CN110305214A

CN110305214A - 新型抗cd47抗体

Info

Publication number: CN110305214A
Application number: CN201910199172.9A
Authority: CN
Inventors: 梅芹; 胡发根; 李竞
Original assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Current assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date: 2018-03-20
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2019-10-08
Also published as: TW201940516A

Abstract

本发明提供了抗CD47的抗体或其抗原结合片段、编码其的分离的多核苷酸、包含其的药物组合物，及其用途。

Description

新型抗CD47抗体

优先权要求

本申请要求2018年3月20日提交的PCT申请号PCT/CN2018/079673和2018年5月29日提交的中国申请号201810530689.7的优先权。

发明领域

本发明涉及新的抗人CD47抗体。

背景技术

从Paul Ehrlich提出“魔弹”假说，至rituximab在1997年获批，在过去的数十年间，基于单克隆抗体的疗法在肿瘤、自体免疫疾病以及许多其他疾病方面取得了令人瞩目的进步。单抗抗癌作用的主要机制依赖于其通过抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体依赖的细胞吞噬作用(ADCP)与免疫系统的组成部分相互作用，以及改变信号转导以杀死癌症细胞。在这些机制中，巨噬细胞介导的细胞吞噬作用已被证明是消除病变的或损伤的细胞的重要机制。

分化簇47(CD47)，又称为整合素相关蛋白(IAP)，为大小约为50kDa的免疫球蛋白超家族膜蛋白。CD47与在巨噬细胞上、信号调节蛋白α(SIRPα)上的其配体相互作用，以发送抗吞噬信号或“不要吃我”的信号，从而逃避免疫监视。对病人肿瘤以及对匹配的相邻正常组织的分析揭示，CD47在AML、NHL、乳腺癌、NSCC和卵巢细胞上过表达，并且增加的CD47表达与较差的临床预后相关。这些数据显示，CD47可以作为用于阻断CD47-SIRPα相互作用的癌症疗法的新的免疫检查点。几种抗CD47单抗和SIRPα融合蛋白已取得了涉及巨噬细胞的针对AML、NHL、乳腺细胞和卵巢细胞的有效吞噬作用。另外，抗CD47单克隆抗体与经批准的抗体(抗肿瘤相关抗原)组合已有效地增强抗肿瘤活性。基于这些临床前研究，两种抗CD47单抗(Hu5F9-G4和CC-90002)，以及一种SIRPα工程化的融合蛋白(TTI-621)处于活跃的临床试验的I或II期，其覆盖血液恶性肿瘤和人实体瘤。

对新的抗CD47抗体存在很大的需求。

发明简述

本申请全文中的冠词“一种”、“一个”和“所述”在此用于指代一个或多于一个(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一种抗体”指一种抗体或多于一种抗体。

本申请提供了分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含：

a)1、2或3个选自下组的重链互补决定区(CDR)序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11；和/或

b)1、2或3个选自下组的轻链CDR序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:29。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含选自下组的重链可变区：a)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的CDR序列；和b)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的CDR序列。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含选自下组的轻链可变区：a)轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的CDR序列；b)轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的CDR序列；和c)轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的CDR序列。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含：a)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的CDR序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:6的CDR序列；b)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:5的CDR序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的CDR序列；和c)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11的CDR序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:12的CDR序列。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区选自下组：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25，以及与其具有至少80％序列同一性但仍然保持与CD47的特异性的结合亲和力的同源序列

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，所述轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:27，以及与其具有至少80％序列同一性但仍然保持与CD47的特异性的结合亲和力的同源序列。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段包含：

a)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:13，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:15；

b)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:17，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:19；

c)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:21，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:23；和

d)重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:25，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:27。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段进一步包含一个或多个氨基酸残基替代或修饰，但仍然保持与CD47的特异性的结合亲和力。在某些实施方式中，其中至少一个所述替代或修饰在一个或多个所述CDR序列里，和/或在一个或多个所述重链可变区或轻链可变区序列里而不在任何所述CDR序列里。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区，可选地包含人免疫球蛋白的恒定区，或可选地包含人IgG的恒定区。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段是人源化的。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段为骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体或双价抗体。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段能够以不超过10^-9M(例如不超过9×10^-10M、不超过8×10^-10M、不超过7×10^-10M、不超过6×10^-10M、不超过5×10^-10M、不超过4×10^-10M、不超过3×10^-10M、不超过2×10^-10M、不超过10^-10M、不超过9×10^-11M、不超过8×10^-11M或不超过7.5×10^-11M)的K_D值特异性地与表达在细胞表面上的人CD47结合，所述K_D值通过流式细胞术测定。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段能够特异性地与食蟹猴CD47结合。

