CN1297316C - 作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式 - Google Patents
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Abstract
突变型霍乱全毒素包括霍乱毒素亚基(A)在氨基酸位置(16或72)有单个氨基酸取代或者双重氨基酸位置(16和68)或(68和72)与所述野生型霍乱全毒素相比毒性降低。突变型霍乱全毒素用作免疫原性组合物中的佐剂以提高脊椎动物宿主对选择的抗原的免疫应答,选择的抗原来自致病细菌、病毒、真菌或寄生虫、癌细胞、肿瘤细胞、变应原或自身分子。
Description
与其它申请的相互参照
本申请要求提交于2001年6月7日的美国临时专利申请号60/296,537的优先权利益。
发明的背景
身体免疫系统激活各种攻击病原的机制(Janeway,Jr,CA.和Travers P.编,《免疫生物学》,“健康和疾病中的免疫系统”(The Immune System in Health and Disease),第二版,Current Biology有限公司,伦敦,英国(1996))。然而,不是所有这些机制在免疫后必须激活。免疫诱导的保护性免疫取决于免疫原性组合物引起适当免疫应答的能力,免疫应答抵抗或去除病原。这取决于病原可能需要细胞-介导和/或体液免疫应答。
当许多抗原本身施用时免疫原性或非免疫原性差。对抗原的强适应免疫应答几乎总是要求抗原和佐剂一起施用,佐剂是增强免疫应答的物质(Audbert,F.M和Lise,L.D.1993 Immunology Today,14:281-284)。
相对于传染性生物对有效免疫过程的需要特别强烈,传染性生物引起急性感染或进入身体、肠胃、肺部、鼻咽或生殖泌尿的表面。这些区域浸没在含免疫球蛋白的粘液中,免疫球蛋白主要由分泌型免疫球蛋白IgA组成(Hanson,L.A.,1961Intl.Arch.Allergy Appl.Immunol.,18,241-267;Tomasi,T.B.和Zigelbaum,S.,1963 J.Clin.Invest.42,1552-1560;Tomasi,T.B.等,1965 J.Exptl.Med.,121,101-124)。此免疫球蛋自来源于大量的IgA-产生浆细胞,该细胞渗透粘膜下的固有层区域(Brandtzaeg,P.和Baklein,K,1976 Scand,J.Gastroenterol.,11(Suppl.36),1-45;Brandtzaeg,P.,1984“人鼻粘膜和扁桃体在健康和疾病中的免疫功能”(Immune Functions of Human NasalMucosa and Tonsils in Health and Disease),28页以及下列等,《肺和上呼吸道的免疫学》(Inmunology of the Lung and Upper Respiratory Tract),Bienenstock,J.编,McGraw-Hill,纽约,NY)。分泌型免疫球蛋白IgA通过分泌成分的作用特异运送至腔表面(Solari,R和Kraehenbuhl,J-P,1985 Immunol.Today,6,17-20)。
肠胃外免疫通常在诱导分泌型IgA应答中无效。分泌免疫最常通过直接免疫粘膜相关淋巴组织来获得。它们在一个粘膜部位诱导后,IgA-产生浆细胞的前体溢出并散布到不同粘膜组织,在粘膜组织中最终分化成高速IgA合成(Crabbe,P.A.等,1969 J.Exptl.Med.,130,723-744;Bazin,H.等,1970 J.Immunol.105,1049-1051;Craig,S.W.和Cebra,J.J.,1971 J.Exptl.Med.,134,188-200)。大量研究证明粘膜免疫诱导此共同粘膜免疫系统的可行性(Mestecky,J.等,1978 J.Clin.Invest.,61,731-737),但极少的例外,获得有效免疫所需的大剂量抗原使此方法对于纯化的抗原不实际。
研究克服此问题的策略是使用粘膜佐剂。一些增强抗原免疫应答的佐剂在现有技术中已知(Elson,C.O.和Ealding,W.,1984 J.Immunol.132,2736-2741)。这些佐剂与抗原混合时产生抗原颗粒,有助于在体内更长时间段维持抗原,从而促进巨噬细胞吸收增加并增强免疫应答。然而许多佐剂引起的不利反应或它们在诱导粘膜免疫中的无效使开发更好佐剂用于传递免疫原性组合物成为必要。遗憾的是,迄今佐剂开发主要是根据经验的操作(小Janeway等,上面引用的12-25到12-35页)。因此需要合理和更直接方法以开发有效佐剂用于传递抗原组合物。
已报导革兰氏-阴性细菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(V.cholerae)分泌的毒素是肠胃疾病霍乱的病因,它作为佐剂极有效。已报导霍乱毒素(CT)为382个氨基酸序列(SEQ ID NO:1)(Mekalanos,J.J.等,1983Nature,306,551-557),有18个氨基酸信号(SEQID NO:1的氨基酸1到18)。霍乱毒素全毒素分子是名为CT-A肽亚基(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1的氨基酸19到258)组成的六异聚(hexaheteromeric)复合体,它产生毒素的酶活性,五个各名为CT-B(每个有21个氨基酸信号(SEQ ID NO:1的氨基酸259到379),接着是CT-B肽亚基(SEQ ID NO:1的氨基酸280-382)的相同肽亚基参与毒素结合到肠上皮细胞以及表面含神经节苷脂GM1的其它细胞(Gill,D.M.,1976 Biochem.,15,1242-1248;Cuatrecasas,P.,1973 Biochem.,12,3558-566)。霍乱弧菌(CT)产生的CT在单个二硫键环内成熟CT-A(SEQ ID NO:2)的氨基酸位置187和199的半胱氨酸之间有蛋白酶解切割的CT-A亚基以产生酶活性A1多肽(Kassis,S.等,1982 J.Biol.Chem.,257,12148-12152)和较小的多肽A2,A2连接片段A1到CT-B五聚体(Mekalanos,J.J.等,1979 J.Biol.Chem.,254,5855-5861)。当酶活性片段CT-A1产生的毒性进入肠细胞时,ADP核糖基化调节G蛋白(Gsα)。这引起腺苷酸环化酶的组成性活化,使cAMP的细胞内浓度增加,流体分泌且电解液进入小肠腔,从而引起毒性(Gill,D.M.和Meren,R.,1978 Proc.Natul.Acad.Sci.,USA,75,3050-3054)。在体外,CT的ADP-核糖基转移酶活性被称为ARFs的辅助蛋白的存在刺激,已知GTP-结合蛋白参与真核细胞内小泡运输(Welsh,C.F.等,“ADP-核糖基化因子:活化霍乱毒素并调节小泡运输的鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白家族”(ADP-Ribosylation Factors:A Family of Guanine Nucleotide-Binding Proteins that ActivateCholera Toxin and Regulate Vesicular Transport),《天然毒素手册:疾病中的细菌毒素和毒性因子》第8卷(Handbook of Natural Toxins:Bacterial Toxins and VirulenceFactors in Disease卷8)第257-280页(Moss,J.等编,Marcel Dekker公司,纽约,NY(1995))。
已报导与不相关抗原共施用CT导致同时循环的诱导和粘膜抗体对该抗原的应答(Mekalanos,J.J.等,1983 Nature,306,551-557)。为使人中野生型CT引起的不良症状如腹泻减少到最低程度,优选使用显著降低毒性的CT全毒素形式作为佐剂。CT突变体建议作为获得更有用佐剂的方式。合理设计显著降低毒性的突变霍乱毒素全毒素(CT-CRMs)的一种方法是鉴定和改变毒素分子中的氨基酸残基,它们在霍乱(CT)家族和相关大肠杆菌(E.Coli)的不耐热肠毒素(LT-I、LT-IIa和LT-IIb)中完全保守。产生显著降低毒性的突变型CT-CRMs的另一种合理方法是改变全毒素分子中的氨基酸残基,它们被鉴定为对在CT骨架结构排列基础上的NAD-结合与具有ADP-核糖基转移酶活性如白喉毒素(DT)和百日咳毒素(PT)的相关毒素的骨架重要,(Holmes,R.K,“不耐热肠毒素(大肠杆菌)”(Heat-labile enterotoxins(Escherichiacoli),《蛋白毒素及其在细胞生物中使用的指南》(Guidebook to Protein Toxins andtheir Use in Cell Biology),Montecucco,C.和Rappnoli,R.编,牛津大学出版社,牛津,英格兰(1997);Holmes,R.K.等,“革兰氏阴性菌的霍乱毒素和相关肠毒素”,《天然毒素手册:疾病中的细菌毒素和毒性因子》第8卷,第225-256页,Moss,J.等编,Marcel Dekker公司,纽约,NY 1995)。
最近,揭示了合理设计、遗传-解毒的CT突变体,其中通过改变A亚基中29位上的氨基酸(名为CT-CRME29H)导入单个非保守氨基酸取代(谷氨酸到组氨酸)。所得突变体霍乱全毒素显示显著降低的酶毒性,但有较好的佐剂和免疫原性性质(国际专利出版号WO 00/18434,全部纳入本文作为参考)。
因此,需要鉴定和/或合理设计显著降低毒性的CT全毒素的另外突变体形式,但仍具有与所述野生型CT全毒素相同或增强的佐剂性。
发明概述
一方面,本发明提供霍乱全毒素(CT-CRMs)的新突变体、免疫原性形式,与所述野生型CT相比,毒性显著降低但保持它们作为免疫系统强有力刺激物的能力。具体的是,本发明涉及四种突变体霍乱全毒素(CT-CRMs),最好是由定点诱变产生且与所述野生型CT相比,毒性显著降低但没有丧失佐剂性。
在一个实施方案中,本发明的新CT-CRM包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段,其中A亚基的氨基酸16位上的氨基酸残基由另一个氨基酸取代,取代导致毒性显著降低。在本发明较佳实施方案中,A亚基的氨基酸16位上的氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代。为确定氨基酸位置,CT-A序列作为SEQ ID NO:2中的例子。然而也可使用CT-a的其它变体和片段。
在另一个实施方案中,本发明的新CT-CRM包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段,其中A亚基的氨基酸72位上的氨基酸残基由另一个氨基酸取代,取代导致毒性显著降低。在本发明较佳实施方案中,A亚基的氨基酸72位上的氨基酸缬氨酸由酪氨酸取代。
在又一个实施方案中,本发明的新免疫原性突变型CT-CRM显著降低CT毒性并包括CT的亚基A的氨基酸序列或其片段,其中A亚基的氨基酸16位和68位上的氨基酸残基都由与所述野生型CT的氨基酸16位和68位上存在的不同氨基酸取代,取代导致毒性显著降低。在本发明较佳实施方案中,在A亚基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代异亮氨酸,在A亚基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代丝氨酸。
在另外一个实施方案中,本发明的新免疫原性突变型CT-CRM显著降低CT毒性并包括CT的亚基A的氨基酸序列或其片段,其中A亚基的氨基酸68位和72位上的氨基酸残基都由与所述野生型CT的氨基酸68位和72位上存在的不同氨基酸取代,取代导致毒性显著降低。在本发明较佳实施方案中,在A亚基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代丝氨酸,在A亚基的氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代缬氨酸。
另一方面,发明提供了上述产生新CT-CRMs的方法,用常规技术定点突变编码野生型CT中A亚基的DNA,这样诱变的CT现在毒性显著降低而没有损害毒素刺激免疫应答的能力。
发明的又一方面中,提供的免疫原性组合物包括选择的抗原、上述作为佐剂在脊椎动物宿主中增强对抗原免疫应答的突变型CT-CRM、药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。优选的是,CT-CRM用于在脊椎动物宿主中产生或提高对选择抗原的全身和/或粘膜抗原免疫应答。选择抗原可以是来自致病病毒细菌、真菌或寄生虫的多肽、肽或片段。选择抗原可以是来自癌细胞或肿瘤细胞的多肽、肽或片段。选择抗原可以是来自变应原的多肽、肽或片段以干扰IgE产生来缓和对变应原的变应性反应。选择抗原可以是来自其分子部分的多肽、肽或片段,此部分代表宿主(自身分子)以不需要的方式、量或位置产生,如来自淀粉样前体蛋白,从而防止或治疗脊椎动物宿主中以淀粉样沉积为特征的疾病。
另外一方面,本发明提供了使用这些CT-CRMs作为免疫原性组合物中佐剂的方法或提高含上述选择抗原的抗原组合物引起脊椎动物宿主中免疫应答的能力的方法,这是通过包括有效佐剂量的一个或多个上述新的解毒突变型霍乱全毒素(CT-CRMs)。
发明的进一步方面中,提供了编码上述显著降低毒性的新免疫原性突变型CT-CRMs的DNA序列。优选的是,DNA序列编码毒性降低的突变A亚基和亚基B。另外,DNA序列只可编码毒性降低的突变体A亚基,其中突变型CT-A与其它结合域融合,或用LT-B共表达并可共装配。
发明的又一方面中,提供了含分离和纯化DNA序列的质粒,包括编码本文所述免疫原性、解毒、突变型霍乱全毒素的DNA序列,其中这种DNA序列操作连接于指导宿主细胞中CT-CRM表达的调节序列。调节序列优选包括阿拉伯糖可诱导启动子。在此方面的一个实施方案中,发明涉及名为pLP903的质粒,含分离和纯化DNA序列,包括编码显著降低毒性的免疫原性突变型CT-CRM的DNA序列,其中在A亚基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代异亮氨酸。在此方面的第二个实施方案中,发明涉及名为pLP905的质粒,含分离和纯化DNA序列,包括编码显著降低毒性的免疫原性突变型CT-CRM的DNA序列,其中在A亚基的氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代缬氨酸。在此方面的第三个实施方案中,发明涉及名为pLP904的质粒,含分离和纯化DNA序列,包括编码显著降低毒性的免疫原性突变型CT-CRM的DNA序列,其中在A亚基的氨基酸16位上氨基酸丙氨酸取代异亮氨酸,且在氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代丝氨酸。在此方面的其它实施方案中,发明涉及名为pLP906的质粒,含分离和纯化DNA序列,包括编码显著降低毒性的免疫原性突变型CT-CRM的DNA序列,其中在A亚基的氨基酸68位上氨基酸酪氨酸取代丝氨酸,在氨基酸72位上氨基酸酪氨酸取代缬氨酸。
发明的另一方面中,提供了合适的宿主细胞系,用本文所述质粒转化、感染、转导或转染。免疫原性、解毒、突变型霍乱全毒素是通过用上述一个质粒转化、感染、转导或转染合适的宿主细胞并在允许所述显著降低毒性的重组免疫原性、突变体霍乱全毒素蛋白的宿主细胞表达的培养条件下培养宿主细胞产生的。
发明的这些和其它方面对于读过下列发明详细描述的本领域技术人员是显而易见的。
发明详述
霍乱全毒素的突变体形式表现出毒性降低,但保持它们较多佐剂性和这些CTs的突变体形式作为本文所述免疫原性组合物中的佐剂使用。
A.突变体、解毒的霍乱毒素全毒素
与野生型CT相比,本发明的新突变体、解毒免疫原形式的霍乱毒素全毒素(CT-CRMs)的特征为毒性显著降低。然而这种CT-CRMs保持它们作为免疫系统强有力刺激物的能力。本发明的CT-CRMs特征为在霍乱毒素的CT-A亚基中一个或几个氨基酸取代。本发明的多种突变型CT-A亚基也保持它们与CT-B亚基装配形成突变型CT全毒素的能力,突变型CT全毒素在佐剂性上类似野生型CT,但与野生型CT相比毒性显著降低。本发明的CT-CRMs可使用与所述野生型CT-B亚基相关的突变或改变的CT-A亚基以产生功能性的全毒素。另外,本发明的CT-CRMs可包括与改变或突变型CT-B亚基相关的改变或突变型CT-A亚基。
为确定描述本发明CT-CRMs中氨基酸取代位置的氨基酸位置号,成熟CT-A序列作为SEQ ID NO:2的例子,即野生型CT序列SEQ ID NO:1的氨基酸19-258。编码霍乱全毒素A亚基的核苷酸序列列于国际专利出版号WO 93/13202。类似的,合适的成熟CT-B序列可由SEQ ID NO:1的氨基酸280-382阐明。然而,霍乱弧菌CT-A和CT-B的其它变体、生物型和片段也可用作含本文所述氨基酸取代的序列。参见例如ELTOR生物型,C.Shi等,1993生物化学杂志,9(4):395-399;NCBI基因座数据库号AAC34728和霍乱弧菌毒素变体的其它来源。
优选的是,本发明的CT-CRMs中的氨基酸取代来自用具类似结构和/或化学性质的其它氨基酸取代一个氨基酸,即保守氨基酸取代。“保守”氨基酸取代可在有关残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性基础上进行。例如,非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;极性/中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺;正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸;负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明由CT-CRMs作为例子,如表1总结,它们在氨基酸16位或氨基酸72位上有单个氨基酸取代或氨基酸16位和68位或68位和72位上有双重氨基酸取代。
表1:单个和双重CT-CRM突变体
氨基酸取代 | 天然 | 突变体 | 缩写 |
16 | 异亮氨酸16 | 丙氨酸6 | CT-CRMI16A |
72 | 缬氨酸72 | 酪氨酸72 | CT-CRMV72Y |
16和68 | 异亮氨酸16 | 丙氨酸6 | CT-CRMI16A,S68Y |
丝氨酸68 | 酪氨酸68 | ||
68和72 | 丝氨酸68 | 酪氨酸68 | CT-CRMS68Y,V72Y |
缬氨酸72 | 酪氨酸72 |
因此,在一个实施方案中,本发明的新CT-CRM包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段,其中A亚基的氨基酸16位上的氨基酸残基由另一个氨基酸取代,取代导致毒性显著降低。在本发明的一个较佳实施方案中,A亚基的氨基酸16位上的氨基酸异亮氨酸由丙氨酸取代。此CT-CRMI16A显示较好的佐剂性。
