CN111138551A

CN111138551A - 一种预防金黄色葡萄球菌和白色念珠菌感染的atm融合蛋白的制备及应用

Info

Publication number: CN111138551A
Application number: CN202010039924.8A
Authority: CN
Inventors: 崔玉东; 杨思宇
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2020-01-15
Filing date: 2020-01-15
Publication date: 2020-05-12

Abstract

本发明涉及一种ATM融合蛋白，是在金黄色葡萄球菌MntC融合蛋白的氨基酸序列前用Linker连接了白色念珠菌Als3 T细胞表位的9个氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明选取Als3的T细胞表位与MntC蛋白融合，制备成重组ATM融合蛋白，并对其进行免疫原性研究，结果证实将Als3的T细胞表位与MntC蛋白融合后能诱导机体产生更好的抗S.aureus感染免疫应答和免疫保护作用，且Als3的T细胞表位明显增强了MntC诱导的抗S.aureus菌感染免疫保护作用，同时融合蛋白ATM也具有一定的抗C.albicans感染作用，是制备抗S.aureus感染和C.albicans感染制剂的理想候选融合蛋白，即本发明的融合蛋白具有更好的免疫原性及诱导更机体产生强的免疫保护作用。

Description

一种预防金黄色葡萄球菌和白色念珠菌感染的ATM融合蛋白的制备及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种预防金黄色葡萄球菌和白色念珠菌感染的ATM融合蛋白的制备及应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(S.aureus)是一种常见的人和动物均可感染的条件致病菌，常在鼻腔、皮肤和消化道内定殖，可引起人的皮肤和软组织感染、败血症、心内膜炎和肺炎等多种病症。S.aureus也是引起奶牛乳房炎的重要病原菌之一，可致使奶牛产奶量下降，牛奶品质低劣，严重影响畜牧业和奶业经济效益。以往对S.aureus感染以抗生素治疗为主，但是由于抗生素的长期应用和滥用，导致耐药菌株大量出现。因此研究和使用疫苗来防治S.aureus感染备受重视。研究表明，细胞免疫应答尤其是CD4⁺T细胞分化产生的Th1和Th17细胞在抗S.aureus感染免疫中发挥重要作用。因此，研究和提高S.aureus抗原诱导机体细胞免疫应答能力具有重要意义和应用价值。

白色念珠菌(C.albicans)是寄生在人口腔、皮肤、呼吸道、肠道和生殖道的条件性致病菌，当环境变化及免疫能力降低时，引起反复的浅层感染和严重的系统感染。C.albicans也可引起犊牛、羔羊、禽以及犬猫等多种动物感染，特别是也可以引起奶牛乳房炎。随着广谱抗生素的广泛使用以及免疫功能降低者不断增多，C.albicans感染日渐增加，已成为人们关注和研究的重要疾病之一。抗C.albicans感染的免疫机制包括非特异性免疫应答、特异性细胞免疫应答和特异性体液免疫应答，其中特异性细胞免疫应答特别是Th1细胞和Th17细胞发挥极其重要作用。

如上所述，研究能够诱导强烈细胞免疫应答和体液免疫应答、且同时抗S.aureus感染和C.albicans感染的免疫原具有重要的实际意义和应用价值。MntC是S.aureus获取锰的关键蛋白，在S.aureus感染初期大量持续表达，它不仅表达在S.aureus表面，也表达在其他葡萄球菌表面。MntC作为S.aureus抗原能诱导小鼠产生强烈的体液免疫应答和一定的细胞免疫应答，并通过特异性抗体、Th1细胞和Th17细胞发挥抗S.aureus感染的免疫保护作用。Als3是白色念珠菌(C.albicans)的粘附因子，能够诱导机体产生细胞免疫应答并对S.aureus感染具有交叉免疫保护作用。研究表明，在Als3蛋白中存在着一个T细胞表位，能够诱导机体产生良好的Th1和Th17细胞免疫应答。因此，为进一步提高MntC诱导细胞免疫应答能力，进而提高MntC诱导的抗葡萄球菌感染免疫保护作用，同时能够一定程度地发挥抗C.albicans感染作用，我们将S.aureus MntC蛋白与C.albicans Als3的T细胞表位进行串联融合表达，获得融合蛋白ATM，并将ATM制备成免疫原免疫接种小鼠。研究证明，Als3的T细胞表位明显增强了MntC诱导的抗金黄色葡萄球菌感染免疫保护作用，且ATM也诱导机体产生一定的抗白色念珠菌感染的能力。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种ATM融合蛋白，将S.aureus MntC蛋白与C.albicansAls3的T细胞表位进行融合表达而成，以达到免疫接种后能更好地抗S.aureus感染和一定程度地抗C.albicans感染的能力。