在某些实施方式中，所述分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段与一种或多种缀合部分连接。在某些实施方式中，所述缀合部分包含清除调节剂、化疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶底物标记、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂微管蛋白粘合剂或其他抗癌药。

本申请还提供一种抗体或其抗原结合片段，其与本申请所述的抗体或其抗原结合片段竞争相同的表位。

本申请还提供一种药物组合物，其包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂。

本申请还提供一种分离的多核苷酸，其编码本申请所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28。

本申请还提供一种载体，其包含本申请所述的分离的多核苷酸。

本申请还提供一种宿主细胞，其包含本申请所述的载体。

本申请还提供一种表达本申请所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在表达本申请所述的载体的条件下培养本申请所述的宿主细胞。

本申请还提供一种在个体中治疗可受益于CD47活性调节的疾病或状况的方法，其包含向所述个体施用治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。在某些实施方式中，所述疾病或状况是与CD47相关的疾病或状况。在某些实施方式中，所述疾病或状况是癌症、自体免疫疾病、纤维化病、炎性疾病或感染性疾病。在某些实施方式中，所述个体是人。在某些实施方式中，所述施用是经由口服、鼻内、静脉内、皮下、舌下或肌内施用。

在某些实施方式中，所述癌症是肺癌、支气管癌、骨癌、肝和胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、恶性肉瘤、畸胎瘤、腺癌、白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。

在某些实施方式中，所述疾病或状况是血液科癌症，所述血液科癌症选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、Richter综合征、伯基特氏淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤。

本申请还提供一种在表达CD47的细胞中调节CD47活性的方法，其包含将所述表达CD47的细胞暴露于本申请所述的抗体或其抗原结合片段。

本申请还提供一种在样品中检测CD47的存在或含量的方法，其包含将所述样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触，以及确定样品中CD47的存在或含量。

本申请还提供一种在个体中诊断与CD47相关的疾病或状况的方法，其包含：a)将获取自所述个体的样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触；b)确定在所述样品中CD47的存在或含量；和c)将所述CD47的存在或含量与所述与CD47相关的疾病或状况在所述个体中的存在或状态相关联。

本申请还提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗个体中的与CD47相关的疾病或状况的药物中的用途。

本申请还提供本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断CD47相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。

本申请还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段，其可用于检测CD47。

附图简述

图1示出了W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L与用人CD47转染的CHOK1的FACS结合测定结果，其与基准抗体WBP345-BMK1.uIgG4PE.K、WBP345-BMK2.uIgG4P.K和同种型对照抗体W332-1.80.12xAb.hIgG1(抗体同种型IgG1阴性对照，由药明生物制备)和W332-1.80.12xAb.hIgG4(抗体同种型IgG4阴性对照，由药明生物制备)相比较。

图2示出了W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L与食蟹猴PBMC的FACS结合测定结果，其与基准抗体WBP345-BMK1.uIgG4PE.K、WBP345-BMK2.uIgG4P.K和同种型对照抗体W332-1.80.12xAb.hIgG1和W332-1.80.12xAb.hIgG4相比较。

图3示出了使用转染了人CD47的CHOK1的W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的用FACS测的配体(SIRPα)竞争测定结果，其与基准抗体WBP345-BMK1.uIgG4PE.K、WBP345-BMK2.uIgG4P.K和同种型对照抗体W332-1.80.12xAb.hIgG1和W332-1.80.12xAb.hIgG4相比较。

图4示出了W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的血凝活性，其与基准抗体WBP345-BMK1.uIgG4PE.K、WBP345-BMK2.uIgG4P.K和同种型对照抗体W332-1.80.12xAb.hIgG1和W332-1.80.12xAb.hIgG4相比较。

图5A和5B分别示出了在Jurkat.2B8细胞(图5A)和Raji细胞(图5B)上，W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的巨噬细胞介导的吞噬活性，其与基准抗体WBP345-BMK1.uIgG4PE.K、WBP345-BMK2.uIgG4P.K、WBP345-BMK3.uIgG1K、WBP345-BMK4.uIgG4.SPK和同种型对照抗体W332-1.80.12xAb.hIgG1和W332-1.80.12xAb.hIgG4相比较。

