CN106163550A - 通过大肠杆菌中合成的糖蛋白疫苗预防金黄色葡萄球菌感染 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于治疗和预防金黄色葡萄球菌感染的免疫原性组合物和疫苗。这些免疫原性组合物和疫苗包含N‑连接至一种或多种载体蛋白的生物缀合物荚膜多糖的组合。

Description

通过大肠杆菌中合成的糖蛋白疫苗预防金黄色葡萄球菌感染
本申请要求2013年12月4日提交的美国临时专利申请号61/911,919的权益，所述申请的公开内容以其整体通过引用并入本文。
介绍
本文提供用于治疗和预防金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染的免疫原性组合物和疫苗。这些免疫原性组合物和疫苗包含N-连接至一种或多种载体蛋白的生物缀合物荚膜多糖的组合。
背景
金黄色葡萄球菌是侵袭性的人感染(包括菌血症、心内膜炎、肺炎和伤口感染)的主要原因。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在医院中是地方性的，且社区相关的MRSA菌株是全世界传播的，构成重大全球挑战[1-3]。迫切需要疫苗以预防葡萄球菌疾病。已经在临床试验中测试了几种疫苗，但荚膜多糖(CP)缀合物、个别蛋白抗原和针对脂磷壁酸的单克隆抗体(mAb)已经在各个开发阶段失败，强调了对于具有更广泛效力的新颖疫苗的需求[4-6]。引发体液和细胞介导的免疫应答的金黄色葡萄球菌疫苗目前正在评估[7]，并且α毒素(Hla)和CP两者均为考虑用于包括于多组分疫苗(multi73 component vaccine)中的关键抗原。
血清型5(CP5)或血清型8(CP8)荚膜由~75%的金黄色葡萄球菌临床分离株产生，且CP抗原对于受感染动物的血液中的存活是关键的[8, 9]。荚膜抗体是调理性的，其介导人嗜中性粒细胞对葡萄球菌的摄取和杀灭[8]。Hla是分泌的孔形成毒素，淋巴细胞、巨噬细胞、肺泡上皮细胞、肺内皮和红细胞对于其是敏感的[10]。遗传脱毒蛋白(HlaH35L)是孔形成缺陷的，且针对HlaH35L的抗体中和天然Hla的裂解活性[11]。用HlaH35L免疫保护小鼠免于致死性葡萄球菌肺炎、致死性腹膜炎和皮肤感染[12-14]。
用CP糖基化的保守葡萄球菌蛋白抗原免疫可以是预防金黄色葡萄球菌感染的极好且有效的策略，限制了需要制备并个别纯化的个别疫苗组分的数目。此类方法通过开发新颖的大肠杆菌N-连接的糖基化技术是可行的[15, 16]，其中O抗原通过寡糖基转移酶PglB转移至蛋白载体内的特定位点[15-17]。与化学缀合疫苗相反，具有限定分子结构的生物缀合物疫苗是同质的，并且蛋白和聚糖组分保持于天然构象中，避免必需B-细胞表位的变性[18]。产物含有来自相同生物体的肽和共价连接的糖表位，由此扩大其针对微生物疾病的许多显现的效力。我们已经制备了由CP5-铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白A (Epa)、CP8-Epa和CP5-Hla构成的糖缀合物疫苗并在小鼠中评估它们针对菌血症和致死性肺炎的保护效力。尽管CP5-Epa和CP8-Epa显著减少菌血症，但CP5-Hla生物缀合物疫苗保护免于菌血症和致死性肺炎两者。
附图简述
图1.大肠杆菌中金黄色葡萄球菌的5型(CP5)和8型荚膜多糖(CP8)的合成。A, 构建编码负责CP5或CP8在大肠杆菌中的表达的酶的人工基因簇。它们包含从金黄色葡萄球菌cap5或cap8基因座(黑色)和铜绿假单胞菌O11 LPS基因座(灰色)克隆的基因。B, CP5或CP8聚合物的生物合成，其显示由来自金黄色葡萄球菌(黑色)、铜绿假单胞菌(红色)和大肠杆菌(灰色)的酶介导的UDP-活化的糖前体的酶促组装、转运和聚合。粗体酶用于在大肠杆菌中合成和组装CP5和CP8聚合物。
图2.大肠杆菌中金黄色葡萄球菌5型(CP5)和8型荚膜多糖(CP8)的产生。A, B, 显示金黄色葡萄球菌CP5和CP8重复单元的结构。从重组大肠杆菌提取糖脂，并在从脂质载体酸释放之后用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记；因此CP5和CP8重复亚基的还原性末端携带2-AB。进行具有794.3的质荷比的HPLC洗脱峰的MALDI-TOF/TOF MS-MS分析。用指向对应单糖的箭头显示C, CP5和D, CP8的片段化模式。制备蛋白酶K处理的表达金黄色葡萄球菌CP的大肠杆菌细胞的全细胞裂解物并通过SDS-PAGE分离。E, CP5和F, CP8聚合物通过银染和用针对CP5或CP8的抗体探测的Western印迹显现。从表达G, CP5-Epa；H, CP8-Epa；或I, CP5-Hla的大肠杆菌纯化的生物缀合物通过SDS-PAGE分离并用考马斯蓝(CB)染色。转移至硝酸纤维素之后，生物缀合物通过其与针对铜绿假单胞菌胞外蛋白A (Epa)、CP5、CP8或α毒素(Hla)的血清抗体的反应性进行检测。
图3. 金黄色葡萄球菌糖缀合物疫苗在小鼠中是免疫原性的。来自用PBS、Hla或生物缀合物疫苗制剂免疫的小鼠的血清中的抗原特异性抗体水平通过ELISA以1:100血清稀释度测定。A, 对照小鼠或给予渐增剂量的缀合至Epa的生物缀合物疫苗的小鼠中的针对CP5的抗体水平。B, 用CP8-Epa或2a-Epa免疫的小鼠中针对CP8的抗体水平。C, 对照小鼠、给予CP5-Hla或单独的Hla的小鼠中针对CP5的抗体水平。D, 对照小鼠、给予CP5-Hla或单独的Hla的小鼠中针对Hla的抗体水平。通过用测试血清(1:100稀释)在405nm处的OD除以每个测定中稀释和包括的对照高滴定血清在405nm处的OD而计算ELISA指数。
图4. 金黄色葡萄球菌糖缀合物疫苗引发功能性抗体。A, 针对CP5-Epa或CP5-HlaH135L的兔IgG (10、1或0.1 μg/ml)在HL-60调理吞噬杀灭(OPK)测定法(n = 3)中对于血清型5金黄色葡萄球菌菌株Reynolds (CP5)和Newman是调理性的，而针对Hla和志贺氏菌O1-Epa的抗体是非调理性的。B, 用人嗜中性粒细胞进行的OPK测定揭示，针对CP5-Epa的兔抗体在低至1 μg/ml的浓度对于B, Reynolds (CP5)；C, Newman；D, USA100；和E, USA200是调理性的。针对对照生物缀合物志贺氏菌O1-Epa疫苗的兔抗体缺乏调理活性。如所述(43)用CP5-Epa(浓度显示为μg/ml)、人多形核白细胞(PMN)和豚鼠血清作为补体(C’)源进行OPK测定。F, 测定的特异性通过CP5-Epa IgG无法调理血清型8菌株(Reynolds [CP8]用于吞噬杀灭)而显示。单独的PMNs + C’(有或无荚膜抗体)杀灭荚膜阴性Reynolds (CP-)菌株。G, 针对CP8-Epa的兔IgG (≥1 μg/ml)对于血清型8金黄色葡萄球菌菌株Reynolds(CP8)和MRSA菌株ST80是调理性的。在缺乏抗体或具有志贺氏菌2a-Epa IgG的样品中没有观察到细菌杀灭。H, 来自用20 μg HlaH135L或2 μg CP5-20 μg HlaH135L免疫的小鼠(n = 7-16)的血清中和Hla对于兔红细胞的裂解活性。与用4 U/ml天然Hla对红细胞的100％裂解相比计算百分比溶血。来自用HlaH135L免疫的小鼠的血清显示比来自给予CP5-HlaH135L的小鼠的血清更大的体外中和活性。在50％裂解滴度之间缺乏95% C.I.的重叠表明以P <0.05显著的差异；条代表s.e.m.。
