CN103826656B - 金黄色葡萄球菌抗原的稳定的免疫原性组合物 - Google Patents

金黄色葡萄球菌抗原的稳定的免疫原性组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及冻干的或重建的多抗原或多成分免疫原性组合物，其包含分离白葡萄球菌的至少一种抗原，本发明还涉及生产这种组合物的方法。

Description

金黄色葡萄球菌抗原的稳定的免疫原性组合物
发明背景
人类是金黄色葡萄球菌(S.aureus)的天然储库。金黄色葡萄球菌可以永久地(10-35％)、间歇地(20-75％)在健康个体的皮肤上、鼻孔及咽喉内建群，或呈非携带(non-carriage)状态(5-70％)，而无相关疾病。见Vandenbergh et a1.，J.Clin.Micro.37：3133-3140(1999)。当个体由于免疫屏障破坏如手术期间、放置留置导管或其他装置、创伤或伤口而变得免疫系统受损时，随后会发生疾病。所产生的金黄色葡萄球菌感染可导致众多疾病，从轻度皮肤感染至心内膜炎、骨髓炎、菌血症、脓毒症，及其它形式疾病，伴随高死亡率。大的人类储库增加了适应的病原性克隆类型的进化和传播的机会。
来自革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的侵袭性葡萄球菌感染被特别关注，这是由于其成为世界范围内日益增加的公众健康问题。特别地，金黄色葡萄球菌与大多数医院获得性(医院内)感染相关，其在群体性发作的感染中的流行性渐增。例如，据估计美国在2005年侵袭性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的发生率为31.8/100,000人，包括18,650人死亡。见Klevens R.M.et a1.，JAMA，298：1763-71(2007)所述。
葡萄球菌疾病在近20年来已经示出是引人注目的疾病；其随着血管内装置和介入术的使用而增加。由于平行的抗生素抗性的增加使得疾病发生率的上升更麻烦；因此，迫切需要免疫原性组合物，以用于疫苗或者激发多克隆或单克隆抗体以赋予被动免疫性，从而作为预防或治疗葡萄球菌感染及相关疾病的手段。
聚集因子A(Clumping factorA，ClfA)是金黄色葡萄球菌细胞壁相关的粘附素，其介导葡萄球菌结合血纤蛋白原和血小板。在细菌细胞表面上表达，认为其在此通过结合沉积在组织损伤部位的血纤蛋白原和纤维蛋白而促进发病。ClfA是非常保守的，甚至最多样性形式(～85％相同性)也呈现出对于单克隆和多克隆抗体的广泛交叉反应性。因此，ClfA是抗金黄色葡萄球菌的疫苗的成分的一种适当的候选物。然而，鉴于ClfA的结构不稳定性，由于其在贮存时易于随时间降解因此ClfA的配制是一个问题。
全长ClfA包含一些区域和结构域：N-末端分泌结构域(“S”结构域)；随后是配体结合A区，其含有三个结构域(N1，含有EF-手性基序的N2，以及N3)；随后是R区，其含有丝氨酸-天冬氨酸二肽重复；随后是细胞壁结合区(“W”区)，其含有LPXTG基序；疏水性跨膜结构域(“M”区)；及带电荷的C-末端(“C”区)，其含有带正电荷的氨基酸。所述N1区含有蛋白酶敏感性位点。ClfA的不稳定性很大程度上归因于ClfA在N1的剪切，产生含有N1和N2N3的片段。ClfA的结构和功能在美国专利申请出版物20070087014A1(Pavliak et a1.，2007年4月19日)中公开，所述专利以其全部内容援引加入本文。
能导致侵袭性疾病的葡萄球菌属微生物通常也能产生荚膜多糖(CP)，其包囊细菌并增强其对宿主天然免疫系统清除的抗性。所述CP将细菌细胞掩盖在保护性荚膜中，导致细菌对于吞噬作用及细胞内杀灭的抗性。缺少荚膜的细菌更易于被吞噬。荚膜多糖通常是包括流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和B族链球菌在内的许多细菌病原体的重要毒力因子。
金黄色葡萄球菌的大部分临床分离株被血清型5或8包囊。5型(CP5)和8型(CP8)荚膜多糖具有相似的三糖重复单位，包含N-乙酰氨基甘露醇醛酸(mannosaminuronic acid)、N-乙酰-L-岩藻糖胺及N-乙酰-D-岩藻糖胺。见Fournier，J.M.et a1.，Infect.Immun.45：97-93(1984)和Moreau，M.，et a1.，Carbohydrate Res.201：285-297(1990)所述。这两个CP具有相同的糖，但是糖链接和O-乙酰化位置不同，各自产生血清学不同的免疫反应性模式。
金黄色葡萄球菌MntC蛋白(也称作蛋白305、P305、P305A，及ORF305)是锰ABC转运蛋白的一种成分。这种蛋白在体内表达。金黄色葡萄球菌使用锰作为增强金黄色葡萄球菌在中性粒细胞中存活的酶的辅因子。因此，MntC对于在感染期间金黄色葡萄球菌的体内存活是重要的。与ClfA相同，这种蛋白在溶液中也是不稳定的。然而，与可以聚集或者通过水解剪切的ClfA不同，MntC降解的主要机制是在碱性pH和/或室温(大约25℃)或更高温度条件下的脱酰胺作用。
因此，不仅急切地需要抗金黄色葡萄球菌感染的疫苗，而且还特别需要具有增强的抗原稳定性的疫苗。
发明概述
本发明涉及冻干的或重建的(reconstituted)多抗原或多成分免疫原性组合物，其包含至少一种分离自葡萄球菌的抗原。所述抗原是多肽和多糖，可以通过使用本领域技术人员已知的分离方法直接得自细菌，或者可以使用合成方案产生，或者可以使用本领域技术人员已知的遗传工程方法重组产生，或者通过组合前述这些方式产生。在某些实施方案中，本发明的冻干的或重建的免疫原性组合物包含分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)。在某些实施方案中，本发明的冻干的或重建的免疫原性组合物包含选自如下的三种或更多种抗原：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)以及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。此外，本发明提供了诱导针对葡萄球菌的免疫应答的方法；预防由葡萄球菌所致疾病、降低这种疾病的严重性或者延迟疾病发生的方法；以及预防由葡萄球菌感染所致疾病的至少一个症状、降低这种疾病的至少一个症状的严重性或者延迟这种疾病的至少一个症状发生的方法。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了冻干的或重建的免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的或重建的免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的或重建的免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的或重建的免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)以及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的或重建的免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)以及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)选自如下的至少三种成分：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(“ClfA”)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(“ClfB”)多肽、5型荚膜多糖(CP5)-蛋白缀合物、8型荚膜多糖8(CP8)-蛋白缀合物及分离的金黄色葡萄球菌MntC多肽；(b)缓冲剂，其pKa为6.0±0.6；及(c)填充剂(bulking agent)。在某些实施方案中，所述ClfA多肽在37℃下保持至少一个月基本不降解。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(“ClfA”)多肽；(b)5型荚膜多糖(CP5)-蛋白缀合物；(c)8型荚膜多糖8(CP8)-蛋白缀合物；(d)缓冲剂，其pKa为6.0±0.6；以及(e)填充剂。在某些实施方案中，所述ClfA多肽在37℃下保持至少一个月基本不降解。
在一个实施方案中，冻干的免疫原性组合物包含占所述免疫原性组合物总重量小于3％重量的水(％w/w)，其中ClfA多肽在0.09％±0.027％和0.85％±0.26％w/w之间，CP5-蛋白缀合物在0.04％±0.013％和0.42±0.13％w/w之间，CP8-蛋白缀合物在0.04％±0.013％和0.42±0.13％w/w之间，所述缓冲剂为2.54％±0.76％w/w。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)ClfA多肽；(b)CP5-蛋白缀合物；(c)CP8-蛋白缀合物；(d)组氨酸缓冲剂，pH6.0±0.5；(e)蔗糖；(f)聚山梨醇酯80；以及(g)水。在某些实施方案中，所述ClfA多肽在37℃下保持至少3个月基本不降解。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)ClfA多肽，在0.09％±0.027％和0.85％±0.26％w/w之间；(b)CP5-蛋白缀合物，在0.04％±0.013％和0.42±0.13％w/w之间；(c)CP8-蛋白缀合物，在0.04％±0.013％和0.42±0.13％w/w之间；(d)组氨酸缓冲剂，pH6.0±0.5，为2.54％±0.76％w/w；(e)蔗糖，97％±2.0％w/w；(f)聚山梨醇酯80，0.21％±0.04％w/w；以及(g)水，2％±1％w/w。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性三抗原组合物，其通过将本发明的冻干的免疫原性组合物在水性稀释剂中重建而产生，所述重建的组合物的最终pH为6.0±0.5。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性组合物，其通过重建本发明的冻干的免疫原性组合物而产生，其包含：(a)ClfA多肽，浓度在40μg/ml±4μg/ml和800μg/ml±80μg/ml之间；(b)CP5-蛋白缀合物，浓度在20μg/ml±2μg/ml和400μg/ml±40μg/ml之间；(c)CP8-蛋白缀合物，浓度在20μg/ml±2μg/ml和400μg/ml±40μg/ml之间；(d)组氨酸缓冲剂，浓度为10mM±5mM；(e)聚山梨醇酯80，浓度为0.1％±0.05％重量/体积(w/v)；以及(f)蔗糖，浓度为9％±4.5％w/v。在另一实施方案中，聚山梨醇酯80的浓度为0.01％±0.005％重量/体积(w/v)，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性组合物，其包含：(a)重建的冻干的ClfA多肽；(b)CP5-蛋白缀合物；(c)CP8-蛋白缀合物；(d)组氨酸缓冲剂，pH6.0±0.5；(e)聚山梨醇酯80；(f)蔗糖；及(g)水性稀释剂。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性组合物，其通过重建本发明的冻干的免疫原性组合物而产生，其包含：(a)重建的冻干的ClfA多肽，浓度在40μg/ml±4μg/ml和800μg/ml±80μg/ml之间；(b)CP5-蛋白缀合物，浓度在20μg/ml±2μg/ml和400μg/ml±40μg/ml之间；(c)CP8-蛋白缀合物，浓度在20μg/ml±2μg/ml和400μg/ml±40μg/ml之间；(d)组氨酸缓冲剂，浓度为10mM±5mM；(e)聚山梨醇酯80，浓度为0.1％±0.05％重量/体积(w/v)；(f)蔗糖，浓度为9％±4.5％w/v；及(g)水性稀释剂。在另一实施方案中，聚山梨醇酯80浓度为0.01％±0.005％重量/体积(w/v)，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在一个实施方案中，本发明提供了产生免疫原性组合物的方法，包括如下步骤：(a)组合水溶液，水溶液包含：(i)ClfA多肽，(ii)CP5-蛋白缀合物，(iii)CP8-蛋白缀合物，(iv)缓冲剂，pKa为6.0±0.6，及(v)填充剂；以及(b)冻干步骤(a)的组合以形成包含重量小于3％水的块状物(cake)。在某些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(a)组合(vi)表面活性剂。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对步骤(a)的组合进行过滤灭菌，之后进行步骤(b)的冻干。在某些实施方案中，所述水溶液包含pH6.0±0.5的10mM±1mM组氨酸、9％±4.5％w/v的蔗糖以及0.1％±0.05％w/v的聚山梨醇酯80。在另一实施方案中，所述聚山梨醇酯80的浓度为0.01％±0.005％w/v，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在某些实施方案中，冻干步骤(b)包括如下步骤：(i)以0.3℃±0.03℃/分钟的速度冷冻步骤(a)的灭菌的组合，直至达到温度为-50℃±5℃，压力为400毫巴±40毫巴；然后将该组合在-50℃±5℃保持60分钟±6分钟；(ii)复性所述组合，通过以0.3℃±0.03℃/分钟的速度提高温度至-10℃±5℃，接着在-10℃±5℃保持120分钟±12分钟，随后以0.3℃±0.03℃/分钟的速度降低温度直至达到-50℃±5℃温度，在-50℃±5℃温度保持180分钟±18分钟；(iii)干燥该组合，通过使压力降低至50毫托(mTorr)及保持30分钟，随后以0.2℃±0.02℃/分钟的速度提高温度至-30℃±5℃，接着在-30℃±5℃温度保持1,920分钟±192分钟；(iv)进一步干燥该组合，通过以0.2℃±0.02℃/分钟的速度提高温度至30℃±5℃并增加压力至200mTorr，随后在30℃±5℃温度保持720分钟±72分钟；以及(v)以0.5℃±0.05℃/分钟的速度降低温度至5℃±5℃。在一些实施方案中，在小瓶内进行冻干。在一些实施方案中，所述小瓶在冻干后用瓶塞塞住。在某些实施方案中，将小瓶用氮气充填之后用瓶塞塞住。在某些实施方案中，所述方法进一步包括如下步骤：(c)将在步骤(b)的冻干的组合在水性介质中重建。在某些实施方案中，步骤(c)的重建的组合的重量摩尔渗透压浓度在250mOsM±25mOsM和300mOsM±30mOsM之间。在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物是根据产生本发明的免疫原性组合物的任何方法生产的。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)选自如下的至少四种成分：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、CP5-蛋白缀合物、CP8-蛋白缀合物及分离的金黄色葡萄球菌MntC多肽；(b)缓冲剂，其pKa为6.0±0.6；以及(c)填充剂。在某些实施方案中，所述ClfA多肽在37℃下保持至少1个月基本不降解。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽；(b)与CRM197缀合的5型荚膜多糖(CP5-CRM197)；(c)与CRM197缀合的8型荚膜多糖(CP8-CRM197)；(d)分离的MntC多肽；(e)缓冲剂，其pKa为6.0±0.6；及(f)填充剂。在某些实施方案中，所述ClfA多肽在37℃下保持至少1个月基本不降解。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：低于所述免疫原性组合物总重量3％重量的水(％w/w)，其中所述ClfA多肽在0.09％±0.027％和0.84％±0.25％w/w之间，CP5-CRM197在0.04％±0.013％和0.42±0.13％w/w之间，CP8-CRM197在0.04％±0.013％和0.42±0.13％w/w之间，MntC在0.09％±0.027％和0.84％±0.25％w/w之间，缓冲剂为3.3％±0.99％w/w。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)ClfA多肽；(b)CP5-CRM197缀合物；(c)CP8-CRM197缀合物；(d)MntC多肽；(e)组氨酸缓冲剂；(f)蔗糖；(g)聚山梨醇酯80；及(h)水。在某些实施方案中，所述ClfA多肽在37℃下保持至少3个月基本不降解。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)ClfA多肽，在0.09％±0.027％和0.84％±0.25％w/w之间；(b)CP5-CRM197缀合物，在0.04％±0.013％和0.42±0.13％w/w之间；(c)CP8-CRM197缀合物，在0.04％±0.013％和0.42±0.13％w/w之间；(d)MntC多肽，在0.09％±0.027％和0.84％±0.25％w/w之间；(e)组氨酸缓冲剂，3.3％±0.99％w/w；(f)蔗糖，95％±2％w/w；(g)聚山梨醇酯80，0.21％±0.063％w/w；及(h)水，2％±1％w/w。在某些实施方案中，所述ClfA多肽在37℃下保持至少3个月基本不降解。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性四抗原组合物，其通过将本发明的冻干的免疫原性组合物在水性稀释剂中重建而产生，所述重建的组合物的最终pH为6.5±0.5。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性组合物，其包含：(a)ClfA多肽，其浓度在40μg/ml±4μg/ml和800μg/ml±80μg/ml之间；(b)CP5-cRM197缀合物，其浓度在20μg/ml±2μg/ml和400μg/ml±40μg/ml之间；(c)CP8-CRM197缀合物，其浓度在20μg/ml±2μg/ml和400μg/ml±40μg/ml之间；(d)分离的MntC多肽，其浓度在40μg/ml±4μg/ml和800μg/ml±80μg/ml之间；(e)组氨酸缓冲剂，其浓度为10mM±5mM；(f)聚山梨醇酯80，其浓度为0.01％±0.005％重量/体积(w/v)；及(g)蔗糖，其浓度为4.5％±1.5％w/v。在另一实施方案中，聚山梨醇酯80的浓度为0.01％±0.005％w/v，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性组合物，其包含：(a)重建的冻干的ClfA多肽；(b)CP5-CRM197缀合物；(c)CP8-CRM197缀合物；(d)MntC多肽；(d)组氨酸缓冲剂；(e)聚山梨醇酯80；(f)蔗糖；及(g)水性稀释剂。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性组合物，其包含：(a)重建的冻干的ClfA多肽，浓度在40μg/ml±4μg/ml和800μg/ml±80μg/ml之间；(b)CP5-CRM197缀合物，浓度在20μg/ml±2μg/ml和400μg/ml±40μg/ml之间；(c)CP8-CRM197缀合物，浓度在20μg/ml±20μg/ml和400μg/ml±40μg/ml之间；(d)分离的MntC多肽，浓度在40μg/ml±40μg/ml和800μg/ml±80μg/ml之间；(e)组氨酸缓冲剂，浓度为10mM±5mM；(f)聚山梨醇酯80，浓度为0.1％±0.05％重量/体积(w/v)；及(g)蔗糖，浓度为9％±4.5％w/v；以及(h)水性稀释剂。在另一实施方案中，聚山梨醇酯80浓度为0.01％±0.005％w/v，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在一个实施方案中，本发明提供了产生免疫原性组合物的方法，包括如下步骤：(a)在水溶液中组合如下成分：(i)ClfA多肽，(ii)CP5-CRM197缀合物，(iii)CP8-CRM197缀合物，(iv)MntC多肽，(v)缓冲剂，pKa为6.0±0.6，及(vi)填充剂；及(b)将步骤(a)的组合冻干以形成包含重量少于3％水的块状物。在某些实施方案中，所述方法在步骤(a)进一步包括组合(vi)表面活性剂。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对步骤(a)的组合进行过滤灭菌的步骤，之后进行步骤(b)的冻干。在某些实施方案中，所述水溶液包含pH6.0±0.5的10mM±5mM组氨酸，9％±1％w/v的蔗糖以及0.1％±0.02％w/v的聚山梨醇酯80。在其它实施方案中，聚山梨醇酯80浓度为0.01％±0.001％w/v，蔗糖浓度为4.5％±0.45％w/v。在某些实施方案中，冻干步骤(b)包括如下步骤：(i)将步骤(a)的灭菌的组合以0.3℃±0.03℃/分钟的速度冷冻直至达到温度-50℃±5℃，压力为400毫巴±40毫巴；然后将所述组合在温度-50℃±5℃保持60分钟±6分钟；(ii)复性该组合，通过以0.3℃±0.03℃/分钟的速度提高温度至-10℃±5℃，然后在-10℃±5℃温度保持120分钟±12分钟，然后以0.3℃±0.03℃/分钟的速度降低温度直至达到-50℃±5℃，然后在-50℃±5℃温度保持180分钟±18分钟；(iii)使所述组合干燥，通过将压力降低至50毫托(mTorr)及保持30分钟，然后以0.2℃±0.02℃/分钟的速度增加温度至-30℃±5℃，然后在-30℃±5℃温度保持1,920分钟±192分钟；(iv)干燥所述组合，通过以0.2℃±0.02℃/分钟的速度提高温度至30℃±5℃，然后再加压力至200mTorr并在30℃±5℃温度保持720分钟±72分钟；(v)以0.5℃±0.05℃/分钟的速度降低温度至5℃±5℃。在一些实施方案中，冻干是在小瓶中进行。在一些实施方案中，在冻干之后将小瓶用瓶塞塞住。在某些实施方案中，用氮气充填小瓶之后再用瓶塞塞住。在某些实施方案中，所述方法进一步包括如下步骤：(c)在水性介质中重建步骤(b)的冻干的组合。在某些实施方案中，步骤(c)的重建的组合的重量摩尔渗透压浓度在250mOsM±25mOsM和300mOsM±30mOsM之间。在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物是根据产生本发明的免疫原性组合物的任何方法产生的。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽，其包含血纤蛋白原结构域，(b)缓冲剂，pKa为6.0±0.6，及(c)填充剂。在某些实施方案中，所述ClfA多肽在37℃下保持至少1个月基本不降解。在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含低于所述免疫原性组合物总重量3％重量的水(％w/w)，其中ClfA多肽为0.52％±0.46％w/w，所述缓冲剂为0.28％±0.065％w/w。在某些实施方案中，所述填充剂是97％±2.0％w/w的蔗糖。
在一个实施方案中，本发明提供了冻干的免疫原性组合物，其包含：(a)ClfA多肽，0.52％±0.46％w/w，(b)琥珀酸盐缓冲剂，0.28％±0.065％w/w，(c)蔗糖，97％±0.57％w/w，(d)聚山梨醇酯80，0.20％±0.042％w/w，及(e)水，2.5％±0.5％w/w。在某些实施方案中，ClfA多肽在37℃下保持至少1个月基本不降解。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性ClfA组合物，其通过将本发明的冻干的免疫原性组合物在水性稀释剂中重建而产生，所述重建的组合物的最终pH为6.0±0-3。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性ClfA组合物，其通过将本发明的冻干的免疫原性组合物在水性稀释剂中重建而产生，所述重建的组合物的最终pH为6.5±0.3。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性组合物，其包含：(a)ClfA多肽，浓度在20μg/m1±2μg/ml和600μg/m1±60μg/ml之间；(b)组氨酸缓冲剂，10mM±5mM；(c)聚山梨醇酯80，0.1％±0.05％重量/体积(w/v)；及(d)蔗糖，浓度为9％±4.5％w/v。在另一实施方案中，聚山梨醇酯80的浓度为0.01％±0.005％w/v，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在一个实施方案中，本发明提供了产生免疫原性组合物的方法，包括如下步骤：(a)在水溶液中组合：(i)重组聚集因子A(rClfA)多肽，(ii)pKa为6.0±0.6的缓冲剂，及(iii)填充剂；及(b)将步骤(a)的组合冻干以形成包含低于3％重量的水的块状物。在某些实施方案中，所述方法在步骤(a)中进一步包括组合(vi)表面活性剂。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对步骤(a)的组合进行过滤灭菌的步骤，之后进行步骤(b)的冻干。在某些实施方案中，所述水溶液包含pH6.0±0.5的10mM±1mM组氨酸，9％±1％w/v的蔗糖及0.1％±0.02％w/v的80。在其它实施方案中，聚山梨醇酯80浓度为0.01％±0.001％w/v，蔗糖浓度为4.5％±0.45％w/v。在某些实施方案中，冻干步骤(b)包括如下步骤：(i)将步骤(a)的灭菌的组合以0.3℃±0.03℃/分钟的速度冷冻直至达到温度为-50℃±5℃，压力为400毫巴±40毫巴；然后将该组合在-50℃±5℃温度保持60分钟±6分钟；(ii)使该组合复性，通过以0.3℃±0.03℃/分钟的速度提高温度至-10℃±5℃；然后在-10℃±5℃温度保持120分钟±12分钟；然后以0.3℃±0.03℃/分钟的速度降低温度至-50℃±5℃；然后在-50℃±5℃温度保持180分钟±18分钟；(iii)使所述组合干燥，通过将压力降低至50毫托(mTorr)及以0.2℃±0.02℃/分钟的速度提高温度至-25℃±5℃；然后在25℃±5℃温度保持1,320分钟±132分钟；(iv)干燥该组合，通过以0.2℃±0.02℃/分钟的速度将温度提高至30℃±5℃；然后将压力增加至200mTorr并在30℃±5℃温度保持720分钟±72分钟；(v)以0.5℃±0.05℃/分钟的速度降低温度至5℃±5℃。在一些实施方案中，冻干是在小瓶中进行。在一些实施方案中，在冻干后将该小瓶用瓶塞塞住。在某些实施方案中，用氮气充填该小瓶，之后再用瓶塞塞住小瓶。在某些实施方案中，所述方法进一步包括如下步骤：(c)将步骤(b)的冻干的组合在水性介质中重建。在某些实施方案中，将步骤(b)的干燥的组合在水性介质中重建步骤(c)的重建的组合的重量摩尔渗透压浓度，其中重建的组合的重量摩尔渗透压浓度为300mOsm±30mOsm。在某些实施方案中，所述水性介质包含选自如下的至少两种成分：(a)金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽，(b)5型荚膜多糖(CP5)-蛋白缀合物，(c)8型荚膜多糖(CP8)-蛋白缀合物，及(d)金黄色葡萄球菌MntC多肽。在某些实施方案中，所述水溶液包含CP5-蛋白缀合物和CP8-蛋白缀合物。在某些实施方案中，所述水溶液包含CP-5蛋白缀合物，CP8-蛋白缀合物和MntC多肽。在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物是根据产生本发明的免疫原性组合物的任何方法产生的。
在某些实施方案中，所述ClfA多肽包含N结构域。在某些实施方案中，所述ClfA多肽包含N1、N2或N3结构域。在某些实施方案中，所述ClfA多肽包含N1、N2和N3结构域。在某些实施方案中，所述ClfA多肽包含血纤蛋白原结合结构域。在某些实施方案中，所述血纤蛋白原结合结构域已经被改变以在与观测到血纤蛋白原与ClfA的天然血纤蛋白原结合结构域的结合水平相比降低的水平结合血纤蛋白原。在某些实施方案中，所述血纤蛋白原结合结构域通过在Tyr338、Tyr256、Pro336、Lys389、Ala254和Ile387中的一或多个具有氨基酸取代而展示出与血纤蛋白原的结合降低。在某些实施方案中，在Tyr338、Tyr256、Pro336、Lys389、Ala254和Ile387中一或多个的氨基酸取代是取代为Ala或Ser。在某些实施方案中，Tyr338被取代为Ala。
在某些实施方案中，所述CP5-蛋白缀合物是CP5-CRM197、CP5-肺炎球菌溶血素或者CP5-链球菌C5a肽酶(SCP)。在某些实施方案中，所述CP8-蛋白缀合物是CP8-CRM197、CP8-肺炎球菌溶血素或者CP8-链球菌C5a肽酶(Scp)。
