결건조 전 액체와 비교하는 대표적 SE-HPLC 크로마토그램이 도 4에 제시되어 있다. 동결건조된 샘플은 상기 모든 세 저장 온도에서 특히 주 단량체 피크의 바로 우측에 있는 분해물 영역 근처에서 우수한 오버레이를 나타내었다. 대조적으로, 액체 제제는 분해물 피크의 현저한 증가를 보였다(도 4, 원형). 추가로, 동결건조된 제제의 피크는 모든 동결건조된 로트에 공통된 특성인 올리고머 피크의 미미한 존재(주 단량체 피크의 좌측에 있음, 도 4)를 보였다.

실시예 9: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 구조적 안정성: 단백질 변형

역상 HPLC는 단백질 품질 및 통합성의 특징규명을 제공하기 위해 종종 이용되는 분석 방법이다. 분석물의 분리는 단백질마다 유의하게 달라질 수 있는, 상이한 종의 소수성 차이에 기초한다. 그 결과, 역상 HPLC 분석은 절단 이외에 전형적으로 관심 있는 단백질과 예를 들면, 단백질 분해물, 서열 변형(예컨대, 탈아미드화 및 산화)을 가진 단백질 및 잔류 숙주 세포 단백질 불순물 사이의 우수한 분리를 제공할 수 있다. 이 분석을 이용하여 안정성 연구에서 시간의 경과에 따른 단백질 품질에 대한 데이터를 제공하였다.

SE-HPLC 데이터와 마찬가지로, 역상 크로마토그램은 새로 제조된 제제와 비교하였을 때 동결건조된 물질에 대한 유사한 프로파일을 37℃, 25℃ 및 2℃ 내지 8℃에서 3개월 후에 보인다.

동결건조된 물질의 안정성 연구의 과정 동안 pH, 수분 및 OD₃₅₀을 모니터링하였다. pH 값은 목표 pH의 ± 0.03 유닛 이내에서 유지되어야 하고, 수분은 3% 미만이어야 한다. OD₃₅₀은 응집된 입자에 의해 산란된 광의 척도이다. 전형적으로, 검출가능한 응집물의 부재는 0.03 미만의 OD₃₅₀ 수치를 회복시킬 것이다. 도 5a, 5b 및 5c는 모든 3종의 파라미터가 3개월에 걸쳐 우수한 안정성을 보인다는 것을 입증하는, 다수의 동결건조된 로트로부터 조합된 데이터이다.

실시예 10: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 바이오베리스에 의해 측정된 효능

시험관내 효능 분석을 이용하여, 안정성 연구에서 선택된 시점에서 ClfA 단백질의 기능성 에피토프의 지속성을 평가하였다. 이를 위해 바이오베리스 플랫폼을 이용하였다. 이 분석에서, 1종의 단일클론 항체(mAb 12-9)가 항원을 포획하는 데에 사용되었고 상이한 에피토프에 대해 발생된 또 다른 단일클론 항체(mAb 15EC6)가 항원의 존재를 ECL 검출로 검출하는 데에 사용된 샌드위치 포맷을 이용하였다. 단일클론 항체 12-9는 ClfA의 N3 도메인을 인식하여 이 도메인에 결합하는 항체인 반면, mAb 15EC6은 ClfA의 N2 도메인을 인식하여 이 도메인에 결합한다.

바이오베리스 항체 경쟁 분석 시스템을 이용하여 로트 L36051-81-1(DS L40184-61) 및 L36051-81-2(DS L40184-62)에서 최대 3개월 동안 ClfA의 효능을 모니터링하였다. 동결건조된 제제 및 동결건조 전 액체 제제 둘다가 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 3개월의 기간에 걸쳐 효능의 감소를 전혀 보이지 않았다.

실시예 11: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 부형제의 효과

ClfA의 안정성을 확립한 후, (1) 제제 성분에 대한 요건을 설정하고, (2) 케이크 외관을 최적화하는 부형제를 스크리닝하고, (3) 공정 디자인 면에서 제제화 절차를 이해하고, (4) 약제 및 약물의 동결-해동 내성을 조사하기 위한 추가 연구를 계획하였다.

수크로스 함량을 3% 내지 4.5% w/v부터 6% w/v까지 변경하면서 0.2 mg/㎖ ClfA 및 10 mM 석시네이트(pH 6.0)를 함유하는 동결건조 완충제 매트릭스에서 폴리소르베이트 80(PS80) 적정을 수행하였다. PS80 농도는 0% 내지 0.005% v/v부터 0.01% v/v까지 변경되었다. (1) 동결건조 전 액체 제제에서 폴리소르베이트에 대한 필요성을 확인하고, (2) 동결건조 전 액체 제제에서 폴리소르베이트에 대한 요구 농도를 설정하고, (3) 동결건조 전 액체 제제에서 수크로스에 대한 요구 농도를 설정하기 위해 이 실험을 수행하였다.

PS80 및 수크로스 농도를 변경하면서 교반 실험을 수행하였다. 도 6a, 6b 및 6c는 L40184-61(200 ㎍/㎖ ClfA, 6% 수크로스, 10 mM 석시네이트(pH 6.0), 0.005% PS80) 및 L401840-62(200 ㎍/㎖ ClfA, 4.5% 수크로스, 10 mM 석시네이트(pH 6.0), 0.01% PS80) 제제를 실온에서 24시간 동안 교반한 후 SE-HPLC로 측정한 % 이량체, % 단량체 및 % 분해물(절단) 결과를 보여준다. PS80을 함유하지 않는 제제는 t = 0 샘플에 비해 상대적으로 교반 후 % 이량체 형성의 증가를 나타내었다(도 6d). 심지어 가장 낮은 양의 PS80(0.005%)의 존재 하에서, 이량체화의 양은 t = 0에서의 이량체화의 양보다 더 적었는데, 이것은 PS80이 제제에 유리하였다는 것을 암시한다. 나아가, "PS80 무함유" 대조군의 SE-HPLC 분석은 교반 후 (이량체보다 더 큰) 고차 올리고머의 존재를 보인 반면, PS80을 함유하지 않는 샘플은 그러하지 않았다. 따라서, 폴리소르베이트 80에 대한 권장 수준은 0.01 ± 0.005%에서 확립되었다. 다양한 양(3%, 4.5% 및 6%)의 수크로스는 SEC 데이터에서 어떠한 차이도 보이지 않았다. 또한, % 단량체 및 % 분해물은 PS80의 존재 또는 부재, 또는 다양한 양의 수크로스에 의해 크게 영향을 받는 것으로 보이지 않았다.

다양한 부형제가 제조 공정의 제제화/혼합 단계 동안 ClfA에 대한 불리한 효과를 나타낼지를 확인하기 위해 혼합 연구를 수행하였다. 상기 다양한 부형제는 0% 및 5%의 수크로스, 0% 및 5%의 트레할로스, 및 수크로스와 만니톨의 조합물(4% 수크로스 및 1% 만니톨)을 포함하였다. 부형제는 동결건조에서의 그들의 통상적인 사용에 기초하여 선택되었다. 이들 실험의 경우, 제제 기제는 0.3 mg/㎖ ClfA, 10 mM 석시네이트(pH 6.0) 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하였다. 샘플을 제제화하여 2℃ 내지 8℃에서 밤새 저장하였고, 다음날 아침 연구를 시작하였다. 웨스트(West) 4432 회색 부틸 마개를 가진 30 ㎖ 쇼트 1형 유리 바이알 내에 제제를 넣고 VWR 마이크로플레이트 진탕기 상에 올려놓았다. 상기 바이알을 실온에서 연속 500 RPM으로 혼합하고 t = 0시간, 2시간, 4시간, 8시간 및 24시간에서 샘플링하였고, 이때 SE-HPLC가 일차 분석으로서 이용되었다.

여러 개의 로트((L36051-96-1, L36501-96-2, L36051-96-3, L36051-96-4, L36051-100-1 및 L36051-100-2)를 혼합 연구에서 조사하여, 수크로스, 트레할로스 및 수크로스/만니톨이 실온에서 24시간 동안 혼합되었을 때 ClfA의 안정성에 영향을 미치는지를 확인하였다. 도 7a, 7b 및 7c는 시간의 경과에 따라 각각의 제제에 대해 SE-HPLC에 의해 보고된 % 분해물(절단), % 이량체 및 % 단량체를 나타낸다. 수크로스 단독 샘플 및 수크로스/만니톨 샘플을 사용한 경우에는 주요 분해가 관찰되지 않았지만, 트레할로스 제제는 분해의 유의한 향상을 보였다. 수크로스 단독을 사용하는 ClfA의 2개 DS 로트에 대한 이량체화 속도는 유사하였으나, 이량체의 로트 의존적 증가가 트레할로스 및 수크로스/만니톨을 사용한 경우에서 관찰되었다. 단량체의 변화는 분해물 및 이량체의 변화를 반영하였다.

수크로스, 메티오닌, 글라이신 및 만니톨의 다양한 조합물을 ClfA와 함께 제제화한 후 가속화 안정성 시험으로 ClfA 안정성에 대해 시험하였다. 가속화 안정성 시험은 계획된 저장 온도보다 더 높은 온도에서 제제(액체 또는 동결건조된 제제)를 저장하는 단계 및 분해의 징후에 대해 시간의 경과에 따라 ClfA 단백질을 모니터링하는 단계를 포함한다. 동결건조된 ClfA의 경우, 권장된 저장 온도는 2℃ 내지 8℃이므로, 25℃ 및 37℃는 "가속화" 조건으로서 간주될 것이다. 0.300 mg/㎖의 ClfA, 10 mM 석시네이트(pH 6.0) 및 폴리소르베이트 80을 각각 함유하고 수크로스, 메티오닌, 글라이신 및 만니톨의 다양한 조합물을 함유하는 8개의 제제(표 13 참조)를 만들어, (1) ClfA의 동결건조 전 액체 안정성, (2) 동결건조된 케이크의 안정성 및 (3) 동결건조된 케이크 외관에 대한 그들의 효과를 조사하였다. 메티오닌은 단백질의 산화를 방지하는 그의 능력으로 인해 선택되었고, 글라이신은 배제된 부피를 통한 그의 일반적 안정화 특성으로 인해 선택되었고, 만니톨은 케이크 외관을 개선하는 그의 성향으로 인해 선택되었다. 액체 제제에 대해 가속화 안정성 시험을 수행하고 상기 액체 제제를 1주에 걸쳐 SE-HPLC로 모니터링하고 2주에서 RP-HPLC로 모니터링하였다. 동결건조된 케이크를 2℃ 내지 8℃ 및 37℃에서 저장하였고 2개월 동안 모니터링하였다. 수크로스만을 사용한 제제에 비해 상대적으로 케이크 외관을 시각적으로 평가하였다.

