CN1553955A - 血小板糖蛋白IBα融合多肽和其利用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了治疗或预防与血管相关的紊乱的组合物和方法。
Description
发明领域
本发明大体上涉及治疗或预防与血管相关的紊乱的组合物和方法，更具体地说涉及含有起源于血小板糖蛋白IBα的多肽的组合物和利用它们的方法。
发明背景
与血管有关的紊乱的不利后果如休克，心脏病发作，和动脉硬化被认为至少部分是不合适地引发了血管炎症和修复应答引起的。血管炎症和修复应答包括在血液自由循环中正常发现的各种类型的细胞之间的黏连相互反应。这样的相互反应的例子有，可以在血小板，白细胞和血管的内壁(即，血管内皮)之间可以发生的相互反应。在高的液体剪切力条件下，血小板通过在它们表面的糖蛋白(GP)Ib-IX-V复合物与存在于暴露的血管内皮上存在的von Willebrand因子(vWF)之间的相互作用黏附于内皮上。相反，白细胞可以直接或间接地通过开始黏附到vWF固定的血小板来黏附于激活的内皮。在两种情况中，结合黏附受体的选择素或整合素类别的白细胞表面分子介导了这些黏附事件。白细胞-血小板黏附认为部分是通过白细胞表面整合素分子，血小板表面GPIb-IX-V复合物的MacI和GP1b成分的相互反应来进行的。
在对血管紊乱如，动脉硬化斑捕获或机械损伤，例如，如气球成形术，stent植入，缺血损伤或狭窄的应答中，白细胞和血小板可以在血管损伤位点积累，并且相互提供多个黏附底物。白细胞和血小板的这一积累导致局部因子的产生，包括例如，有丝分裂素，细胞因子，和趋化因子，引起其他不必要的血管疾病的发展。
发明概要
本发明部分是基于发现了抑制血小板与白细胞的黏附的糖蛋白-Ibα-起源的融合蛋白质。因此，糖蛋白-Ibα-起源的融合蛋白质可以用于治疗与血管炎症，凝血，动脉硬化，和气球成形术相关的再狭窄相关的血管症状。该多肽，本文称为糖蛋白Ibα融合多肽。
在一方面，本发明提供了包括第一个多肽的糖蛋白Ibα融合多肽，其中至少包括一个糖蛋白Ibα多肽的区域，该区域与第二个多肽可操作地连接。第二个多肽优选地形成了多体，例如，二体。在优选的实施方案中，第二个多肽至少包括一个免疫球蛋白多肽的区域。在一些实施方案中，融合蛋白质包括GP1b302-Ig(SEQ ID NO：1)，Gp1b302A-Ig(SEQ ID NO：2)，GP1b302/4X-Ig(SEQ ID NO：3)，GP1b209Ig(SEQ ID NO：4)，GP1b290/2V-Ig(SEQ ID NO：5)，或GP1b290/1A-Ig(SEQ ID NO：6)的序列，或其片段，同源物，类似物或衍生物。这些多肽的序列如下：
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AT
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SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：2)
GP1b302/4X-Ig
MPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTF
SLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVS
FNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNG
LENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQ
VVDVKA
VTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKV
AAT
AT
VVKFPTKARPHTCPPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF
NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：3)
GP1b290-Ig
MPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTF
SLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVS
FNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNG
LENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQ
GVDVKAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRPHTC
PPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：4)
GP1b290/2V-Ig
MPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTF
SLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVS
FNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNG
LENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQ
VVDVKA
VTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRPHTC
PPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：5)
GP1b290-1A-Ig
MPLLLLLLLLPSPLHPHPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTF
SLATLMPYTRLTQLNLDRCELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVS
FNRLTSLPLGALRGLGELQELYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNG
LENLDTLLLQENSLYTIPKGFFGSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQ
GVDV
AAMTSNVASVQCDNSDKFPVYKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRPHTC
PPCPAPEALGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYT
LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：6)
同时本发明提供了抑制白细胞与生物组织的黏附的方法，包括将白细胞与本发明的糖蛋白Ibα融合多肽接触，白细胞的接触量是足以抑制白细胞和生物组织的黏附的量。
在另一方面，本发明提供了治疗与血小板激活相关的紊乱的方法。该方法包括对受试者给药有效量的糖蛋白Ibα融合多肽。
同时包括在本发明中的是编码糖蛋白Ibα融合多肽的核酸，以及含有糖蛋白Ibα融合多肽-编码核酸的载体，和含有本文所述的载体或核酸的细胞。
同时包括在本发明中的有包括糖蛋白Ibα融合多肽的药物组合物，以及特异地识别糖蛋白Ibα融合多肽的抗体。
除非特别定义，本文利用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的技术人员一般理解的相同的意义，虽然与本文所述的相似或相当的方法和材料可以用于本发明的实践或实验中，适当的方法和材料可以如下所述。所有的公开物，专利申请，专利，和其他本文提到的参考文献以全文引入作为参考。在有矛盾的情况中，本申请书，包括其中的定义，将作为参照。另外，材料，方法，和实施例仅仅作为说明，不打算用来限制，