在另一个实施方案中,本发明的新CT-CRM包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段,其中A亚基的氨基酸72位上的氨基酸残基由另一个氨基酸取代,取代导致毒性显著降低。在本发明的一个较佳实施方案中,A亚基的氨基酸72位上的氨基酸缬氨酸由酪氨酸取代,产生CT-CRMV72Y。此CT-CRMV72Y显示较多的佐剂性。
在又一个实施方案中,本发明的新免疫原性突变型CT-CRM显著降低CT毒性并包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段,其中A亚基的氨基酸16位和68的氨基酸残基都由与所述野生型CT的氨基酸16位和68位上存在的不同氨基酸取代,取代导致毒性显著降低。在本发明的一个较佳实施方案中,A亚基的氨基酸16位上的氨基酸丙氨酸取代异亮氨酸,A亚基的氨基酸68位上的氨基酸酪氨酸取代丝氨酸,产生CT-CRMI16A,S68Y。此CT-CRMI16A,S68Y显示较好的佐剂性。
在另外一个实施方案中,本发明的新免疫原性突变型CT-CRM显著降低CT毒性并包括CT亚基A的氨基酸序列或其片段,其中A亚基的氨基酸68位和72位上的氨基酸残基都由与所述野生型CT的氨基酸68位和72位上存在的不同氨基酸取代,取代导致毒性显著降低。在本发明的一个较佳实施方案中,A亚基的氨基酸68位上的氨基酸酪氨酸取代丝氨酸,A亚基的氨基酸72位上的氨基酸酪氨酸取代缬氨酸。此CT-CRMS68Y,V72Y显示较好的佐剂性。
评估表1中新CT-CRMs对CT结构和功能的表型效果。通过定点诱变CT-编码基因产生的突变A亚基在亚基B存在时也能装配到免疫反应性的全毒素中,这由非-变性凝胶电泳分析确定(参见表3,实施例2)。各突变全毒素也在Y-1肾上腺肿瘤细胞试验中测试以确定其与野生型CT全毒素比较的剩余毒性(参见表4和5,实施例3)。表4所示结果证明突变型CT-CRMs与所述野生型霍乱全毒素相比毒性显著降低。有单个和双重氨基酸取代的CT-CRMs的剩余毒性与所述野生型CT相比显著降低。
各突变型CT-CRMs也与ADP-核糖基转移酶活性试验中的野生型CT相比(参见实施例4)。结果一般与Y-1肾上腺细胞试验中的毒性数据一致,表明多种CT-CRMs的ADP-核糖基转移酶活性与所述野生型CT相比显著减小(表6)。具有最大ADP-核糖基转移酶活性的突变体似乎是双重突变体CT-CRMI16A,S68Y。此活性仅约为野生型CT的3.3%。CT-CRMs、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A和CT-CRMS68Y,V72Y的酶活性分别为野生型CT活性的1.1%、2.4%和1.2%。
本发明的其它CT-CRMs可包含上述至少一个或双重突变和除了一个或多个上列氨基酸残基16、68或72位的位置上至少一个附加的突变。纳入本文作为参考的国际专利出版号WO 93/13202描述一系列CT-A亚基的突变,突变用于减少霍乱全毒素的毒性。这些突变包括取代氨基酸7位的精氨酸、9位的天冬氨酸、11位的精氨酸、29位的谷氨酸、44位的组氨酸、53位的缬氨酸、54位的精氨酸、61位的丝氨酸、63位的丝氨酸、70位的组氨酸、97位的缬氨酸、104位的酪氨酸、106位的脯氨酸、107位的组氨酸、110位的谷氨酸、112位的谷氨酸、114位的丝氨酸、127位的色氨酸、146位的精氨酸和192位的精氨酸。纳入本文作为参考的国际专利出版号WO 98/42375描述在A亚基的氨基酸109位上取代丝氨酸,用来减少霍乱全毒素的毒性。
用于本发明的其它有用的CT-CRM突变蛋白包括具有一个或多个上面提供的特异性突变的全长全毒素、多肽或其含上述诱变残基的片段,蛋白、多肽或片段保持来源于野生型CT的佐剂活性,但有毒性降低的特征。
这些酶活性减少的CT-CRMs免疫活性片段也可用于在本发明的方法和组合物。片段通常包含至少约25个CT-CRM蛋白的毗连氨基酸,蛋白含上述诱变位点。更具代表性的CT-CRM片段包含至少约75个毗连氨基酸。其它CT-CRM片段含至少约100个毗连氨基酸。CT-CRM亚基A的另外实施方案包含至少约150个毗连氨基酸长度。
本文所述CT-CRMs片段如果产生或增强脊椎动物宿主中对选择抗原的免疫应答,它在下述方法和组合物中有用。片段包括CT-CRMs的羧基末端区域截短。例如,截短为仅含CT-A突变亚基的CT-CRM是理想的片段。类似地,在约残基240或250上截短的CT-A亚基是理想的片段。可选择本发明的CT-CRMs的其它片段。CT-CRM全毒素的另外片段可包含少于五个CT-B亚基的重复或截短的CT-B亚基。前述片段也可包含一个或多个上述特异性突变。
其它合适的CT-CRM蛋白可包括一个或多个含取代基团的氨基酸残基。另一合适的CT-CRM全毒素蛋白是其中CT-CRM多肽与其它化合物融合,如增加多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。又一合适的CT-CRM蛋白是其中其它氨基酸融合到多肽中,如前导序列或分泌序列或用来提高CT-CRM蛋白的免疫原性的序列。CT-CRMs的其它修饰包括缺失上述CT-A信号或CT的N末端的前导序列,即SEQID No:1的氨基酸1-18,和/或在SEQ ID No.1氨基酸259-279上缺失CT-B信号或前导序列,和/或缺失其它不影响免疫原性的区域。类似地,修饰本文所述CT-CRMs包括用另外信号或前导序列取代信号或前导序列。参见如纳入本文参考文献的美国专利号5,780,601。
合适的CT-CRM蛋白的另一个例子是其中任选氨基酸(如-Gly-Ser-)或其它氨基酸或化学化合物间隔子可包括在多肽末端用于连接多种全毒素蛋白在一起或连接到载体。例如,有用的CT-CRMs可包括一个或多个上述偶联到载体蛋白的CT-CRMs。另外,有用的CT-CRM可存在于含多种CT-CRMs的融合蛋白中,任选地偶联到载体蛋白。
对于这些实施方案,载体蛋白理想是可提高选择的CT-CRM免疫原性的蛋白或其它分子。这种载体可以是也有佐剂效果的较大分子。示范性常规蛋白载体包括但不限于,大肠杆菌DnaK蛋白、半乳糖激酶(GalK,催化细菌中半乳糖代谢的第一步)、泛素、α-交配因子、β-半乳糖苷酶和流感NS-1蛋白。类毒素(即编码天然产生的毒素的序列,具有充分修饰以去除其毒性)也可用作载体,如白喉类毒素和破伤风类毒素、它们各自的毒素和这些蛋白的任何突变体形式如CRM197(白喉毒素的一种非毒性形式,参见美国专利号5,614,382)。其它载体包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A、大肠杆菌的不耐热毒素和轮状病毒颗粒(包括轮状病毒和VP6颗粒)。另外,可使用载体蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或抗原表位。例如,半抗原可偶联到细菌毒素的T细胞抗原表位。参见美国专利号5,784,973。类似地可使用多种细菌热激蛋白,如分枝杆菌hsp-70。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)是另一种有用载体。本领域技术人员可选择一种适当载体用于此方面。融合蛋白可通过标准技术形成用于偶联蛋白质物质。融合可从融合基因构建物表达,构建物由下述重组DNA技术制备。
本文所述其它合适的CT-CRMs可不同于具体例示的CT-CRMs,这是通过不恢复酶毒性、不减少佐剂活性的修饰或这些特征的组合。例如可进行保守氨基酸变化,尽管它们改变CT-CRM蛋白的主要序列,但一般不改变其功能。在作出这些变化中,可考虑氨基酸的亲水指标。亲水氨基酸指标在赋予多肽相互作用生物功能中的重要性一般在本领域中了解(Kyte&Doolittle,1982 J.Mol.Biol.,157(1):105-132)。已知某些氨基酸可取代其它有类似亲水指标或分数的氨基酸,并仍导致有相似生物活性的多肽。各氨基酸在其疏水性和电荷特性基础上确定亲水指标。那些指标是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸残基的相对亲水特性确定所得多肽的二级和三级结构,从而明确多肽与其它分子的相互作用,如酶、底物、受体、抗体、抗原等。在本领域已知氨基酸可由另一个具类似亲水指标的氨基酸取代且仍获得功能相当的多肽。在这些电荷中,取代氨基酸的亲水指标优选在+/-2内,尤其优选在+/-1内,更尤其优选在+/-0.5内。
取代相似氨基酸也可在亲水性基础上进行,具体是生物功能相当的多肽或因此产生的肽用于免疫学实施方案。纳入本文作为参考的美国专利号4,554,101指明由相邻氨基酸的亲水性决定的多肽最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关,即与多肽生物性质相关。
如美国专利号4,554,101中详述,下列亲水性值分配给氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);脯氨酸(-0.5±1);苏氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。据说氨基酸可取代具类似亲水性值的另外氨基酸,且仍获得生物学相当具体是免疫学相当多肽。在这些变化中,优选取代亲水性值在±2内的氨基酸,尤其优选在+/-1内,更尤其优选在+/-0.5内。
如上概括,氨基酸取代一般以氨基酸侧链取代的相对类似性为基础,例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示范性取代对本领域技术人员熟知并包括:精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天冬酰胺;缬氨酸;亮氨酸和异亮氨酸。
此外,一般不改变CT-CRM蛋白主要序列的修饰包括多肽的体内或体外化学衍生化,如乙酰化、甲基化或羧化。同样包括作为本发明的CT-CRMs是糖基化修饰的蛋白,如通过在合成和加工或进一步加工步骤中修饰多肽的糖基化模式制成;或通过使多肽暴露于影响糖基化的酶制成,如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。也包括作为CT-CRMs的是上面鉴定有磷酸化氨基酸残基的突诱变序列,如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
同样包括作为本发明CT-CRMs的是用普通分子生物技术修饰的上述序列,以便改进它们耐分解蛋白的降解或最优化溶解性质。在这些CT-CRMs中包括那些含除了天然产生的L-氨基酸外的残基,如D-氨基酸或非天然产生合成氨基酸。可存在于本发明CT-CRMs中的其它已知修饰没有限制,是酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附着黄素、共价附着血红素部分、共价附着核苷酸或核苷酸衍生物、共价附着脂质或脂质衍生物、共价附着磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆寇酰化、氧化、蛋白水解加工、异戊二烯化、外消旋化、硒基化(senenoylation)、硫化、转移-RNA介导的氨基酸加入蛋白质如精氨酰化和泛素化。
因此本发明突变型CT-CRMs是全毒素并表现出毒性降低或比野生型CT毒性显著小。如本文所用,术语和短语“全毒素降低毒性”或“毒性显著减小”或等等指本发明CT-CRM突变体与野生型CT相比显示每单位纯化的毒素蛋白较低毒性,如本文所述四种CT-CRM突变体(CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A,S68Y和CT-CRMS68Y,V72Y)。此“降低的毒性”使各突变体能用作免疫原性组合物中的佐剂而不引起显著副作用,特别是那些已知与CT相关的副作用如腹泻。如下面更详细描述,本发明突变型CT-CRMs在Y-1小鼠肾上腺细胞试验中表现出显著低于野生型CT的毒性水平,且与所述野生型CT比较ADP-核糖基转移酶活性显著降低。
根据本发明的免疫原性突变型CT-CRMs表现毒性降低和保持佐剂活性的平衡,这样所得突变型CT蛋白在其导入的脊椎动物宿主中安全地耐受时作为佐剂发挥功能。如以下例子所示,鼠模型试验系统中的结果表明本文所示突变型CT-CRMs能在鼻内施用不同抗原后显著增强粘膜和全身免疫应答。此外,即使存在先存在的抗-CT免疫应答,突变体CT-CRMs能用作有效的粘膜佐剂。支持本发明CT-CRMs的这些特征的研究在下面总结,并在实施例中更具体说明。
为评估突变型CT-CRMs作为组合物粘膜佐剂的效率,组合物含包括在免疫原性组合物中鉴定作为候选物的细菌或病毒抗原,检测了三种不同模型抗原系统:(1)非典型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(NTHi)的重组P4外膜蛋白(也称为蛋白“e”(rP4))(参见美国专利号5,601,831),(2)粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)的天然UspA2外膜蛋白(国际专利出版号WO 98/28333),(3)呼吸道合胞病毒(RSV)的天然融合糖蛋白(F蛋白)(参见美国专利号5,223,254)。突变型CT-CRMs作为NTHi rP4的佐剂与CT-CRME29H和野生型CT互相比较。在第一个研究中,评估突变型CT-CRMI16A提高全身和粘膜抗体对rP4诱导的佐剂活性能力,并与所述野生型CT和CT-CRME29H相比。结果表明CT-CRMI16A像野生型CT和CT-CRME29H,增加rP4蛋白引起全身和体液免疫应答的能力(参见表8和9)。例如第三次IN免疫后六周,用CT-CRMI16A或CT-CRME29H制成的rP4蛋白免疫小鼠的抗rP4 IgG抗体效价比单独PBS中用重组蛋白免疫的小鼠大40倍。初次IN免疫六周后,施用重组蛋白加1μg浓度野生型CT全毒素的小鼠抗体效价(IgG)比单独在盐水中施用重组rP4的小鼠抗体效价提高67倍。用1μg突变体CT-CRME29H免疫小鼠的抗体效价比单独用rP4免疫小鼠的抗体效价提高48倍。相比之下,用1μg和0.1μg突变体CT-CRMI16A免疫小鼠的抗体效价分别比盐水中单独用rP4免疫小鼠的抗rP4抗体效价增加15倍和27倍。
第三次免疫后两周检测粘膜分泌中蛋白-特异抗体进一步表明,CT-CRMI16A促进产生局部免疫应答抗rP4蛋白。此外,抗rP4抗体效价可与所述野生型CT佐剂免疫原性组合物诱导的相比(表9)。
为测试及比较含1μg重组rP4和1μg突变型CT-CRMs(CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y)的制剂和含1μg rP4和1μg CT-CRME29H或盐水中单独1μg rP4的制剂中突变型CT-CRMs的佐剂效果。多种组合物鼻内传送给雌性BALB/c小鼠,并在3和5周以及第5周第六天测量抗rP4 IgG和IgA效价。数据表明CT-CRMs、CT-CRMI16A和CT-CRMV72Y在诱导全身以及粘膜抗rP4抗体反应中与CT-CRM一样有效(表10和11)。含rP4和CT-CRMI16A制剂诱导的抗rP4抗体的血清IgG效价在第5周第六天比rP4单独诱导大22倍,且是CT-CRME29H诱导IgG水平的一半。然而,含rP4和CT-CRMV72Y制剂诱导的抗rP4抗体的血清IgG效价比CT-CRME29H诱导大1.2倍,且比rP4单独诱导大53倍。尽管CT-CRMI16A,S68Y和CT-CRMS68Y,V72Y诱导的rP4-特异IgG效价仅约为CT-CRMI16A和CT-CRMV72Y诱导的五分之一,这些水平仍显著高于盐水中单独rP4诱导。
用CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y免疫小鼠血清中的蛋白-特异IgA抗体效价比单独用rP4免疫IN小鼠大6到23倍。
用CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y免疫小鼠的支气管肺泡洗液、鼻洗液、唾液和阴道洗液中的蛋白-特异IgA抗体效价可与用CT-CRME29H免疫小鼠的粘膜洗液收集中的IgA水平相比,但显著大于单独用rP4免疫的小鼠(见表11)。
在以上研究中,也评估了六组中各单独小鼠血清中的抗rP4抗体效价。具体是,IN施用后41天,IgA和包括IgG亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3的IgG终点效价通过ELISA确定。结果表明,在接受含rP4和四种突变体CT-CRMs之一的制剂的各单独小鼠中IgA和IgG亚类效价显著高于仅接受盐水中rP4抗原的动物中IgA和IgG效价(见表12-17)。结果进一步表明,在接受rP4和突变体CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y和CT-CRMV72Y之一的动物中IgA和IgG效价可与接受rP4加上CT-CRME29H小鼠中检测到的IgA和IgG效价相比。
本发明CT-CRMs增加全身和粘膜免疫应答抗呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白的能力用纯化的天然融合(F)蛋白检测。先前证明用CT或CT-CRME29H辅助的F蛋白免疫IN的BALB/c小鼠产生全身和局部IgG和IgA效价,(Tebbey等,上面引用)。此研究也表明前-存在抗CT抗体对局部或全身抗F蛋白IgA和IgG抗体的水平没有副作用。确实,研究表明,先存在的抗CT抗体有益于产生增强的抗F蛋白抗体反应。另外,数据也显示包括通过IN免疫操作应答中刺激的粘膜或体液免疫球蛋白,免疫操作含F/CT-CRME29H。在本研究中,盐水或制剂中单独的纯化F蛋白(3μg/剂量)中和感染性病毒的机制IN施用给BALB/c小鼠,制剂含0.1或1μg野生型CT或者0.1或1μg突变体CT-CRMs(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y)之一。确定小鼠的支气管肺泡洗液、鼻洗液和阴道洗液中的蛋白-特异IgG和IgA抗体效价。用1μg CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y,V72Y免疫小鼠的支气管肺泡洗液、鼻洗液和阴道洗液中的蛋白-特异IgG和IgA抗体效价可与用所述野生型CT或CT-CRME29H免疫小鼠的粘膜洗液收集中的IgG和IgA水平相比(见表19)。用0.1μg CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y,V72Y免疫小鼠中粘膜蛋白-特异IgG水平尽管显著高于用盐水中F蛋白免疫小鼠中检测到的水平,仍比用1μg CT-CRMs免疫小鼠中检测到的水平低三分之一到十分之一。相反,粘膜洗液中IgA水平显著提高仅在用1μg突变型CT-CRMs免疫小鼠中观察到。
检测了突变型CT-CRMs增强小鼠中全身和粘膜免疫应答抗粘膜炎莫拉氏菌的天然UspA2外膜蛋白的能力。10μl盐水或10μl制剂中单独的纯化UspA2(5μg/剂量)在0、7和14天施用IN,制剂含0.1μg/剂量的突变型CT-CRM(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y,V72Y)。血清和粘膜灌洗中蛋白-特异IgG和IgA水平在第28天检测。仅在用CT-CRME29H、CT-CRMI16A,S68Y和CT-CRMV72Y免疫动物血清中检测到统计学显著水平。还在用CT-CRME29H、CT-CRM116A,S68Y和CT-CRMV72Y免疫动物的支气管洗液中检测到显著水平的IgG。