1주 후 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 액체 샘플에 대한 크기 배제 데이터는 조사된 부형제들 중 어느 부형제도 수크로스 단독 대조군(제제 -109-1)에 비해 (절단의 관점에서) ClfA의 안정성을 개선하지 못한다는 것을 보여주었다. t = 0에서, 모든 제제는 매우 유사한 프로파일을 가졌다. 모든 제제는 분해 생성물에 의해 야기된, 주 피크의 측면에 존재하는 보다 작은 피크의 동시적인 증가와 관련된 주 피크 높이의 약간의 손실을 온도의 함수로서 보여주었다. 다양한 부형제의 존재가 수크로스 단독 제제에 비해 어떠한 현저한 개선도 보이지 못한다는 것을 관찰하였다.

추가로, 제제를 동결건조하고 케이크 외관에 대해 조사하였다. 수크로스 단독 대조군과 비교하였을 때, 시험된 비율에서 부형제들 중 어느 부형제도 케이크의 시각적 품질의 어떠한 개선도 제공하지 못하였다. 또한, 동결건조된 케이크에 대해 안정성 시험을 수행하고 2℃ 내지 8℃ 및 37℃에서 2개월 후 SE-HPLC로 분해(절단)에 대해 조사하였다. 결과는 모든 제제가 안정하였다는 것을 보여주었다.

실시예 12: ClfA 동결건조된 약물의 제제화: 동결-해동

ClfA 단백질의 여러 개 로트(즉, L40184-63, L40184-64 및 L40184-65)에 대한 동결-해동 연구를 수행하였다. 제제는 0.2 mg/㎖의 ClfA, 10 mM 석시네이트(pH 6.0), 4.5% w/v 수크로스 및 0.01% v/v 폴리소르베이트 80을 포함하였다. 상기 연구는 3개의 부분으로 나누어졌다: (1) 비제제화된 ClfA(약제)의 3회 동결-해동; (2) 제제화된 ClfA(약물)의 3회 동결-해동; 및 (3) 3회 동결-해동되고 각각의 해동 후 약물로 제제화된 약제. SE-HPLC를 이용하여 분석을 수행하였다.

본 연구의 목적은 다회 동결-해동 후 약제 및 약물로서 상기 단백질의 안정성을 평가하는 것이었다. 각각의 해동 후 SE-HPLC를 이용하여 샘플을 분석함으로써 ClfA의 분해(절단)의 임의의 변화를 검출하였다. 3회 동결-해동 사건은 조사된 3개의 로트 중 2개의 로트에 대해 3차 해동에 의한 분해의 증가를 보이지 않았다는 것을 관찰하였다. 특히, 1개의 로트는 다른 로트보다 더 큰 분해의 변화를 보였다.

실시예 13: ClfA/CP5/CP8(3종-항원) 동결건조된 약물의 제제화

동결건조에 의한 ClfA 안정화의 성공에 기초하여, ClfA를 CP5 및 CP8 스타필로코커스 항원 및 CRM 접합체와 조합하여 추가 약물을 제제화하였다. (동결건조 전 또는 재구성 후) 액체 제제의 몇몇 실시양태는 0.5 ㎖의 약물 당 200 ㎍의 rClfAm, 및 각각 100 ㎍의 CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체를 함유한다. 몇몇 실시양태에서, 액체 제제는 0.5 ㎖의 약물 당 100 ㎍의 rClfAm, 및 각각 50 ㎍의 CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체를 함유한다.

수크로스, 만니톨 및 트레할로스를 포함하는 다양한 벌킹제를 평가하였다. 수크로스는 혼합 연구에 기초할 때 가장 우수한 안정성, 케이크 외관 및 단기간 액체 안정성을 제공한다는 것을 관찰하였다.

다양한 pH에서 3개의 로트에 기초한 액체 제제의 단기간 가속화 안정성은 pH 6.0이 최적 pH라는 것을 암시하였다. CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체는 5.0 내지 7.0의 pH 범위 내에서 안정하였다.

pH 6 근처에서 완충하는 다양한 완충제 시스템(석시네이트 및 히스티딘을 포함함)을 시험하였다. 히스티딘 또는 석시네이트 완충제를 사용하였을 때 rClfAm의 용융 온도(T_m)의 차이는 관찰되지 않았다. 상기 두 완충제는 CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체와 상용가능하였다. 10 mM 석시네이트 완충제(pH 6.0)를 향후 사용을 위해 선택하였다.

폴리소르베이트 80(PS80)을 교반 연구에서 잠재적 안정화제로서 시험하였다. 교반 연구는 일반적으로 이량체 또는 고차 올리고머를 증가시킬 수 있는 수송의 전단 및 응력을 모방한다. 이들 실험의 결과는 PS80이 ClfA의 응집을 방지한다는 것을 암시한다. 0.01%(0.005% 내지 0.15%) 폴리소르베이트 80을 향후 사용을 위해 선택하였다.

동결건조된 생성물의 재구성을 위해, 생리학적 삼투질농도(즉, 250 mOsM 내지 300 mOsM)를 달성하는 희석제를 선택하였다. 한 실시양태에서, 60 mM NaCl을 희석제로서 선택하였다. 재구성 후 0.5 ㎖ 용량을 전달하는 능력에 기초하여, 바이알 당 0.64 ㎖ 내지 0.66 ㎖의 충전 부피를 선택하였다. 0.64 ㎖ 내지 0.66 ㎖의 재구성된 부피가 0.5 ㎖의 용량을 전달하도록, 주사기 당 0.66 ㎖ 내지 0.68 ㎖의 충전 부피를 선택하였다.

생리학적 삼투질농도에 가까운 약 300 mOsM을 달성하기 위해 동결건조된 3종-항원 케이크를 재구성함에 있어서 희석제 제제가 60 mM에서 최적인 것으로 확인되었다. 상기 제제 중의 4.5% 수크로스는 액체 약물의 삼투질농도에 상당히 기여하여 임의의 추가 염 없이 약 200 mOsM의 삼투질농도가 달성되게 한다. 용융 백(back) 또는 수축을 갖지 않는 백색 솜털 형태의 케이크로서, 60 mM NaCl을 사용한 재구성시 6.0 ± 0.3의 pH를 갖는 투명한 용액을 생성하는 케이크를 발생시키도록 동결건조 파라미터를 선택하였다.

실시예 14: 3종-항원 약물의 제제화 방법

10 mM 석시네이트(pH 6.0), 4.5% 수크로스 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 포함하는 예시적 액체 제제를 제조하고 밀리포어 0.22 ㎛ PVDF 막으로 여과하고 2 ㎖ 바이알 당 650 ㎕씩 분취하고 후술된 주기를 이용하여 동결건조하였다. 희석제로서 60 mM NaCl을 사용하여 예비충전한 주사기를 이용하여, 동결건조된 케이크를 재구성하였다.

한 실시양태에서, 액체 제제를 다음과 같이 조립하였다: (a) 25% 수크로스, 100 mM 석시네이트(pH 6.0), 1% PS80 및 WFI를 조합하여 10 mM 석시네이트, 4.5% 수크로스 및 0.01% PS80을 수득하였다. (b) 적당한 양의 rClfAm, CP5 접합체 및 CP8 접합체를 (a)의 혼합물에 첨가한 후, (c) 0.22 ㎛ 필터를 통해 멸균하였다. (d) 동결건조 바이알을 0.65 ㎖ ± 0.1 ㎖의 여과된 용액으로 각각 충전하고, (e) 표 14의 파라미터에 따라 동결건조하고, (f) 마개를 닫고, (g) 밀봉하고, (h) 표지하였다. 동결건조된 약물을 2℃ 내지 8℃에서 저장하였다.

활성 성분 및 불활성 성분이 제제화 공정, 여과 후 회수 및 동결건조에 미치는 영향을 확인하기 위해 2종의 실험 디자인을 수행하였다. 핵심 변수는 rClfAm, CP5 접합체 및 CP8 접합체의 농도(±30% 목표)이었다. 제제화부터 동결건조까지 이들 성분의 전체 회수는 모든 제제의 경우 95% 초과의 수준인 것으로 확인되었다. (디자인 엑스퍼트(DESIGN EXPERT) 소프트웨어를 이용한) 데이터 분석은 하기 사항을 암시하였다: (a) rClfAm 순도는 분석 한계 내에서 rClfAm의 농도에 의해 영향을 받지 않고, 이때 저용량(70 ㎍/㎖)은 약 93%의 측정된 최대 순도를 나타내었고, 고용량(520 ㎍/㎖)은 약 97%의 측정된 최대 순도를 나타내었고; (b) CP5 접합체 및 CP8 접합체의 농도는 개별 접합체의 회수에 영향을 미칠 수 있으나, 그럼에도 불구하고 분석 성능 내에서 유지되고; (c) 모든 3종의 성분은 PS80 농도에 의해 영향을 받지 않는다. 결과는 표 15에 제시되어 있다.

다른 실험에서, pH(5.7 내지 6.3(이때, 목표는 6.0임)), 석시네이트(5 mM 내지 15 mM(이때, 목표는 10 mM임)), 폴리소르베이트 80(0.005% 내지 0.15%(이때, 목표는 0.01%임)) 및 수크로스(3.0% 내지 6.0%(이때, 목표는 4.5%임))를 제제에서 변경시켰다. 표 16에 제시된 결과는 활성 약물에 대한 허용 기준(rClfAm(397 ± 6.7 ㎍/㎖), CP5-CRM₁₉₇ 접합체(179.8 ± 64.0 ㎍/㎖) 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체(188.2 ± 10.5 ㎍/㎖))이 조절 범위 내에 있다는 것을 보여준다.

대표적 제제 로트의 데이터는 표 17 및 18에 제시되어 있다. 3개의 대표적 로트를 제제화하고 충전하고 고용량(400 ㎍/㎖의 rClfAm, 및 각각 200 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체) 및 저용량(200 ㎍/㎖의 rClfAm, 및 각각 50 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 접합체 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체)으로 동결건조하였다. 제제는 순도, 강도, 수분, 외관 및 pH에 대한 목표 허용 기준 내에 있다. 이들 데이터를 이용하여 중간 수준 용량을 브래키팅하였다.

실시예 15: 3종-항원 약물 안정성

동결건조된 3종-항원 제제의 6개 로트에 대한 안정성 분석을 수행하였다. 핵심 분석들 중 몇몇은 rClfAm 강도 및 순도 분석을 위한 역상 크로마토그래피(예를 들면, RP-HPLC), 및 CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇ 강도 분석을 위한 비탁법이었다. 동결건조된 케이크를 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에 놓아두고 선택된 시점에서 분석하였다. 케이크를 시험 직전에 재구성하였다. 시험 결과는 건조된 형태로 4주 경과 후 rClfAm의 강도(농도) 또는 순도 및 상기 접합체의 강도(항원성)의 변화가 없음을 보여준다(도 8 및 9). rClfAm 농도 및 순도, 및 CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇ 농도(항원성)도 3개월만큼 긴 기간 동안 각각 RP-HPLC 및 비탁법으로 측정하였다. 2℃ 내지 8℃에서 저장된 샘플에 대해 수행된 선형 회귀 분석은 상기 샘플이 최소 6개월 동안 안정하다는 것을 보여준다(도 8 및 9). 샘플을 고용량 (L36686-3-1 및 L36686-25) 및 저용량(L36686-3-2 및 L360510195-2) 둘다에서 시험하였다(표 19 내지 22).