图6A-6D分别示出了针对Raji细胞和CCRF-CEM细胞的W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的ADCC(图6A和6B)和CDC(图6C和6D)活性，其与基准抗体WBP345-BMK1.uIgG4PE.K、WBP345-BMK2.uIgG4P.K和同种型对照抗体W332-1.80.12xAb.hIgG1和W332-1.80.12xAb.hIgG4相比较。

图7示出了W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的热稳定性结果。

图8A、8B和8C分别示出了W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的人血清稳定性。

图9示出了W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L在剂量分别为0.5mg/kg和3mg/kg时的抗肿瘤活性，其与剂量为3mg/kg的基准抗体WBP345-BMK2.uIgG4P.K相比较。

图10A-10D示出了在临床毒性研究中施用抗体后食蟹猴中的红细胞(RBC，图10A)、血红蛋白(HGB，图10B)、血细胞比容(HCT，图10C)和网织红细胞(RET，图10D)的变化。每只雄性食蟹猴以不同剂量(30mg/kg或150mg/kg)施用IgG4形式(W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L)或IgG1形式(W3452-2.683.2-z27-IgG1L)的抗体。C1001和C1002代表给药W3452-2.683.2-z27-IgG1L的2只个体动物，C2001和C2002代表给药W3452-2.683.2-z27-IgG1L的2只个体动物，C3001和C3002代表给药W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的2只个体动物，以及C4001和C4002代表给药W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的2只个体动物。

图11示出了以不同剂量(30mg/kg或150mg/kg)对个体食蟹猴施用W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L后抗体的血清浓度。

发明详述

本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包含在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包含公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。

定义

本发明中的“抗体”一词包含可结合某特定抗原的任意抗体：免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、双价抗体、单价抗体。一个天然的完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由一可变区(V_H)和第一、第二、第三恒定区(分别为C_H1、C_H2、C_H3)组成；哺乳动物的轻链可分为λ或κ，每条轻链由一可变区(V_L)和一恒定区组成。抗体呈“Y”型，“Y”型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成，其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条臂包含其中一条重链的可变区和第一恒定区，其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区，称互补决定区(CDR)(轻链的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat，IMGT，Chothia或Al-Lazikani命名法命名或识别。(Al-Lazikani,B.，Chothia,C.，Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，273(4),927(1997)；Chothia,C.等，J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C和Lesk,A.M.，J.Mol.Biol.，196,901(1987)；Chothia,C.等，Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.等，National Institutes ofHealth，马里兰州Bethesda(1991)；Marie-Paule Lefranc et al,Developmental andComparative Immunology,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc et al,ImmunomeResearch,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,Molecular Biology of B cells(secondedition),chapter 26,481-514,(2015))。其中，三个CDR由被称为框架区(FR)的侧面连续部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有α、δ、ε、γ和μ重链，抗体可分别分为五个主要的分类或异构体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。

本申请中的术语“双价”是指具有两个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；术语“单价”是指仅具有一个单一抗原结合位点的抗体或抗原结合片段；而术语“多价”是指具有多个抗原结合位点的抗体或抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是双价的。

本申请中的“抗原结合片段”一词，指由含有一个或多个CDR的抗体部分或者任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段所形成的一种抗体片段。抗原结合片段的例子包含，但不限于，如双功能抗体(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)₂、二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(双价的双功能抗体)、双价单链抗体(BsFv)、骆驼化单域抗体(camelizedsingle domain antibody)、纳米抗体、域抗体和双价域抗体。抗原结合片段可以与母体抗体结合相同的抗原。

抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包含可变区和恒定区)和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。

“Fab'”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。

“F(ab')₂”指的是Fab’的二聚体。抗体的“Fv”段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由单条轻链的可变区结合到单条重链的可变区组成。

“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其单条轻链的可变区与单条重链的可变区之间的连接键是二硫键。在一些实施方式中，“(dsFv)₂”含有三条肽链：两个V_H部分通过多肽连接子(例如长的柔性连接子)相连，并经由二硫键分别与两个V_L部分结合。

