JP2022514704A - Ｏ結合型グリコシル化認識モチーフ - Google Patents
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Abstract
本明細書中提供されるのは、Ｏ結合型グリコシル化認識モチーフを含有する糖タンパク質、及び、例えばコンジュゲートワクチンの製造で使用するための、作製法である。
Description
関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０１８年１２月２１日出願の米国仮出願第６２／７８３，９７１号の優先権を主張する。
本ＰＣＴ出願は、２０１８年１２月２１日出願の米国仮出願第６２／７８３，９７１号の優先権を主張する。
本出願は、２０１７年８月２５日出願の米国出願第１５／５５３，７３３号に関連する。この関連する出願は、２０１６年２月２６日出願のＰＣＴ／ＣＡ２０１６／０５０２０８の国内段階出願であり、２０１５年２月２４日出願の米国仮出願第６２／１２１，４３９号の優先権を主張する。
本出願は、２０１９年６月１４日出願のＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３７２５１にも関連する。この関連する出願は、２０１８年６月１６日出願の米国仮出願第６２／６８５，９７０号及び２０１８年１２月２１日出願の米国仮出願第６２／７８３，９７１号の優先権を主張する。
政府の資金提供声明
本発明は、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）によって授与された助成金番号第Ｒ４１ ＡＩ１４２９２８－０１号の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立アレルギー感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）によって授与された助成金番号第Ｒ４１ ＡＩ１４２９２８－０１号の下、政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
最初に、細菌における一般的なタンパク質グリコシル化経路として、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉのＮ結合型グリコシル化システムが、２０年前に発見された（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２（５）：１０２２－１０３０）。それ以来、多様な原核生物グリコシル化システムが数多く特性決定されてきており、その中には、Ｏ結合型グリコシル化システムも含まれるが、これに相同するカウンターパートは真核生物にはない（Ｉｗａｓｈｋｉｗ ＪＡ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｐｏｕｒ ｓｏｍｅ ｓｕｇａｒ ｏｎ ｉｔ： ｔｈｅ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８９（１）：１４－２８）。これらの発見からほどなくして、グリコシル化経路は、Ｅ． ｃｏｌｉに組換え操作により導入され、細菌糖鎖工学という分野が創出された（Ｗａｃｋｅｒ Ｍ， ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８（５５９９）：１７９０－１７９３）。細菌糖鎖工学は、宿主としてＥ． ｃｏｌｉまたは他のグラム陰性生物を使用し、組換えによるグリコシル化タンパク質の産生に原核生物グリコシル化システムを利用する、新たなバイオテクノロジーツールである。現在、糖鎖工学は、組換えによりタンパク質をグリコシル化するための２つの大きなアプローチ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）依存性及びＯＴアーゼ非依存性アプローチを利用するが、それらは両方とも、Ｎ結合型またはＯ結合型を生成することができる。
タンパク質グリコシル化、すなわちタンパク質への炭水化物の共有結合は、偏在的な翻訳後修飾である。ほとんどの場合、タンパク質グリコシル化は、グリカンがアスパラギン残基に結合したＮ結合型、またはグリカンがセリンもしくはトレオニン残基に結合したＯ結合型いずれかに特定される。真核生物グリコシル化の重要性は、これまでもそして現在も鋭意研究の理由となっているものの、原核生物グリコシル化については、ε－プロテオバクテリアＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉにおいて全般的Ｎ結合型タンパク質グリコシル化システムが見つかったことで、最近になってやっと、科学界の注目を集めだしたところである（Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２（５）：１０２２－１０３０）。最初にＣ． ｊｅｊｕｎｉで発見されたため、原核生物グリコシル化システムは、大量のグラム陰性菌及びグラム陽性菌にまたがり記載がなされてきており、病理発生だけでなく通常の細菌生理学に対しても貢献を示してきた（Ｉｗａｓｈｋｉｗ ＪＡ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｐｏｕｒ ｓｏｍｅ ｓｕｇａｒ ｏｎ ｉｔ： ｔｈｅ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｗｏｒｌｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８９（１）：１４－２８；Ｎｏｔｈａｆｔ Ｈ ＆ Ｓｚｙｍａｎｓｋｉ ＣＭ （２０１０） Ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ： ｓｗｅｅｔｅｒ ｔｈａｎ ｅｖｅｒ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８（１１）：７６５－７７８）；Ｓｃｈａｆｆｅｒ Ｃ ＆ Ｍｅｓｓｎｅｒ Ｐ （２０１７） Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆａｃｅｔｓ ｏｆ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ４１（１）：４９－９１）。原核生物遺伝子の単純明快な性質を考慮すると、「細菌糖鎖工学」と呼ばれるプロセスにおいてデザイナー糖タンパク質を生成するためにタンパク質グリコシル化システムが操作され利用されるようになるのは、時間の問題にすぎなかった。
細菌は、真核生物グリコシル化とほぼ同様に、Ｎ結合型ＯＴアーゼ経路を発達させたが、原核生物独自のＯ結合型ＯＴアーゼシステムも採用している。ＯＴアーゼ非依存性グリコシル化は、細胞質で起こり、糖タンパク質の逐次組立のためヌクレオチド活性化前駆体から単糖類を移動させるのにグリコシルトランスフェラーゼに頼る。ＯＴアーゼ依存性及び非依存性経路の両方が、炭水化物とタンパク質のバイオコンジュゲーションに利用される。
細菌表面多糖類は、感染中に免疫系が遭遇する最初の、そして最も大量の微生物構成要素の一部である（Ｃｏｍｓｔｏｃｋ ＬＥ ＆ Ｋａｓｐｅｒ ＤＬ （２００６） Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｌｙｃａｎｓ： ｋｅｙ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｈｏｓｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｃｅｌｌ １２６（５）：８４７－８５０）。こうした多糖類は、通常は莢膜または脂質Ａに結合したＯ抗原の形状をしていて、微生物を外的脅威及び免疫除去から保護することをはじめとする多数の目的に役立つ。侵入生物上のそれらの多さならびにそれらが真核生物の炭水化物とは生化学的に異なっていることを考慮して、微生物表面多糖類の一部は、ワクチン開発のための抗原として使用されてきた。しかしながら、多糖類を単独でワクチン配合物に使用した場合、それらは、通常、Ｔ細胞非依存性抗原として作用し、したがって、免疫グロブリンクラススイッチ及び長期Ｂ細胞記憶を刺激しない。その上、多糖ワクチン単独では、年齢２歳未満の乳幼児のような脆弱な集団において保護を誘発しない。この乏しい免疫応答は、コンジュゲーションとして知られるプロセスにおいて多糖をタンパク質キャリアに共有結合させることにより克服できる可能性がある（Ｄｅ Ｇｒｅｇｏｒｉｏ Ｅ ＆ Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ （２０１４） Ｆｒｏｍ ｅｍｐｉｒｉｃｉｓｍ ｔｏ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ： ａ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｎａｔ ＲｅｖＩ ｍｍｕｎｏｌ １４（７）：５０５－５１４）。
従来、複合多糖ワクチンは、半合成アプローチを用いて合成される。このアプローチでは、多糖を、標的微生物から抽出し、精製し、化学修飾して、担体タンパク質に共有結合させる。このアプローチは、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型、ならびに複数の血清型のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓによるコロニー形成及び感染症を防ぐための複数の複合多糖ワクチンの商用認可をもたらした。半合成または合成複合多糖ワクチンの製造に関する詳細な総説については、以下の優れた総説論文を参照（Ｂｅｒｔｉ Ｆ ＆ Ａｄａｍｏ Ｒ （２０１８） Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃ ａｎｄ ｍｏｄｅｒｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ ４７（２４）：９０１５－９０２５）。化学的に製造されたコンジュゲートワクチンは商業的な大成功を示した（複合多糖ワクチンＰＲＥＶＮＡＲ １３は、２０１５～２０１８年で最も売れたＰｆｉｚｅｒ製品であり、売り上げは２４０億ＵＳＤを超える）ものの、その製造プロセスに欠点がないわけではない；欠点として、バッチごとのばらつき、不均一な製品形成、病原性生物の大規模生成、及び高額の製造原価があげられる（Ｆｒａｓｃｈ ＣＥ （２００９） Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２７（４６）：６４６８－６４７０）。
ここ２０年間にわたり、複合多糖ワクチンを製造する代替戦略が台頭してきている。それらの技法は、アプローチに関して幅広く、あるものは、他のものより商用認可されたワクチンに近いワクチンをもたらす。具体的には、複合多糖ワクチンを製造するためのｉｎ ｖｉｖｏ細菌コンジュゲーションの出現が、現在最も臨床的に進化した製品の一部をもたらした。バイオコンジュゲーションまたはタンパク質グリカンカップリング技法（ＰＧＣＴ）と一般に称される、複合多糖ワクチン製造のための多糖類とタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーションは、ＯＴアーゼに頼る（Ｆｒａｓｃｈ ＣＥ （２００９） Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ． Ｖａｃｃｉｎｅ ２７（４６）：６４６８－６４７０）。バイオコンジュゲーションは、複合多糖ワクチンの生成及び製造プロセスの簡略化を代表するものであると一般的にみなされる（Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ， Ｄｅ Ｇｒｅｇｏｒｉｏ Ｅ， ＆ Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｐ （２０１９） Ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１６（１）：１４－１６）。
Ｎ結合ＯＴアーゼ及びＯ結合ＯＴアーゼのどちらも、複合多糖ワクチン製造のための多糖類と担体タンパク質との生物学的コンジュゲーションに使用されてきた。どちらのＯＴアーゼが使用されるかに関わらず、任意のグラム陰性菌における生物学的コンジュゲーションは、３つの構成要素に頼る：多糖生合成タンパク質をコードする遺伝子座（単数または複数）、グリコシル化される担体タンパク質、及び所望の炭水化物を担体タンパク質に移動させるＯＴアーゼである。これら３つの構成要素は、必要ではあるものの、３つの別個のプラスミド上にある必要はない。
最近、第３クラスのＯ結合ＯＴアーゼが、バイオコンジュゲートワクチン製造に使用された（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｈｏｓｔ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：８９１）。ＰｇｌＳと名づけられたこの第３クラスのＯＴアーゼは、他に知られる唯一のＯ結合ＯＴアーゼ、ＰｉｌＯ及びＰｇｌＬとほとんど同様に、ピリン様タンパク質、ＣｏｍＰを天然にグリコシル化する（Ｓｃｈｕｌｚ ＢＬ， ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（５）：ｅ６２７６８）。追跡研究により、ＰｇｌＳが、実際のところ、ピリン特異的ＯＴアーゼであり、包括的糖タンパク質スクリーニングアプローチを用いて他に同定される糖タンパク質がなかったことから、ＣｏｍＰのみをグリコシル化する可能性が高いことが実証された（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｃａｒｒｙ ｔｗｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ， ｏｎｅ ｄｅｖｏｔｅｄ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｔｏ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎｅ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６（５）：１０２３－１０４１）。当初は環境細菌Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉのＡＤＰ１株由来のＰｇｌＬ相同分子種として特性決定されたが、ＰｇｌＳは、実際には、ＰｇｌＬタンパク質と系統学的にはっきり異なる。ＰｇｌＳタンパク質をコードするＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の株は、ＰｇｌＬタンパク質もコードし、このタンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属の種と同様な様式で、少なくとも７種の膜結合型タンパク質をグリコシル化する全般的ＯＴアーゼとして作用することが示されている（Ｉｗａｓｈｋｉｗ ＪＡ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｒａｌ Ｏ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８（６）：ｅ１００２７５８）。また、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の一部の株は、ＰｉｌＯのＯＴアーゼもコードし、そのためＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属は、３種のＯ－ＯＴアーゼファミリー（ＰｉｌＯ、ＰｇｌＬ、及びＰｇｌＳ）全部の遺伝子を保有する細菌として知られる唯一の属となっている（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｃａｒｒｙ ｔｗｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ， ｏｎｅ ｄｅｖｏｔｅｄ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｔｏ ｔｙｐｅ ＩＶ ｐｉｌｉｎ， ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎｅ ｄｅｄｉｃａｔｅｄ ｔｏ Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６（５）：１０２３－１０４１；Ｉｗａｓｈｋｉｗ ＪＡ， ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅｒａｌ Ｏ－ｌｉｎｋｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ８（６）：ｅ１００２７５８）。
系統発生学的差異とは別に、ＰｇｌＳは、その同族ピリンを独特のセリン部位でグリコシルし、この部位は、ＰｉｌＥ（ＰｇｌＬのピリン標的）またはＰｉｌＡ（ＰｉｌＯのピリン標的）のグリコシル化部位と比較した場合に保存されておらず、ＬＣＲ内に含まれてもいない（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｈｏｓｔ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：８９１）。しかしながら、最も目を引く違いは、ＰｇｌＳが移動させる多糖基質にある。ＰｇｌＳは、Ｎ結合またはＯ結合のどちらでも、還元末端にグルコースを持つ多糖類を移動させることができると知られる唯一のＯＴアーゼである。多くの病原体は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｇｅｎｏ ＫＡ， ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ Ｃａｐｓｕｌｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｔｙｐｅｓ： Ｐａｓｔ， Ｐｒｅｓｅｎｔ， ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２８（３）：８７１－８９９）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属グループＢ（Ｃａｒｂｏｎｉ Ｆ， ｅｔ ａｌ． （２０１７） Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ ｇｒｏｕｐ Ｂ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４（１９）：５０１７－５０２２）、及びＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｐａｎ ＹＪ， ｅｔ ａｌ． （２０１５） Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｉｎ ７９ ｃａｐｓｕｌａｒ ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５：１５５７３）のように、還元末端にグルコースを持つ多糖類を含有する莢膜を産生し、したがって、ＰｇｌＳ依存性バイオコンジュゲートワクチン開発の標的となる可能性がある。実際、ＰｇｌＳは、担体タンパク質として天然のアクセプターであるＣｏｍＰを使用して、血清型８、９Ｖ、及び１４（全て還元末端にグルコースを有する）に対する多価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンの生成に使用された。また、最初の２８のアミノ酸を欠いたＣｏｍＰ断片も、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの外毒素ＡのＣ末端と翻訳融合させた場合、グリコタグ（ｇｌｙｃｏｔａｇ）として機能することができ、より多くの従来のワクチン担体をＰｇｌＳバイオコンジュゲーションシステムに組み込むための道筋をつけた（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｈｏｓｔ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：８９１）。
発明の概要
本開示は、融合タンパク質と共有結合したオリゴ糖または多糖を含むバイオコンジュゲートを提供し、ただし、融合タンパク質は、ＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ）グリコシル化タグを含み、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の７１位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号２の９３位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方、または配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を含み、ならびに、融合タンパク質は、配列番号２の８２位または配列番号１の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基で、ＣｏｍＰグリコシル化タグのオリゴ糖または多糖を用いてグリコシル化される。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するメチオニン残基を含まない。ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートの融合タンパク質は、ＣｏｍＰグリコシル化タグに関して、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するまたはほとんど相当すると思われるメチオニン残基を含まない。ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートは、コンジュゲートワクチンである。
本開示は、融合タンパク質と共有結合したオリゴ糖または多糖を含むバイオコンジュゲートを提供し、ただし、融合タンパク質は、ＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ）グリコシル化タグを含み、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の７１位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号２の９３位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方、または配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を含み、ならびに、融合タンパク質は、配列番号２の８２位または配列番号１の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基で、ＣｏｍＰグリコシル化タグのオリゴ糖または多糖を用いてグリコシル化される。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するメチオニン残基を含まない。ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートの融合タンパク質は、ＣｏｍＰグリコシル化タグに関して、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するまたはほとんど相当すると思われるメチオニン残基を含まない。ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートは、コンジュゲートワクチンである。
本開示のある特定の態様において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］からなる群より選択されるアミノ酸配列、または１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアミノ酸置換、付加、及び／または欠失を有するそのバリアントを含む、あるいはそれからなり、ただし、バリアントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基及び配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を維持しており、ならびに、バリアントは、配列番号１の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基を維持している。
本開示は、ＣｏｍＰタンパク質の単離された断片を含むＣｏｍＰグリコシル化タグを提供し、ただし、断片は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基、ならびに配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の７１位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号２の９３位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方、または配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を含む。ある特定の実施形態において、請求項４１に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ、ただし、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するメチオニン残基を含まない。ある特定の実施形態において、請求項４２に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ、ただし、ＣｏｍＰグリコシル化タグのアミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない。
本明細書中提供されるのは、本開示のＣｏｍＰグリコシル化タグを含む融合タンパク質である。
同じく本明細書中提供されるのは、オリゴ糖または多糖とアクセプターポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ結合法であり、本方法は、ＰｇｌＳオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）を用いて、オリゴ糖または多糖をアクセプターポリペプチドと共有結合させることを含み、ただし、アクセプターポリペプチドは本開示のＣｏｍＰグリコシル化タグを含み、任意選択で、ＣｏｍＰグリコシル化タグは異種担体タンパク質と連結している。