B.编码CT-CRMs的核酸分子
本发明的另一个方面包括分离、合成或重组核酸分子以及编码上述CT-CRMs的序列,CT-CRMs具有指定的定点突变或可进一步含一个或多个那些突变的片段。
一种包括编码CT-CRM的蛋白核酸序列的分离核苷酸分子可优选在调节序列的控制下,调节序列指导宿主细胞中CT-CRM的表达。如本文所述,这种核酸分子可用来体外表达CT-CRM蛋白或允许在人中体内表达CT-CRM蛋白。
如本文所用,术语“分离的核苷酸分子或序列”指没有其它生物成分污染的核酸部分或片段,这些生物成分可与分子或序列在其天然环境中相关。例如,本发明分离的核苷酸分子或序列的一个实施方案是从天然产生状态侧翼序列分离的序列,如从正常邻近片段的序列取出的DNA片段,例如邻近基因组中天然产生的片段的序列。此外,改变本发明的核苷酸酸序列和分子以编码本发明的CT-CRM蛋白。因此,术语“分离的核酸分子或序列”也用于从其它成分中大量纯化的核酸序列或分子,这些成分天然伴随未诱变的核酸,如细胞中的RNA或DNA或蛋白质。本发明分离的核苷酸分子或序列也包括由其它常规方法制备的序列和分子,如重组方法、合成方法如诱变,或这些方法的组合。本发明的核苷酸序列或分子构建不应仅限于本文所列具体核苷酸序列,但应构建包括任何和所有与本文所示核苷酸序列有同源性的核苷酸序列(即有序列同一性)。
术语“基本同源性”或“基本相似性”当指核酸或其片段时,表明与插入或缺失其它核酸(或其互补链)的适当核苷酸最佳排列时,至少约70%核苷酸碱基有核苷酸序列同一性,这是由任何熟知的序列同一性的算法如GCG版6.1中的程序FASTA测量的。如本文所用,术语“同源的”指两个聚合分子间的序列相似性,如在两个核酸分子间,如两个DNA分子或两个RNA分子或两个多肽分子间。当两个分子中核苷酸或氨基酸位置都由相同单体核苷酸或氨基酸占据时,例如如果两个DNA分子中各自的位置由腺嘌呤占据,它们在此位置是同源的。两个序列间的同源是匹配或同源位置数的直接函数,例如如果两个化合物序列中半数(如十个亚基长度聚合物中的五个位置)位置同源,那么两个序列是50%同源。如果90%位置如10个中9个匹配或同源,那么两个序列有90%同源性。作为例子,DNA序列3’ATTGCC5’和3TATGCG5’有50%同源性。如本文所用,术语“基本同源”指与所需核酸约70%同源的DNA或RNA,更优选约80%同源且最优选约90%同源。
本发明也针对分离的核苷酸分子,它包括的核酸序列与编码本发明CT-CRM蛋白的核酸序列至少70%、80%或90%同源,本发明CT-CRM蛋白与野生型CT蛋白相比酶毒性降低且保持野生型CT的佐剂活性。此外,由于遗传密码的简并性,本文描述的任何编码CT-CRM的突变氨基酸残基的三核苷酸密码子在本发明范围内。
如本文所讨论,CT-CRMs、突变型CT-A亚基或突变型CT-B亚基和/或编码它们的DNA序列或其它本文所述核酸分子或组合物中有用的序列由它们与鉴定序列的同源性或同一性百分比定义,用于计算同源性或同一性百分比的算法包括下列:Smith-Waterman算法(J.F.Collins等,1988,Comput.Appl.Biosci.,4:67-72;J.F.Collins等,分子序列比较和排列(Molecular Sequence Comparison and Alignment)(M.J.Bioshop等编),实用方法系列:核酸和蛋白质序列分析XVIII(Practical ApproachSeries:Nucleic Acid and Protein Sequence Analysis XVIII),IRL Press:牛津,英格兰,UK(1987)417页)和BLAST和FASTA程序(E.G.Shpaer等,1996,Genomics,38:179-191)。这些参考书目纳入本文作为参考。
如本文所用描述两个DNAs为“可操作连接”,是指单链或双链DNA包括全部两个DNAs物各个,且两个DNAs用这样的方式在DNA内排列即至少一个DNA序列能对另一个施加生理效果。
优选的是,为用于产生本发明的CT-CRM蛋白或施用此蛋白在细胞中体内产生,编码序列的各CT-CRM蛋白和必要调节序列存在于不同病毒或非病毒重组载体(包括传送核酸分子到细胞中的非病毒方法)。另外,编码CT-CRM蛋白双份拷贝或编码多种不同本发明CT-CRMs的两个或多个这些核酸序列可包含在多顺反子转录物中,即设计表达多种基因产物的单个分子。
本发明进一步涉及载体,具体是含分离和纯化DNA序列的质粒,序列包括编码免疫原性突变型霍乱全毒素的DNA序列。理想的实施方案包括含编码CT-CRMs的DNA序列的质粒,CT-CRMs在氨基酸16位或72位有单个氨基酸取代或者分别在氨基酸16位和68或68位和72位有双重氨基酸取代。如本文所用,术语“载体”指衍生自病毒或非病毒的DNA分子,如细菌、设计为编码外源或异源核酸序列的种类。因此,术语包括常规细菌质粒。这种质粒或载体可包括来自病毒或噬菌体的质粒序列。这种载体包括染色体、游离型形体或病毒来源的载体,如来源于细菌质粒、噬菌体、酵母游离体、酵母染色体元件和病毒的载体。载体也可来源于它们的组合,如来源于质粒和噬菌体遗传因子、粘粒和噬菌粒。术语也包括将基因从一个细胞转移到另一个细胞的非复制病毒。术语也应该包括非质粒和非病毒化合物,它们促进核酸转移到细胞中,如聚赖氨酸化合物等。
本发明的核酸分子包括非病毒载体或根据本发明将编码CT-CRM蛋白的序列传递到宿主细胞的方法。多种非病毒载体在本领域已知,并包括但不限于质粒、细菌载体、噬菌体载体、“裸露”DNA和用阳离子脂类或聚合体凝聚的DNA。
细菌载体的例子包括但不限于来自卡介苗(bacille Calmette Guerin)(BCG)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、大肠杆菌和李斯特菌(Listeria)的序列。合适的当质粒载体包括例如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pK37、pKC101、pAC105、pVA51、pKH47、pUB110、pMB9、pBR325、ColE1、pSC101、pBR313、pML21、RSF2124、pCR1、RP4、pBAD18和pBR328。
合适的可诱导大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等,1988Gene,69:301-315)、阿拉伯糖表达载体(如pBAD18,Guzman等,1995 J.Bacteriol.,177:4121-4130)和pETIId(Studier等,1990 Methods in Enzymology 185:60-89)。来自pTrc载体的靶基因表达取决于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pETIId载体的靶基因表达取决于来自T7 gn10-lac融合启动子的转录,此启动子由共表达的病毒RNA聚合酶T7 gn1介导。此病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS I74(DE3)在lacUV5启动子的转录控制下提供,宿主菌株来自含携带T7 gn1基因的定居原噬菌体。pBAD系统取决于araC基因调节的可诱导阿拉伯糖启动子。启动子在阿拉伯糖存在下诱导。
在一个例子中,名为pLP903的质粒包含分离和纯化DNA序列,包括的DNA序列编码显著降低毒性的免疫原性突变型CT-CRM,其中氨基酸丙氨酸在A亚基中氨基酸16位上取代异亮氨酸。第二种名为pLP905的质粒包含分离和纯化DNA序列,包括的DNA序列编码显著降低毒性的免疫原性突变型CT-CRM,其中氨基酸酪氨酸在A亚基中氨基酸72位上取代缬氨酸。另一种示范质粒名为pLP904。此质粒包含分离和纯化DNA序列,包括的DNA序列编码显著降低毒性的免疫原性突变型CT-CRM,其中氨基酸丙氨酸在A亚基中氨基酸16位上取代异亮氨酸,且氨基酸酪氨酸在A亚基中氨基酸68位上取代丝氨酸。本发明中另一个作为例子的质粒名为pLP906。它包含分离和纯化DNA序列,包括的DNA序列编码显著降低毒性的免疫原性突变型CT-CRM,其中氨基酸酪氨酸在A亚基中氨基酸68位上取代丝氨酸,且氨基酸酪氨酸在A亚基中氨基酸72位上取代缬氨酸。
另一类型的有用载体是单链或双链噬菌体载体。例如合适的克隆载体包括但不限于载体如噬菌体λ载体系统、λgt11、μgtμWES.tB、Charon4、λgt-WES-λB、Charon 4A、λgt-1-λBC、λgt-1-λB、M13mp7、M13mp8或M13mp9。
在其它实施方案中,表达载体是酵母表达载体。用于酵母如酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体例子包括pYepSecI(Baldari等,1987 ProteinEng.,1(5):433-437)、pMFa(Kurjan和Herskowitz,1982Cell,30(3):933-943)、pJRY88(Schultz等,1987 Gene,61(2):123-133)和pYES2(Invitrogen Corporation,SanDiego,CA)。
另外,使用杆状病毒表达载体。用于在培养昆虫细胞(如Sf9或Sf21细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAC系列(Smith等,1983 Biotechnol.,24:434-443)和pVL系列(Luckow和Summers,1987 Virol.,170(1):31-39)。在另一个实施方案中,哺乳动物表达载体用于在哺乳动物中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed,1987 Nature,329:840-842)和pMT2PC(Kaufman等,1987 EMBOJ.,6(1):187-93)。当用于哺乳动物细胞时,表达载体的控制功能通常由病毒调节因子提供。
一种重组载体是重组单链或双链RNA或DNA病毒载体。多种病毒载体系统在本领域已知。这种载体的例子包括但不限于重组腺病毒载体、基于单纯疱疹病毒(HSV)的载体、腺伴随病毒(AAV)载体、杂合腺病毒/AAV载体、重组逆转录病毒或慢病毒、重组痘病毒载体、重组痘苗病毒载体、SV-40载体、昆虫病毒如杆状病毒以及构建携带或表达感兴趣的选择核酸组合物的载体。
可使用的逆转录病毒载体包括那些描述于EP 0415731;国际专利出版号WO90/07936;WO 94/03622;WO 93/25698和WO 93/25234;美国专利号5219,740;国际专利出版号WO 93/11230和WO 93/10218;Vile和Hart,1993 Cancer Res.53:3860-3864;Vile和Hart,1993 Cancer Res.53:962-967;Ram等,1993 Cancer Res.53:83-88;Takamiya等,1992 J.Neurosci.Res.33:493-503;Baba等,1993 J.Neurosurg.79:729-735;美国专利号4,777,127;GB专利号2,200,651和EP 0345 242。适合的重组逆转录病毒的例子包括在国际专利出版号WO 91/02805中描述的那些。
基于甲病毒的载体也可用作编码CT-CRM蛋白的核酸分子。这种载体可从多种病毒构建,包括例如辛德比斯病毒载体、Semliki森林病毒(ATCC VR-67;ATCCVR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373;ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923;ATCC VR-1250;ATCC VR-1249;ATCC VR-532)。这种载体系统的代表例子包括在美国专利号5,091,309;5,217,879和5,185,440;国际专利出版号WO 92/10578;WO 94/21792;WO 95/27069;WO 95/27044和WO 95/07994中描述的那些。
腺病毒载体例子包括在Berkner,1988 Biotechniques 6:616-627;Rosenfeld等,1991Science 252:431-434;国际专利出版号WO 93/19191;Kolls等,1994 PNAS 91:215-219;Kass-Eisler等,1993 PNAS 90:11498-11502;Guzman等,1993 Circulation88:2838-2948;Guzman等,1993 Cir.Res.73:1202-1207;Zabner等,1993 Cell 75:207-216;Li等,1993 Hum.Gene Ther.4:403-409;Cailaud等,1993 Eur.J.Neurosci.5:1287-1291;Vincent等,1993 Nat.Genet.5:130-134;Jaffe等,1992 Nat.Genet.1:372-378;Levrero等,1991 Gene 101:195-202中描述的那些。示范腺病毒载体包括在国际专利出版号WO 94/12649;WO 93/03769;WO 93/19191;WO 94/28938;WO 95/11984和WO 95/00655中描述的那些。其它腺病毒载体包括那些来源于黑猩猩腺病毒的,如在美国专利号6,083,716中描述的那些。
另一个病毒载体以细小病毒为基础如腺伴随病毒(AAV)。代表例子包括AAV载体描述于国际专利出版号WO 93/09239,Samulski等,1989 J.Virol.63:3822-3828;Mendelson等,1988 Virol.166:154-165和Flotte等,1993 PNAS 90:10613-10617。其它特别理想的AAV载体包括那些以AAV1为基础的;参见国际专利出版号WO00/28061,2000年5月18日出版。其它理想的AAV载体包括假型载体,即含由AAV 5’ITRS、转基因、AAV 3’ITRs组成的小基因,它们包装在与AAV ITRs异源的AAV血清型的衣壳中。产生这种假型AAV载体的方法详细描述于国际专利出版号WO 01/83692。
在一个实施方案中,本发明的核酸分子是“裸露DNA”,它可结合的聚合物包括传统聚合物和非传统聚合物如含环糊精的聚合物和保护、相互作用的非凝聚聚合物。“裸露”DNA和用阳离子脂质或聚合物凝聚的DNA一般用化学方法传递给细胞。一些化学方法在细胞传递领域已知并包括使用脂质、聚合物或蛋白质与DNA络合,任选地凝聚相同物到颗粒中并传递给细胞。另外非病毒化学方法包括使用阳离子凝聚DNA,DNA然后置于脂质体中并根据本发明使用。参见C.Henry,2001Chemical and Engineering News,79(48):35-41。
编码本发明CT-CRM的核酸分子作为“裸露”DNA直接导入细胞(美国专利号5,580,859)或和试剂制成组合物,试剂促进免疫如布比卡因和其它局部麻醉剂(美国专利号6,127,170)。
上述所有病毒和非病毒载体的成分可从本领域已知材料和制药工业中选择。选择载体成分和调节序列不认为是对本发明的限制。根据本发明的编码CT-CRM蛋白的各核酸序列优选在调节序列的控制下,调节序列指导哺乳动物或脊椎动物细胞中各核酸序列产物的复制和产生。术语“启动子/调节序列”指表达可操作连接于启动子/调节序列的核酸所需的DNA序列。在一些情况中,启动子/调节序列可以组织特异方式发挥功能。例如,启动子/调节序列仅能在具体组织类型的细胞中驱动表达。在一些情况中,此序列可以是核心启动子序列和在其它情况中,此序列还可包括增强子序列,和其它组织特异方式表达所需的调节因子。
优选的是,编码本发明CT-CRM蛋白的核酸分子和/或重组载体进一步包括调节序列。例如,这种调节序列包括驱动CT-CRM蛋白表达的启动子。启动子/调节序列优选位于编码序列的5’末端,这样它驱动细胞中CT-CRM蛋白的表达。
合适的启动子可选择自组成型启动子、可诱导启动子、组织-特异启动子和其它。组成型启动子有非特异活性并用于编码本发明CT-CRM蛋白的核酸分子,例子包括但不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、逆转录病毒LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(参见例如Boshart等,Cell,41:521-530(1985))、SV 40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子和EF1α启动子(Invitrogen)。
由外源提供化合物调节的可诱导启动子包括但不限于阿拉伯糖启动子、锌-可诱导的绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)-可诱导的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088);蜕皮激素昆虫启动子(No等,1996 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351)、四环素-可诱导系统(Gossen等,1995Science.268:1766-1769,也参见Harvey等,1998 Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518)、RU486-可诱导系统(Wang等,1997 Nat.Biotech,15:239-243和Wang等,1997 GeneTher.,4:432-441)和拉帕霉素-可诱导系统(Magari等,1997 J.Clin.Invest.,100:2865-2872)。用于CT-CRMs表达系统的特别优选的启动子是阿拉伯糖可诱导的启动子。
可用于此方面的其它种类的可诱导启动子是由具体生理状态调节的,如温度或急性期或仅在复制细胞中。有用的组织-特异启动子包括的启动子来自基因编码骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌养蛋白、肌肉肌酸激酶以及活性高于天然产生的启动子的合成肌肉启动子(参见Li等,1999 Nat.Biotech.,17:241-245)。已知的组织-特异启动子的例子有肝脏(清蛋白,Miyatake等,1997 J.Virol.,71:5124-32;乙肝炎病毒核心启动子(hepatitis B virus core promoter),Sandig等,1996 Gene Ther.,3:1002-9;α-胎蛋白(AFP),Arbuthnot等,1996 Hum.Gene Ther.,7:1503-14)、骨(骨钙蛋白,Stein等,1997 Mol.Biol.Rep.,24:185-96;骨唾液蛋白,Chen等,1996 J.Bone Miner.Res.,11:654-64)、淋巴细胞(CD2,Hansal等,1998 J.Immunol.,161:1063-8;免疫球蛋白重链;T细胞受体α链)、神经元(神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子,Anderson等,1993 Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15;神经丝轻链基因,Piccioli等,1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5;神经元特异性B ngf基因,Piccioli等,1995 Neuron,15:373-84)。参见例如国际专利出版号WO 00/55335,用于此方面已知的启动子的附加列表。