图5. 用金黄色葡萄球菌糖缀合物疫苗的主动免疫保护小鼠免于菌血症、重量减轻和肾脓肿。A, 在第0、14和28天用CP5- Epa免疫且用~107 CFU金黄色葡萄球菌Reynolds(CP5)通过腹膜内途径攻击的小鼠具有较少从血液(P = 0.0029)和B, 肾(P < 0.0001)回收的细菌，并且C, 显示与用志贺氏菌O1-Epa免疫的小鼠相比减少的重量减轻(P =0.005)。D, 用0.2 μg CP8-Epa免疫且用3.9 x 107 CFU Reynolds (CP8)攻击的小鼠显示与对照小鼠相比减少的菌血症(P = 0.0015)。E, 用0.2 μg CP5–20 μg HlaH135L免疫的小鼠被保护免于通过用~107 CFU菌株Reynolds (CP5)攻击激发的菌血症和F, 重量减轻。水平线代表组中位数。统计学分析用Mann-Whitney U检验(* P < 0.05，** P < 0.01和*** P< 0.0001)进行。G, 用CP5-HlaH135L、2a-Epa或缓冲液主动免疫的小鼠中的小鼠CP5抗体水平和菌血症水平之间的负相关性(通过Spearman非参数分析，P<0.001)。将细菌攻击前一天获得的小鼠血清1:100稀释，并且通过CP5特异性ELISA测试。小鼠用1 x 107 CFU金黄色葡萄球菌Reynolds腹膜内攻击，并且在2小时之后进行定量血培养。每个点代表来自一只小鼠的样品，并且菌血症水平的检测下限范围为5 – 20 CFU/ml。
图6. 用CP5-HlaH135L的免疫保护小鼠免于由不同的金黄色葡萄球菌分离株激发的致死性肺炎。A, 用2 μg CP5–20 μg HlaH135L或20 μg HlaH135L免疫的小鼠被保护免于由用1.4 x 109 CFU金黄色葡萄球菌Newman (n = 15 - 18)；B, 1.6 x 109 CFU LAC (n = 8)；或C, 6.0 x 108 CFU ST80 (n = 9)的鼻内攻击导致的致死性肺炎。D, 在第0、14和28天用生物缀合物疫苗免疫小鼠。在用金黄色葡萄球菌Newman攻击前72小时和24小时用针对CD4或CD8a的单克隆抗体注射小鼠。向对照动物给予PBS。CP5-HlaH135L免疫的小鼠(有或没有T细胞耗竭)显示类似的存活曲线，而用志贺氏菌2a-EPA生物缀合物免疫的小鼠在细菌攻击后24小时内死亡。用对数秩检验分析数据。
图7.用对于金黄色葡萄球菌生物缀合物疫苗特异性的兔IgG的被动免疫保护小鼠免于菌血症和致死性肺炎。A, 施用CP5-Epa IgG且用6 x 106 CFU金黄色葡萄球菌Reynolds (CP5)或B, 7 × 107 CFU USA200 IP攻击的小鼠，与给予志贺氏菌O1-Epa IgG的小鼠相比，在攻击后2小时具有明显较少从血液回收的细菌。C, 给予CP8-Epa IgG的小鼠被保护免于由4 x 107 CFU金黄色葡萄球菌Reynolds (CP8)诱导的菌血症。D, 施用CP5-Hla IgG的小鼠显示减少的由金黄色葡萄球菌USA100 (8 × 107 CFU/小鼠)或E, Newman(9 x 107 CFU/小鼠)激发的菌血症。F, 用300 μg CP5-Epa或CP5-HlaH135L IgG被动免疫的小鼠在用菌株Reynolds (CP5) (4 x 106 CFU)攻击之后显示类似的菌血症减少。针对Hla的抗体菌血症水平没有影响。水平线代表组中位数，且P值(*< 0.05，** < 0.01和*** <0.0001)用Mann-Whitney U检验确定。G, 与在用6.1 × 108 CFU金黄色葡萄球菌Newman鼻内攻击前24小时给予CP5-Epa IgG或O1-Epa IgG的小鼠相比，用单一1 mg剂量的CP5-HlaH135L IgG或Hla IgG被动免疫的小鼠(10/组)存活更长(P =0.0001)。H, 在用9.7 x 108CFU菌株Newman细菌攻击前4小时和24小时给予1 mg Hla IgG或CP5-HlaH135L IgG的小鼠被保护(P <0.0001)免于致死性肺炎。用对数秩检验确定存活研究的P值。
图8. 来自用金黄色葡萄球菌生物缀合物疫苗免疫的小鼠的血清在体外功能测定中介导葡萄球菌的调理吞噬杀灭。(A) 从用CP5-Epa或CP5-HlaH135L免疫的小鼠合并的血清(三倍稀释，从1:50至1:109,350)对于血清型5金黄色葡萄球菌菌株Reynolds (CP5)和Newman是调理性的。(B) 从用CP8-Epa免疫的小鼠合并的血清(三倍稀释，从1:50至1:109,350)对于血清型8菌株Reynolds (CP8)和MRSA菌株ST80是调理性的。从免疫之前(免疫前)的小鼠或用志贺氏菌2a-Epa生物缀合物疫苗免疫的小鼠收集的缺乏血清或含有合并血清的样品的调理性不佳。
详述
本文提供用于治疗和预防金黄色葡萄球菌感染的免疫原性组合物和疫苗。这些免疫原性组合物和疫苗包含N-连接至一种或多种载体蛋白的生物缀合物荚膜多糖的组合。
荚膜多糖可以如先前所述在原核宿主细胞中(例如，在大肠杆菌中)合成。参见，例如，2011年5月4日提交且作为WO 2011/138361公开的国际专利申请号PCT/EP2011/057111，其以其整体并入本文。这些荚膜多糖可以经由寡糖基转移酶(诸如来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的pglB)N-连接至载体蛋白，如描述于，例如，2011年5月4日提交且作为WO 2011/138361公开的国际专利申请号PCT/EP2011/057111，其以其整体并入本文。
在某些实施方案中，载体蛋白是天然地包含一个或多个N-糖基化共有序列的蛋白。在其他实施方案中，已将一个或多个N-糖基化共有序列重组地引入载体蛋白中。可以在本文中使用适合在缀合疫苗生产中使用的任何载体蛋白。示例性的载体蛋白包括，但不限于，铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)外毒素A(EPA)、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的脱毒溶血素A(Hla，例如Hla H35L)、金黄色葡萄球菌的凝集因子A (ClfA)、金黄色葡萄球菌的凝集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的脱毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的脱毒变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的过客结构域(passenger domain)、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白，肺炎链球菌肺炎球菌溶血素和另外的肺炎链球菌蛋白抗原，例如，肺炎链球菌NOX、肺炎链球菌PspA、肺炎链球菌PcpA、肺炎链球菌PhtD、肺炎链球菌PhtE、肺炎链球菌Ply和肺炎链球菌LytB。在某些实施方案中，载体蛋白融合至信号肽，使得载体蛋白位于革兰氏阴性宿主细胞(例如，大肠杆菌)的周质空间中。在一个具体实施方案中，信号肽是DsbA信号肽。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包含(i)N-连接至ClfA的荚膜多糖8型(CP8-ClfA)；和(ii)N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖。在更具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP5-Hla、CP8-EPA或CP8-Hla。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包含(i)N-连接至Hla的荚膜多糖5型(CP5-Hla)；和(ii)N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖。在更具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、CP8-ClfA或CP8-Hla。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包含(i)N-连接至Hla的荚膜多糖5型(CP5-Hla)；(ii)N-连接至ClfA的荚膜多糖8型(CP8-ClfA)；和(iii)N-连接至载体蛋白的第三荚膜多糖。在更具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第三荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA或CP8-Hla。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包含N-连接至一种载体蛋白的CP5和CP8。在其他实施方案中，本文提供的组合物包含N-连接至两种或更多种载体蛋白的CP5和CP8。
