MX2012000045A - Composiciones y metodos para preparar composiciones inmunogenicas de conjugado de polisacarido capsular de serotipo 5 y 8 de staphylococcus aureus. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a conjugados inmunogénicos que comprenden polisacáridos capsulares de serotipo 5 y 8 de S. aureus conjugados con proteínas portadoras y métodos para su preparación y uso; los métodos para fabricar los conjugados inmunogénicos de la invención implican una conjugación covalente de los polisacáridos capsulares con las proteínas portadoras usando una química de conjugación que implica o bien 1 ,1-carboil-di-1,2,4-triazol (CDT) o bien 3-(2-piridilditio)-propio nil-hidrazida (PDPH).

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA PREPARAR COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS DE CONJUGADO DE POLISACÁRIDO CAPSULAR DE SEROTIPO 5 Y 8 DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de las Solicitudes de Patente Provisional de los Estados Unidos con n.os 61/219,143 y 61/219,151 , presentadas el 22 de junio de 2009, la totalidad de cada una de las divulgaciones de las cuales se incorporan por la presente que se incorpora por referencia en el presente documento en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere en general a composiciones inmunogénicas de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 y 8 de Staphylococcus aureus y métodos para su preparación y uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los seres humanos son un depósito natural para Staphylococcus aureus Gram positivas. Por ejemplo, S. aureus puede colonizar la piel, las fosas nasales y garganta, o bien permanentemente o bien de forma transitoria, sin dar lugar a enfermedad. Las infecciones por S. aureus varían entre infecciones de la piel leves y endocarditis, osteomielitis, bacteriemia y septicemia. S. aureus también da lugar a una mayoría de infecciones nosocomiales, y su prevalencia en infecciones de aparición en la comunidad va en aumento. Además, en 2005, las infecciones por S. aureus resistentes a meticilina (MRSA) se estimaron en 31.8 por 100,000 individuos, incluyendo 16,650 muertes en los Estados Unidos en 2005 (Klevens y col. (2007) J. Am. Med. Assoc. 298:1763 a 1771). Posteriormente tiene lugar la enfermedad cuando los individuos están immunocomprometidos debido a brechas en las barreras inmunitarias, tal como durante la cirugía, colocación de catéteres permanentes u otros dispositivos, traumatismo o heridas.

S. aureus produce un gran número de antígenos extra- y intracelulares, incluyendo numerosas toxinas y enzimas. De particular interés en el presente documento son los serotipos de polisacárido capsular de S. aureus (véase el documento de Karakawa & Vann, "Capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus", en: Weinsteín & Fields, eds. Seminars in Infectious Diseases. IV. Bacterial Vaccines. (Nueva York, NY¡ Thieme Stratton; 1982. págs. 285 a 293), especialmente polisacáridos capsulares de serotipo 5 y 8. Estudios epidemiológicos sobre un gran número de cepas de S. aureus aisladas a partir de individuos mostraron que de un 70 % a un 80 % fueron o bien polisacárido capsular de serotipo 5 o bien 8 (Arbeit y col. (1984) Diagn. Microbiol. Infecí. Dis. 2:85 a 91). Desafortunadamente, los polisacáridos capsulares son pobres inmunógenos por sí mismos.

Las infecciones y enfermedades por estafilococos aumentaron dramáticamente en los últimos veinte años, tal como lo ha hecho el uso de dispositivos intravasculares y de métodos invasivos. El aumento en incidencia de enfermedad es más preocupante debido a un aumento paralelo de resistencia a antibióticos; por lo tanto, hay una necesidad urgente de composiciones inmunogénicas para evitar infecciones y enfermedades por estafilococos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige hacia conjugados inmunogénicos que comprenden un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador, y a métodos para fabricar tales conjugados. Los polisacáridos capsulares de serotipo 5 u 8 de S. aureus pueden obtenerse directamente a partir de las bacterias usando unos métodos de aislamiento conocidos por los expertos en la técnica, pueden producirse usando protocolos de síntesis, o pueden producirse de forma recombinante usando unos métodos de ingeniería genética también conocidos por los expertos en la técnica. Además, la presente invención proporciona métodos para inducir una respuesta inmunitaria frente a una bacteria de estafilococo, métodos para prevenir una enfermedad causada por una bacteria de estafilococo, y métodos para reducir la gravedad de al menos un síntoma de una enfermedad causada por infección con una bacteria Staphylococcus.

En una modalidad, la invención comprende un conjugado de polisacárido-proteína inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de Staphylococcus aureus aislado conjugado con una proteína de portador, en el que el polisacárido tiene un peso molecular de entre 20 kDa y 1000 kDa. En algunas modalidades, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre 200 kDa y 5000 kDa. En una modalidad, la parte de polisacárido del conjugado inmunogénico tiene un intervalo de peso molecular de entre 70 kDa y 300 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un intervalo de peso molecular de entre 500 kDa y 2500 kDa.

En una modalidad, el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 tiene un grado de O-acetilación de entre un 10 y un 100 %. En una modalidad, el grado de O-acetilación es de entre un 50 y un 100 %. En una modalidad, el grado de O-acetilación es de entre un 75 y un 100 %. En una modalidad, el conjugado inmunogénico genera un anticuerpo que es funcional tal como se mide por la destrucción de bacterias o bien en un modelo de eficacia animal o bien a través de un ensayo de destrucción opsonofagocítica.

En una modalidad, la proteína de portador de conjugado inmunogénico comprende CRM197. En una modalidad, la CRMi97 se une covalentemente con el polisacárido a través de un enlace de carbamato, un enlace de amida, o ambos. En una modalidad, la razón molar de lisínas conjugadas con respecto a CRIv puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 25:1. En una modalidad, el conjugado comprende un enlace covalente entre CRM197 y polisacárido para al menos cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido. En una modalidad, el enlace entre la proteína de portador y el polisacárido tiene lugar en una de cada 5 unidades de repetición del polisacárido.

En una modalidad, el conjugado inmunogénico que comprende CRM197 comprende de 5 a 22 lisinas o de 8 a 15 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En una modalidad, el conjugado inmunogénico que comprende CRM197 comprende de 5 a 23 lisinas o de 8 a 12 lisinas con enlace covalente con el polisacárido.

En una modalidad, el conjugado inmunogénico comprende un polisacárido de tipo 5 u 8 que es 10 a 100 % O-Acetilado. En una modalidad, el conjugado inmunogénico comprende un polisacárido de tipo 5 u 8 que es 50 a 100 % O-Acetilado. En una modalidad, el conjugado inmunogénico comprende un polisacárido de tipo 5 u 8 que es 75 a 100 % O-Acetilado. En algunas modalidades, la composición inmunogénica puede usarse para generar unos anticuerpos que son funcionales en un modelo de eficacia animal o un ensayo de destrucción opsonofagocítica.

En una modalidad, el conjugado inmunogénico comprende menos de aproximadamente un 30 % de polisacárido libre de tipo 5 u 8 en comparación con la cantidad total de polisacárido de tipo 5 u 8.

En una modalidad, el conjugado inmunogénico comprende menos de aproximadamente un 20 % de polisacárido libre de tipo 5 u 8 en comparación con la cantidad total de polisacárido de tipo 5 u 8.

En una modalidad, la invención comprende una composición inmunogénica que comprende un conjugado inmunogénico tal como se describe en el presente documento y al menos uno de un adyuvante, diluyente, o portador.

El adyuvante puede ser un adyuvante basado en aluminio, tal como uno o más de fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio. En una modalidad, el adyuvante comprende fosfato de aluminio.

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende menos de aproximadamente un 30 % de polisacárido libre de tipo 5 u 8 en comparación con la cantidad total de polisacárido de tipo 5 u 8.

En una modalidad, la composición inmunogénica comprende menos de aproximadamente un 20 % de polisacárido libre de tipo 5 u 8 en comparación con la cantidad total de polisacárido de tipo 5 u 8.

En una modalidad, la invención comprende un método de inducción de una respuesta inmunitaria a un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de Staphylococcus aureus conjugado en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición inmunogénica tal como se describe en el presente documento.

En una modalidad, la invención comprende un método de producción de un conjugado de polisacárido-proteína inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de Staphylococcus aureus aislado conjugado con una proteína de portador, comprendiendo el método las etapas de: hacer que reaccione un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus aislado con 1 ,1-carbonil-di-(1 ,2,4-triazol) (CDT) en un disolvente orgánico para producir un polisacárido de serotipo 5 u 8 activado; y hacer que reaccione el polisacárido de serotipo 5 u 8 activado con una proteína de portador en un disolvente orgánico para producir un conjugado de polisacárido de serotipo 5 u 8-proteína de portador.

En una modalidad, el método de activación de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de Staphylococcus aureus además comprende liofilizar el polisacárido de serotipo 5 u 8 aislado y volver a suspender el polisacárido liofilizado en un disolvente orgánico. En una modalidad, el polisacárido resuspendido se activa y a continuación se hace que reaccione directamente con la proteína de portador. En una modalidad, el polisacárido de serotipo 5 u 8 aislado activado se aisla antes de hacer que reaccione con la proteína de portador. En una modalidad, el polisacárido de serotipo 5 u 8 aislado activado aislado se liofiliza para producir un polisacárido de serotipo 5 u 8 aislado activado liofilizado antes de hacer que reaccione el polisacárido con la proteína de portador. En una modalidad, el método de producción de un conjugado de polisacárido aislado-proteína de portador comprende una etapa de liofilización de la proteína de portador para producir una proteína de portador liofilizada antes de hacer que reaccione la proteína de portador con el polisacárido. En una modalidad, el método de producción de un conjugado de polisacárido aislado-proteína de portador comprende la etapa de volver a suspender el polisacárido de serotipo 5 u 8 aislado activado liofilizado y la proteína de portador liofilizada en un disolvente orgánico como parte de la reacción del polisacárido de serotipo 5 u 8 aislado activado con una proteína de portador.

En una modalidad, el método de producción de un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de S. aureus aislado-proteína de portador comprende la etapa de dilución de la mezcla de reacción de polisacárido activado y proteína de portador y mantener un pH de aproximadamente 8.8 a aproximadamente 9.2 durante al menos 4 horas a de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 26 °C.

En una modalidad, la mezcla de reacción de activado polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de S. aureus y proteína de portador se mantiene a un pH de aproximadamente 9.0 durante al menos 4 horas a aproximadamente 23 °C.

En una modalidad, el método de producción de un polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de S. aureus aislado-proteína de portador comprende la etapa de aislamiento del polisacárido de serotipo 5 u 8 aislado-proteína conjugado después de que éste se produce.

En una modalidad, el disolvente orgánico que se usa en el método de producción de un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de S. aureus aislado-proteína de portador es un disolvente aprótico polar. En una modalidad, el disolvente aprótico polar se selecciona del grupo que consiste en dimetilsulfóxido (DMSO), En una modalidad, el método de producción de un conjugado de polisacárido aislado-proteína de portador el disolvente orgánico es DMSO.

En una modalidad, el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 de S. aureus aislado-proteína de portador comprende la etapa de ajustar la concentración acuosa de la mezcla de reacción que comprende polisacárido capsular de tipo 5 y CDT en un disolvente orgánico a entre aproximadamente un 0.1 y un 0.3 %. En una modalidad, la concentración acuosa de la mezcla de reacción que comprende polisacárido capsular de tipo 5 y CDT en un disolvente orgánico se ajusta a aproximadamente un 0.2 %.

En una modalidad, la etapa de activación de polisacárido capsular de tipo 5 de S. aureus aislado comprende hacer que reaccione el polisacárido con aproximadamente una cantidad de CDT que tiene un exceso molar de 20 con respecto a la cantidad de polisacárido presente en la mezcla de reacción que comprende polisacárido capsular de tipo 5 y CDT en un disolvente orgánico.

En una modalidad, el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de tipo 8 de S. aureus aislado-proteína de portador comprende la etapa de determinación de la concentración acuosa de la mezcla de reacción que comprende polisacárido capsular de tipo 8. En una modalidad, la cantidad de CDT que se añade a la mezcla de reacción para activar el polisacárido se prevé en aproximadamente una cantidad de CDT que es equimolar con respecto a la cantidad de agua presente en la mezcla de reacción que comprende polisacárido capsular de tipo 8 y CDT en un disolvente orgánico.

En una modalidad, la cantidad de CDT que se añade a la mezcla de reacción para activar el polisacárido se prevé en aproximadamente una cantidad de CDT que tiene una razón molar de aproximadamente 0.5:1 en comparación con la cantidad de agua presente en la mezcla de reacción que comprende polisacárido capsular de tipo 8 y CDT en un disolvente orgánico. En una modalidad, la cantidad de CDT que se añade a la mezcla de reacción para activar el polisacárido se prevé en aproximadamente una cantidad de CDT que tiene una razón molar de 0.75:1 en comparación con la cantidad de agua presente en la mezcla de reacción que comprende polisacárido capsular de tipo 8 y CDT en un disolvente orgánico.

En una modalidad, el método que comprende la etapa de aislamiento del polisacárido activado comprende la etapa de diafiltración.

En una modalidad, el método que comprende la liofilización de la proteína de portador, antes de la liofilización la proteína de portador se somete a diafiltración frente a NaCI y la razón en p/p de NaCI/proteína de portador de proteína se ajusta a de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5. En una modalidad, la razón de NaCI con respecto a proteína de portador es de aproximadamente 1.

En una modalidad, la proteína de portador que se usa en el método de producción de un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de S. aureus aislado-proteína de portador comprende CRM197.

En una modalidad, se hace que la CRM197 que se usa en el método de producción de un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de S. aureus aislado-proteína de portador reaccione con el polisacárido de serotipo 5 u 8 activado en una razón en peso de aproximadamente 1 :1.

En una modalidad, el método de producción de un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de S. aureus aislado-proteína de portador comprende la etapa de mezclado del polisacárido capsular de tipo 5 u 8 con imidazol o triazol antes del mezclado con CDT en un disolvente orgánico.

En una modalidad, el método de producción de un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de S. aureus aislado-proteína de portador comprende la etapa de hidrolización del conjugado de polisacárido de serotipo 5 u 8-proteína de portador para eliminar grupos de activación sin reaccionar.

En una modalidad, la invención proporciona un método de producción de un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de Staphylococcus aureus aislado conjugado con una proteína de portador, comprendiendo el método las etapas de: hacer que reaccione un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus con 3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida (PDPH) y una carbodiimida en un disolvente orgánico para producir un polisacárido unido a PDPH; hacer que reaccione el polisacárido unido a PDPH con un agente reductor para producir un polisacárido activado; aislar el polisacárido de serotipo 5 u 8 activado para producir un polisacárido de serotipo 5 u 8 activado aislado; proporcionar una proteína de portador activada; hacer que reaccione el polisacárido de serotipo 5 u 8 activado aislado con la proteína de portador activada para producir un conjugado de polisacárido de serotipo 5 u 8-proteína de portador; mediante lo cual se produce un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus aislado conjugado con una proteína de portador. En una modalidad, la proteína de portador activada se aisla antes de hacer que reaccione la proteína de portador activada con el polisacárido activado.

En una modalidad, la etapa de aislamiento de la proteína de portador activada además comprende liofilizar el polisacárido de serotipo 5 u 8 activado aislado para producir un polisacárido de serotipo 5 u 8 activado liofilizado.

En una modalidad, el ácido bromoacético es un éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético (BAANS).

En una modalidad, el método de producción de polisacárido capsular de serotipo 8-proteína de portador conjugado que utiliza PDPH comprende el uso de un disolvente orgánico que es un disolvente aprótico polar. En una modalidad, el disolvente aprótico polar se selecciona del grupo que consiste en dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, y hexametilfosforamida (HMPA), En una modalidad, el disolvente orgánico es dimetilsulfóxido (DMSO).

En una modalidad, la carbodiimida que se usa en el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC).

En una modalidad, el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC comprende la etapa de hacer que reaccione el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 con PDPH y EDAC en un medio orgánico en una razón en peso de polisacárido:PDPH:EDAC de aproximadamente 1 :5:3.

En una modalidad, el agente reductor que se usa en el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC es ditiotreitol (DTT).

En una modalidad, la activación de la proteína de portador en el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC comprende hacer que reaccione la proteína de portador con un ácido bromoacético.

En una modalidad, la etapa de aislamiento del polisacárido de serotipo 5 u 8 activado en el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC comprende una diafiltración.

En una modalidad, el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC comprende la etapa de hidrolización del conjugado de polisacárido de serotipo 5 u 8-proteína de portador para eliminar grupos de activación sin reaccionar. En una modalidad, la etapa de hidrolización del conjugado de polisacárido de serotipo 5 u 8-proteína de portador comprende la adición de clorhidrato de cisteamina.

En una modalidad, el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC además comprende aislar el conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus aislado conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, el aislamiento del conjugado de polisacárido de serotipo 5 u 8-proteína de portador comprende una diafiltración.

En una modalidad, la proteína de portador que se usa en el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC comprende CRIv .

En una modalidad, la CRM 97 en el método de producción de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-CRM197 conjugado que utiliza PDPH y EDAC se añade en una razón en peso de aproximadamente 1 :1 de CR i97:molécula de polisacárido capsular.

En una modalidad, el polisacárido capsular de tipo 5 u 8 activado que se usa en el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC tiene un tamaño de entre aproximadamente 50 kDa y aproximadamente 500 kDa.

En una modalidad, el conjugado inmunogénico que se produce en el método de producción de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que utiliza PDPH y EDAC tiene un tamaño de entre aproximadamente entre 400 kDa y aproximadamente 5000 kDa.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 u 8-proteína de portador que se produce mediante cualquiera de los métodos que se describen en el presente documento.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 u 8-proteína de portador que se produce mediante cualquiera de los métodos que se describen en el presente documento y al menos uno de un adyuvante, diluyente o portador. En una modalidad, las composiciones inmunogénicas comprenden un adyuvante basado en aluminio que puede seleccionarse del grupo que consiste en fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio. En una modalidad, las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento comprenden el adyuvante de fosfato de aluminio.

Las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento pueden comprender menos de un 30 % y menos de un 20 % de polisacárido libre de tipo 5 u 8 en comparación con la cantidad total de polisacárido de tipo 5 u 8. Las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento pueden almacenarse en agua o en un tampón de pH neutro de baja fuerza iónica.

En una modalidad, la invención proporciona un método de reducción o de prevención de una enfermedad, afección o infección por estafilococos asociada con una bacteria de estafilococo en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administración de una cantidad eficaz de forma terapéutica o profiláctica de una composición inmunogénica tal como se describe en el presente documento al sujeto. En una modalidad, la infección, enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en Staphylococcus aureus invasivo, septicemia y estado de portador.

En una modalidad, la invención proporciona un método de reducción o de prevención de una infección por estafilococos en un sujeto que se somete a un método quirúrgico, comprendiendo el método la etapa de administración de una cantidad eficaz de forma profiláctica de una composición inmunogénica tal como se describe en el presente documento al sujeto antes del método quirúrgico.

En una modalidad, el método de la invención comprende la sustitución de CDT por CDI.

En una modalidad, la invención proporciona un polisacárido capsular de tipo 5 u 8 de Staphylococcus aureus que tiene un peso molecular de entre 50 kDa y 800 kDa unido covalentemente a una proteína de portador; en el que el peso molecular combinado del polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador es de entre aproximadamente 400 kDa y 5000 kDa.

En una modalidad, el polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador comprende una parte de polisacárido que tiene un intervalo de peso molecular de entre 70 kDa y 300 kDa. En una modalidad, el polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador tiene un intervalo de peso molecular de entre 500 kDa y 2500 kDa.

En una modalidad, la parte de proteína de portador del polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador comprende CRMi97- En una modalidad, la CRM197 se une covalentemente con el polisacárido a través de un enlace de carbamato, un enlace de amida, o ambos. En algunas modalidades, la razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRMi97 es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 25:1. En algunas modalidades, el polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador comprende al menos un enlace covalente entre CRMi97 al menos en cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido. En algunas modalidades, el polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador comprende al menos un enlace entre CRIv y polisacárido que tiene lugar en cada 5 unidades de repetición de sacárido del polisacárido. En algunas modalidades, la parte de CRM197 del polisacárido unido covalentemente a la CRM197 comprende de 5 a 22 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas modalidades, la parte de CRM 97 del polisacárido unido covalentemente a la CRM197 comprende de 5 a 23 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas modalidades, la parte de CRMi97 del polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador de comprende de 8 a 15 lisinas con enlace covalente con el polisacárido. En algunas modalidades, la parte de CRMi97 del polisacárido unido covalentemente a la proteína de portador de comprende de 8 a 12 lisinas con enlace covalente con el polisacárido.

En una modalidad, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un polisacárido de tipo 5 u 8 de S. aureus unido covalentemente a la proteína de portador tal como se describe en el presente documento y al menos uno de un adyuvante, diluyente, o portador.

En una modalidad, la invención proporciona un método de administración de una composición inmunogénica que comprende un polisacárido de tipo 5 u 8 de S. aureus unido covalentemente a la proteína de portador tal como se describe en el presente documento a un sujeto para generar una respuesta inmunitaria tal como se describe en el presente documento.

En una modalidad, la invención proporciona un método de aislamiento de un polisacárido con un peso molecular entre 20 kDa y 1 ,000 kDa.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo generado mediante un polisacárido capsular, un conjugado inmunogénico, o una composición inmunogénica de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención se entenderá mejor y características, aspectos y ventajas diferentes de las que se exponen anteriormente se harán evidentes cuando se tengan en cuenta la siguiente descripción detallada de la misma. Tal descripción detallada hace referencia a los siguientes dibujos, en los que: La figura 1 muestra una estructura de polisacárido de repetición de un polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus (ácido N-acetil mannosaminurónico es ManNAca, N-acetil L-fucosamina es L-FucNAc, y N-acetil D-fucosamina es D-FucNAc).

La figura 2A muestra un análisis de fracciones a partir de cromatografía de intercambio iónico (Q-Sepharose) para polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus (ensayo de O-Acetilo) y ácido teicoico (ensayo de fosfato); la figura 2B muestra un análisis de fracciones a partir de cromatografía de intercambio iónico (Q-Sepharose) para polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus mediante ensayo de inmunodifusión doble.

La figura 3A muestra el efecto de pH (3.5, 4 o 5) a 95 °C tras la reducción de peso molecular de polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus en un tratamiento térmico; la figura 3B muestra el efecto de la temperatura (55 °C, 75 °C o 95 °C) a un pH de 3.5 tras la reducción de peso molecular de polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus en un tratamiento térmico.

La figura 4 muestra el peso molecular de polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus purificado en comparación con polisacárido capsular de serotipo 5 a lo largo del tiempo durante el tratamiento térmico a un pH de 3.5 y 4.5, respectivamente, y 95 °C.

La figura 5 muestra un aumento de la supervivencia en ratones que recibieron un conjugado de polisacárido capsular de serotipo 8-CRMi97 (diamantes) en comparación con controles tratados con AIP04 (círculos).

La figura 6 muestra una estructura de polisacárido de repetición de polisacárido de serotipo 5 de S. aureus (ácido N-acetil mannosaminurónico es ManNAcA, N-acet¡l L-fucosamina es L-FucNAc, y N-acet¡l D-fucosamina es D-FucNAcA).

La figura 7A muestra un análisis de fracciones a partir de cromatografía de intercambio iónico (Q-Sepharose) para polisacárido de serotipo 5 de S. aureus (ensayo de O-Acetilo) y ácido teicoico (ensayo de fosfato); la figura 7B muestra un análisis de fracciones a partir de cromatografía de intercambio iónico (Q-Sepharose) para polisacárido de serotipo 5 de S. aureus mediante ensayo de inmunodifusión doble.

La figura 8A muestra el efecto de pH (3.5, 4 o 5) a 95 °C tras la reducción de peso molecular de polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus en un tratamiento térmico; la figura 8B muestra el efecto de la temperatura (55 °C, 75 °C o 95 °C) a un pH de 3.5 tras la reducción de peso molecular de polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus en un tratamiento térmico.

La figura 9 muestra una reducción de pielonefritis en ratones que recibieron un polisacárido de serotipo 5-CRMig conjugado en comparación con unos controles tratados con PBS (el área sombreada son los ratones tratados).

La figura 10 muestra unidades de formación de colonias (UFC) recuperadas en ríñones después de una exposición a PFESA0266 de S. aureus en ratones vacunados con CP5-CRM de alto peso molecular (HMW), CP5-CRM de bajo peso molecular (LMW) o control de PP5-CRM La figura 1 1 muestra una comparación de títulos de OPA (media geométrica) a partir de suero que se obtiene a partir de ratones vacunados con diferentes formulaciones de polisacárido conjugado (CP5-CRM de alto peso molecular (HMW), CP5-CRM de bajo peso molecular (LMW)). Los grupos consistieron en de 5 a 9 ratones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Visión de conjunto La presente invención se refiere a conjugados inmunogénicos que comprenden polisacáridos capsulares de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con proteínas portadoras y métodos para su preparación y uso. Características novedosas de los conjugados inmunogénicos de la invención incluyen los perfiles de peso molecular de los polisacáridos y de los conjugados resultantes, la razón de lisinas conjugadas por proteína de portador de CRM197 y el número de lisinas con enlace covalente con el polisacárido, el número de enlaces covalentes entre la proteína de portador y el polisacárido como una función de las unidades de repetición del polisacárido, y la cantidad relativa de polisacárido libre en comparación con el polisacárido total. La expresión "polisacárido libre" tal como se usa en el presente documento quiere decir un polisacárido que no está conjugado con la proteína de portador, pero que está, no obstante, presente en la composición de conjugado.

Los métodos para fabricar los conjugados inmunogénicos de la invención implican una conjugación covalente de los polisacáridos capsulares con las proteínas portadoras usando una química de conjugación que implica CDI (1 ,1-carbonildiimidazol), CDT (1 ,1-carboil-di-1 ,2,4-triazol) o PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida). CDI es específico sólo para la conjugación de CP8. El uso de CDI/CDT da como resultado un ligador de un carbono o de cero carbonos entre el polisacárido capsular y la proteína de portador, mientras que el uso de PDPH da como resultado un enlace tioéter covalente entre el polisacárido capsular y la proteína de portador.

Agentes reticulantes adicionales para enlaces de -SH (CP tiolado) a -NH2 incluyen pero no se limitan a: sulfo-LC-SMPT; sulfo-LC-SMPT (4-sulfosuccinimidil-6-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato)); sulfo-KMUS (éster de N-[k-maleimidoundecanoiloxi]sulfosuccinimida); sulfo-LC-SPDP (6-(3'-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato de sulfosuccinimidilo) que se escinde por tioles; sulfo-SMPB (4-[p-maleimidofenil]butirato de sulfosuccinimidilo); sulfo-SIAB (N-sulfosuccinimidil[4-yodoacetiljaminobenzoato); sulfo-EMCS ([éster de N-e-maleimidocaproiloxijsulfosuccinimida); EMCA (ácido N-e-maleimidocaproico); sulfo-SMCC (4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo); sulfo-MBS (éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida); sulfo-GMBS (éster de N-[g-maleimidobutyriloxijsulfosuccinimida); BMPA (ácido ?-ß-maleimidopropiónico); clorhidrato de 2-inmunotiolano; éster N-succinimidilíco del ácido 3-(2-piridilditio) propiónico; éster N-succinimidilíco del ácido 3-malemidopropiónico; éster N-succinimidilíco del ácido 4-maleimidobutírico; S PT (4-succinimidiloxicarbonil-metil-a-[2-piridilditio]tolueno); LC-S CC (4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxi-[6-amidocaproato] de succinimidilo); KMUA (ácido N-k-maleimidoundecanoico); LC-SPDP (6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato de succinimidilo); SMPH (6-[ß-maleimidopropionamido]hexanoato de succinimidilo); S PB (4-[p-maleimidofeniljbutirato de succinimidilo); SIAB (N-succinimidil[4-yodoacetiljaminobenzoato); EMCS (éster de [N-e-maleimidocaproiloxijsuccinimida); SMCC (4-[N-maleimidomet¡l]ciclohexano-1 -carboxilato de succinimidilo); MBS (éster m-maleimidobenzoílico de N-hidroxisuccinimida); SBAP (3-[bromoacetamido]propionato de succinimidilo); BMPS (éster de N-[p-maleimidopropiloxi]succinimida); AMAS (éster de N-(a-maleimidoacetoxi) succinimida); SIA (yodoacetato de N-succinimidilo); y N-succinimidil (4-yodoacetil)-aminobenzoato.