本发明的第二目的是提供上述ATM融合蛋白的编码基因。

本发明的第三目的是提供上述ATM融合蛋白的制备方法。

本发明的第四目的是提供上述ATM融合蛋白的应用。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种ATM融合蛋白，是在金黄色葡萄球菌MntC融合蛋白的氨基酸序列前用Linker连接了白色念珠菌Als3 T细胞表位的9个氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

二、编码上述的ATM融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

三、上述的ATM融合蛋白的制备方法，是将上述的基因克隆至原核细胞中进行异源表达、纯化获得融合蛋白。

四、上述的ATM融合蛋白在制备预防金黄色葡萄球菌感染和白色念珠菌感染疫苗以及抗葡萄球菌感染和念珠菌感染制剂中的应用。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。首先以重组菌MntC为模板，设计引物，引物中包含C.albicans Als3的T细胞表位的基因及Linker。通过PCR方法扩增获得MntC和Als3 T细胞表位的融合基因，然后将该基因插入到表达载体pET-28a并转化至BL21(DE3)大肠杆菌中，经IPTG诱导后可获得可溶性融合蛋白ATM。

本发明进一步提供上述融合蛋白在制备抗S.aureus感染和抗C.albicans感染制剂中的应用。选用His-Bind Resin蛋白纯化系统进行纯化，并将纯化后的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备抗原免疫接种小鼠，然后进行免疫原性和免疫保护作用研究。

采用上述技术方案的积极效果：本发明选取Als3的T细胞表位与MntC蛋白融合，制备成重组ATM融合蛋白，并对其进行免疫原性研究，结果证实将Als3的T细胞表位与MntC蛋白融合后能诱导机体产生更好的抗S.aureus感染免疫应答和免疫保护作用，且Als3的T细胞表位明显增强了MntC诱导的抗S.aureus菌感染免疫保护作用，同时融合蛋白ATM也具有一定的抗C.albicans感染作用，是制备抗S.aureus感染和C.albicans感染制剂的理想候选融合蛋白，即本发明的融合蛋白具有更好的免疫原性及诱导更机体产生强的免疫保护作用。

附图说明

图1为ATM融合蛋白结构示意图；

图2为ATM的PCR产物电泳分析结果。其中，M为DNA Marker DL8000；1为ATM的PCR产物，933bp；2为阴性对照；

图3为重组质粒ATM-pET28a表达载体重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定结果。M为DNAMarker DL8000；1为PCR的鉴定结果；2为双酶切鉴定结果；3为阴性对照；

图4为重组ATM蛋白表达及纯化结果。M为蛋白质Marker；1为未诱导的pET-28；2为IPTG诱导后的pET-28a；3为未诱导的重组菌；4为IPTG诱导后的重组菌；5为蛋白纯化结果；6为Western blot验证结果；

图5为重组蛋白ATM、MntC、Als3等免疫小鼠后S.aureus攻毒的细菌荷载量结果。其中，A为肝；B为脾；C为肺；D为肾；

图6为重组蛋白ATM、MntC、Als3等免疫小鼠后C.albicans攻毒的细菌荷载量结果。其中，A为肝；B为脾；C为肾；

图7为重组蛋白ATM、MntC、Als3等免疫小鼠后血清中抗体水平分析结果；

图8为重组蛋白ATM、MntC、Als3等免疫小鼠后CD4⁺T细胞增殖以及分泌细胞因子水平；

图9为重组蛋白ATM、MntC、Als3等免疫小鼠后CD8⁺T细胞增殖以及分泌细胞因子水平。

具体实施方式

本发明中生物材料的来源：

1、金黄色葡萄球菌标准株Newman：金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性，冯昊、刘乐峰、迟佳琦、王宁、李闰婷、佟春玉、马金柱、朱战波、崔玉东，生物工程学报，2009,25(8)：1180-1186；另外，该生物专利还公开在专利“金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白的制备及应用”中，专利号：201110231144.4，申请日2011.08.12，公开日2011.12.14和专利“金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白及制备方法和应用”中，专利号：201310480520.2，申请日2013.10.15，公开日2014.02.12中。