本发明的其他特征和优点将可以从下面的详细说明中和权利要求中明了。
附图的简要说明
图1是显示从用含有GP1b302-Ig编码区的哺乳动物表达载体稳定转染的CHO细胞分泌的GP1b302-Ig融合蛋白质的纯化的考马斯亮兰染色的凝胶的图解。
图2是用凝胶过滤柱(GFC)洗脱的GP1b302-Ig融合蛋白质的蛋白质A的纯化的凝胶的图解。GFC能够从下面的带(胰蛋白酶裂解片段，带7)中分离上面的带(完整的融合蛋白质，带4)。
图3是证实从稳定转染的CHO细胞分泌的各种GP1b-Ig融合蛋白质的蛋白质水解程度的已调节的细胞培养基的western影印的图解。
图4是描述测量血小板聚集的UV光谱的图解。
图5是显示在体内的Folts模型实验中，在平均LCX流动方式上单个大丸剂注射各种浓度的GPIb290/2V-Ig融合蛋白的效果的图。箭头显示了药物注射的时间。
图6是描述具有高液体剪切血流的损伤的冠状动脉的图解。
发明的详细说明
本发明提供了用于抑制血小板和白细胞与生物组织如血管内皮的黏附的糖蛋白Ibα蛋白质-免疫球蛋白融合蛋白质的融合蛋白质。本发明的融合蛋白质或编码融合蛋白质的核酸可以掺入药物组合物，并且可以对受试者给药抑制糖蛋白Ibα配体(如，Von Willebrand因子，Mac-1，P-选择或凝血素)和糖蛋白Ibα蛋白质在细胞如血小板表面上的相互反应。抑制结合也抑制了糖蛋白Ibα蛋白质介导的血小板聚集，并且与体内的信号转导相关。
糖蛋白Ibα蛋白质-免疫球蛋白融合蛋白质可以用于调节糖蛋白Ibα蛋白质同质配体的生物可得性。糖蛋白Ibα蛋白质配体/糖蛋白Ibα蛋白质相互反应的抑制特别可用于治疗血管炎症和其他与血小板激活相关的血管紊乱。
糖蛋白Ibα融合多肽
在各个方面，本发明提供了包括至少含有与第二个多肽可操作地连接的一部分糖蛋白Ibα多肽的第一个多肽。如本文所用，糖蛋白Ibα“融合蛋白质”或“嵌合蛋白质”至少包括一部分糖蛋白Ibα多肽，它们与非糖蛋白Ibα多肽可操作地连接。“糖蛋白Ibα多肽”指具有与至少一部分糖蛋白Ibα多肽对应的氨基酸序列，而“非糖蛋白Ibα多肽”指具有与糖蛋白Ibα蛋白质基本不同源的蛋白质对应的氨基酸序列的多肽，这些蛋白质例如与糖蛋白Ibα多肽或片段不同并且起源于同一或不同的生物体的蛋白质。在糖蛋白Ibα融合蛋白质内，糖蛋白Ibα多肽可以与Ibα蛋白质的所有或部分相对应。
在一个实施方案中，糖蛋白Ibα融合蛋白质至少包括糖蛋白Ibα蛋白质的一个生物活性部分。在另一个实施方案中，糖蛋白Ibα融合蛋白质至少包括糖蛋白Ibα蛋白质的两个生物活性部分。仍然在另一个实施方案中，糖蛋白Ibα融合蛋白质至少包括糖蛋白Ibα蛋白质的三个生物活性部分。在融合蛋白质内，术语“可操作地连接”打算表示化学地连接的第一个和第二个多肽(最通常是通过共价键如肽键)，连接的方式是允许至少一个官能团与糖蛋白Ibα多肽连接。当用于指编码糖蛋白Ibα融合多肽的核酸时，术语可操作地连接指编码糖蛋白Ibα多肽和非糖蛋白Ibα多肽的核酸在阅读框架内相互融合。非糖蛋白Ibα多肽可以与糖蛋白Ibα多肽的N末端或C末端融合。
在其他实施方案中，糖蛋白Ibα融合蛋白质可以连接到一个或多个其他成分上。例如，糖蛋白Ibα融合蛋白质可以另外连接GST融合蛋白质，其中糖蛋白Ibα融合蛋白质序列是与GST(即，谷硫氨酸S-转移酶)序列的C末端融合。这样的融合蛋白质可以简化糖蛋白Ibα融合蛋白质的纯化。
在另一个实施方案中，融合蛋白质包括在异源的信号序列的5‘末端中(即，多肽序列不存在于糖蛋白Ibα核酸编码的多肽中)。例如，可以除去天然的糖蛋白Ibα信号序列，并且可以用来自另一个蛋白质的信号序列来取代。在一些寄主细胞(例如，哺乳动物寄主细胞)中，糖蛋白Ibα的表达和/分泌可以通过利用异源信号序列来增强。
本发明的嵌合或融合蛋白质可以用标准的重组DNA技术来生产。例如，编码不同的多肽序列的DNA片段是根据常规的技术在阅读框架内连接的，这些技术例如利用末端钝化或末端交错切口的末端来连接，限制酶消化；来提供适当的末端，如果恰当填充在粘合的末端，碱性磷酸酶处理来避免不需要的连接，和酶连接。在另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术来合成，包括自动DNA合成仪。或者，可以利用随后退火和再扩增产生嵌合基因序列的两个连续的基因片段之间产生互补突出的锚引物碱性基因片段的PCR扩增(参见例如，Ausubel et al(eds)，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley & Sons，1992)。另外，许多表达载体是商业可得的，编码融合成分(例如，免疫球蛋白重链的Fc区域)。编码核酸的糖蛋白Ibα可以克隆进这样一个表达载体，以致融合成分与免疫球蛋白在框架内连接。
在各种实施方案中，糖蛋白Ibα融合多肽包括SEQ ID NO：1-6的一个或多个序列的氨基酸序列。
糖蛋白Ibα融合多肽可以作为寡聚物存在，如二体或三体。优选地，糖蛋白Ibα融合多肽是二体。
编码第一个多肽的第一个多肽和/或核酸可以利用GPIbα编码序列构建，这是本领域已知的，并且在例如欧洲专利申请公开物No.0317 278 A2和Lopez et al.84：5615-19，1987中有叙述。GPIbα多肽的其他来源和编码GPIbα多肽的核酸包括基因库登记号BAB12038和AB038516，D85894和BA12911(人序列)，和基因库登记号AAC53320和U91967，并且以全文引入作为参考。
在一些实施方案中，GPIbα多肽成分作为变异体GPIbα多肽提供，GPIbα多肽在天然存在的GPIbα序列(野生型)中具有一个突变，导致GPIβα多肽与白细胞表面分子的高亲和力(相对于非突变序列)的结合。例如，突变的多肽可以高亲和力结合VonWillebrand因子(vWF)。这一增强的反应性，或超应答性可以来源低浓度的瑞斯托菌素可以获得的。或者，确定多肽与vWF的反应性的任何其他适当的方法也可以用于鉴定与vWF具有“更多”反应性的多肽，即比天然存在的野生型GPIbα具有更多的反应性。高亲和力结合vWF的GPIbα多肽变异体的例子包括在GPIbα多肽的铰合区具有序列变化的GPIbα变异体。铰合区定义为包括残基220-310的区域，并且报道是GPIbα多肽内的大的结合位点。在结合区的突变包括在残基233的那些，它在野生型GPIbα中编码甘氨酸。缬氨酸取代甘氨酸233是优选的，但其他氨基酸也可以被取代。在铰合区的第二个突变位点是残基239，它在野生型GPIbα中编码甲硫氨酸。缬氨酸取代甘氨酸239是优选的，其他氨基酸也可以被取代。适于在本发明的融合多肽中利用的GPIbα多肽的铰合区域突变体在位置233和239具有突变燕麦残基(参见例如，Dong et al.，JBC 275：3627663-27670(2000))。所以，本发明包括在位置239具有取代的融合蛋白，例如突变体GPIbα多肽的M239V取代。同样包括在本发明内得失在位置233具有取代的融合蛋白，例如G233V，同样包括在本发明内的是在233和239的位置上的突变体GPIbα多肽，例如G233V和M239V取代。
在一些实施方案中，GPIbα多肽成分提供作为在天然存在的GPIbα序列(野生型)中具有突变的变异体GPIbα多肽，导致GPIbα序列对蛋白质水解更具抗性(相对于非突变序列)。在天然存在的GPIbα序列中的胰蛋白酶位点已经有叙述(参见例如，Titani et al，PNAS 84：5610-5614(1987))。
在一些实施方案中，第一个多肽包括全长GPIbα多肽，或者第一个多肽具有比全长GPIbα多肽小的序列。例如，在长度上小于600个氨基酸的第一个多肽，例如小于或等于500，250，150，100，50或25个氨基酸长度。
第一个多肽的例子包括具有GPIbα多肽序列GP1b302(SEQID NO：7)，GP1b302/2A(SEQ ID NO：8)，GP1b/4X(SEQ ID NO：9)，GP1b290(SEQ ID NO：10)，GB1b290/2V(SEQ ID NO：11)和GB1b290/1A(SEQ ID NO：12)的任何一个的氨基酸序列.
HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNL
DR
CELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGEL
QE
LYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKG
FF
GSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKF
PV
YKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVRATRTVVKFPTKA (SEQ ID NO：7)
HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNL
DR
CELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGEL
QE
LYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKG
FF
GSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKF
PV
YKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVAATATVVKFPTKA (SEQ ID NO：8)
HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNL
DR
CELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGEL
QE
LYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKG
FF
GSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQVVDVKAVTSNVASVQCDNSDKF
PV
KYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVAATATVVKFPTKA (SEQ ID NO：9)
HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNL
DR
CELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGEL
QE
LYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKG
FF
GSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVKAMTSNVASVQCDNSDKF
PV
YKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR (SEQ ID NO：10)
HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNL
DR
CELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGEL
QE
LYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKG
FF
GSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQVVDVKAVTSNVASVQCDNSDKF
PV
YKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR (SEQ ID NO：11)
HPICEVSKVASHLEVNCDKRNLTALPPDLPKDTTILHLSENLLYTFSLATLMPYTRLTQLNL
DR
CELTKLQVDGTLPVLGTLDLSHNQLQSLPLLGQTLPALTVLDVSFNRLTSLPLGALRGLGEL
QE
LYLKGNELKTLPPGLLTPTPKLEKLSLANNNLTELPAGLLNGLENLDTLLLQENSLYTIPKG
FF
GSHLLPFAFLHGNPWLCNCEILYFRRWLQDNAENVYVWKQGVDVAAMTSNVASVQCDNSDKF
PV
YKYPGKGCPTLGDEGDTDLYDYYPEEDTEGDKVR (SEQ ID NO：12)
可以包括在融合蛋白中的信号肽是MPLLLLLLLLPSPLHP(SEQ ID NO：13)。如果需要，在具有GPIbα成分的多肽成分和第二个多肽成分之间另外插入了一个或多个氨基酸。
第二个多肽优选地是可溶的。在一些实施方案中，第二个多肽增长了连接多肽的半衰期(例如，血清的半衰期)。在一些实施方案中，第二个多肽包括简化融合多肽与第二个GPIbα多肽的结合。在优选的实施方案中，第二个多肽至少包括免疫球蛋白多肽的区域。免疫球蛋白融合多肽是本领域已知的，并且在例如美国专利号5,516,964；5,225,538；5,428,130；5,514,582；5,714,147；和5,455,165中有叙述。
在一些实施方案中，第二个多肽包括全长免疫球蛋白多肽。或者，第二个多肽包括比全长免疫球蛋白多肽小的序列，例如重链，轻链，Fab，Fab2，Fv，或Fc。优选地，第二个多肽包括免疫球蛋白多肽的重链。更优选地，第二个多肽包括免疫球蛋白多肽的Fc区域。
在本发明的另一个方面，第二个多肽具有较小的效应器功能，即野生型免疫球蛋白重链的Fc区域的效应器功能。Fc效应器功能包括例如，Fc受体结合，互补固定和T细胞消耗活性。(参见例如，美国专利号6,136,310)，测试T细胞消耗活性，Fc效应器功能，和抗体稳定性的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，第二个多肽具有低的或没有Fc受体的亲和力。在或选的实施方案中，第二个多肽具有低的或没有互补的蛋白质Clq的亲和力。
优选的第二个多肽序列包括SEQ ID NO：12的氨基酸序列。这一序列包括Fc区域。下面划线的氨基酸是与野生型免疫球蛋白序列的对应位置中发现的氨基酸不同的那些：
HTCPPCPAPE
ALG
APSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP
VPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP
SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO：14)
编码SEQ ID NO：1-6的DNA序列公开在下面，是SEQ IDNO：15-20各个序列：
GP1b302-Ig核苷酸序列
atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtga
ggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgc
ctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttc
tccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagct
caccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatc
agctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctcc
ttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagct
ctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagc
tggagaagctcagtctggctaacaacaacttgactgagctccccgctgggctcctgaatggg
ctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggctt
ttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtg
agatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaa
ggtgtggacgtcaaggccatgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaa
gtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacag
acctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtgcgtgccacaaggact
gtggtcaagttccccaccaaagcgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagc
cctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctccc
ggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc
aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagta
caacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca
aggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctcc
aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagat
gaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccg
tggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggac
tccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggg
gaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc
tctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO：15)
GP1b302/2A-Ig核苷酸序列
atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtga
ggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgc
ctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttc
tccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagct
caccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatc
agctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctcc
ttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagct
ctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagc
tggagaagctcagtctggctaacaacaacttgactgagctccccgctgggctcctgaatggg
ctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggctt
ttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtg
agatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaa
ggtgtggacgtcaaggccatgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaa
gtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacag
acctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtggctgccacagcgact
gtggtcaagttccccaccaaagcgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagc
cctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctccc
ggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc
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aggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctcc
aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagat
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tggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggac
tccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggg
gaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc
tctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO：16)
GP1b302/4X-Ig核苷酸序列
atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtga
ggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgc
ctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttc
tccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagct
caccaagctccaggtcgatgggacgctgccagtgctggggaccctggatctatcccacaatc
agctgcaaagcctgcccttgctagggcagacactgcctgctctcaccgtcctggacgtctcc
ttcaaccggctgacctcgctgcctcttggtgccctgcgtggtcttggcgaactccaagagct
ctacctgaaaggcaatgagctgaagaccctgcccccagggctcctgacgcccacacccaagc
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ctggagaatctcgacacccttctcctccaagagaactcgctgtatacaataccaaagggctt
ttttgggtcccacctcctgccttttgcttttctccacgggaacccctggttatgcaactgtg
agatcctctattttcgtcgctggctgcaggacaatgctgaaaatgtctacgtatggaagcaa
gtggtggacgtcaaggccgtgacctctaacgtggccagtgtgcagtgtgacaattcagacaa
gtttcccgtctacaaatacccaggaaaggggtgccccacccttggtgatgaaggtgacacag
acctatatgattactacccagaagaggacactgagggcgataaggtggctgccacagcgact
gtggtcaagttccccaccaaagcgcggccgcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagc
cctgggggcaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctccc
ggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc
aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagta
caacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggca
aggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctcc
aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagat
gaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccg
tggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggac
tccgacggccccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggg
gaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc
tctccctgtctccgggtaaa (SEQ ID NO：17)
GP1b290-Ig核苷酸序列
atgcctctcctcctcttgctgctcctgctgccaagccccttacacccccaccccatctgtga
ggtctccaaagtggccagccacctagaagtgaactgtgacaagaggaatctgacagcgctgc
ctccagacctgccgaaagacacaaccatcctccacctgagtgagaacctcctgtacaccttc
tccctggcaaccctgatgccttacactcgcctcactcagctgaacctagataggtgcgagct
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GP1b290/2V-Ig核苷酸序列
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GP1b290/1A核苷酸序列