Los agentes pueden también reticularse usando agentes reticulantes para grupos -SH a -OH. Tales agentes reticulantes incluyen pero no se limitan a PMPI (N-[p-maleimidofenil]isocianato).

Las composiciones y métodos que se describen en el presente documento son útiles en una variedad de aplicaciones. Por ejemplo, los conjugados pueden usarse en la producción de composiciones inmunogénicas de conjugado para proteger a los receptores frente a infecciones por S. aureus. Alternativamente, los varios conjugados pueden usarse en la producción de anticuerpos frente a polisacáridos capsulares bacterianos, que posteriormente pueden usarse en investigación y en ensayos clínicos de laboratorio, tal como serotipado y detección bacteriana. Tales anticuerpos pueden usarse también para conferir inmunidad pasiva a un sujeto. En algunas modalidades, los anticuerpos que se producen frente a polisacáridos bacterianos son funcionales o bien en un modelo de eficacia animal o bien en un ensayo de destrucción opsonofagocítica.

A menos que se defina de otro modo, todas las expresiones técnicas y científicas que se usan en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende normalmente por un experto en la técnica a la que se refiere la invención. A pesar de que cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento pueden usarse en la práctica o modalidad de pruebas de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen en el presente documento. En la descripción de las modalidades y reivindicaciones de la invención, cierta terminología se usará de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuación.

Tal como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, las referencias a "el método" incluyen uno o más métodos, y/o etapas del tipo que se describe en el presente documento y/o que se harán evidentes para un experto en la técnica tras la lectura de la presente divulgación, etcétera.

Tal como se usa en el presente documento, "aproximadamente" quiere decir dentro de un intervalo estadísticamente significativo de un valor tal como un intervalo de concentraciones, marco de tiempo, peso molecular, temperatura o pH indicados. Un intervalo de este tipo puede estar dentro de un orden de magnitud, habitualmente dentro de un 20 %, más habitualmente aún dentro de un 10 %, y incluso más habitualmente dentro de un 5 % de un valor o intervalo dado. La variación admisible abarcada por la expresión "aproximadamente" dependerá del sistema particular sometido a estudio, y puede apreciarse fácilmente por un experto en la técnica. Siempre que se menciona un intervalo dentro de la presente solicitud, cada número entero en su totalidad dentro del intervalo se contempla también como una modalidad de la invención.

Se observa que en la presente divulgación, expresiones tales como "comprende", "comprendido/a", "comprendiendo/ que comprende", "contiene", "conteniendo/ que contiene" y similares pueden tener el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos; por ejemplo, éstas pueden significar "incluye", "incluído/a", "incluyendo/ que incluye" y similares. Tales expresiones se refieren a la inclusión de unos componentes particulares o conjunto de componentes sin excluir cualesquiera otros componentes. Expresiones tales como "consistiendo/ que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos, por ejemplo, éstas permiten la inclusión de componentes o etapas adicionales que no restan valor a las características novedosas o básicas de la invención, es decir, éstas excluyen componentes o etapas no mencionados adicionales que restan valor a las características novedosas o básicas de la invención, y éstas excluyen componentes o etapas de la técnica anterior, tal como documentos en la técnica que se indican en el presente documento o se incorporan por referencia en el presente documento, especialmente debido a que es un objetivo del presente documento definir unas modalidades que pueden patentarse, por ejemplo, novedosas, no obvias, de la invención, sobre la técnica anterior, por ejemplo, sobre los documentos que se indican en el presente documento o que se incorporan por referencia en el presente documento. Y, las expresiones "consiste en" y "consistiendo/ que consiste en" tienen el significado que se atribuye a éstas en la ley de patentes de los Estados Unidos; a saber, que estas expresiones son cerradas. Por consiguiente, estas expresiones se refieren a la inclusión de un conjunto de componentes o un componente particular y a la exclusión de todos los otros componentes.

Conjugados inmunogénicos Tal como se describe anteriormente, la presente invención se refiere a conjugados inmunogénicos que comprenden polisacáridos capsulares de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con proteínas portadoras. Una modalidad de la invención proporciona conjugados inmunogénicos que comprenden un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína o molécula portadora que tiene una o más de las siguientes características: el polisacárido tiene un peso molecular de entre 50 kDa y 700 kDa; el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre 500 kDa y 2,500 kDa; y el conjugado comprende menos de aproximadamente un 30 % de polisacárido libre en relación con el polisacárido total. En algunas modalidades, el polisacárido tiene un peso molecular de entre 20 kDa y 1 ,000 kDa. En algunas modalidades el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre 200 kDa y 5,000 kDa. En otras modalidades, el conjugado comprende menos de aproximadamente un 25 %, aproximadamente un 20 %, aproximadamente un 15 %, aproximadamente un 10 %, o aproximadamente un 5 % de polisacárido libre en relación con el polisacárido total.

Los "conjugados" tal como se usan en el presente documento, comprenden un polisacárido de cápsula normalmente de un intervalo deseado de peso molecular y una proteína de portador, en el que el polisacárido de cápsula está conjugado con la proteína de portador. Los conjugados pueden o pueden no contener alguna cantidad de polisacárido de cápsula libre. Tal como se usa en el presente documento, "polisacárido de cápsula libre" se refiere a un polisacárido de cápsula que está asociado no covalentemente con (es decir, está unido no covalentemente a, adsorbido a o atrapado en o con) el polisacárido capsular-proteína de portador conjugado. Las expresiones "polisacárido de cápsula libre", "polisacárido libre" y "sacárido libre" pueden usarse de forma intercambiable y se pretende que transmitan el mismo significado.

Con independencia de la naturaleza de la molécula portadora, esta puede conjugarse con el polisacárido capsular o bien directamente o bien a través de un ligador. Tal como se usa en el presente documento, "(para) conjugar", "conjugado/a" y "conjugando" se refieren a un método mediante el cual un polisacárido capsular bacteriano se une covalentemente a la molécula portadora. La conjugación aumenta la inmunogenicidad del polisacárido capsular bacteriano. La conjugación puede realizarse de acuerdo con los métodos que se describen a continuación o mediante otros métodos que se conocen en la técnica.

El peso molecular del polisacárido capsular de S. aureus es una consideración para su uso en composiciones inmunogénicas. Los polisacáridos capsulares de alto peso molecular son capaces de inducir ciertas respuestas inmunitarias de anticuerpo debido a una valencia más alta de los epítopos presentes en la superficie antigénica. El aislamiento de los "polisacáridos capsulares de alto peso molecular" se contempla para su uso en las composiciones y métodos de la presente invención. En una modalidad de la invención, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular puede aislarse y purificarse variando de 20 kDa a 1000 kDa en peso molecular. En una modalidad de la invención, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular puede aislarse y purificarse variando de 50 kDa a 700 kDa en peso molecular. En una modalidad de la invención, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular puede aislarse y purificarse variando de 50 kDa a 300 kDa en peso molecular. En una modalidad, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular puede aislarse y purificarse variando de 70 kDa a 300 kDa en peso molecular. En una modalidad, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular puede aislarse y purificarse variando de 90 kDa a 250 kDa en peso molecular. En una modalidad, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular puede aislarse y purificarse variando de 90 kDa a 150 kDa en peso molecular. En una modalidad, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular puede aislarse y purificarse variando de 90 kDa a 120 kDa en peso molecular. En una modalidad, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular puede aislarse y purificarse variando de 80 kDa a 120 kDa en peso molecular. Otros intervalos de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de alto peso molecular que puede aislarse y purificarse mediante los métodos de la presente invención incluyen de 70 kDa a 100 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 110 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 70 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 110 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 80 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 110 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 90 kDa a 160 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 120 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 130 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 140 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 150 kDa en peso molecular; de 100 kDa a 160 kDa en peso molecular; y intervalos deseados similares de peso molecular. Cualquier número entero en su totalidad dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una modalidad de la invención.

En una modalidad, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 50 kDa y aproximadamente 5000 kDa en peso molecular. En una modalidad, el conjugado tiene un peso molecular de entre aproximadamente 200 kDa y aproximadamente 5000 kDa en peso molecular. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 2500 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 500 kDa y aproximadamente 2500 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 600 kDa y aproximadamente 2800 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 700 kDa y aproximadamente 2700 kDa. En una modalidad, el conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre aproximadamente 1000 kDa y aproximadamente 2000 kDa; de entre aproximadamente 1800 kDa y aproximadamente 2500 kDa; de entre aproximadamente 1100 kDa y aproximadamente 2200 kDa; de entre aproximadamente 1900 kDa y aproximadamente 2700 kDa; de entre aproximadamente 1200 kDa y aproximadamente 2400 kDa; de entre aproximadamente 1700 kDa y aproximadamente 2600 kDa; de entre aproximadamente 1300 kDa y aproximadamente 2600 kDa; de entre aproximadamente 1600 kDa y aproximadamente 3000 kDa. Cualquier número entero en su totalidad dentro de cualquiera de los intervalos anteriores se contempla como una modalidad de la invención Tal como se usa en el presente documento, "inmunogénica" quiere decir una capacidad de un antígeno (o un epítopo del antígeno), tal como un polisacárido capsular bacteriano o un composición inmunogénica de conjugado que comprende el antígeno, para provocar una respuesta inmunitaria en un huésped tal como un mamífero, o bien mediada de forma celular o bien humoral, o ambas. Por consiguiente, "conjugado inmunogénico" o "conjugado" tal como se usa en el presente documento quiere decir cualquier conjugado inmunogénico con contenido en un antígeno o determinante antigénico (es decir, epítopo) de un polisacárido capsular bacteriano conjugado con una molécula portadora que puede usarse para provocar una respuesta inmunitaria. El conjugado inmunogénico puede servir para sensibilizar el huésped mediante la presentación del antígeno en asociación con moléculas de CMH en una superficie celular. Además, pueden generarse unas células T o anticuerpos específicos de antígeno para permitir la protección futura de un huésped inmunizado. Los conjugados inmunogénicos pueden por lo tanto proteger al huésped frente a uno o más síntomas asociados con una infección por bacterias, o puede proteger al huésped frente a muerte debida a la infección con bacterias asociadas con el polisacárido capsular. Los conjugados inmunogénicos pueden usarse también para generar unos anticuerpos policlonales o monoclonales, que pueden usarse para conferir inmunidad pasiva a un sujeto. Los conjugados inmunogénicos pueden usarse también para generar unos anticuerpos que son funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias o bien en un modelo de eficacia animal o bien a través de un ensayo de destrucción opsonofagocítica.

Un "anticuerpo" es una molécula de inmunoglobulina capaz de unión específica a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, que se encuentra en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique de otro modo por el contexto, se pretende que la expresión abarque no sólo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también anticuerpos diseñados por ingeniería genética (por ejemplo, quiméricos, humanizados y/o derivados para efectuar funciones de efector, estabilidad y otras actividades biológicas) y fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), anticuerpos de cadena única (ScFv) y de dominio, lo que incluye anticuerpos de tiburón y de camélido), y proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo, anticuerpos multivalentes, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos a condición de que éstos exhiban la actividad biológica deseada) y fragmentos de anticuerpo tal como se describe en el presente documento, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA, o IgM (o subclase de los mismos), y el anticuerpo no ha de ser de ninguna clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse inmunoglobulinas a clases diferentes. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 y lgA2 en los seres humanos. Los dominios constantes de cadena pesada que se corresponden con las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan alfa, delta, épsilon, gamma, y mu, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden sólo una parte de un anticuerpo intacto, en el que la parte preferentemente retiene al menos una, preferentemente la mayor parte o la totalidad, de las funciones que se asocian normalmente con esa parte cuando está presente en un anticuerpo intacto.

La expresión "antígeno" en general se refiere a una molécula biológica, normalmente una proteína, péptído, polísacárido o conjugado en una composición inmunogénica, o sustancia inmunogénica que puede estimular la producción de anticuerpos o respuestas de células T, o ambas, en un animal, incluyendo composiciones que se inyectan o se absorben en un animal. La respuesta inmunitaria puede generarse frente a la totalidad de la molécula, o frente a varias partes de la molécula (por ejemplo, un epítopo o hapteno). La expresión puede usarse para referirse a una molécula individual o a una población homogénea o heterogénea de moléculas antigénicas. Un antígeno se reconoce por anticuerpos, receptores de células T u otros elementos de inmunidad humoral y/o celular específica. El "antígeno" también incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. Los epítopos de un antígeno dado pueden identificarse usando cualquier número de técnicas de asignación de epítopos, que se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Human Press, Totowa, N.J. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse, por ejemplo, sintetizando de forma concurrente un gran número de péptidos en soportes sólidos, correspondiéndose los péptidos con partes de la molécula de proteína, y hacer que reaccionen los péptidos con anticuerpos a la vez que los péptidos están aún unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con n.° 4,708,871 ; Geysen y col. (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :3998 a 4002; Geysen y col. (1986) Molec. Immunol. 23:709 a 715; cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia como si se hubiera expuesto en su totalidad. De forma similar, los epítopos conformacionales pueden identificarse determinando la conformación espacial de los aminoácidos tal como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear en 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, citado anteriormente. Además, para los fines de la presente invención, "antígeno" también puede usarse para referirse a una proteína que incluye modificaciones, tal como deleciones, adiciones y sustituciones (en general de naturaleza conservativa, si bien éstas pueden ser no conservativas), en la secuencia nativa, a condición de que la proteína mantenga la capacidad para provocar una respuesta inmunológica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de una mutagénesis dirigida al sitio, o a través de unos métodos de síntesis particulares, o a través de un enfoque de ingeniería genética, o pueden ser accidentaels, tal como a través de mutaciones de huéspedes, que producen los antígenos. Además, el antígeno puede derivarse, obtenerse, o aislarse a partir de un microbio, por ejemplo, una bacteria, o puede ser la totalidad de un organismo. De forma similar, un oligonucleótido o polinucleótido, que expresa un antígeno, tal como en aplicaciones de inmunización de ácido nucleico, se incluye también en la definición. También se incluyen los antígenos de síntesis, por ejemplo, poliepítopos, epítopos flanqueantes, y otros antígenos derivados de forma sintética o recombinante (Bergmann y col. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781 ; Bergmann y col. (1996) J. Immunol. 157:3242 a 3249; Suhrbier (1997) Immunol. Cell Biol. 75:402 408; Gardner y col. (1998) 12th World AIDS Conference, Ginebra, Suiza, de 28 de Junio a 3 de Julio de 1998).

Una respuesta inmunitaria "de protección" se refiere a la capacidad de una composición inmunogénica para provocar una respuesta inmunitaria, o bien mediada de forma celular o bien humoral, o ambas, que sirve para proteger a un sujeto frente a una infección. La protección que se prevé no ha de ser absoluta, es decir, la infección no ha de evitarse o erradicarse totalmente, si hay una mejora estadísticamente significativa en comparación con una población de control de sujetos, por ejemplo, animales infectados a los que no se administró la vacuna o composición inmunogénica. La protección puede limitarse a mitigar la gravedad o rapidez de aparición de los síntomas de la infección. En general, una "respuesta inmunitaria de protección" incluiría la inducción de un aumento en los niveles de anticuerpos específicos para un antígeno particular en al menos un 50 % de los sujetos, incluyendo un cierto nivel de respuestas de anticuerpos funcionales medibles para cada antígeno. En situaciones particulares, una "respuesta inmunitaria de protección" podría incluir la inducción de un aumento del doble en los niveles de anticuerpos o de un aumento de cuatro veces en los niveles de anticuerpos específicos para un antígeno particular en al menos un 50 % de los sujetos, incluyendo un cierto nivel de respuestas de anticuerpos funcionales medibles para cada antígeno. En ciertas modalidades, la opsonización de anticuerpos está relacionada con una respuesta inmunitaria de protección. Por lo tanto, la respuesta inmunitaria de protección puede someterse a ensayo midiendo la disminución en porcentaje en el recuento de bacterias en un ensayo de opsonofagocitosis, por ejemplo, los que se describen a continuación. Preferentemente, hay una disminución en el recuento de bacterias de al menos un 10 %, un 25 %, un 50 %, un 65 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o más. La "cantidad inmunogénica" de un conjugado particular en una composición se dosifica en general en base al polisacárido total, conjugado y no conjugado para ese conjugado. Por ejemplo, un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 conjugado con un 20 % de polisacárido libre tendrá aproximadamente 80 mcg de polisacárido conjugado y aproximadamente 20 mcg de polisacárido no conjugado en una dosis de 100 mcg. La contribución de la proteína al conjugado no se considera normalmente cuando se calcula la dosis de un conjugado. La cantidad de conjugado puede variar dependiendo del serotipo estafilocócico. En general, cada dosis comprenderá de 0.1 a 100 mcg de polisacárido, en particular de 0.1 a 10 mcg, y más en particular de 1 a 10 mcg.

La expresión "sujeto" se refiere a un mamífero, pájaro, pez, reptil, o cualquier otro animal. La expresión "sujeto" también incluye seres humanos. La expresión "sujeto" también incluye mascotas domésticas. Unos ejemplos no limitantes de mascotas domésticas incluyen: perros, gatos, cerdos, conejos, ratas, ratones, gerbos, hámsteres, cobayas, hurones, pájaros, serpientes, lagartos, peces, tortugas, y ranas. La expresión "sujeto" también incluye animales de ganado. Unos ejemplos no limitantes de animales de ganado incluyen: alpaca, bisonte, camello, ganado bovino, ciervo, cerdos, caballos, llamas, muías, burros, ovejas, cabras, conejos, reno, yak, gallinas, gansos, y pavos.

Tal como se muestra en la figura 1 , los polisacáridos capsulares de serotipo 5 y 8 de S. aureus tienen las siguientes estructuras: serotipo 5 [?4)-p-D-ManNAcA-(1?4) -3-O-Ac -0 L-FucNAc-(1?3)-p-DFucNAc-(1?]n. y serotipo 8 [?3)-4-0-Ac- -D-ManNAcA-(1?3)-a-L-FucNAc-(1?3)-p-DFucNAc-(1?]n. Véase el documento de Jones (2005) Carbohidr. Res. 340:1097 a 1106. El polisacárido capsular de serotipo 8 tiene unas unidades de repetición de trisacárido similares a las del polisacárido capsular de serotipo 5; no obstante, éstos se diferencian en los enlaces de azúcar y en los sitios de O-acetilación, que producen unos patrones serológicamente diferentes de inmunoreactividad (Fournier y col. (1984) Infect. Immun. 45:87 a 93; y Moreau y col. (1990) Carbohidr. Res. 201 :285 a 297). Los polisacáridos capsulares de serotipo 8 y 5 son por lo tanto carbohidratos relativamente complejos que son solubles en agua, normalmente ácidos, y se pensó anteriormente que tenían unos pesos moleculares de aproximadamente 25 kDa (Fattom (1990) Infect. Immun. 58, 2367 a 2374).

En algunas modalidades, los polisacáridos capsulares de serotipo 5 y/o 8 de la invención son O-acetilados. En algunas modalidades, el grado de O-acetilación de oligosacárido o polisacárido capsular de tipo 5 es de un 10 a un 100 %, de un 20 a un 100 %, de un 30 a un 100 %, de un 40 a un 100 %, de un 50 a un 100 %, de un 60 a un 100 %, de un 70 a un 100 %, de un 80 a un 100 %, de un 90 a un 100 %, 50- 90 %, de un 60 a un 90 %, de un 70 a un 90 % o de un 80 a un 90 %. En algunas modalidades, el grado de O-acetilación de oligosacárido o polisacárido capsular de tipo 8 es de un 10 a un 100 %, de un 20 a un 100 %, de un 30 a un 100 %, de un 40 a un 100 %, de un 50 a un 100 %, de un 60 a un 100 %, de un 70 a un 100 %, de un 80 a un 100 %, de un 90 a un 100 %, de un 50 a un 90 %, de un 60 a un 90 %, de un 70 a un 90 % o de un 80 a un 90 %. En algunas modalidades, el grado de O-acetilación de los oligosacáridos o polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8 es de un 10 a un 100 %, de un 20 a un 100 %, de un 30 a un 100 %, de un 40 a un 100 %, de un 50 a un 100 %, de un 60 a un 100 %, de un 70 a un 100 %, de un 80 a un 100 %, de un 90 a un 100 %, de un 50 a un 90 %, de un 60 a un 90 %, de un 70 a un 90 % o de un 80 a un 90 %.

El grado de O-acetilación del polisacárido u oligosacárido puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, mediante una RMN de protones (Lemercinier y Jones 1996, Carbohidrate Research 296; 83 a 96, Jones y Lemercinier 2002, J Pharmaceutical y Biomedical analysis 30; 1233 a 1247, documentos WO 05/033148 o WO 00/56357). Otro método que se usa normalmente se describe por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249 a 261.

En algunas modalidades, los polisacáridos capsulares de serotipo 5 y/o 8 de la invención se usan para generar unos anticuerpos que son funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias en un modelo de eficacia animal o un ensayo de destrucción opsonofagocítica que muestra que los anticuerpos destruyen las bacterias. Puede que la destrucción funcional no se demuestre usando un ensayo que supervisa la generación de anticuerpos únicamente, lo que no es indicativo de la importancia de la O-acetilación en cuanto a la eficacia.

Los polisacáridos capsulares tales como de serotipo 5 u 8 pueden obtenerse directamente a partir de bacterias usando unos métodos de aislamiento conocidos por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Fournier y col. (1984), citado anteriormente; Fournier y col. (1987) Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 138:561 a 567; publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos con n.° 2007/0141077; y la publicación de solicitud de patente internacional con n.° WO 00/56357; cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia como si se hubiera expuesto en su totalidad). Además, éstos pueden producirse usando protocolos de síntesis. Además, el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 puede producirse de forma recombinante usando unos métodos de ingeniería genética también conocidos por un experto en la técnica (véase el documento de Sau y col. (1997) Microbiology 143:2395 a 2405; y la patente de los Estados Unidos con n.° 6,027,925; cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia como si se hubiera expuesto en su totalidad).

Una cepa de S. aureus que puede usarse para obtener un polisacárido capsular de serotipo 8 aislado es la R2 PFESA0286 de S. aureus. Esta cepa se seleccionó mediante una citometría de flujo con unos anticuerpos de polisacárido de anti-serotipo 8 de conejo después de un cultivo de PFESA0286 de S. aureus (Colección Americana de Cultivos Tipo; Manassas, VA; n.° de Registro de ATCC 49525;) en caldo Frantz modificado. Dos poblaciones, R1 y R2, se observaron durante la citometría de flujo. R1 y R2 se purificaron y volvieron a cultivarse. R2 produjo un polisacárido capsular de serotipo 8. El análisis citométrico de flujo mostró una intensidad de fluorescencia homogénea. En ese sentido, R2 se seleccionó para la producción de polisacárido capsular de serotipo 8.

Una cepa de S. aureus que puede usarse para obtener un polisacárido capsular de serotipo 5 aislado es PFESA0266 de S. aureus. Esta cepa produce un polisacárido capsular de serotipo 5 durante el crecimiento, y producción alcanza su máximo cuando las células se encuentran en una fase estacionaria. Otras cepas de tipo 5 o tipo 8 de S. aureus pueden usarse para fabricar los polisacáridos respectivos que se obtienen o bien a partir de colecciones de cultivo establecidas o bien muestras clínicas.

Otro componente del conjugado inmunogénico de la invención es una proteína o molécula portadora con la que se conjuga el polisacárido capsular bacteriano. La expresión "portador de proteína" o "proteína de portador" se refiere a cualquier molécula de proteína que puede conjugarse con un antígeno (tal como los polisacáridos capsulares) frente a la que se desea una respuesta inmunitaria. La conjugación con un portador puede aumentar la inmunogenicidad del antígeno. La conjugación puede realizarse mediante métodos convencionales. Los portadores de proteína preferidos para los antígenos son toxinas, toxoides o cualquier material de reacción cruzada mutante (CRM) de la toxina a partir de tétanos, difteria, tos ferina, Pseudomonas, E. coli, estafilococo y estreptococo. En una modalidad, un portador particularmente preferido es la CRM197 del toxoide diftérico, derivada de cepa C7 de C. diphtheriae (ß197), que producen la proteína CRM197. Esta cepa tiene un n.° de registro de ATCC 53281. Un método para producir la CRM197 se describe en la patente de los Estados Unidos con n.° 5,614,382, que se incorpora en el presente documento por referencia como si se hubiera expuesto en su totalidad. Alternativamente, un fragmento o epítopo del portador de proteína o puede usarse otra proteína inmunogénica. Por ejemplo, un antígeno hapténico puede acoplarse a un epítopo de célula T de una toxina, toxoide o CRM bacterianos. Véase la solicitud de patente de los Estados Unidos con n.° 150,688, presentada el 1 de febrero de 1988, titulada "Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjúgate Vaccines"; que se incorpora en el presente documento por referencia como si se hubiera expuesto en su totalidad. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen toxinas bacterianas inactivadas tal como el toxoide del cólera (por ejemplo, tal como se describe en la solicitud de patente internacional con n.° WO 2004/083251), E. coli LT, E. coli ST, y exotoxina A a partir de Pseudomonas aeruginosa. También pueden usarse proteínas de la membrana exterior bacteriana tales como el complejo de la membrana exterior c (OMPC), porinas, proteínas de unión a transferrina, neumolisina, proteína de superficie neumocócica A (PspA), proteína de adhesión neumocócica (PsaA) o proteína de Haemophilus influenzae D. También pueden usarse como proteínas portadoras otras proteínas, tal como ovalbúmina, hemocianina de la lapa californiana (KLH), albúmina de suero bovino (BSA) o derivado de proteína purificado de la tuberculina (PPD).

Por consiguiente, en una modalidad, la proteína de portador dentro del conjugado ¡nmunogénico de la invención es la CRIv , y la CRM197 se une covalentemente con el polisacárido capsular a través de un enlace de carbamato, un enlace de amida, o ambos. En algunas modalidades, la proteína de portador dentro del conjugado inmunogénico de la invención es la CRMig7, y la CRIv se une covalentemente con el polisacárido capsular a través de un enlace tioéter. El número de residuos de lisina en la proteína de portador que se han conjugado con un polisacárido capsular puede caracterizarse como un intervalo de lisinas conjugadas. Por ejemplo, en una composición inmunogénica dada, la CRM197 puede comprender de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 12 % a un 40 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el polisacárido capsular. Por ejemplo, en una composición inmunogénica dada, la CRM197 puede comprender de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 40 % a un 60 % de lisinas de CRM197 tienen enlace covalente con el polisacárido capsular. En algunas modalidades, la CRM197 comprende de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el CP8. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 12 % a un 40 % de lisinas de CRMi97 tienen enlace covalente con el CP8. En algunas modalidades, la CRM 97 comprende de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el CP5. Otra forma de expresar este parámetro es que de un 40 % a un 60 % de lisinas de CRMi97 tienen enlace covalente con el CP5.

Tal como se analiza anteriormente, el número de residuos de Usina en la proteína de portador conjugado con el polisacárido capsular puede caracterizarse como un intervalo de lisinas conjugadas, que puede expresarse como una razón molar. Por ejemplo, la razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado ¡nmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 18:1 a aproximadamente 22:1. En una modalidad, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 15:1 a aproximadamente 25:1. En una modalidad, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP8 puede ser de entre aproximadamente 14:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 12:1 a aproximadamente 18:1 ; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 16:1 ; de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 14:1 ; de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 12:1 ; de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1 ; de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 26:1 ; de aproximadamente 22:1 a aproximadamente 28:1 ; de aproximadamente 24:1 a aproximadamente 30:1 ; de aproximadamente 26:1 a aproximadamente 32:1 ; de aproximadamente 28:1 a aproximadamente 34:1 ; de aproximadamente 30:1 a aproximadamente 36:1 ; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 10:1 ; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 20:1 ; o de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 30:1. Así mismo la razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 3:1 y 25:1. En una modalidad, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 5:1 a aproximadamente 20:1. En una modalidad, el intervalo de razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 en el conjugado inmunogénico de CP5 puede ser de entre aproximadamente 4:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 6:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 10: 1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 11 :1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 12:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 13:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 14:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 15:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 16:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 17:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 18:1 a aproximadamente 20:1 ; de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 18:1 ; de aproximadamente 7:1 a aproximadamente 16:1 ; o de aproximadamente 9:1 a aproximadamente 14:1.