同じく本明細書中提供されるのは、（ａ）オリゴ糖または多糖の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター、（ｂ）ＰｇｌＳのＯＴアーゼ、及び（３）本開示のＣｏｍＰグリコシル化タグを含むアクセプターポリペプチド、を含む宿主細胞である。
同じく本明細書中提供されるのは、ＣｏｍＰグリコシル化タグ及び／または本開示の融合タンパク質をコードする単離核酸、ならびに当該単離核酸を含む宿主細胞である。
同じく本明細書中提供されるのは、本開示のコンジュゲートワクチンまたは融合タンパク質、及びアジュバントを含む組成物である。
病原性微生物に対する宿主免疫応答を誘導する方法であり、本方法は、免疫応答を必要とする対象に本開示のコンジュゲートワクチン、融合タンパク質、または組成物を有効量で投与することを含む。
同じく本明細書中提供されるのは、対象における細菌性疾患及び／または感染症の予防または治療法であり、本方法は、予防または治療を必要とする対象に本開示のコンジュゲートワクチン、融合タンパク質、または組成物を有効量で投与することを含む。
同じく本明細書中提供されるのは、肺炎球菌感染症に対する肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造法であり、本方法は、本開示のバイオコンジュゲートまたはグリコシル化融合タンパク質を単離すること、及び単離したバイオコンジュゲートまたはグリコシル化融合タンパク質をアジュバントと組み合わせることを含む。
説明的なサポートを提供するために必要な範囲で、添付の特許請求の範囲の主題及び／または文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
この書面による説明の全ての読者にとって当然のことながら、本明細書中記載及び請求される例示的な態様及び実施形態は、本明細書中具体的に開示されているか否かに関わらず、列挙された特長、要素、または工程のいずれかが存在しない場合でも、適切に実施可能である。
定義
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「多糖」は、１つまたは複数の多糖を表すと理解されることに留意されたい。そのようなとき、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実体の１つまたは複数を指し、例えば、「多糖」は、１つまたは複数の多糖を表すと理解されることに留意されたい。そのようなとき、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用され得る。
さらに、「及び／または」は、本明細書で使用される場合、他のものを伴ってまたは伴わずに、特定の特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示として受け取られるべきである。したがって、本明細書で「Ａ及び／またはＢ」等の語句で使用されるとき、「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような語句で使用されるとき、「及び／または」という用語は、以下の実施形態の各々を包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
本明細書で「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という言葉で態様が記載されている場合は常に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語で記載されている類似の態様も提供されることを理解されたい。
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本開示の関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
数値範囲は範囲を定義する数を含む。「及びその間の任意の範囲」などによって明示的に識別されていない場合、または例えば、１，２，３または４のように値の列挙が記載されている場合でも、特に明記しない限り、本開示は、値の間の任意の範囲、例えば、１～３、１～４、２～から４などを具体的に含む。
本明細書で提供される見出しは、単に参照を容易にするためのものであり、本明細書全体を参照することによって得られることができる本開示の様々な態様または態様の限定ではない。
本明細書中使用される場合、「天然に存在しない」物質、組成物、実体、及び／または物質、組成物、もしくは実体の任意の組み合わせという用語、またはそれらの任意の文法的異形は、当業者によって「天然に存在する」と十分に理解されている、または「天然に存在する」と裁判官または行政または司法機関によっていつでも判定または解釈される可能性のある形式の物質、組成物、実体、及び／または物質、組成物、もしくは実体の任意の組み合わせを明示的に除外するが、除外するだけの条件付き用語である。
本明細書中使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数形の「ポリペプチド」及び複数形の「ポリペプチド」を包含することを意図し、この用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結した単量体（アミノ酸）からなる分子を示す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖または複数の鎖を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。したがって、２つ以上のアミノ酸の鎖または複数の鎖を指すのに使用されるペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、用語「ポリペプチド」は、任意のこれらの用語の代わりに、または互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、または非標準アミノ酸による修飾を含むがこれらに限定されないポリペプチドの発現後修飾の生成物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来するか、または組換え技術によって生成され得るが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるわけではない。それは化学合成によることを含む任意の方法で生成することができる。
本明細書中使用される場合、「タンパク質」は、単一のポリペプチド、すなわち上述で定義された単一のアミノ酸鎖を指すことができるが、例えば、ジスルフィド結合、水素結合、または疎水性相互作用によって結合されて多量体タンパク質を生成する２つ以上のポリペプチドを指すこともできる。
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体とは、その天然の環境にはないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルが求められるわけではない。例えば、単離されたポリペプチドはその天然のまたは自然な環境から取り出され得る。いずれかの適切な技法によって、分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された天然のポリペプチドまたは組み換えポリペプチドと同様に、宿主細胞で発現させた組み換え産生ポリペプチドとタンパク質は、本発明の目的において、単離されているものとみなす。単離されたポリペプチドまたは断片、バリアント、またはそれらの誘導体などは、補因子と会合、結合などすることができる。同様に、精製されたか、または精製及び単離されたポリペプチドまたは断片、バリアント、またはそれらの誘導体などは、補因子と会合、結合などすることができる。
本明細書中使用される場合、「天然に存在しない」ポリペプチドという用語、またはその任意の文法的変形は、当業者により「天然に存在する」と十分に理解されている、あるいは裁判官または行政もしくは司法機関によりいつでも「天然に存在する」と判定または解釈される可能性のある形式のポリペプチドを明白に除外するが、ただ除外するだけの条件付き用語である。
本明細書中開示されるのは、ある種の結合分子、あるいはそれらの抗原結合断片、バリアント、または誘導体である。天然に存在する抗体などのように具体的に原寸大の抗体と示さない限り、「結合分子」という用語は、原寸大の抗体ならびに当該抗体の抗原結合断片、バリアント、アナログ、または誘導体、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子または抗体分子と同様な様式で抗原に結合する改変抗体分子もしくは断片を包含する。
本明細書中使用される場合、「結合分子」という用語は、その最も広義において、抗原決定基に特異的に結合する分子を示す。本明細書中さらに記載されるとおり、結合分子は、複数の「結合ドメイン」のうち１つを含むことができる。本明細書中使用される場合、「結合ドメイン」とは、所定の抗原決定基、すなわちエピトープに特異的に結合することができる二次元または三次元のポリペプチド構造である。結合分子の限定ではなく例として、抗原決定基またはエピトープに特異的に結合する結合ドメインを含む抗体またはその断片がある。結合分子の別の例は、第一エピトープに結合する第一結合ドメイン、及び第二エピトープに結合する第二結合ドメインを含む二重特異性抗体である。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書中同義で使用可能である。抗体（または、本明細書中開示されるとおりのその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、少なくとも重鎖の可変ドメインならびに少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的十分に解明されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照。
結合分子、例えば、抗体、またはそれらの抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬもしくはＶＨドメインいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリにより生成した断片が挙げられるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当該分野で既知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本開示により包含される免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子が可能である。
「特異的に結合する」とは、結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介して、エピトープに結合すること、及びその結合が、抗原結合ドメインとエピトープの間に何かしらの相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、結合分子が、その抗原結合ドメインを介して、無関係のエピトープに無作為に結合するよりも容易にあるエピトープに結合するとき、その結合分子は、そのエピトープに「特異的に結合する」と言える。「特異的に」という用語は、本明細書中、ある特定の結合分子がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を特定するのに使用される。例えば、結合分子「Ａ」は、所定のエピトープに関して結合分子「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなすことができ、または結合分子「Ａ」は、エピトープ「Ｃ」に対して、関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性で結合すると言うことができる。
「二重特異性抗体」という用語は、本明細書中使用される場合、単一抗体分子内に、２種の異なる抗原に対する結合部位を有する抗体を示す。古典的抗体構造に加えて、他の分子も２つの結合特異性を持って構築することができることが理解されるだろう。さらに、二重特異性抗体による抗原結合は、同時でも順次でも可能であることが理解されるだろう。トリオーマ（Ｔｒｉｏｍａ）及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌することが可能な細胞株の２つの例である。二重特異性抗体は、組換え手法によって構築することも可能である。（Ｓｔｒｏｈｌｅｉｎ ａｎｄ Ｈｅｉｓｓ， Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ． ６：１３８７－９４ （２０１０）；Ｍａｂｒｙ ａｎｄ Ｓｎａｖｅｌｙ， ＩＤｒｕｇｓ． １３：５４３－９（２０１０））。二重特異性抗体は、ダイアボディでもあり得る。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合または非従来の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その本来の環境から回収された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図している。例えば、ベクターに含まれるポリペプチドサブユニットをコードする組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるように単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の精製された（部分的または実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのポリヌクレオチドのＲＮＡ転写物が含まれる。単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に生成されたそのような分子がさらに含まれる。さらに、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントであり得るか、またはそれらを含み得る。
本明細書中使用される場合、「天然に存在しない」ポリヌクレオチドという用語、またはその任意の文法的変形は、当業者により「天然に存在する」と十分に理解されている、あるいは裁判官または行政もしくは司法機関によりいつでも「天然に存在する」と判定または解釈される可能性のある形式のポリヌクレオチドを明白に除外するが、ただ除外するだけの条件付き用語である。
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであることが可能である。
「ベクター」は、宿主細胞に導入される核酸分子であり、それにより、形質転換された宿主細胞を生成する。ベクターは、複製起点などの宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、当該技術分野で知られている、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子及び他の遺伝子エレメントを含んでもよい。
「形質転換された」細胞、または「宿主」細胞は、分子生物学技法によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書中使用される場合、形質転換という用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、及びエレクトロポレーション、リポフェクション、及びパーティクルガン加速によるネイキッドＤＮＡの導入を含む、核酸分子をそのような細胞に導入することができる技法を包含する。形質転換された細胞または宿主細胞は、細菌細胞または真核生物細胞であり得る。
「発現」という用語は、本明細書中使用される場合、遺伝子が生化学物質、例えばポリペプチドを生成するプロセスを指す。このプロセスには、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現と安定発現の両方を含むがこれらに限定されない、細胞内の遺伝子の機能的存在の任意の発現が含まれる。これには、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、及びそのようなｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳が含まれるが、これらに限定されない。最終的な所望の製品が生化学物質である場合、発現にはその生化学物質及び任意の前駆体の作成が含まれる。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を生成する。本明細書中使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物は、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を有する核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断などを有するポリペプチドをさらに含む。
本明細書中使用される場合、「治療する」、「治療」、または「の治療」（例えば、「対象を治療する」という語句における）という用語は、例えば、対象がより長い生存期間または不快の低減を有する程度まで、疾患病理の可能性を低下させること、疾患症候の発生を減少させることを示す。例えば、治療は、ある療法が、対象に投与された場合の、疾患の症候、兆候、または原因を減少させる能力を示すことができる。治療は、少なくとも１つの臨床症候を軽減または減少させること、及び／または症状の進行を阻害もしくは遅らせること、及び／または疾患もしくは疾病の発症を予防または遅らせることも示す。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」は、診断、予後、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象として、ヒト、家畜動物、牧畜動物、スポーツ動物、及び動物園動物が挙げられ、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマなどが含まれる。
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性を有効にさせる形態であり、組成物が投与される対象にとって許容しがたい程度に毒性であるさらなる成分を含まない製剤を指す。そのような組成物は無菌であり得る。
抗体の「有効量」とは、本明細書中開示される場合、具体的に表明された目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、表明された目的に関して、経験的に及び常套的やり方により決定することができる。
概要。タンパク質に連結した多糖からなるコンジュゲートワクチンは、命を救う予防薬である。伝統的に、コンジュゲートワクチンは化学的方法論を使用して製造されている。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏ細菌コンジュゲーションは、製造の代替手段として浮上している。Ｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーション（バイオコンジュゲーション）は、多糖をタンパク質に結合するためにオリゴサッカリルトランスフェラーゼに依存している。現在、バイオコンジュゲーションに使用されるオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、多糖が還元末端にグルコースを含む場合、コンジュゲートワクチンの生成には適さない。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜の約７５％に還元末端糖としてグルコースが含まれているため、この制限には大きな影響がある。本明細書に開示されるのは、それらの還元末端にグルコースを含む多糖を有する初めての多価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを生成するためのＯ結合型オリゴ糖トランスフェラーゼの使用である。肺炎球菌バイオコンジュゲートは免疫原性、防御性があり、組換え技法で迅速に生成された。本明細書に開示される特定の態様は、ワクチン担体として天然アクセプタータンパク質ＣｏｍＰを使用する多価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチン、ならびに従来のワクチン担体、例えば、特定の態様において、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ 外毒素Ａタンパク質を含むものを使用する一価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンの工学的、特性評価、及び免疫学的応答を提供する。これにより、他のコンジュゲート酵素の制限を克服するためのプラットフォームが確立され、多くの重要なヒト及び動物の病原体に対するバイオコンジュゲートワクチンの開発が可能になる。
過去２０年間に肺炎球菌コンジュゲートワクチンが導入及び実施されたとしても、毎年約１５０万人の死がＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに起因している。これは、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの９０を超える血清型と、肺炎球菌コンジュゲートワクチンの合成に必要な複雑な製造方法に一部起因する。これらの要因が合わさって、ワクチンのより広く、より保護的なバリエーションの世界的な流通と開発を妨げている。開発を促進し、製造コストを下げるために、本明細書に開示されるのは、ｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーションを使用して、コンジュゲートワクチン、例えば肺炎球菌コンジュゲートワクチンを開発するためのプラットフォームである。この合理化されたプロセスは、既存の製造パイプラインを補完するか、化学コンジュゲーション方法論への依存を完全に回避する可能性があり、より包括的なコンジュゲートワクチンの製造を可能にする。
従来の化学コンジュゲートワクチン合成は、複雑で、費用がかかり、面倒であると考えられている（Ｆｒａｓｃｈ， Ｃ．Ｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２７， ６４６８－６４７０ （２００９））。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーションは、実行可能な生合成の代替手段として徹底的に進歩している（Ｈｕｔｔｎｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７， ５２８－５３７ （２０１７））。これらの進歩は、ＧｌｙｃｏＶａｘｙｎ（現在はＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅと直接関係のある独立企業であるＬｉｍｍａＴｅｃｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ＡＧ）の成功によって最もよく強調されている。これは、臨床試験の様々なフェーズで複数のバイオコンジュゲートワクチンを使用する臨床段階のバイオ医薬品企業であり、そのうちの１つ（Ｆｌｅｘｙｎ２ａ）はフェーズ２ｂチャレンジ研究を完了した。ＧｌｙｃｏＶａｘｙｎはｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーション革命の最前線にあるが、還元末端糖としてグルコース（Ｇｌｃ）を含む多糖で担体／アクセプタータンパク質をグリコシル化する能力はとらえどころのないものであり、予想通り、肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンの開発を妨げてきた。
Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．（ＰＭＩＤ２３６５８７７２）によってＰｇｌＬと、及びＨａｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１５（ＰＭＩＤ ２６７２７９０８）によってＰｇｌＬＣｏｍＰと以前は呼ばれていたオリゴサッカリルトランスフェラーゼは、機能的なＯＴアーゼとして最近特徴付けられた（Ｓｃｈｕｌｚ， Ｂ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８， ｅ６２７６８ （２０１３））。総糖ペプチドに関するその後の質量分析研究は、ＰｇｌＳが一般的なＰｇｌＬ様ＯＴアーゼとして作用せず、複数のペリプラズム及び外膜タンパク質をグリコシル化することを示した（Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｃ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６， １０２３－１０４１ （２０１５））。実際、Ａ． ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１のゲノムは、２つのＯＴアーゼ、ＰｇｌＬ様オルソログ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ６ＦＦＳ６．１）をコードし、これは一般的なＯＴアーゼ及びＰｇｌＳ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ： Ｑ６Ｆ７Ｆ９．１）として作用し、単一タンパク質ＣｏｍＰをグリコシル化する（Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｃ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６， １０２３－１０４１ （２０１５））。