단기간 안정성 분석도 수행하였다. 동결건조된 3종-항원 제제를 60 mM NaCl 희석제로 재구성하고 실온에서 다양한 시간 동안 항온처리하였다(이때, t = 0시간, 4시간 및 24시간 시점에서 rClfAm 강도 및 순도, 및 CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇ 강도를 분석하였다)(표 23 내지 25). 고용량(400 ㎍/㎖의 rClfAm, 200 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 및 200 ㎍/㎖의 CP8-CRM₁₉₇) 및 저용량(200 ㎍/㎖의 rClfAm, 및 각각 50 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇) 제제를 조사하였다. 상기 두 용량은 도 10에서 보이는 바와 같이 (재구성 후) 실온에서 24시간에서 성분의 안정성을 보여준다.

동결-해동 연구도 수행하였다. 고용량 3종-항원 약물(400 ㎍/㎖의 rClfAm, 200 ㎍/㎖의 CP5-CRM₁₉₇ 및 200 ㎍/㎖의 CP8-CRM₁₉₇)에 대해 3회 동결-해동 주기를 수행하고 rClfAm 강도 및 순도, 및 CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇ 강도에 대해 분석하였다. 사실상 농도의 변화가 각각의 성분에 대해 관찰되지 않았는데, 이것은 상기 약물의 활성 성분이 상기 3회 주기에 걸쳐 안정하다는 것을 암시한다(도 11 및 표 26).

실시예 16: ClfA/CP5/CP8/MntC(4종-항원) 약물: ClfA의 특징규명

상기 3종-항원 제제 중의 ClfA의 성공적인 안정화는 스타필로코커스 아우레우스 MntC 단백질을 추가로 포함하는 제제의 개발로 이끌었다. 추가로, 응괴 인자 A는 T7 태그 부착된 버전(rClfAm)으로부터 상기 태그를 갖지 않는 응괴 인자 A(rmClfA)로 갱신되었다. CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇은 담체 단백질 및 폴리사카라이드 반복 유닛의 관점에서 동일한 상태로 유지되었다.

약물의 성분에 대한 다양한 변화로 인해, 체계적이고 합리적인 방법을 이용하여 모든 4종의 활성 성분과 상용가능한 신규 약물을 제제화하였다. 활동은 항원의 제제화 전 특징규명, 제제 성분에 대한 근거의 구축, 제제화된 약물의 안정성 및 강인성(robustness)의 입증, 및 제제화 공정의 개발을 포함하였다. 연구는 하기 용량에 맞춰 디자인되었다:

1. 400/400/200/200 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇, 및

2. 200/200/100/100 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇.

다수의 오르토고날(ortogonal) 방법(원편광이색법, 형광, 모세관 시차 주사 열량측정법 및 OD₃₅₀)을 이용한 생물물리학적 특징규명을 rClfAm의 2개 로트(L40184-77 및 L40256-26; 매트릭스: 10 mM 석시네이트(pH 6.0), 20 mM NaCl) 및 rmClfA의 2개 로트(L40227-36 및 L40256-28; 매트릭스: 10 mM 히스티딘(pH 6.5))에 대해 수행하였다. 수득된 데이터는 1) rClfAm과 rmClfA의 유사성 및 2) 각각의 rClfA 구축물 내에서 로트-대-로트 일관성을 보여주었고, 3) 향후 사용될 pH 작업 범위에 대한 골격을 제공하였다.

원편광이색법(CD)은 pH 6.0 및 7.0에서 rClfA의 다양한 로트를 비교하기 위한 수단으로서 이용되었다(도 12). 상기 두 pH에서 CD 스캔은 rClfAm 및 rmClfA의 모든 시험된 로트가 스펙트럼의 오버레이에 기초할 때 유사한 이차 구조를 가진다는 것을 보여주었다. 또한, 상기 단백질의 CD 용융을 수행하여 상기 로트의 열안정성을 pH의 함수로서 비교하였다. 도 13에서 보이는 결과는 모든 로트가 이차 구조 면에서 유사하다는 것을 보여준다. 또한, 상기 결과는 pH 5.0 내지 7.0이 이 방법에 기초한 최적 제제화 범위라는 것을 암시하였다.

고유 트립토판 형광을 이용하여 rClfAm 및 rmClfA의 삼차 구조에 대한 정보를 수득하였다. 상기 두 단백질의 로트에 대한 형광 용융을 수행하여 열안정성을 pH의 함수로서 평가하였다. rClfA가 상기 단백질의 동일한 N3 도메인 상에 위치하는 2개의 트립토판을 보유하므로, 이 방법에 의해 제공된 데이터는 이 영역으로 국한된다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 도 14a는 rClfA의 모든 시험된 로트가 유사한 열안정성을 보유한다는 것을 보여주는데, 이것은 구조도 유사하다는 것을 암시한다. 소수성 염료인 8-아닐리노-1-나프탈렌 설포네이트(ANS)를 사용하여 다수의 rClfA 로트에 대한 비고유 형광 용융도 수행하였다. 단백질 구조가 온도의 증가에 따라 비폴딩되기 때문에, ANS는 단백질의 새로 노출된 소수성 패치에 결합하여 방출 강도를 증가시킨다. 도 14b에서, 모든 시험된 단백질 로트에 대한 ANS 신호에 기초한 용융 온도는 pH의 함수로서 유사하다. DSC 데이터는 rClfA의 모든 시험된 로트의 용융 온도가 pH의 함수로서 유사하고(도 15) pH 5 내지 7이 향후 사용될 우수한 범위라는 것을 확인시켜주었다. 또한, OD₃₅₀을 이용하여 온도 및 pH의 함수로서 응집을 모니터링하였다(도 16). pH의 함수로서 rmClfA 로트 L40256-29(매트릭스: 10 mM 히스티딘(pH 6.5))의 용융은 이 방법에 의해 검출된 응집 사건만이 pH 4.0에서 일어난다는 것을 보여주었다.

2개의 약제 로트(L40256-28 및 L40256-29)를 사용하여 석시네이트보다 오히려 히스티딘에서 rmClfA의 액체 안정성을 pH의 함수로서 평가하였다. 제제는 400 ㎍/㎖ rmClfA, 10 mM 히스티딘(5.5 내지 7.5의 pH 범위), 4.5% 수크로스 및 0.01% 폴리소르베이트 80으로 구성되었다. 2개의 추가 제제는 히스티딘(pH 6.5)과 비교하기 위한 10 mM 석시네이트(pH 6.5) 및 높은 pH를 조사하기 위한 10 mM 포스페이트(pH 8.0)로 구성되었다(이들 두 제제는 4.5% 수크로스 및 0.01% PS80도 함유하였다). 크기 배제 HPLC를 이용하여 25℃에서 6주 동안 rmClfA의 절단을 모니터링하였다. 결과는 pH 약 6.5의 히스티딘이 -28 로트 및 -29 로트 둘다에서 가장 느린 분해 속도를 나타내었다는 것을 보여주었다(도 17a). 이 속도는 석시네이트(pH 6.6) 제제의 속도와 일치하였는데, 이것은 히스티딘이 석시네이트만큼 rmClfA와 상용가능하다는 것을 암시한다. 나아가, 모든 제제에 대한 pH는 안정한 상태로 유지되었고, 연구 전체에서 응집이 OD₃₅₀에 의해 검출될 수 없었다(도 17b).

실시예 17: 4종-항원 약물: MntC의 특징규명

가수분해를 통해 분해되기 쉬운 ClfA와 달리, MntC는 탈아미드화에 의해 분해된다. 따라서, 일정한 pH 범위에 걸쳐 MntC의 안정성을 측정하는 것이 중요하였다. MntC를 사용하여 수행한 고유 트립토판 형광 실험은 40℃ 내지 55℃에서 T_m1을 갖고 65℃ 내지 75℃에서 T_m2를 가진 2종의 주요 사건이 일어났다는 것을 암시하였다(도 18). T_m1을 추적하였을 때, pH 7.0 다음으로 pH 5.0 및 pH 6.0이 가장 높았다. 데이터는 5.0 내지 7.0의 작업 pH 범위를 암시하였다. 대표적 MntC 로트를 사용한 DSC도 수행하였다. 대표적 온도기록도는 추가로 규명될 수 있는 2종의 주요 열적 사건을 보여준다(도 19). 제1 용융 온도(T_m1)를 추적하였을 때, pH 7.0 다음으로 pH 5.0 및 pH 6.0이 가장 높은 열안정성을 가진다는 것이 분명하다(도 19). 형광 결과와 일치하여, 이들 데이터는 5.0 내지 7.0의 작업 pH 범위를 암시하였다. OD₃₅₀ 데이터도 이들 관찰결과를 뒷받침한다(도 20). IEX-HPLC에 의한 탈아미드화 분석은 높은 pH 및 높은 온도가 MntC의 탈아미드화 속도를 증가시켰다는 것을 확인시켜주었다.

실시예 18: 4종-항원 약물: 제제 개발(완충제)

전술된 3종-항원 제제에서, CP5 접합체 약제 및 CP8 접합체 약제는 pH 7.0의 석시네이트에서 제공되었다. 그러나, 석시네이트 완충제 시스템은 보다 낮은 pH에서 우수한 완충 성능을 제공하지 못하였다. 따라서, 10 mM 히스티딘(pH 6.7)에서 재제제화된 CP5 접합체 및 CP8 접합체를 사용하여 실험을 수행하였다. 접합체 약제가 6.5 미만의 pH에서 잘 여과되지 않아 여과를 늦추고 접합된 단백질을 손실시키기 때문에, 6.5보다 더 높은 pH가 바람직하였다. 이것은 히스티딘 중의 rmClfA, MntC 및 약물 제제를 균일성에 대해 평가하는 동력이 되었다.

제제화 전 특징규명 연구로부터, rmClfA 및 MntC 둘다에 대한 pH의 작업 범위가 5 내지 7이라는 것이 확인되었다. 접합체 DS 매트릭스를 히스티딘으로 변화시키는 것은 약물 중의 이 완충제 시스템의 평가를 필요로 하였다. 최적 제제 pH를 확립하기 위해 4종-항원 제제로서 항원의 분해 속도를 시간의 함수로서 평가하였다. 교반 실험을 수행하여 상기 제제 중의 계면활성제에 대한 필요성을 확인하였다. 동결건조를 기대하면서, 안정화제 및 벌킹제를 항원과의 상용가능성에 대해 평가하였다.

400/400/200/200 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇로 구성된 고용량 4종-항원 제제를 히스티딘 완충제에서 pH의 함수로서 제조하였다. RP-HPLC를 이용하여 rmClfA 단백질의 분해를 검출하였고, IEX-HPLC를 이용하여 MntC의 탈아미드화를 검출하였다. 도 21은 상기 2종의 단백질의 대표적 크로마토그램, 및 이들이 분해된 종에 대해 어떻게 모니터링되었는지를 보여준다. rmClfA의 경우, 절단된 단백질 단편이 주 단백질 피크의 우측에서 나타난 반면, MntC의 경우, 탈아미드화된 피크가 상기 주 피크의 좌측에서 발견될 수 있다. 상기 단백질 둘다가 25℃에서 시간의 경과에 따른 분해로서 도 21에 제시되어 있다.