在某些实施方案中，本文提供的组合物包含N-连接至一种载体蛋白的CP5和CP8，其中所述载体蛋白获得自金黄色葡萄球菌，诸如Hla或Clfa。在其他实施方案中，本文提供的组合物包含N-连接至两种或更多种载体蛋白的CP5和CP8，其中这些载体蛋白中的一种、两种或所有获得自金黄色葡萄球菌，诸如Hla或Clfa。
在另一个方面，本文提供治疗具有金黄色葡萄球菌感染或处于发展金黄色葡萄球菌感染的风险中的主体(例如，人主体)的方法，其中所述方法包括向所述主体施用一种或多种本文所述的组合物。
在一个具体实施方案中，本文提供治疗具有金黄色葡萄球菌感染或处于发展金黄色葡萄球菌感染的风险中的主体的方法，其中所述方法包括向所述主体施用组合物，所述组合物包含(i)包含N-连接至ClfA的荚膜多糖8型(CP8-ClfA)的第一生物缀合物；和(ii)包含N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖的第二生物缀合物。在一个具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP5-Hla、CP8-EPA或CP8-Hla。在某些实施方案中，第一和第二生物缀合物作为相同组合物的部分施用于所述主体。在某些实施方案中，第一和第二生物缀合物作为相同治疗方案的部分、但作为不同组合物施用于所述主体。
在另一个具体实施方案中，本文提供治疗具有金黄色葡萄球菌感染或处于发展金黄色葡萄球菌感染的风险中的主体的方法，其中所述方法包括向所述主体施用组合物，所述组合物包含(i)包含N-连接至Hla的荚膜多糖5型(CP5-Hla)的第一生物缀合物；和(ii)包含N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖的第二生物缀合物。在一个具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、CP8-ClfA或CP8-Hla。在某些实施方案中，第一和第二生物缀合物作为相同组合物的部分施用于所述主体。在某些实施方案中，第一和第二生物缀合物作为相同治疗方案的部分、但作为不同组合物施用于所述主体。
在另一个具体实施方案中，本文提供治疗具有金黄色葡萄球菌感染或处于发展金黄色葡萄球菌感染的风险中的主体的方法，其中所述方法包括向所述主体施用组合物，所述组合物包含(i)包含N-连接至Hla的荚膜多糖5型(CP5-Hla)的第一生物缀合物；(ii)包含N-连接至ClfA的荚膜多糖8型(CP8-ClfA)的第二生物缀合物；和(iii)包含N-连接至载体蛋白的第三荚膜多糖的第三生物缀合物。在一个具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第三荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA或CP8-Hla。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三生物缀合物作为相同组合物的部分施用于所述主体。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三生物缀合物作为相同治疗方案的部分、但作为不同组合物施用于所述主体。
在另一个具体实施方案中，本文提供治疗具有金黄色葡萄球菌感染或处于发展金黄色葡萄球菌感染的风险中的主体的方法，其中所述方法包括向所述主体施用包含N-连接至一种载体蛋白的CP5和CP8的组合物。在另一个具体实施方案中，本文提供治疗具有金黄色葡萄球菌感染或处于发展金黄色葡萄球菌感染的风险中的主体的方法，其中所述方法包括向所述主体施用包含N-连接至两种或更多种载体蛋白的CP5和CP8的组合物。在某些实施方案中，所述载体蛋白是获得自金黄色葡萄球菌的载体蛋白，诸如Hla或Clfa。
制品
本文还涵盖成品包装和标记的药物产品。该制品在适当的器皿或容器(诸如玻璃小瓶)或气密密封的其他容器中包括适当的单位剂型。药物产品可以含有，例如，单位剂型的一种或多种本文所述的组合物。
在一个具体实施方案中，单位剂型适合于肠胃外、静脉内、肌肉内、鼻内或皮下递送。因此，本文涵盖适合于各递送途径的溶液，优选无菌溶液。
对于任何药物产品，设计包装材料和容器以保护产品在储存和运输过程中的稳定性。此外，本文提供的产品包括使用说明或建议医师、技术人员或患者如何适当地预防或治疗感染(例如，金黄色葡萄球菌感染)的其他信息材料。换言之，所述制品包括说明方式，其指示或表明给药方案，包括但不限于，实际剂量、监测程序和其他信息。
具体地，本文提供制品，其包含包装材料，诸如盒、瓶、管、小瓶、容器、喷雾器、吹入器、静脉内(i.v.)袋、包封等；和所述包装材料内含有的本文所述的疫苗或组合物(例如，药物组合物)的至少一个单位剂型，其中本文所述的所述疫苗或组合物(如药物组合物)包含本文所述的金黄色葡萄球菌疫苗，并且其中所述包装材料包括说明方式，其表明本文所述的所述组合物可用于通过如本文所述施用特定剂量和使用特定给药方案而预防、控制和/或治疗金黄色葡萄球菌感染或其一种或多种症状。
在一个具体实施方案中，本文提供的制品包含(i)包含N-连接至ClfA的荚膜多糖8型(CP8-ClfA)的第一生物缀合物；和(ii)包含N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖的第二生物缀合物。在一个具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP5-Hla、CP8-EPA或CP8-Hla。在某些实施方案中，第一和第二生物缀合物提供于相同组合物中。在某些实施方案中，第一和第二生物缀合物提供于不同组合物中(例如，分开的容器中)。
在另一个具体实施方案中，本文提供的制品包含(i)包含N-连接至Hla的荚膜多糖5型(CP5-Hla)的第一生物缀合物；和(ii)包含N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖的第二生物缀合物。在一个具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第二荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA、CP8-ClfA或CP8-Hla。在某些实施方案中，第一和第二生物缀合物提供于相同组合物中。在某些实施方案中，第一和第二生物缀合物提供于不同组合物中(例如，分开的容器中)。