在某些实施方案中，冻干的免疫原性组合物的缓冲剂包含pH6.0±0.3的琥珀酸盐。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含pH6.5±0.5的组氨酸。在某些实施方案中，所述缓冲剂包含pH6.0±0.3的组氨酸。在某些实施方案中，填充剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸和山梨糖醇。在某些实施方案中，所述填充剂是蔗糖。在某些实施方案中，所述填充剂是96％±0.2％w/w的蔗糖。在某些实施方案中，所述冻干的免疫原性组合物进一步包含表面活性剂。在某些实施方案中，所述表面活性剂选自泊洛沙姆(poloxamer)、聚氧乙烯烷基醚和聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯。在某些实施方案中，所述聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯是聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，对于ClfA和三抗原配制物，所述聚山梨醇酯80为0.20％±0.041％w/w。在某些实施方案中，对于四抗原配制物，所述聚山梨醇酯80为0.1％±0.05％w/w。在其它实施方案中，所述聚山梨醇酯80浓度为0.01％±0.005％w/v。
在某些实施方案中，所述冻干的免疫原性组合物进一步包含佐剂。在某些实施方案中，所述佐剂是ISCOMATRIXTM。
在某些实施方案中，所述液体组合物的水性稀释剂是水。在某些实施方案中，所述水性稀释剂是低盐溶液。在某些实施方案中，所述低盐溶液包含60mM±10mM氯化钠。在某些实施方案中，所述水性稀释剂包含聚山梨醇酯80。在某些实施方案中，所述水性稀释剂包含佐剂。在某些实施方案中，所述佐剂是ISCOMATRIXTM。
附图简述
图1示出各种形式重组ClfA多肽的示意图并公开了SEQ ID NO：125和127-129。
图2示出在各种条件下随着时间不同批次冻干的ClfA蛋白与其液体对应物相比浓度的改变，以ln[C]表示。A组：批号L36051-37-1和L36051-44。B组：批号L36051-72。C组：批号L36051-81-1。D组：批号36051-81-2。
图3示出在t＝0的冻干的DS L40184-61与在2-8℃、25℃和37℃贮存3个月的块状物相比的大小排阻层析图。
图4示出对比冻干的配制物与冻干前的液体ClfA批号L36051-81-1的大小排阻层析图。
图5示出冻干的ClfA在不同时间和温度条件下的pH(A组)、含水量百分比(B组)和光密度(C组)的柱状图，这些是聚集的测量指标。
图6示出ClfA的二聚体百分比(A组)、单体百分比(B组)和降解物百分比(裂解)(C组)的柱状图，这些是通过SE-HPLC在室温搅拌24小时后而确定。X-轴示出含有不同浓度聚山梨醇酯80(0.000、0.0100、0.005和0.100％w/w)和蔗糖(3、4.5和6％w/w)的配制物。不含有PS80的配制物呈现出在搅拌之后二聚体形成百分比增加(D组)。
图7示出ClfA的降解物百分比(裂解)(A组)、二聚体百分比(B组)和单体百分比(C组)的柱状图，这些通过SE-HPLC针对不同填充剂配制物随时间而确定。
图8示出在高剂量冻干的块状物重建之后在不同时间的ClfA纯度(A组)、CP5强度(strength)(抗原性)(B组)和CP8强度(抗原性)。
图9示出在低剂量冻干的块状物重建之后在不同时间的ClfA纯度(A组)，CP5的强度(抗原性)(B组)和CP8的强度(抗原性)。
图10示出在室温重建后0、4和24小时ClfA的浓度(A组)和纯度百分比(B组)及CP5和CP8的浓度(C组)。
图11示出在冷冻-解冻循环1、2和3次后ClfA的浓度(A组)和纯度百分比(B组)及CP5和CP8的浓度(C组)。
图12示出多个批次rClfA在pH6.0(A组)和7.0(B组)的圆二色性扫描(CD)。
图13示出作为pH函数的多个批次rClfA的CD熔解(melts)。
图14示出针对rClfAm和rmClfA的作为pH函数的固有色氨酸荧光(A组)和ANS荧光(B组)熔解。
图15示出针对rClfAm和rmClfA的作为pH函数的差示扫描量热法(DSC)熔解。
图16示出作为pH函数的rmClfA的OD350熔解。
图17示出针对在25℃、6周的rmClfA的作为pH函数的大小排阻-HPLC(A组)及液体rmClfA配制物的pH和OD350稳定性(B组)
图18示出MntC的固有色氨酸荧光熔解(A组)和Tml追踪(B组)。
图19示出作为pH函数的MntC的DSC熔解的Tml追踪(A组)以及两个主要热事件的热分析图(B和C组)。
图20示出作为pH函数的MntC的OD350熔解。
图21示出监测稳定性的rmClfA(A组)和MntC(B组)的层析图。
图22示出使用RP-HPLC在5℃(A组)和25℃(B组)测量的rmClfA的稳定性结果及使用IEX-HPLC测量的在5℃(C组)和25℃(D组)的MntC的稳定性结果。
图23示出使用浊度测定法在不同pH条件下CP5-CRM197在5℃和25℃(分别为A和C组)及CP8-CRM197在5℃和25℃(分别为B和D组)的稳定性结果。
图24示出使用不同填充剂的摇动后的样品的渗透性(A组)和OD350(B组)的测量。
图25示出作为填充剂函数的稳定性检测，高剂量(A组)和低剂量(B组)冻干的配制物使用RP-HPLC数据，MntC质量使用IEX-HPLC数据(C组)。
图26示出所有四种抗原的搅拌后数据：抗原浓度(A组中rmClfA和MntC；B组中CP5-CRM197和CP8-CRM197)，通过RP-HPLC测量的rmClfA和MntC纯度(B组)，通过IEX-HPLC测量的MntC纯度(C组)，pH(D组)和OD350(E组)。
图27示出所有四种抗原的冻干前和冻干后数据：rmClfA和MntC的RP-HPLC数据(A组)，CP5-CRM197(B组)和CP8-CRM197(C组)的浊度测定结果，使用4.5％蔗糖(D组)和4％甘露醇/1％蔗糖(E组)的MntC的CEX-HPLC数据，DSC数据(F组)和rmClfA(G组)及缀合物(H组)的效力百分比。
图28示出高剂量和低剂量配制物的重量摩尔渗透压浓度。
图29示出MntC(A组)和rmClfA(B组)的RP-HPLC纯度数据，MntC的IEX-HPLC纯度数据(C组)，以及重建后MntC(D组)和rmClfA降解(E组)的动力学。
图30示出重建后抗原浓度(A-D组)和pH稳定性(E组)。
图31示出冻干过程后抗原浓度(A和B组)和纯度(C和D组)的恢复。
图32示出重建后rmClfA(A组)和MntC纯度(B组)，rmClfA(C组)和MntC浓度(D组)，CP5-CRM197(E组)及CP8-CRM197(F组)浓度以及pH稳定性(G组)。
图33示出通过RP-HPLC分析的冷冻-解冻后rmClfA和MntC纯度(A组)，通过IEX-HPLC分析的MntC纯度(B组)，抗原浓度(C和D组)及pH稳定性(E组)。
图34示出通过RP-HPLC分析的搅拌后rmClfA和MntC纯度(A组)，通过IEX-HPLC分析的MntC纯度(B组)，抗原浓度(C和D组)，pH(E组)和OD350(F组)。
图35示出通过CEX-HPLC分析的用ISCOMATRIXTM重建24小时后的MntC在2-8℃(A组)和25℃(B组)的降解，通过CEX-HPLC分析的用ISCOMATRIXTM重建的rmClfA的纯度(C和D组)，通过RP-HPLC分析的用ISCOMATRIXTM重建的MntC在2-8℃(E组)和25℃(F组)的纯度，用ISCOMATRIXTM重建的在2-8℃(G组)和25℃(H组)的CP5-CRM197和CP8-CRM197缀合物浓度，以及用ISCOMATRIXTM重建的在2-8℃(I图)和25℃(J图)的rmClfA和MntC浓度。
图36示出重建的配制物在2-8℃(A组)和25℃(B组)在24小时期间的ISCOMATRIXTM浓度，ISCOMATRIXTM颗粒大小(C组)以及pH稳定性(D组)。
图37示出通过RP-HPLC分析的用ISCOMATRIXTM重建4小时后MntC的纯度(A组)和脱酰胺化，以及用ISCOMATRIXTM重建的抗原浓度(C和D组)。
图38示出重建的配制物在4小时期间ISCOMATRIXTM颗粒大小(A组)和pH稳定性(B组)。
图39A-J示出金黄色葡萄球菌不同菌株之间ClfA的比对(以出现顺序分别为SEQ ID NO：62、64、68、84、70、104、66、78、86、88、90、72、74、76、80、94、82、92、96、98、100、102、106和108)。
图40A-I示出金黄色葡萄球菌不同菌株之间的ClfB的比对(以出现顺序分别为SEQ ID NO：26、28、32、18、54、34、36、30、16、20、22、24、38、40、42、44、46、48、50、52、56、58和60)。
图41A-C示出金黄色葡萄球菌不同菌株之间的MntC的比对(以出现顺序分别为SEQ ID NO：2、8、10、4、6、14和12)。
图42示出来自金黄色葡萄球菌不同菌株的ClfB序列表格。
图43示出来自金黄色葡萄球菌不同菌株的MntC序列表格。
发明详述
在描述本发明的方法和治疗方法之前，应理解本发明非限于特定的方法和描述的实验条件，因为这些方法和条件可以变化。也应理解本说明书中使用的术语只是为了描述特定的实施方案，无限制之意。
尽管在实施或检测本发明中可使用与本发明中描述的材料和方法相似或等同的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均以其全部内容援引加入本文。
本说明书中使用的术语具有本领域技术人员认可和已知的含义，然而，为方便和完整起见，下文详细解释了特定的术语及其含义。
如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”和“所述”除非特别指出则还包括其复数形式。因此，例如，提及“所述方法”包括一或多种方法，和/或文中描述的类型步骤和/或在本领域技术人员阅读本文而显而易见的等。
术语“大约”或者“近似”是指在一个值的统计学有意义的范围内。这个范围可以是在给定值或范围的数量级范围内，典型在20％以内，更典型在10％以内，还更典型在5％以内。术语“大约”或“近似”涵盖的容许变化依赖于所研究的特定系统，可易于由本领域技术人员意识到。无论在本说明书中何时提及范围时，所述范围内的每一整数也涵盖在本发明实施方案中。
“抗体”是能通过位于免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点特异性结合靶位如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的一种免疫球蛋白分子。如本文所用，除非特别指出，该术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且还包含工程化的抗体(如嵌合抗体、人源化抗体和/或为改变效应子功能、稳定性及其它生物学活性而衍生化的抗体)及其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)，单链抗体(ScFv)及结构域抗体，包括鲨鱼和骆驼源化抗体)，以及包含抗体一部分的融合蛋白，多价抗体，多特异性抗体(如双特异性抗体，只要其呈现希望的生物学活性)以及本文所述的抗体片段，以及免疫球蛋白分子的包含抗原识别位点的任何其它修饰的构型。抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，所述抗体不需要是任何特定类别。根据抗体其重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可被确定为不同类别。有五种主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可进一步分为亚类(同种型)，例如在人体中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。相应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。本领域熟知不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型。
“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留完整抗体中存在的与该部分正常相关的至少一种、优选大多数或全部功能。
术语“抗原”通常是指生物分子，通常为蛋白、肽、多糖、脂质或缀合物，其含有同源抗体可选择性结合的至少一个表位；或者在一些情况中是指免疫原性物质，其可刺激动物体内抗体或T细胞应答或者这二者的产生，包括注射或吸收进动物体内的组合物。可以针对整个分子或者针对分子的一或多个不同部分(如表位或半抗原)产生免疫应答。该术语可用于指个体分子或者抗原性分子的同质或异质群。抗原被抗体、T-细胞受体或者特异性体液和/或细胞免疫性的其它元件识别。术语“抗原”包括所有相关的抗原性表位。指定抗原的表位可以使用本领域熟知的任何数目的表位作图技术鉴别。见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，Vo1.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press，Totowa，N.J.。例如，线性表位可以如下确定：例如在固体支持物上同时合成大量的相应于蛋白分子的一部分的肽，将所述肽与抗体反应，而所述肽仍附着在支持物上。这种技术为本领域已知，在例如美国专利4,708,871；Geysen et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3998-4002；Geysen et al.(1986)Molec.Immunol.23：709-715中描述，所有文献均以其全部内容援引加入本文。相似地，构象表位可以通过确定氨基酸的空间构象而鉴别，如通过例如X-线晶体照相术和二维核磁共振确定。见例如Epitope Mapping Protocols，如上。此外，对于本发明目的而言，“抗原”也可以用于是指包括对天然序列的修饰如缺失、添加和取代(通常性质上是保守的，但是其可以是非保守的)的蛋白，只要所述蛋白保留引发免疫学应答的能力即可。这些修饰可以是有意的，如通过定向诱变或者通过特定的合成程序或者通过遗传工程方法，或者可以是偶然的，如通过产生抗原的宿主的突变形成。进一步地，抗原可以从微生物如细菌中衍生、获得或分离，或者可以是完整生物体。相似地，表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸，如在核酸免疫应用中，也包含在这个定义中。也包括合成的抗原，例如多表位、侧翼表位(flanking epitope)及其它重组或合成衍生的抗原(Bergmann et al.(1993)Eur.J.Immunol.23：27772781；Bergmann et al.(1996)J.Immunol.157：32423249；Suhrbier，A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75：402408；Gardner et a1.(1998)12th World AIDSConference，Geneva，Switzerland，Jun.28-Jul.3，1998)。
术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物，如在本文中进一步描述和例证。
“菌血症”是细菌在血液中的短暂存在。菌血症可以进展为败血病或者脓毒症，其被认为是感染，是细菌在血液中长期存在，具有相关的临床迹象/症状。不是所有细菌均能在血液中存活。具有特殊遗传性状的那些细菌才具有此能力。此外，宿主因素也发挥重要作用。
“荚膜多糖”是指在大多数葡萄球菌分离株细胞壁的外面的多糖荚膜。例如，金黄色葡萄球菌包含由肽聚糖复合物组成的细胞壁成分，其使得生物体能在不利的渗透条件下存活，其也包含与肽聚糖连接的独特的磷壁酸。在细胞壁的外面，一层薄的多糖荚膜包被大多数金黄色葡萄球菌分离株。这种血清学独特的荚膜可用于对各种金黄色葡萄球菌分离株确定血清型。许多临床有意义的分离株已经示出包括两种荚膜类型：血清型5(CP5)和血清型8(CP8)。
如本文所用，“缀合物”包含通常在希望的分子量范围的荚膜多糖和载体蛋白，其中所述荚膜多糖与所述载体蛋白缀合。缀合物可包含或不包含一定量的游离荚膜多糖。如本文所用，“游离的荚膜多糖”是指与缀合的荚膜多糖-载体蛋白不共价关联(即不与其共价结合、不附着或不与其包载或包载于其中)的荚膜多糖。术语“游离荚膜多糖”、“游离多糖”和“游离糖”可互换使用，表达相同的含义。无论载体分子的性质如何，其可以与荚膜多糖直接缀合或者通过接头间接缀合。如本文所用，“缀合”是指细菌荚膜多糖与载体分子共价附着的过程。缀合增强细菌荚膜多糖的免疫原性。所述缀合可以根据下文所述方法或者通过本领域已知的方法进行。
如上文所述，本发明涉及包含与载体蛋白缀合的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖(CP5)的缀合物，以及包含与载体蛋白缀合的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖(CP8)的缀合物。本发明的一个实施方案提供了包含与载体蛋白缀合的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖以及与载体蛋白缀合的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的缀合物，其中：5型荚膜多糖的分子量在50kDa-800kDa之间，8型荚膜多糖的分子量在50-700kDa之间；所述免疫原性缀合物的分子量在大约1000kDa-大约5000kDa之间；所述缀合物包含相对于总多糖低于大约30％的游离多糖。在一个实施方案中，所述缀合物包含相对于总多糖低于大约25％、大约20％、大约15％、大约10％或者大约5％游离多糖。在一个实施方案中，5型或8型多糖的分子量在大约20kDa-大约1000kDa之间，在大约50kDa-大约500kDa之间，在大约50kDa-大约200kDa之间，在大约75kDa-大约150kDa之间。
在一个实施方案中，缀合物的分子量在大约50kDa-大约5000kDa之间。在一个实施方案中，缀合物的分子量在大约200kDa-大约5000kDa之间。在一个实施方案中，免疫原性缀合物的分子量在大约400kDa-大约2500kDa之间。在一个实施方案中，免疫原性缀合物的分子量在大约500kDa-大约2500kDa之间。在一个实施方案中，免疫原性缀合物的分子量在大约600kDa-大约2800kDa之间。在一个实施方案中，免疫原性缀合物的分子量在大约700kDa-大约2700kDa之间。在一个实施方案中，免疫原性缀合物的分子量在大约1000kDa-大约2000kDa之间、大约1800kDa-大约2500kDa之间、大约1100kDa-大约2200kDa之间、大约1900kDa-大约2700kDa之间、大约1200kDa-大约2400kDa之间、大约1700kDa-大约2600kDa之间、大约1300kDa-大约2600kDa之间、大约1600kDa-大约3000kDa之间。
因此，在一个实施方案中，本发明的免疫原性缀合物中的载体蛋白是CRM197，所述CRM197与荚膜多糖通过氨基甲酸酯键、酰胺键或者这二者共价连接。载体蛋白中与荚膜多糖缀合的赖氨酸残基的数目可以被描述为缀合的赖氨酸的范围。例如在给出的免疫原性组合物中，CRM197可包含在39个赖氨酸中有5-15个赖氨酸与荚膜多糖共价连接。表示这个参数的另一方式是12％-40％的CRM197的赖氨酸与荚膜多糖共价连接。在一些实施方案中，与CRM197共价结合的多糖的CRM197部分包含5-25个与该多糖共价连接的赖氨酸。在一些实施方案中，与CRM197共价结合的多糖的CRM197部分包含5-20个与该多糖共价连接的赖氨酸。在一些实施方案中，与载体蛋白共价结合的多糖的CRM197部分包含10-25个与该多糖共价连接的赖氨酸。在一些实施方案中，与载体蛋白共价结合的多糖的CRM197部分包含8-15个与该多糖共价连接的赖氨酸。例如，在给出的免疫原性组合物中，CRM197可包含在39个赖氨酸中有18-22个赖氨酸与荚膜多糖共价连接。表示这个参数的另一方式是40％-60％的CRM197赖氨酸与荚膜多糖共价连接。在一些实施方案中，所述CRM197包含在39个赖氨酸中有5-15个赖氨酸与CP8共价连接。表示这个参数的另一方式是12％-40％的CRM197赖氨酸与CP8共价连接。在一些实施方案中，CRM197包含在39个赖氨酸中有18-22个赖氨酸与CP5共价连接。表示这个参数的另一方式是40％-60％的CRM197赖氨酸与CP5共价连接。
如上所述，与荚膜多糖缀合的载体蛋白中赖氨酸残基的数目可以被描述为缀合的赖氨酸的范围，其可以表示为摩尔比率。例如，在CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸与CRM197的摩尔比率可以是在大约18：1-大约22：1之间。在一个实施方案中，CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸与CRM197的摩尔比率范围可以在大约15：1-大约25：1之间。在一些实施方案中，CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸与CRM197的摩尔比率范围可以在大约14：1-大约20：1之间、大约12：1-大约18：1、大约10：1-大约16：1、大约8：1-大约14：1、大约6：1-大约12：1、大约4：1-大约10：1、大约20：1-大约26：1、大约22：1-大约28：1、大约24：1-大约30：1、大约26：1-大约32：1、大约28：1-大约34：1、大约30：1-大约36：1、大约5：1-大约10：1、大约5：1-大约20：1、大约10：1-大约20：1，或者大约10：1-大约30：1。CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸与CRM197的摩尔比率也可以在大约3：1-25：1之间。在一个实施方案中，CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸与CRM197的摩尔比率范围可以在大约5：1-大约20：1之间。在一个实施方案中，CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸与CRM197的摩尔比率范围可以在大约4：1-大约20：1之间，大约6：1-大约20：1、大约7：1-大约20：1、大约8：1-大约20：1、大约10：1-大约20：1、大约11：1-大约20：1、大约12：1-大约20：1、大约13：1-大约20：1、大约14：1-大约20：1、大约15：1-大约20：1、大约16：1-大约20：1、大约17：1-大约20：1、大约18：1-大约20：1、大约5：1-大约18：1、大约7：1-大约16：1，或者大约9：1-大约14：1。
表示与荚膜多糖缀合的载体蛋白中的赖氨酸残基数目的另一方式可以是缀合的赖氨酸范围。例如，在给出的CP8免疫原性缀合物中，CRM197可包含在39个赖氨酸中有5-15个赖氨酸与荚膜多糖共价连接。或者，这个参数可以百分数表示。例如，在给定的CP8免疫原性缀合物中，缀合的赖氨酸的百分比可以在10％-50％之间。在一些实施方案中，20％-50％的赖氨酸可以与CP8共价连接。或者，30％-50％的CRM197赖氨酸可以与CP8共价连接，10％-40％的CRM197赖氨酸、10％-30％的CRM197赖氨酸、20％-40％的CRM197赖氨酸、25％-40％的CRM197赖氨酸、30％-40％的CRM197赖氨酸、10％-30％的CRM197赖氨酸、15％-30％的CRM197赖氨酸、20％-30％的CRM197赖氨酸、25％-30％的CRM197赖氨酸、10％-15％的CRM197赖氨酸，或者10％-12％的CRM197赖氨酸与CP8共价连接。在给定的CP5免疫原性缀合物中，CRM197可包含在39个赖氨酸中有18-22个赖氨酸与荚膜多糖共价连接。或者，这个参数可以百分数表示。例如，在给定的CP5免疫原性缀合物中，缀合的赖氨酸的百分比可以在40％-60％之间。在一些实施方案中，40％-60％的赖氨酸可以与CP5共价连接。或者，30％-50％的CRM197赖氨酸可以与CP5共价连接，20％-40％的CRM197赖氨酸、10％-30％的CRM197赖氨酸、50％-70％的CRM197赖氨酸、35％-65％的CRM197赖氨酸、30％-60％的CRM197赖氨酸、25％-55％的CRM197赖氨酸、20％-50％的CRM197赖氨酸、15％-45％的CRM197赖氨酸、10％-40％的CRM197赖氨酸、40％-70％的CRM197赖氨酸或者45％-75％的CRM197赖氨酸与CP5共价连接。
荚膜多糖链与载体分子上赖氨酸的附着频率是鉴定荚膜多糖缀合物的另一参数。例如，在一个实施方案中，荚膜多糖的至少每5-10个糖重复单位存在至少一个CRM197与多糖之间的共价连接。在另一实施方案中，荚膜多糖的每5-10个糖重复单位存在至少一个CRM197与荚膜多糖之间的共价连接，每2-7个糖重复单位、每3-8个糖重复单位、每4-9个糖重复单位、每6-11个糖重复单位、每7-12个糖重复单位、每8-13个糖重复单位、每9-14个糖重复单位、每10-15个糖重复单位、每2-6个糖重复单位、每3-7个糖重复单位、每4-8个糖重复单位、每6-10个糖重复单位、每7-11个糖重复单位、每8-12个糖重复单位、每9-13个糖重复单位、每10-14个糖重复单位、每10-20个糖重复单位、每5-10个糖重复单位存在至少一个CRM197与荚膜多糖之间的共价键。在另一实施方案中，在荚膜多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个糖重复单位存在至少一个CRM197与荚膜多糖之间的连接。
多糖的化学激活及随后与载体蛋白的缀合可以通过常规方式实现。见例如美国专利4,673,574和4,902,506所述。可另外使用其它激活和缀合方法。
如本文所用，“载体蛋白”或者“蛋白载体”是指可以与针对其产生希望的免疫应答的抗原(如荚膜多糖)缀合的任何蛋白分子。抗原如多糖与载体蛋白的缀合可以使得所述抗原成为免疫原性的。载体蛋白优选是无毒性及无反应原性的，且可以以足够量和纯度获得。举例的载体蛋白是来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌属、大肠杆菌、葡萄球菌属和链球菌属的毒素、类毒素或者毒素的任何突变的交叉反应性材料(CRM197)。载体蛋白应适合标准缀合方法。在本发明的特定实施方案中，CRM197用作载体蛋白。
CRM197(Wyeth/Pfizer，Sanford，NC)是分离自在基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中生长的白喉杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的培养物的白喉毒素的一种无毒性变体(即类毒素)。CRM197通过超滤、硫酸铵沉淀及离子交换层析而纯化。产生CRM197蛋白的白喉杆菌菌株C7(197)的培养物保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Rockville，Maryland)，保藏号为ATCC53281。其它白喉类毒素也适合用作载体蛋白。
其它合适的载体蛋白包括失活的细菌毒素如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(如国际专利申请W02004/083251所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST以及来自的绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。也可以使用细菌外膜蛋白如外膜蛋白复合物c(OMPC)、孔蛋白、运铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附蛋白(PsaA)、艰难梭菌(C.difficile)肠毒素(毒素A)和细胞毒素(毒素B)或者流感嗜血杆菌蛋白D。其它蛋白如链球菌C5a肽酶(SCP)、卵清蛋白、钥孔嘁血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或者结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)也可以用作载体蛋白。