제제의 안정성을 2℃ 내지 8℃에서 0주, 1주 및 2주 동안 모니터링하였고 25℃에서 0일, 3일 및 7일 동안 모니터링하였다. 25℃에서, rmClfA는 pH의 증가가 상기 단백질의 절단 속도를 감소시킨다는 것을 보여주었다(도 22a 및 22b). 대조적으로, pH의 증가는 MntC 탈아미드화의 속도를 감소시켰다(도 22c 및 22d). pH 의존적 경향이 일관되게 유지되었지만, 상기 기작 둘다가 2℃ 내지 8℃에서 유의하게 억제된다.

2℃ 내지 8℃ 및 25℃에서 상이한 pH에서 비탁법을 이용하여 CP5-CRM₁₉₇ 접합체 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체의 항원성을 모니터링하였다. 2℃ 내지 8℃에서, 상기 접합체 둘다가 2주 실험 기간 동안 항원성을 유지하였다(도 23a 및 23b). 25℃에서, CP5-CRM₁₉₇은 1주 후 변화를 전혀 보이지 않았으나, CP8-CRM₁₉₇은 pH 5.5에서 약 18%의 항원성 감소를 보였다(도 23c 및 23d).

실시예 19: 4종-항원 약물: 제제 개발(벌킹제)

400/400/200/200 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇을 포함하고 1) 4.5% 수크로스, 2) 4.5% 트레할로스, 3) 3% 만니톨/1%의 수크로스, 4) 3% 만니톨/1% 트레할로스, 5) 3% 글라이신/1%의 트레할로스, 6) 3% 글라이신/1% 트레할로스, 및 7) 4.5% 수크로스(PS80 무함유)를 함유하는 제제를 안정성에 대해 시험하였다. 모든 제제가 10 mM 히스티딘 및 0.01% 폴리소르베이트 80을 함유하였고(제제 7을 제외함), 이때 상기 제제의 측정된 pH는 6.3이었다. 상기 제제의 분취액을, 플루로텍(Flurotec)으로 코팅된 4432/50 마개를 가진 쇼트 1형 2 ㎖ 바이알로 옮겼고, 상기 바이알을 실온에서 6일 동안 약하게 락킹하였다.

모든 락킹 후 샘플의 OD₃₅₀ 측정은 응집된 종의 증가를 전혀 보이지 않았다(도 24b). 삼투질농도 측정은 글라이신 함유 제제가 290 mOsm의 생리학적 삼투질농도를 초과하는 값을 가졌다는 것을 보여주었다(도 24a). ClfA 및 MntC에 대한 회수율은 98% 초과의 수준이었고, CP5-CRM₁₉₇에 대한 회수율은 95% 초과의 수준이었고, CP8-CRM₁₉₇에 대한 회수율은 93% 초과의 수준이었고, 이들 값은 모두 분석 변수 내에 있었다. MntC의 탈아미드화를 모니터링하기 위한 IEX-HPLC 분석은 6일 동안의 락킹 후 증가를 보였지만, 모든 제제는 유사한 속도를 보였는데, 이것은 특정 부형제 또는 부형제 조합물이 공정을 개선하거나 가속화하지 못한다는 것을 암시한다. 최종적으로, MntC 및 rmClfA의 RP-HPLC 분석은 크로마토그램 프로파일에서 유의한 변화를 보이지 않았다.

글라이신 함유 샘플은 높은 삼투질농도로 인해 부형제 후보 목록으로부터 제거되었다. 수크로스, 트레할로스, 만니톨 및 글라이신은 표 27의 제제에 의해 기재된 바와 같이 동결건조된 생성물로서 평가되었다. 제제를 동결건조하고 각각의 제제를 2℃ 내지 8℃, 25℃, 37℃ 및 50℃에서 안정성에 대해 시험하였다. 도 25a에서 고용량에 대한 RP-HPLC 데이터는 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 1개월 후 변화를 보이지 않았다. 50℃에서, rmClfA는 전방 숄더(front shoulder) 피크의 증가를 보였고, 이때 만니톨/수크로스 제제가 가장 큰 변화를 나타내었다. 또한, MntC의 전방 숄더 피크는 만니톨/수크로스 제제에서도 증가하였다. 저용량의 경우, 상기 두 rmClfA 전방 숄더 피크에서 변화를 관찰하였으나, 만니톨/수크로스 제제는 다시 보다 큰 증가를 나타내었다(도 25b).

또한, IEX-HPLC를 이용하여 MntC의 품질을 모니터링하였다. 도 25c에서, 고용량에 대한 2℃ 내지 8℃ 안정성 샘플은 1개월 후 어느 제제에서도 변화를 보이지 않는다. 25℃ 및 37℃에서 유지된 샘플은 유사한 결과를 제공하였다(사진촬영하지 않았음). 그러나, 50℃에서, 고용량 및 저용량 둘다 만니톨/수크로스 조합물에 대한 프로파일에서 가장 큰 변화를 보였다. CP5 접합체 및 CP8 접합체에 대한 비탁법 결과는 1개월 후 임의의 온도에서 항원성의 어떠한 변화도 보이지 않았다.

수크로스가 이들 실험에서 선두 부형제 후보이었기 때문에, 약물 매트릭스를 일정하게 유지된 10 mM 히스티딘(pH 6.5) 및 0.01% PS80, 및 2.0% 내지 7.0%의 범위에 걸친 다양한 농도의 수크로스로 제제화하고 동결건조하였다. 핵심 판독정보는 일차 건조 단계에서의 건조 시간, 외관 및 수분이었다. 시험 결과는 3종-항원 제제에 사용된 3% 내지 6%의 수크로스 농도 범위가 4종-항원 제제에 대해서도 허용가능하다는 것을 암시하였다.

실시예 20: 4종-항원 약물: 제제 개발(폴리소르베이트 80)

1) 폴리소르베이트 80의 필요성을 확인하고 2) 제제의 강인성을 검증하기 위해 교반 실험을 디자인하였다. 표 28에 기재된 바와 같이, 1가 제제 및 SA4ag 제제를 0%, 0.01% 및 0.03% PS80을 사용하여 평가하였다. 샘플을, 플루로텍으로 코팅된 4432/50 마개를 가진 쇼트 1형 2 ㎖ 바이알 내로 분취하고, VWR 볼텍서(모델 DVX-2500, 500 RPM 펄스 모드)로 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 교반된 샘플과 함께 비교반된 대조군을 실온에서 24시간 동안 놓아두었다. 다수의 바이알을 각각의 제제에 대해 풀링하고 분석하였다.

교반 후 회수에 대해 항원의 농도를 조사하였다. 모든 4종의 항원의 교반 후 데이터는 농도의 변화가 없음을 보여주었는데, 이것은 PS80을 함유하지 않는 제제를 포함하는 샘플들 중 어느 샘플에서도 손실이 없음을 입증한다(도 26a 및 26b). RP-HPLC를 이용한 rmClfA 및 MntC의 순도 분석은 교반 후 단백질의 변화가 없음을 보여주었다(도 26c). IEX-HPLC를 이용한 MntC의 순도 분석은 PS80의 수준을 비교하였을 때 1가 제제에서 (탈아미드화로 인한) 유사한 감소를 보여주었다(도 26d). MntC의 IEX-HPLC 순도 데이터로부터 관찰된 한 가지 흥미로운 결과는 1가 제제로서 (탈아미드화에 상응하는) 분해의 속도가 4종-항원 제제 중의 MntC에 비해 상당하다는 것이다. 모든 제제가 동일한 완충제 매트릭스를 공유하는 한, MntC가 단백질의 탈아미드화 속도를 늦추는 또 다른 항원과 상호작용하는 것이 가능하다. 제제의 pH 값도 일정하게 유지되었고(도 26e), OD₃₅₀ 측정은 교반 후 응집의 증가가 없음을 보여주었다(도 26f).

실시예 21: 4종-항원 약물: 동결건조

TA 기구 조절된 시차 주사 열량계(mDSC)를 이용하여 동결건조 전 액체 제제에 대한 유리 전이 온도를 수득하였고, T_g' 값은 표 29에 보고되어 있다. 로트 L44130-39-1 및 L44130-39-2는 4.5% 수크로스를 함유하는 고용량 및 저용량 목표 제제를 나타낸다. 로트 L44130-45 샘플은 목표 수크로스 농도를 브래키팅하고 3% 또는 6%의 부형제를 함유한다. 이들 샘플은 L44130-39-1 고용량 및 저용량(+30% 및 -30%)을 브래키팅하는 ClfA/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇/MntC 농도를 함유한다. 모든 제제가 문헌에 보고된 바와 같이 수크로스의 전형적인 T_g' 값인 -33℃ 내지 -35℃의 T_g' 값을 제공하였다.

동결건조된 샘플의 T_g 값은 표 30에 보고되어 있다. 상기 샘플을 개방하고 건조 글로브 박스 내의 알루미늄 기밀 DSC 팬으로 옮기고 밀봉하여, 동결건조된 케이크가 대기로부터 수분을 흡수하는 것을 방지하였다. 측정된 값은 수크로스 제제의 전형적인 온도 범위인 65℃ 내지 70℃의 범위 내에 있었다.

수크로스를 벌킹제로서 사용하는 상기 2종의 제제가 유사하였기 때문에 동결건조 주기는 SA3ag 약물을 위해 이용된 주기에 기초하였다. 표 31은 4종-항원 제제의 제조에 이용된 동결건조 주기에 대한 범위를 정의한다.

하기 파라미터를 비교하는 동결건조 연구를 수행하였다.:

1. 4.5% 수크로스 대 4% 만니톨/1% 수크로스, 및

2. 보존적 동결건조 주기 대 보다 빠른 공격적 주기.

샘플을 1가 약물 제제 및 4종-항원 제제 둘다로서 평가하였다. 모든 제제는 10 mM 히스티딘(pH 6.5) 및 0.01% PS80을 포함하였다. 용량은 rmClfA 및 MntC의 경우 400 ㎍/㎖이었고 CP5-CRM₁₉₇ 접합체 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체의 경우 200 ㎍/㎖이었다. 동결건조 전 제제 및 동결건조 후 제제를 하기 분석을 이용하여 비교하였다: 외관, pH, MntC 탈아미드화의 측정을 위한 CEX-HPLC, MntC 및 rmClfA 순도의 측정을 위한 RP-HPLC, 접합체 회수 측정을 위한 비탁법, 수분, 침전물 검출을 위한 OD₃₅₀ 및 구조 평가를 위한 시차 주사 열량측정법(DSC). 이용된 주기는 하기 표 32 및 33에 기재되어 있다.

