CN1745096A - 卡他莫拉氏菌的交叉保护表位和其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及施用于对卡他莫拉氏菌敏感的宿主的免疫原性组合物。更具体地,本发明涉及卡他莫拉氏菌CopB蛋白质的交叉反应表位序列的鉴定。
Description
发明领域
本发明一般涉及微生物学、临床细菌学和免疫学领域。更具体地,本发明涉及鉴定卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)的CopB蛋白质的新的交叉反应性表位序列。
发明背景
卡他莫拉氏菌,以及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是中耳炎(OM)的三种主要的细菌病因。在儿童中,中耳炎是访问儿科医生的最主要的原因,具有渗出液的中耳炎可以导致迟至青少年的发育问题(Bennett等人,2001)。据估计卡他莫拉氏菌占所有中耳炎病例的高达23%(Murphy,1996)。此外,卡他莫拉氏菌通常与年长的成年人中呼吸道感染,尤其慢性阻塞性肺病的恶化有关(Sethi和Murphy,2001)。
从而,用于防止卡他莫拉氏菌感染的免疫原性组合物将非常有益于这些群体的健康。实际上,1989Consensus Report总结,由于中耳炎在婴儿和儿童,以及所有年龄组的某些群体中发生,中耳炎的预防是重要的卫生保健目标(匿名,″Consensus″,Pediatr.Infect.Dis.J.,8:594-597,1989)。估计中耳炎的总的经济负担为每年至少2.5亿美元。在Consensus Report中将疫苗确定为防止中耳炎的最希望的方法。
卡他莫拉氏菌的CopB蛋白质是用于包括在免疫原性组合物中的若干有希望的候选抗原之一。该80kDa的完整外部膜蛋白介导铁获取并且对于该细菌体内的生存是必需的(Helminen等人,1993a)。已经报导copB基因存在于所检查的每种分离物(Bootsma等人,2000)中并且从分离物到分离物相对良好地保守(Sethi等人,1997;Helminen等人,1993b)。CopB蛋白质与奈瑟氏菌属的FetA蛋白质(以前称作FrpB蛋白质)具有同源性,FetA蛋白质作为肠杆菌素铁载体的受体(Aebi等人,1996;Campagnari等人,1994;Carson等人,1999)。将CopB考虑为潜在的候选抗原的主要原因是CopB特异的单克隆抗体(Mab)10F3显示出依赖补体的杀细菌活性(Aebi等人,1998),并且在肺的移地发育攻击模型中,用10F3对小鼠的被动免疫促进了细菌清除(Helminen等人,1993b)。
与CopB血清学有关的唯一出版的信息来自对Mab反应性的研究。Helminen等人表明Mab 10F3识别与70%的卡他莫拉氏菌分离物(Helminen等人,1993b)。Sethi等人使用不同的Mab组(Sethi等人,1997)报导了类似的反应性模式,并且来自相同实验室的报导表明CopB可能具有免疫显性表位(Ameen等人,1998)。作图揭示MAb 10F3的表位结构域在CopB蛋白质的氨基酸残基295和302之间发生,并且10F3阳性分离物035E表位和10F3阴性分离物TTA24表位之间有单个氨基酸差异(Aebi等人,1998;国际申请WO 98/06851)。
如上面陈述,正在研究卡他莫拉氏菌的CopB外部膜蛋白作为候选免疫原。有效免疫原需要引起针对群体中发生的多数,甚至全部卡他莫拉氏菌株系的交叉保护。因此,本领域中强烈希望鉴定一种或多种CopB表位,其赋予针对高浓度卡他莫拉氏菌株系的保护(例如,交叉保护)。预计这种CopB交叉反应表位将具有治疗用途,用作免疫原性组合物以施用于对卡他莫拉氏菌感染敏感的宿主。
发明概述
本发明广义的涉及用于施用于对卡他莫拉氏菌感染敏感的宿主的免疫原性组合物。更具体地,本发明涉及鉴定卡他莫拉氏菌的CopB蛋白质的交叉反应性表位序列。
具体地,本发明利用了所发现的两种新的卡他莫拉氏菌CopB血清组:血清组III,其具有SEQ ID NO:3的CopB表位结构域;和血清组IV,其具有SEQ ID NO:4的CopB表位结构域。
在某些实施方案中,本发明涉及含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一实施方案中,本发明提供了含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在再一实施方案中,本发明提供了含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一个实施方案中,将该片段进一步限定为CopB表位。在另一实施方案中,本发明提供了含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在某些其他实施方案中,将SEQID NO:3定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。在其他实施方案中,将SEQ ID NO:4定义为卡他莫拉氏菌分离物4608.1的CopB多肽内所含的氨基酸序列。
在某些其他实施方案中,所述片段与载体蛋白质共价结合(缀合)并且可以含有一种或多种佐剂。在优选实施方案中,所述免疫原性组合物当以免疫原性量施用于哺乳动物宿主时,保护该宿主抵抗75%以上的卡他莫拉氏菌株系。
在一个实施方案中,本发明涉及含有至少三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:2的氨基酸序列,第三种多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在某些实施方案中,该免疫原性组合物还含有含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第四种多肽。在另一实施方案中,本发明涉及含有三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:2的氨基酸序列,第三种多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在其他实施方案中,本发明涉及含有至少两种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在其他实施方案中,本发明涉及含有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物。在其他实施方案中,本发明涉及含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物。在其他实施方案中,所述免疫原性组合物还含有第四种多肽,其含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在其他实施方案中,还将所述多肽进一步定义为Cop B多肽。在优选实施方案中,将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。在其他实施方案中,将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌分离物4608.1的CopB多肽内所含的氨基酸序列。在其他其他实施方案中,所述多肽与载体蛋白质共价结合并且可以还含有一种或多种佐剂。在某些实施方案中,所述免疫原性组合物当以免疫原性量施用于哺乳动物宿主时,保护该宿主抵抗75%以上的卡他莫拉氏菌株系。
在一个具体实施方案中,本发明涉及含有许多与卡他莫拉氏菌CopB表位片段共价连接的分离的多肽,其中该多肽含有至少包含SEQID NO:1的氨基酸序列的片段,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段。在其他实施方案中,本发明涉及含有许多与卡他莫拉氏菌CopB表位片段共价连接的经分离的多肽,其中该多肽含有至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。在其他实施方案中,本发明涉及含有许多与卡他莫拉氏菌CopB表位片段共价连接的经分离的多肽,其中该多肽含有至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段、包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。在一个实施方案中,本发明涉及编码含有许多与卡他莫拉氏菌CopB表位片段共价连接的多肽的多核苷酸。在另一实施方案中,本发明提供了含有编码含有许多与卡他莫拉氏菌CopB表位片段共价连接的多肽的多核苷酸的表达载体。在其他实施方案中,本发明提供了用含有编码含有许多与卡他莫拉氏菌CopB表位片段共价连接的多肽的多核苷酸的表达载体转化、转染或感染的宿主细胞。
在某些实施方案中,本发明涉及免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的氨基酸序列,其中该方法还包括含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。
在其他实施方案中,本发明涉及免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4的氨基酸序列,其中该方法还包括含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段。
在再一实施方案中,本发明涉及免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有至少三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:2的氨基酸序列,第三种多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列,其中该方法可以还含有包含至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第四种多肽。
在再一实施方案中,本发明涉及免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有至少三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:2的氨基酸序列,第三种多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列,其中该方法可以还含有包含至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第四种多肽。
在其他实施方案中,本发明涉及免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有许多共价连接的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的免疫原性组合物,其中该许多片段包含至少含有SEQID NO:1的氨基酸序列的片段、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段,其中该方法还包括含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列的第四种片段。
在某些实施方案中,本发明涉及免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有许多共价连接的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的免疫原性组合物,其中该许多片段包含至少含有SEQID NO:1的氨基酸序列的片段、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段、含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段,其中该方法还包括含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列的第四种片段。
在具体实施方案中,上面方法任一种中的多肽可以与抗原载体蛋白缀合,可以含有额外的抗原,和/或可以含有一种或多种佐剂。
根据下面的详细描述、其优选实施方案,和权利要求书,本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图简述
图1显示了来自卡他莫拉氏菌分离物035E、TTA24、430:345、218:038、417:082和4608.1的CopB蛋白质的氨基酸序列的比对。带阴影的区域表示MAb 10F3定义的表面暴露的表位。加框的字母反映了分离物中的氨基酸不同。
发明详述
下面描述的本发明解决本领域中对施用于对卡他莫拉氏菌感染敏感的哺乳动物宿主(例如,人)的有效免疫原性组合物的需求。通常基于免疫原性定义抗原或者免疫原。免疫原性定义为诱导体液和/或细胞介导的免疫应答的能力。从而,下文中定义的术语抗原或者免疫原是具有诱导体液和/或细胞介导的免疫应答的能力的分子。
在一个具体的实施方案中,本发明已经鉴定了两种新的卡他莫拉氏菌CopB血清组(下文,血清组III和血清组IV)。血清组III的代表性分离物是卡他莫拉氏菌分离物430:345、分离物56和分离物046E。血清组IV的代表性分离物是卡他莫拉氏菌分离物4608.1。在鉴定不结合单克隆抗体10F3的卡他莫拉氏菌分离物(即,10F3阴性分离物)期间鉴定了血清组III和IV。本领域中公知单克隆抗体10F3(下文中,10F3或者MAb 10F3)识别约70%的卡他莫拉氏菌分离物(Helminen等人,1993b)并且已经提出CopB可能具有免疫显性表位(Ameen等人,1998)。蛋白质作图已经揭示MAb 10F3的表位结构域在Cop B蛋白质的氨基酸残基295和302之间发生。如本文中所定义,被10F3识别的Cop表位结构域具有NKYAGKGY(SEQ ID NO:1)的8残基氨基酸序列,其中SEQ ID NO:1包含在卡他莫拉氏菌CopB血清组I蛋白质的约氨基酸残基295和约氨基酸残基302中。
分离物430:345(10F3阴性分离物)的copB基因在相应于10F3表位结构域的区域内测序并且检测到与035E分离物(10F3阳性分离物;见表1和图2)的四个氨基酸差异。类似地,分离物4608.1(10F3阴性分离物)的copB基因在相应于10F3表位的区域内测序并且检测到与035E分离物的序列的3个氨基酸差异(见表1)。
如本文定义,“10F3阳性”分离物是结合10F3的卡他莫拉氏菌分离物。如本文定义,“10F3阴性”分离物是不结合10F3的卡他莫拉氏菌分离物。
如本文定义,卡他莫拉氏菌CopB蛋白质的“CopB表位”或者“表位结构域”涉及8个残基氨基酸序列NKYAGKGY(SEQ ID NO:1)。更具体地,如本文定义,卡他莫拉氏菌血清组I的CopB表位具有NKYAGKGY(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。血清组I的代表性分离物是分离物035E、012E和ATCC25240。如本文定义,卡他莫拉氏菌血清组II的CopB表位具有DKYAGKGY(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列,其中粗体残基表示与SEQ ID NO:1不同的残基。血清组II的代表性分离物是分离物TTA24。如本文定义,新近鉴定的卡他莫拉氏菌血清组III的CopB表位具有KDYPGQGY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列,其中粗体残基表示与SEQ ID NO:1不同的残基。血清组III的代表性分离物是分离物430:345、046E和56。如本文定义,新近鉴定的卡他莫拉氏菌血清组IV的CopB表位具有KKYPGQGY(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列,其中粗体残基表示与SEQ ID NO:1不同的残基。血清组IV的代表性分离物是分离物4608.1。