在荚膜多糖与载体蛋白缀合后，所述多糖-蛋白缀合物通过各种技术而纯化(关于多糖-蛋白缀合物的量的富集)。这些技术包括例如浓缩/渗滤、沉淀/洗脱、柱层析及深度过滤。见下文实施例所述。
在纯化各个缀合物之后，可以将其组合以配制本发明的免疫原性组合物，其可用于例如疫苗中。本发明的免疫原性组合物的配制可以使用本领域认可的方法完成。
注意在本说明书中，如“包含”、“含有”等术语可具有美国专利法中认可的含义；如其可意味着“包括”等。这种术语是指包含一特定成分或一系列成分，但不排除任何其它成分。术语“基本上由…组成”具有美国专利法认为属于其的含义，如其允许包含未损害本发明的新的或基本特征的其它成分或步骤，即其排除损害本发明的新的或基本特征的其它未列举的成分或步骤，以及其排除现有技术如本文提及的或者援引加入本文的文献中的成分或步骤，特别其是这个文献的目的以限定可专利的实施方案，如相对于现有技术如本文提及的或援引加入本文的文献是新的、非显而易见的、有创造性的。术语“由…组成”具有美国专利法认为属于其的含义，即这些术语是封闭式的。因此，这些术语是指包含一个特定成分或者一系列成分，及排除所有其它成分。
“保守氨基酸取代”是指蛋白的一或多个氨基酸残基用具有相似物理和/或化学性质的其它氨基酸残基取代。序列内的氨基酸取代可以选自所述氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这种改变预期不影响如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者等电点确定的表观分子量。特别优选的取代是：Lys取代Arg，反之亦然，由此可以保持正电荷；Glu取代Asp，反之亦然，由此可以保持负电荷；Ser取代Thr，由此可以保持游离-OH；Gin取代Asn，由此可以保持游离NH2。
“片段”是指仅包含较大蛋白的特异性结构域的蛋白。例如，如果包括信号序列，ClfA和ClfB蛋白各含有多如8个结构域。相应于N1N2N3、N2N3、N1N2、N1、N2或N3结构域的多肽均被认为是ClfA或ClfB的片段。“片段”也是指包含这样的氨基酸序列的蛋白或多肽，所述氨基酸序列具有亲代蛋白或多肽的氨基酸序列的至少4个氨基酸残基(优选至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少125个氨基酸残基或者至少150个氨基酸残基)，或者是指包含这样的核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列具有亲代核酸的核苷酸序列的至少10个碱基对(优选至少20个碱基对、至少30个碱基对、至少40个碱基对、至少50个碱基对、至少50个碱基对、至少100个碱基对、至少200个碱基对)。
如本文所用，抗体的“功能活性”或者“功能性抗体”是指这样的抗体，其最低限度能特异性结合抗原。其它功能为本领域已知，可包括如通过调理作用、ADCC或者补体介导的细胞毒性实现病原体的清除或杀灭的免疫性系统的其它成分。在抗原结合之后，任何随后的抗体功能均可通过抗体的Fc区介导。抗体调理吞噬试验(OPA)是一种体外测定，设计为测量在体外Ig补体辅助的效应细胞(白细胞)的细菌杀灭作用，因此模拟生物学过程。抗体结合也可以直接抑制其结合的抗原的生物学功能，如结合ClfA的抗体可中和其酶功能。在一些实施方案中，“功能性抗体”是指通过在动物效力模型中或者调理吞噬杀灭测定中通过杀灭细菌测量的证实其杀灭细菌而发挥功能的抗体。
金黄色葡萄球菌荚膜多糖的分子量在用于免疫原性组合物中是一个考虑因素。例如，高分子量的荚膜多糖由于抗原性表面上存在的表位的较高化合价而能诱导某些抗体免疫应答。“高分子量荚膜多糖”的分离预期用于本发明的组合物和方法中。例如，在本发明的一个实施方案中，预期分子量大小在大约50-大约800kDa范围的5型高分子量多糖的分离。在本发明的一个实施方案中，预期分子量大小在大约20-大约1000kDa范围的5型高分子量多糖的分离。在本发明的一个实施方案中，预期分子量大小在大约50-大约300kDa范围的5型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量在70-300kDa范围的5型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量在90-250kDa范围的5型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量在90-150kDa范围的5型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量在90-140kDa范围的5型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量在80-120kDa范围的5型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。可以通过本发明的方法分离和纯化的其它范围的高分子量血清型5荚膜多糖包括分子量大小范围在大约70kDa-大约100kDa、70kDa-110kDa、70kDa-120kDa、70kDa-130kDa、70kDa-140kDa、70kDa-150kDa、70kDa-160kDa、80kDa-110kDa、80kDa-120kDa、80kDa-130kDa、80kDa-140kDa、80kDa-150kDa、80kDa-160kDa、90kDa-110kDa、90kDa-120kDa、90kDa-130kDa、90kDa-140kDa、90kDa-150kDa、90kDa-160kDa、100kDa-120kDa、100kDa-130kDa、100kDa-140kDa、100kDa-150kDa、100kDa-160kDa及相似的希望的分子量范围。
如上所述，金黄色葡萄球菌荚膜多糖的分子量是用于免疫原性组合物中的一个考虑因素。例如，高分子量荚膜多糖由于在抗原性表面上存在的表位的较高化合价而能诱导某些抗体免疫应答。在本发明的一个实施方案中，预期分子量范围在大约20kDa-大约1000kDa的8型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在本发明的一个实施方案中，预期分子量范围在大约50kDa-大约700kDa的8型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在本发明的一个实施方案中，预期分子量范围在50kDa-300kDa的8型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量范围在70kDa-300kDa的8型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量范围在90kDa-250kDa的8型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量范围在90kDa-150kDa的8型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量范围在90kDa-120kDa的8型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。在一个实施方案中，预期分子量范围在80kDa-120kDa的8型高分子量荚膜多糖的分离和纯化。可以通过本发明的方法分离和纯化的其它范围的高分子量血清型8荚膜多糖包括分子量大小范围在大约70kDa-大约100kDa、70kDa-110kDa、70kDa-120kDa、70kDa-130kDa、70kDa-140kDa、70kDa-150kDa、70kDa-160kDa、80kDa-110kDa、80kDa-120kDa、80kDa-130kDa、80kDa-140kDa、80kDa-150kDa、80kDa-160kDa、90kDa-110kDa、90kDa-120kDa、90kDa-130kDa、90kDa-140kDa、90kDa-150kDa、90kDa-160kDa、100kDa-120kDa、100kDa-130kDa、100kDa-140kDa、100kDa-150kDa、100kDa-160kDa及相似的希望的分子量范围。
对免疫原性组合物的“免疫应答”是对感兴趣的组合物中存在的分子(例如抗原，如蛋白或多糖)在对象中产生的体液和/或细胞介导的免疫应答。对于本发明的目的，“体液免疫应答”是抗体介导的免疫应答，包括产生对本发明的免疫原性组合物中存在的抗原具有亲和性的抗体，而“细胞介导的免疫应答”是由T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。“细胞介导的免疫应答”是由与主要组织相容性复合物(MHC)I类或II类分子相关的抗原性表位的呈递引发的。这激活了抗原特异性CD4+T辅助细胞或CDS+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CTL对于与主要组织相容性复合物(MHC)或CDl编码的在细胞表面表达的蛋白相关的呈递的肽或脂质抗原具有特异性。CTL帮助诱导和促进细胞内微生物的细胞内破坏或者这种微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫性的另一方面包括辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞帮助刺激非特异性效应细胞针对在表面上展示与经典或非经典MHC分子相关的肽抗原的细胞的功能并且关注其活性。“细胞介导的免疫应答”也是指由激活的T细胞和/或其它白细胞产生的细胞因子、趋化因子及其它这种分子的产生，包括衍生自CD4+和CDS+T-细胞的那些分子。特定抗原或组合物刺激细胞介导的免疫学应答的能力可以通过许多测定法确定，如通过淋巴增殖(淋巴细胞激活)测定，CTL细胞毒性细胞测定，测定敏化对象中特异于抗原的T-淋巴细胞，或者测量应答抗原再刺激的T细胞的细胞因子产生。这种测定为本领域熟知。见例如Erickson et a1.，J.Immunol.(1993)151：4189-4199；Doe et a1.，Eur.J.Immun0l.(1994)24：2369-2376。
术语“免疫原性”是指抗原或疫苗引发体液或者细胞介导的免疫应答或者这两种免疫应答的能力。
“免疫原性量”或者“免疫学有效量”或者“剂量”在本文可互换使用，通常是指足以引发细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)免疫应答或者这两种应答的抗原或免疫原性组合物的量，所述的量通过本领域技术人员已知的标准测定法测量。
组合物中特定缀合物的量通常基于对于该缀合物而言是缀合的及非缀合的总多糖计算。例如，具有20％游离多糖的CP5缀合物是在100mcg CP5多糖剂量中具有大约80mcg缀合的CP5多糖和大约20mcg非缀合的CP5多糖。当计算缀合物的剂量时通常不考虑产生缀合物的蛋白。缀合物的量可以根据葡萄球菌血清型而变化。通常，每剂量包含0.01-100mcg多糖，特别是0.1-10mcg，更特别是1-10mcg。所述免疫原性组合物中不同多糖成分的“免疫原性量”可以是不同的，每种可包含0.01mcg、0.1mcg、0.25mcg、0.5mcg、1mcg、2mcg、3mcg、4mcg、5mcg、6mcg、7mcg、8mcg、9mcg、10mcg、15mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg或者大约100mcg任何特定多糖抗原。
在另一实施方案中，免疫原性组合物中蛋白成分的“免疫原性量”的范围可以是大约10mcg-大约300mcg每种蛋白抗原。在特定的实施方案中，免疫原性组合物中蛋白成分的“免疫原性量”的范围可以是大约20mcg-大约200mcg每种蛋白抗原。免疫原性组合物中不同蛋白成分的“免疫原性量”可以不同，每种可包含10mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、100mcg、125mcg、150mcg、175mcg或大约200mcg任何特定蛋白抗原。
可以通过测量血清中特异于抗原的循环抗体的水平测量B细胞活性水平而测定作为免疫原的抗原的效力进行，使用免疫测定、免疫沉淀测定、功能性抗体测定如体外调理作用测定及本领域已知的一些其它测定进行。作为T细胞免疫原的抗原的效力的另一种测定法可以通过增殖测定、细胞裂解测定如铬释放测定以测量T细胞裂解其特异性靶细胞的能力进行测定。此外，在本发明中，“免疫原性量”也可以通过测量施用抗原后诱导的抗原特异性抗体的血清水平或者通过测量由此诱导的抗体增强特定白细胞的调理吞噬作用能力的能力而定义，如本文所述。免疫应答的保护作用水平可以通过用已经注射的抗原攻击免疫的宿主进行测量。例如，如果希望对其产生免疫应答的抗原是细菌，则由所述抗原的“免疫原性量”诱导的保护作用水平可以通过检测用所述细菌细胞攻击动物后的存活率百分比或死亡率百分比而测量。在一个实施方案中，保护作用的量可以通过测量与细菌感染相关的至少一个症状而测定，例如与感染相关的发热症状。多抗原或多成分疫苗或免疫原性组合物中每种抗原的量随着每种其它成分而变化，这可以通过本领域技术人员已知的方法确定。这种方法包括例如测量免疫原性和/或体内效力的方法。
术语“免疫原性组合物”涉及含有抗原如微生物或其成分的任何药物组合物，所述组合物可用于在对象体内引发免疫应答。本发明的免疫原性组合物可通过全身性经皮或粘膜途径施用所述免疫原性组合物而用于治疗易患金黄色葡萄球菌感染的人。这些施用可包括通过肌肉(i.m.)、腹膜内(i.p.)、皮内(i.d.)或者皮下途径注射；通过贴剂或者其它经皮输送装置应用；或者通过粘膜施用至口腔/食管、呼吸道或泌尿生殖道。在一个实施方案中，鼻内施用用于治疗或预防金黄色葡萄球菌的鼻咽部运送(carriage)，因此减弱在最早期的感染。在一个实施方案中，所述免疫原性组合物可用于准备用于被动保护或治疗动物的疫苗或引发多克隆或单克隆抗体。
特定免疫原性组合物的成分的最佳量可以通过包括观测对象体内适当的免疫应答的标准研究确定。在最初的免疫接种之后，对象可接受足够间隔的一或几次强化免疫。
在本发明的一个实施方案中，金黄色葡萄球菌冻干的免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段(N1N2N3或其组合)。在本发明的进一步的实施方案中，金黄色葡萄球菌冻干的免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段、与CRM197缀合的分离的5型荚膜多糖及与CRM197缀合的分离的8型荚膜多糖。
本发明的免疫原性组合物可进一步包含一或多个另外的“免疫调节剂”，其是扰动或改变免疫系统的物质，由此观测到体液和/或细胞介导的免疫性的上调或下调。在一个特定的实施方案中，优选免疫系统的体液和/或细胞介导臂(arm)上调。某些免疫调节剂的实例包括例如佐剂或细胞因子，或者在美国专利5,254,339中描述的ISCOMATRIXTM(CSL Limited，Parkville，Australia)等。可用于本发明疫苗中的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.，Hamilton，Mont.)，明矾，矿物质凝胶如氢氧化铝凝胶，水包油乳状液，水包油乳状液如氟氏完全和不完全佐剂，嵌段共聚物(CytRx，Atlanta Ga.)，QS-21(Cambridge Biotech Inc.，Cambridge Mass.)，SAF-M(Chiron，Emeryville Calif.)，佐剂，皂苷，Quil A或其它皂苷级分，单磷酸脂质A，及Avridine脂质-胺佐剂。可用于本发明疫苗中的水包油乳状液的非限制性实例包括修饰的SEAM62和SEAM1/2配制物。修饰的SEAM62是水包油乳状液，含有5％(v/v)鲨烯(Sigma)、1％(v/v)85去污剂(ICI Surfactants)、0.7％(v/v)聚山梨醇酯80去污剂(ICI Surfactants)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml QuilA、100μg/ml胆固醇及0.5％(v/v)卵磷脂。修饰的SEAM1/2是水包油乳状液，含有5％(v/v)鲨烯、1％(v/v)85去污剂、0.7％(v/v)聚山梨醇酯80去污剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A及50μg/ml胆固醇。可包含在本发明组合物中的其它“免疫调节剂”包括例如一或多种白细胞介素、干扰素或者其它已知的细胞因子或趋化因子。在一个实施方案中，佐剂可以是环糊精衍生物或者聚阴离子聚合物，如美国专利6，165,995和6,610,310中分别描述的那些。应理解使用的免疫调节剂和/或佐剂依赖于要施用疫苗或免疫原性组合物的对象、注射途径和注射次数。
在本发明的进一步实施方案中，金黄色葡萄球菌冻干的免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段、与CRM197缀合的分离的5型荚膜多糖、与CRM197缀合的分离的8型荚膜多糖及重组MntC蛋白(也称作rP305A)。在一些实施方案中，所述MntC蛋白是脂化的。在其它实施方案中，所述MntC蛋白不是脂化的。在另一实施方案中，金黄色葡萄球菌免疫原性组合物是重组金黄色葡萄球菌聚集因子(ClfA)片段(N1N2N3或其组合)、重组金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其组合)、与CRM197缀合的分离的5型荚膜多糖及与CRM197缀合的分离的8型荚膜多糖的无菌配制物(液体、冻干的、DNA疫苗、皮内制备物)。
在本发明的一个实施方案中，金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段(N1N2N3或其组合)、金黄色葡萄球菌铁结合蛋白MntC、与CRM197缀合的分离的5型荚膜多糖及与CRM197缀合的分离的8型荚膜多糖。在一个实施方案中，金黄色葡萄球菌免疫原性组合物是重组金黄色葡萄球菌聚集因子(ClfA)片段(N1N2N3或其组合)、重组金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其组合)、金黄色葡萄球菌铁结合蛋白MntC、与CRM197缀合的分离的5型荚膜多糖及与CRM197缀合的分离的8型荚膜多糖的无菌配制物(液体、冻干的、DNA疫苗、皮内制备物)。
在本发明的一个实施方案中，金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其组合)、与CRM197缀合的分离的5型荚膜多糖及与CRM197缀合的分离的8型荚膜多糖。在本发明的一个实施方案中，金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其组合)、金黄色葡萄球菌铁结合蛋白MntC、与CRM197缀合的分离的5型荚膜多糖以及与CRM197缀合的分离的8型荚膜多糖。在本发明的一个实施方案中，金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌铁结合蛋白MntC、与CRM197缀合的分离的5型荚膜多糖以及与CRM197缀合的分离的8型荚膜多糖。
金黄色葡萄球菌“侵袭性疾病”是从正常无菌部位分离细菌，此部位有相关的临床迹象/疾病症状。正常的无菌身体部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、关节/滑膜液、骨、身体内部位(淋巴结、脑、心脏、肝、脾、玻璃体液、肾、胰腺、卵巢)或者其它正常无菌部位。鉴定侵袭性疾病的临床状况包括菌血症、肺炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、心内膜炎、感染性休克等。
术语“分离的”是指将材料从其原始环境中取出(例如如果其是天然发生的是从其天然环境中取出，或者如果其是重组实体则从其宿主生物体中取出，或者从一个环境移至不同环境)。例如，“分离的”荚膜多糖、蛋白或肽基本上不含来自衍生所述蛋白的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白，或者当是化学合成或者另外作为化学反应的一部分存在于混合物中时基本上不含化学前体或其它化合物。在本发明中，蛋白或多糖可分离自细菌细胞或细胞碎片，由此其以可用于生产免疫原性组合物的形式提供。术语“分离的”或“分离”可包括纯化，包括例如如本文所述的蛋白或荚膜多糖的纯化方法。语言“基本上不含细胞材料”包括多肽/蛋白的制备，其中所述多肽/蛋白与其所分离自其中或重组产生自其中的细胞的细胞成分分开。因此，基本上不含细胞材料的荚膜多糖、蛋白或肽包括具有低于大约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)的污染蛋白或多糖或其它细胞材料的荚膜多糖、蛋白或肽的制备物。当所述多肽/蛋白是重组产生的，也优选基本上不含培养基，即培养基占所述蛋白制备物体积的低于大约20％、10％或5％。当多肽/蛋白或多糖是通过化学合成产生的时，优选基本上不含化学前体或其它化合物，即其与在蛋白或多糖的合成中涉及的化合物前体或其它化合物分开。因此，这种多肽/蛋白或多糖的制备物除了感兴趣的多肽/蛋白或多糖片段之外具有低于大约30％、20％、10％、5％(干重)的化合物前体或化合物。
“非保守氨基酸取代”是指蛋白内一或多个氨基酸残基用具有不同物理和/或化学性质的其它氨基酸残基取代，使用上述特性。
术语“药物可接受的载体”是指由联邦监管机构、政府或其它监管机构许可的或者在美国药典或者其它通常被认可的药典中列出的用于动物包括人以及非人哺乳动物中的载体。术语“载体”是指用其施用所述药物组合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或者运载体。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油。水、盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可含有少量湿润剂、填充剂、乳化剂或者pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液、悬浮液、乳状液、缓释配制物等形式。举例的合适的药物载体在″Remington′sPharmaceutical Sciences″，E.W.Martin中描述。配制物应适合施用模式。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”是指氨基酸残基的聚合物，不限于最小长度的产物。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等均包含在这个定义内。该术语还包括修饰，如对天然序列的缺失、添加和取代(通常是性质保守的，但是可以是非保守的)，优选由此蛋白保留在施用所述蛋白的动物体内引发免疫学应答的能力。也包括表达后修饰，如糖基化、乙酰化、脂化、磷酸化等。
“保护性”免疫应答是指免疫原性组合物引发体液或细胞介导的免疫应答的能力，其保护对象免于感染。所提供的保护不是绝对的，即如果与对照的对象群体(如未给予所述疫苗或免疫原性组合物的感染动物)比较存在统计学显著的改善，所述感染也不需要被完全阻止或根除。保护作用可限于缓和感染症状发作的严重度或速度。通常，“保护性免疫应答”包括在至少50％的对象中诱导特异于特定抗原的抗体水平的增加，包括对每种抗原的一些可测量水平的功能性抗体应答。在特定的情况中，“保护性免疫应答”可包括在至少50％的对象中诱导特异于特定抗原的抗体水平增加两倍或者增加四倍，包括对每种抗原的一些可测量水平的功能性抗体应答。在某些实施方案中，调理抗体与保护性免疫应答相关。因此，保护性免疫应答可以通过在调理吞噬测定中测量细菌计数下降百分比而测定，例如下文所述那些。优选地，细菌计数降低至少10％、25％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。
如本文所用，术语“重组”简单地是指通过遗传工程方法产生的任何蛋白、多肽或者表达感兴趣基因的细胞。关于蛋白或多肽使用的术语“重组”是指通过重组多核苷酸的表达产生的多肽。本发明的免疫原性组合物中使用的蛋白可以分离自天然来源或者通过遗传工程方法产生，例如重组ClfA、重组ClfB或者重组MntC。如本文所用，“重组”进一步描述了核酸分子，由于其来源或操纵，其与其天然关联的多核苷酸的全部或一部分不再关联。关于宿主细胞使用的术语“重组”是指其中已经导入了重组多核苷酸的宿主细胞。
如本文所用，重组ClfA(rClfA)和重组ClfB(rClfB)是指用于本发明的免疫原性组合物中的ClfA或ClfB的形式。在某些实施方案中，rClfA是包含一或多个N结构域例如N1N2N3、N2N3、N2或N3的ClfA片段，在本文被称作“重组ClfA”或“rClfA”。在一个实施方案中，rClfB是包含一或多个ClfB的N结构域例如N1N2N3、N2N3、N2或N3的ClfB片段，在本文被称作“重组ClfB”或“rClfB”。
术语“对象”是指哺乳动物、鸟类、鱼类、爬行动物或任何其它动物。术语“对象”也包括人。术语“对象”也包括家庭宠物。家庭宠物的非限制性实例包括：狗、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、鸟类、蛇、蜥蜴、鱼类、龟和青蛙。术语“对象”也包括家畜。家畜动物的非限制性实例包括羊驼、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、马、美洲驼、骡子、驴、绵羊、山羊、兔、驯鹿、牦牛、鸡、鹅及火鸡。
如本文所用，“治疗”(包括其变化用语)是指如下任一或多种：(i)预防感染或再感染，如在传统的疫苗中，(ii)降低症状的严重性或者消除症状，及(iii)基本或完全消除所考虑的病原体或失调。因此，治疗可以是预防性(感染前)的或者治疗性(感染后)的。在本发明中，可以使用预防性或治疗性治疗。根据本发明的一个特定实施方案，提供了治疗包括预防性和/或治疗性免疫宿主动物抗微生物(例如细菌，如葡萄球菌属)感染的组合物和方法。本发明的方法可用于赋予对象预防性和/或治疗性免疫性。本发明的方法也可以应用于对象进行生物医学研究应用。
术语“疫苗”或者“疫苗组合物”可互换使用，是指包含至少一种诱导动物体内免疫应答的免疫原性组合物的药物组合物。
一般描述
本发明涉及冻干的免疫原性组合物，其包含来自葡萄球菌属生物体如金黄色葡萄球菌的抗原。在一些实施方案中，冻干的免疫原性组合物包含ClfA。在一些实施方案中，冻干的免疫原性组合物包含至少三种抗原。在一些实施方案中，冻干的免疫原性组合物包含至少四种抗原。抗原可使用生物化学分离方法分离自生物体，或者其可以合成产生或者通过重组方式产生。所述抗原可以是多肽或者多糖或者其组合。这些免疫原性组合物可用于生产疫苗以免疫对象对抗葡萄球菌生物体导致的感染。适用于这些组合物中的成分在下文更详细描述。
葡萄球菌免疫原性组合物
金黄色葡萄球菌是许多人类疾病的致病因素，范围从表面皮肤感染至危及生命的病症如肺炎、脓毒症和心内膜炎。见Lowy N.Eng.J.Med.339：580-532(1998)所述。在侵袭性疾病的情况中，金黄色葡萄球菌可以分离自正常无菌身体部位包括血液、脑脊液CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、关节/滑膜液、骨、内部身体部位(淋巴结、脑、心脏、肝脏、脾、玻璃体液、肾脏、胰腺、卵巢)，或者其它正常无菌部位。这可导致危及生命的临床状况如菌血症、肺炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、心内膜炎和感染性休克。成人、老年人和小儿患者最易处于金黄色葡萄球菌感染危险中。
本发明的实施方案描述了在冻干的免疫原性组合物中的选择的抗原，所述组合物包含分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。对一些冻干的免疫原性组合物的配制物进行检测，以证实ClfA蛋白增加的稳定性。对一些冻干的免疫原性组合物的配制物进行检测，以证实MntC蛋白的稳定性。对一些冻干的组合物的配制物也进行检测，以确保CP5-蛋白缀合物和CP8-蛋白缀合物在冻干后是稳定的。
因此，一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽。一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(CIfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽，分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖及与载体蛋白缀合的分离的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。一种冻干的免疫原性组合物包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。