케이크의 외관은 표 34에 기재되어 있다. 모든 만니톨 함유 케이크는 상기 두 주기를 이용하였을 때 시각적으로 훌륭한 케이크를 생성하였다. 수크로스 제제는 긴 주기를 이용하였을 때 예측된 바와 같이 허용가능한 케이크를 보였지만, 짧은 공격적 주기를 이용하였을 때 부분적으로 붕괴된 케이크를 생성하였다. 케이크 수분 함량 데이터는 모든 제제가 1% 미만의 수분을 함유하였지만, 만니톨 함유 샘플이 일반적으로 수크로스 단독을 함유하는 샘플보다 더 낮은 수분을 가졌다는 것을 보여주었다. 도 27a의 RP-HPLC 오버레이는 동결건조 전과 동결건조 후에 rmClfA 및 MntC 순도의 변화가 없음을 보여주었고, 비탁법 결과도 주기 또는 부형제와 관계없이 동결건조 후 CP5-CRM₁₉₇(도 27b) 및 CP8-CRM₁₉₇(도 27c)에 대한 항원성의 변화가 없음을 보여주었다. 도 27d 및 27e는 MntC의 탈아미드화된 종이 4종-항원 제제의 경우 동결건조 후 약 2.5%로 유지된다는 것을 입증한다. pH는 동결건조 후 동일하게 유지되었고, OD₃₅₀의 주목할만한 증가는 어느 동결건조 후 샘플에서도 검출되지 않았는데, 이것은 침전물의 부재를 암시한다. 그러나, OD₃₅₀은 작은 가용성 응집체의 발생을 검출하지 않을 것임을 인식하는 것이 중요하다. DSC 데이터는 용융 온도의 변화 부재에 의해 입증되는 바와 같이 항원(rmClfA 및 MntC)의 구조적 변동이 각각의 주기의 결과로서 촉진되지 않았다는 것을 암시하였다(도 27f). 접합체는 강한 용융 신호를 생성하지 않기 때문에 모니터링되지 않았다. 최종적으로, 루미넥스(Luminex) 분석을 이용하여 항원의 % 시험관내 상대적 효능을 동결건조 전과 동결건조 후에 비교하였다. rmClfA는 둘다에서 1가로서 분석되었으나, 4종-항원 조합이 간섭을 생성하기 때문에 4종-항원 제제에서는 접합체만이 1가 제제로서 분석되었다. 결과는 모든 분석된 샘플(만니톨 및 수크로스)이 동결건조 전과 동결건조 후(둘다 느린 주기 및 빠른 주기)를 비교하였을 때 분석 오차 내에 있었고 rmClfA(도 27g) 및 접합체(도 27h)가 이러한 조건 하에서 안정하였다는 것을 보여주었다.

실시예 22: 4종-항원 약물: 재구성

주사용수(WFI) 중의 60 mM NaCl을 재구성 희석제로서 선택하였다. 도 28은 이 희석제를 사용하여 재구성하였을 때, 고용량(400/400/200/200 ㎍/㎖ rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇) 및 저용량(200/200/100/100 ㎍/㎖ rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇) 둘다가 생리학적 범위 내의 삼투질농도를 보인다는 것을 입증한다. 선택된 재구성 부피는 0.73 ㎖의 최종 부피를 발생시키는 0.7 ㎖이었다.

60 mM NaCl로 재구성한 후, 고용량 4종-항원 백신 및 저용량 4종-항원 백신을 안정성 연구를 위해 2℃ 내지 8℃ 및 25℃에서 48시간 동안 유지하였다. 도 29a의 데이터는 RP-HPLC에 의해 검출된 MntC의 순도가 2℃ 내지 8℃ 및 25℃에서 48시간 동안 변화되지 않은 상태로 유지되었다는 것을 보여준다. rmClfA는 2℃ 내지 8℃에서 48시간 동안 안정하였지만, 25℃에서 순도는 24시간 시점에서 감소되었다(도 29b). IEX-HPLC를 이용하여 MntC의 순도를 모니터링하였는데, 상기 순도의 감소는 탈아미드화의 증가를 표시하였다(도 29c). 상기 단백질은 2% 미만의 공칭 순도 감소를 보이면서 2℃ 내지 8℃에서 안정한 상태로 유지되었다. 25℃에서, MntC는 4시간 동안 안정한 상태로 유지되었으나, 24시간 후 순도가 유의하게 감소되었다(90% 미만). 상기 데이터의 반응속도론적 분석은 하기 사항을 보여주었다: MntC의 경우 2℃ 내지 8℃ 및 25℃ 각각에서 시간 당 0.03% 및 0.26% 분해(도 29d), 및 rmClfA의 경우 2℃ 내지 8℃ 및 25℃ 각각에서 시간 당 0.01% 및 0.16% 분해(도 29e). 추가 데이터는 항원의 농도가 48시간 후 어느 온도에서도 변화하지 않았다는 것을 보여주었다(도 30a 내지 30d). pH도 48시간 동안 동일하게 유지되었다(도 30e).

재구성 후 백신은 모든 4종의 항원에 대한 재구성 후 백신의 분석에 기초할 때 실온에서 4시간 동안 안정하였고 2℃ 내지 8℃에서 최대 24시간 동안 안정하였다.

실시예 23: 4종-항원 약물: 동결건조 후 회수

4종-항원 제제의 동결건조 공정 후 회수를 2개 세트의 연구(두 고용량 및 두 저용량)로 평가하였고, 이때 상기 공정은 제제화, 여과, 충전 및 동결건조로 구성되었다. 도 31a 및 31b는 동결건조 후 어느 항원도 손실되지 않았다는 것을 보여준다. 마찬가지로, 도 31c 및 31d는 동결건조 후 샘플에서 rmClfA 또는 MntC의 순도의 변화가 없었다는 것을 보여준다.

실시예 24: 4종-항원 약물: 제제 안정성

(1) 400/400/200/200 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇, (2) 200/200/100/100 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇, 또는 (3) 40/40/20/20 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇을 가진 4종-항원 제제를 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 안정성에 대해 시험하였다. 제제 (1) 및 (2)는 상기 세 온도에서 6개월 동안 안정하였다. 제제 (3)은 2℃ 내지 8℃에서 5개월 동안 안정성을 나타내었다(표 35). 본 연구에 사용된 약제는 rmClfA에 대한 L40256-30(대표적 4종-항원 로트), MntC에 대한 L44124-64(대표적 4종-항원 로트), CP5-CRM₁₉₇에 대한 7CP5C-1002(대표적 3종-항원 로트) 및 CP8-CRM₁₉₇에 대한 G-C8-3-9(대표적 3종-항원 로트)이었다.

표 36에는 안정성 연구에 사용된 4종-항원 동결건조된 제제의 로트가 기재되어 있다.

표 37 및 38은 고용량 및 저용량 각각에 대한 6개월간 안정성 데이터의 요약을 보여준다. 6개월 후, 상기 두 용량은 동일한 케이크 외관을 유지하였고 희석제에 의해 신속히 재구성되었고, pH는 6.5 ± 0.3으로 유지되었고, 수분은 1.5% 미만으로 보유되었다. rmClfA, MntC, CP5-CRM₁₉₇ 및 CP8-CRM₁₉₇의 강도는 변화하지 않았다. 추가로, rmClfA 및 MntC의 순도 값은 t = 0에서의 순도로 유지되었다. 4종-항원 고용량 제제 및 저용량 제제는 장기간 저장 조건 및 가속화 저장 조건에서 3개월 동안 안정성을 보인다. 유사하게, 상기 두 용량 수준의 제2 제제 세트는 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 6개월 동안 안정성을 보였다(표 39 및 표 40). 데이터에 기초할 때, 이들 샘플의 제안된 저장 수명은 12개월이다.

2℃ 내지 8℃에서 6개월 동안 수행된 동결건조된 약물 매트릭스의 안정성 시험은 모든 시험된 파라미터가 연구 기간에 걸쳐 동일하게 유지되었다는 것을 보여주었다(표 41). 상기 약물 매트릭스의 제안된 저장 수명은 12개월이다.

동결건조된 4종-항원 독성학 고용량(L44130-39-1) 및 저용량(L44130-39-2) 제제를 0.7 ㎖의 60 mM NaCl 희석제로 재구성하고 2℃ 내지 8℃ 및 25℃에서 안정성에 대해 시험하였다. 샘플을 t = 0시간, 4시간 및 24시간에서 분석하였다. 임계적 분석은 pH, RP-HPLC에 의해 분석된 rmClfA 순도, IEX-HPLC에 의해 분석된 MntC 순도, IEX-HPLC에 의해 분석된 rmClfA 및 MntC 강도, 및 비탁법에 의해 분석된 CP5/CP8 접합체 항원성이었다. 모니터링되는 분해의 주요 기작은 rmClfA의 단백질 절단 및 MntC의 탈아미드화이었다. 도 32a 및 32b에서, 상기 두 재조합 단백질의 순도는 상기 두 용량의 경우 2℃ 내지 8℃에서 24시간 동안 유지되었다. 25℃ 항온처리에서, 상기 두 단백질의 순도는 4시간에서 변화되지 않은 상태로 유지되었으나 24시간에서 감소되었다. 상기 단백질의 강도(도 32c 및 32d), 상기 접합체의 강도(도 32e 및 32f) 및 pH(도 32g)도 2℃ 내지 8℃ 및 25℃에서 24시간 후 일정하였다. 요약하건대, 재구성 후 제제의 분석에 기초할 때, 모든 4종의 항원에 대한 제제는 재구성 후 실온에서 4시간 동안 안정하였고 2℃ 내지 8℃에서 최대 24시간 동안 안정하였다.

실시예 25: 4종-항원 약물: 에지(edge) 연구

제제의 강인성을 입증하기 위해 고용량 제제 및 저용량 제제의 성분을 브래키팅하도록 에지 연구를 디자인하였다. 표 42에는 제제가 상세히 기재되어 있다. 활성 성분은 고용량(400/400/200/200 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇)보다 30% 더 높은 수준 및 저용량(200/200/100/100 ㎍/㎖의 rmClfA/MntC/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇)보다 30% 더 낮은 수준으로서 변경되었다. 불활성 성분은 pH의 경우 6.0 내지 7.0의 범위, 히스티딘의 경우 5 mM 내지 15 mM의 범위, 수크로스의 경우 3% 내지 6%의 범위 및 PS80의 경우 0.005% 내지 0.015%의 범위 내에서 변경되었다.

에지 제제를 동결건조하고 2℃ 내지 8℃, 25℃ 및 37℃에서 안정성에 대해 시험하였다. 표 43 내지 46에 제시된 결과는 모든 에지 제제가 상기 세 온도에서 3개월 동안 안정하였다는 것을 보여주는데, 이는 4종-항원 제제의 강인성을 확인시켜준다.