“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过肽链序列连接组成的工程化抗体(Huston JS等，Proc Natl Acad Sci USA、85:5879(1988))。

抗体的“Fc”指的是由第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键与第二重链的第二和第三恒定区连接组成的那部分抗体。抗体的Fc段负责多种不同的效应功能如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。

“单链抗体Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由连接到抗体Fc段的scFv组成的工程化抗体。

“骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)”、“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies，HCAb)”都是指含有两个V_H域而不含有轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.，J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；U.S.专利号6,005,079)。重链抗体最初从驼科(骆驼、单峰驼和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻链，骆驼化抗体(camelized antibodies)有确证的抗原结合全部功能(Hamers-Casterman C.等，Nature.Jun 3；363(6428):446-8(1993)；Nguyen VK.等，“Heavy-chainantibodies in Camelidae；a case of evolutionary innovation,”Immunogenetics.Apr；54(1):39-47(2002)；Nguyen VK.等，Immunology.May；109(1):93-101(2003))。重链抗体的可变区(VHH域)是最小的已知的获得性免疫产生的抗原结合单位(Koch-Nolte F.等，FASEB J.Nov；21(13):3490-8.Epub 2007Jun 15(2007))。

“纳米抗体”是指一种抗体片段，其由一个来自重链抗体的VHH域和两个恒定区CH2和CH3组成。

“双功能抗体(diabody)”或“dAb”包含带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的V_H域和V_L域(V_H-V_L或V_H-V_L)(请参见，Holliger P.等，Proc Natl Acad Sci USA.Jul 15；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。两个域之间衔接物很短，使同一条链上的两个域不能互相配对，从而迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗体结合位点。抗原结合位点可以靶向相同抗原(或抗原表位)。在某些实施方式中，“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价ScFv(BsFv)，包含V_H-V_L与另一个V_H-V_L部分的二聚化(由多肽连接子连接)，使得一个部分的V_H与另一个部分的V_L协作形成两个结合位点，这两个结合位点可靶向相同抗原(或抗原表位)。

“域抗体”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个V_H域由肽连接子共价结合并形成双价域或多价域抗体。双价域抗体的两个V_H域可靶向作用于相同或不同的抗原。

本申请中使用的术语“嵌合”是指具有来源于一种物种的重链和/或轻链的一部分，和所述重链和/或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的例子中，嵌合抗体可以包含来源于人的恒定区和来源于非人动物例如小鼠的可变区。在一些实施方式中，所述非人动物为哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。

本申请中使用的术语“人源化”是指包含来源于非人动物的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区(如果适用的话)的抗体或抗原结合片段。

本申请中的“CD47”来源于任何脊椎动物来源，包含哺乳物动，如灵长类(例如人、猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。人CD47的示例性序列包含人CD47蛋白(NCBI登录号GI:4502673)。CD47的示例性序列包含Mus musculus(小鼠)CD47蛋白(NCBI登录号GI:76364104)和Macaca fascicularis(猴)CD47蛋白(NCBI登录号GI:544416831)。

本申请中的术语“CD47”旨在涵盖任意形式的CD47，例如1)天然未经处理的CD47分子、“全长”CD47链或CD47天然存在的变体(包含例如剪接变体或等位基因变体)；2)CD47由在细胞中的处理而产生的任何形式；或3)通过重组方法产生的CD47亚单位的全长、片段(例如截短的形式、胞外/跨膜域)或修饰的形式(例如突变形式、糖基化/聚乙二醇化的形式、组氨酸标签/免疫荧光融合的形式)。

术语“抗CD47抗体”是指能够特异性地结合CD47(例如人或猴或小鼠或大鼠CD47)的抗体。

本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请的抗体或其抗原结合片段与人和/或猴CD47特异性结合，并且其结合亲和力(K_D)≤10^-6M(如：≤5×10^-7M、≤2×10^-7M、≤10^-7M、≤5×10^-8M、≤2×10^-8M、≤10^-8M、≤5×10^-9M、≤4×10^-9M、≤3×10^-9M、≤2×10^-9M，≤10^-9M，5×≤10^-10M或5×10^-11M)。本申请中的KD是指解离速度与结合速度的比值(koff/kon)，其可通过使用任何本领域常用的方法测定，包含但不限于表面等离子共振法、微量热流动法、HPLC-MS法和流式细胞术(如FACS)。在某些实施方式中，K_D值可以适当地通过使用流式细胞术测定。