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本发明的另一个方面涉及载体，优选地是表达载体，含有编码糖蛋白Ibα融合多肽，或衍生物，片段，类似物或其同源物的核酸。如本文所用，术语“载体”指能够运输另一个已经连接的核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，指环双链DNA环，其中可以连接其他的DNA片段。另一类型的载体是病毒载体，其中其他的DNA片段可以连接进病毒基因组。一些载体能够在它们导入的寄主中自我复制(例如，具有复制的细菌原点的细菌载体和附加的哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加哺乳动物载体)是在导入寄主细胞时导入寄主基因组中的，并且从而沿着寄主基因组复制。另外，一些载体能够指导它们可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中利用的表达载体经常的形式是质粒。在本申请书中，“质粒”和“载体”可以相互变化地作为质粒利用，这是最常用的载体形式。但是，本发明打算包括这样的其他的表达载体形式，如病毒载体(例如，复制缺陷逆病毒，腺病毒，和腺相关病毒)，具有相当的功能。
本发明的重组表达载体包括适于在寄主细胞中表达该核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一个或多个在带用于表达的寄主细胞的基础上选择的调节序列，这是与带表达的核酸序列可操作地连接的。在重组表达载体内，“可操作地连接”指需要的核苷酸序列与调节序列以允许核苷酸序列表达的方式连接(例如，当将载体导入寄主细胞中死在体外转录/翻译系统或寄主细胞中)。
术语“调节序列”打算包括启动子，增强子和其他表达对照元素(例如，聚腺苷酸化信号)。这样的调节序列例如在Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS INENZYMOLOGY 185，学术出版社，圣迭戈，加州(1990)中有叙述。调节序列包括那些指导许多类型的寄主细胞中构成性第表达核苷酸序列的那些，呵指导仅仅在一些寄主比中核苷酸序列的表达的那些(例如，组织特异调节序列)。令本领域技术人员满意的是，表达载体的设计可以依赖于这样的因子，如选择带转化的寄主细胞，需要的蛋白质的表达水平等等。本发明的表达载体可以导入寄主细胞，从而产生蛋白质或肽，包括本文所述的核酸编码的融合蛋白质或肽，(例如，糖蛋白Ibα融合多肽，糖蛋白Ibα融合多肽的突变形式等等)。
本发明的重组表达载体可以设计成在原核或真核细胞中表达糖蛋白Ibα融合多肽的。例如，糖蛋白Ibα融合多肽可以在细菌细胞中表达，例如大肠杆菌，昆虫细胞(利用杆状病毒表达载体)，酵母细胞或哺乳动物细胞。适当的寄主细胞进一步在Goeddel，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS INENZYMOLOGY 185，学术出版社，圣迭戈，加州(1990)中讨论。或者，可以转录和在体外翻译重组表达载体，例如利用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
在带有含有指导融合或非融合蛋白质的表达的构成性或可诱导启动子的载体的大肠杆菌中经常较小蛋白质在原核生物中的表达。融合载体在其中编码的蛋白质的许多氨基酸到重组蛋白质的氨基末端。这样的融合载体通常是有三个目的：(i)增强重组蛋白质的表达；(ii)增强重组蛋白质的可溶性；和(iii)通过作为亲和纯化中的配体在重组蛋白质的纯化中辅助。通常，在融合表达载体中，将蛋白质水解裂解位点导入融合成分和重组蛋白质的接合处，能够从随后进行融合蛋白质的纯化的融合成分中分离重组蛋白质。这样的酶，和它们的同源识别序列，包括因子Xa，凝血素和肠激素酶。通常融合表达载体包括pGEX(药学生物技术公司；Smith and Johnson，1988，Gene 67：31-40)，pMAL(新英格兰生物实验室，Beverly，Mass)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J)，其中融合了谷光甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白质，或蛋白质A和目标重组蛋白质。
适当的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amrann et al.，(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier etal.，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY；METHODS INENZYMOLOGY 185，学术出版社，圣迭戈，加州(1990)60-89)。
使大肠杆菌中的重组蛋白质表达的最大的一个方案是在蛋白质水解重组蛋白质的能力受损伤的寄主细菌中表达蛋白质。参见例如，Gottesman，GENE EXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY 185，学术出版社，圣迭戈，加州(1990)119-128。另一个方案是，改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，以致各个氨基酸的各个密码子是那些优选在大肠杆菌中利用的(参见例如，Wada，et al.，1992.Nucl.Acids Res.20：2111-2118)。本发明的核酸序列的这样的变化可以通过标准的DNA合成技术来进行。
在另一个实施方案中，糖蛋白Ibα融合多肽表达载体是酵母表达载体。在啤酒酵母中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari，et al.，1987.EMBO J.6：229-234)，pMFa(Kurjan and Herskowitz，1982，Cell 30：933-943)，pJRY88(Schultz et al.，1987. Gene54：113-123)，pYES2(Invitrogen公司，圣迭戈，加州)和picZ(InVitrogen公司，圣迭戈，加州)。
或者，利用杆状病毒表达载体，在昆虫细胞中可以表达糖蛋白Ibα融合多肽。在培养昆虫细胞中(例如，SF9细胞)中可以表达蛋白质的杆状载体包括pAc系列(Smith，et al.，1983，Mol.Cell.Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow and Summers，1989.Virology 170：31-39)。
仍然在另一个实施方案中，本发明的核酸是利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达的。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，1987，自然329：840)和pMT2PC(Kaufman，et al.，1987.EMBO J.6：187-195)。当在哺乳动物细胞中利用时，经常由病毒调节元素提供表达载体的控制功能。例如，通常利用的启动子是从多形瘤，腺病毒2，巨细胞瘤病毒和猴的病毒40中起源的。对于其他适当的原核细胞和真核细胞中的表达系统都可以参见例如Sambrook，et al.，分子克隆：实验室操作手册第二版，冷泉港实验室，冷泉港出版社，冷泉港，纽约，1989的第16章和17章。
在另一个实施方案中，重组的哺乳动物表达载体能够优选地指导特别细胞类型中的核酸的表达(例如，组织特异调节元素可用于表达核酸)。组织特异调节元素是本领域已知的。适当的组织特异启动子的非限制例子包括白蛋白启动子(肝特异；Pinkert，et al.，1987，Gene Dev.1：268-277)，淋巴特异启动子(Calame andEaton，1988.Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体启动子(Winoto and Baltimore，1989.EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji，et al.，1983，Cell 33：729-740；Queen andBaltimore，1983.Cell 33：741-748)，神经元特异启动子(例如，神经丝启动子，Byrne and Ruddle，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5473-5477)，胰脏特异启动子(Edlund，et al.，1985.Science230：912-916)，和乳腺特异启动子(例如，奶乳启动子，美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。发育调节启动子也包括在其中，例如小鼠贺克启动子(Kessel and Gruss，1990.Science 249：374-379)和α-胎儿蛋白质启动子(Campes andTilghman，1989.Gene Dev.3：537-546)。
本发明进一步提供含有在反义方向克隆进表达载体的本发明的DNA分子的重组表达载体。即，DNA分子以允许表达与NOV糖蛋白Ibα融合多肽mRNA反义的RNA分子(通过转录DNA分子)的方式操作性地连接调节序列。可以选择操作性地连接反义方向克隆的核酸的调节序列，指导许多细胞类型中反义RNA分子的连续表达，例如，病毒启动子和/或增强子，或可以选择调节序列，指导构成性的组织特异的或特异细胞类型的反义RNA的表达。反义表达载体可以是重组质粒，噬菌体质粒或减毒病毒，其中反义核酸是在高效调节区的控制下产生的，其活性可以通过载体导入的细胞类型来确定。为了利用反义基因讨论基因表达的调节，参见例如Weintraub，et al.，“作为基因分析的分子工具的反义RNA“，Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986。