Otra forma de expresar el número de residuos de lisina en la proteína de portador conjugado con el polisacárido capsular puede ser como un intervalo de lisinas conjugadas. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP8 dado, la CRM197 puede comprender de 5 a 15 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Alternativamente, este parámetro puede expresarse como un porcentaje. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP8 dado, el porcentaje de lisinas conjugadas puede ser de entre un 110 % y un 50 %. En algunas modalidades, de un 20 % a un 50 % de lisinas puede tener enlace covalente con el CP8. Aún más alternativamente, de un 30 % a un 50 % de lisinas de CRM197 puede tener enlace covalente con el CP8; de un 10 % a un 40 % de lisinas de CRM-i9 ; de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRMi97; de un 20 % a un 40 % de lisinas de CRMi97; de un 25 % a un 40 % de lisinas de CRMi97; de un 30 % a un 40 % de lisinas de CRIv ; de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRMi97; de un 15 % a un 30 % de lisinas de CRMi97; de un 20 % a un 30 % de lisinas de CRM 97; de un 25 % a un 30 % de lisinas de CRIv ; de un 10 % a un 15 % de lisinas de CRMi97; o de un 10 % a un 12 % de lisinas de CRM-|97 tienen enlace covalente con el CP8. Así mismo en un conjugado inmunogénico de CP5 dado, la CRMi97 puede comprender de 18 a 22 lisinas de entre 39 con enlace covalente con el polisacárido capsular. Alternativamente, este parámetro puede expresarse como un porcentaje. Por ejemplo, en un conjugado inmunogénico de CP5 dado, el porcentaje de lisinas conjugadas puede ser de entre un 40 % y un 60 %. En algunas modalidades, de un 40 % a un 60 % de lisinas puede tener enlace covalente con el CP5. Aún más alternativamente, de un 30 % a un 50 % de lisinas de CRMi97 puede tener enlace covalente con el CP5; de un 20 % a un 40 % de lisinas de CRM 97; de un 10 % a un 30 % de lisinas de CRMi97; de un 50 % a un 70 % de lisinas de CRMi97; de un 35 % a un 65 % de lisinas de CRM197; de un 30 % a un 60 % de lisinas de CRMi97; de un 25 % a un 55 % de lisinas de CRMi97; de un 20 % a un 50 % de lisinas de CRM197; de un 15 % a un 45 % de lisinas de CRM197; de un 10 % a un 40 % de lisinas de CRM197; de un 40 % a un 70 % de lisinas de CRM197; o de un 45 % a un 75 % de lisinas de CRMig7 tienen enlace covalente con el CP5.

La frecuencia de unión de la cadena de polisacárido capsular a una lisina en la molécula portadora es otro parámetro para la caracterización de conjugados de polisacáridos de cápsula. Por ejemplo, en una modalidad, al menos un enlace covalente entre CRM-ig7 y polisacárido tiene lugar para al menos cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular. En otra modalidad, hay al menos un enlace covalente entre CRMig7 y polisacárido capsular para cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido; cada de 2 a 7 unidades de repetición de sacárido, cada de 3 a 8 unidades de repetición de sacárido; cada de 4 a 9 unidades de repetición de sacárido; cada de 6 a 11 unidades de repetición de sacárido; cada de 7 a 12 unidades de repetición de sacárido; cada de 8 a 13 unidades de repetición de sacárido; cada de 9 a 14 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 15 unidades de repetición de sacárido; cada de 2 a 6 unidades de repetición de sacárido, cada de 3 a 7 unidades de repetición de sacárido; cada de 4 a 8 unidades de repetición de sacárido; cada de 6 a 10 unidades de repetición de sacárido; cada de 7 a 11 unidades de repetición de sacárido; cada de 8 a 12 unidades de repetición de sacárido; cada de 9 a 13 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 14 unidades de repetición de sacárido; cada de 10 a 20 unidades de repetición de sacárido; o cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular. En otra modalidad, al menos un enlace entre CRIv y polisacárido capsular tiene lugar para cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 unidades de repetición de sacárido del polisacárido capsular.

Una modalidad de la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende cualquiera de los conjugados inmunogénicos que comprenden un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador que se describe anteriormente.

La expresión "composición inmunogénica" se refiere a cualquier composición farmacéutica con contenido en un antígeno, por ejemplo, un microorganismo o un componente del mismo, composición que puede usarse para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto. Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden usarse para proteger a o para tratar un ser humano susceptible de infección por S. aureus, por medio de administración de las composiciones inmunogénicas a través de una vía sistémica, dérmica o mucosa o usarse para generar una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales que podría usarse para conferir inmunidad pasiva a otro sujeto. Estas administraciones pueden incluir una inyección a través de las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o a través de administración mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. En una modalidad, se usa una administración intranasal para el tratamiento o prevención de estado nasofaríngeo de portador de S. aureus, atenuando de este modo la infección en su fase más temprana. Pueden usarse también composiciones inmunogénicas para generar unos anticuerpos que son funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias o bien en un modelo de eficacia animal o bien a través de un ensayo de destrucción opsonofagocítica.

Pueden determinarse unas cantidades óptimas de componentes para una composición inmunogénica particular mediante unos estudios convencionales que implican la observación de unas respuestas inmunitarias apropiadas en los sujetos. Siguiendo una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo separadas de forma adecuada.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden incluir también uno o más de los siguientes antígenos: ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE MntC/SitC/Proteína de unión de saliva, IsdB, IsdA, Opp3a, DltA, HtsA, LtaS, SdrH, SrtA, SpA, SBI, alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de unión a fibronectina (fnbA), coagulasa, map, leucocidina Panton-Valentine (pvl), gamma-toxina (hlg), ica, transportador ABC inmunodominante, RAP, autolisina, receptores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB, SPOIIIE, SsaA, EbpS, SasF, SasH, EFB (FIB), FnbB, Npase, EBP, sialoproteína II de unión a hueso, precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1 , Cna, TSST-1 , mecA, dPNAG, GehD, EbhA, EbhB, SSP-1 , SSP-2 HBP, proteína de unión a vitronectina, HarA, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 , y autolisina novedosa.

En una modalidad, las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden además al menos uno de un adyuvante, un tampón, un crioprotector, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un inhibidor de oxidación por radicales libres, un diluyente o un portador. En una modalidad, el adyuvante dentro de la composición inmunogénica de la invención es un adyuvante basado en aluminio. En una modalidad, el adyuvante es un adyuvante basado en aluminio que se selecciona del grupo que consiste en fosfato de aluminio, sulfato de aluminio e hidróxido de aluminio. En una modalidad, el adyuvante es fosfato de aluminio.

Un adyuvante es una sustancia que aumenta la respuesta inmunitaria cuando se administra junto con un inmunógeno o antígeno. Se ha mostrado que un número de citocinas o linfocinas tienen una actividad de modulación inmunitaria, y por lo tanto pueden ser útiles de una forma igual o similar a adyuvantes, incluyendo, pero sin limitarse a, las interleucinas 1-a, 1-ß, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con n.° 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes); los interferones-a, ß y y; factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-LCR) (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con n.° 5,078,996 y número de Registro de ATCC 39900); factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-LCR); factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-LCR); y los factores de necrosis tumoral a y ß. Aún otros adyuvantes que son útiles con las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento incluyen quimiocinas, incluyendo sin limitación, MCP-1 , ???-1a, ???-1 ß, y RANTES; moléculas de adhesión, tal como una selectina, por ejemplo, L-selectina, P-selectina y E-selectina; moléculas de tipo mucina, por ejemplo, CD34, GlycAM-1 y MadCAM-1 ; un miembro de la familia de las integrinas tal como LFA-1, VLA-1 , Mac- y p150,95; un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas tal como PECAM, ICAMs, por ejemplo, ICAM-1 , ICAM-2 y ICAM-3, CD2 y LFA-3; moléculas coestimuladoras tal como B7-1 , B7-2, CD40 y CD40L; factores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento vascular, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epidérmico, PDGF, BL-1 , y factor de crecimiento endotelial vascular; moléculas de receptor incluyendo Fas, receptor de TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1 , DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, y DR6; y caspasas, incluyendo ICE.

Adyuvantes adecuados que se usan para aumentar una respuesta inmunitaria pueden incluir además, sin limitación, MPL™ (lípido monofosforílico 3-O-desacilado A, Corixa; Hamilton, MT), que se describe en la patente de los Estados Unidos con n.° 4,912,094. También son adecuados para su uso como adyuvantes, análogos de lípido A de síntesis o compuestos de fosfato de aminoalquilglucosamina (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles a través de Corixa, y los que se describen en la patente de los Estados Unidos con n.° 6,113,918. Un AGP de este tipo es 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-desoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoioxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido, que se conoce también como 529 (anteriormente conocido como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa (AF) o como una emulsión estable (SE).

Aún otros adyuvantes incluyen péptidos de muramilo, tal como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1 '-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE); emulsiones de aceite en agua, tal como MF59 (patente de los Estados Unidos con n.° 6,299,884) (que contiene un 5 % de escualeno, un 0.5 % de Polysorbate 80, y un 0.5 % de Span 85 (que opcionalmente contiene varias cantidades de MTP-PE) que se formulan para dar partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA)), y SAF (que contiene un 10 % de escualeno, un 0.4 % de Polysorbate 80, un 5 % de polímero L121 bloqueado con Pluronic, y thr-MDP, o bien microfluidizado para dar una emulsión submicrométrica o bien mediante agitación con vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande); adyuvante de Freund incompleto (IFA); sales de aluminio (alumbre), tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio; Amphigen; Avridine; L121/escualeno; D-lactida-polilactida/glicósido; polioles de Pluronic; Bordetella inactivada; saponinas, tal como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), que se describen en la patente de los Estados Unidos con n.° 5,057,540, Iscomatrix® (CSL Limited, Parkville, Australia), que se describe en la patente de los Estados Unidos con n.° 5,254,339, y complejos inmunoestimulantes (ISCOMS); tuberculosis por Mycobacterium; lipopolisacáridos bacterianos; polinucleótidos de síntesis tales como oligonucleótidos con contenido en un motivo de CpG (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos con n.° 6,207,646); CI-31 (Intercell AG, Viena, Austria), que se describe en las patentes EP con n.os 1,296,713 y 1,326,634; una toxina de tos ferina (PT) o una mutante de la misma, una toxina de cólera o una mutante de la misma (por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos con n.os 7,285,281, 7,332,174, 7,361 ,355 y 7,384,640); o an E. coli heat-labile toxina (LT) o una mutante de la misma, en particular LT-K63, LT-R72 (por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos con n.os 6,149,919, 7,115,730 y 7,291,588).

La composición inmunogénica puede comprender opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión "portador farmacéuticamente aceptable" quiere decir un portador aprobado por una agencia de regulación de un gobierno estatal, uno Federal, u otra agencia de regulación, o que se enumera en la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida en general para su uso en animales, incluyendo seres humanos así como mamíferos no humanos. La expresión "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra la composición farmacéutica. Agua, soluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol pueden emplearse como portadores líquidos, en particular para disoluciones inyectables. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. La formulación ha de adecuarse al modo de administración.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden comprender además uno o más "inmunomoduladores" adicionales, que son agentes que perturban o alteran el sistema inmunitario, de tal modo que se observa o bien una regulación por aumento o bien una regulación por disminución de inmunidad mediada de forma celular y/o humoral. En una modalidad, se prevé la regulación por aumento de las armas mediadas de forma celular y/o humoral del sistema inmunitario. Ejemplos de ciertos inmunomoduladores incluyen, por ejemplo, un adyuvante o citocina, o Iscomatrix® (CSL Limited; Parkville, Australia), que se describe en la patente de los Estados Unidos con n.° 5,254,339 entre otros. Unos ejemplos no limitantes de adyuvantes que pueden usarse en la composición inmunogénica de la presente invención incluyen el sistema de adyuvante RIBI (Ribi Inc.; Hamilton, MT), alumbre, geles minerales tales como gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, por ejemplo, adyuvantes completos y incompletos de Freund, copolímero de Block (CytRx; Atlanta, GA), QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, MA), SAF-M (Chiron; Emeryville, CA), Adyuvante Amphigen®, saponina, Quil A u otra fracción de saponina, lípido monofosforílico A, y adyuvante lípido-amina Avridine. Unos ejemplos no limitantes de emulsiones de aceite en agua útiles en la composición inmunogénica de la invención incluyen las formulaciones SEAM62 y SEAM 1/2 modificadas. La SEAM62 modificada es una emulsión de aceite en agua con contenido en un 5 % (v/v) de escualeno (Sigma), un 1 % (v/v) de detergente Span® 85 (ICI Surfactants), un 0.7 % (v/v) de detergente de Polysorbate 80 (ICI Surfactants), un 2.5 % (v/v) de etanol, 200 mcg/ml de Quil A, 100 mcg/ml de colesterol, y un 0.5 % (v/v) de lecitina. La SEAM 1/2 modificada es una emulsión de aceite en agua que comprende un 5 % (v/v) de escualeno, un 1 % (v/v) de detergente Span® 85, un 0.7 % (v/v) de detergente de Polysorbate 80, un 2.5 % (v/v) de etanol, 100 mcg/ml de Quil A, y 50 mcg/ml de colesterol. Otros "inmunomoduladores" que pueden incluirse en la composición inmunogénica incluyen, por ejemplo, una o más interleucinas, interferones, u otras citocinas o quimiocinas conocidas otras citocinas o quimiocinas conocidas. En una modalidad, el adyuvante puede ser un derivado de ciclodextrina o un polímero polianiónico, tal como los que se describen en las patentes de los Estados Unidos con n.os 6,165,995 y 6,610,310, respectivamente. Ha de entenderse que el inmunomodulador y/o adyuvante que va a usarse dependerá del sujeto al que se administrará la composición inmunogénica, la vía de inyección y el número de inyecciones que van a darse.

Las composiciones inmunogénícas de la invención pueden comprender además uno o más conservantes además de una pluralidad de conjugados de polisacárido capsular estafilocócico-proteína. La FDA requiere que los productos biológicos en viales de múltiples dosis (múltiples dosis) contengan un conservante, con sólo unas pocas excepciones. Los productos de vacuna con contenido en conservantes incluyen vacunas con contenido en cloruro de benzetonio (ántrax), 2-fenoxietanol (DTaP, HepA, Lyme, Polio (parenteral)), fenol (Pneumo, Typhoid (parenteral), Vaccinia) y timerosal (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Rabies). Conservantes aprobados para su uso en fármacos inyectables incluyen, por ejemplo, clorobutanol, m-cresol, metilparaben, propilparaben, 2-fenoxietanol, cloruro de benzetonio, cloruro de benzalconio, ácido benzoico, alcohol bencílico, fenol, timerosal y nitrato fenilmercúrico.

Las formulaciones de la invención pueden comprender además uno o más de un tampón, una sal, un catión divalente, un detergente no iónico, un crioprotector tal como un azúcar, y un antioxidante tal como un eliminador de radicales libres o agente quelante, o cualquier combinación múltiple de los mismos. La elección de un componente cualquiera, por ejemplo, un agente de quelación, puede determinar si es deseable otro componente (por ejemplo, un eliminador) o no. La composición final que se formula para la administración ha de ser estéril y/o libre de pirógenos. El experto puede determinar de forma empírica qué combinaciones de estos y otros componentes serán óptimas para la inclusión en las composiciones inmunogénicas con contenido en conservante de la invención, dependiendo de una variedad de factores tales como las condiciones de almacenamiento y de administración particulares que se requieren.

En ciertas modalidades, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tampones fisiológiamente aceptables que se seleccionan de, pero sin limitarse a, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidína y succinato. En ciertas modalidades, la formulación está tamponada a dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 9.0, preferentemente de aproximadamente 6.4 a aproximadamente 7.4.

En ciertas modalidades, puede ser deseable ajustar el pH de la composición inmunogénica o formulación de la invención. El pH de una formulación de la invención puede ajustarse usando técnicas convencionales en la técnica. El pH de la formulación puede ajustarse para ser de entre 3.0 y 8.0. En ciertas modalidades, el pH de la formulación puede ser, o puede ajustarse para ser, entre 3.0 y 6.0, 4.0 y 6.0, o 5.0 y 8.0. En otras modalidades, el pH de la formulación puede ser, o puede ajustarse para ser, aproximadamente 3.0, aproximadamente 3.5, aproximadamente 4.0, aproximadamente 4.5, aproximadamente 5.0, aproximadamente 5.5, aproximadamente 5.8, aproximadamente 6.0, aproximadamente 6.5, aproximadamente 7.0, aproximadamente 7.5, o aproximadamente 8.0. En ciertas modalidades, el pH puede ser, o puede ajustarse para ser, en un intervalo de 4.5 a 7.5, o de 4.5 a 6.5, de 5.0 a 5.4, de 5.4 a 5.5, de 5.5 a 5.6, de 5.6 a 5.7, de 5.7 a 5.8, de 5.8 a 5.9, de 5.9 a 6.0, de 6.0 a 6.1 , de 6.1 a 6.2, de 6.2 a 6.3, de 6.3 a 6.5, de 6.5 a 7.0, de 7.0 a 7.5 o de 7.5 a 8.0. En una modalidad específica, el pH de la formulación es de aproximadamente 5.8.

En ciertas modalidades, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más cationes divalentes, incluyendo pero sin limitarse a, MgCI2, CaCI2 y MnCI2, a una concentración variando de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 10 mM, prefiriéndose con hasta aproximadamente 5 mM.

En ciertas modalidades, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende una o más sales, incluyendo pero sin limitarse a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, y sulfato de potasio, presentes a una fuerza iónica que es fisiológiamente aceptable por el sujeto tras la administración parenteral e incluidas a una concentración final para producir una fuerza iónica u osmolaridad seleccionadas en la formulación final. La fuerza iónica u osmolalidad finales de la formulación se determinará por múltiples componentes (por ejemplo, iones de compuesto(s) de tamponamiento y otras sales de no tamponamiento. Una sal preferida, NaCI, está presente desde un intervalo de hasta aproximadamente 250 mM, seleccionándose las concentraciones de sal para complementar otros componentes (por ejemplo, azúcares) de tal modo que la osmolaridad total final de la formulación es compatible con la administración parenteral (por ejemplo, inyección intramuscular o subcutánea) y promoverá la estabilidad a largo plazo de los componentes inmunogénicos de la formulación de composición inmunogénica a lo largo de varios intervalos de temperatura. Formulaciones libres de sal tolerarán intervalos aumentados del uno o más crioprotectores seleccionados para mantener los niveles de osmolaridad finales deseados.

En ciertas modalidades, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más crioprotectores que se seleccionan de, pero sin limitarse a, disacáridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sacarosa o trehalosa) y polihidroxi-hidrocarburos (por ejemplo, dulcitol, glicerol, manitol y sorbitol).

En ciertas modalidades, la osmolaridad de la formulación está en un intervalo de aproximadamente 200 mOs/L a aproximadamente 800 mOs/L, con un intervalo preferido de aproximadamente 250 mOs/L a aproximadamente 500 mOs/L, o aproximadamente 300 mOs/L a aproximadamente 400 mOs/L. Una formulación libre de sal puede contener, por ejemplo, de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 25 % de sacarosa, y preferentemente de aproximadamente un 7 % a aproximadamente un 15 %, o aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 12 % de sacarosa. Alternativamente, una formulación libre de sal puede contener, por ejemplo, de aproximadamente un 3 % a aproximadamente un 12 % de sorbitol, y preferentemente de aproximadamente un 4 % a un 7 %, o aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 6 % de sorbitol. Si se añade una sal tal como cloruro de sodio, entonces el intervalo eficaz de sacarosa o sorbitol se reduce relativamente. Estas y otras consideraciones tales como la osmolalidad y la osmolaridad se conocen bien en la técnica.

En ciertas modalidades, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más inhibidores de la oxidación por radicales libres y/o agentes quelantes. Una variedad de eliminadores de radicales libres y agentes de quelación se conocen en la técnica y se aplican a las formulaciones y los métodos de uso que se describen en el presente documento. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a etanol, EDTA, una combinación de EDTA etanol, trietanolamina, manitol, histidina, glicerol, citrato de sodio, hexafosfato de inositol, tripolifosfato, ácido ascórbico/ascorbato, ácido succínico/succinato, ácido málico/maleato, desferal, EDDHA y DTPA, y varias combinaciones de dos o más de los anteriores. En ciertas modalidades, al menos puede añadirse un eliminador de radicales libres no reductor a una concentración que aumenta eficazmente la estabilidad a largo plazo de la formulación. También puede añadirse uno o más inhibidores de la oxidación por radicales libres/agentes de quelación en varias combinaciones, tal como un eliminador y un catión divalente. La elección de agente de quelación determinará si es necesaria o no la adición de un eliminador.

En ciertas modalidades, una formulación de la invención que es compatible con la administración parenteral comprende uno o más tensioactivos iónicos, incluyendo pero sin limitarse a, ésteres de ácido graso de polioxietileno sorbitano, Polysorbate-80 (Tween 80), Polysorbate-60 (Tween 60), Polysorbate-40 (Tween 40) y Polysorbate-20 (Tween 20), polioxietileno-alquil éteres, incluyendo pero sin limitarse a, Brij 58, Brij 35, así como otros tales como Tritón X-100; Tritón X- 114, NP40, Span 85 y la serie de tensioactivos no iónicos de Pluronic (por ejemplo, Pluronic 121), con componentes preferidos Polysorbate-80 a una concentración de aproximadamente un 0.001 % a aproximadamente un 2 % (prefiriéndose hasta aproximadamente un 0.25 %) o Polysorbate-40 a una concentración de aproximadamente de un 0.001 % a un 1 % (prefiriéndose hasta aproximadamente un 0.5 %).

En ciertas modalidades, una formulación de la invención comprende uno o más agentes de estabilización adicionales adecuados para su administración parenteral, por ejemplo, un agente reductor que comprende al menos un grupo tiol (-SH) (por ejemplo, cisteína, N-acetilcisteína, glutatión reducido, tioglicolato de sodio, tiosulfato, monotioglicerol, o mezclas de los mismos). Alternativa u opcionalmente, las formulaciones de composición inmunogénica que contienen conservante de la invención pueden estabilizarse adicionalmente eliminando el oxígeno de los recipientes de almacenamiento, protegiendo a la formulación de la luz (por ejemplo, usando recipientes de vidrio de color ámbar).

Las formulaciones de composición inmunogénica que contienen conservante de la invención pueden comprender uno o más portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables, lo que incluye cualquier excipiente que no induce por sí mismo una respuesta inmunitaria. Los excipientes adecuados incluyen pero no se limitan a macromoléculas tales como proteínas, sacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa (Paoletti y col, 2001 , Vaccine, 19:2118), trehalosa, lactosa y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas). Tales portadores son bien conocidos por el experto. Excipientes farmacéuticamente aceptables se analizan, por ejemplo, en Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN:0683306472.

Las composiciones de la invención pueden estar líofilizadas o en forma acuosa, es decir disoluciones o suspensiones. Las formulaciones líquidas pueden administrarse de forma ventajosa directamente a partir de su forma envasada y son por lo tanto ideales para inyección sin la necesidad de reconstitución en medio acuoso tal como se requiere de otro modo para composiciones liofilizadas de la invención.

La administración directa de composiciones inmunogénicas de la presente invención a un sujeto puede llevarse a cabo mediante la administración parenteral (por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía intravenosa, o en el espacio intersticial de un tejido); o mediante administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administración mucosa. En una modalidad preferida, la administración parenteral es mediante inyección intramuscular, por ejemplo, en el muslo o el brazo del sujeto. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero alternativamente puede usarse una inyección libre de aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0.5 mi. Las composiciones de la invención pueden prepararse en varias formas, por ejemplo, para inyección o bien como disoluciones líquidas o bien como suspensiones. En ciertas modalidades, la composición puede prepararse como un polvo o pulverización para su administración pulmonar, por ejemplo, en un inhalador. En otras modalidades, la composición puede prepararse como un supositorio u óvulo vaginal, o para su administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, como una pulverización, gotas, gel o polvo.

La cantidad de conjugado en cada dosis de composición inmunogénica se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos adversos significativos. Tal cantidad puede variar dependiendo del serotipo estafilocócico. En general, cada dosis comprenderá de 0.1 a 100 pg de polisacárido, en particular de 0.1 a 10 pg, y más en particular de 1 a 5 pg.

Pueden determinarse unas cantidades óptimas de componentes para una composición inmunogénica particular mediante unos estudios convencionales que implican la observación de unas respuestas inmunitarias apropiadas en los sujetos. Siguiendo una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o vahas inmunizaciones de refuerzo separadas de forma adecuada.

Acondicionamiento y formas farmacéuticas Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden envasarse forma de dosis unitaria o múltiples dosis (por ejemplo, 2 dosis, 4 dosis, o más). Para formas de múltiples dosis, habitualmente pero no necesariamente se prefieren los viales con respecto a las jeringuilla previamente cargadas. Los formatos de múltiples dosis adecuados incluyen pero no se limitan a: de 2 a 10 dosis por recipiente a 0.1 a 2 mi por dosis. En ciertas modalidades, la dosis es una dosis de 0.5 mi. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO2007/127668, que se incorpora por referencia en el presente documento.

Las composiciones pueden presentarse en viales u otros recipientes de almacenamiento adecuados, o pueden presentarse en dispositivos de administración cargados previamente, por ejemplo, jeringuillas de un solo componente o múltiples componentes, que pueden suministrarse con o sin agujas. Una jeringuilla habitualmente, pero no necesariamente, contiene una dosis individual de la composición inmunogénica con contenido en conservante de la invención, a pesar de que también se prevén jeringuillas de múltiples dosis, cargadas previamente. De forma similar, un vial puede incluir una dosis individual pero alternativamente puede incluir múltiples dosis.

Los volúmenes de dosificación eficaces pueden establecerse de forma rutinaria, pero una dosis típica de la composición para inyección tiene un volumen de 0.5 mi. En ciertas modalidades, la dosis se formula para la administración a un sujeto humano. En ciertas modalidades, la dosis se formula para la administración a un sujeto humano adulto, joven, adolescente, niño o lactante (es decir, no más de un año de edad) y en modalidades preferidas puede administrarse mediante inyección.

Las composiciones inmunogénicas líquidas de la invención son también adecuadas para reconstituir otras composiciones inmunogénicas que se presentan en forma liofilizada. Cuando una composición inmunogénica va a usarse para tal reconstitución extemporánea, la invención proporciona un kit con dos o más viales, dos o más jeringuillas cargadas preparadas, o uno o más de cada, usándose el contenido de la jeringuilla para reconstituir el contenido del vial antes de la inyección, o viceversa.

Alternativamente, las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden liofilizarse y reconstituirse, por ejemplo, usando uno de una multitud de métodos para la liofilización que se conocen bien en la técnica para formar partículas secas, de forma regular (por ejemplo, esférica), tal como microgránulos o esferas, que tienen características de partícula tales como tamaños de diámetro medio que pueden seleccionarse y controlarse variando los métodos exactos que se usan para prepararlos. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender además un adyuvante que puede prepararse opcionalmente con o estar contenido en partículas secas, de forma regular (por ejemplo, esféricas) separadas tales como microgránulos o esferas. En tales modalidades, la presente invención proporciona además un kit de composición inmunogénica que comprende un primer componente que incluye una composición inmunogénica seca, estabilizada, que comprende además opcionalmente uno o más conservantes de la invención, y un segundo componente que comprende una disolución acuosa, estéril, para la reconstitución del primer componente. En ciertas modalidades, la disolución acuosa comprende uno o más conservantes, y puede comprender opcionalmente al menos un adyuvante (véase, por ejemplo, el documento WO2009/109550 (que se incorpora en el presente documento por referencia).