从而,本发明的新的CopB血清组(即血清组III和IV)的鉴定将对开发免疫原和其组合物尤其有用,所述免疫原和其组合物赋予针对多数(例如,>75%)卡他莫拉氏菌株系的高保护百分数。
表1
CopB血清组与表位序列
血清组 | 原型分离物 | Genebank登录号 | 表位序列a |
CopB-ICopB-IICopB-IIICopB-IV | 035E012EATCC25240TTA24430:345046E564608.1 | L12346U69981U83900U69980TBDcU69982U83901TBD | NKYAGKGY(SEQ ID NO:1)DKYAGKGY(SEQ ID NO:2)KDYPGQGY(SEQ ID NO:3)KKYPGQGY(SEQ ID NO:4) |
a从DNA序列推导相应于10F3表位的结构域的氨基酸序列。
bTBD=待保藏
A.CopB多肽和其片段
在具体实施方案中,本发明提供了含有卡他莫拉氏菌CopB表位的免疫原。在一个具体实施方案中,这些免疫原用于制备免疫原性组合物,该组合物用于免疫哺乳动物宿主抗卡他莫拉氏菌感染。在优选实施方案中,这些免疫原赋予针对高百分数的异源卡他莫拉氏菌株系的保护(即,交叉保护)。
从而,在一个实施方案中,本发明涉及含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在另一实施方案中,所述免疫原性组合物含有卡他莫拉氏菌多肽片段,其中所述片段含有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在再一个实施方案中,免疫原性组合物含有卡他莫拉氏菌多肽片段,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
在某些其他实施方案中,本发明涉及含有至少三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:2的氨基酸序列,第三种多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列或者至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
某些其他实施方案涉及许多共价连接的CopB表位片段。从而,在一个实施方案中,本发明提供了含有许多共价连接的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的分离的多肽,其中该多肽含有至少包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段,包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段和包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段和/或包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。如下文所述,每种片段缀合到载体蛋白。
优选地,本发明的全长CopB多肽是重组多肽。本发明的CopB多肽片段可以经重组表达或者通过本领域中公知的肽合成方法(Barany等人,1987;美国专利号5,258,454)制备。
根据本发明的CopB多肽的生物学等价物或者变体包含含有与CopB多肽基本上同源的多肽,只要通过SEQ ID NOs:1-4定义的CopB表位结构域在该多肽序列中保守。生物学等价物或者变体还包括那些多肽,其中甚至通过SEQ ID NOs:1-4定义的CopB表位结构域也被修饰,只要该多肽保持通过该修饰的CopB表位结构域引起免疫原性应答的能力。
通常,有功能的生物学等价物或者变体是CopB多肽的天然发生的氨基酸序列变体,其中该多肽保持通过CopB表位结构域引发免疫原性应答的能力。
可以在本发明的多肽结构中进行修饰和改变并且仍然得到保持具有CopB表位免疫原性性质的分子。因为多肽的相互作用能力和性质限定了该多肽的生物学功能活性,所以可以在多肽序列(或者,当然,其潜在的DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列置换并且仍然得到具有类似性质的多肽。
在进行这些改变时,可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水性氨基酸指数在赋予肽的相互作用生物功能中的重要性是本领域中公知的(Kyte & Doolittle,1982)。公知某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或者得分的其他氨基酸置换并且仍然得到具有相似生物学活性的多肽。对每种氨基酸基于其疏水性和带电特征分配亲水指数。那些指数为:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天门冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。
认为氨基酸残基的相对亲水特征确定了所得多肽的二级和三级结构,所述肽又反过来限定了该多肽与其他分子,如酶、底物、受体、抗体、抗原等的相互作用。本领域中公知氨基酸可以被具有相似亲水指数的另一氨基酸置换并且仍然得到功能上等价的多肽。在这些改变中,优选亲水指数为+/-2以内的氨基酸的置换,尤其优选亲水指数为+/-1以内的那些置换,甚至更尤其优选+/-0.5内的那些置换。
基于亲水性可以进行相似氨基酸的置换,尤其当生物学功能等价多肽或者多肽片段计划用于免疫学实施方案中时。美国专利号4,554,101(下文将其引用作为参考)陈述了多肽的最大局部平均亲水性(受到其相邻氨基酸的亲水性的控制)与其免疫原性和抗原性,即该多肽的生物学性质相关。
如美国专利号4,554,101中详述的,将下面的亲水性值分配给氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.01);谷氨酸(+3.01);丝氨酸(+0.3);天门冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);脯氨酸(-0.51);苏氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);白氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。可以理解氨基酸可以被具有相似亲水性值的另一氨基酸置换并且仍然得到生物学等价物,具体地,免疫学等价多肽。在这些改变中,优选亲水性值为±2以内的氨基酸的置换,尤其优选±以内的那些置换,甚至更尤其优选±0.5内那些置换。
如上面列出的,氨基酸置换因此通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性,例如,它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑多种前面的特征的代表性置换是本领域中技术人员众所周知的并且包括:精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天门冬酰胺;和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(见下面的表2)。从而本发明预期如上面提出的CopB多肽的功能或者生物学等价物。
表2氨基酸置换
原残基 代表性残基置换
Ala | Gly;Ser |
Arg | Lys |
Asn | Gln;His |
Asp | Glu |
Cys | Ser |
Gln | Asn |
Glu | Asp |
Gly | Ala |
His | Asn;Gln |
Ile | Leu;Val |
Leu | IIe;Val |
Lys | Arg |
Met | Leu;Tyr |
Ser | Thr |
Thr | Ser |
Trp | Tyr |
Tyr | Trp;Phe |
Val | Ile;Leu |
将本发明的CopB多肽或者多肽片段理解为含有与含有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的表位结构域的CopB多肽具有充分的序列相似性、结构相似性和/或功能相似性的任一CopB多肽。此外,本发明的CopB多肽不限于具体来源。
预期在本发明中,有利地将CopB多肽切割成片段以用于进一步结构或者功能分析,或者产生试剂如CopB-相关的多肽和CopB-特异抗体。这可通过用肽酶如内蛋白酶glu-C(Roche DiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN)处理纯化或者未纯化的CopB多肽实现。用CNBr处理是另一种方法,通过该方法可以从天然CopB多肽产生CopB肽片段。也可以用重组技术产生CopB多肽的一种或多种特定片段,这些片段为单独的或者相互共价连接。
此外,本发明还考虑可以制备与特定CopB多肽免疫原立体相似的化合物以模拟CopB表位结构域的关键部分,将所述化合物称为肽模拟物。模拟物是含有肽的分子,其模拟蛋白质二级结构的元件(见,例如,Johnson等人,1993;美国专利5,424,334;美国专利4,992,463和美国专利5,552,431)。使用肽模拟物的基本原理是蛋白质的肽主链主要以这样的方式确定氨基酸侧链的方向使得方便分子相互作用,如受体和配体的相互作用。
肽模拟概念的成功应用迄今集中在蛋白质内β-转角的模拟物。通过本领域中公知的基于计算机的算法可以类似地预测CopB内的β-转角结构。一旦确定了该转角的组成氨基酸,就可以构建模拟物以实现氨基酸侧链的基本元件的类似的空间取向,如Johnson等人,1993中讨论。
如上文描述,本发明的CopB多肽片段(例如,SEQ ID Nos:1-4)可尤其用作免疫原。通过化学合成或者重组表达方法学产生的片段为多肽,其具有的氨基酸序列与所述氨基酸序列的部分但不是所有序列完全相同。该片段可以含有例如,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的至少7个或多个(例如,7、8、10、12、14、16、18、20或更多)连续的氨基酸。片段可以是“独立的”或者包含在更大的多肽中,这些片段形成该多肽的部分或者区域,最优选地作为单一的连续区域。在一个实施方案中,所述片段含有成熟CopB多肽序列的表位结构域(例如,SEQ ID NO:1)。将本发明的CopB多肽或者多肽片段理解为含有与含有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的表位结构域的CopB多肽具有充分的序列相似性、结构相似性和/或功能相似性的任一CopB多肽。此外,本发明的CopB多肽不限于具体来源。
预期在本发明中,有利地将CopB多肽切割成片段以用于进一步结构或者功能分析,或者产生试剂如CopB-相关的多肽和CopB-特异抗体。这可通过用肽酶如内蛋白酶glu-C(Roche DiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN)处理纯化或者未纯化的CopB多肽实现。用CNBr处理是另一种方法,通过该方法可以从天然CopB多肽产生CopB肽片段。也可以用重组技术产生CopB多肽的一种或多种特定片段,这些片段为单独的或者相互共价连接。
此外,本发明还考虑可以制备与特定CopB多肽免疫原立体相似的化合物以模拟CopB表位结构域的关键部分,将所述化合物称为肽模拟物。模拟物是含有肽的分子,其模拟蛋白质二级结构的元件(见,例如,Johnson等人,1993;美国专利5,424,334;美国专利4,992,463和美国专利5,552,431)。使用肽模拟物的基本原理是蛋白质的肽主链主要以这样的方式确定氨基酸侧链的方向使得方便分子相互作用,如受体和配体的相互作用。
肽模拟概念的成功应用迄今集中在蛋白质内β-转角的模拟物。通过本领域中公知的基于计算机的算法可以类似地预测CopB内的β-转角结构。一旦确定了该转角的组成氨基酸,就可以构建模拟物以实现氨基酸侧链的基本元件的类似的空间取向,如Johnson等人,1993中讨论。
如上文描述,本发明的CopB多肽片段(例如,SEQ ID Nos:1-4)可尤其用作免疫原。通过化学合成或者重组表达方法学产生的片段为多肽,其具有的氨基酸序列与所述氨基酸序列的部分但不是所有序列完全相同。该片段可以含有例如,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的至少7个或多个(例如,7、8、10、12、14、16、18、20或更多)连续的氨基酸。片段可以是“独立的”或者包含在更大的多肽中,这些片段形成该多肽的部分或者区域,最优选地作为单一的连续区域。在一个实施方案中,所述片段含有成熟CopB多肽序列的表位结构域(例如,SEQ ID NO:1)。在某些实施方案中,本发明涉及含有许多共价连接的CopB表位片段的组合物和使用方法。由于CopB表位结构域的小尺寸,考虑单个片段不总是提供最佳的免疫原性。从而,在某些实施方案中,本发明提供了重组CopB多肽,其含有不同CopB株系的串联(即,许多)CopB表位片段,这些片段由一些copB基因的适宜的表位区域的基因融合表达。从而,许多或者串联CopB表位片段是任何数目和/或任何顺序的CopB表位片段,这些片段连接在一起或者连接到载体蛋白。在优选实施方案中,含有许多CopB表位片段的重组多肽包括来自血清组I、血清组II和血清组III(例如,SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)的至少一种CopB的表位结构域。在另一优选实施方案中,含有许多CopB表位片段的重组多肽包括来自血清组I、血清组II和血清组IV的至少一种CopB的表位结构域。在再一个实施方案中,含有许多CopB表位片段的重组多肽包括来自血清组I、血清组II、血清组III和血清组IV的至少一种CopB的表位结构域。
因此,可以工程化这些串联分子以保持连接点处的适当结构并且足够大而具有免疫原性和表达与广谱卡他莫拉氏菌株系交叉反应的一群表位。备选地,通过化学方法可以将个别重组产生的或者合成的片段连接而形成许多共价连接的片段。
B.卡他莫拉氏菌多核苷酸
考虑本发明的分离和纯化的卡他莫拉氏菌多核苷酸用于产生CopB多肽和多肽片段。更具体地,在某些实施方案中,所述多核苷酸编码CopB多肽片段或者融合多肽,尤其是SEQ ID Nos:1-4的CopB表位。
在特定实施方案中,本发明的多核苷酸是DNA分子,其中该DNA可以是基因组DNA、染色体DNA、质粒DNA或者cDNA。在优选实施方案中,本发明的多核苷酸是重组多核苷酸,其编码CopB多肽(例如,CopB表位结构域)。在优选实施方案中,编码CopB多肽的多核苷酸包含在质粒载体中并在原核宿主细胞中表达。
如下文中所用的术语“多核苷酸”指通过磷酸二酯键连接的核苷酸序列。下文中给出的多核苷酸为5’到3’方向。本发明的多核苷酸可以含有约10到约数十万碱基对。优选地,多核苷酸含有约10到约3,000碱基对。具体核苷酸的优选长度在下文中给出。