在另一个具体实施方案中，本文提供的制品包含(i)包含N-连接至Hla的荚膜多糖5型(CP5-Hla)的第一生物缀合物；(ii)包含N-连接至ClfA的荚膜多糖8型(CP8-ClfA)的第二生物缀合物；和(iii)包含N-连接至载体蛋白的第三荚膜多糖的第三生物缀合物。在一个具体实施方案中，N-连接至载体蛋白的第三荚膜多糖是CP5-EPA、CP5-ClfA、CP8-EPA或CP8-Hla。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三生物缀合物提供于相同组合物中。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三生物缀合物提供于不同组合物中(例如，分开的容器中)。
实施例
大肠杆菌中CP5和CP8的表达和生物缀合物疫苗产生
细菌菌株、质粒构建体、引物和生物缀合物疫苗制备的细节在补充方法中提供。简言之，通过PCR从铜绿假单胞菌O11 O抗原基因簇(wzz至wbpM)扩增基因，并将其与金黄色葡萄球菌cap5HIJK或cap8HIJK克隆于质粒中。将重组质粒引入脂多糖和肠细菌抗原表达突变的大肠杆菌菌株，导致大肠杆菌中CP5和CP8的表达。修饰Epa，用于脱毒[19]，用大肠杆菌DsbA信号肽替代N-端信号肽，添加两个糖基化共有序列[20]，和插入C端六组氨酸标签。基于金黄色葡萄球菌Hla的公开的[11, 21]和脱毒版本设计用于重组表达具有一个糖位点和用于周质定位的信号序列的HlaH35L的表达质粒。
将含有PglB和Epa或Hla的质粒转化入表达CP5或CP8的大肠杆菌细胞。使含有重组质粒的大肠杆菌生长至对数期，并通过添加1 mM IPTG和0.2%阿拉伯糖诱导PglB和Epa或Hla的表达。在37℃过夜孵育之后，收获大肠杆菌，并通过渗透休克或高压均质化[15, 16]提取生物缀合物。生物缀合物疫苗通过固定化的金属亲和、阴离子交换、羟磷灰石和大小排阻层析进行纯化，如支持信息中所详述。
细菌培养
先前描述了金黄色葡萄球菌菌株Reynolds (CP5)、Reynolds (CP8)和Newman[9, 22]。金黄色葡萄球菌菌株LAC和ST80是社区相关的MRSA分离株[23, 24]。菌株NRS 382(USA100)和NRS 383 (USA200)是从关于在NIAID NIH合同号HHSN272200700055C下支持的金黄色葡萄球菌抗微生物抗性网络计划获得的医院相关的MRSA菌株。对于菌血症研究和调理吞噬杀灭(OPK)测定法，将金黄色葡萄球菌菌株在37℃在补充2% NaCl的Columbia琼脂(Difco Laboratories)上培养24小时[9]。对于肺炎研究，如所述[25]，从生长至生长对数期的胰蛋白酶大豆液体培养基(Difco)培养物收获葡萄球菌。
调理吞噬杀灭测定
如机构指南所批准，从给予书面知情同意书的健康志愿者收集人血。如所述[26]，用人嗜中性粒细胞进行常规OPK测定(0.5 ml体积)。基于微量滴定的OPK测定法基于Burton和Nahm [27]描述的测定法。HL-60细胞(ATCC)在低传代(<3个月)利用，并维持于补充10%热灭活的胎牛血清(HyClone)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和0.25 μg/ml两性霉素(Mediatech)的含有L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(Mediatech)中。如所述[27]用N, N-二甲基甲酰胺使细胞分化为粒细胞，且通过流式细胞术[27]证实它们的表型。该测定在96孔板中进行，且各孔(80 μl)含有4 x 105个HL60细胞、103 CFU金黄色葡萄球菌、兔IgG或小鼠血清和1％豚鼠血清(Cedarlane)作为补体(C’)源。在37℃振荡孵育2小时之后，通过添加20μl 1% Triton X-100裂解HL60细胞。将样品一式两份铺板，并且将CFU/ml的百分比变化(即，杀灭)定义为2小时后的CFU/ml与在零时间的CFU/ml相比的降低。
Hla中和测定
将Hla (4 HU/ml; Toxin Technology)与来自免疫小鼠的血清的连续两倍稀释液一起孵育1小时。添加等体积的洗涤的2％兔红细胞并孵育60分钟。将样品以200 x g离心10分钟，并测量上清液的OD545 nm。将各样品的百分比溶血与用4 HU的Hla裂解的红细胞进行比较。使用具有可变斜率的S形曲线的非线性回归(PRISM 4软件)计算50％抑制滴度。
动物感染研究
根据机构IACUC指南进行动物研究。在第0天、第14天和第28天通过皮下(SC)途径免疫Swiss-Webster小鼠(购自Taconic Farms或Charles River Laboratories)。对照动物接受无关的志贺氏菌O-抗原生物缀合物疫苗(O1-Epa或2a-Epa)。用Alhydrogel®配制EPA-缀合物，并用Adju-Phos®配制CP5-Hla以获得0.06％的最终Al3+浓度。
小鼠在每次免疫之前和细菌攻击之前采血。通过ELISA在用偶联至聚-L-赖氨酸[28]的纯化CPs (4 μg/ml)或天然Hla (1 μg/ml)包被的微量滴定板中测试1:100稀释的血清。最后一次免疫后两周，通过腹膜内(IP)途径用金黄色葡萄球菌接种小鼠，并在攻击后2小时进行定量血培养[9]。在第4天评估重量减轻和肾感染，并通过Mann-Whitney U检验分析培养数据。对于致死性肺炎模型[25]通过鼻内途径接种小鼠，并使用对数秩检验(Prism4软件)分析存活数据。对于针对菌血症的被动免疫，在攻击前24小时向小鼠静脉内(IV)给予兔IgG (300 μg-1 mg)。小鼠在细菌攻击后1-2小时采血用于培养。
对于针对致死性肺炎的被动免疫，在细菌接种前24小时(或24小时和4小时)向小鼠IP注射1 mg兔IgG。对于T细胞耗竭研究，在用金黄色葡萄球菌Newman鼻内攻击前72小时和24小时，向主动免疫的小鼠IP注射500 μg大鼠抗小鼠CD4(克隆GK 1.5)或大鼠抗小鼠CD8a (克隆8 53-6.7) mAb。通过脾淋巴细胞的流式细胞分析验证CD4+或CP8+细胞的耗竭。
结果
大肠杆菌中金黄色葡萄球菌CP的合成
在细菌膜载体脂质十一异戊二烯焦磷酸酯上通过保守途径组装金黄色葡萄球菌CP，所述保守途径与革兰氏阴性细菌中的O多糖合成的聚合酶依赖性途径共享同源性[29]。通过将糖磷酸酯从UDP-供体转移至十一异戊二烯磷酸酯而起始O抗原组装。脂质连接的O抗原通过不同的糖基转移酶的相继作用组装于内膜的细胞质侧。然后糖脂被翻转至周质空间并进行聚合。通过用寡糖基转移酶PglB替代O抗原连接酶WaaL，聚合的O抗原可以被转移至选择的蛋白载体，而不是转移至脂质A核心[16] [30]。为了O抗原产生缺陷的大肠杆菌菌株中合成金黄色葡萄球菌CP5或CP8，我们构建了含有来自金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的具有已知功能的基因的基于质粒的嵌合基因簇(图1A)。基于金黄色葡萄球菌CP和铜绿假单胞菌O11抗原的类似结构设计该基因簇，因为各自含有FucNAc二糖作为三糖重复单元的部分[31, 32]。与大肠杆菌单糖生物合成基因组合，预测由这些基因编码的酶合成由重复三糖单元组成的十一异戊二烯焦磷酸酯连接的CP5或CP8聚合物(图1B)。将重组质粒转化入O-抗原连接酶WaaL缺失的大肠杆菌菌株，并且提取细菌糖脂。多糖通过温和酸处理而从载体释放，通过2-氨基苯甲酰胺(2-AB)标记，并通过HPLC分离。收集CP5(图2A)和CP8(图2B)的单一重复亚基并使用MALDI-Q TOF/TOF分析来表征。在794.3的质荷比看到的主要离子进行MS-MS。片段离子的系列与在还原端含有2-AB的CP5和CP8单一重复单元的Na-加合物的预期离子一致(图2，C和D)。为了显示CP5和CP8亚基进行聚合并转移至脂质A，制备从表达WaaL的大肠杆菌细胞的全细胞提取物的蛋白酶K消化物并通过SDS-PAGE分离。工程改造的大肠杆菌细胞合成CP5或CP8聚合物，其通过银染可视化，并分别在用金黄色葡萄球菌CP5或CP8特异性抗血清探测的Western印迹上识别(图2，E和F)。