ＣｏｍＰは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＰｉｌＡ及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ由来のＰｉｌＥなどのＩＶ型ピリンタンパク質とオルソロガスであり、そのどちらもそれぞれ、ＯＴａｓｅｓ ＴｆｐＯ（Ｃａｓｔｒｉｃ， Ｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１ （ Ｐｔ ５）， １２４７－１２５４ （１９９５））及びＰｇｌＬ（Ｐｏｗｅｒ， Ｐ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４９， ８３３－８４７ （２００３））によってグリコシル化される。ＴｆｐＯとＰｇｌＬもセリン残基で同族のピリンをグリコシル化するが、グリコシル化の部位は各システム間で異なる。ＴｆｐＯは、ＣｏｍＰには存在しないＣ末端のセリン残基で同族のピリンをグリコシル化する（Ｃｏｍｅｒ， Ｊ．Ｅ．， Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｍ．Ａ．， Ｂｌａｎｃｈ， Ｖ．Ｊ．， Ｄｅａｌ， Ｃ．Ｄ．＆ Ｃａｓｔｒｉｃ， Ｐ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０， ２８３７－２８４５ （２００２））。ＰｇｌＬは６３位にある内部セリンでＰｉｌＥをグリコシル化する（Ｓｔｉｍｓｏｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７， １２０１－１２１４ （１９９５））。ＣｏｍＰは６３位付近にセリン残基も含み、周囲の残基はＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ由来のＰｉｌＥに対して中程度の保存を示している。しかし、包括的な糖ペプチド分析により、このセリンと周囲の残基はＣｏｍＰのグリコシル化部位ではないことが明らかになった。ここで、ＰｇｌＳが、ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６３１（配列番号１）（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１（配列番号２）の８２位の保存されたセリンにも対応する）の８４位の保存されたセリンに対応する位置に位置する単一のセリン残基でＣｏＭＰをグリコシル化することが開示され、これは、ＩＶ型ピリンスーパーファミリー内ではこれまで見られなかった新規のグリコシル化部位である。ピリンスーパーファミリー内のグリコシル化の新規部位の同定と組み合わされ、還元末端糖としてグルコースを含む多糖を転移するＰｇｌＳの能力は、ＰｇｌＳがＰｇｌＬ及びＴｆｐＯとは機能的に異なるＯＴａｓｅであることを実証する。
ＰｇｌＳは、還元末端にグルコースを含む多糖をアクセプタータンパク質ＣｏｍＰに転移させたが、ＰｇｌＢもＰｇｌＬもそうではなかった。２つのクラスのＯＴアーゼ、ＰｇｌＢ、及びＰｇｌＬは、以前はｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーションに使用されていた（Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｍ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２， ３０１６－３０２１ （２００５）；Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ， Ａ．， Ｆｅｎｔａｂｉｌ， Ｍ．Ａ．， Ｍｉｌｌｓ， Ｄ．Ｃ．， Ｋｌａｓｓｅｎ， Ｊ．Ｓ． ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｍ．Ｆ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８９， ８０８８－８０９８（２００７））。記載された最初のＯＴアーゼであるＰｇｌＢは、基質認識に役割を果たすと考えられているため、還元末端のＣ－２位置にアセトアミド基を含むグリカン（すなわちＮ－アセチルグルコサミン）を優先的に転移する（Ｗａｃｋｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３， ７０８８－７０９３ （２００６））。しかしながら、Ｓ． ｅｎｔｅｒｉｃａ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ Ｏ抗原など、還元末端にガラクトース（Ｇａｌ）を含む多糖は、操作されたＰｇｌＢバリアントによって転移できる（Ｉｈｓｓｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ ５， １４０２２７（２０１５））。２番目に記載されたＯＴアーゼであるＮ． ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ由来のＰｇｌＬは、ＰｇｌＢよりも基質特異性が緩和されており、Ｃ－２位にアセトアミド基を持つ多糖と還元末端にガラクトース（Ｇａｌ）を含む多糖を自然に転移する（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ， Ａ．， Ｆｅｎｔａｂｉｌ， Ｍ．Ａ．， Ｍｉｌｌｓ， Ｄ．Ｃ．， Ｋｌａｓｓｅｎ， Ｊ．Ｓ． ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｍ．Ｆ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８９， ８０８８－８０９８ （２００７）；Ｐａｎ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．ＭＢｉｏ ７ （２０１６））。しかしながら、還元末端にグルコース（Ｇｌｃ）を含む多糖のＰｇｌＢまたはＰｇｌＬを介した転移について利用できる証拠はなく、これは、肺炎球菌ＣＰＳの大部分が還元末端にグルコースを含むことを考えると特に興味深い（Ｇｅｎｏ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２８， ８７１－８９９ （２０１５））。肺炎球菌血清型１４莢膜多糖（ＣＰＳ１４）をそれらの同族のグリコシル化標的であるＡｃｒＡ（Ｗａｃｋｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８， １７９０－１７９３ （２００２））及びＤｓｂＡ （Ｖｉｋ， Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６， ４４４７－４４５２ （２００９））に転移するＰｇｌＢ及びＰｇｌＬの能力がそれぞれ試験された。図１４Ａ及び図１４Ｂに見られるように、両方のアクセプタータンパク質が発現したが、いずれかのアクセプタータンパク質へのＣＰＳ１４グリコシル化の証拠は観察されなかった。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種は、３つのＯ結合型；複数のタンパク質のグリコシル化に関与する一般的なＰｇｌＬ ＯＴアーゼ、及び２つのピリン特異的ＯＴアーゼＯＴアーゼを含むと記載されている（Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｃ．Ｍ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６， １０２３－１０４１ （２０１５））。最初のピリン特異的ＯＴアーゼはＴｆｐＯ（ＰｉｌＯとしても知られる）のオルソログであり、１つを超える繰り返し単位を持つ多糖を転移できないため、ｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーションシステムには使用されない（Ｆａｒｉｄｍｏａｙｅｒ， Ａ．， Ｆｅｎｔａｂｉｌ， Ｍ．Ａ．， Ｍｉｌｌｓ， Ｄ．Ｃ．， Ｋｌａｓｓｅｎ Ｊ．Ｓ．＆ Ｆｅｌｄｍａｎ， Ｍ．Ｆ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８９， ８０８８－８０９８（２００７））。２番目のピリン特異的ＯＴアーゼであるＰｇｌＳは、単一のタンパク質であるＩＶ型ピリンＣｏｍＰ２８をグリコシル化する。バイオインフォマティクス分析は、ＰｇｌＳがＯＴアーゼの異なるファミリーの原型であることを示した。ＰｇｌＳが新しいクラスのＯ－ＯＴアーゼであることを考え、肺炎球菌ＣＰＳ１４をその同族のアクセプタータンパク質であるＣｏｍＰに転移する能力（Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｃ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６， １０２３－１０４１（２０１５））を試験した。図１４Ｃに見られるように、ＰｇｌＳ及びＣｏｍＰのヘキサヒスタグ付きバリアントと組み合わせたＣＰＳ１４生合成遺伝子座の共発現は、ウエスタンブロッティングで分析した場合、タンパク質のグリコシル化と互換性のある典型的なはしご状のバンドパターンをもたらした（図１４Ｂ）。シグナルの高分子量のモーダル分布は、分子量が増加するグリカンサブユニットの繰り返しによるタンパク質のグリコシル化を示す。まとめると、これらの結果は、以前に特性決定されたＯＴアーゼとは異なり、ＰｇｌＳが還元末端にグルコースを含む多糖を転移できることを示す。
Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅには９０を超える血清型がある（Ｇｅｎｏ， Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２８， ８７１－８９９（２０１５））。血清型８、２２Ｆ、及び３３Ｆなど、ますます流行している多くの血清型は、現在認可されているワクチンには含まれていない。したがって、ＰｇｌＳの汎用性を試験して、Ｐｒｅｖｎａｒ １３に含まれる２つの血清型（血清型９Ｖ及び１４）と含まれない１つの血清型（血清型８）に対する多価肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを生成した（添付文書－Ｐｒｅｖｎａｒ １３－ＦＤＡ、ワールドワイドウェブの（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＢｉｏｌｏｇｉｃｓＢｌｏｏｄＶａｃｃｉｎｅｓ／Ｖａｃｃｉｎｅｓ／ＡｐｐｒｏｖｅｄＰｒｏｄｕｃｔｓ／ＵＣＭ２０１６６９．ｐｄｆ）。重要なことに、これらの３つの莢膜多糖は全て、還元末端糖としてグルコースを含む（Ｇｅｎｏ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２８， ８７１－８９９（２０１５））。図１５に見られるように、ＰｇｌＳ、ヘキサヒスタグ付きＣｏｍＰバリアント、及びＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１４のいずれかを共発現する全細胞からのアフィニティー精製タンパク質のウエスタンブロット分析により、ＣＰＳ特異的バイオコンジュゲートが生成された。さらに、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１４抗原のいずれかに特異的な抗血清も、抗Ｈｉｓ反応性バンドに反応し、ＣｏｍＰ－Ｈｉｓが正しい多糖でグリコシル化されたことを示す。精製された材料が脂質結合多糖で汚染されていないことを確認するために、試料をプロテイナーゼＫで処理し、ウエスタンブロッティングで分析したときにシグナルの喪失を観察し、バイオコンジュゲートがタンパク質性であることを確認した。
したがって、ＰｇｌＳはＳ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの多糖をＣｏｍＰに転移することができるが、ＰｇｌＢとＰｇｌＬは転移することができないことが実証された。具体的には、ＰｇｌＳは、還元末端にグルコースを含む多糖を転移することができる、世界で知られている中の唯一のＯＴアーゼである。特定の態様において、ＰｇｌＳは、還元末端にグルコースを含む脂質結合型オリゴ糖または多糖（本明細書では総称して「オリゴ糖または多糖」と呼ぶ）をＣｏｍＰまたはＣｏｍＰの断片を含む融合タンパク質に転移するために使用できる。
ＰｇｌＳは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａの莢膜多糖をＣｏｍＰに転移することができる。グラム陰性の日和見ヒト病原菌であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、病原性に重要であることが知られている莢膜多糖を生成する。現在までに、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種について少なくとも７９の抗原的に異なる莢膜多糖が報告されている（Ｐａｎ， Ｙ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５， １５５７３（２０１５））。さらに、Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ は、７７の莢膜多糖のうち少なくとも５９を生成することが知られており、その半分以上が還元末端糖としてグルコースを含む（Ｐａｎ， Ｙ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５， １５５７３（２０１５））。ＰｇｌＳがＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜多糖をＣｏｍＰに転移できるかどうかを判断するために、Ｋ１またはＫ２莢膜多糖の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子をＩＰＴＧ誘導性ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２ベクターにクローニングした（Ｋｏｖａｃｈ， Ｍ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １６６， １７５－１７６（１９９５））。Ｋ１莢膜遺伝子座は、以前に特徴付けられたＫ１莢膜産生株であるＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＴＵＨＫ－２０４４からクローン化された（Ｗｕ， Ｋ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９１， ４４９２－４５０１（２００９））。Ｋ２莢膜遺伝子座は、以前に特徴付けられたＫ２莢膜産生株であるＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ５２．１４５からクローン化された（Ｌｅｒｙ， Ｌ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｌ １２， ４１（２０１４））。次いで、Ｋ１またはＫ２莢膜多糖発現プラスミドを、別のプラスミドベクターからＰｇｌＳ ＯＴアーゼとアクセプタータンパク質ＣｏｍＰを共発現するＥ． ｃｏｌｉに個別に導入した。Ｋ１及びＫ２特異的多糖の発現を増強するために、Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＴＵＨＫ－２０４４由来のＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 転写活性化因子ｒｍｐＡを続いてｐＡＣＴ３（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ， Ｄ．Ｍ．， Ｓｔ Ｐｉｅｒｒｅ， Ｒ． ＆ Ｌｉｎｎ， Ｔ． Ｇｅｎｅ １７７， １３３－１３６（１９９６））低コピー、ＩＰＴＧ誘導性ベクターにクローニングしたが、それが以前にＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜の調節因子として特徴づけられていたためである（Ａｒａｋａｗａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５９， ２０４３－２０５０（１９９１））；Ｙｅｈ， Ｋ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４５， ４６６－４７１（２００７））。ＰｇｌＳとヘキサヒスタグ付きＣｏｍＰバリアント、及びＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＫ１またはＫ２莢膜多糖のいずれかを共発現するＥ． ｃｏｌｉ株にｒｍｐＡ遺伝子を導入すると、ウエスタンブロッティングで分析した場合、タンパク質のグリコシル化と互換性のある、バンドの典型的なラダーのようなパターンで示されるように、高分子ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの強力な発現と検出が得られた（図１６Ｂ）。シグナルのモーダル分布は、分子量が増加するグリカンサブユニットの繰り返しによるタンパク質のグリコシル化を示す。したがって、まとめると、ＰｇｌＳはＣｏｍＰをＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａ由来のＫ１及びＫ２莢膜多糖でグリコシル化することができた。Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の転写活性化因子ｒｍｐＡの共発現により、コンジュゲーション効率の増加が観察された。
ＰｇｌＳは、Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖をＣｏｍＰに転移することができる。ほとんどのＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜多糖が還元末端糖としてグルコースを含んでいることを考えると、他の商業的に認可されたＯＴアーゼ（ＰｇｌＢ及びＰｇｌＬ）のみがこれらの多糖を使用してコンジュゲートワクチンを生成できないはずである。さらに、転写活性化因子であるＲｍｐＡと莢膜遺伝子クラスターの共発現により、莢膜の発現が検出可能なレベルまで増強された。特定の態様において、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａコンジュゲートの製造方法を使用してＫ． ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋ． ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、及びＫ． ｏｘｙｔｏｃａなどの他の種を含む全ての血清型を包含する汎Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａコンジュゲートワクチンを生成できる。
質量分析及び部位特異的変異導入により、ＰｇｌＳがＯ結合型ＯＴアーゼであることが確認され、ＣｏｍＰがＣｏｍＰＡＤＰ１の８４位に対応するセリン残基でグリコシル化されていることが確認された。細菌のＮ－グリコシル化は、一般に、シークオンＤ－Ｘ－Ｎ－Ｓ－Ｔ（配列番号２１）内で発生し、ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である（Ｋｏｗａｒｉｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２５， １９５７－１９６６ （２００６））。これに対して、Ｏ－グリコシル化は定義されたシークオンに従わないように見える。細菌タンパク質のほとんどのＯ－グリコシル化イベントは、セリン、アラニン、及びプロリンが豊富な低複雑度（ＬＣＲ）の領域で発生する（Ｖｉｋ， Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０６， ４４４７－４４５２ （２００９））。代替的に、いくつかのピリンは、Ｃ末端のセリン残基でＯ－グリコシル化される（Ｃｏｍｅｒ， Ｊ．Ｅ．， Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｍ．Ａ．， Ｂｌａｎｃｈ， Ｖ．Ｊ．， Ｄｅａｌ， Ｃ．Ｄ．＆ Ｃａｓｔｒｉｃ， Ｐ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７０， ２８３７－２８４５（２００２））。ＣｏｍＰは、他のピリン様タンパク質に見られるものと相同な明らかなＬＣＲまたはＣ末端セリン残基を持っていないようであるため、質量分析を使用してグリコシル化の部位（複数可）を決定した。精製されたＣＰＳ１４－ＣｏｍＰバイオコンジュゲートは、タンパク質分解消化、ＺＩＣ－ＨＩＬＩＣ糖ペプチド濃縮、及び複数のＭＳ分析にかけられた。図１７Ａ及び図１７Ｂに見られるように、ペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）からなる単一の糖ペプチドが、公開されているＣＰＳ１４組成に一致するグリカンに結合していることが同定された（Ｇｅｎｏ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２８， ８７１－８９９（２０１５））。ペプチドと結合したグリカン配列の両方を確認できるようにするために、複数の衝突エネルギーレジームを実行して、ＨｅｘＮＡＣ２Ｈｅｘｏｓｅ６に対応する１３７８．４７Ｄａグリカンによるｓｅｍｉ－ＧｌｕＣ由来ペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）のグリコシル化を確認した（図１７Ｂ）。最大４つの四糖繰り返し単位に対応する拡張グリカンで装飾された追加の糖ペプチドも観察された（図２９）。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種は主にセリン残基でタンパク質をグリコシル化することが以前に示されており、したがって、配列番号１で番号が付けられているセリン（Ｓ）８２または８４のいずれかがグリコシル化の部位であると仮定された（Ｓｃｏｔｔ， Ｎ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３， ２３５４－２３７０ （２０１４））。どのセリン残基がグリコシル化の部位であるかを決定するために、これらのセリン残基を個別にアラニン（Ａ）に変異させ、両方の変異タンパク質のグリコシル化状態を分析した。この実験では、Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ 七糖の生合成遺伝子座をドナーグリカンとして使用した。これは、ｈＲ６抗グリカン抗血清で、また電気泳動移動度の増加によって、グリコシル化が容易に検出できるためである（Ｓｃｈｗａｒｚ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ６， ２６４－２６６（２０１０））。図１８に示すように、野生型ヘキサヒスタグ付きＣｏｍＰは、ＰｇｌＳと共発現した場合の電気泳動移動度の増加と、ｈＲ６抗血清シグナルとの共局在によって示されるように、Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ七糖でグリコシル化された。ＭＳ分析では、ＣＰＳ１４で修飾された同一のｓｅｍｉ－ＧｌｕＣ由来ペプチドＩＳＡＳＮＡＴＴＮＶＡＴＡＴ（配列番号２２）にＣ． ｊｅｊｕｎｉ七糖が存在することも確認された（図３０及び図３１）。陰性対照として、触媒的に不活性なＰｇｌＳ変異体（Ｈ３２４Ａ）が生成され、Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ七糖グリカンと共発現すると、野生型ＣｏｍＰをグリコシル化できなかった。部位特異的変異導入が行われ、Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ七糖によるＣｏｍＰのグリコシル化がＣｏｍＰ［Ｓ８４Ａ］変異体で廃止されたのに対し、ＣｏｍＰ［Ｓ８２Ａ］は野生型レベルでグリコシル化されたことが観察された。まとめると、これらの結果は、ＣｏｍＰがセリン８４（配列番号１で番号付け）でＰｇｌＳによって単独でグリコシル化されていることを示し、これは、以前に特徴付けられた他のピリン様タンパク質とは異なる固有の部位である。これは、配列番号２で番号付けされたセリン８２に対応する。
ＣｏｍＰピリンオルソログのバイオインフォマティクス特徴。ＣｏｍＰは、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１の自然形質転換に必要な因子として最初に記載された（Ｐｏｒｓｔｅｎｄｏｒｆｅｒ， Ｄ．， Ｄｒｏｔｓｃｈｍａｎｎ， Ｕ． ＆ Ａｖｅｒｈｏｆｆ， Ｂ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６３， ４１５０－４１５７（１９９７））。その後の研究では、Ａ． ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１（本明細書ではＣｏｍＰＡＤＰ１と呼ぶ）由来のＣｏｍＰが、染色体上の他の場所にある一般的なＯＴアーゼ ＰｇｌＬではなく、ＣｏｍＰのすぐ下流にある新しいＯＴアーゼ、ＰｇｌＳによってグリコシル化されることが示された（Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｃ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９６， １０２３－１０４１（２０１５））。ＣｏｍＰＡＤＰ１タンパク質（ＮＣＢＩ識別子ＡＡＣ４５８８６．１）は、ＩＶ型ピリンと呼ばれるタンパク質ファミリーに属している。具体的には、ＣｏｍＰはＩＶａ型の主要なピリンと相同性を共有している（Ｇｉｌｔｎｅｒ， Ｃ．Ｌ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｙ． ＆ Ｂｕｒｒｏｗｓ， Ｌ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ７６， ７４０－７７２（２０１２））。ＩＶａ型ピリンは、高度に保存されたリーダー配列とＮ末端アルファヘリックスをコードするＮ末端で高い配列相同性を共有しているが、Ｃ末端は属間及び種内でさえ顕著な相違を示す（Ｇｉｌｔｎｅｒ， Ｃ．Ｌ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｙ． ＆ Ｂｕｒｒｏｗｓ， Ｌ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ７６， ７４０－７７２（２０１２））。ＣｏｍＰオルソログを他のＩＶａ型ピリンタンパク質、例えば、Ａ． ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＰｉｌＡならびにナイセリア種由来のＰｉｌＥなど（Ｐｅｌｉｃｉｃ， Ｖ． Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６８， ８２７－８３７（２００８））と区別するために、ＢＬＡＳＴｐ分析を実行して、ＣｏｍＰＡＤＰ１ の一次アミノ酸配列をＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属の細菌由来の全てのタンパク質と比較した。予想通り、ＣｏｍＰＡＤＰ１を含む多くのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒＩＶａ型ピリンオルソログは、Ｎ末端で高い相同性を共有している。しかしながら、ＣｏｍＰのアミノ酸配列全体で高い配列保存を示すタンパク質はほとんどない。少なくとも６つのＣｏｍＰオルソログ（図１９）は、ＣｏｍＰＡＤＰ１に対して８４位の保存セリンの存在と、予測されるアルファベータループをベータストランド領域に接続する予測されるグリコシル化の部位に隣接する保存されたジスルフィド結合に基づいて同定された（Ｇｉｌｔｎｅｒ， Ｃ．Ｌ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｙ． ＆ Ｂｕｒｒｏｗｓ， Ｌ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ７６， ７４０－７７２（２０１２））。さらに、６つのＣｏｍＰオルソログは全て、ｃｏｍＰ遺伝子のすぐ下流にあるｐｇｌＳホモログと、染色体上のいずこかにあるｐｇｌＬホモログの両方を有する。まとめると、少なくとも８４位の保存セリンの存在、グリコシル化の部位に隣接するジスルフィドループ、ｃｏｍＰのすぐ下流のｐｇｌＳ遺伝子の存在、及び染色体上のいずこかにあるｐｇｌＬホモログの存在は、ＣｏｍＰピリンバリアントを他のＩＶａ型ピリンバリアントと区別する。
