CN102988983B

CN102988983B - 抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物

Info

Publication number: CN102988983B
Application number: CN201110266469.6A
Authority: CN
Inventors: 费敏; 阮长耿; 杨剑峰
Original assignee: SUZHOU SUDA SAIER IMMUNOBIOLOGY TECHNOLOGY Co Ltd; Suzhou University
Current assignee: SUZHOU SUDA SAIER IMMUNOBIOLOGY TECHNOLOGY Co Ltd; Suzhou University
Priority date: 2011-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2031-09-09
Also published as: CN102988983A

Abstract

本发明公开了含抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物，主要包括嵌合抗体成熟轻链和嵌合抗体成熟重链，所述嵌合抗体成熟轻链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第453～666位氨基酸残基，所述嵌合抗体成熟重链的氨基酸序列为序列表中序列2的自氨基末端第1～452位氨基酸残基。本发明还公开了所述嵌合抗体药物组合物的制备方法及其浓度效果分析。

Description

抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物

技术领域

本发明涉及生物技术嵌合抗体领域，具体的说是抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物。

背景技术

血小板GPIbα是一种血小板特异性膜糖蛋白，以GPIb-IX-V复合物的形式存在，该复合物包含四个亚单位，GPIbα，GPIbβ，GPIX和GPV，以2∶4∶2∶1的比例组成。它们都是I型跨膜糖蛋白，包括胞外区，跨膜区和胞浆区。GPIbα与GPIbβ之间以二硫键的形式共价连接组成GPIb，GPIb与GPIX，GPV以非共价键的形式连接形成GPIb-IX-V复合物。GPIbα是该复合物中主要的配体结合亚单位。当血管受损时，血小板膜表面受体GPIbα在高剪切力条件下与血浆VWF A1结构域结合，同时VWF的A3结构域与血管损伤部位暴露的内皮下基质主要是胶原结合，从而在VWF的桥联作用下实现血小板的初始黏附。此外，VWF结合GPIbα后引发一系列血小板细胞内信号传递，最终使血小板整合素受体GPIIb/IIIa活化，引起血小板聚集，形成血栓。而动脉血栓引起的中风、心肌梗死等血栓栓塞性疾病是我国最常见的死亡病因之一，且其发病率仍在不断上升。目前临床应用的阿司匹林和氯噼格雷是第一代抗血小板药物，GPIIb/IIIa抑制剂为第二代抗血小板药物。虽然这些药物对于改善动脉血栓引起的血栓栓塞性疾病有着巨大的贡献，但是，仍然有相当一部分病人用了这类药物之后不能改善缺血性症状。另外，潜在的出血并发症也限制了这些药物的应用。血小板黏附是动脉血栓形成的早期必经阶段，阻断GPIbα与VWF的结合，抑制血小板的初始黏附，被认为能够有效抑制血栓形成，并且能够降低出血倾向。Deckmyn等报道在狒狒股动脉狭窄血栓模型的体内实验中应用抗血小板GPIbα单克隆抗体6B4-Fab剂量为0.6mg/kg时可以明显减少单位时间内周期性血流减低发生的次数，还明显抑制血小板在I型胶原上的沉积(700-1000/s)。2mg/kg的6B4-Fab可以完全抑制周期性血流减低的发生，而无出血时间的延长。因此，抗GPIbα单克隆抗体具有良好的抗血栓应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种人源化的抗血小板GPIbα单克隆抗体药物组合物。

本发明提供的抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物，包括嵌合抗体和药学上可接受的载体，其特征在于所述嵌合抗体的氨基酸序列为序列表中序列2，所述氨基酸的编码基因为序列表中的序列1。药学上可接受的载体包括以下组份中的一种或多种：糖类，淀粉，纤维素及其衍生物，滑石，固体润滑剂，植物油，多元醇，着色剂，压片剂，无热源水，等渗盐溶液。

附图说明

附图是本发明嵌合抗体及其Fab片段体外抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集分析图。其中：

(A)中(f)富血小板血浆与10μg/ml chSZ2；(g)富血小板血浆与10μg/ml鼠源SZ2；(h)富血小板血浆与10μg/m1人IgG；

(B)中chSZ2Fab呈剂量依赖型抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集(a至e代表0.5，1，2，5，10μg/mlchSZ2Fab片段)。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作进一步说明。

