CN107096020A - 金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物 - Google Patents

金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫原性组合物，其包含来自金黄色葡萄球菌的多肽和多糖。本发明还涉及免疫原性组合物，其包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌荚膜多糖。此外，本发明涉及利用金黄色葡萄球菌多肽和荚膜多糖的免疫原性组合物诱导个体中针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法。

Description

金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年6月22日提交的美国临时专利申请第61/219,134号的优先权，其整体援引加入本文。
发明领域
本发明涉及免疫原性组合物，其包含分离自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的多肽和荚膜多糖。此外，本发明涉及利用金黄色葡萄球菌多肽和荚膜多糖的免疫原性组合物在对象中诱导针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法。所得的抗体还可以用于通过被动免疫治疗来治疗或预防金黄色葡萄球菌感染。
发明背景
人是金黄色葡萄球菌(S.aureus)的天然储存宿主。健康个体可以被金黄色葡萄球菌持续(10-35％)、间歇(20-75％)或以非携带状态(5-70％)定殖在皮肤上、鼻孔和咽喉中，而没有相关疾病。参见Vandenbergh等人，J.Clin.Micro.37:3133-3140(1999)。当个体由于免疫屏障的破坏，例如手术期间、放置留置导管或其他装置、创伤或伤口而变成无免疫应答时，疾病随后发生。所导致的金黄色葡萄球菌感染可以引起广泛的不同疾病，其范围从轻微的皮肤感染至内膜炎、骨髓炎、菌血症、脓毒症以及伴随高死亡率的其他形式的疾病。巨大的人储存宿主提高了适应的致病性克隆类型演化和传播的机会。
特别关注来自革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)的侵入性葡萄球菌感染，因为它们是日益增加的全球性公共健康问题。具体而言，金黄色葡萄球菌是造成大多数医院获得性(医院)感染的原因，并且其在社区发病感染中的流行增加。例如，2005年在美国侵入性抗甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的发生率估计为31.8/100,000人，包括18,650例死亡。参见Klevens R.M.等人，JAMA,298:1763-71(2007)。
在过去20年葡萄球菌疾病已急剧增加，这种增加与血管内装置和侵入性操作的伴随并行。由于抗生素抗性的伴随上升，疾病发生率的这种上升更令人不安，因此，对免疫原性组合物有迫切需要，所述免疫原性组合物用于疫苗或者引发多克隆或单克隆抗体以赋予被动免疫作为预防或治疗葡萄球菌感染和相关疾病的方法。
发明概述
本发明涉及包含至少3种分离自葡萄球菌的抗原的多抗原或多组分免疫原性组合物。作为多肽和多糖的抗原可以利用本领域技术人员已知的分离方法直接获得自细菌，或者它们可以利用合成方案来制备，或者它们可以利用本领域技术人员也已知的基因工程方法来重组制备，或者通过任何上述方法的组合。在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含3种或更多种抗原，所述抗原选自分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)、以及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。此外，本发明提供诱导针对葡萄球菌的免疫应答的方法，预防、降低葡萄球菌所引起的疾病的严重程度或者延迟葡萄球菌所引起的疾病的发生的方法，以及预防、降低感染葡萄球菌所引起的疾病的至少一种症状的严重程度或者延迟感染葡萄球菌所引起的疾病的至少一种症状的发生的方法。
相应地，在一实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、以及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。
在一实施方案中，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含分离的ClfA多肽片段，其中所述ClfA多肽片段包含ClfA的纤维蛋白原结合结构域。在一实施方案中，所述ClfA多肽片段包含纤维蛋白原结合结构域，所述纤维蛋白原结合结构域包含ClfA的N1、N2和N3结构域。在一实施方案中，所述ClfA多肽片段包含纤维蛋白原结合结构域，所述纤维蛋白原结合结构域包含ClfA的N2和N3结构域。在一实施方案中，含有所述ClfA纤维蛋白原结合结构域的组合物显示对纤维蛋白原降低的结合。在一实施方案中，所述ClfA 的纤维蛋白原结合结构域以与观察到的由ClfA的天然纤维蛋白原结合结构域结合至纤维蛋白原相比降低的水平结合至纤维蛋白原。在一实施方案中，含有所述ClfA纤维蛋白原结合结构域的组合物显示对纤维蛋白原减低了的结合，并且在含有信号序列的全长蛋白中具有Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254和Ile 387中的一处或多处的氨基酸取代。在一实施方案中，含有所述ClfA纤维蛋白原结合结构域的组合物在Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254和Ile 387中的一处或多处显示氨基酸取代，其中这些位置中的任何一处或多处的氨基酸取代为Ala或Ser。在一实施方案中，所述组合物包含ClfA纤维蛋白原结合结构域，其中位置338处的Tyr取代为Ala。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含分离的ClfB多肽片段，其中所述ClfB多肽片段包含ClfB的纤维蛋白原结合结构域。在一实施方案中，所述ClfB多肽片段包含纤维蛋白原结合结构域，所述纤维蛋白原结合结构域包含ClfB的N1、N2和N3结构域。在一实施方案中，所述ClfB多肽片段包含纤维蛋白原结合结构域，所述纤维蛋白原结合结构域包含ClfB的N2和N3结构域。在一实施方案中，含有所述ClfB纤维蛋白原结合结构域的组合物显示对纤维蛋白原降低了的结合。在一实施方案中，所述ClfB的纤维蛋白原结合结构域以与观察到的由ClfB的天然纤维蛋白原结合结构域结合至纤维蛋白原相比降低的水平结合至纤维蛋白原。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)，其为20-1000kDa的高分子量多糖。在一实施方案中，所述5型高分子量多糖具有50-300kDa的分子量。在一实施方案中，所述5型高分子量多糖具有70-150kDa的分子量。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含10％-100％O-乙酰化的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含50％-100％O-乙酰化的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含75％-100％O-乙酰化的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖，其为20-1000kDa的高分子量多糖。在一实施方案中，所述8型高分子量多糖具有50-300kDa的分子量。在一实施方案中，所述8型高分子量多糖具有70-150kDa的分子量。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含10％-100％O-乙酰化的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含50％-100％O-乙酰化的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含75％-100％O-乙酰化的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。
在一实施方案中，存在于免疫原性组合物中的荚膜多糖5和/或8缀合至载体蛋白。在一实施方案中，所述载体蛋白为白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae，C.diphtheriae)类毒素CRM197。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌MntC，其为脂质化(lipidated)的蛋白。在一实施方案中，所述免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌MntC，其不是脂质化的蛋白。
在一实施方案中，本发明提供如本文所述的免疫原性组合物，其进一步包含选自SdrC、SdrD和SdrE的来自丝氨酸-天冬氨酸重复(Serine-aspartate repeat,Sdr)蛋白家族的至少一种蛋白。
在一实施方案中，本发明提供如本文所述的免疫原性组合物，其进一步包含铁表面决定子B(Iron surface determinant B,IsdB)蛋白。
在本文所述的其中免疫原性组合物包含3种或更多种所列举的抗原的每个实施方案中，所述组合物可以进一步包含其他免疫原性和/或非免疫原性物质。如本文所详述，可选地，在某些实施方案中，每种免疫原性组合物可以“基本上由”或“由”3种或更多种所列举的抗原“组成”，并且进一步包含一种或多种非免疫原性物质。
在一实施方案中，本发明提供如本文所述的免疫原性组合物，其进一步包含以下抗原中的任一种：Opp3a、DltD、HtsA、LtaS、IsdA、IsdC、SdrF、SdrG、SdrH、SrtA、SpA、SbiFmtB、α-溶血素(hla)、β-溶血素、纤连蛋白结合蛋白A(fnbA)、纤连蛋白结合蛋白B(fnbB)、凝固酶、Fig、map、Panton-Valentine杀白细胞素(pvl)、α-毒素及其变体、γ-毒素(hlg)及变体、ica、免疫显性ABC转运蛋白、Mg2+转运蛋白、Ni ABC转运蛋白、RAP、自溶素、层粘连蛋白受体、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、Sas A、SasF、SasH、EFB(FIB)、SBI、Npase、EBP、骨唾液酸蛋白结合蛋白II(bone sialo binding protein II)、金黄色葡萄球菌金属蛋白酶(aureolysin)前体(AUR)/Sepp1、Cna、及其片段如M55、TSST-1、mecA、聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG/dPNAG)外泌多糖、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、HarA、EsxA、EsxB、肠毒素A、肠毒素B、肠毒素C1、以及新自溶素。在本发明的某些实施方案中，当所述免疫原性组合物包含某些形式的CP5和/或CP8时，其不可以进一步包含PNAG。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂。在一实施方案中，所述免疫原性组合物进一步包含药学可接受的载体。
在一实施方案中，所述免疫原性组合物用于配制疫苗。在一实施方案中，所述疫苗用于在对象中诱导针对金黄色葡萄球菌的免疫应答。在一实施方案中，所述免疫原性组合物用于产生抗体制剂以赋予对象被动免疫。
在一实施方案中，本发明提供一种诱导针对金黄色葡萄球菌的免疫应答的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性量的任何本文所述的免疫原性组合物以及药学可接受的载体。
在一实施方案中，本发明提供预防或减少感染金黄色葡萄球菌的方法，或者预防或降低与金黄色葡萄球菌所引起的感染相关的至少一种症状的严重程度的方法，所述方法包括给对象施用免疫原性量的任何本文所述的免疫原性组合物以及药学可接受的载体。
在一实施方案中，诱导针对金黄色葡萄球菌的方法包括与佐剂一起递送所述免疫原性组合物。在一实施方案中，诱导针对金黄色葡萄球菌的方法提供与药学可接受的载体一起的所述免疫原性组合物的递送。
在一实施方案中，本文所述的免疫原性组合物诱导的免疫应答预防或减少与对象中的葡萄球菌生物体相关的疾病或病症，或者预防或减少与对象中的葡萄球菌生物体相关的一种或多种症状。在一实施方案中，所述疾病选自侵入性金黄色葡萄球菌病、脓毒症和携带(carriage)。
在一实施方案中，所诱导的免疫应答包括产生针对金黄色葡萄球菌的具有调理吞噬活性(OPA)的抗体。在一实施方案中，所诱导的免疫应答包括产生与非免疫对象中观察到的相比更高效价的金黄色葡萄球菌特异性调理吞噬抗体。在一实施方案中，调理吞噬效价为至少1:20。
在一实施方案中，诱导免疫应答针对的金黄色葡萄球菌为MRSA。在一实施方案中，诱导免疫应答针对的金黄色葡萄球菌为MSSA。在一实施方案中，诱导免疫应答针对的金黄色葡萄球菌为VRSA。在一实施方案中，诱导免疫应答针对的金黄色葡萄球菌为VISA。
在一实施方案中，本发明提供预防接受外科手术的对象中的葡萄球菌感染的方法，所述方法包括在所述外科手术之前给所述对象施用免疫有效量的任何如本文所述的免疫原性组合物。所述外科手术可以是选择性外科手术(elective surgical procedure)或非选择性外科手术(non-elective surgical procedure)。在一实施方案中，所述外科手术是心胸外科手术(Cardio-thoracic surgical procedure)。在一实施方案中，所述对象是人、兽医动物或家畜。
在一实施方案中，本发明提供一种赋予对象被动免疫的方法，所述方法包括以下步骤：(1)利用本发明的免疫原性组合物来产生抗体制品；以及(2)给所述对象施用所述抗体制品以赋予被动免疫。
附图说明
图1示出各种形式的重组ClfA并以出现的顺序分别公开SEQ ID NO：125和127-129。
图2示出用于构建表达ClfA的pLP1179的克隆步骤。
图3示出T7ClfA(N123)Y338A表达载体pLP1179。
图4示出CP5和CP8多糖的重复结构。
图5A和5B示出在不同培养液(broth)pH下产生的CP5(A)和CP8(B)的分子量谱。
图6A和6B示出在不同温度下产生的CP5(A)和CP8(B)的分子量谱。
图7证实纯化的CP5和CP8的分子量与温和酸水解的处理时间的相关性。
图8A-8E示出金黄色葡萄球菌的各种菌株之间ClfA的比对(以出现的顺序分别为SEQ ID NO：62、64、68、84、70、104、66、78、86、88、90、72、74、76、80、94、82、92、96、98、100、102、106和108)。
图9示出ClfA系统树。
图10A-10E示出金黄色葡萄球菌的各种菌株之间ClfB的比对(以出现的顺序分别为SEQ ID NO：26、28、32、18、54、34、36、30、16、20、22、24、38、40、42、44、46、48、50、52、56、58和60)。
图11示出ClfB系统树。
图12示出金黄色葡萄球菌的各种菌株之间MntC的比对(以出现的顺序分别为SEQID NO：2、8、10、4、6、14和12)。
图13证实多克隆兔抗ClfA抗体减少小鼠脓毒症模型中的金黄色葡萄球菌659-018菌落计数。
图14证实用ClfA主动免疫减少兔感染性心内膜炎模型中心脏被金黄色葡萄球菌PFESA0003定殖。
图15A和15B证实用MntC免疫减少血液中的金黄色葡萄球菌。A：金黄色葡萄球菌PFESA0237菌株；B：金黄色葡萄球菌PFESA0266菌株。
图16证实金黄色葡萄球菌CP5-CRM197缀合物免疫原性制剂在小鼠肾盂肾炎模型中一贯表现出保护。
图17证实用CP8-CRM197缀合物免疫原性制剂免疫接种减少脓毒症模型中的死亡。
图18示出用高分子量(HMW)CP5-CRM、低分子量(LMW)CP5-CRM或PP5-CRM对照免疫接种的小鼠中用金黄色葡萄球菌PFESA0266攻击之后肾中恢复的菌落形成单位(CFU)。
图19示出获得自用多糖缀合物的不同制剂(高分子量(HMW)CP5-CRM，低分子量(LMW)CP5-CRM)免疫接种的小鼠的血清的OPA效价(几何平均数(geomean))的比较。组由5-9只小鼠组成。
图20证实用金黄色葡萄球菌抗原的不同组合免疫接种之前(wk0，空心符号)和2周之后(wk2，实心符号)非人灵长类血清的OPA效价。3-抗原(3Ag)疫苗由3种抗原组成，而4-抗原(4Ag)疫苗由4种抗原组成。每种制剂具有2种CP缀合物以及1种或2种肽。
发明详述
在描述目前的方法和治疗方法之前，应当理解本发明不限于特定方法和所述的实验条件，这样方法和条件可以变化。还应当理解本文所用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并不是为了限制。
虽然与本文所述的方法和材料相似或相当的任何方法和材料可以用于本发明的实施或测试，但是现在描述优选的方法和材料。本文提到的所有出版物整体援引加入本文。
本文所用的术语具有本领域技术人员所认可和已知的含义，然而，为了方便和完整性，特定术语和它们的含义如下文所示。
在本说明书和所附权利要求中使用时，除非上下文明确另有规定，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数参考物。因此，例如，提及“所述方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，和/或在阅读本公开等时对本领域技术人员会变得清楚的一种或多种方法和/或步骤。
术语“约”或“大约”表示在值的统计上有意义的范围内。这样的范围可以在一个数量级内，典型地在给定值或范围的20％内，更典型地仍在10％内，并且甚至更典型地在5％内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许偏差取决于研究下的特定系统，并且可以由本领域技术人员很容易判断。在本申请内无论何时提到范围，所述范围内的每个整数也预期为本发明的实施方案。
“抗体”是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合至诸如糖类、多核苷酸、脂质、多肽等的靶标的免疫球蛋白分子。在本文中使用时，除非上下文另有说明，该术语不仅包括完整多克隆或单克隆抗体，还包括工程抗体(例如，嵌合、人源化和/或衍生以改变效应子功能、稳定性和其他生物学活性)及其片段(如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(ScFv)和结构域抗体，包括鲨鱼和骆驼抗体)，以及包含抗体部分的融合蛋白、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们表现出期望的生物学活性)和如本文所述的抗体片段，以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构型。抗体包括任何类别的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且所述抗体不需要是任何特定类别的。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配至不同类别。有五大类的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，人中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是公知的。
“抗体片段”仅包含完整抗体的部分，其中所述部分优选保留存在于完整抗体中时通常与该片段相关的功能的至少一种，优选大部分或全部。
术语“抗原”一般指生物分子，通常为蛋白、肽、多糖、脂质或含有同源抗体可以选择性结合的至少一个表位的缀合物；或者在某些情况下指可以在动物中刺激产生抗体或T-细胞应答或者两者的免疫原性物质，包括注射或吸收入动物的组合物。可以对整个分子，或者对该分子的一个或多个不同部分(例如，表位或半抗原)产生免疫应答。该术语可以用来指单个分子，或者指抗原分子的同质或异质群体。抗原被抗体、T-细胞受体或者特异性体液和/或细胞免疫的其他元件识别。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。给定抗原的表位可以利用本领域公知的任何数量的表位作图技术来鉴定。参见，例如，Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed.,1996)Humana Press,Totowa,N.J.。例如，线性表位可以这样测定，例如，在固相支持体上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白分子的部分，并且在所述肽仍然连接至所述支持体的同时使所述肽与抗体反应。这类技术是本领域已知的，并且如美国专利第4,708,871号；Geysen etal.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998-4002；Geysen et al.(1986)Molec.Immunol.23:709-715所述，所有文献整体援引加入本文。相似地，构象表位可以通过例如x射线晶体分析法和二维核磁共振测定氨基酸的空间构象来鉴定。参见，例如，上文的Epitope Mapping Protocols。此外，为了本发明的目的，“抗原”还可以用来指包括对天然序列的修饰的蛋白，如缺失、添加和取代(一般在自然中保守，但是它们可以不保守)，只要所述蛋白保持引起免疫应答的能力。这些修饰可以是故意的，如通过位点定向诱变，或者通过特定合成方法，或者通过基因工程方法，或者可以是偶然的，如通过宿主的突变，其产生抗原。此外，抗原可以来源于、获得自或分离自微生物，例如细菌，或者可以是整个生物体。相似地，如在核酸免疫应用中表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸也包括在所述定义中。还包括合成抗原，例如，多表位、侧翼表位以及其他重组或合成来源的抗原(Bergmann et al.(1993)Eur.J.Immunol.23:2777 2781；Bergmann et al.(1996)J.Immunol.157:32423249；Suhrbier,A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75:402 408；Gardner et al.(1998)12th World AIDS Conference,Geneva,Switzerland,Jun.28-Jul.3,1998)。
术语“佐剂”指如本文进一步所述或例证的增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。
“菌血症”是血液中细菌的瞬时存在。菌血症可以发展为败血症或脓毒症，这可以认为是感染和血液中细菌的持续存在，具有相关的临床体征/症状。不是所有细菌均能够在血液中存活。那些细菌具有提供该能力的特定遗传性状。而且宿主因素也起重要作用。
“荚膜多糖(Capsular polysaccharide)”或“荚膜多糖(capsulepolysaccharide)”指在葡萄球菌(Staphylococci)的大多数分离菌(isolate)的细胞壁外部的多糖荚膜。例如，金黄色葡萄球菌包括由肽聚糖复合物组成的细胞壁组分，其使得该生物能够在不利的渗透条件下存活，并且还包括连接至所述肽聚糖的独特磷壁酸。在细胞壁外部薄多糖荚膜包被金黄色葡萄球菌的大多数分离菌。这种血清型不同的荚膜可以用于血清分型金黄色葡萄球菌的各种分离菌。据显示许多临床显著的分离菌包括两种荚膜类型：血清型5(CP5)和血清型8(CP8)。CP5和CP8的结构如图4所示。
在本文中使用时，“缀合物”包含通常具有期望范围的分子量的荚膜多糖和载体蛋白，其中所述荚膜多糖缀合至所述载体蛋白。缀合物可以含有或可以不含一定量的游离荚膜多糖。在本文中使用时，“游离荚膜多糖”指与缀合的荚膜多糖-载体蛋白非共价关联(即，非共价结合、吸附或包埋(entrapped))的荚膜多糖。术语“游离荚膜多糖”、“游离多糖”和“游离糖”可以交换使用，并且旨在表达相同含义。无论所述载体分子的性质，其可以直接或通过接头缀合至所述荚膜多糖。在本文中使用时，“待缀合”、“已缀合”和“正在缀合”指将细菌荚膜多糖共价连接至所述载体分子的过程。缀合增强所述细菌荚膜多糖的免疫原性。缀合可以根据下文所述的方法或通过本领域已知的方法进行。
如上文所述，本发明涉及包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖(CP5)的缀合物以及包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖(CP8)的缀合物。本发明的一实施方案提供包含缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型5荚膜多糖和缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌血清型8荚膜多糖的缀合物，其中：所述5型荚膜多糖具有50kDa-800kDa的分子量；所述8型荚膜多糖具有50-700kDa；所述免疫原性缀合物具有约1000kDa-约5000kDa的分子量；并且相对于总多糖，所述缀合物包含少于约30％游离多糖。在一实施方案中，相对于总多糖，所述缀合物包含少于约25％、约20％、约15％、约10％或约5％游离多糖。在一实施方案中，所述5型或8型多糖具有20kDa-1000kDa的分子量。
在一实施方案中，所述缀合物具有约50kDa-约5000kDa的分子量。在一实施方案中，所述缀合物具有约200kDa-约5000kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约400kDa-约2500kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约500kDa-约2500kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约600kDa-约2800kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约700kDa-约2700kDa的分子量。在一实施方案中，所述免疫原性缀合物具有约1000kDa-约2000kDa；约1800kDa-约2500kDa；约1100kDa-约2200kDa；约1900kDa-约2700kDa；约1200kDa-约2400kDa；约1700kDa-约2600kDa；约1300kDa-约2600kDa；约1600kDa-约3000kDa的分子量。
相应地，在一实施方案中，本发明的免疫原性缀合物内的载体蛋白为CRM197，并且所述CRM197通过氨基甲酸酯键、酰胺键或两者共价连接至荚膜多糖。所述载体蛋白中缀合至荚膜多糖的赖氨酸残基的数目可以表征为缀合的赖氨酸的范围。例如，在给定的免疫原性组合物中，所述CRM197可以包含39个赖氨酸中的5-15个，这5-15个赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。表达这个参数另一方式是12％-40％的CRM197赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。在一些实施方案中，共价结合至CRM197的多糖的CRM197部分包含5-22个共价连接至所述多糖的赖氨酸。在一些实施方案，共价结合至CRM197的多糖的CRM197部分包含5-23个共价连接至所述多糖的赖氨酸。在一些实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖的CRM197部分包含8-15个共价连接至所述多糖的赖氨酸。在一些实施方案中，共价结合至载体蛋白的多糖的CRM197部分包含8-12个共价连接至所述多糖的赖氨酸。例如，在给定的免疫原性组合物中，所述CRM197可以包含39个赖氨酸中的18-22个，这18-22个赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。表达这个参数的另一方式是40％-60％的CRM197赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。在一些实施方案中，所述CRM197包含39个赖氨酸中的5-15个，这5-15个赖氨酸共价连接至CP8。表达这个参数的另一方式是12％-40％的CRM197赖氨酸共价连接至CP8。在一些实施方案中，所述CRM197包含39个赖氨酸中的18-22个，这18-22个赖氨酸共价连接至CP5。表达这个参数的另一方式是40％-60％的CRM197赖氨酸共价连接至CP5。
如上文所讨论，所述载体蛋白中缀合至所述荚膜多糖的赖氨酸残基的数目可以表征为缀合的赖氨酸的范围，其可以表达为摩尔比。例如，所述CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比可以为约18:1-约22:1。在一实施方案中，所述CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比的范围可以为约15:1-约25:1。在一些实施方案中，所述CP8免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比的范围可以为约14:1-约20:1；约12:1-约18:1；约10:1-约16:1；约8:1-约14:1；约6:1-约12:1；约4:1-约10:1；约20:1-约26:1；约22:1-约28:1；约24:1-约30:1；约26:1-约32:1；约28:1-约34:1；约30:1-约36:1；约5:1-约10:1；约5:1-约20:1；约10:1-约20:1；或者约10:1-约30:1。而且，所述CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比可以为约3:1-25:1。在一实施方案中，所述CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比的范围可以为约5:1-约20:1。在一实施方案中，所述CP5免疫原性缀合物中缀合的赖氨酸比CRM197的摩尔比的范围可以为约4:1-约20:1；约6:1-约20:1；约7:1-约20:1；约8:1-约20:1；约10:1-约20:1；约11:1-约20:1；约12:1-约20:1；约13:1-约20:1；约14:1-约20:1；约15:1-约20:1；约16:1-约20:1；约17:1-约20:1；约18:1-约20:1；约5:1-约18:1；约7:1-约16:1；或者约9:1-约14:1。