在一些实施方案中，上述组合进一步包含至少一种如下抗原：EkeS，DsqA，KesK，KrkN，KrkN2，RkaS，RrkN，KnkA，SdrC，SdrD，SdrE，Opp3a，DltD，HtsA，LtaS，IsdA，IsdB，IsdC，SdrF，SdrG，SdrH，SrtA，SpA，Sbi，α-溶血素(hla)，β-溶血素，纤连蛋白-结合蛋白A(fnbA)，纤连蛋白-结合蛋白B(fnbB)，凝固酶，Fig，map，Panton-Valentine杀白细胞素(pvl)，α-毒素及其变体，γ-毒素(hlg)及变体，ica，免疫显性ABC转运蛋白，Mg2+转运蛋白，Ni ABC转运蛋白，RAP，自溶素，层粘连蛋白受体，IsaA/PisA，IsaB/PisB，SPOIIIE，SsaA，EbpS，SasA，SasF，Sash，EFB(FIB)，SBI，Npase，EBP，骨唾液结合蛋白II，溶金菌素(aureolysin)前体(AUR)/Seppl，Cna，及其片段如M55，TSST-1，mecA，聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG/dPNAG)外泌多糖，GehD，EbhA，EbhB，SSP-1，SSP-2，HBP，玻连蛋白结合蛋白，HarA，EsxA，EsxB，肠毒素A，肠毒素B，肠毒素C1，以及新的自溶素。
佐剂
如本文所述冻干的免疫原性组合物在某些实施方案中也包含一或多种佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是干燥的冻干组合物的一种成分。在其它实施方案中，所述佐剂可以加入至重建的冻干组合物中，之后给患者施用该组合物。佐剂是一种当与免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答的物质。许多细胞因子或淋巴因子已经示出具有免疫调节活性，因此可用作佐剂，包括但不限于白细胞介素1-α，1-β，2，4，5，6，7，8，10，12(见例如美国专利5,723，127)，13，14，15，16，17和18(及其突变形式)；干扰素-α、β和γ；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(见例如美国专利5,078,996和ATCC登录号39900)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；以及肿瘤坏死因子α和β。可用于本文描述的免疫原性组合物中的其它佐剂包括趋化因子，包括但不限于：MCP-1，MIP-1α，MIP-1β和RANTES；粘附分子，如选择蛋白，如L-选择蛋白，P-选择蛋白和E-选择蛋白；粘蛋白样分子，如CD34，GlyCAM-1和MadCAM-1；整联蛋白家族成员，如LFA-1，VLA-1，Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族成员，如PECAM，ICAMs如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3；共刺激分子，如B7-1，B7-2，CD40和CD40L；生长因子，包括血管生长因子，神经生长因子，成纤维细胞生长因子，表皮生长因子，PDGF，BL-1及血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas，TNF受体，Flt，Apo-1，p55，WSL-1，DR3，TRAMP，Apo-3，AIR，LARD，NGRF，DR4，DR5，KILLER，TRAIL-R2，TRICK2和DR6；以及胱天蛋白酶(ICE)。
用于增强免疫应答的合适佐剂进一步包括但不限于MPLTM(3-O-脱酰基的单磷酰脂质A，Corixa，Hamilton，MT)，其在美国专利4,912,094中描述。也适合用作佐剂的是合成的脂质A类似物或氨基烷基磷酸葡糖胺化合物(AGP)，或者其衍生物或类似物，其可得自Corixa(Hamilton，MT)，在美国专利6，113，918中描述。一种这样的AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-0-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也被称作529(先前称作RC529)。这个529佐剂是作为水溶液形式(AF)或者稳定乳状液(SE)形式配制的。
再其它的佐剂包括胞壁肽，如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰-Sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳状液，如MF59(美国专利6,299,884)(含有5％鲨烯，0.5％聚山梨醇酯80和0.5％SPANTM85(任选含有不同量的MTP-PE)，使用微流体仪如Model110Y微流体仪(Microfluidics，Newton，MA)配制为亚微米颗粒)，及SAF(含有10％鲨烯、0.4％聚山梨醇酯80、5％pluronic嵌段聚合物L121和thr-MDP，微流体化为亚微米颗粒乳状液或者涡旋产生较大颗粒大小乳状液)；不完全氟氏佐剂(IFA)；铝盐(明矾)，如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝；Amphigen；Avridine；L121/鲨烯；D-交酯-聚交酯/葡糖苷；pluronic多元醇；灭活的博特氏菌(Bordetella)；皂苷类，如在美国专利5,057,540中描述的STIMULONTM QS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，在美国专利5,254,339中描述的ISCOMATRIXTM(CSL Limited，Parkville，Australia)，以及免疫刺激复合物(ISCOMATRIXTM)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；细菌脂多糖；合成的多核苷酸如含有CpG基序的寡核苷酸(如美国专利6,207,646所述)；在欧洲专利1,296,713和1,326,634中描述的IC-31(Intercell AG Vienna，Austria)；百日咳毒素(PT)或其突变体，霍乱毒素或其突变体(如美国专利7,285,281、7,332,174、7,361，355和7,384,640所述)；或者大肠杆菌不耐热毒素(LT)或其突变体，特别是LT-K63，LT-R72(如美国专利6，149,919、7，115,730和7,291，588所述)。
在一些实施方案中，所述佐剂是ISCOMATRIXTM(见例如Davis et a1.，Proc.Nat’1.Acad.Sci.，2004，101(29)：10697-10702)。
候选抗原：
ClfA：结构域组构
聚集因子A(ClfA)是金黄色葡萄球菌表面蛋白，与通过血纤蛋白原结合位点结合宿主基质蛋白相关。ClfA是含有羧基末端LPXTG(SEQ ID NO：125)基序的蛋白家族成员，其使得该蛋白变得与细胞表面共价连接。ClfA也属于另一蛋白家族(微生物表面成分识别粘附基质分子，或者MSCRAMMs)，其与结合宿主蛋白如血纤蛋白原(由ClfA结合)、纤连蛋白结合蛋白(FnbA和FnbB)、胶原结合蛋白(Cna)等相关。这些蛋白均共有氨基末端信号序列，其介导转运至细胞表面。MSCRAMMs也包含A-结构域，其是含有配体结合(如血纤蛋白原、纤连蛋白、弹性蛋白、角蛋白)的活性位点的功能区。A-结构域随后是由丝氨酸天冬氨酸重复(SD重复)组成的区域，其被认为跨越肽聚糖层。所述SD重复随后是跨膜区，其包含LPXTG(SEQID NO：125)基序以使所述蛋白与肽聚糖共价连接。ClfA在美国专利6,008,341中描述。
包含A结构域的N1N2N3的ClfA配体结合区(图1)跨越氨基酸40-559。ClfA的N结构域已经如下分配：N1涵盖残基45-220，N2涵盖残基229-369，N3涵盖残基370-559。见Deivanayagam et a1.EMBO J.21：6660-6672(2002)所述。简便起见，N1N2N3结构域可以称作N123，同样N2N3可以称作N23。在重组N1N2N3的制备中，已经发现N1结构域是蛋白酶敏感性的，易于被裂解或水解，以使N2N3成为稳定的配体结合重组片段。参见Deivanayagam et a1.EMBO J.21：6660-6672(2002)。结合ClfA A结构域的N2N3片段的血纤蛋白原的晶体结构揭示N2和N3均主要为反平行β链。除了反平行β链之外，N2结构域还含有一个单转角(single turn)α螺旋和两个310螺旋，N3结构域含有三个310螺旋。见Deivanayagam et a1.EMBO J.21：6660-6672(2002)所述。N2与N3的序列比对表明在其全长仅13％的序列相同性和36％的序列相似性。见Deivanayagam et a1.EMBO J.21：6660-6672(2002)所述。N2与N3结构域的拓扑结构与典型的IgG折叠相似，已经提议是IgG折叠新的变体。见Deivanayagam et a1.EMBO J.21：6660-6672(2002)所述。
本发明揭示了包含稳定的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽的组合物及产生该组合物的方法，其可用作免疫原性组合物或疫苗。本发明还揭示了包含稳定的ClfA多肽、CP5缀合物和CP8缀合物(三抗原)的组合物，及产生这种组合物的方法，其可用作免疫原性组合物或疫苗。本发明进一步揭示了包含稳定的ClfA多肽、CP5缀合物、CP8缀合物及MntC多肽(四抗原)的组合物，及产生这种组合物的方法，其可用作免疫原性组合物或疫苗。已知ClfA是不稳定的蛋白，其易于在N1和N2结构域之间剪切。本发明涉及ClfA配制物，其使得ClfA N1N2N3在加速的应激条件下基本保持至少三个月不降解。在一些实施方案中，所述配制物是冻干的组合物，其包含少于3％的水分。术语“冻干的组合物”是指这样的配制物，其包含低于3％的水分，不意味着限制所述组合物为产生所述组合物的方法，如冻干或任何其它干燥混合物的方法或者组合干燥的配料。加速的应激条件，是指极端温度、pH和/或离子强度的条件，通常用于检测配制物的稳定性，如37℃几周或更多时间。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及稳定的组合物，其包含基本上不降解的ClfA蛋白和低于3％的水分。在一个实施方案中，本发明涉及稳定的组合物，其包含基本上不降解的ClfA蛋白、5型荚膜多糖(CP5)缀合物、CP8缀合物及低于3％的水分。在一个实施方案中，本发明涉及稳定的组合物，其包含基本上不降解的ClfA蛋白、5型荚膜多糖(CP5)缀合物、CP8缀合物、MntC蛋白和低于3％的水分。所述ClfA蛋白可分离自任何葡萄球菌属菌株，或者其可以是重组多肽。重组ClfA多肽可具有野生型序列，可包含一或多个突变，或者其氨基酸序列与野生型序列可以是至少90％相同的。表1描述了一些金黄色葡萄球菌菌株及其各自的ClfA DNA和蛋白序列。
表1：ClfA菌株和序列表
ClfA序列
称作ClfA的聚集因子蛋白A的基因已经在分子水平充分克隆、测序和分析(McDevitt et a1.，Mo1.Microbiol.11：237-248(1994)；McDevitt et a1.，Mo1.Microbiol.16：895-907(1995))。来自111个金黄色葡萄球菌致病分离株的ClfA的氨基酸序列的序列标识符示于表1。来自金黄色葡萄球菌菌株PFESA0237的全长(包括信号序列)野生型ClfA的氨基酸序列示于SEQ IDNO：130。这个序列示出在338位置的酪氨酸，在ClfA突变形式中被改变为丙氨酸。编码来自金黄色葡萄球菌菌株PFESA0237的野生型ClfA的全长基因示于SEQ ID NO：131，其包含N123区、重复区和锚区。ClfA的Y338A突变形式的氨基酸序列示于SEQ ID NO：123。然而，应注意在ClfA的突变形式中酪氨酸改变为丙氨酸在野生型ClfA中是在SEQ ID NO：130的338位置发生，将其命名为Y338A，在SEQ ID NO：123中是在310位置发生。此外，SEQ ID NO：123所示氨基酸序列的ClfA突变形式是无信号序列的ClfA成熟形式，因此说明了SEQ ID NO：130与SEQ ID NO：123之间这个突变的位置不同。
在一个实施方案中，ClfA蛋白包含SEQ ID NO：123序列，其包含Y388A突变，消除血纤蛋白原结合。
在一些实施方案中，ClfA蛋白不需要是全长的，可由第50-597位氨基酸组成(根据SEQ ID NO：130编号，但是可基于任何ClfA蛋白)。
在一些实施方案中，ClfA蛋白包含或者基本由N1结构域、N2结构域和N3结构域组成。在一些实施方案中，ClfA蛋白包含N结构域。N结构域是指N1结构域、N2结构域或者N3结构域。
ClfA蛋白、它们的生产和使用的方法在2009年6月22日申请的共同未决专利申请美国专利申请系列号61/219，134中描述，所述专利在此以其全部内容援引加入本文。ClfA蛋白也在国际专利申请PCT/US2010/039510中描述，所述专利以其全部内容援引加入本文。
稳定的是指ClfA在加速的或其它应激条件及延长的时间如贮存期间保持基本不降解。基本不降解是指至少70％、80％、90％、95％或99％的总累积ClfA多肽含有包含N1序列和另外的N2和/或N3的序列的多肽。完整的是指ClfA蛋白含有至少N1、N2和N3结构域。在一些实施方案中，ClfA在37℃保持稳定至少两周，至少一个月，或者至少三个月。
在一些实施方案中，本发明的冻干的组合物含有完整的ClfA，其量低于1％冻干的免疫组合物总重量(1％[w/w])。在一些实施方案中，所述ClfA的量在0.09％±0.027％与0.85％±0.26％之间。
ClfB：结构或组构
ClfB是金黄色葡萄球菌蛋白，具有血纤蛋白原结合活性并且在存在血浆时触发金黄色葡萄球菌形成簇(clumps)。ClfB是MSCRAMM蛋白，展示特征性MSCRAMM结构域组构，包含A-结构域，其是含有配体结合(如血纤蛋白原、纤连蛋白、弹性蛋白、角蛋白)的活性位点的功能区。A-结构域随后是由丝氨酸天冬氨酸重复(SD重复)组成的区域，其被认为跨越肽聚糖层。SD重复随后是跨膜区，其包含LPXTG(SEQ ID NO：125)基序以使蛋白与肽聚糖共价连接。ClfB在WO99/27109和美国专利6,680,195中描述。
ClfB N-末端A结构域的内部组构与在ClfA中发现的组构非常相似。A结构域由三个亚结构域N1、N2和N3组成。包含A结构域的N1N2N3的ClfB配体结合区跨越氨基酸44-585。为简便起见，N1N2N3结构域可以被称作N123，同样N2N3可以被称作N23。ClfB的N结构域已经如下分配：N1涵盖残基44-197，N2涵盖残基198-375，及N3涵盖残基375-585。在ClfA中，发现A结构域的晶体结构具有免疫球蛋白折叠的独特形式，由此类推ClfB也如此。见Deivanayagam et a1.，EMBO J.21：6660-6672(2002)所述。即使ClfB和ClfA的A结构域的组构是相似的，但是序列相同性仅为26％。见Ni Eidhin et a1.，Mo1.Microbio1.30：245-257(2002)所述。
ClfB序列
编码ClfB的基因被分类为核心粘附基因。来自与多种疾病状态相关的92个金黄色葡萄球菌菌株的ClfB序列在图42中概括示出。其它序列得自GenBank。
其它MSCRAMMS
其它MSCRAMMS可被考虑用于本发明的免疫原性组合物中。例如，丝氨酸天冬氨酸重复(Sdr)蛋白、SdrC、SdrD和SdrE在一级序列和结构组构方面与ClfA和ClfB蛋白是相关的，并且位于细胞表面上。所述SdrC、SdrD和SdrE蛋白是细胞壁相关蛋白，具有在N末端的信号序列及在C末端的LPXTG(SEQ ID NO：125)基序、疏水性结构域和带正电荷残基。每一个还具有含有足够长度的R区的SD重复，以使得与B基序一起在细胞表面上有效表达配体结合结构域A区。鉴于SdrC、SdrD和SdrE蛋白的A区位于细胞表面上，所述蛋白可与血浆中的蛋白、胞外基质或者与宿主细胞表面上的分子相互作用。Sdr蛋白与ClfA和ClfB呈现一些有限的氨基酸序列相似性。与ClfA和ClfB相同，SdrC、SdrD和SdrE也呈现出胞外基质蛋白的阳离子依赖性配体结合。
sdr基因是紧密连接及串联排列的。(SdrC、SdrD、SdrE、ClfA和ClfB的)Sdr蛋白特征性包含A区，在此其具有高度保守的氨基酸序列，可用于获得共有的TYTFTDYVD(SEQ ID NO：126)基序。所述基序在不同蛋白之间呈现出稍有变化。这种变化与所述基序的共有序列在美国专利6,680,195中描述。在Clf-Sdr蛋白中，这个基序是高度保守的。所述基序可用于免疫原性组合物中以赋予对细菌感染的广谱免疫性，也可以在单克隆或多克隆抗体的生产中用作抗原。这种抗体可用于赋予广谱被动免疫性。
Sdr蛋白与ClfA和ClfB的不同在于位于A区与R区之间2-5个另外的110113个残基重复序列(B基序)。每个B基序含有正常在真核细胞蛋白中发现的一个共有的Ca2+-结合EF-手环。包含SdrD的5个B重复的重组蛋白的结构完整性通过bisANS荧光分析示出是Ca2+-依赖性的，提示EF手是功能性的。当除去Ca2+时，该结构坍塌为未折叠构象。原始结构通过添加Ca2+恢复。Sdr蛋白的C末端R结构域含有132-170个SD残基。随后是许多革兰氏阳性菌表面蛋白的特征性的保守锚壁区。
在Sdr和Clf蛋白中，这个B基序是高度保守的，变性形式发生在纤连蛋白结合MSCRAMMS以及胶原结合蛋白Can中。所述B基序与R区联合是在与细胞表面相距一定距离展示配体结合结构域所必需的。重复的B基序是本文描述的SD重复蛋白亚组的一个共同性。发现这些基序在来自菌株PFESA0237的三个Sdr蛋白中数目不同。在各个B基序之间存在明显区别。最保守的单位是位于与R区相邻的那些(SdrC B2，SdrD B5和SdrEB3)。其在一些位点、尤其是在C末端一半与其余的不同。值得注意的结构详情是C末端区域中存在的相邻的B重复总是由脯氨酸残基分开，但是脯氨酸从不发生在最后的B重复与R区之间。代替地，这个接头特征在于一段短的酸性序列。这些差异是明显的，末端单位与其它B基序相比具有不同结构或功能作用。SdrD和SdrE的N末端B基序与其余的疏远，存在许多氨基酸改变，包括小的插入和缺失，而剩余的内部B基序是更高度保守的。注意三个Sdr蛋白的每一个均具有每一类的至少一个B基序。
Sdr蛋白的C末端R结构域含有132-170个SD残基。这些残基随后是许多革兰氏阳性菌表面蛋白的特征性的保守锚壁区。
其它候选的SdrD分子可以衍生自不同物种的生物体，以用于本发明的免疫原性组合物中，其中一些包括来自如下金黄色葡萄球菌的SdrD：菌株USA300FPR3757(蛋白登录号SAUSA3000547)，菌株NCTC8325(蛋白登录号SAOUHSC00545)，菌株MW2(蛋白登录号MW0517)，菌株MSSA476(蛋白登录号SAS0520)，及菌株Mu50(蛋白登录号SAV0562)。
可考虑用于本发明的免疫原性组合物中的其他MSCRAMMS包括EkeS，DsqA，KesK，KrkN，KrkN2，RkaS，RrkN和KnkA。这些MSCRAMMS在WO02/102829中描述，所述专利援引加入本文。以GenBank登录号标示的其它MSCRAMMS包括NP_373261.1，NP_373371.1，NP_374246.1，NP_374248.1，NP_374841.1，NP_374866.1，NP_375140.1，NP_375614.1，NP_375615.1，NP_375707.1，NP_375765.1和NP_375773.1。
5型和8型荚膜多糖
能导致侵袭性疾病的葡萄球菌属微生物通常也能产生荚膜多糖(CP)，其包被细菌并增强其对于宿主天然免疫系统清除的抗性。CP使细菌细胞掩盖在保护性荚膜中，使得细菌对于吞噬作用和细胞内杀灭具有抗性。缺少荚膜的细菌对于吞噬作用更易感。荚膜多糖对于许多细菌病原体包括流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和B族链球菌通常是重要的毒力因子。
荚膜多糖可用于对特定细菌物种确定血清型。分型通常是通过与针对荚膜多糖特征性的特异性结构或独特表位产生的特异性抗血清或单克隆抗体反应而实现的。荚膜包被的细菌趋于在平滑集落中生长，而失去荚膜的细菌菌落看起来是粗糙的。产生粘液样外观的菌落已知是大量荚膜包被的(Heavily Encapsulated)。1型和2型金黄色葡萄球菌是大量荚膜包被的，很少与疾病相关。
大多数的金黄色葡萄球菌临床分离株是用血清型5型或8型荚膜包被的。5型(CP5)和8型(CP8)荚膜多糖具有相似的三糖重复单位，由N-乙酰甘露糖胺糖醛酸(N-acetyl mannosaminuronic acid)、N-乙酰L-岩藻糖胺和N-乙酰D-岩藻糖胺组成。见Foumier，J.M.et a1.，Infect.Immun.45：97-93(1984)和Moreau，M.，et a1.，Carbohydrate Res.201：285-297(1990)所述。这两个CP具有相同的糖，但是糖链接和O乙酰化位点不同以产生血清学独特的免疫反应性模式。
在一些实施方案中，本发明的血清型5型和/或8型荚膜多糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中，5型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度是10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。在一些实施方案中，8型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度是10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或者80-90％。在一些实施方案中，5型和8型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度是10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或80-90％。
多糖或寡糖的O-乙酰化程度可以通过本领域已知的任何方法确定，例如通过质子NMR(Lemercinier and Jones1996，Carbohydrate Research296；83-96，Jones and Lemercinier2002，J Pharmaceutical and Biomedical Analysis30；1233-1247，WO05/033148或WO00/56357)确定。另一常用的方法在Hestrin(1949)J.Bio1.Chem.180；249-261中描述。
在一些实施方案中，本发明的血清型5型和/或8型荚膜多糖用于产生功能性抗体，通过在动物效力模型或者在证实所述抗体杀灭细菌的调理吞噬杀灭测定中通过杀灭细菌而测量。这种功能性使用只监测抗体产生的测定法也许观测不到，其不指示O-乙酰化在效力中的重要性。
荚膜流行病学
通过监测临床分离株能使特定荚膜血清型与疾病关联。在鉴别的金黄色葡萄球菌的8个不同血清型中(Karakawa and Vann(1982))，仅血清型1和2是大量荚膜包被的，且这些很少被分离。见Capsular Polysaccharides ofStaphylococcus aureus，p.285-293，In J.B.Robbins，J.C.Hill and J.C.Sadoff(ed.)，Seminars in infectious disease，vo1.4，Bacterial Vaccines.Thieme Stratton，Inc.New York所述。调查示出大约85-90％的金黄色葡萄球菌临床分离株表达CP5或CPS(Arbeit RD，et a1.，Diagn.Microbio1.Infect.Dis.(1984)Apr；2(2)：85-91；Karakawa WW，et a1.，J.Clin.Microbio1.(1985)Sep；22(3)：445-7；Essawi T，et a1.，Trop.Med.Int.Health.(1998)Jul；3(7)：576-83；Na′was T，et a1.，J.Clin.Microbio1.(1998)36(2)：414-20)。大多数CP5和CP8不可分型(non-typeable)菌株在遗传上是在cap5/8基因座含有突变的5型或8型(Cocchiaro，Gomez et a1.，(2006)，Mo1.Microbio1.Feb.59(3)：948-960)。一些菌株的荚膜化在体外的几次传代中快速丧失，这是由于临床诊断中使用的培养基中高磷酸盐浓度对于荚膜产生的抑制作用所致。也有报道非荚膜包被的分离株在通过奶牛传代后恢复荚膜表达。见Opdebeck，J.P.et a1.，J.Med.Microbio1.19：275-278(1985)所述。一些不可分型菌株在合适的生长条件下成为荚膜阳性的。
CP5和CP8结构
CP5和CP8的重复单位均由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-甘露糖醛酸、2-乙酰氨基-2-脱氧-L-海藻糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-海藻糖组成。见C.Jones et a1.，Carbohydr.Res.340：1097-1106(2005)所述。尽管CP5和CP8具有相同的糖组成，但是已经证实其是免疫学不同的。区别在于糖醛酸的糖苷键和O-乙酰化位点。观测到FucNAc残基之一的菌株依赖性不完全N-乙酰化。见Tzianabos et a1.，PNAS V98：9365(2001)所述。
免疫原性组合物中金黄色葡萄球菌荚膜多糖
金黄色葡萄球菌荚膜多糖的分子量是用于免疫原性组合物中需要重点考虑的因素。高分子量荚膜多糖由于抗原性表面上存在的表位的高化合价而能诱导一些抗体免疫应答。本文描述的方法提供了对比先前可获得的高得多的分子量的5型和8型荚膜多糖的分离和纯化。
MntC/SitC/唾液结合蛋白
MntC/SitC/唾液结合蛋白是ABC转运蛋白，并在表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中具有同系物。在本发明中被称作MntC。这个蛋白是32kDa脂蛋白，位于细菌细胞壁中。见Sellman et a1.，and Cockayne et a1.，Infect.Immun.66：3767(1998)所述。在表皮葡萄球菌中，其是铁调节操纵子的成分。其示出与粘附蛋白包括副血链球菌(S.parasanguis)的FimA及与具有经证实或推定的金属铁转运功能的ABC转运蛋白家族的脂蛋白的相当大的同源性(见关于金黄色葡萄球菌菌株和序列的表2)。
金黄色葡萄球菌MntC蛋白
MntC的金黄色葡萄球菌同系物已知为唾液结合蛋白，在美国专利5,801,234中揭示，并且可以包含在本发明的免疫原性组合物中。MntC/SitC/唾液结合蛋白的金黄色葡萄球菌同系物的蛋白序列见于菌株Mu50的GenBank登录号NP_371155(也称作SAV0631)。序列标识符是SEQ IDNO：134。菌株Mu50的完整基因组的核苷酸序列的登录号是NC_002758.2。在GenBank登录号NP_371155中发现的蛋白序列的编码DNA序列的坐标为704988-705917(SEQ ID NO：135)。在某些实施方案中，MntC的N末端被裂解，如SEQ ID NO：119示出(多肽序列)和SEQ ID NO：136示出(编码该多肽的核苷酸序列)。来自不同金黄色葡萄球菌菌株的MntC序列在图43中概括示出。
表皮葡萄球菌SitC蛋白
MntC/SitC/唾液结合蛋白的表皮葡萄球菌同系物称作SitC，在Sellmanet a1.，(Sellman et a1.，Infect.Immun.2005October；73(10)：6591-6600)中揭示。MntC/SitC/唾液结合蛋白的表皮葡萄球菌同系物的蛋白序列见于GenBank登录号YP_187886.1(也称作SERP0290)。序列标识符是SEQ IDNO：132。
菌株RP62A的完整基因组的核苷酸序列的登录号是NC_002976。见于GenBank登录号YP_187886.1的蛋白序列的编码DNA序列的坐标是293030-293959(SEQ ID NO：133)。相应N末端截短形式的SitC示于SEQ IDNO：121(多肽序列)和SEQ ID NO：137(编码该多肽的核苷酸序列)。其它候选SitC分子可衍生自不同物种生物体以用于本发明的免疫原性组合物中，其中一些列于下表2中。
表2
蛋白 菌种 举例的菌株 蛋白登录号
SitC 溶血葡萄球菌(S.haemolyticus) JCSCl435 BAE03450.1
SitC 表皮葡萄球菌 ATCC 12228 AAO04002.1