Aún en otra modalidad, un recipiente del formato de múltiples dosis se selecciona de uno o más del grupo que consiste en, pero sin limitarse a, artículos de vidrio de laboratorio generales, matraces, vasos de precipitados, cilindros graduados, fermentadores, biorreactores, tubos, tuberías, bolsas, jarras, viales, cierres para viales (por ejemplo, un tapón de caucho, un tornillo en la tapa), ampollas, jeringuillas, jeringuillas de doble cámara o de múltiples cámaras, tapones de jeringuilla, émbolos de jeringuillas, cierres de caucho, cierres de plástico, cierres de vidrio, cartuchos y plumas desechables y similares. El recipiente de la presente invención no está limitado en cuanto al material de fabricación, e incluye materiales tales como vidrio, metales (por ejemplo, acero, acero inoxidable, aluminio, etc.) y polímeros (por ejemplo, termoplásticos, elastómeros, elastómeros termoplásticos). En una modalidad particular, el recipiente del formato es un vial de vidrio Schott tipo 1 de 5 mi con un tapón de butilo. El experto apreciará que el formato expuesto anteriormente no es de ningún modo una lista exhaustiva, sino que simplemente sirve como guía para el experto con respecto a la variedad de formatos disponibles para la presente invención. Formatos adicionales contemplados para su uso en la presente invención pueden encontrarse en catálogos publicados de vendedores y fabricantes de equipos de laboratorio tales como United States Plástic Corp. (Lima, OH), VWR.

Métodos para fabricar conjugados inmunogénicos La presente invención también incluye métodos de fabricación de los conjugados inmunogénicos que se describen en el presente documento. Los métodos para fabricar los conjugados inmunogénicos de la invención implican una conjugación covalente de los polisacáridos capsulares con las proteínas portadoras usando una química de conjugación que implica CDI (1 ,1-carbonildiimidazol), CDT (1 ,1-carboil-di-1 ,2,4-triazol) o PDPH (3-(2- piridilditio)-propionil-hidrazida).

Por consiguiente, una modalidad de la invención proporciona un método de fabricación basado en CDT de un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador, comprendiendo el método las etapas de: a) combinar un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus con imidazol o triazol para producir un polisacárido combinado; b) hacer que reaccione el polisacárido combinado con CDT en un disolvente orgánico y aproximadamente un 0.1 % a aproximadamente un 0.3 % p/v de agua para producir un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado; c) purificar el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado para producir un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado purificado; d) hacer que reaccione el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado purificado con una proteína de portador en el disolvente orgánico para producir un conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador; y e) hidrolizar el conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador para eliminar grupos de activación sin reaccionar; medíante lo cual se produce un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador. En una modalidad, antes de la etapa (d), el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado purificado se combina con una proteína de portador.

En una modalidad de la invención, se prevé otro método de fabricación basado en CDT de un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador, comprendiendo el método las etapas de: a) combinar un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus con imidazol o triazol para producir un polisacárido combinado; b) hacer que reaccione el polisacárido combinado con CDT en un disolvente orgánico y aproximadamente un 0.1 % a aproximadamente un 0.3 % p/v de agua para producir un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado; c) hacer que reaccione el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado con una proteína de portador en el disolvente orgánico para producir un conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador; y d) hidrolizar el conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador para eliminar grupos de activación sin reaccionar; mediante lo cual se produce un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, el disolvente orgánico dentro de los métodos de fabricación basados en CDT de un conjugado inmunogénico es un disolvente aprótico polar. En una modalidad, el disolvente orgánico es un disolvente aprótico polar que se selecciona del grupo que consiste en dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, y hexametilfosforamida (HMPA). En una modalidad, el disolvente orgánico es DMSO.

En una modalidad, la etapa de hacer que reaccione el polisacárido combinado con CDT dentro de los métodos de fabricación basados en CDT de un conjugado inmunogénico comprende proporcionar aproximadamente un exceso molar de 20 veces de CDT en comparación con el polisacárido.

En una modalidad, la etapa de purificar el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado dentro de los métodos de fabricación basados en CDT de un conjugado inmunogénico comprende una diafiltración.

En una modalidad, la proteína de portador dentro de los métodos de fabricación basados en CDT de un conjugado inmunogénico es la CRM197. En una modalidad, el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado dentro de los métodos de fabricación de un conjugado inmunogénico se hace que reaccione con la CRM197 en una razón en peso de aproximadamente 1 :1.

En una modalidad, la etapa de hidrolización del conjugado de polisacárido de serotipo 5 u 8-proteína de portador para eliminar grupos de activación sin reaccionar dentro de los métodos de fabricación basados en CDT de un conjugado inmunogénico comprende la dilución en un tampón y mantener un pH de aproximadamente 8.8 a aproximadamente 9.2 durante al menos 4 horas a de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 26 °C. En una modalidad, la etapa de hidrolización del conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador comprende la dilución en un tampón y mantener un pH de aproximadamente 9.0 durante al menos 4 horas a aproximadamente 23 °C.

En una modalidad, se purifica el conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que se produce de acuerdo con los métodos de fabricación basados en CDT de un conjugado inmunogénico. En una modalidad, la purificación del conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador comprende una diafiltración.

En una modalidad, antes de hacer que reaccione el polisacárido combinado con CDT dentro de los métodos de fabricación basados en CDT de un conjugado inmunogénico, el polisacárido combinado de serotipo 5 u 8 se liofiliza y resuspende. En una modalidad, tanto el polisacárido combinado como la proteína de portador son por separado liofilizado y se resuspenden antes de hacer que reaccione el polisacárido combinado con CDT. En una modalidad, el polisacárido combinado liofilizado y/o la proteína de portador liofilizada se resuspenden en un disolvente orgánico. En una modalidad, el disolvente orgánico es DMSO.

En una modalidad, antes de hacer que reaccione el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado combinado con una proteína de portador dentro del método de fabricación basado en CDT de un conjugado inmunogénico, el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado purificado y la proteína de portador se liofilizan por separado y se resuspenden. En una modalidad, la proteína de portador es la CRM197 y antes de la liofilización la CRMi97 se somete a diafiltración frente a NaCI. En una modalidad, antes de la liofilización la CRIv se somete a diafiltración frente a NaCI y la razón en p/p de NaCI/CRM se ajusta a de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5.

Una modalidad de la presente invención proporciona un método de fabricación basado en PDPH de un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador, comprendiendo el método las etapas de: a) hacer que reaccione un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus con PDPH y una carbodiimida en un disolvente orgánico para producir un polisacárido unido a PDPH; b) hacer que reaccione el polisacárido unido a PDPH con un agente reductor para producir un polisacárido activado; c) purificar el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado para producir un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado purificado; d) hacer que reaccione una proteína de portador con un ácido bromoacético en un disolvente orgánico para producir una proteína de portador activada; e) purificar la proteína de portador activada para producir una proteína de portador activada purificada; f) hacer que reaccione el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado purificado con la proteína de portador activada purificada para producir un conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador; y g) hidrolizar el conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador para eliminar grupos de activación sin reaccionar; mediante lo cual se produce un conjugado inmunogénico que comprende un polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 de S. aureus conjugado con una proteína de portador.

En una modalidad, el ácido bromoacético que se usa dentro de los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico es un éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético (BAANS). En una modalidad, la proteína de portador que se usa dentro de los métodos basados en PDPH de la invención es la CRM19 y el BAANS se añade en una razón en peso de CRMi9 :BAANS de aproximadamente 1:0.1 a aproximadamente 1 :0.5.

En una modalidad, el disolvente orgánico dentro de los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico es un disolvente aprótico polar. En una modalidad, el disolvente orgánico es un disolvente aprótico polar que se selecciona del grupo que consiste en DMSO, DMF, dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, y HMPA. En una modalidad, el disolvente orgánico es DMSO.

En una modalidad, la carbodiimida que se usa dentro de los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico es 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC). En una modalidad, la etapa de hacer que reaccione el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 con PDPH y EDAC en un disolvente orgánico comprende mantener una razón en peso de polisacárido:PDPH:EDAC de aproximadamente 1 :5:3.

En una modalidad, el agente reductor que se usa dentro de los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico es ditiotreitol (DTT).

En una modalidad, cada una de las etapas de purificar el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado y purificar la proteína de portador dentro de los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico comprende diafiltración.

En una modalidad, la proteína de portador dentro de los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico es la CRM197. En una modalidad, el polisacárido de serotipo 5 u 8 activado dentro de los métodos de fabricación de un conjugado inmunogénico se hace que reaccione con la CRM^r en una razón en peso de aproximadamente 1 :1.

En una modalidad, la etapa de hidrolización del conjugado de polisacárido de serotipo 5 u 8-proteína de portador para eliminar grupos de activación sin reaccionar dentro de los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico comprende la adición de clorhidrato de cisteamina.

En una modalidad, se purifica el conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador que se produce de acuerdo con los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico. En una modalidad, la purificación del conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 u 8-proteína de portador comprende una diafiltración.

En una modalidad, antes de hacer que reaccione el polisacárido capsular de serotipo 5 u 8 activado purificado con la proteína de portador activada purificada dentro de los métodos de fabricación basados en PDPH de un conjugado inmunogénico, tanto el polisacárido activado purificado como la proteína de portador activada purificada se liofilizan por separado y se resuspenden. En una modalidad, el polisacárido activado liofilizado y/o la proteína de portador activada liofilizada se resuspenden en un disolvente orgánico. En una modalidad, el disolvente orgánico es DMSO.

Tal como se usa en el presente documento, "liofilización" quiere decir un método de des idratación el que el polisacárido capsular bacteriano se congela mientras que se reduce la presión del entorno en presencia de suficiente calor para permitir que el agua congelada sublime directamente a partir de una fase sólida hasta una fase gaseosa. Puede usarse método conocido en la técnica para liofilizar polisacáridos. Véase, por ejemplo, Harris & Angal (1989) "Protein Purification Methods", en: Kennedy & Cabral, eds. "Recovery Métodos for Biological Materials" (John Wiley & Sons; 1993); la patente de los Estados Unidos con n.° 4,134,214; y la publicación de solicitud de patente internacional con n.° WO 2003/086471 ; cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia como si se hubiera expuesto en su totalidad. Opcionalmente, puede incluirse un crioprotector durante la liofilización, tal como, por ejemplo, sacarosa, glucosa, lactosa, trehalosa, arabinosa, xilosa, galactosa, sorbitol o manitol.

Tal como se usa en el presente documento, "activar" y "activación" quiere decir que un polisacárido capsular bacteriano o proteína de portador se modifica de tal modo que se vuelve sensible a conjugación (es decir, al menos un resto debe hacerse capaz de unirse covalentemente a la molécula portadora). Por ejemplo, con respecto a Métodos de conjugación basados en CDT de la presente invención, el polisacárido se activa en un entorno de baja humedad (por ejemplo, en DMSO) para formar restos de carbamato de triazol con restos adiltriazol e hidroxilos disponibles con ácidos carboxílicos. Los polisacáridos activados pueden hacerse reaccionar a continuación con la proteína CRM197, lo que conduce al desplazamiento nucleofílico del triazol mediante residuos de lisina dentro de CRM197 y formación de un enlace de carbamato (para hidroxiios activados) y el enlace de amida (para ácidos carboxílicos activados). Por el contrario, con respecto a los métodos de conjugación basados en PDPH de la presente invención, tanto las proteínas portadoras como los polisacáridos se activan antes de la conjugación: 1) la activación de CR 197 implica introducir grupos bromoacetilo en la proteína CRM197 mediante reacción de grupos amina con el éster de N-hidroxisuccimida de ácido bromoacético; y 2) la activación de polisacárido implica acoplar la carbodiimida-grupos carboxilato activados de Ácido N-acetilmanosaminourónico en el polisacárido con el grupo hidrazida del ligador heterobifuncional de hidrazida reactiva-sulfhidrilo PDPH, seguido por la reducción con DTT. Los polisacáridos activados pueden hacerse reaccionar a continuación con la proteína de portador activada de tal modo que los tioles de PDPH-polisacáridos tiolados reaccionan con grupos bromoacetilo de proteína de portador activada dando como resultado un enlace covalente de tioéter formado por desplazamiento de bromuro.

De acuerdo con los métodos de la invención, pueden purificarse los polisacáridos capsulares, proteínas portadoras, y/o conjugados de polisacárido-proteína. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para purificar polisacáridos o proteínas, tal como concentración/diafiltración, precipitation/elución, cromatografía en columna y filtración profunda. Véase, por ejemplo, Farrés y col. (1996) Biotechnol. Tech. 10:375 a 380; Goncalves y col. en: Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology (Antonio Méndez Vilas, ed. 1a ed. Badajoz, España: Formatex; 2007. págs. 450 a 457); Tanizaki y col. (1996) J. Microbiol. Methods 27:19 a 23; y la patente de los Estados Unidos con n.° 6,146,902; y la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos con n.° 2008/0286838; cada una de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia como si se hubiera expuesto en su totalidad.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "aislado" o "purificado" quiere decir que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural o de su organismo huésped si éste es una entidad recombinante, o se lleva de un entorno a un entorno diferente). Por ejemplo, un polisacárido aislado, péptido o proteína está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes en la célula o fuente de tejido de la que se deriva la proteína, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente o está presente de otro modo en una mezcla como parte de una reacción química. En la presente invención, la proteína o polisacárido puede aislarse a partir de la célula bacteriana o a partir del residuo celular, de tal modo que se proporcionan en una forma útil en la fabricación de una composición inmunogénica. La expresión "aislado" o "aislar" puede incluir purificar, o purificación, incluyendo por ejemplo, los métodos de purificación de los polisacáridos capsulares, tal como se describe en el presente documento. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de un polisacárido/polipéptido/proteína en las que el polisacárido/polipéptido/proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que se aisla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, un polipéptido/proteína, polisacárido, o conjugado que está sustancialmente libre de material celular u otros compuestos incluye preparaciones del polipéptido/proteína, polisacárido, o conjugado que tienen menos de aproximadamente un 30 %, un 20 %, un 10 %, un 5 %, un 2.5 % o un 1 % (en peso seco) de proteína, polisacárido, u otros compuestos contaminantes. Cuando el polipéptido/proteína se produce de forma recombinante, está también preferentemente sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente un 20 %, un 10 %, un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 %, o un 1 % del volumen de la preparación de proteína. Cuando el polipéptido/proteína o polisacárido se produce mediante síntesis química, está preferentemente sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, se separa de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína o polisacárido. Por consiguiente, tales preparaciones del polipéptido/proteína o polisacárido tienen menos de aproximadamente un 30 %, un 20 %, un 10 %, un 5 %, un 4 %, un 3 %, un 2 %, o un 1 % (en peso seco) de precursores químicos o compuestos distintos del fragmento de polipéptido/proteína o polisacárido de interés.

Los conjugados inmunogénicos que se producen mediante cualquiera de los métodos que se describen en el presente documento pueden almacenarse en agua o en un tampón de pH neutro de baja fuerza iónica o liofilizarse en un polvo seco.

Métodos para inducir una respuesta inmunitaria y proteger frente a infección por S. Aureus La presente invención también incluye métodos de uso para composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento. Por ejemplo, una modalidad de la invención proporciona un método de inducción de una respuesta inmunitaria frente a S. aureus que comprende la administración a un sujeto de una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento. Una modalidad de la invención proporciona un método de protección de un sujeto frente a una infección con S. aureus, o un método de prevención de infección con S. aureus, o un método de reducción de la gravedad de o retardo de la aparición de al menos un síntoma asociado con una infección causada por S. aureus, comprendiendo los métodos la administración a un sujeto de una cantidad inmunogénica de cualquiera de las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento. Una modalidad de la invención proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad, afección o infección por estafilococos asociada con una Staphylococcus sp. en un sujeto, comprendiendo el método la etapa de administración de una cantidad eficaz de forma terapéutica o profiláctica de una composición inmunogénica que se describe en el presente documento al sujeto. En algunas modalidades, el método de tratamiento o prevención de una infección, enfermedad o afecciones por estafilococos comprende tratamiento en seres humanos, veterinaria, en animales o en la agricultura. Otra modalidad proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad, afección o infección por estafilococos asociada con una Staphylococcus sp. en un sujeto, comprendiendo el método la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales a partir de la composición inmunogénica que se describe en el presente documento, y usando dicha preparación de anticuerpos para conferir inmunidad pasiva al sujeto. Una modalidad de la invención proporciona un método de prevención de una infección por estafilococos en un sujeto que se somete a un método quirúrgico, comprendiendo el método la etapa de administración de una cantidad eficaz de forma profiláctica de una composición inmunogénica que se describe en el presente documento al sujeto antes del método quirúrgico.

Una "respuesta inmunitaria" frente a un antígeno o composición inmunogénica es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria mediada por células frente a moléculas presentes en el antígeno o composición de vacuna de interés. Para los fines de la presente invención, una "respuesta inmunitaria humoral" es una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos e implica la inducción y generación de anticuerpos que reconocen y se unen con cierta afinidad por el antígeno en la composición inmunogénica de la invención, mientras que una "respuesta inmunitaria mediada por células" es una respuesta mediada por células T y/u otros glóbulos blancos. Una "respuesta inmunitaria mediada por células" se provoca mediante la presentación de epítopos antigénicos en asociación con moléculas de clase I o de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), CD1 u otras moléculas similares al CMH no clásicas. Ésta activa células T CD4+ cooperadoras específicas de antígeno o linfocitos T citotóxicos CD8+ ("CTL"). Los CTL tienen espeficificidad por antígenos peptídicos que se presentan en asociación con proteínas codificadas por CMH clásicos y no clásicos y se expresan sobre las superficies de células. Los CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de microbios intracelulares, o la lisis de células infectadas con tales microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica de antígeno mediante las células T cooperadoras. Las células T cooperadoras actúan para ayudar a estimular la función, y enfocan la actividad de, células efectoras no específicas frente a células que presentan péptido u otros antígenos en asociación con moléculas clásicas o no clásicas de CMH en su superficie. Una "respuesta inmunitaria mediada por células" también se refiere a la producción de citocinas, quimiocinas y otras moléculas de este tipo que se producen mediante células T activadas y/u otros glóbulos blancos, incluyendo las derivadas de células T CD4+ y CD8+. La capacidad de una composición o antígeno particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por células puede determinarse mediante un número de ensayos, tal como mediante ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos de células citotóxicas CTL, sometiendo a ensayo linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado, o mediante la medición de la producción de citocinas por células T en respuesta a la reestimulación con antígeno. Tales ensayos se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Erickson y col. (1993) J. Immunol. 151 :4189 a 4199; y Doe y col. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2369 a 2376.

Tal como se usa en el presente documento, "tratamiento" (incluyendo variaciones del mismo, por ejemplo, "tratar" o "tratado") quiere decir uno o más cualquiera de lo siguiente: (i) la prevención de infección o reinfección, como en una vacuna tradicional, (ii) la reducción en la gravedad de, o, en la eliminación de síntomas, y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno o trastorno en cuestión. Por lo tanto, el tratamiento puede efectuarse de forma profiláctica (antes de infección) o terapéuticamente (tras la infección). En la presente invención, el tratamiento profiláctico es el modo preferido. De acuerdo con una modalidad particular de la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos que tratan, incluyendo inmunizar de forma profiláctica y/o terapéutica, un huésped animal frente a una infección microbiana (por ejemplo, una bacteria tal como estafilococo). Los métodos de la presente invención son útiles para conferir inmunidad profiláctica y/o terapéutica a un sujeto. Los métodos de la presente invención pueden también ponerse en práctica en sujetos para aplicaciones de investigación biomédica.

Tal como se usa en el presente documento, "mamífero" quiere decir un ser humano o animal distinto de ser humano. Más en particular, mamífero se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoo, deportivos y mascotas de compañía tales como una mascota doméstica y otro animal domesticado incluyendo, pero sin limitarse a, ganado bovino, ovejas, hurones, cerdos, caballos, conejos, cabras, perros, gatos, y similares. Los animales de compañía preferidos son perros y gatos. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

Una "cantidad inmunogénica", y "cantidad inmunológicamente eficaz", usándose ambas de forma intercambiable en el presente documento, se refiere a la cantidad de antígeno o composición inmunogénica suficiente para provocar una respuesta inmunitaria, o bien una respuesta celular (célula T) o bien humoral (células B o anticuerpo), o ambas, tal como se mide por ensayos convencionales conocidos por un experto en la técnica.

Las cantidades de un conjugado particular en una composición se calculan en general en base al polisacárido total, conjugado y no conjugado para ese conjugado. Por ejemplo, un conjugado de CP5 con un 20 % de polisacárido libre tendrá aproximadamente 80 mcg de polisacárido CP5 conjugado y aproximadamente 20 mcg de polisacárido CP5 no conjugado en una dosis de polisacárido CP5 de 100 mcg. La contribución de la proteína al conjugado no se considera normalmente cuando se calcula la dosis de un conjugado. La cantidad de conjugado puede variar dependiendo del serotipo estafilocócico. En general, cada dosis comprenderá de 0.1 a 100 mcg de polisacárido, en particular de 0.1 a 10 mcg, y más en particular de 1 a 10 mcg. La "cantidad ¡nmunogénica" de los componentes de polisacárido diferentes en la composición ¡nmunogénica, puede divergir y cada uno puede comprender 1 mcg, 2 mcg, 3 mcg, 4 mcg, 5 mcg, 6 mcg, 7 mcg, 8 mcg, 9 mcg, 10 mcg, 15 mcg, 20 mcg, 30 mcg, 40 mcg, 50 mcg, 60 mcg, 70 mcg, 80 mcg, 90 mcg, o aproximadamente 100 mcg de cualquier antígeno de polisacárido particular.

"Enfermedad invasiva" por S. aureus es el aislamiento de bacterias a partir de un sitio normalmente estéril, en el que están asociados signos/síntomas clínicos de enfermedad. Los sitios del organismo normalmente estériles incluyen sangre, LCR, fluido pleural, fluido pericárdico, fluido peritoneal, fluido articular/sinovial, hueso, sitio interno del organismo (ganglio linfático, cerebro, corazón, hígado, bazo, fluido vitreo, riñon, páncreas, ovario) u otros sitios normalmente estériles. Las afecciones clínicas que caracterizan a las enfermedades invasivas incluyen bacteriemia, neumonía, celulitis, osteomielitis, endocarditis, choque septicémico y más.

La eficacia de un antígeno como un inmunógeno, puede medirse o bien mediante ensayos de proliferación, mediante ensayos citolíticos, tales como ensayos de liberación de cromo para medir la capacidad de una célula T para lisar su célula diana específica, o bien midiendo los niveles de actividad de células B midiendo los niveles de anticuerpos en circulación específicos para el antígeno en el suero. Una respuesta inmunitaria puede detectarse también midiendo los niveles en suero de anticuerpo específico de antígeno que se induce a continuación de la administración del antígeno, y más específicamente, midiendo la capacidad de los anticuerpos que se inducen de tal forma para aumentar la capacidad opsonofagocítica de glóbulos blancos particulares, tal como se describe en el presente documento. El nivel de protección de la respuesta inmunitaria puede medirse exponiendo el huésped inmunizado al antígeno que se ha administrado. Por ejemplo, si el antígeno con respecto al que se desea una respuesta inmunitaria es una bacteria, el nivel de protección que se induce mediante la cantidad inmunogénica del antígeno se mide detectando el porcentaje de supervivencia o el porcentaje de mortalidad después de una exposición de los animales a las células bacterianas. En una modalidad, la cantidad de protección puede medirse midiendo al menos un síntoma asociado con la infección bacteriana, por ejemplo, una fiebre asociada con la infección. La cantidad de cada uno de los antígenos en la vacuna o en las composiciones inmunogénicas multiantígeno o multicomponente variará con respecto a cada uno de los otros componentes y puede determinarse mediante métodos conocidos por el experto. Tales métodos incluirían unos métodos para medir la inmunogenicidad y/ o la eficacia en vivo. En ciertas modalidades, la expresión "aproximadamente" quiere decir dentro de un 20 %, preferentemente dentro de un 10 %, y más preferentemente dentro de un 5 %.

La invención proporciona además anticuerpos y composiciones de anticuerpos que se unen específica y selectivamente a los conjugados inmunogénicos o polisacáridos capsulares de serotipo 5 u 8 de la presente invención. En algunas modalidades, los anticuerpos se generan después de la administración a un sujeto de los conjugados inmunogénicos o polisacáridos capsulares de serotipo 5 u 8 de la presente invención. En algunas modalidades, la invención proporciona unos anticuerpos purificados o aislados que se dirigen contra uno o más de los conjugados inmunogénicos o polisacáridos capsulares de serotipo 5 u 8 de la presente invención. En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención son funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias o bien en un modelo de eficacia animal o bien a través de un ensayo de destrucción opsonofagocítica. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención confieren inmunidad pasiva a un sujeto. La presente invención proporciona además unas moléculas de polinucleótido que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención, y una célula, línea celular (tal como células de hibridoma u otras líneas celulares diseñadas por ingeniería genética para la producción recombinante de anticuerpos) o un animal transgénico que produce un anticuerpo o una composición de anticuerpo de la invención, usando unas técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los anticuerpos o composiciones de anticuerpos de la invención pueden usarse en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad, afección o infección por estafilococos asociada con una Staphylococcus sp. en un sujeto, comprendiendo el método la generación de una preparación de anticuerpos policlonales o monoclonales, y el uso de dicho anticuerpo o composición de anticuerpo para conferir inmunidad pasiva al sujeto. Los anticuerpos de la invención pueden ser útiles también para métodos de diagnóstico, por ejemplo, detectar la presencia o cuantificar los niveles de CP5, de CP8 o de un conjugado de los mismos.

Varios modelos animales que se conocen en la técnica pueden usarse para evaluar la eficacia de una cualquiera de las composiciones inmunogénicas que se describen en el presente documento. Por ejemplo: Modelo murino de septicemia pasivo: Se inmunizan unos ratones de forma pasiva por vía intraperitoneal (i.p.) con IgG inmunitario o anticuerpo monoclonal. Los ratones se exponen 24 horas más tarde a una dosis letal de S. aureus. La exposición bacteriana se administra por vía intravenosa (i.v. o i.p.) lo que asegura que cualquier supervivencia puede atribuirse a la interacción en vivo específica del anticuerpo con las bacterias. Se determina que la dosis de exposición bacteriana es la dosis que se requiere para conseguir una septicemia letal de aproximadamente un 20 % de los ratones de control no inmunizados. La evaluación estadística de los estudios de supervivencia puede llevarse a cabo mediante un análisis de Kaplan-Meier.

Inmunización activa y modelo de exposición: En este modelo, se inmunizan unos ratones de forma activa por vía subcutánea (SC) con un antígeno diana a 0, 3 y 6 semanas (o un programa similar conocido por los expertos en la técnica) y se exponen a S. aureus en la semana 8 (o otro programa similar conocido por los expertos en la técnica) por la vía intravenosa o intraperitoneal. La dosis de exposición bacteriana se calibra para obtener aproximadamente un 20 % supervivencia en el grupo de control a lo largo de un periodo de 14 días. La evaluación estadística de los estudios de supervivencia puede llevarse a cabo mediante un análisis de Kaplan-Meier.

Modelo de endocarditis infecciosa pasiva: Un modelo de inmunización pasiva para endocarditis infecciosa (IE) causada por S. aureus se ha usado anteriormente para mostrar que el ClfA puede inducir una inmunidad protectora. Véase el documento de Vernachio y col. (2006) Antmicro. Agents & Chemo. 50:511 a 518. En este modelo de IE, se usan conejos o ratas para simular unas infecciones clínicas que incluyen un catéter venoso central, bacteriemia, y siembra hematógena a órganos distales. A unos conejos o ratas cateterizados con vegetaciones de válvula aórtica estériles se les administra una única inyección intravenosa de un anticuerpo monoclonal o policlonal específico para el antígeno diana. Después de 24 horas, los animales se exponen por vía i.v. a una cepa de MRSA o a cepas estafilocócicas heterólogas. A continuación, 48 horas después de una exposición, las vegetaciones cardíacas, los ríñones y la sangre se recolectan y se cultivan. La frecuencia de infección por estafilococos en las vegetaciones de válvula cardíaca, los ríñones y la sangre se mide a continuación. En un estudio, cuando los animales se expusieron a o bien MRSE ATCC 35984 o bien MRSA PFESA0003, se mostraron unas reducciones significativas en la velocidad de infección usando o bien la preparación de anticuerpos policlonales o bien la de anticuerpos monoclonales to ClfA. Véase el documento de Vernachio y col., citado anteriormente.

