TWI469789B - 金黃色葡萄球菌抗原之免疫原性組合物 - Google Patents

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Description

金黃色葡萄球菌抗原之免疫原性組合物
本發明係關於一種免疫原性組合物，其包含自金黃色葡萄球菌分離之多肽及莢膜多醣。另外，本發明係關於一種使用該等金黃色葡萄球菌多肽及莢膜多醣之免疫原性組合物來誘導個體針對金黃色葡萄球菌之免疫反應的方法。所得抗體亦可用於經由被動免疫療法治療或預防金黃色葡萄球菌感染。
本申請案主張2009年6月22日申請之美國臨時專利申請案第61/219,134號的優先權益，該案之全部內容以引用的方式併入本文中。
人類為金黃色葡萄球菌之天然貯主。健康個體可由金黃色葡萄球菌持久地(10-35%)、間歇地(20-75%)定殖於皮膚上、鼻孔及咽喉中或處於非帶菌狀態(5-70%)而無相關疾病。參見Vandenbergh等人，J. Clin. Micro. 37:3133-3140(1999)。當個體由於免疫障壁出現裂口(諸如在手術、置放留置導管或其他裝置、創傷或創口期間)而變得免疫功能不全時，隨後發生疾病。所得金黃色葡萄球菌感染可引起各種不同疾病，其範圍為輕度皮膚感染至心內膜炎、骨髓炎、菌血症、敗血症及其他形式之伴有高死亡率的疾病。大的人類貯主會增強適應之病原性純系類型進化及傳播的機會。
革蘭氏陽性(Gram positive)球菌金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌(S .epidermidis )之侵襲性葡萄球菌感染尤其值得關注，因為其為全世界日益嚴重的公共健康問題。具體而言，金黃色葡萄球菌造成大多數醫院獲得性(病院)感染且其在社區起始感染中之流行率愈來愈高。舉例而言，2005年，美國侵襲性抗二甲氧苯青黴素金黃色葡萄球菌(MRSA)之發病率據估計為每100,000個人中有31.8例，包括18,650例死亡。參見Klevens R.M.等人，JAMA ,298:1763-71(2007)。
葡萄球菌疾病在最近20年內已明顯增多，此增多與血管內裝置及侵襲性程序之使用平行存在。由於抗生素抗性之平行升高，故使得此發病率升高更麻煩，因此，急需用於疫苗中或引發多株或單株抗體賦予被動免疫性之免疫原性組合物作為預防或治療葡萄球菌感染及相關疾病之方法。
本發明係針對一種多抗原或多組分免疫原性組合物，其包含至少三種自葡萄球菌分離之抗原。呈多肽及多醣形式之抗原可尤其使用熟習此項技術者已知之分離程序直接自細菌獲得，或其可使用合成方案來製造，或其可使用熟習此項技術者亦已知之遺傳工程改造程序重組製造，或經由上述任何方法之組合來製造。在某些實施例中，本發明之免疫原性組合物包含三種或三種以上選自以下之抗原：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、結合於載體蛋白的分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)、結合於載體蛋白的分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)、及分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白。另外，本發明提供誘導針對葡萄球菌之免疫反應的方法，預防由葡萄球菌引起之疾病、降低其嚴重程度或延遲其發作的方法，及預防由葡萄球菌感染引起之疾病的至少一種症狀、降低其嚴重程度或延遲其發作的方法。
因此，在一實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)結合於載體蛋白及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)結合於載體蛋白。
在一實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)結合於載體蛋白及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)結合於載體蛋白。
在一實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)結合於載體蛋白及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)結合於載體蛋白。
在一實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)結合於載體蛋白及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)結合於載體蛋白。
在一實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)結合於載體蛋白及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)結合於載體蛋白。
在一實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)結合於載體蛋白及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)結合於載體蛋白。
在一實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽及分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白。
在一實施例中，本發明提供一種免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)結合於載體蛋白及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)結合於載體蛋白。
在一實施例中，免疫原性組合物包含分離之ClfA多肽片段，其中該ClfA多肽片段包含ClfA之纖維蛋白原結合域。在一實施例中，ClfA多肽片段包含ClfA之包含N1、N2及N3域的纖維蛋白原結合域。在一實施例中，ClfA多肽片段包含ClfA之包含N2及N3域的纖維蛋白原結合域。在一實施例中，含有ClfA纖維蛋白原結合域之組合物呈現與纖維蛋白原之結合減少。在一實施例中，ClfA之纖維蛋白原結合域與纖維蛋白原之結合程度低於纖維蛋白原與ClfA之天然纖維蛋白原結合域所觀察到的結合程度。在一實施例中，含有ClfA纖維蛋白原結合域之組合物呈現與纖維蛋白原之結合減少且在含有信號序列之全長蛋白的Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254及Ile 387中之一或多處具有胺基酸取代。在一實施例中，含有ClfA纖維蛋白原結合域之組合物在Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254及Ile 387中之一或多處呈現胺基酸取代，其中此等位置中之任一處或多處的胺基酸變為Ala或Ser。在一實施例中，組合物包含ClfA纖維蛋白原結合域，其中位置338處之Tyr變為Ala。
在一實施例中，免疫原性組合物包含分離之ClfB多肽片段，其中該ClfB多肽片段包含ClfB之纖維蛋白原結合域。在一實施例中，ClfB多肽片段包含ClfB之包含N1、N2及N3域的纖維蛋白原結合域。在一實施例中，ClfB多肽片段包含ClfB之包含N2及N3域的纖維蛋白原結合域。在一實施例中，含有ClfB纖維蛋白原結合域之組合物呈現與纖維蛋白原之結合減少。在一實施例中，ClfB之纖維蛋白原結合域與纖維蛋白原之結合程度低於纖維蛋白原與ClfB之天然纖維蛋白原結合域所觀察到的結合程度。
在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)，其為介於20 kDa與1000 kDa之間的高分子量多醣。在一實施例中，第5型高分子量多醣之分子量介於50 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，第5型高分子量多醣之分子量介於70 kDa與150 kDa之間。
在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣，其中10%至100%經O-乙醯化。在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣，其中50%至100%經O-乙醯化。在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣，其中75%至100%經O-乙醯化。
在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣，其為介於20 kDa與1000 kDa之間的高分子量多醣。在一實施例中，第8型高分子量多醣之分子量介於50 kDa與300 kDa之間。在一實施例中，第8型高分子量多醣之分子量介於70 kDa與150 kDa之間。
在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣，其中10%至100%經O-乙醯化。在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣，其中50%至100%經O-乙醯化。在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣，其中75%至100%經O-乙醯化。
在一實施例中，免疫原性組合物中所存在之莢膜多醣5及/或8結合於載體蛋白。在一實施例中，載體蛋白為白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheriae /C. diphtheriae )類毒素CRM197 。
在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌MntC，其為脂化蛋白。在一實施例中，免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌MntC，其不為脂化蛋白。
在一實施例中，本發明提供如本文所述之免疫原性組合物，其進一步包含至少一種來自絲胺酸-天冬胺酸重複(Sdr)蛋白家族之蛋白質，該蛋白質選自由SdrC、SdrD及SdrE組成之群。
在一實施例中，本發明提供如本文所述之免疫原性組合物，其進一步包含鐵表面決定子B(IsdB)蛋白。
在免疫原性組合物包含三種或三種以上所述抗原的本文所述之各實施例中，彼組合物可進一步包含其他免疫原性及/或非免疫原性物質。在某些實施例中，各免疫原性組合物或者可「基本上由三種或三種以上所述抗原組成」或「由三種或三種以上所述抗原組成」且進一步包含一或多種非免疫原性物質，如本文更詳細描述。
在一實施例中，本發明提供如本文所述之免疫原性組合物，其進一步包含以下任一種抗原：Opp3a、DltD、HtsA、LtaS、IsdA、IsdC、SdrF、SdrG、SdrH、SrtA、SpA、Sbi FmtB、α-溶血素(hla)、β-溶血素、纖維網蛋白-結合蛋白A(fibronectin-binding protein A，fnbA)、纖維網蛋白-結合蛋白B(fnbB)、凝固酶、Fig、map、潘頓-瓦倫丁殺白血球素(Panton-Valentine leukocidin，pvl)、α-毒素及其變異體、γ-毒素(hlg)及變異體、ica、免疫優勢ABC轉運體、Mg2+轉運體、Ni ABC轉運體、RAP、自溶素、層黏連蛋白受體、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、Sas A、SasF、SasH、EFB(FIB)、SBI、Npase、EBP、骨涎結合蛋白II、金黃色葡萄球菌金屬蛋白酶(aureolysin)前驅體(AUR)/Sepp1、Cna及其片段，諸如M55、TSST-1、mecA、聚-N-乙醯葡糖胺(PNAG/dPNAG)胞外多醣、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻璃網蛋白-結合蛋白、HarA、EsxA、EsxB、腸毒素A、腸毒素B、腸毒素C1及新穎自溶素。在本發明之某些實施例中，當免疫原性組合物包含某些形式之CP5及/或CP8時，其可能不進一步包含PNAG。
在一實施例中，免疫原性組合物進一步包含佐劑。在一實施例中，免疫原性組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
在一實施例中，使用免疫原性組合物調配疫苗。在一實施例中，使用該疫苗誘導個體針對金黃色葡萄球菌之免疫反應。在一實施例中，使用免疫原性組合物產生賦予個體被動免疫性之抗體調配物。
在一實施例中，本發明提供一種誘導針對金黃色葡萄球菌之免疫反應的方法，其包含向個體投與免疫原性量之本文所述之任何免疫原性組合物及醫藥學上可接受之載劑。
在一實施例中，本發明提供預防或減少金黃色葡萄球菌感染之方法，或預防與由金黃色葡萄球菌引起之感染相關的至少一種症狀或降低其嚴重程度之方法，該等方法包含向個體投與免疫原性量之本文所述之任何免疫原性組合物及醫藥學上可接受之載劑。
在一實施例中，誘導針對金黃色葡萄球菌之免疫反應的方法包含傳遞免疫原性組合物及佐劑。在一實施例中，誘導針對金黃色葡萄球菌之免疫反應的方法提供傳遞免疫原性組合物及醫藥學上可接受之載劑。
在一實施例中，由本文所述之免疫原性組合物誘導之免疫反應預防或減少個體之與葡萄球菌生物體相關的疾病或病狀，或預防或減少個體之與葡萄球菌生物體相關的一或多種症狀。在一實施例中，疾病係選自由侵襲性金黃色葡萄球菌疾病、敗血症及帶菌(carriage)組成之群。
在一實施例中，所誘導之免疫反應包含產生具有針對金黃色葡萄球菌之調理吞噬活性(opsonophagocytic activity，OPA)的抗體。在一實施例中，所誘導之免疫反應包含產生與未經免疫之個體中所觀察到的效價相比較高效價之對於金黃色葡萄球菌具有特異性之調理吞噬抗體。在一實施例中，調理吞噬效價為至少1:20。
在一實施例中，所誘導之免疫反應所針對的金黃色葡萄球菌為MRSA。在一實施例中，所誘導之免疫反應所針對的金黃色葡萄球菌為MSSA。在一實施例中，所誘導之免疫反應所針對的金黃色葡萄球菌為VRSA。在一實施例中，所誘導之免疫反應所針對的金黃色葡萄球菌為VISA。
在一實施例中，本發明提供一種預防經歷手術程序之個體之葡萄球菌感染的方法，該方法包含在手術程序之前向個體投與免疫有效量之如本文所述之任何免疫原性組合物。手術程序可為任選手術程序或非任選手術程序。在一實施例中，手術程序為心胸手術程序。
在描述本發明方法及治療方法之前，應瞭解本發明並不限於所述之特定方法及實驗條件，因為該等方法及條件可改變。亦應瞭解本文中所使用之術語僅用於達成描述特定實施例之目的，且不欲加以限制。
儘管任何類似或等效於本文所述之方法及材料均可用於本發明之實踐或測試，但現描述較佳方法及材料。本文所提及之所有公開案均以全文引用的方式併入本文中。
本文中所使用之術語具有熟習此項技術者認可及已知之含義，然而，為了方便及完整性起見，下文闡明特定術語及其含義。
如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除非本文另外明確規定，否則單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「該方法」包括本文所述類型及/或熟習此項技術者閱讀本發明後將顯而易知之一或多種方法及/或一或多個步驟等。
術語「約」意謂在值之統計學有意義範圍內。該範圍可在一個數量級內，通常在既定值或範圍之20%內，更通常在10%內，且甚至更通常在5%內。由術語「約」涵蓋之容許變化視所研究之特定系統而定，且可易於由一般技術者瞭解。無論何時本申請案中列舉範圍，該範圍內之每一整數均亦作為本發明之一實施例加以涵蓋。
「抗體」為免疫球蛋白分子，能夠經由位於免疫球蛋白分子之可變區中的至少一個抗原識別位點特異性結合於標靶(諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等)。如本文中所使用，除非本文另有指示，否則該術語意欲不僅涵蓋完整多株或單株抗體，而且涵蓋經工程改造之抗體(例如嵌合、人類化及/或經衍生以改變效應功能、穩定性及其他生物活性)及其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(scFv)及域抗體(包括鯊魚及駱駝科動物抗體)，及包含抗體部分之融合蛋白、多價抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要其展現所需生物活性即可)及如本文所述之抗體片段，及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾之構型。抗體包括任何種類之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，且該抗體不必為任何特定種類。視重鏈之恆定域的抗體胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸為不同種類。存在5種主要的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且在人類中一些此等免疫球蛋白可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同種類之免疫球蛋白的次單位結構及三維構型為眾所周知的。
「抗體片段」僅包含完整抗體之一部分，其中該部分較佳保留至少一種、較佳大部分或所有當存在於完整抗體中時通常與彼部分相關之功能。
術語「抗原」一般係指含有至少一個可選擇性結合同源抗體之抗原決定基的生物分子，通常為蛋白質、肽、多醣、脂質或結合物；或在一些情況下，係指可刺激動物體內產生抗體或T細胞反應或兩者之免疫原性物質，包括注射或吸收至動物體內之組合物。可針對整個分子或針對該分子之一或多個各種部分(例如抗原決定基或半抗原)產生免疫反應。該術語可用於指個別分子或指抗原性分子之均質或異質群體。抗原係由抗體、T細胞受體、或特定體液及/或細胞免疫性之其他元件識別。術語「抗原」包括所有相關抗原決定基。既定抗原之抗原決定基可使用此項技術中熟知之諸多抗原決定基定位技術來鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E. Morris編輯，1996) Humana Press,Totowa,N. J。舉例而言，線性抗原決定基可如下確定：例如，在固體支撐物上同時合成大量肽，該等肽對應於蛋白質分子之部分，且在該等肽仍附著於支撐物時使肽與抗體反應。該等技術為此項技術中已知的且描述於例如以下文獻中：美國專利第4,708,871號；Geysen等人，(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；Geysen等人，(1986)Molec. Immunol. 23:709-715中，所有文獻均以全文引用的方式併入本文中。類似地，構形抗原決定基可藉由確定胺基酸之空間構形，諸如藉由例如x-射線結晶學及2維核磁共振來鑑別。參見例如Epitope Mapping Protocols(同上)。此外，出於本發明之目的，「抗原」亦可用於指包括對天然序列之修飾，諸如缺失、添加及取代(在自然界中通常為保守性修飾，但其亦可為非保守性修飾)的蛋白質，只要該蛋白質保留引發免疫反應之能力即可。此等修飾可為故意的，如經由定點突變誘發，或經由特定合成程序，或經由遺傳工程改造方法，或可為偶然的，諸如經由宿主突變，從而產生抗原。此外，抗原可自微生物(例如細菌)得到、獲得或分離，或可為整個生物體。類似地，表現抗原之寡核苷酸或聚核苷酸(諸如核酸免疫應用中)亦包括於該定義中。亦包括合成抗原，例如多抗原決定基、側接抗原決定基及其他重組或以合成方式得到之抗原(Bergmann等人，(1993)Eur. J. Immunol. 23:27772781；Bergmann等人，(1996)J. Immunol. 157:32423249；Suhrbier,A.(1997)Immunol. and Cell Biol. 75:402 408；Gardner等人，(1998) 12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日)。
術語「佐劑」係指增強對抗原之免疫反應的化合物或混合物，如本文進一步描述及例示。
「菌血症」為細菌短暫存在於血液中。菌血症可發展成敗血症(septicemia/sepsis)，後者將被視為感染且細菌持久存在於血液中伴有相關臨床徵兆/症狀。並非所有細菌均能夠於血液中存活。具有特殊遺傳性狀之細菌提供彼能力。又，宿主因素亦起重要作用。
「莢膜多醣」係指在大部分葡萄球菌分離株之細胞壁外的多醣莢膜。舉例而言，金黃色葡萄球菌包括由使生物體能夠在不利滲透條件下存活之肽聚糖複合物構成的細胞壁組分，且亦包括連接於肽聚糖之獨特磷壁酸質。在細胞壁以外，薄的多醣莢膜包覆大部分金黃色葡萄球菌分離株。此血清學上不同之莢膜可用於將金黃色葡萄球菌之各種分離株按血清型分類。已顯示許多臨床上重要之分離株包括兩種莢膜類型：第5血清型(CP5)及第8血清型(CP8)。圖4中示意性展示CP5及CP8之結構。
如本文中所使用，「結合物」包含通常具有所需分子量範圍之莢膜多醣、及載體蛋白，其中該莢膜多醣結合於該載體蛋白。結合物可能含有或可能不含有一些量之游離莢膜多醣。如本文中所使用，「游離莢膜多醣」係指與結合之莢膜多醣-載體蛋白非共價締合(亦即非共價結合於結合物、吸附於結合物或截留於結合物中或與結合物一起截留)之莢膜多醣。術語「游離莢膜多醣」、「游離多醣」及「游離醣」可互換使用且意欲傳達相同含義。不考慮載體分子之性質，其可直接或經由連接子結合於莢膜多醣。如本文中所使用，「結合」係指使得細菌莢膜多醣共價連接於載體分子之過程。結合增強細菌莢膜多醣之免疫原性。結合可根據下文所述之方法或由此項技術中已知之過程進行。
如上文所述，本發明係關於包含金黃色葡萄球菌第5血清型莢膜多醣(CP5)結合於載體蛋白之結合物及包含金黃色葡萄球菌第8血清型莢膜多醣(CP8)結合於載體蛋白之結合物。本發明之一實施例提供包含金黃色葡萄球菌第5血清型莢膜多醣結合於載體蛋白及金黃色葡萄球菌第8血清型莢膜多醣結合於載體蛋白之結合物，其中：第5型莢膜多醣之分子量介於50 kDa與800 kDa之間；第8型莢膜多醣之分子量介於50 kDa與700 kDa之間；該等免疫原性結合物之分子量介於約1000 kDa與約5000 kDa之間；且相對於總多醣，結合物包含小於約30%游離多醣。在一實施例中，相對於總多醣，結合物包含小於約25%、約20%、約15%、約10%或約5%游離多醣。在一實施例中，第5型或第8型多醣之分子量介於20 kDa與1000 kDa之間。
在一實施例中，結合物之分子量介於約50 kDa與約5000 kDa之間。在一實施例中，結合物之分子量介於約200 kDa與約5000 kDa之間。在一實施例中，免疫原性結合物之分子量介於約400 kDa與約2500 kDa之間。在一實施例中，免疫原性結合物之分子量介於約500 kDa與約2500 kDa之間。在一實施例中，免疫原性結合物之分子量介於約600 kDa與約2800 kDa之間。在一實施例中，免疫原性結合物之分子量介於約700 kDa與約2700 kDa之間。在一實施例中，免疫原性結合物之分子量介於約1000 kDa與約2000 kDa之間；介於約1800 kDa與約2500 kDa之間；介於約1100 kDa與約2200 kDa之間；介於約1900 kDa與約2700 kDa之間；介於約1200 kDa與約2400 kDa之間；介於約1700 kDa與約2600 kDa之間；介於約1300 kDa與約2600 kDa之間；介於約1600 kDa與約3000 kDa之間。
因此，在一實施例中，本發明之免疫原性結合物中的載體蛋白為CRM197 ，且CRM197 經由胺基甲酸酯鍵、醯胺鍵或兩者共價連接於莢膜多醣。載體蛋白中結合於莢膜多醣之離胺酸殘基的數目可表示為所結合之離胺酸的範圍。舉例而言，在既定免疫原性組合物中，CRM197 可包含5至15個(總共39個)共價連接於莢膜多醣之離胺酸。表示此參數之另一方法為12%至40%之CRM197 離胺酸共價連接於莢膜多醣。在一些實施例中，共價結合於CRM197 之多醣的CRM197 部分包含5至22個共價連接於多醣之離胺酸。在一些實施例中，共價結合於CRM197 之多醣的CRM197 部分包含5至23個共價連接於多醣之離胺酸。在一些實施例中，共價結合於載體蛋白之多醣的CRM197 部分包含8至15個共價連接於多醣之離胺酸。在一些實施例中，共價結合於載體蛋白之多醣的CRM197 部分包含8至12個共價連接於多醣之離胺酸。舉例而言，在既定免疫原性組合物中，CRM197 可包含18至22個(總共39個)共價連接於莢膜多醣之離胺酸。表示此參數之另一方法為40%至60%之CRM197 離胺酸共價連接於莢膜多醣。在一些實施例中，CRM197 包含5至15個(總共39個)共價連接於CP8之離胺酸。表示此參數之另一方法為12%至40%之CRM197 離胺酸共價連接於CP8。在一些實施例中，CRM197 包含18至22個(總共39個)共價連接於CP5之離胺酸。表示此參數之另一方法為40%至60%之CRM197 離胺酸共價連接於CP5。
如上文所論述，載體蛋白中結合於莢膜多醣之離胺酸殘基的數目可表示為所結合之離胺酸的範圍，其可以莫耳比表示。舉例而言，CP8免疫原性結合物中所結合之離胺酸與CRM197 的莫耳比可介於約18:1至約22:1之間。在一實施例中，CP8免疫原性結合物中所結合之離胺酸與CRM197 的莫耳比範圍可為約15:1至約25:1。在一些實施例中，CP8免疫原性結合物中所結合之離胺酸與CRM197 的莫耳比範圍可為約14:1至約20:1；約12:1至約18:1；約10:1至約16:1；約8:1至約14:1；約6:1至約12:1；約4:1至約10:1；約20:1至約26:1；約22:1至約28:1；約24:1至約30:1；約26:1至約32:1；約28:1至約34:1；約30:1至約36:1；約5:1至約10:1；約5:1至約20:1；約10:1至約20:1；或約10:1至約30:1。又，CP5免疫原性結合物中所結合之離胺酸與CRM197 的莫耳比可介於約3:1與25:1之間。在一實施例中，CP5免疫原性結合物中所結合之離胺酸與CRM197 之莫耳比範圍可為約5:1至約20:1。在一實施例中，CP5免疫原性結合物中所結合之離胺酸與CRM197 之莫耳比範圍可為約4:1至約20:1；約6:1至約20:1；約7:1至約20:1；約8:1至約20:1；約10:1至約20:1；約11:1至約20:1；約12:1至約20:1；約13:1至約20:1；約14:1至約20:1；約15:1至約20:1；約16:1至約20:1；約17:1至約20:1；約18:1至約20:1；約5:1至約18:1；約7:1至約16:1；或約9:1至約14:1。