表达所述载体蛋白中缀合至所述荚膜多糖的赖氨酸残基的数目的另一方式可以为缀合的赖氨酸的范围。例如，在给定的CP8免疫原性缀合物中，所述CRM197可以包含39个赖氨酸中的5-15个，这5-15个赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。或者，这个参数可以表达为百分比。例如，在给定的CP8免疫原性缀合物中，缀合的赖氨酸的百分比可以为10％-50％。在一些实施方案中，20％-50％的赖氨酸可以共价连接至CP8。或者，30％-50％的CRM197赖氨酸可以共价连接至CP8；10％-40％的CRM197赖氨酸；10％-30％的CRM197赖氨酸；20％-40％的CRM197赖氨酸；25％-40％的CRM197赖氨酸；30％-40％的CRM197赖氨酸；10％-30％的CRM197赖氨酸；15％-30％的CRM197赖氨酸；20％-30％的CRM197赖氨酸；25％-30％的CRM197赖氨酸；10％-15％的CRM197赖氨酸；或者10％-12％的CRM197赖氨酸共价连接至CP8。而且，在给定的CP5免疫原性缀合物中，所述CRM197可以包含39个赖氨酸中的18-22个，这18-22个赖氨酸共价连接至所述荚膜多糖。或者，这个参数可以表达为百分比。例如，在给定的CP5免疫原性缀合物中，缀合的赖氨酸的百分比可以为40％-60％。在一些实施方案中，40％-60％的赖氨酸可以共价连接至CP5。或者，30％-50％的CRM197赖氨酸可以共价连接至CP5；20％-40％的CRM197赖氨酸；10％-30％的CRM197赖氨酸；50％-70％的CRM197赖氨酸；35％-65％的CRM197赖氨酸；30％-60％的CRM197赖氨酸；25％-55％的CRM197赖氨酸；20％-50％的CRM197赖氨酸；15％-45％的CRM197赖氨酸；10％-40％的CRM197赖氨酸；40％-70％的CRM197赖氨酸；或者45％-75％的CRM197赖氨酸共价连接至CP5。
荚膜多糖链附着至所述载体分子上的赖氨酸的频率是表征荚膜多糖缀合物的另一参数。例如，在一实施方案中，对于所述荚膜多糖的至少每5-10个糖重复单元，CRM197和多糖之间存在至少一个共价键。在另一实施方案中，对于所述荚膜多糖的每5-10个糖重复单元；每2-7个糖重复单元，每3-8个糖重复单元；每4-9个糖重复单元；每6-11个糖重复单元；每7-12个糖重复单元；每8-13个糖重复单元；每9-14个糖重复单元；每10-15个糖重复单元；每2-6个糖重复单元，每3-7个糖重复单元；每4-8个糖重复单元；每6-10个糖重复单元；每7-11个糖重复单元；每8-12个糖重复单元；每9-13个糖重复单元；每10-14个糖重复单元；每10-20个糖重复单元；每5-10个糖重复单元，CRM197和荚膜多糖之间存在至少一个共价键。在另一实施方案中，对于所述荚膜多糖的每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个糖重复单元，CRM197和荚膜多糖之间存在至少一个键。
多糖的化学活化以及随后缀合至载体蛋白可以通过常规方法来实现。参见，例如，美国专利第4,673,574号和第4,902,506号。其他活化和缀合方法可以选择使用。
在本文中使用时，“载体蛋白”或“蛋白载体”指可以缀合至抗原(如所述荚膜多糖)的任何蛋白分子，针对所述抗原的免疫应答是期望的。将诸如多糖的抗原缀合至载体蛋白可以使抗原具有免疫原性。载体蛋白优选为无毒和无反应原性并且可以足够量和纯度获得的蛋白。载体蛋白的实例为毒素，类毒素或者来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌(Pseudomonas)物种、大肠杆菌(E.coli)、葡萄球菌(Staphylococcus)物种和链球菌(Streptococcus)物种的毒素的任何突变交叉反应物质(CRM197)。载体蛋白应当可以经受标准缀合过程。在本发明的特定实施方案中，CRM197用作载体蛋白。
CRM197(Wyeth/Pfizer,Sanford,NC)是分离自在酪蛋白氨基酸和基于酵母提取物的培养基中生长的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)菌株C7(β197)的培养物的白喉毒素的无毒变体(即，类毒素)。通过超滤、硫酸铵沉淀和离子交换层析来纯化CRM197。产生CRM197蛋白的白喉棒杆菌菌株C7(197)的培养物已储存在美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，并且已分配登录号ATCC 53281。其他白喉类毒素也适合用作载体蛋白。
其他合适的载体蛋白包括灭活的细菌毒素，如破伤风类毒素、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如国际专利申请WO2004/083251所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST以及来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A。还可以使用细菌外膜蛋白，如外膜蛋白复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌粘附素蛋白(PsaA)、艰难梭菌(C.difficile)肠毒素(毒素A)和细胞毒素(毒素B)或者流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)蛋白D。其他蛋白也可以用作载体蛋白，如卵白蛋白、匙孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)。
荚膜多糖缀合至载体蛋白之后，通过各种技术纯化多糖-蛋白缀合物(多糖-蛋白缀合物的量富集)。这些技术包括，例如，浓缩/渗滤操作、沉淀/洗脱、柱层析和深层过滤。参见下文的实例。
纯化单个缀合物之后，可以将它们组合以配制本发明的免疫原性组合物，例如，其可以用于疫苗。本发明的免疫原性组合物的配制可以利用本领域公知的方法来完成。
注意到在本公开中，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含(comprising)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”等的术语可以具有符合美国专利法的含义；例如，它们可以表示“包括(includes)”、“包括(included)”、“包括(including)”等。这类术语指包括特定成分或成分的组而不排除任何其他成分。诸如“基本上由...组成(consisting essentially of)”和“基本上由…组成(consists essentially of)”的术语具有符合美国专利法的含义，例如，它们允许包括不偏离本发明的新特征或基本特征的额外的成分或步骤，即，它们排除偏离本发明的新特征或基本特征的额外的未列举的成分或步骤，并且它们排除现有技术的成分或步骤，例如本文所引用或援引加入本文的文件，特别是该文件的目的是限定可授权的实施方案，如对于现有技术是新的、非显而易见的、具有创造性的，如对于本文所引用的文件或援引加入本文的文件。并且，术语“由…组成(consistsof)”和“由...组成(consisting of)”具有符合美国专利法的含义；即这些术语是封闭的。因此，这些术语指包括特定成分或成分的组，并且排除所有其他成分。
“保守氨基酸取代”指用具有相似物理和/或化学特性的其他氨基酸残基取代蛋白的一个或多个氨基酸残基。序列内的氨基酸的取代物可以选自所述氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳环结构的氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这类改变不会影响如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳所测定的表观分子量或等电点。特别优选的取代为：Lys取代Arg并且反之亦然，从而可以保留正电荷；Glu取代Asp并且反之亦然，从而可以保留负电荷；Ser取代Thr，从而可以保留游离--OH；以及Gln取代Asn，从而可以保留游离NH2。
“片段”指仅包括较大蛋白的特定结构域的蛋白。例如，如果包括信号序列，ClfA和ClfB蛋白每个含有多达8个结构域。对应于N1N2N3、N2N3、N1N2、N1、N2或N3结构域的多肽每个被认为是ClfA或ClfB的片段。“片段”还指蛋白或多肽，其包含亲本蛋白或多肽的氨基酸序列的至少4个氨基酸残基(优选至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少125个氨基酸残基或者至少150个氨基酸残基)的氨基酸序列；或者核酸，其包含亲本核酸的核苷酸序列的至少10个碱基对(优选至少20个碱基对、至少30个碱基对、至少40个碱基对、至少50个碱基对、至少50个碱基对、至少100个碱基对、至少200个碱基对)的核苷酸序列。
在本文中使用时，抗体的“功能活性”或“功能抗体”指至少可以特异性结合至抗原的抗体。附加功能为本领域已知，并且可以包括例如通过调理、ADCC或补体介导的细胞毒性来影响清除或杀死病原体的免疫系统的附加组分。抗原结合之后，任何随后的抗体功能可以通过所述抗体的Fc区来介导。抗体调理吞噬测定(opsonophagocytic assay，OPA)为体外测定，其设计用来测量体外Ig补体辅助的用效应细胞(白细胞)杀死细菌，从而模仿生物学过程。抗体结合还可以直接抑制其结合的抗原的生物学功能，例如，结合ClfA的抗体可以中和其酶促功能。在一些实施方案中，“功能抗体”指如通过动物效力模型中杀死细菌或者通过证实所述抗体杀死细菌的调理吞噬杀死测定所测量的有功能的抗体。
所述金黄色葡萄球菌荚膜多糖的分子量是用于免疫原性组合物的考虑因素。例如，由于存在于抗原表面的较高价的表位，高分子量荚膜多糖能够诱导某些抗体免疫应答。“高分子量荚膜多糖”的分离考虑用于本发明的组合物和方法。例如，在本发明的一实施方案中，考虑分离分子量大小为约50-约800kDa的5型高分子量多糖。在本发明的一实施方案中，考虑分离分子量大小为约20-约1000kDa的5型高分子量多糖。在本发明的一实施方案中，考虑分离和纯化分子量大小为约50-约300kDa的5型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为70kDa-300kDa的5型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为90kDa-250kDa的5型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为90kDa-150kDa的5型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为90kDa-140kDa的5型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为80kDa-120kDa 的5型高分子量荚膜多糖。可以通过本发明的方法分离和纯化的高分子量血清型5荚膜多糖的其他范围包括约70kDa-约100kDa的分子量大小范围；70kDa-110kDa的分子量大小范围；70kDa-120kDa的分子量大小范围；70kDa-130kDa的分子量大小范围；70kDa-140kDa的分子量大小范围；70kDa-150kDa的分子量大小范围；70kDa-160kDa的分子量大小范围；80kDa-110kDa的分子量大小范围；80kDa-120kDa的分子量大小范围；80kDa-130kDa的分子量大小范围；80kDa-140kDa的分子量大小范围；80kDa-150kDa的分子量大小范围；80kDa-160kDa的分子量大小范围；90kDa-110kDa的分子量大小范围；90kDa-120kDa的分子量大小范围；90kDa-130kDa的分子量大小范围；90kDa-140kDa的分子量大小范围；90kDa-150kDa的分子量大小范围；90kDa-160kDa的分子量大小范围；100kDa-120kDa的分子量大小范围；100kDa-130kDa的分子量大小范围；100kDa-140kDa的分子量大小范围；100kDa-150kDa的分子量大小范围；100kDa-160kDa的分子量大小范围；以及相似的期望的分子量范围。
如上文所讨论的，所述金黄色葡萄球菌荚膜多糖的分子量是用于免疫原性组合物的考虑因素。例如，由于存在于抗原表面的较高价的表位，高分子量荚膜多糖能够诱导某些抗体免疫应答。在本发明的一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为约20kDa-约1000kDa的8型高分子量荚膜多糖。在本发明的一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为约50kDa-约700kDa的8型高分子量荚膜多糖。在本发明的一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为50kDa-300kDa的8型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为70kDa-300kDa的8型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为90kDa-250kDa的8型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为90kDa-150kDa的8型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为90kDa-120kDa的8型高分子量荚膜多糖。在一实施方案中，考虑分离和纯化分子量范围为80kDa-120kDa的8型高分子量荚膜多糖。可以通过本发明的方法分离和纯化的高分子量血清型8荚膜多糖的其他范围包括约70kDa-约100kDa的分子量大小范围；70kDa-110kDa 的分子量大小范围；70kDa-120kDa的分子量大小范围；70kDa-130kDa的分子量大小范围；70kDa-140kDa的分子量大小范围；70kDa-150kDa的分子量大小范围；70kDa-160kDa的分子量大小范围；80kDa-110kDa的分子量大小范围；80kDa-120kDa的分子量大小范围；80kDa-130kDa的分子量大小范围；80kDa-140kDa的分子量大小范围；80kDa-150kDa的分子量大小范围；80kDa-160kDa的分子量大小范围；90kDa-110kDa的分子量大小范围；90kDa-120kDa的分子量大小范围；90kDa-130kDa的分子量大小范围；90kDa-140kDa的分子量大小范围；90kDa-150kDa的分子量大小范围；90kDa-160kDa的分子量大小范围；100kDa-120kDa的分子量大小范围；100kDa-130kDa的分子量大小范围；100kDa-140kDa的分子量大小范围；100kDa-150kDa的分子量大小范围；100kDa-160kDa的分子量大小范围；以及相似的期望的分子量范围。
对免疫原性组合物的“免疫应答”是对象中对存在于所关注的组合物中的分子(例如，抗原，如蛋白或多糖)的体液和/或细胞介导的免疫应答的发展。为了本发明的目的，“体液免疫应答”是抗体介导的免疫应答，并且包括产生具有对存在于本发明的免疫原性组合物中的抗原的亲和性的抗体，而“细胞介导的免疫应答”是T-淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。“细胞介导的免疫应答”是由与主要组织相容性复合体(MHC)的I类分子或II类分子相关的抗原表位的呈递激发的。这激活抗原特异性CD4+T辅助细胞或CD8+细胞毒性T淋巴细胞("CTL")。CTL对与主要组织相容性复合体(MHC)或CD1编码并在细胞表面上表达的蛋白联合呈递的肽或脂质抗原具有特异性。CTL辅助诱导和促进细胞内消灭细胞内微生物，或者裂解感染这类微生物的细胞。细胞免疫的另一方面包括辅助T-细胞的抗原特异性反应。辅助T-细胞辅助刺激功能，并且集中于非特异性效应细胞针对在细胞表面上与经典或非经典MHC分子联合展示肽抗原的细胞的活性。“细胞介导的免疫应答”还指产生细胞因子、趋化因子以及活化的T-细胞和/或其他白细胞所产生的其他这类分子，包括来源于CD4+和CD8+T-细胞的分子。特定抗原或组合物刺激细胞介导的免疫应答的能力可以通过许多测定来确定，例如通过淋巴细胞增殖(淋巴细胞活化)测定、CTL细胞毒性细胞测定，通过测定敏化对象中所述抗原的特异性T-淋巴细胞，或者通过测量对抗原重新刺激反应的T细胞产生的细胞因子。这类测定是本领域公知的。参见，例如，Erickson et al.,J.Immunol.(1993)151:4189-4199；Doe et al.,Eur.J.Immunol.(1994)24:2369-2376。
术语“免疫原性”指抗原或疫苗引起免疫应答的能力，体液或细胞介导的免疫应答或者两者。
“免疫原性量”、或者“免疫有效量”或“剂量”，在本文中每个可交换使用，一般指如通过本领域技术人员已知的标准测定所测量的，足以引起免疫应答的抗原或免疫原性组合物的量，所述免疫应答为细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)应答。
组合物中特定缀合物的量一般基于对所述缀合物缀合和非缀合的总多糖来计算。例如，含有20％游离多糖的CP5缀合物在100mcg CP5多糖剂量中会含有约80mcg缀合的CP5多糖和约20mcg非缀合的CP5多糖。在计算缀合物的剂量时通常不考虑蛋白对所述缀合物的贡献。缀合物的量可以根据葡萄球菌血清型变化。通常，每个剂量会包含0.01-100mcg多糖，特别地0.1-10mcg，并且更特别地1-10mcg。所述免疫原性组合物中不同多糖组分的“免疫原性量”可以不同，并且各自可以包含0.01mcg、0.1mcg、0.25mcg、0.5mcg、1mcg、2mcg、3mcg、4mcg、5mcg、6mcg、7mcg、8mcg、9mcg、10mcg、15mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg或者约100mcg的任何特定多糖抗原。
在另一实施方案中，免疫原性组合物中蛋白组分的“免疫原性量”可以为约10mcg-约300mcg每种蛋白抗原。在特定实施方案中，免疫原性组合物中蛋白组分的“免疫原性量”可以为约20mcg-约200mcg每种蛋白抗原。免疫原性组合物中不同蛋白组分的“免疫原性量”可以不同，并且各自包含10mcg、20mcg、30mcg、40mcg、50mcg、60mcg、70mcg、80mcg、90mcg、100mcg、125mcg、150mcg、175mcg或者约200mcg任何特定蛋白抗原。
抗原作为免疫原的有效性可以通过测量B细胞活性水平来测量，所述B细胞活性水平通过利用免疫测定、免疫沉淀测定、诸如体外调理测定的功能抗体测定以及本领域已知的许多其他测定测量所述抗原的特异性循环抗体的水平来测量。抗原作为T-细胞免疫原的有效性的另一测量可以通过增殖测定、通过细胞溶解测定来测量，如铬释放测定以测量T细胞裂解其特异性靶细胞的能力。此外，在本发明中，“免疫原性量”还可以通过测量施用所述抗原之后诱导的抗原特异性抗体的血清水平来定义，或者如上文所述通过测量这样诱导的抗体增强特定白细胞的调理吞噬能力的能力来定义。免疫应答的保护水平可以通过用已注射的抗原攻击免疫的宿主来测量。例如，如果期望免疫应答的抗原是细菌，“免疫原性量”的抗原所诱导的保护水平可以通过检测用所述细菌细胞攻击动物之后的存活百分比或死亡百分比来测量。在一实施方案中，保护量可以通过测量与细菌感染相关的至少一种症状来测量，例如，与感染相关的发热。多抗原或多组分疫苗或免疫原性组合物中每种抗原的量会相对于每种其他组分变化，并且可以通过技术人员已知的方法来确定。这类方法包括，例如，测量免疫原性和/或体内效力的方法。
术语“免疫原性组合物”涉及含有抗原的任何药物组合物，例如微生物，或者其组分，所述组合物可以用来引起对象中的免疫应答。本发明的免疫原性组合物可以用于通过全身性透皮或粘膜途径施用所述免疫原性组合物来治疗对金黄色葡萄球菌感染易感的人。这些给药可以包括通过肌肉内(i.m.)、腹腔内(i.p.)、皮内(i.d.)或皮下途径注射；通过贴剂或其他透皮递送装置施用；或者通过粘膜给至口腔/消化道、呼吸道或泌尿生殖道。在一实施方案中，鼻内给药用于治疗或预防金黄色葡萄球菌的鼻咽携带，从而在感染的最初阶段减弱感染。在一实施方案中，所述免疫原性组合物可以用于制备疫苗或者用于引出可以用来被动保护或治疗动物的多克隆或单克隆抗体。
特定免疫原性组合物的组分的最佳量可以通过标准研究来确定，包括观察对象中的适当免疫应答。初始免疫接种之后，对象可以接受充分间隔的一次或多次加强免疫。
在本发明的一实施方案中，所述金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段(N1N2N3，或者其组合)、分离的缀合至CRM197的5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的8型荚膜多糖。在另一实施方案中，所述金黄色葡萄球菌免疫原性组合物是重组金黄色葡萄球菌聚集因子(ClfA)片段(N1N2N3，或者其组合)、重组金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3，或者其组合)、分离的缀合至CRM197的5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的8型荚膜多糖的无菌制剂(液体、冻干的、DNA疫苗、皮内制品)。在本发明的一实施方案中，所述金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)片段(N1N2N3，或者其组合)、金黄色葡萄球菌铁结合蛋白MntC、分离的缀合至CRM197的5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的8型荚膜多糖。在一实施方案中，所述金黄色葡萄球菌免疫原性组合物是重组金黄色葡萄球菌聚集因子(ClfA)片段(N1N2N3，或者其组合)、重组金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3，或者其组合)、金黄色葡萄球菌铁结合蛋白MntC、分离的缀合至CRM197的5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的8型荚膜多糖的无菌制剂(液体、冻干的、DNA疫苗、皮内制品)。在本发明的一实施方案中，所述金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3，或者其组合)、分离的缀合至CRM197的5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的8型荚膜多糖。在本发明的一实施方案中，所述金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含重组金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)片段(N1N2N3，或者其组合)、金黄色葡萄球菌铁结合蛋白MntC、分离的缀合至CRM197的5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的8型荚膜多糖。在本发明的一实施方案中，所述金黄色葡萄球菌免疫原性组合物包含金黄色葡萄球菌铁结合蛋白MntC、分离的缀合至CRM197的5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的8型荚膜多糖。
本发明的免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种额外的“免疫调谐剂”，所述免疫调谐剂是扰乱或改变免疫系统的物质，从而观察到体液和/或细胞介导的免疫的上调或下调。在一特定实施方案中，优选体液和/或细胞介导的那部分(arm)的免疫系统上调。某些免疫调谐剂的实例包括，例如，美国专利第5,254,339号等所述的佐剂或细胞因子，或者ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)。可以用于本发明的疫苗的佐剂的非限制性实例包括RIBI佐剂系统(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.)，明矾，诸如氢氧化铝凝胶的矿物凝胶，水包油乳剂，油包水乳剂，例如弗氏完全和不完全佐剂，嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)，QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.)，SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)，佐剂，皂草苷，Quil A或其他皂草苷成分，单磷酰脂质A以及阿夫立定脂质-胺佐剂。在本发明的疫苗中有用的水包油乳剂的非限制性实例包括改良的SEAM62和SEAM 1/2制剂。改良的SEAM62是含有5％(v/v)角鲨烯(Sigma)、1％(v/v)85去污剂(ICI表面活性剂)、0.7％(v/v) 80去污剂(ICI表面活性剂)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml胆固醇以及0.5％(v/v)卵磷脂的水包油乳剂。改良的SEAM 1/2是包含5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)85去污剂、0.7％(v/v)聚山梨酯80去污剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A以及50μg/ml胆固醇的水包油乳剂。可以包括在所述疫苗中的其他“免疫调谐剂”包括，例如，一种或多种白介素、干扰素、或者其他已知的细胞因子或趋化因子。在一实施方案中，所述佐剂可以是环糊精衍生物或聚阴离子聚合物，分别如美国专利第6,165,995号和第6,610,310号所述。应当理解待使用的免疫调谐剂和/或佐剂取决于施用所述疫苗或免疫原性组合物的对象、注射途径以及待施用的注射的数量。
金黄色葡萄球菌“侵入性疾病”是从正常无菌的部位分离细菌，其中有相关的疾病的临床体征/症状。正常无菌的身体部位包括血液、CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、关节/滑液、骨、内部身体部位(淋巴结、脑、心脏、肝、脾、玻璃体液、肾、胰、卵巢)或者其他正常无菌的部位。特征为侵入性疾病的临床病症包括菌血症、肺炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、心内膜炎、败血性休克等。
术语“分离”表示将物质从其原来的环境移出(例如，如果其是天然存在的，自然环境，或者如果其是重组实体，从其宿主生物，或者从一个环境移至不同环境)。例如，“分离”的荚膜多糖、蛋白或肽基本上不含来自细胞或组织来源的细胞物质或其他污染蛋白，所述蛋白来源于所述细胞或组织来源，或者基本上不含化学合成时或以其他方式存在于作为化学反应的部分的混合物中的化学前体或其他化学物质。在本发明中，所述蛋白或多糖可以分离自细菌细胞或细胞碎片，从而以有益于制备免疫原性组合物的方式提供它们。术语“分离(isolated)”或“分离(isolating)”可以包括纯化(purifying)或纯化(purification)，包括例如，如本文所述的纯化蛋白或荚膜多糖的方法。语言“基本上不含细胞物质”包括多肽/蛋白制品，其中所述多肽/蛋白分离自细胞的细胞组分，所述多肽/蛋白从所述细胞分离或重组产生。因此，基本上不含细胞物质的荚膜多糖、蛋白或肽包括含有少于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(干重)的污染蛋白或多糖或其他细胞物质的荚膜多糖、蛋白或肽制品。当所述多肽/蛋白是重组产生的时，其还优选基本上不含培养基，即，培养基代表少于约20％、10％或5％的蛋白制品体积。当多肽/蛋白或多糖是通过化学合成产生的时，其优选基本上不含化学前体或其他化学物质，即，其分离自所述蛋白或多糖合成所涉及的化学前体或其他化学物质。相应地，这类多肽/蛋白或多糖制品含有少于约30％、20％、10％、5％(干重)的除所关注的多肽/蛋白或多糖片段之外的化学前体或化合物。
“非保守氨基酸取代”指用具有不同物理和/或化学特性的其他氨基酸残基取代蛋白的一个或多个氨基酸残基，所述物理和/或化学特性使用上文所定义的特征。
术语“药学可接受的载体”表示联邦管理机构、州政府或其他管理机构批准的载体，或者美国药典或用于动物(包括人以及非人哺乳动物)的其他普遍公认的药典所列的载体。术语“载体”指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的。水、盐溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液可以用作液体载体，特别是用于可注射的溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望，所述组合物还可以含有少量的湿润剂、膨胀剂、乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液剂、混悬剂、乳剂、缓释制剂等的形式。合适的药物载体的实例如E.W.Martin的"Remington's PharmaceuticalSciences"所述。制剂应当适合给药模式。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”指氨基酸残基的多聚体，并且不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等均包括在该定义内。该定义涵盖全长蛋白及其片段。该术语还包括对天然序列的修饰，如缺失、添加和取代(一般在自然中保守，但是其可以是非保守的)，优选使得蛋白保持在施用所述蛋白的动物内引起免疫应答的能力。还包括表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、脂质化(lipidation)、磷酸化等。
“保护性”免疫应答指免疫原性组合物引起体液或细胞介导的免疫应答的能力，所述免疫应答有助于保护对象免受感染。所提供的保护不需要是绝对的，即，如果与对象的对照群体(例如未施用所述疫苗或免疫原性组合物的感染的动物)相比有统计上显著的改善，所述感染不需要被完全阻止或根除。保护可以限于缓解所述感染症状发生的严重程度或速度。一般来说，“保护性免疫应答”包括在至少50％的对象中诱导特定抗原的特异性抗体水平的提高，包括对每种抗原应答的可测量的功能抗体的一些水平。在特定情况下，“保护性免疫应答”可以包括在至少50％的对象中诱导特定抗原的特异性抗体水平的2倍增加或4倍增加，包括对每种抗原应答的可测量的功能抗体的一些水平。在某些实施方案中，调理抗体与保护性免疫应答相关。因此，保护性免疫应答可以通过测量调理吞噬测定中细菌计数减少的百分比来测定，例如下文所述。优选地，细菌计数有至少10％、25％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％或更多减少。