本发明的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子、核糖核酸(RNA)分子、或者使用核苷酸类似物产生的DNA或者RNA的类似物。该核酸分子可以是单链或者双链的,但是优选为双链DNA。当多核苷酸为DNA分子时,该分子可以是基因、cDNA分子或者基因组DNA分子。核苷酸碱基在下文中通过单字母代码表示:腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C)、次黄嘌呤(I)和尿嘧啶(U)。
“分离的”指通过“人的手”从天然状态改变的。“分离的”组分或者物质是已经受到改变或者从其最初环境除去或者同时改变和从其最初环境除去的组分或者物质。例如,天然存在于动物中的多核苷酸或者多肽不是“分离的”。但是,从其天然状态的共存物质分开的相同多核苷酸或者多肽是“分离的”,如该术语在下文中所用的。
优选地,“分离的”多核苷酸没有这样的序列,所述序列是该核酸所来源的生物的基因组DNA中该核酸天然的侧翼序列(即,位于该核酸的5’和3’末端)。例如,在多种实施方案中,经分离的CopB核酸分子可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列,这些序列天然位于该核酸所来源的细胞的基因组DNA的核酸分子的侧翼。然而,CopB核酸分子可以与其他蛋白质编码或者调节序列融合并仍然认为其是分离的。
使用标准克隆和筛选技术从来源于mRNA的cDNA文库得到本发明的CopB多核苷酸。本发明的多核苷酸还从天然来源,如基因组DNA文库(例如,卡他莫拉氏菌文库)得到或者使用众所周知的和通过商业途径可得到的技术合成。
使用本领域中众所周知的方法容易鉴定CopB多核苷酸的直向同源物和等位基因变体。所述多核苷酸的等位基因变体和直向同源物含有核苷酸序列,该核苷酸序列与SEQ ID NOs:1-4中所示的核苷酸序列,或者这些核苷酸序列的片段具有通常至少约70-75%,更通常至少约80-85%,最通常至少约90-95%或者更高同源性。将这些核酸分子容易地鉴定为能够优选在严格条件下与SEQ ID NOs:1-4中所示的核苷酸序列,或者这些核苷酸序列的片段杂交。
在某些优选的实施方案中,本发明的多核苷酸仅含有CopB多核苷酸或者基因的编码区的片段,如编码CopB表位结构域的片段,例如,具有SEQ ID NOs:1-4之一的氨基酸序列的多肽片段。
当本发明的CopB多核苷酸用于CopB多肽或者多肽片段的重组产生时,该多核苷酸可以包括成熟多肽自身的编码序列,或者与其他编码序列处于读框中的成熟多肽的编码序列,所述其他编码序列为诸如编码前导序列或者分泌序列、前蛋白质序列、原蛋白质序列、前原蛋白质序列,或者其他融合肽部分的那些编码序列。例如,方便融合多肽的纯化的标记序列可以与编码序列相连(见,Gentz等人,1989,下文将其完整引用作为参考)。从而,本发明预期制备编码允许表达产物的His-标记纯化的融合多肽的多核苷酸。该多核苷酸可以还含有非编码5’和3’序列,如经转录的、未翻译序列、剪接和多腺苷酸化信号。
得到本发明的编码CopB多肽的多核苷酸,包括来自不同于卡他莫拉氏菌的其他物种的同系物和直向同源物,所使用的方法包括在严格杂交条件(下文讨论)下用具有编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的多肽的多核苷酸序列或者其片段的标记探针筛选适宜的文库;并分离含有所述核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。这些杂交技术是技术人员众所周知的。技术人员将明白,在许多情况中,分离的cDNA序列将是不完全的,因为编码该多肽的区域在cDNA的5’末端切断。这是逆转录酶的结果,逆转录酶是具有内在低“持续合成能力”(酶在聚合反应期间保持结合模板的能力的量度)的一种酶,其在第一链cDNA合成期间不能完成mRNA模板的DNA拷贝。
从而,在某些实施方案中,本发明提供的多肽序列信息(即SEQ IDNOs:1-4)允许制备相对短的DNA(或者RNA)寡核苷酸序列,其具有与下文中公开的所选的多核苷酸的基因序列特异杂交的能力。如下文中所用的术语“寡核苷酸”被定义为两个或多个脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸,通常多于三(3)个,通常多于十(10)个,多达一百(100)或者更多(尽管优选20到30之间)。确切的大小将取决于许多因素,这些因素又取决于寡核苷酸的最终功能或者用途。从而,在本发明的特定实施方案中,基于所选核苷酸序列的考虑制备了适宜长度的核酸探针。这些核酸探针与编码CopB多肽的多核苷酸特异杂交的能力导致所述探针尤其应用于多种实施方案中。最重要地,所述探针用于多种测定法中以检测给定样品中互补序列的存在。
在某些实施方案中,优选地使用寡核苷酸引物。这些引物可以以任何方式产生,所述方式包括化学合成、DNA复制、逆转录,或者它们的组合。使用本发明的多核苷酸设计这些引物的序列,其用于使用聚合酶链式反应(PCR)技术从原核细胞检测、扩增或者突变编码CopB多肽的CopB多核苷酸的确定片段。
在某些实施方案中,有利地是使用本发明的多核苷酸与用于检测杂交体形成的适宜的标记的联合。多种适宜的标记是本领域中公知的,包括放射性、酶或者其他配体,如抗生物素蛋白/生物素,这些际记能够给出可检测信号。
与编码SEQ ID NOs:1-4的多肽片段的核苷酸序列相同或者足够相同的多核苷酸可用作cDNA和基因组DNA的杂交探针或者作为核酸扩增(PCR)反应的引物,以分离编码本发明的多肽的全长cDNA和基因组克隆和分离与编码SEQ ID NOs:1-4的序列的多肽片段的多核苷酸具有高度序列相似性的其他基因(包括编码来自与卡他莫拉氏菌不同的物种的同系物和直向同源物(ortholog)的基因)的cDNA和基因组克隆。通常,这些核苷酸序列与参比核苷酸序列具有至少约70%同一性到至少约95%同一性。该探针或者引物将通常含有至少15个核苷酸,并且可以具有至少18、21、24、30、40、或50个核苷酸。尤其优选的探针将具有15到50个核苷酸。
本领域中若干种可利用的并且技术人员众所周知的方法可以用于得到全长cDNA,或者延伸短cDNA,例如,基于cDNA末端快速扩增(RACE)(见,Frohman等人,1988)的方法的那些方法。该技术的最近改良方法,例如MarathonTM技术(BD BiosciencesClontech,Palo Alto,CA)已经极大地简化了较长cDNA的搜寻。
为了提供根据本发明的优点,用于杂交研究或者测定法的优选的核酸序列包括探针分子,其与编码SEQ ID NO:1-4的多肽的多核苷酸的至少10到约18个核苷酸长的一段序列互补。至少10个核苷酸长的大小有助于确保该片段足够长以形成稳定且具有选择性的双链体分子。然而,为了增加杂交分子的稳定性和选择性,从而提高所得特异杂交体分子的质量和程度,通常优选具有长度大于10个碱基的互补序列的分子。例如,通过化学方法直接合成片段,通过应用核酸扩增技术,如PCR技术(美国专利4,683,202,下文将其引用作为参考)或者通过从含有适宜的插入片段和适宜的限制酶位点的重组质粒切割所选的DNA片段容易地制备所述片段。
另一方面,本发明预期含有与编码SEQ ID NO:1-4的多肽的多核苷酸的至少10个连续碱基的片段相同或者互补的核苷酸序列的经分离和纯化的多核苷酸,其中该多核苷酸与编码含有CopB表位结构域的CopB多肽的多核苷酸杂交。
之所以使用本发明的多核苷酸探针分子是因为其能够与基因的互补序列选择性形成双链体分子。根据所预见的应用,将希望使用杂交严格性的不同条件实现所述探针与靶序列的不同程度的选择性(见下表3)。对于需要高度选择性的应用,将通常希望使用相对严格的条件形成杂交体分子。对于某些应用,例如,当希望使用与潜在模板杂交的突变引物链制备突变体的时候或者从其他细胞分离同源多肽编码序列、功能等价物等等时,通常需要较不严格的杂交条件以形成异源双链体(见表3)。从而,可以关于对照杂交将交叉杂交物种容易地鉴定为阳性杂交信号。在任一情况中,通常希望通过加入增量甲酰胺使得条件更严格,甲酰胺用于与升温相同的方式使杂交体双链体去稳定。从而,可容易地控制杂交条件,并且根据所希望的结果,杂交条件将通常是可以选择的方法。
本发明还包括在低严格条件下、更优选严格条件下、最优选高严格条件下能够与下文中描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。严格条件的实例在下表3中显示:高严格条件是至少与例如条件A-F一样严格的条件;严格条件是至少与例如条件G-L一样严格的条件;低严格条件是至少与例如条件M-R一样严格的条件。
表3
杂交严格条件
严格条件 | 多核苷酸杂种 | 杂交体长度(bp)1 | 杂交温度和缓冲液H | 洗涤温度和缓冲液H |
A | DNA:DNA | >50 | 65℃;1×SSC-或-42℃;1×SSC,50%甲酰胺 | 65℃;0.3×SSC |
B | DNA:DNA | <50 | TB;1×SSC | TB;1×SSC |
C | DNA:RNA | >50 | 67℃;1×SSC-或-45℃;1×SSC,50%甲酰胺 | 67℃;0.3×SSC |
D | DNA:RNA | <50 | TD;1×SSC | TD;1×SSC |
E | RNA:RNA | >50 | 70℃;1×SSC-或-50℃;1×SSC,50%甲酰胺 | 70℃;0.3×SSC |
F | RNA:RNA | <50 | TF;1×SSC | TF;1×SSC |
G | DNA:DNA | >50 | 65℃;4×SSC-或-42℃;4×SSC,50%甲酰胺 | 65℃;1×SSC |
H | DNA:DNA | <50 | TH;4×SSC | TH;4×SSC |
I | DNA:RNA | >50 | 67℃;4×SSC-或-45℃;4×SSC,50%甲酰胺 | 67℃:1×SSC |
J | DNA:RNA | <50 | TJ;4×SSC | TJ;4×SSC |
K | RNA:RNA | >50 | 70℃;4×SSC-或-50℃;4×SSC,50%甲酰胺 | 67℃;1×SSC |
L | RNA:RNA | <50 | TL;2×SSC | TL;2×SSC |
严格条件 | 多核苷酸杂种 | 杂交体长度(bp)1 | 杂交温度和缓冲液H | 洗涤温度和缓冲液H |
M | DNA:DNA | >50 | 50℃;4×SSC-或-40℃;6×SSC,50%甲酰胺 | 50℃;2×SSC |
N | DNA:DNA | <50 | TN;6×SSC | TN;6×SSC |
O | DNA:RNA | >50 | 55℃;4×SSC-或42℃;6×SSC,50%甲酰胺 | 55℃;2×SSC |
P | DNA:RNA | <50 | TP;6×SSC | TP;6×SSC |
Q | RNA:RNA | >50 | 60℃;4×SSC-或-45℃;6×SSC,50%甲酰胺 | 60℃;2×SSC |
R | RNA:RNA | <50 | TR;4×SSC | TR;4×SSC |
(bp)1:杂交体长度为杂交多核苷酸的杂交区域所预期的。当多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时,假定杂交体长度为杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸杂交时,通过多核苷酸的序列比对并鉴定最优序列互补性的一个或多个区域来确定杂交体长度。
缓冲液H:杂交和洗涤缓冲液中,SSPE(1×SSPE是0.15M NaCl,10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA,pH7.4)可以由SSC(1xSSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)代替;杂交完成后进行15分钟洗涤。
TB到TR:预期长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度比该杂交体的解链温度(Tm)低5-10℃,其中根据下面的等式确定Tm。对于长度小于18个碱基对的杂交体,Tm(℃)=2(A+T碱基的数目)+4(G+C碱基的数目)。对于长度为18到49个碱基对的杂交体,Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N),其中N是杂交体中的碱基数,[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1×SSC的[Na+]=0.165M)。
多核苷酸杂交的严格条件的额外实例在Sam brook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor, NY,第9和11章,和Ausubel等人,1995,Current Protocols in Molecular Biology,编者,John Wiley& Sons,Inc.,2.10和6.3-6节中提供,下文中引用这些参考文献作为参考。
C.重组表达载体和宿主细胞
在另一实施方案中,本发明提供了含有编码卡他莫拉氏菌CopB多肽的多核苷酸的表达载体。优选地,本发明的表达载体含有编码含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CopB多肽的多核苷酸。更优选地,本发明的表达载体含有与增强子-启动子可操作连接的多核苷酸。在某些实施方案中,本发明的表达载体含有与原核启动子可操作连接的多核苷酸。
本文中所用术语“载体”指一种核酸分子,其能够运输其所连接的另一核酸。一种类型的载体是“质粒”,其指环状双链DNA环,其他DNA片段可以连接到所述环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体,其中其他DNA片段可以连接到该病毒基因组中。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制原点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如,非附加型哺乳动物载体)当导入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组,从而随着宿主基因组一起复制。此外,某些载体能够指导与它们可操作连接的基因的表达。这些载体在本文中称作“表达载体”。通常,在重组DNA技术中所用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可以互换使用,因为质粒是最常用的载体形式。然而,本发明计划包括其他形式的表达载体,如病毒载体(例如,复制缺陷的逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒),它们具有等价功能。
最通常在大肠杆菌中进行原核生物中蛋白质的表达,使用含有组成性或者可诱导的启动子的载体,所述启动子指导融合或者非融合蛋白质的表达。融合载体将许多氨基酸加到其所编码的蛋白质,加到该重组蛋白的氨基或者羧基末端。这些融合载体通常具有三个目的:1)增加重组蛋白的表达;2)增加重组蛋白的溶解性;和3)通过作为亲和纯化中的配体帮助该重组蛋白的纯化。通常,在融合表达载体中,蛋白水解切割位点在融合部分和重组蛋白的连接处导入以便在纯化融合蛋白后将重组蛋白与融合部分分开。这些酶、和它们的同源识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。
通常的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith和Johnson,1988)、pMAL(New England Biolabs,Beverly;MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ),它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白,或者蛋白A与靶标重组蛋白融合。