本申请中的“阻断结合”或“竞争相同的表位”的能力是指抗体或其抗原结合片段将两个分子间结合(例如人CD47和抗CD47抗体)的相互作用抑制到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少85％或至少90％。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于85％或大于90％。

本申请中使用的“表位”是指抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则可能结合抗原上的相同或密切相关的表位。例如，如果抗体或其抗原结合片段阻断参比抗体与抗原至少85％或至少90％或至少95％的结合，那么所述抗体或其抗原结合片段可以被认为与所述参比抗体结合相同/密切相关的表位。

本领域技术人员将认识到，可以通过有限的实验，确定给定的抗体是否阻止本申请所述的抗体(例如啮齿动物单克隆抗体W3452-1.164.16和W3452-2.683.2和人源化抗体W3452-1.164.16-z11和W3452-2.683.2-z27)结合至CD47抗原多肽，从而确定给定的抗体与本申请所述的抗体是否结合至相同表位。如果本申请所述的抗体与CD47抗原多肽的结合下降，表示所述给定的抗体与本申请所述的抗体竞争，则这两个抗体结合至相同或密切相关的表位。或者，如果给定的抗体与CD47抗原多肽的结合受到本申请所述的抗体的抑制，那么这两个抗体结合至相同或密切相关的表位。

本申请中的抗体名称可以包含一个或多个后缀符号，其通常表示抗体的类型或对抗体所做的特定修饰。例如，“IgG1”或“IgG4”是指IgG1同种型或IgG4同种型的人(除非另有说明)抗体恒定区，“z”是指人源化的抗体，“K”是指κ轻链，“P”和“E”分别是指人IgG4恒定区中的S228P和L235E。

在本申请中当“保守替代”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在疏水侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)、中性亲水侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)或方向侧链残基间(例如Trp、Tyr和Phe)进行保守替代。本领域已知保守替代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。

本申请所述的术语“同源”和“同源的”可以互换使用，指当最佳比对时核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列具有与另一条序列至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的同一性。

当“百分比序列同一性”用于氨基酸序列(或核酸序列)时，是指在进行序列比对，并且必要时引入间隔使相同氨基酸(或核酸)数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸(或核酸)残基占所述候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN,BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)，也可参见，Altschul S.F.等，J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；Stephen F.等，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站，可参见，Higgins D.G.等，Methods inEnzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.等，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007))和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，对序列进行比对以确定氨基酸(或核酸)序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。

本申请中使用的“效应功能”是指抗体的Fc区与其效应器例如C1复合物和Fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包含抗体与C1复合物上的C1q相互作用诱导的补体依赖的细胞毒性(CDC)、抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及吞噬。

对某种状况的“治疗”或“疗法”包含预防或减轻某种状况，降低某种状况兴起或发展的速度，减少发展出某种状况的风险，预防或延迟与某种状况相关的症状发展，减少或终止与某种状况相关的症状，产生某种状况的完全或部分的逆转，治愈某种状况，或以上的组合。

“被分离”的物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“被分离”的物质或成分，那么其已经被改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的，但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然状态下共存的物质足够分离并以足够纯的状态存在，则可以认为是“被分离”。

本发明中“载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体，以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还可包括协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳。载体可以是表达载体或克隆载体。本申请提供的载体(例如表达载体)含有本申请所述的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

本发明中“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。

本发明中的“与CD47相关的”疾病或状况是指任何由CD47增加或减少的表达或活动所引起、加剧的，或另外与其相关的疾病或症状。在一些实施方式中，CD47相关的状况是免疫相关的疾病，例如癌症、自身免疫疾病、炎性疾病或感染性疾病。

本申请中使用的“癌症”是指以恶性细胞生长或肿瘤、异常增生、浸润或转移为特征的任何医学状况，并且包括实体肿瘤和例如白血病的非实体癌症(血液恶性肿瘤)。本申请中使用的“实体瘤”是指肿瘤和/或恶性细胞的实体团块。癌症或肿瘤的实例包括血液科恶性疾病、口腔癌(例如唇、舌或咽的癌症)、消化器官癌(例如食道、胃、小肠、结肠、大肠或直肠)、腹膜癌、肝或胆道癌、胰腺癌、呼吸系统，如喉或肺(小细胞或非小细胞)癌、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、乳腺癌、生殖器官(输卵管、子宫、宫颈、睾丸、卵巢或前列腺)癌、尿道(例如膀胱或肾)癌、脑和内分泌腺(如甲状腺)癌。在某些实施方式中，癌症选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌，以及结直肠癌。在某些实施方式中，癌症为血液癌症。在某些实施方式中，所述血液科癌症选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、Richter综合征、伯基特氏淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤。