したがって、異なるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種のＣｏｍＰオルソログを同定するＣｏｍＰタンパク質に共通の特徴が本明細書に開示されている。ＣｏｍＰタンパク質は、ＡＤＰ１ ＣｏｍＰタンパク質に対して８４位に位置する保存されたグリコシル化セリンの存在と、グリコシル化部位に隣接するジスルフィドループの存在によって、他のピリンと区別することができる。さらに、ＣｏｍＰのすぐ下流にｐｇｌＳホモログが存在することはＣｏｍＰの指標である。さらに、ＰｇｌＬ ＯＴアーゼタンパク質ではなくＰｇｌＳ ＯＴアーゼタンパク質として分類されるために、ＣｏｍＰの下流のＯＴアーゼは、Ａ． ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１のＰｇｌＬ（ＡＣＩＡＤ０１０３）と比較した場合、ＰｇｌＳ（ＡＣＩＡＤ３３３７）でより高い配列保存を示す必要がある。同じく当業者にとって明白であるのは、本明細書中開示されるいずれの実施形態においても、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基を含み、このセリン残基でグリコシル化可能であるということである。
Ａ． ｓｏｌｉ ＣＩＰ １１０２６４由来のＣｏｍＰは、Ａ． ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１由来のＰｇｌＳによってグリコシル化される。複数のＣｏｍＰオルソログの存在を考慮して、Ａ． ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１由来のＰｇｌＳが多様なＣｏｍＰタンパク質をグリコシル化できるかどうかを調べた。Ａ． ｓｏｌｉ ＣＩＰ １１０２６４由来のＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ１１０２６４）は、ＣｏｍＰＡＤＰ１と比較した場合、アミノ酸レベルで７１％同一である。しかしながら、上述の特徴と一致して、ＣｏｍＰ１１０２６４には、予測されるアルファベータループと第２のベータストランドの間の予測されるジスルフィド架橋と、ＣｏｍＰＡＤＰ１に対して８４位の保存セリンが含まれている。さらに、ＰｇｌＳオルソログはＣｏｍＰ１１０２６４のすぐ下流にあり得る。Ａ． ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１由来のＰｇｌＳ（ＰｇｌＳＡＤＰ１）がＣｏｍＰ１１０２６４をグリコシル化できるかどうかを判断するために、ＰｇｌＳＡＤＰ１をｐＡＣＴ３に、ＣｏｍＰ１１０２６４をｐＥＸＴ２０にクローニングし（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎ， Ｄ．Ｍ．， Ｓｔ Ｐｉｅｒｒｅ， Ｒ． ＆ Ｌｉｎｎ， Ｔ． Ｇｅｎｅ １７７， １３３－１３６ （１９９６））、これらのプラスミドを、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の血清型８莢膜多糖（ＣＰＳ８）を発現するＥ． ｃｏｌｉに導入された。さらに、Ａ． ｓｏｌｉ ＣＩＰ １１０２６４由来のＰｇｌＳ（ＰｇｌＳ１１０２６４）をＣｏｍＰＡＤＰ１と共にクローニングして発現することにより、逆の実験を実施した。図２０に見られるように、ＰｇｌＳ１１０２６４は、ＰｇｌＳ１１０２６４を欠く全細胞溶解物と比較した場合、高分子量のＣｏｍＰピリン変異体によって示されるように、同族のアクセプターピリンＣｏｍＰ１１０２６４を最小限にグリコシル化した。ウエスタンブロット分析に基づくと、ＰｇｌＳ１１０２６４はＣｏｍＰＡＤＰ１をグリコシル化しないように見受けられた。一方、ＰｇｌＳＡＤＰ１は、電気泳動移動度の増加によるＨｉｓ反応性シグナルの強力な増加によって示されるように、ＣｏｍＰＡＤＰ１とＣｏｍＰ１１０２６４の両方を効率的にグリコシル化した。まとめると、ＰｇｌＳＡＤＰ１は、複数のＣｏｍＰ基質を交差グリコシル化する独自の能力を備えた、Ｅ． ｃｏｌｉにおける異種グリコシル化の最適なＯＴアーゼであるように見える。したがって、異なるＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種からのＰｇｌＳタンパク質は、多様な非ネイティブのＣｏｍＰ配列をグリコシル化できることが実証された。
ＰｇｌＳによってグリコシル化可能な可溶性のペリプラズム融合タンパク質の生成。ＩＶａ型ピリンファミリーの全てのメンバーは、それらのＮ末端のアルファヘリックスの一部が内膜に埋め込まれているため、膜タンパク質とみなされる（Ｇｉｌｔｎｅｒ， Ｃ．Ｌ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｙ． ＆ Ｂｕｒｒｏｗｓ， Ｌ．Ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ７６， ７４０－７７２（２０１２））。したがって、ＰｇｌＳによってグリコシル化できるＣｏｍＰの可溶性バリアントを生成するために、３つの異なる担体タンパク質上にトランケートされたＣｏｍＰ断片タンパク質の翻訳融合を構築した。Ｅ． ｃｏｌｉ由来の担体タンパク質であるＤｓｂＡ及びＭａｌＥ（マルトース結合タンパク質－ＭＢＰとしても知られる）は、ペリプラズムの局在化とそれらのＣ末端で融合したアクセプタータンパク質の溶解性を促進することが以前に示されているため、適切な担体として選択された（Ｍａｌｉｋ， Ａ． Ｂｉｏｔｅｃｈ ６， ４４（２０１６））。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＥＰＡ）由来の外毒素Ａも、他のコンジュゲートワクチン製剤で免疫原性担体タンパク質として作用することが以前に示されているため、選択された（Ｒａｖｅｎｓｃｒｏｆｔ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２６， ５１－６２（２０１６））。融合タンパク質は、リーダー配列、担体タンパク質、短いリンカーペプチド、最初の２８アミノ酸を含まないＣｏｍＰバリアント、及びヘキサヒスチジンタグからなった。ＣｏｍＰＡＤＰ１とＣｏｍＰ１１０２６４の最初の２８アミノ酸は、リーダー配列と、内膜に埋め込まれると予測されるＮ末端アルファヘリックスの疎水性領域を含むため、削除された。次いで、融合構築物を、肺炎球菌血清型８莢膜多糖（ＣＰＳ８）及びｐＡＣＴ３単独、またはｐｇｌＳ１１０２６４もしくはｐｇｌＳＡＤＰ１を保有するｐＡＣＴ３のいずれかを発現するＥ． ｃｏｌｉに導入した。図２１に示すように、ＤｓｂＡ－ＡＡＡ－ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４またはＤｓｂＡ－ＧＧＧＳ－ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４のいずれかをＰｇｌＳＡＤＰ１と組み合わせて発現するＥ． ｃｏｌｉ細胞は、電気泳動移動度の増加という反応性シグナルのモーダル分布によって示されるように、検出可能なレベルのグリコシル化を示した。ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１を含む融合体を発現するＥ． ｃｏｌｉ細胞は、検出可能なグリコシル化を示さなかった。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合体を発現するＥ． ｃｏｌｉ細胞でも同じグリコシル化パターンが観察された。特に、図２２に示すように、ＭＢＰ－ＡＡＡ－ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４またはＭＢＰ－ＧＧＧＳ－ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４のいずれかをＰｇｌＳＡＤＰ１と組み合わせて発現するＥ． ｃｏｌｉ細胞は、抗Ｈｉｓ反応性シグナルのモーダル分布によって示されるように、検出可能なレベルのグリコシル化を示したが；一方で、ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１との融合は最小限のグリコシル化にすぎなかった。最後に、コンジュゲートワクチン製剤に使用される以前に確立された担体タンパク質が肺炎球菌ＣＰＳ８でＰｇｌＳによってグリコシル化できることを実証するために、ＥＰＡに融合したＤｓｂＡシグナルペプチド配列を含む融合タンパク質を改変した。次いで、ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４ペプチドをＥＰＡのＣ末端へのグリシン－グリシン－グリシン－セリン（ＧＧＧＳ；配列番号２３）リンカーと融合し、全細胞抽出物とペリプラズム抽出物の両方でＰｇｌＳＡＤＰ１の存在下及び非存在下でのグリコシル化を試験した。図２３に示すように、ＥＰＡ－ＧＧＧＳ－ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４構築物は、抗Ｈｉｓ反応性シグナルのモーダル分布によって示されるように、ＣＰＳ８グリカンとＰｇｌＳＡＤＰ１を共発現する細胞の全細胞抽出物とペリプラズム抽出物の両方でグリコシル化されていることが判明した。ＰｇｌＳオルソログを欠く試料またはＰｇｌＳ１１０２６４を発現する試料では、検出可能なグリコシル化は観察されなかった。まとめると、ＰｇｌＳＡＤＰ１は、還元末端にグルコースを含む多糖を短縮型ＣｏｍＰ融合タンパク質に転移するための最適なＯＴアーゼである。各融合構築物の具体的なアミノ酸配列を図２４に示す。
グリコシル化されたＣｏｍＰバイオコンジュゲートによる免疫は免疫応答を誘発する。コンジュゲートワクチンに対するＴ細胞依存性免疫応答は、高親和性ＩｇＧ１抗体の分泌を特徴とする（Ａｖｃｉ， Ｆ．Ｙ．， Ｌｉ， Ｘ．， Ｔｓｕｊｉ， Ｍ． ＆ Ｋａｓｐｅｒ， Ｄ．Ｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １７， １６０２－１６０９（２０１１））。マウスワクチン接種モデルにおけるＣＰＳ１４－ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの免疫原性を評価した。図２５Ａに見られるように、ＣＰＳ１４－ＣｏｍＰバイオコンジュゲートでワクチン接種されたマウスから採取された血清は、ＣＰＳ１４特異的ＩｇＧ力価が有意に増加しましたが、ＩｇＭ力価は増加しなかった。さらに、二次ＨＲＰタグ付き抗ＩｇＧサブタイプ抗体を使用して、どのＩｇＧサブタイプが力価を上昇させたかを決定した。図２５Ｂに見られるように、ＩｇＧ１力価は他のサブタイプよりも高いように見受けられた。
次に、３価のＣＰＳ８－、ＣＰＳ９Ｖ－、及びＣＰＳ１４－ＣｏｍＰバイオコンジュゲートの免疫原性を現在の標準治療であるＰＲＥＶＮＡＲ １３（登録商標）と比較する２回目のワクチン接種試験を実施した。血清型９Ｖ及び１４はＰＲＥＶＮＡＲ １３（登録商標）に含まれ、これら２つの血清型に対してＰＲＥＶＮＡＲ １３（登録商標）免疫マウスでＩｇＧ力価の上昇が見られた（図２６）。血清型１４に対する一価免疫も、予備免疫と同様の血清型特異的ＩｇＧ力価の有意な誘導を示した（図２５及び図２６）。三価バイオコンジュゲートを投与されたマウスは、予想通り、対照と比較した場合、全て血清型特異的ＩｇＧ力価が上昇し、４９日目の血清は血清型９Ｖと比較して血清型８及び１４のＩｇＧ力価の上昇を示した。それにもかかわらず、９Ｖに対するＩｇＧ力価は、プラセボよりも有意に高かった（図２６）。
本明細書中提供されるのは、融合タンパク質に連結されたオリゴ糖または多糖を含むバイオコンジュゲートである。ある特定の実施形態において、オリゴ糖または多糖は、融合タンパク質と共有結合している。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、ＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ）を含む。ある特定の他の実施形態において、融合タンパク質は、（本明細書中いずれかの箇所で詳細に説明されているように）ＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグを含む。
本明細書中開示されるとおり、ＣｏｍＰがセリン（Ｓ）残基でグリコシル化されることが発見された。このセリン残基はＣｏｍＰタンパク質で保存されており、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位に相当する。このセリン残基はまた、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の８２位に相当する（図３９Ａ、Ｂ、及びＣ）。したがって、ある特定の態様において、融合タンパク質（したがってバイオコンジュゲート）は、そのＣｏｍＰグリコシル化タグ上の配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に相当するまたは配列番号２の８２位のセリン残基に相当するセリン残基において、オリゴ糖もしくは多糖でグリコシル化される。図２８は、ＣｏｍＰ配列間で保存されている、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に相当するセリン（Ｓ）残基（四角の囲み）を含むＣｏｍＰ配列の領域のアライメントを示す。ある特定の実施形態において、グリコシル化されることを可能にする目的で、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基及び配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を含む。または、同様な記載になるが、ある特定の実施形態において、グリコシル化されることを可能にする目的で、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７１位の保存システイン残基に相当するシステイン残基及び配列番号２の９３位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を含む。
本開示のバイオコンジュゲートのある特定の実施形態において、オリゴ糖または多糖は、その還元末端にグルコースを含む。
当業者ならわかるだろうが、ＣｏｍＰ配列を配列番号１と（例えば、全長配列または部分配列と）整列させることによって、配列番号１の８４位のセリン残基に相当する本明細書に開示される配列番号１ではないＣｏｍＰタンパク質の保存された残基を同定することができる。さらに、当業者ならわかるだろうが、ＣｏｍＰ配列を配列番号１と整列させることにより、本明細書で言及される配列番号１の残基、領域、及び／または特徴に対応する他の残基、領域、及び／または特徴を、配列番号１ではないＣｏｍＰ配列で同定し、配列番号１に関して参照することができる。そして、本明細書中は概して配列番号１を参照するが、類推により、本明細書中開示される任意のＣｏｍＰ配列の任意の残基、領域、特徴などを、例えば、配列番号２に関して同様に参照することができる。
ＣｏｍＰタンパク質は、本明細書で提供される記載と一致するＣｏｍＰタンパク質として同定されたタンパク質である。例えば、ＣｏｍＰタンパク質の代表的な例には、ＡＡＣ４５８８６．１ ＣｏｍＰ［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＡＤＰ１］；ＥＮＶ５８４０２．１ 仮想タンパク質 Ｆ９５１＿００７３６［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ ＣＩＰ １１０２６４］；ＡＰＶ３６６３８．１ コンピテンスタンパク質［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｏｌｉ ＧＦＪ－２］；ＰＫＤ８２８２２．１ コンピテンスタンパク質［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ ５０ｖ１］；ＳＮＸ４４５３７．１ ＩＶ型線毛集合タンパク質ＰｉｌＡ［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐｕｙａｎｇｅｎｓｉｓ ＡＮＣ ４４６６］；及びＯＡＬ７５９５５．１ コンピテンスタンパク質［Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＳＦＣ］が含まれるが、これらに限定されない。特定の態様において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基を含む。配列番号１は、２８アミノ酸のリーダー配列を含む。特定の態様において、ＣｏｍＰタンパク質は、２８アミノ酸のリーダー配列を含まないが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基を含む、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ－２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、ＣｏｍＰタンパク質は、２８アミノ酸のリーダー配列を含まないが、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基を含む、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。特定の態様において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ－２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）を含む。特定の態様において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ－２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）である。
ある特定の態様において、バイオコンジュゲートは、本明細書に開示される生産方法のいずれかによってなど、宿主細胞においてｉｎ ｖｉｖｏで産生される。ある特定の態様において、バイオコンジュゲートは、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、鳥類細胞、藻類細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞で産生される。ある特定の態様において、バイオコンジュゲートは無細胞系で産生される。ＰｇｌＳ以外のＯＴアーゼを利用する無細胞システムの使用例は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０６７５２３Ａ１に見出すことができる。
配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するメチオニン残基は、ＣｏｍＰグリコシル化タグ中に存在する場合、たとえこのメチオニン残基を含む全長ＣｏｍＰタンパク質がグリコシル化されるとしても、グリコシル化に対して阻害効果を有する可能性があることが発見された。したがって、ある特定の実施形態において、本開示のＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するメチオニン残基を含まない。例えば、ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰアミノ酸配列中の当該メチオニン残基は、阻害効果を呈さない別のアミノ酸に置き換えられるか、またはＣｏｍＰグリコシル化タグアミノ酸配列から削除される。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグのアミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない。例えば、ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグのアミノ酸配列は、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の９３位、９４位、９５位、９６位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、または１０３位に相当する残基で終わる。当業者ならわかるだろうが、ＣｏｍＰグリコシル化タグを含む融合タンパク質も同様に、ＣｏｍＰグリコシル化タグに関して、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するまたはそれにおよそ相当すると思われるメチオニン残基を、たとえそのメチオニン残基がＣｏｍＰグリコシル化タグ配列に属するものではない融合タンパク質の配列に起因するとしても、含まない。例えば、ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートの融合タンパク質は、ＣｏｍＰグリコシル化タグに関して、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するまたはそれにおよそ相当すると思われるメチオニン残基を含まない。ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートの融合タンパク質は、ＣｏｍＰグリコシル化タグに関して、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当すると思われるメチオニン残基を含まない。
本開示のＣｏｍＰグリコシル化タグは、概して、全長ＣｏｍＰタンパク質ではない。本明細書中記載されるいずれかのＣｏｍＰグリコシル化タグのある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが１８～５０アミノ酸長、例えば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸長である。ある特定の実施形態において、グリコシル化タグは、長さが２１～４５アミノ酸長である。ある特定の実施形態において、グリコシル化タグは、長さが２３～４５アミノ酸長である。
本開示のＣｏｍＰグリコシル化タグは、本明細書中いずれかの箇所に記載されるとおりのＣｏｍＰタンパク質の断片、バリアント、またはバリアント断片であることが可能である。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ－２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）または配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ－２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）を含む。さらに、ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ－２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）または配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。さらに、ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ－２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）を含む。
ある特定の実施形態において、本開示のＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２７のアミノ酸コンセンサス配列を含むまたはその配列からなるとして定義することができ：
式中：
Ｘ１は、Ｖ、Ａであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｔであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ５は、Ｐ、Ｓ、またはＱであり；
Ｘ６は、Ｓ、Ｍ、またはＩであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｐ、またはＶであり；
Ｘ８は、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ１０は、Ｎであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、またはＡであり；
Ｘ１２は、ＳまたはＮであり；
Ｘ１４は、Ｖ、Ｔ、またはＡであり；
Ｘ１７は、Ｑ、Ｔ、またはＥであり；
Ｘ１８は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり；
Ｘ２０は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり；
Ｘ２１は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ２２は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ２５は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり；