在一个实施方案中,CopB基因的编码序列(例如,编码具有CopB表位结构域的多肽的多核苷酸)克隆到pGEX表达载体以产生编码融合蛋白的载体,该融合蛋白从N末端到C末端含有GST-凝血酶切割位点-CopB多肽。通过亲和层析使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化该融合蛋白。通过用凝血酶切割该融合蛋白可以回收不与GST融合的重组CopB多肽。
适宜的可诱导的非-融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人,1988)和pETIId(Studier等人,1990)。pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂交体trp-lac融合启动子的转录。pET IId载体的靶基因表达取决于共表达的病毒RNA聚合酶T7gnl介导的从T7gn1β-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主株系BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)中的驻留原噬菌体提供,该原噬菌体含有处于lacUV 5启动子的转录控制下的T7gnl基因。
最大化大肠杆菌中重组蛋白质表达的一种策略是在蛋白水解切割重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达该蛋白质。另一种策略是改变将要插入表达载体中的核酸的核酸序列,从而每种氨基酸的个别密码子是在大肠杆菌中优先利用的密码子。通过标准DNA诱变或者合成技术实施本发明的核酸序列的这种改变。
启动子是转录开始的位点(即,转录起始点)前面(上游)的通常约100个核苷酸对以内的DNA分子区域。该区域通常含有几种类型的DNA序列元件,所述元件位于不同基因中相似的相对位置中。本文中所用术语“启动子”包括本领域中所称作的上游启动子区,启动子区或者概括性的真核RNA聚合酶II转录单位的启动子。
另一种类型的离散转录调节序列元件是增强子。增强子提供了特定编码区(例如,基因)的时间、位置和表达水平的特异性。增强子的一个主要功能是增加含有与该增强子结合的一种或多种转录因子的细胞中编码序列的转录水平。不像启动子,当增强子位于距离起始位点的不同距离时,只要存在启动子,增强子就可以发挥功能。
本文中所用的短语“增强子-启动子”指含有增强子和启动子元件的复合单位。增强子-启动子与编码至少一种基因产物的编码序列可操作连接。本文中所用短语“可操作连接”指增强子-启动子与编码序列以如此方式连接使得编码序列的转录受到该增强子-启动子的控制和调节。将增强子-启动子可操作连接到编码序列的方法是本领域中众所周知的。如本领域中众所周知的,相对于转录受到控制的编码序列的精确取向和定位取决于增强子-启动子的特定性质。从而,TATA盒最小启动子通常位于转录起始位点上游约25到约30个碱基对,上游启动子元件通常位于转录起始位点上游约100到约200个碱基对。相比,增强子可以位于起始位点的下游并且可以与该位点的距离相当大。
本发明的经转染的细胞也可以用于引起抗体产生或者免疫人和动物抵抗病原。所植入的转染细胞可用于递送免疫抗原,其刺激宿主的细胞和体液免疫应答。可以设计这些免疫应答以保护宿主免于卡他莫拉氏菌感染(即,用于免疫),刺激和增强针对正发生的感染的疾病抵抗能力,或者产生针对受转染的细胞体内产生的抗原的抗体,所述受转染的细胞可用于治疗或诊断目的。可以用可除去的屏障装置允许以简单的方法结束对抗原的暴露。备选地,可以用将最终被排斥的细胞(异种或者同种异体的转染细胞)限制对抗原的暴露,因为当细胞已经被排斥时抗原产生将停止。
本发明的另一方面涉及本发明的重组表达载体已经导入的宿主细胞。术语“宿主细胞”、“基因工程化宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。可以理解这些术语不仅指具体的受试细胞而且指这种细胞的后代或者潜在后代。因为由于突变或者环境影响,在连续世代中可以发生某些修饰,这些后代可以实际上不与亲代细胞相同,但是仍然包括在此处所用的术语的范围内。宿主细胞可以是任何原核或者真核细胞。例如,CopB多肽表位结构域可以在细菌细胞如大肠杆菌、卡他莫拉氏菌、昆虫细胞(如Sf9或Sf21细胞)、酵母(如酿酒酵母)或者哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NIH3T3、PER.C6、NSO或COS细胞)中表达。其他适宜的宿主细胞是本领域中技术人员公知的。
通过常规转化、感染或者转染技术可以将载体DNA导入原核或者真核细胞中。本文中所用的术语“转化”、“感染”、和“转染”旨在指用于将外来核酸(例如,DNA)导入宿主细胞的多种本领域中公知的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染、感染或者电穿孔。用于转化、感染或者转染宿主细胞的适宜的方法可以在Sambrook,等人(″Molecular Cloning:ALaboratory Manual″第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)和其他实验室手册中发现。
本发明的宿主细胞,如培养中的原核或者真核宿主细胞,可用于产生(即,表达)CopB多肽。因此,本发明还提供了使用本发明的宿主细胞产生CopB多肽的方法。在一个实施方案中,该方法包括在适宜的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已经导入编码多肽的重组表达载体)直到产生CopB多肽。在另一实施方案中,该方法还包括从培养基或者宿主细胞分离该CopB多肽。
表达载体的编码序列与转录终止区可操作连接。RNA聚合酶转录编码DNA序列直到发生多腺苷酸化的位点。通常,位于多腺苷酸化位点下游几百个碱基对的DNA序列用于终止转录。那些DNA序列在此处被称为转录终止区。那些区域是转录的信使RNA(mRNA)的有效多腺苷酸化所需的。转录终止区是本领域中众所周知的。用于本发明的载体构建体中的优选的转录终止区含有SV40或者鱼精蛋白基因的多腺苷酸化信号。也适宜使用bGH多腺苷酸化信号。
表达载体含有编码CopB多肽(即,CopB表位结构域)的多核苷酸。这种多肽旨在包括具有编码Cop多肽的核苷酸碱基序列,其具有足够长度而可以将所述片段与编码非-CopB多肽的多核苷酸片段区分。本发明的多肽还可以编码具有变异的氨基酸序列的具有生物学功能的多肽或者CopB多肽,所述具有变异的氨基酸序列为诸如基于诸如基于交换的氨基酸的相对亲水得分的考虑而选择的改变的氨基酸序列。这些变异序列为从天然来源分离或者使用诱变方法如定点诱变在本文中公开的序列中诱导的那些序列。
通过本领域中众所周知的许多技术可以将本发明的DNA分子、基因或者多核苷酸掺入到载体中。例如,已经表明载体pUC18尤其具有价值。同样,相关载体M13mp18和M13mp19可用于本发明的某些实施方案中,尤其用于实施双脱氧测序。
本发明的表达载体可用作制备大量编码CopB多肽自身的DNA方法,还可用作制备所编码的多肽的方法。考虑当通过重组方法产生本发明的CopB多肽时,可以利用原核或者真核表达载体作为穿梭系统。
在再一个实施方案中,本发明提供了用编码CopB多肽的多核苷酸转化、感染或者转染的重组宿主细胞。优选地,本发明的该重组宿主细胞受到编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的CopB多肽表位结构域的多核苷酸的转染。用外源多核苷酸如DNA分子转化或者转染细胞的方法是本领域中众所周知的并且包括技术诸如磷酸钙-或者DEAE葡聚糖介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导的转染、直接微注射和腺病毒感染(Sam brook,Fritsch和Maniatis,1989)。
最广泛使用的方法是磷酸钙或者DEAE-葡聚糖介导的转染。尽管其机理仍不清楚,但是认为经转染的DNA通过内吞进入细胞的细胞质并被运输到细胞核。根据细胞类型,任何一次可以转染所培养的细胞群体的高达90%。因为其高效率,磷酸钙或者DEAE-葡聚糖介导的转染是需要在大量细胞中瞬时表达外来DNA的实验所选择的方法。磷酸钙介导的转染还可用于建立细胞系,所述细胞系整合外来DNA拷贝,所述拷贝通常以头尾串联排列在宿主细胞基因组。
在原生质体融合方法中,来源于细菌的携带大量目的质粒拷贝的原生质体与经培养的哺乳动物细胞直接混合。细胞膜融合(通常用聚乙二醇)后,细菌的内容物递送到哺乳动物细胞的细胞质并且质粒DNA被运输到细胞核中。原生质体融合没有通常用于瞬时表达分析的许多细胞系的转染有效,但是对于DNA的内吞低效发生的细胞系,原生质体融合是有用的。原生质体融合通常产生质粒DNA的多份拷贝,它们串联整合到宿主染色体。
对许多哺乳动物和植物细胞应用短暂的高电压电脉冲导致在原生质膜中形成纳米大小的孔。DNA通过这些孔直接被摄入细胞胞质或者由于伴随着孔的关闭的膜组分的再分布而被摄入细胞胞质。电穿孔可以非常有效并且可用于所克隆基因的瞬时表达和建立携带目标基因的整合拷贝的细胞系。电穿孔与磷酸钙介导的转染和原生质体融合相比,通常产生携带外来DNA的一份,或者最多几份整合拷贝的细胞系。
脂质体转染包括将DNA和RNA包裹在脂质体中,然后将该脂质体与细胞膜融合。DNA是怎样递送到细胞中的机理还不清楚,但是转染效率可以高达90%。
DNA分子向细胞核的直接微注射具有不将DNA暴露于细胞隔室如低pH内体的优点。因此微注射主要用作建立携带目标DNA的整合拷贝的细胞的细胞系的方法。
使用腺病毒作为细胞转染的载体是本领域中众所周知的。已经在多种细胞报导了腺病毒载体-介导的细胞转染(Stratford-Perricaudet等人,1992)。
在优选实施方案中,本发明的重组宿主细胞是原核宿主细胞。优选地,本发明的重组宿主细胞是大肠杆菌的DH5α株系的细菌细胞。通常,优选用原核细胞启动DNA序列的克隆和用于本发明的载体的构建。例如,大肠杆菌K12株系尤其有用。可以使用的其他微生物株系包括大肠杆菌B和大肠杆菌x1976(ATVC No.31537)。当然,这些实例旨在阐明而不是限制。
原核生物也可用于表达。还可以使用前面提到的株系,以及大肠杆菌W3110(ATCC No.273325)、芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或者其他肠杆菌科如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)或者Serratia marcesans,和多种假单胞菌种。
通常,含有复制子和来源于与宿主细胞相容的物种的控制序列的质粒载体与这些宿主连用。该载体通常携带复制位点,以及能够提供转化细胞中表型选择的标记序列。例如,用pBR322转化大肠杆菌,pBR322是来源于大肠杆菌种的质粒(Bolivar等人,1977)。pBR322含有氨苄西林和四环素抗性基因,从而提供了鉴定所转化细胞的简单方法。pBR质粒、或者其他微生物质粒或者噬菌体必须也含有,或者经修饰而含有启动子,所述启动子可以被微生物利用而表达其自己的多肽。
最通常用于重组DNA构建的那些启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等人,1978;Itakura等人,1977;Goeddel等人,1979;Goeddel等人,1980)和色氨酸(TRP)启动子系统(欧洲申请号EP 0036776;Siebwenlist等人,1980)。尽管这些启动子是最通常使用的,但是已经发现并利用了其他微生物启动子,关于它们的核苷酸序列的细节已经出版,使得技术人员可以将功能启动子导入质粒载体中(Siebwenlist等人,1980)。
转染后,将细胞在培养条件下保持足够时间以表达CopB多肽。培养条件是本领域中众所周知的并且包括离子组分和浓度、温度、pH等。通常,将转化细胞保持在培养基中的培养条件下。多种细胞类型的适宜培养基是本领域中众所周知的。在优选实施方案中,温度为约2O℃到约50℃,更优选约30℃到约40℃,甚至更优选约37℃。
pH值优选为约6.0到约8.0,更优选约6.8到约7.8,最优选约7.4。摩尔渗透压浓度优选为约200毫渗透摩尔/升(mosm/L)到约400mosm/L。转染和表达所编码的多肽的所需的其他生物学条件是本领域中众所周知的。
将转染的细胞保持足够时间以表达CopB多肽。适宜的时间取决于所用的细胞类型并且可以容易地由技术人员确定。通常,保持时间为约2到约14天。
从转染的细胞或者那些细胞在其中培养的培养基回收或者收集重组CopB多肽。回收包括分离和纯化CopB多肽。多肽的分离和纯化技术是本领域中众所周知的并且包括诸如沉淀、过滤、层析、电泳等步骤。
D.与CopB表位免疫反应的抗体
在再一实施方案中,本发明提供了与CopB表位结构域免疫反应的抗体。在一个实施方案中,本发明的抗体是单克隆抗体。在另一实施方案中,发明的抗体是多克隆抗体。此外,CopB多肽是含有表位结构域的CopB多肽片段,所述表位结构域含有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。制备和表征抗体的方法是本领域中众所周知的(见,例如,Antibodies″ALaboratory Manual″,E.Harlow和D.Lane,Cold Spring HarborLaboratory,1988)。
简言之,通过用含有本发明的多肽或者多核苷酸的免疫原免疫动物,并从该免疫的动物收集抗血清制备多克隆抗体。许多动物种类可用于产生抗血清。通常,用于产生抗-抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠或者豚鼠。因为兔的相对大的血液体积,兔是产生多克隆抗体的优选选择。
如本领域中众所周知的,给定的多肽或者多核苷酸的免疫原性可以改变。因此通常必须将本发明的免疫原(例如,多肽或者多核苷酸)与载体偶联。代表性和优选的载体是CRM197、匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或者兔血清白蛋白也可以用作载体。
将多肽或者多核苷酸缀合到载体蛋白的方法是本领域中众所周知的并且包括戊二醛、间-maleimidobencoyl-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和二-biazotized联苯胺。
用于产生多克隆抗体的免疫原的量随着免疫原的性质以及用于免疫的动物而变。可以用多种途径施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。通过免疫后在多个点采集免疫动物的血液监视多克隆抗体的产生。当得到所希望的免疫原性水平时,可以对经免疫的动物取血并分离和保存血清。
另一方面,本发明考虑产生与CopB多肽免疫反应的抗体的方法,该方法包括步骤:(a)用编码CopB多肽的多核苷酸转染重组宿主细胞;(b)在足够表达该多肽的条件下培养所述宿主细胞;(c)回收所述多肽;和(d)制备针对所述多肽的抗体。优选地,用编码SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的CopB表位结构域的多核苷酸转染宿主细胞。甚至更优选地,本发明提供了根据上述方法制备的抗体。