실시예 26: 4종-항원 약물: 동결-해동 안정성

4종-항원 고용량(L44130-88-1) 및 저용량(L44130-88-2)의 동결건조 전 액체 제제를 쇼트 1형 바이알 내에서 4회 주기 동안 동결하고 해동하였다. 샘플을 매번 -70℃에서 24시간 이상 동안 동결한 후 실온에서 해동하였다. 해동 주기 동안, 상기 바이알을 면밀히 모니터링하여, 해동된 액체 제제가 실온에서 연장된 기간 동안 남아 있지 않게 하였다. 이것은 데이터가 실온에서 제제를 항온처리한 결과로서 일어나는 rmClfA의 임의의 절단 및 MntC의 탈아미드화를 반영하지 않게 하기 위해 수행되었다. 각각의 동결-해동 세트(3회 반복 수행됨)를 풀링하고, rmClfA 및 MntC 순도에 대해 RP-HPLC로 분석하고, rmClfA 및 MntC 농도에 대해 IEX-HPLC로 분석하고, MntC 순도에 대해 IEX-HPLC로 분석하고, CP5 접합체 및 CP8 접합체 농도에 대해 비탁법으로 분석하였다. 4회 동결-해동 주기 후, RP-HPLC에 의해 분석된 rmClfA 및 MntC의 순도(도 33a), 및 IEX-HPLC에 의해 분석된 MntC의 순도(도 33b)는 변화하지 않았다. 마찬가지로, 항원의 농도(도 33c 및 33d) 및 pH(도 33e)는 4회 동결-해동 주기 후 일정하게 유지되었다.

실시예 27: 4종-항원 약물: 교반 후 안정성

교반 후 안정성을 측정하는 연구의 목적은 0.01% 폴리소르베이트 80을 함유하는 4종-항원 제제가 용기 밀폐 시스템을 사용하였을 때 임의의 흡착 문제를 보이지 않는다는 것을 보장하는 것이었다. 고용량 동결건조 전 4종-항원 제제(L44130-100)를 0%, 0.01% 및 0.03% 폴리소르베이트 80으로 제조하고, 샘플을 동결건조 바이알/마개 용기 밀폐 시스템 내에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 대조군 샘플을 교반 없이 동일한 주위 온도에서 놓아두었다. 교반을 위해, VWR DVX-2500 다중튜브 볼텍서를 펄스 모드로 500 RPM으로 설정하였다. 폴리소르베이트 80 농도는 0% 내지 0.03%의 범위에 걸쳐 브래키팅되었다.

핵심 분석은 하기 분석을 포함하였다: rmClfA 절단 및 MntC 분해(탈아미드화를 제외함)의 검출을 위한 RP-HPLC, MntC 탈아미드화를 모니터링하기 위한 IEX-HPLC, 4종의 항원의 농도, pH 및 OD₃₅₀. 도 34a 및 34b는 rmClfA 및 MntC의 순도가 교반 후 유사하게 유지되었다는 것을 보여준다. 또한, 도 34c 및 34d는 모든 4종의 항원이 교반 후 회수된다는 것을 보여준다. pH는 유지되지만(도 34e), 교반은 OD₃₅₀에 의해 모니터링되었을 때 항원의 응집을 촉진하지 않는다(도 34e). 모든 데이터는 제제가 동결건조 용기 밀폐 시스템과 상용가능하다는 것을 암시한다.

동결건조 용기 밀폐 시스템이 실리콘을 함유하지 않지만, 제제는 백신의 재구성 및 전달을 위해 사용될 유리 주사기의 마개 상의 실리콘과 접촉할 것이다.

실시예 28: 4종-항원 약물: 이스코매트릭스™ 연구

60 mM NaCl을 갖거나 갖지 않는 20 유닛/㎖의 이스코매트릭스™를 가진 10 mM 히스티딘(pH 6.5)에서 재구성한 후 고용량 4종-항원 제제(400/400/200/200 ㎍/㎖의 rmClfA/rP305A/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇)의 안정성을 분석하였다. 안정성을 2℃ 내지 8℃ 및 25℃에서 24시간에 걸쳐 모니터링하였다. MntC의 순도를 CEX-HPLC로 분석하였다. 25℃에서, NaCl을 가진 이스코매트릭스™와 염을 가진 대조군 NaCl은 유사한 탈아미드화 속도를 보인다(도 35b). 염을 갖지 않는 이스코매트릭스™는 보다 더 느린 탈아미드화 속도를 보였다. 5℃에서, 탈아미드화 속도는 급격히 감소하였다(도 35a). 이스코매트릭스™로부터의 간섭으로 인해 rmClfA 순도를 직접적으로 정량하는 것은 불가능하였다(도 35c). 대표적 시간 경과 오버레이의 분석은 rmClfA 주 피크가 변화되지 않았다는 것을 보여주었는데, 이것은 25℃에서 24시간 동안의 안정성을 암시한다(도 35d). 2℃ 내지 8℃에서 모든 샘플에 대해 유사한 결과를 관찰하였다. 2℃ 내지 8℃(도 35e) 및 25℃(도 35f)에서 24시간 후 MntC의 순도 변화는 RP-HPLC에 의해 검출되지 않았다(도 35c). 2℃ 내지 8℃(도 35g) 및 25℃(도 35h)에서 24시간 후 CP5-CRM₁₉₇ 접합체 및 CP8-CRM₁₉₇ 접합체 농도의 변화는 관찰되지 않았다. 2℃ 내지 8℃(도 35i) 및 25℃(도 35j)에서 24시간 후 rmClfA 또는 MntC 농도의 변화는 관찰되지 않았다.

이스코매트릭스™ 농도는 2℃ 내지 8℃(도 36a) 및 25℃(도 36b)에서 24시간에 걸쳐 변화하지 않았다. NaCl을 가진 이스코매트릭스™의 입자 크기는 약 50 nm까지 증가하였고, NaCl을 갖지 않는 이스코매트릭스™의 입자 크기는 약 60 nm까지 증가하였다(도 36c). 모든 집단이 단분산되어 있었다(< 0.2). 재구성된 제제의 pH는 안정성 연구 전체에서 일정하게 유지되었다(도 36d).

60 mM NaCl을 갖거나 갖지 않는 20 유닛/㎖의 이스코매트릭스™를 가진 10 mM 히스티딘(pH 6.5)에서 재구성한 후 저용량 4종-항원 제제(40/40/20/20 ㎍/㎖의 rmClfA/rP305A/CP5-CRM₁₉₇/CP8-CRM₁₉₇)의 안정성을 분석하였다. 2℃ 내지 8℃에서 4시간 후 MntC 순도의 변화는 RP-HPLC에 의해 검출되지 않았다(도 37a). 2℃ 내지 8℃에서 4시간 후 MntC 탈아미드화의 증가는 CEX-HPLC에 의해 검출되지 않았다(도 37b). 모든 4종의 항원 농도가 연구 전체에서 일정하게 유지되었다(도 37c 및 37d).

NaCl을 가진 이스코매트릭스™의 입자 크기는 4시간 후 증가하였고 NaCl을 갖지 않는 이스코매트릭스™의 입자 크기는 일정하게 유지되었으나, 두 경우에서 입자 크기는 이스코매트릭스™만의 입자 크기보다 더 컸다(도 38a). 재구성된 샘플은 다분산되어 있었다(약 0.3). 재구성된 제제의 pH는 4시간 후 일정하게 유지되었다(도 38b).

실시예 29: 4종-항원 약물: 희석제 비교

4종-항원 제제 중의 저용량, 중간 용량 및 고용량 MntC를 사용하여 단기간 안정성 연구를 수행함으로써 희석제로서 60 mM NaCl, 물 중의 4.5% 수크로스 및 물을 비교하였다. 각각의 제제는 pH 6.5에서 4.5% 수크로스, 0.01% PS80, 및 표 47에 제공된 농도의 항원을 함유하였다.

실험을 시작하기 전에 바이알을 2℃ 내지 8℃에서 저장하였고 2일 및 7일 후 5℃ 및 25℃에서 안정성에 대해 시험하였다. 하기 분석을 이용하여 제제를 비교하였다: MntC 탈아미드화 및 순도 분석을 위한 CEX-HPLC, MntC 및 ClfA 순도 분석을 위한 RP-HPLC, MntC 및 ClfA 농도 분석을 위한 IEX, 및 접합체 농도 분석을 위한 비탁법. 결과의 세부 설명은 표 48 내지 56에 제공되어 있다. MntC의 탈아미드화 속도는 60 mM NaCl로 재구성된 모든 3종의 제제에서 더 높았고, 상기 세 용량 수준 중에서 고용량 MntC는 가장 빠른 탈아미드화 속도를 보였다. 모든 다른 결과는 유사하였다.

실시예 30: 4종-항원 약물: 대안적 제제

표 57에 제시된 4종-항원 약물의 여러 상이한 제제에 대한 안정성 분석을 수행하였다.