表示載體蛋白中結合於莢膜多醣之離胺酸殘基之數目的另一方法可為所結合之離胺酸的範圍。舉例而言，在既定CP8免疫原性結合物中，CRM197 可包含5至15個(總共39個)共價連接於莢膜多醣之離胺酸。或者，此參數可以百分比表示。舉例而言，在既定CP8免疫原性結合物中，所結合之離胺酸的百分比可為10%至50%。在一些實施例中，20%至50%之離胺酸可共價連接於CP8。或者，30%至50%之CRM197 離胺酸可共價連接於CP8；10%至40%之CRM197 離胺酸；10%至30%之CRM197 離胺酸；20%至40%之CRM197 離胺酸；25%至40%之CRM197 離胺酸；30%至40%之CRM197 離胺酸；10%至30%之CRM197 離胺酸；15%至30%之CRM197 離胺酸；20%至30%之CRM197 離胺酸；25%至30%之CRM197 離胺酸；10%至15%之CRM197 離胺酸；或10%至12%之CRM197 離胺酸共價連接於CP8。又，在既定CP5免疫原性結合物中，CRM197 可包含18至22個(總共39個)共價連接於莢膜多醣之離胺酸。或者，此參數可以百分比表示。舉例而言，在既定CP5免疫原性結合物中，所結合之離胺酸的百分比可為40%至60%。在一些實施例中，40%至60%之離胺酸可共價連接於CP5。或者，30%至50%之CRM197 離胺酸可共價連接於CP5；20%至40%之CRM197 離胺酸；10%至30%之CRM197 離胺酸；50%至70%之CRM197 離胺酸；35%至65%之CRM197 離胺酸；30%至60%之CRM197 離胺酸；25%至55%之CRM197 離胺酸；20%至50%之CRM197 離胺酸；15%至45%之CRM197 離胺酸；10%至40%之CRM197 離胺酸；40%至70%之CRM197 離胺酸；或45%至75%之CRM197 離胺酸共價連接於CP5。
莢膜多醣鏈連接於載體分子上之離胺酸的出現率為用於表徵莢膜多醣之結合物的另一參數。舉例而言，在一實施例中，關於莢膜多醣之至少每5至10個醣重複單元，存在至少一個在CRM197 與多醣之間的共價鍵。在另一實施例中，關於莢膜多醣之每5至10個醣重複單元；每2至7個醣重複單元；每3至8個醣重複單元；每4至9個醣重複單元；每6至11個醣重複單元；每7至12個醣重複單元；每8至13個醣重複單元；每9至14個醣重複單元；每10至15個醣重複單元；每2至6個醣重複單元；每3至7個醣重複單元；每4至8個醣重複單元；每6至10個醣重複單元；每7至11個醣重複單元；每8至12個醣重複單元；每9至13個醣重複單元；每10至14個醣重複單元；每10至20個醣重複單元；每5至10個醣重複單元，存在至少一個在CRM197 與莢膜多醣之間的共價鍵。在另一實施例中，關於莢膜多醣之每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個醣重複單元，存在至少一個在CRM197 與莢膜多醣之間的鍵。
多醣之化學活化及隨後結合於載體蛋白可由習知方法達成。參見例如美國專利第4,673,574號及第4,902,506號。或者，可使用其他活化及結合方法。
如本文中所使用，「載體蛋白」或「蛋白載體」係指可結合於所需免疫反應所針對的抗原(諸如莢膜多醣)之任何蛋白分子。諸如多醣之抗原結合於載體蛋白可使得抗原具有免疫原性。載體蛋白較佳為無毒且不具有反應原性並可以足夠量及純度獲得之蛋白。載體蛋白之實例為來自破傷風、白喉、百日咳、假單胞菌屬(Pseudomonas species)、大腸桿菌、葡萄球菌屬(Staphylococcus species)及鏈球菌屬(Streptococcus species)之毒素、類毒素、或毒素之任何突變交叉反應性物質(CRM197 )。載體蛋白應能夠經受標準結合程序。在本發明之一特定實施例中，使用CRM197 作為載體蛋白。
CRM197 (Wyeth/Pfizer,Sanford,NC)為自在基於酪蛋白胺基酸及酵母萃取物之培養基中生長的白喉棒狀桿菌菌株C7(β197 )之培養物分離之白喉毒素的無毒變異體(亦即類毒素)。經由超濾、硫酸銨沈澱及離子交換層析來純化CRM197 。產生CRM197 蛋白之白喉棒狀桿菌菌株C7(197 )的培養物已寄存於美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)(RockVille,Maryland)且已指定寄存編號ATCC 53281。其他白喉類毒素亦適用作載體蛋白。
其他適合之載體蛋白包括去活細菌毒素，諸如破傷風類毒素、百日咳類毒素、霍亂類毒素(例如國際專利申請案WO2004/083251中所述)、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST及來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )之外毒素A。亦可使用細菌外膜蛋白，諸如外膜蛋白複合物c(OMPC)、膜孔蛋白、轉鐵蛋白-結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏附素蛋白(PsaA)、難養芽胞梭菌(C.difficile )腸毒素(毒素A)及細胞毒素(毒素B)或流行性感冒桿菌(Haemophilus influenzae )蛋白D。亦可使用諸如卵白蛋白、匙孔螺血氰蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或結核菌素純蛋白衍化物(PPD)之其他蛋白作為載體蛋白。
莢膜多醣結合於載體蛋白之後，由各種技術純化多醣-蛋白結合物(增濃多醣-蛋白結合物之量)。此等技術包括例如濃縮/透析過濾操作、沈澱/溶離、管柱層析及深部過濾。參見以下實例。
個別結合物在純化之後可經組合以調配本發明之免疫原性組合物，該組合物可例如用於疫苗中。本發明之免疫原性組合物的調配可使用此項技術認可之方法來完成。
應注意在本發明中，諸如「包含」、「含有」及其類似術語之術語可具有其在美國專利法中之含義；例如，其可意謂「包括」及其類似術語。該等術語係指包括特定成分或成分組而不排除任何其他成分。諸如「基本上由…組成」之術語具有其在美國專利法中之含義，例如，其允許包括不減損本發明之新穎或基本特徵的其他成分或步驟，亦即，其排除減損本發明之新穎或基本特徵的其他未描述成分或步驟，且其排除先前技術之成分或步驟，諸如本文中所引用或以引用的方式併入本文中之此項技術中的文獻，尤其當此文獻之目的為定義可取得專利(例如相對於先前技術，例如相對於本文中所引用或以引用的方式併入本文中之文獻為新穎、非明顯、發明性的)之實施例時。且，術語「由…組成」具有其在美國專利法中之含義；亦即，此等術語為封閉式的。因此，此等術語係指包括特定成分或成分組且排除所有其他成分。
「保守性胺基酸取代」係指蛋白質之一或多個胺基酸殘基由具有類似物理及/或化學性質之其他胺基酸殘基取代。序列中之胺基酸的取代物可選自胺基酸所屬種類中之其他成員。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。含有芳環結構之胺基酸為苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸。帶正電(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶負電(酸性)胺基酸包括天冬胺酸及麩胺酸。預期該等變化將不會影響如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳或等電點所測定之表觀分子量。尤其較佳之取代為：Lys取代Arg及Arg取代Lys，使得可維持正電荷；Glu取代Asp及Asp取代Glu，使得可維持負電荷；Ser取代Thr，使得可維持游離--OH；及Gln取代Asn，使得可維持游離NH2 。
「片段」係指僅包括較大蛋白質之特定域的蛋白質。舉例而言，若包括信號序列，則ClfA及ClfB蛋白各含有多達8個域。對應於N1N2N3、N2N3、N1N2、N1、N2或N3域之多肽各視為ClfA或ClfB之片段。「片段」亦指包含親本蛋白質或多肽之胺基酸序列的至少4個胺基酸殘基(較佳至少10個胺基酸殘基、至少15個胺基酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘基、至少40個胺基酸殘基、至少50個胺基酸殘基、至少60個胺基酸殘基、至少70個胺基酸殘基、至少80個胺基酸殘基、至少90個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘基、至少125個胺基酸殘基或至少150個胺基酸殘基)之胺基酸序列的蛋白質或多肽，或包含親本核酸之核苷酸序列的至少10個鹼基對(較佳至少20個鹼基對、至少30個鹼基對、至少40個鹼基對、至少50個鹼基對、至少50個鹼基對、至少100個鹼基對、至少200個鹼基對)之核苷酸序列的核酸。
如本文中所使用，抗體之「功能活性」或「功能性抗體」係指可以最小程度特異性結合於抗原之抗體。其他功能為此項技術所已知且可包括免疫系統中實現病原體之清除或殺滅(諸如經由調理作用、ADCC或補體介導性細胞毒性)的其他組分。抗原結合後，任何後續抗體功能均可經由抗體之Fc區介導。抗體調理吞噬檢驗(OPA)為設計成活體外量測效應細胞(白血球)對細菌之Ig補體輔助殺滅的活體外檢驗，由此模擬生物學過程。抗體結合亦可直接抑制其所結合之抗原的生物學功能，例如，結合ClfA之抗體可中和其酶促功能。在一些實施例中，「功能性抗體」係指如藉由在動物功效模型中殺滅細菌或藉由說明抗體殺滅細菌之調理吞噬殺滅檢驗所量測具有功能之抗體。
金黃色葡萄球菌莢膜多醣之分子量為用於免疫原性組合物中之考慮因素。舉例而言，高分子量莢膜多醣由於抗原性表面上所存在之抗原決定基的較高價數而能夠誘導某些抗體免疫反應。預期「高分子量莢膜多醣」之分離用於本發明之組合物及方法中。舉例而言，在本發明之一實施例中，預期分離分子量大小範圍為約50 kDa至約800 kDa之第5型高分子量多醣。在本發明之一實施例中，預期分離分子量大小範圍為約20 kDa至約1000 kDa之第5型高分子量多醣。在本發明之一實施例中，預期分離及純化分子量大小範圍為約50 kDa至約300 kDa之第5型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為70 kDa至300 kDa之第5型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為90 kDa至250 kDa之第5型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為90 kDa至150 kDa之第5型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為90 kDa至140 kDa之第5型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為80 kDa至120 kDa之第5型高分子量莢膜多醣。可由本發明方法分離及純化之高分子量第5血清型莢膜多醣的其他範圍包括以下大小範圍：約70 kDa至約100 kDa之分子量；70 kDa至110 kDa之分子量；70 kDa至120 kDa之分子量；70 kDa至130 kDa之分子量；70 kDa至140 kDa之分子量；70 kDa至150 kDa之分子量；70 kDa至160 kDa之分子量；80 kDa至110 kDa之分子量；80 kDa至120 kDa之分子量；80 kDa至130 kDa之分子量；80 kDa至140 kDa之分子量；80 kDa至150 kDa之分子量；80 kDa至160 kDa之分子量；90 kDa至110 kDa之分子量；90 kDa至120 kDa之分子量；90 kDa至130 kDa之分子量；90 kDa至140 kDa之分子量；90 kDa至150 kDa之分子量；90 kDa至160 kDa之分子量；100 kDa至120 kDa之分子量；100 kDa至130 kDa之分子量；100 kDa至140 kDa之分子量；100 kDa至150 kDa之分子量；100 kDa至160 kDa之分子量；及類似的所需分子量範圍。
如上文所論述，金黃色葡萄球菌莢膜多醣之分子量為用於免疫原性組合物中之考慮因素。舉例而言，高分子量莢膜多醣由於抗原性表面上所存在之抗原決定基的較高價數而能夠誘導某些抗體免疫反應。在本發明之一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為約20 kDa至約1000 kDa之第8型高分子量莢膜多醣。在本發明之一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為約50 kDa至約700 kDa之第8型高分子量莢膜多醣。在本發明之一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為50 kDa至300 kDa之第8型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為70 kDa至300 kDa之第8型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為90 kDa至250 kDa之第8型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為90 kDa至150 kDa之第8型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為90 kDa至120 kDa之第8型高分子量莢膜多醣。在一實施例中，預期分離及純化分子量範圍為80 kDa至120 kDa之第8型高分子量莢膜多醣。可由本發明方法分離及純化之高分子量第8血清型莢膜多醣的其他範圍包括以下大小範圍：約70 kDa至約100 kDa之分子量；70 kDa至110 kDa之分子量；70 kDa至120 kDa之分子量；70 kDa至130 kDa之分子量；70 kDa至140 kDa之分子量；70 kDa至150 kDa之分子量；70 kDa至160 kDa之分子量；80 kDa至110 kDa之分子量；80 kDa至120 kDa之分子量；80 kDa至130 kDa之分子量；80 kDa至140 kDa之分子量；80 kDa至150 kDa之分子量；80 kDa至160 kDa之分子量；90 kDa至110 kDa之分子量；90 kDa至120 kDa之分子量；90 kDa至130 kDa之分子量；90 kDa至140 kDa之分子量；90 kDa至150 kDa之分子量；90 kDa至160 kDa之分子量；100 kDa至120 kDa之分子量；100 kDa至130 kDa之分子量；100 kDa至140 kDa之分子量；100 kDa至150 kDa之分子量；100 kDa至160 kDa之分子量；及類似的所需分子量範圍。
對免疫原性組合物之「免疫反應」為個體對所關注之組合物中所存在之分子(例如抗原，諸如蛋白質或多醣)發展體液及/或細胞介導性免疫反應。出於本發明之目的，「體液免疫反應」為抗體介導性免疫反應且涉及產生對於本發明之免疫原性組合物中所存在的抗原具有親和力之抗體，而「細胞介導性免疫反應」為由T淋巴細胞及/或其他白血球介導之免疫反應。「細胞介導性免疫反應」係藉由呈現抗原決定基以及主要組織相容性複合體(MHC)之I型或II型分子來引發。此活化抗原特異性CD4+ T輔助細胞或CD8+細胞毒性T淋巴細胞(「CTL」)。CTL對於與由主要組織相容性複合體(MHC)或CD1編碼且於細胞表面上表現之蛋白質一起呈現的肽或脂質抗原具有特異性。CTL幫助誘導及促進細胞內微生物之細胞內破壞，或受該等微生物感染之細胞的溶解。細胞免疫性之另一態樣涉及由輔助T細胞引起之抗原特異性反應。輔助T細胞用於幫助刺激非特異性效應細胞針對在表面上呈現肽抗原以及經典或非經典MHC分子之細胞的功能，且集中該等效應細胞之活性。「細胞介導性免疫反應」亦指產生由活化T細胞及/或其他白血球產生之細胞因子、趨化因子及其他此類分子，包括源自CD4+及CD8+T細胞之分子。特定抗原或組合物刺激細胞介導性免疫反應之能力可由許多檢驗確定，諸如藉由淋巴細胞增殖(淋巴細胞活化)檢驗、CTL細胞毒性細胞檢驗，藉由檢驗對於致敏個體之抗原具有特異性之T淋巴細胞或藉由量測T細胞回應用抗原再刺激所產生之細胞因子來確定。該等檢驗為此項技術所熟知。參見例如，Erickson等人，J .Immunol .(1993)151:4189-4199；Doe等人，Eur .J .Immunol .(1994)24:2369-2376。
術語「免疫原性」係指抗原或疫苗引發體液或細胞介導性免疫反應或兩者之能力。
「免疫原性量」或「免疫有效量」或「劑量」(其中每一者均可在本文中互換使用)一般係指抗原或免疫原性組合物足以引發免疫反應(細胞(T細胞)或體液(B細胞或抗體)反應，或兩者)之量，如藉由熟習此項技術者已知之標準檢驗所量測。
組合物中特定結合物之量一般基於彼結合物結合及未結合之總多醣進行計算。舉例而言，具有20%游離多醣之CP5結合物在100 mcg CP5多醣劑量中將具有約80 mcg結合之CP5多醣及約20 mcg未結合之CP5多醣。當計算結合物之劑量時，通常不考慮結合物之蛋白質影響。結合物之量可視葡萄球菌血清型而變化。一般而言，各劑量將包含0.01 mcg至100 mcg多醣、尤其0.1 mcg至10 mcg多醣且更尤其1 mcg至10 mcg多醣。免疫原性組合物中不同多醣組分之「免疫原性量」可不同且各可包含0.01 mcg、0.1 mcg、0.25 mcg、0.5 mcg、1 mcg、2 mcg、3 mcg、4 mcg、5 mcg、6 mcg、7 mcg、8 mcg、9 mcg、10 mcg、15 mcg、20 mcg、30 mcg、40 mcg、50 mcg、60 mcg、70 mcg、80 mcg、90 mcg或約100 mcg任何特定多醣抗原。
在另一實施例中，免疫原性組合物中蛋白質組分之「免疫原性量」可在約10 mcg至約300 mcg各蛋白質抗原之範圍內。在一特定實施例中，免疫原性組合物中蛋白質組分之「免疫原性量」可在約20 mcg至約200 mcg各蛋白質抗原之範圍內。免疫原性組合物中不同蛋白質組分之「免疫原性量」可不同，且各包含10 mcg、20 mcg、30 mcg、40 mcg、50 mcg、60 mcg、70 mcg、80 mcg、90 mcg、100 mcg、125 mcg、150 mcg、175 mcg或約200 mcg任何特定蛋白質抗原。
抗原作為免疫原之有效性可如下量測：使用免疫檢驗、免疫沈澱檢驗、功能性抗體檢驗(諸如活體外調理性檢驗)及此項技術中已知之許多其他檢驗來量測對於血清中之抗原具有特異性之循環抗體的含量，藉此來量測B細胞活性之程度。抗原作為T細胞免疫原之有效性的另一度量可藉由增殖檢驗、藉由量測T細胞溶解其特異性標靶細胞之能力的細胞溶解檢驗(諸如鉻釋放檢驗)來量測。此外，在本發明中，「免疫原性量」亦可藉由量測投與抗原後所誘導之抗原特異性抗體的血清含量或藉由量測由此誘導之抗體增強特定白血球之調理吞噬能力的能力來定義，如本文所述。免疫反應之保護程度可藉由用已注射之抗原攻擊經免疫之宿主來量測。舉例而言，若所需免疫反應所針對的抗原為細菌，則由「免疫原性量」之抗原誘導之保護程度可藉由偵測用細菌細胞對動物攻毒後之存活率百分比或死亡率百分比來量測。在一實施例中，保護量可藉由量測至少一種與細菌感染相關之症狀(例如與感染相關之發熱)來量測。多抗原或多組分疫苗或免疫原性組合物中各抗原之量將隨各其他組分而變化且可藉由熟練技術人員已知之方法來測定。該等方法將包括例如量測免疫原性及/或活體內功效之程序。
術語「免疫原性組合物」係關於含有抗原(例如微生物或其組分)之任何醫藥組合物，該組合物可用於引發個體之免疫反應。可使用本發明之免疫原性組合物，藉助於經由全身經皮或黏膜途徑投與免疫原性組合物來治療易受金黃色葡萄球菌感染之人類。此等投藥可包括經由肌肉內(i.m.)、腹膜內(i.p.)、皮內(i.d.)或皮下途徑注射；藉由貼片或其他經皮傳遞裝置來施用；或經由黏膜投與至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一實施例中，使用鼻內投藥治療或預防鼻咽攜帶金黃色葡萄球菌，由此在感染最初階段將其削弱。在一實施例中，免疫原性組合物可用於製造疫苗或用於引發可用於被動地保護或治療動物之多株或單株抗體。
用於特定免疫原性組合物之組分的最佳量可藉由涉及觀察個體之適當免疫反應的標準研究來確定。在初始疫苗接種之後，個體可接受一次或若干次適當間隔之加強免疫。
在本發明之一實施例中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)片段(N1N2N3或其組合)、分離之第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之第8型莢膜多醣結合於CRM197 。在另一實施例中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物為具有重組金黃色葡萄球菌凝集因子(ClfA)片段(N1N2N3或其組合)、重組金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其組合)、分離之第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之第8型莢膜多醣結合於CRM197 的無菌調配物(液體、凍乾物、DNA疫苗、皮內製劑)。在本發明之一實施例中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)片段(N1N2N3或其組合)、金黃色葡萄球菌鐵結合蛋白MntC、分離之第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之第8型莢膜多醣結合於CRM197 。在一實施例中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物為具有重組金黃色葡萄球菌凝集因子(ClfA)片段(N1N2N3或其組合)、重組金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其組合)、金黃色葡萄球菌鐵結合蛋白MntC、分離之第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之第8型莢膜多醣結合於CRM197 的無菌調配物(液體、凍乾物、DNA疫苗、皮內製劑)。在本發明之一實施例中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其組合)、分離之第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之第8型莢膜多醣結合於CRM197 。在本發明之一實施例中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含重組金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)片段(N1N2N3或其組合)、金黃色葡萄球菌鐵結合蛋白MntC、分離之第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之第8型莢膜多醣結合於CRM197 。在本發明之一實施例中，金黃色葡萄球菌免疫原性組合物包含金黃色葡萄球菌鐵結合蛋白MntC、分離之第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之第8型莢膜多醣結合於CRM197 。
本發明之免疫原性組合物可進一步包含一或多種額外「免疫調節劑」，其為干擾或改變免疫系統以使得觀察到體液及/或細胞介導性免疫性之調升或調降的藥劑。在一特定實施例中，免疫系統之體液及/或細胞介導性組的調升為較佳的。某些免疫調節劑之實例包括例如佐劑或細胞因子、或美國專利第5,254,339號中所述之ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)。可用於本發明之疫苗中之佐劑的非限制性實例包括RIBI佐劑系統(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.)、明礬、礦物質凝膠(諸如氫氧化鋁凝膠)、水包油乳液、油包水乳液(例如弗氏完全及不完全佐劑(Freund's complete and incomplete adjuvants))、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)、AMPHIGEN佐劑、皂苷(Quil A或其他皂苷部分)、單磷醯基脂質A及阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑。適用於本發明之疫苗中之水包油乳液的非限制性實例包括經改質之SEAM62及SEAM 1/2調配物。經改質之SEAM62為含有5%(v/v)角鯊烯(Sigma)、1%(v/v)SPAN85清潔劑(ICI Surfactants)、0.7%(v/v)聚山梨醇酯80清潔劑(ICI Surfactants)、2.5%(v/v)乙醇、200 μg/ml Quil A、100 μg/ml膽固醇及0.5%(v/v)卵磷脂之水包油乳液。經改質之SEAM 1/2為包含5%(v/v)角鯊烯、1%(v/v)SPAN85清潔劑、0.7%(v/v)聚山梨醇酯80清潔劑、2.5%(v/v)乙醇、100 μg/ml QuilA及50 μg/ml膽固醇之水包油乳液。疫苗中可包括之其他「免疫調節劑」包括例如一或多種介白素、干擾素或其他已知細胞因子或趨化因子。在一實施例中，佐劑可為環糊精衍生物或聚陰離子性聚合物，分別諸如美國專利第6,165,995號及第6,610,310號中所述者。應瞭解，欲使用之免疫調節劑及/或佐劑將視將投與疫苗或免疫原性組合物之個體、注射途徑及欲給予之注射次數而定。