2、所有引物为自行设计并委托吉林省库美生物科技有限公司合成。

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明ATM融合蛋白及相应实验相关蛋白的制备。

1、引物的设计与合成

参照NCBI上已发表的S.aureus mntc基因序列(ID:12330566)，应用Primer 5.0软件设计特异性上下游引物，并在上游引物5’末端引入BamH I，在下游引物3’末端引入HindIII酶切位点。引物序列如下表：下划线的直线代表限制性酶切位点，波浪线代表Linker-(GS)₄，虚线代表Als3 T细胞表位。上述引物均由吉林省库美生物科技有限公司合成。

表1 PCR引物及Linker设计

2、MntC-pET28a/BL21(DE3)重组菌培养及质粒提取

取-70℃冻存的甘油保存菌MntC-pET28a/BL21(DE3)重组菌，用接菌环沾取菌液在含有Kan⁺的LB固体培养基上划线，37℃过夜培养，次日无菌操作挑取中等大小、边缘整齐的菌落，无菌接种于3mL LB/Kan⁺液体培养基中，180rpm/min 37℃震荡培养12h。无菌操作吸取2ml菌液于离心管中，12000rpm/min离心2min，弃上清液，按照质粒提取实验试剂盒(Axygen Plasmid miniprep purification kit)提取说明书进行操作。取3μL进行1％琼脂凝胶电泳验证。

3、ATM目的基因的扩增

以MntC-pET28a/BL21(DE3)重组质粒为模板进行PCR扩增，将PCR管置于冰上，依次按照说明书加入试剂进行扩增。反应条件如下：94℃预变性3min后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸7min，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证，在933bp出现电泳带，与预期扩增产物目的片段大小一致，如图2所示。

4、克隆载体的构建

使用Takara pMD18-T Vector进行TA克隆，按照pMD18-T Vector kit说明书进行操作，依次向离心管中加入Solution I 5μL、pMD-18T Vector 1μL、纯化的PCR产物1μL和无菌dd水3μL充分混匀后，在16℃连接仪中放置4h。将连接产物在无菌操作台内全部加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃加热90s，再放置冰中2min，随后加入37℃预热的无抗性LB培养基900μL，用封闭膜封闭离心管于37℃150rpm震荡培养1h，4000rpm离心5min，吸弃700μL上清，重悬菌体，吸取重悬液转移至Amp⁺抗性的固体LB培养基中进行涂布，置于37℃恒温培养箱培养过夜。

次日通过菌落PCR和双酶切进行鉴定。将上述PCR体系中的模板用微量菌落代替，其他不变；对扩增出目的条带的菌株进行扩增培及质粒提取，对质粒进行双酶切鉴定，体系如下：BamH I 2.5μL，Hind III 2.5μL，重组质粒20μL，10×Buffer 5μL，无菌dd水20μL，充分混匀后放于37℃水浴锅内反应2h，取少量样品上样，于1％琼脂糖凝胶电泳验证，均在预期位置出现目的基因条带及载体片段条带，将鉴定正确的阳性菌株送吉林省库美生物科技有限公司合成进行基因测序，将测序结果用BLSAT方法与GenBank中已发表的标准序列进行比较，同源性达到100％。

5、表达载体的构建

将pET-28a质粒和重组克隆质粒pMD-18T-ATM用限制性核酸内切酶BamH I和HindⅢ进行双酶切，用DNA纯化/回收试剂盒进行回收目的基因片段。将回收的ATM和pET-28a片段以浓度比4:1的比例进行混合，并加入T4连接酶、10×T4连接酶Buffer以及无菌dd水，置于22℃连接仪内4h，然后按前述方法进行转化，其中感受态细胞更换为BL21(DE3)，抗生素更换为硫酸卡那霉素(Kan⁺)，确定目的片段正确插入。将鉴定正确的质粒进行PCR及酶切检并送吉林省库美生物科技有限公司测序(图3)。最终获得ATM--pET28a/BL21(DE3)重组菌。