Modelo de endocarditis infecciosa pasiva: El modelo de endocarditis infecciosa se ha adaptado también para los estudios de inmunización activa. Se inmunizan conejos o ratas por vía intramuscular (IM) con un antígeno diana y se exponen a S. aureus dos semanas más tarde a través de la vía i.v..

Modelo de pielonefritis: En el modelo de pielonefritis, se inmunizan ratones en las semanas 0, 3 y 6 (o un programa similar conocido por los expertos en la técnica) con los antígenos diana. En la semana 8, los animales se exponen mediante, por ejemplo, una inyección por vía i.p. de, por ejemplo, 1.7 x 108 ufe PFESA0266 de S. aureus. Después de 48 horas, los ríñones y/o otros tejidos se recolectan y se cultivan. Por último, se recuentan las unidades de formación de colonias de exposición bacterias en los ríñones y/o en otros tejidos. Este modelo evalúa la diseminación sistémica en el animal.

Supervisión de anticuerpos funcionales usando ensayos de destrucción opsonofaqocíticas Las células efectoras diferenciadas a partir de una línea celular (por ejemplo, HL60) o células polimorfonucleares (PMN) aisladas de sangre de donante humano usando una disolución LYMPHOLYTE®-pol¡ (Cedarlane laboratories limited, Ontario, Canadá), de acuerdo con el protocolo del fabricante, pueden usarse para este ensayo. Las células efectoras volvieron a suspenderse en tampón de ensayo (medio de Eagle modificado con contenido en un 1 % de albúmina de suero bovino) a una concentración de aproximadamente 2 X 107 células/ml y se colocaron en una incubadora a 37 °C hasta que estuvieron listas para su uso. Se hizo que la cepa de S. aureus PFESA0266 creciera durante la noche sobre unas placas de agar de soja tríptico. Las células bacterianas se rasparon, se lavaron dos veces y volvieron a suspenderse en tampón de ensayo con un contenido de un 5 % de glicerol a una DO 600 = 1 , lo que es igual a una concentración de aproximadamente 5 X 108 ufc/ml. Unas alícuotas de un mi de la suspensión bacteriana se congelaron y se almacenaron a -40 °C hasta que estuvieron listas para su uso. La suspensión bacteriana congelada se descongeló y se ajustó a una concentración de 106 ufc/ml en tampón de ensayo y se colocó en hielo. El ensayo se realizó usando unas placas de polipropileno de 1 mi 96 de Deep-Well estériles. Unas diluciones en serie en dos veces de muestras de anticuerpo (50 µ?) se prepararon, a lo que siguió la adición de 300 µ? de tampón de ensayo a la mezcla de anticuerpos. Se añadieron bacterias (50 µ?) a las placas y se colocaron en un agitador rotatorio a 4 °C durante 30 minutos. La etapa de opsonización fue seguida por la adición de 50 µ? de complemento humano (un 1 % de la concentración final). Por último, se añadieron 50 µ? de células efectoras (107 células/ml concentración) a la placa y la suspensión se mezcló bien mediante pipeteo repetido. Una alícuota de 50 µ? de la suspensión se diluyó 10 veces en serie en una disolución de saponina al 1 % estéril, mediante agitación con vórtex para minimizar la aglutinación bacteriana y se colocó sobre una placa de agar de soja tríptico por duplicado. La placa de ensayo se incubó a 37 °C durante 1 hora con un mezclado continuo usando un agitador de tipo bandeja giratoria. Al final de la incubación, una alícuota de 50 µ? de suspensión se diluyó 10 veces en serie en una disolución de saponina al 1 % estéril, se mezcló mediante agitación con vórtice para minimizar la aglutinación bacteriana y se colocó sobre una placa de agar de soja tríptico por duplicado. El porcentaje de destrucción se calculó determinando la razón del número de ufe que sobrevivieron a 60 minutos en pocilios con bacterias, anticuerpos, complemento y células efectoras con respecto al número de ufe que sobrevivieron en tubos carentes de anticuerpos pero con contenido en bacterias, complemento y células efectoras. Los controles con contenido en bacterias, complemento, y sueros se incluyeron para ajustar cualquier reducción en ufe debida a la aglutinación.

Adsorción de complemento El suero a partir de donantes humanos adsorbido frente a cepas de S. aureus PFESA0266, PFESA0286 y PFESA0270 puede usarse como una fuente de complemento en el ensayo. Se hizo que crecieran unas cepas de S. aureus durante la noche sobre placas de TSA a 37 °C. Las células se rasparon de la placa y volvieron a suspenderse en PBS estéril. Las células bacterianas se centrifugaron a 10,000 rpm durante 10 minutos a 4 °C y el sedimento celular volvió a suspenderse en suero humano para su adsorción. El suero se incubó con bacterias en un Nutator a 4 °C durante 30 minutos. Las células se centrifugaron, el suero se transfirió a otro tubo con contenido en bacterias y la etapa de adsorción se repitió de nuevo durante 30 minutos. Por último, las células se centrifugaron y el suero se pasó a través de un filtro de 0.2 micrómetros antes de que 0.5 mi de alícuotas se congelaran en nitrógeno líquido.

Método II - OPA usando células HL-60 Las células HL-60 se diferenciaron de acuerdo con S. Romero-Steiner, y col., Clin Diagn Lab Immunol 4 (4) (1997), págs. 415 a 422. Las células HL-60 recolectadas volvieron a suspenderse en tampón de ensayo (medio de Eagle modificado con contenido en un 1 % de albúmina de suero bovino) a aproximadamente 108 células/ml y se colocaron en una incubadora a 37 °C hasta que estuvieron listas para su uso. Se hizo que S. aureus creciera durante la noche sobre unas placas de agar de soja tríptico. Las células bacterianas se rasparon, se lavaron dos veces y volvieron a suspenderse en tampón de ensayo con un contenido de un 5 % de glicerol a una DO 600 = 1 , lo que es igual a aproximadamente 5 X 108 ufc/ml. Unas alícuotas de un mi de la suspensión bacteriana se congelaron y se almacenaron a -40 °C hasta que estuvieron listas para su uso. La suspensión bacteriana congelada se descongeló y se ajustó a una concentración de 106 ufc/ml en tampón de ensayo y se colocó en hielo. El ensayo se realizó usando unas placas de polipropileno de 1 mi 96 de Deep-Well estériles. Se prepararon unas diluciones en serie en dos veces de muestras de anticuerpo monoclonal (25 µ?), a lo que siguió la adición de 150 pl de tampón de ensayo a la suspensión de anticuerpos. Se añadieron bacterias (25 µ?) a las placas y se colocaron en un agitador rotatorio a 4 °C durante 30 minutos seguido por la adición de 25 µ? de complemento humano (un 1 % de la concentración final). Por último, 25 µ? de células HL-60 (107 células/ml) se añadieron a la placa y la suspensión se mezcló bien mediante pipeteo repetido. Una alícuota de 25 µ? de la suspensión se diluyó 10 veces en serie en una disolución de saponina al 1 % estéril, se mezcló mediante agitación con vórtice para minimizar la aglutinación bacteriana y se colocó sobre una placa de agar de soja tríptico por duplicado. La placa de ensayo se incubó a 37 °C durante 1 hora con un mezclado continuo usando un agitador de tipo bandeja giratoria. Al final de la incubación, una alícuota de 25 µ? de suspensión se diluyó 10 veces en serie en una disolución de saponina al 1 % estéril, se mezcló mediante agitación con vórtice y se colocó sobre una placa de agar de soja tríptico por duplicado. El porcentaje de destrucción se calculó determinando la razón del número de ufe que sobrevivieron a 60 minutos en pocilios con bacterias, anticuerpos, complemento y células HL-60 con respecto al número de ufe que sobrevivieron en tubos carentes de anticuerpos pero con contenido en bacterias, complemento y células HL-60. Los controles con contenido en bacterias, complemento y AcM se incluyeron para ajustar cualquier reducción en ufe debida a la aglutinación.

Los siguientes ejemplos se prevén a modo de ilustración, no a modo de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Preparación de polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus.

En el presente ejemplo, se describe la producción de varios intervalos de tamaño de polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus. La estructura de la unidad de repetición de polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus se muestra en la figura 1. Los métodos que se describen en el presente documento son eficaces para producir polisacárido capsular de serotipo 8 con pesos moleculares que varían de aproximadamente 20 kDa a 700 kDa. Mediante una selección apropiada de las condiciones, pueden aislarse y purificarse polisacáridos capsulares de serotipo 8 de alto peso molecular variando de 50 kDa a 700 kDa en peso molecular. Para su uso en composiciones ¡nmunogénicas, el polisacárido capsular de serotipo 8 puede aislarse y purificarse variando de 70 kDa a 300 kDa en peso molecular y muchos intervalos deseados. En base a las características de crecimiento y a la cantidad de cápsula que se produce, se usaron unas cepas PFESA0005 o PFESA0286 para la producción de polisacárido capsular de serotipo 8. Las cápsulas aisladas a partir de las cepas PFESA0005 o PFESA0286 mostraron que eran idénticas.

Para la producción de polisacáridos capsulares de serotipo 8, se hizo que las cepas crecieran en un medio complejo que consistía principalmente en una fuente de carbono (o bien lactosa o bien sacarosa), harina de soja hidrolizada como la fuente de nitrógeno, y trazas de metales. Se hizo que las cepas crecieran en biorreactores durante de 2 a 5 días.

Antes del procesado en autoclave, una muestra se retiró para someter a prueba el nivel de la Enterotoxina estafilocócica B (SEB) en el cultivo. En presencia de un 0.05 % de Polysorbate 80, la concentración de SEB en la fermentación fue de 15 a 20 ng/ml. Experimentos previos mostraron que el procesado en autoclave del cultivo durante 1 hora redujo el nivel de SEB a menos de 0.1 ng/ml, que se encuentra por debajo del límite de detección para el kit TECRA.

Un polisacárido fraccionado en etanol, diafiltrado, se cargó en una columna Q-Sepharose AEC y se eluyó con un gradiente lineal de NaCI tal como se describe anteriormente. Las fracciones se analizaron mediante el ensayo de O-Acetilo y una prueba de doble inmunodifusión para determinar la presencia de polisacárido de serotipo 5 y un ensayo de fosfato para determinar la presencia de ácido teicoico (TA). La presencia de polisacárido de serotipo 8 se detectó en las fracciones 35 a 95 (las figuras 2A y 2B).

Para reducir la contaminación con ácido teicoico, las fracciones 35 a 75 se agruparon y cualquier ácido teicoico residual se oxidó con metaperyodato de sodio para permitir su eliminación mediante diafiltración de 3K frente a diH20.

La purificación de polisacárido capsular de serotipo 8 que se usa para la preparación de conjugados se realizó mediante dos métodos diferentes que se basan en una temperatura elevada y en un pH bajo para afectar a la liberación de cápsula a partir de la célula y reducir el peso molecular del polisacárido. El peso molecular resultante dependía del momento, la temperatura y el pH de la etapa de hidrólisis.

La caracterización del polisacárido capsular de serotipo 8 se realizó usando las técnicas que se especifican en el cuadro 1.

CUADRO 1 Ensayos de caracterización para polisacáridos capsulares de serotipo 8 de S. aureus purificados.

Especificidad Ensayo Proteína residual ensayo colorimétrico de Lowry Ácidos nucleicos residuales barrido de 260nm Ácido teicoico residual ensayo colorimétrico de fosfato Peptidoglicano residual HPAEC-PAD Tamaño SEC-MALLS Composición HPAEC-PAD Identidad 1 H-RMN o reacción con AcM específico O-acetilación 1H-RMN Concentración MALLS-RI o HPAEC-PAD Los polisacáridos de cápsula que se producen mediante los métodos que se describen a continuación dan como resultado unos polisacáridos puros bien caracterizados con bajos niveles de contaminantes de proteína, ácido nucleico, peptidoglicano y ácido teicoico.

En el primer método, a continuación de la liberación del polisacárido de cápsula a partir de la célula y de la reducción de peso molecular, la preparación se trató con un cóctel de enzimas (por ejemplo, ribonucleasa, desoxiribonucleasa, lisozima y proteasa) para digerir impurezas. Después de la incubación, las impurezas residuales se precipitan mediante la adición de etanol (concentración final de aproximadamente un 25 %). Después de la eliminación del etanol residual, una disolución con contenido en un polisacárido de cápsula se cargó en una columna de intercambio aniónico (Q-Sepharose) y se eluyó con un gradiente de sal lineal. Las fracciones con contenido en polisacárido de cápsula se agruparon y se trataron con metaperyodato de sodio. Este tratamiento dio como resultado la hidrólisis oxidativa del contaminante de ácido teicoico residual, pero no afectó al polisacárido capsular de serotipo 8. La reacción se extinguió mediante la adición de etilenglicol. El material se concentró y se diafiltró frente a dH20 para eliminar cualesquiera productos secundarios y reactivos residuales.

El segundo método se usó para producir polisacárido de cápsula sin el uso de enzimas para digerir las varias impurezas derivadas de célula. En el presente método, a continuación de la liberación del polisacárido de cápsula a partir de la célula y de la reducción de peso molecular, el caldo de fermentación hidrolizado se clarificó por microfiltración seguida por ultrafiltración y diafiltración. La disolución se trató con carbono activado para eliminar impurezas. Después del tratamiento de carbono, el material se trató con metaperyodato de sodio para oxidar el ácido teicoico residual seguido por una extinción con propilenglicol. El material se concentró y se diafiltró frente a dH20 para eliminar cualesquiera productos secundarios y reactivos residuales.

Las preparaciones que se producen usando cualquiera de los métodos dieron como resultado unos polisacáridos capsulares puros con bajos niveles de contaminantes de proteína, ácido nucleico y ácido teicoico. Los métodos que se describen pueden usarse para producir unos intervalos específicos de los polisacáridos de alto peso molecular deseados variando las condiciones de hidrólisis. En el cuadro 2 a continuación se muestran unos ejemplos de polisacárido capsular que puede obtenerse mediante los métodos que se describen en el presente documento. Los lotes de polisacárido capsular de serotipo 8 purificado tenían una alta pureza tal como se indica por la ausencia de ácido teicoico (TA), peptidoglicano y proteína residual baja. Véase el cuadro 2. El intervalo de pesos moleculares más bajos abarcaba de 20.4 kDa a 65.1 kDa, y los polisacáridos purificados estaban muy O-acetilados (-100 %). Los niveles de contaminación de ácido nucleico eran bajos (de un 0.12 a un 2.45 %).

CUADRO 2 Caracterización de las preparaciones de polisacárido capsular de serotipo 8.

CP8 purificado Muestra total MW Proteína Ácido Nuc. O-Acetilo mg (kDa) (g/mol) (Lowry) % (barrido de RMN % (p/p) 260 nm) % _ _ _ (p/p) _ _ 1 310 27.0 1.2 0,94 100 2 438 29.0 2.4 2 100 3 179 20.4 0.37 0.12 108 Selección de peso molecular de los polisacáridos capsulares: Un análisis cinético mostró que un amplio intervalo de pesos moleculares de polisacáridos de cápsula puede generarse mediante los métodos que se describen en el presente documento. Inicialmente, se produjeron unos polisacáridos más grandes mediante las células bacterianas, y posteriormente, un intervalo de peso molecular deseado puede seleccionarse y a continuación purificarse mediante la manipulación del pH y las condiciones de calor de las etapas de calentamiento y de hidrólisis.

El tratamiento térmico del caldo de fermentación de S. aureus es una etapa de método entre la fermentación y la recuperación de polisacárido capsular. Esta etapa de método usa calor para tratar el caldo de pH ajustado durante un periodo especificado. Los fines del tratamiento térmico a un pH bajo eran destruir células, inactivar enterotoxinas, liberar polisacárido unido a célula y reducir el peso molecular al tamaño deseado. Entre estos fines, la reducción de peso molecular era la menor en términos de tiempo de procesamiento requerido en esta etapa. Por lo tanto, los otros fines se lograron de forma inevitable dentro del plazo de tiempo del tratamiento considerado.

Tratamiento térmico: se determinaron las condiciones de pH y temperatura para seleccionar varios intervalos de peso molecular de los polisacáridos de cápsula. Se usó un fermentador Biolafitte de 15 I para estos estudios. El caldo de fermentación se transfirió al fermentador mediante una bomba peristáltica. Usando una velocidad de agitación de aproximadamente 200 rpm, el pH del caldo se ajustó con ácido sulfúrico concentrado. A continuación, la temperatura del caldo se elevó hasta el valor fijado. El tiempo de tratamiento térmico empezó en cuanto la temperatura alcanzó el punto fijado. Cuando se alcanzó el tiempo de tratamiento deseado, el caldo se enfrió hasta temperatura ambiente. Se tomaron muestras en método para determinar la concentración de polisacárido y el peso molecular mediante sistemas de HPLC y SEC-MALLS, respectivamente. Los datos del peso molecular (MW) se usaron en el análisis cinético. Los perfiles de MW se determinaron a lo largo del tiempo a un pH de 3.5, 4.0 y 5.0. Véase la figura 3A.

La cinética de hidrólisis ácida suave de polisacáridos se realizó usando polisacárido capsular de serotipo 8 purificado que se obtiene a partir del método. La disolución de polisacárido purificado se ajustó al pH deseado para el experimento con ácido sulfúrico. Aproximadamente 1.5 mi de la disolución se transfirió a cada uno de los tubos de centrífuga de 15 mi. Se colocaron los tubos en un baño de aceite equipado con un sistema de control de la temperatura de precisión. El tubo se sacó a un intervalo de tiempo predeterminado y se extinguió en un cubo de hielo. Al final del experimento, una alícuota de tampón Tris 1 M (pH 7.5) se añadió a la muestra para ajustar el pH de nuevo a aproximadamente 7. Las muestras se analizaron mediante un sistema SEC-MALLS. Los datos de MW se usaron en el análisis cinético. El efecto de la temperatura sobre el perfil de MW de CP8 a un pH de 3.5 se determinó a lo largo del tiempo. Véase la figura 3B.

Resultados Tal como se muestra en la figura 3A, un pH más bajo era más eficaz para reducir el peso molecular del polisacárido. Pesos moleculares entre 300 kDa y 600 kDa pueden generarse usando un pH de 5 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos. De forma similar, pesos moleculares entre 250 kDa y 450 kDa pueden generarse usando un pH de 4 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos. Además, pesos moleculares entre 120 kDa y 450 kDa pueden generarse usando un pH de 3.5 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos.

Tal como se muestra en la figura 3B, cuanto más alta es la temperatura, más rápida es la velocidad de hidrólisis y más amplio es el intervalo de los pesos moleculares de polisacárido que se produce con el tiempo. El uso de una temperatura más baja, 55 °C frente a 95 °C al mismo pH, produce un intervalo más estrecho de pesos moleculares de polisacárido.

Además, la figura 4 muestra una correlación entre el peso molecular de CP8 purificado con el tiempo de tratamiento para hidrólisis ácida suave (pH 3.5 a 95 °C). El polisacárido purificado es el producto final que se obtiene a partir del método de recuperación detallado anteriormente. Como también se muestra en la figura 4, un aumento en el tiempo de tratamiento térmico de la cepa S. aureus PFESA0005 a un pH de 3.5 dio como resultado CP8 de peso molecular más bajo, mientras que tiempos de tratamiento térmico más cortos a un pH de 3.5 dieron como resultado CP8 de peso molecular más alto. El tamaño de los polisacáridos capsulares de serotipo 8 oscilaba de aproximadamente 80 kDa a aproximadamente 220 kDa dependiendo de la duración del tiempo de tratamiento térmico a un pH de 3.5. La correlación entre el momento de tratamiento térmico a un pH bajo y el tamaño del CP8 purificado, tal como se muestra en la figura 4, permite una estimación del tiempo de tratamiento requerido para producir polisacárido purificado con un intervalo especificado de peso molecular.

Es importante indicar que tal como se muestra anteriormente el intervalo completo de pesos moleculares de polisacáridos capsulares de serotipo 8 de 20 kDa a más de 500 kDa puede producirse, liberarse y purificarse. Los métodos por lo tanto pueden usarse para producir unos intervalos específicos de polisacáridos de cápsula de alto peso molecular deseados tal como se muestra en el cuadro 3. El intervalo relativamente estrecho de peso molecular de polisacárido que se produce cuando los pesos moleculares pico varían de 87 kDa a 108 kDa representa un intervalo bien caracterizado de pesos moleculares que puede obtenerse mediante los métodos que se describen en el presente documento. Un intervalo particularmente ventajoso de polisacáridos de alto peso molecular, variando de 70 kDa a 300 kDa o de 70 kDa a 150 kDa, es útil para fabricar composiciones inmunogénicas conjugando el polisacárido capsular con una proteína o molécula portadora (véase el cuadro 3). Las condiciones que se usan para generar el polisacárido de cápsula CP8 que tiene un intervalo de peso molecular de aproximadamente 80 a 120 kDa son tal como sigue: 95 °C, pH 3.5 durante 300 minutos.

CUADRO 3 Producción de intervalo específico de polisacárido capsular de serotipo 8 de alto peso molecular.

Polisacárido capsular de serotipo, 8 Pase MW (kDa) 1 98 2 89 3 108 4 108 5 89 6 100 1 99 2 113 3 105 4 100 5 87 EJEMPLO 2 Conjugación de polisacáridos capsulares de serotipo 8 con CRMi97.

El presente ejemplo describe métodos y ensayos de caracterización que se usan en la producción de conjugados de polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aure¿7S-CRM197. Se desarrollaron diferentes químicas de conjugación para conjugar polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus con esta proteína de portador. Por ejemplo, conjugación usando PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida) da como resultado un enlace tioéter covalente entre el CP y la proteína de portador. Alternativamente, conjugación usando CDI/CDT (1 ,1 -carboildiimidazol/ , 1 -carboil-di-1 ,2,4-triazol) da como resultado un ligador de un carbono o de cero carbonos entre CP y proteína de portador.

Conjugación de polisacárido capsular de serotipo 8 con CRMIQ7 mediante química de conjugación de PDPH.

La química de conjugación de PDPH es un método de múltiples etapas que implica la activación del polisacárido, la eliminación del grupo protector de tiol, la purificación del producto intermedio de polisacárido activado, la activación y la purificación de la proteína CRM197, y la conjugación de los componentes activados seguido por purificación. Después de la introducción de un grupo tiol con contenido en ligador en el polisacárido y un grupo haloacetilo en el portador de proteína CRIv , el polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus se unió al portador de proteína a través de un enlace tioéter. S introdujeron grupos bromoacetilo en la proteína CRM-|97 mediante reacción de grupos amina con el éster de N-hidroxisuccimida de ácido bromoacético. Para generar polisacárido tiolado, los grupos carboxilato activados de carbodiimida de ácido N-acetilmanosaminourónico en el polisacárido se acoplaron con el grupo hidrazida del ligador heterobifuncional de hidrazida reactiva-sulfhidrilo 3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida (PDPH). Los tioles de PDPH-polisacárido tiolado, generados mediante reducción con DTT y purificados mediante SEC en una columna Sephadex G25, reaccionaron con los grupos bromoacetilo de proteína activada dando como resultado enlace covalente de tioéter formado mediante desplazamiento de bromo entre polisacárido y la proteína de portador. Los grupos bromoacetilo sin reaccionar se "taparon" con clorhidrato de cisteamina (clorhidrato de 2-aminoetanotiol). La mezcla de reacción se concentró a continuación y se sometió a diafriltración. Los grupos bromoacetilo no conjugados restantes se taparon con clorhidrato de cisteamina para garantizar que no quedaba ningún grupo bromoacetilo reactivo tras la conjugación. Éste formó un enlace covalente entre el extremo de tiol de cisteamina y el grupo acetilo en el residuo de lisina tras el desplazamiento de bromo. 1. Tiolación de polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus con PDPH: El polisacárido se activó en primer lugar mediante tiolación con PDPH. Se mezcló el polisacárido con una disolución madre de PDPH recién preparada (250 mg/ml en DMSO), una disolución madre de EDAC (90 mg/ml en d¡H20), y disolución madre de tampón MES (0.5 M, pH 4.85) para fabricar la disolución final 0.1 M de MES, y 2 y 4 mg de polisacárido/ml mientras se mantiene una razón en peso de polisacárido:PDPH:EDAC de 1 :0.6:1 .25 para polisacárido capsular de serotipo 8. Se incubó esta mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se dializó frente a un volumen 1000Xde H20 destilada cuatro veces usando un dispositivo de diálisis 3500 MWCO a entre 4 °C y 8 °C para eliminar PDPH sin reaccionar. El polisacárido unido a PDPH se hizo DTT 0.2 M y se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas o durante la noche a entre 4 °C y 8 °C. Se separaron el DTT en exceso así como los productos secundarios de la reacción del sacárido activado mediante SEC usando resina Sephadex G25 y agua destilada como la fase móvil. Las fracciones se sometieron a ensayo mediante el ensayo de DTDP para grupos tiol y se agruparon las fracciones positivas que eluían cerca del volumen vacío de la columna. Se sometió a ensayo el conjunto de fracciones mediante los ensayos de PAHBAH y de O-acetilo para determinar el grado de activación que se expresa como un porcentaje molar de las unidades de repetición con contenido en un grupo tiol (concentración molar de tioles/concentración molar de las unidades de repetición). Se liofilizó el polisacárido activado y se almacenó a -25 °C hasta que era necesario para la conjugación.

Los resultados de la reproducibilidad de la tiolación del polisacárido de serotipo 8 con PDPH se muestran en el cuadro 4. El grado de activación de polisacárido de serotipo 8 estaba en el intervalo de un 12 % a un 16 %, lo que corresponde a aproximadamente una molécula de ligador unida por diez unidades de repetición de polisacárido capsular frente a una molécula de ligador por cinco unidades de repetición.

CUADRO 4 Activación de polisacárido capsular de serotipo 8 con PDPH - Estudio de reproducibilidad.

Polisacárido de Activación Escala, Rendimiento, mg serotipo 8-PDPH (% de MSH/MRU) mg (%, p/p) 1 14 36 30 (83) 2 16 30 27 (91) 4 16 38 42 (1 10) 5 12 40 44 (1 10) 2. Activación de proteína de portador. Por separado, se activó la proteína de portador mediante bromoacetilación.

CRM197 se diluyó hasta 5 mg/ml con NaCI al 0.9 % tamponado con fosfato 10 mM pH 7 (PBS) y a continuación se hizo NaHC03 0.1 M pH 7.0 usando disolución madre 1 M. El éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético (BAANS) se añadió a una razón CRM197 :BAANS 1 :0.25 (p:p) usando una disolución madre de BAANS de DMSO 20 mg/ml. Esta mezcla de reacción se incubó a entre 4 y 8 °C durante 1 hora a continuación se purificó usando SEC sobre Sephadex G-25. El CRM197 activado purificado se sometió a ensayo mediante el ensayo de Lowry para determinar la concentración de proteína y a continuación se diluyó con PBS hasta 5 mg/ml. Se añadió sacarosa a un 5 % p/vol como un crioprotector y se congeló la proteína activada y se almacenó a -25 °C hasta que era necesaria para la conjugación.

La bromoacetilación de residuos de lisina de CRM197 fue muy consistente, dando como resultado la activación de 19 a 25 lisinas de las 39 lisinas disponibles (véase el cuadro 5). La reacción produjo altos rendimientos de proteína activada.

CUADRO 5 Rendimientos v grado de Bromoacetilación de CRM197.

Lisinas Preparación Activadas Escala (mg) Rendimiento (% p/p) 1 24 23 85 2 20 38 87 3 19 35 77 4 22 35 94 5 23 35 87 6 25 48 104 3. CoupHna Reacción: Una vez se prepararon el polisacárido de cápsula activado y la proteína de portador activada, se combinaron los dos en una reacción de conjugación. Se disolvió el polisacárido tiolado y liofilizado en borato 0.16 M pH 8.95, se mezcló CRM197 bromoacetilado descongelado y agua destilada para fabricar la disolución final de borato 0.1 M, razón 1 :1 en p/p de CRMi97:polisacárido, y polisacárido 1 mg/ml. Se incubó esta mezcla a temperatura ambiente durante entre 16 y 24 horas. Se taparon los grupos bromoacetilo sin reaccionar en la proteína añadiendo clorhidrato de cisteamina en una razón de CRM197:cisteamina de 1 :2 (p/p) usando una disolución 135 mg/ml de cisteamina disuelta en borato 0.1 M pH 8.95 y se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente. El conjugado de polisacárido de cápsula-CRM-197 (conjugado) se purificó mediante diafiltración 50 veces frente a NaCI al 0.9 % usando un ultrafiltro de polietersulfona de 100K.