本发明的另一方面涉及已经导入本发明的重组表达载体的寄主细胞。术语“寄主细胞“和”重组寄主细胞“在本文中可互换使用。应当理解这样的术语不仅指特别的受试者细胞而且指这样的细胞的子代或潜在的子代。因为在随后的子代中由于突变或环境的影响可以发生一些修饰，这样的子代事实上不可能与亲本细胞相同，但仍然包括在本文所用的术语的范围内。
寄主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，糖蛋白Ibα融合多肽可以在细菌细胞如大肠杆菌细胞，酵母或哺乳动物细胞(如人，中国仓鼠细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其他适当的寄主细胞是本领域技术人员已知的。
载体DNA可以通过常规的转化或转染技术导入原核或真核细胞。如本文所用，术语“转化“和”转染“是指在寄主细胞中导入外源核酸(例如，DNA)的各种本领域内认识到的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE葡聚糖介导的转染，脂转染，或电穿孔。适当的转化或转染寄主细胞的方法可以在Sambrook，et al(MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL.第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)中找到，和其他实验室手册。
对于稳定转染哺乳动物细胞，已知根据利用的表达载体和转染技术，仅小部分细胞可以整合外源DNA到它们的基因组。为了鉴定和选择这些整合体，编码可选择的标记(例如，抗性或抗生素)的基因通常是导入具有需要的基因的寄主细胞中。各种可选择的标记包括给予药物抗性的那些，如G418，潮霉素和氨甲喋呤。编码可选择标记的核酸可以在同一载体上导入寄主细胞中，因为它编码糖蛋白Ibα融合多肽，或可以在分开的载体上导入。用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择来鉴定(例如，已经掺入可选择标记基因的细胞将生存，而其他细胞将死亡)。
本发明的寄主细胞如培养物中的原核或真核寄主细胞可以用于生产(即表达)糖蛋白Ibα融合多肽。因此，本发明进一步提供了利用本发明的寄主细胞生产糖蛋白Ibα融合多肽的方法。在一个实施方案中，该方法包括在适当的培养基中培养本发明的寄主细胞(其中编码糖蛋白Ibα融合多肽的重组表达载体已经导入)，以致产生糖蛋白Ibα融合多肽。在另一个实施方案中，该方法进一步包括从培养基或寄主细胞中分离糖蛋白Ibα融合多肽。
利用常规技术如萃取，沉淀，层析，亲和层析，电泳或等等可以分离或纯化融合多肽。例如，将溶液通过含有固定蛋白质A或蛋白质G的柱可以纯化免疫球蛋白融合蛋白质，这些柱上的蛋白质选择性地结合融合蛋白质的Fc部分，参见例如，Reis，K.J.，et al.，免疫学杂志，132：3098-3102(1984)；PCT申请，公开号WO87/00329。融合多肽可以通过用离液序列高的盐处理或通过用乙酸水溶液(1M)来洗脱。
或者，本发明的融合多肽可以利用本领域已知的方法化学地合成。多肽的化学合成如下有叙述，如本领域常用的各种蛋白质合成的方法，包括利用肽合成仪的合成，参见例如肽化学，APractical Textbook，Bodasnasky，Ed. Springer-Verlag，1988；Merrifield，Science232：241-247(1986)；Barany，et al.，Intl.J.Peptide Protein Res.30：705-739(1987)；Kent，Ann.Rev.Biochem.57：957-989(1988)，和Kaiser，et al.，Science 243：187-198(1989)。利用标准肽纯化技术纯化多肽以致它们基本无化学前体，或其他化学物。术语“基本无化学前体或其他化学物”包括制备肽，其中肽是从化学前体或前体参与肽的合成的化学物中分离的。在一个实施方案中，术语“基本无化学前体或其他化学物”包括制备的肽少于约30％(干重)化学物或非肽化学物，更优选地少于20％化学前体或非肽化学物，更优选地少于10％的化学前体或非肽化学物，最优选地少于5％的化学前体或非肽化学物。
肽的化学合成简化了修饰的或非天然的氨基酸的掺入，包括D氨基酸和其他小的有机分子。在具有对应的D氨基酸同工型的肽中的一个或多个L氨基酸的取代可以用于增强肽对酶水解的抗性，和增强一个或多个生物活性肽的特性，即受体结合，功能潜力或作用的持久性。参见例如，Doherty，et al.，1993，J.Med.Chem.36：2585-2594；Kirby，et al.，1993，J.Med.Chem.36：3802-3808；Morita，et al.，1994，FEBS Lett.353：84-88；Wang，etal.，1993，Int.J.Pept.Protein Res.42：392-399；Fauchere andThiumieau，1992.Adv.Drug Res.23：127-159。
在肽序列中导入共价交联键可以在构型上和在几何学上约束多肽骨架。这一方法可以用于开发具有增强的势，选择性和稳定性的融合多肽的肽类似物。因为环肽的构型熵是比它的线性部分低，采用特异的构型可以与采用比环类似物更小的降低的环类似的熵同时进行，从儿产生结合可容易的自由能。大的环化经常通过在肽N和C末端之间，在侧链和N或C末端之间形成酰胺键来完成[例如，K3Fe(CN)6的pH8.5](Samson et al.，内分泌学，137：5182-5185(1966))，或在两个氨基酸侧链之间形成酰胺键。参见例如，DeGrado，Adv Protein Chem，39：51-124(1988)。也将二硫键导入线性序列中降低它们的灵活性。参见例如，Rose，et al.，Adv Protein Chem，37：1-109(1985)；Mosberg et al.，Biochem Biophys Res Commun，106：505-512(`1982)。另外，用青霉胺(Pen，3-巯基-(D)缬氨酸)代替半胱氨酸残基已经用于增强一些阿片样物质受体相互作用的选择性。Lipkowski and Carr，肽：合成，结构和应用，Gutte，ed.，学术出版社，287-320页(1995)。
包括糖蛋白Ibα融合多肽或编码其的核酸的药物组合物
本发明的糖蛋白Ibα融合蛋白质，或编码这些融合蛋白质(在本文中也称为“治疗”或“活性化合物”)的核酸分子和其衍生物，片段，类似物和同源物可以掺入适于给药的药物组合物。
这样的组合物通常包括核酸分子，蛋白质或抗体和药物可接受载体。如本文所用，“药物可接受载体”包括与药物的给药方法可相适应的任何或所有溶剂，分散介质，包衣，抗细菌和抗真菌试剂，等渗和吸收延迟剂，等等。适当的载体在最近编辑的Remington药物科学，本领域的标准参考文献中有叙述，该文献引入作为参考。这样的载体的优选的例子包括，但不限于水，盐水，finger溶液，葡聚糖溶液，和5％人血清白蛋白。脂质体和非水溶液载体如固定油也可以利用。药物活性物质的这样的介质和试剂的利用是本领域已知的。除了与活性化合物不兼容的常规介质或试剂，它们在组合物中的用途都应该受到关注。补充的活性化合物也可以掺入这些组合物。
本文公开的活性试剂也可以作为脂质体配制。脂质体是用本领域已知的方法制备的，方法如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030(1980)；和美国专利号4,485,045和4,544,545中有叙述。循环时间增加的脂质体在美国专利号5,013,556中有公开。
利用逆相蒸发方法可以生产特别利用的脂质体，脂组合物含有磷脂酰胆碱，胆固醇，和PEG派生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。脂质体是通过确定孔大小的滤纸来产生的，产生需要直径的脂质体。
本发明的药物组合物是配制成与它的需要的给药途径相容的形式的。给药的途径的例子包括肠胃外的，例如，静脉内的，皮内的，皮下的，口服的(例如，吸入)，经皮的(例如，局部的)，经粘膜的和直肠给药。用于肠胃外的，皮内的，或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括下面的成分：无菌稀释液如用于注射的水，盐溶液，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇，或其他合成溶剂；抗细菌试剂如苯乙醇或甲基对甲基苯甲酸；抗氧化剂如抗坏血酸或二硫酸钠，螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液如乙酸，柠檬酸或磷酸，和用于调节张力的试剂如氯化钠或葡聚糖。可以用酸或碱调节pH，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可以包容在安瓿中，可处置针筒或玻璃或塑料制造的多倍剂量小瓶。