实施例1，抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体的获得：

一、引物设计和合成，

实验中所涉及的引物除了试剂盒提供的以外，均为Invitrogen公司合成。

HGSP1	GTCCACCTTGGTGCTGCTGGCCGGGTG
		KGSP1	ACTTGACATTGATGTCTTTG
HGSP2	GCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC
		KGSP2	CACGACTGAGGCACCTCCAG
5’RACE Outer Primer	CATGGCTACATGCTGACAGCCTA
		5’RACE Inner Primer	CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG
SZ2HR	GCGGCTAGCCACCATGACATTGAACATGCTG
		SZ2HF	GCGGGCCCTTGGTGGAGGCTAAGGAGACGGTGACAG
SZ2KR	GCGATATCATGAGGGTCCTTGCTGAG
		SZ2KF	CACCGTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTC

二、mAb SZ2V区基因的克隆与测定，

以分泌鼠源单克隆抗体SZ2的杂交瘤细胞的总RNA为模板，采用大连Takara公司的5’快速扩增cDNA末端试剂盒进行VH和VL基因的克隆。概括来说，抽提杂交瘤细胞总RNA，对RNA5’去帽子反应，然后5’加磷酸基团，之后在5’端加上接头RNA，完成对RNA的加工处理。

VH基因的克隆：以上述加工过的RNA为模板，HGSP1为逆转录引物，合成第一链cDNA，然后以HGSP2和5’RACE Outer Primer一对引物PCR扩增10个循环，然后以该PCR产物为模板，以HGSP2和5’RACE Inner Primer为引物PCR扩增20个循环，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，回收，与pMD-18T载体(大连Takara)连接，转化TOP10感受态细菌，涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上。37℃培养过夜，第二天挑取5个单菌落，送测序公司测序鉴定。

VL基因的克隆：以前述加工过的RNA为模板，KGSP1为逆转录引物，合成第一链cDNA，然后以KGSP2和5’RACE Outer Primer一对引物PCR扩增10个循环，然后以该PCR产物为模板，以KGSP2和5’RACE Inner Primer为引物PCR扩增20个循环，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，回收，与pMD-18T载体(大连Takara)连接，转化TOP10感受态细菌，涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上。37℃培养过夜，第二天挑取5个单菌落，送测序公司测序鉴定。

三、入-鼠嵌合抗体表达质粒的构建，

SZ2的VH和VL基因经测序鉴定后，与NCBI的免疫球蛋白数据库比对序列，确认为免疫球蛋白可变区序列。然后根据所得的VH序列，设计合成了扩增VH的SZ2HF和SZ2HR一对引物，以克隆有VH的pMD-18T质粒为模板，扩增VH序列，经Nhe I/Apa I双酶切后克隆入pIDH表达载体中，成为pID-SZ2H表达载体。同样，以测序所得的SZ2VL序列设计合成了SZ2KF和SZ2KR一对引物，以克隆有VL的pMD-18T质粒为模板，PCR扩增VL序列，经EcoR V/BsiWI双酶切后克隆入pIDL表达载体中，成为pID-SZ2K表达载体。pIDH和pIDL表达载体为本单位自己构建保有，两个载体都是以pcDNA3为架构，分别带有人IgG1重链恒定区和kappa轻链恒定区编码序列，同时都带有从中国仓鼠卵巢细胞CHO中克隆的二氢叶酸还原酶基因(DHFR)编码序列。

四、CHO细胞的转染和筛选，

CHO-dhfr^-细胞培养在IMDM+7％胎牛血清+HT的培养基中，转染前一天接种2×106细胞于10cm细胞培养平皿，第二天换10ml新鲜的完全培养基，3h后转染。

A管：pIDH-SZ2和pIDL-SZ2各10μg于300μlIMDM；

B管：lipofectamine200050μl于300μlIMDM，

室温放置5min后将A和B两管溶液充分混匀，静置30min后，逐滴加入CHO-dhfr^-细胞培养上清中。转然36h后，收集培养上清备检测，细胞用PBS洗涤2次后加入1ml胰酶，37℃孵育1min后弃去胰酶，加入IMDM+7％透析的胎牛血清+10nMMTX，吹打细胞使细胞悬浮，细胞计数，调整细胞浓度，按4000个细胞/孔加入96孔细胞培养板，37℃，5％CO₂培养箱中培养，每5天换液，直至细胞克隆形成。为了筛选到高表达细胞克隆，细胞从10nM MTX压力开始下，20nM，50nM逐步加压至100nM。