金黃色葡萄球菌「侵襲性疾病」為自存在相關臨床疾病徵兆/症狀之通常無菌部位分離細菌。通常無菌身體部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、關節/滑液、骨、內部身體部位(淋巴結、腦、心臟、肝、脾、玻璃狀液、腎、胰臟、卵巢)或其他通常無菌部位。表示侵襲性疾病特徵之臨床病狀包括菌血症、肺炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、心內膜炎、敗血性休克及其他病狀。
術語「分離」意謂物質自其原始環境移出(例如若其為天然存在的，則自天然環境移出，或若其為重組實體，則自其宿主生物體移出，或自一個環境帶至不同環境)。舉例而言，「分離」之莢膜多醣、蛋白質或肽實質上不含細胞物質或來自產生該蛋白質之細胞或組織來源的其他污染蛋白質，或實質上不含以化學方式合成或另外作為化學反應之一部分存在於混合物中之化學前驅體或其他化學物質。在本發明中，蛋白質或多醣可自細菌細胞或自細胞碎片分離，使得其以適用於製造免疫原性組合物之形式提供。術語「分離」可包括純化，包括例如純化蛋白質或莢膜多醣之方法，如本文所述。措辭「實質上不含細胞物質」包括多肽/蛋白質之製劑，其中多肽/蛋白質與分離其或重組製造其之細胞的細胞組分分離。因此，實質上不含細胞物質之莢膜多醣、蛋白質或肽包括具有小於約30%、20%、10%、5%、2.5%或1%(以乾重計)污染蛋白質或多醣或其他細胞物質之莢膜多醣、蛋白質或肽之製劑。當多肽/蛋白質經重組製造時，其亦較佳地實質上不含培養基，亦即， 培養基佔蛋白質製劑之體積的小於約20%、10%或5%。當多肽/蛋白質或多醣藉由化學合成而製造時，其較佳地實質上不含化學前驅體或其他化學物質，亦即，其與蛋白質或多醣的合成中所涉及之化學前驅體或其他化學物質分離。因此，該等多肽/蛋白質或多醣之製劑具有除所關注之多肽/蛋白質或多醣片段外小於約30%、20%、10%、5%(以乾重計)之化學前驅體或化合物。
「非保守性胺基酸取代」係指使用上文所定義之特徵，蛋白質之一或多個胺基酸殘基由具有不同物理及/或化學性質之其他胺基酸殘基取代。
術語「醫藥學上可接受之載劑」意謂由聯邦州政府之管理機構或其他管理機構批准或美國藥典(U.S. Pharmacopeia)或其他公認藥典中所列舉的用於動物(包括人類以及非人類哺乳動物)之載劑。術語「載劑」係指與醫藥組合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。該等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之載劑。水、生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液可用作液體載劑，尤其用於可注射溶液。合適之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及其類似物。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑、膨化劑、乳化劑或pH值緩衝劑。此等組合物可採用溶液、懸浮液、乳液、持續釋放調配物及其類似物之形式。適合之醫藥載劑的實例描述於E. W. Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。調配物應適合投藥方式。
術語「蛋白質」、「多肽」及「肽」係指胺基酸殘基之聚合物且不限於最小長度之產物。因此，肽、寡肽、二聚體、多聚體及其類似物均包括於該定義中。全長蛋白質與其片段皆由該定義涵蓋。該等術語亦包括對天然序列之修飾，諸如缺失、添加及取代(一般在自然界中為保守性的，但其亦可為非保守性的)，較佳使得蛋白質在接受投與蛋白質之動物體內維持引發免疫反應的能力。亦包括表現後修飾，例如糖基化、乙醯化、脂化、磷酸化及其類似修飾。
「保護性」免疫反應係指免疫原性組合物引發體液或細胞介導性免疫反應之能力，該免疫反應用以保護個體免受感染。所提供之保護無需為絕對的，亦即，若與對照個體群體(例如未投與疫苗或免疫原性組合物之受感染動物)相比較，出現統計學顯著改善時，則無需完全預防或根除感染。保護可限於減輕感染之症狀的嚴重程度或發作速度。一般而言，「保護性免疫反應」將包括在至少50%個體中誘導針對特定抗原之特異性抗體含量增加，包括針對各抗原的某一程度之可量測功能性抗體反應。在特定情形下，「保護性免疫反應」可包括在至少50%個體中誘導針對特定抗原之特異性抗體含量增加兩倍或抗體含量增加四倍，包括某一程度之對各抗原的可量測功能性抗體反應。在某些實施例中，調理性抗體與保護性免疫反應有關。因此，可藉由在調理吞噬檢驗中量測細菌計數之減少百分比(例如下文所述者)來檢驗保護性免疫反應。較佳地，細菌計數減少至少10%、25%、50%、65%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。
如本文中所使用，術語「重組」僅係指藉由遺傳工程改造方法製造之任何蛋白質、多肽或表現所關注之基因的細胞。如關於蛋白質或多肽所使用，術語「重組」意謂藉由表現重組聚核苷酸而製造之多肽。本發明之免疫原性組合物中所用的蛋白質可自天然來源分離或藉由遺傳工程改造方法製造，例如重組ClfA、重組ClfB或重組MntC。如本文中所使用，「重組」進一步描述核酸分子由於其來源或處理而與自然界中與其相關之聚核苷酸的全部或一部分不相關。如關於宿主細胞所使用，術語「重組」意謂已引入重組聚核苷酸之宿主細胞。
如本文中所使用，重組ClfA(rClfA)及重組ClfB(rClfB)係指用於本發明之免疫原性組合物中之ClfA或ClfB的形式。在一實施例中，rClfA為ClfA中包含一或多個N域之片段，例如N1N2N3、N2N3、N2或N3，且在本文中稱為「重組ClfA」或「rClfA」。在一實施例中，rClfB為ClfB中包含ClfB之一或多個N域的片段，例如N1N2N3、N2N3、N2或N3，且在本文中稱為「重組ClfB」或「rClfB」。
術語「個體」係指哺乳動物、鳥、魚、爬行動物或任何其他動物。術語「個體」亦包括人類。術語「個體」亦包括家庭寵物。家庭寵物之非限制性實例包括：狗、貓、豬、兔子、大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、天竺鼠、雪貂、鳥、蛇、蜥蜴、魚、海龜及蛙。術語「個體」亦包括家畜動物。家畜動物之非限制性實例包括：羊駝、野牛、駱駝、牛、鹿、豬、馬、美洲駝、騾、驢、綿羊、山羊、兔子、馴鹿、犛牛、雞、鵝及火雞。
如本文中所使用，「治療」係指以下任一者或多者：(i)預防感染或再感染，如傳統疫苗；(ii)降低症狀之嚴重程度或消除症狀；及(iii)所述病原體或病症之實質或完全消除。因此，治療可預防性(在感染之前)或治療性(在感染之後)實現。在本發明中，可使用預防性或治療性治療。根據本發明之一特定實施例，提供針對微生物感染(例如細菌，諸如葡萄球菌屬)治療(包括預防性及/或治療性免疫)宿主動物之組合物及方法。本發明方法適用於賦予個體預防性及/或治療性免疫性。本發明方法亦可對個體實踐以供生物醫學研究應用。
術語「疫苗」或「疫苗組合物」可互換使用，係指包含至少一種誘導動物之免疫反應的免疫原性組合物之醫藥組合物。
一般描述
本發明係關於免疫原性組合物，其包含至少三種來自葡萄球菌生物體(例如金黃色葡萄球菌)之抗原。該等抗原可使用生物化學分離程序自生物體分離，或其可以合成方式製造或藉由重組方法製造。抗原可為多肽或多醣或其組合。此等免疫原性組合物可用於製造使個體免疫以免受由葡萄球菌生物體引起之感染的疫苗。下文更詳細地描述適用於此等組合物中之組分。
葡萄球菌免疫原性組合物
金黃色葡萄球菌為淺表性皮膚感染至危急生命之病狀(諸如肺炎、敗血症及心內膜炎)之各種人類疾病的病原體。參見Lowy N. Eng. J. Med. 339:580-532(1998)。在侵襲性疾病之情況下，金黃色葡萄球菌可自通常無菌身體部位，包括血液、大腦脊髓液CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、關節/滑液、骨、內部身體部位(淋巴結、腦、心臟、肝、脾、玻璃狀液、腎、胰臟、卵巢)或其他通常無菌部位分離。此可導致危急生命之臨床病狀，諸如菌血症、肺炎、蜂窩組織炎、骨髓炎、心內膜炎及敗血性休克。成年、老年及兒童患者大多數處於金黃色葡萄球菌感染之危險中。
本發明之實施例描述包括分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)及重組金黃色葡萄球菌MntC蛋白之免疫原性組合物中的所選抗原。接著，將免疫原性組合物中之抗原表示為一系列組合，以說明特定組合提供之免疫反應可能優於使用免疫原性組合物之個別組分所產生的免疫反應。因此，一個組合提供免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。第二個組合提供免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。第三個組合提供免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。第四個組合提供免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。第五個組合提供免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。第六個組合提供免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。第七個組合提供免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。第八個組合提供免疫原性組合物，其包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽及分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白。在一些實施例中，以上組合進一步包含以下至少一種抗原：EkeS、DsqA、KesK、KrkN、KrkN2、RkaS、RrkN、KnkA、SdrC、SdrD、SdrE、Opp3a、DltD、HtsA、LtaS、IsdA、IsdB、IsdC、SdrF、SdrG、SdrH、SrtA、SpA、Sbiα-溶血素(hla)、β-溶血素、纖維網蛋白-結合蛋白A(fnbA)、纖維網蛋白-結合蛋白B(fnbB)、凝固酶、Fig、map、潘頓-瓦倫丁殺白血球素(pvl)、α-毒素及其變異體、γ-毒素(hlg)及變異體、ica、免疫優勢ABC轉運體、Mg2+轉運體、NiABC轉運體、RAP、自溶素、層黏連蛋白受體、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、SasA、SasF、SasH、EFB(FIB)、SBI、Npase、EBP、骨涎結合蛋白II、金黃色葡萄球菌金屬蛋白酶前驅體(AUR)/Sepp1、Cna及其片段，諸如M55、TSST-1、mecA、聚-N-乙醯葡糖胺(PNAG/dPNAG)胞外多醣、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻璃網蛋白-結合蛋白、HarA、EsxA、EsxB、腸毒素A、腸毒素B、腸毒素C1及新穎自溶素。
金黃色葡萄球菌暴發之流行病學研究指示金黃色葡萄球菌之進化在自然界中為純系的，其中獲得成功基因型之單一純系已快速傳播且引起許多感染。因此，進化被視為純系的。細菌基因組包含較大且更穩定的物種核心基因組及更多樣化的附屬基因組。參見Feil等人，Nature Reviews: Microbiology 2:483-495(2004)。核心基因普遍存在於物種之所有純系中，且附屬基因未必存在於任何既定純系中。考慮到金黃色葡萄球菌，一項使用佔金黃色葡萄球菌基因組之超過90%的DNA微陣列之研究發現，基因組中78%之基因為所有金黃色葡萄球菌所共有，因此表示「物種核心」，且其餘22%為「附屬基因」。附屬基因包含非必需遺傳物質，其中許多遺傳物質編碼毒性因子、介導抗生素抗性之蛋白質及編碼對於與特定宿主環境相互作用具有特異性之蛋白質的基因。參見Fitzgerald等人，PNAS 98:8821-8826(2001)；Feil等人，Nature Reviews: Microbiology 2:483-495(2004)。一般而言，核心基因進化更緩慢且附屬基因為多形性的。參見Kuhn等人，J. Bact. 188:169-178(2006)。因此，適當選擇之核心基因提供用於免疫原性組合物中以預防感染之較佳標靶抗原。
來自金黃色葡萄球菌之致病分離株或純系類型的表面表現之抗原提供能夠誘導免疫性及功能性抗體之抗原來源。在巨分子層面(胺基酸或多醣序列)上，可選擇由不同疾病分離株表現之保守形式的抗原以允許抗體與可具有疫苗標靶之抗原性變異的彼等菌株存在廣泛交叉反應性。
對於本文所述之多抗原免疫原性組合物中包括抗原所考慮的一個重要因素為，是否已藉由在一或多個動物細菌感染模型中提供保護而證實當以免疫原性組合物形式投與時抗原具有功效。對於各種金黃色葡萄球菌疾病，存在許多動物模型。此等模型各具有功效及弱點。
細菌感染之人類清除可經由在吞噬細胞攝取後介導之調理性殺滅來進行。使用革蘭氏陽性多醣抗原，諸如肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)莢膜多醣及金黃色葡萄球菌莢膜多醣之研究中存在許多關於此清除之確信實例。參見Lee等人，Crit. Rev. Micro. 29:333-349(2003)。關於由革蘭氏陽性蛋白抗原誘導調理活性，存在較少證據。已觀察到由吞噬細胞攝取，但仍難以證實直接殺滅。已顯示在動物感染模型中針對蛋白之單株抗體給予保護以免受金黃色葡萄球菌攻毒；且除調理吞噬殺滅外之機制可說明所觀察到之保護。
具有可量測功能活性(諸如調理吞噬活性(OPA))之抗體的誘導為特定抗原是否適用於包括在本發明之免疫原性組合物中的一項指標。其他指標包括(但不限於)如使用抗原特異性抗體所量測的在活體內表現期間細胞表面上之抗原表現，或抗體抑制/中和抗原功能之能力。
物種/菌株
一定類型之任何特定醫院或疾病菌株適用於判定原始純系相關性且監測暴發之流行病學。多種方法可用於對金黃色葡萄球菌菌株進行分類。細菌物種之經典實際定義為特徵為超過70%之基因組雜交(DDH之DNA-DNA基因組雜交)及超過97%之16S核糖體RNA基因序列一致性的一組菌株。參見Vandamme等人，Microbiol. Rev. 60:407-438(1996)。噬菌體分類(BT)為一種基於金黃色葡萄球菌菌株對於由某些噬菌體類型溶解之敏感性來對該等菌株進行分類的方法。參見Blair等人，Bull. W.H.O. 24:771-784(1961)。此古老的方法缺乏實驗室之間的再現性且無法對15-20%之分離株進行分類。
單抗原相對於多抗原免疫原性組合物
關於防止受主要金黃色葡萄球菌菌株感染之最佳免疫原性組合物是否應包含單一組分或多種組分，存在問題。大量研究已顯示，在某些動物模型中，基於單一蛋白質或碳水化合物組分之免疫原性組合物可提供一些保護以免受表現彼組分之金黃色葡萄球菌菌株攻毒。重要的是，亦已證實，針對單一抗原之保護可視所選菌株而定。
已以單組分疫苗形式研究諸如黏附素之表面蛋白。舉例而言，用金黃色葡萄球菌ClfA免疫之小鼠所發展的關節炎之嚴重程度比用對照蛋白免疫之小鼠低。參見Josefsson等人，J. Infect. Dis. 184:1572-1580(2001)。在小鼠敗血症模型中，膠原蛋白結合黏附素(cna )之片段提供保護。參見Nilsson等人，J. Clin. Invest.,101:2640-2649(1998)。在小鼠模型中，用ClfB之A域使小鼠免疫會減少鼻部定殖。參見Schaffer等人，Infect. Immun. 74:2145-2153(2006)。
正在防止受金黃色葡萄球菌感染之單價免疫原性調配物中研究14種金黃色葡萄球菌鐵螯合蛋白之一(稱為IsdB)。此蛋白已在小鼠中顯示良好保護作用且在非人類靈長類動物中顯示良好免疫原性。參見Kuklin等人，Infect. Immun. 74:2215-2223(2006)。
由於金黃色葡萄球菌進化或取代不同蛋白以進行相同或類似功能之巨大潛力，故保護大多數人免於罹患大多數金黃色葡萄球菌疾病之最佳免疫原性調配物為多抗原調配物，其包含經適當選擇且於免疫原性調配物中呈遞之兩種或兩種以上(例如3、4、5種等)抗原。在某些實施例中，本發明之免疫原性組合物包含三種或三種以上選自以下之抗原：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、結合於載體蛋白的分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)、結合於載體蛋白的分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)及分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白。在某些實施例中，本發明之免疫原性組合物包含四種或四種以上選自以下之抗原：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、結合於載體蛋白的分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)、結合於載體蛋白的分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)及分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白。在某些實施例中，本發明之免疫原性組合物包含分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、結合於載體蛋白的分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣(CP5)、結合於載體蛋白的分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣(CP8)及分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白作為抗原。
佐劑
在某些實施例中，如本文所述之免疫原性組合物亦包含一或多種佐劑。佐劑為當與免疫原或抗原一起投與時增強免疫反應之物質。已顯示許多細胞因子或淋巴介質具有免疫調節活性，且因此適用作佐劑，包括(但不限於)介白素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(參見例如，美國專利第5,723,127號)、13、14、15、16、17及18(及其突變形式)；干擾素-α、β及γ；顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)(參見例如，美國專利第5,078,996號及ATCC寄存編號39900)；巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)；顆粒球群落刺激因子(G-CSF)；及腫瘤壞死因子α及β。適用於本文所述之免疫原性組合物的其他佐劑包括趨化因子，包括(但不限於)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β及RANTES；黏著分子，諸如選擇素，例如L-選擇素、P-選擇素及E-選擇素；黏蛋白樣分子，例如CD34、GlyCAM-1及MadCAM-1；整合素家族之成員，諸如LFA-1、VLA-1、Mac-1及p150.95；免疫球蛋白超家族之成員，諸如PECAM、ICAM(例如ICAM-1、ICAM-2及ICAM-3)、CD2及LFA-3；協同刺激分子，諸如B7-1、B7-2、CD40及CD40L；生長因子，包括血管生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、PDGF、BL-1及血管內皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受體、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2及DR6；及卡斯蛋白酶(Caspase，ICE)。
適合用於增強免疫反應之佐劑另外包括(但不限於)MPLTM (3-O-脫除醯基之單磷醯基脂質A，Corixa,Hamilton,MT)，其描述於美國專利第4,912,094號中。合成脂質A類似物或胺基烷基葡糖胺磷酸鹽化合物(AGP)或其衍生物或類似物亦適用作佐劑，其可購自Corixa(Hamilton,MT)且描述於美國專利第6,113,918號中。一種此類AGP為2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基胺基]乙基2-去氧-4-O-膦酸基-3-O-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基]-2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基-胺基]-b-D-葡萄哌喃糖苷，其亦稱為529(先前稱為RC529)。此529佐劑係調配為水溶液形式(AF)或穩定乳液(SE)。
其他佐劑包括胞壁醯肽，諸如N-乙醯基-胞壁醯基-L-羥丁胺醯基-D-異麩醯胺酸(thr-MDP)、N-乙醯基-去胞壁醯基-L-丙胺酸-2-(1'-2'二軟脂醯基-sn -甘油-3-羥基磷醯氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳液，諸如MF59(美國專利第6,299,884號)(含有5%角鯊烯、0.5%聚山梨醇酯80及0.5%Span 85(視情況含有各種量之MTP-PE)，使用諸如型號110Y微流化床裝置(Microfluidics,Newton,MA)之微流化床裝置調配成次微粒子)及SAF(含有10%角鯊烯、0.4%聚山梨醇酯80、5%泊洛尼克(pluronic)嵌段聚合物L121及thr-MDP，微流化成次微乳液或渦旋產生較大粒徑乳液)；不完全弗氏佐劑(incomplete Freund's adjuVant，IFA)；鋁鹽(明礬)，諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁；愛菲金(Amphigen)；阿夫立定(Avridine)；L121/角鯊烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；氧化異丙烯多元醇類；經滅毒之博德氏桿菌(Bordetella )；皂苷，諸如美國專利第5,057,540號中所述之StimulonTM QS-21(Antigenics,Framingham,MA.)、美國專利第5,254,339號中所述之ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)、及免疫刺激複合物(ISCOMATRIX)；結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis )；細菌脂多醣；合成聚核苷酸，諸如含有CpG基元之寡核苷酸(例如美國專利第6,207,646號)；歐洲專利第1,296,713號及第1,326,634號中所述之IC-31(Intercell AG,Vienna,Austria)；百日咳毒素(PT)或其突變體、霍亂毒素或其突變體(例如美國專利第7,285,281號、第7,332,174號、第7,361,355號及第7,384,640號)；或大腸桿菌不耐熱毒素(LT)或其突變體，尤其為LT-K63、LT-R72(例如美國專利第6,149,919號、第7,115,730號及第7,291,588號)。
候選抗原：
ClfA：域組織
凝集因子A(ClfA)為與經由纖維蛋白原結合位點結合於宿主基質蛋白相關之金黃色葡萄球菌表面蛋白。ClfA為含有使蛋白能夠共價連接於細胞表面之羧基端LPXTG(SEQ ID NO: 125)基元之蛋白家族的成員。ClfA亦屬於與結合諸如纖維蛋白原(經由ClfA結合)、纖維網蛋白-結合蛋白(FnbA及FnbB)、膠原蛋白-結合蛋白(Cna)及其他蛋白之宿主蛋白相關的另一蛋白家族(微生物表面組分識別黏附基質分子(Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matirx Molecule)或MSCRAMM)。此等蛋白均共有介導轉運至細胞表面之胺基端信號序列。MSCRAMM亦包括A域，該域為含有用於配位體結合(例如纖維蛋白原、纖維網蛋白、彈性蛋白、角蛋白)之活性位點之功能區。在A域之後為由絲胺酸天冬胺酸重複單元(SD重複單元)構成之區域，認為該區域跨越肽聚糖層。在SD重複單元之後為包括用於使蛋白共價連接於肽聚糖之LPXTG(SEQ ID NO: 125)基元的跨膜區。ClfA描述於美國專利第6,008,341號中。
ClfA中包含A域之N1N2N3的配位體結合區(圖1)跨越胺基酸40-559。ClfA之N域分配如下：N1涵蓋殘基45-220；N2涵蓋殘基229-369；及N3涵蓋殘基370-559。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。為了便於參考，N1N2N3域可稱為N123，同樣，N2N3可稱為N23。在重組N1N2N3之製備中，發現N1域對於蛋白酶敏感且容易裂解或水解，留下N2N3作為穩定的配位體結合重組片段。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。ClfAA域之結合纖維蛋白原之N2N3片段的晶體結構揭示，N2與N3皆受反平行β股控制。除反平行β股外，N2域亦含有單個轉角α螺旋及兩個310 螺旋且N3域亦含有三個310 螺旋。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。N2及N3之序列比對揭示在其長度上僅具有13%序列一致性及36%序列相似性。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。N2及N3域之拓撲類似於經典IgG摺疊且已提出為IgG摺疊之新穎變異體。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。