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ２８は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ３１は、ＡまたはＥであり；
Ｘ３２は、ＴまたはＳであり；
Ｘ３４は、Ｔ、Ｑ、またはＡであり；
Ｘ３６は、Ｇ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ３７は、Ａ、Ｇ、またはＤであり；
Ｘ３８は、Ｓ、Ｌ、またはＡであり；
Ｘ３９は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＴであり；
Ｘ４０は、Ａ、Ｖ、またはＧであり；
Ｘ４１は、Ｇ、Ｉ、またはＶであり；
Ｘ４２は、Ｑ、Ｔ、またはＩであり；
Ｘ４３は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、またはＬであり；及び
Ｘ４４は、Ｉ、Ｔ、またはＶである。
Ｘ１は、Ｖ、Ａであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｔであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ５は、Ｐ、Ｓ、またはＱであり；
Ｘ６は、Ｓ、Ｍ、またはＩであり；
Ｘ７は、Ｔ、Ｐ、またはＶであり；
Ｘ８は、Ａ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ１０は、Ｎであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、またはＡであり；
Ｘ１２は、ＳまたはＮであり；
Ｘ１４は、Ｖ、Ｔ、またはＡであり；
Ｘ１７は、Ｑ、Ｔ、またはＥであり；
Ｘ１８は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり；
Ｘ２０は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり；
Ｘ２１は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ２２は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ２５は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり；
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ２８は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ３１は、ＡまたはＥであり；
Ｘ３２は、ＴまたはＳであり；
Ｘ３４は、Ｔ、Ｑ、またはＡであり；
Ｘ３６は、Ｇ、Ｓ、またはＴであり；
Ｘ３７は、Ａ、Ｇ、またはＤであり；
Ｘ３８は、Ｓ、Ｌ、またはＡであり；
Ｘ３９は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＴであり；
Ｘ４０は、Ａ、Ｖ、またはＧであり；
Ｘ４１は、Ｇ、Ｉ、またはＶであり；
Ｘ４２は、Ｑ、Ｔ、またはＩであり；
Ｘ４３は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、またはＬであり；及び
Ｘ４４は、Ｉ、Ｔ、またはＶである。
ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２７のアミノ酸コンセンサス配列の断片を含むまたはその断片からなり、ただし、断片は、配列番号２７の１３位のシステイン残基、配列番号２７の３５位のシステイン残基、及び配列番号２７の２４位のセリン残基を保持している。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２７のアミノ酸コンセンサス配列またはその断片のバリアントを含むまたはそのバリアントからなり、バリアントは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有するが、ただし、バリアントは、配列番号２７の１３位のシステイン残基、配列番号２７の３５位のシステイン残基、及び配列番号２７の２４位のセリン残基を保持している。ある特定の実施形態において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。本明細書中開示されるとおり、ある特定の実施形態において、配列番号２７を含むＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない。さらに、ある特定の実施形態において、配列番号２７を含むＣｏｍＰグリコシル化タグのアミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２７の４４位に相当するアミノ酸残基より先に続かない。ある特定の実施形態において、配列番号２７のアミノ酸コンセンサス配列またはその断片及び／またはバリアントを含むまたはそれからなるＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが、２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である。
ある特定の実施形態において、本開示のＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２８のアミノ酸コンセンサス配列を含むまたはその配列からなるとして定義することができ：
式中：
Ｘ２は、Ｖ、Ｔ、またはＡであるか、任意選択でＶであり；
Ｘ５は、Ｑ、Ｔ、またはＥであるか、任意選択でＱであり；
Ｘ６は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり；
Ｘ８は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり；
Ｘ９は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ１０は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ１３は、Ｎ、Ｓ、またはＡであるか、任意選択でＮであり；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、またはＫであるか、任意選択でＡであり；
Ｘ１６は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ１９は、ＡまたはＥであるか、任意選択でＡであり；
Ｘ２０は、ＴまたはＳであるか、任意選択でＴであり；あるいは
Ｘ２２は、Ｔ、Ｑ、またはＡであるか、任意選択でＴである。
Ｘ２は、Ｖ、Ｔ、またはＡであるか、任意選択でＶであり；
Ｘ５は、Ｑ、Ｔ、またはＥであるか、任意選択でＱであり；
Ｘ６は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり；
Ｘ８は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり；
Ｘ９は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ１０は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく；
Ｘ１３は、Ｎ、Ｓ、またはＡであるか、任意選択でＮであり；
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、またはＫであるか、任意選択でＡであり；
Ｘ１６は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり；
Ｘ１９は、ＡまたはＥであるか、任意選択でＡであり；
Ｘ２０は、ＴまたはＳであるか、任意選択でＴであり；あるいは
Ｘ２２は、Ｔ、Ｑ、またはＡであるか、任意選択でＴである。
ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２８のアミノ酸コンセンサス配列のバリアントを含むまたはそのバリアントからなり、バリアントは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有するが、ただし、バリアントは、配列番号２８の１位のシステイン残基、配列番号２８の２３位のシステイン残基、及び配列番号２８の１２位のセリン残基を維持している。ある特定の実施形態において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。
ある特定の実施形態において、配列番号２８を含むＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない。さらに、ある特定の実施形態において、配列番号２８を含むＣｏｍＰグリコシル化タグのアミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない。ある特定の実施形態において、配列番号２８のアミノ酸コンセンサス配列またはそのバリアントを含むＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが、２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である。
ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］からなる群より選択されるアミノ酸配列に１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有するバリアントを含むまたはそのバリアントからなり、ただし、バリアントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基及び配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を維持しており、ならびにバリアントは、配列番号１の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基を維持している。ある特定の実施形態において、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。さらに、ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはそのアミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態において、上記の配列またはそれらのバリアントのうち１つを含む当該ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない。さらに、ある特定の実施形態において、上記の配列またはそれらのバリアントのうち１つを含む当該ＣｏｍＰグリコシル化タグのアミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない。ある特定の実施形態において、上記に列挙されるアミノ酸配列及び／またはそれらのバリアントを含むＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが、２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。
ある特定の実施形態において、グリコシル化タグ、融合タンパク質、及び／またはバイオコンジュゲートと結合させるためのオリゴ糖または多糖は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌により産生される。例えば、ある特定の実施形態において、多糖は、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ． ｓｕｉｓの莢膜多糖である。さらに、ある特定の実施形態において、莢膜多糖は、ＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである。ある特定の他の実施形態において、オリゴ糖または多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌により産生される。例えば、ある特定の実施形態において、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの莢膜多糖である。ある特定の実施形態において、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜多糖である。さらに、ある特定の実施形態において、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２莢膜多糖である。
ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏで産生される。例えば、ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートは、細菌細胞で産生される。
バイオコンジュゲートは融合タンパク質に共有結合で連結されたオリゴ糖または多糖を含むことから、ある特定の用途では、担体タンパク質またはその断片と融合タンパク質を形成することが有利であり得る。ある特定の実施形態において、担体タンパク質は、コンジュゲートワクチンの製造に有用であると当該技術分野で認識されているものである。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化断片が担体タンパク質またはその断片と融合される場合、グリコシル化断片、したがって融合タンパク質は、本明細書中いずれかの箇所で記載される保存セリン残基でグリコシル化され得る。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃ断片、コレラ毒素Ｂサブユニット、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはそれらの断片からなる群より選択される担体タンパク質を含む。ある特定の実施形態において、担体タンパク質またはその断片は、アミノ酸リンカー、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２３、式中、ｎは少なくとも１である）、またはＡＡＡ（配列番号２４）を介して、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化に連結されている。ＣｏｍＰ融合タンパク質の潜在的免疫原性を上昇させる目的で、１つより多いグリコシル化タグを含ませることが有利である場合がある。したがって、ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、８以上、１０以上、１５以上、または２０以上のＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグ断片を含む。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０のうちのいずれかから３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２５のうちのいずれかまでのＣｏｍＰタンパク質のグリコシル化タグ断片を含む。ある特定の実施形態において、複数のグリコシル化は、融合タンパク質中互いに直列に配置される。ある特定の実施形態において、複数のグリコシル化タグ断片は、融合タンパク質中互いに離れて配置され、例えば、担体タンパク質の配列によって隔てられている。ある特定の実施形態において、グリコシル化タグ（複数可）は、例えば、担体タンパク質及び／または融合タンパク質のＮ末端に位置することができる。ある特定の実施形態において、グリコシル化タグ（複数可）は、例えば、担体タンパク質及び／または融合タンパク質のＣ末端に位置することができる。ある特定の実施形態において、グリコシル化タグ（複数可）は、例えば、担体タンパク質及び／または融合タンパク質内で内側に位置することができ、グリコシル化タグ断片は、融合タンパク質中の複数の担体タンパク質の間に位置する。ある特定の実施形態において、複数の担体タンパク質は、タイプが同じであることもタイプが異なることも可能である。ある特定の実施形態において、グリコシル化タグは、タイプが同じであることもタイプが異なることも可能である。ある特定の実施形態において、これらのＣｏｍＰグリコシル化タグは、同一である。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグのうち少なくとも２つは、互いに異なっている。ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグのうち少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つは、全てお互いに異なっている。さらに、ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグのどれ１つとして同一ではない。
本発明のバイオコンジュゲートは、多数の用途のうちの１つに使用することができ、そのような用途としてコンジュゲートワクチンとしての使用が挙げられるが、これに限定されない。例えば、ある特定の実施形態において、コンジュゲートワクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型５、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型７Ｆ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｎ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型９Ｖ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１０Ａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１１Ａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１２Ｆ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１５Ｂ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１７Ｆ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１８Ｃ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ｆ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型１９Ａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２０、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２２Ｆ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型２３Ｆ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型３３Ｆ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型Ｋ１、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型Ｋ２、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型Ｋ５、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型Ｋ１６、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型Ｋ２０、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型Ｋ５４、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型Ｋ５７、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型Ｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型Ｉｂ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型ＩＩ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型ＩＩＩ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型ＩＶ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型Ｖ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型ＶＩ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型ＶＩＩ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型ＶＩＩＩ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ血清型ＩＸ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓグループＡ炭水化物、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ血清型Ａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ血清型Ｂ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ血清型Ｃ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ血清型Ｄ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ莢膜多糖及びリポテイコ酸、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓリポオリゴ糖Ａ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓリポオリゴ糖Ｂ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓリポオリゴ糖Ｃ、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓリポテイコ酸に対するワクチンである。ある特定の実施形態において、コンジュゲートワクチンは、対象に投与された場合に免疫応答を誘導するから、有用である。ある特定の実施形態において、免疫応答は、長期記憶（メモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞）を誘発し、抗体応答であり、及び任意選択で、血清型特異的抗体応答である。ある特定の実施形態において、抗体応答は、ＩｇＧ応答またはＩｇＭ応答である。例えば、ある特定の実施形態において、抗体応答は、ＩｇＧ応答であることが可能であり、ある特定の実施形態においては、ＩｇＧ１応答であることが可能である。ある特定の実施形態において、コンジュゲートワクチンは、ワクチンを投与された対象において免疫記憶を生成する。
本明細書中提供されるのは、本明細書中いずれかの箇所でさらに詳細に開示されるとおりの融合タンパク質であり、この融合タンパク質は本明細書中いずれかの箇所で詳細に開示されるとおりのＣｏｍＰグリコシル化タグを含む。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、グリコシル化タグ上の配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に相当するセリン残基でグリコシル化される。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、オリゴ糖または多糖でグリコシル化される。ある特定の実施形態において、オリゴ糖または多糖は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌により産生され、例えば、Ｓ． ｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ． ｓｕｉｓの莢膜多糖である。ある特定の実施形態において、莢膜多糖は、ＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである。ある特定の実施形態において、オリゴ糖または多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌により産生され、例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの莢膜多糖である。ある特定の実施形態において、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜多糖である。ある特定の実施形態において、多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２莢膜多糖である。本明細書中開示されるいずれかの実施形態のある特定のものにおいて、オリゴ糖または多糖は、その還元末端にグルコースを含む。ある特定の実施形態は、融合タンパク質に関し、この融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで産生される。例えば、ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、哺乳類細胞、真菌細胞、酵母菌細胞、昆虫細胞、トリ細胞、藻類細胞、または細菌細胞で産生される。ある特定の実施形態において、融合タンパク質は、細菌細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉで産生される。