SitC 腐生葡萄球菌(S.saprophyticus) ATCC 15305 BAEl9233.1
SitC 木糖葡萄球菌(S.xylosus) DSM20267 ABR57162.1
SitC 肉葡萄球菌(S.camosus) TM300 CAL27186.1
金黄色葡萄球菌铁结合蛋白
考虑用于本发明的免疫原性组合物中的另一潜在的候选抗原包括金黄色葡萄球菌表面蛋白铁表面决定簇B(IsdB)。这个MSCRAMM在Mazmanian et al.(Mazmanian，SK et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，USA99：2293-2298(2002))中描述，其随后被检测并示出在感染的鼠模型和恒河猴免疫原性研究中是有效的疫苗候选物，见Kuklin，et al.(Kuklin，NA，et al.Infection and Immunity，Vol.74，No.4，2215-2223，(2006))所述。这个IsdB分子存在于各种金黄色葡萄球菌菌株中，包括菌株MRSA252(蛋白登录号CAG40104.1)，菌株Newman(蛋白登录号BAF67312.1)，菌株MSSA476(蛋白登录号CAG42837.1)，菌株Mu3(蛋白登录号BAF78003.1)，菌株RFl22(蛋白登录号CAl80681.1)。
候选抗原
本发明的免疫原性组合物也可包含一或多种如下抗原：Opp3a，DltD，HtsA，LtaS，IsdA，IsdC，SdrF，SdrG，SdrH，SrtA，SpA，Sbi，α-溶血素(hla)，β-溶血素，纤连蛋白-结合蛋白A(fnbA)，纤连蛋白-结合蛋白B(fnbB)，凝固酶，Fig，map，Panton-Valentine杀白细胞素(pvl)，α-毒素及其变体，γ-毒素(hlg)及变体，ica，免疫显性ABC转运蛋白，Mg2+转运蛋白，Ni ABC转运蛋白，RAP，自溶素，层粘连蛋白受体，IsaA/PisA，IsaB/PisB，SPOIIIE，SsaA，EbpS，Sas A，SasF，SasH，EFB(FIB)，SBI，Npase，EBP，骨唾液结合蛋白II，溶金菌素前体(AUR)/Seppl，Cna，及其片段如M55，TSST-1，mecA，聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG/dPNAG)外泌多糖，GehD，EbhA，EbhB，SSP-1，SSP-2，HBP，玻连蛋白结合蛋白，HarA，EsxA，EsxB，肠毒素A，肠毒素B，肠毒素C1，及新的自溶素。在本发明的某些实施方案中，当所述免疫原原性组合物包含某些形式的CP5和/或CP8时，其可不进一步包含PNAG。
免疫原性组合物配制
在一个实施方案中，本发明的冻干的免疫原性组合物进一步包含如下至少一种物质：佐剂，缓冲剂，冷冻保护剂，盐，二价阳离子，非离子去污剂，自由基氧化抑制剂，填充剂，或者载体。
本发明的免疫原性组合物除了多个葡萄球菌蛋白抗原和荚膜多糖-蛋白缀合物之外，可进一步包含一或多种防腐剂。FDA要求多剂量小瓶中的生物学产物含有防腐剂，仅小部分除外。含有防腐剂的疫苗产物包括含有苄索氯铵(炭疽)、2-苯氧乙醇(DTaP，HepA，Lyme，Polio(肠胃外))、苯酚(Pneumo，Typhoid(肠胃外)，Vaccinia)和硫柳汞(DTaP，DT，Td，HepB，Hib，流感，JE，Mening，Pneumo，狂犬病)的疫苗。许可用于可注射药物中的防腐剂包括如氯丁醇、m-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞和硝酸苯汞。
本发明的配制物可进一步包含如下一或多种物质：缓冲剂、盐、二价阳离子、非离子去污剂、冷冻保护剂如糖、填充剂及抗氧化剂如自由基清除剂或螯合剂或者其任何多种组合。任一成分如螯合剂的选择可以确定另一成分(如清除剂)是否需要。施用的配制的最终组合物应是无菌和/或无热原的。技术人员可根据各种因素如要求的特定贮存和施用条件根据经验确定这些与其它成分的哪种组合对于包括在本发明的含防腐剂的免疫原性组合物中是最佳的。
在一些实施方案中，冻干的组合物进一步含有缓冲剂，其pKa为6.0±0.6，量低于3％(w/w)。在某些实施方案中，配制物被缓冲为pH在大约6.0-大约9.0的范围，优选大约7.5-大约7.5。在一些实施方案中，所述缓冲剂浓度为2.54％±0.76％(w/w)。在一些实施方案中，所述缓冲剂包含琥珀酸盐，pH为6.0±0.6。在一些实施方案中，所述缓冲剂包含组氨酸，pH为6.0±0.6。在一些实施方案中，所述缓冲剂包含组氨酸，pH为6.5±0.6。表3列出了可用于本发明中的一些非限制性缓冲剂实例。
表3：缓冲剂
缓冲剂 pH范围 pKa
马来酸盐 4.0-6.0 5.13
吡啶 4.9-5.9 5.23
哌嗪(pKl) 5.0-6.0 5.33
二甲基胂酸盐 5.0-7.4 6.27
琥珀酸盐 5.5-6.5 5.64
MES 5.5-6.7 6.10
柠檬酸盐 5.5-7.2 6.40
马来酸盐 5.5-7.2 6.24
组氨酸 5.5-7.4 1.70，6.04，9.09
bis-tris 5.8-7.2 6.46
磷酸盐 5.8-8.0 7.20
ADA 6.0-7.2 6.59
碳酸盐 6.0-8.0 6.35
在某些实施方案中，可以调节本发明冻干的免疫原性组合物或配制物的pH。本发明配制物的pH可以使用本领域标准技术调节。所述配制物的pH可以调节至3.0-8.0。在某些实施方案中，所述配制物的pH可以是或者可以调节为3.0-6.0、4.0-6.0、5.0-7.0或者5.0-8.0。在其它实施方案中，所述配制物的pH可以是或可以调节为大约3.0、大约3.5、大约4.0、大约4.5、大约5.0、大约5.5、大约5.8、大约6.0、大约6.5、大约7.0、大约7.5或者大约8.0。在某些实施方案中，所述pH可以是或者可以调节为4.5-7.5，或者4.5-6.5、5.0-5.4、5.4-5.5、5.5-5.6、5.6-5.7、5.7-5.8、5.8-5.9、5.9-6.0、6.0-6.1、6.1-6.2、6.2-6.3、6.3-6.4、6.4-6.5、6.5-6.6、6.6-6.7、6.7-6.8、6.8-6.9、6.9-7.0、6.5-7.0、7.0-7.5或7.5-8.0。在特定的实施方案中，所述配制物的pH为大约6.0。在特定的实施方案中，所述配制物的pH为大约6.5。
在一些实施方案中，冻干的免疫原性组合物包含填充剂。所述填充剂通常使所述组合物膨大并促进药物可见，所述药物通常每剂的量很低由此药物的干燥沉淀物不可见或者几乎不可见，和/或防止活性配料从小瓶中喷出，例如在冻干期间。填充剂也可以促进药剂沉淀。填充剂也可以作为冷冻保护剂。各种冷冻保护剂在常规的教科书如Remington：The Science andPractice of Pharmacy，Vo1.2，19th edition(1995)中描述。
填充剂的非限制性实例包括糖醇，如糖醇，甘露醇，山梨糖醇，肌醇及聚乙二醇，糖酸，如醛糖酸，糖醛酸和醛糖二酸，碳水化合物如醛糖，酮糖，氨基糖，糖醇，肌醇，醛糖酸，糖醛酸，醛糖二酸，单、二、或多碳水化合物，甘油醛，阿拉伯糖，来苏糖，戊糖，核糖，木糖，半乳糖，葡萄糖，己糖，艾杜糖，甘露糖，塔罗糖，庚糖，葡萄糖，果糖，葡糖酸，山梨糖醇，乳糖，甘露醇，甲基a-吡喃葡糖苷，麦芽糖，异抗坏血酸，抗坏血酸，内酯，山梨糖，葡糖二酸，赤藓糖，苏糖，阿拉伯糖，阿洛糖，阿卓糖，古洛糖，艾杜糖，塔罗糖，赤藓酮糖，核酮糖，木酮糖，阿洛酮糖，塔格糖，葡糖醛酸，葡糖酸，葡糖二酸，半乳糖醛酸，甘露糖醛酸，葡糖胺，半乳糖胺，蔗糖，海藻糖，神经氨酸，阿拉伯聚糖，果聚糖，岩藻聚糖，半乳聚糖，聚半乳糖醛酸，葡聚糖，甘露聚糖，木聚糖(例如菊粉)，果聚糖，岩藻多糖，角叉藻聚糖，半乳卡洛糖，果胶，果胶酸，直链淀粉，普鲁兰，糖原，支链淀粉，纤维素，葡聚糖，石耳素，壳多糖，琼脂糖，角蛋白，软骨素，皮肤素，透明质酸，褐藻酸，黄原胶(xanthin gum)，或者淀粉。
在一些实施方案中，填充剂是蔗糖、甘露醇、甘氨酸和山梨糖醇的任一或多种。在一些实施方案中，填充剂是蔗糖。在一些实施方案中，蔗糖大于91％(w/w)。在一些实施方案中，蔗糖是96％±2.0％(w/w)。
在某些实施方案中，与胃肠外施用相容的冻干的或重建的冻干的组合物的配制物包含一或多种二价阳离子，包括但不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2，浓度为大约0.1mM-大约10mM，优选直至大约5mM。
在某些实施方案中，与胃肠外施用相容的冻干的或重建的冻干的组合物的配制物包含一或多种盐，包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾，离子强度在胃肠外施用时对于对象是生理学可接受的，包括在终浓度在最终配制物中产生选择的离子强度或者摩尔渗透压浓度。配制物的最终离子强度或重量摩尔渗透压浓度由多种成分(如来自缓冲化合物的离子及其它非缓冲盐确定。优选的盐，NaCl，范围直至大约250mM，选择的盐浓度与其它成分(如糖)互补，以便配制物的最终总摩尔渗透压浓度与胃肠外施用(如肌肉注射或皮下注射)相容，并将促进免疫原性组合物配制物的免疫原性成分在各种温度范围的长期稳定性。无盐配制物将耐受增加的一或多种选择的冷冻保护剂范围，以维持希望的最终摩尔渗透压浓度水平。
在某些实施方案中，与胃肠外施用相容的冻干的或者重建的冻干的组合物的配制物包含一或多种冷冻保护剂，选自但不限于二糖(如乳糖、麦芽糖、蔗糖或海藻糖)及多羟基烃(如半乳糖醇、甘油醇、甘露醇和山梨糖醇)。
在某些实施方案中，重建的冻干的配制物的摩尔渗透压浓度在大约200mOs/L-大约800mOs/L范围，优选大约250mOs/L-大约500mOs/L，或者大约300mOs/L-大约400mOs/L。重建的冻干的配制物可含有例如大约0％-大约25％蔗糖、大约3％-大约15％、大约5-大约10％蔗糖。或者，重建的冻干的配制物可含有例如大约3％-大约12％山梨糖醇。如果加入盐如氯化钠，则蔗糖或山梨糖醇的有效范围可以相对降低或者不降低。这些及其它这样的重量摩尔渗透压浓度和摩尔渗透压浓度考虑为本领域技术人员熟知。
在某些实施方案中，与胃肠外施用相容的本发明的冻干的或重建的冻干的配制物包含一或多种自由基氧化抑制剂和/或螯合剂。本领域已知多种自由基清除剂和螯合剂，并应用于本文所述配制物和使用方法中。例子包括但不限于乙醇、EDTA、EDTA/乙醇组合、三乙醇胺、甘露醇、组氨酸、甘油、柠檬酸钠、六磷酸肌醇、三聚磷酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、琥珀酸/琥珀酸盐、苹果酸/苹果酸盐、去铁胺(desferal)、EDDHA和DTPA，及上述两或更多种物质的不同组合。在某些实施方案中，可以加入至少一种非还原自由基清除剂，浓度为有效增强所述配制物的长期稳定性。也可以加入各种组合的一或多种自由基氧化抑制剂/螯合剂，如清除剂和二价阳离子。螯合剂的选择将确定是否需要加入清除剂。
在一些实施方案中，冻干的免疫原性组合物包含低于0.5％(w/w)的表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂为0.21％±0.04％(w/w)。表面活性剂在配制物中具有多种非限制性作用，包括如作为佐剂，作为乳化剂及作为增溶剂。例如，在一些实施方案中，表面活性剂作为增溶剂以阻止药物即ClfA蛋白粘留在容器或注射器壁上，及因此不被恢复或输送。表面活性剂也用于防止可能的聚集发生，如当或如果ClfA蛋白与来自瓶塞的硅氧烷润滑油接触时。用于免疫原性组合物和疫苗中的表面活性剂在Ascarateiland Dupuis，Vaccine，24(2006)：S83-S85中描述。简而言之，非限制性的表面活性剂包括脂多糖(LPS)，皂苷，二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)，嵌段共聚物，或者泊洛沙姆，其是环氧乙烷(EO)与环氧丙烷(PO)的随机聚合物，脱水山梨糖糖酯，其可以是脱水山梨糖醇单或三油酸酯及其是由山梨糖醇与油酸通过酯键连接制成的及是乙氧基化的(即聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯80)，磷脂如卵磷脂，及二缩甘露糖醇油酸酯(mannide oleates)，其是油酸与甘露醇的酯。
在一些实施方案中，表面活性剂是任一或多种的泊洛沙姆，聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij58，Brij35，以及其它如Triton X-100，Triton X-114，NP40，Span85及Pluronic系列非离子表面活性剂(如Pluronic121)，及聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，其包括聚山梨醇酯。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯-80(吐温80)，聚山梨醇酯-60(吐温60)，聚山梨醇酯-40(吐温40)或者聚山梨醇酯-20(吐温20)。在一些实施方案中，聚山梨醇酯80(吐温80)为0.20％±0.042％(w/w)。
在一些实施方案中，特别是其中冻干的组合物不含有佐剂的那些实施方案中，水溶液稀释剂包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂是ISCOMATRIXTM。
在一些实施方案中，特别是其中冻干的组合物不含有表面活性剂的实施方案中，稀释剂包含表面活性剂，如聚山梨醇酯80。
在一些实施方案中，液体免疫原性组合物包含完整的rClfA多肽，如本文所述，其浓度在20μg/ml±2μg/ml与800μg/ml±80μg/ml之间，包括如20μg/ml±2μg/ml、40μg/ml±4μg/ml、200μg/ml±20μg/ml、400μg/ml±40μg/ml、600μg/ml±60μg/ml和800μg/ml±80μg/ml。在一些实施方案中，液体免疫原性组合物包含完整ClfA多肽，其浓度在40μg/ml±4μg/ml与800μg/ml±80μg/ml之间。在一些实施方案中，液体免疫原性组合物包含(a)完整的rClfA多肽，如本文所述，其浓度在20μg/ml±2μg/ml与800μg/ml±80μg/ml之间，包括如20μg/ml±2μg/ml、40μg/ml±4μg/ml、200μg/ml±20μg/ml、400μg/ml±40μg/ml、600μg/ml±60μg/ml、和800μg/ml±80μg/ml；(b)CP5-CRM197缀合物，在10μg/ml±1μg/ml与400μg/ml±40μg/ml之间，包括如10μg/ml±1μg/ml、20μg/ml±2μg/ml、100μg/ml±10μg/ml、200μg/ml±20μg/ml和400μg/ml±40μg/ml；(c)CP8-CRM197缀合物，在10μg/ml±1μg/ml与400μg/ml±40μg/ml之间，包括如10μg/ml±1μg/ml、20μg/ml±2μg/ml、100μg/ml±10μg/ml、200μg/ml±20μg/ml和400μg/ml±40μg/ml；(d)组氨酸缓冲剂，为大约5mM-大约50mM、大约5mM-大约25mM及大约5mM-大约15mM；(e)聚山梨醇酯80，大约0.05％-大约0.5％、大约0.075％-大约0.25％及大约0.1％-大约0.2％重量/体积(w/v)；及(f)蔗糖，浓度为大约0％-大约25％蔗糖，大约3％-大约15％，大约5-大约10％w/v。在其它实施方案中，聚山梨醇酯80的浓度为0.01％±0.005％重量/体积(w/v)，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。在一些实施方案中，液体免疫原性组合物包含：(a)完整rClfA多肽，如本文所述，其浓度在20μg/ml±2μg/ml与800μg/ml±80μg/ml之间，包括例如20μg/ml±2μg/ml、40μg/ml±4μg/ml、200μg/ml±20μg/ml、400μg/ml±40μg/ml、600μg/ml±60μg/ml及800μg/ml±80μg/ml；(b)CP5-CRM197缀合物，在10μg/ml±1μg/ml与400μg/ml±40μg/ml之间，包括如10μg/ml±1μg/ml、20μg/ml±2μg/ml、100μg/ml±10μg/ml、200μg/ml±20μg/ml及400μg/ml±40μg/ml；(c)CP8-CRM197缀合物，在10μg/ml±1μg/ml与400μg/ml±40μg/ml之间，包括如10μg/ml±1μg/ml、20μg/ml±2μg/ml、100μg/ml±10μg/ml、200μg/ml±20μg/ml及400μμ/ml±40μg/ml；(d)MntC多肽，在20μg/ml±2μg/ml与800μg/ml±80μg/ml之间，包括例如20μg/ml±2μg/ml、40μg/ml±4μg/ml、200μg/ml±20μg/ml、400μg/ml±40μg/m、600μg/ml±60μg/ml及800μg/ml±80μg/ml；(e)组氨酸缓冲剂，大约5mM-大约50mM、大约5mM-大约25mM及大约5mM-大约15mM，(f)聚山梨醇酯80，大约0.05％-大约0.5％、大约0.075％-大约0.25％及大约0.1％-大约0.2％重量/体积(w/v)；以及(g)蔗糖，浓度为大约0％-大约25％蔗糖、大约3％-大约15％及大约5-大约10％w/v。在另一实施方案中，聚山梨醇酯80浓度为0.01％±0.005％重量/体积(w/v)，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在一些实施方案中，尤其是在其中冻干的组合物和稀释剂均不含佐剂的实施方案中，液体免疫原性组合物与佐剂组合。
在一个实施方案中，本发明提供了产生免疫原性组合物的方法，包括如下步骤：(a)在水性介质中组合：(i)聚集因子A多肽(rClfA)，(ii)缓冲剂，pKa为大约6.0±0.6，及(iii)填充剂；以及(b)冻干步骤(a)的组合以形成块状物，其含有少于3％重量的水。在一个实施方案中，本发明提供了产生免疫原性组合物的方法，其包括如下步骤：(a)在水性介质中组合：(i)聚集因子A多肽(rClfA)，(ii)CP5-CRM197缀合物，(iii)CP8-CRM197缀合物，(iv)缓冲剂，pKa为大约6.0±0.6，及(v)填充剂；以及(b)冻干步骤(a)的组合以形成块状物，其含有少于3％重量的水。在一个实施方案中，本发明提供了产生免疫原性组合物的方法，其包括如下步骤：(a)组合水溶液，其包含：(i)聚集因子A多肽(rClfA)，(ii)CP5-CRM197缀合物，(iii)CP8-CRM197缀合物，(iv)分离的MntC多肽，(v)缓冲剂，pKa为大约6.0±0.6，及(vi)填充剂；以及(b)冻干步骤(a)的组合以形成块状物，其含有少于3％重量的水。本发明的免疫原性组合物可用于预防或治疗金黄色葡萄球菌感染。在一些实施方案中，所述块状物是白色的，具有海绵样构造。
“冻干”是指冷冻-干燥(冷冻干燥)材料的方法。通常，冻干方法包括冷冻材料，然后降低环境压力及提供足够的热度以使得材料中的冷冻水升华。在一些情况中，冻干包括最初的冷冻步骤，初次干燥(升华)步骤，二次干燥，主要是消除剩余的最终微量的水。在一些情况中，包括复性步骤以改良块状物特性及改良升华。见Lyophilization of Biopharmaceuticals，HenryCostatino and Michael Pikal，eds.，AAPS Press，Arlington VA，2004关于冻干的更详细讨论。
“块状物(cake)”通常是指在冻干过程后剩下的干燥的材料。块状物表观依赖于通过冷冻形成的固体基质结构，及受在冻干过程期间各种参数影响。在冻干方法中加入复性步骤通常可导致更均一的块状物表观。
在一些实施方案中，在步骤(a)将表面活性剂如聚山梨醇酯80与rClfA、缓冲剂和填充剂组合。在一些实施方案中，所述表面活性剂的浓度为大约0.1％±0.05％(w/v)。在其它实施方案中，表面活性剂的浓度为0.01％±0.005％w/v。
在一些实施方案中，在步骤(a)中形成的水性组合含有完整的rClfA多肽，浓度在20gg/m1±2μg/ml与800μμ/m1±80μg/ml之间，包括例如20μg/m1±2μg/ml、40μg/m1±4μg/ml、200μg/m1±20μg/ml、400μg/m1±40μg/ml、600μg/mi±60μg/ml和800μg/m1±80μg/ml。在一些实施方案中，在步骤(a)中形成的水性组合含有完整的rClfA多肽，浓度在20μg/m1±2μg/ml与800μg/m1±80μg/ml之间，包括例如20μg/m1±2μg/ml、40μg/m1±4μg/ml、200μg/m1±20μg/ml、400μg/m1±40μg/ml、600μg/m1±60μg/ml和800μg/m1±80μg/ml；CP5-CRM197缀合物，在10μg/m1±1μg/ml与400μg/m1±40μg/ml之间，包括例如10μg/m1±1μg/ml、20μg/m1±2μg/ml、100μg/m1±10μg/ml、200μg/m1±20μg/ml和400μg/ml±40μg/ml；CP8-CRM197缀合物，在10μg/m1±1μg/ml与400μg/m1±40μg/ml之间，包括例如10μg/m1±1μg/ml、20μg/m1±2μg/ml、100μg/m1±10μg/ml、200μg/m1±20μg/ml和400μg/m1±40μg/ml；组氨酸缓冲剂，10mM±5mM；聚山梨醇酯80，0.1％±0.05％重量/体积(w/v)；以及蔗糖，浓度为9％±4.5％w/v。在另一实施方案中，聚山梨醇酯80浓度为0.01％±0.005％w/v，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在一些实施方案中，在步骤(a)中形成的水性组合含有完整的rClfA多肽，浓度在40μg/m1±4μg/ml与800μg/m1±80μg/ml之间，包括例如40μg/m1±4μg/ml、200μg/m1±20μg/ml、600μg/m1±60μg/ml和800μg/m1±80μg/ml；CP5-CRM197缀合物，在10μg/m1±1μg/ml与400μg/m1±40μg/ml之间，包括如10μg/m1±1μg/ml、20μg/m1±2μg/ml、100μg/m1±10μg/ml、200μg/m1±20μg/ml和400μg/m1±40μg/ml；CP8-CRM197缀合物，在10μg/m1±1μg/ml与400μg/m1±40μg/ml之间，包括如10μg/m1±1μg/ml、20μg/m1±2μg/ml、100μg/m1±10μg/ml、200μg/m1±20μg/ml和400μg/m1±40μg/ml；MntC多肽，在40μg/m1±4μg/ml与800μg/m1±80μg/ml之间，包括例如40μg/m1±4μg/ml、200μg/m1±20μg/ml、600μg/ml±60μg/ml和800μg/ml±80μg/ml；组氨酸缓冲剂，10mM±5mM；聚山梨醇酯80，0.1％±0.05％重量/体积(w/v)；及蔗糖，浓度为9％±4.5％w/v。在另-实施方案中，聚山梨醇酯80的浓度为0.01％±0.005％重量/体积(w/v)，蔗糖浓度为4.5％±1.5％w/v。
在一些实施方案中，冻干步骤包括如下步骤：(i)冷冻所述水性组合，(ii)复性所述水性组合，及(iii)在两个阶段干燥所述组合。在一个实施方案中，(i)冷冻是通过以0.3α±0.03℃/分钟降低水性组合的温度至-50℃±5℃，压力为400毫巴±40毫巴，然后保持60分钟±6分钟；(ii)复性是以0.3℃±0.03℃/分钟的速度提高温度至-10℃±5℃，随后在-10℃±5℃温度保持120分钟±12分钟，随后以0.3℃±0.03℃/分钟的速度降低温度直至达到-50℃±5℃温度，然后在-50℃±5℃温度保持180分钟±18分钟；(iii)第一个干燥阶段是通过降低压力至50毫托(mTorr)并保持30分钟±3分钟，随后以0.2℃±0.02℃/分钟的速度提高温度至-30℃±5℃，然后在此温度保持1,920分钟±192分钟；及(iv)第二个干燥阶段是以0.2℃±0.02℃/分钟的速度提高温度至30℃±5℃，随后增加压力至200mTorr并在30℃±5℃温度保持720分钟±72分钟。在某些实施方案中，冷冻是在大约1013毫巴(1大气压)进行。在某些实施方案中，冷冻是在直至1013毫巴(1大气压)进行。在某些实施方案中，干燥时间可以是大约2,600分钟。在某些实施方案中，干燥时间可以直至2,600分钟。在某些实施方案中，干燥温度是40℃±5℃，50℃±5℃，或者60℃±5℃。在最后的干燥步骤之后，将冻干的组合物的温度以0.5℃±0.05℃/分钟的速度降低至5℃±5℃。在某些实施方案中，冻干在小瓶中进行。在一些实施方案中，在冻干后将小瓶用瓶塞塞住。在一些实施方案中，小瓶在用瓶塞塞住之前用氮气回填，在局部真空如在60％大气压下塞住。
在一个实施方案中，所述方法还包括在水性稀释剂中重建冻干的组合物的步骤，其中重建的组合的重量摩尔渗透压浓度为300mOsm±30mOsm。在一些实施方案中，水性稀释剂是水。在一些实施方案中，水性稀释剂是60mM NaCl。
在一个实施方案中，本发明提供了根据上述方法生产的免疫原性组合物。
在某些实施方案中，本发明的配制物包含适于胃肠外施用的一或多种另外的稳定剂，如还原剂，其包含至少一个硫醇(一SH)基团(如半胱氨酸，N一乙酰半胱氨酸，还原的谷胱甘肽，硫代乙酸钠，硫代硫酸盐，一硫代甘油，或者其混合物)。或者或任选，本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物配制物可以通过从贮存容器中除去氧、避光保存(如使用琥珀玻璃容器)而进一步稳定。
本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物配制物可包含一或多种药物可接受载体或赋形剂，包括其自身不诱导免疫应答的任何赋形剂。合适的赋形剂包括但不限于大分子如蛋白、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖(Paoletti et al、2001、Vaccine、19：2118)、海藻糖、乳糖及脂质聚集物(如油滴或脂质体)。这种载体为本领域技术人员熟知。药物可接受赋形剂在例如Gennaro，2000，Remington：The Science and Practice ofPharmacy，20th edition，ISBN：0683306472中论述。
在一个实施方案中，本发明提供了液体免疫原性组合物，其是通过如本文所述将冻干的免疫原性组合物在水性稀释剂中重建而生产的。在一些实施方案中，水性稀释剂是水。在其它实施方案中，水性稀释剂是低盐溶液。低盐溶液是指盐浓度在大约1mM-大约200mM之间、优选大约1mM一大约100mM之间的水溶液。在一些实施方案中，所述盐是氯化钠。在一些实施方案中，所述低盐溶液包含60mM±6mM氯化钠。在一些实施方案中，所述液体免疫原性组合物的pH为6.0±0.6。在一些实施方案中，所述液体免疫原性组合物的pH为6.5±0.6。
术语“稀释剂”是指能悬浮、稀释或溶解任何物质的液体。在一些实施方案中，所述物质是含有ClfA多肽的冻干的组合物。在一些实施方案中，所述稀释剂是水性的及使所述冻干的组合物溶解。
将本发明的重建的冻干的免疫原性组合物直接输送给对象可以通过胃肠外施用(肌肉，腹膜内，皮内，皮下，静脉内或者组织细胞间隙)，或者通过直肠、口腔、阴道、局部、经皮、鼻内、眼内、耳内、肺部或其它粘膜施用进行。在优选的实施方案中，胃肠外施用是通过肌肉注射，如注射至对象的大腿或上臂。可以通过针头注射(如皮下注射器针头)，但是可以使用无针头注射。典型的肌肉注射剂量是0.5mL。本发明的组合物可以各种形式制备，如作为液体溶液或悬浮液注射。
特定免疫原性组合物的成分的最佳量可以通过标准研究确定，包括观测对象体内适当的免疫应答。在初次接种之后，对象可接受适当间隔的一或几次加强免疫。
包装和剂量形式
本发明的免疫原性组合物可以以单位剂量或多剂量(例如2剂，4剂或更多)形式包装。在某些实施方案中，所述剂量是在重建冻干的免疫原性组合物之后0.5mL的剂量。见例如国际专利申请W02007/127668，该专利援引加入本文。
组合物可以存在于小瓶或其它合适的贮存容器中，或者可以存在于预先充填的输送装置中，如单成分或多成分注射器，其可以配有或不配有针头。注射器典型但不必需含有单剂量的含有防腐剂的本发明的免疫原性组合物，也可以预期是多剂量预先充填的注射器。同样，小瓶可以包含单剂量，也可以包括多剂量。
有效剂量体积可以常规确定，但是注射用重建的冻干的组合物的典型剂量为0.5mL体积。在某些实施方案中，所述剂量是根据施用给人类对象而配制的。在某些实施方案中，配制所述剂量用于施用给成人、青少年、少年、幼童或婴儿(即不超过一岁)的人类对象，在优选的实施方案中可以通过注射施用。