ClfA序列
凝集因子蛋白A(稱為ClfA)之基因已經選殖、測序及在分子層面上進行詳細分析(McDevitt等人，Mol. Microbiol. 11: 237-248(1994)；McDevitt等人，Mol. Microbiol. 16:895-907(1995))。來自111個金黃色葡萄球菌致病分離株之clfA的胺基酸序列之序列識別符展示於表10中。來自金黃色葡萄球菌菌株PFESA0237之全長(包括信號序列)野生型ClfA的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 130中。此序列在位置338處顯示酪胺酸，其在ClfA之突變形式中變為丙胺酸。包含N123區、重複區及錨定區之編碼來自金黃色葡萄球菌菌株PFESA0237之野生型ClfA的全長基因顯示於SEQ ID NO: 131中。ClfA之Y338A突變形式的胺基酸序列顯示於SEQ ID NO: 123中。然而，應注意，野生型ClfA中在SEQ ID NO: 130之位置338處發生且以Y338A表示之酪胺酸變為丙胺酸如ClfA之突變形式中SEQ ID NO: 123之位置310處所示。此外，SEQ ID NO: 123之胺基酸序列所示之ClfA的突變形式為無信號序列之ClfA的成熟形式，由此解釋SEQ ID NO: 130與SEQ ID NO: 123之間此突變位置之差異。
ClfB：域組織
ClfB為具有纖維蛋白原結合活性之金黃色葡萄球菌蛋白且觸發金黃色葡萄球菌在血漿存在下形成凝塊。ClfB為MSCRAMM蛋白且呈現包括A域之特徵性MSCRAMM域組織，A域為含有用於配位體結合(例如纖維蛋白原、纖維網蛋白、彈性蛋白、角蛋白)之活性位點之功能區。在A域之後為由絲胺酸天冬胺酸重複單元(SD重複單元)構成之區域，認為該區域跨越肽聚糖層。在SD重複單元之後為包括用於使蛋白共價連接於肽聚糖之LPXTG(SEQ ID NO:125)基元的跨膜區。ClfB描述於WO 99/27109及美國專利6,680,195中。
ClfB N端A域之內部組織與ClfA中所見之組織極其類似。A域由三個亞域N1、N2及N3構成。ClfB中包含A域之N1N2N3的配位體結合區(圖1)跨越胺基酸44-585。為了便於參考，N1N2N3域可稱為N123，同樣，N2N3可稱為N23。ClfB之N域分配如下：N1涵蓋殘基44-197；N2涵蓋殘基198-375；及N3涵蓋殘基375-585。在ClfA中，發現A域之晶體結構具有獨特形式之免疫球蛋白摺疊，且藉由類推可推測ClfB之情況相同。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。即使ClfB與ClfA之A域組織類似，但序列一致性僅為26%。參見Ni Eidhin等人，Mol. Microbiol. 30:245-257(2002)。
ClfB序列
編碼ClfB之基因被歸類為核心黏著基因。來自與多種疾病狀況相關之92個金黃色葡萄球菌菌株的ClfB序列概述於表11中。自Genbank獲得其他序列。
其他MSCRAMM
可考慮將其他MSCRAMM用於本發明之免疫原性組合物中。舉例而言，絲胺酸-天冬胺酸重複(Sdr)蛋白SdrC、SdrD及SdrE在一級序列及結構組織方面與ClfA及ClfB蛋白相關且定位於細胞表面上。SdrC、SdrD及SdrE蛋白為細胞壁締合蛋白，在N端具有信號序列且在C端具有LPXTG(SEQ ID NO: 125)基元、疏水性域及帶正電殘基。各蛋白亦具有含有SD重複單元之R區，該區具有足夠長度以與B基元一起使配位體結合域A區於細胞表面上有效表現。使用位於細胞表面上之SdrC、SdrD及SdrE蛋白之A區，該等蛋白可與血漿中之蛋白、與細胞外基質或與宿主細胞表面上之分子相互作用。Sdr蛋白與ClfA及ClfB共有一些有限的胺基酸序列相似性。類似ClfA及ClfB，SdrC、SdrD及SdrE亦展現細胞外基質蛋白之陽離子依賴性配位體結合。
sdr基因緊密連接且以串聯方式排列。(SdrC、SdrD、SdrE、ClfA及ClfB之)Sdr蛋白特徵性地包含A區，其中存在可用於得到共同TYTFTDYVD(SEQ ID NO: 126)基元之高度保守性胺基酸序列。該基元在不同蛋白之間展現微小變化。此變化與基元之共同序列一起描述於美國專利第6,680,195號中。在Clf-Sdr蛋白中，此基元具有高度保守性。該基元可用於免疫原性組合物中以賦予針對細菌感染之廣譜免疫性，且亦可在單株或多株抗體之製造中用作抗原。此類抗體可用於賦予廣譜被動免疫性。
Sdr蛋白與ClfA及ClfB的不同之處在於，另外具有2至5個含110-113個殘基之重複序列(B基元)位於A區與R區之間。各B基元含有真核蛋白中通常所見之結合Ca2+ 的共同EF手環。bisANS螢光分析顯示，包含SdrD之5個B重複單元之重組蛋白的結構完整性具有Ca2+ 依賴性，從而表明EF手具有功能。當移除Ca2+ 時，結構塌陷為展開構形。藉由添加Ca2+ 恢復原始結構。Sdr蛋白之C端R域含有132-170個SD殘基。在此等殘基之後為保守性壁錨定區，其為革蘭氏陽性細菌之許多表面蛋白的特徵。
在Sdr及Clf蛋白中，此B基元具有高度保守性，而在結合纖維網蛋白之MSCRAMM以及膠原蛋白-結合蛋白Cna中則出現簡併形式。B基元以及R區為與細胞表面隔開一定距離呈現配位體結合域所必需的。重複B基元為本文所述之SD重複蛋白之亞組的一個共同特徵。發現此等基元在來自菌株PFESA0237之三種Sdr蛋白中的數目不同。個別B基元之間存在明顯區別。最保守之單元為位於鄰近R區之處者(SdrC B2、SdrD B5及SdrE B3)。其與其餘單元在若干位點處存在不同，尤其在C端半段。值得注意的結構細節在於，相鄰B重複單元始終由C端區域中所存在之脯胺酸殘基分隔，但脯胺酸決不出現在最後B重複單元與R區之間。實情為，此連接子之特徵為短的酸性延伸段。此等差異證實末端單元具有與其他B基元相比不同的結構或功能性作用。SdrD及SdrE之N端B基元遠離其他基元，且存在許多胺基酸變化，包括小插入及缺失，而其餘內部B基元之保守性較高。應注意，三種Sdr蛋白各具有每種至少一個B基元。
Sdr蛋白之C端R域含有132-170個SD殘基。在此等殘基之後為保守性壁錨定區，其為革蘭氏陽性細菌之許多表面蛋白的特徵。
其他候選SdrD分子可源自各種生物體物種以用於本發明之免疫原性組合物中，其中一些分子包括以下金黃色葡萄球菌之SdrD：菌株USA300 FPR3757(蛋白質寄存編號SAUSA300 0547)；菌株NCTC8325(蛋白質寄存編號SAOUHSC 00545)；菌株MW2(蛋白質寄存編號MW0517)；菌株MSSA476(蛋白質寄存編號SAS0520)；及菌株Mu50(蛋白質寄存編號SAV0562)。
可考慮用於本發明之免疫原性組合物中的其他MSCRAMM包括EkeS、DsqA、KesK、KrkN、KrkN2、RkaS、RrkN及KnkA。此等MSCRAMM描述於WO 02/102829中，該案以引用的方式併入本文中。以GenBank寄存編號識別之其他MSCRAMM包括NP_373261.1、NP_373371.1、NP_374246.1、NP_374248.1、NP_374841.1、NP_374866.1、NP_375140.1、NP_375614.1、NP_375615.1、NP_375707.1、NP_375765.1及NP_375773.1。
第5型及第8型莢膜多醣
能夠引起侵襲性疾病之葡萄球菌微生物一般亦能夠產生莢膜多醣(CP)，其囊封細菌且增強其對由宿主固有免疫系統清除之抗性。CP用以將細菌細胞遮蓋在保護性莢膜中，使得細菌對吞噬及細胞內殺滅具有抗性。無莢膜之細菌更易經吞噬。莢膜多醣通常為許多細菌性病原體(包括流行性感冒桿菌、肺炎鏈球菌及B群鏈球菌(Group B streptococci))之重要毒性因子。
莢膜多醣可用於將特定細菌物種按血清型分類。分類通常藉由與針對為莢膜多醣之特徵的特定結構或獨特抗原決定基所產生之特異性抗血清或單株抗體反應來達成。經囊封之細菌易於以光滑群落形式生長，而喪失莢膜之細菌群落則顯得粗糙。產生類黏蛋白外觀之群落係稱為高度囊封的。第1型及第2型金黃色葡萄球菌經高度囊封且很少引起疾病。
大部分金黃色葡萄球菌臨床分離株由第5血清型或第8血清型囊封。第5型莢膜多醣(CP5)及第8型莢膜多醣(CP8)具有類似的三醣重複單元，該等單元包含N-乙醯基胺基甘露醇醛酸、N-乙醯基L-墨角藻糖胺及N-乙醯基D-墨角藻糖胺。參見Fournier,J.M.等人，Infect. Immun. 45:97-93(1984)及Moreau,M.等人，Carbohydrate Res. 201:285-297(1990)。該兩種CP具有相同的糖，但在糖鍵及O乙醯化位點方面存在不同以產生血清學上不同之免疫反應性模式。
在一些實施例中，本發明之第5血清型及/或第8血清型莢膜多醣經O-乙醯化。在一些實施例中，第5型莢膜多醣或寡醣之O-乙醯化程度為10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在一些實施例中，第8型莢膜多醣或寡醣之O-乙醯化程度為10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在一些實施例中，第5型及第8型莢膜多醣或寡醣之O-乙醯化程度為10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。
多醣或寡醣之O-乙醯化程度可藉由此項技術中已知之任何方法，例如藉由質子NMR(Lemercinier及Jones 1996,Carbohydrate Research 296;83-96，Jones及Lemercinier 2002,J Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30;1233-1247，WO 05/033148或WO 00/56357)來測定。另一種常用方法由Hestrin(1949)J. Biol. Chem. 180;249-261描述。
在一些實施例中，使用本發明之第5血清型及/或第8血清型莢膜多醣來產生抗體，如藉由在動物功效模型中殺滅細菌或藉由說明抗體殺滅細菌之調理吞噬殺滅檢驗所量測，該等抗體具有功能。該功能性可能無法使用單獨監測抗體產生之檢驗觀察到，此並不表示O-乙醯化對於功效之重要性。
莢膜流行病學
特定莢膜血清型與疾病之相關性有可能經由監測臨床分離株而獲知。在所鑑別之金黃色葡萄球菌的8種不同血清型(Karakawa及Vann(1982))中，僅第1及第2血清型經高度囊封，且此等血清型很少經分離。參見Capsular PolysaccharidesofStaphylococcus aureus ，第285-293頁，J.B. Robbins,J.C. Hill及J.C. Sadoff(編),Seminars in infectious disease，第4卷，Bacterial Vaccines. Thieme Stratton,Inc. New York。調查已顯示，約85-90%之金黃色葡萄球菌臨床分離株表現CP5或CP8(Arbeit RD等人，Diagn. Microbiol. Infect. Dis.(1984)4月；2(2):85-91；Karakawa WW等人，J. Clin. Microbiol.(1985) 9月；22(3):445-7；Essawi T等人，Trop. Med. Int. Health.(1998) 7月；3(7):576-83；Na'was T等人，J. Clin. Microbiol.(1998) 36(2):414-20)。大部分CP5及CP8不可分類菌株在遺傳學上為在cap5/8基因座中含有突變之第5型或第8型(Cocchiaro,Gomez等人，(2006),Mol. Microbiol. 2月，59(3):948-960)。一些菌株之莢膜化在活體外極少繼代中快速丟失，此歸因於臨床診斷中所用之培養基中的高磷酸鹽濃度對莢膜產生之抑制作用。亦報導，非莢膜化分離株在經由母牛繼代後恢復莢膜表現。參見Opdebeck,J.P.等人，J. Med. Microbiol. 19:275-278(1985)。一些不可分類菌株在適當生長條件下變成莢膜陽性。
CP5及CP8結構
CP5與CP8之重複單元皆包含2-乙醯胺基-2-去氧-D-甘露糖醛酸、2-乙醯胺基-2-去氧-L-海藻糖及2-乙醯胺基-2-去氧-D-海藻糖。參見C. Jones等人，Carbohydr. Res. 340:1097-1106(2005)。儘管CP5及CP8具有相同糖組成，但已證實其在免疫學上不同。其在醣苷鍵、及糖醛酸之O-乙醯化位點方面不同。觀察到一個FucNAc殘基之菌株依賴性不完全N-乙醯化。參見Tzianabos等人，PNAS V98: 9365(2001)。
免疫原性組合物中之金黃色葡萄球菌莢膜多醣
金黃色葡萄球菌莢膜多醣之分子量為用於免疫原性組合物中之重要考慮因素。高分子量莢膜多醣由於抗原性表面上所存在之抗原決定基的較高價數而能夠誘導某些抗體免疫反應。本文所述之方法分離及純化分子量比先前所得高得多之第5型及第8型莢膜多醣。
MntC/SitC/唾液結合蛋白
MntC/SitC/唾液結合蛋白為ABC轉運體蛋白且在表皮葡萄球菌及金黃色葡萄球菌中具有同系物。其在本發明中稱為MntC。此蛋白為32 kDa脂蛋白且位於細菌細胞壁中。參見Sellman等人，及Cockayne等人，Infect. Immun. 66: 3767(1998)。在表皮葡萄球菌中，其為鐵調節操縱子之組分。其與兩種黏附素(包括副血鏈球菌(S. parasanguis )之FimA)及經證實或假定具有金屬鐵轉運功能之ABC轉運體家族的脂蛋白顯示相當大的同源性。(關於金黃色葡萄球菌菌株及序列，參見表12。)
金黃色葡萄球菌MntC蛋白
MntC之金黃色葡萄球菌同系物係稱為唾液結合蛋白且揭示於美國專利第5,801,234號中，並可包括在本發明之免疫原性組合物中。MntC/SitC/唾液結合蛋白之金黃色葡萄球菌同系物的蛋白質序列見於菌株Mu50之Genbank寄存編號NP_371155。(亦稱為SAV0631。)序列識別符為SEQID NO: 119。菌株Mu50之完整基因組之核苷酸序列的寄存編號為NC_002758.2(等同於704988-705917)。
表皮葡萄球菌SitC蛋白
MntC/SitC/唾液結合蛋白之表皮葡萄球菌同系物係稱為SitC且揭示於Sellman等人(Sellman等人，Infect. Immun.2005年10月；73(10): 6591-6600)中。MntC/SitC/唾液結合蛋白之表皮葡萄球菌同系物的蛋白質序列見於Genbank寄存編號YP_187886.1。(亦稱為SERP0290。)序列識別符為SEQ ID NO: 121。
菌株RP62A之完整基因組之核苷酸序列的寄存編號為NC_002976(等同於293030-293959)。其他候選SitC分子可源自各種生物體物種以用於本發明之免疫原性組合物中，其中一些分子列於下表1中。
金黃色葡萄球菌鐵結合蛋白
另一種考慮用於本發明之免疫原性組合物中之潛在候選抗原包括金黃色葡萄球菌表面.蛋白鐵表面決定子B(IsdB)。此MSCRAMM由Mazmanian等人(Mazmanian，SK等人，Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:2293-2298(2002))描述且隨後已由Kuklin等人(Kuklin,NA等人，Infection and Immunity，第74卷，第4期,2215-2223,(2006))測試，並顯示在鼠類感染模型及恆河猴免疫原性研究中為有效的疫苗候選物。此IsdB分子存在於各種金黃色葡萄球菌菌株中，包括菌株MRSA252(蛋白質寄存編號CAG40104.1)；菌株Newman(蛋白質寄存編號BAF67312.1)；菌株MSSA476(蛋白質寄存編號CAG42837.1)；菌株Mu3(蛋白質寄存編號BAF78003.1)；菌株RF122(蛋白質寄存編號CAI80681.1)。
候選抗原：
本發明之免疫原性組合物亦可包括一或多種以下抗原：Opp3a、D1tD、HtsA、LtaS、IsdA、IsdC、SdrF、SdrG、SdrH、SrtA、SpA、Sbi α-溶血素(hla)、β-溶血素、纖維網蛋白-結合蛋白A(fnbA)、纖維網蛋白-結合蛋白B(fnbB)、凝固酶、Fig、map、潘頓-瓦倫丁殺白血球素(pvl)、α-毒素及其變異體、γ-毒素(hlg)及變異體、ica、免疫優勢ABC轉運體、Mg2+轉運體、Ni ABC轉運體、RAP、自溶素、層黏連蛋白受體、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、SasA、SasF、SasH、EFB(FIB)、SBI、Npase、EBP、骨涎結合蛋白II、金黃色葡萄球菌金屬蛋白酶前驅體(AUR)/Sepp1、Cna及其片段，諸如M55、TSST-1、mecA、聚-N-乙醯葡糖胺(PNAG/dPNAG)胞外多醣、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻璃網蛋白-結合蛋白、HarA、EsxA、EsxB、腸毒素A、腸毒素B、腸毒素Cl及新穎自溶素。在本發明之某些實施例中，當免疫原性組合物包含某些形式之CP5及/或CP8時，其可能不會進一步包含PNAG。
免疫原性組合物調配物
在一實施例中，本發明之免疫原性組合物進一步包含佐劑、緩衝液、低溫保護劑、鹽、二階陽離子、非離子型清潔劑、自由基氧化抑制劑、稀釋劑或載劑中之至少一者。
除複數種葡萄球菌蛋白抗原及莢膜多醣-蛋白結合物外，本發明之免疫原性組合物可進一步包含一或多種防腐劑。FDA要求多劑量小瓶中之生物產品含有防腐劑，其中僅有少數例外。含有防腐劑之疫苗產品包括含有以下之疫苗：苄索氯銨(炭疽)、2-苯氧基乙醇(DTaP、HepA、萊姆病(Lyme)、脊髓灰質炎(非經腸))、苯酚(Pneumo、傷寒(非經腸)、牛痘)及硫柳汞(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流感、JE、Mening、Pneumo、狂犬病)。獲准用於可注射藥物中之防腐劑包括例如氯丁醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、苄索氯銨、氯苄烷銨、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞及硝酸苯汞。
本發明之調配物可進一步包含緩衝液、鹽、二階陽離子、非離子型清潔劑、低溫保護劑(諸如糖)及抗氧化劑(諸如自由基清除劑或螯合劑)中之一或多者，或其任何多種組合。任一種組分(例如螯合劑)之選擇均可決定是否需要另一種組分(例如清除劑)。經調配用於投藥之最終組合物應為無菌及/或無熱原質的。熟練技術人員可憑經驗判定此等組分與其他組分之何種組合對於包括在本發明之含有防腐劑的免疫原性組合物中將為最佳，此視各種因素(諸如所需之特定儲存及投藥條件)而定。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容之本發明調配物包含一或多種選自(但不限於)Tris(三甲胺)、磷酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、甘胺酸、組胺酸及丁二酸鹽之生理學上可接受之緩衝液。在某些實施例中，調配物經緩衝至約6.0至約9.0、較佳約6.4至約7.4之pH值範圍內。
在某些實施例中，可能需要調節本發明之免疫原性組合物或調配物的pH值。本發明調配物的pH值可使用此項技術中之標準技術進行調節。調配物之pH值可調節至介於3.0與8.0之間。在某些實施例中，調配物之pH值可介於或可調節至介於3.0與6.0、4.0與6.0、或5.0與8.0之間。在其他實施例中，調配物之pH值可為或可調節至約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約5.8、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5或約8.0。在某些實施例中，pH值可介於或可調節至介於4.5至7.5、或4.5至6.5、5.0至5.4、5.4至5.5、5.5至5.6、5.6至5.7、5.7至5.8、5.8至5.9、5.9至6.0、6.0至6.1、6.1至6.2、6.2至6.3、6.3至6.5、6.5至7.0、7.0至7.5、或7.5至8.0之範圍內。在一特定實施例中，調配物之pH值為約5.8。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容之本發明調配物包含一或多種二價陽離子，包括(但不限於)MgCl2 、Ca Cl2 及MnCl2 ，其濃度範圍為約0.1 mM至約10 mM，其中最多約5 mM為較佳的。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容之本發明調配物包含一或多種鹽，包括(但不限於)氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉及硫酸鉀，其以在非經腸投藥後對於個體為生理學上可接受之離子強度存在且以產生最終調配物之所選離子強度或容積滲透濃度所需之最終濃度包括在內。調配物之最終離子強度或滲透壓度將由多種組分(例如來自緩衝化合物及其他非緩衝鹽之離子)決定。較佳之鹽NaCl以最多約250 mM之範圍存在，其中選擇鹽濃度以補充其他組分(例如糖)，使得調配物之最終總容積滲透濃度與非經腸投藥(例如肌肉內或皮下注射)相容，且將促進在各種溫度範圍內免疫原性組合物調配物之免疫原性組分的長期穩定性。無鹽調配物將耐受一或多種所選低溫保護劑的範圍增加以維持所需之最終容積滲透濃度。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容之本發明調配物包含一或多種選自(但不限於)雙醣(例如乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖)及聚羥基烴(例如半乳糖醇、甘油、甘露糖醇及山梨糖醇)之低溫保護劑。
在某些實施例中，調配物之容積滲透濃度在約200 mOs/L至約800 mOs/L之範圍內，其中較佳範圍為約250 mOs/L至約500 mOs/L或約300 mOs/L至約400 mOs/L。無鹽調配物可含有例如約5%至約25%蔗糖，且較佳含有約7%至約15%或約10%至約12%蔗糖。或者，無鹽調配物可含有例如約3%至約12%山梨糖醇，且較佳含有約4%至7%或約5%至約6%山梨糖醇。若添加諸如氯化鈉之鹽，則蔗糖或山梨糖醇之有效範圍相對降低。此等及其他此類滲透壓度及容積滲透濃度考慮因素完全在此項技術之技能範圍內。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容之本發明調配物包含一或多種自由基氧化抑制劑及/或螯合劑。各種自由基清除劑及螯合劑為此項技術所已知且適用於本文所述之調配物及使用方法。實例包括(但不限於)乙醇、EDTA、EDTA/乙醇組合、三乙醇胺、甘露糖醇、組胺酸、甘油、檸檬酸鈉、六磷酸肌醇、三聚磷酸鹽、抗壞血酸/抗壞血酸鹽、丁二酸/丁二酸鹽、蘋果酸/順丁烯二酸鹽、得斯芬(desferal)、EDDHA及DTPA，及以上兩者或兩者以上之各種組合。在某些實施例中，至少一種非還原自由基清除劑可以有效增強調配物之長期穩定性的濃度添加。一或多種自由基氧化抑制劑/螯合劑亦可以各種組合添加，諸如清除劑及二階陽離子。螯合劑之選擇將決定是否需要添加清除劑。
在某些實施例中，與非經腸投藥相容之本發明調配物包含一或多種非離子性界面活性劑，包括(但不限於)聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，聚山梨醇酯-80(Tween 80)、聚山梨醇酯-60(Tween 60)、聚山梨醇酯-40(Tween 40)及聚山梨醇酯-20(Tween 20)；聚氧乙烯烷基醚，包括(但不限於)Brij 58、Brij 35以及諸如Triton X-100、Triton X-114、NP40、Span 85之其他物質；及泊洛尼克系列之非離子性界面活性劑(例如泊洛尼克121)，其中較佳組分為濃度為約0.001%至約2%(最多約0.25%為較佳)之聚山梨醇酯-80或濃度為約0.001%至1%(最多約0.5%為較佳)之聚山梨醇酯-40。
在某些實施例中，本發明調配物包含一或多種適用於非經腸投藥之其他穩定劑，例如包含至少一個巰基(-SH)之還原劑(例如半胱胺酸、N-乙醯基半胱胺酸、還原型麩胱甘肽、巰基乙酸鈉、硫代硫酸鹽、單硫代甘油或其混合物)。或者或視情況，本發明之含有防腐劑之免疫原性組合物調配物可進一步藉由自儲存容器移除氧氣，使調配物避光(例如使用琥珀色玻璃容器)而穩定化。
本發明之含有防腐劑之免疫原性組合物調配物可包含一或多種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑，包括自身不誘導免疫反應之任何賦形劑。適合之賦形劑包括(但不限於)巨分子，諸如蛋白質、醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合胺基酸、胺基酸共聚物、蔗糖(Paoletti等人，2001,Vaccine ,19:2118)、海藻糖、乳糖及脂質凝集體(諸如油滴或脂質體)。該等載劑為熟練技術人員所熟知。醫藥學上可接受之賦形劑論述於例如Gennaro,2000,Remington: The Science and Practice of Pharmacy，第20版,ISBN:0683306472中。
本發明組合物可經凍乾或呈水溶液形式，亦即為溶液或懸浮液。液體調配物宜直接自其包裝形式投與且因此對於注射為理想的，而無需如本發明之凍乾組合物另外所需用水性介質復原。
將本發明之免疫原性組合物直接傳遞至個體可藉由非經腸投藥(肌肉內、腹膜內、皮內、皮下、靜脈內或達至組織間質間隙)來完成；或藉由直腸、口腔、陰道、局部、經皮、鼻內、眼、耳、肺或其他黏膜投藥來完成。在一較佳實施例中，非經腸投藥為肌肉內注射，例如至個體之大腿或上臂。可經由針(例如皮下注射針)進行注射，但或者可使用無針注射。典型肌肉內劑量為0.5 mL。本發明組合物可製成各種形式，例如用於以液體溶液或懸浮液形式進行注射。在某些實施例中，組合物可製成用於肺投藥之散劑或噴霧，例如用於吸入器中。在其他實施例中，組合物可製成栓劑或子宮托，或用於鼻、耳或眼投藥，例如呈噴霧、滴劑、凝膠或散劑形式。