本明細書中開示されるのは、オリゴ糖または多糖とポリペプチドとのｉｎ ｖｉｖｏコンジュゲーション（ｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化）法である。ある特定の実施形態において、本方法は、ＰｇｌＳオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）（本明細書中いずれかの箇所で記載される）を用いて、オリゴ糖または多糖をポリペプチドに共有結合させることを含む。ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグを含む。ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、担体タンパク質などの異種ポリペプチドに連結されたＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグを含む。ＰｇｌＳＯＴアーゼの例として、ＰｇｌＳ１１０２６４、ＰｇｌＳＡＤＰ１、ＰｇｌＳＧＦＪ－２、ＰｇｌＳ５０ｖ１、ＰｇｌＳ４４６６、及びＰｇｌＳＳＦＣが挙げられるが、これらに限定されない。ＣｏｍＰタンパク質は、いずれかの箇所で詳細に記載されており、代表例として、ＣｏｍＰ１１０２６４、ＣｏｍＰＡＤＰ１、ＣｏｍＰＧＦＪ－２、ＣｏｍＰ５０ｖ１、ＣｏｍＰ４４６６、及びＣｏｍＰＳＦＣが挙げられるが、これらに限定されない。当然のことながら、ある生物由来のＰｇｌＳＯＴアーゼは、その生物由来のＣｏｍＰタンパク質を天然にグリコシル化する（例えば、ＰｇｌＳ１１０２６４が、ＣｏｍＰ１１０２６４をグリコシル化する）可能性があるものの、ある特定の実施形態において、ある種の生物由来のＰｇｌＳは、異なる生物由来のＣｏｍＰをグリコシル化する（例えば、ＰｇｌＳＡＤＰ１が、ＣｏｍＰ１１０２６４をグリコシル化する）。例えば、ある特定の態様において、ＰｇｌＳＯＴアーゼは、ＰｇｌＳＡＤＰ１である。ＰｇｌＳＯＴアーゼがＰｇｌＳＡＤＰ１である特定の実施形態において、グリコシル化されたＣｏｍＰタンパク質は、ＣｏｍＰＡＤＰ１ではない。例えば、ＰｇｌＳＯＴアーゼがＰｇｌＳＡＤＰ１である特定の実施形態において、ＣｏｍＰタンパク質は、ＣｏｍＰ１１０２６４である。もちろん、当然のことながら、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグ断片が異種担体タンパク質に連結されている場合、ＰｇｌＳＯＴアーゼは、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグ断片が、ＰｇｌＳＯＴアーゼと同じ生物由来であったとしても、それらを天然にグリコシル化することはない。
ＰｇｌＳとＣｏｍＰのいずれかの組み合わせに関するある特定の実施形態において、ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグ断片は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に相当するセリン残基でグリコシル化される。
本明細書中開示されるある特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化は、宿主細胞中で起こる。ある特定の実施形態において、例えば、宿主細胞は、哺乳類細胞、真菌細胞、酵母菌細胞、昆虫細胞、トリ細胞、藻類細胞、または細菌細胞が可能である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、細菌細胞、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉである。
ある特定の実施形態において、本方法は、オリゴ糖または多糖をポリペプチドに結合させるのに必要な構成要素を含む宿主細胞を培養することを含む。一般に、そのような構成要素とは、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、グリコシル化されるアクセプターポリペプチド、及びオリゴ糖または多糖である。ある特定の実施形態において、本方法は、以下を含む宿主細胞を培養することを含む：（ａ）オリゴ糖または多糖の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター、（ｂ）ＰｇｌＳＯＴアーゼ、及び（３）アクセプターポリペプチド。さらに、オリゴ糖または多糖の産生が、転写アクチベーターにより向上可能であることが発見されている。ある特定の実施形態において、オリゴ糖または多糖の産生は、Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ転写アクチベーターｒｍｐＡ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＴＵＨ Ｋ－２０４４）またはＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ転写アクチベーターｒｍｐＡ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＴＵＨ Ｋ－２０４４）のホモログにより向上する。ある特定の実施形態において、本方法は、さらに、宿主細胞に、他の構成要素と合わせて、そのような転写アクチベーターを発現させる及び／または提供することを含む。
ある特定の実施形態において、ＣｏｍＰグリコシル化タグに連結される担体タンパク質は、例えば、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃ断片、コレラ毒素Ｂサブユニット、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄ、またはその断片である。
ある特定の実施形態は、本開示のバイオコンジュゲートを含むコンジュゲートワクチン、または当該コンジュゲートワクチンの製造法に関する。
ある特定の実施形態は、アクセプターＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグ断片をｉｎ ｖｉｖｏグリコシル化するための構成要素を含む宿主細胞も提供する。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、以下を含む：（ａ）オリゴ糖または多糖の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター、（ｂ）ＰｇｌＳＯＴアーゼ、及び（３）ＣｏｍＰタンパク質またはそのグリコシル化タグ断片を含むアクセプターポリペプチド。ある特定の実施形態において、アクセプターポリペプチドは、融合タンパク質である。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、さらに、上記したものなどの転写アクチベーターを、他の構成要素と合わせて含む。
ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＰｇｌＳＯＴアーゼをコードする単離核酸を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＣｏｍＰアクセプターポリペプチドをコードする単離核酸を含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、オリゴ糖または多糖の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスターを含む。ある特定の実施形態において、宿主細胞は、ＰｇｌＳＯＴアーゼをコードする単離核酸、ＣｏｍＰアクセプターポリペプチドをコードする単離核酸、及びオリゴ糖または多糖の合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスターのうち少なくとも２つを含む。実施形態態様において、宿主細胞は、１種の生物のＰｇｌＳＯＴアーゼをコードする核酸及び異なる生物由来のＣｏｍＰアクセプターポリペプチドをコードする核酸を含む。
ある特定の実施形態は、本明細書中いずれかの箇所で記載されるＣｏｍＰタンパク質、ＣｏｍＰグリコシル化タグ断片、及び／またはＣｏｍＰ融合タンパク質をコードする単離核酸も提供する。ある特定の実施形態において、本明細書中称される単離核酸とは、ベクターであるか、ベクター内に含まれている。ある特定の実施形態において、本明細書中称される単離核酸は、異種ゲノムまたはゲノムの異種領域に挿入される及び／または組み込まれている。
本明細書中開示されるのは、従来のワクチン担体を含む肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンである。ある特定の実施形態は、グリコシル化タグ（別名「グリコタグ」）としてのＣｏｍＰ断片の使用を含む。ある特定の実施形態において、グリコシル化タグは、担体タンパク質のＣ末端及び／またはＮ末端に付加することができる。例えば、ある特定の実施形態において、従来の担体タンパク質であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）のＣ末端にグリコタグが付加される。ある特定の実施形態において、グリコシル化タグ／担体融合タンパク質は、ＣＰＳ８多糖及びＰｇｌＳの使用と組み合わせて、その種の肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンとしては初めての担体タンパク質－ＣＰＳ８バイオコンジュゲートを生成できることが実証された。例えば、ある特定の実施形態において、ＥＰＡ融合物をＣＰＳ８多糖及びＰｇｌＳの使用と組み合わせて、ＥＰＡ－ＣＰＳ８バイオコンジュゲートを生成することができる。ＥＰＡ－ＣＰＳ８バイオコンジュゲートワクチンは、殺菌性殺傷によって決定されたように保護的である血清型８特異的に特異的な高いＩｇＧ力価を誘発することが実証された。重要なことに、ＥＰＡ－ＣＰＳ８バイオコンジュゲート中の１００ｎｇの多糖をワクチン接種することで、保護を提供することができた。したがってある特定の実施形態は、ＣＰＳ８肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを提供する。
コンジュゲートワクチン（ＥＰＡワクチン構築物など）は、包括的な肺炎球菌バイオコンジュゲートワクチンを開発するために、グリカン対タンパク質比を増加させるだけでなく、血清型の数を拡大するためのグリコシル化の追加／複数部位を含むことができると考えられる。
ある特定の実施形態において、本明細書中開示されるバイオコンジュゲートまたはグリコシル化融合タンパク質は、感染症及び／または疾患の予防及び／または治療のために対象に投与することができるコンジュゲートワクチンである。ある特定の実施形態において、コンジュゲートワクチンは、例えば、感染症及び／または疾患に対して対象を免疫するために使用することができる予防法である。ある特定の実施形態において、バイオコンジュゲートは、（治療組成物などで）アジュバントに関連し、及び／またはアジュバントとともに投与されている。ある特定の実施形態は、本明細書中記載されるコンジュゲートワクチン及びアジュバントを含む組成物（治療組成物など）を提供する。ある特定の実施形態において、コンジュゲートワクチンが対象に投与されると、それは免疫応答を誘導する。ある特定の実施形態において、免疫応答は長期記憶（メモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞）を誘発する。ある特定の実施形態において、免疫は抗体応答である。ある特定の実施形態において、抗体反応は、血清型特異的抗体応答である。ある特定の実施形態において、抗体応答はＩｇＧまたはＩｇＭ応答である。抗体応答がＩｇＧ応答である特定の実施形態において、ＩｇＧ応答はＩｇＧ１応答である。さらに、ある特定の実施形態において、コンジュゲートワクチンは、ワクチンを投与された対象において免疫記憶を生成する。
ある特定の実施形態は、感染症及び／または疾患に対するワクチンの製造を提供する。ある特定の実施形態において、方法は、本明細書中開示されるバイオコンジュゲートまたは融合タンパク質（コンジュゲートワクチン）を単離し、コンジュゲートワクチンをアジュバントと組み合わせることを含む。ある特定の実施形態において、感染症は、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の局所または全身性感染症であるか、あるいは性質的に自己免疫である。ある特定の実施形態において、ワクチンは肺炎球菌感染症に対するコンジュゲートワクチンである。ある特定の実施形態において、疾患は肺炎である。ある特定の実施形態において、感染症は、全身性感染症及び／または血液感染症である。ある特定の実施形態において、対象は、哺乳類である。例えば、ある特定の実施形態において、ブタまたはヒトである。
重要なことは、本明細書中開示される態様は、肺炎球菌多糖に限定されず、実際、ＰｇｌＢ及びＰｇｌＬと適合しない多くの重要なヒト及び動物の病原体に対するバイオコンジュゲートワクチンを生成するための広範な適用性を有する。注目すべき例としては、ヒトの病原体であるＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとＢ群連鎖球菌、及びブタの病原体であるＳ． ｓｕｉｓがあり、利用可能な認可されたワクチンがない、非常に関連性の高い全ての病原体が含まれる。
本明細書中提供されるのは、病原体に対する宿主免疫応答を誘導する方法である。ある特定の実施形態において、病原体は病原性微生物である。ある特定の実施形態において、宿主は病原体に対して免疫されている。ある特定の実施形態において、方法は、免疫応答を必要とする対象に、有効量のＣｏｍＰコンジュゲートワクチン、グリコシル化融合タンパク質、または本明細書中開示される任意の他の治療／免疫原性組成物を投与することを含む。ある特定の実施形態は、病原性微生物に対する宿主免疫応答の誘導及び病原性微生物に対する免疫化に使用するための、本明細書中開示されるコンジュゲートワクチン、グリコシル化融合タンパク質、または他の治療／免疫原性組成物を提供する。免疫応答の例として、先天性応答、適応応答、体液性応答、抗体応答、細胞媒介性応答、Ｂ細胞応答、Ｔ細胞応答、サイトカインの上方制御または下方制御、免疫系クロストーク、及び上記免疫応答の２つ以上の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、免疫応答は抗体応答である。ある特定の実施形態において、免疫応答は、先天性応答、体液性応答、抗体応答、Ｔ細胞応答、または上記免疫応答の２つ以上の組み合わせである。
同じく本明細書中提供されるのは、本明細書中開示されるコンジュゲートワクチン、融合タンパク質、または組成物を必要とする対象に投与することを含む、対象における細菌性疾患及び／または感染症を予防または治療する方法である。ある特定の実施形態において、感染症は、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の局所的または全身的な感染症であるか、または本質的に自己免疫性である。ある特定の実施形態において、疾患は肺炎である。ある特定の実施形態において、感染症は、全身感染症及び／または血液の感染症である。本明細書中開示されるある特定の実施形態において、対象は脊椎動物である。ある特定の実施形態において、対象は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、モルモット、サル、類人猿などの哺乳動物である。そして、例えば、ある特定の実施形態において、哺乳動物はヒトである。
本明細書中開示される投与の実施形態のいずれにおいても、組成物は、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与される。
実施例１．ＣｏｍＰ中のグリコシル化部位に隣接するシステイン残基がＣｏｍＰ安定性及びグリコシル化に寄与しているかどうかの判定。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１由来のＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰＡＤＰ１）及びＡ． ｓｏｌｉの１１０２６４株由来のＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ１１０２６４）が、Ｏ結合型ＯＴアーゼＰｇｌＳにより、それぞれ８４位及び８２位に位置する相同セリン残基でグリコシル化されることが、以前に実証された（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｈｏｓｔ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：８９１）。具体的には、ＣｏｍＰＡＤＰ１のＳ８４Ａ点変異体及びＣｏｍＰ１１０２６４のＳ８２Ａ点変異体は、ＰｇｌＳによる血清型８肺炎球菌莢膜多糖でのグリコシル化ができないことが示された。ＰｇｌＳ依存性グリコシル化に重要な他のアミノ酸の役割をさらに分析するため、点変異体をシリーズで生成させ、ＣｏｍＰＡＤＰ１の７５位及び９５位に位置するグリコシル化部位に隣接する保存システイン残基を改変した（図１Ａ）。
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１由来のＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰＡＤＰ１）及びＡ． ｓｏｌｉの１１０２６４株由来のＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ１１０２６４）が、Ｏ結合型ＯＴアーゼＰｇｌＳにより、それぞれ８４位及び８２位に位置する相同セリン残基でグリコシル化されることが、以前に実証された（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｈｏｓｔ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：８９１）。具体的には、ＣｏｍＰＡＤＰ１のＳ８４Ａ点変異体及びＣｏｍＰ１１０２６４のＳ８２Ａ点変異体は、ＰｇｌＳによる血清型８肺炎球菌莢膜多糖でのグリコシル化ができないことが示された。ＰｇｌＳ依存性グリコシル化に重要な他のアミノ酸の役割をさらに分析するため、点変異体をシリーズで生成させ、ＣｏｍＰＡＤＰ１の７５位及び９５位に位置するグリコシル化部位に隣接する保存システイン残基を改変した（図１Ａ）。
点変異体のシリーズは、最初に、システイン７５をアラニンまたはグリシンいずれかで置き換えて生成させた。というのも、これらの変異体が、システイン７５とシステイン９５の間に形成される可能性があるジスルフィド結合の形成をブロックすると思われるからである。次いで、点変異体を、Ｃ． ｊｅｊｕｎｉ七糖生合成遺伝子クラスター及びＰｇｌＳＡＤＰ１を同時発現するＥ． ｃｏｌｉ ＳＤＢ１に導入した。図１Ｂに見られるとおり、システイン７５の変異は、野生型（ＷＴ）ＣｏｍＰに比べてＣｏｍＰタンパク質変異体の発現を顕著に低下させた。詳細には、Ｃ７５Ａ変異体及びＣ７５Ｇ変異体は、非常に低いレベルのタンパク質発現を呈し、低分子量非グリコシル化形としてのみ存在するように見受けられた。次に、点変異体の２番目のシリーズを、システイン９５をアラニン、グリシン、またはセリンいずれかで置き換えて生成させ、次いで、再びこれら変異体ＣｏｍＰ構築物をＣ． ｊｅｊｕｎｉ七糖生合成遺伝子クラスター及びＰｇｌＳＡＤＰ１を同時発現するＥ． ｃｏｌｉ ＳＤＢ１に導入した。図１Ｂに見られるとおり、システイン９５の代わりにアラニン、グリシン、またはセリンいずれかを持つＣｏｍＰｊ変異体は、検出不能だった。最後に、システイン７５をアラニンまたはグリシンに及びシステイン９５をアラニン、グリシン、またはセリンにする全通りの組み合わせからなる二重点変異体のシリーズを生成させた。図１Ｂに見られるとおり、ＣｏｍＰ二重変異体は、検出不能だった。様々なＣｏｍＰ点変異体バリアントに関して検出可能な発現が欠けていたことに基づくと、７５位及び９５位に位置するシステイン残基は、セリン８４のグリコシル化部位に隣接するジスルフィド結合を形成する可能性が高い。このジスルフィド結合の形成をブロックすることは、タンパク質安定性及びタンパク質グリコシル化にとって有害であるように見受けられる。
実施例２．短縮クローニング（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｃｌｏｎｉｎｇ）戦略による、短いＰｇｌＳ依存性Ｏ結合型認識モチーフの決定。
最初の２８アミノ酸を欠いたＣｏｍＰ１１０２６４（本明細書中ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４と称する）をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来外毒素Ａタンパク質（ＥＰＡ）の遺伝子不活化バリアントのＣ末端に融合させて含有する翻訳融合物は、ＰｇｌＳにより、複数の肺炎球菌及びＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜多糖で効率的にグリコシル化されることが実証された（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｈｏｓｔ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：８９１；Ｆｅｌｄｍａｎ ＭＦ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ）。ＰｇｌＳ依存性グリコシル化に必要な最小限の認識部位まで短縮しそれを定義する目的で、ＣｏｍＰ１１０２６４断片をＥＰＡタンパク質のＣ末端においてグリシン－グリシン－グリシン－セリン（ＧＧＧＳ）リンカーとヘキサヒスチジンタグの間に翻訳融合する短縮クローニング戦略を追求した（図２）。具体的には、ＣｏｍＰ１１０２６４の２５、３０、３５、４０、または４５アミノ酸断片のいずれかを含有する複数の構築物を生成させた。各断片を、大きさに関係なく、ＣｏｍＰ１１０２６４の終止コドンに向かって１アミノ酸ずつ移動させた。例として、第一の構築物は、残基６７番～９１番にわたるＣｏｍＰ１１０２６４の２５アミノ酸断片を含有しており、第二の構築物は、残基６８番～９２番にわたるＣｏｍＰ１１０２６４の２５アミノ酸断片を含有しており、第三の構築物は、残基６９番～９３番にわたるＣｏｍＰ１１０２６４の２５アミノ酸断片を含有していたなどである。全ての断片は、ＰｇｌＳグリコシル化部位であるセリン８２を含有していた。次いで、ＥＰＡ融合構築物を、ＰｇｌＳＡＤＰ１及び肺炎球菌ＣＰＳ８を同時発現するＥ． ｃｏｌｉ ＳＤＢ１に導入した。
最初の２８アミノ酸を欠いたＣｏｍＰ１１０２６４（本明細書中ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４と称する）をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来外毒素Ａタンパク質（ＥＰＡ）の遺伝子不活化バリアントのＣ末端に融合させて含有する翻訳融合物は、ＰｇｌＳにより、複数の肺炎球菌及びＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ莢膜多糖で効率的にグリコシル化されることが実証された（Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＭ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｕｓｉｎｇ Ｅ． ｃｏｌｉ ａｓ ａ ｈｏｓｔ． Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：８９１；Ｆｅｌｄｍａｎ ＭＦ， ｅｔ ａｌ． （２０１９） Ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ）。ＰｇｌＳ依存性グリコシル化に必要な最小限の認識部位まで短縮しそれを定義する目的で、ＣｏｍＰ１１０２６４断片をＥＰＡタンパク質のＣ末端においてグリシン－グリシン－グリシン－セリン（ＧＧＧＳ）リンカーとヘキサヒスチジンタグの間に翻訳融合する短縮クローニング戦略を追求した（図２）。具体的には、ＣｏｍＰ１１０２６４の２５、３０、３５、４０、または４５アミノ酸断片のいずれかを含有する複数の構築物を生成させた。各断片を、大きさに関係なく、ＣｏｍＰ１１０２６４の終止コドンに向かって１アミノ酸ずつ移動させた。例として、第一の構築物は、残基６７番～９１番にわたるＣｏｍＰ１１０２６４の２５アミノ酸断片を含有しており、第二の構築物は、残基６８番～９２番にわたるＣｏｍＰ１１０２６４の２５アミノ酸断片を含有しており、第三の構築物は、残基６９番～９３番にわたるＣｏｍＰ１１０２６４の２５アミノ酸断片を含有していたなどである。全ての断片は、ＰｇｌＳグリコシル化部位であるセリン８２を含有していた。次いで、ＥＰＡ融合構築物を、ＰｇｌＳＡＤＰ１及び肺炎球菌ＣＰＳ８を同時発現するＥ． ｃｏｌｉ ＳＤＢ１に導入した。
図３に見て取れるとおり、ＣｏｍＰ１１０２６４の２５アミノ酸の短い断片を含有する構築物３種について、ウエスタンブロットにより分析した場合、電気泳動移動度の低下及び複数のグリコフォームの存在（非グリコシル化タンパク質より上の梯子様分布として観察される）により特定されるとおり、ＰｇｌＳＡＤＰ１により肺炎球菌ＣＰＳ８でグリコシル化されることがわかった。陽性対照として、ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４断片を含有するＥＰＡ融合物を含めた。というのも、このタンパク質は、既に、ＰｇｌＳＡＰＤ１によりＣＰＳ８でグリコシル化されることが確立されているからである。特筆すべきは、３種の２５アミノ酸構築物だけがグリコシル化されることがわかった：Ｃ１（配列番号３２）、Ｄ１（配列番号３３）、及びＥ１（配列番号３４）である。これらは全て、ＣｏｍＰ１１０２６４グリコシル化部位（セリン８２）に隣接してジスルフィド結合を形成することが予測される保存システイン残基を含有していた。
図３及び図４に見て取れるとおり、ＣｏｍＰ１１０２６４の３０アミノ酸の断片を含有する構築物７種について、ＰｇｌＳＡＤＰ１により肺炎球菌ＣＰＳ８でグリコシル化されることがわかった：Ｅ２（配列番号４１）、Ｆ２（配列番号４２）、Ｇ２（配列番号４３）、Ｈ２（配列番号４４）、Ａ３（配列番号４５）、Ｂ３（配列番号４６）、Ｃ３（配列番号４７）である。７種の構築物は全て、ＣｏｍＰ１１０２６４グリコシル化部位に隣接してジスルフィド結合を形成することが予測される保存システイン残基を含有していた。
図５及び図６に見て取れるとおり、ＣｏｍＰ１１０２６４の３５アミノ酸の断片を含有する構築物９種について、ＰｇｌＳＡＤＰ１により肺炎球菌ＣＰＳ８でグリコシル化されることがわかった：Ｄ４（配列番号５５）、Ｅ４（配列番号５６）、Ｆ４（配列番号５７）、Ｇ４（配列番号５８）、Ａ５（配列番号５９）、Ｂ５（配列番号６０）、Ｄ５（配列番号６１）、Ｅ５（配列番号６２）、Ｆ５（配列番号６３）である。９種の構築物は全て、ＣｏｍＰ１１０２６４グリコシル化部位に隣接してジスルフィド結合を形成することが予測される保存システイン残基を含有していた。