在本文中使用时，术语“重组”简单地指任何蛋白、多肽或者表达通过基因工程方法产生的所关注的基因的细胞。当对蛋白或多肽使用时，术语“重组”表示通过表达重组多核苷酸所产生的多肽。用于本发明的免疫原性组合物的蛋白可以分离自天然来源或通过基因工程方法产生，例如重组ClfA、重组ClfB或重组MntC。在本文中使用时，“重组”进一步描述核酸分子，由于其来源或操作，所述核酸分子与其自然中相关的多核苷酸的全部或部分无关。当对宿主细胞使用时，术语“重组”表示已引入重组多核苷酸的宿主细胞。
在本文中使用时，重组ClfA(rClfA)和重组ClfB(rClfB)指用于本发明的免疫原性组合物的ClfA或ClfB的形式。在一实施方案中，rClfA是ClfA的片段，其包含一个或多个N结构域，例如N1N2N3、N2N3、N2或N3，并且在本文中称为“重组ClfA”或“rClfA”。在一实施方案中，rClfB是ClfB的片段，其包含一个或多个ClfB的N结构域，例如N1N2N3、N2N3、N2或N3，并且在本文中称为“重组ClfB”或“rClfB”。
术语“对象”指哺乳动物、鸟、鱼、爬行动物或任何其他动物。术语“对象”还包括人。术语“对象”还包括家庭宠物。家庭宠物的非限制性实例包括：犬、猫、猪、兔、大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、豚鼠、雪貂、鸟、蛇、蜥蜴、鱼、海龟和蛙。术语“对象”还包括家畜。家畜的非限制性实例包括：羊驼、野牛、骆驼、牛、鹿、猪、马、美洲驼、骡、驴、绵羊、山羊、兔、驯鹿、牦牛、鸡、鹅和火鸡。
在本文中使用时，“治疗(treatment)”(包括其变体，例如，“治疗(treat)”或“治疗(treated)”)指以下的任何一种或多种：(i)如在传统疫苗中，预防感染或再感染，(ii)降低症状的严重程度，或者消除症状，以及(iii)基本上或完全消除有问题的病原体或病症。因此，可以预防性(感染之前)或治疗性(感染之后)影响治疗。在本发明中，可以使用预防性或治疗性治疗。根据本发明的特定实施方案，提供组合物和方法，其治疗宿主动物对抗微生物感染(例如细菌，如葡萄球菌物种)，包括预防性和/或治疗性免疫。本发明的方法有益于赋予对象预防性和/或治疗性免疫。本发明的方法还可以施用于生物医学研究应用的对象。
可交换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指药物组合物，其包含至少一种诱导动物中的免疫应答的免疫原性组合物。
概述
本发明涉及包含至少3种来自葡萄球菌生物体的抗原的免疫原性组合物，例如来自金黄色葡萄球菌。所述抗原可以利用生化分离方法分离自生物体，或者它们可以合成或通过重组方法产生。所述抗原可以是多肽或多糖或者其组合。这些免疫原性组合物可以用于制备疫苗以免疫对象对抗葡萄球菌生物体所引起的感染。适合用于这些组合物的组分在下文中更详细描述。
葡萄球菌免疫原性组合物
金黄色葡萄球菌是各种人类疾病的病原体，所述疾病范围从浅表性皮肤感染至威胁生命的病症，如肺炎、脓毒症和心内膜炎。参见Lowy N.Eng.J.Med.339:580-532(1998)。在侵入性疾病的情况下，金黄色葡萄球菌可以分离自正常无菌的身体部位，包括血液、脑脊髓液CSF、胸膜液、心包液、腹膜液、关节/滑液、骨、内部身体部位(淋巴结、脑、心脏、肝、脾、玻璃体液、肾、胰、卵巢)或者其他正常无菌的部位。这可以导致威胁生命的临床病症，如菌血症、肺炎、蜂窝组织炎、骨髓炎、心内膜炎和败血性休克。成年、老年和儿童患者最有风险感染金黄色葡萄球菌。
本发明的实施方案描述免疫原性组合物中所选的抗原包括分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)以及重组金黄色葡萄球菌MntC蛋白。然后，免疫原性组合物中抗原的特征为一系列组合，以证实特定组合提供免疫应答，所述免疫应答可以优于利用免疫原性组合物的单个组分所产生的免疫应答。相应地，一种组合提供免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。第二组合提供免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。第三组合提供免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。第四组合提供免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。第五组合提供免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。第六组合提供免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。第七组合提供免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。第八组合提供免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽以及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。在一些实施方案中，以上组合进一步包含以下抗原中的至少一种：EkeS、DsqA、KesK、KrkN、KrkN2、RkaS、RrkN、KnkA、SdrC、SdrD、SdrE、Opp3a、DltD、HtsA、LtaS、IsdA、IsdB、IsdC、SdrF、SdrG、SdrH、SrtA、SpA、Sbiα-溶血素(hla)、β-溶血素、纤连蛋白结合蛋白A(fnbA)、纤连蛋白结合蛋白B(fnbB)、凝固酶、Fig、map、Panton-Valentine杀白细胞素(pvl)、α-毒素及其变体、γ-毒素(hlg)及变体、ica、免疫显性ABC转运蛋白、Mg2+转运蛋白、Ni ABC转运蛋白、RAP、自溶素、层粘连蛋白受体、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、Sas A、SasF、SasH、EFB(FIB)、SBI、Npase、EBP、骨唾液酸蛋白结合蛋白II、金黄色葡萄球菌金属蛋白酶前体(AUR)/Sepp1、Cna、及其片段如M55、TSST-1、mecA、聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG/dPNAG)外泌多糖、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、HarA、EsxA、EsxB、肠毒素A、肠毒素B、肠毒素C1以及新自溶素。
金黄色葡萄球菌爆发的流行病学研究显示金黄色葡萄球菌的演化在自然中是克隆的，其中获得成功基因型的单个克隆迅速传播并引起许多感染。因此，认为演化是克隆的。细菌基因组是由较大的更稳定的物种核心基因组以及更多样化的辅助基因集组成。参见Feil et al.,Nature Reviews:Microbiology 2:483-495(2004)。核心基因普遍存在于物种的所有克隆中，而辅助基因不必存在于任何给定克隆中。考虑到金黄色葡萄球菌，利用代表超过90％的金黄色葡萄球菌基因组的DNA微阵列的一个研究发现基因组中78％的基因对所有金黄色葡萄球菌是共有的，因此代表“物种核心”，而剩余的22％是“辅助基因”。辅助基因包含非必需的遗传物质，许多编码毒力因子、介导抗生素抗性的蛋白以及编码与特定宿主环境特异性相互作用的蛋白的基因。参见Fitzgerald et al.,PNAS 98:8821-8826(2001)；Feil et al.,Nature Reviews:Microbiology 2:483-495(2004)。总的来说，核心基因更缓慢演变，而辅助基因是多态的。参见Kuhn et al.,J.Bact.188:169-178(2006)。因此，适当选择的核心基因提供更好的靶抗原用于免疫原性组合物以预防感染。
来自金黄色葡萄球菌的引起疾病的分离菌或克隆型的表面表达的抗原提供能够诱导免疫和功能抗体的抗原的来源。在大分子水平(氨基酸或多糖序列)，可以选择不同疾病分离菌所表达的抗原的保守形式以允许抗体对可能具有疫苗靶标的抗原变异的那些菌株的广泛交叉反应性。
将抗原包括在本文所述的多抗原免疫原性组合物中的一个重要考虑因素是在作为免疫原性组合物施用时，通过在一个或多个细菌感染的动物模型中提供保护所述抗原是否具有证实的效力。各种金黄色葡萄球菌疾病有许多动物模型。这些模型各自具有优点和缺点。
细菌感染的人清除可以通过吞噬细胞摄入之后介导的调理杀死来进行。从利用革兰氏阳性多糖抗原(例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖和金黄色葡萄球菌荚膜多糖)的研究对此有许多令人信服的实例。参见Lee et al.,Crit.Rev.Micro.29:333-349(2003)。对于革兰氏阳性蛋白抗原所诱导的调理活性有较少证据。已观察到吞噬细胞摄入，但是直接杀死较难证实。据证实蛋白的单克隆抗体在感染的动物模型中赋予保护对抗金黄色葡萄球菌攻击；并且除调理吞噬杀死之外的机制可以是所观察到的保护的原因。
具有诸如调理吞噬活性(OPA)的可测量的功能活性的抗体的诱导是特定抗原是否有益于包括在本发明的免疫原性组合物中的一个指标。其他指标包括但不限于如利用抗原特异性抗体所测量的体内表达期间细胞表面上的抗原表达，或者抗体抑制/中和抗原功能的能力。
物种/菌株
任何特定医院或疾病菌株的类型有益于确定起源、克隆关联性以及监测爆发的流行病学。许多方法可用于金黄色葡萄球菌菌株分型。细菌物种的经典实用定义是一组菌株，其特征在于超过70％基因组杂交(DDH的DNA-DNA基因组杂交)以及超过97％的16S核糖体RNA基因序列相同性。参见Vandamme et al.,Microbiol.Rev.60:407-438(1996)。噬菌体分型(BT)是基于其对某些噬菌体型裂解的敏感性的金黄色葡萄球菌菌株分型的方法。参见Blair et al.,Bull.W.H.O.24:771-784(1961)。这种较老的方法缺少实验室之间的重复性，并且有15-20％的分离菌分型失败。
单抗原对多抗原免疫原性组合物
产生了问题，防范主要金黄色葡萄球菌菌株感染的最佳免疫原性组合物是否应当由单一组分或多组分组成。许多研究已显示基于单一蛋白或糖类组分的免疫原性组合物可以在某些动物模型中提供一些保护免受表达该组分的金黄色葡萄球菌菌株的攻击。重要的是，还已证实针对单一抗原的保护可以取决于所选的菌株。
已研究诸如粘附素的表面蛋白作为单一组分疫苗。例如，用金黄色葡萄球菌ClfA免疫的小鼠发展与用对照蛋白的小鼠相比较不严重的关节炎。参见Josefsson et al.,J.Infect.Dis.184:1572-1580(2001)。胶原结合粘附素(cna)的片段在小鼠脓毒症模型中提供保护。参见Nilsson,et al.,J.Clin.Invest.,101:2640-2649(1998)。用ClfB的A结构域免疫小鼠可以减少小鼠模型中的鼻定殖。参见Schaffer et al.,Infect.Immun.74:2145-2153(2006)。
在用于保护免受金黄色葡萄球菌感染的单价免疫原性制剂中研究称为IsdB的14种金黄色葡萄球菌铁螯合蛋白中的一种。这种蛋白在小鼠中已表现出良好的保护效应，并且在非人灵长类中已表现出良好的免疫原性。参见Kuklin et al.,Infect.Immun.74:2215-2223(2006)。
由于金黄色葡萄球菌进化或取代不同蛋白以行使相同或相似功能的巨大潜力，用于保护大部分人免受大多数金黄色葡萄球菌疾病的最佳免疫原性制剂为多抗原制剂，其包含2种或更多种(例如，3、4、5种等)适当选择并存在于免疫原性制剂中的抗原。在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含3种或更多种抗原，所述抗原选自分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)以及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含4种或更多种抗原，所述抗原选自分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)以及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。在某些实施方案中，本发明的免疫原性组合物包含分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖(CP5)、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖(CP8)以及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白作为抗原。
佐剂
在某些实施方案中，如本文所述的免疫原性组合物还包含一种或多种佐剂。佐剂是在与免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答的物质。据证实许多细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性，并且因此用作佐剂，包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见，例如，美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17和18(及其突变形式)；干扰素-α、β和γ；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参见，例如，美国专利第5,078,996号和ATCC登录号39900)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；以及肿瘤坏死因子α和β。有益于本文所述的免疫原性组合物的其他佐剂包括趋化因子，包括但不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES；粘附分子，例如选择素，如L-选择素、P-选择素和E-选择素；粘蛋白样分子，例如，CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整联蛋白家族成员，如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族成员，例如PECAM，ICAM，如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3；共刺激分子，如B7-1、B7-2、CD40和CD40L；生长因子，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6；以及胱天蛋白酶(ICE)。
用来增强免疫应答的合适的佐剂进一步包括但不限于美国专利第4,912,094号所述的MPLTM(3-O-脱酰单磷酰脂质A,Corixa,Hamilton,MT)。合成的脂质A类似物或氨基烷基磷酸葡糖胺化合物(AGP)，或者其衍生物或类似物也适合用作佐剂，其可从Corixa(Hamilton,MT)获得，并且如美国专利第6,113,918号所述。一种这样的AGP为2-[(R)-3-十四酰基氧基-十四酰-氨基]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四-癸酰基氧基-十四酰]-2-[(R)-3-十四酰氧-十四酰-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也称为529(以前称为RC529)。这种529佐剂配制为水性形式(AF)或者为稳定的乳剂(SE)。
其他佐剂包括胞壁酰肽，如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基-磷酰基-氧基)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳剂，如MF59(美国专利第6,299,884号)(含有5％角鲨烯、0.5％聚山梨酯80和0.5％司盘85(任选含有各种量的MTP-PE)，利用诸如Model 110Y微射流机(Microfluidics,Newton,MA)的微射流机配制为亚微粒子)和SAF(含有10％角鲨烯、0.4％聚山梨酯80、5％普流罗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，微射流为亚微乳剂或者涡旋以产生较大粒径的乳剂)；不完全弗氏佐剂(IFA)；铝盐(明矾)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝；爱菲金；阿夫立定；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚交酯/苷；普流罗尼克多元醇；杀死的博德特氏菌(Bordetella)；皂草苷，如美国专利第5,057,540号所述的StimulonTMQS-21(Antigenics,Framingham,MA.)、美国专利第5,254,339号所述的ISCOMATRIX(CSL Limited,Parkville,Australia)以及免疫刺激复合物(ISCOMATRIX)；结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)；细菌脂多糖；合成的多核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸(例如，美国专利第6,207,646号)；IC-31(Intercell AG,Vienna,Austria)，如欧洲专利第1,296,713号和第1,326,634号所述；百日咳毒素(PT)或其变体、霍乱毒素或其变体(例如，美国专利号7,285,281、7,332,174、7,361,355和7,384,640)；或者大肠杆菌不耐热毒素(LT)或其变体，特别是LT-K63、LT-R72(例如，美国专利号6,149,919、7,115,730和7,291,588)。
候选抗原：
ClfA：结构域组织
聚集因子A(ClfA)是与通过纤维蛋白原结合位点结合至宿主基质蛋白有关的金黄色葡萄球菌表面蛋白。ClfA是含有使得蛋白能够共价结合至细胞表面的羧基端LPXTG(SEQID NO:125)基序的蛋白家族的成员。ClfA还属于与结合宿主蛋白相关的另一蛋白家族(微生物表面组分识别粘附基质分子或MSCRAMM)，所述宿主蛋白如纤维蛋白原(被ClfA结合)、纤连蛋白结合蛋白(FnbA和FnbB)、胶原结合蛋白(Cna)等。这些蛋白全部共享介导转运至细胞表面的氨基端信号序列。MSCRAMM还包括A-结构域，其为功能区，含有配体结合的活性位点(例如，纤维蛋白原、纤连蛋白、弹性蛋白、角蛋白)。A-结构域之后是由丝氨酸天冬氨酸重复(SD重复)组成的区域，其被认为跨越肽聚糖层。SD重复之后是跨膜区，其包括LPXTG(SEQID NO:125)基序，用于蛋白共价连接至肽聚糖。ClfA如美国专利第6,008,341号所述。
包含A结构域的N1N2N3的ClfA的配体结合区(图1)跨越氨基酸40-559。ClfA的N结构域已分配如下：N1包括残基45-220；N2包括残基229-369；并且N3包括残基370-559。参见Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)。为了便于参考，N1N2N3结构域可以称为N123，同样地N2N3可以称为N23。在重组N1N2N3的制备中，据发现N1结构域是蛋白酶敏感的，并且作为稳定的配体结合重组片段很容易被切割或水解离开N2N3。参见Deivanayagamet al.EMBO J.21:6660-6672(2002)。ClfA A结构域的纤维蛋白原结合N2N3片段的晶体结构显示N2和N3是受反向平行的β链控制的。除了反向平行的β链，N2结构域含有一个单折叠α螺旋和两个310螺旋，并且N3结构域含有三个310螺旋。参见Deivanayagam et al.EMBOJ.21:6660-6672(2002)。N2和N3的序列比对显示在它们的长度中仅13％序列相同性和36％序列相似性。参见Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)。N2和N3结构域的拓扑结构与经典IgG折叠相似，并且已被提议为IgG折叠的新变体。参见Deivanayagam etal.EMBO J.21:6660-6672(2002)。
ClfA序列
已将称为ClfA的聚集因子蛋白A的基因克隆、测序并且在分子水平详细分析(McDevitt et al.,Mol.Microbiol.11:237-248(1994)；McDevitt et al.,Mol.Microbiol.16:895-907(1995))。来自111个金黄色葡萄球菌引起疾病的分离菌的ClfA的氨基酸序列的序列标识符如表10所示。来自金黄色葡萄球菌菌株PFESA0237的全长(包括信号序列)野生型ClfA的氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示。这个序列在位置338处显示酪氨酸，其在ClfA的突变形式中变为丙氨酸。编码来自金黄色葡萄球菌菌株PFESA0237的野生型ClfA的全长基因如SEQ ID NO:131所示，其包含N123区、重复区和锚定区。ClfA的Y338A突变形式的氨基酸序列如SEQ ID NO:123所示。然而，应当注意到存在于野生型ClfA中SEQ IDNO:130的位置338处并称为Y338A的酪氨酸至丙氨酸的变化在ClfA的突变形式中显示，在SEQ ID NO: 123中位置310处。此外，SEQ ID NO:123的氨基酸序列所示的ClfA的突变形式是没有信号序列的ClfA的成熟形式，因此这是SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:123之间这个突变的位置不同的原因。
ClfB：结构域组织
ClfB是具有纤维蛋白原结合活性的金黄色葡萄球菌，并且触发金黄色葡萄球菌在血浆存在的情况下形成团块。ClfB为MSCRAMM蛋白，并且表现出特征性MSCRAMM结构域组织，包括A-结构域，A-结构域是含有配体结合的活性位点的功能区(例如，纤维蛋白原、纤连蛋白、弹性蛋白、角蛋白)。A-结构域之后是由丝氨酸天冬氨酸重复(SD重复)组成的区域，其被认为跨越肽聚糖层。SD重复之后是跨膜区，其包括LPXTG(SEQ ID NO:125)基序，用于蛋白共价连接至肽聚糖。ClfB如WO 99/27109和美国专利6,680,195所述。
ClfB N端A结构域的内部组织与ClfA中发现的组织非常相似。A结构域由三个亚结构域N1、N2和N3组成。包含A结构域的N1N2N3的ClfB的配体结合区(图1)跨越氨基酸44-585。为了易于参考，N1N2N3结构域可以称为N123，同样地N2N3可以称为N23。ClfB的N结构域已分配如下：N1包括残基44-197；N2包括残基198-375；并且N3包括残基375-585。在ClfA中，发现A结构域的晶体结构具有免疫球蛋白折叠的独特形式，并且通过类比可以推测ClfB的情况是相同的。参见Deivanayagam et al.,EMBO J.21:6660-6672(2002)。虽然ClfB和ClfA的A结构域的组织相似，但是序列相同性仅26％。参见Ni Eidhin et al.,Mol.Microbiol.30:245-257(2002)。
ClfB序列
编码ClfB的基因被分类为核心粘附基因。来自与多种疾病状态相关的金黄色葡萄球菌的92个菌株的ClfB序列如表11所总结。其他序列获得自GenBank。
其他MSCRAMMS
其他MSCRAMMS可以考虑用于本发明的免疫原性组合物。例如，丝氨酸-天冬氨酸重复(Sdr)蛋白SdrC、SdrD和SdrE在一级序列和结构组织方面与ClfA和ClfB相关，并且定位在细胞表面。SdrC、SdrD和SdrE蛋白为细胞壁相关蛋白，具有N端的信号序列和LPXTG(SEQ IDNO:125)基序、C端的疏水结构域和带正电荷的残基。各自还具有SD重复，SD重复含有足够长度的R区以与B基序一起允许配体结合结构域区A在细胞表面高效表达。具有位于细胞表面上的SdrC、SdrD和SdrE的A区，蛋白可以与血浆中的蛋白、细胞外基质或宿主细胞表面上的分子相互作用。Sdr蛋白与ClfA和ClfB享有一些有限的氨基酸序列相似性。像ClfA和ClfB一样，SdrC、SdrD和SdrE也表现出阳离子依赖性配体结合细胞外基质蛋白。
sdr基因紧密相连并串联排列。Sdr蛋白(SdrC、SdrD、SdrE、ClfA和ClfB)特征上包含A区，其中有高度保守的氨基酸序列，可以用来获得共有TYTFTDYVD(SEQ ID NO:126)基序。该基序在不同蛋白之间表现出轻微变异。这种变异与该基序的共有序列如美国专利第6,680,195号所述。在Clf-Sdr蛋白中，这种基序是高度保守的。该基序可以用于免疫原性组合物以赋予对细菌感染的广谱免疫，并且还可以在单克隆或多克隆抗体的制备中用作抗原。这样的抗体可以用来赋予广谱被动免疫。
Sdr蛋白与ClfA和ClfB的不同之处在于含有2-5个额外的110-113个残基的重复序列(B-基序)，位于A区和R区之间。每个B-基序均含有通常在真核蛋白中发现的共有Ca2+-结合EF-手环。通过bisANS荧光分析显示包含5个SdrD的B-重复的重组蛋白的结构完整性是Ca2+依赖性的，表明EF-手是有功能的。当去除Ca2+时，该结构倒塌为未折叠的构象。通过加入Ca2+恢复原有结构。Sdr蛋白的C端R-结构域含有132-170个SD残基。这些之后是许多革兰氏阳性细菌表面蛋白特征性的保守的壁锚定区。
在Sdr和Clf蛋白中，这种B基序是高度保守的，而简并形式出现在纤连蛋白结合MSCRAMMS以及胶原结合蛋白Can中。B基序联合R区是在细胞表面一定距离展示配体结合结构域所必需的。重复B基序是本文所述的SD重复蛋白的亚组的一个共同特性。这些基序在来自菌株PFESA0237的3种Sdr蛋白中发现不同的数目。各个B基序之间有明显不同。最保守的单元是毗邻R区的单元(SdrC B2、SdrD B5和SdrE B3)。它们与其余的不同之处在于几个位点，特别是在C端一半中。值得注意的结构细节是相邻的B重复通常被存在于C端区中的脯氨酸分开，但是脯氨酸从不出现在最后的B重复与R区之间。相反，这个接头的特征在于短的酸性区段(stretch)。这些不同是末端单元具有与其他B基序相比不同的结构或功能作用的证据。SdrD和SdrEN端B基序与其他B基序疏远，并且有许多氨基酸改变，包括小的插入和缺失，而剩余的内部B基序更加高度保守。注意到3种Sdr蛋白每种具有至少一个各种B基序。
Sdr蛋白的C端R-结构域含有132-170个SD残基。这些之后是许多革兰氏阳性细菌表面蛋白特征性的保守的壁锚定区。
用于本发明的免疫原性组合物的其他候选SdrD分子可以来源于各种物种的生物体，其中一些包括以下SdrD，来自金黄色葡萄球菌：菌株USA300FPR3757(蛋白登录号SAUSA300 0547)；菌株NCTC8325(蛋白登录号SAOUHSC 00545)；菌株MW2(蛋白登录号MW0517)；菌株MSSA476(蛋白登录号SAS0520；以及菌株Mu50(蛋白登录号SAV0562)。
可以考虑用于本发明的免疫原性组合物的其他MSCRAMMS包括EkeS、DsqA、KesK、KrkN、KrkN2、RkaS、RrkN和KnkA。这些MSCRAMMS如WO 02/102829所述，其援引加入本文。通过GenBank登录号识别的其他MSCRAMMS包括NP_373261.1、NP_373371.1、NP_374246.1、NP_374248.1、NP_374841.1、NP_374866.1、NP_375140.1、NP_375614.1、NP_375615.1、NP_375707.1、NP_375765.1和NP_375773.1。
5型和8型荚膜多糖
能够引起侵入性疾病的葡萄球菌微生物一般还能够产生荚膜多糖(CP)，所述荚膜多糖包裹细菌并增强其对宿主先天免疫系统清除的抗性。CP将细菌细胞掩盖在保护性荚膜中，使得细菌耐受吞噬细胞裂解和细胞内杀死。缺少荚膜的细菌对吞噬细胞裂解更敏感。荚膜多糖经常是许多细菌病原体的重要毒力因子，包括流感嗜血杆菌、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)和B族链球菌(Group B streptococci)。
荚膜多糖可以用来血清分型细菌的特定物种。分型通常是通过与对荚膜多糖特征性的特定结构或独特表位产生的特异性抗血清或单克隆抗体反应来完成的。包在荚膜内的细菌倾向于生长为光滑菌落，而已失去其荚膜的细菌的菌落显得粗糙。产生粘液外观的菌落称为严重包裹的。金黄色葡萄球菌的1型和2型是严重包裹的，并且很少与疾病相关。
金黄色葡萄球菌的大部分临床分离菌被血清型5或8包裹。5型(CP5)和8型(CP8)荚膜多糖含有相似的由N-乙酰氨基甘露醇醛酸、N-乙酰L-岩藻糖胺和N-乙酰D-岩藻糖胺组成的三糖重复单元。参见Fournier,J.M.et al.,Infect.Immun.45:97-93(1984)和Moreau,M.,et al.,Carbohydrate Res.201:285-297(1990)。这两种CP含有相同的糖，但是糖键和O乙酰化位点不同以产生血清学上不同的免疫反应性模式。
在一些实施方案中，本发明的血清型5和/或8荚膜多糖是O-乙酰化的。在一些实施方案中，5型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度为10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或80-90％。在一些实施方案中，8型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度为10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或80-90％。在一些实施方案中，5型和8型荚膜多糖或寡糖的O-乙酰化程度为10-100％、20-100％、30-100％、40-100％、50-100％、60-100％、70-100％、80-100％、90-100％、50-90％、60-90％、70-90％或80-90％。
所述多糖或寡糖的O-乙酰化程度可以通过本领域已知的任何方法测定，例如，通过质子NMR(Lemercinier and Jones 1996,Carbohydrate Research296；83-96,Jones andLemercinier 2002,J Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30；1233-1247,WO 05/033148或WO 00/56357)。另一常用的方法如Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180；249-261所述。
在一些实施方案中，本发明的血清型5和/或8荚膜多糖用来产生抗体，如通过在动物效力模型中杀死细菌或者通过证实所述抗体杀死细菌的调理吞噬杀死测定所测量的，所述抗体是有功能的。利用单独监测抗体的产生的测定可能未观察到这样的功能性，这未显示O-乙酰化在效力中的重要性。