用於特定免疫原性組合物之組分的最佳量可藉由涉及觀察個體之適當免疫反應的標準研究來確定。在初始疫苗接種之後，個體可接受一次或若干次適當間隔之加強免疫。
包裝及劑型
本發明之免疫原性組合物可以單位劑量或多劑量形式(例如2劑、4劑或更多劑)包裝。對於多劑量形式，通常為小瓶，但其未必優於預填充注射器。適合之多劑量形式包括(但不限於)：每個容器2至10劑，每劑0.1至2 mL。在某些實施例中，劑量為0.5 mL劑量。參見例如國際專利申請案WO2007/127668，該案以引用的方式併入本文中。
組合物可以小瓶或其他適合之儲存容器呈遞，或可以預填充傳遞裝置呈遞，該等裝置為例如單組分或多組分注射器，其可以針或不以針供應。注射器通常(但不必要)含有單次劑量之本發明之含有防腐劑的免疫原性組合物，但亦預想多劑量、預填充注射器。同樣，小瓶可包括單次劑量，但或者可包括多次劑量。
有效劑量體積可按常規制定，但用於注射之組合物的典型劑量體積為0.5 mL。在某些實施例中，劑量經調配用於投與人類個體。在某些實施例中，劑量經調配用於投與成年、少年、青少年、幼年或嬰兒(亦即不超過一歲)人類個體且在較佳實施例中可藉由注射投與。
本發明之液體免疫原性組合物亦適用於復原以凍乾形式呈遞之其他免疫原性組合物。當欲將免疫原性組合物用於此類臨時復原時，本發明提供一種套組，其具有兩個或兩個以上小瓶、兩個或兩個以上準備填充之注射器(或各一或多個)，其中在注射之前使用注射器之內含物復原小瓶之內含物，或使用小瓶之內含物復原注射器之內含物。
或者，本發明之免疫原性組合物可經凍乾及復原，例如使用此項技術中熟知之多種冷凍乾燥方法之一來形成規則形狀(例如球形)的乾粒子(諸如小球或微球體)，該等粒子具有可藉由改變用於製備其之精確方法來選擇及控制之粒子特徵(諸如平均直徑尺寸)。免疫原性組合物可進一步包含佐劑，其可視情況與各別規則形狀(例如球形)之乾粒子(諸如小球或微球體)一起製備或含於該等粒子中。在該等實施例中，本發明進一步提供一種免疫原性組合物套組，其包含包括穩定之乾免疫原性組合物且視情況進一步包含本發明之一或多種防腐劑的第一組分，及包含用於復原該第一組分之無菌水溶液的第二組分。在某些實施例中，該水溶液包含一或多種防腐劑，且可視情況包含至少一種佐劑(參見例如WO2009/109550(以引用的方式併入本文中))。
在另一實施例中，多劑量形式之容器係選自由(但不限於)以下組成之群中的一或多者：普通實驗室玻璃器皿、燒瓶、燒杯、量筒、醱酵罐、生物反應器、管(tubing)、管道(pipe)、袋、罐、小瓶、小瓶瓶蓋(例如橡膠塞子、螺旋帽蓋)、安瓿、注射器、雙腔室或多腔室注射器、注射器塞子、注射器柱塞、橡膠瓶蓋、塑膠瓶蓋、玻璃瓶蓋、藥筒及拋棄式筆及其類似物。本發明之容器不受製造材料限制，且包括諸如玻璃、金屬(例如鋼、不鏽鋼、鋁等)及聚合物(例如熱塑性塑膠、彈性體、熱塑性彈性體)之材料。在一特定實施例中，該形式之容器為具有丁基塞子之5 mL肖特氏第1型(Schott Type 1)玻璃小瓶。熟練技術人員應瞭解，上文所述之形式決非詳盡清單，而僅充當關於可用於本發明之形式種類對技術人員之指導。意欲用於本發明之其他形式可見於實驗室設備供應商及製造商之公開目錄，諸如United States Plastic Corp.(Lima,QH),VWR。
免疫原性組合物之評估
在一實施例中，本發明提供包含至少三種來自金黃色葡萄球菌生物體之抗原的免疫原性組合物。
使用各種活體外測試來評估本發明之免疫原性組合物的免疫原性。舉例而言，藉由與葡萄球菌細胞、含有針對所述抗原之特異性抗體的熱去活血清及外源性補體來源之混合物一起培育來進行活體外調理性檢驗。調理吞噬在新鮮分離之多形核細胞(PMN)或分化之效應細胞(諸如HL60)及抗體/補體/葡萄球菌細胞混合物之培育期間進行。塗有抗體及補體之細菌細胞在調理吞噬後經殺滅。自調理吞噬回收之存活細菌的群落形成單位(cfu)係藉由將檢驗混合物塗板來測定。效價係以產生50%細菌殺滅之最高稀釋度的倒數(如與檢驗對照組相比所測定)來報導。
亦使用全細胞ELISA檢驗來評估抗原之活體外免疫原性及表面曝露，其中將所關注之細菌菌株(金黃色葡萄球菌)塗佈於培養板(諸如96孔培養板)上，且使來自經免疫之動物的測試血清與細菌細胞反應。若對於測試抗原具有特異性之任何抗體均與抗原之表面曝露抗原決定基反應，則可藉由熟習此項技術者已知之標準方法來偵測該抗體。
接著在活體內動物攻毒模型中測試顯示所需活體外活性之任何抗原。在某些實施例中，藉由熟習此項技術者已知之免疫方法及途徑(例如鼻內、非經腸、口腔、直腸、陰道、經皮、腹膜內、靜脈內、皮下等)，使用免疫原性組合物使動物(例如小鼠)免疫。在用特定葡萄球菌屬免疫原性組合物使動物免疫後，用葡萄球菌屬對動物攻毒且檢驗對葡萄球菌感染之抗性。
在一實施例中，使無病原體小鼠免疫且用金黃色葡萄球菌攻毒。舉例而言，用一或多劑在免疫原性組合物中之所需抗原使小鼠免疫。隨後，用金黃色葡萄球菌對小鼠攻毒且在攻毒後隨時間監測存活率。
免疫方法
亦提供使宿主免疫以預防葡萄球菌感染之方法。在一較佳實施例中，宿主為人類。因此，投與宿主或個體免疫原性量之如本文所述的免疫原性組合物。免疫原性組合物之免疫原性量可藉由進行劑量反應研究來測定，在該研究中用逐漸增加之量的免疫原性組合物使個體免疫且分析免疫反應以判定最佳劑量。可自動物模型中之免疫資料來推測研究起始點。劑量可視個體之特定條件而變化。該量可藉由熟習此項技術者已知之方法以常規試驗來測定。在一些實施例中，使宿主免疫以預防葡萄球菌感染、疾病或病狀之方法包含人類、獸醫、動物或農業處理。另一實施例提供一種使宿主免疫以預防個體與葡萄球菌屬相關之葡萄球菌感染、疾病或病狀的方法，該方法包含由本文所述之免疫原性組合物產生多株或單株抗體製劑，及使用該抗體製劑賦予個體被動免疫性。
向個體投與適當劑量數目之免疫有效量的免疫原性組合物以引發免疫反應。經治療之個體不應展現較嚴重的臨床葡萄球菌感染表現。劑量可視個體之特定條件(諸如年齡及體重)而變化。此量可藉由熟習此項技術者已知之方法以常規試驗來測定。
在一實施例中，投與本發明之免疫原性組合物的患者顯示金黃色葡萄球菌攜帶率降低。自醫學需要之觀點看來，在投與免疫原性組合物之後，該攜帶降低或作為非帶菌者所用之時間間隔延長為顯著的。舉例而言，帶菌者之總體金黃色葡萄球菌攜帶降低可在一劑金黃色葡萄球菌多抗原疫苗之後加以評估。舉例而言，在投與免疫原性組合物之前1天，可藉由鼻部及咽喉擦拭、隨後進行培養以測定其帶菌狀況來篩選一組18-50歲成人之帶菌。接著，可投與該組本發明之免疫原性組合物，而一組接受對照物。鼻部及咽喉擦拭每週進行一次，歷時12週，且每月進行一次，直至投與免疫原性組合物之後6個月，並與安慰劑作比較。一個主要終點為在免疫之後間隔3個月時比較投與免疫原性組合物相對於投與安慰劑後患者之攜帶率。
葡萄球菌感染之動物模型
下文描述用於評估本文所述之任一種免疫原性組合物之功效的若干動物模型。
鼠類敗血症模型(被動或主動)
被動免疫模型
用免疫IgG或單株抗體經腹膜內(i.p.)使小鼠被動免疫。隨後在24小時後用致命劑量之金黃色葡萄球菌對小鼠攻毒。經靜脈內(i.v.)或腹膜內投與細菌攻毒，從而確保任何存活均可歸因於抗體與細菌之特異性活體內相互作用。達成約20%未經免疫之對照小鼠的致命敗血症所需之劑量即定為細菌攻毒劑量。存活研究之統計學評估可藉由卡本-麥爾分析(Kaplan-Meier analysis)來進行。
主動免疫模型
在此模型中，在第0、3及6週(或其他類似的適當間隔之疫苗接種時程)，用標靶抗原經腹膜內(i.p.)或皮下(s.c.)使小鼠(例如瑞士韋伯斯特(Swiss Webster)小鼠)主動免疫，且隨後在第8週藉由靜脈內途徑用金黃色葡萄球菌攻毒。校準細菌攻毒劑量以經10-14天時期達成對照組之約20%存活。存活研究之統計學評估可藉由卡本-麥爾分析來進行。
傳染性心內膜炎模型(被動或主動)
由金黃色葡萄球菌引起之傳染性心內膜炎(IE)的被動免疫模型先前已用於顯示ClfA可誘導保護性免疫性。參見Vernachio等人，Antmicro. Agents ＆ Chemo. 50:511-518(2006)。在此IE模型中，使用兔子或大鼠模擬臨床感染，包括中心靜脈導管、菌血症及血原性播散至遠端器官。向具有無菌主動脈瓣增殖體之插有導管的兔子或大鼠投與對於標靶抗原具有特異性之單株或多株抗體的單次或多次靜脈內注射液。隨後，用金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌株經靜脈內對動物攻毒。接著在攻毒後，收集心臟、心臟增殖體及其他組織(包括腎及血液)並加以培養。接著量測心臟組織、腎及血液之葡萄球菌感染的出現率。在一項研究中，當用MRSE ATCC 35984或MRSA 67-0對動物攻毒時，使用針對ClfA之多株抗體製劑或單株抗體顯示感染率顯著降低。參見Vernachio等人，Antmicro. Agents ＆ Chemo. 50:511-518(2006)。
傳染性心內膜炎模型亦適用於兔子與大鼠之主動免疫研究。用標靶抗原經肌肉內或皮下使兔子或大鼠免疫且兩週後經由靜脈內途徑用金黃色葡萄球菌攻毒。
腎盂腎炎模型
在腎盂腎炎模型中，在第0、3及6週(或其他適當間隔之免疫時程)，用標靶抗原使小鼠免疫。隨後，用金黃色葡萄球菌PFESA0266經腹膜內或靜脈內對動物攻毒。48小時後，收集腎且對細菌CFU計數。
抗體及抗體組合物
本發明進一步提供抗體及抗體組合物，其特異性及選擇性結合於本發明之免疫原性組合物的一或多種抗原。在一些實施例中，在向個體投與本發明之免疫原性組合物後即產生抗體。在一些實施例中，本發明提供經純化或分離之針對本發明之免疫原性組合物之一或多種抗原的抗體。在一些實施例中，如藉由在動物功效模型中殺滅細菌或經由調理吞噬殺滅檢驗所量測，本發明之抗體具有功能。在一些實施例中，本發明之抗體賦予個體被動免疫性。本發明進一步提供編碼本發明之抗體或抗體片段的聚核苷酸分子，及使用熟習此項技術者所熟知之技術製造本發明之抗體或抗體組合物的細胞或細胞株(諸如用於重組製造抗體之融合瘤細胞或其他經工程改造之細胞株)及轉殖基因動物。
本發明之抗體或抗體組合物可用於治療或預防個體與葡萄球菌屬相關之葡萄球菌感染、疾病或病狀的方法中，該方法包含產生多株或單株抗體製劑，及使用該抗體或抗體組合物賦予個體被動免疫性。本發明之抗體亦可適用於診斷方法，例如偵測本發明之免疫原性組合物之一或多種抗原的存在或定量其含量。
實例
以下實例說明本發明之一些實施例。然而，應瞭解，此等實例僅供說明之用且不欲對本發明之條件及範疇進行完全確定。應瞭解，當已給出典型反應條件(例如溫度、反應時間等)時，亦可使用高於及低於特定範圍之條件，但該等條件一般不太合宜。除非另外規定，否則本文所提及之所有份數及百分比均以重量計且所有溫度均以攝氏度表示。
此外，使用熟習此項技術者所熟知之常規標準技術進行以下實例，但其他詳細描述之處除外。如上文所述，以下實例係出於說明性目的而提供，且不應以限制本發明之範疇的任何方式來解釋。
實例1：製造抗原ClfA及ClfB
凝集因子A(ClfA)及B(ClfB)為負責結合於包括纖維蛋白原(ClfA、ClfB)及細胞角蛋白10(ClfB)之宿主蛋白的金黃色葡萄球菌表面蛋白。ClfA及ClfB為含有使該蛋白能夠共價連接於細胞表面之羧基端LPXTG(SEQ ID NO: 125)基元之蛋白家族的成員。ClfA與ClfB皆屬於識別及結合諸如纖維蛋白原(ClfA及ClfB)、纖維網蛋白(FnbA及FnbB)、膠原蛋白(Cna)及其他蛋白之宿主細胞外基質蛋白的蛋白家族(微生物表面組分識別黏附基質分子或MSCRAMM)。此等蛋白均共有介導轉運至細胞表面之胺基端信號序列。MSCRAMM亦包括A域，該域為含有用於纖維蛋白原、纖維網蛋白、彈性蛋白及角蛋白之配位體結合位點之功能區。在A域之後可為由絲胺酸-天冬胺酸重複單元(SD重複單元)構成之區域，認為該區域跨越肽聚糖層。在SD重複單元之後為包括用於使蛋白共價連接於肽聚糖之LPXTG(SEQ ID NO: 125)基元的跨膜區。
C1fA及C1fB中包含A域之N1N2N3的配位體結合區跨越胺基酸40-559。C1fA/C1fB之N域分配如下：N1涵蓋殘基45-220；N2涵蓋殘基229-369；及N3涵蓋殘基370-559。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。在重組C1fA N1N2N3之製備中，發現N1域對於蛋白酶敏感且容易裂解或水解，留下N23作為穩定的配位體結合重組片段。參見DeiVanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。類似地，證實C1fB之N1域亦對於蛋白酶敏感且可易於由金黃色葡萄球菌金屬蛋白酶裂解(McAleese,F. M.等人，J. Biol. Chem. 2001,276,第29969-29978頁)。C1fA A域之結合纖維蛋白原之N23片段的晶體結構揭示，N2與N3皆受反平行β股控制。除反平行β股外，N2域亦含有單個轉角α螺旋及兩個310螺旋且N3域亦含有三個310螺旋。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。
N2及N3之序列比對揭示在其長度上僅具有13%序列一致性及36%序列相似性。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。N2及N3域之拓撲類似於經典IgG摺疊且已提出為IgG摺疊之新穎變異體。參見Deivanayagam 等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。
用於本文所述之免疫原性組合物中之ClfA的重組形式為ClfA中包含一或多個N域之片段，例如N1N2N3、N2N3，且在本文中稱為「重組ClfA」或「rClfA」。另外，任何rClfA均應為維持個別N域及關鍵抗原決定基之天然結構、但在投藥後不干擾經免疫之個體的正常過程(亦即不結合纖維蛋白原)之rClfA。突變研究已顯示，突變Y338A(N2)完全消除N23片段與纖維蛋白原之結合。(此Y338A位置係指在仍連接有前導序列之多肽序列之未成熟形式的位置338處酪胺酸變為丙胺酸。此改變可見於SEQ ID NO:123之突變型ClfA多肽之成熟形式的位置310處，說明未結合於纖維蛋白原)。參見Deivanayagam等人，EMBO J. 21:6660-6672(2002)。因此，在以下研究中，對於ClfA之所有片段均採用Y338A突變。
類似地，用於本文所述之免疫原性組合物中之ClfB的重組形式為ClfB中包含一或多個N域之片段，例如N1N2N3、N2N3，且在本文中稱為「重組ClfB」或「rClfB」。另外，任何rClfB均應為維持個別N域及關鍵抗原決定基之天然結構、但在投藥後不干擾經免疫之個體的正常過程(亦即不結合纖維蛋白原)之rClfB。(參見例如Walsh,E.J.等人，Microbiology(2008),154,550-558)。
ClfA及ClfB：選殖策略之概述
用於產生臨床前功效資料之不同形式的rClfA蛋白包括HisClfA(N123) ；T7ClfA(N123) ；T7ClfA(N123) ；Y338A；ClfA(N23) 及ClfA(N23) Y338A。參見圖1。ClfA基因含有來自金黃色葡萄球菌PFESA0237之對應於殘基40-559的A區編碼序列。將自金黃色葡萄球菌選殖之閱讀框架融合於載體(MRGSHHHHHHGS SEQ ID NO:127)之N端HisTag及連接子序列，同時將三個其他編碼序列(KLN)引入C端。(關於詳細程序，參見下文。)將由此載體表現之蛋白用於所有實驗，其中該蛋白稱為HisClfA(N123) 。
不同形式之rClfA係源自A區(由金黃色葡萄球菌PFESA0237(頂列)表現之ClfA的殘基40-559)。使用pQE30中所含之T5啟動子表現HisClfA(N123 )且使用基於T7之pET表現系統表現所有其他形式。
將兩種形式之ClfB(T7ClfB N1N2N3及ClfB N23)用於臨床前動物研究。
ClfA選殖程序
選殖來自金黃色葡萄球菌菌株PFESA0237之對應於胺基酸殘基40-559的ClfA編碼序列且引入突變Y338A以消除纖維蛋白原結合。將突變型ClfA基因引入T7 RNA聚合酶表現載體pET9a(Novagen)中以提供質體pLP1179。pLP1179中包含T7啟動子及編碼區之區域的DNA序列為SEQ ID:124。將該表現載體轉型至大腸桿菌BLR(DE3)(Novagen)中以用於製造重組ClfA。
T7ClfA(N123) Y338A之構建包含若干步驟。用於構建最終表現質體pLP1179之選殖步驟的概述展示於圖2中。
pQEClf40中所存在之clfA DNA序列對應於最初選殖至pQE30之BamHI/HindIII選殖位點中的ClfA之胺基酸殘基40-559。此在ClfA之N端形成HisTag融合物且在C端添加三個殘基。將(AmpR) pQEClf40中所存在之ClfA編碼區次選殖至KanR pET 27b載體(Novagen)中以形成pLP1137。另外，將對應於胺基酸殘基221-559之clfA DNA序列選殖至pET27b之NdeI-HindIII選殖位點中以形成pLP1134。藉由將BamHI-BlpI DNA片段自pQEClf40次選殖至pET9a(Novagen)中而使ClfA之N端HisTag經N端T7置換以形成pLP1153。pLP1153中所存在之T7ClfA(N123) 的編碼序列含有來自pET9a之T7標籤的11個N端胺基酸殘基，隨後為來自連接子序列之三個胺基酸殘基加上最初存在於pQE30Clf40中之三個源自連接子的C端殘基。首先將Y338A突變引入pLP1134之ClfA(N23) 編碼序列中以形成pLP1168。稍後將來自pLP1168之ClfA(N23) 的含有Y338A突變之PstI-SnaBI DNA片段置換至pLP1153之T7ClfA(N123) 編碼序列的PstI-SnaBI中以形成pLP1171。藉由在T7 rClfA Y338A ORF之DNA位置339及342處進行沉默突變來改變pLP1171之T7ClfA(N123) Y338A之編碼序列中所存在的內部核糖體結合位點，從而分別使G變為T及使G變為A。接著使用所得質體pLP1176移除最初源自pQE30Clf40且位於T7標籤與ClfA編碼區起始處之間的三個外來殘基。亦在此時移除三個源自連接子之C端殘基。
由所得質體pLP1179(圖2及3)表現之rClfA僅含有11個N端胺基酸融合於ClfA(N123) Y338A之殘基40-559。pLP1179中包含T7啟動子及T7 rClfA(N123) Y338A之編碼序列之區域的DNA序列為SEQ ID NO 124。
細菌菌株及質體
使用質體骨架pET9a(自Novagen獲得)構建pLP1179，其自T7啟動子表現T7ClfA(N123) Y338A。該質體含有用於陽性選擇之康黴素(kanamycin)抗性基因(KanR)。最初使用BL21(DE3)大腸桿菌宿主菌株[F-ompT hsdS B (rB - mB - )gal dcm (DE3)](Novagen)獲得T7ClfA(N123) Y338A之表現。DE3名稱表示含有lacUV5 (IPTG誘導性)啟動子控制下之T7 RNA聚合酶基因的λ溶素原，該啟動子用於誘導T7RNA聚合酶表現及隨後自接近pLP1179中所存在之ClfA(N123) Y338A編碼序列的T7啟動子轉錄。在接收BL21(DE3)溶源性宿主菌株在大規模醱酵後能夠誘導裂解性噬菌體之資訊後，宿主菌株即變為recA BLR(DE3)宿主菌株[F-ompT hsdS B (rB - mB - )gal dcm δ(sri -recA )306::Tn10 (TcR )(DE3)](Novagen)。
製造及純化ClfA
為製造ClfA，以分批饋送葡萄糖之模式使大腸桿菌BLR(DE3)/pLP1179在生物反應器中之合成培養基中生長。當培養物達到光學密度(OD600)為30-50時，藉由添加IPTG誘導ClfA之表現。在誘導後3-16小時收集培養物。
破壞細胞且收集澄清之可溶性部分。添加硫酸銨之後，將該物質施加於含有苯基-瓊脂糖樹脂之管柱上並進行溶離。鑑別含有ClfA之溶離份，透析且裝載於陰離子交換管柱(Q-瓊脂糖)上。用鹽梯度溶離之後，鑑別含有ClfA之溶離份，藉由超濾進行濃縮且裝載於尺寸排阻管柱(Superdex-75)上。鑑別含有ClfA之溶離份並彙集。此時，如藉由SDS-PAGE所量測，ClfA之純度為約98%。
選殖及純化ClfB N1N2N3
將對應於胺基酸殘基44-542之ClfB編碼序列選殖至T7 RNA聚合酶表現載體pET28a(Novagen)中以提供質體pPX1189。將該表現載體轉型至大腸桿菌BLR(DE3)(Novagen)中以用於製造重組ClfB。(參見Walsh等人，Microbiology 154:550-558(2008)。)
為製造ClfB，以分批饋送葡萄糖之模式使大腸桿菌BLR(DE3)/pLP1179在生物反應器中之合成培養基中生長。當培養物達到光學密度(OD600)為30-50時，藉由添加IPTG誘導ClfB之表現。在誘導後3-16小時收集培養物。
破壞細胞且收集澄清之可溶性部分。將可溶性部分之pH值調節至約pH 3.2且移除所沈澱之雜質。將含有ClfB之可溶性部分的pH值再調節至約pH 8.0且進行透析以移除鹽。添加硫酸銨之後，將該物質施加於含有苯基-瓊脂糖樹脂之管柱上並進行溶離。鑑別含有ClfB之溶離份，透析且裝載於陰離子交換管柱(Q-瓊脂糖)上。用鹽梯度溶離之後，鑑別含有ClfB之溶離份，藉由超濾進行濃縮且裝載於尺寸排阻管柱(Superdex-75)上。鑑別含有ClfB之溶離份並彙集。此時，如藉由SDS-PAGE所量測，ClfB之純度為約94%。
實例2：　製造抗原：金黃色葡萄球菌MntC
選殖金黃色葡萄球菌脂化MntC
最初自金黃色葡萄球菌菌株Mu50選殖重組MntC。藉由PCR，自金黃色葡萄球菌Mu50基因組DNA擴增rMntC編碼序列。使用兩對巢式引子進行擴增(表2)。第一對引子，5'SA926-MntC ups及3'SA926-MntC doWn，與rMntC之開放閱讀框架上游及下游的序列對準。第二組引子與rMntC之編碼序列對準，使得擴增對應於胺基酸殘基19-309之序列。將限制酶位點併入此等引子之5'端，以促進定向選殖。在Peltier熱循環器(Peltier Thermal Cycler)(MJ Research Inc,Walthan,MA)中，使用TaKaRa PrimeSTAR HS DNA聚合酶預混物(Takara Bio USA,Madison,WI)進行PCR。藉由QIAEX II(Qiagen,Valencia,CA)純化PCR產物，用適當限制性核酸內切酶(New England BioLabs,Ipswich,MA)裂解，且次選殖至araBAD啟動子驅動之表現載體pBAD18Cm中。此載體亦含有來自流行性感冒桿菌之脂蛋白P4的信號肽。自P4信號肽下游框內次選殖MntC PCR產物以形成pLP1194。pLP1194之MntC編碼區的DNA序列顯示於SEQ ID NO: 120中。由pLP1194表現之MntC為脂蛋白。藉由ABI PRISM BigDyeTM Terminator V.3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)對重組質體DNA定序，且使重組蛋白表現於大腸桿菌BLR(NOVAGEN)中，產生脂化rMntC。
製造及純化脂化MntC
為製造脂化MntC，以分批饋送葡萄糖之模式，使大腸桿菌BLR/pLPl194在生物反應器中之合成培養基中生長。當培養物達到光學密度(OD600)為約60時，藉由將饋料轉換為葡萄糖與阿拉伯糖之混合物，誘導rMntC之表現。在誘導後約24小時收集培養物。
破壞細胞且收集不溶性部分。發現脂化MntC由於脂質修飾而與細胞膜締合。用清潔劑(Zwittergent ZW-312)自膜部分萃取MntC。移除不溶性碎片後，於可溶性部分中發現脂化MntC。將可溶性部分施加於含有混合模式樹脂之管柱上且用線性鹽及pH值梯度進行溶離。鑑別含有MntC之溶離份並彙集。將硫酸銨添加至彙集物中且將該物質施加於含有丁基-瓊脂糖之管柱上，並進行溶離。鑑別含有MntC之溶離份，去鹽且裝載於陽離子交換管柱(SP-瓊脂糖)上。用鹽梯度溶離之後，鑑別含有rMntC之溶離份並彙集。
選殖金黃色葡萄球菌非脂化MntC
藉由PCR擴增，自質體pLPl194分離用於表現非脂化rMntC之DNA序列。所得序列對應於胺基酸殘基19-309且不含有引導分泌及脂化之信號序列。pLPl215之rMntC編碼區的DNA序列見於DNA SEQ ID NO:120中。
為形成pLPl215，藉由PCR自pLPl194擴增MntC。pLPl215中所存在之MntC DNA序列對應於胺基酸殘基19-309且將此構築體之第一密碼子引入用於擴增該基因之正向引子中。用於PCR之引子亦在5'端含有限制酶位點以促進定向選殖(表2)。如上文所述進行PCR及擴增基因之純化。用適當限制性核酸內切酶(New England BioLabs,Ipswich,MA)裂解經純化之PCR產物且次選殖至T7啟動子驅動之表現載體pET28a(Novagen,Madison,WI)中。藉由ABI PRISM BigDyeTM Terminator V.3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)對重組質體DNA pLP1215測序且使重組蛋白表現於大腸桿菌BLR(DE3)中。純化pLP1215之質體DNA且用於轉型大腸桿菌HMS174(DE3)以評估蛋白表現。
表2：MntC引子。
使用合成寡核苷酸產生rMntC構築體。對限制性核酸內切酶位點加下劃線。粗體核苷酸指示非脂化rMntC構築體之第一密碼子。
製造及純化非脂化rMntC
為製造非脂化rMntC，以分批饋送葡萄糖之模式使大腸桿菌HMS174(DE3)/pLP1215在生物反應器中之合成培養基中生長。當培養物達到光學密度(OD600)為約60至80時，藉由添加IPTG誘導rMntC之表現。在誘導後約24小時收集培養物。破壞細胞且收集澄清之可溶性部分。將溶菌液施加於含有陽離子交換樹脂之管柱(SP-瓊脂糖)上且用線性鹽梯度進行溶離。鑑別含有MntC之溶離份。添加硫酸銨之後，將該物質施加於含有苯基-瓊脂糖樹脂之管柱上並進行溶離。溶離後，鑑別含有rMntC之溶離份，彙集且去鹽。此時，如藉由SDS-PAGE所量測，rMntC之純度大於95%。
實例3：製造莢膜多醣CP5及CP8