适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水可溶)或分散液呵无菌粉末，用于制备无菌可注射溶液或分散液。对于静脉内给药，适当的载体包括生理盐，无细菌的水，CremophorELTM(BASF，Parsippany，N.J.)，或磷酸缓冲盐(PBS)。在所有情况中，组合物必须是无菌的，并且应该是液体，容易用针筒。必须在制造和储存条件下稳定，并且必须对微生物如细菌和真菌的污染是可防腐的。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水，乙醇，聚醇(例如，甘油，丙二醇，和液体聚乙二醇等等)，它们的适当的混合物。可以保持适当的液体性，例如利用包衣如卵磷脂，在分散液的情况中维持需要的颗粒大小，和利用表面活性剂。防止微生物的作用可以用各种抗细菌和抗真菌试剂，例如，对甲基苯甲酸，氯丁醇，酚，抗坏血酸，硫柳汞，等等。在许多情况中，在组合物中包括等渗剂，例如糖，聚乙醇如甘露醇，山梨醇，氯化钠是优选的。可注射的组合物的延长吸收可以在组合物中包括延长吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
无菌可注射溶液可以在适当的溶剂中掺入需要量的活性化合物和如果需要在过滤灭菌后与上面的成分的一种或联合来混合制备。通常，在无菌载体中掺入需要的化合物来制备分散剂，其中含有基本的分散介质和来自上面的那些中的需要的其他成分。
口服组合物通常包括在惰性稀释剂或可食载体中。它们可以包括在明胶胶囊中或压缩成片剂。为了口服治疗给药的目的，活性化合物可以与赋形剂一起掺入，并且以片剂，锭剂，或胶囊的形式使用。口服组合物也可以利用液体载体来制备，用作口洗剂，其中在液体载体中的化合物是口服利用的，并且洗，咳出或咽下。药物兼容结合剂和/或佐剂物质可以作为组合物部分包括在内。片剂，丸剂，胶囊，锭剂等等可以含有任何下面的成分，或相同特性的化合物：结合剂如微结晶纤维素，黄氏胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，离解剂如褐藻酸，Primogel，或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；滑移剂如胶质二氧化硅；调味剂如蔗糖或糖精；调味剂如胡椒粉，甲基唾液酸或橙味调味剂。
对于吸入给药，化合物是以从压力容器中或含有适当的推进剂例如二氧化碳的气体的配出器或喷雾器中气雾喷洒的形式来递送的。
系统给药也可以是经粘膜或经皮的方法。对于经粘膜或经皮的给药，适于待渗透的屏障的渗透剂使用在配方中。这样的渗透剂通常是本领域已知的，并且对于经粘膜的给药包括例如去垢剂，胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜的给药可以通过利用鼻喷洒或栓剂来完成。对于经皮的给药，活性化合物配制成油膏，药膏，凝胶或奶液，如通常本领域已知的那些。
化合物也可以制备成栓剂(例如，与常规的栓剂基质如可可油和气体甘油)或直肠递送的滞留灌肠液的形式。
在一个实施方案中，制备的活性化合物中含有保护化合物使不从体内快速消除的载体，如控制释放的配方，包括植入剂和未包囊递送系统。可生物降解的，生物兼容的多聚物可以利用，如乙二烯乙酸，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原，聚正酯，和聚乙酸。制备这样的配剂的方法是本领域技术人员已知的。这些物质也可以从Alza公司和Nova药物公司商业得到。脂质体悬浮液(包括目标用病毒抗原的单克隆抗体感染细胞的脂质体)也可以用作药物可接受载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，如美国专利号4,522,811中所述。
在一些实施方案中，口服或肠胃外组合物配制成容易给药的剂量单位形式和均一的剂量形式。如本文所用的剂量单位形式对于待治疗的受试者是指适于作为联合剂量的物理分散单位；每个单位含有预定量的计算产生需要的治疗效果的活性化合物和需要的药物载体。本发明的剂量单位形式的特异性是由直接依赖独特的活性化合物的特征和待达到的特别的治疗效果和本化学领域内在的限制如用于治疗个体的活性化合物来支配的。
本发明的核酸分子可以插入载体中，并且用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射，局部给药(参见例如，美国专利号5,328,470)或通过立体注射(参见例如，Chenet al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3054-3057)递送给受试者。基因治疗载体的药物制备可以在可接受的稀释剂中包括基因治疗载体，并且可以含有慢释放基质，其中包埋了基因递送载体。或者，当可以从重组细胞中完整地产生完全的基因递送载体，如逆病毒载体，药物制剂可以包括一个或几个产生基因递送系统的细胞。
如果需要可以制备持续释放的制剂。适当的持续释放制剂的例子包括固体疏水多聚体的半可渗透基质，含有抗体，基质的形式是成形颗粒形式，如薄膜，或微胶囊。持续释放的基质的例子包括聚酯，水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基异丁烯酸盐)，或聚(乙烯醇)，聚乳酸(美国专利号，3,773,919)，L谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物，非可降解乙烷乙烯乙酸，可降解的乳酸-甘氨酸共聚物如LUPRON-DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和leuprolide乙酸组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)3-羟丁酸。当多聚物如乙烷乙烯乙酸和乳酸-乙醇酸能够在100天内释放分子，一些水凝胶在较短的时期释放蛋白质。
药物组合物可以包括在容器，包装，或配出器中，附带有给药的说明书。
在生物系统中抑制黏连的方法
同时包括在本发明中的是抑制血液细胞与生物系统中的生物组织的黏连的方法。该方法包括在生物系统中加入足以抑制血液细胞与生物组织的黏连的量的融合多肽。
血液细胞例如可以是白细胞，血小板或红血细胞。白细胞可以是任何白细胞，能够黏连到生物组织。在各个方面来说，白细胞是粒细胞(即，嗜中性的，嗜碱性的或嗜红性的)，单核细胞(即，巨噬细胞)或淋巴细胞(例如，T淋巴细胞，B淋巴细胞，肿瘤渗滤淋巴细胞或天然杀伤细胞)。在一些实施方案中，白细胞表达β2整合素，例如Mac-1。或者，白细胞表达了选择素配体。
同时包括在本发明中的是抑制生物系统中蛋白质与生物组织的黏连的方法。该方法包括在生物系统中加入足以抑制蛋白质与生物组织的黏连的量的融合多肽。
蛋白质可以是与膜连接的(例如，共价地，非共价地，离子键地)。或者，蛋白质可以是可溶形式(即在溶液中)。蛋白质是von Willibrand因子，凝血素，糖蛋白Ibα的P选择素。
如本文所用，“生物组织”指包括一个或多个细胞，有或没有细胞内物质(例如，细胞外基质蛋白质，聚多糖和蛋白糖)。生物组织也包括唯一的细胞外基质物质，如皮下结缔组织基质。在一些方面，生物组织是血管内皮。生物组织可以是一个或多个血小板或白细胞。在各个方面来看，生物组织是与GPIb-IX-V复合物如糖蛋白Ibα，Mac-1，P-选择素，凝血素或von Willibrand因子复合的。“复合”是指生物组织含有GPIb-IX-V复合物成分的可溶形式。或者“复合”指生物组织含有表达GPIb-IX-V复合物的成分的细胞。
如本文所用，生物系统指包括含有生物成分的任何系统，如细胞，蛋白质，碳水化合物，脂或核酸。生物系统可以是体内，来自体内或体外的系统。
“黏连”指包括任何白细胞生物相互作用，例如，成卷，固定附着或特定的相互作用。
抑制血液细胞或蛋白质与生物组织的黏连可以利用本领域已知的方法来测量。例如，检测糖蛋白Ibα与生物组织的结合的实验如Simon et al.，J.Exp.Med.192：193-204，2000中所述，文献引入作为参考。在各个实施方案中，GPIbα融合蛋白质的结合抑制了血液细胞或蛋白质与生物组织的结合，至少有30％，50％，75％，90％，95％，99％或99.9％。
黏连也可以在更大或更小的生理流动条件下评价，包括静止条件和系列应用静止和剪切条件。黏连可以例如用比色，荧光计，流动细胞计或利用平行平板流动室实验来确定。
同样包括在本发明中的是通过对受试者给药生物活性治疗化合物(下文中“治疗性”)在受试者治疗血小板激活相关的紊乱的方法。或者受试者也给药一种或多种下面的乙酰唾液酸，例如，阿斯片林肝素，例如，未分离的或低分子量的肝素，糖蛋白Iib/IIIa拮抗剂，氯吡哆，P-选择素拮抗剂，凝血素抑制剂或溶栓酶。
受试者可以例如是任何哺乳动物，例如人，灵长类，小鼠，大鼠，狗，猫，牛，马，猪。
治疗剂包括例如：(i)任何一种或多种糖蛋白Ibα融合多肽，和其衍生物，片段，类似物和同源物，(ii)直接抗糖蛋白Ibα融合多肽的抗体；和(iii)编码糖蛋白Ibα融合多肽的核酸，和其衍生物，片段，类似物和同源物。
基本上，任何紊乱在病原学上与血小板激活相关，认为是都可以预防或治疗的。紊乱可以例如是血管炎症，动脉硬化，再狭窄(例如，气球成形术相关的再狭窄)和/或与血栓疾病相关的症状，例如咽痛(即，稳定的咽痛和不稳定的咽痛)，急性心肌梗死，休克，静脉血栓或动脉血栓。
本发明将进一步在下面的非限制性实施例中说明。
实施例1：重组GP1B-IG融合蛋白质的产生和纯化
通过重组方法可以产生三个GP1b-Ig融合蛋白质，GP1b302-Ig(SEQ ID NO：1)，GP1b290Ig(SEQ ID NO：4)，和GP1b290/2V-Ig(SEQ ID NO：5)并且纯化。用线性质粒DNA稳定转染没有二氢叶酸还原酶(DHFR)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，质粒DNA中含有指导含有DHFR可选择标记基因的GP1b-Ig编码区中顺反子方式的转录的哺乳动物表达载体。在含有氨甲喋呤(MTX)的培养基中选择候选的表达细胞，方法基本如Kaufmanet al.Nucleic Acids Res.(1991)19：4485-90中所述。为了收集GP1b-Ig调节的培养基，CHO细胞在5-20培养盘(150mm直径)中生长到接近融合水平，细胞单层用PBS洗涤两次，培养细胞将近24小时，培养基中没有胎牛血清。然后收集培养基，丢弃细胞。