其它包括在本发明核酸序列、分子或载体中的调节序列包括但不限于增强子序列、聚腺苷酸化序列、剪接供体序列和剪接供体序列、分别位于待翻译多肽开始和末端的转录起始和终止位点、用于在转录区域翻译的核醣体结合位点、抗原表位标签、核定位序列、IRES元件、Goldberg-Hogness“TATA”元件、限制酶裂解位点、可选择标记等。增强子序列包括如S40 DNA的72bp串联重复或逆转录病毒长末端重复序列或LTRs等,且用于提高转录效率。启动子和其它普通载体元件的选择是常规的,且有许多这种序列用来设计本发明中有用的核苷酸分子和载体。参见例如Sambrook等,《分子克隆.实验室手册》(Molecular Cloning.A Laboratory Manual),ColdSpring Harbor Laboratory,纽约(1989)和本文所引用参考文献,例如3.18-3.26页和16.17-16.27页和Ausubel等,《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols inMolecularBiology),John Wiley&Sons,纽约(1989)。本领域技术人员可从这些已知调节序列中选择以制备本发明的分子。这种调节序列的选择不是本发明的限制。
C.产生本发明的CT-CRM蛋白和核苷酸分子的方法
考虑到突变型CT-CRMs被证明作为抗原组合物佐剂的效用,产生合适量的突变型CT-CRMs是需要的。制备或合成核苷酸序列和CT-CRMs以及含本文所示发明核苷酸分子或CT-CRMs蛋白的组合物在本领域使用现有材料的普通技术人员的能力范围内。本发明不限制合成方法。下面例子详述了合成编码本发明CT-CRMs序列的较佳实施方案。
本发明CT-CRMs和核苷酸分子和序列的产生可通过化学合成方法、重组遗传工程方法、定点诱变和这些方法的组合。例如本发明核苷酸序列/CT-CRMs可采取已知化学合成技术来常规制备,例如固相化学合成,如Merrifield,1963 J.Amer.Chem.Soc.,85:2149-2154;J.Stuart和J.Young,固相肽合成,Pierce Chemical Company,Rockford,IL(1984);Matteucci等,1981 J.Amer.Chem.Soc.,103:3185;Alvarado-Urbina等,1980 Science,214:270;Sinha,N.D.等,1984 Nucl.Acids Res.,13:4539描述。也可参见:《蛋白质-结构和分子性质》(PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES),第二版,T.E.Creighton,W.H.Freeman和Company,纽约,1993;Wold,F.,“翻译后蛋白质修饰:观点和前景”(Posttranslational Protein Modifications:Perspective and Prospects),1-12页,《翻译后蛋白质的共价修饰》(POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS),B.C.Johnson编,Academic Press,纽约,1983:Seifter等,1990 Meth.Enzymol.,182:626-646和Rattan等,1992 Ann.N.Y.Acad.Sci.,663:48-62。
另外,本发明组合物可用常规分子生物技术、定点诱变、遗传工程或聚合酶链式反应来重组构建,如通过克隆和表达编码CT-CRM蛋白的核苷酸分子,CT-CRM蛋白有任选其它免疫原和任选宿主微生物内的载体蛋白等,并利用本文提供的信息(参见例如Sambrook等,《分子克隆.实验室手册》,Cold Spring Harbor Laboratory,纽约(1989);Ausubel等,《新编分子生物学实验指南》,John Wiley&Sons,纽约(1997))。CT-CRMs和任选免疫原的编码序列可合成制备(W.P.C.Stemmer等,1995Gene,164:49)。
大体上,重组DNA技术包括通过合成或分离编码上述CT-CRM蛋白的DNA序列获得,将它导入在其中表达的适当载体/宿主细胞表达系统,优选在阿拉伯糖可诱导启动子控制下。任何描述将DNA插入表达载体的方法可用于连接启动子和其它调节控制元件到选择重组载体内的特定部位。然后通过常规技术用这种载体或质粒转化、感染、转导或转染合适的宿主细胞。
多种宿主细胞-载体(质粒)系统可用于表达免疫原性突变型霍乱全毒素。优选包括阿拉伯糖可诱导启动子的载体系统与所用宿主细胞相容。编码突变型CT-CRMs的DNA插入表达系统,且启动子(优选是阿拉伯糖可诱导启动子)和其它控制元件连接到载体内的特定部位从而当载体插入宿主细胞中时(通过转化、转导或转染,这取决于所用宿主细胞-载体系统),编码CT-CRM的DNA由宿主细胞表达。
载体可选择自上述一种病毒载体或非病毒载体,但必须与所用宿主细胞相容。重组DNA载体可通过转化、转导或转染(取决于载体/宿主细胞系统)导入适当宿主细胞(细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞等)中。宿主-载体系统包括但不限于转化噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的细菌;微生物如含酵母载体的酵母;感染病毒(如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系统和感染病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统。
克隆和表达本发明CT-CRMs和其它组合物的系统使用合成核酸分子,包括使用多种重组技术中熟知的微生物和细胞。宿主细胞可选择自任何生物,包括原核(如细菌)细胞和包括哺乳动物、昆虫细胞、酵母细胞的真核细胞。优选的是,本发明不同方法和组合物中所用细胞是细菌细胞。合适的细菌细胞包括例如大肠杆菌、杆菌(Bacillus)和链霉菌(Streptomyces)的不同菌株。酵母细胞如酵母(Saccharomyces)和毕赤酵母、昆虫细胞如Sf9和Sf21细胞也是用于生产目的的有用宿主细胞。哺乳动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、鸡胚成纤维细胞、幼仓鼠肾细胞、NIH3T3、PERC6、NSO、VERO或COS细胞,它们也是合适的宿主细胞以及其它常规和非常规的生物和植物。
选择其它合适的宿主细胞和用于转化、培养、扩增、筛选和产物生成和纯化的方法可由本领域技术人员参考已知技术进行,参见例如Gething和Sambrook,1981Nature,293:620-625。
典型,宿主细胞在培养条件下维持一段足够表达的时间。培养条件在本领域熟知并包括离子组成和浓度、温度、pH等。通常,转染细胞在培养条件下维持在培养基中。用于多种细胞类型的合适介质在本领域中熟知。在一个较佳实施方案中,温度从约20℃到约50℃,更优选从约30℃到约40℃,更加优选约37℃。
优选pH从约6.0到约8.0,更优选从约6.6到约7.8,最优选约7.4。优选渗量浓度从约200毫摩尔渗透压/升(mosm/L)到约400mosm/L,更优选从约290mosm/L到约310mosm/L选。转染和表达编码蛋白的其它生物学条件在本领域熟知。
重组CT-CRM蛋白回收或收集自宿主细胞或它的膜或者来自培养那些细胞的培养基。回收包括分离和纯化重组CT-CRM蛋白。用于多肽的分离和纯化技术在本领域熟知并包括步骤如沉淀、过滤、层析、电泳等。
当通过常规重组方法产生时,本发明的CT-CRMs可用常规方法分离和纯化自细胞或其培养基,包括层析(如离子交换、亲和性和定大小柱层析)、离心、差别溶解性,或通过其它标准技术纯化蛋白。存在一些技术用于从原核细胞纯化异源蛋白。参见美国专利号4,518,526;4,599,197和4,173,362。但产生的纯化制备应该基本上没有可能对人有害的宿主毒素。具体是,当在革兰氏阴性菌宿主细胞如大肠杆菌中表达时,纯化的肽或蛋白应该基本上没有内毒素污染。参见例如Sambrook等,《分子克隆·实验室手册》,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,纽约(1989)。
本发明方法和组合物中所用CT-CRMs不限于本文所列任何具体示范过程的产物。事实上,蛋白可通过上面所引用内容的方法或此说明书其它地方所引用内容的方法来制备。分离和产生这种用途的重组或合成蛋白组合物在本领域技术范围内。
表1的四个示范CT-CRMs中,两个带有单个氨基酸取代,两个带有双重氨基酸取代,它们如实施例1中详细所述使用上述一些方法产生。具体的是,一组突变体CT克隆(CT-CRMs)通过标准定点诱变操作在大肠杆菌中产生,定点诱变操作用于编码已知CT全毒素分子的质粒。
前面显示纯化CT-CRME29H全毒素的所得产量约50μg每升培养基(参见国际专利出版号WO 00/18434)。通过修饰原始质粒来增加CT-CRME29H产量的最初尝试显示很少或没有效果。产量的适度增加通过质粒pIIB29H和衍生物与霍乱弧菌DsbA和大肠杆菌RpoH共表达来获得。共表达和纯化修饰提高CT-CRME29H产量到约2mg/升。
为了增加本发明CT-CRMs的表达,质粒中的乳糖可诱导启动子用阿拉伯糖可诱导启动子替代(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA),阿拉伯糖可诱导启动子可操作连接于编码CT-CRMs的DNA序列。在克隆期间,确定质粒pIIB29H包含的ctxA基因编码来自霍乱弧菌菌株569B的CT亚基A,质粒连接到编码来自霍乱弧菌菌株2125的CT亚基A的ctxB基因。这些基因的交叉排列表明两个ctxB基因间的七个碱基取代和ctxA基因间的单个碱基变化。几个这些碱基取代导致成熟亚基中的氨基酸变化。特别指出的是,ctxA基因间的取代导致A-2部分或A亚基的全毒素装配结构域内的氨基酸变化。不知道这些基因间异源性是否对毒素表达或全毒素装配有负的影响。然而,从进化观点优先认为毒素亚基基因来自相同来源。阿拉伯糖可诱导系统构建中所用ctxA和ctxB基因都来自霍乱弧菌菌株569B。质粒pLP903、pLP904、pLP905和pLP906的构建描述于实施例1。免疫原性突变体霍乱全毒素通过用上述质粒转化、感染、转导或转染宿主细胞来产生,并在允许宿主细胞表达所述重组免疫原性解毒蛋白的条件下培养宿主细胞。从pLP903、pLP904、pLP905和pLP906产生的CT-CRMs约为10mg纯化物质每升培养物。
所得CT-CRM蛋白或核酸分子可制成具有任何数量的选择抗原的免疫原性组合物并用体内分析筛选佐剂功效,如在以下列例子中描述的那些。
D.免疫原性组合物
根据发明一种有效的免疫原性组合物包括本发明的突变型霍乱全毒素。优选的是,突变型霍乱全毒素CT-CRM与所述野生型霍乱全毒素相比毒性降低。此“降低的毒性”使各突变体能用作免疫原性组合物中的佐剂而不引起显著副作用,特别是那些已知与所述野生型CT相关的副作用,如腹泻。更优选的是,本发明免疫原性组合物中的CT-CRM在全毒素的A亚基中氨基酸16位或72位上有单个氨基酸取代,或在霍乱全毒素的A亚基中氨基酸16位和68位或68位和72位上有双重氨基酸取代。在一个实施方案中,CT-CRM可有一个或多个其它上述修饰。在另一个实施方案中,组合物包括选择抗原和合适有效佐剂量的CT-CRM,其中所述全毒素显著增强脊椎动物宿主对所述抗原的免疫应答。本发明组合物通过改进对施用组合物的脊椎动物宿主抗体应答和细胞介导的免疫应答来调节免疫应答,组合物施用包括上述选择抗原。
如本文所用,术语“有效佐剂量”指有效引起脊椎动物宿主中免疫应答增加的一种本发明CT-CRM突变体的剂量。在一个更具体的定义中,术语“有效佐剂量”指有效引起脊椎动物宿主中免疫应答增加的本文所述四种CT-CRM突变体之一(CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMS68Y,V72Y)的剂量。具体是,在鼻内使用不同抗原后,本文所示CT-CRMs增强粘膜和全身免疫应答。此外,即使存在先存在的抗CT免疫应答,突变型CT-CRMs能作为有效粘膜佐剂。根据本发明的免疫原性突变型CT-CRMs表现出毒性降低和保持佐剂活性的平衡,这样所得突变型CT蛋白在被其导入的脊椎动物宿主安全地耐受时作为佐剂发挥功能。具体“有效佐剂剂量或量”取决于宿主的年龄、重量和医疗状况以及施用方法。合适剂量由本领域技术人员确定。
免疫原性组合物包含本发明的突变型霍乱全毒素作为佐剂,也含至少一种选自各种抗原的抗原。抗原可包括全细胞或病毒、或一种或多种糖类、蛋白质、蛋白质亚基、多肽、肽或片段、多或寡核苷酸、或其它大分子成分。如果需要,抗原组合物可包含不止一种来自相同或不同致病微生物的抗原。
因此,在一个实施方案中,本发明的免疫原性组合物包括来原于致病细菌的多肽、肽或片段作为选择抗原。合乎需要的细菌免疫原性组合物包括CT-CRM突变体作为佐剂,包括那些预防和/或治疗疾病的组合物,疾病不限于由流感嗜血杆菌(典型和非典型)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)、粘膜炎莫拉氏菌、肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Steptococcus pyogene)、无乳链球菌(Steptococcus agalactiae)、粪链球菌(Steptococcus faecalis)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、耳炎差异球菌(Alloiococcus otiditis)、伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis))、大肠杆菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分枝杆菌-胞内复合体分枝杆菌、奇异变形菌、普通变形菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、问号钩端螺旋体、伯氏疏螺旋体、溶血巴斯德氏菌、多杀巴斯德氏菌、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)和鸡败血枝原体引起。
在另一个实施方案中,本发明的免疫原性组合物包括来源于致病病毒的多肽、肽或片段作为选择抗原。合乎需要的病毒免疫原性组合物包含CT-CRM突变体作为佐剂,包括那些针对预防和/或治疗疾病的组合物,疾病不限于由呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、人肺炎后病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、人免疫缺陷病毒、猿免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、杯状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬病病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒、禽肺病毒(以前的火鸡鼻气管炎病毒)、Hendra病毒、Nipah病毒、冠状病毒、细小病毒、传染性鼻气管炎病毒、猫白血病毒、猫传染性腹膜炎病毒、禽传染性囊病病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、猪呼吸道和生殖综合症病毒、马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
在另一个实施方案中,本发明的免疫原性组合物包括来源于致病真菌的多肽、肽或片段作为选择抗原。合乎需要的抗真菌病原体的免疫原性组合物包括CT-CRM突变体作为佐剂,包括针对预防和/或治疗疾病的组合物,疾病不限于由曲霉菌(Aspergillis)、芽生菌(Blastomyces)、假丝酵母(Candida)、球孢子菌(Coccidiodes)、隐球菌(Cryptococcus)和组织胞浆菌(Histoplasma)引起。
在又一个实施方案中,本发明的免疫原性组合物包括来源于致病寄生虫的多肽、肽或片段作为选择抗原。合乎需要的抗寄生虫的免疫原性组合物包括CT-CRM突变体作为佐剂,包括那些针对预防和/或治疗疾病的组合物,疾病不限于由利什曼虫(Leishmania major)、蛔虫(Ascaris)、鞭虫(Trichuris)、贾第虫(Giardia)、血吸虫(Schistosoma)、隐孢子虫(Cryptosporidium)、毛滴虫(Trichomonas)、鼠弓形体(Tixoplasma gondii)和卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)。
针对抗非传染性疾病的理想免疫原性组合物包括CT-CRM突变体作为佐剂,它们也在本发明范围内。这种免疫原性组合物包括那些针对脊椎动物抗原的组合物,具体针对抗原的组合物用于预防和/或治疗疾病,疾病不限于如变态反应、自身免疫疾病、阿尔茨海默氏病和癌症。
例如,本发明的免疫原性组合物可包含来源于癌细胞或肿瘤细胞的多肽、肽或片段。引起脊椎动物宿主中治疗或预防抗癌效果的理想免疫原性组合物包含本发明的CT-CRM突变体,包括那些使用癌抗原或肿瘤-相关抗原的组合物,抗原不限于前列腺特异抗原、癌-胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125、MAGE-3、激素类似物等。
本发明的其它免疫原性组合物对于缓和脊椎动物宿主中变应原反应是理想的。这种组合物包含本发明的CT-CRM突变体和来源于变应原或其片段的多肽、肽或片段。这些变应原的例子描述于纳入本文作为参考的美国专利号5,830,877和国际专利出版号WO 99/51259,包括花粉、昆虫毒液、动物皮屑、真菌孢子和药物(如青霉素)。免疫原性组合物干扰已知引起变应反应的IgE抗体的产生,从而缓和对变应原的变应性反应。
在另一实施方案中,本发明的免疫原性组合物包含来源于抗原的分子部分的多肽、肽或片段作为选择抗原,抗原是由宿主(自身分子)以不合乎需要的方式、量或位置产生的,如那些来自淀粉样前体蛋白以预防或治疗脊椎动物宿主中以淀粉样沉积为特征的疾病。缓和脊椎动物宿主中对自身分子反应的理想组合物包含本发明的CT-CRM突变体,包括含自身分子或其片段的组合物。这种自身分子的例子包括参与糖尿病的β-链胰岛素、参与胃食管反流病的G17分子和疾病中负调节自身免疫应答的抗原如多发性硬化、狼疮和类风湿性关节炎。