“药用可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料和/或盐，总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。

抗CD47抗体

本申请提供了抗CD47抗体及其抗原结合片段，其包含抗CD47抗体W3452-1.164.16、W3452-1.164.16-z11、W3452-2.683.2或W3452-2.683.2-z27的一个或多个(例如1、2、3、4、5或6个)CDR序列。

本申请中的“W3452-1.164.16”是指具有如SEQ ID NO:13所示的重链可变区和如SEQ ID NO:15所示的κ轻链可变区的啮齿动物单克隆抗体。

本申请中的“W3452-1.164.16-z11”是指具有如SEQ ID NO:17所示的重链可变区和如SEQ ID NO:19所示的κ轻链可变区的人源化单克隆抗体。

本申请中的“W3452-2.683.2”是指具有如SEQ ID NO:21所示的重链可变区和如SEQ ID NO:23所示的λ轻链可变区的啮齿动物单克隆抗体。

本申请中的“W3452-2.683.2-z27”是指具有如SEQ ID NO:25所示的重链可变区和如SEQ ID NO:27所示的λ轻链可变区的人源化单克隆抗体。

表1示出了这些抗CD47抗体的CDR序列。下文还在表2和表3中提供了重链和轻链可变区序列。

表1.CDR氨基酸序列

表2.可变区氨基酸序列

表3.可变区核酸序列

已知CDR负责抗原结合，然而已发现6个CDR并不都是不可缺少或不可改变的。换言之，可以替换或改变或修饰抗CD47抗体W3452-1.164.16、W3452-1.164.16-z11或W3452-2.683.2中的一个或多个CDR，而基本上保持与CD47特异性结合的亲和力。

在某些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体及其抗原结合片段包含抗CD47抗体W3452-1.164.16、W3452-1.164.16-z11或W3452-2.683.2的重链CDR3序列。在某些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体和抗原结合片段包含如SEQ ID NO:5和11所示的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点的中心，并因此被认为与抗原接触最多，而且对抗体与抗原的亲和力提供最多的自由能。此外还认为重链CDR3由于多种多样化机制在长度、氨基酸组成和构象方面是目前抗原结合位点最多样化的CDR(Tonegawa S.，Nature.302:575-81)。重链CDR3的多样化足以产生多数抗体特异性(Xu JL,Davis MM.Immunity.13:37-45)以及所需的抗原结合亲和性(Schier R等，J Mol Biol.263:551-67)。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含适当的框架区(FR)序列，只要所述的抗体及其抗原结合片段可以特异性地结合至CD47即可。表1中所示的CDR序列获取自大鼠或小鼠抗体，但其可使用本领域公知的合适方法(如重组技术)移植至任何合适物种(如小鼠、人、大鼠、兔以及其他)的任何合适的FR序列。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段是人源化的。人源化的抗体或抗原结合片段理想地在人体具有降低的免疫原性。人源化的抗体或其抗原结合片段在其可变区是嵌合的，因为非人CDR序列移植至人或基本上是人的FR序列中。抗体或抗原结合片段的人源化基本上可通过在人免疫球蛋白基因上将非人(如小鼠)CDR基因替换为对应的人CDR基因来完成(参见例如Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536)。

可以使用本领域公知的方法选择合适的人重链和轻链可变域，以达到这一目的。在一个示例性的实例中，可以使用最佳拟合的方法，其中对非人(例如啮齿动物)抗体可变域序列进行筛选，或者将其与已知的人可变域序列的数据库进行BLAST比对，并且识别出最接近非人查询序列的人序列，用作用于移植非人CDR序列的人框架(参见例如Sims等(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia等(1987)J.Mot.Biol.196:901)。或者，可以将源自所有人抗体的共有序列的框架用于移植非人CDR(参见例如Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285；Presta等(1993)J.Immunol.，151:2623)。