荚膜流行病学
通过监测临床分离菌，特定荚膜血清型与疾病之间的关联是可能的。已鉴定的金黄色葡萄球菌的8种不同血清型中(Karakawa and Vann(1982)仅血清型1和2是严重包裹的，并且这些很少分离。参见Capsular Polysaccharides of Staphylococcus aureus,p.285-293,In J.B.Robbins,J.C. Hill and J.C.Sadoff(ed.),Seminars in infectiousdisease,vol.4,Bacterial Vaccines.Thieme Stratton,Inc.New York)。调查已显示约85-90％的金黄色葡萄球菌临床分离菌表达CP5或CP8(Arbeit RD,et al.,Diagn.Microbiol.Infect.Dis.(1984)Apr；2(2):85-91；Karakawa WW,et al.,J.Clin.Microbiol.(1985)Sep；22(3):445-7；Essawi T,et al.,Trop.Med.Int.Health.(1998)Jul；3(7):576-83；Na'was T,et al.,J.Clin.Microbiol.(1998)36(2):414-20。大部分CP5和CP8不可分型的菌株一般是在cap5/8基因座中含有突变的5型或8型(Cocchiaro,Gomez et al.,(2006),Mol.Microbiol.Feb.59(3):948-960)。在体外一些菌株的包囊化在几次传代内迅速丢失，这是由于临床诊断荚膜产生所用的培养基中的高磷酸盐浓度的阻遏效应。还报道经过奶牛之后未包裹的分离菌恢复荚膜表达。参见Opdebeck,J.P.et al.,J.Med.Microbiol.19:275-278(1985)。一些不可分型的菌株在适当的生长条件下变为荚膜阳性。
CP5和CP8结构
CP5和CP8的重复单元均由2-乙酰氨基-2-脱氧-D-甘露糖醛酸、2-乙酰氨基-2-脱氧-L-岩藻糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-岩藻糖组成。参见C.Jones et al.,Carbohydr.Res.340:1097-1106(2005)。虽然CP5和CP8具有相同的糖组成，但是已证实它们是免疫上不同的。它们的不同之处在于配糖键和糖醛酸O-乙酰化的位点。观察到FucNAc残基中的一个的菌株依赖性不完全N-乙酰化。参见Tzianabos et al.,PNAS V98:9365(2001)。
免疫原性组合物中的金黄色葡萄球菌荚膜多糖
所述金黄色葡萄球菌荚膜多糖的分子量是用于免疫原性组合物的重要考虑因素。由于存在于抗原表面的更高价的表位，高分子量荚膜多糖能够诱导某些抗体免疫应答。本文所述的方法提供比以前可获得的更高分子量的5型和8型荚膜多糖的分离和纯化。
MntC/SitC/唾液结合蛋白
MntC/SitC/唾液结合蛋白是ABC转运蛋白，并且在表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中有同系物。在本发明中其被称为MntC。这种蛋白是32kDa脂蛋白，并且位于细菌的细胞壁中。参见Sellman et al.,and Cockayne et al., Infect.Immun.66:3767(1998)。在表皮葡萄球菌，其为铁调控操纵子的组分。其显示出相当的与粘附素(包括副血链球菌(S.parasanguis)的FimA)以及具有证实的或推定的金属铁转运功能的ABC转运蛋白家族的脂蛋白的同源性。(金黄色葡萄球菌菌株和序列参见表12。)
金黄色葡萄球菌MntC蛋白
MntC的金黄色葡萄球菌同系物称为唾液结合蛋白，在美国专利第5,801,234号中公开，并且可以包括在本发明的免疫原性组合物中。MntC/SitC/唾液结合蛋白的金黄色葡萄球菌同系物的蛋白序列在菌株Mu50的GenBank登录号NP_371155中找到。(也称为SAV0631。)序列标识符为SEQ ID NO:119。菌株Mu50的完整基因组的核苷酸序列的登录号为NC_002758.2(坐标704988-705917)。
表皮葡萄球菌SitC蛋白
MntC/SitC/唾液结合蛋白的表皮葡萄球菌同系物称为SitC，并且如Sellman等人所公开(Sellman et al.,Infect.Immun.2005October；73(10):6591–6600)。MntC/SitC/唾液结合蛋白的表皮葡萄球菌同系物的蛋白序列在GenBank登录号YP_187886.1中找到。(也称为SERP0290。)。序列标识符为SEQ ID NO:121。
菌株RP62A的完整基因组的核苷酸序列的登录号为NC_002976(坐标293030-293959)。用于本发明的免疫原性组合物的其他候选SitC分子可以来源于各种物种的生物体，其中一些如以下表1所列。
表1
蛋白 物种 实例菌株 蛋白登录号
SitC 溶血葡萄球菌(S.haemolyticus) JCSC1435 BAE03450.1
SitC 表皮葡萄球菌 ATCC 12228 AAO04002.1
SitC 腐生葡萄球菌(S.saprophyticus) ATCC 15305 BAE19233.1
SitC 木糖葡萄球菌(S.xylosus) DSM20267 ABR57162.1
SitC 肉葡萄球菌(S.carnosus) TM300 CAL27186.1
金黄色葡萄球菌铁结合蛋白
考虑用于本发明的免疫原性组合物的另一潜在候选抗原包括金黄色葡萄球菌表面蛋白铁表面决定子B(IsdB)。这种MSCRAMM如Mazmanian等人所述(Mazmanian,SK etal.Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 99:2293-2298(2002))，并且随后在Kuklin等人的小鼠感染模型和猕猴免疫原性研究中已测试和证实其作为疫苗候选是有效的(Kuklin,NA,etal.Infection and免疫,Vol.74,No.4,2215-2223,(2006))。这种IsdB分子存在于金黄色葡萄球菌的各种菌株中，包括菌株MRSA252(蛋白登录号CAG40104.1)；菌株Newman(蛋白登录号BAF67312.1)；菌株MSSA476(蛋白登录号CAG42837.1)；菌株Mu3(蛋白登录号BAF78003.1)；菌株RF122(蛋白登录号CAI80681.1)。
候选抗原：
本发明的免疫原性组合物还可以包括以下抗原的一种或多种：Opp3a、DltD、HtsA、LtaS、IsdA、IsdC、SdrF、SdrG、SdrH、SrtA、SpA、Sbiα-溶血素(hla)、β-溶血素、纤连蛋白结合蛋白A(fnbA)、纤连蛋白结合蛋白B(fnbB)、凝固酶、Fig、map、Panton-Valentine杀白细胞素(pvl)、α-毒素及其变体、γ-毒素(hlg)及变体、ica、免疫显性ABC转运蛋白、Mg2+转运蛋白、Ni ABC转运蛋白、RAP、自溶素、层粘连蛋白受体、IsaA/PisA、IsaB/PisB、SPOIIIE、SsaA、EbpS、Sas A、SasF、SasH、EFB(FIB)、SBI、Npase、EBP、骨唾液酸蛋白结合蛋白II、金黄色葡萄球菌金属蛋白酶前体(AUR)/Sepp1、Cna、及其片段如M55、TSST-1、mecA、聚-N-乙酰葡糖胺(PNAG/dPNAG)外泌多糖、GehD、EbhA、EbhB、SSP-1、SSP-2、HBP、玻连蛋白结合蛋白、HarA、EsxA、EsxB、肠毒素A、肠毒素B、肠毒素C1以及新自溶素。在本发明的某些实施方案中，当所述免疫原性组合物包含某些形式的CP5和/或CP8时，其不可以进一步包含PNAG。
免疫原性组合物制剂
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合物进一步包含佐剂、缓冲剂、冷冻保护剂、盐、二价阳离子、非离子型去污剂、自由基氧化抑制剂、稀释剂或载体中的至少一种。
除了多种葡萄球菌蛋白抗原和荚膜多糖-蛋白缀合物，本发明的免疫原性组合物可以进一步包含一种或多种防腐剂。FDA要求多个剂量(多剂量) 小瓶中的生物制品含有防腐剂，仅有少数例外。含有防腐剂的疫苗产品包括含有苄索氯铵(炭疽)、2-苯氧乙醇(DTaP、HepA、Lyme、脊髓灰质炎(肠胃外))、苯酚(Pneumo、伤寒(肠胃外)、牛痘)和硫柳汞(DTaP、DT、Td、HepB、Hib、流感、JE、Mening、Pneumo、狂犬病)的疫苗。批准用于可注射的药物的防腐剂包括，例如，三氯叔丁醇、间甲苯酚、羟苯甲酯、羟苯丙酯、2-苯氧乙醇、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯甲酸、苯甲醇、苯酚、硫柳汞以及硝酸苯汞。
本发明的制剂可以进一步包含缓冲剂、盐、二价阳离子、非离子型去污剂、诸如糖的冷冻保护剂以及诸如自由基清除剂或螯合剂的抗氧化剂中的一种或多种，或者它们的任何多种组合。任何一种组分(例如，螯合剂)的选择可以决定另一组分(例如，清除剂)是否可取。为给药配制的最终组合物应当无菌和/或无热原。技术人员可以根据各种因素，例如所需的特定储存和给药条件，凭经验确定这些和其他组分的哪种组合包括在本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物中是最佳的。
在某些实施方案中，与肠胃外给药相容的本发明的制剂包含一种或多种生理可接受的缓冲剂，其选自但不限于Tris(trimethamine)、磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、甘氨酸、组氨酸和琥珀酸盐。在某些实施方案中，将所述制剂缓冲至约6.0-约9.0的pH范围内，优选约6.4-约7.4。
在某些实施方案中，调整本发明的免疫原性组合物或制剂的pH是可取的。可以利用本领域的标准技术调整本发明的制剂的pH。可以将所述制剂的pH调整至3.0-8.0。在某些实施方案中，所述制剂的pH可以是、或者可以调整至3.0-6.0、4.0-6.0或5.0-8.0。在其他实施方案中，所述制剂的pH可以是、或者可以调整至约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约5.8、约6.0、约6.5、约7.0、约7.5或约8.0。在某些实施方案中，pH可以是、或者可以调整至范围为4.5-7.5、或者4.5-6.5、5.0-5.4、5.4-5.5、5.5-5.6、5.6-5.7、5.7-5.8、5.8-5.9、5.9-6.0、6.0-6.1、6.1-6.2、6.2-6.3、6.3-6.5、6.5-7.0、7.0-7.5或7.5-8.0。在特定实施方案中，所述制剂的pH为约5.8。
在某些实施方案中，与肠胃外给药相容的本发明的制剂包含一种或多种二价阳离子，包括但不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2，浓度范围为约0.1mM-约10mM，优选最多约5mM。
在某些实施方案中，与肠胃外给药相容的本发明的制剂包含一种或多种盐，包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠和硫酸钾，以肠胃外给药时对象生理可接受的离子强度存在，并且以在最终制剂中产生所选的离子强度或摩尔渗透压浓度的终浓度包括在内。所述制剂的最终离子强度或重量摩尔渗透压浓度是由多种组分(例如，来自缓冲化合物和其他非缓冲盐的离子)决定的。优选的盐NaCl以多达约250mM的范围存在，具有选择以补足其他组分(例如，糖)的盐浓度，从而所述制剂的最终总摩尔渗透压浓度与肠胃外给药(例如，肌肉内或皮下注射)相容，并且会提高所述免疫原性组合物制剂的免疫原性组分在各种温度范围中的长期稳定性。不含盐的制剂会容忍增加的一种或多种所选冷冻保护剂的范围以维持期望的最终摩尔渗透压浓度水平。
在某些实施方案中，与肠胃外给药相容的本发明的制剂包含一种或多种冷冻保护剂，其选自但不限于二糖(例如，乳糖、麦芽糖、蔗糖或海藻糖)和多羟基烃(例如，卫矛醇、甘油、甘露醇和山梨醇)。
在某些实施方案中，所述制剂的摩尔渗透压浓度在约200mOs/L-约800mOs/L的范围内，优选约250mOs/L-约500mOs/L或者约300mOs/L-约400mOs/L的范围。不含盐的制剂可以含有例如约5％-约25％蔗糖，并且优选约7％-约15％或者约10％-约12％蔗糖。或者，不含盐的制剂可以含有例如约3％-约12％山梨醇，并且优选约4％-7％或者约5％-约6％山梨醇。如果加入诸如氯化钠的盐，然后蔗糖或山梨醇的有效范围相对减少。这些和其他这样的重量摩尔渗透压浓度和摩尔渗透压浓度考虑因素在本领域技术内是良好的。
在某些实施方案中，与肠胃外给药相容的本发明的制剂包含一种或多种自由基氧化抑制剂和/或螯合剂。各种自由基清除剂和螯合剂是本领域已知的，并且应用于本文所述的制剂和使用方法。实例包括但不限于乙醇、EDTA、EDTA/乙醇组合、三乙醇胺、甘露醇、组氨酸、甘油、柠檬酸钠、肌醇六磷酸酯、三聚磷酸盐、抗坏血酸/抗坏血酸盐、琥珀酸/琥珀酸盐、苹果酸/马来酸盐、得斯芬、EDDHA和DTPA，以及两种或更多种以上物质的各种组合。在某些实施方案中，可以有效提高所述制剂的长期稳定性的浓度加入至少一种非还原性自由基清除剂。还可以各种组合加入一种或多种自由基氧化抑制剂/螯合剂，例如清除剂与二价阳离子。螯合剂的选择会决定是否需要加入清除剂。
在某些实施方案中，与肠胃外给药的相容的本发明的制剂包含一种或多种非离子表面活性剂，包括但不限于聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯，聚山梨酯-80(吐温80)、聚山梨酯-60(吐温60)、聚山梨酯-40(吐温40)和聚山梨酯-20(吐温20)，聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于Brij 58、Brij 35，以及其他如曲通X-100；曲通X-114、NP40、司盘85和非离子表面活性剂的普流罗尼克系列(例如，普流罗尼克121)，优选组分为约0.001％-约2％(优选最多约0.25％)浓度的聚山梨酯-80或约0.001％-1％(优选最多约0.5％)浓度的聚山梨酯-40。
在某些实施方案中，本发明的制剂包含一种或多种额外的适合肠胃外给药的稳定剂，例如，包含至少一个巯基(-SH)的还原剂(例如，半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、还原谷胱甘肽、巯基乙酸钠、硫代硫酸盐、硫代甘油，或者它们的混合物)。可选地或任选地，可以通过从储存容器去除氧、保护所述制剂免受光照(例如，通过使用琥珀色玻璃容器)来进一步稳定本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物制剂。
本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物制剂可以包含一种或多种药学可接受的载体或赋形剂，其包括本身不诱导免疫应答的任何赋形剂。合适的赋形剂包括但不限于大分子，例如蛋白、糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖(Paoletti et al,2001,Vaccine,19:2118)、海藻糖、乳糖和脂质团聚体(如油滴或脂质体)。这类载体是技术人员公知的。药学可接受的赋形剂如Gennaro,2000,Remington:The Science andPractice of Pharmacy,20th edition,ISBN:0683306472所讨论。
本发明的组合物可以是冻干的或水性形式，即溶液剂或混悬剂。液体制剂可以有利地直接从其包装形式给药，因此对于注射是理想的，不需要如本发明的冻干组合物另有要求地重建于水性介质中。
将本发明的免疫原性组合物直接递送至对象可以通过肠胃外给药(肌肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脉内或者至组织的胞间隙)来完成；或者通过直肠、口服、阴道、体表、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其他粘膜给药。在一优选实施方案中，肠胃外给药通过肌肉内注射，例如至对象的大腿或上臂。注射可以通过针(例如，皮下针)，但是可替代地使用无针注射。典型的肌肉内剂量为0.5mL。本发明的组合物可以制备为各种形式，例如，作为液体溶液剂或混悬剂用于注射。在某些实施方案中，所述组合物可以制备为粉剂或喷雾剂用于肺部给药，例如，在吸入器中。在其他实施方案中，所述组合物可以制备为栓剂或阴道栓剂，或者对于鼻部、耳部、或眼部给药，例如，作为喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉剂。
特定免疫原性组合物的组分的最佳量可以通过标准研究来确定，包括观察对象中适当的免疫应答。初始免疫接种之后，对象可以接受充分间隔的一次或几次加强免疫。
包装和剂型
本发明的免疫原性组合物可以包装为单位剂量或多剂量形式(例如2个剂量、4个剂量或更多)。对于多剂量形式，小瓶相对于预灌装注射器是典型但非必需优选的。合适的多剂量形式包括但不限于：2-10剂量/容器，0.1-2mL/剂量。在某些实施方案中，所述剂量为0.5mL剂量。参见，例如，国际专利申请WO2007/127668，其援引加入本文。
组合物可以存在于小瓶或其他合适的储存容器中，或者可以存在于预灌装的递送装置中，例如，单一组分或多组分注射器，其可以带或不带针头供应。虽然也设想多剂量、预灌装注射器，但是注射器通常但不必需含有单剂量的本发明的含有防腐剂的免疫原性组合物。同样地，小瓶可以包括单剂量，但是可替代地包括多剂量。
有效剂量体积可以常规建立，但是注射用组合物的典型剂量具有0.5mL的体积。在某些实施方案中，将所述剂量配制为施用给人类对象。在某些实施方案中，将所述剂量配制为施用给成年、十几岁的(teen)、青少年(adolescent)、幼儿或婴儿(即，不超过一岁)的人类对象，并且在优选实施方案中可以通过注射给药。
本发明的液体免疫原性组合物还适合重建以冻干形式存在的其他免疫原性组合物。当免疫原性组合物用于这种即时重建时，本发明提供试剂盒，其具有两个或更多个小瓶，两个或更多个已灌装的注射器，或者每种一个或多个，所述注射器的内容物用来在注射之前重建所述小瓶的内容物，或者反之亦然。
或者，本发明的免疫原性组合物可以冻干和重建，例如，利用本领域公知的用于冷冻干燥的多种方法中的一种以形成干燥、规则形状(例如，球形)的颗粒，例如微颗粒或微球体，其具有诸如平均直径大小的颗粒特征，所述平均直径大小可以通过改变用于制备它们的确切方法来选择和控制。所述免疫原性组合物可以进一步包含佐剂，其可以任选与单独的干燥、规则形状(例如，球形)的颗粒(例如，微颗粒或微球体)制备，或者包含在单独的干燥、规则形状(例如，球形)的颗粒(例如，微颗粒或微球体)中。在这类实施方案中，本发明进一步提供免疫原性组合物试剂盒，其包含第一组分和第二组分，所述第一组分包括稳定的干燥免疫原性组合物，任选进一步包含本发明的一种或多种防腐剂，所述第二组分包含用于重建所述第一组分的无菌的水溶液。在某些实施方案中，所述水溶液包含一种或多种防腐剂，并且可以任选包含至少一种佐剂(参见，例如，WO2009/109550(援引加入本文)。
在另一实施方案中，多剂量形式的容器选自由以下容器组成的组中的一种或多种，但是不限于一般实验室玻璃器皿、瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、管(tubing)、管(pipe)、袋、罐、小瓶、小瓶塞(例如，胶塞、螺帽)、安瓿、注射器、双室或多室注射器、注射器塞、注射器柱塞、橡皮塞、塑料瓶盖、玻璃瓶塞、药筒和一次性笔等。本发明的容器不受制造材料限制，并且包括诸如玻璃、金属(例如，钢、不锈钢、铝等)和聚合物(例如，热塑性塑料、弹性体、热塑性塑料-弹性体)的材料。在特定实施方案中，所述形式的容器是具有丁基瓶塞的5mL Schott 1型玻璃小瓶。技术人员应当理解上文所示的形式并不是详尽的清单，而仅仅作为对技术人员的关于本发明可用的各种形式的指导。考虑用于本发明的其他形式可以在来自诸如United States Plastic Corp.(Lima,OH),VWR的实验室设备供应商和制造商的出版的产品目录中找到。
免疫原性组合物的评价
在一实施方案中，本发明提供包含至少3种来自金黄色葡萄球菌生物体的免疫原性组合物。
各种体外测试用来评价本发明的免疫原性组合物的免疫原性。例如，体外调理测定是通过将葡萄球菌细胞、热灭活的含有所考虑的抗原的特异性抗体的血清以及外源性补体来源的混合物一起孵育来进行的。在孵育新鲜分离的多形核细胞(PMN's)或诸如HL60的分化的效应细胞与抗体/补体/葡萄球菌细胞混合物期间，调理吞噬进行。在调理吞噬时抗体和补体包被的细菌细胞被杀死。通过平板接种测定混合物来测定从调理吞噬恢复的存活细菌的菌落形成单位(cfu)。滴度报道为如通过与测定对照比较所测定的给出50％细菌杀死的最高稀释的倒数。
全细胞ELISA测定也用来体外评价所述抗原的免疫原性和表面暴露，其中将所关注的细菌菌株(金黄色葡萄球菌)包被在平板上，例如96孔板，并且使来自免疫动物的测试血清与细菌细胞反应。如果测试抗原特异性的任何抗体与所述抗原的表面暴露的表位反应，其可以通过本领域技术人员已知的标准方法来检测。
然后在体内动物攻击模型中测试任何证实期望的体外活性的抗原。在某些实施方案中，免疫原性组合物用于通过本领域技术人员已知的免疫方法和途径(例如，鼻内、肠胃外、口服、直肠、阴道、透皮、腹腔内、静脉内、皮下等)免疫动物(例如，小鼠)。用特定葡萄球菌菌种(Staphylococcus sp.)的免疫原性组合物免疫动物之后，用葡萄球菌攻击所述动物，并且测定其对葡萄球菌感染的抗性。
在一实施方案中，将不含病原体的小鼠免疫并用金黄色葡萄球菌攻击。例如，将小鼠用一个或多个剂量的免疫原性组合物中的期望抗原免疫。随后，将小鼠用金黄色葡萄球菌攻击，并且在攻击后随时间的推移监测存活。免疫方法
还提供免疫宿主以预防葡萄球菌感染的方法。在一优选实施方案中，所述宿主为人。因此，如本文所述向宿主或对象施用免疫原性量的免疫原性组合物。免疫原性组合物的免疫原性量可以通过进行剂量反应研究来测定，其中用逐渐增加量的所述免疫原性组合物免疫对象，并且分析免疫应答以确定最佳剂量。该研究的起点可以从动物模型中的免疫数据推断。剂量可以根据个人的具体条件变化。所述量可以在常规试验中通过本领域技术人员已知的方法测定。在一些实施方案中，免疫宿主以预防葡萄球菌感染、疾病或病症的方法包括人、兽医、动物或农业治疗。另一实施方案提供免疫宿主以预防与对象中的葡萄球菌相关的葡萄球菌感染、疾病或病症的方法，所述方法包括从本文所述的免疫原性组合物产生多克隆或单克隆抗体制品，并且利用所述抗体制品赋予所述对象被动免疫。
将适当数量的剂量中的免疫有效量的免疫原性组合物施用给对象以引起免疫应答。所治疗的个体不应该表现出更严重的葡萄球菌感染的临床表现。剂量可以根据个体的具体条件变化，例如年龄和体重。这个量可以在常规试验中通过本领域技术人员已知的方法测定。
在一实施方案中，施用本发明的免疫原性组合物的患者表现出金黄色葡萄球菌携带率的减少。从医疗需要的角度，施用免疫原性组合物之后这样的携带的减少或者延长的作为非载体所花的时间间隔是显著的。例如，可以在一个剂量的金黄色葡萄球菌多抗原疫苗之后评估载体中所有金黄色葡萄球菌携带的减少。例如，施用免疫原性组合物之前1天，可以对一组18-50岁的成年筛选携带，通过鼻和咽喉拭子然后培养以测定其携带状态。然后，向该组施用本发明的免疫原性组合物，同时一组接受对照。鼻和咽喉拭子在12周的时间中每周进行，然后每月进行直至施用所述免疫原性组合物后6个月，并且与安慰剂比较。一个主要终点是在免疫后3个月的间隔比较施用免疫原性组合物对安慰剂之后患者中的携带率。
葡萄球菌感染的动物模型
下文描述用于评价本文所述的免疫原性组合物中的任一种的效力的几种动物模型。
小鼠脓毒症模型(被动或主动)
被动免疫模型
将小鼠用免疫IgG或单克隆抗体腹腔内(i.p.)被动免疫。随后24小时后将小鼠用致死剂量的金黄色葡萄球菌攻击。静脉内(i.v.)或i.p施用细菌攻击，确保任何存活均可以归因于抗体与细菌的特异性体内相互作用。细菌攻击剂量确定为达到约20％未免疫的对照小鼠的致死脓毒症所需的剂量。存活研究的统计评价可以通过Kaplan-Meier分析来进行。
主动免疫模型
在这个模型中，将小鼠(例如，Swiss Webster小鼠)在第0、3和6周(或者其他相似的适当间隔的免疫接种时间表)用靶抗原腹腔内(i.p.)或皮下(s.c.)主动免疫，并且随后在第8周通过静脉内途径用金黄色葡萄球菌攻击。细菌攻击剂量标定为在10-14天的时间内于对照组中达到约20％存活。存活研究的统计评价可以通过Kaplan-Meier分析来进行。
感染性心内膜炎模型(被动或主动)
金黄色葡萄球菌所引起的感染性心内膜炎(IE)的被动免疫模型先前已用来显示ClfA可以诱导保护性免疫。参见Vernachio et al.,Antmicro.Agents&Chemo.50:511-518(2006)。在这个IE的模型中，兔或大鼠用来模拟临床感染，包括中心静脉导管、菌血症以及血源性移种(hematogenous seeding)至远端器官。向具有无菌主动脉瓣赘生物的插入导管的兔或大鼠施用单静脉内注射或多静脉内注射的靶抗原特异性的单克隆或多克隆抗体。随后，将动物用金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌株i.v.攻击。然后，攻击之后，将心脏、心脏赘生物和包括肾在内的其他组织以及血液收获并培养。然后测量心脏组织、肾和血液中葡萄球菌感染的频率。在一研究中，当用MRSE ATCC 35984或MRSA 67-0攻击动物时，利用ClfA的多克隆抗体制品或单克隆抗体显示出感染率的显著减少。参见Vernachio et al.,Antmicro.Agents&Chemo.50:511-518(2006)。
感染性心内膜炎还适用于兔和大鼠中的主动免疫研究。将兔或大鼠用靶抗原肌肉内或皮下免疫，并且2周后通过静脉内途径用金黄色葡萄球菌攻击。
肾盂肾炎模型
在肾盂肾炎模型中，将小鼠在第0、3和6周(或者其他适当间隔的免疫时间表)用靶抗原免疫。随后，将该动物用金黄色葡萄球菌PFESA0266 i.p.或i.v.攻击。48小时后，收获肾，并且将细菌CFU计数。
抗体和抗体组合物
本发明进一步提供特异性和选择性结合至本发明的免疫原性组合物的一种或多种抗原的抗体和抗体组合物。在一些实施方案中，在给对象施用本发明的免疫原性组合物时产生抗体。在一些实施方案中，本发明提供纯化或分离的针对本发明的免疫原性组合物的一种或多种抗原的抗体。在一些实施方案中，如通过在动物效力模型或调理吞噬杀死测定中杀死细菌所测量的，本发明的抗体是有功能的。在一些实施方案中，本发明的抗体赋予对象被动免疫。本发明进一步提供编码本发明的抗体或抗体片段的多核苷酸分子，以及利用本领域技术人员公知的技术产生本发明的抗体或抗体组合物的细胞或细胞系(例如杂交瘤细胞或者用于重组产生抗体的其他工程细胞系)和转基因动物。
本发明的抗体或抗体组合物可以用于治疗或预防与对象中的葡萄球菌相关的葡萄球菌感染、疾病或病症，所述方法包括产生多克隆或单克隆抗体制品，并且利用所述抗体或抗体组合物赋予所述对象被动免疫。本发明的抗体还可以用于诊断方法，例如，检测本发明的免疫原性组合物的一种或多种抗原的存在或者定量本发明的免疫原性组合物的一种或多种抗原的水平。
实施例
以下实例证实本发明的一些实施方案。然而，应当理解关于本发明的条件和范围，这些实例仅为了说明而不应视作完全确定的。应当理解当给出典型反应条件(例如，温度、反应时间等)时，虽然一般不太方便，但是在指定范围之上和之下的条件也可以使用。除非另有说明，本文所提到的所有部分和百分比均在重量基础上，并且所有温度均以摄氏度表示。
此外，除非另有详细描述，以下实例均利用本领域技术人员公知和常规的标准技术进行。如上文所述，以下实例为了说明目的而出现，并且不应当理解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：抗原ClfA和ClfB的产生
聚集因子A(ClfA)和B(ClfB)是负责结合至包括纤维蛋白原(ClfA,ClfB)和细胞角蛋白10(ClfB)在内的宿主蛋白的金黄色葡萄球菌表面蛋白。ClfA和ClfB是含有使得蛋白能够共价连接至细胞表面的羧基端LPXTG(SEQ ID NO:125)基序的蛋白家族的成员。ClfA和ClfB均属于识别和结合诸如纤维蛋白原(ClfA和ClfB)、纤连蛋白(FnbA和FnbB)、胶原(Cna)等的宿主细胞外基质蛋白的蛋白家族(微生物表面组分识别粘附基质分子或MSCRAMM)。这些蛋白全部享有介导转运至细胞表面的氨基端信号序列。MSCRAMM还包括A-结构域，所述A-结构域是含有纤维蛋白原、纤连蛋白、弹性蛋白和角蛋白的配体结合位点的功能区。所述A-结构域之后可以是由丝氨酸-天冬氨酸重复(SD重复)组成的区域，据认为该区域跨越肽聚糖层。所述SD重复之后是包括将蛋白共价连接至肽聚糖的LPXTG(SEQ ID NO:125)基序的跨膜区。
包含A结构域的N1N2N3的ClfA和ClfB的配体结合区跨越氨基酸40-559。ClfA/ClfB的N结构域已分配如下：N1包括残基45-220；N2包括残基229-369；并且N3包括残基370-559。参见Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)。在重组ClfA N1N2N3的制备中，据发现N1结构域是蛋白酶敏感的，并且作为稳定的配体结合重组片段很容易被切割或水解离开N2N3。参见Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)。相似地，据证实ClfB的N1结构域也是蛋白酶敏感的，并且可以很容易被金黄色葡萄球菌金属蛋白酶切割(McAleese,F.M.et al.J.Biol.Chem.2001,276,pp.29969-29978)。ClfAA结构域的纤维蛋白原结合N23片段的晶体结构显示N2和N3是受反向平行的β链控制的。除了反向平行的β链，N2结构域含有一个单折叠α螺旋和两个310螺旋，并且N3结构域含有三个310螺旋。参见Deivanayagam etal.EMBO J.21:6660-6672(2002)。
N2和N3的序列比对显示在它们的长度中仅13％序列相同性和36％序列相似性。参见Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)。N2和N3结构域的拓扑结构与经典IgG折叠相似，并且已被提议为IgG折叠的新变体。参见Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)。
用于本文所述的免疫原性组合物的ClfA的重组形式是包含一个或多个N结构域的ClfA片段，例如N1N2N3、N2N3，并且在本文中称为“重组ClfA”或“rClfA”。此外，任何rClfA应当是这样的，其保持单个N结构域和关键表位的天然结构，但是施用之后不干扰免疫个体的正常加工(即，不结合纤维蛋白原)。突变研究已显示突变Y338A(N2)完全消除N23片段结合至纤维蛋白原。(这个Y338A位置指前导序列仍然连接的多肽序列的未成熟形式中位置338处从酪氨酸变为丙氨酸。这种变化可以在证实缺少结合至纤维蛋白原的SEQ ID NO:123的突变ClfA多肽的成熟形式中的位置310处见到。)参见Deivanayagam et al.EMBO J.21:6660-6672(2002)。因此，在以下研究中ClfA的所有片段均已采用所述Y338A突变。