五、表达产物的ELISA检测，

羊抗人IgG1多克隆抗体10μg/ml包被96孔板，4℃过夜，第二天弃包被液，用PBST洗涤2次，加入200μl2％PBST-BSA溶液，37℃，2h封闭。弃封闭液，拍干ELISA板。加入细胞培养上清，以已知浓度的商品化人IgG1标准品做对照，37℃反应1h，PBST洗涤5次，加入100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体，37℃反应1h，PBST洗涤5次，加入100μlTMB，37℃反应10min后加入50μl2N的H₂SO₄终止反应。测OD450读数。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标拟合标准曲线，根据标准曲线计算细胞培养上清中嵌合抗体的浓度。

六、嵌合抗体的纯化，

收集细胞无血清培养上清，12,000rpm，离心30min去除细胞碎片。HiTraprProteinAFF柱先用20mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)平衡，然后细胞培养上清用恒流泵以0.5ml/min的速度过柱。上清全部上柱后再用5倍柱体积的磷酸钠缓冲液洗涤出去未结合的蛋白质。ProteinA结合的嵌合抗体用0.1M的柠檬酸钠洗脱液(pH3.0)洗脱，每0.5ml洗脱液加入至预先放有100μl1M Tris-Hcl(pH9.0)中，使抗体溶液的pH在7.0左右。分光光度计测定每管中溶液的OD280值，选取OD280值大于0.2的溶液，合并。转移至透析袋中，在PBS缓冲液中4℃透析3小时后换新鲜的PBS，继续透析过夜。测定OD280值，以OD280/1.35计算抗体浓度(mg/ml)。

七、嵌合抗体Fab片段的制备，

100μl纯化的SZ2嵌合抗体2mg/ml，加入100μl0.02mg/mlpapainsuspension(0.02M EDTA，0.02M cysteine在PBS中)，37℃孵育2h。加入20μl的0.3M碘乙酰胺终止反应。在PBS缓冲液中透析过夜，然后再过proteinA柱，收集穿透液，结合在ProteinA柱上的蛋白样品用0.1M的柠檬酸钠洗脱液洗脱。OD280分别测定穿透液和洗脱液中的蛋白含量。

八、嵌合抗体及其Fab片段体外抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集分析，

正常人全血以0.38％(终浓度)枸橼酸钠抗凝，以1000rpm离心10min，吸取富含血小板的血浆(platelet-rich plasma，PRP)，下层液继续以3,000rpm离心10min，吸取上层血浆为(platelet-poor plasma，PPP)。计数PRP中血小板的浓度，用PPP调整血小板浓度至3×10⁸/ml。取235μlPRP加入10μl抗体(0.25mg/ml)预孵育5min，然后加入6.25μl的50mg/ml瑞斯托霉素，在1,000rpm转子搅拌下，记录血小板的聚集。分析数据见附图。

实施例2，抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物：

本发明还提供了一种药物组合物，该组合物含有药学上有效量的抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物以及药学上可接受的载体。“药学上有效量”是指当分子本体和组合物给予动物或人时，动物或人不会产生不利的、过敏的或其它不良反应的量。“药学上可接受的载体”是指与本发明的嵌合抗体相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。其具体例子有糖类：乳糖、葡萄糖、蔗糖，淀粉：玉米淀粉、土豆淀粉，纤维素及其衍生物，滑石，固体润滑剂，植物油，多元醇，着色剂，压片剂，无热源水，等渗盐溶液等。

Claims

1.抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物，包括嵌合抗体和药学上可接受的载体，其特征在于所述嵌合抗体的氨基酸序列为序列表中序列2，所述氨基酸的编码基因为序列表中的序列1。

2.根据权利要求1所述抗人血小板膜糖蛋白Ibα嵌合抗体药物组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体包括以下组份中的一种或多种：糖类，淀粉，纤维素及其衍生物，固体润滑剂，植物油，多元醇，着色剂，压片剂，无热源水，等渗盐溶液。