使用众所周知的技术如美国专利4,196,265(下文中引用其作为参考)中例证的那些技术可以容易地制备本发明的单克隆抗体。通常,该技术包括首先用所选抗原(例如,本发明的多肽或者多核苷酸)以足够提供免疫应答的方式免疫适宜的动物。啮齿类动物,如小鼠和大鼠,是优选的动物。然后用永生化骨髓瘤细胞与来自免疫动物的脾细胞融合。当受免疫的动物是小鼠时,优选骨髓瘤细胞是鼠NS-1骨髓瘤细胞。
将所融合的脾/骨髓瘤细胞在选择性培养基中培养以选择来自亲代细胞的融合的脾/骨髓瘤细胞。例如,通过加入阻断组织培养基中核苷酸的从头合成的试剂将融合细胞与未融合的亲代细胞的混合物分离。代表性和优选的试剂是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成,而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或者氨甲蝶呤时,向培养基补加次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源。当使用重氮丝氨酸时,向培养基补加次黄嘌呤。
该培养提供了一群杂交瘤,可以从它们选择特异杂交瘤。通常,通过将单个克隆在微量滴定板中稀释,然后用单个克隆的上清液试验与抗原多肽的反应性进行杂交瘤的选择。然后无限增殖所选择的克隆以提供单克隆抗体。
通过使用本发明的单克隆抗体,将本发明的特定多肽和多核苷酸鉴定为抗原。一旦鉴定,通过诸如抗体-亲和层析的技术分离和纯化那些多肽和多核苷酸。在抗体-亲和层析中,单克隆抗体与固态基质结合并暴露于含有所希望的抗原的溶液。通过与所结合抗体的免疫特异反应从溶液除去抗原。然后从基质容易地除去所述多肽或者多核苷酸并将其纯化。
此外,尤其用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以在例如,美国专利5,223,409;国际申请WO92/18619;国际申请WO 91/17271;国际申请WO 92/20791;国际申请92/15679;国际申请WO 93/01288;国际申请WO 92/01047;国际申请WO 92/09690;国际申请WO 90/02809中发现。
此外本发明包括重组抗-CopB抗体,如含有人和非人片段的嵌合和人源化的单克隆抗体,其可以使用标准重组DNA技术产生。通过本领域中公知的重组DNA技术可以产生这些嵌合和人源化单克隆抗体,例如,使用国际申请PCT/US86/02269;国际申请EP 184,187;国际申请EP 171,496;国际申请EP 173,494;国际申请WO 86/01533;美国专利4,816,567;和国际申请EP 125,023中描述的方法。
通过标准技术,如亲和层析或者免疫沉淀用抗-CopB抗体(例如,单克隆抗体)分离CopB多肽。抗-CopB抗体方便了Cop多肽从细胞的纯化和宿主细胞中表达的重组产生的CopB多肽的纯化。此外,用抗-CopB抗体检测CopB多肽(例如,细胞裂解物或者细胞上清液中)以便评估CopB多肽的丰度。抗-CopB抗体可诊断性地用于作为临床试验方法的一部分监视组织中蛋白质水平,例如,以确定给定辅助方案的功效。通过将抗体与可检测的物质偶联(例如,物理连接)以方便检测。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、和放射性物质。适宜的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶、或者乙酰胆碱酯酶;适宜的辅基复合体的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素;适宜的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、dichlorotriazinylarnine荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白;发光物质的实例包括鲁米诺;生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母发光蛋白,适宜的放射性物质的实例包括125I、131I、15S或3H。
E.免疫原性组合物和药物组合物
在某些优选实施方案中,本发明提供了CopB免疫原性和药物组合物,其含有CopB多肽片段(即,CopB表位结构域免疫原)和生理学上可接受的载体。更优选地,该免疫原性和药物组合物含有具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CopB多肽片段。在优选实施方案中,免疫原性组合物含有包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的氨基酸序列的至少三种表位结构域。在其他实施方案中,本发明的药物组合物含有编码CopB多肽表位结构域的多核苷酸,和生理学上可接受的载体。
CopB表位片段掺入到适于施用于哺乳动物受试者,例如,人的药物组合物和免疫原性组合物。这些组合物通常含有“活性”组合物和药学上可接受的载体。如下文中所用的,术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物使用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂,等等。对药学活性物质使用这些介质和试剂是本领域中众所周知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂之外,这些介质可用于本发明的组合物。也可以向所述组合物掺入补充性活性化合物。
配制本发明的药物组合物或者免疫原性组合物使得其与其计划的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外(例如,静脉内、皮内、皮下、肌内、腹膜内)、粘膜(例如,经口、直肠、鼻内、颊、阴道、呼吸)和透皮(局部)。用于肠胃外、皮内或者皮下应用的溶液或者悬浮液可以包括下面的组分:无菌稀释液,如注射用水、盐溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他合成溶剂;抗细菌剂,如苯甲醇或者甲基对羟基苯甲酸酯;抗氧化剂,如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠;螯合剂,如乙二胺四乙酸;缓冲剂,如乙酸盐、柠檬酸盐或者磷酸盐和用于调节张力的试剂,如氯化钠或者右旋糖。可以用酸或者碱,如盐酸或者氢氧化钠调节pH。可以将肠胃外制剂密封在玻璃或者塑料制造的安瓿、一次性注射器或者多剂量小瓶中。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(水可溶时)或者分散剂和无菌粉剂,其用于临时制备无菌可注射溶液或者分散剂。对于静脉内施用,适宜的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或者磷酸缓冲盐溶液(PBS)。在所有情况中,该组合物必须是无菌的并且是可以容易通过注射器施用的液体。该组合物必须在生产和保存条件下是稳定的并且保存时必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体是溶剂或者分散介质,其含有,例如,水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇,和液态聚乙二醇,等等),和它们的适宜的混合物。通过使用包衣如卵磷脂,对于分散剂通过保持所需的颗粒大小,和通过使用表面活性剂保持适当的流动性。通过多种抗细菌和抗真菌剂,例如,对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞,等等实现防止微生物的作用。在许多情况下,组合物优选包括等渗剂,例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇和氯化钠。在组合物中包含延缓吸收的试剂,例如,单硬脂酸铝和明胶致使可主射组合物的吸收延长。
通过将活性化合物(例如,CopB表位结构域)以所需要的量与上面列举的成分的之一或者组合(如果需要)掺入溶剂中,然后通过过滤除菌制备无菌可注射溶液。通常通过将活性化合物和所需要的来自上面所列举的成分的其他成分掺入含有基本分散介质的无菌载体制备分散剂。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂,制剂的优选方法是真空干燥和冷冻干燥,其产生活性成分与来自其前面无菌过滤溶液的任何额外的所需要的成分的粉末。
经口组合物通常包括惰性稀释剂或者可食用的载体。可以将它们密封在明胶胶囊或者压缩成片剂。对于经口治疗施用,将活性化合物掺入赋形剂并以片剂、锭剂或者胶囊剂的形式使用。使用液态载体还制备了用作漱口水的经口组合物,其中液体中的化合物经口应用、漱口并吐出或者吞下。可以包括药学上相容的结合剂,和/或佐剂物质作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有下面的成分,或者具有相似性质的化合物的任一种:结合剂,如微晶纤维素、西黄蓍胶或者明胶;赋形剂,如淀粉或者乳糖;崩解剂,如藻酸、Primogel、或者玉米淀粉;润滑剂,如硬脂酸镁或者Sterotes;助流剂,如胶态二氧化硅;增甜剂,如蔗糖或者糖精;或者调味剂,如薄荷、水杨酸甲酯或者桔子香料。
对于通过吸入施用,将化合物以气溶胶喷雾的形式递送,该喷雾来自含有适宜的推进剂,例如,气体,如二氧化碳的压缩的容器或者分配器或者雾化器。系统施用也可以通过粘膜或者透皮方式。对于粘膜或者透皮施用,制剂中施用适于渗透屏障的渗透剂。这些渗透剂是本领域中公知的,并且包括,例如,对于粘膜施用,为去污剂、胆汁盐、和梭链孢酸衍生物。通过使用鼻喷雾或者栓剂实现粘膜施用。时于透皮施用,将活性化合物配制成本领域中公知的软膏剂、药膏剂、凝胶剂或者霜剂。
还将化合物制备成栓剂(例如,用常规栓剂基质,如可可脂和其他甘油酯)或者保留灌肠用于直肠递送。
在一个实施方案中,将活性化合物与载体制备,所述载体将保护该化合物防止从身体快速清除,如控释制剂,包括植入物和微胶囊化递送系统。
可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物,如乙烯-乙酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。这些制剂的制备方法对于本领域中技术人员是显而易见的。还从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc通过商业途径得到材料。脂质体悬浮液(包括含有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶定受感染细胞的脂质体)也用作药学上可接受的载体。根据本领域中技术人员描述的方法,如美国专利4,522,811(下文引用其作为参考)中描述的方法制备这些脂质体悬浮液。
特别有利的是制备剂量单位形式的经口或者肠胃外组合物以易于剂量的施用和均一性。下文中所用的剂量单位形式指适于作为施用于受试者的单一剂量的物理上离散的单位;每个单位含有所计算的预定量的活性化合物,所述预定量与所需要的药物载体联合产生所希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由如下条件规定并且直接依赖于这些条件:活性化合物的独特特征和所要实现的特定治疗效果,和复合用于个体的治疗的这种活性化合物的本领域中固有的限制。
在优选实施方案中,通过包括三种和多种本发明的CopB多肽片段(例如,SEQ ID Nos:1-4的表位结构域)提供了组合免疫原性组合物。针对造成中耳炎的多种细菌的多价免疫原性组合物含有三种和多种本发明的CopB多肽以及一种和多种其他公知的卡他莫拉氏菌多肽,包括,但不限于,UspA1、UspA2、B1、C/D、E和74kDa蛋白,和/或一种或多种公知的未定型的(nonty pable)流感嗜血杆菌多肽,包括,但不限于,P2、P4、P5、P6和PCP蛋白,和/或一种或多种公知的肺炎链球菌多肽和多糖-蛋白质缀合物,包括,但不限于,当前可利用的23价肺炎球菌荚膜多糖疫苗和7价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合疫苗。一种尤其优选的多价免疫原性组合物含有三种或多种本发明的多肽以及P4、P6和UspA2多肽。
将药学上可接受的载体理解为进入药物组合物或者免疫原性组合物的化合物或者化合物的组合,所述化合物或者化合物的组合不导致副作用并且使得可能例如,方便活性化合物的施用,增加其寿命和/或其在体内的功效,和增加其在溶液中的溶解性或者备选地增强其保存。这些药学上可接受的载体是众所周知的并且将由本领域技术人员根据所选的活性化合物的性质和施用模式修改。
“佐剂”是可以增强免疫原的免疫原性的物质。从而,通常用佐剂强化免疫应答并且佐剂是技术人员众所周知的。本发明中预期的佐剂的实例包括,但不限于,铝盐(alum),如磷酸铝和氢氧化铝,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、细菌脂多糖、氨基烷基葡糖胺磷酸化合物(AGP)、或者其衍生物或者类似物,它们可以从Corixa(Hamilton,MT)得到,并且在美国专利号6,113,918中描述;一种AGP是2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰基氨基]-乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰基]-2-[(R)-3-四癸酰氧基四癸酰基氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷,其也称为529(以前称作RC529),其经配制成水性形式或者稳定的乳剂,美国专利号4,912,094中描述的MPLTM(3-O-脱酰基化单磷酰基脂质A)(Corixa),合成多核苷酸,如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646),多肽,皂甙,如Quil A或STIMULONTMQS-21(Antigenics,Framingham,Massachusetts),其在美国专利号5,057,540中描述,百日咳毒素(PT),或者大肠杆菌热不稳定毒素(LT),尤其是LT-K63、LT-R72、CT-S109、PT-K9/G129;见,例如,国际专利公开号WO 93/13302和WO 92/19265,霍乱毒素(野生型或者突变形式,例如,根据出版的国际专利申请号WO 00/18434,其中29位氨基酸位置上的谷氨酸被另一氨基酸,优选组氨酸置换)。多种细胞因子和淋巴因子也适于用作佐剂。一种这样的佐剂是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),其具有美国专利号5,078,996中描述的核苷酸序列。已经将含有GM-CSF cDNA的质粒转化到大肠杆菌并且该质粒已经保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),1081University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209,保藏号为39900。细胞因子白介素12(IL-12)是另一种佐剂,其在美国专利号5,723,127中描述。已经表明其他细胞因子或者淋巴因子具有免疫调节活性,包括,但不限于,白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、13、14、15、16、17和18,和干扰素-α、β和γ,粒细胞集落刺激因子,和肿瘤坏死因子α和β,并且适于用作佐剂。