在此實例中，描述各種大小之金黃色葡萄球菌第5型及第8型莢膜多醣的製造。CP5及CP8多醣之結構展示於圖4中。本文所述之方法有效製造分子量範圍為約50 kDa至800 kDa之CP5及CP8。基於生長特徵及所產生之莢膜數量，選擇菌株PFESA0266用於製造CP5，而使用菌株PFESA0005或PFESA0286製造CP8。顯示自菌株PFESA0005及PFESA0286分離之莢膜為相同的。
為製造莢膜多醣，使菌株在主要由碳源(乳糖或蔗糖)、作為氮源之水解大豆粉、及痕量金屬組成之複合培養基中生長。使菌株在生物反應器中生長2至5天。
藉由兩種不同方法來純化用於製備結合物之CP5及CP8，該等方法依賴於高溫及低pH值以實現自細胞釋放莢膜及降低多醣之分子量。所得分子量視水解步驟之時間、溫度及pH值而定。
使用表3中所指定之技術進行CP5及CP8之表徵。由此程序製造之莢膜多醣產生含有低含量之蛋白質、NA、肽聚糖及TA污染物的純多醣。參見表4及5。
表3：用於經純化之金黃色葡萄球菌CP5及CP8的表徵檢驗
在第一種方法中，在自細胞釋放莢膜及分子量降低之後，用酶(核糖核酸酶、去氧核糖核酸酶、溶菌酶及蛋白酶)之混合液處理莢膜製劑以消化雜質。培育後，藉由添加乙醇(最終濃度為約25%)使殘餘雜質沈澱。移除殘餘乙醇之後，將含有莢膜之溶液裝載於陰離子交換管柱(Q-瓊脂糖)上且用線性鹽梯度進行溶離。彙集含有莢膜之溶離份且用偏過碘酸鈉進行處理。此處理導致殘餘磷壁酸質污染物氧化水解，但不影響CP5或CP8。藉由添加乙二醇淬滅反應。濃縮物質且針對dH2 O進行透析過濾以移除任何殘餘試劑及副產物。
使用第二種方法製造莢膜，該方法不涉及使用酶來消化各種源自細胞之雜質。在此方法中，在自細胞釋放莢膜及分子量降低之後，藉由微過濾、隨後超濾及透析過濾使水解之醱酵培養液澄清。用活性碳處理溶液以移除雜質。碳處理之後，用偏過碘酸鈉處理物質以氧化殘餘磷壁酸質，隨後用丙二醇淬滅。濃縮物質且針對dH2 O進行透析過濾以移除任何殘餘試劑及副產物。
使用任一種方法製造之莢膜均產生含有低含量之蛋白質、核酸及磷壁酸質污染物的純多醣。所述方法可用於僅藉由改變水解條件而製造特定範圍之所需高分子量多醣。尤其有利範圍之高分子量多醣(範圍為70 kDa至150 kDa)適用於藉由使多醣結合於載體蛋白而製備免疫原性組合物。
可由本文所述之方法獲得的高分子量莢膜多醣之實例展示於下表4中。如藉由無TA、肽聚糖及低殘餘蛋白質所指示，數批經純化之較高MW CP5亦具有高純度。參見表4。在此等實例中，分子量範圍跨越132.7 kDa至800 kDa且經純化之多醣經高度O-乙醯化，範圍為90-100%，且N-乙醯化為100%。參見表4。
可由本文所述之方法獲得的較低分子量莢膜多醣之實例展示於下表5中。如藉由無磷壁酸質(TA)、肽聚糖及低殘餘蛋白質所指示，數批經純化之較低MW CP8具有高純度。參見表5。較低分子量範圍跨越20.4 kDa至65.1 kDa且經純化之多醣經高度O-乙醯化，範圍為75-96%。核酸污染程度較低，範圍為0.5%-2.45%。參見表5。
表4：CP5製劑之表徵
表5：CP8製劑之表徵
莢膜多醣之分子量選擇
此動力學分析說明多種分子量之莢膜多醣可由本文所述之方法產生。最初，由細菌細胞製造較大多醣，隨後可選擇所需分子量範圍，接著藉由操縱加熱及水解步驟之pH值及加熱條件進行純化。
金黃色葡萄球菌醱酵培養液之熱處理為介於醱酵與CP回收之間的處理步驟。此處理步驟使用熱將pH值經調節之培養液處理指定時期。低pH值下熱處理之目的為殺滅細胞，使腸毒素去活，釋放細胞所結合之多醣，及使分子量降低至所需大小。在此等目的中，就此步驟所需之處理時間而言，分子量之降低最慢。因此，其他目的必然在所考慮之處理時間內實現。
熱處理
確定用於選擇各種分子量範圍之莢膜多醣的溫度及pH值條件。用濃硫酸調節培養液pH值。接著，使培養液溫度升至設定值。一旦溫度達到設定點，熱處理時間即開始。當達到所需處理時間時，將培養液冷卻至室溫。取出處理中之樣品以分別藉由HPLC及SEC-MALLS系統測定多醣濃度及分子量。將MW資料用於動力學分析中。隨時間在pH 4.0、4.5及5.0下測定CP5之MW概況且在pH 3.5、4.0及5.0下測定CP8之MW概況。參見圖5A及5B。
使用自該過程獲得之經純化之CP-5及CP-8進行多醣之弱酸水解的動力學。將經純化之多醣溶液調節至所需pH值以用於使用硫酸之實驗。將樣品置於配備有精密溫度控制系統之油浴中。以預定時間間隔取出各樣品且在冰桶中驟冷。在實驗結束時，將1 M Tris緩衝液(pH 7.5)之等分試樣添加至樣品中以將pH值調節回約7。藉由SEC-MALLS系統分析樣品。將MW資料用於動力學分析中。隨時間測定溫度對CP5(pH 4.5)及CP8(pH 3.5)之MW概況的影響。參見圖6A及6B。此酸水解程序可使用醱酵罐培養來實施，或在純化之中間階段實施，或如此處所示使用經純化之多醣來實施。其他分子量降低步驟(諸如音波處理或剪切)可類似地實施。
結果
對於CP-5及CP-8，在熱處理中pH值對MW降低之影響分別展示於圖5A及5B中。可見較低pH值更有效降低多醣大小。資料亦表明在相同pH值下，CP-5比CP-8更難以水解。考慮到CP8概況，可使用pH 5，在95℃下，在15分鐘至120分鐘內產生介於300 kDa與600 kDa之間的分子量範圍。同樣，選擇pH 4，在95℃下，在15分鐘至120分鐘內可得到介於250 kDa與450 kDa之間的CP8多醣分子量範圍。另外，選擇pH 3.5，在95℃下，在15分鐘至120分鐘內可得到介於120 kDa與450 kDa之間的CP8多醣分子量範圍。
使用自回收過程回收之經純化之多醣進行溫度對MW降低之影響。結果展示於圖6A及6B中。如圖所示，溫度愈高，水解速率愈快且隨時間產生之多醣之分子量範圍愈寬。在相同pH值下，使用較低溫度55℃相對於95℃產生較窄之多醣分子量範圍。
此外，圖7說明經純化之CP5及CP8的分子量與弱酸水解之處理時間之間的相關性。經純化之多醣為自先前詳述之回收過程獲得的最終產物。如圖7中所示，pH 4.5下金黃色葡萄球菌PFESA0266菌株之熱處理時間增加導致產生較小分子量CP5多醣，而pH 4.5下較短熱處理時間導致產生較高分子量CP5多醣。CP5多醣之大小範圍為約90 kDa至約220 kDa，視低pH值(4.5)下熱處理之持續時間而定。同樣，pH 3.5下金黃色葡萄球菌PFESA0005菌株之熱處理時間增加導致產生較小分子量CP8多醣，而pH 3.5下較短熱處理時間導致產生較高分子量CP8多醣。CP8多醣之大小範圍為約80 kDa至約220 kDa，視低pH值(3.5)下熱處理之持續時間而定。如此研究中所示，低pH值下之熱處理時間與經純化之CP5及CP8多醣之大小之間的相關性允許估計製造具有指定分子量範圍之經純化多醣所需的處理時間。
重要的是，應注意如上文所說明，可製造對於CP5與CP8而言20 kDa至超過800 kDa之全分子量範圍的莢膜多醣，釋放並進行純化。所述方法可用於製造特定範圍之所需高分子量莢膜多醣。尤其有利範圍之高分子量第5型及第8型莢膜多醣可由此等方法產生，該等多醣之分子量範圍為70 kDa至150 kDa。參見表6。此分子量範圍之莢膜多醣適用於藉由使多醣結合於載體蛋白而製備免疫原性組合物。或者，此有利範圍之高分子量莢膜多醣在80 kDa至140 kDa之CP5及CP8的範圍內。參見表6。另一有利範圍之高分子量莢膜多醣CP5及CP8為90 kDa至130 kDa或90 kDa至120 kDa之CP5及CP8。參見表6。用於產生分子量範圍為約100 kDa至140 kDa之CP5莢膜多醣的條件如下：95℃，pH 4.5，歷時135分鐘。用於產生分子量範圍為約80 kDa至120 kDa之CP8莢膜多醣的條件如下：95℃，pH 3.5，歷時300分鐘。
表6：製造特定範圍之高分子量CP5及CP8
實例4：莢膜多醣CP5及CP8結合於CRM 197
此實例描述用於製造金黃色葡萄球菌CP5-CRM197 及CP8-CRM197 結合物之過程及表徵檢驗。對於金黃色葡萄球菌莢膜多醣CP5及CP8結合於載體蛋白，評估數種結合化學作用。使用PDPH(3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼)進行結合會產生共價硫醚鍵且使用CDI/CDT(1,1-羰基二咪唑/1,1-羰基-二-1,2,4-三唑)會在CP與載體蛋白之間產生一碳或零碳連接子。
藉由PDPH結合化學作用使CP結合於CRM 197
PDPH結合化學作用為涉及活化多醣、移除巰基保護基、純化經活化之多醣中間物、活化及純化CRM197 蛋白、及結合經活化之組分、隨後純化之多步過程。將含有巰基之連接子引入多醣中且將鹵乙醯基引入CRM197 蛋白載體中之後，使金黃色葡萄球菌CP5及CP8多醣經由硫醚鍵連接於蛋白載體。藉由使胺基與溴乙酸之N-羥基丁二醯亞胺酯反應將溴乙醯基引入CRM197 蛋白中。為產生硫醇化CP，將CP中N-乙醯基胺基甘露醇醛酸之經碳化二亞胺活化之甲酸酯基團偶合於氫硫基反應性醯肼異雙官能連接子3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯肼(PDPH)之醯肼基。使藉由用DTT還原而產生且藉由在Sephadex G25管柱中進行SEC而純化之PDPH-硫醇化CP的巰基與經活化蛋白的溴乙醯基反應，產生藉由CP與蛋白之間的溴位移所形成之共價硫醚鍵。用半胱胺鹽酸鹽(2-胺基乙硫醇鹽酸鹽)對未反應之溴乙醯基「封端」。接著濃縮反應混合物且透析過濾。用半胱胺鹽酸鹽對殘餘之未結合溴乙醯基封端以確保溴乙醯基在結合後不具反應性。在溴位移後，此在半胱胺之巰基端與離胺酸殘基上之乙醯基之間形成共價鍵。
用PDPH硫醇化金黃色葡萄球菌莢膜多醣
首先藉由用PDPH硫醇化來活化多醣。將多醣與新鮮製備之PDPH儲備溶液(250 mg/mL DMSO溶液)、EDAC儲備溶液(90 mg/mL diH2 O溶液)及MES緩衝液儲備溶液(0.5 M，pH 4.85)混合以使最終溶液為0.1 M MES以及2 mg CP/mL及4 mg CP/mL，同時維持CP:PDPH:EDAC重量比為1:5:3(對於CP 5)及1:0.6:1.25(對於CP 8)。在室溫下培育此混合物1小時，接著在4℃與8℃之間，使用3500 MWCO透析裝置，針對1000倍體積之蒸餾水透析四次，以移除未反應之PDPH。使連接PDPH之多醣為0.2 M DTT且在室溫下培育3小時或在4℃與8℃之間培育隔夜。藉由使用Sephadex G25樹脂及作為移動相之蒸餾水進行SEC而使過量DTT以及反應副產物與活化醣分離。藉由DTDP檢驗，針對巰基檢驗溶離份且彙集接近空體積管柱時所溶離之巰基陽性溶離份。藉由PAHBAH及O-乙醯基檢驗來檢驗溶離份彙集物以測定活化程度，其以含有巰基之重複單元的莫耳百分比表示(巰基之莫耳濃度/重複單元之莫耳濃度)。凍乾經活化之多醣且儲存於-25℃下直至需要結合為止。
載體蛋白活化
分別藉由溴乙醯化活化載體蛋白。用10 mM經磷酸鹽緩衝之0.9% NaCl(pH 7)(PBS)將CRM197 稀釋至5 mg/mL，接著使用1 M儲備溶液製備0.1 M NaHCO3 (pH 7.0)。使用20 mg/mL DMSO之溴乙酸之N-羥基丁二醯亞胺酯(BAANS)儲備溶液，以CRM197 :BAANS比率1:0.25(w:w)添加BAANS。在4℃與8℃之間培育此反應混合物1小時，接著使用SEC在Sephadex G-25上進行純化。藉由洛瑞檢驗來檢驗經純化及活化之CRM197 以測定蛋白濃度，接著用PBS稀釋至5 mg/m L。添加蔗糖至5% wt/vol以作為低溫保護劑且將經活化之蛋白冷凍及儲存於-25℃下直至需要結合為止。
偶合反應
製備經活化之莢膜多醣及經活化之載體蛋白後，隨即將兩者在結合反應中組合。將經凍乾及硫醇化之多醣溶解於0.16 M硼酸鹽(pH 8.95)中，與解凍之溴乙醯化CRM197 及蒸餾水混合以使最終溶液為0.1 M硼酸鹽、1:1 wt/wt比率之CRM197 :CP及1 mg/mL多醣(對於CP8)及2 mg/mL多醣(對於CP5)。在室溫下培育此混合物16至24小時。藉由使用溶解於0.1 M硼酸鹽(pH 8.95)中之135 mg/mL半胱胺儲備溶液，以1:2(wt/wt)之CRM197 ：半胱胺比率添加半胱胺鹽酸鹽對蛋白上未反應之溴乙醯基封端，且在室溫下培育4小時。藉由使用100K聚醚碸超濾膜，針對0.9% NaCl透析過濾50倍來純化莢膜多醣-CRM197 結合物(結合物)。
來自使用PDPH之CP5及CP8硫醇化研究之再現性的結果說明CP5之活化程度在11%至19%之範圍內，其相當於大致每10個CP重複單元連接一個連接子分子至每5個重複單元連接一個連接子分子。CP8活化在12%至16%之範圍內，其極類似於CP5之活化。
CRM197 之離胺酸殘基的溴乙醯化極其一致，導致39個可用離胺酸中之19至25個離胺酸經活化。該反應產生高產率之經活化蛋白。
藉由CDI/CDT結合化學作用使CP結合於CRM 197
CDI及CDT提供一步結合過程，其中在無水環境(DMSO)中活化多醣以形成具有可用羥基之咪唑或三唑胺基甲酸酯部分及具有羧酸之醯基咪唑或醯基三唑部分。添加蛋白載體(於DMSO中)導致由離胺酸使咪唑或三唑親核性位移且形成胺基甲酸酯鍵(對於經活化之羥基)及醯胺鍵(對於經活化之羧酸)。用水溶液將反應溶液稀釋10倍以移除未反應之活化基團，接著藉由透析過濾進行純化。
兩種結合化學作用所產生之CP均共價連接於載體蛋白，此藉由來自尺寸排阻層析之溶離份中存在醣及蛋白及藉由經羥基乙醛封端或經半胱胺鹽酸鹽封端之結合物的胺基酸分析來指示。
由若干批藉由用於兩種莢膜血清型及在20 kDa至40 kDa範圍內之多醣大小之PDPH與CDI/CDT化學作用所製備之結合物的製備獲得之結果之概述展示於下表7中。在游離莢膜多醣、CP：蛋白之比率及藉由此兩種結合方法產生之結合物的產率方面無顯著差異。結合之CP的抗原性未如結合物與天然CP之間的特性沈澱線所描繪因結合而改變。
表7：藉由兩種結合化學作用所製備之SACP5-CRM 197 及CP8-CRM 197 的表徵
如以上所示，本文所述之方法可用於製造特定範圍之所需高分子量莢膜多醣。此研究之目的在於由可為用於免疫原性組合物中之經過濾及純化之CP的預選範圍之高分子量製備結合物。在此實例中，選擇CP5莢膜多醣之分子量範圍為約90 kDa至約120 kDa的8個批次且使用三唑(CDT)活化來進行結合。參見表8。所得結合物之分子量範圍為1533 kDa至2656 kDa。每個CRM197 所結合之離胺酸的數目範圍為最大值22至最小值15。游離莢膜多醣之範圍為最大值18%至最小值11%。參見表8。
表8：具有預選MW範圍之CP5的結合物
表9概述CP8結合物之分析，其中CP8莢膜多醣之分子量範圍為約87 kDa至113 kDa且使用咪唑結合化學作用。所得結合物之分子量範圍為595 kDa至943 kDa。每個CRM197 所結合之離胺酸的數目範圍為最大值9至最小值3。游離莢膜多醣之範圍為最大值6%至最小值2%。參見表9。
表9：具有預選MW範圍之CP8的結合物
兩種結合化學作用使得CP共價連接於載體蛋白。在游離莢膜多醣、CP：蛋白之比率及藉由此兩種方法產生之結合物的產率方面無顯著差異。
實例5：ClfA之多肽片段N1、N2及N3的序列多樣性
在此實例中，評估來自獲自各種來源之致病分離株之ClfA多肽片段N1、N2及N3的蛋白質序列異質性。自與多種疾病狀況相關之金黃色葡萄球菌菌株對ClfA基因測序。自Genbank獲得其他菌株之序列資訊以自相關菌株產生序列。表10列舉不同ClfA序列。
來自金黃色葡萄球菌之不同致病菌株之ClfA蛋白的序列比對展示於圖8A-8E中。使用MUSCLE比對蛋白質序列。參見Edgar,R.C. Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797(2004)。使用SHOWALIGN呈現比對。參見Rice,P.等人，「EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite」Trends in Genetics,16(6): 276-277(2000)。許多序列重複出現多次而無變異。為了清楚起見，僅將各獨特序列置於比對中一次。參見圖8A-8E。序列表中僅包括獨特序列。舉例而言，自多個不同菌株獲得ClfA_001之蛋白質序列而無變異。參見圖8A-8E。亦可自表10獲得任何序列之序列表編號：ClfA菌株及序列表。表10列舉一個含有此相同ClfA_001蛋白質序列之實例菌株。此序列展示於圖8A-8E中之第一列比對中。此ClfA抗原之獨特序列的比對指示多態現象分佈於ClfA之整個A區(N1-N2-N3)中。在一些情況下，對於ClfA之任何既定獨特蛋白質序列，發現編碼同一蛋白質之一種以上核苷酸序列。序列表及表10中僅包括最常出現之DNA序列。對於ClfA，本文中揭示以下序列且該等序列未在GenBank中發現：ClfA_003、ClfA_005、ClfA_008、ClfA_009、ClfA_013、ClfA_014、ClfA_015、ClfA_016、ClfA_017、ClfA_018、ClfA_019、ClfA_020、ClfA_021、ClfA_022、ClfA_023及ClfA_024。
表10：ClfA菌株及序列表
檢查ClfA蛋白序列之系統發生且構建系統樹。使用ClustalW比對序列。參見Chenna R,Sugawara H,Koike T等人，Nucleic Acids Research. 31(13):3497-3500(2003)。將鄰接樹自引導1000次且用MEGA 4.0呈現。參見Tamura K等人，Molecular Biology ＆ Evolution. 24(8):1596-1599(2007)。分支上指示之自引導值為在1,000次試驗中分支再現之次數。小於500(50%再現性)之值被視為支持不足。
ClfA序列形成具有2個主要分支之樹。參見圖9。此兩組之分離在系統發生中獲得充分支持。一個分支(頂部)包括9個序列，其彼此相當密切地相關(96-99%一致性)，但與候選序列clfA_011之相關性較遠，其與該候選序列之一致性為91-92%。包括clfA_011之第二組更具多樣性且此組之系統發生亦未獲得支持。此等蛋白質序列彼此之一致性範圍為93-99%。
實例6：ClfB之多肽片段N1、N2及N3的序列多樣性
在此實例中，評估來自獲自各種來源之92個致病分離株之ClfB N1、N2及N3多肽片段的蛋白質序列異質性。自與多種疾病狀況相關之金黃色葡萄球菌菌株對ClfB基因測序。參見表11。自Genbank獲得其他菌株之資訊以產生其他序列。
來自金黃色葡萄球菌之不同致病菌株之ClfB蛋白的序列比對展示於圖10A-10E中。使用MUSCLE比對蛋白質序列。參見Edgar,R.C. Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797(2004)。使用SHOWALIGN呈現比對。參見Rice,P.等人，「EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite」Trends in Genetics,16(6): 276-277(2000)。參見圖10A-10E ClfB比對。如同ClfA，許多序列重複出現多次而無變異。為了清楚起見，僅將各獨特序列置於比對中一次。參見圖10A-10E。序列表中僅包括獨特ClfB序列。舉例而言，自多個不同菌株獲得ClfB_006之序列而無變異。此序列展示於圖10A-10E中之第一列比對中。亦可自表11獲得任何序列之序列表編號。此ClfB抗原之代表性獨特序列的比對指示多態現象分佈於ClfB之整個A區(N1-N2-N3)中。類似於ClfA，對於ClfB之任何既定獨特蛋白質序列，發現編碼同一蛋白質之一種以上核苷酸序列。序列表及表11中僅包括最常出現之DNA序列。對於ClfB，本文中揭示以下序列且該等序列未在GenBank中發現：ClfB_001、ClfB_004、ClfB_005、ClfB_010、ClfB_011、ClfB_013、ClfB_014、ClfB_015、ClfB_016、ClfB_017、ClfB_018、ClfB_019、ClfB_020、ClfB_021、ClfB_022、ClfB_023及ClfB_024。系統樹展示於圖11中。
表11：ClfB菌株及序列表
實例7：金黃色葡萄球菌之致病純系中之MntC的序列多樣性
在此實例中，評估來自獲自各種來源之104個致病分離株之MntC基因的蛋白質序列異質性。自與多種疾病狀況相關之金黃色葡萄球菌菌株對MntC基因測序。參見表12。自Genbank獲得其他菌株之資訊以產生菌株序列。
來自金黃色葡萄球菌之不同致病菌株之MntC蛋白的序列比對展示於圖12A-12B中。使用MUSCLE比對蛋白質序列。參見Edgar,R.C. Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797(2004)。使用SHOWALIGN呈現比對。參見Rice,P.等人，「EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite」Trends in Genetics,16(6):276-277(2000)。參見圖12。如同ClfA，許多序列重複出現多次而無變異。為了清楚起見，僅將各獨特序列置於比對中一次。參見圖12。序列表中僅包括獨特MntC序列。舉例而言，自不同菌株獲得MntC_001之序列而無變異。參見圖12。此序列展示於圖12中之第一列比對中。亦可自表12獲得任何序列之序列表編號。序列表中僅包括最常見之相應DNA序列。對於MntC，本文中揭示以下序列且該等序列未在GenBank中發現:MntC_002、MntC_006、MntC_007、MntC_008及MntC_009。
表12:MntC菌株及序列表
實例8：在感染期間活體內ClfA、CP5、CP8及MntC之表面表現
金黃色葡萄球菌導致引起各種人類感染。因此，細菌必須藉由感染所需之毒性因子的差異表現而適應不同的環境小生境。在三種活體內齧齒動物檢驗中研究標靶抗原之表現以評估其在感染期間之表現：量測初始感染部位處抗原表現之創口模型、監測血液中抗原表現之菌血症模型及監測在營養物/氧氣有限條件期間抗原表現之留置腔室模型。對於所有此等模型，均用細菌在研究部位對齧齒動物攻毒。感染後，在各時間點收集細菌且使用免疫螢光顯微術(創口及菌血症)或流動式細胞測量術(腔室)評估抗原表現(ClfA、CP5、CP8、MntC)。
材料及方法 在創口模型中之表現
創口感染實驗由每組5隻動物且最多5組組成，每次實驗最多25隻動物。對6至8週(wk)齡C57BL/6雄性小鼠進行手術以將縫合線環埋入大腿肌肉切口中。此舉提供用於細菌附著之外來身體基質且顯著降低製造葡萄球菌創口感染所需之最小感染劑量。將5 μL金黃色葡萄球菌或無菌生理食鹽水引入切口中至4-0絲之深組織縫合線下方。用4-0普羅綸(Prolene)縫合線或手術黏著劑(例如氰基丙烯酸酯)使皮膚閉合。在感染後30分鐘與10天之間的時間點使動物安樂死且切除大腿肌肉，均質化並對細菌計數。藉由免疫螢光(IF)共焦顯微術分析感染所見細菌之抗原表現。
在菌血症模型中之表現
在第0、3及6週，藉由皮下注射，用1 μg蛋白質或CP結合物使各組(每組10隻)4週齡CD-1或Balb/C小鼠免疫。在第0週及第8週將動物放血，隨後用在TSB中生長至對數晚期之金黃色葡萄球菌經腹膜內攻毒。攻毒後3小時，使動物安樂死且收集血液以用於IF共焦顯微術。
在留置透析管模型中之表現
在37℃下使金黃色葡萄球菌分離株在TSA培養板上生長隔夜。自該等培養板刮落細菌且使其再懸浮於無菌PBS中，並將OD600 調節至1，每毫升約109 個群落形成單位(cfu)。將細菌稀釋至103 cfu/mL之濃度且接種至透析管中。將懸浮液之等分試樣塗板以測定cfu之實際數目。藉由在70%乙醇中滅菌30分鐘，隨後用無菌水、接著無菌生理食鹽水充分沖洗來準備具有3.5 kDa MWCO之透析管以用於植入。將細菌懸浮液之2 mL等分試樣轉移至透析管中，藉由打結使袋子閉合，接著用無菌生理食鹽水充分沖洗。使雄性Sprague Dawley大鼠(6週齡)麻醉且沿背部中線切開2-3 cm切口。藉由輕輕地將皮膚與下層組織分離而在切口部位形成凹穴。將管植入凹穴中且使用外科短纖使皮膚閉合。24小時後，使大鼠安樂死，移出管，且回收細菌以用於流動式細胞測量分析。
免疫螢光顯微術(IF)
將來自5隻小鼠之血液彙集至冰冷檸檬酸鈉(pH 7.0)(最終濃度為0.4%)中。用1% NP-40(Pierce Biotechnology)溶解真核細胞。用PBS洗滌細菌且在4℃下與兔子免疫或免疫前血清(1:100)一起培育隔夜，並用結合ALEXA488之山羊-α-兔子抗體(1:250，Invitrogen)進行偵測。在載玻片上乾燥經標記之細菌且用Vectashield HardSet培養基(Vector Laboratories,Inc.)封埋蓋玻片。由Leica TCS SL光譜共焦顯微鏡(Leica Microsystems)獲得影像。
流動式細胞測量分析
如大鼠透析管模型程序中所述使金黃色葡萄球菌分離株生長。在冰上，用染色緩衝液(含有10%山羊血清之亨克氏平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution))阻斷約107 個細菌細胞，歷時1小時。在10,000 rpm下將細菌細胞離心5分鐘，移除上清液，且將細胞與小鼠抗體或同型對照抗體一起在冰上培育30分鐘。接著洗滌細胞且在冰上用結合FITC之山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)染色30分鐘。用染色緩衝液洗滌細菌，用2%三聚甲醛固定且使用FACS Caliber流式細胞儀及Cell quest軟體(Becton,Dickinson and Co.)獲得及分析資料。對於各樣品，收集總共30,000個結果。
表13a：金黃色葡萄球菌第5型CP分離株之抗原表現概況。
表13b：金黃色葡萄球菌第8型CP分離株之抗原表現概況。
表13c：在留置透析管中之金黃色葡萄球菌抗原的表現。陽性細胞之出現率(總%)
結果
針對感染期間ClfA、CP5、CP8或MntC在金黃色葡萄球菌細胞表面上之表現測試19個金黃色葡萄球菌分離株之組合(表13a、13b及13c)。此等分離株包括近來發現在臨床上相關之菌株且如藉由MLST所監測具有多樣性。抗原表現視菌株、時間點及感染模型而定。不同活體內環境(血流相對於創口)中之分離株之間的抗原表現變化支持使用多抗原免疫原性組合物在各種不同感染中誘導廣泛覆蓋範圍之葡萄球菌分離株。抗原在感染之最初24小時內於表面表現且因此為抗葡萄球菌免疫原性組合物之有效組分。蛋白抗原ClfA及MntC在莢膜表現存在下易染色，指示莢膜之存在不會遮蔽蛋白免受針對其之抗體影響。