図６及び図７に見て取れるとおり、ＣｏｍＰ１１０２６４の４０アミノ酸の断片を含有する構築物８種について、ＰｇｌＳＡＤＰ１により肺炎球菌ＣＰＳ８でグリコシル化されることがわかった：Ｈ６（配列番号７２）、Ｂ７（配列番号７３）、Ｃ７（配列番号７４）、Ｄ７（配列番号７５）、Ｅ７（配列番号７６）、Ｆ７（配列番号７７）、Ａ８（配列番号７８）、Ｂ８（配列番号７９）である。８種の構築物は全て、ＣｏｍＰ１１０２６４グリコシル化部位に隣接してジスルフィド結合を形成することが予測される保存システイン残基を含有していた。
図８、図９、及び図１０に見て取れるとおり、ＣｏｍＰ１１０２６４の４５アミノ酸の断片を含有する構築物１０種について、ＰｇｌＳＡＤＰ１により肺炎球菌ＣＰＳ８でグリコシル化されることがわかった：Ａ１０（配列番号９２）、Ｂ１０（配列番号９３）、Ｃ１０（配列番号９４）、Ｄ１０（配列番号９５）、Ｆ１０（配列番号９６）、Ｇ１０（配列番号９７）、Ｈ１０（配列番号９８）、Ａ１１（配列番号９９）、Ｂ１１（配列番号１００）、Ｃ１１（配列番号１０１）である。またしても、１０種の構築物は全て、ＣｏｍＰ１１０２６４グリコシル化部位に隣接してジスルフィド結合を形成することが予測される保存システイン残基を含有していた。
図３、図４、図５、図６、図７、図８、図９、及び図１０に示されるデータに基づくと、ＥＰＡ担体タンパク質のＣ末端に翻訳融合させた場合、７１位及び９３位に位置するシステイン残基は、ＰｇｌＳＡＤＰ１によるグリコシル化に必須である。また、１０４位に位置するメチオニン残基は、Ｃ末端グリコシル化タグの一部である場合、ＰｇｌＳＡＤＰ１によるグリコシル化をブロックするように見受けられる。これは、特に、構築物Ｇ５（配列番号６４）、Ｃ８（配列番号８０）、及びＤ１１（配列番号１０２）がそれぞれ、７１位及び９３位に必須のシステインを含有しているのに、グリコシル化の兆候をなにも提示しなかったという事実により裏付けられる。Ｇ５（配列番号６４）、Ｃ８（配列番号８０）、及びＤ１１（配列番号１０２）は、それぞれ、長さが３５、４０、及び４５アミノ酸のＣｏｍＰ１１０２６４断片を含有するものの、各断片は、１０４位のメチオニンが末端に存在しており、この残基がＣ末端グリコタグに含まれている場合、これがグリコシル化をブロックするのに十分であることを実証する。その上、７１位及び９３位のシステインに加えてメチオニン１０４を含有する構築物は全て、グリコシル化の兆候をなにも提示しなかった（Ｇ５（配列番号６４）、Ｈ５（配列番号６５）、Ｃ８（配列番号８０）、Ｄ８（配列番号８１）、Ｅ８（配列番号８２）、Ｆ８（配列番号８３）、Ｇ８（配列番号８４）、Ｈ８（配列番号８５）、Ａ９（配列番号８６）、Ｄ１１（配列番号１０２）、Ｅ１１（配列番号１０３）、Ｆ１１（配列番号１０４）、Ｈ１１（配列番号１０５）、Ａ１２（配列番号１０６）、Ｂ１２（配列番号１０７）、Ｃ１２（配列番号１０８）、Ｄ１２（配列番号１０９）、Ｅ１２（配列番号１１０）、Ｆ１２（配列番号１１１）、Ｇ１２（配列番号１１２）。表１に、ＰｇｌＳＡＤＰ１によるＯ結合型グリコシル化認識モチーフとして機能する能力について試験したＣｏｍＰ１１０２６４断片全ての一覧を提示する。
Ｏ結合型グリコシル化認識モチーフは、ＮもしくはＣ末端に直列で、またはＮ末端及びＣ末端に同時に、Ｎ末端で翻訳融合させた場合、ＰｇｌＳＡＤＰ１によりグリコシル化される可能性がある。上記に提示するデータに基づき、ＣｏｍＰ１１０２６４のＤ５（配列番号６１）断片を、追跡実験用に選択した。図１２Ａ及び図１２Ｂに概要を示すとおり、追跡実験により、Ｄ５（配列番号６１）断片またはその誘導体（Ｄ５’）を、Ｎ末端及びＣ末端に様々な組み合わせで翻訳融合させた。陽性対象として、ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４断片を含有するＥＰＡ融合物を含めた。というのも、このタンパク質は、既に、ＰｇｌＳＡＰＤ１によりＣＰＳ８でグリコシル化されることが確立されているからである。次いで、ＥＰＡ融合構築物を、ＰｇｌＳＡＤＰ１の存在下または不在下で、肺炎球菌ＣＰＳ８を同時発現するＥ． ｃｏｌｉ ＳＤＢ１に導入した。図１２Ｃに見られるとおり、ＥＰＡ－ＣｏｍＰ１１０２６４融合構築物は全て、肺炎球菌ＣＰＳ８でグリコシル化された。このことは、ＣｏｍＰ１１０２６４のＯ結合型グリコシル化認識モチーフは、複数の組み合わせでＮ末端またはＣ末端に翻訳融合させることが可能であり、それでもなおＰｇｌＳＡＤＰ１によりグリコシル化可能であることを示す。
実施例３．Ｃ末端に直列で融合させた二重ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４グリコシル化タグは、ＰｇｌＳＡＤＰ１によりグリコシル化される。Ｃ末端に直列で融合させた二重ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４グリコシル化タグを含有するＥＰＡ融合構築物を構築した。ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４グリコシル化タグは、グリシン－グリシン－グリシン－グリシン－セリン（ＧＧＧＳ）リンカー（配列番号２３）またはプロリン－アラニン－プロリン－アラニン－プロリン（ＰＡＰＡＰ）リンカー（配列番号２５）いずれかにより隔てられていた。どちらの構築物も、下流での精製を補助するためヘキサヒスチジンタグを含有していた。陽性対象として、ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４断片を含有するＥＰＡ融合物を含めた。というのも、このタンパク質は、既に、ＰｇｌＳＡＰＤ１によりＣＰＳ８でグリコシル化されることが確立されているからである。次いで、二重タグＥＰＡ融合構築物を、ＰｇｌＳＡＤＰ１の存在下または不在下で、肺炎球菌ＣＰＳ８を同時発現するＥ． ｃｏｌｉ ＳＤＢ１に導入した。図１３に見られるとおり、ＥＰＡバリアント７及びＥＰＡバリアント８はどちらも、ＰｇｌＳＡＤＰ１が存在する場合、肺炎球菌ＣＰＳ８でグリコシル化された。その上、グリコシル化は、非常に高分子量であるように見受けられ、免疫活性は２５０ｋＤａマーカーに近かった。
本開示は、本開示の個々の態様の単一の例示として意図される、記載された特定の態様または先行する実施例によって範囲が限定されるべきではなく、機能的に同等である任意の組成物または方法は、本開示の範囲内である。実際、示されたそれらのもの及び本明細書に記載されるものに加えて、本開示の様々な改変が、上述の説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
本明細書において言及される全ての刊行物及び特許出願は、各々個別の刊行物または特許出願が、参照により本明細書に組み入れられるように具体的かつ個別に示されているかのように、それと同程度まで、参照により本明細書に組み入れられる。
参照文献
Claims (103)
- 融合タンパク質と共有結合したオリゴ糖または多糖を含むバイオコンジュゲートであって、
前記融合タンパク質は、ＣｏｍＰタンパク質（ＣｏｍＰ）グリコシル化タグを含み、
前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の７１位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号２の９３位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方、または配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を含み、ならびに
前記融合タンパク質は、前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの配列番号２の８２位または配列番号１の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基において、オリゴ糖または多糖でグリコシル化されている、
前記バイオコンジュゲート。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するメチオニン残基を含まず、
任意選択で、前記バイオコンジュゲートの前記融合タンパク質は、前記ＣｏｍＰグリコシル化タグに関して、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するまたはおよそ相当する可能性がある位置のメチオニン残基を含まない、
請求項１に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記アミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない、請求項２に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが１８～５０アミノ酸長、長さが２１～４５アミノ酸長、または長さが２３～４５アミノ酸長である、請求項１から３のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ－２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）または配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ－２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）を含む、
請求項１から４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ－２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）または配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ－２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）を含む、
請求項１から４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、以下のアミノ酸コンセンサス配列：
Ｘ１は、Ｖ、Ａであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｔであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ５は、Ｐ、Ｓ、またはＱであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ｍ、またはＩであり、
Ｘ７は、Ｔ、Ｐ、またはＶであり、
Ｘ８は、Ａ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ１０は、Ｎであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、またはＡであり、
Ｘ１２は、ＳまたはＮであり、
Ｘ１４は、Ｖ、Ｔ、またはＡであり、
Ｘ１７は、Ｑ、Ｔ、またはＥであり、
Ｘ１８は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり、
Ｘ２０は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ２１は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２２は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２５は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ２８は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ３１は、ＡまたはＥであり、
Ｘ３２は、ＴまたはＳであり、
Ｘ３４は、Ｔ、Ｑ、またはＡであり、
Ｘ３６は、Ｇ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ３７は、Ａ、Ｇ、またはＤであり、
Ｘ３８は、Ｓ、Ｌ、またはＡであり、
Ｘ３９は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＴであり、
Ｘ４０は、Ａ、Ｖ、またはＧであり、
Ｘ４１は、Ｇ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ４２は、Ｑ、Ｔ、またはＩであり、
Ｘ４３は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、またはＬであり、及び
Ｘ４４は、Ｉ、Ｔ、またはＶである；
あるいはその断片、ただし前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記断片は、配列番号２７の１３位のシステイン残基、配列番号２７の３５位のシステイン残基、及び配列番号２７の２４位のセリン残基を含む；
あるいは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有する、配列番号２７のアミノ酸コンセンサス配列またはその断片のバリアント、
ただし、前記バリアントは、配列番号２７の１３位のシステイン残基、配列番号２７の３５位のシステイン残基、及び配列番号２７の２４位のセリン残基を維持している；
を含むまたはそれからなる、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、以下のアミノ酸コンセンサス配列：
Ｘ１は、Ｖ、Ａであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｔであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ５は、Ｐ、Ｓ、またはＱであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ｍ、またはＩであり、
Ｘ７は、Ｔ、Ｐ、またはＶであり、
Ｘ８は、Ａ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ１０は、Ｎであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、またはＡであり、
Ｘ１２は、ＳまたはＮであり、
Ｘ１４は、Ｖ、Ｔ、またはＡであり、
Ｘ１７は、Ｑ、Ｔ、またはＥであり、
Ｘ１８は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり、
Ｘ２０は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ２１は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２２は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２５は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ２８は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ３１は、ＡまたはＥであり、
Ｘ３２は、ＴまたはＳであり、
Ｘ３４は、Ｔ、Ｑ、またはＡであり、
Ｘ３６は、Ｇ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ３７は、Ａ、Ｇ、またはＤであり、
Ｘ３８は、Ｓ、Ｌ、またはＡであり、
Ｘ３９は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＴであり、
Ｘ４０は、Ａ、Ｖ、またはＧであり、
Ｘ４１は、Ｇ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ４２は、Ｑ、Ｔ、またはＩであり、
Ｘ４３は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、またはＬであり、及び
Ｘ４４は、Ｉ、Ｔ、またはＶである；
あるいはその断片、ただし前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記断片は、配列番号２７の１３位のシステイン残基、配列番号２７の３５位のシステイン残基、及び配列番号２７の２４位のセリン残基を含む；
を含むまたはそれからなる、請求項７に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない、請求項８に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記アミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２７の４４位に相当するアミノ酸残基より先に続かない、請求項９に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である、請求項８から１０のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、以下のアミノ酸コンセンサス配列：
Ｘ２は、Ｖ、Ｔ、またはＡであるか、任意選択でＶであり、
Ｘ５は、Ｑ、Ｔ、またはＥであるか、任意選択でＱであり、
Ｘ６は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり、
Ｘ８は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ９は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ１０は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ１３は、Ｎ、Ｓ、またはＡであるか、任意選択でＮであり、
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、またはＫであるか、任意選択でＡであり、
Ｘ１６は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ１９は、ＡまたはＥであるか、任意選択でＡであり、
Ｘ２０は、ＴまたはＳであるか、任意選択でＴであり、または
Ｘ２２は、Ｔ、Ｑ、またはＡであるか、任意選択でＴである；
あるいは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有する、そのバリアント、
ただし、前記バリアントは、配列番号２８の１位のシステイン残基、配列番号２８の２３位のシステイン残基、及び配列番号２８の１２位のセリン残基を維持している；
を含むまたはそれからなる、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない、請求項１２に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記アミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない、請求項１３に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である、請求項１２から１４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］；
あるいは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有する、そのバリアント、
ただし、前記バリアントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を維持しており、及び
前記バリアントは、配列番号１の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基を維持している；
を含むまたはそれからなる、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１６に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない、請求項１６または１７に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグのアミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない、請求項１８に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である、請求項１６から１９のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記オリゴ糖または多糖は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌により産生され、
任意選択で、前記多糖は、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ． ｓｕｉｓの莢膜多糖である、
請求項１から２１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記莢膜多糖は、ＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである、請求項２２に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記オリゴ糖または多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌により産生され、
任意選択で、前記多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの莢膜多糖である、
請求項１から２１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜多糖である、請求項１から２１のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２莢膜多糖である、請求項２５に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記オリゴ糖または多糖は、その還元末端にグルコースを含む、請求項１から２６のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記バイオコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｖｏで産生され、
任意選択で、細菌細胞で産生される、請求項１から２７のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記融合タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃ断片、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄからなる群より選択される担体タンパク質またはその断片を含む、請求項１から２８のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、前記融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、及び／または前記融合タンパク質内で内側に位置しており、
任意選択で、前記担体タンパク質またはその断片は、アミノ酸リンカーを介して前記グリコシル化タグと連結している、請求項２９に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記融合タンパク質は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、８つ以上、１０以上、１５以上、または２０以上のＣｏｍＰグリコシル化タグを含む、請求項１から３０のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０のいずれかの数から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２５のいずれかの数までのＣｏｍＰグリコシル化タグを含む、請求項１から３０のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、同一である、請求項３１または３２に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグのうち少なくとも２つは、互いに異なっており、
任意選択で、前記ＣｏｍＰグリコシル化タグのうち少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つは、全てが互いに異なっており、
任意選択で、前記ＣｏｍＰグリコシル化タグのどれ１つとして同じものはない、
請求項３１または３２に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記バイオコンジュゲートは、コンジュゲートワクチンであり、
任意選択で、前記コンジュゲートワクチンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型８に対するワクチンである、請求項１から３４のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記コンジュゲートワクチンは、対象に投与された場合に免疫応答を誘導する、請求項３５に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記免疫応答は、長期記憶（メモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞）を誘発し、抗体応答であり、及び任意選択で、血清型特異的抗体応答である、請求項３５または３６に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記抗体応答は、ＩｇＧ応答またはＩｇＭ応答である、請求項３７に記載のバイオコンジュゲート。
- 前記抗体応答は、ＩｇＧ応答であり、
任意選択で、ＩｇＧ１応答である、請求項３８に記載のバイオコンジュゲート。 - 前記コンジュゲートワクチンは、前記ワクチンが投与された対象において免疫記憶を生成する、請求項３５から３９のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲート。
- ＣｏｍＰタンパク質の単離断片を含むＣｏｍＰグリコシル化タグであって、前記断片は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基と、ならびに配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の７１位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号２の９３位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方、または配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方とを含む、