通常将本发明的组合物以剂量单位制剂肠胃外施用,所述剂量单位制剂含有标准的、众所周知的无毒的生理学可接受的载体、佐剂,和所希望的赋形剂。下文中所用的术语“肠胃外”包括静脉内、皮下、皮内、肌内、动脉内注射,或者输注技术。
根据本领域中公知的技术施用适宜的分散或者增湿剂和悬浮剂配制可注射的制剂,例如,无菌可注射的水性或者油性悬浮剂。该无菌可注射制剂可以是无毒肠胃外可接受的稀释剂或者溶剂中的无菌可注射的溶液剂或者悬浮剂,例如,作为1,3-丁二醇中的溶液。
可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、Ringer氏溶液,和等渗氯化钠溶液。此外,无菌、不挥发性油可方便地用作溶剂或者悬浮介质。为了该目的,可以使用任何温和的不挥发性油,包括合成的单-或双-甘油酯。此外,脂肪酸如油酸可以用于制备可注射剂。
优选的载体包括用磷酸盐、乳酸盐、Tris等缓冲的中性盐溶液。当施用病毒载体时,将载体足够纯化使得其基本上无不希望的污染物,如有缺陷的干扰性腺病毒颗粒或者内毒素和其他致热原,从而使得个体接受该载体构建体时不在该个体中导致任何不适当的反应。纯化载体的优选方法包括使用浮力密度梯度,如氯化铯梯度离心。
载体也可以是脂质体。使用脂质体作为递送载体的方法是本领域中众所周知的。
在特定实施方案中,本发明的免疫原性组合物包括本发明的多核苷酸序列,其与控制基因表达的调节序列可操作连接。将目标多核苷酸序列工程化到表达载体,如质粒中,处于调节元件的控制下,所述调节元件将促进DNA的表达,所述调节元件即启动子和/或增强子元件。在优选实施方案中,使用人巨细胞病毒立即早启动子/增强子(美国专利5,168,062)。该启动子可以是细胞特异的并且允许所述多核苷酸仅在预定细胞中大量转录。
将该多核苷酸作为“裸露”DNA(美国专利5,580,859)直接导入宿主或者与促进免疫的试剂,如bupivicaine和其他局部麻醉剂(美国专利5,593,972)和阳离子多胺(美国专利6,127,170)一起配制到组合物中。
在该多核苷酸免疫方法中,本发明的多肽在体内瞬时表达;没有遗传物质插入或者整合到宿主的染色体中。该方法与基因治疗不同,基因治疗的目的是将目标遗传物质插入或者整合到染色体中。用测定法证实通过免疫施用的多核苷酸不引起宿主中转化的表型(美国专利6,168,918)。
将引用的所有专利和出版物并入本文作为参考。
F.实施例
用标准技术实施下面的实施例。除了详细描述的技术之外,这些技术是本领域中众所周知的和技术人员的常规技术。给出下面的实施例用于阐明目的,并且绝不应该将所述实施例理解为限制本发明的范围。
实施例1
材料和方法
卡他莫拉氏菌分离物和抗体。卡他莫拉氏菌分离物O35E、TTA24和O46E由E.Hansen(University of Texas,Dallas,TX)提供。卡他莫拉氏菌分离物B46和J261由G.Doern(University of Iowa,lowaCity,IA)提供。卡他莫拉氏菌分离物4608.1由T.Murphy(University ofBuffalo,Buffalo,NY)提供。所有其他分离物由D.Hardy(University ofRochester,Rochester,NY)提供。将细菌在-70℃保存于含有40%甘油的Mueller-Hinton培养液(Difco Laboratories,Detroit,MI)中并常规的在Mueller-Hinton琼脂上37℃下用5%CO2孵育进行传代。通过E.Hansen提供的杂交瘤克隆的培养上清液的硫酸铵浓缩物制备对来源于分离物035E的CopB特异的MAb 10F3。
大肠杆菌中CopB蛋白质的表达。将来自分离物O35E的编码CopB的基因克隆到pET30a T7表达质粒(Novagen,Madison WI)中,该质粒中没有CopB前导序列,并将所得质粒称为pLP141。类似地,用从分离物TTA24PCR扩增的CopB基因构建质粒pLP131,并将其克隆到PET28a T7表达系统(Novagen,Madison WI)中。用这两种质粒转化大肠杆菌表达宿主株系BL21(DE3)。对于细菌生长,将转化的大肠杆菌培养物在37℃下补加30μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani(LB)培养基(LB-Kan)中孵育。为了制备细胞以分离重组CopB(rCopB)蛋白,将冷冻的细胞在LB-Kan琼脂上复苏,然后在LB-Kan肉汤中过夜生长。用该过夜培养物接种新鲜LB-Kan肉汤到最终A600为0.05并摇动下孵育直到A600达到约1.5。用1mM异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导该培养物。10分钟后,加入利福平到终浓度0.15mg/ml。诱导3小时后,通过低速离心收获细菌。
分离rCopB蛋白。将收获的细菌细胞重悬浮在含有1%TritonX-100的磷酸缓冲液(PBS)中并通过French Press(Aminco FA-078,SLM InstrumentsInc.,Urbana,IL)两次。将细胞裂解物以36,000×g离心20分钟。用0.1M Tris(pH8.0)中的6M尿素和0.5M氯化钠在4℃,轻微摇动下过夜提取主要由rCopB包含体组成的沉淀。以36,000×g离心20分钟后,可溶性rCopB保留在上清液中并将其穿过用0.1MTris(pH8.0)中的0.5M氯化钠和1%Triton X-100平衡的大小排阻柱(Sephadex G-25,Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)。将含有rCopB的洗脱液离心除去微粒物质。该可溶性rCopB在1%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(12%丙烯酰胺)电泳(SDS-PAGE)中迁移成约80kDa的带。根据考马斯染色凝胶的扫描得到该蛋白质的纯度为90%。
CopB肽的合成和缀合。使用Fmoc、HOBt、PyBOP双偶联化学在Gilson AMS 422多种肽合成仪(Gilson MedicalElectronics,Inc_Middletown,WI)上合成CopB肽并将其在反相HPLC(RaininInstrument,Inc.,Woburn,MA)上纯化。这些肽长18个氨基酸,包括所报导的8个氨基酸核心表位和每边的5个侧翼残基(见表1)。O35E肽具有序列QAELDNKYAGKGYKLGSK(SEQ ID NO:5);TTA25肽为QAELDDKYAGKGYKLGSk(SEQ ID NO:6);430:345为LAELNKDYPGQGYKLGKK(SEQ ID NO:7)。将半胱氨酸加入到每种肽的N-末端以便将CopB肽缀合到基因脱毒的白喉毒素CRM197。
为了制备肽缀合物,将CRM197首先用杂双功能交联试剂N-succinimidyl溴乙酸以1∶1重量比溴乙酰基化。该反应导致每个CRM197分子的19个赖氨酸残基的修饰,如通过基质-辅助激光解吸/电离飞行时间质谱所确定的。将所述肽溶于水中并立即以1∶1重量比加到溴乙酰基化CRM197中。轻微搅拌下将混合物过夜孵育,然后对PBS透析以除去游离肽。通过氨基酸分析评估缀合程度。酸水解时,与CRM197的每个肽硫醚键释放一个S-羧甲基半胱氨酸。在SDS-PAGE中,所迁移的肽缀合物的分子大小比未缀合的CRM197大。
在小鼠中产生免疫血清。BALB/c和Swiss Webster小鼠都从Taconic Farms,Germantown,NY购买。为了检查对rCopB蛋白质的免疫应答,用20μg重组蛋白,以50μg 3-O-脱酰基化单磷脂酰脂质A(MPLTM;Corixa Corp.,Hamilton,MT)和100μg磷酸铝作为佐剂在周0和周4皮下免疫10只雌性BALB/c小鼠组,每只小鼠6到8周龄。将周0、4和6收集的血清合并用于分析。为了制备针对CopB肽缀合物的多克隆血清,用10μg肽缀合物,以20μg QS21作为佐剂在周0、3和6皮下免疫5只雌性Swiss Webster小鼠组,每只小鼠6到8周龄。周0合并血清和周8合并血清用于分析。此外,产生了针对重组CD蛋白的小鼠多克隆血清和来自O35E分离物的天然UspA。将来自这些小鼠的周6血清合并并用作测定法中的对照。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)。用标准酶联免疫吸附测定方法(ELISA)测量所合并的血清中总的抗原特异的免疫球蛋白水平。对于这些测定法,用在pH9.6碳酸盐缓冲液中稀释到2μg/ml的rCopB蛋白(含有6M尿素和0.5M氯化钠的pH8的0.1M Tris)将Costal96孔平底聚苯乙烯介质结合板(Corning Inc.,Corning,NY)包被过夜。用缀合山羊抗小鼠抗体(BioSouree,Camarilla,CA)的碱性磷酸酶检测蛋白质特异抗体。抗体效价表达为吸收为0.1时的血清稀释的倒数,其从吸收的对数对血清样品稀释的对数的线性图外推得到。在所有情况中,周0血清显示出小于50的抗体效价。如Chen等人,1996所描述的测量针对卡他莫拉氏菌的多种分离物的合并血清的总细胞效价。周0血清显示出对于所有试验的分离物,总细胞效价小于50。
CopB基因的测序。用于从分离物430:345克隆copB基因的PCR引物对为寡核苷酸5′-GGATCCGCCACCATGGCTAATAAGTTTCAATTATTACCG (SEQID NO:8)和5′-GAATTCVCCATAAAAAGAACACCC(SEQ ID NO:9);来自分离物111:210和318:086的PCR引物对为寡核苷酸5′-CATATGGCTGTTAGCCAGCCTAAGG(SEQ ID NO:10)和5′-CACCAAGCTCTACACTGG(SEQ ID NO:11);来自分离物218:038和417:082的PCR引物对为寡核苷酸5′-CTGACATTGGCGGTGAGT(SEQ ID NO:12)和5′-GTGCTTGAGTGTTCAGT(SEQ ID NO:13)。在PerSeptiveBiosystems寡核苷酸合成仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)上使用β-氰乙基亚磷酰胺化学合成寡核苷酸。通过PCR使用ReddyMixPCR Master Mix(Abgene_House,Surrey,U.K.)中的适宜的寡核苷酸从细菌细胞扩增copB基因并将PCR产物克隆到pCR_2.1-TOPO_载体(Invitrogen Co.,Carlsbad,CA)中。使用BigDye终止子化学用特别设计的引物在Applied Biosystems 377自动化DNA测序仪(AppliedBiosysytems,Foster City,CA)上实施DNA测序。用SequencherTM 4.0.5软件(Gene Codes,Corp.,Ann Arbor,MI)分析DNA序列并用LASERGENE软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)分析蛋白质序列。
实施例2
O35E重组CopB和TTA24重组CopB蛋白的免疫原性
O35E rCopB和TTA24rCopB蛋白都在第二次免疫加强的小鼠中引发良好的初次免疫应答。针对O35E rCopB的抗体和针对TTA24rCopB的抗体是交叉反应的,即,通过任一种rCopB产生的多克隆血清具有针对该蛋白质的同源和异源形式的高抗体效价(见,表4)。
表4
来自用O35E rCopB、TTA24rCopB和这两种蛋白质的混合物免疫的
小鼠的血清的蛋白质特异抗体效价
检测抗原 | 由如下蛋白引起的抗体效价a | ||
O35E rCopB | TTA24rCopB | rCopB混合物 | |
O35E rCopB | 659,950 | 109,290 | 272,075 |
TTA24rCopB | 194,086 | 185,260 | 365,430 |
a来自10只小鼠的周6合并血清的抗体效价
对于用两种重组蛋白免疫的小鼠所得血清也见到针对两种rCopB蛋白的高抗体效价。这些结果与035E和TTA24CopB蛋白具有大于98%的序列同一性(Sethi,1997;Helminen等人,1993)这一事实相一致。在总细胞ELISA测定中检测到小得多的交叉反应性(表5)。
表5
来自用O35E rCopB、TTA24rCopB和这两种蛋白质的混合物免疫的
小鼠的血清的卡他莫拉氏菌总细胞效价
检测分离物 | 与Mab 10F3的反应性 | 由如下蛋白引起的抗体效价a | ||
035ErCopB | TTA24rCopB | rCopB混合物 | ||
035E1230:359216:96TTA24430:345111:210 | +++--- | 47,41651,85541,7269301,7721,175 | 1,1627846394,7551,0385,333 | 28,28419,94630,60942,5253,30155,561 |
a来自10只小鼠的周6合并血清的总细胞效价
抗035E rCopB血清优先与10F3阳性分离物的总细胞反应,抗TTA24rCopB血清与10F3阴性分离物反应,430:345除外。观察到抗TTA24rCopB血清针对10F3阴性分离物的总细胞效价比抗035ErCopB血清针对10F3阳性分离物的总细胞效价低得多。
然而,通过两种重组蛋白质的混合物产生的抗血清显示出针对10F3阳性和10F3阴性分离物的相当的总细胞效价,但是分离物430:345除外。
还检查了蛋白质印迹中抗血清针对卡他莫拉氏菌的细胞裂解物的反应性(数据未显示)。在8种所试验的分离物中,四种10F3阳性分离物的CopB蛋白(即,SDS-PAGE中迁移到80kDa的带)与针对035ErCopB的多克隆血清强烈反应,但是与针对TTA24rCopB的多克隆血清反应很弱。另一方面,四种10F3阴性分离物的中有三种CopB蛋白与针对TTA24rCopB的多克隆血清强烈反应,但是与针对035ErCopB的多克隆血清反应很弱。再次,观察到10F3阴性分离物430:345的CopB是个例外。10F3阴性分离物430:345与针对035E rCopB的抗血清和针对TTA24rCopB的抗血清反应都很弱。在蛋白质印迹和总细胞ELISA测定中观察到的两种rCopB蛋白质引起的多克隆血清的特异性强烈表明通过MAb10F3限定的表位是细菌表面上的单个免疫显性结构域。
实施例3
新CopB血清组的检测
尤其重要的是针对035E和TTA24rCopB蛋白的多克隆血清具有对于10F3阴性分离物430:345的CopB的相对低的反应性(见表5)。从而,预计430:345分离物可能代表新的CopB血清组。为了检验该假说,将来自分离物430:345的copB基因在相应于10F3表位的区域中测序并从035E分离物的区域检测到四个氨基酸差异(图1)。该发现与单个免疫显性表位假说吻合,并解释了为什么430:345分离物的CopB蛋白质与035E或TTA24的CopB蛋白质在免疫学上不同。在430:345分离物的CopB蛋白质中发现的表位序列也存在于分离物046E和56的CopB的公开序列(Sethi,1997;Aebi等人,1998)中,这一事实表明这三种分离物属于相同的血清学组(见表1)。
实施例4
通过蛋白质印迹分析表征的CopB的血清学
为了估计该新的血清组在10F3阴性分离物中的流行性,通过点印迹分析对感染卡他莫拉氏菌的患者的100种以上的分离物筛选与MAb 10F3的反应性。选择不与10F3反应的18种分离物和与之反应的4种分离物用于进一步研究。通过蛋白质印迹检查所选分离物的总裂解物与MAb 10F3和针对所述三种CopB血清组的相同表位区域的多克隆血清的反应性。为此,合成了三种肽,它们长为18个氨基酸。每种肽携带各自的8个氨基酸核心表位和如在分离物035E、TTA24和430:345的肽序列中发现的每个边上的5个侧翼残基。将肽通过它们的N-末端的半胱氨酸残基缀合到CRM197,并将肽缀合物施用于小鼠以产生抗血清。为了易于讨论,将所得血清称为抗-035E肽、抗-TTA24肽和抗-430:345肽血清。使用这些表位特异的抗体试剂,以及针对两种rCopB蛋白质制备的血清和DNA测序,发现了四种血清组:CopB-I、CopB-II、CopB-III和CopB-IV。