Los resultados de la reproducibilidad de estudios de tiocilación de polisacárido capsular de serotipo 8 con PDPH mostraron que el grado de activación del polisacárido estaba en el intervalo de un 12 % a un 16 % lo que corresponde a aproximadamente una molécula de ligador unida por diez unidades de repetición de polisacárido frente a una molécula de ligador por cinco unidades de repetición.

Conjugación de polisacárido capsular de serotipo 8 con CRM1Q7 mediante química de conjugación de CDI/CDT.

CDI y CDT proporcionan un método de conjugación de una sola etapa en el que el polisacárido se activa en un entorno anhidro (DMSO) para formar imidazol o restos de carbamato de triazol con restos acilimidazol o aciltriazol e hidroxilos disponibles con ácidos carboxílicos. La adición de un portador de proteína (en DMSO) conduce al desplazamiento nucleofílico del imidazol o triazol mediante lisinas y la formación de un enlace de carbamato (para hidroxilos activados) y el enlace de amida (para ácidos carboxílicos activados).

Las químicas de conjugación tanto de CDI como CDT producían un polisacárido capsular de serotipo 8 con enlace covalente con la proteína de portador, que se indicaba por la presencia del sacárido y la proteína en las fracciones en cromatografía de exlusión molecular, y mediante análisis de aminoácidos de conjugado de clorhidrato de cisteamina tapado o glicolaldehído tapado.

El resumen de los resultados de la preparación de varios lotes de conjugados preparados mediante químicas tanto de PDPH como de CDI/CDT para el serotipo 8 capsular con tamaño de polisacárido en el intervalo de 20 kDa a 40 kDa se muestra en el cuadro 6 a continuación. No hubo diferencias significativas en el polisacárido de cápsula libre, razón de polisacárido-proteína y rendimientos de conjugados generados mediante estos dos métodos de conjugación. La antigenicidad de polisacárido conjugado capsular de serotipo 8 no se vio alterada por la conjugación tal como se representa mediante la línea de precipitinas de identidad entre conjugados y polisacárido nativo.

CUADRO 6 Caracterización del polisacárido capsular de serotipo 8-CRM197 preparado mediante dos químicas de conjugación.

Rendi- B .

RendiPro- . . . Tamaño miento ^azón Libre Usinas miento de (MW o Kd Química de .. azúcar de CP fmodJ" (% < 0.3), (%) P«?teina Znio <%> f,cadas sac/prot.)) 34/57 CDI/CDT 46-62 54-55 0,8-0,9 22-25 < 1 7-8 60/57 PDPH 34-70 61-83 0,6-0,9 15-41 ND 1 1 -16 74-92 % Tal como se muestra anteriormente, los métodos que se describen en el presente documento pueden usarse para producir unos intervalos específicos de polisacáridos de cápsula de alto peso molecular deseados. Se buscaba preparar conjugados a partir de un intervalo preseleccionado de alto peso molecular que pudiera ser polisacárido capsular de serotipo 8 purificado y filtrado para su uso en composiciones inmunogénicas. El cuadro 7 resume el análisis de conjugados de polisacárido capsular de serotipo 8 en los que el peso molecular del polisacárido de cápsula de serotipo 8 oscilaba de aproximadamente 80 kDa a 120 kDa y se utilizó la química de conjugación de imidazol. Los pesos moleculares de los conjugados resultantes oscilaban de 595 kDa a 1 ,708 kDa. El número de lisinas conjugadas por CRIv oscilaba de un número alto de 9 a un número bajo de 3. El polisacárido de cápsula libre oscilaba de un número alto de un 6 % a un número bajo de un 2 %.

CUADRO 7 Conjugados con intervalo de peso molecular preseleccionado de polisacárido capsular de serotipo 8.

Pase Poli, Rendimiento Sac. MW mediante Lisinas MW (%) libre SEC-MALLS modificadas (kDa) (%) (kDa) 1 99 88 6 943 4 2 1 13 73 5 841 3 3 105 79 3 719 7 4 100 86 2 630 9 5 87 90 3 595 6 Ambas químicas de conjugación producen un polisacárido capsular de serotipo 8 con enlace covalente con la proteína de portador. No hubo diferencias significativas en polisacárido de cápsula libre, razón de polisacárido capsular de serotipo 8-proteína y rendimientos de conjugados generados mediante estos dos métodos.

EJEMPLO 3 Método en un solo recipiente frente a método de CDI/CDT complejo.

Tal como se describe anteriormente, los métodos para fabricar los conjugados inmunogénicos de la invención implican una conjugación covalente de los polisacáridos capsulares con las proteínas portadoras usando una química de conjugación que implica CDI (1 , -carbonildiimidazol), CDT (1 ,1 -carboil-di-1 ,2,4-triazol) o PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida). El uso de CDI/CDT da como resultado un ligador de un carbono o de cero carbonos entre el polisacárido capsular y la proteína de portador, mientras que el uso de PDPH da como resultado un enlace tioéter covalente entre el polisacárido capsular y la proteína de portador.

El método basado en PDPH era un método de múltiples etapas que implicaba la activación del polisacárido, la eliminación de un grupo protector de tiol en el polisacárido, la purificación del producto intermedio de polisacárido activado, la activación y la purificación del portador de proteína, y la conjugación de los componentes activados seguido por purificación. En el presente método, se hicieron reaccionar polisacáridos capsulares de serotipo 8 de S. aureus con PDPH y una carbodiimida en una disolución acuosa tal como MES 0.1 M para producir polisacáridos unidos a PDPH. Los polisacáridos unidos a PDPH se hicieron reaccionar con un agente reductor para producir polisacáridos activados que se purificaron a continuación. Proteínas de portador se hicieron reaccionar con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido bromoacético en una disolución acuosa para producir proteínas portadoras activadas que se purificaron a continuación. Los polisacáridos de serotipo 8 activados purificados se hicieron reaccionar a continuación con las proteínas portadoras activadas purificadas para producir conjugados de polisacárido de serotipo 8-proteína de portador.

Por el contrario, los métodos basados en CDI- y CDT eran métodos de conjugación de una o dos etapas, en los que polisacárido capsular se activaba en un entorno anhidro (es decir, DMSO) para formar imidazol o restos de carbamato de triazol con restos acilimidazol o aciltriazol e hidroxilos disponibles con ácidos carboxílicos. La adición del portador de proteína (en DMSO) condujo a un desplazamiento nucleofílico del imidazol o triazol mediante lisinas y la formación de un enlace de carbamato (para hidroxilos activados) y el enlace de amida (para ácidos carboxílicos activados). Por consiguiente, se desarrollaron dos métodos basados en CDI- o CDT: un método más complejo y un método en un solo recipiente más sencillo. En el método más complejo, se combinaron polisacáridos capsulares de serotipo 8 de S. aureus con imidazol o triazol, se liofilizaron, y a continuación se hicieron reaccionar con CDI o CDT en un disolvente orgánico (tal como DMSO) para producir polisacáridos de serotipo 8 activados. Los polisacáridos de serotipo 8 activados se purificaron y a continuación se hicieron reaccionar con proteínas portadoras en el disolvente orgánico para producir conjugados de polisacárido de serotipo 8-proteína de portador. El método en un solo recipiente era similar al método complejo excepto en que los polisacáridos de serotipo 8 activados no se purificaban antes de la reacción con proteínas portadoras.

Método complejo de CDI/CDT.

Activación de polisacárido: Se mezcló polisacárido de serotipo 8 con 10 g de triazol/g de serotipo 8 y se liofilizó. Se disolvió la torta resultante en DMSO a 2.0 mg de polisacárido de serotipo 8/ml. Se determinó el contenido en agua. Una disolución recién preparada de CDT a 100 mg/ml en DMSO se añadió hasta conseguir una cantidad molar de CDT equivalente al agua. Alternativamente, la cantidad de CDT que se añade puede ajustarse para obtener un grado de activación más alto o más bajo. Esto se mantuvo 30 minutos a 23 °C.

Purificación de polisacárido de serotipo 8 activado: La disolución de serotipo 8 activado (ACP8) se vertió en 25 volúmenes de agua para destruir el CDT en exceso. Ésta se concentró hasta su volumen original sobre una membrana de PES de 10 kDa a aproximadamente 1 mg/cm2 y se diafiltró frente a agua para al menos 10 volúmenes. Esta etapa se completó en menos de 4 horas. Se mezcló el material diafiltrado con 10 g de triazol/g de polisacárido de serotipo 8 original y se liofilizó.

Preparación de CRM ¡iofilizado: CRM se sometió a diafiltración frente a NaCI al 0.4 %/sacarosa al 5 % a volumen constante sobre una membrana de PES de 10 kDa para al menos 0 volúmenes. La concentración de proteína se determinó y se añadió suficiente tampón de diafiltración para llevar la concentración de proteína hasta 5.0 g/l, proporcionando de este modo una razón en p/p de NaCI/CRM = 0.8. Se liofilizó el CRM.

Conjugación: Polisacárido de serotipo 8 diafiltrado, activado, se disolvió en DMSO a 1 mg/ml. Disolución de borato a 100 mM se añadió para conseguir un 2 % v/v.

CRM volvió a suspenderse a 2 mg/ml y, cuando se completó la disolución, se combinó con la disolución de ACP8. Ésta se dejó reaccionar a 23 °C durante 20 horas.

Se vertió la reacción de conjugado en 24 volúmenes de borato 5 mM pH 9.0 y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se ajustó a pH 7.5 con tampón fosfato 0.5 M, pH 6.5. Ésta se filtró a través de un filtro de 5 micrometros y se concentró hasta el volumen original sobre una membrana de PES de 300 kDa a una carga de ~ 1 mg/cm2 y se diafiltró frente a al menos 10 volúmenes de agua. El concentrado resultante se filtró a través de un filtro de 0.22 micrometros y se almacenó a 2 °C-8 °C.

Método en un solo recipiente de CDI/CDT.

Intercambio de matriz de CRM197: CRM197 se sometió a diafiltración para intercambiar de la matriz voluminosa de aproximadamente 10 mM fosfato/NaCI 80 mM/sacarosa al 15 %, pH de 7 a imidazol 5 mM/NaCI al 0.72 %/ octil- -D-glucósido 15 mM, pH 7. El intercambio permitió la eliminación de fosfato y sacarosa que son perjudiciales para la conjugación y define el contenido en cloruro de sodio portado en la conjugación. Se añade octil- -D-glucopiranósido para prevenir la formación de partículas tras la filtración estéril.

La matriz de la CRM197 se intercambió mediante filtración de flujo tangencial frente a imidazol 5 mM/0.72 %/octil-B-D-glucopiranósido 15 mM pH 7 a través de 10 diavolúmenes usando membranas de PES de MWCO de 10K a una concentración de retentato de aproximadamente 4 mg/ml. La exposición de membrana típica era de 2 gramos/ft2 y la concentración de CRM197 final diana en la matriz fue de 6 mg/ml. La CRM197 se almacenó a 2 °C-8 °C.

Activación/Conjugación: El método de activación/conjugación para polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aureus consistió en las siguientes etapas: 1) Intercambio de matriz de la CRM197; 2) Combinación del polisacárido; 3) Congelación superficial y liofilización de CRM197 y polisacárido combinado; 4) Disolución del polisacárido liofilizado y CRM197; 5) Activación del polisacárido; 6) Conjugación del polisacárido activado con CRM-i97; y 7) Purificación del conjugado (dilución, diafiltración, filtración estéril).

El polisacárido se combinó con 10 gramos de excipiente de 1 ,2,4-triazol por gramo de polisacárido. El excipiente se añadió como un polvo al polisacárido, con una disolución que se obtiene tras menos de 15 minutos de mezclado a temperatura ambiente.

El polisacárido combinado y CRM197 se congelaron superficialmente por separado usando un baño de etanol a -75 °C. El volumen por frasco de 1 I era de aproximadamente 500 mi.

Para la disolución de polisacárido, Se añadió DMSO a los frascos de liofilización individuales del polisacárido para obtener una suspensión y a continuación se transfirió al recipiente de reacción de activación/conjugación para calentar. Se añadió DMSO hasta obtener una concentración de 2 g/l. Se obtuvo una disolución transparente a medida que la suspensión alcanzaba aproximadamente 45 °C con mezclado. La disolución se enfrió a continuación hasta 23 °C + 2 °C.

Para la disolución de CRM197, se añadió DMSO a los frascos de liofilización individuales con contenido en CR ig7 para obtener una suspensión y a continuación se transfirió a un segundo recipiente para mezclar. Se añadió DMSO hasta obtener una concentración de 2 g/l. Habitualmente se obtuvo una disolución transparente en menos de 15 minutos.

La disolución de polisacárido/DMSO se muestreó por el análisis de KarI Fischer para determinar el contenido en humedad. CDT se preparó como una disolución 100 mg/ml en DMSO y se añadió en base al contenido en humedad determinado. La adicón continua de la disolución de CDT se realizó a lo largo de aproximadamente 5 minutos a 23 °C + 2 °C con mezclado. Se dejó avanzar la reacción durante un mínimo de 30 minutos a 23 °C + 2 °C. La reacción se muestreó para determinar el nivel de activación (UV 220/205 nm) y a continuación se añadió borato de sodio 100 mM, pH 9 hasta obtener una disolución acuosa al 1.5 %. A continuación se agitó la disolución de reacción durante un mínimo de 30 minutos a 23 °C + 2 °C.

Para la conjugación del polisacárido activado con CRIv , se añadió DMSO hasta obtener una concentración de reacción de 0.8 mg/ml. el CRMi97 disuelto en DMSO se añadió a continuación a la disolución de polisacárido activado con mezclado. Se agitó la reacción durante un mínimo de 4 horas a 23 °C + 2 °C.

La reacción disolución se diluyó 10X mediante su adición en tetraborato de sodio 5 mM , pH 9 con mezclado para hidrolizar grupos residuales de activación. La disolución diluida se pasó a través de un filtro de 5 pm y se concentró hasta una concentración de retentato diana de 2 g/l. Filtración de flujo tangencial se realizó usando membranas de celulosa regeneradas de 300K a través de 20 diavolúmenes con succinato 5 mM, pH 7. La exposición de membrana típica era de 1 gramo/ft2. El conjugado purificado se pasó a través de un filtro de 0.22 micrómetros y se almacenó a 2 °C-8 °C.

EJEMPLO 4 Conjugación de polisacárido capsular de se ro tipo 8 usando El método de conjugación en un solo recipiente v complejo.

El presente ejemplo muestra que el intervalo preseleccionado de pesos moleculares de polisacáridos de cápsula puede usarse para conjugación o bien en el método en un solo recipiente o bien complejo. Los polisacáridos más grandes se producen inicialmente por las células bacterianas, y el intervalo de peso molecular purificado resultante puede controlarse mediante el pH y el calor del método de hidrólisis en el ejemplo 1 (tal como se muestra en el cuadro 3).

En el presente ejemplo, ocho lotes en los que el peso molecular del polisacárido de cápsula de serotipo 8 oscilaba de aproximadamente 80 kDa a aproximadamente 120 kDa se seleccionaron y se realizó la conjugación usando activación con 1 ,1-carbonil-di-(1 ,2,4-triazol) para polisacárido capsular de serotipo 8. Véase el cuadro 8. Los pesos moleculares de los conjugados resultantes oscilaban de 595 kDa a 1 ,708 kDa. El número de lisinas conjugadas por CRM oscilaba de un número alto de 13 a un número bajo de 3. El azúcar libre oscilaba de un alto número de un 11 % a un bajo número de un 1 %.

CUADRO 8 Conjugados de polisacárido capsular de serotipo 8 preparados con polisacáridos capsulares de 80 kDa a 120 kDa.

MW Rendi¬ Azúcar mediante Poli, MW Método miento Pase libre SEC- (kDa) Lisinas de (%) MALLS sac.(%) (kDa) En un 1 98 86 1 751 11 recipiente 2 89 80 1 675 13 3 108 76 4 1073 5.0 4 108 69 4 819 5.2 5 89 85.1 8 1708 10 6 100 94.0 11 1577 5 Complejo 1 99 88 6 943 4 2 1 13 73 5 841 3 3 105 79 3 719 7 4 100 86 2 630 9 5 87 90 3 595 6 EJEMPLO 5 Evaluación del polisacárido capsular de serotipo 8 tratado con base y nativo conjugado en un modelo de bacteriemia murino.

La importancia de los grupos O-acetilo presentes en polisacárido capsular de serotipo 8 nativo se evaluó antes de la conjugación para inducción de respuestas de anticuerpos funcionales para polisacárido capsular conjugados. El polisacárido capsular de serotipo 8 se O-desacetiló en condiciones básicas suaves, y tanto RMN como cromatografía iónica (Cl) confirmaron la ausencia de O-acetilación en polisacárido capsular de serotipo 8 des-O-Ac-CRM. El conjugado de CP8 des-O-Ac-CRM se preparó mediante conjugación de polisacárido CP8 des-O-Ac con CRM mediante química de PDPH tal como se describe en el ejemplo 2.

El polisacárido capsular de serotipo 8 conjugado inesperadamente no mostró grupos acetilo medibles mediante el método de Cl. Esto podría atribuirse a diferencias en la estructura, sitios de O-acetilación en comparación con otros polisacáridos capsulares de S. aureus, que a su vez podrían provocar la eliminación o modification de los grupos acetilo en polisacáridos capsulares de serotipo 8 durante la conjugación.

El modelo de bacteriemia murino se usó para evaluar la eficacia de polisacárido capsular de serotipo 8 nativo frente a tradao con base conjugado con CRM197. Grupos de ratones BALB/c hembra (15/grupo) se vacunaron en las semanas 0, 3 y 6 con 1 mcg de polisacárido capsular de serotipo 8 des-O-Ac-CRM o 1 pg de polisacárido capsular de serotipo 8 O-Ac- CRM. Las vacunas se formularon con 22 mcg de AIP04. Los animales se expusieron a S. aureus PFESA0003, y se contaron las bacterias de la sangre tres horas más tarde. Los datos mostraron que no había una reducción estadísticamente significativa (p = 0.0362) en ufe bacterianas recuperadas de la sangre de animales inmunizados con conjugado de polisacárido capsular de serotipo 8 nativo sin tratar tal como se determina mediante la prueba de la t de Student (Cuadro 9). En animales que se inmunizaron con conjugado de polisacárido capsular de serotipo 8 tratado con base, las ufe bacterianas recuperadas de sangre fueron similares al grupo de control de solución salina.

CUADRO 9 El conjugado de polisacárido capsular de serotipo 8-CRMi97 reduce la bacteriemia causada por S. aureus PFESA0003 en ratones LogUFC/S Antígeno Cepa/Dosis Significación (valor p) angre Solución salina PFESA0003 4.35 CP8 des-O-Ac-CRM 4.45 1.14 x 108 CP8 O-Ac-CRM 3.93 0.03 EJEMPLO 6 Evaluación del polisacárido capsular de serotipo 8 nativo y tratado con base conjugado tratado en un modelo de bacteriemia murino.

Conjugados de polisacárido capsular de serotipo 8 se evaluaron para determinar su capacidad para proteger a ratones en un modelo de pielonefritis. Los recuentos de bacterias en la sangre de ratones que recibieron exposición a S. aureus i.p. se redujeron significativamente en comparación con controles inmunizados con PBS.

Se llevaron a cabo dos estudios para evaluar la eficacia de conjugado de CP8-CRM197 en el modelo de bacteriemia murino, que se describe anteriormente, después de una exposición a S. aureus PFESA0268 (tipo 8). El primer estudio (figura 5) mostró una reducción significativa de bacteriemia (p = 0.0308). Para el estudio, grupos de ratones 6 a 8 Swiss Webster de 6 a 8 semanas de edad (n = 30) se inmunizaron de forma activa mediante inyección subcutánea con 1 µg de polisacárido capsular de serotipo 8-CRM197 y solución salina ambos formulados con 100 pg de AIP04 a 0, 2 y 4 semanas y se exponen en la semana 6 por la vía intravenosa a S. aureus PFESA0268 (tipo 8). Antes de la exposición se realizaron experimentos para optimizar la dosis de cepa de exposición at the age ratones reach after tres vacunacións. La evaluación estadística de los estudios de supervivencia se llevó a cabo mediante un análisis de Kaplan-Meier.

EJEMPLO 7 Actividad opsónica de sueros de ratones inmunizados con Conjugados de polisacárido capsular de serotipo 8 nativos y modificados químicamente.

Sueros de ratón seleccionados (n = 5) con altos títulos de polisacárido capsular de serotipo 8 de un estudio de vacunación se compararon para determinar la actividad opsónica usando la cepa PFESA0005. Los resultados de OPA (cuadro 10) muestran que sólo conjugados preparados mediante la conjugación de polisacárido capsular de serotipo 8 nativo provocaba anticuerpos opsónicos en ratones. Cabe destacar que el conjugado de polisacárido capsular de serotipo 8 des-OAc era inmunogénico en ratones but los anticuerpos provocados no eran opsónicos en este ensayo. Los títulos de OPA se notifican como la inversa de la dilución a la que se observó una destrucción del 40 %.

CUADRO 10 Actividad opsónica de sueros de ratón inmunizados con polisacárido capsular de serotipo 8 nativo frente a Polisacárido capsular de serotipo 8 des-O-Ac-CRM.

Polisacárido capsular de Polisacárido capsular de serotipo 8- serotipo 8 Des-O-Ac-CRM CRM título de OP título de OP título de OP Sem. título de OP Sem.

Sem. 0 sueros Sem. 8 sueros 0 sueros 8 sueros < 50 < 50 50 150 < 50 < 50 < 50 1350 < 50 < 50 < 50 450 < 50 < 50 < 50 1350 < 50 < 50 < 50 4050 EJEMPLO 8 La destrucción de cepas de S. aureus por antisueros de conjugado de serotipo 8 puede inhibirse mediante la adición de polisacárido capsular de serotipo 8 nativo.

Para confirmar la especificidad de la destrucción, se realizó el enayo opsonofagocítico en presencia de polisacárido capsular de serotipo 8 nativo o polisacárido neumocócico no relacionado (Pn 14 poli), esencialmente tal como se describe anteriormente.

Los resultados (cuadro 1 1) mostraron que la presencia de polisacárido capsular de serotipo 8 nativo en mezcla de reacción inhibía la destrucción opsonofagocítica de PFESA0286 de S. aureus (tipo 8). Estos resultados confirman que la destrucción opsonofagocítica mediante sueros inmunitarios está mediada por anticuerpos específicos de cápsula.

CUADRO 11 Adición Polisacárido capsular de serotipo 8 Inhibits Destrucción opsonofagocítica de S. aureus mediante sueros inmunitarios.

Mono Muestra de sueros Título de OPA Sem. 0 < 50 02D 33 Sem. 8 4050 Sem. 0 + 20 Mg CP8 poli < 50 Sem. 8 + 20 CP8 poli < 50 Sem. 0 + 20 ¡g Pn14 poli < 50 Sem. 8 + 20 pg Pn 14 poli 4050 Sem. 0 < 50 A4N122 Sem. 8 4050 Sem. 0 + 20 pg CP8 poli < 50 Sem. 8 + 20 pg CP8 poli < 50 Sem. 0 + 20 pg Pn14 poli < 50 Sem. 8 + 20 g Pn 14 poli 1350 Resumen Todas las químicas de conjugación produjeron polisacárido capsular de serotipo 8 con enlace covalente con la proteína de portador CRM197. No hubo diferencias significativas en sacárido libre, razón de polisacárido capsular de serotipo 8-proteína y rendimientos de conjugados generados mediante estos métodos.

EJEMPLO 9 Preparación de polisacárido capsular de serotipo 5 de S.aureus.

En el presente ejemplo, se describe la producción de varios intervalos de tamaño de polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus. La estructura de la unidad de repetición de polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus se muestra en la figura 6. Los métodos que se describen en el presente documento son eficaces para producir polisacárido capsular de serotipo 5 con pesos moleculares que varían de aproximadamente 20 kDa a 800 kDa. Mediante una selección apropiada de las condiciones, pueden aislarse y purificarse polisacáridos capsulares de serotipo 5 de alto peso molecular variando de 50 kDa a 800 kDa en peso molecular. Para su uso en composiciones inmunogénicas, puede aislarse y purificarse polisacárido capsular de serotipo 5 variando de 70 kDa a 300 kDa en peso molecular, de 70 kDa a 150 kDa y muchos otros intervalos deseados. La cepa PFESA0266 see seleccionó para la producción de polisacárido capsular de serotipo 5 en base a las características de crecimiento y a la cantidad de cápsula que se produce.

Para la producción de polisacárido capsular de serotipo 5, se hizo que la cepa PFESA0266 creciera en un medio complejo que consiste principalmente en una fuente de carbono (o bien lactosa o bien sacarosa), harina de soja hidrolizada como la fuente de nitrógeno, y trazas de metales. Se hizo que la cepa creciera en biorreactores durante de 2 a 5 días.

La fermentación de la cepa PFESA0266 se llevó a cabo tal como se detalló anteriormente. En el momento de la recogida, la DO 600 del cultivo era de 7.38. El cultivo se trató en autoclave durante 1 hora y tras enfriar, se procesó el cultivo tal como se describe anteriormente para separar las células del material sobrenadante. Se recuperó aproximadamente 1 I de cada uno de las céluas y del sobrenadante filtrado y concentrado.

Antes del procesado en autoclave, una muestra se retiró para someter a prueba el nivel de la enterotoxina estafilocócica B (SEB) en el cultivo. En presencia de un 0.05 % de Polysorbate 80, la concentración de SEB en la fermentación fue de 15 a 20 ng/ml. Experimentos previos mostraron que el procesado en autoclave del cultivo durante 1 hora redujo el nivel de SEB a menos de 0.1 ng/ml, que se encuentra por debajo del límite de detección para el kit TECRA.

Un polisacárido fraccionado en etanol, diafiltrado, se cargó en una columna Q-Sepharose AEC y se eluyó con un gradiente lineal de NaCI tal como se describe anteriormente. Las fracciones se analizaron mediante el ensayo de O-Acetilo y una prueba de doble inmunodifusión para determinar la presencia de polisacárido de serotipo 5 y un ensayo de fosfato para determinar la presencia de ácido teicoico. La presencia de polisacárido de serotipo 5 se detectó en las fracciones 60 a 105 (figuras 7A y 7B). Para reducir la contaminación con ácido teicoico, las fracciones 60 a 85 se agruparon y cualquier ácido teicoico residual se oxidó con metaperyodato de sodio para permitir su eliminación mediante diafiltración de 3K frente a diH2O.

La purificación de polisacárido capsular de serotipo 5 que se usa para la preparación de conjugados se realizó mediante dos métodos diferentes que se basan en una temperatura elevada y en un pH bajo para afectar a la liberación de cápsula a partir de la célula y reducir el peso molecular del polisacárido. El peso molecular resultante dependía del momento, la temperatura y el pH de la etapa de hidrólisis.

La caracterización del polisacárido capsular de serotipo 5 se realizó usando las técnicas que se especifican en el cuadro 1 , citado anteriormente.

Los polisacáridos de cápsula que se producen mediante los métodos que se describen a continuación dan como resultado polisacáridos puros con bajos niveles de contaminantes de proteína, ácido nucleico, peptidoglicano y ácido teicoico.

En el primer método, a continuación de la liberación del polisacárido de cápsula a partir de la célula y de la reducción de peso molecular, la preparación se trató con un cóctel de enzimas (por ejemplo, ribonucleasa, desoxiribonucleasa, lisozima y proteasa) para digerir impurezas. Después de la incubación, las impurezas residuales se precipitaron mediante la adición de etanol (concentración final de aproximadamente un 25 %). Después de la eliminación del etanol residual, una disolución con contenido en un polisacárido de cápsula se cargó en una columna de intercambio aniónico (Q-Sepharose) y se eluyó con un gradiente de sal lineal. Las fracciones con contenido en polisacárido de cápsula se agruparon y se trataron con metaperyodato de sodio. Este tratamiento dio como resultado la hidrólisis oxidativa del contaminante de ácido teicoico residual, pero no afectó al polisacárido capsular de serotipo 5. La reacción se extinguió mediante la adición de etilenglicol. El material se concentró y se diafiltró frente a agua destilada (dH20) para eliminar cualesquiera productos secundarios y reactivos residuales.