동결건조된 제제를 0.7 ㎖의 물로 재구성하였고 1개월, 3개월 및 6개월 후 5℃ 및 25℃에서 안정성에 대해 시험하였고 1개월 및 3개월 후 40℃에서 안정성에 대해 시험하였다. 하기 분석을 이용하여 상기 제제를 비교하였다: 칼 피셔 수분, 투명성, 색채, 미립자의 검출, MntC 탈아미드화 및 순도 분석을 위한 CEX-HPLC, MntC 및 ClfA 순도 분석을 위한 RP-HPLC, MntC 및 ClfA 농도 분석을 위한 IEX, 및 접합체 농도 분석을 위한 비탁법. % 수분은 45 mg/㎖의 수크로스를 함유하는 제제에서 더 높았다. 케이크 중의 물의 양은 케이크의 총 질량의 백분율이다. 따라서, 90 mg/㎖ 수크로스 케이크는 수크로스 질량의 2배 양으로 인해 2배 더 높은 % 수분을 가졌다. 결과의 세부 설명은 표 58 내지 66에 제공되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Wyeth LLC <120> STABLE IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS ANTIGNES <130> PC057927A <140> PCT/IB2011/055883 <141> 2011-12-21 <150> 61/426,476 <151> 2010-12-22 <160> 137 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 927 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 1 atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60 ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120 attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180 cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240 gacgctgacg ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300 aaagccttag aacaggctgg taaatcatta aaagataaaa aagttatcgc agtatcaaaa 360 gatgttaaac ctatctattt aaacggtgaa gaaggcaaca aagataaaca agatccacac 420 gcatggttaa gtttagataa cggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480 gataacgaca aaaaacataa agcagattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540 ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac aaatttaatg acattccaaa agaacaacgt 600 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Asp Val Lys Pro Ile Tyr Leu Asn 115 120 125 Gly Glu Glu Gly Asn Lys Asp Lys Gln Asp Pro His Ala Trp Leu Ser 130 135 140 Leu Asp Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Gln Thr Phe Ile 145 150 155 160 Asp Asn Asp Lys Lys His Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Gln Gly Asn Lys 165 170 175 Tyr Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Asn Asn Asp Ser Lys Asp Lys Phe 180 185 190 Asn Asp Ile Pro Lys Glu Gln Arg Ala Met Ile Thr Ser Glu Gly Ala 195 200 205 Phe Lys Tyr Phe Ser Lys Gln Tyr Gly Ile Thr Pro Gly Tyr Ile Trp 210 215 220 Glu Ile Asn Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Glu Gln Met Arg Gln Ala 225 230 235 240 Ile Glu Phe Val Lys Lys His Lys Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr 245 250 255 Ser Val Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys 260 265 270 Asp Ile Phe Gly Glu Val Tyr Thr Asp Ser Ile Gly Lys Glu Gly Thr 275 280 285 Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Glu Thr Val 290 295 300 His Gly Ser Met Lys 305 <210> 3 <211> 927 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 3 atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60 ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120 attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180 cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240 gacgctgaca ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300 aaagccttag aacaggctgg taaatcatta aaagataaaa aagttatcgc agtatcaaaa 360 gatgttaaac ctatctattt aaacggtgaa gaaggcaaca aagataaaca agatccacac 420 gcatggttaa gtttagataa tggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480 gataacgaca aaaaacataa agcagattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540 ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac aaatttaatg acattccaaa agaacaacgt 600 gccatgatta caagtgaagg tgccttcaag tacttctcaa aacaatacgg tattacacca 660 ggttatattt gggaaattaa cactgaaaaa caaggtacac ctgaacaaat gagacaagct 720 attgagtttg ttaaaaagca caaattaaaa cacttattag tagaaacaag tgttgataag 780 aaagcaatgg aaagtttatc tgaagaaacg aagaaagata tctttggtga agtgtacaca 840 gattcaatcg gtaaagaagg cactaaaggt gactcttatt 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tacgatagaa acacctcaat taaatacaac ggctaatgat 240 acatctgata ttagtgcaaa cacaaacagt gcgaatgtag atagcacagc aaaaacaatg 300 tctacacaaa cgagcaatac cactacaaca gagccagctt caacaaatga aacacctcaa 360 ccgacggcaa ttaaagatca agcaactgct gcaaaaatgc aagatcaaac tgttcctcaa 420 gaagcaaatt ctcaagtaga taataaaaca acgaatgatg ctaataacat agcaacaaac 480 agtgagctta aaaatcctca aacattagat ttaccacaat catcaccaca aacgatttcc 540 aatgcgcaag gaactagtaa accaagtgtt agaacgagag ctgtacgtag tcttgcagtt 600 gctgaacctg tagtaaatgc tgctgatgct aaaggtacaa atgtaaatga taaagttacg 660 gcaagtgatt tcaagttaga aaagactgca tttgacccta accaaagtgg taacacattt 720 atggcggcaa attttaaagt gactggacaa gtgaaatcag gggattattt tacagcgaag 780 ttaccagata gtgtaactgg taatggagac gtggattact ctaattcaaa taatacgatg 840 ccaattgcag acattaaaag tacgaatggc gatgttgtag ctaaagcaac atatgatatc 900 ttgactaaga cgtatacatt tgtctttaca gattatgtaa atgataaaga aaatattaac 960 ggacaatttt cattaccttt atttacagac cgagcaaagg cacctaaatc aggaacatat 1020 gatgcaaata ttaatattgc ggatgaaatg 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cgagcaaagg cacctaaatc aggaacatat 1020 gatgcgaata ttaatattgc ggatgaaatg tttaataata aaattactta taactatagt 1080 tcgccaattg caggaattga taaaccaaat ggcgcgaaca tttcttctca aattattggt 1140 gtagatacag cttcaggtca aaacacatac aagcaaacag tatttgttaa ccctaagcaa 1200 cgagttttag gtaatacgtg ggtgtatatt aaaggttacc aagataaaat cgaagaaagt 1260 agcggtaaag taagtgctac agatacaaaa ctgagaattt ttgaagtgaa tgatacatct 1320 aaattatcag atagctacta tgcggaccca aatgactcta accttaaaga agtaacgaat 1380 gagtttaagg ataaaatcac ttataaatac caaaatgtag caagtattaa ttttggcgat 1440 attactaaaa cgtatgttgt attagtggaa ggtcactatg ataatactgg taaaaacttg 1500 aaaacacagg ttattcaaga aaatattgac ccagcgacag gtaaagacta cagtattttc 1560 ggttggaata atgagaatgt tgtacgttat ggtggtggaa gtgctgatgg tgattcagca 1620 gtaaat 1626 <210> 56 <211> 542 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 56 Leu Lys Lys Arg Ile Asp Tyr Leu Ser Asn Lys Gln Asn Lys Tyr Ser 1 5 10 15 Ile Arg Arg Phe Thr Val Gly Thr Thr Ser Val Ile Val Gly Ala Thr 20 25 30 Ile Leu Phe Gly Ile Gly Asn 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85 atgaatatga agaaaaaaga aaaacacgca attcggaaaa aatcgattgg cgtggcttca 60 gtgcttgtag gtacgttaat cggttttgga ctactcagca gtaaagaagc agatgcaagt 120 gaaaatagtg ttacgcaatc tgatagcgca agtaacgaaa gcaaaagtaa tgattcaagt 180 agcgttagtg ctgcacctaa aacagacgac acaaacgtga gtgatactaa aacatcgtca 240 aacactaata atggcgaaac gagtgtggcg caaaatccag cacaacagga aacgacacaa 300 tcagcattaa caaatgcaac tacggaagaa actccgttaa ctggtgaagc tactacggca 360 acgaatcaag ctaatacacc ggcaacaact caatcaagca atacaaatgc ggaggaatta 420 gtgaatcaaa caagtaatga aacgacttct aatgatacta atacagtatc atctgtaaat 480 tcacctcaaa attctacaaa tgcggaaaat gtttcaacaa cgcaagatac ttcaactgaa 540 gcaacacctt caaacaatga atcagctcca cagagtacag atgcaagtaa taaagatgta 600 gttaatcaag cggttaatac aagtgcgcct agaatgagag catttagttt agcggcagta 660 gctgcagatg caccggcagc tggcacagat attacgaatc agttgacaga tgtgaaagtt 720 actattgact ctggtacgac tgtgtatccg caccaagcag gttatgtcaa actgaattat 780 ggtttttcag tgcctaattc tgctgttaaa ggtgacacat tcaaaataac tgtacctaaa 840 gaattaaact 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atacaaatgc ggaggaatta 420 gtgaatcaaa caagtaatga aacgacttct aatgatacta atacagtatc atctgtaaat 480 tcacctcaaa attctacaaa tgcggaaaat gtttcaacaa cgcaagatac ttcaactgaa 540 gcaacacctt caaacaatga atcagctcca cagaatacag atgcaagtaa taaagatgta 600 gttaatcaag cggttaatac aagtgcgcct agaaagagag catttagttt agcggctgta 660 gctgcagatg caccggcagc tggcacagat attacgaatc agttgacaga tgtgaaagtt 720 actattgact ctggtacgac tgtgtatccg caccaagcag gttatgtcaa actgaattat 780 ggtttttcag tgcctaattc tgctgttaaa ggtgacacat tcaaaataac tgtacctaaa 840 gaattaaact taaatggtgt aacttcaact gctaaagtgc caccaattat ggctggagat 900 caagtattgg caaatggtgt aatcgatagt gatggtaatg ttatttatac atttacagac 960 tatgttgata ataaagaaaa tgtaacagct aatattacta tgccagctta tattgaccct 1020 gaaaatgtta caaagacagg taatgtgaca ttgacaactg gcataggaac caatactgct 1080 agtaagacag tattaatcga ctatgagaaa tatggacaat tccataattt atcaattaaa 1140 ggtacgattg atcaaatcga taaaacaaat aatacgtatc gccaaacaat ttatgtcaat 1200 ccaagcggag ataacgttgt gttacctgcc ttaacaggta atttaattcc taatacaaag 1260 agtaatgcgt taatagatgc aaaaaacact gatattaaag tttatagagt cgataatgct 1320 aatgatttat ctgaaagtta ttatgtgaat cctagcgatt ttgaagatgt aactaatcaa 1380 gttagaattt catttccaaa tgctaatcaa tacaaagtag aatttcctac ggacgatgac 1440 caaattacaa caccgtatat tgtagttgtt aatggccata ttgatcctgc tagtacaggt 1500 gatttagcac tacgttcgac attttatggt tatgattcta attttatatg gagatctatg 1560 tcatgggaca acgaagtagc atttaataac ggatcaggtt ctggtgacgg tatcgataaa 1620 ccagttgttc ctgaacaacc tgatgagcct ggtgaaattg aaccaattcc agag 1674 <210> 90 <211> 558 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 90 Met Asn Met Lys Lys Lys Glu Lys His Ala Ile Arg Lys Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gly Val Ala Ser Val Leu Val Gly Thr Leu Ile Gly Phe Gly Leu Leu 20 25 30 Ser Ser Lys Glu Ala Asp Ala Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp 35 40 45 Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala 50 55 60 Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser 65 70 75 80 Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala 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ggtgacacat tcaaaataac tgtacctaaa 840 gaattaaact taaatggtgt aacttcaact gctaaagtgc ctccaattat ggccggagat 900 caagtattgg caaatggtgt aatcgatagt gatggtaatg ttatttatac atttacagac 960 tatgttgata ctaaagaaaa tgtaacagct aatattacta tgccagctta tattgaccct 1020 gaaaatgtta caaagacagg taatgtaaca ttgacaactg gcataggtag tacaacagca 1080 aacaaaacag tattagtaga ttatgaaaaa tatggtaagt tttataactt atctattaaa 1140 ggtacaattg accaaatcga taaaacaaat aatacgtatc gtcagacaat ttatgtcaat 1200 ccaagtggag ataacgttat tgcgccggtt ttaacaggta atttaaaacc caatacggat 1260 agtaatgcat taatagatca gcaaaataca agtattaaag tatataaagt agataatgca 1320 gctgatttat ctgaaagtta ctttgtaaat ccagaaaact ttgaggatgt cactaatagt 1380 gtgaatatta cattcccaaa tccaaatcaa tataaagtag agtttaatac gcctgatgat 1440 caaattacaa caccgtatat tgtagttgtt aatggtcata ttgatccgaa tagcaaaggt 1500 gatttagctt tacgttcaac tttatatggg tataactcga atataatttg gcgctctatg 1560 tcatgggaca acgaagtagc atttaataac ggatcaggtt ctggtgacgg tatcgataaa 1620 cctgttgtcc ctgaacaacc tgatgagcct 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ctggtgaagc tactacggca 360 acgaatcaag ctaatacacc ggcaacaact caatcaagca atacaaatgc ggaggaatta 420 gtgaatcaaa caagtaatga aacgacttct aatgatacta atacagtatc atctgtaaat 480 tcacctcaaa attctacaaa tgcggaaaat gtttcaacaa cgcaagatac ttcaactgaa 540 gcaacacctt caaacaatga atcagctcca cagagtacag atgcaagtaa taaagatgta 600 gttaatcaag cggttaatac aagtgcgcct agaatgagag catttagttt agcggcagta 660 gctgcagatg caccggcagc tggcacagat attacgaatc agttgacaga tgtgaaagtt 720 actattgact ctggtacgac tgtgtatccg caccaagcag gttatgtcaa actgaattat 780 ggtttttcag tgcctaattc tgctgttaaa ggtgacacat tcaaaataac tgtacctaaa 840 gaattaaact taaatggtgt aacttcaact gctaaagtgc ctccaattat ggccggagat 900 caagtattgg caaatggtgt aatcgatagt gatggtaatg ttatttatac atttacagac 960 tatgttgata ataaaaacga tgttaaagca acactaactg ttcctgcata cattgatcca 1020 gaaaatgtaa cgaaaacagg taatgtaaca ttgacaactg gcataggaac caatactgct 1080 agtaagacag ttttaatcga ctatgagaaa tatggacaat tccataattt atcaattaaa 1140 ggtacaattg atcaaatcga caaaacaaac aatacgtatc gtcaaacgat ttatgtcaat 1200 ccaagtggag acaatgttgt attaccagtg ttaactggta atctaattcc taagagtaat 1260 agtaatgctt taatagatgc caacaatact aatattaaag tttataaagt ggataatgct 1320 aatgatttat ctgaaagtta ttatgtgaat cctagcgatt ttgaagatgt aactaatcaa 1380 gttagaattt catttccaaa tgctaatcaa tacaaagtag aatttcctac ggacgatgac 1440 caaattacaa caccgtatat tgtagttgtt aatggccata ttgatcctgc tagtacaggt 1500 gatttagcac tacgttcgac attttatggt tatgattcta attttatatg gagatctatg 1560 tcatgggaca acgaagtagc atttaataac ggatcaggtt ctggtgacgg tatcgataaa 1620 ccagttgttc ctgaacaacc tgatgagcct ggtgaaattg aaccaattcc agag 1674 <210> 98 <211> 558 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 98 Met Asn Met Lys Lys Lys Glu Lys His Ala Ile Arg Lys Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gly Val Ala Ser Val Leu Val Gly Thr Leu Ile Gly Phe Gly Leu Leu 20 25 30 Ser Ser Lys Glu Ala Asp Ala Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp 35 40 45 Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala 50 55 60 Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser 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catttccaaa tgctaatcaa tacaaagtag aatttcctac ggacgatgac 1440 caaattacaa caccgtatat tgtagttgtt aatggccata ttgatcctgc tagtacaggt 1500 gatttagcac tacgttcgac attttatggt tatgattcta attttatatg gagatctatg 1560 tcatgggaca acgaagtagc atttaataac ggatcaggtt ctggtgacgg tatcgataaa 1620 ccagttgttc ctgaacaacc tgatgagcct ggtgaaattg aaccaattcc agag 1674 <210> 100 <211> 558 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 100 Met Asn Met Lys Lys Lys Glu Lys His Ala Ile Arg Lys Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gly Val Ala Ser Val Leu Val Gly Thr Leu Ile Gly Phe Gly Leu Leu 20 25 30 Ser Ser Lys Glu Ala Asp Ala Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp 35 40 45 Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala 50 55 60 Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser 65 70 75 80 Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln 85 90 95 Glu Thr Thr Gln Ser Ala Leu Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr Pro 100 105 110 Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Ala Thr Asn Gln Ala Asn Thr Pro Ala 115 120 125 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 125 Leu Pro Xaa Thr Gly 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 126 Thr Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asp 1 5 <210> 127 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 127 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser 1 5 10 <210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 128 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser 1 5 10 <210> 129 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 129 Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly 1 5 10 <210> 130 <211> 933 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 130 Met Asn Met Lys Lys Lys Glu Lys His Ala Ile Arg Lys Lys 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aagtatataa agtagataat 1320 gcagctgatt tatctgaaag ttactttgtg aatccagaaa actttgagga tgtcactaat 1380 agtgtgaata ttacattccc aaatccaaat caatataaag tagagtttaa tacgcctgat 1440 gatcaaatta caacaccgta tatagtagtt gttaatggtc atattgatcc gaatagcaaa 1500 ggtgatttag ctttacgttc aactttatat gggtataact cgaatataat ttggcgctct 1560 atgtcatggg acaacgaagt agcatttaat aacggatcag gttctggtga cggtatcgat 1620 aaaccagttg ttcctgaaca acctgatgag cctggtgaaa ttgaaccaat tccagaggat 1680 tcagattctg acccaggttc agattctggc agcgattcta attcagatag cggttcagat 1740 tcgggtagtg attctacatc agatagtggt tcagattcag cgagtgattc agattcagca 1800 agtgattcag actcagcgag tgattcagat tcagcaagcg attccgactc agcgagcgat 1860 tccgactcag acaatgactc ggattcagat agcgattctg actcagacag tgactcagat 1920 tccgacagtg actcagattc agatagcgat tctgactcag acagtgactc agattcagat 1980 agcgattcag attcagatag cgattcagat tccgacagtg attccgactc agacagcgat 2040 tctgactccg acagtgattc cgactcagac agcgattcag attccgacag tgattccgac 2100 tcagatagcg attccgactc agatagcgac tcagattcag 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Met Lys 305 <210> 135 <211> 930 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 135 atgaaaaaat tagtaccttt attattagcc ttattacttc tagttgctgc atgtggtact 60 ggtggtaaac aaagcagtga taagtcaaat ggcaaattaa aagtagtaac gacgaattca 120 attttatatg atatggctaa aaatgttggt ggagacaacg tcgatattca tagtattgta 180 cctgttggtc aagatcctca tgaatatgaa gttaaaccta aagatattaa aaagttaact 240 gacgctgacg ttattttata caacggatta aatttagaga ctggtaacgg ttggtttgaa 300 aaagccttag aacaggctgg taaatcatta aaagataaaa aagttatcgc agtatcaaaa 360 gatgttaaac ctatctattt aaacggtgaa gaaggcaaca aagataaaca agatccacac 420 gcatggttaa gtttagataa tggtattaaa tacgtaaaaa caattcaaca aacatttatc 480 gataacgaca aaaaacataa agcagattat gaaaagcaag gtaacaaata cattgctcaa 540 ttggaaaaat taaataatga cagtaaagac aaatttaatg acattccaaa agaacaacgt 600 gccatgatta caagtgaagg tgccttcaag tacttctcaa aacaatacgg tattacacca 660 ggttatattt gggaaattaa cactgaaaaa caaggtacac ctgaacaaat gagacaagct 720 attgagtttg ttaaaaagca caaattaaaa cacttattag tagaaacaag tgttgataag 780 aaagcaatgg 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660 agacaagcta ttgagtttgt taaaaagcac aaattaaaac acttattagt agaaacaagt 720 gttgataaga aagcaatgga aagtttatct gaagaaacga agaaagatat ctttggtgaa 780 gtgtacacag attcaatcgg taaagaaggc actaaaggtg actcttacta caaaatgatg 840 aaatcaaata ttgaaactgt acacggaagc atgaaa 876 <210> 137 <211> 876 <212> DNA <213> Staphylococcus epidermidis <400> 137 atggggaatc acagtaacca tgaacatcac tcacatgaag gaaaattaaa agttgtaact 60 acaaactcta ttctctatga catggttaaa cgtgtcggtg gaaataaggt cgatgttcat 120 agcatcgttc cagtaggaca agatccacat gaatatgagg ttaaacctaa agatattaaa 180 gcattaacag atgctgacgt tgtattttat aatggtttaa acctagaaac tggaaatggt 240 tggtttgaaa aagcacttga ccaagcagga aaatcaacaa aagataaaaa tgtgatagca 300 gcatcaaata atgttaaacc aatatactta aatggtgagg aaggtaacaa aaacaaacaa 360 gatccacatg catggttaag tttagagaat ggaattaaat acgtaaaaac aatacaaaaa 420 tcactagaac atcatgataa aaaagataag tctacatatg aaaaacaagg gaatgcatat 480 atatcaaaat tagaagaact taataaagat agtaaaaata aatttgatga catacccaaa 540 aatcaacgtg ccatgatgac aagtgaaggt 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Claims