通过蛋白质印迹分析检查了所有22种分离物(数据未显示)。通过MAb 10F3与分离物035E、1230:359、110:070、115:142和B46(血清组CopB-1)的Cop蛋白质的反应性清楚地阐明了MAb 10F3的特异性。抗-TTA24肽血清几乎为选择性的,其与三种10F3阴性分离物TTA24、111:210和113:136(血清组CopB-II)的CopB蛋白质反应最强烈。抗-035E肽血清特异性低得多,其识别除了430:345之外的所有分离物的CopB蛋白质。
相比,抗-430:345肽血清的反应模式更复杂。尽管在多数分离物中,显示出针对多种分子量的许多蛋白质的弱反应性,但是抗-430:345肽血清仅与430:345和046E的CopB蛋白质强烈反应(数据未显示)。该观察进一步表明分离物430:345和046E代表新的血清学组(血清组CopB-III)。
实施例5
通过总细胞ELISA进一步表征CopB
发现四种CopB血清组促使进一步检查可能暴露于细菌表面的蛋白质的表位。为此,用总细胞ELISA测定分析针对两种重组CopB蛋白质和三种CopB肽缀合物的血清。基于总细胞效价(表6),将22种分离物分成以前通过蛋白质印迹分析鉴定的4种CopB血清组。如表7中概述,通过那些分离物与MAb 10F3和抗-035E rCopB血清的特异反应性定义血清组CopB-I;通过那些分离物与MAb 10F3和抗-TTA24rCopB血清的特异反应性定义血清组CopB-II;通过那些分离物与MAb 10F3和抗430:345肽血清的特异反应性定义血清组CopB-III。针对035E和TTA24肽的血清显示出类似于针对来自那些分离物的rCopB蛋白的血清所见的反应性模式,但是具有更低的效价(数据未显示)。针对rCopB蛋白和三种CopB肽的这些多克隆血清的相对严格特异性清楚地表明血清组CopB-I、CopB-II和CopB-III的每一种都具有它们各自分离物的细菌表面上的单一的免疫显性结构域。
表6
MAb 10F3和针对035E rCopB、TTA24rCopB、和430:345CopB肽制备的小鼠多克隆血清的卡他莫拉氏菌总细胞效价
血清组 | 分离物 | 总细胞效价 | |||
10F3Mab | 抗-O35ErCopB血清 | 抗-TTA24rCopB血清 | 抗-430:345肽血清 | ||
CopB-I | O35E125:114128:1791230:359205:211110:070306:155204:206B46 | 70,92852,25719,1107,95593,05489,037138,33551,45853,866 | 52,71774,90918,87865,34785,959207,562173,24936,29446,408 | 2416952405533623006601,683345 | <100182<100<100<100164107<100<100 |
CopB-II | TTA24422:318312:171J261113:136205:333 | <100<100<100<100<100<100 | 3823041,009514316807 | 3,3404,1669,21111,6012,7106,169 | <100<100<100150<100<100 |
CopB-III | 430:345O46E | <100<100 | 778576 | 822681 | 45,58345,186 |
CopB-IV | 4608.1 | <100 | 860 | 1,173 | <100 |
表7
基于总细胞ELISA测定中观察到的反应性的CopB血清组
血清组 | 针对下面物质的总细胞反应性 | |||
Mab10F3 | 抗-035ErCopB血清 | 抗-TTA24rCopB血清 | 抗-430:345肽血清 | |
CopB-ICopB IICopB-III | +++-- | +++-- | -++- | --+++ |
在表7中概述了基于22种分离物与MAb 10F3、针对035E和TTA24rCopB蛋白质的抗血清、针对430:345肽的抗血清的总细胞反应性,所鉴定的四种CopB血清组的特征。多克隆抗体的交叉反应性的缺少表明血清组CopB-I、CopB-II和CopB-III每一种由细菌表面上单个但是不同的免疫显性表位限定。
实施例6来自CopB-III和CopB-IV分离物的CopB基因的测序
克隆并完全测序分离物430:345和4608.1的copB基因。然后将这些分离物的所预测的CopB蛋白质序列与所出版的序列比较。代表性CopB蛋白质序列的比对在图1中显示。分离物430:345的所预测蛋白质的序列类似于分离物046E的序列,仅具有5个残基不同。相比,分离物430:345的所预测蛋白质的序列与分离物035E和TTA24的序列十分不同。有75或更多残基不同。有趣的是,在分离物430:345、046E和56的CopB蛋白质中发现相同的免疫显性表位序列KDYPGQGY(SEQ ID NO:3)(图1和表1)。在蛋白质印迹(数据未显示)和总细胞ELISA测定(表6)中,分离物430:345和046E中相同表位的存在与抗-430:345肽血清的特异反应性良好相关。尽管没有检验,但是预期分离物56也结合针对430:345肽的抗体。
血清组CopB-IV分离物在蛋白质印迹中不显示出与MAb 10F3或者抗-CopB肽血清(数据未显示)的反应性,血清组CopB-IV分离物在总细胞ELISA测定中也不与血清特异抗体试剂反应(表6)。然而,申请人能够从该分离物克隆和测序copB基因。如图1中所示,从分离物4608.1的copB基因预测的CopB蛋白质与035E、TTA24和430:435分离物的CopB蛋白质十分不同。为了确定copB基因产物是否由该分离物产生,在蛋白质印迹中用针对035E和TTA24rCopB的多克隆血清探测4608.1的细胞裂解物。如前面提到的,针对rCopB蛋白质的多克隆血清含有针对不同于表面暴露的免疫显性表位(表4)的区域的抗体。发现4608.1分离物表达所预期大小的CopB蛋白。这些结果表明4608.1代表新的血清组,将其称为CopB-IV。
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<160>13
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>卡他莫拉氏菌
<400>1
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<213>卡他莫拉氏菌
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<211>17
<212>DNA
<213>卡他莫拉氏菌
<400>13
gtgcttgagt gttcagt 17
Claims (158)
1.含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中该片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的免疫原性组合物,其中所述片段进一步被定义为CopB表位。
3.根据权利要求1的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的免疫原性组合物,其中所述片段缀合到载体蛋白。
5.根据权利要求1的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
6.根据权利要求1的免疫原性组合物,其中所述组合物当以免疫原性量施用于哺乳动物宿主时,保护该宿主抵抗75%以上的卡他莫拉氏菌株系。
7.根据权利要求1的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
8.含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中该片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
9.根据权利要求8的免疫原性组合物,其中所述片段还被定义为CopB表位。
10.根据权利要求8的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物4608.1的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
11.根据权利要求8的免疫原性组合物,其中所述片段缀合到载体蛋白。
12.根据权利要求8的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
13.根据权利要求8的免疫原性组合物,其中所述组合物当以免疫原性量施用于哺乳动物宿主时,保护该宿主抵抗75%以上的卡他莫拉氏菌株系。
14.根据权利要求8的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
15.含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中该片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
16.根据权利要求15的免疫原性组合物,其中所述片段进一步被定义为CopB表位。
17.根据权利要求15的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
18.根据权利要求15的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物4608.1的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
19.根据权利要求15的免疫原性组合物,其中所述片段缀合到载体蛋白。
20.根据权利要求15的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
21.根据权利要求15的免疫原性组合物,其中所述组合物当以免疫原性量施用于哺乳动物宿主时,保护该宿主抵抗75%以上的卡他莫拉氏菌株系。
22.根据权利要求15的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
23.含有至少三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:2的氨基酸序列以及第三种多肽含有至少SEQ IDNO:3的氨基酸序列。
24.根据权利要求23的免疫原性组合物,其中所述多肽进一步被定义为CopB多肽。
25.根据权利要求23的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
26.根据权利要求23的免疫原性组合物,其中所述多肽缀合到载体蛋白。
27.根据权利要求23的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
28.根据权利要求23的免疫原性组合物,其中所述组合物当以免疫原性量施用于哺乳动物宿主时,保护该宿主抵抗75%以上的卡他莫拉氏菌株系。
29.根据权利要求23的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
30.含有至少三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:2的氨基酸序列以及第三种多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
31.根据权利要求30的免疫原性组合物,其中所述多肽进一步被定义为CopB多肽。
32.根据权利要求30的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物4608.1的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
33.根据权利要求30的免疫原性组合物,其中所述多肽缀合到载体蛋白。
34.根据权利要求30的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
35.根据权利要求30的免疫原性组合物,其中所述组合物当以免疫原性量施用于哺乳动物宿主时,保护该宿主抵抗75%以上的卡他莫拉氏菌株系。
36.根据权利要求30的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
37.含有至少四种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQ ID NO:2的氨基酸序列,第三种多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列以及第四种多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
38.根据权利要求37的免疫原性组合物,其中所述多肽进一步被定义为CopB多肽。
39.根据权利要求37的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
40.根据权利要求37的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物4608.1的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
41.根据权利要求37的免疫原性组合物,其中所述多肽缀合到载体蛋白。
42.根据权利要求37的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
43.根据权利要求37的免疫原性组合物,其中所述组合物当以免疫原性量施用于哺乳动物宿主时,保护该宿主抵抗75%以上的卡他莫拉氏菌株系。
44.根据权利要求37的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
45.含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,所述多肽片段含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
46.根据权利要求45的免疫原性组合物,其中所述片段进一步被定义为CopB表位。
47.根据权利要求45的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
48.根据权利要求45的免疫原性组合物,其中所述片段缀合到载体蛋白。
49.根据权利要求45的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
50.根据权利要求45的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
51.含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述多肽片段含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
52.根据权利要求51的免疫原性组合物,其中所述片段进一步被定义为CopB表位。