相似地，用于本文所述的免疫原性组合物的ClfB的重组形式是包含一个或多个N结构域的ClfB片段，例如N1N2N3、N2N3，并且在本文中称为“重组ClfB”或“rClfB”。此外，任何rClfB应当是这样的，，其保持单个N结构域和关键表位的天然结构，但是施用之后不干扰免疫个体的正常加工(即，不结合纤维蛋白原)。(参见，例如，Walsh,E.J.etal.Microbiology(2008),154,550-558)。
ClfA和ClfB：克隆方法综述
用来产生临床前效力数据的不同形式的rClfA蛋白包括HisClfA(N123)；T7ClfA(N123)；T7ClfA(N123)；Y338A；ClfA(N23)和ClfA(N23)Y338A。参见图1。ClfA基因含有对应于残基40-559的来自金黄色葡萄球菌PFESA0237的A区编码序列。将克隆自金黄色葡萄球菌的阅读框融合至载体的N端HisTag和接头序列(MRGSHHHHHHGS SEQ ID NO:127)，伴随着引入在C端的3个额外的编码序列(KLN)。(详细过程参见下文。)表达自这个载体的蛋白用于所有实验，其中该蛋白称为HisClfA(N123)。
不同形式的rClfA来源于A区(金黄色葡萄球菌PFESA0237表达的ClfA的残基40-559(顶行)。利用pQE30中含有的T5启动子表达HisClfA(N123)，并且利用基于T7的pET表达系统表达所有其他形式。
两种形式的ClfB(T7ClfB N1N2N3和ClfB N23)用于临床前动物研究。
ClfA克隆方法
克隆来自金黄色葡萄球菌菌株PFESA0237的对应于氨基酸残基40-559的ClfA编码序列，并且引入突变Y338A以消除纤维蛋白原结合。将突变的ClfA基因引入T7RNA聚合酶表达载体pET9a(Novagen)以提供质粒pLP1179。pLP1179中包含T7启动子的区域和编码区的DNA序列为SEQ ID:124。将该表达载体转化入大肠杆菌BLR(DE3)(Novagen)用于产生重组ClfA。
T7ClfA(N123)Y338A的构建包括几个步骤。用来构建最终表达质粒pLP1179的克隆步骤的总结如图2所示。
存在于pQEClf40中的clfA DNA序列对应于原来克隆入pQE30的BamHI/HindIII克隆位点的ClfA的氨基酸残基40-559。这产生了在ClfA的N端的HisTag融合，并且在C端添加了3个残基。将存在于(AmpR)pQEClf40中的ClfA编码区亚克隆入KanR pET 27b载体(Novagen)以产生pLP1137。此外，将对应于氨基酸残基221-559的clfA DNA序列克隆如pET27b的NdeI-HindIII克隆位点以产生pLP1134。通过将BamHI-BlpI DNA片段从pQEClf40亚克隆至pET9a(Novagen)来用N端T7代替ClfA的N端HisTag以产生pLP1153。存在于pLP1153中的T7ClfA(N123)的编码序列含有来自pET9a的T7标签的11个N端氨基酸残基，之后是来自接头序列的3个氨基酸残基加上原来存在于pQE30Clf40中的3个C端接头来源的残基。首先将Y338A突变引入pLP1134的ClfA(N23)编码序列以产生pLP1168。然后将来自pLP1168的ClfA(N23)的含有Y338A突变的PstI-SnaBI DNA片段替换入pLP1153的T7ClfA(N123)编码序列的PstI-SnaBI以产生pLP1171。通过T7rClfA Y338AORF的DNA位置339和342处的沉默突变来改变存在于pLP1171的T7ClfA(N123)Y338A的编码序列中的内部核糖体结合位点，分别从G变为T和从G变为A。然后所得的质粒pLP1176用来去除最初来源于pQE30Clf40的T7标签与ClfA编码区起始之间的3个外来残基。3个接头来源的C端残基也在这时去除。
所得的质粒pLP1179(图2和3)表达的rClfA仅含有融合至ClfA(N123)Y338A的残基40-559的11个N端氨基酸。包含T7启动子和pLP1179的T7rClfA(N123)Y338A的编码序列的区域的DNA序列为SEQ ID NO 124。
细菌菌株和质粒
质粒骨架pET9a(获得自Novagen)用于构建从T7启动子表达T7ClfA(N123)Y338A的pLP1179。该质粒含有用于阳性选择的卡那霉素抗性基因(KanR)。BL21(DE3)大肠杆菌宿主菌株[F-ompT hsdSB(rB -mB -)gal dcm(DE3)](Novagen)最初用来获得T7ClfA(N123)Y338A的表达。DE3命名表示含有在lacUV5(IPTG可诱导的)启动子的控制之下的T7RNA聚合酶基因的λ溶源菌，其用于诱导表达T7RNA聚合酶，随后从接近存在于pLP1179 中的ClfA(N123)Y338A编码序列的T7启动子转录。当收到BL21(DE3)溶源宿主菌株能够在大规模发酵时诱导裂解性噬菌体的信息时，将宿主菌株变为recA BLR(DE3)宿主菌株[F-ompT hsdSB(rB -mB -)gal dcmΔ(sri-recA)306::Tn10(TcR)(DE3)](Novagen)
ClfA的产生和纯化
为了产生ClfA，使大肠杆菌BLR(DE3)/pLP1179在确定成分培养基中以葡萄糖补料分批模式在生物反应器中生长。当培养物达到30-50之间的光密度(OD600)时，通过加入IPTG来诱导ClfA的表达。诱导后3-16小时之间收获培养物。
使细胞破裂，并且收集澄清的可溶部分。加入硫酸铵之后，将该物质施用于含有苯基-琼脂糖树脂的柱并洗脱。将含有ClfA的部分鉴定、透析并装上阴离子交换柱(Q-琼脂糖)。用盐梯度洗脱之后，将含有ClfA的部分鉴定、通过超滤浓缩并装上大小排阻柱(Superdex-75)。将含有ClfA的部分鉴定并集中。如通过SDS-PAGE所测量的，在这个点ClfA的纯度为约98％。
ClfB N1N2N3的克隆和纯化
将对应于氨基酸残基44-542的ClfB编码序列克隆入T7RNA聚合酶表达载体pET28a(Novagen)以提供质粒pPX1189。将该表达载体转化入大肠杆菌BLR(DE3)(Novagen)用于产生重组ClfB。(参见Walsh,et al.,Microbiology 154:550-558(2008)。)
为了产生ClfB，使大肠杆菌BLR(DE3)/pLP1179在确定成分培养基中以葡萄糖补料分批模式在生物反应器中生长。当培养物达到30-50之间的光密度(OD600)时，通过加入IPTG来诱导ClfB的表达。诱导后3-16小时之间收获培养物。
使细胞破裂，并且收集澄清的可溶部分。将可溶部分的pH调整至约pH 3.2，并且去除沉淀的杂质。将含有ClfB的可溶部分的pH重新调整至约pH 8.0并透析以去除盐。加入硫酸铵之后，将该物质施用于含有苯基-琼脂糖树脂的柱并洗脱。将含有ClfB的部分鉴定、透析并装上阴离子交换柱(Q-琼脂糖)。用盐梯度洗脱之后，将含有ClfB的部分鉴定、通过超滤浓缩并装上大小排阻柱(Superdex-75)。将含有ClfB的部分鉴定并集中。如通过SDS-PAGE所测量的，在这个点ClfB的纯度为约94％。
实施例2：抗原的产生：金黄色葡萄球菌(Staph Aureus)MntC
克隆金黄色葡萄球菌脂质化的MntC
重组MntC最初克隆自金黄色葡萄球菌菌株Mu50。通过PCR从金黄色葡萄球菌Mu50基因组DNA扩增rMntC编码序列。两对嵌套引物用于所述扩增(表2)。第一对引物5'SA926-MntC ups和3'SA926-MntC down比对至rMntC的开放阅读框的上游和下游序列。第二套引物比对至rMntC的编码序列，允许扩增对应于氨基酸残基19-309的序列。将限制酶位点加在这些引物的5'端以促进定向克隆。在Peltier热循环仪(MJ Research Inc,Walthan,MA)中用TaKaRa PrimeSTAR HS DNA聚合酶预混合液(Takara Bio USA,Madison,WI)进行PCR。将PCR产物通过QIAEX II(Qiagen,Valencia,CA)来纯化，用适当的限制性内切核酸酶(NewEngland BioLabs,Ipswich,MA)切割，并且亚克隆入araBAD启动子驱动的表达载体pBAD18Cm。这个载体还含有来自流感嗜血杆菌(H.influenza)的脂蛋白P4的信号肽。将MntCPCR产物符合读框地亚克隆至P4信号肽下游以产生pLP1194。pLP1194的MntC编码区的DNA序列如SEQ ID NO:120所示。表达自pLP1194的MntC为脂蛋白。将重组质粒DNA通过ABI PRISMBigDyeTM Terminator V.3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)来测序，并且在大肠杆菌BLR(NOVAGEN)中表达重组蛋白用于产生脂质化的rMntC。
脂质化MntC的产生和纯化
为了产生脂质化MntC，使大肠杆菌BLR/pLP1194在确定成分培养基中以葡萄糖补料分批模式在生物反应器中生长。当培养物达到约60的光密度(OD600)时，通过将补料转换为葡萄糖和阿拉伯糖的混合物来诱导rMntC的表达。诱导后约24小时收获培养物。
使细胞破裂，并且收集不溶部分。据发现由于脂质修饰，脂质化MntC与细胞膜相关。用去污剂(Zwittergent ZW-312)从膜部分提取MntC。去除不溶碎片之后，发现脂质化MntC在可溶部分中。将可溶部分施用于含有混合模式树脂的柱，并且用线性盐和pH梯度洗脱。将含有MntC的部分鉴定并集中。将硫酸铵加入池，将该物质施用于含有丁基-琼脂糖的柱并洗脱。将含有MntC的部分鉴定、脱盐并装上阳离子交换柱(SP-琼脂糖)。用盐梯度洗脱之后，将含有rMntC的部分鉴定并集中。
克隆金黄色葡萄球菌非脂质化MntC
通过从质粒pLP1194PCR扩增来分离用于表达非脂质化rMntC的DNA序列。所得的序列对应于氨基酸残基19-309，并且不含引导分泌和脂质化的信号序列。pLP1215的rMntC编码区的DNA序列在DNA SEQ ID NO:120中找到。
为了产生pLP1215，通过PCR从pLP1194扩增MntC。存在于pLP1215中的MntC DNA序列对应于氨基酸残基19-309，并且将这个构建体的第一个密码子引入用于扩增该基因的正向引物。用于PCR的引物也在5'端含有限制酶位点以促进定向克隆(表2)。扩增基因的PCR和纯化如上文所述进行。将纯化的PCR产物用适当的限制性内切核酸酶(New EnglandBioLabs,Ipswich,MA)切割，并且亚克隆入T7启动子驱动的表达载体pET28a(Novagen,Madison,WI)。将重组质粒DNApLP1215通过ABI PRISM BigDyeTM Terminator V.3.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)来测序，并且在大肠杆菌BLR(DE3)中表达重组蛋白。将pLP1215的质粒DNA纯化并用于转化大肠杆菌HMS174(DE3)以评价蛋白表达。
表2：MntC引物。
合成寡核苷酸用来产生rMntC构建体。限制性内切核酸酶位点有下划线。黑体的核苷酸显示非脂质化rMntC构建体的第一个密码子。
非脂质化rMntC的产生和纯化
为了产生非脂质化rMntC，使大肠杆菌HMS174(DE3)/pLP1215在确定成分培养基中以葡萄糖补料分批模式在生物反应器中生长。当培养物达到约60-80的光密度(OD600)时，通过加入IPTG来诱导rMntC的表达。诱导后约24小时收获培养物。使细胞破裂，并且收集澄清的可溶部分。将裂解液施用于含有阳离子交换树脂(SP-琼脂糖)的柱，并且用线性盐梯度洗脱。鉴定含有MntC的部分。加入硫酸铵之后，将该物质施用于含有苯基-琼脂糖树脂的柱并洗脱。洗脱之后，将含有rMntC的部分鉴定、集中并脱盐。如通过SDS-PAGE所测量的，在这个点rMntC的纯度为>95％。
实施例3：荚膜多糖CP5和CP8的产生
在这个实施例中，描述了各种大小的金黄色葡萄球菌荚膜多糖5型和8型的产生。CP5和CP8多糖的结构如图4所示。本文所述的方法在产生具有约50kDa-800kDa的分子量的CP5和CP8中是有效的。基于生长特征和所产生的荚膜的质量，选择菌株PFESA0266用于CP5的产生，而菌株PFESA0005或PFESA0286用于CP8的产生。据证实分离自菌株PFESA0005和PFESA0286的荚膜是相同的。
为了产生荚膜多糖，使所述菌株在主要由碳源(乳糖或蔗糖)、作为氮源的水解大豆粉和痕量金属组成的复杂培养基中生长。使所述菌株在生物反应器中生长2-5天。
用于制备缀合物的CP5和CP8的纯化是通过两种不同方法来进行的，所述方法依靠升高的温度和低pH以影响荚膜从细胞释放并降低多糖的分子量。所得的分子量取决于水解步骤的时间、温度和pH。
利用表3所指定的技术进行CP5和CP8的表征。通过这种方法所产生的荚膜多糖导致具有低水平的蛋白、NA、肽聚糖和TA污染物的纯多糖。参见表4和5。
表3：纯化的金黄色葡萄球菌CP5和CP8的表征测定
在第一种方法中，荚膜从细胞释放并降低分子量之后，将荚膜制品用酶混合物(核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、溶菌酶和蛋白酶)处理以消化杂质。孵育之后，通过加入乙醇(终浓度约25％)来沉淀残余杂质。去除残余乙醇之后，将含有荚膜的溶液装上阴离子交换柱(Q-琼脂糖)并用线性盐梯度洗脱。将含有荚膜的部分集中并用偏过碘酸钠处理。这种处理导致残余磷壁酸污染物的氧化水解，但是不影响CP5或CP8。通过加入乙二醇来猝灭该反应。将该物质浓缩并对dH20渗滤以去除任何残余试剂和副产物。
第二种方法用来产生荚膜，不包括使用酶消化各种细胞来源的杂质。在这种方法中，荚膜从细胞释放并降低分子量之后，通过微量过滤然后超滤和渗滤来使水解发酵培养液澄清。将该溶液用活性炭处理以去除杂质。炭处理之后，将该物质用偏过碘酸钠处理以氧化残余磷壁酸，然后用丙二醇猝灭。将该物质浓缩并对dH2O渗滤以去除任何残余试剂和副产物。
利用任一种方法所产生的荚膜导致具有低水平的蛋白、核酸和磷壁酸污染物的纯多糖。所述方法可以用于简单地通过改变水解条件来产生特定范围的期望的高分子量多糖。70-150kDa的特别有利范围的高分子量多糖用于通过将多糖缀合至载体蛋白来制备免疫原性组合物。
可通过本文所述的方法获得的高分子量荚膜多糖的实例如下文表4所示。如无TA、肽聚糖和低残余蛋白所示，纯化的较高MW CP5的批次也具有高纯度。参见表4。这些实例中的分子量的范围跨越132.7kDa-800kDa，而且纯化的多糖是高度O-乙酰化的，范围为90-100％，并且100％N-乙酰化。参见表4。
可通过本文所述的方法获得的较低分子量荚膜多糖的实例如下文表5所示。如无磷壁酸(TA)、肽聚糖和较低残余蛋白所示，纯化的较低MW CP8的批次具有高纯度。参加表5。较低分子量的范围跨越20.4kDa-65.1kDa，并且纯化的多糖是高度O-乙酰化的，范围为75-96％。核酸污染的水平很低，范围为0.5-％-2.45％。参见表5。
表4：CP5制品的表征
表5：CP8制品的表征
荚膜多糖的分子量选择
这个动力学分析证实通过本文所述的方法可以产生广泛分子量的荚膜多糖。最初，通过细菌细胞产生较大的多糖，随后，期望的分子量范围可以通过操纵加热和水解步骤的pH和加热条件来选择然后纯化。
金黄色葡萄球菌发酵培养液的加热处理是发酵和CP回收之间的加工步骤。这个加工步骤利用加热处理pH已调整的培养液一段指定的时间。在低pH下加热处理的目的是杀死细胞、灭活肠毒素、释放细胞结合多糖并将分子量降低至期望大小。在这些目的中，就这个步骤所需的加工时间而言，降低分子量是最慢的。因此，在所考虑的处理时间内其他目的必然实现。
加热处理
测定用于选择各种分子量范围的荚膜多糖的温度和pH条件。用浓硫酸调整培养液pH。然后，将培养液温度提高至设定值。温度一达到设定点加热处理时间就开始。当达到期望的处理时间时，将培养液冷却至室温。采集过程中样品以分别通过HPLC和SEC-MALLS系统测定多糖浓度和分子量。MW数据用于动力学分析。随时间的推移测定CP5在pH 4.0、4.5和5.0下的MW谱以及CP8在pH 3.5、4.0和5.0下的MW谱。参见图5A和5B。
利用获得自所述方法的纯化的CP-5和CP-8进行多糖的温和酸水解的动力学。将纯化的多糖溶液用硫酸调整至实验期望的pH。将样品放置在装备有精确温度控制系统的油浴中。将每个样品在预定的时间间隔取出并在冰桶中急速冷却。在实验结束时，将等分的1MTris缓冲液(pH 7.5)加入样品以将pH调回至约7。通过SEC-MALLS系统分析样品。MW数据用于动力学分析。随时间的推移测定温度对pH 4.5下的CP5和pH 3.5下的CP8的MW谱的影响。参见图6A和6B。这个酸水解过程可以利用发酵罐培养物、或者在纯化的中间阶段、或者如本文所示利用纯化的多糖来完成。诸如超声处理或剪切(sheer)的其他分子量降低步骤可以相似地完成。
结果
对于CP-5和CP-8，加热处理中pH对降低MW的影响分别如图5A和5B所示。可以看到较低pH在减少多糖的大小中更有效。该数据还显示在相同pH下，CP-5比CP-8更难以水解。考虑到CP8谱，300kDa-600kDa的分子量范围可以利用pH 5在95℃下持续15分钟-120分钟来产生。同样地，选择pH 4在95℃下持续15分钟-120分钟可以产生250kDa-450kDa的CP8多糖分子量范围。此外，选择pH 3.5在95℃下持续15分钟-120分钟可以产生120kDa-450kDa的CP8多糖分子量范围。
温度对MW降低的影响是利用从回收过程回收的纯化的多糖来进行的。结果如图6A和6B所示。如图所示，温度越高，水解速率越快，并且随时间产生的多糖的分子量范围越广。在相同pH下，使用较低的温度55℃对95℃产生较窄的多糖分子量范围。
此外，图7证实纯化的CP5和CP8的分子量与温和酸水解处理时间之间的相关性。纯化的多糖是获得自先前详述的回收过程的终产物。如图7所示，增加在pH 4.5下加热处理金黄色葡萄球菌PFESA0266菌株的时间导致产生较小分子量的CP5多糖，而在pH 4.5下较短的加热处理时间导致产生较高分子量的CP5多糖。CP5多糖的大小范围为约90kDa-约220kDa，取决于在低pH(4.5)下加热处理的时间长度。同样地，增加在pH 3.5下加热处理金黄色葡萄球菌PFESA0005菌株的时间导致产生较小分子量的CP8多糖，而在pH 3.5下较短的加热处理时间导致产生较高分子量的CP8多糖。CP8多糖的大小范围为约80kDa-约220kDa，取决于在低pH(3.5)下加热处理的时间长度。如本研究所示，在低pH下加热处理的时间与纯化的CP5和CP8多糖的大小之间的相关性允许估计产生具有指定范围的分子量的纯化的多糖所需的处理时间。
重要的是注意到如上文所证实的，可以产生、释放和纯化20kDa至超过800kDa的CP5和CP8的完全范围分子量的荚膜多糖。所述方法可以用来产生特定范围的期望的高分子量荚膜多糖。特别有利范围的高分子量荚膜多糖5型和8型可以从这些方法产生，具有范围为70-150kDa的分子量。参见表6。这个分子量范围的荚膜多糖用于通过将所述多糖缀合至载体蛋白来制备免疫原性组合物。或者，这个有利范围的高分子量荚膜多糖为80-140kDa的CP5和CP8。参见表6。另一有利范围的高分子量荚膜多糖CP5和CP8为90-130kDa、或者90-120kDa的CP5和CP8。参见表6。用来产生具有约100-140kDa的分子量范围的CP5荚膜多糖的条件如下：95℃、pH4.5持续135分钟。用来产生具有约80-120kDa的分子量范围的CP8荚膜多糖的条件如下：95℃、pH 3.5持续300分钟。
表6：特定范围的高分子量CP5和CP8的产生
运行 CP8MW(kDa) CP5MW(kDa)
1 98 142
2 89 108
3 108 142
4 108 108
5 89 ND
6 100 ND
7 99 63
8 113 72
9 105 74
10 100 63
11 87 ND
ND＝未进行
实施例4：将荚膜多糖CP5和CP8缀合至CRM197
这个实施例描述用于产生金黄色葡萄球菌CP5-CRM197和CP8-CRM197缀合物的方法和表征测定。为了将金黄色葡萄球菌荚膜多糖CP5和CP8缀合至载体蛋白，评价了几种缀合化学。利用PDPH(3-2-吡啶基二硫代)-丙酰肼)缀合导致共价硫醚键，而利用CDI/CDT(1,1-羰基二咪唑/1,1-羰基-二-1,2,4-三唑)缀合导致CP和载体蛋白之间的1-碳或0-碳接头。
通过PDPH缀合化学将CP缀合至CRM197
PDPH缀合化学是多步骤过程，其包括活化多糖、去除巯基保护基团、纯化活化的多糖中间体、活化和纯化CRM197蛋白以及缀合活化的组分然后纯化。将含有巯基的接头引入多糖并将卤代乙酰基引入CRM197蛋白载体之后，将金黄色葡萄球菌CP5和CP8多糖通过硫醚键连接至蛋白载体。通过使胺基与溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应来将溴乙酰基引入CRM197蛋白。为了产生硫醇化CP，将CP中的N-乙酰甘露糖胺糖醛酸(N-acetylmannosaminouronic acid)的碳二亚胺活化的羧酸盐基团偶联至巯基反应的酰肼异型双功能接头3-(2-吡啶二硫代)-丙酰肼(PDPH)的酰肼基团。使通过用DTT还原产生并通过SEC在Sephadex G25柱上纯化的PDPH-硫醇化CP的巯基与活化的蛋白的溴乙酰基反应，导致通过CP与所述蛋白之间的溴置换所形成的共价硫醚键。将非反应的溴乙酰基用半胱胺盐酸盐(2-巯基乙胺盐酸盐)“加帽”。然后将反应混合物浓缩并渗滤。将剩余的未缀合的溴乙酰基用半胱胺盐酸盐加帽以确保缀合之后没有反应的溴乙酰基留下。这形成半胱胺的巯基端与溴置换之后的赖氨酸残基上的乙酰基之间的共价键。
用PDPH硫醇化金黄色葡萄球菌荚膜多糖
首先用PDPH通过硫醇化来活化多糖。将多糖与新鲜制备的PDPH贮存液(DMSO中250mg/mL)、EDAC贮存液(diH2O中90mg/mL)和MES缓冲液贮存液(0.5M,pH 4.85)混合以制备最终溶液0.1M MES、以及2和4mg CP/mL，同时保持CP 5的CP:PDPH:EDAC重量比为1:5:3，CP8的CP:PDPH:EDAC重量比为1:0.6:1.25。将这个混合物在室温下孵育1小时，然后在4-8℃下利用3500MWCO透析装置对1000X体积的蒸馏H2O透析4次以去除未反应的PDPH。使PDPH连接的多糖为0.2M DTT，并且在室温下孵育3小时或者在4-8℃下孵育过夜。利用Sephadex G25树脂和蒸馏水作为流动相通过SEC从活化的糖分离过量的DTT以及反应的副产物。通过巯基的DTDP测定来测定部分，并且将洗脱的接近柱的空隙体积的巯基阳性部分集中。通过PAHBAH和O-乙酰基测定来测定部分的池以确定活化程度，所述活化程度表达为含有巯基的重复单元的摩尔百分比(巯基的摩尔浓度/重复单元的摩尔浓度)。将活化的多糖冻干并储存在-25℃下直至需要缀合。
载体蛋白活化
单独地，通过溴乙酰化来活化载体蛋白。将CRM197用10mM磷酸盐缓冲的0.9％NaClpH 7(PBS)稀释至5mg/mL，然后利用1M贮存液使其为0.1M NaHCO3pH 7.0。利用20mg/mLDMSO的BAANS贮存液以CRM197:BAANS比例1:0.25(w:w)加入溴乙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(BAANS)。将这个反应混合物在4-8℃下孵育1小时，然后在Sephadex G-25上利用SEC纯化。通过Lowry测定来测定纯化的活化的CRM197以确定蛋白浓度，然后用PBS稀释至5mg/mL。加入蔗糖至5％wt/vol作为冷冻保护剂，将活化的蛋白冷冻并储存在-25℃下直至需要缀合。
偶联反应
一旦制备了活化的荚膜多糖和活化的载体蛋白，将这两者在缀合反应中混合。将冻干和硫醇化的多糖溶解在0.16M硼酸盐pH 8.95中，与解冻的溴乙酰化的CRM197和蒸馏水混合以制备最终溶液0.1M硼酸盐、1:1wt/wt比例的CRM197:CP以及1mg/mL多糖(CP8)和2mg/mL多糖(CP5)。将这个混合物在室温下孵育16-24小时。通过利用溶解于0.1M硼酸盐pH8.95中的半胱胺的135mg/mL贮存液以1:2(wt/wt)的CRM197:半胱胺的比例加入半胱胺盐酸盐来将蛋白上未反应的溴乙酰基加帽，并且在室温下孵育4小时。通过利用100K聚醚砜超滤器对0.9％NaCl渗滤50倍来纯化荚膜多糖-CRM197缀合物(缀合物)。
来自用PDPH的CP5和CP8硫醇化研究的重复性的结果证实CP5的活化程度在11-19％的范围中，这对应于大约每10个CP重复单元1个连接的接头分子至每5个重复单元1个连接的接头分子。CP8活化在12-16％的范围中，这与CP5的活化非常相似。
CRM197的赖氨酸残基的溴乙酰化非常一致，导致可用的39个赖氨酸中19-25个赖氨酸活化。该反应产生高产率的活化的蛋白。
通过CDI/CDT缀合化学将CP缀合至CRM197
CDI和CDT提供一步缀合方法，其中将多糖在无水环境(DMSO)中活化以形成具有可用的羟基的咪唑或三唑氨基甲酸酯部分以及具有羧酸的酰基咪唑或酰基三唑部分。蛋白载体(DMSO中)的加入导致咪唑或三唑通过赖氨酸亲核置换，并且形成氨基甲酸酯键(活化的羟基)和酰胺键(活化的羧酸)。将反应溶液10倍稀释入水性溶液以去除为未反应的活化基团，然后通过渗滤纯化。
两种缀合化学均产生共价连接至载体蛋白的CP，这是通过来自大小排阻层析的部分中糖和蛋白的存在以及通过乙醇醛加帽或半胱胺盐酸盐加帽的缀合物的氨基酸分析来显示的。
来自几批缀合物的制品的结果的总结如下文表7所示，所述缀合物是通过PDPH和CDI/CDT制备的具有20-40kDa的多糖大小的两种荚膜血清型的缀合物。游离荚膜多糖、CP:蛋白的比例以及通过这两种缀合方法产生的缀合物的产率没有显著差异。如缀合物与天然CP之间相同的沉淀素线所示，缀合未改变缀合的CP的抗原性。
表7：通过两种缀合化学制备的SA CP5-CRM197和CP8-CRM197的表征
如上文所示，本文所述的方法可以用来产生特定范围的期望的高分子量荚膜多糖。本研究的目的是从可以是过滤和纯化的CP的预先选择范围的高分子量制备缀合物用于免疫原性组合物。在这个实施例中，选择其中CP5荚膜多糖分子量范围为约90kDa-约120kDa的8个批次，并且利用三唑(CDT)活化来进行缀合。参见表8。所得的缀合物的分子量范围为1533kDa-2656kDa。每CRM197缀合的赖氨酸的数目范围从高达22到低至15。游离荚膜多糖范围从高达18％到低至11％。参见表8。
表8具有预先选择的MW范围的CP5的缀合物
表9总结了CP8缀合物的分析，其中CP8荚膜多糖分子量范围为约87kDa-113kDa，并且利用咪唑缀合化学。所得的缀合物的分子量范围为595kDa-943kDa。每CRM197缀合的赖氨酸的数目范围从高达9到低至3。游离荚膜多糖范围从高达6％到低至2％。参见表9。
表9具有预先选择的MW范围的CP8的缀合物
两种缀合化学均产生共价连接至载体蛋白的CP。游离荚膜多糖、CP:蛋白的比例以及通过这两种方法产生的缀合物的产率没有显著差异。
实施例5：ClfA的多肽片段N1、N2和N3的序列多样性
在这个实施例中评价了来自获得自各种来源的引起疾病的分离菌的ClfA多肽片段N1、N2和N3的蛋白序列异质性。从与多种疾病状态相关的金黄色葡萄球菌的菌株测序ClfA基因。来自额外的菌株的序列信息获得自GenBank以产生来自相关菌株的序列。表10列出了不同ClfA序列。
来自金黄色葡萄球菌的引起疾病的不同菌株的ClfA蛋白的序列比对如图8A-8E所示。利用MUSCLE比对蛋白序列。参见Edgar,R.C.Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797(2004)。利用SHOWALIGN显示所述比对。参见Rice,P.et al.,"EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite"Trends in Genetics,16(6):276-277(2000)。许多序列重复出现多次，没有变异。为了清楚起见，将每个独特序列放置在比对中仅一次。参见图8A-8E。仅将独特序列包括在序列表中。例如，ClfA_001的蛋白序列获得自多种不同菌株，没有任何变异。参见图8A-8E。任何序列的序列表编号也可以获得自表10：ClfA菌株和序列表。表10列出了含有这种相同ClfA_001蛋白序列的一种实例菌株。这个序列如图8A-8E中比对的第一行所示。ClfA抗原的独特序列的这种比对显示多态性分布在ClfA的整个A区(N1-N2-N3)中。在某些情况下，对于任何给定的ClfA的独特蛋白序列，发现超过一种核苷酸序列编码相同蛋白。仅将最常出现的DNA序列包括在序列表和表10中。对于ClfA，以下序列在本文中公开并且未在GenBank中找到：ClfA_003、ClfA_005、ClfA_008、ClfA_009、ClfA_013、ClfA_014、ClfA_015、ClfA_016、ClfA_017、ClfA_018、ClfA_019、ClfA_020、ClfA_021、ClfA_022、ClfA_023和ClfA_024。
表10：ClfA菌株和序列表
检测ClfA蛋白序列的系统发生，并且构建系统树。利用ClustalW比对序列。参见Chenna R,Sugawara H,Koike T,et al.Nucleic Acids Research.31(13):3497-3500(2003)。将邻接树引导(bootstrap)1000次，并且用MEGA 4.0显示。参见Tamura K,et al.,Molecular Biology&Evolution.24(8):1596-1599(2007)。分支上所示的自展值是分支在1,000次试验中重复产生的次数。少于500的值(50％重复性)认为是低支持的。
ClfA序列形成具有2个主要分支的树。参见图9。这两组的分离在系统发生中被很好支持。一个分支(上部)包括互相相当密切相关(96-99％相同性)但与候选序列clfA_011的关系更远的9个序列，它们与clfA_011 91-92％相同。包括clfA_011的第二组更多样化，并且这组中的系统发生未被很好支持。这些蛋白序列互相之间93-99％相同。
实施例6：ClfB的多肽片段N1、N2和N3的序列多样性
在这个实施例中，评价了来自分离自各种来源的92个引起疾病的分离菌的ClfBN1、N2和N3多肽片段的蛋白序列异质性。从与多种疾病状态相关的金黄色葡萄球菌的菌株测序ClfB基因。参见表11。来自额外的菌株的信息获得自GenBank以产生额外的序列。