6、ATM重组蛋白的诱导表达

将活化的ATM--pET28a/BL21(DE3)重组菌以以1：100的比例接种至Kan⁺抗性LB液体培养基中，在37℃180rpm的培养条件下培养，直至菌液OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导重组蛋白表达，继续培养4h；培养结束后，吸取1mL菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，加入无菌dd水80μL重悬菌体沉淀，再加入5×上样缓冲液(含β-巯基乙醇)20μL震荡混匀，将样品密封于100℃煮沸10min；待冷却至室温后取10μL样品进行SDS-PAGE分析。电泳后取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中染色30min，弃去染色液，用蒸馏水淋洗凝胶后，加入脱色液，直至显现清晰条带且无背景色，观察并记录SDS-PAGE结果(图4)。

7、ATM重组蛋白的纯化

以上述方式培养并诱导大量重组菌。用CTB公司的His-Bind Resin蛋白纯化系统进行纯化，纯化后蛋白通过SDS-PAGE来进行纯度验证。结果如图4所示，通过与白质分子量Marker比对，诱导后的目的蛋白大小为35KD与纯化后的目的蛋白大小一致。

实施例2

本实施例说明ATM、MntC和Als蛋白免疫效果对比。

1、动物免疫和攻毒试验

取健康、雌性、相同周龄的SPF级Babl/c小鼠30只，分为ATM实验组、Als3与MntC混合实验组、MntC实验组、Als3实验组和PBS组，每组6只。纯化各实验组蛋白1mg/ml，以1：1的比例与弗式完全佐剂进行乳化，每只100μg小鼠腿部肌肉注射免疫；首次免疫21d后，将蛋白与不完全弗氏佐剂以1：1比例进行乳化，腿部肌肉注射加强免疫。

加强免疫14d后以最大耐受剂量分别向小鼠腹腔注射S.aureus Newman(1.5×10⁹CFUs/只)和C.albicans SC5314(6×10⁷CFUs/只)进行攻毒，取出肝、脾、肺和肾，置于2mLPBS缓冲液中进行充分研磨，取1mL匀浆液按照1：10、1：100、1：1000比例进行稀释；每稀释度取20μL涂布于TSA平板，置于37℃培养箱培养24h。通过平板菌落数量计算脏器内细菌定植数。结果如图5，6所示，ATM实验组可显著降低各器官细菌定殖数量。

2、抗体水平

通过间接ELISA方法检测小鼠血清内IgG水平，具体操作如下：将抗原用包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)调整浓度至0.01mg/mL，将稀释后的蛋白液加至酶标板孔中，每孔100μL，4℃包被过夜；第二日，每孔加入200μL的PBST进行清洗3次，随后每孔加入100μL的5％脱脂乳于37℃封闭2h，用PBST清洗酶联板3次，每孔加入100μL以1：1600比例稀释的小鼠血清作为一抗，37℃孵育1h，PBST清洗3次，每孔加入100μL以1：5000比例稀释的Goatanti-mouse HRP-IgG作为二抗，37℃静置孵育1h，PBST清洗3次；每孔加入100μL的TMB显色液，5min后每孔加入50μL的终止液(2M浓H₂SO₄)终止反应；将酶标板放于酶标仪测得各孔OD₄₅₀波长下读数。结果显示，ATM实验组抗体水平显著高于其他各组(图7)。

3、细胞因子检测

根据达科为公司Mouse IFN-γ、Mouse IL-17A、Mouse IL-4Precoated ELISA kit操作说明进行细胞因子检测，结果如图8所示，ATM实验组小鼠CD4⁺T淋巴细胞可分泌高水平的IFN-γ、IL-17A和IL-4，与其他各组差异显著；此外，ATM实验组小鼠CD8⁺T淋巴细胞也可分泌高水平的IFN-γ、IL-17A和IL-4，同其他各组比较差异显著(图9)。

以上结果表明，本发明ATM融合蛋白诱导的免疫应答和免疫保护作用明显优于各蛋白单独或混合免疫组，Als3 T细胞表位明显增强了MntC诱导的抗S.aureus感染免疫保护作用，同时ATM诱导的抗C.albicans感染免疫保护作用也比Als3 T细胞表位有了极显著增强，是制备抗S.aureus感染和C.albicans感染制剂的理想候选抗原。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 黑龙江八一农垦大学

<120> 一种预防金黄色葡萄球菌和白色念珠菌感染的ATM融合蛋白的制备及应用

<130> B020

<141> 2020-01-15

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Gly Ser Trp Asn Tyr Pro Val Ser Ser Glu Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Thr Gly Gly Lys Gln Ser Ser Asp Lys Ser Asn Gly