大部分所測試之第8型分離株在血液中不表現CP直至攻毒後之稍後時間點(大於4小時)(參見表13a-c)。此等結果說明在金黃色葡萄球菌中CP經區別調節，視活體內微環境(亦即感染部位)而定。此等結果可解釋在動物模型中對於CP8結合物所報導之不一致功效結果。
活體內表現結果表明單一抗原免疫原性調配物不會提供針對大多數金黃色葡萄球菌感染之廣泛覆蓋範圍。在活體內微環境中，個別菌株之表現表型的多樣性過高。因此，需要由一種以上抗原組成之免疫原性組合物來預防金黃色葡萄球菌疾病。
實例9：含有ClfA、CP5-CRM 197 及CP8-CRM 197 結合物之多抗原調配物的免疫原性
在此實例中，評估ClfA、CP5-CRM197 及CP8-CRM197 之組合的免疫原性。
A.　雙抗原(CP5-CRM 197 /CP8-CRM 197 )免疫原性組合物調配物-在兔子體內劑量對抗莢膜抗體反應之影響
在此實例中，評估在兔子體內組合之CP5-CRM197 及CP8-CRM197 免疫原性調配物之劑量對免疫原性的影響。在第0、3及6週，用藉由皮下注射投與之二價結合物加上125 μg AlPO4 使兔子免疫。在此研究中評估之劑量為各0.1 μg、1 μg或10 μg之CP5-CRM197 及CP8-CRM197 (最終組合之CP-CRM197 劑量為0.2 μg、2 μg及20 μg)。結合物之劑量反映蛋白多醣結合物之總多醣組分。在第0、3、6及8週將兔子放血。對彙集之血清及個別血清進行ELISA。0.1 OD405 下之稀釋度倒數即定為終點抗體效價。對個別第8週效價進行統計學分析。結果說明藉由對兔子接種各組分為1 μg CP劑量之二價免疫原性調配物來誘導對於CP5為5×105 及對於CP8為1×106 之最高CP5及CP8特異性抗體效價(數據未顯示)。
B.　三抗原調配物(CP5-CRM 197 +CP8-CRM 197 + rClfA)-在兔子體內使用固定劑量(1 μg)之各結合物的rClfA劑量範圍研究
測試rClfA與CP5及CP8結合物之組合對針對各組分之免疫反應的影響。用二價金黃色葡萄球菌CP5-CRM197 +CP8-CRM197 (各結合物為1 μg劑量)與T7-ClfA(N1N2N3)之組合以三種不同劑量1 μg、10 μg及100 μg使三組免疫。用未結合之CP5及CP8(各50 μg)與100 μg T7-ClfA(N1N2N3)之組合使對照組免疫。各免疫原性組合物與500 μg佐劑AlPO4 一起調配。藉由在頸部進行皮下注射來投與免疫原性組合物。在第0、6及8週將兔子放血。對彙集之血清及個別血清進行ELISA且0.1 OD405 下之稀釋度倒數即定為終點抗體效價。
結果顯示當與二價結合物組合時，rClfA之量增加不會影響莢膜抗體反應。針對兩種莢膜血清型之抗體含量在與僅用二價結合物免疫之兔子相同的範圍內(數據未顯示)。針對CP5及CP8之抗體含量在10 μg(103 K)及100 μg(106 K)劑量下為1 μg劑量之rClfA(273 K)的2/5。在第二次及第三次注射後存在加強免疫作用。未結合之二價多醣免疫原性調配物(CP5+CP8，各50 μg)與100 μg rClfA之組合並不誘導CP特異性抗體。rClfA特異性抗體反應亦不受劑量極大影響，其中在1 μg、10 μg及100 μg劑量之三種劑量後效價介於1×105 與1×106 之間(數據未顯示)。又，當與結合或未結合之CP5及CP8多醣一起投與時，所達成之抗ClfA反應程度為類似的。
實例10：三抗原調配物-具有高免疫前CP5、CP8及ClfA Ab效價之兔子體內的免疫原性
葡萄球菌免疫原性組合物之目標為具有針對金黃色葡萄球菌表面組分之預先存在抗體的成年群體。為研究針對免疫原性調配物組分之預先存在抗體對針對免疫原性調配物之反應的影響，選擇具有高效價之天然獲得之抗CP5、抗CP8及抗ClfA抗體效價的兔子。在第0、3及6週，用三抗原免疫原性調配物(CP5-CRM197 (1 μg)及CP8-CRM197 (1 μg)及T7-ClfA(N1N2N3)Y338A(10 μg))使兩組兔子(n=6/7)免疫。用與作為佐劑之500 μg AlPO4 一起調配之免疫原性組合物使一組免疫且用不含有佐劑之免疫原性組合物調配物使第二組免疫。藉由皮下注射投與免疫原性組合物。在第0、3、6及8週將兔子放血。藉由ELISA，將彙集之血清及個別血清的終點抗體效價(測定為0.1 OD405 下之稀釋度倒數)即定為CP5、CP8及rClfA之抗體效價。
結果顯示具有藉由天然感染誘導之預先存在抗體效價的兔子對三價免疫原性調配物作出反應，其中針對所有免疫原性調配物組分CP5、CP8及rClfA之抗體含量均增加。在抗體效價為1×106 之動物中甚至顯示針對各抗原之Ab含量增加5倍至10倍。與在無佐劑情況下經免疫之組相比，免疫原性調配物中佐劑之存在會導致較高抗體效價(數據未顯示)。
實例11：佐劑對針對莢膜多醣組分之反應的影響
A.　在兔子體內兩種不同劑量之AlPO 4 對針對二價CP5-CRM 197 /CP8-CRM 197 結合物免疫原性組合物之反應的影響
研究在兔子體內佐劑AlPO4 之劑量對抗CP5及CP8反應的影響。在第0、3及6週，用二價金黃色葡萄球菌CP5-CRM197 +CP8-CRM197 (各結合物為1 μg劑量)使兔子免疫。用與作為佐劑之125 μg AlPO4 一起調配的免疫原性組合物使一組(每組n=5)免疫且用與作為佐劑之500 μg AlPO4 一起調配的免疫原性組合物使第二組免疫。藉由在頸部進行皮下注射來投與免疫原性組合物。在第0、6及8週將兔子放血且藉由ELISA測定抗莢膜抗體，0.1 OD405 下之稀釋度倒數即定為終點抗體效價。結果指示，在用125 μg或500 μg AlPO4 免疫之兔子體內CP8特異性抗體反應無差異。具有125 μg佐劑之調配物產生較高CP5抗體反應。又，125 μg組中之所有兔子均作出較高CP5抗體反應，而在500 μg佐劑組中，兩隻兔子對調配物作出低反應。
B .　AlPO 4 對三抗原調配物之免疫原性的影響
在第0、3及6週，用包含CP5-CRM197 (1 μg)及CP8-CRM197 (1 μg)及T7-ClfA(N1N2N3)Y338A(10 μg)之三抗原調配物使兔子(NZW，每組n=6/7隻兔子)免疫。用具有500 μg AlPO4 之免疫原性調配物使一組兔子免疫，用無佐劑之調配物使第二組免疫，在第0週用具有500 μg AlPO4 之免疫原性調配物使第三組免疫且在第3週及第6週用無佐劑之免疫原性調配物使第三組免疫。藉由皮下注射投與免疫原性調配物，在第0、3、6及8週將兔子放血且藉由抗原特異性ELISA評估血清。結果顯示在兔子體內免疫原性調配物中佐劑之存在對抗CP5或抗CP8反應無影響(資料未顯示)。Ab對兩種莢膜之GMT效價為類似的。然而，在用所有三種疫苗接種中均存在之佐劑免疫的各組中，顯示佐劑對ClfA特異性抗體反應存在影響。與不使用佐劑之組相比，對用含有佐劑之免疫原性調配物初始免疫的兔子用不含AlPO4 之免疫原性調配物進行第二次及第三次加強免疫會產生較高ClfA反應。
實例12-29：金黃色葡萄球菌ClfA、MntC、CP5-CRM 197 及CP8-CRM 197 之臨床前評估：
以下實例12至29中描述CP5及CP8結合物、ClfA及MntC之臨床前評估的結果。該等實例說明在臨床前動物模型中此等抗原之功效。實例亦說明由CP結合物、ClfA及MntC產生之抗體在活體外檢驗中具有功能活性。
使用兩種不同的化學作用使CP結合於CRM197 ，但未觀察到與藉由不同方法製備之結合物的功效存在差異。顯示莢膜多醣之O-乙醯化影響引發功能性抗體。對包含CP5-CRM197 、CP8-CRM197 及ClfA之組合之免疫原性組合物進行的評估顯示，對針對各免疫原性調配物組分之特異性抗體(Ab)含量無干擾。
材料及方法
ELISA
在4℃下用含1 μg/mL ClfA抗原之PBS(pH 7.5)塗佈Maxisorp微量滴定ELISA培養板(Nalge Nunc International,Rochester,NY)18小時，或在37℃下塗佈90分鐘。用PBST(1×PBS、0.1%聚山梨醇酯20)洗滌該等培養板5次且在室溫下用含1%(w/v)脫脂奶之PBS及0.05%聚山梨醇酯20阻斷1小時。用PBST洗滌培養板，連續稀釋(3倍)且將個別第0、3、6及8週兔子抗血清添加至培養板中，並在4℃下培育隔夜或在37℃下培育2小時。洗滌培養板，且用含結合辣根過氧化酶之山羊抗兔子IgG(1:1000稀釋液)的PBST偵測結合之初級抗體。在37℃下培育培養板1小時，接著洗滌且在室溫下用ABTS-過氧化酶受質溶液(KPL,Inc.,Gaithersburg,MD)顯色約20分鐘。藉由添加1%(v/v)SDS溶液中止反應。在自動讀板器(Molecular Devices Corporation,Sunnyvale,CA)中在405 nm下量測吸光度。抗體效價以吸光度值為0.1之情況下最高血清稀釋度的倒數表示。使用利用JMP軟體(SAS Institute,Cary,NC)之Student氏t-測試測定不同組之間的抗體效價差異。認為小於0.05之機率指示統計學顯著差異。
鼠類敗血症模型
鼠類敗血症模型模擬血液媒介疾病。對於被動免疫，用IgG經腹膜內(i.p.)處理各組(每組15隻)瑞士-韋伯斯特小鼠。24小時後，藉由單一靜脈內(i.v.)注射(0.1 ml)，經由尾部靜脈用金黃色葡萄球菌659-018對小鼠攻毒。追蹤所有動物歷時14至15天，此時處死所有剩餘小鼠。
對於主動免疫，在第0、2及4週用抗原使小鼠免疫且在第6週藉由靜脈內途徑用金黃色葡萄球菌攻毒。
主動免疫兔子心內膜炎模型
用25 μg抗原經肌肉內使成年新西蘭白兔(New Zealand White rabbit)免疫4次。手術後一天，用金黃色葡萄球菌之單次劑量經靜脈內對動物攻毒且攻毒後24小時測定心臟組織中群落形成單位(cfu)之數目。
鼠類菌血症
使用3小時菌血症模型判定疫苗接種對感染早期細菌數目之影響。在第0、3及6週用抗原使小鼠免疫，隨後在第8週用金黃色葡萄球菌經腹膜內攻毒。3小時後對動物抽血且將血液之連續稀釋液塗板以對細菌計數。
鼠類腎盂腎炎模型
鼠類腎盂腎炎模型模擬來自菌血症之金黃色葡萄球菌的傳播。在第0、3及6週，用抗原使各組(每組10隻)4週齡雌性CD-1小鼠免疫。藉由腹膜內注射金黃色葡萄球菌對小鼠攻毒。攻毒後48小時，處死小鼠且對腎及血液中之細菌計數。
大鼠心內膜炎模型
大鼠心內膜炎模型模擬人類心內膜炎，其中在血液媒介感染導致對受損心臟組織之定殖後出現定殖。在第0、2及4週，用與100 μg AlPO4 一起調配之1 μg CP5-CRM197 結合物使5隻5週齡雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River,Kingston,NY)免疫。在第0週及在第5週結束時，在疫苗接種之前將動物放血。72小時後，以手術方式將導管(PE-10管)穿過頸動脈置於心臟之左心室中。置放導管導致形成無菌增殖體，葡萄球菌可在感染後附著於該增殖體。為預防由手術程序引起之感染，在手術時及手術後8小時用抗生素Baytril(5 mg/kg)處理動物。手術後48小時，藉由腹膜內注射，用PFESA0266(約4×108 cfu)或SA315(約1×109 cfu)對大鼠攻毒。攻毒後48小時，使大鼠安樂死且移出心臟及腎，並置於3 mL磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)中。接著用組織均質機(Kinematica AG,Luzernerstrasse,Germany)使器官均質化且用PBS加至10 mL。接著連續稀釋勻漿且塗板以用於細菌計數。
使 用調理吞噬殺滅檢驗監測功能性抗體
按照製造商之方案，由使用LYMPHOLYTE-poly溶液(Cedarlane laboratories limited,Ontario,Canada)自供體人類血液分離之細胞株(例如HL60)或多形核細胞(PMN)分化的效應細胞可用於此檢驗中。將效應細胞以每毫升約2×107 個細胞再懸浮於檢驗緩衝液(含有1%牛血清白蛋白的經改良之伊格爾培養基(Modified Eagle's media))中且置於37℃恆溫箱中直至準備使用為止。使金黃色葡萄球菌菌株PFESA0266在胰蛋白酶大豆瓊脂培養板上生長隔夜。刮落細菌細胞，洗滌兩次且再懸浮於含有5%甘油之檢驗緩衝液中至OD600 =1，其相當於約5×108 cfu/ml之濃度。將細菌懸浮液之1 ml等分試樣冷凍及儲存於-40℃下直至準備使用為止。解凍經冷凍之細菌懸浮液且用檢驗緩衝液調節至106 cfu/ml之濃度，並置於冰上。使用無菌96孔深孔1 ml聚丙烯培養板進行檢驗。製備抗體樣品之兩倍連續稀釋液(50 μl)且隨後將300 μl檢驗緩衝液添加至抗體混合物中。將細菌(50 μl)添加至培養板中且在4℃下置於旋轉震盪器上歷時30分鐘。在調理步驟之後添加50 μl人類補體(1%最終濃度)。最後，將50 μl效應細胞(濃度為每毫升107 個細胞)添加至培養板中且藉由用移液管重複吸取而使懸浮液充分混合。用無菌1%皂苷溶液將懸浮液之50 μl等分試樣連續稀釋10倍，渦旋以使細菌凝集減至最少且一式兩份塗於胰蛋白酶大豆瓊脂上。在37℃下培育檢驗培養板1小時，同時使用烤肉器式震盪器連續混合。在培育結束時，用無菌1%皂苷溶液將懸浮液之50 μl等分試樣連續稀釋10倍，藉由渦旋使其混合以使細菌凝集減至最少且一式兩份塗於胰蛋白酶大豆瓊脂上。藉由測定60分鐘時具有細菌、抗體、補體及效應細胞之孔中存活的cfu數目與無抗體但含有細菌、補體及效應細胞之管中存活的cfu數目之比率來計算殺滅百分比。包括含有細菌、補體及血清之對照組以對由凝集引起之任何cfu降低作出調節。
補體吸附
來自人類供體之針對金黃色葡萄球菌菌株PFESA0266、PFESA0286及PFESA0270所吸附的血清可用作檢驗中之補體來源。在37℃下使金黃色葡萄球菌菌株在TSA培養板上生長隔夜。自培養板刮落細胞且使其再懸浮於無菌PBS中。在4℃下在10,000 rpm下離心細菌細胞10分鐘且將細胞小球再懸浮於人類血清中以供吸附用。在4℃下將血清與細菌一起於章動器上培育30分鐘。離心細胞，將血清轉移至另一含有細菌之管中且再次重複吸附步驟歷時30分鐘。最後，離心細胞且使血清通過0.2微米過濾器，隨後在液氮中冷凍0.5 ml等分試樣。
方法II-使用HL-60細胞之OPA
根據S. Romero-Steiner等人，Clin Diagn Lab Immunol 4(4)(1997)，第415-422頁，使HL-60細胞分化。將收集之HL-60細胞以每毫升約108 個細胞再懸浮於檢驗緩衝液(含有1%牛血清白蛋白之經改良之伊格爾培養基)中且置於37℃恆溫箱中直至準備使用為止。使金黃色葡萄球菌在胰蛋白酶大豆瓊脂培養板上生長隔夜。刮落細菌細胞，洗滌兩次且再懸浮於含有5%甘油之檢驗緩衝液中至OD600 =1，其相當於約5×108 cfu/ml之濃度。將細菌懸浮液之1 ml等分試樣冷凍及儲存於-40℃下直至準備使用為止。解凍經冷凍之細菌懸浮液且用檢驗緩衝液調節至106 cfu/ml之濃度，並置於冰上。使用無菌96孔深孔1 ml聚丙烯培養板進行檢驗。製備單株抗體樣品之兩倍連續稀釋液(25 μl)且隨後將150 μl檢驗緩衝液添加至抗體懸浮液中。將細菌(25 μl)添加至培養板中且在4℃下置於旋轉震盪器上歷時30分鐘，隨後添加25 μl人類補體(1%最終濃度)。最後，將25 μl HL-60細胞(每毫升107 個細胞)添加至培養板中且藉由用移液管重複吸取而使懸浮液充分混合。用無菌1%皂苷溶液將懸浮液之25 μl等分試樣連續稀釋10倍，藉由渦旋使其混合以使細菌凝集減至最少且一式兩份塗於胰蛋白酶大豆瓊脂上。在37℃下培育檢驗培養板1小時，同時使用烤肉器式震盪器連續混合。在培育結束時，用無菌1%皂苷溶液將懸浮液之25 μl等分試樣連續稀釋10倍，藉由渦旋使其混合且一式兩份塗於胰蛋白酶大豆瓊脂上。藉由測定60分鐘時具有細菌、抗體、補體及HL-60細胞之孔中存活的cfu數目與無抗體但含有細菌、補體及HL-60細胞之管中存活的cfu數目之比率來計算殺滅百分比。包括含有細菌、補體及mAb之對照組以對由凝集引起之任何cfu降低作出調節。
實例12：在活體內動物模型中證實ClfA之保護作用
為評估在鼠類敗血症模型中針對ClfA引發之多株兔子抗體是否能夠降低金黃色葡萄球菌群落計數，在被動免疫研究中使用兩種劑量(0.8 mg及1.6 mg)之經純化兔子多株抗ClfA IgG(圖13)。金黃色葡萄球菌攻毒菌株為新近發現之臨床分離株659-018。在鼠類敗血症模型中，兩種抗體劑量皆使細菌群落計數顯著降低(對於1.8 mg劑量，p=0.0134且對於0.8 mg劑量，p=0.0013)。此實驗已用其他金黃色葡萄球菌分離株進行重複，得到類似結果(資料未顯示)。
實例13：用ClfA主動免疫可減少金黃色葡萄球菌對心臟之定殖
在兔子心內膜炎模型中，用ClfA使兔子主動免疫可產生保護作用。發現與用陰性對照組(PBS或AlPO4 )免疫之動物相比，對於用ClfA免疫之動物，自心臟增殖體回收之金黃色葡萄球菌cfu降低log 3-4(圖14)。
實例14：在活體內動物模型中MntC之保護作用
用MntC主動免疫已顯示在金黃色葡萄球菌攻毒後之早期時間點對小鼠提供持續保護。與用PBS免疫之對照組相比，接受腹膜內金黃色葡萄球菌攻毒之小鼠血液中的細菌計數顯著降低(圖15A及15B)。6項個體研究中有4項研究顯示在經免疫之動物的血液中顯著降低(以cfu/ml計)。使用2個不同的金黃色葡萄球菌攻毒菌株PFESA0237(圖15A)及PFESA0266(圖15B)來證實由MntC免疫介導之保護作用。
實 例15：在鼠類腎盂腎炎模型中CP5結合物具有保護作用
評估在主動免疫腎盂腎炎模型中CP5結合物保護小鼠之能力。圖16展示若干研究之結果。與用pbs免疫之對照組相比，接受腹膜內金黃色葡萄球菌攻毒之小鼠血液中的細菌計數顯著降低(圖16)。6項個體研究中，6項研究均顯示在經免疫之動物的腎中顯著降低(以cfu/ml計)。資料顯示在用CP5結合物主動免疫後腎定殖持續減少。
實例16：藉由不同結合化學作用製備之CP5結合物保護小鼠免受實驗性感染
在鼠類腎盂腎炎模型中進行之主動免疫研究係使用藉由PDPH或CDT化學作用製備之CP5結合物來進行。上文描述使CP5或CP8結合於CRM197 之方法。結果顯示與假免疫之動物相比，兩種結合物皆顯著減少小鼠體內之定殖(表14)。
表14：在腎盂腎炎模型中PDPH相對於CDT結合之作用
實例17：在大鼠心內膜炎模型中CP5結合物具有保護作用
用1 μg劑量之CP5-CRM197 PDPH結合物及無關結合物(PP5-CRM197 )進行四項研究。在攻毒第5型攻毒菌株為PFESA0266之3個實驗中的2個實驗中，CP5結合物顯著減少心臟及腎中之定殖(表15)。在第三項研究中，幾何平均效價(GMT)抗CP5效價在三個實驗中為最低，但其僅略低於先前實驗中之效價(51,000相對於67,000)。
表15：在大鼠心內膜炎模型中CP5-CRM 197 免疫降低cfu
實例18：在腎盂腎炎模型中之CP5-CRM 197 結合物
用25 kDa MW CP5進行研究結合物功效之初始研究。改良醱酵方法使得產生高MW多醣，其結合於蛋白載體且與25 kDa CP5結合物一起進行測試。使用CDT結合化學作用製備包含MW為25 kDa(低MW)及300 kDa(高MW)之CP的結合物且在鼠類腎盂腎炎模型中進行評估。測試三種劑量(0.01 μg、0.1 μg及1 μg)之HMW結合物且與1 μg劑量之對照LMW CP5-CRM197 及無關結合物(PP5-CRM197 )作比較。結果顯示在1 μg劑量下自腎回收之金黃色葡萄球菌PFESA0266的CFU顯著降低。在1 μg劑量下用不同大小CP5製備之結合物的保護作用無統計學差異(表16)。較低劑量(0.01 μg及0.1 μg)之結合物無法引發足以顯著減少感染之免疫反應。使用相同的免疫及攻毒程序重複實驗。在重複實驗中，僅1 μg劑量之LMW CP5-CRM197 使得定殖顯著減少(p=0.01)。1 μg劑量之HMW CP5-CRM197 降低腎中之cfu，然而該降低無統計學顯著性(p=0.056)。
表16：在小鼠腎盂腎炎模型中CP5結合物具有保護作用。
實例19：多醣O-乙醯化對於誘導針對CP5結合物免疫原性調配物之保護性抗體反應很重要
為評估CP5之O-乙醯化的重要性，使天然CP5去O-乙醯化(dOAc)且使用PDPH結合化學作用結合於CRM197 (dOAc-CRM197 )。在鼠類腎盂腎炎模型中，將dOAcCP-CRM197 結合物之功效與CP5-CRM197 一起作比較。結果顯示無O-乙醯基之結合物(dOAcCP5-CRM197 )在此模型中並不有效，如藉由腎中之細菌定殖無顯著變化所證實。此等數據(表17)指示O-乙醯化對於引發針對CP5之功能性抗體很重要。
表17：用去O-乙醯化之CP5-CRM 197 免疫並不保護小鼠免受腎定殖
實例20：在敗血症模型中用CP8-結合物免疫可減少死亡
在鼠類敗血症模型中，在用金黃色葡萄球菌PFESA0268(第8型)攻毒後評估CP8-CRM197 結合物之功效。藉由皮下注射，用皆與100 μg AlPO4 一起調配之1 μg CP8-CRM197 及生理食鹽水使瑞士韋伯斯特小鼠(n=30)主動免疫。研究顯示與用單獨AlPO4 免疫之小鼠相比，敗血症顯著減少(p=0.0308)。參見圖17。
實例21：在鼠類菌血症模型中評估結合之天然CP8及經鹼處理之CP8
在結合以誘導功能性抗體反應之前，評估天然CP8上存在之O-乙醯基對於CP8結合物的重要性。在適度鹼性條件下使CP8多醣去O-乙醯化且NMR與離子層析法(IC)皆證實去O-乙醯化之CP8-CRM197 中不存在O-乙醯化。
使用鼠類菌血症模型評估結合於CRM197 之天然CP8相對於經鹼處理之CP8的功效。在第0、3及6週，用1 μg去O-乙醯化之CP8-CRM197 或1 μg O-乙醯化之CP8-CRM197 使各組雌性BALB/c小鼠(每組15隻)免疫。用22 μg AlPO4 調配免疫原性調配物。用金黃色葡萄球菌PFESA0003對動物攻毒。攻毒後3小時，處死小鼠且對血液中之細菌計數。數據顯示自用未經處理之天然CP8結合物免疫之動物的血液回收之細菌cfu存在統計學顯著(p=0.0362)降低，如藉由student t測試所測定(表18)。在用經鹼處理之CP8結合物免疫的動物中，自血液回收之細菌cfu類似於生理食鹽水對照組。
表18：CP8-CRM 197 結合物減少小鼠體內之菌血症金黃色葡萄球菌PFESA0003。
實例22：藉由OPA，使用具有已知特異性之MAb證實O-乙醯化作為CP5之功能性抗原決定基的重要性
評估對於CP5 OAc+(CP5-7-1)、CP5 OAc +/-(CP5-5-1)及CP5 OAc-(CP5-6-1)具有特異性之CP5單株抗體針對第5型菌株PFESA0266之OP殺滅活性(表19)。使用對於CP8 OAc+具有特異性之MAb CP8-3-1作為陰性對照組。結果顯示CP5-7-1 mAb(具有CP5 OAc+特異性)介導殺滅所測試之兩種第5型菌株。又，識別CP5 OAc+與CP5 OAc共有之抗原決定基之mAb CP5-5-1介導殺滅PFESA0266菌株。對於CP5 OAc-多醣上存在之抗原決定基具有特異性之MAb並不介導殺滅PFESA0266菌株。此等結果指示CP5上之O-乙醯基抗原決定基與CP5特異性抗體之功能活性有關。
表19：對於O-乙醯化(+) CP5及O-乙醯化與去O-乙醯化(+/-)CP5具有特異性的mAb針對金黃色葡萄球菌PFESA0266(第5型)具有調理作用。
數據以殺滅百分比形式加以報導且藉由測定60分鐘時具有細菌、抗體、補體及HL-60細胞之孔中存活的cfu數目與無抗體但含有細菌、補體及HL-60細胞之孔中存活的cfu數目之比率來計算。
實例23：針對高及低MW CP5結合物所誘導之小鼠抗體的調理活性
使用金黃色葡萄球菌PFESA0266來比較來自實例18之1μg高分子量及低分子量組的具有高CP5 ELISA效價之小鼠(n=5)的血清之調理活性。OPA結果顯示兩種結合物在小鼠體內皆引發調理性抗體(表20)。易於觀察到高MW結合物引發較高效價調理性抗體。對於5種個別小鼠血清，數據以平均殺滅%±SEM展示。需要抗體如藉由在動物功效模型中殺滅細菌或經由說明抗體殺滅細菌之調理吞噬殺滅檢驗所量測具有功能。功能性殺滅可能無法使用僅監測單獨抗體產生之檢驗來說明，該檢驗並不指示高分子量結合物對於功效之重要性。
表20：LMW與HMW CP5結合物皆引發調理性抗體
實例24：來自用天然CP8結合物及經化學修飾之CP8結合物免疫之小鼠的血清之調理活性
自實例21之研究中選擇具有高CP8效價之小鼠血清(n=5)，使用PFESA0005菌株比較調理活性。OPA結果(表21)顯示僅藉由結合天然CP8所製備之結合物在小鼠體內引發調理性抗體。應注意，去O-乙醯化之CP8結合物在小鼠體內具有免疫原性，但所引發之抗體在此檢驗中不具有調理作用。OPA效價係以觀察到40%殺滅時之稀釋度的倒數加以報導。需要抗體如藉由在動物功效模型中殺滅細菌或經由說明抗體殺滅細菌之調理吞噬殺滅檢驗所量測具有功能。功能性殺滅可能無法使用僅監測單獨抗體產生之檢驗來說明，該檢驗並不指示O-乙醯化對於功效之重要性。
表21：天然CP8相對於去O-乙醯化之CP8-CRM 197 的調理活性
實例25：藉由添加天然CP8來抑制CP8結合物非人類靈長類動物抗血清殺滅第8型菌株
為證實用CP8結合物免疫之非人類靈長類動物之血清中的殺滅活性之特異性，在天然CP8存在下進行檢驗。使用OP方法II，其中存在以下修正。製備抗體樣品之兩倍連續稀釋液(25 μl)且隨後將150 μl(Pn14競爭者)或125 μl(CP8競爭者)檢驗緩衝液添加至抗體懸浮液中。競爭者為經純化之CP8多醣(CP8 poly)且使用無關肺炎球菌多醣(Pn 14 poly)作為對照組。將該等多醣(50 μg)添加至抗體懸浮液中且在4℃下培育培養板30分鐘，同時倒置混合。與多醣一起培育後，將細菌(25 μl)添加至培養板中且在4℃下置於旋轉震盪器上歷時30分鐘，隨後添加25 μl人類補體(1%最終濃度)。結果(表22)顯示反應混合物中天然CP8之存在抑制金黃色葡萄球菌第8型之調理吞噬殺滅。此等結果證實免疫血清之調理吞噬殺滅作用由莢膜特異性Ab介導。
表22：添加CP8多醣可抑制免疫血清對金黃色葡萄球菌之調理吞噬殺滅作用
實例26：天然獲得之針對ClfA的抗體介導金黃色葡萄球菌之調理吞噬殺滅