大肠杆菌中金黄色葡萄球菌生物缀合物疫苗的酶促合成
为了在大肠杆菌中产生金黄色葡萄球菌疫苗，在蛋白载体抗原和PglB存在的情况下表达脂质连接的CP。这允许多糖从载体脂质转移至蛋白抗原的共有序列D-X-N-X-S/T [20]内的Asn残基。培养表达CP5或CP8基因簇、含有两个糖基化共有序列的Epa和PglB的大肠杆菌细胞。诱导Epa和PglB的表达，并提取和纯化糖基化的Epa。SDS-PAGE分析揭示与针对Epa和CP5 (图2G)或Epa和CP8 (图2H)的抗体反应的90和170 kDa之间的条带阶梯，其表明金黄色葡萄球菌CP抗原对Epa的可变糖基化。
设计第二代疫苗系统以便在大肠杆菌中糖基化葡萄球菌蛋白抗原(Hla)。构建在氨基酸130处含有糖基化共有序列的HlaH35L。培养携带编码CP5生物合成、HlaH35L和PglB的基因的大肠杆菌细胞。诱导HlaH35L和PglB的表达，并纯化CP5-HlaH35L。进行SDS-PAGE的CP5-HlaH35L糖缀合物揭示与针对Hla和CP5的抗体反应的55和70 kDa之间的条带阶梯(图2I)。该发现证实HlaH35L可以被CP5糖基化。
小鼠中生物缀合物疫苗的免疫原性
小鼠用CP5-Epa、CP8-Epa或CP5-HlaH35L免疫。CP5-Epa疫苗在0.2-1 μg CP5/小鼠显示最优免疫原性(图3A)，且CP8-Epa在0.2 μg CP8显示良好的免疫原性(图3B)。CP5-HlaH35L在0.2和2 μg/小鼠的CP5浓度是免疫原性的(图3C)。因为最佳HlaH35L剂量为20 μg/小鼠(图3D)，所以选择2 μg CP5-20 μg HlaH35L疫苗用于进一步评估。
生物缀合物疫苗引发功能抗体
在HL60吞噬细胞和血清补体存在的情况下，针对CP5-Epa或CP5-HlaH35L产生的兔IgG对于CP5+ 金黄色葡萄球菌菌株Reynolds和Newman是调理性的(图4A)。≥1 μg/ml的IgG浓度导致葡萄球菌接种物的≥50％杀灭。类似地，来自用CP5-Epa或CP5-HlaH35L免疫的小鼠的血清显示针对产生CP5的金黄色葡萄球菌的OPK活性(补充图1A)。当包括人嗜中性粒细胞作为吞噬细胞源时，针对CP5-Epa的兔抗体对于金黄色葡萄球菌菌株Reynolds (CP5)和Newman也是调理性的(图4，B和C)。在CP5-Epa抗体、人嗜中性粒细胞和血清补体存在的情况下，MRSA菌株USA100和USA200也被杀灭(均为CP5+) (图4，D和E)。CP5抗体对于Reynolds (CP8)没有调理性。在不添加抗体的情况下，Reynolds (CP-)菌株被嗜中性粒细胞和补体杀灭(图4F)。在浓度≥1 μg/ml时，兔CP8-Epa IgG对于金黄色葡萄球菌菌株Reynolds (CP8)和MRSA菌株ST80是调理性的(图4G)。同样地，小鼠CP8-Epa抗血清显示针对CP8+金黄色葡萄球菌菌株的良好调理活性(补充图1B)。
针对Hla的功能抗体中和其裂解活性。如图4H中所示，针对HlaH35L或CP5-HlaH35L的小鼠血清中和天然Hla的体外裂解活性。用20 μg HlaH35L免疫的小鼠显示比给予2 μg CP5-20 μg HlaH35L的小鼠更高的中和滴度。
生物缀合物疫苗保护小鼠免于金黄色葡萄球菌菌血症
用CP5-Epa或志贺氏菌O1-Epa疫苗免疫的小鼠用金黄色葡萄球菌Reynolds (CP5) IP攻击。与给予无关志贺氏菌疫苗的小鼠相比，给予CP5-Epa的小鼠被保护免于菌血症(图5A)、肾脓肿形成(图5B)和重量减轻(图5C)。类似地，用CP8-Epa免疫且用Reynolds (CP8)攻击的动物显示菌血症的显著减少(图5D)。
第二代生物缀合物疫苗含有用CP5糖基化的葡萄球菌类毒素(HlaH35L)。CP5-HlaH35L针对通过用Reynolds (CP5)攻击激发的菌血症(图5E)和相关的重量减轻(图5F)使保护性的。在个别小鼠中的CP5抗体水平和菌血症水平之间存在反相关性(图5G)，证实保护由疫苗诱导的抗体介导。
CP5-HlaH35L针对由CP5+和CP8+金黄色葡萄球菌引起的致死性肺炎进行保护。
小鼠用HlaH35L、CP5-HlaH35L、CP5-Epa或志贺氏菌2a-Epa免疫并用CP5+菌株Newman鼻内攻击。用HlaH35L或CP5-HlaH35L免疫的小鼠被保护免于致死性肺炎。CP5抗体没有介导保护，因为用CP5-Epa免疫的小鼠死于感染，如给予志贺氏菌2a-Epa的小鼠(图6A)。HlaH35L和CP5-HlaH35L疫苗也针对由CP-菌株USA300 LAC (图6B)和CP8+ MRSA菌株ST80 (图6C)诱导的致死性肺炎进行保护。尽管存在HlaH35L比 CP5-HlaH35L引发针对Hla更高的中和抗体应答(图4H)的事实，由两种疫苗引发的针对肺炎的保护是等效的。因此，金黄色葡萄球菌Hla的CP5糖基化扩大了生物缀合物疫苗的保护作用，使得其针对菌血症(图5E)和致死性肺炎(图6，A-C)保护小鼠。
T细胞对于CP5-HlaH35L介导的针对致死性肺炎的保护不是关键的。
我们的被动免疫实验(如下所述)和以前的报道[13，33]表明单独的Hla抗体针对金黄色葡萄球菌致死性肺炎是保护性的。为了解决12种T细胞在针对葡萄球菌性肺炎的免疫中的可能作用，我们用CP5-HlaH35L或志贺氏菌2a- Epa免疫小鼠。在用金黄色葡萄球菌Newman攻击前72小时和24小时，向动物给予500 μg大鼠抗小鼠CD4(克隆GK 1.5)或大鼠抗小鼠CD8a (克隆53-6.7) mAb。向对照小鼠给予PBS。通过来自经处理动物的脾细胞的流式细胞分析验证CD4+或CP8+细胞的耗竭。对照CP5-HlaH35L免疫的小鼠和经受T细胞耗竭的那些在致死性肺炎模型中显示类似的存活，而用志贺氏菌2a-Epa免疫的小鼠死于感染(图6D)。这些结果表明，T细胞对于CP5-HlaH35L介导的针对致死性金黄色葡萄球菌肺炎的保护不是关键的。
对生物缀合物疫苗的抗体针对菌血症和致死性肺炎进行保护
用金黄色葡萄球菌IP攻击前一天，小鼠用针对CP5-Epa、CP8-Epa或CP5-HlaH35L的兔IgGIV被动免疫。与志贺氏菌O1-Epa抗体相比，CP5-Epa抗体针对Reynolds (CP5)(图7A)和MRSA菌株USA200(图7B)诱导的菌血症是保护性的。类似地，针对CP8-Epa的抗体显著减少Reynolds (CP8)菌血症(图7C)。针对CP5-HlaH35L的抗体减少由MRSA菌株USA100 (图7D),、Newman (图7E)和Reynolds (CP5) (图7F)诱导的菌血症。保护是CP特异性的，因为针对CP5-Epa或CP5-HlaH35L的抗体减少菌血症，而针对金黄色葡萄球菌HlaH35L或志贺氏菌2a-Epa的抗体没有提供任何保护(图7F)。
在鼻内细菌攻击前24小时用IP施用的CP5-HlaH35L IgG被动免疫，提供的针对菌株Newman诱导的致死性肺炎的保护有限(图7G)。然而，当在细菌接种前4小时给予IgG的第二剂量时，90％的给予CP5-HlaH35L的小鼠在致死性接种物中存活(图7H)。
讨论
金黄色葡萄球菌在医院和社区中的越来越多的流行及其对抗生素的越来越扩张的抗性已经强调需要针对该微生物的预防性疫苗。然而，有效的葡萄球菌疫苗的开发仍然难以实现。在III期临床试验中，用基于CP或金黄色葡萄球菌铁表面决定簇B的13单组分疫苗的主动免疫无法保护患者免于III期临床试验中的侵袭性疾病[6, 7, 34, 35]。类似地，靶向聚集因子A或脂磷壁酸的被动免疫策略没有防止早产新生儿中的葡萄球菌败血症[7]。目前的努力聚焦于靶向多种葡萄球菌致病因子的疫苗的制备。除了抗体在介导毒素中和和嗜中性粒细胞的调理吞噬杀灭中的重要性以外，近来已经在动物感染模型中显示基于T细胞的免疫对于某些蛋白抗原诱导的疫苗介导的保护是关键的[7, 36-38]。