本发明的其它免疫原性组合物对于预防或治疗脊椎动物宿主中以淀粉样沉积为特征的疾病是理想的。这种组合物包含本发明的CT-CRM突变体以及淀粉样前体蛋白(APP)的部分。该病有不同的名称,称为阿尔茨海默氏病、淀粉样变性病或淀粉样产生疾病(?amyloidogenic)。β-淀粉样肽(也称为Aβ肽)是的APP的42个氨基酸片段,通过β和γ分泌酶加工APP来产生且有下列序列:Asp Ala Glu Phe ArgHis Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly SerAsn Lys Gly Ala Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala(SEQ ID NO:3)。在一些病人中,淀粉样沉积采用聚集的Aβ肽形式。令人惊讶的是,现在发现施用分离的Aβ肽在脊椎动物宿主中诱导抗淀粉样沉积的Aβ肽成分的免疫应答(国际专利出版号WO 99/27944)。因此本发明实施方案包括本发明的CT-CRM突变体加上Aβ肽以及Aβ肽的片段和Aβ肽或其片段的抗体。Aβ肽的一个这种片段是具有下列序列的28个氨基酸肽(美国专利号4,666,829):Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser GlyTyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys(SEQ IDNO:4)。
这种免疫原性组合物进一步包括免疫学上可接受的稀释剂或药学上可接受的载体,如无菌水或无菌等渗盐水。抗原组合物也可以常规方式与这种稀释剂或载体混合。如本文所用,术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包被、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收阻滞剂等,与施用给人或其它脊椎动物宿主相容。合适的载体对于本领域技术人员是明显的,且很大程度上取决于施用途径。
免疫原性组合物也可包括但不限于悬浮液、溶液、在油或水介质中的乳剂、糊和可移植缓释或可生物降解的制剂。这种制剂可进一步包括一种或多种其它成分,包括但不限于悬浮剂、稳定剂或分散剂。在用于肠胃外施用的制剂的实施方案中,活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供用于在肠胃外施用重构组合物前以合适的载体(如无菌无热原水)重建。其它有用的肠胃外可施用的制剂包括那些在脂质体制备中含微晶形式的活性成分或作为可生物降解聚合物系统的组成部分。用于缓释或移植的组合物可包括药学上可接受的聚合或疏水材料如乳剂、离子交换树脂、少量可溶性聚合物或少量可溶性盐类。
可存在于本发明的蛋白免疫原性组合物中的另外成分是除了CT-CRMs、防腐剂、化学稳定剂或其它抗原蛋白的佐剂。通常,最优化稳定剂、佐剂和防腐剂以确定最佳制剂在目标人或动物中的功效。合适的示范防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、棓酸丙酯、乙基香兰系甘油、苯酚和对氯酚。合适的可使用的稳定成分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、磷酸二氢钾、乳糖、乳白蛋白水解产物和奶粉。
本发明的抗原组合物可进一步包括除突变型CT-CRMs以外的佐剂。用于增强免疫应答的常规非CT-CRM佐剂包括但不限于MPLTM(3-O-脱酰基单磷酰脂质A;Corixa,Hamilton,MT),它描述于纳入本文作为参考的美国专利号4,912,094。同样适合用作佐剂的是合成的脂质A类似物或氨烷基葡萄糖胺磷酸化合物(AGP)或其衍生物或类似物,它们来源于Corixa(Hamilton,MT)并描述于纳入本文作为参考献的美国专利号6,113,918。一个这种AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰氨基]-乙基-2-脱氧-4-O-磷酰基-3-0-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰-氨基]-b-D-吡喃葡糖苷,也称为529(以前称为RC529)。此529佐剂制成含水形式或稳定乳剂。
其它非CT-CRM佐剂包括矿物油和水乳剂、铝盐类(明矾)如氢氧化铝和磷酸铝等、Amphigen、Avridine、L121/鲨烯、D-丙交酯-聚交酯/糖苷、普卢尼克多元醇、胞壁酰二肽、灭活的博德特氏菌(Bordetella)、皂角苷如StimulonTM QS-21(Antigenics,Framingham,MA),它们描述于纳入本文作为参考的美国专利号5,057,540,佐剂也包括从此产生的颗粒如ISCOMS(免疫刺激复合体)、结核分枝杆菌、细菌脂多糖、合成多核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸(纳入本文作为参考的美国专利号6,207,646)、百日咳毒素(PT)或大肠杆不耐菌热毒素(LT),具体是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129;参见例如纳入本文作为参考的国际专利出版号WO 93/13302和WO 92/19265。
各种细胞因子和淋巴因子也适合于包括在本发明的免疫原性组合物中。一个这种细胞因子是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),其核苷酸序列描述于纳入本文作为参考的美国专利号5,078,896。含GM-CSF cDNA的质粒转化入大肠杆菌中并由美国模式培养物保藏所(ATCC),10801 University Boulevard,Manassas,VA20110-2209保存,登记号39900。细胞因子白介素-12(IL-12)是另一种佐剂,描述于纳入本文作为参考的美国专利号5,723,127(来源于Genetics Institute,Inc.,Cambridge,MA)。其它细胞因子或淋巴因子显示有免疫调节活性,包括但不限于适合用作佐剂的白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18、干扰素α、β和γ、粒细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子α和β。
本发明的免疫原性组合物的其它合适任选成分包括但不限于:表面活性物质(如十六烷基胺、十八烷基胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基-二十八烷基溴化铵(dioctadecylammonium bromide))、甲氧基十六烷基甘油和普卢尼克多元醇;聚胺如吡喃、葡聚糖硫酸酯、聚IC、carbopol;肽如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬肽;油乳剂;矿物凝胶如磷酸铝等和免疫刺激复合体。CT-CRM和抗原也可掺入到脂质体或与多糖、脂多糖和/或其它用于免疫原性组合物的聚合物的缀合。
本发明的免疫原性组合物包括CT-CRM突变体或编码本发明所需CT-CRM的DNA序列和分子,它们还用作多核苷组合物(也称为DNA免疫原性组合物)或用编码选择抗原的多核苷酸施用。例如,前面证明BALB/c小鼠施用编码单纯疱疹病毒(HSV)2型(gD2)全长糖蛋白的质粒DNA的制剂以及皮内途径的CT-CRME29H,产生的平均细胞反应高于通过皮内途径自身接受编码HSV gD2的质粒DNA的小鼠。此外,接受质粒DNA HSV gD2组合物以及CT-CRME29H的小鼠平均血清抗体效价约与接受没有佐剂的质粒DNA HSV gD2组合物的小鼠相同。类似的,有CT-CRME29H佐剂的质粒DNA HSV gD2组合物也在阴道洗液样品中产生gD2-特异抗体应答,其水平可与通过皮内途径或肌肉内途径传递无佐剂组合物后观察到的水平相比。小鼠用有CT-CRME29H或CT佐剂的质粒DNA HSV gD2组合物并通过皮内途径传递,同样产生的γ干扰素和IL-5水平显著高于接受没有佐剂的质粒DNAHSV gD2组合物的小鼠。因此,当用抗HSV的质粒DNA组合物施用时,CT-CRMs提高增殖和γ干扰素反应。
除了上述载体,免疫原性组合物包括的多核苷酸分子需含任选多核苷酸促进剂或“共作用剂”如局部麻醉剂、肽、包括阳离子脂质、脂质体或脂颗粒的脂质、聚阳离子如聚赖氨酸、分支的三维聚阳离子如树状聚体、碳水化合物、阳离子两性分子、去垢剂、苯甲铵表面活性剂或促进多核苷酸转移到细胞的其它化合物。这种促进剂包括布比卡因(参见纳入本文作为参考的美国专利号5,593,972)。这种本发明中有用的促进剂或共作用剂的其它非排除例子描述于美国专利号5,703,055;5,739,118;5,837,533;出版于1996年4月4日的国际专利出版号WO 96/10038和出版于1994年8月8日的国际专利出版号WO 94/16737,它们都纳入本文作为参考。
最优选的是,局部麻醉剂以形成一个或多个与核酸分子复合的量存在。当局部麻醉剂混合本发明的核酸分子或质粒时,形成多种包装DNA的小复合体或颗粒且是类似的。因此,在本发明免疫原性组合物的一个实施方案中,复合体通过混合局部麻醉剂和至少一种本发明的质粒来形成。来自此混合物的任何单个复合体可包含多种不同质粒的组合。另外,本发明组合物的另一实施方案中,如果所有质粒要以单个药丸施用,局部麻醉剂可与各质粒分别预混合,然后在单个组合物中结合单独混合物以确保理想比例的质粒存在于单个免疫原性组合物中。另外,局部麻醉剂和各质粒可分别混合并单独施用以获得理想比例。然后术语“复合体”或“一个或多个复合体”或“几个复合体”用于定义此免疫原性组合物的实施方案,要理解的是术语包括一个或多个复合体,各复合体含CT-CRM-编码质粒和抗原-编码质粒的混合物,或者形成的复合体的混合物,其中各复合体仅含一种类型质粒,或者一个或复合体的混合物,其中各复合体含多顺反子DNA。优选的是,复合体直径在约50到约150nm间。当所用促进剂是局部麻醉剂时,优选布比卡因,量从约0.1重量百分比到约1.0重量百分比,重量以多核苷酸组合物总重量为基础。也参见纳入本文作为参考的国际专利出版号WO 99/21591,它教授了将苯甲铵表面活性剂作为共作用剂掺入,施用量优选在约0.001-0.03重量%间。根据本发明,局部麻醉剂存在量与所述核酸分子的比例为0.01-2.5%w/v局部麻醉剂对1-10μg/ml核酸。另一个这种范围是0.05-1.25%w/v局部麻醉剂对100μg/ml到1mg/ml核酸。
如本文所用,这种多核苷酸免疫原性组合物在体内瞬时表达CT-CRM和抗原;没有遗传物质插入或整合到宿主染色体中。因此此使用区别于基因治疗,其目标是将感兴趣的遗传物质插入或整合到染色体中。使用分析来确定通过免疫施用的多核苷酸在宿主中没有产生转化表型(美国专利号6,168,918)。
免疫原性组合物也可包含其它适合选择组合物施用模式的添加剂。本发明组合物也可包括冻干的多核苷酸,它可与其它药学上可接受赋形剂一起使用来开发粉末、液体或悬浮液剂量形式。参见例如《Remington:药学科学和实践》(The Scienceand Practice of Pharmacy),第2卷,第19版(1995),如95章气雾剂;国际专利出版号WO 99/45966,其教授内容纳入本文作为参考。如果需要,这些组合物施用途径可以是结合或调节的。
这些含核酸分子的免疫原性组合物可含适合通过任何常规施用途径施用的添加剂。在一些较佳实施方案中,制备本发明免疫原性组合物施用给人受试者,采用形式例如脂质、粉末、气雾剂、片剂、胶囊、肠溶片剂或胶囊、或者栓剂。
上述本发明免疫原性组合物(无论含蛋白或含核酸分子的组合物)不受常规的生理学上可接受的载体、佐剂或用于上述类型药物制备中的其它有用成分的限制。从上述成分中制备这些药学上可接受的组合物在本领域技术范围内,这些组合物具有适当pH等渗性、稳定性和其它常规特征。
E.本发明组合物的使用方法
本发明的免疫原性组合物包括单独的CT-CRM或CT-CRM与选择抗原的组合,组合物通过多种途径施用给人或非人脊椎动物以增强对抗原的免疫应答,优选上面鉴定的引起疾病的抗原。本发明组合物通过改进施用组合物后脊椎动物宿主抗体反应和细胞介导的免疫来调节免疫应答,组合物包括上述选择抗原和有效佐剂量的突变型CT-CRM,其中突变型CT-CRM与野生型CT相比毒性显著降低,其中毒性降低是单个氨基酸取代、双重氨基酸取代或氨基酸插入的结果。
在一个实施方案中,含CT-CRM(作为蛋白或由核酸分子编码)的免疫原性组合物在施用含选择抗原(作为蛋白或核酸分子)的组合物前施用。在另一个实施方案中,免疫原性组合物与抗原同时施用,在含抗原和CT-CRM的组合物中施用或作为含抗原组合物的单独组合物形式。在又一个实施方案中,含CT-CRM的组合物在含抗原的组合物后施用。尽管不要求,优选抗原和突变型CT-CRM同时施用。
如上所述,含CT-CRM的免疫原性组合物可作为蛋白或编码蛋白的核酸分子施用。含CT-CRM的免疫原性组合物可作为蛋白与用作蛋白的选择抗原组合施用。另外如上所述,CT-CRM免疫原性组合物可作为蛋白和编码抗原的核酸分子施用。另一种包括施用CT-CRM和抗原作为编码这些蛋白的核酸序列。
也可使用任何合适途径施用含CT-CRM的免疫原性组合物。如果CT-CRM和抗原在分开的组合物或不同形式如蛋白或核酸中施用,途径可以相同或不同于选择施用含选择抗原组合物的途径。合适施用途径包括但不限于鼻内、口头、阴道、直肠、肠胃外、皮内、经皮(参见例如纳入本文作为参考的国际专利出版号WO98/20734)、肌肉内、腹膜内、皮下、静脉内和动脉内。合适途径的选择取决于所用免疫原性组合物的性质、病人年龄、重量、性别和总体健康的评估以及免疫原性组合物中存在的抗原、参与医师的类似因素。
一般,选择合适“有效量”或剂量用于本发明CT-CRM和/或免疫原性组合物的抗原成分是以来自CT-CRM和抗原的蛋白质或核酸、所用免疫原性组合物中抗原的同一性以及受试者的身体情况为基础,身体情况最主要包括免疫受试者的总体健康、年龄、重量。施用方法和途径以及免疫原性组合物中存在的其它成分也可影响CT-CRM和抗原的剂量和量。这种选择和向上或向下调节有效剂量在本领域的技术内。CT-CRM和抗原诱导免疫应答或在病人中产生外源效果且没有显著副作用所需的量取决于这些因素而变化,免疫应答优选保护性反应。合适剂量由本领域技术人员确定。
一个实施方案中用于含蛋白成分的例子,如上述CT-CRM变体蛋白和/或抗原,各剂量可包括约1μg到约20mg蛋白质/mL无菌溶液。其它剂量范围也可由本领域技术人员决定。初次剂量后如果需要可任选的进行反复强化。在另一个例子中,DNA和载体组合物中核苷酸酸分子的量可由本领域技术人员选择和调整。在一个实施方案中,各剂量可包括约50μg到约1mg CT-CRM编码或抗原编码的核酸如DNA质粒,每mL无菌溶液。
组合物的剂量和剂量方案也可由本领域技术人员确定。除了在稍后时间加大剂量以维持保护,保护可由单剂量含CT-CRM的免疫原性组合物给与,或需要一些剂量与或不与选择抗原施用。在一些情况中,突变型CT-CRM的佐剂性可减少含所需抗原的剂量数或可减少剂量方案的时间过程。即使还需要可监控免疫水平以确定还需要强化。
为更好理解本发明,提供下列实施例。实施例仅用于描述目的而不是限制发明的范围。
本文引用的所有文献纳入本文作为参考。
实施例1.CT突变体的表达
A.细菌菌株、质粒和生长条件
大肠杆菌TG1(Amersham-Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)和TX1用作克隆重组质粒和表达突变蛋白的宿主,TX1是TG1的萘啶酸抗性衍生物,携带来自XL1blue(Stratagene,LaJolla,CA;CJ236(FTc,lacIq)(Bio-Rad,Hercules,CA)的FTc、lacIq。含质粒菌株用所需抗生素(50μg/ml氨苄青霉素;25μg/ml卡那霉素;10μg/ml四环素)维持在LB琼脂平板上。来自霍乱弧菌0395的完整CT操纵子亚克隆到lac启动子控制下的噬菌粒载体pSKII-中,产生名为pMGJ67的IPTG可诱导质粒(Jobling,M.G.和Holmes,R.K.,1992 Infect.Immun.,60,4915-4924)。
B.ctxA基因的诱变
Kunkel,T.A.,1985 Proc.Nat.Acad.Sci.USA,82,488-492的方法用于选择质粒pMGJ67中产生的来源于寡核苷酸的突变体。用于产生突变型CT-CRMs的寡核苷酸和突变型CT-CRMs中的不同氨基酸取代列于表2。
表2:导入ctxA中的寡核苷酸序列
取代 | 寡核苷酸序列a | SEQ ID NO. |
I16a | CCTCCTGATGAAG SYCAAGCAGTCAGG | 5 |
S68Y | GTTTGAGA TCTGCCCACT | 6 |
V72Y | GTTTGACCCACTAAGTGGGC | 7 |
S68Y+V72Y | GTTTGAGA TATGCCCACTTA TATGGTCAAC | 8 |
a下划线是改变的碱基。S代表G或C;Y代表C或T。
简言之,CT-CRMs突变体用QuickChange诱变试剂盒如厂商(StratageneInc.,LaJolla,CA)所述直接在pMGJ142中建立。含CT-CRMS68Y,V72Y取代的双重突变质粒通过PCR产生,用表2所示诱变引物以产生大引物,接着克隆突变的ctxA-编码XbaI-ClaI片段到pMGJ142中。CT-CRMI16A,S68Y双重突变体通过含克隆的I16a的PCR产生,用诱变引物产生大引物,接着克隆突变的ctxA-编码XbaI-ClaI片段到pMGJ142中。CT-CRMV72Y和CT-CRMI16A,S68Y突变体用QuickChange诱变试剂盒通过CT-CRMS68Y,V72Y双重突变体在氨基酸68位回复到野生型来产生。磷酸化各单链寡核苷酸并用于在含尿嘧啶单链DNA模板上指导第二条链合成,DNA模板来自大肠杆菌dut ung菌株CJ236(F’Tc,pMGJ67)。连接和转化ung+菌株TX1后,单链DNA来源于AmpR转化子并通过双脱氧链终止方法(Kunke,上面引用)来测序。
C.阿拉伯糖启动的CT-CRM表达载体的构建
前面用CT-CRME29H试验(国际专利出版号WO 00/18434)显示可通过取代ctxA基因上游合成Shine-Delgamo序列和使操纵子在阿拉伯糖启动子系统控制下来在大肠杆菌中获得最大产量。含A亚基中定点突变的CT操纵子如上所述建立(同上)。CT-CRMs最初在βlac启动子控制下且在大肠杆菌中表达水平低。PCR用于修饰CT-A亚基的ATG的5’区域并在5’末端插入NheI位点。相应3’引物在CT-B基因的3’末端加入HindIII位点。
所用引物序列是:
正向CT:5’TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATGAGC(SEQ ID NO.9);
反向CT:5’CGAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC(SEQ ID NO.10).