El segundo método se usó para producir polisacárido de cápsula sin el uso de enzimas para digerir las varias impurezas derivadas de célula. En el presente método, a continuación de la liberación del polisacárido de cápsula a partir de la célula y de la reducción de peso molecular, el caldo de fermentación hidrolizado se clarificó por microfiltración seguida por ultrafiltración y diafiltración. La disolución se trató con carbono activado para eliminar impurezas. Después del tratamiento de carbono, el material se trató con metaperyodato de sodio para oxidar el ácido teicoico residual seguido por una extinción con propilenglicol. El material se concentró y se diafiltró frente a dH20 para eliminar cualesquiera productos secundarios y reactivos residuales.

Las preparaciones que se producen usando cualquiera de los métodos dieron como resultado unos polisacáridos capsulares puros con bajos niveles de contaminantes de proteína, ácido nucleico y ácido teicoico. Los métodos que se describen pueden usarse para producir unos intervalos específicos de los polisacáridos de alto peso molecular deseados manipulando las condiciones de hidrólisis.

Ejemplos de polisacárido capsular que puede obtenerse mediante los métodos que se describen en el presente documento se muestran en el cuadro 12 a continuación. Los lotes de polisacárido capsular de serotipo 5 purificado tenían una alta pureza tal como se indica por la ausencia de ácido teicoico (TA), peptidoglicano y proteína residual baja. Véanse los cuadros 12 y 13. El intervalo de pesos moleculares abarcaba de 132.7 kDa a 800 kDa y los polisacáridos purificados estaban muy O-acetilados, variando de un 90 % a un 100 %, y estaban un 100 % N-acetilados.

Los rendimientos de la purificación del polisacárido capsular de serotipo 5 eran de un 39 % a un 63 %, y el tamaño de polisacárido purificado de serotipo 5 variaba de 35 kDa a 65 kDa (véase el cuadro 12). El nivel de contaminación por ácido teicoico (TA) era aceptable y los niveles de proteínas residuales y ácido nucleico estaban también en intervalos aceptables. Espectros de RMN de polisacárido de serotipo 5 eran idénticos a los notificados en la bibliografía.

CUADRO 12 Caracterización de polisacárido capsular de serotipo 5.

CP5 total Rendi- Ácido O- Muestra purificado miento MW Proteína Nuc. acetilo % (barrido de 260 (kDa) nm) % RMN mg (g/mol) % (P/P) (P/P) (%) 1 101 39 47 0 0.5 94 2 91 48 65 1.2 2.5 96 3 578 63 35 2.5 0.7 75 CUADRO 13 Caracterización de polisacárido capsular de serotipo 5 adicional.

CP5 RMN de O- Identidad RMN de N- Muestra MW (kDa) (mg/ml) acetilo (%) según RMN acetilo (%) 1 800.1 3.164 100 Pasa 100 2 132.7 1.172 90 Pasa 100 3 335.4 0.975 90 Pasa 100 4 366.8 0.865 90 Pasa ND ND = no detectado Selección de peso molecular de los polisacáridos capsulares: Un análisis cinético mostró que un amplio intervalo de pesos moleculares de polisacáridos de cápsula puede generarse mediante los métodos que se describen en el presente documento. Inicialmente, se produjeron unos polisacáridos más grandes mediante las células bacterianas, y posteriormente, un intervalo de peso molecular deseado puede seleccionarse y a continuación purificarse mediante la manipulación del pH y las condiciones de calor de las etapas de calentamiento y de hidrólisis.

El tratamiento térmico del caldo de fermentación de S. aureus es una etapa de método entre la fermentación y la recuperación de polisacárido capsular. Esta etapa de método usa calor para tratar el caldo de pH ajustado durante un periodo especificado. Los fines del tratamiento térmico a un pH bajo eran destruir células, inactivar enterotoxinas, liberar polisacárido unido a célula y reducir el peso molecular al tamaño deseado. Entre estos fines, la reducción de peso molecular era la menor en términos de tiempo de procesamiento requerido en esta etapa. Por lo tanto, los otros fines se lograron de forma inevitable dentro del plazo de tiempo del tratamiento considerado.

Tratamiento térmico: Se determinaron condiciones de pH y temperatura para seleccionar varios intervalos de peso molecular de los polisacáridos de cápsula. Se usó un fermentador Biolafitte de 15 I para estos estudios. El caldo de fermentación se transfirió al fermentador mediante una bomba peristáltica. Usando una velocidad de agitación de aproximadamente 200 rpm, el pH del caldo se ajustó con ácido sulfúrico concentrado. A continuación, la temperatura del caldo se elevó hasta el valor fijado. El tiempo de tratamiento térmico empezó en cuanto la temperatura alcanzó el punto fijado. Cuando se alcanzó el tiempo de tratamiento deseado, el caldo se enfrió hasta temperatura ambiente. Se tomaron muestras en método para determinar la concentración de polisacárido y el peso molecular mediante sistemas de HPLC y SEC-MALLS, respectivamente. Los datos del peso molecular (MW) se usaron en el análisis cinético. Los perfiles de MW se determinaron a lo largo del tiempo a un pH de 3.5, 4.0 y 5.0. Véase la figura 8A.

La cinética de hidrólisis ácida suave de polisacáridos se realizó usando polisacárido capsular de serotipo 8 purificado que se obtiene a partir del método. La disolución de polisacárido purificado se ajustó al pH deseado para el experimento con ácido sulfúrico. Aproximadamente 1.5 mi de la disolución se transfirió a cada uno de los tubos de centrífuga de 15 mi. Se colocaron los tubos en un baño de aceite equipado con un sistema de control de la temperatura de precisión. The tubos se sacaron a intervalos de tiempo predeterminados y se extinguieron en un cubo de hielo. Al final del experimento, una alícuota de tampón Tris 1 M (pH 7.5) se añadió a la muestra para ajustar el pH de nuevo a aproximadamente 7. Las muestras se analizaron mediante un sistema SEC-MALLS. Los datos de MW se usaron en el análisis cinético. El efecto de la temperatura sobre el perfil de MW de CP5 a un pH de 4.5 se determinó a lo largo del tiempo. Véase la figura 8B.

Resultados Tal como se muestra en la figura 8A, un pH más bajo era más eficaz para reducir el peso molecular del polisacárido. En el presente ejemplo, intervalos de pesos moleculares entre aproximadamente 300 kDa y aproximadamente 600 kDa pueden generarse usando un pH de 5 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos. Véase la figura 8A. De forma similar, elegir un pH de 4.5 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos puede proporcionar intervalos de peso molecular de polisacárido entre 200 kDa y 400 kDa. Además, elegir un pH de 4.0 a 95 °C durante entre 15 minutos y 120 minutos puede proporcionar intervalos de peso molecular de polisacárido entre 120 kDa y 300 kDa.

Tal como se muestra en la figura 8B, cuanto más alta es la temperatura, más rápida es la velocidad de hidrólisis y más anchos son los pesos moleculares de polisacárido que se producen con el tiempo. Expresado de otra forma, el uso de una temperatura más baja, 55 °C frente a 95 °C al mismo pH, produce un intervalo más estrecho de pesos moleculares de polisacárido.

Además, la figura 4 muestra una correlación entre el peso molecular de polisacárido capsular de serotipo 5 purificado con el tiempo de tratramiento para hidrólisis ácida suave (pH 4.5 a 95 °C). El polisacárido purificado es el producto final que se obtiene a partir del método de recuperación detallado anteriormente. Como también se muestra en la figura 4, un aumento en el tiempo de tratamiento térmico de la cepa de S. aureus PFESA0266 a un pH de 4.5 dio como resultado polisacárido capsular de serotipo 8 de menor peso molecular, mientras que tiempos de tratamiento térmico más cortos a un pH de 4.5 dio como resultado polisacárido capsular de serotipo 5 de mayor peso molecular. El tamaño de polisacáridos capsulares de serotipo 5 oscilaba de aproximadamente 90 kDa a aproximadamente 220 kDa dependiendo de la duración del tiempo de tratamiento térmico a un pH de 4.5. Una correlación entre el momento de tratamiento térmico a un pH bajo y el tamaño de los polisacáridos capsulares de serotipo 5 purificados, tal como se muestra en la figura 4, permite una estimación del tiempo de tratamiento requerido para producir polisacárido purificado con un intervalo especificado de peso molecular.

Tal como se muestra anteriormente, el intervalo completo de pesos moleculares de polisacáridos capsulares de serotipo 5 de 20 kDa a más de 500 kDa puede producirse, liberarse y purificarse. Los métodos que se describen pueden usarse para producir unos intervalos específicos de polisacáridos de cápsula de alto peso molecular deseados tal como se muestra en el cuadro 14. El intervalo relativamente estrecho de peso molecular de polisacárido que se produce cuando los pesos moleculares pico varían de 63 kDa a 142 kDa representa un intervalo bien caracterizado de pesos moleculares que puede obtenerse mediante los métodos que se describen en el presente documento. Un intervalo particularmente ventajoso de polisacáridos de alto peso molecular, variando de 70 kDa a 300 kDa o de 70 kDa a 150 kDa, es útil para fabricar composiciones inmunogénicas conjugando el polisacárido capsular con una proteína o molécula portadora. Las condiciones que se usan para generar el polisacárido de cápsula de CP5 que tiene un intervalo de peso molecular de aproximadamente 100 a 140 kDa son tal como sigue: 95 °C, pH 4.5 durante 135 minutos. Diferentes combinaciones de pH, temperatura, y tiempo, no obstante, generarán también moléculas de CP5 con un intervalo de peso molecular de aproximadamente 100 a 140 kDa. capsular de serotipo 5.

Polisacárido capsular de serotipo 5, Pase MW (kDa) 1 142 2 108 3 142 4 108 5 ND 6 ND 7 63 8 72 9 74 10 63 1 1 ND ND = no realizado EJEMPLO 10 Conjugación de polisacáridos capsulares de serotipo 5 con CRMi97.

El presente ejemplo describe métodos y ensayos de caracterización que se usan en la producción de conjugados polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus-CRM^. Se desarrollaron diferentes químicas de conjugación para conjugar polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus con esta proteína de portador. Por ejemplo, la conjugación usando PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida) da como resultado enlace tioéter covalente entre el CP y la proteína de portador; mientras que la conjugción usando CDT (1 ,1-carboil-di-1 ,2,4-triazol) da como resultado un ligador de un carbono o de cero carbonos entre el polisacárido capsular y la proteína de portador.

Conjugación de polisacárido capsular de serotipo 5 con CRM197 mediante química de conjugación de PDPH.

La química de conjugación de PDPH es un método de múltiples etapas que implica la activación del polisacárido, la eliminación del grupo protector de tiol, la purificación del producto intermedio de polisacárido activado, la activación y la purificación de la proteína CRM197, y la conjugación de los componentes activados seguido por purificación. Después de la introducción de un grupo tiol con contenido en ligador en el polisacárido y un grupo haloacetilo en el portador de proteína CRM197, el polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus se unió al portador de proteína a través de un enlace tioéter. Se introdujeron grupos bromoacetilo en la proteína CRM197 mediante reacción de grupos amina con el éster de N-hidroxisuccimida de ácido bromoacético. Para generar polisacárido tiolado, los grupos carboxilato activados de carbodiimida de ácido N-acetilmanosaminourónico en el polisacárido se acoplaron con el grupo hidrazida del ligador heterobifuncional de hidrazida reactiva-sulfhidrilo 3-(2-piridild¡tio)-propionil-hidrazida (PDPH). Los tioles de PDPH-polisacárido tiolado, generados mediante reducción con DTT y purificados mediante SEC en una columna Sephadex G25, reaccionaron con los grupos bromoacetilo de proteína activada dando como resultado enlace covalente de tioéter formado mediante desplazamiento de bromo entre polisacárido y la proteína de portador. Los grupos bromoacetilo sin reaccionar se "taparon" con clorhidrato de cisteamina (clorhidrato de 2-aminoetanotiol). La mezcla de reacción se concentró a continuación y se sometió a diafriltracion. Los grupos bromoacetilo no conjugados restantes se taparon con clorhidrato de cisteamina para garantizar que no quedaba ningún grupo bromoacetilo reactivo tras la conjugación. Éste formó un enlace covalente entre el extremo de tiol de cisteamina y el grupo acetilo en el residuo de lisina tras el desplazamiento de bromo. 1. Tiolación de Polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus con PDPH: El polisacárido se activó en primer lugar mediante tiolación con PDPH. Se mezcló el polisacárido con una disolución madre de PDPH recién preparada (250 mg/ml en DMSO), una disolución madre de EDAC (90 mg/ml en diH20), y disolución madre de tampón MES (0.5 M, pH 4.85) para fabricar la disolución final 0.1 M de MES, y 2 mg y 4 mg de polisacárido capsular/ml mientras se mantiene una razón en peso de polisacárido capsular:PDPH:EDAC de 1 :5:3 para polisacárido capsular de serotipo 5. Se incubó esta mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación se dializó frente a un volumen 1000X de H20 destilada cuatro veces usando un dispositivo de diálisis 3500 MWCO a entre 4 °C y 8 °C para eliminar PDPH sin reaccionar. El polisacárido unido a PDPH se hizo DTT 0.2 M y se incubó a temperatura ambiente durante 3 horas o durante la noche a entre 4 °C y 8 °C. Se separaron el DTT en exceso así como los productos secundarios de la reacción del sacárido activado mediante SEC usando resina Sep adex G25 y agua destilada como la fase móvil. Las fracciones se sometieron a ensayo mediante el ensayo de DTDP para grupos tiol y se agruparon las fracciones positivas que eluían cerca del volumen vacío de la columna. Se sometió a ensayo el conjunto de fracciones mediante los ensayos de PAHBAH y de 0-acetilo para determinar el grado de activación, que se expresa como un porcentaje molar de las unidades de repetición con contenido en un grupo tiol (concentración molar de tioles/concentración molar de las unidades de repetición). Se liofilizó el polisacárido activado y se almacenó a -25 °C hasta que era necesario para la conjugación.

Los resultados de la reproducibilidad de la tiocilación de polisacárido de serotipo 5 con PDPH se muestran en el cuadro 15. El grado de activación de polisacárido de serotipo 5 estaba en el intervalo de un 1 1 % a un 19 %, lo que corresponde a aproximadamente una molécula de ligador unida por diez unidades de repetición de polisacárido capsular frente a una molécula de ligador por cinco unidades de repetición.

CUADRO 15 Activación de polisacárido capsular de serotipo 5 con PDPH - Estudio de reproducibilidad.

Polisacárido de Activación Escala, Rendimiento, mg serotipo 5-PDPH (% de MSH/ RU) mg (%, p/p) 1 11 23 19,6 (85) 2 13 30 28 (93) 3 19 30 23 (77) 4 15 32 29 (90) 2. Activación de proteína de portador.

Por separado, se activó la proteína de portador mediante bromoacetilación. CRM197 se diluyó hasta 5 mg/ml con NaCI al 0.9 % tamponado con fosfato 10 mM pH 7 (PBS) y a continuación se hizo NaHC03 0.1 M pH 7.0 usando disolución madre 1 M. El éster de N-hidroxisuccinimida del ácido bromoacético (BAANS) se añadió a una razón CRM 197: BAANS 1 :0.25 (p:p) usando una disolución madre de BAANS de DMSO 20 mg/ml. Esta mezcla de reacción se incubó a entre 4 y 8 °C durante 1 hora a continuación se purificó usando SEC sobre Sephadex G-25. El CRM197 activado purificado se sometió a ensayo mediante el ensayo de Lowry para determinar la concentración de proteína y a continuación se diluyó con PBS hasta 5 mg/ml. Se añadió sacarosa a un 5 % p/vol como un crioprotector y se congeló la proteína activada y se almacenó a -25 °C hasta que era necesaria para la conjugación.

La bromoacetilación de residuos de lisina de CRM197 fue muy consistente, dando como resultado la activación de 19 a 25 lisinas de las 39 lisinas disponibles (véase el cuadro 16). La reacción produjo altos rendimientos de proteína activada.

CUADRO 16 Rendimientos y grado de bromoacetilación de CRMig?.

Preparación Lisinas activadas Escala (mg) Rendimiento (n => (% P P) 1 24 23 85 2 20 38 87 3 19 35 77 4 22 35 94 5 23 35 87 6 25 48 104 3. Reacción de acoplamiento: Una vez se prepararon el polisacárido de cápsula activado y la proteína de portador activada, se combinaron los dos en una reacción de conjugación. Se disolvió el polisacárido tiolado y liofilizado en borato 0.16 M pH 8.95, se mezcló CRM197 bromoacetilado descongelado y agua destilada para fabricar la disolución final de borato 0.1 M, razón 1 :1 en p/p de CRM 97:polisacárido, y polisacárido capsular de serotipo 5 2 mg/ml. Se incubó esta mezcla a temperatura ambiente durante entre 16 y 24 horas. Se taparon los grupos bromoacetilo sin reaccionar en la proteína añadiendo clorhidrato de cisteamina en una razón de CRMi97:cisteamina de 1 :2 (p/p) usando una disolución 135 mg/ml de cisteamina disuelta en borato 0.1 M pH 8.95 y se incubó durante 4 horas a temperatura ambiente. El conjugado de polisacárido de cápsula-CRMi9 (conjugado) se purificó mediante diafiltración 50 veces frente a NaCI al 0.9 % usando un ultrafiltro de polietersulfona de 100K.

Los resultados de la reproducibilidad de los estudios de tiolación de polisacárido capsular de serotipo 5 con PDPH mostraron que el grado de activación estaba en el intervalo de un 11 % a un 19 %, lo que corresponde a aproximadamente una molécula de ligador unida por diez unidades de repetición de CP con respecto a una molécula de ligador por cinco unidades de repetición.

Conjugación de polisacárido capsular de serotipo 5 con CRIy mediante química de conjugación de CDT.

CDT proporciona un método de conjugación de una sola etapa en el que el polisacárido se activa en un entorno anhidro (DMSO) para formar restos de carbamato de triazol con restos acilimidazol o aciltriazol e hidroxilos disponibles con ácidos carboxílicos. La adición de un portador de proteína (en DMSO) conduce al desplazamiento nucleofílico del triazol mediante Usinas y formación de un enlace de carbamato (para hidroxilos activados) y el enlace de amida (para ácidos carboxílicos activados). Se diluye la disolución de reacción 10 veces en una disolución acuosa en preparación para purificación mediante filtración de flujo tangencial.

La química de conjugación de CDT produjo un polisacárido capsular de serotipo 5 con enlace covalente con la proteína de portador, que se indicaba por la presencia del sacárido y la proteína en las fracciones en cromatografía de exlusión molecular, y mediante análisis de aminoácidos de conjugado de clorhidrato de cisteamina tapado o glicolaldehído tapado.

Un resumen de los resultados de la preparación de varios lotes de conjugados preparados mediante químicas tanto de PDPH como de CDT para tamaños de polisacárido capsular de serotipo 5 en el intervalo de 20 kDa a 40 kDa se muestra en el cuadro 17 a continuación. No hubo diferencias significativas en el polisacárido de cápsula libre, razón de polisacárido-proteína y rendimientos de conjugados generados mediante estas químicas de conjugación. La antigenicidad de polisacárido conjugado capsular de serotipo 5 no se vio alterada por la conjugación tal como se representa mediante la línea de precipitinas de identidad entre conjugados y polisacárido nativo.

CUADR0 17 Caracterización del polisacárido capsular de serotipo S-CRMi ? preparado mediante dos químicas de conjugación Rendi- Rendi- miento Razón Tamaño miento de de Azúcar Lisinas (MW o Kd de CP proteína rendi- libre Proteína modi- (% < 0.3), Química (%) (%) miento (%) libre (%) ficadas sac/prot.)) 38/61 a CDT 19-27 35 0.5-0.8 10-40 < 1 18-22 76/74 7.5 x 105 a PDPH 26-52 40-99 0.4-1.0 23-50 ND ND 2.3 x 106 ND = no detectado Tal como se muestra anteriormente, los métodos que se describen en el presente documento pueden usarse para producir unos intervalos específicos de polisacáridos de cápsula de alto peso molecular deseados. Se buscaba preparar conjugados a partir de un intervalo preseleccionado de alto peso molecular que pudiera ser filtrado y polisacárido capsular de serotipo 5 purificado para su uso en composiciones ¡nmunogénicas. El cuadro 18 resume el análisis de conjugados de polisacárido capsular de serotipo 5 en los que el peso molecular de polisacárido de cápsula de serotipo 5 oscilaba de aproximadamente 92 kDa a aproximadamente 1 19 kDa y activado con triazol (CDT). Los pesos moleculares de los conjugados resultantes oscilaban de 1 ,533 kDa a 2,656. El número de lisinas conjugadas por CRM197 oscilaba de un alto número de 22 a un bajo número de 15. El polisacárido de cápsula libre oscilaba de un alto número de un 18 % a un bajo número de un 11 %.

CUADR0 18 Conjugados con intervalo de peso molecular preseleccionado de polisacárido capsular de serotipo 5 Poli, RendiSac. MW mediante MW miento libre SEC-MALLS Lisinas Pase (kDa) (%) (%) (kDa) modificadas 1 121 63 11 2130 19 2 92 72 16 1533 22 3 119 74 14 2656 15 4 115 63 18 1911 15 Ambas químicas de conjugación producen un polisacárido capsular de serotipo 5 con enlace covalente con proteína de portador. No hubo diferencias significativas en polisacárido de cápsula libre, razón de polisacárido capsular de serotipo 5-proteína y rendimientos de conjugados generados mediante estos dos métodos.

EJEMPLO 11 Complejo frente a métodos de CDT en un solo recipiente.

Tal como se describe anteriormente, los métodos para fabricar los conjugados inmunogénicos de la invención implican una conjugación covalente de los polisacáridos capsulares con las proteínas portadoras usando una química de conjugación que implica CDT (1 ,1-carboil-di-1 ,2,4-triazol) o PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida). El uso de CDT dio como resultado un ligador de un carbono o de cero carbonos entre el polisacárido capsular y la proteína de portador, mientras que el uso de PDPH da como resultado un ligador de cinco carbonos con contenido en enlace tioéter covalente entre el polisacárido capsular y la proteína de portador.

El método basado en PDPH era un método de múltiples etapas que implicaba la activación del polisacárido, la eliminación de un grupo protector de tiol en el polisacárido, la purificación del producto intermedio de polisacárido activado, la activación y la purificación del portador de proteina, y la conjugación de los componentes activados seguido por purificación. En el presente método, polisacáridos capsulares de serotipo 5 de S. aureus se hicieron reaccionar con PDPH y una carbodiimida en un disolvente orgánico tal como DMSO para producir polisacáridos unidos a PDPH. Los polisacáridos unidos a PDPH se hicieron reaccionar con un agente reductor para producir polisacáridos activados que se purificaron a continuación. Proteínas de portador se hicieron reaccionar con ácido bromoacético en un disolvente orgánico para producir proteínas portadoras activadas que se purificaron a continuación. Los polisacáridos de serotipo 5 activados purificados se hicieron reaccionar a continuación con las proteínas portadoras activadas purificadas para producir conjugados de polisacárido de serotipo 5-proteína portadora.

Por el contrario, los métodos basados en CDT eran métodos de conjugación de una sola etapa, en la el polisacárido capsular se activaba en un entorno anhidro (es decir, DMSO) para formar restos de carbamato de triazol con restos acilimidazol o aciltriazol e hidroxilos disponibles con ácidos carboxílicos. La adición del portador de proteína (en DMSO) condujo a un desplazamiento nucleofílico del imidazol o triazol mediante lisinas y la formación de un enlace de carbamato (para hidroxilos activados) y el enlace de amida (para ácidos carboxílicos activados), permitiendo de ese modo que proceda la conjugación en "un solo recipiente". Por consiguiente, se desarrollaron dos métodos basados en CDT: un método más complejo y un método en un solo recipiente más sencillo. En el método más complejo, se combinaron polisacáridos capsulares de serotipo 5 de S. aureus con imidazol o triazol y a continuación se hicieron reaccionar con CDT en un disolvente orgánico (tal como DMSO) y aproximadamente un 0.2 % p/v de agua para producir polisacáridos de serotipo 5 activados. Los polisacáridos de serotipo 5 activados se purificaron y a continuación se hicieron reaccionar con proteínas portadoras en el disolvente orgánico para producir conjugados de polisacárido de serotipo 5-proteína portadora. El método en un solo recipiente era similar al método complejo excepto en que los polisacáridos de serotipo 5 activados no se purificaban antes de la reacción con proteínas portadoras.

Método de CDT complejo Activación de polisacárido capsular de serotipo 5: Se mezcló polisacárido capsular de serotipo 5 con 10 g de triazol/g de polisacárido capsular de serotipo 5 y se liofilizó. Se disolvió la torta resultante en DMSO a 2.0 mg de polisacárido capsular de serotipo 5/ml. Se determinó el contenido en agua y se ajustó a 0.2 %. Una disolución recién preparada de CDT a 100 mg/ml en DMSO se añadió para conseguir una cantidad de CDT en un exceso molar de 20 veces en comparación con la cantidad de CP5. Alternativamente, la cantidad de CDT que se añade puede ajustarse para obtener un grado de activación más alto o más bajo. Esto se mantuvo 30 minutos a 23 °C.

Purificación de polisacárido de serotipo 5 activado capsular.

La disolución de polisacárido de serotipo 5 activado capsular (ACP5) se vertió en 25 volúmenes de agua para destruir el CDT en exceso. Ésta se concentró hasta su volumen original sobre una membrana de PES de 10 kDa a aproximadamente 1 mg/cm2 y se diafiltró frente a agua para al menos 10 volúmenes. Esta etapa se completó en menos de 4 horas. Se mezcló el material diafiltrado con 10 g de triazol/g de polisacárido de serotipo 5 original y se liofilizó.

Preparación de CRM liofilizado: CRM se sometió a diafiltración frente a NaCI al 0.4 %/sacarosa al 5 % a volumen constante sobre una membrana de PES de 10 kDa para al menos 10 volúmenes. La concentración de proteína se determinó y se añadió suficiente tampón de diafiltración para llevar la concentración de proteína hasta 5.0 g/l, proporcionando de este modo una razón en p/p de NaCI/CRM = 0.8. Se liofilizó el CRM.

Conjugación: Se disolvió polisacárido capsular de serotipo 5 activado, diafiltrado, en DMSO a 1 mg/ml. Se añadió disolución de borato a 100 mM para conseguir un 2 % v/v.

CRM volvió a suspenderse a 2 mg/ml y, cuando se completó la disolución, se combinó con la disolución de ACP5. Ésta se dejó reaccionar a 4 °C durante 20 horas.

Se vertió la reacción de conjugado en 24 volúmenes de borato 5 mM pH 9.0 y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación se ajustó a pH 7.5 con tampón fosfato 0.5 M, pH 6.5. Ésta se filtró a través de un filtro de 5 micrómetros y se concentró hasta el volumen original sobre una membrana de PES de 300 kDa a una carga de ~ 1 mg/cm2 y se diafiltró frente a al menos 10 volúmenes de agua. El concentrado resultante se filtró a través de un filtro de 0.22 micrómetros y se almacenó a 2 °C-8 °C.

Procedimiento de en un solo recipiente de CDT Intercambio de matriz de CRM197. CRM197 se sometió a diafiltración para intercambiar de la matriz voluminosa de fosfato aproximadamente 10 mM/NaCI 80 mM/sacarosa al 15 %, pH de 7 a imidazol 5 mM/NaCI al 0.72 %,/octil-3-D-glucopiranósido 15 mM, pH 7. El intercambio permitió la eliminación de fosfato y sacarosa que son perjudiciales para la conjugación y define el contenido en cloruro de sodio portado en la conjugación. Se añade octil- -D-glucopiranósido para prevenir la formación de partículas tras la filtración estéril.