人類群體天然地曝露於金黃色葡萄球菌且因此具有針對其循環中之細菌的預先存在抗體。親和純化來自人類血清之抗ClfA抗體且評估抗體是否可介導調理殺滅。已顯示針對ClfA之抗體對於金黃色葡萄球菌莢膜多醣具有調理作用(資料未顯示)。使菌株PFESA0266在具有2% NaCl之哥倫比亞培養液(Columbia broth)中生長隔夜。用經ClfA親和純化之人類IgG或經無關抗原親和純化之人類IgG(陰性對照組為鏈球菌SCP蛋白)使細菌經受調理且測試調理活性。在調理吞噬檢驗中以100:1之效應物/標靶比率使用分化之HL-60細胞。作為另一對照組，在實驗中包括CP5 mAb以證實CP5存在於表面上。結果為兩個獨立實驗之平均值。ClfA及CP5特異性抗體介導調理殺滅且SCP特異性(陰性對照組)抗體在此檢驗中無活性。
實例27：CP5-CRM 197 結合物在非人類靈長類動物(NHP)體內引發調理性抗體
為比較NHP體內高分子量CP5相對於低分子量CP5-CRM197 結合物之功能性，用含或不含AlPO4 佐劑之2 μg及20 μg劑量的結合物使各組(每組5隻)猴免疫。該等猴分別在第0天及第28天接受第一次及第二次疫苗接種。測試第0、14、28及42天血液的OP活性。結果概述於表23中。與其他組相比，20 μg HMW結合物具有最高OP效價。又，相較於相應低MW組，在兩種劑量之高MW組中OP陽性猴之出現率較高。此等結果說明在NHP體內，相較於LMW CP5結合物，HMW CP5-CRM197 結合物易於引發較佳OP反應。
表23：用CP5結合物免疫之後NHP血清之OPA。
實例28：與包含低分子量多醣之結合物相比，包含高分子量多醣之莢膜多醣結合物顯示增強之免疫原性。
進行非人類靈長類動物(NHP)研究以評估不同莢膜結合物調配物之免疫原性。在兩種不同劑量(2 μg及20 μg)下測試兩種調配物。第一種調配物由高分子量(HMW)多醣(約130 kD)結合於CRM197 構成。第二種調配物含有低分子量(LMW)多醣(約25 kD)結合於CRM197 。對各組(每組5隻)靈長類動物接種單次劑量之任一疫苗且在疫苗接種之前及疫苗接種後兩週監測免疫效價。OPA效價定義為在OPA檢驗中殺滅40%金黃色葡萄球菌菌株PFESA0266所需之血清的稀釋度。亦藉由ELISA監測抗體效價。與LMW調配物相比，對於HMW疫苗可見增強之活性(表24)，證據為與LMW疫苗相比HMW疫苗之抗體效價升高10倍。接受HMW疫苗之NHP的OPA反應速率亦較高(80%相較於40%)。
表24：與LMW多醣結合物疫苗相比，對於HMW多醣結合物疫苗觀察到增強之免疫原性。
實例29：雙抗原(CP5-CRM 197 及ClfA)調配物-非人類靈長類動物體內之抗體反應
為評估NHP體內針對單次劑量之雙抗原免疫原性組合物(CP5-CRM197 及ClfA)的免疫反應，用未添加AlPO4 之不同劑量的兩種抗原使各組(每組5隻)猴免疫。測試第0、14及28天血液的調理吞噬(OP)活性及ELISA效價且結果概述於表24中。結果顯示與CP5假免疫組相比，對於經CP5免疫之動物始終觀察到OP活性。總體而言，與其他組相比，100 μg組具有最高ELISA及OP效價。對於單獨ClfA組之血清，未觀察到OP殺滅活性。在給與遞增劑量之ClfA或CP5的組中未觀察到干擾。參見表25。
表25：NHP之二價免疫研究的OPA結果
動物模型證實金黃色葡萄球菌CP5及CP8莢膜多醣抗原之潛力
CP5-CRM197 與CP8-CRM197 結合物在小鼠、大鼠、兔子及非人類靈長類動物(NHP)體內皆誘導莢膜血清型特異性抗體反應。在活體外功能性調理吞噬殺滅檢驗中，誘導抗體之結合物具有功能。得到如下資料，說明O-乙醯化對於引發針對CP5與CP8之保護性抗體很重要，且O-乙醯基為針對CP5之OPA+ Mab所識別的抗原決定基之一部分。在OPA中，識別O-乙醯化之天然CP5的MAb具有功能且介導殺滅細菌。在OPA中，CP8結合物在小鼠與兔子體內誘導介導殺滅第8型菌株之功能性抗體。多株或單株抗體之殺滅特異性藉由在向檢驗中添加同源天然多醣後殺滅作用消除得到證實。使用各種主動免疫模型顯示CP5-CRM197 與CP8-CRM197 結合物之臨床前功效。CP5結合物在鼠類腎盂腎炎模型及大鼠心內膜炎模型中顯示持續功效。在鼠類腎盂腎炎模型中證實CP5之O-乙醯化的重要性，其中結合於CRM197 之去O-乙醯化之CP5無法保護動物免受實驗性感染。
雙抗原調配物中之結合物組合誘導針對莢膜CP5與CP8之抗體且與單抗原免疫相比，對所誘導之特異性抗體含量無干擾。三抗原調配物中結合物與ClfA之組合誘導高CP5、CP8及ClfA含量，且對針對組合中存在之任何抗原所誘導之抗體反應無干擾。三抗原免疫原性組合物在具有高免疫前效價之兔子體內誘導能夠加強之針對所有三種組分的抗體(Ab)反應。
此等結果表明結合於CRM197 之CP5及CP8應作為保護性金黃色葡萄球菌免疫原性組合物之免疫原性調配物組分包括在內。
實例30：需要不同抗原來預防多種可能的金黃色葡萄球菌疾病
金黃色葡萄球菌會引起多種感染，其範圍為相對輕度的皮膚感染至諸如心內膜炎、壞死性筋膜炎、骨髓炎、敗血性關節炎及肺炎之較嚴重的侵襲性感染。此等活體內部位各為獨特的且細菌可能藉由將其抗原表現概況改變為最適於個別菌株之概況而對環境刺激差異作出反應以定殖、生長並最終引起疾病。如實例12中所例示，金黃色葡萄球菌菌株顯示活體內抗原表現之多樣性。由不同抗原構成之多組分免疫原性組合物更有可能預防由金黃色葡萄球菌引起之不同疾病表現。
經顯示，在齧齒動物心內膜炎及敗血症模型中ClfA具有保護作用。已報導，ClfB在金黃色葡萄球菌之鼻部定殖中很重要。在鼠類菌血症模型中，MntC保護小鼠。在腎盂腎炎及心內膜炎中CP5結合物具有保護作用，且在齧齒動物腎盂腎炎及敗血症模型中CP8結合物具有保護作用。此等結果說明含有此等抗原之多組分疫苗將預防多種類型之金黃色葡萄球菌疾病。
活體內動物模型接近實際感染過程且有助於闡明何等抗原可適用於預防特定疾病。表26概述在各種活體內模型中進行之許多實驗的結果。該等結果以由斜線分隔之四個數字報導於每一區塊中，例如在敗血症模型中ClfA具有數字27/1/3/31。第一個數字表示ClfA免疫產生統計學上顯著的陽性保護結果之實驗次數。第二個數字表示ClfA免疫產生趨向於顯著但並未統計學上顯著之陽性保護結果的實驗次數。第三個數字表示ClfA免疫產生陰性結果但並未統計學上顯著之實驗次數。第四個數字為所進行之實驗的總數。前三個數字應合計等於第四個數字。
表26：在動物模型中針對金黃色葡萄球菌抗原之保護作用的概述
實例31：活體外及活體內測試各種多抗原免疫原性組合物
測試含有三種、四種或五種選自以下多肽及/或多醣之抗原的各種多抗原葡萄球菌免疫原性調配物在各種活體內模型中之免疫原性及功效：ClfA、ClfB、MntC、CP5及CP8。免疫原性組合物如下：
(1)免疫原性組合物包含：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣結合於CRM197 ；
(2)第二組合提供凝集因子A(ClfA)、凝集因子B(ClfB)、分離之MntC、分離之葡萄球菌莢膜多醣CP5結合於CRM197 及分離之葡萄球菌莢膜多醣CP8結合於CRM197 ；
(3)　第三組合提供包含以下之免疫原性組合物：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、或分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣結合於CRM197 ；
(4)　第四組合提供包含以下之免疫原性組合物：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣結合於CRM197 ；
(5)　第五組合提供包含以下之免疫原性組合物：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽、分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣結合於CRM197 及分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣結合於CRM197 ；及
(6)　第六組合提供包含以下之免疫原性組合物：分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽及分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白。
如實例1中所述製備及純化rClfA及rClfB。如實例2中所述製備及純化MntC。如實例3中所述製備及純化分離之CP5及CP8且如實例4中所述使其結合於CRM197 。
更特定言之，使用以上先前實例中所述之程序量測免疫原性及功效。進行研究以判定三種、四種或五種組分中之每一者在單獨或一起傳遞時是否誘導免疫反應。使用此等相同研究判定四種或五種組分中之任一者的存在是否干擾其他三種或四種組分中之任一者誘導免疫反應的能力。此外，進行研究以判定四種或五種組分在單獨測試時或在一起測試時是否將在上述任一種或多種動物模型中給與保護。以單次劑量或以多次劑量向動物(例如小鼠、大鼠、兔子或非人類靈長類動物)投與四種或五種組分，如以上先前實例中所示。將動物放血，收集血清且測試針對四種或五種組分中之每一者的抗體之存在。抗原特異性抗體之存在係藉由熟習此項技術者已知之任何免疫檢驗來量測，例如使用ELISA(參見實例11-29)或西方墨點法(Western blot)(參見實例1)評估抗原特異性抗體是否存在。另外，使用調理吞噬檢驗判定抗原特異性抗體是否有效介導由吞噬細胞殺滅葡萄球菌生物體(參見實例11-29)。
亦使用上述任一種或多種動物研究評估活體內功效，該等研究為諸如(但不限於)留置管模型、鼠類菌血症模型、創口感染模型、鼠類腎盂腎炎模型、大鼠心內膜炎模型及鼠類敗血症模型(參見實例11-30)。
實例32：金黃色葡萄球菌抗原之組合在非人類靈長類動物體內產生增強殺滅金黃色葡萄球菌菌株Pfe5-1之抗體。
使用抗原組合觀察到如使用OPA檢驗所量測有所增強之功效。進行非人類靈長類動物研究，其中用多組分疫苗使各組(每組3-10隻)猴免疫。動物接受單次劑量之疫苗且在第0天及疫苗接種後兩週監測OPA效價。OPA效價定義為在OPA檢驗中殺滅50%金黃色葡萄球菌菌株Pfe5-1所需之血清的稀釋度。與3抗原疫苗調配物相比，對於4種抗原之組合可見增強之活性(p=0.0272；圖18)。
<210>　107
<211>　1677
<212>　DNA
<213>　金黃色葡萄球菌
<400>　107
<210>　108
<211>　559
<212>　PRT
<213>　金黃色葡萄球菌
<400>　108
<210>　109
<211>　29
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成引子
<400>　109
<210>　110
<211>　31
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成引子
<400>　110
<210>　111
<211>　37
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成引子
<400>　111
<210>　112
<211>　39
<212>　DNA
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成引子
<400>　112
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<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成引子
<400>　113
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<211>　37
<212>　DNA
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<220>
<223>　人工序列之描述：合成引子
<400>　114
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<211>　309
<212>　PRT
<213>　表皮葡萄球菌
<400>　115
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<211>　930
<212>　DNA
<213>　表皮葡萄球菌
<400>　116
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<400>　117
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<212>　PRT
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<213>　金黃色葡萄球菌
<400>　120
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<213>　表皮葡萄球菌
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<210>　123
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<213>　金黃色葡萄球菌
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<212>　DNA
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<211>　5
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成肽
<220>
<221>　MOD_RES
<222>　(3)..(3)
<223>　任何胺基酸
<400>　125
<210>　126
<211>　9
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成肽
<400>　126
<210>　127
<211>　12
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成肽
<400>　127
<210>　128
<211>　14
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成肽
<400>　128
<210>　129
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　人工序列之描述：合成肽
<400>　129
<210>　130
<211>　933
<212>　PRT
<213>　金黃色葡萄球菌
<400>　130
<210>　131
<211>　2802
<212>　DNA
<213>　金黃色葡萄球菌
<400>　131
圖1描繪各種形式之重組ClfA且按出現順序分別揭示SEQ ID NO: 125及127-129；
圖2描繪用於構建供表現ClfA用之pLP1179的選殖步驟；
圖3描繪T7ClfA(N123) Y338A表現載體，pLP1179；
圖4描繪CP5及CP8多醣之重複結構；
圖5A及5B描繪在不同培養液pH值下製造之CP5(A)及CP8(B)的分子量概況；
圖6A及6B描繪在不同溫度下製造之CP5(A)及CP8(B)的分子量概況；
圖7說明經純化之CP5及CP8的分子量與弱酸水解之處理時間的相關性；
圖8A-8E描繪金黃色葡萄球菌之各種菌株之間的ClfA比對(按出現順序分別為SEQ ID NO: 62、64、68、84、70、104、66、78、86、88、90、72、74、76、80、94、82、92、96、98、100、102、106及108)；
圖9描繪ClfA系統樹；
圖10A-10E描繪金黃色葡萄球菌之各種菌株之間的ClfB比對(按出現順序分別為SEQ ID NO: 26、28、32、18、54、34、36、30、16、20、22、24、38、40、42、44、46、48、50、52、56、58及60)；
圖11描繪ClfB系統樹；
圖12描繪金黃色葡萄球菌之各種菌株之間的MntC比對(按出現順序分別為SEQ ID NO:2、8、10、4、6、14及12)；
圖13說明在鼠類敗血症模型中多株兔子抗ClfA抗體減少金黃色葡萄球菌659-018群落計數；
圖14說明在兔子感染性心內膜炎模型中用ClfA主動免疫可減少金黃色葡萄球菌PFESA0003對心臟之定殖；
圖15A及15B說明用MntC免疫可減少血液中之金黃色葡萄球菌。A：金黃色葡萄球菌PFESA0237菌株；B：金黃色葡萄球菌PFESA0266菌株；
圖16說明在鼠類腎盂腎炎模型中金黃色葡萄球菌CP5-CRM197 結合物免疫原性調配物始終展現保護作用；
圖17說明在敗血症模型中接種CP8-CRM197 結合物免疫原性調配物可減少死亡；
圖18展示在接種高分子量(HMW)CP5-CRM、低分子量(LMW)CP5-CRM或PP5-CRM對照組之小鼠體內用金黃色葡萄球菌PFESA0266攻毒後腎中所回收之群落形成單位(CFU)；
圖19展示自接種多醣結合物(高分子量(HMW)CP5-CRM、低分子量(LMW)CP5-CRM)之不同調配物的小鼠獲得之血清之OPA效價(幾何平均值)的比較。各組由5至9隻小鼠組成；及
圖20說明在接種金黃色葡萄球菌抗原之不同組合之前(第0週，開符號)及在接種之後2週(第2週，關閉符號)非人類靈長類動物血清之OPA效價。3抗原(3Ag)疫苗由三種抗原構成且4抗原(4Ag)疫苗由四種抗原構成。各調配物具有兩種CP結合物及1或2種肽。
(無元件符號說明)

Claims (40)

  1. 一種免疫原性組合物，其包含：(a)與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣；(b)與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣；及(c)至少一種選自由以下組成之群的組分：分離之金黃色葡萄球菌(S.aureus )凝集因子A(ClfA)多肽、分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽及分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白，其中第5型莢膜多醣為介於70及800kDa之間之高分子量莢膜多醣，且其中第8型莢膜多醣為介於70及700kDa之間之高分子量莢膜多醣。
  2. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該組合物包含分離之金黃色葡萄球菌凝集因子A(ClfA)多肽、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。
  3. 如請求項2之免疫原性組合物，其中該組合物進一步包含分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白。
  4. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該組合物包含分離之金黃色葡萄球菌MntC蛋白、與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第5型莢膜多醣及與載體蛋白結合之分離之金黃色葡萄球菌第8型莢膜多醣。
  5. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該組合物進一步包 含分離之金黃色葡萄球菌凝集因子B(ClfB)多肽。
  6. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該ClfA多肽為包含ClfA之纖維蛋白原結合域的多肽片段。
  7. 如請求項6之免疫原性組合物，其中該ClfA多肽片段為ClfA之包含N1、N2及N3域的纖維蛋白原結合域。
  8. 如請求項6之免疫原性組合物，其中該ClfA多肽片段為ClfA之包含N2及N3域的纖維蛋白原結合域。
  9. 如請求項6之免疫原性組合物，其中該ClfA之纖維蛋白原結合域與纖維蛋白原之結合程度低於纖維蛋白原與ClfA之天然纖維蛋白原結合域所觀察到的結合程度。
  10. 如請求項9之免疫原性組合物，其中該ClfA之纖維蛋白原結合域具有在Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254及Ile 387中之一或多處之胺基酸取代。
  11. 如請求項10之免疫原性組合物，其中在Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254及Ile 387中之一或多處的胺基酸取代為Ala或Ser。
  12. 如請求項11之免疫原性組合物，其中該Tyr 338取代為Ala。
  13. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該ClfA、該ClfB或MntC以重組方式製造。
  14. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該第5型莢膜多醣之分子量介於70kDa與300kDa之間。
  15. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該第5型莢膜多醣之10%至100%經O-乙醯化。
  16. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該第5型莢膜多醣之50%至100%經O-乙醯化。
  17. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該第5型莢膜多醣之75%至100%經O-乙醯化。
  18. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該第8型莢膜多醣之分子量介於70kDa與300kDa之間。
  19. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該第8型莢膜多醣之10%至100%經O-乙醯化。
  20. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該第8型莢膜多醣之50%至100%經O-乙醯化。
  21. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該第8型莢膜多醣之75%至100%經O-乙醯化。
  22. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該載體蛋白為白喉棒狀桿菌(C.diphtheriae )類毒素CRM197 或肺炎球菌溶血素。
  23. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該金黃色葡萄球菌MntC蛋白為脂化蛋白。
  24. 如請求項1之免疫原性組合物，其中該金黃色葡萄球菌MntC蛋白不為脂化蛋白。
  25. 如請求項1之免疫原性組合物，其進一步包含至少一種來自絲胺酸-天冬胺酸重複(Sdr)蛋白家族之蛋白質，該蛋白質選自由SdrC、SdrD及SdrE組成之群。
  26. 如請求項1之免疫原性組合物，其進一步包含鐵表面決定子B(IsdB)蛋白。
  27. 如請求項1之免疫原性組合物，其進一步包含佐劑。
  28. 如請求項1之免疫原性組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
  29. 如請求項1之免疫原性組合物，其進一步包含以下任一種抗原：Opp3a、DltD、HtsA、LtaS、IsdA、IsdC、SdrF、SdrG、SdrH、SrtA、SpA、Sbi FmtB、α-溶血素(hla)、β-溶血素、纖維網蛋白-結合蛋白A(fibronectin-binding protein A，fnbA)、纖維網蛋白-結合蛋白B(fnbB)、凝固酶、Fig、map、潘頓-瓦倫丁殺白血球素(Panton-Valentine leukocidin，pvl)、α-毒素及其變異體、γ-毒素(hlg)及變異體、ica、免疫優勢ABC轉運體、Mg2+轉運體、Ni ABC轉運體、RAP、自溶素、層黏連蛋白受體、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、Sas A、SasF、SasH、EFB(FIB)、SBI、Npase、EBP、骨涎結合蛋白II、金黃色葡萄球菌金屬蛋白酶(aureolysin)前驅體(AUR)/Sepp1、CNA及其片段、TSST-1、mecA、聚-N-乙醯葡糖胺(PNAG/dPNAG)胞外多醣、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻璃網蛋白-結合蛋白、HarA、EsxA、EsxB、腸毒素A、腸毒素B及腸毒素C1。
  30. 一種如請求項1之免疫原性組合物之用途，其係用以製備用於誘導針對金黃色葡萄球菌之免疫反應的藥物。
  31. 如請求項30之用途，其中該免疫反應預防或減少個體由葡萄球菌生物體引起的疾病、感染或病狀。
  32. 如請求項31之用途，其中該疾病、感染或病狀係選自由侵襲性金黃色葡萄球菌疾病、敗血症及帶菌組成之群。
  33. 如請求項30之用途，其中所誘導之免疫反應包括產生具有針對金黃色葡萄球菌之調理吞噬活性(OPA)的抗體。
  34. 如請求項33之用途，其中針對金黃色葡萄球菌具特異性之調理吞噬抗體之效價顯著高於未經免疫之個體中所觀察到的效價。
  35. 如請求項34之用途，其中該調理吞噬效價為至少1：20。
  36. 如請求項30之用途，其中該金黃色葡萄球菌為MSSA。
  37. 如請求項30之用途，其中該金黃色葡萄球菌為VRSA。
  38. 如請求項30之用途，其中該金黃色葡萄球菌為VISA。
  39. 如請求項30之用途，其中該金黃色葡萄球菌為MRSA。
  40. 如請求項31之用途，其中該個體為人類、家庭寵物或家畜動物。
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