PCR在各突变型CT-CRM操纵子上进行,且PCR产物根据厂商说明书连接到pCR2.1-Topo(Invitrogen)中并转化入Top10F’细胞中。重组大肠杆菌在含卡那霉素(25μg/ml)和X-gal(40μg/ml)的SOB琼脂平板上培养。通过EcoRI消化筛选来自白色克隆的质粒用于插入。含正确大小的插入的质粒根据厂商说明书用NheI和HindIII消化,且含CT操纵子的DNA片段从低熔点琼脂糖中分离。质粒pBAD18-Cm(Invitrogen)用NheI-HindIII消化,且从低熔点琼脂糖中分离线性DNA。消化的pBAD18和CT操纵子在12℃连接并转化入Top10F大肠杆菌中。来自氯霉素抗性克隆的质粒通过限制性分析筛选用于插入,测序代表性克隆以确定定点突变的存在。质粒转化到DH5α中用于表达CT-CRMs。在16位和72位携带单个氨基酸取代的编码突变型CT-CRMs的质粒分别命名为pLP903和pLP905,在16位和68位及68位和72位携带双重氨基酸取代的编码突变型CT-CRMs质粒分别命名为pLP904和pLP906。质粒包含编码CT的霍乱弧菌基因ctxA和ctxB的多顺反子。
D.大肠杆菌中CT-CRMs的表达
含质粒pLP903、pLP904、pLP905或pLP906的大肠杆菌DH5α细胞以及分别表达CT-CRMs、CT-CRMI16A、CT-CRMS68Y,I16A、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y的细胞在磷酸缓冲的Hy-Soy培养基中37℃通气生长,培养基含氯霉素(25μg/ml)和甘油(0.5%)。当培养物到达约4.5-5.5的OD600时,它们通过加入L-阿拉伯糖到0.5%的终浓度来诱导。诱导后3小时培养物在37℃通气培养,然后通过离心收集细胞。细胞沉淀贮存在-20℃。
E.CT-CRMs的制备和纯化
细胞沉淀在室温融化并以9%初始培养物体积重悬浮于10mM NaPO4和1mMEDTA(pH7.0)。细胞悬浮液在微流化器(microfluidizer)中机械破裂并以8,500xg离心10分钟。细胞裂解物进一步以160,000xg澄清1小时。澄清的细胞裂解物以2ml/min的流速装入10mM NaPO4(pH7.0)平衡的羧甲基(CM)-琼脂糖TM柱(300mlCM-琼脂糖TM每101培养物)(Amersham,Pharmacia)。柱用>10体积的10mM NaPO4(pH7.0)以5ml/min流速洗。CT-CRME29H全毒素用4柱体积的10mM NaPO4(pH8.3)洗脱。纯化的CT-CRMs通过PBS中透析来更换缓冲液并贮存在4℃。完整全毒素和各亚基的存在分别通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE确定。天然PAGE表明存在86kDa的纯化分子(数据没有显示)、完整霍乱全毒素的预期分子量(Tebbey等,2000 Vaccine,18(24):2723-2734)。
此外,SDS-PAGE显示与CT-A(27kDa)CT-B(12kDa)亚基排列的两条带,亚基包括完整全毒素(数据没有显示)。
实施例2;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
突变型CT-CRMs、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析以确定纯化后CT-CRMs作为完整全毒素存在的百分比。15μl各纯化的CT-CRMs(以不同蛋白质浓度)通过6%聚合的非变性聚丙烯酰胺凝胶。三种不同浓度(300、600和1200ng)的CT-B用作标准。电泳后凝胶用考马斯蓝染色。凝胶然后用光密度计扫描,全毒素的百分比从CT-CRMs和CT-B标准的光密度计读数计算。数据表明97.8%CT-CRMI16A,S68Y和99.4%CT-CRMV72Y作为完整全毒素存在(表3)。
表3:完整全毒素的天然凝胶分析
CT-CRM | 全毒素% |
CT-CRMI16A | 97.8 |
CT-CRMV72Y | 99.4 |
CT-CRMI16A,S68Y | 未做 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 未做 |
实施例3;用于CT-CRMs剩余毒性的Y-1肾上腺细胞分析
突变型CT-CRMs毒性在小鼠Y-1肾上腺肿瘤细胞分析中与所述野生型CT相比,此分析在体外用来测量霍乱毒素/不耐热肠毒素家族中的肠毒素毒性。分析取决于毒素结合到细胞表面受体和毒素的A1亚基随后进入细胞的细胞质中。
分离自霍乱弧菌的天然霍乱毒素在CT-A1-CT-A2连接处蛋白水解产生切口,导致霍乱毒素的A1和A2亚基仅由一个二硫键连接一起。这使A1和A2亚基不稳定并相互容易分离。带切口CT的A1亚基-结合细胞表面受体就从A2亚基中分离并进入细胞,其中ADP-核糖基化调节G蛋白(Gsα),使其毒性效果如上面背景中所述。相反,大肠杆菌中产生的肠毒素(CT或LT)不带切口,因此仍有A1-A2肽连接。因此在Y-1肾上腺细胞分析中,霍乱弧菌中产生的CT毒性显著大于异源细菌细胞如大肠杆菌中产生的CT。
在第一个Y-1肾上腺细胞分析中,突变型CT-CRMs的毒性与来自霍乱弧菌的切口野生型CT相比。在此分析中,Y-1肾上腺细胞(ATCCCCL-79)以104细胞每孔浓度接种于96孔平底平板。之后,三倍血清稀释的纯化(~90%纯度,考马斯蓝染色确定)CT-CRMs加入肿瘤细胞并在37℃培养(5%CO2)18小时。细胞随后用光学显微镜检测毒性存在(细胞团)。终点效价定义为大于50%细胞团所需的最小毒素浓度。然后计算剩余毒性的百分比,用来自乱弧菌的野生型切口CT(100%毒性)的终点效价除以CT-CRMs引起的效价再乘以100。列于表4的数据表明四种纯化的突变全毒素CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y用Y-1肾上腺细胞分析测试的剩余毒性仅为0.37%。
表4:Y-1肾上腺细胞分析
CT-CRM | 剩余毒性% |
CT-CRMI16A | 0.37 |
CT-CRMI16A,S68Y | 0.37 |
CT-CRMV72Y | 0.37 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 0.37 |
在第二个单独研究中,在Y-1肾上腺细胞分析中比较大肠杆菌细胞(TG1)的粗周质提取物的剩余毒性与大肠杆菌中表达的无切口野生型CT全毒素,TG1表达水平提高的突变型CT-CRMs。Y-1肾上腺细胞在多孔盘(含10%胎牛血清的RPMI培养基)中培养,培养时存在粗大肠杆菌细胞裂解物。
细胞毒性如以前一样监控。在此研究中,一个毒性单位定义为过夜培养后引起孔中75-100%细胞团的最小量毒素或上清液。此研究结果列于下表5。
表5:Y-1肾上腺细胞分析
CT-CRM | 剩余毒性% |
CT-CRMI16A | 5 |
CT-CRMV72Y | 100 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 5 |
CT-CRMI16A,S68Y | 未确定 |
此研究结果表明,CT-CRMI16A和CT-CRMS68Y,V72Y的毒性显著降低(5%),CT-CRMV72Y和野生型CT一样毒。不受理论的束缚,第二个研究中的变体结果(表5)是由于第二个研究中所用粗周须大肠杆菌细胞裂解物包含无切口的突变型CT-CRMs,由于毒性测量为大肠杆菌产生的野生型无切口CT毒性的百分比。相反,来自大肠杆菌的无切口野生型CT在Y-1细胞分析中有6250pg/ml的50%细胞团剂量(数据没有显示)。在第一个研究中,突变型CT-CRMs的剩余毒性表示为霍乱弧菌产生的野生型、切口CT毒性的百分比,其中切口全毒素在Y-1细胞分析中有125pg/ml的50%细胞团剂量。因此,第二个研究中报导的剩余毒性比第一个研究中获得的高50倍。
实施例4:ADP-核糖基转移酶试验
NAD+:精胺ADP-核糖基转移酶活性作为来自放射性标记NAD+的[羰基-14C]烟酰胺的释放测量。简言之,CT和CT-CRMs用胰蛋白酶活化,并用在TEAN缓冲液(Tris/EDTA/叠氮化钠/氯化钠)(pH8.0)中的50mM甘氨酸/20mM二硫苏糖醇30℃培养30分钟。之后,下列物质加入反应:0.1μg大豆胰蛋白酶抑制剂、50mM磷酸钾、10mM精胺、20mM二硫苏糖醇、10mM氯化镁、100μM GTP、3mM二豆蔻酰磷脂酰胆碱、0.2%胆酸盐、0.03mg卵清蛋白、100μM[腺嘌呤-U-14C]NAD(Dupont NENTM,Boston,MA)和水到300μl终体积。30℃培养90分钟后,100μl样品加入AG1-X2(Bio-Rad)柱(0.64×5cm),柱用1.0ml蒸馏/去离子水洗五次。收集含[14C]ADP-核糖基精胺的洗脱物用于放射性分析。洗脱物中14C的平均回收表示为加入柱的洗脱物百分比。结果列于表6。
表6:NAD+:精胺ADP-核糖基转移酶活性
CT/CT-CRM | 形成的ADP-核糖基精胺(nmol/hr/μg蛋白质) | ADP-核糖基化活性% |
CT,10μg | 52.5 | 100 |
CT-CRMI16A | 3.3 | 2.4 |
CT-CRMI16A,S68Y | 3.4 | 3.3 |
CT-CRMV72Y | 2.7 | 1.1 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 2.9 | 1.2 |
ADP-核糖基转移酶活性也用二乙基氨基(亚苄基-氨基)胍(DEABAG)作为底物单独确定。在此试验中,来自纯化细胞裂解物的25μl等份突变型CT-CRMs用1/50/w/w胰蛋白酶30℃活化30分钟,用0.1M K2PO4,pH7.5、10μM NAD、4mM DTT中的200μl 2mM DEABAG培养2小时。反应通过加入800μl匀浆缓冲液结合未反应底物来终止,缓冲液含400mg DOWEX AG50-X8树脂。上清液中的ADP-核糖基化DEABAG在用DEABAG校准的DyNA Quant荧光计中用荧光发射来定量。除突变型CT-CRMV72Y以外,突变型CT-CRMs的ADP-核糖基转移酶活性比野生型显著下降(表7)。用CT-CRMV72Y观察到的高水平ADP-核糖基转移酶活性是因为此研究的不同试验方案中使用不同底物测量突变型CT-CRMs的ADP-核糖基转移酶活性。
表7:使用二乙基氨基(亚苄基-氨基)胍(DEABAG)的CT-CRMs的ADP-核糖基转移酶活性
CT/CT-CRM | ADP-核糖基化活性% |
CT | 100 |
CT-CRMS68Y | 11 |
CT-CRMV72Y | 68 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 3 |
CT-CRMI16A,S6SY | 未做 |
实施例5:BALB/C小鼠的免疫应答,小鼠单独用非典型流感嗜血杆菌(NTHI)的重组P4外膜蛋白(RP4)免疫或与CT-CRMS结合
在第一个实验中,评估突变型CT-CRMI16A提高诱导重组P4外膜蛋白(rP4)的全身和粘膜抗体的能力。评估突变型CT-CRMI16A诱导的血清和粘膜抗P4抗体效价并与所述野生型CT和突变型CT-CRME29H(WO 00/18434)比较。在此研究中,BALB/c小鼠在0、3、5周和第5周第6天用制剂鼻内免疫,制剂含1μg盐水中的重组P4蛋白或1μg P4与1μg野生型CT、1μg CT-CRME29H或0.1、1或10μgCT-CRMI16A一起。
结果表明CT-CRMI16A像野生型CT和CT-CRME29H增强rP4蛋白引起全身和粘膜免疫应答的能力(表8)。例如,初次IN免疫后六周,rP4蛋白免疫的小鼠的抗rP4IgG抗体效价比单独PBS中重组蛋白免疫的小鼠大40倍,rP4蛋白用CT-CRMI16A或CT-CRME29H制成。施用重组蛋白加1μg浓度野生型CT全毒素的小鼠的抗体效价(IgG)比施用盐水中单独重组rP4的小鼠的抗体效价提高67倍。1μg突变型CT-CRM、CT-CRME29H免疫小鼠的抗体效价比单独rP4免疫小鼠的抗体效价提高55倍。相比之下,1μg和0.1μg突变型CT-CRM、CT-CRMI16A免疫小鼠的抗体效价分别比盐水中单独rP4免疫小鼠的抗rP4抗体效价提高15和27倍。
表8:对重组P4蛋白的血清抗体反应
佐剂 | 量 | 0周 | 3周 | 5周 | 第5周第6天 | ||||
IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | ||
盐水 | 148 | 386 | 199 | 394 | 140 | 444 | |||
CT | 1.0μg | 184 | 1,348 | 203 | 1,949 | 1,570 | 29,939 | ||
CT-CRME29H | 1.0μg | 108 | 615 | 286 | 1,057 | 1,492 | 21,251 | ||
CT-CRMI16A | 1.0μg | <100 | 426 | 144 | 2,071 | 1,096 | 6,708 | ||
CT-CRMI16A | 0.1μg | 261 | 1,463 | 403 | 2,629 | 1,105 | 10,541 | ||
CT-CRMI16A | 10.0μg | 151 | 502 | 121 | 788 | 108 | 1,460 | 183 | 2,043 |
BALB/c小鼠在0、3、5周免疫IN,第三次免疫后两周检测粘膜分泌中的蛋白-特异抗体。在第5周第6天收集来自阴道洗液(VW)、鼻洗液(NW);支气管肺泡灌洗(BAL)和唾液(SAL)的粘膜样品。列于表9的这些结果进一步表明CT-CRMI16A促进抗rP4蛋白的局部免疫应答产生。此外,抗rP4抗体效价可与由野生型CT作为佐剂的免疫原性组合物诱导的相比。
表9:对rP4蛋白的粘膜抗体反应
佐剂 | 量 | VW | NW | BAL | SAL | ||||
IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | ||
盐水 | 24 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | 20 | <10 | |
CT | 1.0μg | 125 | 74 | 38 | <10 | 158 | 152 | 152 | 14 |
CT-CRME29H | 1.0μg | 254 | 12 | 58 | <10 | 523 | 364 | 454 | 27 |
CT-CRMI16A | 1.0μg | 154 | 16 | 39 | <10 | 330 | 38 | 654 | 32 |
CT-CRMI16A | 0.1μg | 422 | 26 | 60 | <10 | 125 | 53 | 1027 | 74 |
CT-CRMI16A | 10.0μg | 19 | <10 | <10 | <10 | 13 | 16 | 34 | <10 |
在第二个实验中,每组五只BALB/c小鼠在0、21、35天用15μl剂量免疫IN,剂量含1μg单独rP4或1μg rP4加1μg一种突变型CT-CRMs、CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A ,S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y,V72Y作为如表10所示佐剂。抗rP4IgA和IgG抗体效价通过对收集样品进行ELISA来确定,结果列于表10,样品在0、3和5周和在第5周第6天收集。结果表明小鼠中血清抗rP4、IgA和IgG效价显著增加,小鼠同时施用抗原和一种突变型CT-CRMs。对rP4的粘膜抗体反应也在最后一次免疫后一周测量。
表10:突变霍乱毒素对鼻内传递给雌性BALB/c小鼠a
的NTHi rP4蛋白的免疫应答的佐剂效果
佐剂b | 收集血清c的抗NTHi rP4ELISA终点效价 | |||||||
0周 | 3周 | 5周 | 第5周第6天 | |||||
IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | |
盐水 | 123 | 593 | <100 | 715 | 227 | 1,953 | 224 | 6,458 |
CT-CRME29H | 116 | 934 | 1,808 | 135,824 | 7,365 | 282,099 | ||
CT-CRMI16A | 269 | 423 | 788 | 17,465 | 2,609 | 143,313 | ||
CT-CRMI16A,S68Y | 256 | 545 | 821 | 6,062 | 1,998 | 438,553 | ||
CT-CRMV72Y | 294 | 878 | 1,725 | 40,443 | 5,239 | 343,771 | ||
CT-CRMS68Y,V72Y | 172 | 429 | 333 | 4,353 | 1,333 | 55,571 |
a1μg NTHirP4在0、3和5周以15μl体积传递IN给雌性BALB/c小鼠。
bNTHi rP4组合物用盐水或1μg不同突变霍乱毒素配制。
c血清在0、3和5周以及第5周第6天收集;收集样品代表n=5。
表11分别列出来自鼻、支气管肺泡和阴道洗液、唾液的IgA和IgG效价。这些结果也表明施用rP4抗原和一种突变型CT-CRMs的小鼠中粘膜抗rP4、IgA和IgG效价比施用盐水中rP4的小鼠显著提高。
表11:粘膜洗液收集a的抗NTHi rP4 ELISA终点效价
佐剂b | 肺洗液c | 鼻洗液c | 唾液c | 阴道洗液c | ||||
IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | |
盐水 | <10 | 65 | <10 | <10 | 12 | <10 | <10 | <10 |
CT-CRME29H | 1,131 | 1,815 | 196 | 70 | 977 | 1,906 | 255 | 149 |
CT-CRMI16A | 360 | 708 | 166 | 37 | 733 | 96 | 1,066 | 414 |
CT-CRMI16A,S68Y | 449 | 376 | 164 | 19 | 1,221 | 177 | 1,521 | 261 |
CT-CRMV72Y | 3,850 | 4,226 | 500 | 300 | 2,753 | 281 | 1,066 | 212 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 84 | 164 | 111 | 35 | 843 | 103 | 251 | 109 |
a1μg NTHi rP4在0、3和5周以15μl体积传递IN给雌性BALB/c小鼠。
bNTHi rP4组合物用盐水或1μg不同突变霍乱毒素配制。
c粘膜样品在第6周收集;收集样品代表n=5。
在第5周第6天IN施用后,六组单独小鼠血清中的IgA和IgG包括IgG亚类IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3终点效价也通过ELISA确定(表12-17)。在表12-17报导数据中,统计分析使用JMP,SAS Institute,Inc.;单向方差分析在p<0.001水平显著;用Tukey-Kramer HSD,α=0.5进行多次比较。
表12:第5周第6天各单独小鼠中IgA抗NTHi rP4ELISA终点效价
佐剂 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | GMT | StDev | SEM |
盐水 | 217 | 63 | 44 | 48 | 35 | 63 | 76 | 34 |
CT-CRME29H | 6,791 | 2,196 | 1,740 | 1,526 | 4,626 | 2,835 | 2,276 | 1,018 |
CT-CRMI16A | 2,075 | 2,186 | 1,208 | 2,847 | 1,975 | 1,985 | 585 | 262 |
CT-CRMI16A,S68Y | 1,739 | 920 | 739 | 1,289 | 5,694 | 1,541 | 2,058 | 921 |
CT-CRMV72Y | 6,523 | 1,634 | 1,290 | 4,089 | 10,521 | 3,584+ | 3,826 | 1,711 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 1,646 | 878 | 310 | 2,724 | 116 | 676* | 1,069 | 478 |
*来自盐水组的值显著不同
+来自CT-CRMS68Y,V72Y组的值显著不同
表13:第5周第6天各单独小鼠中IgG抗NTHi rP4 ELISA终点效价
佐剂 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | GMT | StDev | SEM |
盐水 | 78,369 | 2,287 | 3,505 | 1,518 | 1,223 | 4,105* | 34,105 | 15,252 |
CT-CRME29H | 440,101 | 280,030 | 17,291 | 111,803 | 193,831 | 135,797* | 161,927 | 72,416 |
CT-CRMI16A | 69,986 | 92,347 | 68,406 | 193,467 | 62,196 | 88,141* | 54,968 | 24,582 |
CT-CRMI16A,S68Y | 57,721 | 59,832 | 17,521 | 57,172 | 29,725 | 40,034* | 19,471 | 8,708 |
CT-CRMV72Y | 161,796 | 143,545 | 72,764 | 187,118 | 363,958 | 163,008* | 108,260 | 48,415 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 80,770 | 71,053 | 14,366 | 73,904 | 2,658 | 27,662* | 36,953 | 16,526 |
*来自盐水组的值显著不同
表14:第5周第6天各单独小鼠血清中IgG1抗NTHi rP4ELISA终点效价
佐剂 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | GMT | StDev | SEM |
盐水 | 2,533 | 33 | 33 | 33 | 33 | 79 | 1,118 | 500 |
CT-CRME29H | 11,462 | 3,029 | 1,801 | 8,517 | 1,172 | 3,623* | 4,547 | 2034 |
CT-CRMI16A | 4,732 | 10,033 | 3,546 | 14,399 | 6,836 | 6,980* | 4,385 | 1961 |
CT-CRMI16A,S68Y | 2,945 | 1,036 | 1,016 | 2,945 | 343 | 1,256* | 1,208 | 540 |
CT-CRMV72Y | 9,123 | 13,942 | 545 | 7,939 | 35,887 | 7,230* | 13,410 | 5997 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 28,434 | 13,553 | 394 | 7,579 | 33 | 2,070* | 11,725 | 5244 |
*来自盐水组的值显著不同
表15:第5周第6天各单独小鼠中IgG2a抗NTHi rP4 ELISA终点效价
佐剂 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | GMT | StDev | SEM |