因为通过嗜中性粒细胞的调理吞噬杀灭是金黄色葡萄球菌的宿主清除的重要组分，我们已经靶向引发调理性抗体的葡萄球菌CP。糖缀合物疫苗的生产是复杂和昂贵的，需要制备重组蛋白和提取和纯化复杂多糖。由于化学缀合的非特异性性质，化学缀合的疫苗是异源、批次间可变的，并且经常以低产率产生。此外，多糖与蛋白抗原的常规缀合需要变性可影响蛋白载体或某些不稳定的多糖的化学物质，导致关键表位的改变。
我们已经开发了一种新颖技术，其允许金黄色葡萄球菌CP缀合至相关的金黄色葡萄球菌蛋白，而无蛋白变性的风险。弯曲杆菌寡糖基转移酶PglB能够将寡糖转移至特定蛋白共有序列[20]，由此允许在细菌细胞中产生糖蛋白。该蛋白糖基化系统已经在功能上转移入大肠杆菌[15]。使用该糖基化机器，各种多糖可以转移至重组蛋白，允许产生可以用作新颖疫苗的生物缀合物。生物缀合物疫苗批次是同质的，并且在生产过程中不存在抑制T细胞依赖的免疫应答的游离多糖。因为在大肠杆菌中产生生物缀合物，所以不需要使毒性生物体生长用于多糖提取。
在本研究中，我们表明了CP5-Epa和CP8-Epa生物缀合物疫苗的产生、纯化和效力。此外，我们显示，铜绿假单胞菌O11抗原的二糖中间体可以充当金黄色葡萄球菌糖基转移酶的底物，首次显示可以组合革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的糖基转移酶。生物缀合物疫苗在小鼠和兔中引发调理性抗体，并且主动和被动免疫策略保护小鼠免于实验性菌血症。第二代生物缀合物疫苗(CP5-HlaH35L)是显示共价连接来自相同微生物的蛋白和多糖抗原的潜能的重要的概念验证产品。如给予CP5-Epa的动物，用CP5-HlaH35L免疫的小鼠被保护免于由几种CP5+金黄色葡萄球菌分离株激发的菌血症。重要的是，CP5-HlaH35L疫苗也保护小鼠免于由血清型5、血清型8或荚膜阴性金黄色葡萄球菌菌株诱导的致死性肺炎。因此，CP5-HlaH35L生物缀合物疫苗显示针对菌血症(通过CP5抗体介导)和致死性肺炎(通过HlaH35L抗体介导)的保护效力。
这种新颖的缀合物疫苗开发的糖工程改造方法可以彻底改变行业。包含CP5、CP8和HlaH35L的三价金黄色葡萄球菌疫苗候选(本文所述)在不同的动物模型中引发功能性抗体并广泛地保护。已经完成了用CP8糖基化金黄色葡萄球菌表面蛋白，并且它目前正在进行生产和测试。糖工程改造技术能够开发针对微生物病原体如金黄色葡萄球菌的定义良好的、新颖且有效的疫苗，单独的蛋白或多糖抗原不足以提供针对所述微生物病原体如金黄色葡萄球菌的广泛的保护。此外，与含有分开的荚膜缀合物和蛋白组分的疫苗相比，将荚膜抗原缀合至蛋白抗原允许减少待注射的组分。
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补充方法
表达Epa、HlaH35L、CP5和PglB的质粒
用于制备生物缀合物疫苗的细菌菌株和质粒构建体描述于表S1中。铜绿假单胞菌Epa是最初用于生物缀合物疫苗产生的载体蛋白。如下修饰Epa，用于脱毒[1]，用大肠杆菌DsbA信号肽替代N-端信号肽，添加两个糖基化共有序列[2]，和插入C端六组氨酸标签。
通过PCR使用寡核苷酸P1-F/R (表S2列出所有引物)和pSVSPORT/RNAse作为模板DNA [3]制备含有大肠杆菌信号序列、HA标签和成熟牛核糖核酸酶B的插入物。扩增子用VspI和EcoRI处理，并克隆入pEC415，导致产生pMIK11。通过NdeI和EcoRI消化从质粒移除HARNase区段，用于替换为编码来自铜绿假单胞菌株DSM1117的成熟胞外蛋白A序列(toxA)的插入物，其具有C末端融合的六组氨酸标签。toxA通过PCR使用寡核苷酸P2-F/R扩增，用NheI和EcoRI消化，并连接入pMIK11。在N末端的所得氨基酸序列是MKKIWLALAGLVLAFSASAAEEA(SEQ ID NO:1)。QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)用于使用寡核苷酸P3-F/R将脱毒突变L552V, ΔE553引入toxA。在所得质粒(p70)上进行进一步QuikChange诱变以使用寡核苷酸P4-F/R在toxA的氨基酸A376周围引入SmaI位点，导致产生p88。为了引入糖基化位点，使用SmaI消化p88，并且将由两个退火互补、磷酸化寡核苷酸(P5-F/R)构成的盒连接入经切割的载体，导致产生p137。通过QuikChange诱变使用寡核苷酸P6 -F/R将额外的糖基化位点插入p137以生成p150。
基于金黄色葡萄球菌Hla的公开的[4, 5]和脱毒版本设计用于重组表达具有一个糖位点的HlaH35L的表达质粒。具体地，融合大肠杆菌DsbA的信号序列的编码序列，其在成熟HlaH35L蛋白的编码序列的上游并与其同框，随后为下游的六组氨酸标签。基于公开的Hla的结构[6]，通过合理设计在融合序列的氨基酸130引入糖基化位点。编码具有糖基化位点和六组氨酸标签的成熟、信号肽切割的HlaH35L的DNA由商业提供者合成并亚克隆入p150中的NheI和SalI位点，导致产生质粒p570。
为了生成用于在大肠杆菌中重组表达金黄色葡萄球菌CP5的生物合成途径基因的质粒，使用寡核苷酸盒P7-F/R将多克隆位点(MCS)插入pLAFR1 [7]的EcoRI位点，导致产生质粒p336。通过PCR使用寡核苷酸P8-F/R从铜绿假单胞菌菌株PA103的基因组扩增铜绿假单胞菌O11 O抗原基因簇(wzz至wbpM) ，并将其经由Bsu36I和PciI克隆入pLAFR1 MCS，导致产生质粒p341。向pACT3 (cap5H-HA)和pEXT22 (cap5I-myc/cap5J-FLAG) [8]中亚克隆金黄色葡萄球菌cap5H与HA标签，亚克隆金黄色葡萄球菌cap5I与myc标签，并亚克隆金黄色葡萄球菌cap5J与FLAG标签。我们使用以下引物通过PCR从金黄色葡萄球菌Mu50的基因组DNA扩增cap5基因：(i) cap5H-HA:P9-F/R，(ii) cap5I-myc:P10- F/R，(iii) cap5J-FLAG:P11-F/R。在p341内，使用Datsenko & Wanner [9]的方法用金黄色葡萄球菌cap5HIJ基因替换O11-wbjA-wzy基因。在第一步骤中通过重叠PCR使用pACT3-cap5-HA和pEXT22-cap5I-myc-cap5J-FLAG作为模板和以下引物((i) PCR1 (cap5H-HA扩增):P12-F/R，(ii) PCR2(cap5I-myc-cap5J-FLAG扩增):P13-F/R，(iii) 重叠-PCR3 (接合cap5H-HA与cap5I-myc- cap5J-FLAG):P14-F/R)接合扩增cap5H-HA-cap5I-myc- cap5J-FLAG片段。在第二重叠PCR中，使用分别来自重叠PCR3的PCR产物和pKD3 [9]作为PCR模板和以下引物((i) PCR4(FRT-侧接的cat基因的扩增):P15-F/R，(ii) 重叠-PCR5 (接合cap5H-HA-capI- myc-capJ-FLAG与cat基因):P16-F/R)将接合的cap5H-HA-capI-myc-capJ-FLAG基因融合至选择标记(cat)，其侧接FLP识别目标(FRT)位点。将所得PCR产物转化入含有pKD46 [9]和p341的DH5α细菌，并且如所述[9]选择氯霉素抗性克隆，生成p345。通过PCR使用引物P17-F/R从金黄色葡萄球菌Mu50的基因组DNA扩增编码CP5特异性翻转酶的基因cap5K，由此引入HA-标签。将扩增子经由cap5J-FLAG下游的MssI和Alw44I亚克隆入p345，导致产生质粒p393。