La matriz de la CRM197 se intercambió mediante filtración de flujo tangencial frente a imidazol 5 mM/NaCI al 0.72 %/octil-3-D-glucopiranósido 15 mM, pH 7 a través de 10 diavolúmenes usando membranas de PES de MWCO de 10K a una concentración de reténtate de aproximadamente 4 mg/ml. La exposición de membrana típica era de 2 gramos/ft2 y la concentración de CRM-197 final diana en la matriz era de 6 mg/ml. La CRM197 se almacenó a 2 °C-8 °C.

Activación/Conjugación: El método de activación/conjugación para polisacárido capsular de serotipo 5 de S. aureus consistió en las siguientes etapas: 1) Combinación del polisacárido; 2) Congelación superficial y liofilización de CRM197 y polisacárido combinado; 3) Disolución del polisacárido liofilizado y CRM197; 4) Activación del polisacárido; 5) Conjugación del polisacárido activado con CRMi97; y 6) Purificación del conjugado (dilución, diafiltración, filtración estéril).

El polisacárido se combinó con 10 gramos de excipiente de 1 ,2,4-triazol por gramo de polisacárido. El excipiente se añadió como un polvo al polisacárido, con una disolución que se obtiene tras menos de 15 minutos de mezclado a temperatura ambiente.

El polisacárido combinado y CRM197 se congelaron superficialmente por separado usando un baño de etanol a -75 °C. El volumen por frasco de 1 I era de aproximadamente 500 mi.

Para la disolución de polisacárido, se añadió DMSO a los frascos de liofilización individuales del polisacárido para obtener una suspensión y a continuación se transfirió al recipiente de reacción de activación/conjugación para calentar. Se añadió DMSO hasta obtener una concentración de 2 g/l. Se obtuvo una disolución transparente tras 5 a 10 minutos de mezclado.

Para la disolución de CRMi97, se añadió DMSO a los frascos de liofilización individuales con contenido en CRM-i97 para obtener una suspensión y a continuación se transfirió a un segundo recipiente para mezclar. Se añadió DMSO hasta obtener una concentración de 2 g/l. Habitualmente se obtuvo una disolución transparente en menos de 15 minutos.

La disolución de polisacárido/DMSO se muestreó por el análisis de KarI Fischer para determinar el contenido en humedad. CDT se preparó como una disolución 00 mg/ml en DMSO y se añadió a un exceso molar de 5 con respecto a polisacárido de tipo 5 (el método complejo usaba 20 equivalentes molares de CDT mientras que el método en un solo recipiente usaba 5 equivalentes molares de CDT:CP5). La adicón continua de la disolución de CDT se realizó a lo largo de aproximadamente 5 minutos a 23 °C + 2 °C con mezclado. Se dejó avanzar la reacción durante un mínimo de 30 minutos a 23 °C ± 2 °C. La reacción se muestreó para determinar el nivel de activación (UV 220/205 nm) y a continuación se añadió borato de sodio 100 mM, pH 9 hasta obtener una disolución acuosa al 1.5 %. A continuación se agitó la disolución de reacción durante un mínimo de 30 minutos a 23 °C + 2 °C.

Para la conjugación del polisacárido activado con CRM197, DMSO se añadió para obtener una concentración de reacción de 0.55 mg/ml. El CRMig7 disuelto en DMSO se añadió a continuación a la disolución de polisacárido activado con mezclado. Se agitó la reacción durante un mínimo de 16 horas a 23 °C + 2 °C.

La reacción disolución se diluyó 10X con tetraborato de sodio 5 mM, pH 8.6 para obtener un pH diluido final de 9 ± 0.2. La disolución se agitó a 23 ± 3 °C durante un mínimo de 4 horas. La disolución diluida se pasó a través de un filtro de 5 pm y se concentró hasta una concentración de retentato diana de 2 g/l. La filtración de flujo tangencial se realizó usando membranas de celulosa regeneradas de 300K a través de 20 diavolúmenes con succinato 5 mM, pH 7. La exposición de membrana típica era de 1 gramo/ft2. El conjugado purificado se pasó a través de un filtro de 0.22 micrómetros y se almacenó a 2 °C-8 °C.

EJEMPLO 12 Conjugación de polisacárido capsular de serotipo 5 usando el método de conjugación en un solo recipiente y complejo.

El presente ejemplo muestra que el intervalo preseleccionado de pesos moleculares de polisacáridos de cápsula puede usarse para conjugación o bien en el método en un solo recipiente o bien en el método complejo. Los polisacáridos más grandes se producen inicialmente por las células bacterianas y el intervalo de peso molecular purificado resultante puede controlarse mediante el pH y el calor del método de hidrólisis en el ejemplo 9. En el presente ejemplo, se seleccionaron ocho lotes en los que el peso molecular de polisacárido capsular de serotipo 5 oscilaba de aproximadamente 90 kDa a aproximadamente 140 kDa y se realizó la conjugación usando activación con triazol (CDT) en los método o bien en un solo recipiente o bien complejo que se describen anteriormente. Véase el cuadro 19. Los pesos moleculares de los conjugados resultantes oscilaban de 1 ,125 kDa a 2,656 kDa. El número de lisinas conjugadas por CRM oscilaba de un número alto de 22 a un bajo número de 15. El azúcar libre oscilaba de un alto número de un 23 % a un bajo número de un 11 %.

CUADRO 19 Conjugados de polisacárido capsular de serotipo 5 preparados con polisacáridos capsulares de 90 kDa a 140 kDa.

MW Rendimediante Poli, miento Azúcar SEC- ProcediMW de sac. libre MALLS miento Pase (kDa) (%) (%) (kDa) Lisinas En un 1 142 93 1 1 1932 19 solo 2 108 93 14 1 1 17 20 recipiente 3 142 85 17 1609 15 4 108 86 23 1 125 15 Complejo 1 121 63 1 1 2130 19 2 92 72 16 1533 22 3 1 19 74 14 2656 15 4 1 15 63 18 191 1 15 EJEMPLO 13 Los conjugados de polisacárido capsular de serotipo 5 muestran constantemente protección en modelo de pielonefritis murino.

Los conjugados de polisacárido capsular de serotipo 5 se evaluaron para determinar su capacidad para proteger a ratones en un modelo de pielonefritis. Los recuentos de bacterias en la sangre de ratones que recibieron exposición a S. aureus i.p. se redujeron significativamente en comparación con controles inmunizados con PBS.

Los seis estudios individuales mostraron una reducción significativa en ufc/ml de ríñones en los animales inmunizados (la figura 9). Cuando estos estudios se agruparon para metanálisis, la significación global para los estudios como un todo aumentó hasta por debajo de 0.0001. Los datos mostraron una reducción constante de la colonización de ríñones trs vacunaciones activas con el polisacárido capsular conjugado.

EJEMPLO 14 Los conjugados de polisacárido capsular de serotipo 5 preparados mediante diferentes químicas de conjugación proteien a los ratones frente a infecciones experimentales.

Los estudios de inmunización activa en el modelo de pielonefritis murino se llevaron a cabo con conjugados de polisacárido capsular de serotipo 5 preparados mediante química o bien de PDPH o bien de CDT. Los métodos para conjugar polisacáridos capsulares con CRIv se describen anteriormente. Los resultados mostraron que ambos conjugados reducen la colonización en ratones en comparación con animales inmunizados sham (cuadro 20).

CUADRO 20 Efecto de la conjugación de PDPH frente a CDT sobre la protección frente a exposición a S. aureus en el modelo de pielonefritis.

Estudio N° Antígenos Cepa/Dosis logUFC/Riñón Significación Estudio 1 Solución salina + AIP04 PFESA0266 5,53 ± 1 ,90 — 1 mcg de CP5-CR (PDPH)¦ AIP04 2 x 108 3.01 ± 1 ,83 p < 0.001 1 mcg de CP5-CRM (CDT) ¦ AIP04 1.67 ± 0.23 p < 0.0001 Estudio 2 Solución salina + AIP04 PFESA0266S 6.17 ± 1.76 — 1 mcg de CP5-CR (PDPH)¦ AIP04 2.7 x 108 3.06 + 1.69 p < 0.0001 1 mcg de CP5-CRM (CDT) ¦ AIP04 1.87 ± 0.69 p < 0.0001 EJEMPL0 15 La inmunización activa de conjugado de polisacárido capsular de serotipo 5 protege a fatas en un modelo de endocarditis de rata.

Cuatro estudios se llevaron a cabo con conjugado de de PDPH CP5-CRMi97. Los conjugados de polisacárido capsular de serotipo 5 reducián significativamente las UFC recuperadas después de una exposición a PFESA0266 de S. aureus tanto en el corazón como los ríñones en 2 de 3 experimentos (cuadro 21 ). En el tercer estudio, el título anti-CP5 medio geométrico (TMG) fue el más bajo de los tres experimentos, pero sólo fue ligeramente más bajo que en el experimento previo.

CUADRO 21 La inmunización con polisacárido capsular de serotipo 5-CRM197 reduce las UFC en un modelo de endocarditis de rata.

Log UFC Recuperadas Significación TMG Cepa de Composición exposición/ Cora Riñó CoraTítulo de inmunogénica Dosis -zón n zón Riñón CP 4.34± 3.92± 1 mcg de CP5-CRM PFESA0266 103,000 1.78 1.73 7.94± 6.77± 1 mcg de PP5-CRM 2.21 x 108 ufe P < P 0.78 0.79 0.001 0.05 4.43± 3.11± 1 mcg de CP5-CRM PFESA0266 51 ,000 2.30 2.33 5.63± 4.19± Solución salina 6,5 x 107 ufe No No 2 48 2.05 4.01 ± 3.90± 1 mcg de CP5-CRM PFESA0266 67,000 2.49 1.92 7.52± 6.52± P < Solución salina 4.0 x 108 ufe 0.000 P < 1.38 1.17 0.0002 2 EJEMPLO 16 Inmunogenicidad potenciada de vacunas de conjugado de CP5 HMW en ratones en comparación con vacunas de conjugado de CP5 LMW Se realizó un estudio de pielonefritis murina para evaluar la inmunogenicidad y eficacia de diferentes formulaciones de conjugado de CP5. Se sometieron a prueba dos formulaciones: La primera formulación estaba compuesta por un CP5 de alto peso molecular (HMW) (aproximadamente 300 kDa) conjugado con CRM197. La segunda formulación contenía un CP5 de bajo peso molecular (LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado con CRM197. Se sometieron a prueba tres niveles de dosis para la vacuna de HMW (1 , 0.1 y 0.01 mcg). La vacuna de LMW se sometió a prueba a 1 mcg. También estaba incluido un grupo de control negativo compuesto por una vacuna de conjugado de polisacárido derivada de Streptococcus pneumoniae conjugado con CRM197 (PP5). Los polisacáridos se formularon con 22 mcg de AIP04 en las semanas 0, 3 y 6 y se expusieron a PFESA0266 de S. aureus en la semana 8. Se extrajeron los ríñones se y se contaron las colonias bacterianas 48 horas después de una exposición. Ambas vacunas fueron eficaces para generar una respuesta inmunitaria y se observó una reducción en las UFC de PFESA0266 de S. aureus en los ríñones de ratones vacunados con los grupos de 1 pg grupos de vacuna tanto de HMW como de LMW. Esto dependiá de la dosificación tal como se muestra mediante la eficacia reducida con respecto a las dosificaciones de vacuna más bajas (figura 10). La lectura de UFC no era suficientemente sensible para detectar una diferencia en cuanto a la eficacia para las vacunas de HMW y de LMW. Los sueros de los ratones se sometieron a prueba por lo tanto mediante OPA. Los títulos de OPA se definieron como la dilución de suero requerida para destruir el 40 % de la cepa S. aureus PFESA0266 en un ensayo de OPA. Se observaron títulos aumentados de OPA para la vacuna de HMW en comparación con la formulación de LMW (figura 1 1).

EJEMPLO 17 Los conjugados de polisacárido de cápsula que comprenden polisacáridos de alto peso molecular muestran una inmunogenicidad aumentada en comparación con los conjugados que comprenden polisacáridos de bajo peso molecular.

Se llevaron a cabo estudios en primates no humanos (NHP) para evaluar la inmunogenicidad de diferentes formulaciones de conjugado de cápsula. Se sometieron a prueba dos formulaciones a dos niveles de dosificación diferentes (2 y 20 pg). La primera formulación contenia un polisacárido de alto peso molecular (HMW) (aproximadamente 130 kDa) conjugado con CRM197. La segunda formulación contenía un polisacárido de bajo peso molecular (LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado con CRM197. Se vacunaron grupos de cinco primates con una dosis individual de una u otra de vacuna y se monitorizaron los títulos inmunitarios antes de la vacunación y dos semanas después de la vacunación. Los títulos de OPA se definieron como la dilución de suero requerida para destruir el 40 % de cepa S. aureus PFESA0266 en un esnayo de OPA. También se monitorizaron los títulos de anticuerpo mediante ELISA. Se observó una actividad aumentada para la vacuna de HMW en comparación con la formulación de LMW (cuadro 22), que se demuestra por un aumento de diez veces en los títulos de anticuerpo para la vacuna de HMW en comparación con la vacuna de LMW. La tasa de sujetos que responden a OPA para los NHP que recibieron la vacuna de HMW fue también más alta (un 80 % en comparación con un 40 %).

CUADRO 22 Se observa inmunoqenicidad aumentada para vacunas de coniuqado de polisacárido de HMW en comparación con vacuna de coniuqado de polisacárido de LMW.

Nivel de dosis Media geométrica Tasa de sujetos que de CP5-CRM197 de PD1* responden a OPA (mcg) por (%)± animal HMW (125 kDa) 20 32 80 2 21 80 LMW (25 kDa) 20 3 40 2 8 40 * Aumento en veces calculado a partir del título de ELISA de CP5 2 semanas tras la vacunación en comparación con los títulos antes de la vacuna. ± Tasa de sujetos que responden calculada a partir de monos que generan un aumento en el título de OPA tras una dosis individual de vacuna 2 semanas tras la vacunación. Cada grupo contenía 5 macacos Rhesus y las vacunas se formularon con AIP04 (250 mcg/dosis) EJEMPLO 18 La O-acetilación de polisacárido es importante para la inducción de respuestas de anticuerpos protectores frente a coniuqado de polisacárido capsular de serotipo 5.

Para evaluar la importancia de la O-acetilación de polisacárido capsular de serotipo 5, se O-desacetiló el polisacárido capsular nativo (dOAc) y conjugado con CRM197 (dOAc-CRM-197) usando química de conjugación de PDPH, tal como se analiza anteriormente. La eficacia de conjugado de dOAcCP-CRMi97 se comparó junto con CP5-CRMi97 en un modelo de pielonefritis murino.

La inmunización con conjugados carentes de grupos O-acetilo (dOAc CP5-CRM) no reducía las ufe bacterianas recuperadas en los ríñones. Estos datos (cuadro 23) indican que la O-acetilacíón es importante para obtener anticuerpos funcionales frente a CP5.

CUADRO 23 La inmunización con Conjugados de polisacárido capsular de serotipo 5 des-O-acetilados no protegía a los ratones frente a la conolización de riñon.

Estudio N° Antígenos Cepa/Dosis LogUFC/Riñón Significación Estudio 1 1 meg de PP5-CRM PFESA0266 3.89 ± 2.24 1 meg de dOAc 8 CP5-CRM 7 x 10' 4.20 ± 1.75 1 meg de CP5-CRM 1.75 ± 0.39 valor p < 0.008 Estudio 2 Solución salina PFESA0266 5.08 ± 1.96 1 meg de dOAc CP5-CRM 2.4 x 108 5.89 ± 1.29 1 meg de de CP5- CRM 2.93 ± 2.11 valor p < 0.02 EJEMPLO 19 Confirmación de la importancia de la O-acetilación como epítopo funcional de polisacárido capsular de serotipo 5 mediante OPA usando anticuerpos monoclonales con especificidades conocidas.

Se evaluaron anticuerpos monoclonales frente a polisacárido capsular de serotipo 5 con especificidades para OAc + (CP5-7-1), OAc + /-(CP5-5-1) y OAc- (CP5-6-1 ) para determinar la actividad de destrucción de OP frente a la cepa PFESA0266 de tipo 5 (cuadro 24). Se usaron anticuerpos monoclonales frente a polisacárido capsular de serotipo 8 (CP8-3-1 específico frenet a CP8 OAc +) como control negativo.

El AcM anti-CP5 específico de OAc CP5-7-1 mediaba la destrucción de PFESA0266 de S. aureus (cuadro 24). También el anticuerpo monoclonal CP5-5-1 , que reconoce epítopos compartidos tanto por CP5 OAc + como por CP5 OAc-, mediaba la destrucción de la cepa PFESA0266. El anticuerpo monoclonal específico para epítopos presentes en polisacárido capsular OAc- de serotipo 5 no mediaba la destrucción de la cepa PFESA0266. Estos resultados indican que son necearlos epítopos de O-acetilo en el polisacárido capsular de serotipo 5 para provocar una actividad funcional de anticuerpos específicos de serotipo 5.

Los anticuerpos necesitan ser funcionales tal como se mide por la destrucción de bacterias en un modelo de eficacia animal o un ensayo de destrucción opsonofagocítica que muestra que los anticuerpos destruyen las bacterias. Puede que la destrucción funcional no se demuestre usando un ensayo que supervisa la generación de anticuerpos únicamente, lo que no es indicativo de la importancia de la O-acetilación en cuanto a la eficacia.

CUADRO 24 Los anticuerpos monoclonales específicos frente a polisacárido capsular de serotipo 5 O-acetilado (+) y Polisacárido capsular de serotipo 5 O- y des-O-acetilado (+ /-) son opsónicos frente a PFESA0266 de S. aureus (tipo 5).

CP5-5-1 (O-Ac + /-) CP5-6-1 (O-Ac -) CP5-7-1 (O-Ac +) CP8-3-1 (-control) (mcg) 20 10 5 2,5 (mcg) 20 10 5 2,5 (mcg) 20 10 5 2,5 (mcg) 20 10 5 2,5 28 33 30 21 -12 -5 -12 -5 31 46 49 55 -18 -3 -13 -5 Datos notificados como porcentaje de destrucción y calculados determinando la razón del número de UFC que sobrevivieron a 60 minutos en pocilios con bacterias, anticuerpos, complemento y células HL-60 con respecto al número de UFC que sobrevivieron en pocilios carentes de anticuerpos pero con contenido en bacterias, complemento y células HL-60.

EJEMPLO 20 Se observa inmunogenicidad aumentada para conjugados de CP5 compuestos por polisacáridos de alto peso molecular en comparación con polisacáridos de bajo peso molecular en primates no humanos (NHP).

Se llevaron a cabo estudios en primates no humanos (NHP) para evaluar la inmunogenicidad de diferentes formulaciones de conjugado de cápsula. Se sometieron a prueba dos formulaciones a dos niveles de dosificación diferentes (2 y 20 pg). La primera formulación estaba compuesta por un polisacárido de alto peso molecular (HMW) (aproximadamente 130 kDa) conjugado con CRM197. La segunda formulación contenía un polisacárido de bajo peso molecular (LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado con CRM197. Se vacunaron grupos de cinco primates con una dosis individual de una u otra vacuna y se monitorizaron los títulos inmunitarios antes de la vacunación y dos semanas tras la vacunación. Los títulos de OPA se definieron como la dilución de suero requerida para destruir el 40 % de cepa S. aureus PFESA0266 en un ensayo de OPA. También se monitorizaron los títulos de anticuerpo mediante ELISA. Se observó una actividad aumentada para la vacuna de HMW en comparación con la formulación de LMW (cuadro 25). Hubo un aumento de tres a diez veces en los títulos de anticuerpo para la vacuna de HMW en comparación con la vacuna de LMW. La tasa de sujetos que responden a OPA para los NHP que recibieron la vacuna de HMW fue también más alta (un 80 % en comparación con un 40 %).

CUADRO 25 Enhanced Inmunoqenicidad se observa para HMW polisacárido conjugado vacunas en comparación con LMW polisacárido conjugado vacuna.

Nivel de dosis de Media geométrica Tasa de sujetos CP5-CRM197 (mcg) de PD1* que responden a por animal OPA (%)± HMW (125 kDa) 20 32 80 21 80 LMW (25 kDa) 20 40 8 40 * Aumento en veces calculado a partir de título de ELISA de CP5 2 semanas tras la vacunación en comparación con títulos antes de la vacuna. ± Tasa de sujetos que responden calculada a partir de monos que generan un aumento en el título de OPA tras una dosis individual de vacuna 2 semanas tras la vacunación. Cada grupo contenía 5 macacos Rhesus y las vacunas se formularon con AIPQ4 (250 mcg/dosis) Resumen Las dos químicas de conjugación, que se describen en el presente documento, producían un polisacárido capsular de serotipo 5 con enlace covalente con la proteína de portador CRM197. No hubo diferencias significativas en sacárido libre, razón de polisacárido de serotipo 5-proteína y rendimientos de conjugados generados mediante estos dos métodos.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la técnica a la que pertenece la presente invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en el presente documento por referencia en la misma medida que si se indicara específica e individualmente que cada publicación o solicitud de patente individual se incorpora por referencia.

A pesar de que la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y de ejemplo para los fines de claridad de comprensión, pueden ponerse en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (35)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un conjugado de polisacárido-proteína ¡nmunogénico que comprende un polisacárido capsular de Staphylococcus aureus conjugado con una proteína de portador, en el que el polisacárido tiene un peso molecular de entre 20 kDa y 1000 kDa o entre 70 kDa y 300 kDa.

2. - El conjugado inmunogénico de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque conjugado inmunogénico tiene un peso molecular de entre 200 kDa y 5000 kDa o entre 500 kDa y 2500 kDa.

3. - El conjugado de polisacárido-proteína inmunogénico de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el polisacárido capsular es un serotipo 5 o un polisacárido capsular serotipo 8.

4.- El conjugado inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque el polisacárido tiene un grado de O-acetilación de entre un 10 y un 100 %, entre un 50 y un 100 % o entre un 75 y un 100 %.

5. - El conjugado inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado además porque la proteína de portador es CRM197.

6. - El conjugado inmunogénico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la CRMi97 se une covalentemente con el polisacárido a través de un enlace de carbamato, un enlace de amida, o ambos.

7. - El conjugado inmunogénico de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizado además porque la razón molar de lisinas conjugadas con respecto a CRM197 es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 25:1.

8. - El conjugado inmunogénico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque al menos un enlace covalente entre CRM 97 y polisacárido tiene lugar al menos en cada de 5 a 10 unidades de repetición de sacárido del polisacárido o cada 5 unidades de repetición de sacárido del polisacárido.

9. - El conjugado inmunogénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-8, caracterizado además porque la CRMi97 comprende de 5 a 25, 5 a 20, o 10 a 25 lisinas con enlace covalente con el polisacárido.

10. - Una composición inmunogénica que comprende el conjugado inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y al menos uno de un adyuvante, diluyente o portador.

1 1. - La composición inmunogénica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque la composición inmunogénica comprende menos de un 30 % o menos de un 20% de polisacárido libre de tipo 5 u 8 en comparación con la cantidad total de polisacárido de tipo 5 u 8.

12. - El uso de la composición inmunogénica de la reivindicación 10 u 1 1 , para preparar un medicamento para la inducción de una respuesta inmunitaria contra Staphylococcus aureus en un sujeto.

13. - Un método de producción de un conjugado inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende los pasos de: a) hacer que reaccione un polisacárido capsular de S. aureus aislado con carbonil-ditriazol (CDT) en un disolvente orgánico para producir un polisacárido activado; b) hacer que reaccione el polisacárido activado con una proteína de portador en un disolvente orgánico para producir un conjugado de polisacárido de proteína de portador; y c) aislar el conjugado de polisacárido capsular de proteína de portador.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque comprende adicionalmente liofilizar el polisacárido aislado y volver a suspender el polisacárido liofilizado en un disolvente orgánico.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polisacárido activado se aisla con respecto a la reacción de activación antes de hacer que reaccione con la proteína de portador.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque la etapa b) comprende: i) liofilizar el polisacárido aislado activado aislado para producir un polisacárido aislado activado liofilizado; ii) liofilizar la proteína de portador para producir una proteína de portador liofilizada; y iii) volver a suspender el polisacárido aislado activado líofilizado y la proteína de portador liofilizada en un disolvente orgánico para producir un polisacárido aislado activado mezclado con una proteína de portador.

17.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-16, caracterizado además porque comprende adicionalmente la dilución de la mezcla de reacción de la etapa b) en un tampón y mantener un pH de aproximadamente 8.8 a aproximadamente 9.2 , de aproximadamente 9.0, durante al menos 4 horas a aproximadamente 20 °C a aproximadamente 26 °C, a aproximadamente 23 °C.

18.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17, caracterizado además porque el paso de hacer que reaccione el polisacárido con CDT comprende determinar el agua presente en el polisacárido capsular de serotipo 8 de S. aueus y ajustar la concentración de CDT a aproximadamente 1 :1 , aproximadamente 0.5:1 , o aproximadamente 0.75:1 rázón molasr de CDT:agua en el disolvente orgánico.

19. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17, caracterizado además porque el paso de hacer que reaccione el polisacárido de serotipo 5 de S. aureus con CDT comprende proporcionar aproximadamente un exceso molar 20 veces mayor de CDT en comparación con el polisacárido.

20. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-17 ó 19, caracterizado además porque la CDT de polisacárido serotipo 2 en una mezcla de disolvente orgánico se ajusta a una concentración de agua entre 0.1 y 0.3%, tal como 0.2%.

21. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-20, caracterizado además porque el polisacárido capsular serotipo de S. aureus se mezcla con imidazola o triazola antes de mezclarlo con CDT en un disolvente orgánico.

22. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-21 , caracterizado además porque comprende adicionalmente hidrolizar el conjugado de polisacárido de proteína de portador para remover los grupos de activación no hechos reaccionar.

23.- Un método para producir el conjugado inmunogénico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9 que comprende los pasos de: a) hacer que reaccione un polisacárido con 3-(2-pir¡dilditio)-prop¡onil-hidrazida (PDPH) y una carbodiimida en un disolvente orgánico para producir un polisacárido unido a PDPH; b) hacer que reaccione el polisacárido unido a PDPH con un agente reductor para producir un polisacárido activado; c) aislar el polisacárido activado para producir un polisacárido activado aislado; d) proporcionar una proteína de portador activada; e) hacer que reaccione el polisacárido activado aislado con la proteína de portador activada para producir un conjugado de polisacárido de proteína de portador; y f) aislar el conjugado de polisacárido de proteína de portador.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque la proteína de portador activada se aisla antes de hacer que reaccione la proteína de portador activada con el polisacárido activado.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado además porque el paso c) además comprende liofilizar el polisacárido aislado activado para producir un polisacárido activado liofilizado.

26.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-25, caracterizado además porque el disolvente orgánico es un disolvente aprótico polar.

27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque el disolvente aprótico polar se selecciona del grupo que consiste en dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida, N-metil-2-pirrolidona, y hexametilfosforamida (HMPA).

28. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-27, caracterizado además porque la carbodiimida es 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDAC).

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque la etapa de hacer que reaccione el polisacárido capsular de serotipo con PDPH y EDAC en un disolvente orgánico comprende mantener una razón en peso de polisacárido:PDPH:EDAC de aproximadamente 1 :5:3.

30.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-29, caracterizado además porque el agente reductor es ditiotreitol (DTT).

31.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-30, caracterizado además porque la activación de la proteína de portador comprende hacer que reaccione la proteína de portador con un ácido bromoacético.

32. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-31 , caracterizado además porque además incluye la etapa de hidrolización del conjugado de polisacárido de serotlpo-proteína de portador para eliminar grupos de activación sin reaccionar.

33. - El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque la etapa de hidrolización del conjugado de polisacárido de serotipo-proteína de portador comprende la adición de clorhidrato de cisteamina.

34. - El uso de una composición inmunogénica de la reivindicación 10 u 1 1 , para preparar un medicamento para la reducción o prevención de una enfermedad, afección o infección por estafilococos asociada con una bacteria de estafilococo en un sujeto.

35. - El uso como se reclama en la reivindicación 34, en donde la infección, enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en Staphylococcus aureus invasivo, septicemia y estado de portador.