将CHO细胞条件培养基(CM)调节到50mM Tris pH8.0，200mM NaCl，通过0.2uM滤纸过滤，加到Poros蛋白质A柱上。用10个柱体积的50mM Tris pH8.0，200mM NaCl洗涤，并且用Pierce IgG洗脱缓冲液洗脱。接着在280nM处测量蛋白质峰的吸光值。用0.1个体积的1M Tris，pH8.0调节洗脱物的pH。然后，浓缩蛋白质，对TBS(10mM Tris，pH8.0，150mM NaCl)用手指分析(25kD MWCO)交换缓冲液。然后，通过在TBS中的TosoHaasG3000SW柱上凝胶过滤层析进一步纯化浓缩的蛋白质。
通过Western印迹分析纯化的蛋白质。简要地说，在4-20％还原SDS PAGE凝胶上的每道上加载13微升CHO细胞的调节培养基。利用Electroblot仪器和硝酸纤维素膜(Novex，SanDiego，CA)进行Western转移。最初检测的抗体是单克隆AP1，次级抗体是HRP-共轭山羊抗小鼠IgG(GTI，Brookfield，WI)。HRP检测是通过ECL系统的(Amersham-Pharmacia Biotech)。
实施例2：体外抑制血小板聚集
确定糖蛋白Ibα多肽-免疫球蛋白融合多肽体外抑制血小板聚集的能力。通过在900rpm分化离心10分钟制备来自新鲜的柠檬酸血液的富血小板血浆(PRP)。在37℃和各个浓度的GP1b290/2v-Ig预温育0.4ml的PRP(3×108/ml)5分钟。将瑞斯托菌素加到1.5mg/ml降低血小板的聚集。利用Sienco DP247E聚集仪测量聚集。定量聚集，通过在1000rpm搅拌检测光传递的增加，在图象记录仪上记录。如图4说明，GP1b290/2v-Ig抑制瑞斯托菌素诱导了血小板聚集。
实施例3：体内抑制重复冠状动脉凝血
糖蛋白IbαGPIb2902V-Ig多肽免疫球蛋白融合多肽抑制体内冠状动脉血栓的能力是利用Folts et al.，循环54：365-70，1976中所述的方法来确定的。
用巴比妥钠麻醉称重20-25kg的Mongrel狗。然后插管和利用呼吸器通入空气。放置静脉和动脉导管。通过左边的胸廓切开术通过第五个肋骨空间接近心脏。打开心包膜，缝合到伤口边缘，不替代心脏提供支架。分离约2cm的左旋冠状动脉(LCX)。利用放置在动脉附近的周微管超声波流动探针连续地检测平均的和动力学LCX流。在稳定期，用止血钳夹住损伤LCX的内皮。塑料压缩器放置于远侧，覆盖损伤的内皮区域提供约70％-80％的微管狭窄。当血流降低到零，通过摇动压缩器恢复血流，疏通聚集的血小板。这一血流的降低和再狭窄的术语是CFR。在给药测试药物之前记录至少5个连续的CFR。
图5中表示了代表性的结果。示踪表明，糖蛋白IbαGPIb290/2V-Ig的量增加导致血流更强。这些结果证明，糖蛋白IbαGPIb290/2V-Ig在动物模型中抑制凝血。
图6中表示了描述具有高液体剪切力血流的损伤的冠状动脉的图解。该图描述了具有高液体剪切力血流的损伤的冠状动脉。血管具有接触内皮基质蛋白质包括固定的vWF的损伤的内皮的区段。在存在GP1bα融合多肽(GPIb-Ig)时，vWF结合位点阻塞了，从而防止了通过GPIb-V-IX复合物内的GPIbα结合血小板防止血小板黏连。白细胞捕获也消失了。
其他实施方案
结合详细的说明已经叙述了本发明，前面的叙述解释了，并且不限制本发明的范围，该范围也是附加的权利要求确定的。其他方面，优点，和修改是在下面的权利要求的范围内的。
Claims (53)
1.含有第一个多肽和可操作地连接的第二个多肽的融合多肽，其中第一个多肽至少含有糖蛋白Ibα多肽，第二个多肽至少含有免疫球蛋白多肽的区域。
2.权利要求1所述的融合多肽，其中所述的第一个多肽包括膜糖蛋白Ibα多肽的细胞外部分。
3.权利要求2所述的融合多肽，其中所述的第一个多肽结合选自包括白细胞整合素Mac-1多肽，von Willebrand因子，凝血素和P-选择素的组的一个或多个多肽。
4.权利要求3所述的融合多肽，其中所述的多肽至少与SEQ IDNO：1有85％的同源性。
5.权利要求1所述的融合多肽，其中所述的多肽含有SEQ IDNO：1。
6.权利要求1所述的融合多肽，其中所述的第一个多肽是对蛋白质水解比野生型GPIbα1多肽更有抗性。
7.权利要求1所述的融合多肽，其中所述的第一个多肽以比野生型糖蛋白Ibα多肽更高的亲和力结合von Willibrand因子多肽。
8.权利要求7所述的融合多肽，其中所述的第一个多肽至少含有比较野生型GPIbα多肽有一个氨基酸取代的G233V或M239V。
9.权利要求7所述的融合多肽，其中所述的第一个多肽含有比较野生型GPIbα1多肽的氨基酸序列有氨基酸取代的G233V和M239V。
10.权利要求1所述的融合多肽，其中所述的第二个多肽含有重链免疫球蛋白多肽的区域。
11.权利要求10的融合多肽，其中所述的第二个多肽含有免疫球蛋白重链的Fc区域。
12.权利要求11的融合多肽，其中所述的第二个多肽具有的效应器功能比野生型免疫球蛋白重链的Fc区域的效应器功能小。
13.权利要求12所述的融合多肽，其中所述的第二个多肽结合Fc受体的亲和力低甚至没有。
14.权利要求12所述的融合多肽，其中所述的第二个多肽结合补充蛋白质C1q的亲和力低甚至没有。
15.权利要求2所述的融合多肽，其中所述的第二个多肽含有重链免疫球蛋白多肽的区域。
16.权利要求15所述的融合多肽，其中所述的第二个多肽含有免疫球蛋白重链的Fc区域。
17.权利要求15所述的融合多肽，其中所述的第二个多肽具有的效应器功能比野生型免疫球蛋白重链的Fc区域的效应器功能小。
18.权利要求17所述的融合多肽，其中所述的第二个多肽结合Fc受体的亲和力低甚至没有。
19.权利要求17所述的融合多肽，其中所述的第二个多肽结合补充的蛋白质C1q的亲和力低甚至没有。
20.权利要求1所述的融合多肽，其中所述的融合多肽含有氨基酸序列GP1b302-Ig(SEQ ID NO：1)，Gp1b302/2A-Ig(SEQ IDNO：2)，GP1b302/4X-Ig(SEQ ID NO：3)，GP1b290Ig(SEQ IDNO：4)，GP1b290/2V-Ig(SEQ ID NO：5)和GP1b290/1A-Ig(SEQID NO：6)。
21.含有权利要求1的融合多肽的多体多肽。
22.权利要求21所述的多体多肽，其中所述的多体多肽是二体。
23.编码权利要求1所述的融合多肽的DNA分子。
24.含有权利要求21所述的DNA的载体。
25.含有权利要求22所述的载体的细胞。
26.表达糖蛋白Ibα多肽免疫球蛋白融合多肽的方法，该方法包括在导致表达所述的糖蛋白Ibα多肽免疫球蛋白融合多肽的条件下培养权利要求25所述的细胞。
27.含有权利要求1所述的融合多肽的药物组合物。
28.含有权利要求23所述的核酸的药物组合物。
29.抑制血液细胞与生物系统中的生物组织黏连的方法，该方法包括在所述的生物系统中加入权利要求1的融合多肽，加入的量是足以抑制所述的血液细胞与所述的生物组织黏连。
30.权利要求29所述的方法，其中所述的生物系统是体外系统。
31.权利要求29所述的方法，其中所述的生物系统是来自体内的系统。
32.权利要求29所述的方法，其中所述的生物系统是体内系统。
33.权利要求29所述的方法，其中所述的血液细胞是血小板。
34.权利要求33所述的方法，其中所述的血小板表达糖蛋白Ibα，P-选择素或凝血素。
35.权利要求29所述的方法，其中所述的血液细胞是白细胞。
36.权利要求35所述的方法，其中所述的白细胞表达Mac-1或选择素配体。
37.权利要求29所述的方法，其中所述的生物组织是与vonWillibrand因子或凝血素，糖蛋白Ibα，或P-选择素复合的。
38.抑制蛋白质与生物系统中的生物组织的黏连的方法，该方法包括在所述的生物系统中加入权利要求1所述的融合多肽，加入的量是足以抑制所述的蛋白质与所述的生物组织黏连的。
39.权利要求38所述的方法，其中所述的生物系统是体内系统。
40.权利要求38所述的方法，其中所述的生物系统是来自体内的系统。
41.权利要求38所述的方法，其中所述的生物系统是体内系统。
42.权利要求38所述的方法，其中所述的蛋白质是结合膜的。
43.权利要求42所述的方法，其中所述的蛋白质是糖蛋白Ibα，P-选择素，von Willibrand因子或凝血素。
44.权利要求38所述的方法，其中所述的蛋白质是在溶液中的。
45.权利要求44所述的方法，其中所述的蛋白质是von Willbrand因子或凝血素。
46.权利要求38所述的方法，其中所述的生物组织是与选自包括糖蛋白Ibα，P-选择素，von Willibrand因子或凝血素的组的蛋白质复合。
47.治疗与受试者中的血小板激活相关的紊乱的方法，该方法包括对受试者给药需要的权利要求1的融合多肽。
48.权利要求47所述的方法，其中所述的紊乱是与溶血疾病相关的。
49.权利要求47所述的方法，其中所述的紊乱是缺血性心脏疾病，咽痛，急性心肌梗死，休克，静脉溶血，动脉硬化，或动脉溶血。
50.权利要求47所述的方法，其中所述的紊乱是咽痛。
51.权利要求50所述的方法，其中所述的咽痛是不稳定咽痛。
52.权利要求47所述的方法，其中所述的受试者是人。
53.权利要求47所述的方法，进一步包括对所述的受试者给药选自包括乙酰唾液酸，肝素，糖蛋白IIb/IIIa拮抗剂，clopidogrel，P选择素拮抗剂，凝血素抑制剂和溶血酶的组的化合物。
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