为了在一个质粒中组合编码CP5和PglB的表达的基因，通过重叠PCR的方式将HA-标记的pglB基因与源自来自大肠杆菌O121的O-抗原基因簇的组成型启动子组合，并克隆入p393。在第一PCR中用寡核苷酸对P18-F/R使用含有来自大肠杆菌O121的O121 O抗原簇的p331作为模板[10]扩增O121 rfb启动子区域。在第二PCR中用寡核苷酸对P19-F/R使用PglB表达质粒p114 [11]作为模板扩增HA标记的pglB的基因。使用第三重叠PCR通过使用寡核苷酸P20-F/R和来自第一和第二PCR的PCR产物作为模板扩增O121启动子区域并将其与pglB基因组合入一种PCR产物中。经由PscI限制性位点将重叠PCR产物(O121-pglB)克隆入p393，导致产生质粒p484。
为了生成用于在大肠杆菌中重组表达金黄色葡萄球菌CP8的生物合成途径基因的质粒，使用限制性内切酶BspTI和Alw44I将上述质粒p345中存在的cap5HIJ-簇替换为cap8HIJ-簇(源自p327，参见下文)，导致产生质粒p405。该cap8HIJ基因簇已经由GenScriptInc.合成为还编码Myc-标签(cap8H)、FLAG-标签(cap8I)和HA-标签(cap8J)的密码子使用优化的ORF，并克隆入pUC57中，导致产生质粒p327。此外，使用来自金黄色葡萄球菌菌株MW2的基因组DNA扩增cap8HIJK基因，并使用BspTI和Alw44I亚克隆入p345，由此用cap8HIJK替代cap5HIJ，并导致产生质粒p404。该质粒在PCR中充当模板，以使用寡核苷酸对P21-F/R扩增cap8K，引入两个Alw44I-位点(5’和3’)和HA-标签的ORF(3’)。将PCR产物经由Alw44I非受迫地克隆入p405，导致产生p413。在该质粒内，O11 wzz-wzx的基因被替换为MCS。为了该目的，将寡核苷酸对P22-F/R退火，并经由Eco81I和BspTI连接入p413质粒，导致产生质粒p555。通过使寡核苷酸P23-F/R退火而获得的组成型活性启动子经由SanDI和BspTI克隆入质粒p555，导致产生质粒p564。
大肠杆菌菌株的构建
通过Datsenko和Wanner [9]的用于产生CP5-Epa和CP8-Epa的方法构建菌株StGVXN1690。首先，大肠杆菌W3110的waaL基因被替换为cat抗性盒以废除LPS合成。寡核苷酸P24-F/R用于使用pKD3作为模板PCR扩增cat盒。PCR产物编码侧接FRT位点的cat表达盒。缺失waaL和插入cat盒之后，通过菌落PCR评估waaL的不存在。此外，通过银染色分析不能产生LPS以证实敲除。如所述[9]通过位点特异性FLP驱动的重组去除cat盒以引入额外的染色体突变。为了防止肠细菌共同抗原(ECA)的合成，使用从pKD3生成的PCR产物和寡核苷酸P25-F/R缺失基因簇中从rmlB至wecG的基因延伸。通过以下证实诱变：i)对从突变体和侧接突变的DNA区域的引物生成的PCR产物进行测序，ⅱ)使用银染色证实LPS形成的不存在，和iii)显示来自蛋白酶K处理的细胞提取物和用于ECA检测[12]的单克隆抗体的免疫印迹中不存在ECA。
通过类似于用于生成菌株StGVXN1690的方法的方法制备大肠杆菌菌株StGVXN1717。缺失waaL基因并去除cat盒，然后使用从pKD3和寡核苷酸P26-F/R PCR生成的cat盒缺失来自ECA簇的wecA和wzzE基因。通过位点特异性FRT重组去除cat之后，如上所述将rmlB-wecG DNA片段染色体替换为另一个cat盒。
十一异戊二烯焦磷酸酯(Und-PP)-连接的CP5和CP8聚糖的分析
在大肠杆菌菌株StGVXN1690中分析O抗原聚糖。通过用p393转化细胞而表达CP5，并且通过用p564转化细胞而表达CP8。使菌株在摇瓶中生长过夜。收获相当于400的A600 nm的细胞，用0.9% NaCl洗涤一次并冻干。如所述[10]提取并分析CP5和CP8。
生物缀合物疫苗的产生
将含有7 L批次培养基(酵母提取物[BD] 10 g/L、大豆蛋白胨[Organotechnie] 20 g/L、甘油53 g/L、56 mM磷酸盐、5 mM柠檬酸、2 mM MgCl2和痕量元素)的15-L生物反应器(NewMBR AG)用用于产生CP5-EPA的大肠杆菌菌株StGVXN1690 p150、p114和p393或用于产生CP5-HlaH35L的大肠杆菌菌株StGVXN1717 p570和p484接种至0.05的OD600 nm。使培养物在37℃在有氧条件下生长。在40的OD600 nm，用1 mM IPTG (仅用于产生CP5- EPA)和0.2%阿拉伯糖诱导细菌细胞。在诱导之后，以186 g/h的流速开始恒定进料(180 g/L甘油、100 g/L大豆蛋白胨、33 mM MgSO4、1 mM IPTG和痕量元素)。在诱导后15小时，通过离心收获细菌细胞，用0.9% NaCl洗涤，并在固定化的金属亲和层析(IMAC)结合缓冲液(30 mM Tris, 500mM NaCl, pH 8)中悬浮至200的OD600 nm。将细菌在APV1000 (APV Manufacturing)中以800巴均质化，随后离心，以获得作为上清液的澄清匀浆。
为了产生CP8-Epa，补充有10 mM MgCl2的Terrific培养液用大肠杆菌(StGVXN1690 p150、p114和p564)的过夜培养物接种，并在37℃振荡孵育。在0.9的OD600 nm用1 mM IPTG和0.1%阿拉伯糖诱导培养物，并且次日收获生物质。将细菌细胞用0.9% NaCl洗涤，并在裂解缓冲液(30 mM Tris HCl pH8.5, 1 mM EDTA, 20%蔗糖)中悬浮至20的OD600 nm。在4℃在1 mg/ml溶菌酶(Sigma -Aldrich)搅拌孵育30分钟之后，将样品离心以获得可溶性周质提取物。
生物缀合物疫苗的纯化
如下用三个层析步骤纯化CP5-EPA，以IMAC开始，随后为阴离子交换，最后为大小排阻层析(SEC)：将60 mL Ni-琼脂糖珠(GE-Healthcare)添加至澄清的匀浆。结合糖蛋白的珠粒用IMAC结合缓冲液洗涤并填充入层析柱。填充柱用6个柱体积(CV)的IMAC-缓冲液A (30 mMTris, 200 mM NaCl, 10 mM咪唑, pH 8)洗涤，随后用15个CV的0%至100% IMAC-缓冲液B(30 mM Tris, 200 mM NaCl, 500 mM咪唑, pH 8)的线性梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，并且将含有糖蛋白的级分合并且用Q-缓冲液A (10 mM Tris, pH 7)稀释至6.5 mS/cm导电率。将稀释的样品上样至60 mL Q Ceramic HyperD F (Pall AG)层析柱上，用4 CV Q-缓冲液A洗涤，并用15个CV的0至100% Q-缓冲液B (10 mM Bis-Tris, 500 mM NaCl, pH 7)的线性梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，并合并含有糖蛋白的级分。通过切向流过滤用10-kDa截止115 cm2 mPES中空纤维(Spectrum Europe B.V.)将样品浓缩至25 mL。将12.5mL浓缩样品的等分试样上样至填充有320 mL Superdex 200 (GE Healthcare)的XK26/60柱(GE Healthcare)上。通过SDS-PAGE分析由1X PBS (Amresco)的等度洗脱得到的级分，并合并含有糖蛋白的级分并储存于-80℃。