来自金黄色葡萄球菌的引起疾病的不同菌株的ClfB蛋白的序列比对如图10A-10E所示。利用MUSCLE比对蛋白序列。参见Edgar,R.C.Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797(2004)。利用SHOWALIGN显示所述比对。参见Rice,P.et al.,"EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite"Trends in Genetics,16(6):276-277(2000)。参见图10A-10E ClfB比对。与ClfA一样，许多序列重复出现多次，没有变异。为了清楚起见，将每个独特序列放置在比对中仅一次。参见图10A-10E。仅将独特ClfB序列包括在序列表中。例如，ClfB_006的序列获得自多种不同菌株，没有任何变异。这个序列如图10A-10E中比对的第一行所示。任何序列的序列表编号也可以获得自表11。ClfB抗原的代表性独特序列的这种比对显示多态性分布在ClfB的整个A区(N1-N2-N3)中。与ClfA相似，对于任何给定的ClfB的独特蛋白序列，发现超过一种核苷酸序列编码相同蛋白。仅将最常出现的DNA序列包括在序列表和表11中。对于ClfB，以下序列在本文中公开并且未在GenBank中找到：ClfB_001、ClfB_004、ClfB_005、ClfB_010、ClfB_011、ClfB_013、ClfB_014、ClfB_015、ClfB_016、ClfB_017、ClfB_018、ClfB_019、ClfB_020、ClfB_021、ClfB_022、ClfB_023和ClfB_024。系统树如图11所示。
表11：ClfB菌株和序列表
实施例7：金黄色葡萄球菌的引起疾病的克隆中MntC的序列多样性
在这个实施例中，评价了来自获得自各种来源的104个引起疾病的分离菌的MntC基因的蛋白序列异质性。从与多种疾病状态相关的金黄色葡萄球菌的菌株测序MntC序列。参见表12。来自额外的菌株的信息获得自GenBank以产生菌株序列。
来自金黄色葡萄球菌的引起疾病的不同菌株的MntC蛋白的序列比对如图12所示。利用MUSCLE比对蛋白序列。参见Edgar,R.C.Nucleic Acids Research 32(5):1792-1797(2004)。利用SHOWALIGN显示所述比对。参见Rice,P.et al.,"EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite"Trends in Genetics,16(6):276-277(2000)。参见图12。与ClfA一样，许多序列重复出现多次，没有变异。为了清楚起见，将每个独特序列放置在比对中仅一次。参见图12。仅将独特MntC序列包括在序列表中。例如，MntC_001的序列获得自不同菌株，没有任何变异。参见图12。这个序列如图12中比对的第一行所示。任何序列的序列表变化也可以获得自表12。仅将最常对应的DNA序列包括在序列表中。对于MntC，以下序列在本文中公开并且未在GenBank中找到：MntC_002、MntC_006、MntC_007、MntC_008和MntC_009。
表12：MntC菌株和序列表
实施例8：感染期间ClfA、CP5、CP8和MntC在体内的表面表达
金黄色葡萄球菌负责引起多种人类感染。因此细菌必须通过差异表达感染所需的毒力因子来适应不同的环境小生境。在3个体内啮齿动物测定中研究靶抗原的表达以评价它们在感染期间的表达：测量抗原在感染的原发部位的表达的伤口模型，监测血液中的抗原表达的菌血症模型，以及监测营养/氧有限的条件下的抗原表达的留置室模型。对于所有这些模型，用细菌在所研究的部位攻击啮齿动物。感染之后，在不同时间点收获细菌，并且利用免疫荧光显微术(伤口和菌血症)或流式细胞术(室)评价抗原表达(ClfA、CP5、CP8、MntC)。
材料和方法
伤口模型中的表达
伤口感染实验由5只动物/组以及多达5组组成，最多25只动物/实验。使6-8周(wk)龄的C57BL/6雄性小鼠接受手术以将缝合线包埋入大腿肌肉切口。这为细菌附着提供异物基质，并且显著降低产生葡萄球菌伤口感染所需的最小感染剂量。将5μL的金黄色葡萄球菌或无菌盐水引入4-0丝的深部组织缝合下的切口。用4-0Prolene缝合线或外科粘合剂(例如，氰基丙烯酸酯)来闭合皮肤。在感染后30min至10天之间的时间点将动物安乐死，将大腿肌肉切除、匀浆，并且将细菌计数。看到感染时，通过免疫荧光(IF)共焦显微术分析细菌的抗原表达。
菌血症模型中的表达
在第0、3和6周将10只4周龄的CD-1或Balb/C小鼠的组用1μg的蛋白或CP缀合物通过皮下注射免疫。用在TSB中生长至对数期晚期的金黄色葡萄球菌腹腔内攻击之后第0和8周将动物取血。攻击之后3小时将动物安乐死并收集血液用于IF共焦显微术。
留置透析袋模型中的表达
使金黄色葡萄球菌分离菌在TSA平板上于37℃下生长过夜。将细菌从平板上刮下，重悬在无菌PBS中，并且将OD600调整至1,约109菌落形成单位(cfu)/mL。将细菌稀释至103cfu/mL的浓度并接种入透析袋。将该悬浮液的等分试样平板接种以测定cfu的实际数目。通过在70％乙醇中灭菌30分钟之后在无菌水然后无菌盐水中大量漂洗来准备将具有3.5kDaMWCO的透析袋用于植入。将2mL等分的细菌悬浮液转移至透析袋，用结封闭该袋，然后用无菌盐水大量漂洗。将雄性Sprague Dawley大鼠(6周龄)麻醉，并且沿背中线制造2-3cm切口。通过温和地从皮下组织分离皮肤以在切口的部位创造口袋。将袋植入在口袋中，并且使用外科封缝钉闭合皮肤。24h之后，将大鼠安乐死，取出该袋，并且将细菌回收用于流式细胞术分析。
免疫荧光显微术(IF)
将来自5只小鼠的血液汇集入冰冷的柠檬酸钠，pH 7.0(终浓度，0.4％)。将真核细胞用1％NP-40(Pierce Biotechnology)裂解。将细菌用PBS洗涤，在4℃下与兔免疫或免疫前血清(1:100)孵育过夜，并且用ALEXA488缀合的山羊-α-兔抗体(1:250,Invitrogen)检测。将标记的细菌在显微镜载玻片上干燥，并且将盖玻片用Vectashield HardSet介质(Vector Laboratories,Inc.)封片。用Leica TCS SL光谱共焦显微镜(LeicaMicrosystems)获得图像。
流式细胞术分析
如大鼠透析袋模型方法中所述使金黄色葡萄球菌分离菌生长。将约107个细菌细胞在染色缓冲液(含有10％山羊血清的Hank's平衡盐溶液)中于冰水封闭1小时。将细菌细胞在10,000rpm下离心5分钟，去除上清，并且将细胞与小鼠抗体或同种型对照抗体在冰上孵育30分钟。然后将细胞洗涤，并且用FITC缀合的山羊抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch)在冰上染色30分钟。将细胞用染色缓冲液洗涤，用2％多聚甲醛固定，并且利用FACS Caliber流式细胞仪和Cell quest软件(Becton,Dickinson and Co.)获得和分析数据。每个样品收集总计30,000个事件。
表13a：金黄色葡萄球菌CP 5型分离菌中的抗原表达谱。
/＝菌血症实验进行6小时 ！＝实验期间动物死亡 NT＝未检测
表13b：金黄色葡萄球菌CP 8型分离菌中的抗原表达。
/＝菌血症实验进行6小时 ！＝实验期间动物死亡 NT＝未检测
表13c.留置透析袋中金黄色葡萄球菌抗原的表达。
阳性细胞的频率(总计的％)
结果
检测19个金黄色葡萄球菌分离菌的组合在感染期间金黄色葡萄球菌细胞表面上ClfA、CP5、CP8或MntC的表达(表13a、13b和13c)。这些分离菌包括最近临床相关的菌株，并且如通过MLST所监测的各不相同。抗原表达取决于菌株、时间点和感染模型。不同体内环境(血流对伤口)中分离菌之间抗原表达的变化支持使用多抗原免疫原性组合物以诱导广泛覆盖各种不同感染中的葡萄球菌分离菌。所述抗原在感染的第一个24小时内表面表达，并且因此是抗葡萄球菌免疫原性组合物的有效组分。蛋白抗原ClfA和MntC在荚膜表达存在的情况下可以染色，显示荚膜的存在并不对针对所述蛋白的抗体掩盖它们。
大部分检测的8型分离菌在血液中不表达CP直至攻击后较晚的时间点(>4小时)(参见表13a-c)。这些结果证实在金黄色葡萄球菌中CP被差异调节，取决于体内微环境，即感染的部位。这些结果可以解释所报道的CP8缀合物在动物模型中不一致的效力结果。
体内表达结果表明没有单一抗原免疫原性制剂会提供对大多数金黄色葡萄球菌感染的广泛覆盖。在体内微环境内各个菌株有太多表达表型的多样性。因此，预防金黄色葡萄球菌疾病需要由超过一种抗原组成的免疫原性组合物。
实施例9:含有ClfA、CP5-和CP8-CRM197缀合物的多抗原制剂的免疫原性
在这个实施例中，我们评价了ClfA、CP5-CRM197和CP8-CRM197的组合的免疫原性。
A.双抗原(CP5-CRM197/CP8-CRM197)免疫原性组合物制剂-对兔中抗荚膜抗体应答 的剂量效应
在这个实施例中，评价了兔中组合的CP5-CRM197和CP8-CRM197免疫原性制剂对免疫原性的剂量效应。在第0、3和6周用通过皮下注射施用的二价缀合物加上125μg AlPO4免疫兔。本研究中评价的剂量为CP5-CRM197和CP8-CRM197各0.1μg、1μg或10μg(最终组合的CP-CRM197剂量为0.2μg、2μg和20μg)。所述缀合物的剂量反映该蛋白多糖缀合物的总多糖组分。将兔在第0、3、6和8周取血。对汇集的和个体的血清进行ELISA。终点抗体效价测定为在0.1OD405的倒数稀释。对个体第8周的效价进行统计分析。结果证实通过用二价免疫原性制剂以每种组分1μg CP剂量免疫接种兔诱导最高的CP5和CP8特异性抗体效价，其中CP5为5X105，CP8为1X106(数据未显示)。
B.三抗原制剂(CP5-CRM197+CP8-CRM197+rClfA)-兔中具有固定剂量(1μg)的每种缀 合物的rClfA剂量范围研究
检测了rClfA与CP5和CP8缀合物的组合对每种组分的免疫应答的影响。用二价金黄色葡萄球菌CP5-CRM197+CP8-CRM197(每种缀合物1μg剂量)联合3个不同剂量1、10和100μg的T7-ClfA(N1N2N3)免疫3组。用未缀合的CP5和CP8(各50μg)联合100μg T7-ClfA(N1N2N3)免疫对照组。每种免疫原性组合物与500μg佐剂AlPO4一起配制。通过在颈部皮下注射来施用免疫原性组合物。在第0、6和8周将兔取血。对汇集的和个体的血清进行ELISA，并且终点抗体效价测定为在0.1OD405的倒数稀释。
结果显示当与二价缀合物联合时，增加量的rClfA不影响荚膜抗体应答。两种荚膜血清型的抗体水平在与仅用二价缀合物免疫的兔中相同的范围内(数据未显示)。CP5和CP8的抗体水平在10(103K)和100μg(106K)剂量的rClfA与1μg剂量的ClfA(273K)相比低2.5倍。第二次和第三次注射之后有加强效应。未缀合的二价多糖免疫原性制剂(CP5+CP8，各50μg)联合100μg rClfA未诱导CP特异性抗体。rClfA特异性抗体应答也未受剂量的很大影响，其中1、10和100μg剂量的3个剂量之后效价在1X105和1X106之间(数据未显示)。而且在与缀合的或未缀合的CP5和CP8多糖一起施用时所达到的抗ClfA应答的水平相似。
实施例10：三抗原制剂-具有高免疫前CP5、CP8和ClfA Ab效价的兔中的免疫原性。
将葡萄球菌免疫原性组合物靶向具有预先存在的金黄色葡萄球菌表面组分的抗体的成年群体。为了研究预先存在的免疫原性制剂组分的抗体对于对免疫原性制剂的应答的影响，我们选择具有高效价的天然获得的抗CP5、抗CP8和抗ClfA抗体效价的兔。在第0、3和6周用三抗原免疫原性制剂(CP5-CRM197(1μg)和CP8-CRM197(1μg)和T7-ClfA (N1N2N3)Y338A(10μg))免疫2组兔(n＝6/7)。一组用与作为佐剂的500μgAlPO4一起配制的免疫原性组合物免疫，而第二组用不含佐剂的免疫原性组合物免疫。通过皮下注射施用免疫原性组合物。在第0、3、6和8周将兔取血。通过ELISA测定CP5、CP8和rClfA的抗体效价作为汇集的和个体的血清的终点抗体效价(测定为在0.1OD405的倒数稀释)。
结果显示具有自然感染所诱导的预先存在的抗体效价的兔对三价免疫原性制剂应答，所有免疫原性制剂组分CP5、CP8和rClfA的抗体的水平升高。甚至在具有1x106的抗体效价的动物中显示各个抗原的Ab水平升高5-10倍。免疫原性制剂中佐剂的存在导致与不用佐剂免疫的组相比更高的抗体效价(数据未显示)。
实施例11：佐剂对于对荚膜多糖组分的应答的影响
A.两个不同剂量的AlPO4对于兔中对二价CP5-CRM197/CP8-CRM197缀合物免疫原性 组合物的应答的影响
研究兔中佐剂AlPO4对抗CP5和CP8应答的剂量效应。在第0、3和6周用二价金黄色葡萄球菌CP5-CRM197+CP8-CRM197(每种缀合物1μg剂量)免疫兔。一组(n＝5/组)用与作为佐剂的125μg AlPO4一起配制的免疫原性组合物免疫，而第二组用500μg AlPO4作为佐剂。通过在颈部皮下注射来施用免疫原性组合物。在第0、6和8周将兔取血，并且通过ELISA测定抗荚膜抗体作为终点抗体效价，所述终点抗体效价测定为在0.1OD405的倒数稀释。结果显示在用125μg或500μg AlPO4免疫的兔中，CP8特异性抗体应答没有差异。含有125μg佐剂的制剂给出更高的CP5抗体应答。而且，125μg组中的所有兔均具有更高的CP5抗体应答，而在500μg佐剂组中，有2只兔对该制剂具有低应答。
B.AlPO4对三抗原制剂的免疫原性的影响
在第0、3和6周用由CP5-CRM197(1μg)和CP8-CRM197(1μg)和T7-ClfA(N1N2N3)Y338A(10μg)组成的三抗原制剂免疫兔(NZW，n＝6/7只兔每组)。一组兔用含有500μg AlPO4的免疫原性制剂免疫，第二组配制为不含佐剂，第三组在第0周用含有500μg AlPO4的免疫原性制剂免疫，并且在第3和6周用不含佐剂的免疫原性制剂免疫。通过皮下注射施用免疫原性制剂，在第0、3、6和8周将兔取血，并且通过抗原特异性ELISA评价血清。结果显示免疫原性制剂中佐剂的存在对兔中抗CP5或抗CP8应答没有影响(数据未显示)。两种荚膜的Ab的GMT效价是可比的。然而，在用存在于所有3次免疫接种中的佐剂免疫的组中对ClfA特异性抗体应答有佐剂效应。在最初用含有佐剂的免疫原性制剂的兔中用不含AlPO4的免疫原性制剂第二次和第三次加强给出与不用佐剂的组相比更高的ClfA应答。
实施例12-29：金黄色葡萄球菌ClfA、MntC、CP5-CRM197和CP8-CRM197的临床前评价：
在以下实施例12-29中描述了CP5和CP8缀合物、ClfA以及MntC的临床前评价的结果。所述实施例证实了这些抗原在临床前动物模型中的效力。所述实施例还证实CP缀合物、ClfA和MntC所产生的抗体在体外测定中具有功能活性。
两种不同的化学用来将CP缀合至CRM197，但是未观察到通过不同方法制备的缀合物的效力有差异。据证实荚膜多糖的O-乙酰化影响引发功能抗体。包含CP5-CRM197、CP8-CRM197和ClfA的组合的免疫原性组合物的评价显示对每种免疫原性制剂组分的特异性抗体(Ab)水平没有干扰。
材料和方法
ELISA
将Maxisorp微量滴定ELISA板(Nalge Nunc International,Rochester,NY)用PBSpH 7.5中的1μg/mL ClfA抗原在4℃下包被18小时或者在37℃下包被90min。将板在PBST(1XPBS，0.1％聚山梨酯20)中洗涤5次，并且用含有0.05％聚山梨酯20的PBS中的1％(w/v)脱脂奶在室温下封闭1h。将板用PBST洗涤，将连续稀释(3倍)和个体的第0、3、6和8周兔抗血清加入板，并且在4℃下孵育过夜或者在37℃下孵育2h。将板洗涤，并且用PBST中的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG(1:1000稀释)检测结合的一抗。将板在37℃下孵育1h，然后洗涤，并且用ABTS-过氧化物酶底物溶液(KPL,Inc.,Gaithersburg,MD)在室温下显影约20分钟。通过加入1％(v/v)SDS溶液来终止反应。在自动酶标仪(Molecular Devices Corporation,Sunnyvale,CA)中于405nm下测量吸光度。抗体效价表示为具有0.1的吸光度值的最高血清稀释的倒数。利用JMP软件(SAS Institute,Cary,NC)的斯氏t检验用来测定不同组之间抗体效价的差异。认为少于0.05的概率显示统计上显著差异。
小鼠脓毒症模型
小鼠脓毒症模型模拟血源性疾病。为了被动免疫，将15只Swiss-Webster小鼠的组用IgG腹腔内(i.p.)处理。24小时之后，用金黄色葡萄球菌659-018通过尾静脉单一静脉内(i.v.)注射(0.1ml)攻击小鼠。密切注意所有动物14-15天，在这个点将所有剩余的小鼠处死。
为了主动免疫，将小鼠在第0、2和4周用抗原免疫，并且在第6周用金黄色葡萄球菌通过静脉内途径攻击。
主动免疫兔心内膜炎模型
将成年新西兰白兔用25μg抗原肌肉内免疫4次。手术后一天，将动物用一团金黄色葡萄球菌i.v.攻击，并且在攻击后24小时测定心脏组织中菌落形成单位(cfu)的数量。
小鼠菌血症
3hr菌血症模型用来测定感染期间早期免疫接种对细菌数量的影响。将小鼠在第0、3和6周用抗原免疫，然后在第8周用金黄色葡萄球菌i.p.攻击。3小时之后，将动物取血，并且将连续稀释的血液平板接种以计数细菌。
小鼠肾盂肾炎模型
小鼠肾盂肾炎模型模拟来自菌血症的金黄色葡萄球菌的传播。将10只4周龄的雌性CD-1小鼠的组在第0、3和6周用抗原免疫。通过i.p.注射金黄色葡萄球菌来攻击小鼠。攻击之后48小时，将小鼠处死，并且计数肾和血液中的细菌。
大鼠心内膜炎模型
大鼠心内膜炎模型模拟人心内膜炎，其中血源性感染之后发生的定殖导致受损的心脏组织的定殖。将5只5周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River,Kingston,NY)在第0、2和4周用与100μg AlPO4一起配制的1μg CP5-CRM197缀合物免疫。在免疫接种之前第0周和第5周结束时将动物取血。72小时之后，将导管(PE-10管)通过颈动脉手术放置入心脏的左心室。导管的放置导致形成在感染时葡萄球菌可以附着的无菌赘生物。为了预防外科手术所导致的感染，在手术时和手术之后8hr用抗生素Baytril(5mg/kg)处理动物。手术后48小时，用PFESA0266(约4x 108cfu)或SA315(约1x 109cfu)通过腹腔内注射攻击大鼠。攻击后48小时，将大鼠安乐死，将心脏和肾取出并放置在3mL磷酸缓冲盐水(PBS)中。然后将所述器官用组织匀浆器(Kinematica AG,Luzernerstrasse,Germany)匀浆并用PBS补充至10mL。然后将匀浆连续稀释并平板接种用于细菌计数。
利用调理吞噬杀死测定监测功能抗体
来自细胞系(例如HL60)或多形核细胞(PMN)的分化的效应细胞可以用于本测定，所述多形核细胞(PMN)是利用聚溶液(Cedarlane laboratorieslimited,Ontario,Canada)按照制造商的方案从供体人体血液分离的。将效应细胞以约2X107个细胞/ml的浓度重悬在测定缓冲液(含有1％牛血清白蛋白的改良伊格尔培养基)中，并且放置在37℃培养箱中直至准备使用。使金黄色葡萄球菌菌株PFESA0266在胰胨豆胨琼脂平板上生长过夜。将细菌细胞刮下，洗涤2次并重悬在含有5％甘油的测定缓冲液中至OD600＝1，这等于约5X108cfu/ml的浓度。将1ml等分的细菌悬浮液冷冻并储存在-40℃下直至准备使用。将冷冻的细菌悬浮液解冻，在测定缓冲液中调整至106cfu/ml的浓度并放置在冰上。利用无菌的96深孔1ml聚丙烯板进行测定。制备2倍连续稀释的抗体样品(50μl)，然后将300μl测定缓冲液加入抗体混合物。将细胞加入(50μl)板，并且在4℃下放置于旋转振荡器上30分钟。调理步骤之后加入50μl人补体(1％终浓度)。最后，将50μl效应细胞(107个细胞/ml的浓度)加入板，并且通过反复吹打将悬浮液混合均匀。将50μl等分的悬浮液在无菌的1％皂草苷溶液中10倍连续稀释，涡旋以最小化细菌聚集，并且一式两份平板接种在胰胨豆胨琼脂上。将测定板在37℃下孵育1小时，利用电转烤肉架风格摇床连续混合。孵育结束时，将50μl等分的悬浮液在无菌的1％皂草苷溶液中10倍连续稀释，通过涡旋混合以最小化细菌聚集，并且一式两份平板接种在胰胨豆胨琼脂上。通过测定60分钟时含有细菌、抗体、补体和效应细胞的孔中存活的cfu的数量比缺少抗体但含有细菌、补体和效应细胞的管中存活的cfu的数量的比例来计算百分比杀死。将含有细菌、补体和血清的对照包括在内以便为归因于聚集的cfu的任何减少调整。
补体吸附
针对金黄色葡萄球菌菌株PFESA0266、PFESA0286和PFESA0270吸附的来自人供体的血清可以在测定中用作补体的来源。使金黄色葡萄球菌菌株在37℃下于TSA平板上生长过夜。将细胞从平板刮下并重悬在无菌的PBS中。将细菌细胞以10,000rpm在4℃下离心10分钟，并且将细胞沉淀重悬于人血清中用于吸附。将血清与细菌在4℃下于章动器上孵育30分钟。将细胞离心，将血清转移至含有细菌的另一管，并且将吸附步骤再次重复30分钟。最后，将细胞离心，并且使血清通过0.2微米滤器，然后将0.5ml等分试样在液氮中冷冻下来。
方法II-利用HL-60细胞的OPA
根据S.Romero-Steiner,et al.,Clin Diagn Lab Immunol 4(4)(1997),pp.415–422使HL-60细胞分化。将收获的HL-60细胞以约108个细胞/ml重悬在测定缓冲液(含有1％牛血清白蛋白的改良伊格尔培养基)中，并且放置在37℃培养箱中直至准备使用。使金黄色葡萄球菌在胰胨豆胨琼脂平板上生长过夜。将细菌细胞刮下，洗涤两次并重悬在含有5％甘油的测定缓冲液中至OD600＝1，这等于约5X108cfu/ml。将1ml等分的细菌悬浮液冷冻并储存在-40℃下直至准备使用。将冷冻的细菌悬浮液解冻，在测定缓冲液中调整至106cfu/ml的浓度并放置在冰上。利用无菌的96深孔1ml聚丙烯板进行测定。制备2倍连续稀释的单克隆抗体样品(25μl)，然后将150μl测定缓冲液加入抗体悬浮液。将细菌加入(25μl)板，并且在4℃下放置于旋转振荡器上30分钟，然后加入25μl人补体(1％终浓度)。最后，将25μl HL-60细胞(107cells/ml)加入板，并且通过反复吹打将悬浮液混合均匀。将25μl等分的悬浮液在无菌的1％皂草苷溶液中10倍连续稀释，通过涡旋混合以最小化细菌聚集，并且一式两份平板接种在胰胨豆胨琼脂上。将测定板在37℃下孵育1小时，利用电转烤肉架风格摇床连续混合。孵育结束时，将25μl等分的悬浮液在无菌的1％皂草苷溶液中10倍连续稀释，通过涡旋混合，并且一式两份平板接种在胰胨豆胨琼脂上。通过测定60分钟时含有细菌、抗体、补体和HL-60细胞的孔中存活的cfu的数量比缺少抗体但含有细菌、补体和HL-60细胞的管中存活的cfu的数量的比例来计算百分比杀死。将含有细菌、补体和mAb的对照包括在内以便为归因于聚集的cfu的任何减少调整。
实施例12：在体内动物模型中证实ClfA的保护效应
为了评价针对ClfA引发的多克隆兔抗体是否能够减少小鼠脓毒症模型中的金黄色葡萄球菌菌落计数，在被动免疫研究中以两个剂量(0.8mg和1.6mg)使用纯化的兔多克隆抗ClfA IgG(图13)。金黄色葡萄球菌攻击菌株是最近的临床分离菌659-018。两个抗体剂量均导致小鼠脓毒症模型中细菌菌落计数显著减少(1.8mg剂量p＝0.0134，并且0.8mg剂量p＝0.0013)。已用其他金黄色葡萄球菌分离菌重复这个实验，具有相似结果(数据未显示)。
实施例13：用ClfA主动免疫减少金黄色葡萄球菌的心脏定殖
用ClfA主动免疫兔在兔心内膜炎模型中导致保护。我们发现用ClfA免疫的动物与阴性对照(PBS或AlPO4)免疫的动物相比，从心脏赘生物回收的金黄色葡萄球菌cfu减少3-4个数量级(图14)。
实施例14：MntC在体内动物模型中的保护效应
用MntC主动免疫已显示从金黄色葡萄球菌攻击之后的早期时间点一致保护小鼠。接受i.p.金黄色葡萄球菌攻击的小鼠的血液中的细菌计数与用PBS免疫的对照相比显著减少(图15A和15B)。6个个体研究中的4个显示免疫的动物中cfu/ml血液显著减少。利用2个不同的金黄色葡萄球菌攻击菌株PFESA0237(图15A)和PFESA0266(图15B)证实了MntC免疫所介导的保护。
实施例15：小鼠肾盂肾炎模型中的CP5缀合物保护
评价CP5缀合物在主动免疫肾盂肾炎模型中保护小鼠的能力。图16示出来自几个研究的结果。接受i.p.金黄色葡萄球菌攻击的小鼠的血液中的细菌计数与用pbs免疫的对照相比显著减少(图16)。6个个体研究中的6个显示免疫的动物中cfu/ml肾显著减少。数据显示用CP5缀合物主动免疫之后肾定殖一致减少。
实施例16：通过不同缀合化学制备的CP5缀合物保护小鼠对抗实验感染
利用通过PDPH或CDT化学制备的CP5缀合物进行小鼠肾盂肾炎模型中的主动免疫研究。将CP5或CP8缀合至CRM197的方法如上文所述。结果显示与假免疫的动物相比两种缀合物均显著降低小鼠中的定殖(表14)。
表14：PDPH对CDT缀合在肾盂肾炎模型中的效应
实施例17：大鼠心内膜炎模型中的CP5缀合物保护
用CP5-CRM197PDPH缀合物和无关缀合物(PP5-CRM197)以1μg剂量进行4个研究。在攻击5型攻击菌株是PFESA0266的3个实验中的2个中，CP5缀合物显著降低心脏和肾中的定殖(表15)。在第三个研究中，几何平均效价(GMT)抗CP5效价是这3个实验中最低的，但是其仅略低于以前实验中的效价(51,000对67,000)。
表15：CP5-CRM197免疫减少大鼠心内膜炎模型中的cfu
实施例18：肾盂肾炎模型中的CP5-CRM197缀合物
用25kDa MW CP5进行探讨缀合物效力的初步研究。发酵方法的改进导致产生高MW多糖，将其缀合至蛋白载体并与25kDa CP5缀合物并行测试。利用CDT缀合化学制备包含具有25kDa(低MW)和300kDa(高MW)的MW的CP的缀合物，并且在小鼠肾盂肾炎模型中评价。测试3个剂量(0.01、0.1和1μg)的HMW缀合物，并且与1μg剂量的对照LMW CP5-CRM197和无关缀合物(PP5-CRM197)比较。结果显示在1μg剂量回收自肾的金黄色葡萄球菌PFESA0266的CFU显著减少。在1μg剂量来自用不同大小的CP5制备的缀合物的保护之间没有统计差异(表16)。较低剂量(0.01μg和0.1μg)的缀合物没有引发足以显著降低感染的免疫应答。利用相同的免疫和攻击方法重复该实验。在重复实验中，仅1μg剂量的LMW CP5-CRM197导致定殖显著减少(p＝0.01)。1μg剂量的HMW CP5-CRM197降低肾中的cfu，但是该降低并不是统计显著的(p＝0.056)。
表16.小鼠肾盂肾炎模型中的CP5缀合物保护
实施例19：多糖O-乙酰化对于诱导对CP5缀合物免疫原性制剂的保护性抗体应答很重要
为了评价CP5的O-乙酰化的重要性，将天然CP5去O-乙酰化(dOAc)，并且利用PDPH缀合化学缀合至CRM197(dOAc-CRM197)。在小鼠肾盂肾炎模型中将dOAcCP-CRM197缀合物的效力与CP5-CRM197并行比较。结果显示如通过肾中的细菌定殖没有显著变化所证实的，缺少O-乙酰基的缀合物(dOAc CP5-CRM197)在这个模型中无效。这些数据(表17)显示O-乙酰化对于引发针对CP5的功能抗体很重要。
表17：用去O-乙酰化CP5-CRM197免疫不保护小鼠免受肾定殖
实施例20：用CP8-缀合物免疫减少脓毒症模型中的死亡
用金黄色葡萄球菌PFESA0268(8型)攻击之后在小鼠脓毒症模型中评价CP8-CRM197缀合物的效力。将Swiss Webster小鼠(n＝30)用与100μgAlPO4一起配制的1μg CP8-CRM197和盐水通过皮下注射主动免疫。该研究显示与单独用AlPO4免疫的小鼠相比，脓毒症显著减少(p＝0.0308)。参见图17。
实施例21：在小鼠菌血症模型中评价缀合的天然的和碱处理的CP8
对于CP8缀合物，评价了缀合之前存在于天然CP8上的O-乙酰基对诱导功能抗体应答的重要性。将CP8多糖在温和碱条件下去O-乙酰化，并且NMR和离子层析(IC)均证实在CP8去O-Ac-CRM197中不存在O-乙酰化。
小鼠菌血症模型用来评价缀合至CRM197的天然的对碱处理的CP8的效力。将雌性BALB/c小鼠的组(15/组)在第0、3和6周用1μg CP8去O-Ac-CRM197或1μg CP8 O-Ac-CRM197免疫。免疫原性制剂与22μg AlPO4一起配制。用金黄色葡萄球菌PFESA0003攻击动物。攻击后3小时将小鼠处死，并且计数血液中的细菌。数据显示如通过斯氏t检验所测定的，从用未处理的天然CP8缀合物免疫的动物的血液回收的细菌cfu统计上显著(p＝0.0362)减少(表18)。在用碱处理的CP8缀合物免疫的动物中，从血液回收的细菌cfu与盐水对照组相似。
表18：CP8-CRM197缀合物减少小鼠中的菌血症金黄色葡萄球菌PFESA0003
实施例22：利用具有已知特异性的MAb通过OPA证实O-乙酰化作为CP5的功能表位的重要性
评价具有对CP5 OAc+(CP5-7-1)、CP5 OAc+/-(CP5-5-1)和CP5 OAc-(CP5-6-1)的特异性的CP5单克隆抗体对5型菌株PFESA0266的OP杀死活性(表19)。CP8 OAc+特异性的MAbCP8-3-1用作阴性对照。结果显示CP5-7-1mAb(CP5 OAc+特异性)介导测试的5型菌株的杀死。而且识别CP5 OAc+和CP5 OAc-共享的表位的mAb CP5-5-1介导PFESA0266菌株的杀死。存在于CP5 OAc-多糖上的表位的特异性MAb不介导PFESA0266菌株的杀死。这些结果显示CP5上的O-乙酰基表位参与CP5特异性抗体的功能活性。
表19O-乙酰化(+)CP5以及O-和去O-乙酰化(+/-)CP5特异性mAb是针对金黄色葡萄 球菌PFESA0266(5型)调理的。
数据报道为百分比杀死，并且通过测定60分钟时含有细菌、抗体、补体和HL-60细胞的孔中存活的cfu的数量比缺少抗体但含有细菌、补体和HL-60细胞的孔中存活的cfu的数量的比例来计算。
实施例23：诱导的高和低MW CP5缀合物的小鼠抗体的调理活性
利用金黄色葡萄球菌PFESA0266比较来自实施例18的1μg高分子量和低分子量组的具有高CP5ELISA效价的来自小鼠(n＝5)的血清的调理活性。OPA结果显示两种缀合物均在小鼠中激发调理抗体(表20)。有观察到这样的趋势，高MW缀合物激发更高效价的调理抗体。数据显示为5只个体小鼠血清的平均％杀死±SEM。如通过在动物效力模型中杀死细菌或者通过证实抗体杀死细菌的调理吞噬杀死测定所测量的，抗体需要有功能。利用仅单独监测抗体的产生的测定不可以证实功能性杀死，这不是高分子量缀合物在效力中的重要性的指示。
表20：LMW和HMW CP5均激发调理抗体
实施例24：来自用天然的和化学修饰的CP8缀合物免疫的小鼠的血清的调理活性
选择来自实施例21中的研究的具有高CP8效价的小鼠血清(n＝5)，利用PFESA0005菌株比较其调理活性。OPA结果(表21)显示仅通过缀合天然CP8制备的缀合物激发小鼠中的调理抗体。值得注意的是去OAc CP8缀合物在小鼠中是有免疫原性的，但是所激发的抗体在这个测定中没有调理。OPA效价报道为观察到40％杀死的稀释的倒数。如通过在动物效力模型中杀死细菌或者通过证实抗体杀死细菌的调理吞噬杀死测定所测量的，抗体需要有功能。利用仅单独监测抗体的产生的测定不可以证实功能性杀死，这不是O-乙酰化在效力中的重要性的指示。
表21.天然CP8对去O-Ac CP8-CRM197的调理活性
实施例25:添加天然CP8抑制CP8缀合物非人灵长类抗血清杀死8型菌株