20 25 30

Lys Leu Lys Val Val Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Ala Lys

35 40 45

Asn Val Gly Gly Asp Asn Val Asp Ile His Ser Ile Val Pro Val Gly

50 55 60

Gln Asp Pro His Glu Tyr Glu Val Lys Pro Lys Asp Ile Lys Lys Leu

65 70 75 80

Thr Asp Ala Asp Val Ile Leu Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly

85 90 95

Asn Gly Trp Phe Glu Lys Ala Leu Glu Gln Ala Gly Lys Ser Leu Lys

100 105 110

Asp Lys Lys Val Ile Ala Val Ser Lys Asp Val Lys Pro Ile Tyr Leu

115 120 125

Asn Gly Glu Glu Gly Asn Lys Asp Lys Gln Asp Pro His Ala Trp Leu

130 135 140

Ser Leu Asp Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Gln Thr Phe

145 150 155 160

Ile Asp Asn Asp Lys Lys His Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Gln Gly Asn

165 170 175

Lys Tyr Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Asn Asn Asp Ser Lys Asp Lys

180 185 190

Phe Asn Asp Ile Pro Lys Glu Gln Arg Ala Met Ile Thr Ser Glu Gly

195 200 205

Ala Phe Lys Tyr Phe Ser Lys Gln Tyr Gly Ile Thr Pro Gly Tyr Ile

210 215 220

Trp Glu Ile Asn Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Glu Gln Met Arg Gln

225 230 235 240

Ala Ile Glu Phe Val Lys Lys His Lys Leu Lys His Leu Leu Val Glu

245 250 255

Thr Ser Val Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys

260 265 270

Lys Asp Ile Phe Gly Glu Val Tyr Thr Asp Ser Ile Gly Lys Glu Gly

275 280 285

Thr Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Glu Thr

290 295 300

Val His Gly Ser Met Lys

305 310

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatcct ggaattatcc ggtttcatct gaatcaggta gtggtagtgg tagtggtagt 60

actggtggta aacaaagcag tgataagtca aatggcaaat taaaagtagt aacgacgaat 120

tcaattttat atgatatggc taaaaatgtt ggtggagaca acgtcgatat tcatagtatt 180

gtacctgttg gtcaagatcc tcatgaatat gaagttaaac ctaaagatat taaaaagtta 240

actgacgctg acgttatttt atacaacgga ttaaatttag agactggtaa cggttggttt 300

gaaaaagcct tagaacaggc tggtaaatca ttaaaagata aaaaagttat cgcagtatca 360

aaagatgtta aacctatcta tttaaacggt gaagaaggca acaaagataa acaagatcca 420

cacgcatggt taagtttaga taacggtatt aaatacgtaa aaacaattca acaaacattt 480

atcgataacg acaaaaaaca taaagcagat tatgaaaagc aaggtaacaa atacattgct 540

caattggaaa aattaaataa tgacagtaaa gacaaattta atgacattcc aaaagaacaa 600

cgtgccatga ttacaagtga aggtgccttc aagtacttct caaaacaata cggtattaca 660

ccaggttata tttgggaaat taacactgaa aaacaaggta cacctgaaca aatgagacaa 720

gctattgagt ttgttaaaaa gcacaaatta aaacacttat tagtagaaac aagtgttgat 780

aagaaagcaa tggaaagttt atctgaagaa acgaagaaag atatctttgg tgaagtgtac 840

acagattcaa tcggtaaaga aggcactaaa ggtgactctt actacaaaat gatgaaatca 900

aatattgaaa ctgtacacgg aagcatgaaa taa 933

<210> 3

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcct ggaattatcc ggtttcatct gaatcaggta gtggtagtgg tagtggtagt 60

actggtggta aacaaagcag tgata 85

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttt tatttcatgc ttccgtgtac agtt 34

Claims

1.一种ATM融合蛋白，是在金黄色葡萄球菌MntC融合蛋白的氨基酸序列前用Linker连接了白色念珠菌Als3 T细胞表位的9个氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述的ATM融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1所述的ATM融合蛋白的制备方法，是将权利要求2中所述的基因克隆至原核细胞中进行异源表达，纯化获得融合蛋白。

4.权利要求1所述的ATM融合蛋白在制备预防金黄色葡萄球菌感染和白色念珠菌感染疫苗以及抗葡萄球菌感染和念珠菌感染制剂中的应用。