如对于CP5-EPA所述，经由以IMAC开始且以SEC结束的四个相继纯化步骤纯化CP5-HlaH35L。如下进行中间纯化步骤，阴离子交换，随后为羟磷灰石层析。合并的从IMAC获得的级分用ANX-缓冲液A (10 mM Tris pH 7.5)稀释至3 mS/cm导电率，并上样至16 mL床体积ANX Sepharose 4 Fast Flow (High Sub) (GE Healthcare)柱。用5 CV ANX-缓冲液A洗涤该柱，并用0至100% ANX-缓冲液B (10 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.5)的线性梯度洗脱产物。合并含有糖蛋白的级分，用500 mM NaH2PO4将磷酸盐浓度调节至5 mM，并用5 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)将导电率调节至10 mS/cm。将样品上样至14 mL陶瓷羟磷灰石I型(Bio-RadLaboratories)柱上，用6个CV HA-缓冲液A (10 mM磷酸钠, 100 mM NaCl, pH 6.8)洗涤，并用0至100% HA-缓冲液B (10 mM磷酸钠, 1 M NaCl, pH 6.8)经12个CV的线性梯度洗脱。合并含有糖蛋白的级分，并经5 kDa PES Pellicon切向流过滤膜(Millipore)浓缩至12mL。如对于CP5-EPA所述进行SEC。
用四个层析步骤纯化CP8-EPA，以IMAC开始，随后为两个阴离子交换层析步骤，最后为大小排阻层析。将补充有30 mM Tris pH 8、500 mM NaCl和10 mM咪唑(pH 8)的周质提取物上样至5 ml HisTrap柱(GE Healthcare)上。将该柱用5个CV HisTrap洗涤缓冲液(30mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 10 mM咪唑)洗涤，随后用100% HisTrap洗脱缓冲液(30 mMTris pH 8, 200 mM NaCl, 500 mM咪唑)洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，并且将含有糖蛋白的级分合并且在PallQ缓冲液A (20 mM L-His pH 6.0)中稀释至5 mS/cm。将稀释的样品上样至10 mL Q Ceramic HyperD F (Pall AG)层析柱上，用5个CV PallQ缓冲液A洗涤，并用20个CV的0至100% PallQ缓冲液B (20 mM L-His pH 6.0, 1 M NaCl)的线性梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，并且将含有糖缀合物的级分合并且在SourceQ缓冲液A (20 mMBisTris pH 6.0)中稀释至5 mS/cm。将稀释的样品上样至10 ml Source 15Q (GEHealthcare)层析柱上，用5个CV SourceQ缓冲液A洗涤，并用20个CV的0至100% SourceQ缓冲液B (20 mM Bis Tris pH 6.0, 1 M NaCl)的线性梯度洗脱。通过SDS-PAGE分析级分，并且将含有糖缀合物的级分合并且使用具有Ultracel-30膜的Amicon Ultra-4离心过滤单元(Millipore)浓缩至0.5 ml。将样品上样至Superdex 200 10/300 GL预填充的凝胶过滤柱(GE Heathcare)上。通过SDS-PAGE分析由1X PBS的等度洗脱得到的级分，并合并含有糖蛋白的级分并储存于4℃。
含有弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri) 2a-EPA的匀浆通过切向流过滤经500kDa mPES中空纤维(Spectrum)澄清，并经Q Ceramic HyperD F (Pall)层析基质纯化，随后为用Source 15Q珠粒(GE Healthcare)的第二阴离子交换纯化步骤。进行对于CP5-EPA所述的SEC，作为最终纯化步骤。如对于CP5-EPA所述，通过用Source 15Q珠粒作为基质的两个阴离子交换层析步骤、随后为SEC步骤，纯化痢疾志贺氏菌(S. dysenteriae) O1-EPA。
金黄色葡萄球菌疫苗和对照志贺氏菌疫苗的内毒素含量是相当的，范围为39-557EU/mg蛋白，平均为155 EU/mg蛋白。
表S1. 用于构建生物缀合物疫苗的细菌菌株、质粒和引物
aDSMZ, German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Leibniz-Institut, Braunschweig, Germany
bNARSA, The Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus
cThe Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT, USA
缩写：Tet，四环素；Spc，壮观霉素；Amp，氨苄青霉素；Cm，氯霉素。
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等效方案和通过引用并入：本文所述的实施方案意欲仅仅是示例性的，并且本领域技术人员将仅仅使用常规实验认识到或能够确定许多与本文所述的具体程序的等效方案。所有此类等效方案被认为在本发明的范围之内，并且被以下实施方案所覆盖。本文引用的所有参考文献(包括专利申请、专利和公开)都以其整体和出于所有目的通过引用并入本文，其程度等同于每个单独的公开或专利或专利申请被明确地并单独地指明以其整体出于所有目的通过引用并入。

Claims (12)

1.组合物，其包含N-连接至ClfA的荚膜多糖8型(CP8-ClfA)和第二N-糖基化的蛋白。
2.权利要求1的组合物，其中所述第二蛋白是CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、CP5-Hla或CP8-Hla。
3.权利要求1或2的组合物，其进一步包含第三N-糖基化的蛋白。
4.权利要求4的组合物，其中所述第三N-糖基化的蛋白是CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、CP5-Hla或CP8-Hla。
5.组合物，其包含N-连接至Hla的荚膜多糖5型(CP5-Hla)和第二N-糖基化的蛋白。
6.权利要求5的组合物，其中所述第二蛋白是CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、CP8-ClfA或CP8-Hla。
7.权利要求5或5的组合物，其进一步包含第三N-糖基化的蛋白。
8.权利要求7的组合物，其中所述第三N-糖基化的蛋白是CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA、CP5-Hla或CP8-Hla。
9.组合物，其包含(i) N-连接至Hla的荚膜多糖5型(CP5-Hla)；(ii) N-连接至ClfA的荚膜多糖8型(CP8-ClfA)；和(iii) 第三N-糖基化的蛋白。
10.权利要求9的组合物，其中所述第三N-糖基化的蛋白是CP5-Epa、CP8-Epa、CP5-ClfA或CP8-Hla。
11.通过施用权利要求1至10中任一项的组合物治疗或预防金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)感染的方法。
12.权利要求11的方法，其中所述金黄色葡萄球菌是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。
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