(a) 단리된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 응괴 인자 A(ClfA) 폴리펩티드;
(b) 단리된 스타필로코커스 아우레우스 MntC 폴리펩티드;
(c) 캡슐 폴리사카라이드 5형(CP5)-CRM₁₉₇ 접합체;
(d) 캡슐 폴리사카라이드 8형(CP8)-CRM₁₉₇ 접합체;
(e) 6.0 ± 0.6의 pKa를 가진 완충제; 및
(f) 벌킹제
를 포함하되,
상기 ClfA 폴리펩티드가 N1, N2 및 N3 도메인을 포함하는, 동결건조된 면역원성 조성물.
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제 1 항에 있어서,
ClfA 폴리펩티드가 피브리노겐 결합 도메인을 포함하는, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 3 항에 있어서,
피브리노겐 결합 도메인이, Tyr 338, Tyr 256, Pro 336, Lys 389, Ala 254 및 Ile 387 중 하나 이상에서 Ala 또는 Ser으로의 아미노산 치환을 가짐으로써, ClfA의 천연 피브리노겐 결합 도메인을 가진 피브리노겐에 대해 관찰된 결합에 비해 감소된 수준으로 피브리노겐에 결합하도록 변형되어 있는, 동결건조된 면역원성 조성물.
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제 4 항에 있어서,
Tyr 338이 Ala으로 치환되어 있는, 동결건조된 면역원성 조성물.
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제 1 항에 있어서,
면역원성 조성물의 총 중량의 3% 중량(% w/w) 미만으로 물을 포함하고, ClfA 폴리펩티드가 0.09% ± 0.027% 내지 0.85% ± 0.26% w/w로 존재하고, CP5-CRM₁₉₇ 접합체가 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w로 존재하고, CP8-CRM₁₉₇ 접합체가 0.04% ± 0.013% 내지 0.42% ± 0.13% w/w로 존재하고, 완충제가 2.54% ± 0.76% w/w로 존재하는, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서,
완충제가 pH 6.0 ± 0.5의 히스티딘을 포함하는, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서,
벌킹제가 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 글라이신 및 소르비톨로 구성된 군으로부터 선택되는, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 11 항에 있어서,
벌킹제가 수크로스인, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 12 항에 있어서,
벌킹제가 96% ± 0.060% w/w의 수크로스인, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서,
계면활성제를 추가로 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물.
제 14 항에 있어서,
계면활성제가 폴록사머(poloxamer), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터로 구성된 군으로부터 선택되는, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 15 항에 있어서,
폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스터가 폴리소르베이트 80인, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 16 항에 있어서,
폴리소르베이트 80이 0.01% ± 0.005% w/w로 존재하는, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서,
항원보강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 동결건조된 면역원성 조성물.
제 18 항에 있어서,
항원보강제가 사포닌인, 동결건조된 면역원성 조성물.
제 1 항에 있어서,
단리된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 응괴 인자 B(ClfB)를 추가로 포함하는, 동결건조된 면역원성 조성물.
(a) 수성 용액 중에,
(i) N1, N2 및 N3 도메인을 포함하는 ClfA 폴리펩티드,
(ii) CP5-CRM₁₉₇ 접합체,
(iii)CP8-CRM₁₉₇ 접합체,
(iv) MntC 폴리펩티드,
(v) 6.0±0.6의 pKa를 갖는 완충제, 및
(vi) 벌킹제를 조합하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)의 조합물을 동결건조하여, 3 중량% 미만의 물을 포함하는 케이크(cake)를 형성하는 단계
를 포함하는 면역원성 조성물의 제조 방법.
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