本发明的免疫原性组合物可以冻干和重建，如使用本领域熟知的多种冷冻干燥方法之一以形成干燥的规则形状(如球形)颗粒，如微丸(micropellet)或微球，其具有颗粒特性如平均直径大小可以通过改变制备其的实际方法而选择和控制。免疫原性组合物可进一步包含佐剂，其任选可以制备或者包含于单独的干燥的规则形状(如球形)颗粒如微丸或微球中。在一个实施方案中，本发明进一步提供了免疫原性组合物试剂盒，其包含第一成分和第二成分，第一成分包含冻干的免疫原性组合物，任选进一步包含一或多种本发明的防腐剂，第二成分包含无菌水溶液以重建第一成分。在某些实施方案中，所述水溶液包含一或多种防腐剂，及可任选包含至少一种佐剂(见例如W02009/109550(援引加入本文)。
在另一实施方案中，多剂量形式的容器选自但不限于如下一或多种：一般的实验室玻璃器皿，烧瓶，烧杯，带刻度的圆筒，发酵罐，生物反应器，试管，管，袋，罐，小瓶，小瓶封口(vial closures)(如橡胶瓶塞，螺旋盖)，安瓿，注射器，双腔或多腔注射器，注射器塞，注射器活塞，橡胶封口，塑料封口，玻璃封口，药筒和一次性笔等。本发明的容器不受生产材料限制，包括如玻璃、金属(如钢、不锈钢、铝等)和聚合物(如热塑性塑料，人造橡胶，热塑性弹性材料)等材料。在一特定实施方案中，容器形式是5mL Schott Type1玻璃瓶，具有丁基合成橡胶瓶塞。技术人员意识到上述形式无论如何不是穷举列出，只是作为可为本发明利用的多种形式的给予技术人员的指导。预期用于本发明中的其它形式可见于来自实验室设备供应商和生产商的目录，如United States Plastic Corp.(Lima，OH)，VWR。
免疫原性组合物的评估
在一个实施方案中，本发明提供了包含来自金黄色葡萄球菌生物体的至少一种抗原的免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明提供了包含来自金黄色葡萄球菌生物体的至少三种抗原的免疫原性组合物。在一个实施方案中，本发明提供了包含来自金黄色葡萄球菌生物体的至少四种抗原的免疫原性组合物。
许多体外检测可用于评估本发明免疫原性组合物的免疫原性。例如，可以通过将葡萄球菌细胞、含有所研究抗原的特异性抗体的热灭活血清与外源补体来源的混合物一起保温而进行体外调理测定。调理吞噬作用在新鲜分离的多形核细胞(PMN′s)或分化的效应细胞如HL60及抗体/补体/葡萄球菌属细胞混合物的保温期间进行。用抗体和补体包被的细菌细胞在调理吞噬作用时被杀死。从调理吞噬作用中恢复的存活细菌的菌落形成单位(cfu)可以通过铺板该测定混合物确定。效价报告为通过与测定对照对比而确定的提供50％细菌杀灭的最高稀释度的倒数。
全细胞ELISA测定也可用于体外评估抗原的免疫原性和表面暴露，其中感兴趣的细菌菌株(金黄色葡萄球菌)包被于平板上如96孔平板，将来自免疫的动物的检测血清与细菌细胞反应。如果特异于检测抗原的任何抗体与抗原的表面暴露的表位反应，其可以通过本领域技术人员已知的标准方法检测。
然后可以在体内动物攻击模型中检测证实希望的体外活性的任何抗原。在某些实施方案中，免疫原性组合物可用于通过本领域技术人员已知的免疫方法和途径(如鼻内、胃肠外、口服、直肠、阴道、经皮、腹膜内、静脉内、皮下等途径)免疫动物(如小鼠)。在用特定的葡萄球菌免疫原性组合物对动物进行免疫之后，将该动物用葡萄球菌攻击，测定对葡萄球菌感染的抗性。
在一个实施方案中，可以用金黄色葡萄球菌免疫和攻击无病原体小鼠。例如，将小鼠用免疫原性组合物中一或多剂的希望的抗原免疫。随后，将小鼠用金黄色葡萄球菌攻击，在攻击后随时间监测存活。
免疫方法
本发明还提供了免疫宿主以预防葡萄球菌感染的方法。在优选的实施方案中，所述宿主是人。因此，给宿主或对象施用本发明所述的免疫原性量的免疫原性组合物。免疫原性组合物的免疫原性量可以通过进行剂量应答研究确定，其中将对象用梯度增加的量的免疫原性组合物免疫，分析免疫应答以确定最佳剂量。该研究的起始点可以从动物模型中免疫数据推导。所述剂量可以根据个体的特定条件而变化。所述量可以由本领域技术人员在常规试验中确定。在一些实施方案中，免疫宿主以预防葡萄球菌感染、疾病或病症的方法包括人、兽医、动物或农业治疗。另一实施方案提供了免疫宿主以在对象中预防与葡萄球菌相关的葡萄球菌感染、疾病或病症的方法，所述方法包括从本文所述免疫原性组合物产生多克隆或单克隆抗体制备物，及使用所述抗体制备物赋予对象被动免疫性。
所述免疫原性组合物的免疫学有效量以适当数目的剂量施用给对象以引发免疫应答。治疗的个体应不呈现出更严重的葡萄球菌感染临床表现。所述剂量根据个体的具体状况如年龄和体重而可以改变。这个量可以通过本领域技术人员已知的方式在常规试验中确定。
在一个实施方案中，被施用了本发明免疫原性组合物的患者示出金黄色葡萄球菌携带率(carriage rates)降低。在施用免疫原性组合物后这种携带率降低或者作为非携带者的时间间隔延长从医学需要观点上是显著的。例如，携带者中整体金黄色葡萄球菌携带的降低可以在给予一剂金黄色葡萄球菌多抗原疫苗之后评定。例如，在施用免疫原性组合物前一天，筛选年龄在18-50岁的一组成人的携带情况，通过鼻和咽拭子擦拭随后培养以确定携带状态。接着，给该组施用本发明的免疫原性组合物，一组接受对照。施用所述免疫原性组合物之后在12周时间每周及在6个月的时间每月进行鼻和咽拭子擦拭并与安慰剂对比。一个最初的终点是对比施用免疫原性组合物与安慰剂后患者在免疫后3个月间隔的携带率。
葡萄球萄感染的动物模型
下文描述了一些动物模型用于评定本发明所述任一免疫原性组合物的功效。
鼠脓毒症模型(被动或主动)
被动免疫模型
将小鼠通过腹膜内(i.p.)免疫IgG或单克隆抗体进行被动免疫。24小时后将小鼠用致死剂量的金黄色葡萄球菌攻击。通过静脉内(i.v.)或i.p.施用细菌攻击，确保任何存活可以归因于抗体与细菌的特异的体内相互作用。细菌攻击剂量被确定为需要达到大约20％未免疫对照小鼠致命脓毒症的剂量。通过Kaplan-Meier分析进行存活研究的统计学评估。
主动免疫模型
在这个模型中，用靶抗原在第0、3和6周(或者其它相似的适当间隔的接种方案)对小鼠(例如Swiss Webster小鼠)进行腹膜内(i.p.)或皮下(s.c.)主动免疫，随后在第8周通过静脉内途径用金黄色葡萄球菌攻击。细菌攻击剂量校准为实现对照组中在10-14天期间大约20％存活。通过Kaplan-Meier分析进行存活研究的统计学评估。
感染性心内膜炎模型(被动或主动)
由金黄色葡萄球菌所致感染性心内膜炎(IE)的被动免疫模型先前已经用于示出ClfA可诱导保护性免疫性。见Vemachio et a1.，Antmicro.Agents&Chemo.50：511-518(2006)。在这个IE模型中，兔或大鼠用于模拟临床感染，包括中心静脉导管、菌血症和血性传播至远端器官。给具有无菌主动脉瓣植入体的插入导管的兔或大鼠施用单一或多次静脉内注射特异于所述靶抗原的单克隆或多克隆抗体。随后，将动物用金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌株经i.v.攻击。在攻击之后，采集心脏、心脏植入体及其它组织包括肾和血液并培养。然后测量心脏组织、肾和血液中葡萄球菌感染频率。在一项研究中，当动物用MRSE ATCC35984或MRSA67-0攻击时，使用ClfA的多克隆抗体制备物或者单克隆抗体示出感染率明显降低。见Vernachioet a1.，Antmicro.Agents&Chemo.50：511-518(2006)。
感染性心内膜炎模型已经调试用于兔和大鼠的主动免疫研究中。兔或大鼠用靶抗原经肌肉或皮下免疫并在2周后通过静脉内途径用金黄色葡萄球菌攻击。
肾盂肾炎模型
在肾盂肾炎模型中，在第0、3和6周(或者其它合适间隔的免疫方案)用靶抗原免疫。随后，将动物用金黄色葡萄球菌PFESA0266通过i.p.或i.v.进行攻击。48小时后，收获肾脏，计数细菌CFU。
抗体及抗体组合物
本发明进一步提供了抗体及抗体组合物，其特异性和选择性结合本发明免疫原性组合物的一或多种抗原。在一些实施方案中，抗体是在给对象施用本发明的免疫原性组合物时产生的。在一些实施方案中，本发明提供了针对本发明免疫原性组合物的一或多种抗原的纯化的或分离的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体是功能性的，通过在动物效力模型或者通过在调理吞噬性杀灭测定中杀灭细菌而测量。在一些实施方案中，本发明的抗体赋予对象被动免疫性。本发明进一步提供了编码本发明抗体或抗体片段的多核苷酸分子，及使用本领域技术人员熟知的技术产生本发明的抗体或抗体组合物的细胞或细胞系(如杂交瘤细胞或其它工程化细胞系以重组产生抗体)和转基因动物。
本发明的抗体或抗体组合物可用于治疗或预防对象中与葡萄球菌相关的葡萄球菌感染、疾病或病症的方法中，所述方法包括产生多克隆或单克隆抗体制备物，使用所述抗体或抗体组合物赋予所述对象被动免疫性。本发明的抗体也可用于诊断方法，如检测本发明免疫原性组合物的一或多种抗原的存在或者量化其水平。
实施例
如下实施例证实本发明的一些实施方案。然而，应理解这些实施例只是举例说明目的，无限制本发明的条件和范围之意。应意识到当给出典型的反应条件(如温度、反应时间等)时，虽然不太便利但也可以使用高于和低于指定范围的条件。除非特别指出，本文提及的所有分数和百分比均是基于重量，所有温度均以摄氏度表示。
此外，除了另外详细描述之外，使用本领域技术人员熟知及常规使用的标准技术进行如下实施例。如下实施例只是例证目的，不以任何方式限制本发明的范围。
本发明揭示了稳定的冻干的三抗原配制物，其包含重组聚集因子A(rClfA)，5型荚膜多糖缀合物(CP5-CRM197)和8型荚膜多糖缀合物(CP8-CRM197)，其已经作为金黄色葡萄球菌疫苗或免疫原性组合物而产生。在一个特定的实施方案中，rClfA是表面表达的毒力因子的突变形式，被工程化为减少其与血纤蛋白原的结合亲和性(Y388A)(rClfAm)。CP5和CP8是在临床分离株中常见的多糖，在这种疫苗中与载体蛋白CRM197缀合。
产生的冻干的块状物在外观上是合适的，活性成分在重建该冻干的块状物时是稳定的。此外，在实时(2-8℃)和加速(25℃和37℃)温度条件下多批次冻干的配制物的一个月贮存(高剂量和低剂量)示出所述冻干的三抗原配制物保持稳定。此外，在重建后在室温进行3次冷冻-解冻循环和24小时稳定性测试，均示出所述活性成分在这些条件下的稳定性。
本发明还揭示了稳定的冻干的四抗原配制物，其包含重组ClfA、CP5-CRM197、CP8-CRM197和MntC，其已经作为金黄色葡萄球菌疫苗或免疫原性组合物而产生。在一个特定实施方案中，ClfA是表面表达的毒力因子的突变形式，被工程化为减小其与血纤蛋白原的结合亲和性(Y388A)。在一个特定的实施方案中，MntC不是脂化的。在一个特定的实施方案中，MntC是重组的。与三抗原配制物一样，冻干的四抗原配制物与包含相同抗原的液体配制物相比具有明显增加的稳定性。
虽然已经通过举例方式描述了本发明的一些实施方案，但显然在不偏离本发明精神或者超出权利要求书请求保护的范围下对本发明可以进行许多修饰、变化和调试，及使用许多等价物或者其它溶液，这些为本领域技术人员已知。
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均以其全部内容援引加入本文，就如每篇出版物、专利或专利申请被特异及各自表明以其全文援引加入本文一样。
实施例1：预配制方法学
使用多种生物物理学工具(导数UV吸收光谱学，荧光光谱学，圆二色性(CD)和差示扫描量热法(DSC)检测金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)蛋白在结构稳定性方面的固有特性。温度和pH是可变参数，用于对蛋白施加应激作用以帮助鉴定ClfA蛋白的固有结构属性。然后将这个数据用于筛选赋形剂，以便可以为所述蛋白提供额外的稳定性。而且，进行结合研究以评定ClfA对AlPO4和Al(OH)3的剂量-和pH-依赖性亲和性。本发明揭示的数据用于获得ClfA配制物，用于生物医学应用，如作为疫苗或免疫原性组合物。
虽然本发明涉及任何及所有聚集因子A(ClfA)蛋白和包含ClfA的配制物，但如下实施例使用ClfA变体，其包含ClfA的N1N2N3结构域并具有Y338A取代，包含丙氨酸取代在相应于全长ClfA的第338位的酪氨酸，其缺少结合血纤蛋白原的能力。
为最初生物物理学鉴定准备的样品包含在150mM NaCl中的10mM缓冲液(乙酸盐、琥珀酸盐或磷酸盐)。ClfA的大约靶浓度为0.1mg/mL(对于荧光)，0.2mg/mL(圆二色性(CD)，和0.5mg/mL(UV吸收光谱学)。
蛋白浓度使用可商购的Modified Lowry蛋白测定(Pierce；Lowry et al.J.Bi01.Chem.；193：265-275[1951])或者UV吸收光谱学确定。
使用Jasco J-810分光偏振计进行圆二色性(CD)分析以评定所述免疫原性组合物或疫苗中ClfA蛋白的二级结构。当所述蛋白在pH5.0-8.0配制时，pH对ClfA结构的影响通过观测CD光谱中定性差异进行检查。此外，温度扰动(temperature perturbation)实验在218nm从10℃至85℃进行，以从二级结构透视观测蛋白的构象稳定性。选择218nm的波长，因为已知ClfA的N2N3结构包含大量β-折叠结构。CD扫描的实验参数包括波长范围190-260nm，扫描速度20nm/分钟，响应时间2秒，带宽lnm，累积3次(3)。温度扰动实验使用Jasco软件中可变温度(Variable Temperature)模式进行，使用温度斜坡率(temperature ramp rate)为15℃/小时，响应时间1秒钟，带宽1nm。
使用固有色氨酸荧光发射光谱学监测ClfA蛋白的三级结构作为温度函数的改变。所述方法也用于观测实时及加速研究期间蛋白结构中的改变。荧光光谱录制在PTI QM-1(Brunswick，NJ)荧光计上，激发波长295nm。使用的蛋白浓度为～0.1mg/mL。色氨酸的发射光谱特性在320～350nm之间使用1-em光路石英杯监测。在4.0-8.0的一系列pH值在10℃-85℃(2.5℃间隔)获得荧光数据。进行对照实验，使用缓冲液作为空白进行背景校准。仪器设定包括激发和发射带宽分别为4nm和3nm，积分时间(integration time)为1秒，数据收集波长范围是290nm-400nm。对于含有AlP04的配制物，使用front-face(三角形)比色皿几何学以避免样品的浊度限制。使用7.0进行数据分析，使用二阶多项式11-点Savitsky-Golay函数(second-orderpolynomial11-point Savitsky-Golay function)用于平滑。
使用二阶导数UV吸收光谱学的温度扰动实验用作检查ClfA三级结构以评定固有蛋白稳定性的另一方法。多波长UV可见吸收光谱得自200nm-400nm，使用装备Peltier温度控制仪的Agilent8453UV-可见二极管阵列分光计。所有实验均使用1-em光路的石英杯，使用100μL体积。对于熔融实验，在每次温度改变之后容许4分钟，这被认为足以达到平衡。也收集与作为温度函数的在350nm的光密度数据，以监测ClfA蛋白的潜在聚集。
使用CHEMSTATIONTM软件(Agilent)进行光谱分析。二阶导数光谱使用9点数据滤波器获得并拟合至三次(third-degree)Savitzky-Golay多项式。所述导数光谱在每1-纳米间隔插入99个数据点，提供在非聚集条件下大约0.0lnm的有效分辨率。使用MICROCAL ORIGINTM6.0选择导数光谱的峰位。鉴别相应于氨基酸残基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的峰位(基于Kueltzoet al.，JPharm Sci.2003；92(9)：1805-1820的方法)，并作为温度函数绘图。
使用TOSOH TSK-GEL G3000SWxl柱，7.8mm x30cm，5μm，Partnumber08541进行大小排阻层析，条件如下：流速，0.5mL/min；最大压力，60巴；运行时间，30分钟；流动相，Cellgro PBS，pH7.4；注射体积，100μL；检测仪，UV280，260，214nm，4nm带宽(全部)；参考，340nm，16nm带宽；温度，25℃。
ClfA蛋白的熔融温度(Tm)通过差示扫描量热法(DSC)确定。针对在与ClfA样品同一时间制备的匹配缓冲液测量ClfA样品的DSC谱，所述匹配缓冲液不同的是由药物物质(ClfA)占据的体积由缓冲液置换。这个仪器设定如下：扫描速度，200℃/Hr；扫描范围，10-90℃；过滤时间，8秒；反馈模式/增益，中等。在每次扫描后，将DSC细胞和注射器用注射用水(WFI)漂洗3-5次。在任何重复扫描实验的情况中，细胞清洁循环包括使用10％Contrad(Decon Laboratories Ltd.，East Sussex，UK)以保证清洁细胞进入下一运行。
微量热法毛细管DSC用作高通量平台以筛选赋形剂。在每个筛选实验中，于10mM琥珀酸盐缓冲液中的ClfA、150mM NaCl，pH6.0用作基础以计算Tm中的变化。对一式两份DSC样品获得表观Tm，然后将此平均Tm与在相同DSC运行中无赋形剂的配制物的平均Tm对比。通过对Tm改变的作用对比每种赋形剂/浓度的作用。在存在赋形剂条件下，Tm的正改变被认为是对于ClfA热稳定性的正面作用。对于ΔG计算，从人工选择的转换前和转换后基线计算ΔCP，然后通过曲线与基线之间区域的积分计算ΔH和Tm。ΔG曲线使用Microcal DSC软件计算。
实施例2：ClfA药物产物的预配制：结果
对药物产物(液体配制的ClfA)和药物物质(液相未配制的ClfA蛋白)施加制药相关的温度(10-85℃)和pH(4.0-8.0)压力以鉴别其易感性。
对ClfA样品在pH4.0-pH8.0的不同pH条件下进行固有色氨酸荧光热熔融研究，产生荧光发射曲线。对于这些实验，ClfA的浓度通常为0.1mg/ml-0.2mg/ml。每条曲线的转折点被鉴别为熔融温度(Tm)，在表4中列出。在10℃，在较高pH值的样品示出在较高波长的峰位，提示色氨酸残基更暴露于溶剂。此外，在较高pH值，ClfA呈现出较低的Tm值，表明与较低pH值如pH5.5和6.0相比较低的稳定性。在从pH5.5-6.5以0.2精细增量的pH组(表5)示出Tm随着pH降低而逐渐增加。
表4                                  表5
圆二色性(CD)光谱学用于检查作为pH函数的ClfA的二级结构。在pH7.0和pH 8.0获得的光谱特别示出明确定义的最小值在～200nm和220nm。这个观测结果的一个可能解释是在～220nm的最小值可以是由于已知N2N3结构的β-折叠成分所致，在～200nm的最小值接近在大约195nm通常可见的随机卷曲最小值。这些观测结果支持了ClfA蛋白在pH 7.0和pH 8.0是稍微更不折叠的荧光数据。
从10℃至85℃进行从pH 4.0至8.0的ClfA的CD熔融，产生描绘作为每个pH点的吸光度的函数的摩尔椭圆率的曲线。观测所述曲线在不同pH值的形状。在pH 6.0及更高的数据均似乎具有相似的转换（transition），其可以在大约55℃目测估计。在pH 5.0和5.5的曲线具有较高的转换。此外，pH 5.0呈现出最大程度的改变(椭圆率值)，提示β-折叠含量中的最大增加。由于增加的β-折叠在聚集样品中是典型的，因此pH 5.0可示出ClfA蛋白在升高的温度更倾向于自缔合。
使用Agilent 8453 UV-可见分光光度计测量在350nm的光密度(OD350)，使用Photon Technology International分光荧光计测量作为温度函数的直角和光散射以观测颗粒大小的增加，其相应于信号强度的增加及可能与ClfA蛋白聚集相关。在pH 4.0、5.0和5.5在温度踪迹中观测到显著转换，在pH4.0具有最大程度的改变(最大聚集)。相反，pH 6.0及更高值仅呈现出较小的逐渐上升的改变，表示较少的自缔合事件。
在检测寡聚化(聚集)中直角和光散射是比OD350更敏感的技术。根据得自这个技术的数据，ClfA聚集的最早发生在pH 5.0和5.5可见，而更高的pH值示出在颗粒大小增加方面多达15℃的延迟。
ClfA的结构稳定性通过差示扫描量热法(DSC)鉴定，其测量以kcal/mole/℃表示的焓的改变。根据DSC分析，观测到ClfA的不折叠是可逆的，在大约55.5℃观测到单转换。计算这个转换的焓为大约10kCal/mol。
也测量了作为浓度函数的ClfA的Tm，在从0.1mg/mL至1.0mg/mL确定结果一致。观测到ClfA的Tm未随着蛋白浓度增加而改变，表明ClfA大多数以单体存在。这个观测结果与下文揭示的大小排阻层析数据一致。
ClfA的Tm也通过作为pH函数的毛细管DSC确定(表6)。在这些实验中，观测到ClfA的Tm在大约55-56℃在pH5.0-8.0之间达到平台期，尽管Tm随着pH增加而趋于降低。在pH4.0，ClfA的Tm仅为50.8℃，表明ClfA在此pH的结构不稳定性。对于这些DSC实验，ClfA的浓度为1.0mg/ml。将通过DSC确定的ClfA的Tm与通过色氨酸(Trp)荧光峰移位(如前)确定的Tm进行对比。通过Trp荧光确定的Tm与通过DSC确定的Tm在pH4.0-pH5.5之间是一致的。然而，通过Trp荧光确定的Tm当pH从6.0增加至8.0时明显降低。可能的解释是N3结构域随着pH从6.0增加至8.0而未折叠。在ClfA中只有两个色氨酸，其均位于N3结构域中。通过Trp荧光确定的Tm随着pH从6.0增加至8.0而明显的降低表明这些残基暴露于更极性环境，通常表示蛋白未折叠。
表6
pH 缓冲液 平均Tm
4.0 乙酸盐 50.8
5.5 乙酸盐 56.2
5.5 琥珀酸盐 55.3
6.0 琥珀酸盐 55.7
6.5 琥珀酸盐 55.6
7.0 磷酸盐 55.0
8.0 磷酸盐 54.8
所述ClfA药物产物可以在预先用硅氧烷处理的预先充填的注射器中输送。为防止由于注射器筒和活塞上的硅油以及其它因素所致的蛋白聚集，防止蛋白吸附于玻璃表面，通常在最终的药物产物配制物中包括聚山梨醇酯80(PS80)。由于PS80是去污剂，其可潜在地使蛋白不稳定，因此在存在PS80条件下评估ClfA的Tm。表7概括示出在存在或不存在聚山梨醇酯80条件下使用1.0mg/ml ClfA进行的毛细管DSC实验的结果，示出存在PS80使ClfA的Tm降低大约1℃，这与无PS80的ClfA配制物的Tm存在统计学明显差异。
表7
也评估了AlP04对于ClfA的Tm的作用。为测量与AlP04结合的ClfA的Tm，用pH 5.0的琥珀酸盐-盐水配制0.1mg/mL ClfA，其中大多数ClfA与铝结合。与含有相同浓度磷酸铝的匹配缓冲液相比测量结合的ClfA的Tm。这个实验的结果示出ClfA与磷酸铝结合(即56.16℃±0.12℃)时与未结合的ClfA(即56.34℃±0.15℃)相比Tm不明显改变。
为支持缓冲剂类型、药物产物的浓度和离子强度的选择，在高/低盐配制物和不同浓度组氨酸和琥珀酸盐缓冲液的配制物中确定Tm的改变。表8示出ClfA的Tm随着NaCl浓度或琥珀酸盐缓冲液浓度的增加而增加。然而，ClfA的Tm不随着任何检测的组氨酸-盐水缓冲液配制物而增加。
表8
缓冲液类型/强度 Tm(℃)改变
0mM NaCl，10mM琥珀酸盐，pH6.0 -0.94
300mM NaCl，10mM琥珀酸盐，pH6.0 l.38
600mM NaCl，10mM琥珀酸盐，pH6.0 3.43
5mM琥珀酸盐-盐水，pH6.0 -0.16
50mM琥珀酸盐-盐水，pH6.0 0.70
5mM组氨酸-盐水，pH6.0 -0.41
10mM组氨酸-盐水，pH6．0 -0．20
50mM组氨酸-盐水，pH6.0 -0．25
对已知药物稳定剂的赋形剂如糖、多元醇和氨基酸进行筛选，筛选其与基础配制物(0．6mg/mL ClfA于10mM琥珀酸盐缓冲液、150mM NaCl中，pH6.0)相比对于ClfA的Tm的影响。表9示出ClfA的Tm升高依赖于CaCl2、海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇和谷氨酸的浓度。然而，精氨酸降低ClfA的Tm。脯氨酸对ClfA的Tm不具有明显作用。赋形剂对于蛋白的作用是蛋白依赖性的，因此本领域技术人员在实验前不知道赋形剂将具有什么作用。蔗糖、山梨糖醇、CaCl2和高浓度的NaCl在4℃不仅增加Tm，也增加ΔG。表10示出赋形剂在甚至在存在PS80条件下提高ClfA Tm 2℃-3℃的加合作用。
表9                               表10
获得作为pH在4.0-8.0之间函数的ClfA和AlP04的净表面电荷，用作结合的预测指标。用于这项研究的缓冲系统是乙酸盐(pH4.0-5.0)，琥珀酸盐(pH5.5-6.5)和磷酸盐(pH7.0-8.0)。ClfA的zeta电势分布图与零电荷点在大约pH4.0-5.0之间某处交叉。(zeta电势是在胶体系统中物质的电动电位的测量。见Lyklema，J．“Fundamentals ofInterface and Colloid Science”，v01.2，page.3.208，1995.)。这与ClfA具有低4s的pI值的事实一致。此外，AlP04的zeta电势分布图也发现与其～5.5-5.8的pI一致。因此，最佳结合发生在其中两个实体具有相反的净电荷，大致在pH4.5-5.5之间。Lowry测定表明在0.020和0.100mg/mL ClfA浓度最佳结合均发生在pH5.0。对于Al(OH)3曲线的相反趋向是真实的，其中pH5.0呈现出最低结合。Al(OH)3在检测的任何pH值均未达到100％结合。
使用ClfA在pH5.0、5.5和6.0进行AlP04浓度滴定(0.25，0.50，0.75mg/mL)结合实验。根据这些实验，在pH6.0的ClfA似乎对于蛋白浓度不敏感，一致获得～50％结合，而在pH5.0的蛋白示出结合伴随着AlP04增加而增加。观测到ClfA在pH5.0和在较低蛋白浓度达到最佳结合，随着浓度增加而结合降低。此外，pH5.5和6.0均示出相同趋向，但是在这些pH值、甚至在最低剂量的结合均是不足的。
在尝试改良在pH6.0的结合中，选择几种赋形剂(包括150mM NaCl、500mM NaCl、300mM甘氨酸、300mM赖氨酸、20mM MgCl2和1mMEDTA)与不同浓度的NaCl一起检测。许多赋形剂的选择是由于其阳离子特性，因为在pH6.0，ClfA和AlP04均是带负电荷的。一种修改的Lowry测定用于检测结合的蛋白百分比。根据这个测定，观测到无一赋形剂与150mM NaCl对照相比示出明显的改良。
实施例3：ClfA冻干的药物产物的配制：概述
ClfA通常被认为是不稳定的蛋白，这意味着其易于在N1结构域与N2结构域之间水解或“剪切”，产生至少两个片段，一个含有N1结构域，另一个含有N2N3结构域。稳定性是指与包括例如N1和N2N3肽片段的降解产物相比，含有基本上未降解的ClfA的未水解的ClfA的相对量。基本上未降解的ClfA的相对量越高，该蛋白越稳定。
观测到液体配制物(如前)中的ClfA蛋白在N1与N2N3结构域之间遭受剪切，如通过大小排阻HPLC所见。在用精细选择的赋形剂筛选之后，研究冻干，以基于液体不稳定性作为液体配制物的另一选择。检查四个批次的ClfA药物物质，使用在注射用水(WFI)(少量或无NaCl)中的10mM琥珀酸盐pH6．0、0．01％聚山梨醇酯80和4．5％蔗糖(填充剂)的修改的冻干配制物。所有四个批次的结果均示出冻干的ClfA配制物在实时及加速(37℃)温度下成功稳定蛋白免于剪切直至三个月。使用反相HPLC分析所述配制物证实冻干在整个观测时间点期间阻止其它修饰如脱酰胺化和氧化。在体外效力检测(即BIOVERIS检测)中也表明ClfA在三个月的时间保持其效力。
冻干的药物产物也通过使用如下方法鉴定：生物物理学(pH，通过KarlFisher库仑分析法检测水分[见Scholz，Eugen，Fresenius’J.ofAnal.Chem.，348(4)：269-271，Apr.1994]，OD350，重量摩尔渗透压浓度，圆二色性，UV吸光度光谱学，差示扫描量热法)方法，分离方法(HPLC)，和效力方法(BIOVERIS)，以监测冻干对于配制物(药物产物)及对于蛋白自身(药物物质)的作用。使用多种方法的分析提示所述蛋白特性在冻干前和冻干后是相似的。此外，进行搅拌、冷冻-解冻和赋形剂筛选实验以初步优化冻干配制物。
实施例4：ClfA冻干的药物产物的配制：冻干
在冻干之前，将小瓶充填650μl液体配制物。在冻干后，必需用注射器确定重建体积，由此配药体积考虑到注射器内的无效腔。在这个实验中，将注射器用0.55、0.60、0.65和0.70mL稀释剂充填。将所述稀释剂注入冻干的小瓶中，将重建的液体抽回注射器中。然后将该液体按刻度分配和称重。假设液体的密度是大约1g/mL，确定该小瓶必须含有大约0.65mL的疫苗，以输送大约0.5mL的疫苗至患者。超过0.5mL的体积是可以接受的，但是低于大约0.5mL的体积不是优选的。
两个批次L36051-81-1和L36051-81-2的冻干前的液体配制物的过滤恢复通过SE-HPLC监测。使用的滤膜是Millipore0.22μm PVDF滤膜。两个批次ClfA的恢复均＞99％。
Virtis Genesis EL35冻干器用于本发明报道的所有配制物。冻干运行循环的举例性非限制性参数在表11中示出。批次L36051-44(DS L35812-59)不包括复性步骤，而剩下的三个批次用复性步骤制备。