前記ＣｏｍＰグリコシル化タグ。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当するメチオニン残基を含まない、請求項４１に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記アミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない、請求項４２に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが１８～５０アミノ酸長、長さが２１～４５アミノ酸長、または長さが２３～４５アミノ酸長である、請求項４１から４３のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ－２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）または配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号７（ＣｏｍＰΔ２８ＡＤＰ１）、配列番号８（ＣｏｍＰΔ２８１１０２６４）、配列番号９（ＣｏｍＰΔ２８ＧＦＪ－２）、配列番号１０（ＣｏｍＰΔ２８Ｐ５０ｖ１）、配列番号１１（ＣｏｍＰΔ２８４４６６）、または配列番号１２（ＣｏｍＰΔ２８ＳＦＣ）を含む、
請求項４１から４４のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。 - 前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ－２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）または配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰタンパク質は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）、配列番号３（ＣｏｍＰＧＦＪ－２：ＡＰＶ３６６３８．１）、配列番号４（ＣｏｍＰ５０ｖ１：ＰＫＤ８２８２２．１）、配列番号５（ＣｏｍＰ４４６６：ＳＮＸ４４５３７．１）、または配列番号６（ＣｏｍＰＳＦＣ：ＯＡＬ７５９５５．１）を含む、
請求項４１から４４のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、以下のアミノ酸コンセンサス配列：
Ｘ１は、Ｖ、Ａであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｔであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ５は、Ｐ、Ｓ、またはＱであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ｍ、またはＩであり、
Ｘ７は、Ｔ、Ｐ、またはＶであり、
Ｘ８は、Ａ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ１０は、Ｎであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、またはＡであり、
Ｘ１２は、ＳまたはＮであり、
Ｘ１４は、Ｖ、Ｔ、またはＡであり、
Ｘ１７は、Ｑ、Ｔ、またはＥであり、
Ｘ１８は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり、
Ｘ２０は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ２１は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２２は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２５は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ２８は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ３１は、ＡまたはＥであり、
Ｘ３２は、ＴまたはＳであり、
Ｘ３４は、Ｔ、Ｑ、またはＡであり、
Ｘ３６は、Ｇ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ３７は、Ａ、Ｇ、またはＤであり、
Ｘ３８は、Ｓ、Ｌ、またはＡであり、
Ｘ３９は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＴであり、
Ｘ４０は、Ａ、Ｖ、またはＧであり、
Ｘ４１は、Ｇ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ４２は、Ｑ、Ｔ、またはＩであり、
Ｘ４３は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、またはＬであり、及び
Ｘ４４は、Ｉ、Ｔ、またはＶである；
あるいはその断片、ただし前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記断片は、配列番号２７の１３位のシステイン残基、配列番号２７の３５位のシステイン残基、及び配列番号２７の２４位のセリン残基を含む；
あるいは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有する、配列番号２７のアミノ酸コンセンサス配列またはその前記断片のバリアント、
ただし、前記バリアントは、配列番号２７の１３位のシステイン残基、配列番号２７の３５位のシステイン残基、及び配列番号２７の２４位のセリン残基を維持している；
を含むまたはそれからなる、請求項４１に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、以下のアミノ酸コンセンサス配列：
Ｘ１は、Ｖ、Ａであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２は、Ａ、Ｇ、Ｔであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ５は、Ｐ、Ｓ、またはＱであり、
Ｘ６は、Ｓ、Ｍ、またはＩであり、
Ｘ７は、Ｔ、Ｐ、またはＶであり、
Ｘ８は、Ａ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ｎ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ１０は、Ｎであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ１１は、Ｓ、Ｇ、またはＡであり、
Ｘ１２は、ＳまたはＮであり、
Ｘ１４は、Ｖ、Ｔ、またはＡであり、
Ｘ１７は、Ｑ、Ｔ、またはＥであり、
Ｘ１８は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり、
Ｘ２０は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ２１は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２２は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ２５は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ２６は、Ａ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ２８は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ３１は、ＡまたはＥであり、
Ｘ３２は、ＴまたはＳであり、
Ｘ３４は、Ｔ、Ｑ、またはＡであり、
Ｘ３６は、Ｇ、Ｓ、またはＴであり、
Ｘ３７は、Ａ、Ｇ、またはＤであり、
Ｘ３８は、Ｓ、Ｌ、またはＡであり、
Ｘ３９は、Ｓ、Ｇ、Ｄ、またはＴであり、
Ｘ４０は、Ａ、Ｖ、またはＧであり、
Ｘ４１は、Ｇ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ４２は、Ｑ、Ｔ、またはＩであり、
Ｘ４３は、Ｉ、Ｖ、Ｔ、またはＬであり、及び
Ｘ４４は、Ｉ、Ｔ、またはＶである；
あるいはその断片、ただし前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記断片は、配列番号２７の１３位のシステイン残基、配列番号２７の３５位のシステイン残基、及び配列番号２７の２４位のセリン残基を含む；
を含むまたはそれからなる、請求項４７に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない、請求項４８に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記アミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない、請求項４９に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である、請求項４８から５０のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、以下のアミノ酸コンセンサス配列：
Ｘ２は、Ｖ、Ｔ、またはＡであるか、任意選択でＶであり、
Ｘ５は、Ｑ、Ｔ、またはＥであるか、任意選択でＱであり、
Ｘ６は、Ｅ、Ｑ、またはＴであり、
Ｘ８は、Ｓ、Ｎ、Ａ、またはＧであり、
Ｘ９は、Ｓであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ１０は、Ｇであるか、またはアミノ酸がなく、
Ｘ１３は、Ｎ、Ｓ、またはＡであるか、任意選択でＮであり、
Ｘ１４は、Ａ、Ｓ、またはＫであるか、任意選択でＡであり、
Ｘ１６は、Ｔ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ１９は、ＡまたはＥであるか、任意選択でＡであり、
Ｘ２０は、ＴまたはＳであるか、任意選択でＴであり、または
Ｘ２２は、Ｔ、Ｑ、またはＡであるか、任意選択でＴである；
あるいは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有する、そのバリアント、
ただし、前記バリアントは、配列番号２８の１３位のシステイン残基、配列番号２８の３５位のシステイン残基、及び配列番号２８の１４位のセリン残基を維持している；
を含むまたはそれからなる、請求項４１に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない、請求項５２に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグの前記アミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない、請求項５３に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である、請求項５２から５４のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列：配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］；
あるいは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくは７つのアミノ酸置換、付加、及び／または削除を有する、そのバリアント、
ただし、前記バリアントは、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の７５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基と配列番号１の９５位の保存システイン残基に相当するシステイン残基の両方を維持しており、及び
前記バリアントは、配列番号１の８４位の保存セリン残基に相当するセリン残基を維持している；
を含む、またはそれからなる、請求項４１に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。 - 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項５６に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０４位の保存メチオニン残基に相当する位置にメチオニン残基を含まない、請求項５６または５７に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグのアミノ酸配列は、Ｃ末端方向において、配列番号２（ＣｏｍＰ１１０２６４：ＥＮＶ５８４０２．１）の１０３位に相当するアミノ酸残基より先に続かない、請求項５８に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、長さが２５、３０、４０、４５、または５０アミノ酸以下である、請求項５６から５９のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、配列番号３２［Ｃ１］、配列番号３３［Ｄ１］、配列番号３４［Ｅ１］、配列番号４１［Ｅ２］、配列番号４２［Ｆ２］、配列番号４３［Ｇ２］、配列番号４４［Ｈ２］、配列番号４５［Ａ３］、配列番号４６［Ｂ３］、配列番号４７［Ｃ３］、配列番号５５［Ｄ４］、配列番号５６［Ｅ４］、配列番号５７［Ｆ４］、配列番号５８［Ｇ４］、配列番号５９［Ａ５］、配列番号６０［Ｂ５］、配列番号６１［Ｄ５］、配列番号６２［Ｅ５］、配列番号６３［Ｆ５］、配列番号７２［Ｈ６］、配列番号７３［Ｂ７］、配列番号７４［Ｃ７］、配列番号７５［Ｄ７］、配列番号７６［Ｅ７］、配列番号７７［Ｆ７］、配列番号７８［Ａ８］、配列番号７９［Ｂ８］、配列番号９２［Ａ１０］、配列番号９３［Ｂ１０］、配列番号９４［Ｃ１０］、配列番号９５［Ｄ１０］、配列番号９６［Ｆ１０］、配列番号９７［Ｇ１０］、配列番号９８［Ｈ１０］、配列番号９９［Ａ１１］、配列番号１００［Ｂ１１］、及び配列番号１０１［Ｃ１１］からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４１に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ。
- 請求項４１から６１のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグを含む融合タンパク質であって、
任意選択で、前記融合タンパク質は、前記グリコシル化タグ上の、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６．１）の８４位のセリン残基に相当するセリン残基でグリコシル化される、
前記融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質は、オリゴ糖または多糖でグリコシル化され、及び前記オリゴ糖または多糖は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌により産生され、
任意選択で、前記多糖は、Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ． ａｇａｌａｃｔｉａｅ、またはＳ． ｓｕｉｓの莢膜多糖である、
請求項６２に記載の融合タンパク質。 - 前記莢膜多糖は、ＣＰＳ１４、ＣＰＳ８、ＣＰＳ９Ｖ、またはＣＰＳ１５ｂである、請求項６３に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、オリゴ糖または多糖でグリコシル化され、及び前記オリゴ糖または多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の細菌により産生され、
任意選択で、前記多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｖａｒｒｉｃｏｌａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｍｉｃｈｉｎｇａｎｅｎｉｓ、またはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａの莢膜多糖である、請求項６２に記載の融合タンパク質。 - 前記多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの莢膜多糖である、請求項６５に記載の融合タンパク質。
- 前記多糖は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清型Ｋ１または血清型Ｋ２莢膜多糖である、請求項６６に記載の融合タンパク質。
- 前記オリゴ糖または多糖は、その還元末端にグルコースを含む、請求項６２から６７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで産生され、
任意選択で、細菌細胞中で産生される、
請求項６２から６８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質は、ジフテリアトキソイドＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ（ＥＰＡ）、破傷風毒素Ｃ断片、コレラ毒素Ｂサブユニット、及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａタンパク質Ｄからなる群より選択される担体タンパク質またはその断片を含む、請求項６２から６９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、前記融合タンパク質のＮ末端、前記融合タンパク質のＣ末端、及び／または前記融合タンパク質内で内側に位置しており、
任意選択で、前記担体タンパク質またはその断片は、アミノ酸リンカーを介して前記グリコシル化タグと連結している、請求項７０に記載の融合タンパク質。 - 前記融合タンパク質は、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、８つ以上、１０以上、１５以上、または２０以上のＣｏｍＰグリコシル化タグを含む、請求項６２から７１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記融合タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または２０のいずれかの数から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または２５のいずれかの数までのＣｏｍＰグリコシル化タグを含む、請求項６２から７１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、同一である、請求項７２または７３に記載の融合タンパク質。
- 前記ＣｏｍＰグリコシル化タグのうち少なくとも２つは、互いに異なっており、
任意選択で、前記ＣｏｍＰグリコシル化タグのうち少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つは、全てが互いに異なっており、
任意選択で、前記ＣｏｍＰグリコシル化タグのどれ１つとして同じものはない、
請求項７２または７３に記載の融合タンパク質。 - オリゴ糖または多糖とアクセプターポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ結合法であって、前記方法は、ＰｇｌＳオリゴサッカリルトランスフェラーゼ（ＯＴアーゼ）を用いて、前記オリゴ糖または多糖と前記アクセプターポリペプチドを共有結合させることを含み、ただし、前記アクセプターポリペプチドは、請求項４１から６１のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグを含み、
任意選択で、前記ＣｏｍＰグリコシル化タグは、異種担体タンパク質に連結されている、
前記方法。 - 前記ＰｇｌＳＯＴアーゼは、ＰｇｌＳ１１０２６４、ＰｇｌＳＡＤＰ１、ＰｇｌＳＧＦＪ－２、ＰｇｌＳ５０ｖ１、ＰｇｌＳ４４６６、またはＰｇｌＳＳＦＣである、請求項７６に記載の方法。
- 前記オリゴ糖または多糖は、配列番号１（ＣｏｍＰＡＤＰ１：ＡＡＣ４５８８６３１）の８４位のセリン残基に相当するセリン残基で、前記ＣｏｍＰグリコシル化タグに連結される、請求項７６または７７に記載の方法。
- 前記ｉｎ ｖｉｖｏ結合は、宿主細胞中で起こる、請求項７６から７８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、細菌細胞である、請求項７９に記載の方法。
- 前記細菌宿主細胞は、Ｅ． ｃｏｌｉである、請求項８０に記載の方法。
- 以下（ａ）前記オリゴ糖または多糖を合成するのに必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター、（ｂ）ＰｇｌＳＯＴアーゼ、及び（３）前記アクセプターポリペプチド、を含む宿主細胞を培養することを含む、請求項７９から８１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記オリゴ糖または多糖の産生は、Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ転写アクチベーターｒｍｐＡ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＴＵＨ Ｋ－２０４４）またはＫ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ転写アクチベーターｒｍｐＡ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＮＴＵＨ Ｋ－２０４４）のホモログにより向上する、請求項７６から８２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記方法は、コンジュゲートワクチンを生成する、請求項７６から８３のいずれか１項に記載の方法。
- 以下：（ａ）オリゴ糖または多糖を合成するのに必要なタンパク質をコードする遺伝子クラスター、（ｂ）ＰｇｌＳＯＴアーゼ、及び（３）請求項４１から６１のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグを含むアクセプターポリペプチド、を含む、宿主細胞。
- 前記アクセプターポリペプチドは、融合タンパク質である、請求項８５に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、前記ＰｇｌＳＯＴアーゼをコードする核酸を含む、請求項８５または請求項８６に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、前記アクセプターポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項８５から８７のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項４１から６１のいずれか１項に記載のＣｏｍＰグリコシル化タグ及び／または請求項６２から７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする、単離核酸。
- 前記核酸は、ベクターである、請求項７８に記載の単離核酸。
- 請求項７８または７９に記載の単離核酸を含む、宿主細胞。
- 請求項３５から４０のいずれか１項に記載のコンジュゲートワクチンまたは請求項６２から７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質と、及びアジュバントとを含む、組成物。
- 病原性微生物に対する宿主免疫応答の誘導法であって、前記免疫応答を必要としている対象に、請求項３５から４０のいずれか１項に記載のコンジュゲートワクチン、請求項６２から７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項９２に記載の組成物を、有効量で投与することを含む、前記方法。
- 前記免疫応答は、抗体応答である、請求項９３に記載の方法。
- 前記免疫応答は、先天性応答、適応応答、体液性応答、抗体応答、細胞媒介性応答、Ｂ細胞応答、Ｔ細胞応答、サイトカインの上方制御または下方制御、免疫系クロストーク、及び前記免疫応答の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項９４に記載の方法。
- 前記免疫応答は、先天性応答、体液性応答、抗体応答、Ｔ細胞応答、及び前記免疫応答の２つ以上の組み合わせからなる群より選択される、請求項９５に記載の方法。
- 対象における細菌性疾患及び／または感染症の予防または治療法であって、予防または治療を必要としている対象に、請求項３５から４０のいずれか１項に記載のコンジュゲートワクチン、請求項６２から７５のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項９２に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
- 前記感染症は、皮膚、軟部組織、血液、または臓器の局所または全身性感染症、あるいは性質的に自己免疫である、請求項９７に記載の方法。
- 前記疾患は、肺炎である、請求項９７に記載の方法。
- 前記感染症は、全身性感染症及び／または血液の感染症である、請求項９８に記載の方法。
- 前記対象は、ヒトである、請求項９７から１００のいずれか１項に記載の方法。
- 前記組成物は、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または肺投与を介して投与される、請求項９７から１０１のいずれか１項に記載の方法。
- 肺炎球菌感染症に対する肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製造法であって、以下：
（ａ）請求項１から４０のいずれか１項に記載のバイオコンジュゲートまたは請求項６２から７５のいずれか１項に記載のグリコシル化融合タンパク質を単離すること、及び
（ｂ）前記単離したコンジュゲートワクチンまたは単離したグリコシル化融合タンパク質を、アジュバントと組み合わせること、
を含む、前記方法。
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