53.根据权利要求51的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物4608.1的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
54.根据权利要求51的免疫原性组合物,其中所述片段缀合到载体蛋白。
55.根据权利要求51的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
56.根据权利要求51的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
57.含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
58.根据权利要求57的免疫原性组合物,其中所述片段还被定义为CopB表位。
59.根据权利要求57的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列并且将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物4608.1的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
60.根据权利要求57的免疫原性组合物,其中所述片段缀合到载体蛋白。
61.根据权利要求57的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
62.根据权利要求57的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
63.含有卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中该多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
64.根据权利要求63的免疫原性组合物,其中所述多肽进一步被定义为CopB多肽。
65.根据权利要求63的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
66.根据权利要求63的免疫原性组合物,其中所述多肽缀合到载体蛋白。
67.根据权利要求63的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
68.根据权利要求63的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
69.含有卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中该多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
70.根据权利要求69的免疫原性组合物,其中所述多肽进一步被定义为CopB多肽。
71.根据权利要求69的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物4608.1的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
72.根据权利要求69的免疫原性组合物,其中所述多肽缀合到载体蛋白。
73.根据权利要求69的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
74.根据权利要求69的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
75.含有至少两种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列以及第二种多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
76.根据权利要求75的免疫原性组合物,其中所述多肽进一步被定义为CopB多肽。
77.根据权利要求75的免疫原性组合物,其中将SEQ ID NO:3进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物430:345、卡他莫拉氏菌分离物046E或者卡他莫拉氏菌分离物56的CopB多肽内所含有的氨基酸序列并且将SEQ ID NO:4进一步定义为卡他莫拉氏菌的分离物4608.1的CopB多肽内所含有的氨基酸序列。
78.根据权利要求75的免疫原性组合物,其中所述多肽缀合到载体蛋白。
79.根据权利要求75的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
80.根据权利要求75的免疫原性组合物,其还含有其他抗原。
81.含有许多共价交联的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的分离的多肽,其中该多肽含有至少含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段,和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。
82.含有许多共价交联的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的分离的多肽,其中该多肽含有至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段,含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段以及含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段。
83.含有许多共价交联的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的分离的多肽,其中该多肽含有至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段,含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。
84.含有许多共价交联的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的分离的多肽,其中该多肽含有至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段,含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段,含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。
85.含有许多共价交联的SEQ ID NO:3的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的分离的多肽。
86.合有许多共价交联的SEQ ID NO:4的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的分离的多肽。
87.含有权利要求81的多肽的免疫原性组合物。
88.权利要求87的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
89.根据权利要求87的免疫原性组合物,其还含有额外的抗原。
90.含有权利要求82的多肽的免疫原性组合物。
91.权利要求90的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
92.根据权利要求90的免疫原性组合物,其还含有额外的抗原。
93.含有权利要求83的多肽的免疫原性组合物。
94.权利要求93的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
95.根据权利要求93的免疫原性组合物,其还含有额外的抗原。
96.含有权利要求84的多肽的免疫原性组合物。
97.权利要求96的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
98.根据权利要求96的免疫原性组合物,其还含有额外的抗原。
99.含有权利要求85的多肽的免疫原性组合物。
100.权利要求99的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
101.根据权利要求99的免疫原性组合物,其还含有额外的抗原。
102.含有权利要求86的多肽的免疫原性组合物。
103.权利要求102的免疫原性组合物,其还含有一种或多种佐剂。
104.根据权利要求102的免疫原性组合物,其还含有额外的抗原。
105.编码权利要求81的多肽的多核苷酸。
106.编码权利要求82的多肽的多核苷酸。
107.编码权利要求83的多肽的多核苷酸。
108.编码权利要求84的多肽的多核苷酸。
109.编码权利要求85的多肽的多核苷酸。
110.编码权利要求86的多肽的多核苷酸。
111.含有权利要求105的多核苷酸的表达载体。
112.含有权利要求106的多核苷酸的表达载体。
113.含有权利要求107的多核苷酸的表达载体。
114.含有权利要求108的多核苷酸的表达载体。
115.含有权利要求109的多核苷酸的表达载体。
116.含有权利要求110的多核苷酸的表达载体。
117.用权利要求111的载体转化、转染或者感染的宿主细胞。
118.用权利要求112的载体转化、转染或者感染的宿主细胞。
119.用权利要求113的载体转化、转染或者感染的宿主细胞。
120.用权利要求114的载体转化、转染或者感染的宿主细胞。
121.用权利要求115的载体转化、转染或者感染的宿主细胞。
122.用权利要求116的载体转化、转染或者感染的宿主细胞。
123.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
124.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
125.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有至少三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQID NO:2的氨基酸序列以及第三种多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
126.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有至少三种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQID NO:2的氨基酸序列以及第三种多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
127.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有许多共价连接的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的免疫原性组合物,其中该许多片段包含至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段以及含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段。
128.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有许多共价连接的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的免疫原性组合物,其中该许多片段包含至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段以及含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。
129.根据权利要求123的方法,其中所述多肽缀合到抗原载体蛋白。
130.根据权利要求124的方法,其中所述多肽缀合到抗原载体蛋白。
131.根据权利要求125的方法,其中所述多肽缀合到抗原载体蛋白。
132.根据权利要求126的方法,其中所述多肽缀合到抗原载体蛋白。
133.根据权利要求127的方法,其中所述多肽缀合到抗原载体蛋白。
134.根据权利要求128的方法,其中所述多肽缀合到抗原载体蛋白。
135.根据权利要求123的方法,其还含有额外的抗原。
136.根据权利要求124的方法,其还含有额外的抗原。
137.根据权利要求125的方法,其还含有额外的抗原。
138.根据权利要求126的方法,其还含有额外的抗原。
139.根据权利要求127的方法,其还含有额外的抗原。
140.根据权利要求128的方法,其还含有额外的抗原。
141.根据权利要求123的方法,其还含有一种或多种佐剂。
142.根据权利要求124的方法,其还含有一种或多种佐剂。
143.根据权利要求125的方法,其还含有一种或多种佐剂。
144.根据权利要求126的方法,其还含有一种或多种佐剂。
145.根据权利要求127的方法,其还含有一种或多种佐剂。
146.根据权利要求128的方法,其还含有一种或多种佐剂。
147.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对宿主施用含有卡他莫拉氏菌多肽片段的免疫原性组合物,其中所述片段含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
148.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有至少四种卡他莫拉氏菌多肽的免疫原性组合物,其中第一种多肽含有至少SEQ ID NO:1的氨基酸序列,第二种多肽含有至少SEQID NO:2的氨基酸序列,第三种多肽含有至少SEQ ID NO:3的氨基酸序列以及第四种多肽含有至少SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
149.免疫宿主抗卡他莫拉氏菌感染的方法,该方法包括对该宿主施用含有许多共价连接的卡他莫拉氏菌CopB表位片段的免疫原性组合物,其中该许多片段包含至少含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的片段、含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的片段、含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的片段和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的片段。
150.根据权利要求147的方法,其中该多肽缀合到抗原载体蛋白。
151.根据权利要求148的方法,其中该多肽缀合到抗原载体蛋白。
152.根据权利要求149的方法,其中该多肽缀合到抗原载体蛋白。
153.根据权利要求147的方法,其还含有额外的抗原。
154.根据权利要求148的方法,其还含有额外的抗原。
155.根据权利要求149的方法,其还含有额外的抗原。
156.根据权利要求147的方法,其还含有一种或多种佐剂。
157.根据权利要求148的方法,其还含有一种或多种佐剂。
158.根据权利要求149的方法,其还含有一种或多种佐剂。
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