表11
mTorr＝毫托
通过Karl Fisher化学方法测量水分，使用与样品炉连接的Brinkmann电量计。使用干燥氮气将水分从样品中带入Karl Fisher小室(cell)中。5.5％干燥水分标准用于监测系统性能。使用该炉，在230℃测量水分标准，及在115℃测量冷冻干燥的样品。通常，成功的冷冻-干燥循环含有最小量的水而保留所有其它希望的产物特性。
从每个批次中检测10瓶随机的冻干后配制物，评估目测特性。批次与批次之间的块状物品质相当，然而，用无复性步骤制备的批次L36051-44示出与包括复性步骤的其它批次相比更高的收缩。整体而言，所述块状物是白色及海绵状的，呈现出良好的结构整体性。一个特定配制批次(具有复性步骤)的10个单独的冻干产物的目测特性在表12中示出。
表12
在冻干之前和之后鉴定所述配制物的物理性质。将样品在冻干后用大约630μl盐水(批次44用150mM NaCl重建，其它批次用50mM NaCl重建)重建。当使用50mM NaCl时，重建后的重量摩尔渗透性浓度接近生理目标～290mOsm。观测到当冻干的块状物用稀释剂重建时pH保持6.0±0.3。此外，所有批次的重建时间均低于30秒。瞬时微气泡在将稀释剂加入块状物时产生，是在用瓶塞塞住期间氮气回填的结果。
使用TA Instruments Modulated DSC仪器检测冻干前液体的玻璃态转换温度(Tg′)。Tg′被定义为在此非晶固体达到易碎的玻璃态的温度，在冷却时具有高水平的氢键合。在Tg′之上，能获得更多的分子流动性。Tg′的实验性获得对于冻干循环的优化是重要的，以获得高质量块状物和稳定产物。已经调整的DSC仪器由于其在零下温度扫描的能力而用于Tg′测量。
在冻干程序的优化期间要考虑所述块状物的玻璃态转换时间(Tg′)和水分含量。重要的是所述样品在冻干的复性相期间高于其玻璃态转换温度。冻干的复性步骤在-10℃，其高于所有配制物-34.6℃±0.8℃的Tg′。也重要的是所述冻干程序使所述块状物足够干燥以防止蛋白与水之间的反应，从而降低产物的稳定性和货架期。所述冻干程序对于所有配制物获得低于1％(即0．42％±0．19％)的水分。
实施例5：ClfA冻干的药物产物的配制：热稳定性
使用MICROCAL VP-差示扫描量热计(DSC)鉴定ClfA的固有热稳定性。从10℃至100℃的升温坡度表明蛋白熔融的温度(Tm)及未折叠(熔融)事件要求的焓(ΔH)改变。这提供了关于蛋白折叠特性的信息(即二级和三级结构)及所述构象在冻干后是否改变的信息。
使用MicroCal Capillary DSC对冻干前和冻干后的各批次ClfA进行差示扫描量热法(DSC)以对比所述配制物的熔融温度(Tm)。所有检测的批次均示出在冻干前和冻干后相似的Tm值和未折叠的焓(ΔH)，提示蛋白的全部折叠在冻干前至冻干后不改变。冻干前的平均Tm为55.2℃±0.14℃，冻干后的是55.2℃±0.16℃。冻干前的平均ΔH为1.90x106±0.12x106cal/mole/℃，冻干后的为1.90x106±0.11x106cal/mole/℃。
实施例6：ClfA冻干的药物产物的配制：抗原二级结构
使用圆二色性(CD)评定每个配制物在冻干前和冻干后蛋白的二级结构。所有实验均在Jasco J-810分光偏振计上进行。CD扫描的实验参数包括波长范围190nm-260nm，扫描速度20nm/分钟，响应时间2秒，带宽1nm，累积为3。含有琥珀酸盐、蔗糖和NaCl的相同缓冲剂基质用于背景扣减(background subtraction)。
圆二色性(CD)提供了蛋白二级结构如α-螺旋和β-折叠的光谱指纹(spectral fingerprint)。冻干前与冻干后ClfA批次的对比示出光谱的全部形状在冻干前后无改变，提示所有批次在整个冻干和重建程序期间均保持其二级结构。
实施例7：ClfA冻干的药物产物的配制：抗原三级结构
二阶导数UV吸收光谱学用作另一方法以检查抗原三级结构以评定冻干前后的固有蛋白稳定性。使用Agilent8453UV-可见光二极管阵列光谱仪从200nm-400nm获得多波长UV可见光吸收光谱。1-em光路长的100μL体积的石英杯用于所有实验。
使用CHEMSTATIONTM软件(Agilent)进行光谱分析。使用九点数据滤波并拟合至三次Savitzky-Golay多项式获得二阶导数光谱。所述导数光谱在每一个纳米间隔内插99个数据点，提供了在非聚集条件下大约0．01nm的有效分辨率。使用Microcal OriginTM6.0选择导数光谱的峰位。鉴别相应于氨基酸残基苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的峰位，根据温度函数绘图。
在四个批次的三个批次中(批次44，81-1和81-2)，在冻干后在苯丙氨酸/酪氨酸区域中(260nm～270nm)可见一些差异。然而，批次72示出良好覆盖。这个批次含有最高的残余NaCl(从大量基质中携带)。
实施例8：ClfA冻干的药物产物的配制：结构稳定性：N1剪切
使用大小排阻HPLC评定冻干前药物产物、重建的冻干后药物产物及在不同温度保持的重建的药物产物的初始性质以进行稳定性研究。这个方法能检测不同大小的ClfA种类，包括单体、二聚体、寡聚体(大于二聚体)和降解物(由于在N1与N2N3结构域之间裂解所致)，因此其用作对比冻干前液体配制物与其冻干后对应物的稳定性的主要技术之一。
通过两种HPLC方法监测在2-8℃、25℃和37℃的所述ClfA的液体和冻干的配制物的稳定性。大小排阻HPLC用于检测N1与N2N3结构域的裂解，而反相-HPLC用于监测所述蛋白随着时间的任何化学降解(即脱酰胺化，氧化)。
图2A、B、C和D组例证了四个冻干的ClfA批次与其液体对应物的一级动力学绘图，所有批次均在2-8℃、25℃和37℃保温，通过SE-HPLC随时间监测。结果以ln[C]对时间绘图，其中C组是完整抗原(二聚体+单体)同时除外裂解的降解物的浓度。所有四个批次均示出冻干产物在所有三个保温温度的直至3个月的一致的稳定性，如C组中最小的改变示出。相反，冻干前的液体样品示出降解随着温度提高而成比例地增加。应注意批次L36051-44液体对应物(L36051-37-1)是液体配制物(与冻干前配制物相反)，含有10mM琥珀酸盐，pH6.0，0.01％聚山梨醇酯80和150mM NaCl(图2A)。然而，批次37-1作为温度函数的整体趋向与冻干前液体的相似。
图3例证了冻干的DS L40184-61在t＝0与在2-8℃、25℃和37℃贮存三个月的块状物相比的代表性SE-HPLC层析图。堆积的层析图谱看起来是相同的，在二聚体或降解物峰无明显增加。其它三个冻干的批次示出相似结果。
进行液体(冻干前)与冻干的ClfA配制物批次的对比。代表性SE-HPLC层析图在图4中示出，对比了在2-8℃、25℃和37℃贮存4周的冻干的配制物与冻干前液体。冻干的样品在所有三个贮存温度均呈现出良好的覆盖，特别是在降解物区域在主要单体峰的紧邻右侧。相反，液体配制物示出在降解物峰中的明显升高(图4，圆形)。此外，冻干的峰示出少量存在寡聚物峰(在主要单体峰的左侧，图4)，认为其是所有冻干批次共有的特性。
实施例9：ClfA冻干的药物产物的配制：结构稳定性：蛋白修饰
反相HPLC是通常用于提供对蛋白质量和完整性的鉴定的分析方法。分析物的分离基于不同物质的疏水性差异，这在蛋白与蛋白之间可以明显变化。结果，反相HPLC测定可典型提供感兴趣的蛋白与例如蛋白降解物之间良好的分离，所述蛋白降解物是除了裂解之外具有序列修饰(如脱酰胺化和氧化)及剩余宿主细胞蛋白杂质。这个测定用于提供在稳定性研究中关于蛋白质量随时间的数据。
如SE-HPLC数据一样，反相层析图示出冻干的产物在37℃、25℃和2-8℃贮存三个月后与新鲜制备的配制物相似的谱。
在冻干稳定性研究期间，监测pH、水分和OD350。pH值应保持在靶pH的±0.03单位内，水分应＜3％。OD350通过聚集的颗粒的散射光测量。典型地，不存在可检测的聚集物使OD350数回复为＜0.03。图5的A、B和C组是从多冻干批次组合的数据，证实所有三个参数在超过三个月的时间均示出良好的稳定性。
实施例10：ClfA冻干的药物产物的配制：通过BIOVERIS确定效力
在稳定性研究中使用体外效力测定在选择的时间点评定ClfA蛋白的功能性表位的存在。使用BIOVERIS平台用于这个目的。在这个测定中，使用夹心形式，其中一种单克隆抗体(mAb12-9)用于捕获抗原，针对不同表位产生的另一单克隆抗体(mAb15EC6)用于使用ECL检测法检测抗原的存在。单克隆抗体12-9是识别并结合ClfA的N3结构域的抗体，而mAb15EC6识别并结合ClfA的N2结构域。
BIOVERIS抗体竞争性测定系统用于在批次L36051-81-1(DSL40184-61)和L36051-81-2(DS L40184-62)中监测直至3个月的ClfA效力。冻干的和冻干前的液体配制物均示出在2-8℃、25℃和37℃贮存3个月的时期其效力均不降低。
实施例11：ClfA冻干的药物产物的配制：赋形剂的作用
在已经确定ClfA的稳定性之后，计划进一步的研究，以(1)设定配制物成分的规范，(2)筛选赋形剂以优化块状物外观，(3)在工艺设计方面了解配制程序，及(4)检查药物物质和药物产物的冷冻-解冻耐受性。
在含有0.2mg/ml ClfA和10mM琥珀酸盐pH6.0的冻干缓冲基质中进行聚山梨醇酯80(PS80)滴定，从3％至4.5％至6％w/v改变蔗糖含量。PS80浓度范围是从零(0)至0.005％至0.01％v/v。进行这个实验以(1)确定冻干前液体配制物中对聚山梨醇酯的需要，(2)也设定冻干前液体配制物中聚山梨醇酯的浓度规范，及(3)也设定冻干前液体配制物中蔗糖浓度规范。
使用不同的PS80和蔗糖浓度进行搅拌实验。图6的A、B和C组示出在室温搅拌24小时后通过SE-HPLC针对L40184-61(200μg/ml ClfA，6％蔗糖，10mM琥珀酸盐pH6.0，0.005％PS80)和L401840-62(200μg/ml ClfA，4.5％蔗糖，10mM琥珀酸盐pH6.0，0.01％PS80)配制物获得的二聚体百分比、单体百分比和降解物(裂解)百分比结果。不含PS80的配制物呈现出在搅拌后相对于t＝0样品的二聚体形成百分比增加(图6D)。在存在甚至最低量PS80(0.005％)的条件下，二聚体化的量仍低于t＝0样品，提示PS80有益于所述配制物。此外，对“无PS80”对照的SE-HPLC分析示出在搅拌后存在较高级别的寡聚体(大于二聚体)，而含有PS80的样品则否。因此聚山梨醇酯80的推荐浓度确定为0.01±0.005％。不同量的蔗糖(3、4.5和6％)在SEC数据中未示出任何差异。同样，单体百分比和降解物百分比似乎不受PS80的存在与否或者不同量蔗糖的明显影响。
进行混合研究以确定各种赋形剂在生产过程的配制/混合期间对于ClfA是否有不利作用。各种赋形剂包括0％和5％的蔗糖，0％和5％的海藻糖，及4％蔗糖与1％甘露醇的蔗糖和甘露醇组合。基于其在冻干中的共同用途选择赋形剂。对于这些实验，配制基础包括0.3mg/ml的ClfA，10mM琥珀酸盐pH6.0，及0.01％聚山梨醇酯80。配制样品，在2-8℃贮存过夜，第二天早上开始研究。将配制物置于带有West4432灰色丁基瓶塞的30mLShott1型玻璃瓶中，置于VWR Microplate Shaker(微平板摇床)上。将小瓶在室温在持续500RPM条件下混合，在t＝0、2、4、8和24小时取样，使用SE-HPLC用作初始测定。
在混合研究中检查了一些批次(L36051-96-1，L36501-96-2，L36051-96-3，L36051-96-4，L36051-100-1和L36051-100-2)以确定当在室温混合24小时时蔗糖、海藻糖和蔗糖/甘露醇对ClfA的稳定性是否有作用。图7的A、B和C组示出通过SE-HPLC报告的每个配制物随时间的降解物(裂解)百分比，二聚体百分比和单体百分比。在仅具有蔗糖以及具有蔗糖/甘露醇的样品中可见无主要降解；然而，海藻糖配制物示出降解明显增加。仅具有蔗糖的两个DS批次的ClfA的二聚体比率相似，但是具有海藻糖和蔗糖/甘露醇的样品中可见二聚体的批次依赖性增加。单体的改变反映降解物和二聚体中的改变。
配制蔗糖、甲硫氨酸、甘氨酸和甘露醇与ClfA的各种组合，随后通过加速稳定性试验检测ClfA稳定性。加速稳定性试验包括将配制物(液体或冻干的)在高于计划贮存温度的温度下贮存，监测ClfA蛋白随着时间的降解迹象。在冻干的ClfA情况中，推荐的贮存温度为2-8℃，因此25℃和37℃被认为是“加速”条件。制备8种配制物(见表13)，各自含有0．300mg/ml的ClfA、10mM琥珀酸盐pH6．0和聚山梨醇酯80，并且含有蔗糖、甲硫氨酸、甘氨酸和甘露醇的各种组合，检查其对于(1)冻干前液体ClfA的稳定性的作用，(2)冻干的块状物的稳定性的作用，及(3)冻干的块状物外观(cosmetics)的作用。选择甲硫氨酸是因为其防止蛋白氧化的能力，选择甘氨酸是因为其通过排除的体积的一般性稳定化作用，选择甘露醇是因为其改善块状物外观的倾向。将液体配制物置于加速稳定性条件下并通过SE-HPLC监测一周，RP-HPLC监测两周。冻干的块状物在2-8℃和37℃贮存，监测两个月。相对于仅包含蔗糖的配制物目测评估块状物外观。
表13
在2-8℃、25℃和37℃一周后的液体样品的大小排阻数据示出检查的赋形剂相对于仅具有蔗糖的对照(配制物-109-1)无一改良ClfA的稳定性(就裂解而言)。在t＝0，所有配制物具有非常相似的谱。所有配制物均示出主峰高度随着温度而略低，同时主峰旁侧的由降解产物导致的较小峰升高。观测到各种赋形剂的存在未示出相对仅具有蔗糖的配制物的任何明显改善。
此外，将配制物冻干及检测块状物外观。与仅具有蔗糖的对照相比，在检测的比例无一赋形剂赋予所述块状物目测性质的任何改良。在2-8℃和37℃贮存两个月后使用SE-HPLC对所述冻干的块状物也进行稳定性检测并检查其降解(裂解)情况结果表明所有配制物均是稳定的。
实施例12：ClfA冻干的药物产物的配制：冷冻-解冻
对一些批次的ClfA蛋白(即L40184-63，-64和-65)进行冷冻-解冻研究。所述配制物包含0.2mg/ml的ClfA，10mM琥珀酸盐pH6.0，4.5％蔗糖w/v和0.01％聚山梨醇酯80v/v。该研究分成三个臂：(1)3x冷冻-解冻未配制的ClfA(药物物质)；(2)3x冷冻-解冻配制的ClfA(药物产物)；及(3)药物物质冷冻和解冻3次并在每次解冻后配制为药物产物。使用SE-HPLC进行分析。
此研究的目的是评定在多次冷冻-解冻后所述蛋白作为药物物质和药物产物的稳定性。在每次解冻后使用SE-HPLC分析样品以检测ClfA降解(裂解)中的任何改变。观测到三次冷冻-解冻示出检查的三个批次中的两个批次在第三次解冻后降解未增加。一个批次特别示出较其它批次较大的降解改变。
实施例13：ClfA/CP5/CP8(三抗原)冻干的药物产物的配制
基于通过冻干稳定ClfA的成功，通过组合ClfA与CP5和CP8葡萄球菌抗原和CRM缀合物进一步配制药物产物。液体配制物(冻干前或重建后)的一些实施方案是每0.5ml产物含有200μg的rClfAm和100μg每种CP5-CRM197和CP8-CRM197缀合物。在一些实施方案中，所述液体配制物是每0.5ml产物含有100μg的rClfAm及50μg每种CP5-CRM197和CP8-CRM197缀合物。
评估包括蔗糖、甘露醇和海藻糖在内的各种填充剂。观测到蔗糖赋予基于混合研究的最佳稳定性、块状物外观和短期液体稳定性。
基于在不同pH下的三个批次的液体配制物的短期加速稳定性，提示pH6.0是最佳的。CP5-和CP8-CRM197缀合物在pH5.0-7.0范围内是稳定的。
检测大约为pH6的各种缓冲系统，包括琥珀酸盐和组氨酸。观测到使用组氨酸或琥珀酸盐缓冲剂在rClfAm的熔融温度(Tm)中无差异。这两种缓冲剂与CP5和CP8CRM197缀合物均相容。建议选择10mM琥珀酸盐缓冲液(pH6.0)。
在搅拌研究中检测聚山梨醇酯80(PS80)作为潜在稳定剂。搅拌研究模拟运输中的剪切和应激，其通常可导致二聚体或更高级别的寡聚体增加。这些实验结果提示PS80防止ClfA聚集。选择0.01％(0.005-0.15％)聚山梨醇酯80继续进行。
对于冻干的产物的重建，选择实现生理学重量摩尔渗透压浓度(即250-300mOsM)的稀释剂。在一个实施方案中，选择60mM NaCl作为稀释剂。基于在重建后输送0.5mL剂量的能力，选择0.64-0.66mL/瓶的充填体积。为保证0.64-0.66mL的重建体积输送0.5mL剂量，选择每只注射器0.66-0.68mL充填体积。
确定稀释剂配制在60mM对于重建冻干的三抗原块状物是最佳的，以实现接近生理学重量摩尔渗透压浓度～300mOsM。配制物中4.5％蔗糖对于液体药物产物的重量摩尔渗透压浓度起显著作用，不用任何添加的盐而使得重量摩尔渗透压浓度为大约200mOsM。
选择冻干参数以产生白色松软的块状物，不回熔或收缩，及在用60mMNaCl重建时产生具有pH6.0±0.3的清澈溶液。
实施例14：配制三抗原药物产物的方法
产生举例的液体配制物，其包含10mM琥珀酸盐pH6.0，4.5％蔗糖和0.01％聚山梨醇酯80，用Millipore0.22μm PVDF膜过滤，在650μL等分至每个2mL小瓶中，使用下文描述的循环冻干。冻干的块状物使用预先充填60mM NaCl作为稀释剂的注射器重建。
在一个实施方案中，所述液体配制物如下所述配制：(a)组合25％蔗糖，100mM琥珀酸盐pH6.0，1％PS80及WFI，获得10mM琥珀酸盐，4.5％蔗糖和0.01％PS80。(b)在步骤(a)的混合物中加入适量rClfAm、CP5缀合物和CP8，然后(c)通过0.22μm滤膜过滤。(d)将冻干小瓶均用0.65m1±0.1ml过滤的溶液充填，(e)根据表14的参数冻干，(f)用瓶塞塞住，(g)密封及(h)贴标签。冻干的药物产物在2-8℃贮存。
表14：冻干循环
a．默认是指400毫巴(～40％的大气压).
进行两个实验设计以确定活性和非活性配料对于配制过程、过滤后恢复和冻干的影响。关键变量是rClfAm及CP5和CP8缀合物(±30％靶标)的浓度。从冻干配制物中全部恢复这些成分示出所有配制物均超过95％。数据分析(使用Design Expert软件)提示如下信息：(a)rClfAm纯度不受测定限制内rClfAm浓度的影响，其中低剂量(70μg/m1)呈现出～93％的最大测量纯度，高剂量(520μg/m1)呈现出～97％的最大测量纯度；(b)CP5和CP8缀合物的浓度可影响各个缀合物的恢复，但是保持在测定能力内；及(c)所有三种成分均不受PS80浓度影响。结果示于表15。
表15：三抗原配制物存冻干后的分析
a清澈和无色。基于纯度％数据分析，配制物中C1fA的浓度影响测定能力。对于低剂量规范为＞90％
在其它实验中，配制物中pH(范围5.7-6.3，目标为6.0)、琥珀酸盐(5mM-15mM，目标10mM)、聚山梨醇酯80(0.005％-0.15％，目标0.01％)及蔗糖(3.0％-6.0％，目标为4.5％)是变化的。示于表16的结果表明对于活性药物产物(rClfAm(397±6.7μg/mL)，CP5-cRM197缀合物(179.8±64.0μg/mL)及CP8-CRM197缀合物(188.2±10.5μg/mL))的验收标准在控制范围内。
表16：无活性成分的三抗原的分析
在400μg/mL rClfAm，200μg/mL CP5和200μg/mL CP8活性成分保持恒定。
代表性配制物批次的数据在表17和18示出。配制三个代表性批次，高剂量充填和冻干(400μg/mL rClfAm，200μg/mL每种CP5-和CP8-CRM197缀合物)，低剂量充填和冻干两个(200μg/mL rClfAm，50μg/mL每种CP5-和CP8-CRM197缀合物)。所述配制物在纯度、强度、水分、外观和pH的目标验收标准内。这些数据用于概括(bracket)中等水平剂量。
表17：高剂量配制物t＝0数据分析
awfc：白色松软块状物
表18：低剂量配制物t＝0数据分析
awfc：白色松软块状物
实施例15：三抗原药物产物稳定性
对6个批次的冻干的三抗原配制物进行稳定性测定。一些关键测定是针对rClfAm强度和纯度的反相层析(如RP-HPLC)，针对CP5-CRM197和CP8-CRM197强度的浊度法。将冻干的块状物置于2℃-8℃、25℃和37℃，在选择的时间点分析。在即将进行检测之间立即重建块状物。检测结果示出以干燥形式贮存4周后rClfAm的强度(浓度)或纯度以及缀合物的强度(抗原性)无改变(图8和9)。也通过RP-HPLC和浊度法分别确定rClfAm浓度和纯度及CP5-CRM197/CP8-CRM197浓度(抗原性)，时间长如3个月。对在2℃-8℃贮存的样品进行线性回归分析示出所述样品在最小6个月是稳定的(图8和9)。在高剂量(L36686-3-1和L36686-25)和低剂量(L36686-3-2和L360510195-2)检测样品(表19-22)。
表19：在400μg/mL rClfAm，200μg/mL CP5-和CP8-缀合物(L36686-3-1)配制的三抗原的稳定性
wfc：白色松软块状物
表20：在400μg/mL rClfAm，200μg/mL CP5-和CP8-缀合物(L36686-25)配制的三抗原的稳定性
wfc：白色松软块状物
表21：在100μg/mL rClfAm，50μg/mL CP5-和CP8-缀合物(L36686-3-2)配制的三抗原的稳定性
wfc：白色松软块状物
表22：在100μg/mL rClfAm，50μg/mL CP5-和CP8-缀合物(L36051-195-2)配制的三抗原的稳定性
wfc：白色松软块状物
还进行了短期稳定性测定。冻干的三抗原配制物用60mM NaCl稀释剂重建，在室温保温不同时间，在t＝0、4小时和24时间点分析rClfAm强度和纯度及CP5-CRM197/CP8-CRM197强度(表23-25)。检查高剂量(400μg/mL rClfAm，200μg/mL CP5-CRM197和200μg/mL CP8-CRM197)和低齐量(200μg/mL rClfAm，50μg/mL CP5-CRM197和CP8-CRM197)配制物。从图10中可以看出，这两个剂量均示出所述成分在室温24小时(重建后)的稳定性。
表23：在400μg/mL rClfAm，200μg/mL CP5-和CP8-缀合物(L36686-25)
配制的三抗原的短期稳定性
表24：在400μg/mL rClfAm，200μg/mL CP5-和CP8-缀合物(L36686-3-1)
配制的三抗原的短期稳定性
表25：在100μg/mL rClfAm，50μg/mL CP5-和CP8-缀合物(L36686-3-2)
配制的三抗原的短期稳定性
还进行了冷冻-解冻研究。对高剂量三抗原药物产物(400μg/mL rClfAm，200μg/mL CP5-CRM197和200μg/mL CP8-CRM197)进行三次冷冻-解冻循环，分析rClfAm强度和纯度以及CP5-CRM197/CP8-CRM197强度。实际上观测到每种成分的浓度均无改变，提示药物产物的活性成分在这三个循环中是稳定的(图11，表26)。
表26：L36686-25的冷冻-解冻数据总结
实施例16：ClfA/CP5/CP8/MntC(四抗原)药物产物：ClfA的特性
三抗原配制物中ClfA的成功稳定使得可以开发进一步包含金黄色葡萄球菌MntC蛋白的配制物。此外，聚集因子A自T7标签的形式(rClfAm)更新为不具标签的形式(rmClfA)。CP5-和CP8-CRM197就载体蛋白和糖重复单位而言保持相同。
由于药物产物成分的各种变化，采取系统和合理的方法配制新的药物产物，其与所有四种活性成分均是相容的。活动包括抗原的配制前鉴定，配制成分的基本原理的揭示，配制的药物产物的稳定性和鲁棒性的证实，以及配制过程的揭示。在如下剂量设计研究：
1.400/400/200/200μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197，及
2.200/200/100/100μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197。
对两个批次的rClfAm(L40184-77和L40256-26；基质：10mM琥珀酸盐pH6．0，20mM NaCl)和两个批次的rmClfA(L40227-36和L40256-28；基质：10mM组氨酸pH6．5)通过使用多种正交(orthogonal)方法(圆二色性，荧光，毛细管差示扫描量热法和OD350)进行生物物理学鉴定。结果数据示出：1)rClfAm与rmClfA之间的可比性，2)每个rClfA构建体内批次与批次之间一致性，及3)提供pH工作范围的构架。
圆二色性(CD)用作工具以对比pH6.0和7.0的不同批次的rClfA(图12)。在这两个pH的CD扫描基于光谱覆盖示出所有检测批次的rClfAm和rmClfA具有相似的二级结构。此外，进行蛋白的CD熔融以对比各批次作为pH函数的热稳定性。图13中的结果表明所有批次在二级结构方面均是相似的。结果还提示基于这种方法pH5.0-7.0是最佳配制范围。
固有色氨酸荧光用于获得关于rClfAm和rmClfA三级结构的信息。对两个批次的蛋白进行作为pH函数的荧光熔融以评定热稳定性。重要的是注意rClfA具有两个色氨酸，位于蛋白的同一N3结构域中；因此通过这个方法提供的数据位于这个区域。图14A示出所有检测批次的rClfA均具有相似的热稳定性，推断结构也是相似的。使用疏水性染料8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)在多个批次rClfA上也进行了外在荧光熔融(extrinsic fluorescencemelts)。由于蛋白结构随着温度升高不折叠，因此ANS结合该蛋白的新暴露的疏水性部分，增加发射强度。在图14B中，基于ANS信号的熔融温度是相似的，所有检测的蛋白批次均是pH的函数。DSC数据证实所有检测批次的rClfA的熔融温度均相似地，为pH的函数(图15)，建议pH5-7是良好的运行范围。OD350也用于监测作为温度和pH函数的聚集(图16)。rmClfA批次L40256-29(基质：10mM组氨酸pH6.5)作为pH函数的熔融示出通过这种方法检测的唯一聚集事件是在pH4.0。
两个药物物质批次(L40256-28，L40256-29)用于评定rmClfA在组氨酸而不是在琥珀酸盐中作为pH函数的液体稳定性。所述配制物由400μg/mLrmClfA、10mM组氨酸(pH范围5.5-7.5)、4.5％蔗糖和0.01％聚山梨醇酯80组成。两个另外的配制物与组氨酸pH6.5相对比由10mM琥珀酸盐pH6.5组成，及作为高pH检查的由10mM磷酸盐pH8.0组成(这两个配制物也含有4.5％蔗糖和0.01％PS80)。大小排阻-HPLC用于监测在25℃贮存6周的rmClfA的裂解结果表明组氨酸pH～6.5在-28和-29两个批次中呈现出最低的降解速度(图17A)。这个速度与琥珀酸盐pH6.6配制物一致，表明组氨酸与琥珀酸盐一样与rmClfA是相容的。此外，在此项研究中所有配制物的pH均保持稳定及无聚集可通过OD350检测到(图17B)。
实施例17：四抗原药物产物：MntC的鉴定
与ClfA趋向于通过水解降解不同，MntC是通过脱酰胺降解。因此，重要的是确定MntC在一定pH范围的稳定性。使用MntC进行固有色氨酸荧光实验表明发生两个主要事件，在40-55℃的Tml及在65-75℃的Tm2(图18)。跟踪Tml，在pH5.0和6.0是最高的，随后是在pH7.0。数据表明pH工作范围是5.0-7.0。对一代表性MntC批次也进行了DSC。代表性温度记录图例证了两个主要热事件，其可进一步去卷绕(deconvoluted)(图19)。跟踪第一个熔融温度(Tml)，显然pH5.0和6.0具有最高的热稳定性，随后是在pH7.0(图19)。与荧光结果一致，这些数据提示pH工作范围是5.0-7.0。OD350数据也支持这些观测结果(图20)。通过IEX-HPLC对脱酰胺分析证实高pH和高温增加MntC脱酰胺的速度。
实施例18：四抗原药物产物：配制物开发(缓冲液)
在上述三抗原配制物中，CP5和CP8缀合物药物物质在琥珀酸盐pH7.0中提供。然而，琥珀酸盐缓冲液系统在较低pH不提供良好的缓冲能力。因此用在10mM组氨酸pH6.7中再配制的CP5和CP8缀合物进行实验。由于缀合物药物物质在pH＜6.5不能良好过滤，导致缓慢的过滤及丧失缀合的蛋白，因此优选高于6.5的pH值。这变成评估rmClfA、MntC及药物产物配制物在组氨酸中的均一性的驱动力。
从配制前鉴定研究中，确定了pH对于rmClfA和MntC的工作范围均是5-7。缀合物DS基质改变为组氨酸使评估药物产物中这种缓冲液系统成为必要。评估作为四抗原配制物的抗原作为时间函数的降解速度以确定最佳配制pH。进行搅拌实验以确定配制中对表面活性剂的需求。考虑到冻干，评估稳定剂和填充剂与抗原的相容性。
在组氨酸缓冲液中制备作为pH函数的由400/400/200/200μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197组成的高剂量四抗原配制物。使用RP-HPLC检测rmClfA蛋白的降解，使用IEX-HPLC检测MntC的脱酰胺化。图21例证了两种蛋白代表性的层析图，及对其降解物质的监测。对于rmClfA，裂解的蛋白片段出现在主蛋白峰的右侧，而对于MntC，脱酰胺的峰可见于主峰左侧。这两种蛋白在25℃随时间的降解在图21中示出