为了证实用CP8-缀合物免疫的非人灵长类的血清中的杀死活性的特异性，在天然CP8存在的情况下进行测定。使用OP方法II，具有以下修改。制备2倍连续稀释的抗体样品(25μl)，然后将150μl(Pn14竞争剂)或125μl(CP8竞争剂)的测定缓冲液加入抗体悬浮液。竞争剂为纯化的CP8多糖(CP8聚)，并且无关的肺炎球菌多糖(Pn 14聚)用作对照。将多糖加入(50μg)抗体悬浮液，并且将板在4℃下孵育30分钟，同时颠倒混匀。与多糖孵育之后，将细菌加入(25μl)板，并且在4℃下放置于旋转振荡器上30分钟，然后加入25μl人补体(1％终浓度)。结果(表22)显示反应混合物中天然CP8的存在抑制金黄色葡萄球菌8型的调理吞噬杀死。这些结果证实免疫血清的调理吞噬杀死是由荚膜特异性Ab介导的。
表22.添加CP 8多糖抑制免疫血清调理吞噬杀死金黄色葡萄球菌。
实施例26：天然获得的ClfA的抗体介导调理吞噬杀死金黄色葡萄球菌
使群体中的人自然暴露于金黄色葡萄球菌，并且因此在他们的血液循环中含有预先存在的该细菌的抗体。我们从人血清亲和纯化抗ClfA抗体，并且评价该抗体是否可以介导调理杀死。据证实ClfA的抗体对于金黄色葡萄球菌荚膜多糖是调理的(数据未显示)。使菌株PFESA0266在含有2％NaCl的哥伦比亚肉汤中生长过夜。将细菌用ClfA亲和纯化的人IgG或无关抗原亲和纯化的人IgG(阴性对照，链球菌SCP蛋白)调理，并且检测调理活性。将分化的HL-60细胞以100:1的效应细胞/靶标比例用于调理吞噬测定。作为额外的对照，将CP5mAb包括在本实验中以证实CP5存在于表面上。结果为两个独立实验的平均。ClfA和CP5特异性抗体的确介导调理杀死，而SCP特异性(阴性对照)抗体在这个测定中没有活性。
实施例27：CP5-CRM197缀合物激发非人灵长类(NHP)中的调理抗体
为了比较高分子量对低分子量CP5-CRM197缀合物在NHP中的功能性，将5只猴的组用2和20μg剂量的有或无AlPO4佐剂的缀合物免疫。猴在第0天和第28天分别接受第一次和第二次免疫接种。检测来自第0、14、28和42天的血液的OP活性。结果如表23所总结。将具有最高OP效价的20μg HMW缀合物与其他组比较。而且，在两个剂量的高MW组OP阳性猴的频率均高于相应的低MW组。这些结果证实有这样的趋势，在NHP中HMW CP5-CRM197缀合物比LMWCP5缀合物激发更好的OP应答。
表23.用CP5缀合物免疫之后NHP血清的OPA。
实施例28：包含高分子量多糖的荚膜多糖缀合物表现出与包含低分子量多糖的缀合物相比增强的免疫原性
进行非人灵长类(NHP)研究以评价不同荚膜缀合物制剂的免疫原性。以两个不同剂量水平(2和20μg)检测两个制剂。第一个制剂由缀合至CRM197的高分子量(HMW)多糖(约130kDa)组成。第二个制剂含有缀合至CRM197的低分子量(LMW)多糖(约25kDa)。将5只灵长类的组用单一剂量的任一疫苗免疫接种，并且在免疫接种之前和免疫接种后2周监测免疫效价。OPA效价定义为在OPA测定中杀死40％金黄色葡萄球菌菌株PFESA0266所需的血清的稀释。还通过ELISA监测抗体效价。观察到HMW疫苗与LMW制剂相比增强的活性(表24)，这由HMW疫苗与LMW疫苗相比抗体效价升高10倍所证实。接受HMW疫苗的NHP的OPA效应器率也更高(80％相比40％)。
表24.观察到HMW多糖缀合物疫苗与LMW多糖缀合物疫苗相比增强的免疫原性。
实施例29：非人灵长类中双抗原(CP5-CRM197和ClfA)制剂-抗体应答
为了评价NHP中对单剂量的两种抗原免疫原性组合物(CP5-CRM197和ClfA)的免疫应答，将5只猴的组用不同剂量的不加AlPO4的两种抗原免疫。测试来自第0、14和28天的血液的调理吞噬(OP)活性，并且ELISA效价和结果如表24所总结。结果显示与CP5假组相比，CP5免疫的动物一直观察到OP活性。总的来说，与其他组相比，100μg组具有最高的ELISA和OP效价。来自单独ClfA组的血清未观察到OP杀死活性。在施用递增剂量的ClfA或CP5的组中未观察到干扰。参见表25。
表25：来自NHP中的二价免疫研究的OPA结果
动物模型证实金黄色葡萄球菌CP5和CP8荚膜多糖抗原的潜力
CP5-CRM197和CP8-CRM197缀合物均诱导小鼠、大鼠、兔和非人灵长类(NHP)中的荚膜血清型特异性抗体应答。缀合物诱导的抗体在体外功能性调理吞噬杀死测定中是有功能的。产生数据以证实O-乙酰化对于激发CP5和CP8的保护性抗体均很重要，并且证实O-乙酰基是针对CP5的OPA+mAb所识别的表位的部分。识别O-乙酰化的天然CP5的MAb在OPA中有功能，并且介导杀死细菌。CP8缀合物诱导小鼠和兔中的功能抗体，所述功能抗体在OPA中介导杀死8型菌株。通过将同源天然多糖加入测定之后废除杀死证实多克隆或单克隆抗体杀死的特异性。各种主动免疫模型用来显示CP5-和CP8-CRM197缀合物的临床前效力。CP5缀合物在小鼠肾盂肾炎模型和大鼠心内膜炎模型中表现出一致的效力。在小鼠肾盂肾炎模型中证实了CP5的O-乙酰化的重要性，其中缀合至CRM197的去O-乙酰化CP5未能保护动物对抗实验感染。
双抗原制剂中的缀合物的组合诱导荚膜CP5和CP8的抗体，并且与单一抗原免疫相比，对所诱导的特异性抗体水平没有干扰。三抗原制剂中的缀合物与ClfA的组合诱导高CP5、CP8和ClfA水平，并且对所诱导的针对该组合中存在的任何抗原的抗体应答没有干扰。三抗原免疫原性组合物在具有高免疫前效价的兔中诱导抗体(Ab)应答，其中对所有3个组分的抗体(Ab)应答均能够加强。
这些结果表明缀合至CRM197的CP5和CP8应当作为保护性金黄色葡萄球菌免疫原性组合物的免疫原性制剂组分包括在内。
实施例30：需要不同抗原以防范多种可能的金黄色葡萄球菌疾病
金黄色葡萄球菌引起广泛的感染，范围从相对轻微的皮肤感染至更严重和侵入性感染，如心内膜炎、坏死性筋膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎和肺炎。这些体内部位中的每个是独特的，并且细菌可能通过将它们的抗原表达谱变为最适合个体菌株定殖、生长并最终导致疾病的抗原表达谱来应对环境刺激的差异。如实施例12所示，金黄色葡萄球菌菌株表现出体内抗原表达的多样性。由不同抗原组成的多组分免疫原性组合物更可能防范金黄色葡萄球菌所引起的各种疾病表现。
据证实ClfA在啮齿动物心内膜炎和脓毒症模型中保护。据报道ClfB在金黄色葡萄球菌的鼻部定殖中很重要。MntC在小鼠菌血症模型中包含小鼠。CP5缀合物在肾盂肾炎和心内膜炎中保护，并且CP8缀合物在啮齿动物肾盂肾炎和脓毒症模型中保护。这些结果证实含有这些抗原的多组分疫苗会防范多种类型的金黄色葡萄球菌疾病。
体内动物模型与实际感染的过程近似，并且有助于探讨哪种抗原可以有利于防范特定疾病。表26总结了来自在各种体内模型中进行的许多实验的结果。在每块中结果报道为用斜线分开的4个数字，例如脓毒症模型中的ClfA具有数字27/1/3/31。第一个数字代表ClfA免疫产生统计上显著的阳性保护结果的实验数目。第二个数字代表ClfA免疫产生阳性保护结果的实验数目，所述阳性保护结果倾向于显著，但不是统计上显著的。第三个数字代表ClfA免疫产生阴性结果的实验数目，但是所述阴性结果不是统计上显著的。第四个数字是所进行的实验的总数目。前三个数字加起来应当等于第四个数字。
表26.动物模型中金黄色葡萄球菌抗原保护的总结
CIfA CP5 CP8 MntC20
菌血症 1/4/0/5 3/0/3/6 1/1/1/3 6/2/5/13
脓毒症 27/1/3/31 1/0/0/1 NT NT
肾盂肾炎 0/4/2/6 13/1/0/14 NT 1/0/4/525
心内膜炎 3/6/1/10 3/2/2/7 NT NT
NT：未检测
实施例31：体外和体内检测各种多抗原免疫原性组合物。
在各种体内模型中检测含有选自以下多肽和/或多糖的3种、4种或5种抗原的各种多抗原葡萄球菌免疫原性制剂的免疫原性和效力：ClfA、ClfB、MntC、CP5-和CP8。所述免疫原性组合物如下：
(1)一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的缀合至CRM197的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖；
(2)第二种组合提供聚集因子A(ClfA)、聚集因子B(ClfB)、分离的MntC、分离的缀合至CRM197的葡萄球菌荚膜多糖CP5以及分离的缀合至CRM197的葡萄球菌荚膜多糖CP8；
(3)第三种组合提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、或者分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至CRM197的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖、以及分离的缀合至CRM197的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖；分离的
(4)第四种组合提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的缀合至CRM197的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖；
(5)第五种组合提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至CRM197的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖以及分离的缀合至CRM197的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖；以及
(6)第六种组合提供一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽以及分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。
如实施例1所述制备和纯化rClfA和rClfB。如实施例2所述制备和纯化MntC。如实施例3所述制备和纯化分离的CP5和CP8，并且如实施例4所述将其缀合至CRM197。
更特别地，将上文以前的实施例中描述的方法用来测量免疫原性和效力。进行研究以测定所述3种、4种或5种组分中的每种在单独或一起递送时是否诱导免疫应答。这些相同的研究用来测定所述4种或5种组分中的任一种的存在是否干扰其他3种或4种组分中的任一种诱导免疫应答的能力。此外，进行研究以测定所述4种或5种组分在单独检测时或者在一起检测时是否会在上文所述的任一种或多种动物模型中赋予保护。如上文以前的实施例所述，将所述4种或5种组分作为单剂量或者作为多剂量施用给动物，例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。将动物取血，采集血清，并且测试所述4种或5种组分中每种的抗体的存在。通过本领域技术人员已知的任何免疫测定测量抗原特异性抗体的存在，例如ELISA(参见实施例11-29)或蛋白印迹(参见实施例1)用来评价抗原特异性抗体的存在或不存在。此外，调理吞噬测定用来测定抗原特异性抗体在介导吞噬细胞杀死葡萄球菌生物体中是否有效(参见实施例11-29)。
还利用上文所述的任一种或多种动物研究评价体内效力，例如但不限于留置管模型；小鼠菌血症模型；伤口感染模型；小鼠肾盂肾炎模型；大鼠心内膜炎模型以及小鼠脓毒症模型(参见实施例11-30)。
实施例32：金黄色葡萄球菌抗原的组合在非人灵长类中产生促进杀死金黄色葡萄球菌菌株Pfe5-1的抗体。
如利用OPA测定所测量的，利用抗原的组合观察到增强的效力。进行非人灵长类研究，其中将3-10只猴的组用多组分疫苗免疫。动物接受单剂量的疫苗，并且在第0天和免疫接种后2周监测OPA效价。OPA效价定义为在OPA测定中杀死50％的金黄色葡萄球菌菌株Pfe5-1所需的血清的稀释度。与3-抗原疫苗制剂相比，对4种抗原的组合观察到增强的活性(p＝0.0272；图18)。
序列表
<110> 惠氏有限责任公司
<120> 金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物
<130> AM102183
<140>
<141>
<160> 131
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 927
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
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165 170 175
Tyr Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Asn Asn Asp Ser Lys Asp Lys Phe
180 185 190
Asn Asp Ile Pro Lys Glu Gln Arg Ala Met Ile Thr Ser Glu Gly Ala
195 200 205
Phe Lys Tyr Phe Ser Lys Gln Tyr Gly Ile Thr Pro Gly Tyr Ile Trp
210 215 220
Glu Ile Asn Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Glu Gln Met Arg Gln Ala
225 230 235 240
Ile Glu Phe Val Lys Lys His Lys Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr
245 250 255
Ser Val Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys
260 265 270
Asp Ile Phe Gly Glu Val Tyr Thr Asp Ser Ile Gly Lys Glu Gly Thr
275 280 285
Lys Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Glu Thr Val
290 295 300
His Gly Ser Met Lys
305
<210> 11
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<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 11
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ggttatattt gggaaattaa cactgaaaaa caaggtacac ctgaacaaat gagacaagct 720
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<210> 12
<211> 309
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 12
Met Lys Lys Leu Val Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Val Ala
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Ala Cys Gly Thr Gly Gly Lys Gln Ser Ser Asp Lys Ser Asn Gly Lys
20 25 30
Leu Lys Val Val Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Ala Lys Asn
35 40 45
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50 55 60
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Asp Ala Asp Val Ile Leu Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn
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Leu Asp Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Gln Thr Phe Ile
145 150 155 160
Asp Asn Asp Lys Lys His Lys Ala Tyr Tyr Glu Lys Gln Gly Asn Lys
165 170 175
Tyr Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Asn Asn Asp Ser Lys Asp Lys Phe
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Ser Val Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys
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His Gly Ser Met Lys
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<210> 13
<211> 927
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 13
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<222> (195)..(195)
<223> Any amino acid
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Ile Glu Phe Val Lys Lys His Lys Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr
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Ser Val Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys
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Asp Ile Phe Gly Glu Val Tyr Thr Asp Ser Ile Gly Lys Glu Gly Thr
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<213> Staphylococcus aureus
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<213> Staphylococcus aureus
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<210> 17
<211> 1626
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
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<212> DNA
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Glu Glu Gly Asn Lys Asp Lys Gln Asp Pro His Ala Trp Leu Ser Leu
115 120 125
Asp Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Gln Thr Phe Ile Asp
130 135 140
Asn Asp Lys Lys His Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Gln Gly Asn Lys Tyr
145 150 155 160
Ile Ala Gln Leu Glu Lys Leu Asn Asn Asp Ser Lys Asp Lys Phe Asn
165 170 175
Asp Ile Pro Lys Glu Gln Arg Ala Met Ile Thr Ser Glu Gly Ala Phe
180 185 190
Lys Tyr Phe Ser Lys Gln Tyr Gly Ile Thr Pro Gly Tyr Ile Trp Glu
195 200 205
Ile Asn Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Glu Gln Met Arg Gln Ala Ile
210 215 220
Glu Phe Val Lys Lys His Lys Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr Ser
225 230 235 240
Val Asp Lys Lys Ala Met Glu Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys Asp
245 250 255
Ile Phe Gly Glu Val Tyr Thr Asp Ser Ile Gly Lys Glu Gly Thr Lys
260 265 270
Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Glu Thr Val His
275 280 285
Gly Ser Met Lys
290
<210> 120
<211> 879
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 120
atgggtactg gtggtaaaca aagcagtgat aagtcaaatg gcaaattaaa agtagtaacg 60
acgaattcaa ttttatatga tatggctaaa aatgttggtg gagacaacgt cgatattcat 120
agtattgtac ctgttggtca agatcctcat gaatatgaag ttaaacctaa agatattaaa 180
aagttaactg acgctgacgt tattttatac aacggattaa atttagagac tggtaacggt 240
tggtttgaaa aagccttaga acaggctggt aaatcattaa aagataaaaa agttatcgca 300
gtatcaaaag atgttaaacc tatctattta aacggtgaag aaggcaacaa agataaacaa 360
gatccacacg catggttaag tttagataat ggtattaaat acgtaaaaac aattcaacaa 420
acatttatcg ataacgacaa aaaacataaa gcagattatg aaaagcaagg taacaaatac 480
attgctcaat tggaaaaatt aaataatgac agtaaagaca aatttaatga cattccaaaa 540
gaacaacgtg ccatgattac aagtgaaggt gccttcaagt acttctcaaa acaatacggt 600
attacaccag gttatatttg ggaaattaac actgaaaaac aaggtacacc tgaacaaatg 660
agacaagcta ttgagtttgt taaaaagcac aaattaaaac acttattagt agaaacaagt 720
gttgataaga aagcaatgga aagtttatct gaagaaacga agaaagatat ctttggtgaa 780
gtgtacacag attcaatcgg taaagaaggc actaaaggtg actcttacta caaaatgatg 840
aaatcaaata ttgaaactgt acacggaagc atgaaataa 879
<210> 121
<211> 292
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 121
Met Gly Asn His Ser Asn His Glu His His Ser His Glu Gly Lys Leu
1 5 10 15
Lys Val Val Thr Thr Asn Ser Ile Leu Tyr Asp Met Val Lys Arg Val
20 25 30
Gly Gly Asn Lys Val Asp Val His Ser Ile Val Pro Val Gly Gln Asp
35 40 45
Pro His Glu Tyr Glu Val Lys Pro Lys Asp Ile Lys Ala Leu Thr Asp
50 55 60
Ala Asp Val Val Phe Tyr Asn Gly Leu Asn Leu Glu Thr Gly Asn Gly
65 70 75 80
Trp Phe Glu Lys Ala Leu Asp Gln Ala Gly Lys Ser Thr Lys Asp Lys
85 90 95
Asn Val Ile Ala Ala Ser Asn Asn Val Lys Pro Ile Tyr Leu Asn Gly
100 105 110
Glu Glu Gly Asn Lys Asn Lys Gln Asp Pro His Ala Trp Leu Ser Leu
115 120 125
Glu Asn Gly Ile Lys Tyr Val Lys Thr Ile Gln Lys Ser Leu Glu His
130 135 140
His Asp Lys Lys Asp Lys Ser Thr Tyr Glu Lys Gln Gly Asn Ala Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Lys Leu Glu Glu Leu Asn Lys Asp Ser Lys Asn Lys Phe Asp
165 170 175
Asp Ile Pro Lys Asn Gln Arg Ala Met Met Thr Ser Glu Gly Ala Phe
180 185 190
Lys Tyr Phe Ala Gln Gln Phe Asp Val Lys Pro Gly Tyr Ile Trp Glu
195 200 205
Ile Asn Thr Glu Lys Gln Gly Thr Pro Gly Gln Met Lys Gln Ala Ile
210 215 220
Lys Phe Val Lys Asp Asn His Leu Lys His Leu Leu Val Glu Thr Ser
225 230 235 240
Val Asp Lys Lys Ala Met Gln Ser Leu Ser Glu Glu Thr Lys Lys Asp
245 250 255
Ile Tyr Gly Glu Val Phe Thr Asp Ser Ile Gly Lys Glu Gly Thr Lys
260 265 270
Gly Asp Ser Tyr Tyr Lys Met Met Lys Ser Asn Ile Asp Thr Ile His
275 280 285
Gly Ser Met Lys
290
<210> 122
<211> 879
<212> DNA
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 122
atggggaatc acagtaacca tgaacatcac tcacatgaag gaaaattaaa agttgtaact 60
acaaactcta ttctctatga catggttaaa cgtgtcggtg gaaataaggt cgatgttcat 120
agcatcgttc cagtaggaca agatccacat gaatatgagg ttaaacctaa agatattaaa 180
gcattaacag atgctgacgt tgtattttat aatggtttaa acctagaaac tggaaatggt 240
tggtttgaaa aagcacttga ccaagcagga aaatcaacaa aagataaaaa tgtgatagca 300
gcatcaaata atgttaaacc aatatactta aatggtgagg aaggtaacaa aaacaaacaa 360
gatccacatg catggttaag tttagagaat ggaattaaat acgtaaaaac aatacaaaaa 420
tcactagaac atcatgataa aaaagataag tctacatatg aaaaacaagg gaatgcatat 480
atatcaaaat tagaagaact taataaagat agtaaaaata aatttgatga catacccaaa 540
aatcaacgtg ccatgatgac aagtgaaggt gcatttaaat attttgctca acaattcgat 600
gttaaaccag gttatatttg ggagataaac acagaaaaac aaggtacacc tggtcaaatg 660
aaacaagcca ttaaatttgt taaagataat catttaaaac atttattagt cgaaacaagc 720
gtagataaaa aagctatgca aagtttatca gaagaaacta agaaagatat ttatggtgaa 780
gtatttaccg actctatagg taaggaaggt actaaaggtg actcatacta taaaatgatg 840
aaatctaata ttgatacaat acatggtagt atgaaataa 879
<210> 123
<211> 531
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 123
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Ser Glu Asn Ser Val
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Thr Gln Ser Asp Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser
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Ser Val Ser Ala Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr
35 40 45
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165 170 175
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180 185 190
Val Ala Ala Asp Ala Pro Ala Ala Gly Thr Asp Ile Thr Asn Gln Leu
195 200 205
Thr Asn Val Thr Val Gly Ile Asp Ser Gly Thr Thr Val Tyr Pro His
210 215 220
Gln Ala Gly Tyr Val Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser Val Pro Asn Ser
225 230 235 240
Ala Val Lys Gly Asp Thr Phe Lys Ile Thr Val Pro Lys Glu Leu Asn
245 250 255
Leu Asn Gly Val Thr Ser Thr Ala Lys Val Pro Pro Ile Met Ala Gly
260 265 270
Asp Gln Val Leu Ala Asn Gly Val Ile Asp Ser Asp Gly Asn Val Ile
275 280 285
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asn Thr Lys Asp Asp Val Lys Ala Thr
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Leu Thr Met Pro Ala Ala Ile Asp Pro Glu Asn Val Lys Lys Thr Gly
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Asn Val Thr Leu Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr Thr Ala Asn Lys Thr
325 330 335
Val Leu Val Asp Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Tyr Asn Leu Ser Ile
340 345 350
Lys Gly Thr Ile Asp Gln Ile Asp Lys Thr Asn Asn Thr Tyr Arg Gln
355 360 365
Thr Ile Tyr Val Asn Pro Ser Gly Asp Asn Val Ile Ala Pro Val Leu
370 375 380
Thr Gly Asn Leu Lys Pro Asn Thr Asp Ser Asn Ala Leu Ile Asp Gln
385 390 395 400
Gln Asn Thr Ser Ile Lys Val Tyr Lys Val Asp Asn Ala Ala Asp Leu
405 410 415
Ser Glu Ser Tyr Phe Val Asn Pro Glu Asn Phe Glu Asp Val Thr Asn
420 425 430
Ser Val Asn Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gln Tyr Lys Val Glu Phe
435 440 445
Asn Thr Pro Asp Asp Gln Ile Thr Thr Pro Tyr Ile Val Val Val Asn
450 455 460
Gly His Ile Asp Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser Thr
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Leu Tyr Gly Tyr Asn Ser Asn Ile Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp Asp
485 490 495
Asn Glu Val Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Ile Asp
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515 520 525
Ile Pro Glu
530
<210> 124
<211> 1596
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 124
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtagtgaaa atagtgttac gcaatctgat 60
agcgcaagta acgaaagcaa aagtaatgat tcaagtagcg ttagtgctgc acctaaaaca 120
gacgacacaa acgtgagtga tactaaaaca tcgtcaaaca ctaataatgg cgaaacgagt 180
gtggcgcaaa atccagcaca acaggaaacg acacaatcat catcaacaaa tgcaactacg 240
gaagaaacgc cggtaactgg tgaagctact actacgacaa cgaatcaagc taatacaccg 300
gcaacaactc aatcaagcaa tacaaatgct gaagaattag tgaatcaaac aagtaatgaa 360
acgactttta atgatactaa tacagtatca tctgtaaatt cacctcaaaa ttctacaaat 420
gcggaaaatg tttcaacaac gcaagatact tcaactgaag caacaccttc aaacaatgaa 480
tcagctccac agagtacaga tgcaagtaat aaagatgtag ttaatcaagc ggttaataca 540
agtgcgccta gaatgagagc atttagttta gcggcagtag ctgcagatgc accggcagct 600
ggcacagata ttacgaatca gttgacgaat gtgacagttg gtattgactc tggtacgact 660
gtgtatccac accaagcagg ttatgtcaaa ctgaattatg gtttttcagt gcctaattct 720
gctgttaaag gtgacacatt caaaataact gtacctaaag aattaaactt aaatggtgta 780
acttcaactg ctaaagtgcc accaattatg gctggagatc aagtattggc aaatggtgta 840
atcgatagtg atggtaatgt tatttataca tttacagact atgtaaatac taaagatgat 900
gtaaaagcaa ctttgaccat gcccgctgct attgaccctg aaaatgttaa aaagacaggt 960
aatgtgacat tggctactgg cataggtagt acaacagcaa acaaaacagt attagtagat 1020
tatgaaaaat atggtaagtt ttataactta tctattaaag gtacaattga ccaaatcgat 1080
aaaacaaata atacgtatcg tcagacaatt tatgtcaatc caagtggaga taacgttatt 1140
gcgccggttt taacaggtaa tttaaaacca aatacggata gtaatgcatt aatagatcag 1200
caaaatacaa gtattaaagt atataaagta gataatgcag ctgatttatc tgaaagttac 1260
tttgtgaatc cagaaaactt tgaggatgtc actaatagtg tgaatattac attcccaaat 1320
ccaaatcaat ataaagtaga gtttaatacg cctgatgatc aaattacaac accgtatata 1380
gtagttgtta atggtcatat tgatccgaat agcaaaggtg atttagcttt acgttcaact 1440
ttatatgggt ataactcgaa tataatttgg cgctctatgt catgggacaa cgaagtagca 1500
tttaataacg gatcaggttc tggtgacggt atcgataaac cagttgttcc tgaacaacct 1560
gatgagcctg gtgaaattga accaattcca gagtag 1596
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Any amino acid
<400> 125
Leu Pro Xaa Thr Gly
1 5
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 126
Thr Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Val Asp
1 5
<210> 127
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 127
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser
1 5 10
<210> 128
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 128
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Gly Ser
1 5 10
<210> 129
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 129
Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
1 5 10
<210> 130
<211> 933
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 130
Met Asn Met Lys Lys Lys Glu Lys His Ala Ile Arg Lys Lys Ser Ile
1 5 10 15
Gly Val Ala Ser Val Leu Val Gly Thr Leu Ile Gly Phe Gly Leu Leu
20 25 30
Ser Ser Lys Glu Ala Asp Ala Ser Glu Asn Ser Val Thr Gln Ser Asp
35 40 45
Ser Ala Ser Asn Glu Ser Lys Ser Asn Asp Ser Ser Ser Val Ser Ala
50 55 60
Ala Pro Lys Thr Asp Asp Thr Asn Val Ser Asp Thr Lys Thr Ser Ser
65 70 75 80
Asn Thr Asn Asn Gly Glu Thr Ser Val Ala Gln Asn Pro Ala Gln Gln
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Glu Thr Thr Gln Ser Ser Ser Thr Asn Ala Thr Thr Glu Glu Thr Pro
100 105 110
Val Thr Gly Glu Ala Thr Thr Thr Thr Thr Asn Gln Ala Asn Thr Pro
115 120 125
Ala Thr Thr Gln Ser Ser Asn Thr Asn Ala Glu Glu Leu Val Asn Gln
130 135 140
Thr Ser Asn Glu Thr Thr Phe Asn Asp Thr Asn Thr Val Ser Ser Val
145 150 155 160
Asn Ser Pro Gln Asn Ser Thr Asn Ala Glu Asn Val Ser Thr Thr Gln
165 170 175
Asp Thr Ser Thr Glu Ala Thr Pro Ser Asn Asn Glu Ser Ala Pro Gln
180 185 190
Ser Thr Asp Ala Ser Asn Lys Asp Val Val Asn Gln Ala Val Asn Thr
195 200 205
Ser Ala Pro Arg Met Arg Ala Phe Ser Leu Ala Ala Val Ala Ala Asp
210 215 220
Ala Pro Ala Ala Gly Thr Asp Ile Thr Asn Gln Leu Thr Asn Val Thr
225 230 235 240
Val Gly Ile Asp Ser Gly Thr Thr Val Tyr Pro His Gln Ala Gly Tyr
245 250 255
Val Lys Leu Asn Tyr Gly Phe Ser Val Pro Asn Ser Ala Val Lys Gly
260 265 270
Asp Thr Phe Lys Ile Thr Val Pro Lys Glu Leu Asn Leu Asn Gly Val
275 280 285
Thr Ser Thr Ala Lys Val Pro Pro Ile Met Ala Gly Asp Gln Val Leu
290 295 300
Ala Asn Gly Val Ile Asp Ser Asp Gly Asn Val Ile Tyr Thr Phe Thr
305 310 315 320
Asp Tyr Val Asn Thr Lys Asp Asp Val Lys Ala Thr Leu Thr Met Pro
325 330 335
Ala Tyr Ile Asp Pro Glu Asn Val Lys Lys Thr Gly Asn Val Thr Leu
340 345 350
Ala Thr Gly Ile Gly Ser Thr Thr Ala Asn Lys Thr Val Leu Val Asp
355 360 365
Tyr Glu Lys Tyr Gly Lys Phe Tyr Asn Leu Ser Ile Lys Gly Thr Ile
370 375 380
Asp Gln Ile Asp Lys Thr Asn Asn Thr Tyr Arg Gln Thr Ile Tyr Val
385 390 395 400
Asn Pro Ser Gly Asp Asn Val Ile Ala Pro Val Leu Thr Gly Asn Leu
405 410 415
Lys Pro Asn Thr Asp Ser Asn Ala Leu Ile Asp Gln Gln Asn Thr Ser
420 425 430
Ile Lys Val Tyr Lys Val Asp Asn Ala Ala Asp Leu Ser Glu Ser Tyr
435 440 445
Phe Val Asn Pro Glu Asn Phe Glu Asp Val Thr Asn Ser Val Asn Ile
450 455 460
Thr Phe Pro Asn Pro Asn Gln Tyr Lys Val Glu Phe Asn Thr Pro Asp
465 470 475 480
Asp Gln Ile Thr Thr Pro Tyr Ile Val Val Val Asn Gly His Ile Asp
485 490 495
Pro Asn Ser Lys Gly Asp Leu Ala Leu Arg Ser Thr Leu Tyr Gly Tyr
500 505 510
Asn Ser Asn Ile Ile Trp Arg Ser Met Ser Trp Asp Asn Glu Val Ala
515 520 525
Phe Asn Asn Gly Ser Gly Ser Gly Asp Gly Ile Asp Lys Pro Val Val
530 535 540
Pro Glu Gln Pro Asp Glu Pro Gly Glu Ile Glu Pro Ile Pro Glu Asp
545 550 555 560
Ser Asp Ser Asp Pro Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ser Asp
565 570 575
Ser Gly Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Thr Ser Asp Ser Gly Ser Asp
580 585 590
Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp
595 600 605
Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Asp
610 615 620
Asn Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
625 630 635 640
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
645 650 655
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
660 665 670
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
675 680 685
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
690 695 700
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
705 710 715 720
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
725 730 735
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
740 745 750
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Ala
755 760 765
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
770 775 780
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
785 790 795 800
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp
805 810 815
Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp
820 825 830
Ser Asp Ser Asp Ser Ala Ser Asp Ser Asp Ser Gly Ser Asp Ser Asp
835 840 845
Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Glu Ser Asp Ser Asn Ser Asp Ser Glu
850 855 860
Ser Gly Ser Asn Asn Asn Val Val Pro Pro Asn Ser Pro Lys Asn Gly
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
Leu Leu Ala Ser Ile Gly Ser Leu Leu Leu Phe Arg Arg Lys Lys Glu
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Asn Lys Asp Lys Lys
930
<210> 131
<211> 2802
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 131
atgaatatga agaaaaaaga aaaacacgca attcggaaaa aatcgattgg cgtggcttca 60
gtgcttgtag gtacgttaat cggttttgga ctactcagca gtaaagaagc agatgcaagt 120
gaaaatagtg ttacgcaatc tgatagcgca agtaacgaaa gcaaaagtaa tgattcaagt 180
agcgttagtg ctgcacctaa aacagacgac acaaacgtga gtgatactaa aacatcgtca 240
aacactaata atggcgaaac gagtgtggcg caaaatccag cacaacagga aacgacacaa 300
tcatcatcaa caaatgcaac tacggaagaa acgccggtaa ctggtgaagc tactactacg 360
acaacgaatc aagctaatac accggcaaca actcaatcaa gcaatacaaa tgcggaggaa 420
ttagtgaatc aaacaagtaa tgaaacgact tttaatgata ctaatacagt atcatctgta 480
aattcacctc aaaattctac aaatgcggaa aatgtttcaa caacgcaaga tacttcaact 540
gaagcaacac cttcaaacaa tgaatcagct ccacagagta cagatgcaag taataaagat 600
gtagttaatc aagcggttaa tacaagtgcg cctagaatga gagcatttag tttagcggca 660
gtagctgcag atgcaccggc agctggcaca gatattacga atcagttgac gaatgtgaca 720
gttggtattg actctggtac gactgtgtat ccgcaccaag caggttatgt caaactgaat 780
tatggttttt cagtgcctaa ttctgctgtt aaaggtgaca cattcaaaat aactgtacct 840
aaagaattaa acttaaatgg tgtaacttca actgctaaag tgccaccaat tatggctgga 900
gatcaagtat tggcaaatgg tgtaatcgat agtgatggta atgttattta tacatttaca 960
gactatgtaa atactaaaga tgatgtaaaa gcaactttga ccatgcccgc ttatattgac 1020
cctgaaaatg ttaaaaagac aggtaatgtg acattggcta ctggcatagg tagtacaaca 1080
gcaaacaaaa cagtattagt agattatgaa aaatatggta agttttataa cttatctatt 1140
aaaggtacaa ttgaccaaat cgataaaaca aataatacgt atcgtcagac aatttatgtc 1200
aatccaagtg gagataacgt tattgcgccg gttttaacag gtaatttaaa accaaatacg 1260
gatagtaatg cattaataga tcagcaaaat acaagtatta aagtatataa agtagataat 1320
gcagctgatt tatctgaaag ttactttgtg aatccagaaa actttgagga tgtcactaat 1380
agtgtgaata ttacattccc aaatccaaat caatataaag tagagtttaa tacgcctgat 1440
gatcaaatta caacaccgta tatagtagtt gttaatggtc atattgatcc gaatagcaaa 1500
ggtgatttag ctttacgttc aactttatat gggtataact cgaatataat ttggcgctct 1560
atgtcatggg acaacgaagt agcatttaat aacggatcag gttctggtga cggtatcgat 1620
aaaccagttg ttcctgaaca acctgatgag cctggtgaaa ttgaaccaat tccagaggat 1680
tcagattctg acccaggttc agattctggc agcgattcta attcagatag cggttcagat 1740
tcgggtagtg attctacatc agatagtggt tcagattcag cgagtgattc agattcagca 1800
agtgattcag actcagcgag tgattcagat tcagcaagcg attccgactc agcgagcgat 1860
tccgactcag acaatgactc ggattcagat agcgattctg actcagacag tgactcagat 1920
tccgacagtg actcagattc agatagcgat tctgactcag acagtgactc agattcagat 1980
agcgattcag attcagatag cgattcagat tccgacagtg attccgactc agacagcgat 2040
tctgactccg acagtgattc cgactcagac agcgattcag attccgacag tgattccgac 2100
tcagatagcg attccgactc agatagcgac tcagattcag acagcgattc agattcagac 2160
agcgattcag attcagatag cgattcagat tccgacagtg actcagattc cgacagtgac 2220
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tcagacagtg attcggattc agcgagtgat tcggattcag atagtgattc cgactccgac 2340
agtgactcgg attcagatag cgactcagac tcggatagcg actcggattc agatagcgat 2400
tcggactcag atagcgattc agaatcagac agcgattcag aatcagacag cgattcagat 2460
tcagacagcg actcagacag tgactcagat tcagatagtg actcggattc agcgagtgat 2520
tcagactcag gtagtgactc cgattcatca agtgattccg actcagaaag tgattcaaat 2580
agcgattccg agtcaggttc taacaataat gtagttccgc ctaattcacc taaaaatggt 2640
actaatgctt ctaataaaaa tgaggctaaa gatagtaaag aaccattacc agatacaggt 2700
tctgaagatg aagcaaatac gtcactaatt tggggattat tagcatcaat aggttcatta 2760
ctacttttca gaagaaaaaa agaaaataaa gataagaaat aa 2802

Claims (10)

1.一种免疫原性组合物，其包含选自由以下所组成的组的至少3种组分：分离的金黄色葡萄球菌(S.aureus)聚集因子A(ClfA)多肽、分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽、分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。
2.一种免疫原性组合物，其包含：分离的金黄色葡萄球菌聚集因子A(ClfA)多肽、分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖、以及分离的缀合至载体蛋白的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖。
3.如权利要求2所述的免疫原性组合物，其进一步包含分离的金黄色葡萄球菌聚集因子B(ClfB)多肽。
4.如权利要求2或3所述的免疫原性组合物，其进一步包含分离的金黄色葡萄球菌MntC蛋白。
5.如权利要求1-4中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ClfA或ClfB多肽是包含ClfA或ClfB的纤维蛋白原结合结构域的多肽片段。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述ClfA或ClfB多肽片段是包含ClfA或ClfB的N1、N2和N3结构域的纤维蛋白原结合结构域。
7.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述ClfA或ClfB多肽片段是包含ClfA或ClfB的N2和N3结构域的纤维蛋白原结合结构域。
8.如权利要求5、6或7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述ClfA的纤维蛋白原结合结构域以与观察到的由ClfA的天然纤维蛋白原结合结构域结合至纤维蛋白原相比降低的水平结合至纤维蛋白原。
9.如权利要求8所述的免疫原性组合物，其中所述ClfA的纤维蛋白原结合结构域通过在Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys 389、Ala 254和Ile 387中的一处或多处具有氨基酸取代，而以与观察到的由ClfA的天然纤维蛋白原结合结构域结合至纤维蛋白原相比降低的水平结合至纤维蛋白原。
10.如权利要求9所述的免疫原性组合物，其中所述在Tyr 338、Tyr 256、Pro 336、Lys389、Ala 254和Ile 387中的一处或多处的氨基酸取代是取代为Ala或Ser。
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