盐水 | 10,611 | 317 | 431 | 230 | 217 | 591 | 4,613 | 2083 |
CT-CRME29H | 230,644 | 189,940 | 3,489 | 43,336 | 132,159 | 61,439* | 95,830 | 42858 |
CT-CRMI16A | 24,886 | 43,309 | 42,582 | 89,228 | 23,210 | 39,408* | 26,663 | 11924 |
CT-CRMI16A,S68Y | 39,555 | 37,700 | 6,947 | 29,050 | 17,604 | 22,122* | 13,814 | 6178 |
CT-CRMV72Y | 125,810 | 75,952 | 41,286 | 108,108 | 210,157 | 97,834* | 63,522 | 28409 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 10,136 | 27,702 | 6,289 | 30,058 | 1,462 | 9,505* | 12,950 | 5792 |
*来自盐水组的值显著不同
表16:第5周第6天各单独小鼠血清中IgG2b抗NTHi rP4 ELISA终点效价
佐剂 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | GMT | StDev | SEM |
盐水 | 5,473 | 132 | 153 | 102 | 66 | 237 | 2,397 | 1072 |
CT-CRME29H | 85,041 | 70,413 | 529 | 8,597 | 36,760 | 15,852 | 37,108 | 16596 |
CT-CRMI16A | 10,S54 | 15,798 | 7,562 | 27,484 | 7,885 | 12,227* | 8,302 | 3713 |
CT-CRMI16A,S68Y | 13,545 | 9,942 | 2,731 | 8,724 | 6,257 | 7,253* | 4,048 | 1810 |
CT-CRMV72Y | 25,782 | 23,712 | 14,433 | 25,347 | 74,216 | 27,798* | 23,664 | 10583 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 5,096 | 14,958 | 3,205 | 16,081 | 582 | 4,697* | 7,074 | 3164 |
*来自盐水组的值显著不同
表17:第5周第6天各单独小鼠血清中IgG3抗NTHi rP4 ELISA终点效价
佐剂 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | GMT | StDev | SEM |
盐水 | 992 | 33 | 33 | 33 | 33 | 65 | 429 | 192 |
CT-CRME29H | 311 | 36 | 23 | 344 | 1,246 | 162 | 500 | 224 |
CT-CRMI16A | 2,256 | 62 | 390 | 290 | 150 | 299 | 918 | 411 |
CT-CRMI16A,S68Y | 120 | 1,953 | 33 | 612 | 64 | 198 | 816 | 365 |
CT-CRMV72Y | 479 | 929 | 25 | 1,124 | 462 | 357 | 432 | 193 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 202 | 69 | 3 | 92 | 33 | 42 | 76 | 34 |
实施例6:呼吸道合胞病毒(RSV)的纯化天然融合(F)糖蛋白免疫BALB/C小鼠的免疫应答
本发明的CT-CRMs增强抗呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白的全身和粘膜反应的能力用纯化天然融合(F)蛋白来检测。前面证明用F蛋白免疫IN的BALB/c小鼠产生全身和局部IgG和IgA效价,F蛋白用CT或CT-CRME29H作为佐剂(Tebbey等,上面引用)。此研究也表明先存在的抗CT抗体对局部或全身抗F蛋白IgA和IgG抗体水平没有负影响。研究表明先存在的抗CT抗体有益于产生增强的抗F蛋白抗体反应。此外,数据也提示通过粘膜或体液免疫球蛋白中和感染性病毒的机制,免疫球蛋白在对含F/CT-CRME29H的IN免疫操作的应答中被刺激。
BALB/c小鼠(每组5只)在0和3周用单独在盐水或制剂中的天然纯化F蛋白(3μg/剂量)免疫(IN,0.01ml),制剂含0.1或1μg一种野生型CT(Sigma)或者0.1或1μg一种遗传解毒的突变型CT-CRMs(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y)。血清在第二次免疫后2周收集。蛋白-特异IgG、IgA和IgG亚类、血清中和、支气管肺泡洗液、鼻洗液和阴道洗液中抗体的滴定在96孔微型板中Hep-2细胞单层上双份进行。此外,免疫小鼠的亚组用活病毒攻击以确定免疫原性制剂的保护能力。结果列于表20。数字是几何平均终点抗F蛋白IgG、亚类和IgA抗体效价(±1标准偏差)。
第二次免疫后血清抗体的分析显示用任何来源于霍乱毒素的佐剂免疫显著诱导对RSV F蛋白的免疫应答(表18)。以0.1或1μg/剂量使用各霍乱毒素突变型CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y显著(p<0.05)诱导RSV F蛋白的血清抗体(总IgG、IgG1、IgG2a和IgA)。对RSV F蛋白的总IgG免疫应答程度通过包含来源于霍乱毒素的佐剂比施用含F/PBS组合物的动物获得反应提高约25倍。
下表18报导数据的统计显著性如下。对于总IgG:p<0.05:F/PBS对所有.p>0.05:F/CT对F/CT-CRME29H对F/CT-CRMI16A对F/CT-CRM116A,S68Y对F/CT-CRMS68Y,V72Y对F/CT-CRMS68Y,V72Y(0.1和1.0μg/剂量)。对于IgG1:p<0.05:F/PBS对所有.p>0.05:F/CT对F/CT-CRME29H对F/CT-CRMI16A对F/CT-CRMI16A,S68Y对F/CT-CRMV72Y对F/CT-CRMS68Y,V72Y(0.1和1.0μg/剂量)。对于IgG2a:p<0.05:F/PBS对所有.F/CT(0.1μg)对F/CT-CRMI16A(0.1μg).p>0.05:在1.0μg剂量,F/CT对F/CT-CRME29H对F/CT-CRMI16A对F/CT-CRMI16A,S68Y对F/CT-CRMV72Y对F/CT-CRMS68Y,V72Y.在0.1μg剂量,F/CT对F/CT-CRME29H对F/CT-CRMI16A,S68Y对F/CT-CRMV72Y对F/CT-CRMS68Y,V72Y。
各新的突变毒素(CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、/CT-CRMV72Y和/CT-CRMS68Y,V72Y)和CTE29H或野生型CT间在总抗IgG或IgG1效价中没有观察到显著差异。通过分析IgG2a和IgA效价观察到具体组间的统计差异。然而,这些比较没有显示关于一种突变体对另一种的免疫性能的一致趋势。
表18:用F蛋白和突变型CT-CRMs鼻内免疫后BALB/c小鼠的体液免疫应答
抗原 | 佐剂(μg) | IgG | IgG1 | IgG2a | IgA |
F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白 | 没有CT-CRME29H(1)CT-CRME29H(0.1)CT-CRMI16A(1)CT-CRMI16A(0.1)CT-CRMV72Y(1)CT-CRMV72Y(0.1)CT-CRMI16A,V72Y(1)CT-CRMI16A,V72Y(0.1)CT-CRMS68Y,V72Y(1)CT-CRMS68Y,V72Y(0.1)CT(1)CT(0.1) | 4.1±0.66.3±0.75.6±0.25.6±1.65.5±0.36.4±0.25.6±0.26.4±0.15.5±0.046.5±0.15.8±0.36.7±0.35.8±0.1 | 3.1±0.45.8±0.85.4±0.55.2±1.45.0±0.15.8±0.35.2±0.45.7±0.25.5±0.35.6±0.25.6±0.26.0±0.35.7±0.2 | 1.9±0.34.9±0.74.4±0.24.7±1.13.9±0.45.3±0.34.1±0.45.3±0.34.8±0.24.9±0.34.2±0.35.7±0.25.0±0.4 | 1.9±0.44.3±0.64.0±0.24.3±0.23.5±0.54.5±0.33.5±0.24.6±0.44.1±0.34.8±0.24.6±0.25.3±0.54.9±0.2 |
在另一个实验中,每组5只BALB/c小鼠在0和3周用天然F蛋白(3μg/剂量)免疫(IN,0.01ml)。F蛋白混合1或0.1μg遗传解毒的突变体或野生型CT。抗F蛋白抗体反应也在收集的粘膜洗液样品中分析,样品来自支气管肺泡灌洗(BAL)、鼻洗液(NW)和阴道洗液(VW),在第二次免疫后2周收集。数据代表收集样品的抗F蛋白IgG和IgA抗体效价。如所预期的,在来自F/PBS免疫小鼠的粘膜洗液中没有观察到抗体诱导。然而,各突变型霍乱全毒素的有效粘膜佐剂能力是显然的。尽管没有对这些收集样品进行统计分析,出现了一些趋势。例如,接受F/CT-CT-CRMV72Y(1.0μg/)的小鼠在各所取的BAL、NW和VW样品中显示出提高的IgG和IgA。相比之下,突变毒素CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y和CT-CRMS68Y,V72Y似乎在辅佐对RSV F蛋白的局部免疫应答中可与CT-CRME29H相比。
表19:用F蛋白和遗传解毒的突变体鼻内免疫后BALB/c小鼠的体液免疫应答
抗原 | 佐剂(μg) | BAL | NW | VW | |||
IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | ||
F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白F蛋白 | 没有CT-CRMF29H(1)CT-CRME29H(0.1)CT-CRMI16A(1)CT-CRMI16A(0.1)CT-CRMV72Y(1)CT-CRMV72Y(0.1)CT-CRMI16A,V72Y(1)CT-CRMI16A,V72Y(0.1)CT-CRMS68Y,V72Y(1)CT-CRMS68Y,V72Y(0.1)CT(1)CT(0.1) | <251569549134937611771442093499124852232716436 | <25211<2543<25121<254583979251421037 | <25320454151033145139213311811091593395 | <257931362871872807162778551098710362 | <252659932521722248739134204816191185 | <251629202142735022893119683500137477041361100 |
在另一个实验中,BALB/c小鼠在0和3周用天然F蛋白(3μg/剂量)免疫(IN,0.01μl)。F蛋白混合1或0.1μg各遗传解毒的突变体或野生型CT。在第5周,小鼠用4天后收集的RSV和肺A2菌株攻击以定量病毒感染性。各突变型霍乱全毒素诱导对RSV攻击的保护性免疫应答,这是通过病毒性肺荷载测量(表20)。数据表示为平均回收病毒(log10)/g组织。中和病毒在血液中存在5%豚鼠血清作为补体来源(C’)时分析,在第二次免疫后两周取血。数据显示平均效价(log10),表明与对照孔相比pfu/孔中下降60%。
来自病毒感染性试验的数据统计分析报导为p<0.05:F/PBS对所有;p>0.05:F/CT-E29H对F/CT对F/CRM/I16A对F/CRM/I16A对F/CT-CRMV72Y对F/CT-CRMI16A.V72Y对F/CT-CRMS68Y,V72Y,以0.1和1.0μg/剂量。血清中和反应:p<0.05:F/PBS对所有,除了F/CRM/I16A,S68Y(0.1μg).F/CT(1.0)对F/CT-CRM/116A(0.1).F/CT-CRMI16A,S68Y(0.1)对F/CT-CRMI16A,S68Y(1.0)F/CT(9.0),F/CT-CRMI16A(1.0),F/CT-CRME29H(1.0),F/CT-CRMV72Y(0.1)。
来自F/PBS免疫小鼠的肺明显有RSV(log103.4pfu/g组织)。相反,那些F蛋白免疫小鼠没有显示可检测病毒,F蛋白与突变型霍乱全毒素共配制。观察到一些类似模式的血清中和抗体(表20)。那些F/PBS免疫小鼠显示补体-协助的中和抗体,与以1.0μg每剂量接受突变型霍乱全毒素作为佐剂的所有小鼠相比显著下降,除了F/CT-CRMI16A,S68Y。在缺乏补体时观察到中和活性的证据,没有观察到统计差异(表20)。这些数据共同表明包括突变型霍乱全毒素CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y和CT-CRMS68Y,V72Y显著地影响对RSV F蛋白的功能性免疫应答的程度。
表20:用纯化F蛋白和突变型CT-CRMs免疫引起的功能性免疫应答
抗原 | 佐剂(μg) | GMTpfu/g(Log10) | 几何平均血清(Log10) | |
肺组织 | +C’ | -C’ | ||
F蛋白 | 没有 | 3.38±0.72 | 1.1±0.2 | <1.3 |
F蛋白 | CT-CRME29H(1) | <1.5±0.03 | 3.0±0.6 | 1.6±0.6 |
F蛋白 | CT-CRME29H(0.1) | <1.5±0.1 | 2.7±0.5 | <1.3 |
F蛋白 | CT-CRMI16A(1) | <1.6±0.03 | 3.1±0.3 | 1.5±0.7 |
F蛋白 | CT-CRMI16A(0.1) | <1.5±0.03 | 2.3±0.7 | <1.3 |
F蛋白 | CT-CRMV72Y(1) | <1.6±0.05 | 2.9±0.5 | 1.6±0.6 |
F蛋白 | CT-CRMV72Y(0.1) | <1.5±0.03 | 1.8±0.4 | 1.1±0.1 |
F蛋白 | CT-CRMI16A,V72Y(1) | <1.5±0.02 | 2.7±0.7 | 1.4±0.6 |
F蛋白 | CT-CRMI16A,V72Y(0.1) | <1.5±0.05 | 3.1±0.2 | 1.5±0.6 |
F蛋白 | CT-CRMS68Y,V72Y(1) | <1.6±0.05 | 2.5±0.6 | 1.4±0.6 |
F蛋白 | CT-CRMS68Y,V72Y(0.1) | <1.5±0.5 | 2.5±0.5 | <1.3 |
F蛋白 | CT(1) | <1.5±0.7 | 3.5±0.4 | 1.4±0.6 |
F蛋白 | CT(0.1) | <1.6±0.06 | 2.6±0.5 | 1.5±0.6 |
在另一个实验中,幼稚BALB/c小鼠(8-10周龄,5只/组)在0和3周用天然纯化融合(F)蛋白免疫(IN,0.01μl),蛋白纯化自RSV的248/404菌株。蛋白(3μg/剂量)在与1.0或0.1μg所示CT-CRM的混合物中制备。对照小鼠用F蛋白免疫,F蛋白与单独CT-CRME29H、野生型CT或PBS混合。血清(几何平均效价±1标准偏差)和支气管肺泡(BAL)、鼻(NW)和阴道(VW)洗液流体在第二次免疫后两周收集,用于通过ELISA确定终点抗F蛋白总数和亚类IgG和IgA效价。收集粘膜洗液样品用于确定终点效价。
来自两个试验的结果列于表21和22。
表21.用突变型CT-CRMs制成的F蛋白免疫BALB/C小鼠的几何血清效价
抗原 | 佐剂(μg) | 抗F蛋白Ig效价(Log10) | |||
IgG | IgG1 | IgG2a | IgA | ||
F蛋白 | 没有 | 4.0±0.7 | 2.7±1.0 | 2.3±0.7 | 2.3±0.7 |
F蛋白 | CT-CRMI16A(1) | 5.4±0.3 | 5.1±0.2 | 5.1±0.3 | 4.3±0.3 |
F蛋白 | CT-CRMI16A(0.1) | 5.1±0.4 | 4.6±0.4 | 4.0±0.5 | 3.9±0.5 |
F蛋白 | CT-CRMI16A,S68Y(1) | 5.7±0.2 | 5.4±0.3 | 5.3±0.3 | 4.7±0.3 |
F蛋白 | CT-CRMI16A,S68Y(0.1) | 5.2±0.3 | 5.5±0.3 | 4.2±0.2 | 4.0±0.2 |
F蛋白 | CT-CRMV72Y(1) | 5.6±0.1 | 5.4±0.2 | 5.0±0.2 | 4.7±0.1 |
F蛋白 | CT-CRMV72Y(0.1) | 5.3±0.3 | 4.8±0.2 | 4.7±0.2 | 4.6±0.2 |
F蛋白 | CT-CRMS68Y,V72Y(1) | 5.7±0.2 | 5.5±0.3 | 4.3±0.3 | 4.4±0.2 |
F蛋白 | CT-CRMS68Y,V72Y(0.1) | 5.1±0.2 | 4.5±0.4 | 4.0±0.3 | 4.1±0.3 |
F蛋白 | CT-CRME29H(1) | 5.4±0.3 | 5.4±0.1 | 5.5±0.6 | 4.6±0.3 |
F蛋白 | CT-CRME29H(0.1) | 5.3±0.4 | 5.4±0.1 | 4.3±0.4 | 4.3±0.1 |
F蛋白 | CT(1) | 5.4±0.5 | 5.0±0.5 | 4.4±0.8 | 4.6±1.0 |
F蛋白 | CT(0.1) | 4.6±0.3 | 4.5±0.4 | 3.5±0.2 | 4.3±0.3 |
表22.突变型CT-CRMs制成的F蛋白免疫BALB/c小鼠的收集粘膜洗液样品的Ig效价,
抗原 | 佐剂(μg) | 抗F蛋白Ig效价 | |||||
BAW | NW | VW | |||||
IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | ||
F蛋白 | 没有 | <25 | <25 | <25 | 157 | <25 | 44 |
F蛋白 | CT-CRMI16A(1) | 1,177 | 60 | 1,062 | 1,319 | 270 | 1,773 |
F蛋白 | CT-CRMI16A(0.1) | 340 | 75 | 280 | 228 | 57 | 8,008 |
F蛋白 | CT-CRMI16A,S68Y(1) | 6,029 | 917 | 656 | 1,543 | 1,200 | 7,660 |
F蛋白 | CT-CRMI16A,S68Y(0.1) | 2,318 | 1,028 | 273 | 415 | 669 | 5,904 |
F蛋白 | CT-CRMV72Y(1) | 5,879 | 497 | 6,327 | 1,940 | 1,325 | 4,632 |
F蛋白 | CT-CRMV72Y(0.1) | 4,696 | 2,954 | 764 | 1,002 | 1,726 | 684 |
F蛋白 | CT-CRMS68Y,V72Y(1) | 2,179 | 364 | 444 | 4,153 | 907 | 849 |
F蛋白 | CT-CRMS68Y,V72Y(0.1) | 1,030 | 125 | 289 | 646 | 440 | 201 |
F蛋白 | CT-CRME29H(1) | 1,972 | 217 | 616 | 437 | 327 | 43,466 |
F蛋白 | CT-CRME29H(0.1) | 1,893 | 222 | 1,993 | 1,013 | 845 | 5,489 |
F蛋白 | CT(1) | 2,189 | 434 | 269 | 474 | 1,308 | 994 |
F蛋白 | CT(0.1) | 1,791 | 308 | 316 | 1,997 | 315 | 358 |
当本发明的CT-CRM突变体以1.0μg剂量用作粘膜佐剂时,结果类似于使用突变型CT-CRME29H和野生型CT获得的结果(表21)。F蛋白免疫后没有观察到来自抗F蛋白IgG或IgA效价的显著差异,F蛋白与CT-CRME29H或野生型CT混合。因为收集样品用于确定粘膜洗液流体中的Ig效价,不能进行统计分析。尽管如此,本发明突变型CT-CRMs引起的效价可与F蛋白诱导的相比,F蛋白与CT-CRME29H或野生型CT混合(表22)。
因此,本发明的所有CT-CRM突变体对F蛋白有佐剂活性。
实施例7:粘膜炎莫拉氏菌的USPA2外膜蛋白免疫BALB/C小鼠的免疫应答
在此研究中,检测突变型CT-CRMs增强抗粘膜炎莫拉氏菌的天然UspA2外膜蛋白的全身和粘膜免疫应答的能力。单独在10μl盐水或10μl制剂中的纯化UspA2(5μg/剂量)在0、7、14天施用给Balb/c小鼠IN,制剂含0.1μg/剂量的突变型CT-CRM(CT-CRME29H、CT-CRMI16A、CT-CRMI16A,S68Y、CT-CRMV72Y或CT-CRMS68Y,V72Y)。在第28天检测血清和粘膜灌洗中的蛋白-特异IgG和IgA水平。所得血清和粘膜IgG效价列于表23。所有突变型CT-CRMs,除了CT-CRMI16A,引起增强的血清IgG抗体反应。测量支气管、鼻和阴道中的IgG和IgA水平。在任何洗液中没有检测到IgA,且IgG仅在几个洗液中检测到。
表23:UspA2与不同的CT-CRMs鼻内施用小鼠中UspA2引起的UspA2血清效价
CT突变体 | 血清抗体 | 粘膜IgG抗体 | |||
IgG(log10ISD效价) | IgA | 肺 | 鼻 | 阴道 | |
无 | 530(2.724±0.38) | <10 | <10 | <10 | <10 |
CT-CRME29H | 17,378(4.24±0.47) | 37 | 35 | <10 | <10 |
CT-CRMI16A | 548(2.739±0.48) | <10 | <10 | <10 | <10 |
CT-CRMI16A,S68Y | 7943(3.90±1.15) | 45 | 23 | <10 | 15 |
CT-CRMV72Y | 9550(3.98±0.82) | 42 | 45 | <10 | 19 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 1072(3.03±0.89) | <10 | <10 | <10 | <10 |
实施例8:突变霍乱毒素全毒素的佐剂活性
为产生全面的有不同毒性、功能性和免疫原性特征的突变型CT-CRMs,上述CT-CRM突变体作为粘膜佐剂分析,并确定各突变体的毒性和酶活性分布。如表24的总结,所有突变型CT-CRMs与所述野生型CT相比有显著降低的毒性和酶活性。下列数据来自用于评估这些遗传解毒突变型CTs辅佐免疫应答能力的两个研究,免疫应答针对来自粘膜炎莫拉氏菌的天然UspA2蛋白。
实验进行如下:BALB/c小鼠(6-8周令,5只小鼠/组)在0、2、4周用5μg纯化的天然UspA2蛋白免疫,蛋白在PBS中或与1μg野生型CT或CT-CRME29H或CT-CRMI16A或CT-CRMV72Y或CT-CRMI16A,S68Y或CT-CRMS68Y,V72Y每次免疫共制成。鼻内施用10μl的总体积(5μl每鼻孔)。小鼠在0、2、4或6周放血以试验血清抗体反应。最后一次免疫(第6周)后两周,杀死小鼠用于分析粘膜抗体反应。用JMP统计发现软件(SAS Institute Inc.,Cary,NC)通过Tukey-Kramer HSD多种比较试验确定组间的显著差异。