所述配制物的稳定性在2-8℃监测0、1和2周，以及在25℃监测0、3和7天。在25℃，rmClfA示出增加pH值降低蛋白的裂解速度(图22A和B)。相反，增加pH值降低MntC脱酰胺化速度(图22C和D)。这两种机制在2-8℃被明显抑制，但是pH依赖性倾向保持一致。
在不同pH在2-8℃和25℃使用浊度法监测CP5-和CP8-CRM197缀合物的抗原性。在2-8℃，这两种缀合物在实验的2周期间保持抗原性(图23A和B)。在25℃，CP5-CRM197示出在1周后无变化，然而CP8-CRM197示出在pH5.5的抗原性降低大约18％(图23C和D)。
实施例19：四抗原药物产物：配制物开发(填充剂)
检测配制物的稳定性，所述配制物包含400/400/200/200μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197及含有1)4.5％蔗糖，2)4.5％海藻糖，3)3％甘露醇/1％蔗糖，4)3％甘露醇/1％海藻糖，5)3％甘氨酸/1％海藻糖，6)3％甘氨酸/1％海藻糖及7)4.5％蔗糖，无PS80。所有配制物均含有10mM组氨酸和0.01％聚山梨醇酯80(除了配制物7之外)，测量的配制物的pH为6.3。将所述配制物等份移至Schott1型2mL小瓶中，带有Flurotec-涂覆的4432/50瓶塞，将小瓶在室温轻轻摇动6天。
所有摇动后的样品的OD350测量示出聚集物未增加(图24B)。重量摩尔渗透压浓度测量表明含有甘氨酸的配制物具有超过290mOsm的生理学重量摩尔渗透压浓度的值(图24A)。ClfA和MntC的恢复＞98％，CP5-CRM197的＞95％，及CP8-CRM197的＞93％，这均在测定变化范围(assay variability)内。监测MntC脱酰胺化的IEX-HPLC分析示出在摇动6天后增加，但是所有配制物示出相似速度，表明既没有特殊的赋形剂或赋形剂组合改良或加速该过程。最后，对MntC和rmClfA进行的RP-HPLC分析示出层析图谱无明显改变。
含有甘氨酸的样品由于高重量摩尔渗透压浓度而从赋形剂候选物列表中去除。将蔗糖、海藻糖、甘露醇和甘氨酸作为表27中配制物所述的冻干产物评估。将配制物冻干，检测其在2-8℃、25℃、37℃和50℃的稳定性。图25A中高剂量的RP-HPLC数据示出在2-8℃、25℃和37℃贮存1个月后无改变。在50℃，rmClfA示出前肩峰增加，具有甘露醇/蔗糖形成呈现出最大改变。此外，在甘露醇/蔗糖配制物中MntC的前肩峰增加。对于低剂量，在两个rmClfA前肩峰中均可见改变，但是甘露醇/蔗糖配制物再次证实较高增加(图25B)。
表27：配制物
恒定参数：10mM组氨酸，0.01％PS80，测量pH～6.3
也使用IEX-HPLC监测MntC的品质。在图25C中，2-8℃高剂量稳定性样品在1个月后示出任何配制物均无改变。在25和37℃保持的样品产生相似的结果(未图示)。然而，在50℃，高剂量和低剂量均示出甘露醇/蔗糖组合谱的最大改变。针对CP5和CP8缀合物的浊度法结果未示出在任何温度在1个月后抗原性的任何改变。
因为蔗糖在这些实验中是先导赋形剂候选物，用保持恒定的10mM组氨酸pH6.5和0.01％PS80及范围在2.0-7.0％的不同浓度的蔗糖配制药物产物基质，并冻干。关键的读出结果是初次干燥步骤中的干燥时间、外观和水分。检测结果表明三抗原配制物中使用的3-6％的蔗糖浓度范围对于四抗原配制物也是可接受的。
实施例20：四抗原药物产物：配制物开发(聚山梨醇酯80)
设计搅拌实验，1)以确定聚山梨醇酯80的需求，及2)证实配制物的鲁棒性。如表28所述，评估具有0、0.01％和0.03％PS80的单价的和SA4ag配制物。将样品等份于Schott1型2mL小瓶中，小瓶带有fiurotec-涂覆的4432/50瓶塞，在RT用VWR涡旋仪(Model DVX-2500，500RPM脉冲模式)搅拌24小时。将无搅拌的对照与搅拌样品一起置于室温下24小时。集合每种配制物的多个小瓶并分析。
表28：搅拌实验的配制物
在搅拌后检查恢复的抗原浓度。所有四种抗原的搅拌后数据均表明浓度无变化，证实在任何样品、包括在不含有PS80的配制物中均无丧失(图26A和B)。使用RP-HPLC对rmClfA和MntC的纯度分析表明在搅拌后的蛋白中均无改变(图26C)。当与PS80水平相比时，使用IEX-HPLC对MntC的纯度分析示出在单价配制物中相似的降低(由于脱酰胺化)(图26D)。从MntC的IEX-HPLC纯度数据获得的一个感兴趣的观测结果是作为单价配制物，降解速度(相应于脱酰胺化)与四抗原配制物中MntC相对比是显著的。鉴于所有配制物均共用相同的缓冲液基质，因此可能MntC与减缓蛋白脱酰胺化速度的另一抗原相互作用。所述配制物的pH值也保持恒定(图26E)，OD350测量表明在搅拌后聚集无增加(图26F)。
实施例21：四抗原药物产物：冻干
使用TA Instruments Modulated Differential Scanning Calorimeter(mDSC)获得冻干前液体配制物的玻璃态转换，Tg’值在表29中报告。批次L44130-39-1和39-2代表含有4.5％蔗糖的高剂量和低剂量靶配制物。批次L44130-45样品概括靶蔗糖浓度，含有3％或6％赋形剂。这些样品含有概括L44130-39-1高剂量和低剂量(+30％和-30％)的ClfA/CP5-CRM197/CP8-CRM197/MntC浓度。所有配制物给出的Tg’值为-33至-35℃，这是如文献中报道的蔗糖的典型值。
表29：配制物的Tg’测量
冻干的样品的Tg值在表30报告。将样品打开，转移及密封在干燥手套式干燥箱中的铝密封的DSC盘中防止冻干的块状物从大气中增加水分。测量值在65-70℃，这是蔗糖配制物的典型值。
表30：冻干的配制物的Tg测量
冻干循环基于用于SA3ag药物产物的循环，因为两种配制物是相似的，均使用蔗糖作为填充剂。表31定义了用于产生四抗原配制物的冻干循环的范围。
表31：冻干循环参数
进行冻干研究，对比如下参数：
1.4.5％蔗糖比4％甘露醇/1％蔗糖，及
2.保守冻干循环比更快速积极的循环。
评估作为单价药物产物配制物以及作为四抗原配制物的样品。所有配制物均包含10mM组氨酸pH6.5，和0.01％PS80。rmClfA和MntC剂量为400μg/mL，CP5-和CP8-CRM197缀合物为200μg/mL。冻干前和冻干后配制物使用如下测定对比：外观，pH，CEX-HPLC分析MntC脱酰胺化，RP-HPLC分析MntC和rmClfA纯度，浊度法分析缀合物恢复、水分，OD350分析沉淀物检测，差示扫描量热法(DSC)评估结构。使用的循环在表32和表33描述。
表32：冻干循环参数(慢循环)
总运行时间：66小时
表33：冻干循环参数(快循环)
总运行时间：47小时
所述块状物的外观在表34描述。所有含有甘露醇的块状物在两个循环产生目测美观(elegant)的块状物。蔗糖配制物示出如长循环预期的可接受的块状物，但是短快速(aggressive)循环产生部分瓦解的块状物。块状物水分含量数据证实所有配制物均＜1％，然而，含有甘露醇的样品一般比只含有蔗糖的水分低。图27A中RP-HPLC覆盖示出冻干前和冻干后rmClfA和MntC纯度无变化，浊度法结果也表明CP5-CRMl97(图27B)和CP8-CRMl97(图27C)的抗原性在冻干后无变化，与循环或赋形剂无关。图27D和E证实对于四抗原配制物，MntC的脱酰胺化种类在冻干后保持在～2.5％。pH在冻干后保持一样，在任何冻干后样品中检测OD350均无显著增加，表明不存在沉淀物。然而，重要的是要注意OD350不检测小的可溶聚集体的产生。DSC数据表明抗原(rmClfA和MntC)中无结构扰动是每一循环的结果，如通过熔融温度没有变化而证实(图27F)。未监测缀合物，因为其不产生强熔融信号。最后，使用Luminex测定对比冻干前和冻干后抗原的％体外相对效力。rmClfA是在单价和四抗原配制物中测定，但是缀合物只作为单价配制物测定，因为四抗原组合产生干扰。结果示出当对比冻干前和冻干后(慢循环和快循环)时，所有分析的样品(甘露醇和蔗糖)均在测定误差内，rmClfA(图27G)和缀合物(图27H)在这些条件下是稳定的。
表34：块状物的外观
实施例22：四抗原药物产物：重建
选择重建稀释剂是于注射用水(WFI)中60mM NaCl。图28证实了当用这个稀释剂重建时，高剂量(400/400/200/200μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197)和低剂量(200/200/100/100μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197)均示出在生理范围内的重量摩尔渗透压浓度。选择的重建体积是0.7mL，获得终体积是0.73mL。
在用60mM NaCl重建后，将高剂量和低剂量四抗原疫苗在2-8℃和25℃保持48小时进行稳定性研究。图29A中的数据示出通过RP-HPLC检测的MntC纯度在2-8℃和25℃保持48小时不变。rmClfA在2-8℃稳定48小时，但是在25℃时纯度在24小时时间点降低(图29B)。IEX-HPLC用于监测MntC纯度，其降低表示脱酰胺化增加(图29C)。所述蛋白在2-8℃保持稳定，微不足道的纯度降低＜2％。在25℃，MntC保持稳定4小时，但是在24小时后纯度显著降低(低于90％)。数据的动力学分析示出如下结果：MntC在2-8℃和25℃的降解分别为每小时0.03％和0.26％(图29D)，rmClfA在2-8℃和25℃的降解分别为每小时0.01％和0.16％(图29E)。另外的数据示出抗原的浓度在任一温度在48小时后均不改变(图30A-D)。pH在48小时也保持不变(图30E)。
基于对重建后所有四种抗原的疫苗的分析，重建后的疫苗在室温稳定4小时，在2-8℃稳定直至24小时。
实施例23：四抗原药物产物：冻干后恢复
四抗原配制物的冻干后恢复使用两组研究(两个高剂量和两个低剂量)评估，其中所述方法包括配制、过滤、充填和冻干。图3lA和B示出在冻干后任何抗原均无丧失。同样，图31C和D示出在冻干后样品中rmClfA或MntC的纯度均无变化。
实施例24：四抗原药物产物：配制物稳定性
检测四抗原配制物在2-8℃、25℃和37℃的稳定性，所述四抗原配制物具有：
1)400/400/200/200μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197，
2)200/200/100/100μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197，或者
3)40/40/20/20μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197
配制物(1)和(2)在这三个温度稳定6个月。配制物(3)证实在2-8℃的5个月稳定性(表35)。用于这项研究的药物物质对于rmClfA是L40256-30(四抗原代表性批次)，对于MntC是L44124-64(四抗原代表性批次)，对于CP5-CRM197是7CP5C-1002(三抗原代表性批次)及对于CP8-CRM197是G-C8-3-9(三抗原代表性批次)。
表35：四抗原配制物(3)的5个月稳定性
表36描述了用于研究稳定性的四抗原冻干的配制物的批次
表36：用于稳定性研究的配制物描述
所有配制物均含有10mM绀氨酸pH6.5，4.5％蔗糖，0.01％聚山梨醇酯80
药物物质在如下基质中提供：
rmClfA：10mM组氨酸，pH6.5
MntC：10mM组氨酸，pH6.0
CP5-和CP8-CRM197缀合物：10mM组氨酸，pH6.7
表37和38分别示出了高剂量和低剂量的6个月稳定性数据概述。在6个月后，这两个剂量均保持相同的块状物外观，用稀释剂迅速重建，pH保持在6.5±0.3，水分保持在＜1.5％。rmClfA，MntC，CP5-CRM197和CP8-CRM197的强度未变化。此外，rmClfA和MntC的纯度值保持在t＝0时的。四抗原高剂量和低剂量配制物示出在长期和加速贮存条件下至3个月是稳定的。相似地，两个剂量水平的第二组配制物示出在2-8℃，25℃和37℃的6个月稳定性(表39和表40)。基于数据，建议这些样品的货架时间是12个月。
冻干的药物产物基质在2-8℃的6个月稳定性检测示出所有检测的参数在研究期间保持相同(表41)。建议的药物产物基质的货架时间是12个月。
表41：四抗原药物产物基质冻干的配制物(L44130-57-2)的6个月稳定性概述
将冻干的四抗原毒理学高剂量(L44130-39-1)和低剂量(L44130-39-2)配制物用0.7mL的60mM NaCl稀释剂重建，在2-8℃和25℃检测稳定性。在t＝0、4和24小时分析样品。关键测定是pH，通过RP-HPLC测量rmClfA纯度，通过IEX-HPLC测量MntC纯度，通过IEX-HPLC测量rmClfA和MntC强度，及通过浊度法测量CP5/CP8缀合物抗原性。监测的降解的主要机制是rmClfA的蛋白裂解及MntC的脱酰胺化。在图32A和B中，两种重组蛋白的纯度在这两个剂量在2-8℃保持24小时。在25℃保温条件下，这两种蛋白的纯度在4小时保持不变，但是在24小时降低。在2-8℃和25℃在24小时后所述蛋白(图32C和D)和缀合物(图32E和F)的强度以及pH(图32G)也是恒定的。简而言之，基于对重建后配制物的分析，在重建后，所有四个抗原的配制物在室温下稳定4小时及在2-8℃稳定直至24小时。
实施例25：四抗原药物产物：边缘研究(edge studies)
设计边缘研究以概括高和低剂量配制物的成分以证实所述配制物的鲁棒性。表42详细描述了所述配制物。活性成分变化为高于高剂量(400/400/200/200μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197)的30％及低于低齐量(200/200/100/100μg/mL的rmClfA/MntC/CP5-CRM197/CP8-CRM197)的30％。无活性成分的变化范围为pH6.0-7.0，5-15mM组氨酸，3-6％蔗糖及0.005-0.015％PS80。
表42：边缘研究设计
冻干边缘配制物，置于2-8℃，25℃和37℃测量稳定性结果在表43-46中示出，表明所有边缘配制物在所述三个温度稳定3个月，证实四抗原配制物的鲁棒性。
表43：边缘稳定性：+30％高剂量
表44：边缘稳定性：-30％低剂量
表45：边缘稳定性:高/低
表46：边缘稳定性:低/高
实施例26：四抗原药物产物：冷冻-解冻稳定性
将高剂量(L44130-88-1)和低剂量(L44130-88-2)的四抗原冻干前液体配制物在Schott1型小瓶中冷冻及解冻4个循环。每次将样品在-70℃冷冻至少24小时，然后在室温解冻。在解冻循环期间，严密监测小瓶以便解冻的液体配制物不在室温放置过长时间。这样保证了数据不反映由于所述配制物在室温保温导致的mClfA的任何剪切和MntC的脱酰胺化。集合每个冷冻-解冻系列(一式三份进行)，通过RP-HPLC分析rmClfA和MntC纯度，通过IEX-HPLC分析rmClfA和MntC浓度，通过IEX-HPLC分析MntC纯度，及通过浊度法测量CP5和CP8缀合物浓度。在四次冷冻-解冻循环后，通过RP-HPLC分析的rmClfA和MntC的纯度(图33A)及通过IEX-HPLC分析的MntC的纯度(图33B)没有改变。同样，在四次冷冻-解冻循环后所述抗原的浓度(图33C和D)和pH(图33E)保持恒定。
实施例27：四抗原药物产物：搅拌后的稳定性
测量搅拌后的稳定性的研究目的是保证含有0.01％聚山梨醇酯80的所述四抗原配制物不示出与容器密封系统的任何吸附问题。高剂量的冻干前四抗原配制物(L44130-100)用0、0.01％和0.03％聚山梨醇酯80制备，将样品在室温在冻干小瓶/塞子容器密封(stopper container closure)中搅拌24小时。对照样品置于同一环境温度下，但是不搅拌。对于搅拌，VWRDVX-2500多管式涡旋仪设定为500RPM脉冲模式。聚山梨醇酯80浓度概括为范围0-0.03％。
关键测定包括如下测定：RP-HPLC检测rmClfA裂解和MntC降解(除外脱酰胺化)，IEX-HPLC监测MntC脱酰胺化，四种抗原的浓度，以及pH和OD350。图34A和B示出在搅拌后rmClfA和MntC纯度保持相似。图34C和D中也示出所有四种抗原在搅拌后均恢复。保持pH(图34E)，通过OD350监测到搅拌不促进抗原的聚集(图34E)。所有数据均表明所述配制物与冻干容器密封系统相容。
虽然冻干容器密封不含有硅氧烷，但是所述配制物仍将与用于重建和输送疫苗的玻璃注射器的塞子上的硅氧烷接触。
实施例28：四抗原药物产物：ISCOMATRIXTM研究
在10mM组氨酸pH6.5及有或无60mM NaCl的20单位/mL的ISCOMATRIXTM中重建后分析高剂量四抗原配制物(400/400/200/200μg/mL的rmClfA/rP305A/CP5-CRM197/CP8-CRM197)的稳定性。在2-8℃和25℃监测稳定性24小时。通过CEX-HPLC分析MntC的纯度。在25℃具有NaCl的ISCOMATRIXTM和具有盐的对照NaCl示出相似的脱酰胺化速度(图35B)。无盐的ISCOMATRIXTM示出较慢的脱酰胺化速度。在5℃，脱酰胺化速度明显降低(图35A)。由于来自ISCOMATRIXTM的干扰，不可能直接量化rmClfA纯度(图35C)。代表性的时程覆盖分析表明rmClfA主峰未改变，表明在25℃在24小时的稳定性(图35D)。在2-8℃针对所有样品可见相似结果。通过RP-HPLC检测在2-8℃(图35E)和25℃(图F)在24小时后MntC纯度无改变(图35C)在2-8℃(图35G)和25℃(图35H)在24小时后观测到CP5-CRM197和CP8-CRM197缀合物浓度无改变。在2-8℃(图35I)和25℃(图35J)在24小时后观测到rmClfA或MntC浓度无改变。
在2-8℃(图36A)和25℃(图36B)在24小时ISCOMATRIXTM浓度未改变。具有NaCl的ISCOMATRIXTM颗粒大小增加至大小为～50nm，无NaCl的颗粒大小增加为～60nm(图36C)。所有群均是单分散性的(＜0.2)。在稳定性研究中，重建的配制物的pH保持恒定(图36D)。
在10mM组氨酸pH6.5及有或无60mM NaCl的20单位/mL的ISCOMATRIXTM中重建后分析低剂量四抗原配制物(40/40/20/20μg/mL的rmClfA/rP305A/CP5-CRM197/CP8-CRM197)的稳定性。通过RP-HPLC检测在2-8℃在4小时后MntC纯度无变化(图37A)。通过CEX-HPLC检测在2-8℃在4小时后MntC脱酰胺化无增加(图37B)。在这项研究中，所有四种抗原浓度保持恒定(图37C和D)。
具有NaCl的ISCOMATRIXTM颗粒大小在4小时后增加，无NaCl的保持恒定，但是在这两种情况中均大于单独ISCOMATRIXTM的情况(图38A)。重建的样品是多分散的(～0.3)。重建的配制物的pH在4小时后保持恒定(图38B)。
实施例29：四抗原药物产物：稀释剂对比
在四抗原配制物中使用低-、中-、高-剂量MntC进行短期稳定性研究，以对比作为稀释剂的60mM NaCl、于水中4.5％蔗糖，及水。每种配制物含有4.5％蔗糖，0.01％PS80，及在表47中提供的浓度的抗原，pH6.5。
表47：四抗原药物产物配制物
将小瓶在开始实验之前贮存在2-8℃，在2和7天后在5℃和25℃检测稳定性。使用如下测定对比配制物：CEX-HPL分析MntC脱酰胺化和纯度，RP-HPLC分析MntC和ClfA纯度，IEX分析MntC和ClfA浓度，浊度法测量缀合物浓度。详细结果在表48-56中示出。MntC的脱酰胺化速度在用60mM NaCl重建的所有三个配制物中较高，高剂量MntC在三个剂量水平中具有最高的脱酰胺化速度。所有其它结果是相似的。
表48：低剂量MntC(125426-036-A)的短期稳定性概述，使用60mM NaCl作为稀释剂
表49：低剂量MntC(125426-036-A)的短期稳定性概述，使用4.5％蔗糖水溶液作为稀释剂
NT-未检测
表50：低剂量MntC(125426-036-A)的短期稳定性概述，使用水作为稀释剂
NT-未检测
表51：中剂量MntC(125426-036-B)的短期稳定性概述，使用60mM NaCl作为稀释剂
NT-未检测
表52：中剂量MntC(125426-036-B)的短期稳定性概述，使用4.5％蔗糖水溶液作为稀释剂
NT-未检测
表53：中剂量MntC(125426-036-B)的短期稳定性概述，使用水作为稀释剂
NT-未检测
表54：高剂量MntC(125426-036-C)的短期稳定性概述，使用60mM NaCl作为稀释剂
NT-未检测
表55：高剂量MntC(125426-036-C)的短期稳定性概述，使用4.5％蔗糖作为稀释剂
NT-未检测
表56：高剂量MntC(125426-036-C)的短期稳定性概述，使用水作为稀释剂
实施例30：四抗原药物产物：可选配制物
对一些四抗原药物产物的不同配制物进行稳定性测定，如表57所示。
表57：四抗原药物产物配制物
将冻干的配制物用0.7mL水重建并在5℃和25℃在1、3和6个月后及在40℃在1和3个月后检测稳定性。使用如下测定对比配制物：KarlFischer水分，澄清度，颜色，颗粒的检测，CEX-HPL分析MntC脱酰胺化和纯度，RP-HPLC分析MntC和ClfA纯度，IEX分析MntC和ClfA浓度，及浊度法测量缀合物浓度。水分百分比在具有45mg/ml蔗糖的配制物中较高。块状物中的水含量是与块状物总量的百分比。因此，90mg/ml蔗糖块状物由于蔗糖量的两倍而呈现出水分百分比更强。详细结果在表58-66中示出。
表58：四抗原配制物124369-8-A的稳定性概述
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I
表59：四抗原配制物124369-8-B的稳定性概述
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I
表60：四抗原配制物124369-8-C的稳定性概述
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I
表61：四抗原配制物124369-8-D的稳定性概述
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I
表62：四抗原配制物124369-8-E的稳定性概述
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I
表63：四抗原配制物124369-8-F的稳定性概述
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I
表64：四抗原配制物124369-8-G的稳定性概述
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I
表65：四抗原配制物124369-8-H的稳定性概括
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I
表66：四抗原配制物124369-8-L的稳定性概述
NT-未检测
NMO RSI-不多于EP参考标准I

Claims (28)

1.冻干的免疫原性组合物，其包含：
(a)选自如下的至少三种成分：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、5型荚膜多糖(CP5)-蛋白缀合物、8型荚膜多糖(CP8)-蛋白缀合物以及分离的金黄色葡萄球菌MntC多肽；
(b)pKa为6.0±0.6的缓冲剂；及
(c)填充剂。
2.冻干的免疫原性组合物，其包含：
(a)分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽，
(b)5型荚膜多糖(CP5)-蛋白缀合物，
(c)8型荚膜多糖8(CP8)-蛋白缀合物，
(d)pKa为6.0±0.6的缓冲剂，以及
(e)填充剂。
3.权利要求2的冻干的免疫原性组合物，其中所述组合物进一步包含分离的金黄色葡萄球菌MntC多肽。
4.权利要求2或3的冻干的免疫原性组合物，其中所述组合物进一步包含分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)。
5.权利要求1或2的冻干的免疫原性组合物，其中所述ClfA多肽包含N结构域。
6.权利要求5的冻干的免疫原性组合物，其中所述ClfA多肽包含血纤蛋白原结合结构域。
7.权利要求6的冻干的免疫原性组合物，其中所述血纤蛋白原结合结构域已经被改变从而以与观测到的血纤蛋白原与ClfA的天然血纤蛋白原结合结构域的结合相比降低的水平结合血纤蛋白原。
8.权利要求7的冻干的免疫原性组合物，其中所述血纤蛋白原结合结构域通过具有在Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254和Ile 387中的一或多个处的氨基酸取代而展示出与血纤蛋白原降低的结合。
9.权利要求8的冻干的免疫原性组合物，其中在Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254和Ile 387中的一或多个处的氨基酸取代是取代为Ala或Ser。
10.权利要求9的冻干的免疫原性组合物，其中Tyr 338被取代为Ala。
11.权利要求1或2的冻干的免疫原性组合物，其中所述CP5-蛋白缀合物是CP5-CRM197、CP5-肺炎球菌溶血素或者CP5-链球菌C5a肽酶(SCP)。
12.权利要求1或2的冻干的免疫原性组合物，其中所述CP8-蛋白缀合物是CP8-CRM197、CP8-肺炎球菌溶血素或者CP8-链球菌C5a肽酶(SCP)。
13.权利要求1或2的冻干的免疫原性组合物，其包含占所述免疫原性组合物总重量小于3％重量的水(％w/w)，其中所述ClfA多肽在0.09％±0.027％至0.85％±0.26％w/w之间，所述CP5-蛋白缀合物在0.04％±0.013％至0.42±0.13％w/w之间，所述CP8-蛋白缀合物在0.04％±0.013％至0.42±0.13％w/w之间，并且所述缓冲剂为2.54％±0.76％w/w。
14.权利要求1或2的冻干的免疫原性组合物，其中所述缓冲剂包含pH 6.0±0.5的组氨酸。
15.权利要求1或2的冻干的免疫原性组合物，其中所述填充剂选自蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸和山梨糖醇。
16.权利要求15的冻干的免疫原性组合物，其中所述填充剂是蔗糖。
17.权利要求16的冻干的免疫原性组合物，其中所述填充剂是96％±0.060％w/w的蔗糖。
18.权利要求1或2的冻干的免疫原性组合物，其进一步包含表面活性剂。
19.权利要求18的冻干的免疫原性组合物，其中所述表面活性剂选自泊洛沙姆、聚氧乙烯烷基醚及聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯。
20.权利要求19的冻干的免疫原性组合物，其中所述聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯是聚山梨醇酯80。
21.权利要求20的冻干的免疫原性组合物，其中所述聚山梨醇酯80为0.20％±0.041％w/w。
22.权利要求1或2的冻干的免疫原性组合物，其中所述组合物进一步包含佐剂。
23.权利要求22的冻干的免疫原性组合物，其中所述佐剂是ISCOMATRIXTM。
24.通过用水性稀释剂重建权利要求1-23任一项的冻干的免疫原性组合物制备的液体免疫原性组合物，其中所述液体免疫原性组合物的最终pH为6.0±0.5。
25.权利要求24的液体免疫原性组合物，其中所述水性稀释剂是水。
26.权利要求24或25的液体免疫原性组合物，其中所述液体免疫原性组合物包含：
(a)ClfA多肽，其浓度在40μg/ml±4μg/ml至800μg/ml±80μg/ml之间；
(b)CP5-蛋白缀合物，其浓度在20μg/ml±2μg/ml至400μg/ml±40μg/ml之间；
(c)CP8-蛋白缀合物，其浓度在20μg/ml±2μg/ml至400μg/ml±40μg/ml之间；
(d)组氨酸缓冲剂，其浓度为10mM±5mM；
(e)聚山梨醇酯80，其浓度为0.1％±0.05％重量/体积(w/v)；以及
(f)蔗糖，其浓度为9％±4.5％w/v。
27.权利要求24的液体免疫原性组合物，其中所述液体免疫原性组合物进一步包含MntC多肽，其浓度在40μg/ml±4μg/ml至800μg/ml±80μg/ml之间。
28.权利要求24的液体免疫原性组合物，其中所述液体免疫原性组合物进一步包含ClfB多肽，其浓度在40μg/ml±4μg/ml至800μg/ml±80μg/ml之间。
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