CT-CRMs的佐剂活性可总结如下。第6周的血清抗体分析显示用UspA2蛋白免疫显著诱导对UspA2蛋白的IgG抗体反应,蛋白用1μg/剂量浓度的任何CT-CRM突变体制成。对UspA2蛋白的总IgG抗体反应程度通过包含来源于CT的突变体(除了CT-CRMI16A,S68Y)增加约17-38倍(表25)。突变毒素CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMS68Y,V72Y和CT-CRME29H间总抗UspA2 IgG效价中没有观察到显著差异,即使通过Tukey-Kramer HSD试验它们引起的IgG效价都显著高于单独UspA2蛋白(表25)。使用各CT-CRM突变体也提高UspA2蛋白的血清IgG亚类抗体(IgG1、IgG2a和IgG2b)。IgG1和IgG2a或IgG2b效价的比例约为1.0,指示平衡的Th1/Th2型免疫应答。
抗UspA2蛋白抗体反应也在收集的粘膜洗液样品中分析(表27)。如预期的,在来自UspA2/PBS免疫小鼠的支气管肺泡灌洗(BAL)、鼻洗液(NW)、阴道洗液(VW)或唾液(SAL)中没有观察到抗体的诱导。然而,CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMS68Y,V72Y和CT-CRMI16A,S68Y的有效粘膜佐剂能力是明显的。在大部分粘膜样品中检测到UspA2特异粘膜IgA抗体。尽管对这些收集样品不能进行统计分析,出现一些趋势。例如,接受CT-CRMV72Y的小鼠在各测试的NW、VW和唾液样品中显示提高的UspA2特异IgA抗体。
CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、和CT-CRMS68Y,V72Y是用于卡他莫拉菌UspA2蛋白的有效粘膜佐剂。血清抗体数据显示所有1μg的CT-CRMs除了CT-CRMI16A, S68Y,辅佐对UspA2蛋白的免疫应答能力与CT-CRME29H相同(表25和26)。粘膜洗液数据表明所有突变型CT-CRMs保持有效粘膜佐剂性(表27)。此外如表24所示,它们的毒性和酶活性显著低于野生型CT。因此,CT-CRMI16A、CT-CRMV72Y、CT-CRMS68Y,V72Y和CT-CRMI16A,S68Y是另外的有效粘膜佐剂。
表24.突变霍乱毒素的特征
突变型CT | 同源性(%) | 全毒素(%) | Y-细胞毒性(%) | ADP-核糖基转移酶活性(%) |
CT-CRMI16A | >90 | 未做 | 0.37 | 3.3 |
CT-CRMI16A,S68Y | 75.8 | 97.8 | 0.37 | 2.4 |
CT-CRMV72Y | 95.5 | 99.4 | 0.37 | 1.1 |
CT-CRMS68Y,V72Y | 78.9 | 未做 | 0.37 | 1.2 |
每组5只雌性BALB/c小鼠在0、2、4周用10μl溶液鼻内免疫,溶液含用1μg CT(Sigma)或CT突变体辅佐的5μg nUspA2。终点抗体效价从第5周第6天收集的血清中确定。数据表示为相互稀释的几何平均(±1SD),结果是OD405为0.1。统计分析是用Tukey-Kramer。结果列于表25。
表25:突变型CTs辅佐的nUspA2鼻内免疫后BALB/c小鼠的血清抗nUspA2反应
组 | 抗原(5μg) | 佐剂(1μg) | 平均log10抗体效价(±1SD) | |
IgG | IgA | |||
AG414 | nUspA2 | PBS | <2.00 | <2.00 |
AH415 | nUspA2 | CT | 4.08±0.20* | 2.47±0.33 |
AH416 | nUspA2 | CT-CRME29H | 3.37±0.37* | 2.04±0.09 |
AH417 | nUspA2 | CT-CRMI16A | 3.23±0.21* | 2.00±0.02 |
AH418 | nUspA2 | CT-CRMI16A,S68Y | 2.63±0.12*Φ | <2.00 |
AH419 | nUspA2 | CT-CRMV72Y | 3.59±0.27* | 2.11±0.15 |
AH420 | nUspA2 | CT-CRMS68Y,V72Y | 3.41±0.22* | <2.00 |
*显著高于nUspA2/PBS组
Φ显著低于所有其它辅佐的组
每组5只雌性BALB/c小鼠在0、2、4周用10μl溶液鼻内免疫,溶液含用1μg CT(Sigma)或CT突变体辅佐的5μg nUspA2。终点抗体效价从第5周第6天收集的血清中确定。数据表示为相互稀释的几何平均(±1SD),结果是OD405为0.1。统计分析是用Tukey-Kramer。结果列于表26。
表26:用突变型CT-CRMs辅佐的nUspA2鼻内免疫后BALB/c小鼠的血清抗nUspA2反应
组 | 抗原(5μg) | 佐剂(1μg) | 平均log10抗体效价(±1SD) | ||
IgG1 | IgG2a | IgG2b | |||
AG414 | nUspA2 | PBS | <2.00 | <2.00 | <2.00 |
AH415 | nUspA2 | CT | 3.27±0.12* | 3.39±0.34* | 3.03±0.17* |
AH416 | nUspA2 | CT-CRME29H | 2.60±0.08* | 2.82±0.32* | 2.68±0.25* |
AH417 | nUspA2 | CT-CRMI16A | 2.30±0.20 | 2.91±0.24* | 2.54±0.21* |
AH418 | nUspA2 | CT-CRMI16A,S68Y | 2.36±0.09* | 2.65±0.21* | 2.44±0.24* |
AH419 | nUspA2 | CT-CRMV72Y | 3.07±0.28* | 3.30±0.35* | 2.83±0.19* |
AH420 | nUspA2 | CT-CRMS68Y,V72Y | 2.80±0.25* | 2.86±0.43* | 2.52±0.18* |
*显著高于nUspA2/PBS组
每组5只雌性BALB/c小鼠在0、2、4周用10μl溶液鼻内免疫,溶液含用1μg CT(Sigma)或CT突变体辅佐的5μg nUspA2。终点抗体效价从第6周收集的粘膜洗液中确定。数据表示为相互稀释,结果是OD405为0.1。统计分析用Tukey-Kramer。结果示列表25。
表27:用突变型CTs辅佐的nUspA2鼻内免疫后BALB/c小鼠的粘膜抗nUspA2反应
组 | 抗原(5μg) | 佐剂(1μg) | 支气肺泡管洗液 | 鼻洗液 | 阴道洗液 | 唾液 | ||||
IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | IgG | IgA | |||
AG414 | nUspA2 | PBS | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 |
AH415 | nUspA2 | CT | <10 | <10 | <10 | 34 | <10 | <10 | <10 | 33 |
AH416 | nUspA2 | CT-CRME29H | <10 | <10 | <10 | 22 | <10 | <10 | <10 | <10 |
AH417 | nUspA2 | CT-CRMI16A | <10 | <10 | <10 | <10 | <10 | 17 | <10 | 22 |
AH418 | nUspA2 | CT-CRMI16A,S68Y | <10 | <10 | <10 | 23 | <10 | 12 | <10 | 17 |
AH419 | nUspA2 | CT-CRMV72Y | <10 | 16 | <10 | 15 | <10 | 58 | <10 | 46 |
AH420 | nUspA2 | CT-CRMS68Y,V72Y | <10 | <10 | <10 | 14 | <10 | 41 | <10 | 43 |
本说明引用的所有出版物和文献纳入本文供参考。尽管发明已描述关于具体较佳实施方案,需理解的是,可不背离本发明的精神作出修改。这些修改在所附的权利要求书范围内。
序列表
<110>美国氰胺公司(American Cyanamid Company)
科罗拉多大学(University of Colorado)
B.A.格林(Green,Bruce A.)
R.K.荷尔姆斯(Holmes,Randall K.)
M.G.乔布林(Jobling,Michael G.)
D.朱(Zhu,Duzhang)
<120>作为佐剂的霍乱全毒素的突变体形式
<130>AM100450PCT
<150>US 60/296,537
<151>2001-06-07
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>382
<212>PRT
<213>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
<400>1
Met Val Lys Ile Ile Phe Val Phe Phe Ile Phe Leu Ser Ser Phe Ser
1 5 10 15
Tyr Ala Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp
20 25 30
Glu Ile Lys Gln Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Gly Gln Ser Glu Tyr
35 40 45
Phe Asp Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn Leu Tyr Asp His Ala Arg
50 55 60
Gly Thr Gin Thr Gly Phe Val Arg His Asp Asp Gly Tyr Val Ser Thr
65 70 75 80
Ser Ile Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Val Gly Gln Thr Ile Leu Ser
85 90 95
Gly His Ser Thr Tyr Tyr Ile Tyr Val Ile Ala Thr Ala Pro Asn Met
100 105 110
Phe Asn Val Asn Asp Val Leu Gly Ala Tyr Ser Pro His Pro Asp Glu
115 120 125
Gln Glu Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly
130 135 140
Trp Tyr Arg Val His Phe Gly Val Leu Asp Glu Gln Leu His Arg Asn
145 150 155 160
Arg Gly Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Asp Ile Ala Pro Ala
165 170 175
Ala Asp Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Phe Pro Pro Glu His Arg Ala Trp
180 185 190
Arg Glu Glu Pro Trp Ile His His Ala Pro Pro Gly Cys Gly Asn Ala
195 200 205
Pro Arg Ser Ser Met Ser Asn Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu
210 215 220
Gly Val Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile
225 230 235 240
Phe Ser Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp
245 250 255
Glu Leu Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu
260 265 270
Ser Ser Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys
275 280 285
Ala Glu Ser His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe
290 295 300
Ser Tyr Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr
305 310 315 320
Phe Lys Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Ser Ser Gln His
325 330 335
Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg
340 345 350
Ile Ala Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn
355 360 365
Asn Lys Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn
370 375 380
<210>2
<211>240
<212>PRT
<213>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
<400>2
Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Arg Ala Asp Ser Arg Pro Pro Asp Glu Ile
1 5 10 15
Lys Gln Ser Gly Gly Leu Met Pro Arg Gly Gin Ser Glu Tyr Phe Asp
20 25 30
Arg Gly Thr Gln Met Asn Ile Asn Leu Tyr Asp His Ala Arg Gly Thr
35 40 45
Gln Thr Gly Phe Val Arg His Asp Asp Gly Tyr Val Ser Thr Ser Ile
50 55 60
Ser Leu Arg Ser Ala His Leu Val Gly Gin Thr Ile Leu Ser Gly His
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Tyr Ile Tyr Val Ile Ala Thr Ala Pro Asn Met Phe Asn
85 90 95
Val Asn Asp Val Leu Gly Ala Tyr Ser Pro His Pro Asp Glu Gln Glu
100 105 110
Val Ser Ala Leu Gly Gly Ile Pro Tyr Ser Gln Ile Tyr Gly Trp Tyr
115 120 125
Arg Val His Phe Gly Val Leu Asp Glu Gln Leu His Arg Asn Arg Gly
130 135 140
Tyr Arg Asp Arg Tyr Tyr Ser Asn Leu Asp Ile Ala Pro Ala Ala Asp
145 150 155 160
Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Phe Pro Pro Glu His Arg Ala Trp Arg Glu
165 170 175
Glu Pro Trp Ile His His Ala Pro Pro Gly Cys Gly Asn Ala Pro Arg
180 185 190
Ser Ser Met Ser Asn Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val
195 200 205
Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser
210 215 220
Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu
225 230 235 240
<210>3
<2ll>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>β-淀粉样肽
<400>3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210>4
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>α-β-淀粉样肽
<400>4
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys
20 25
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(14)..(14)
<223>S可以是G或C
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>Y可以是C或T
<400>5
cctcctgatg aagsycaagc agtcagg 27
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>6
gtttgagatc tgcccact 18
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>7
gtttgaccca ctaagtgggc 20
<210>8
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>8
gtttgagata tgcccactta tatggtcaac 30
<210>9
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>9
ttttttgggc tagcatggag gaaaagatga gc 32
<210>10
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列
<400>10
cgaggtcgaa gcttgcatgt ttgggc 26
Claims (18)
1.一种包括野生型霍乱毒素亚基A氨基酸序列的免疫原性、突变型霍乱全毒素,所述亚基A具有第一突变和第二突变,所述第一突变是野生型霍乱毒素亚基A第68位丝氨酸被酪氨酸取代,所述第二突变是野生型霍乱毒素亚基A第16位异亮氨酸被丙氨酸取代或第72位缬氨酸被酪氨酸取代,所述突变型霍乱全毒素与所述野生型霍乱毒素相比毒性降低。
2.免疫原性组合物,包含如权利要求1所述的突变型霍乱全毒素和抗原。
3.如权利要求2所述的组合物,所述抗原的来源选自致病细菌、病毒、真菌或寄生虫、癌细胞、肿瘤细胞、变应原和自身分子构成的组。
4.如权利要求3所述的组合物,所述抗原来自细菌,所述细菌选自细菌种类典型和非典型流感嗜血杆菌、睡眠嗜血杆菌、粘膜炎莫拉氏菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、无乳链球菌、粪链球菌、幽门螺杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、百日咳博德特氏菌、耳炎差异球菌、伤寒沙门氏杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、白喉杆菌、结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌-胞内复合体结核分枝杆菌、奇异变形杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、破伤风杆菌、问号钩端螺旋体、伯氏疏螺旋体、溶血性巴斯德菌、多杀巴斯德菌、胸膜肺炎放线杆菌和鸡败血支原体构成的组。
5.如权利要求4所述的组合物,所述抗原选自流感嗜血杆菌P4外膜蛋白、流感嗜血杆菌P6外膜蛋白和流感嗜血杆菌粘附和穿透蛋白(Haps)、幽门螺杆菌尿素酶蛋白、脑膜炎奈瑟氏球菌B组I型菌毛蛋白(rpilin)和脑膜炎奈瑟氏球菌B组I型外膜蛋白(PorA)构成的组。
6.如权利要求3所述的组合物,所述抗原来自病毒,所述病毒选自呼吸道合胞病毒、副流感病毒1-3型、人肺炎后病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、人免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人乳头状瘤病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、拓状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、腺病毒、狂犬热病毒、犬瘟热病毒、牛瘟病毒、鸟肺病毒、Hendra病毒、Nipah病毒、冠状病毒、细小病毒、传染性鼻气管炎病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、禽传染性囊病病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒、猪呼吸道和生殖综合症病毒、马动脉炎病毒和脑炎病毒构成的组。
7.如权利要求6所述的组合物,所述抗原选自呼吸道合胞病毒融合蛋白和单纯疮疹病毒(HSV)II型糖蛋白D(gD2)构成的组。
8.如权利要求3所述的组合物,所述抗原来自致病真菌,所述致病真菌选自曲霉菌、芽生菌、假丝酵母、球孢子菌、隐球菌和组织胞浆菌构成的组。
9.如权利要求3所述的组合物,所述抗原来自致病寄生虫,所述致病寄生虫选自利什曼虫、蛔虫、鞭虫、贾第虫、血吸虫、似隐孢子虫、毛滴虫、鼠弓形体和卡氏肺囊虫构成的组。
10.如权利要求3所述的组合物,所述抗原选自前列腺特异抗原、癌-胚抗原、MUC-1、Her2、CA-125、MAGE-3、激素和激素类似物构成的组。
11.如权利要求3所述的组合物,所述抗原来自淀粉样前体蛋白,所述前体蛋白选自Aβ肽及Aβ肽的片段构成的组,Aβ肽是淀粉样前体蛋白的42个氨基酸片段。
12.如权利要求2所述的组合物,进一步包括稀释剂、赋形剂或载体。
13.如权利要求2所述的组合物,除了突变型霍乱全毒素之外还包括第二种佐剂。
14.一种分离和纯化的核酸分子或序列,其特征在于编码权利要求1所述的免疫原性、突变型霍乱全毒素。
15.如权利要求14所述的核酸分子,进一步包括调节序列,所述调节序列操作性连接于所述编码序列并能在宿主细胞中表达所述突变全毒素。
16.一种宿主细胞,其特征在于,所述宿主细胞用核酸分子转化、转导、感染或转染,所述核酸分子包含与调节序列操作性连接的分离并纯化的编码权利要求1所述免疫原性突变霍乱全毒素的核酸分子,所述调节序列使所述突变霍乱全毒素在所述宿主细胞内得以表达。
17.一种产生免疫原性突变型霍乱全毒素的方法,所述突变霍乱全毒素与所述野生型霍乱全毒素相比毒性降低,所述方法包括在允许宿主细胞表达所述免疫原性突变型霍乱全毒素的条件下培养用核酸分子转化的宿主细胞,所述核酸分子包含与调节序列操作性连接的分离并纯化的编码权利要求1所述免疫原性突变霍乱全毒素的核酸分子,所述调节序列使所述突变霍乱全毒素在所述宿主细胞内得以表达。
18.有效佐剂量的权利要求1所述突变型霍乱全毒素与抗原一同用于制造增强脊椎动物宿主对所述抗原的免疫应答的药物的用途,所述抗原来自致病细菌、病毒、真菌、寄生虫、癌细胞、肿瘤细胞、变应原、自身分子或脊椎动物抗原。
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