在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原结合片段除了非人的CDR序列以外，基本上全部由人序列组成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区(如果存在)全部或基本上来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以源自不同的人免疫球蛋白基因，例如，FR序列源自一个人抗体，恒定区来自另一个人抗体。在一些实施方式中，人源化抗体或抗原结合片段包含人FR1-4。

在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体及其抗原结合片段包含W3452-1.164.16-z11或W3452-2.683.2-z27的一个或多个FR序列。

示例性的人源化抗CD47抗体W3452-1.164.16-z11、和W3452-2.683.2-z27保留了与表达CD47的细胞特异性结合的亲和力，并且在这方面至少与亲本大鼠抗体相当，甚至优于亲本大鼠抗体。这两种示例性的人源化抗体保留其与CD47表达细胞(如CCRF-CEM细胞)的功能性相互作用，这体现在其均可以阻断CD47-SIRPα相互作用活性，并且诱导高效的巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用。

在一些实施方式中，源自人的FR区可以包含与其所源自的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人FR的一个或多个氨基酸残基由来自亲本非人抗体的对应残基取代。这在某些实施方式中是需要的，以使人源化抗体或其片段密切接近于非人亲本抗体结构。在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原结合片段包含在各个人FR序列中不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代，或者在重或轻链可变域的所有FR不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，这种氨基酸残基的变化可能仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区，或在两条链上都存在。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含选自下组的重链可变域序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:25。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段包含选自下组的轻链可变域序列：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:27。

在一些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体和抗原结合片段包含重链可变域的全部或部分，和/或轻链可变域的全部或部分。在一个实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体和抗原结合片段为由本申请所述的重链可变域的全部或部分组成的单域抗体。这种单域抗体的更多信息可以在现有技术中得到(参见例如美国专利号6,248,516)。

在某些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体及其抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1、铰链和/或CH2-CH3区。在某些实施方式中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方式中，轻链恒定区包含Cκ或Cλ。

在一些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体及其抗原结合片段具有免疫球蛋白(Ig)，优选地人Ig，优选地人IgG的恒定区。在某些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体及其抗原结合片段包括IgG1同种型的恒定区，其可能导致ADCC或CDC，或者IgG4或IgG2同种型的恒定区，其具有减少的或消除的效应功能。效应功能(如ADCC和CDC)可以对表达CD47的细胞产生细胞毒性。可以使用各种测定来评估效应功能，如Fc受体结合测定、C1q结合测定和细胞裂解测定。

本申请所述的抗体和抗原结合片段的结合亲和力可以由K_D值表示，其表示当抗原和抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与结合速率的比值(k_off/k_on)。使用本领域公知的合适的方法，包括例如流式细胞术测定，可恰当地确定抗原结合亲和力(例如K_D)。在一些实施方式中，可通过流式细胞术确定不同浓度下抗体与抗原的结合，可首先将确定的平均荧光强度(MFI)对抗体浓度制图，此时通过使用Prism第5版(GraphPad Software，圣地亚哥，CA)，将特异性结合荧光强度(Y)与抗体浓度(X)的相关性拟合至一个位点的饱和公式：Y＝B_max*X/(K_D+X)，可计算出K_D值，其中B_max是指待测抗体与抗原的最大特异性结合。

在一些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体及其抗原结合片段能够以不超过10^-9M、不超过9×10^-10M、不超过8×10^-10、不超过7×10^-10、不超过6×10^-10、不超过5×10^-10M、不超过4×10^-10M、不超过3×10^-10M、不超过2×10^-10M、不超过10^-10M、不超过9×10¹¹M、不超过8×10^-11M或不超过7.5×10^-11M的结合亲和力(K_D)特异性地与人CD47结合，所述K_D值通过流式细胞术测定。

在某些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗体及其抗原结合片段与食蟹猴CD47交叉反应。

抗体与人CD47的结合还可以用“半最大效应浓度”(EC₅₀)值表示，其是指观察到其最大效应(例如结合或抑制等)的50％时抗体的浓度。EC₅₀值可通过本领域公知的方法测得，例如夹心法(如ELISA、Western印记)、流式细胞术，以及其他结合试验。在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以不超过0.45nM、不超过0.5nM、不超过0.55nM、不超过0.6nM、不超过0.65nM、不超过0.7nM、不超过0.75或不超过0.8nM的EC₅₀值(即50％结合浓度)特异性地与人CD47结合，所述EC₅₀值通过流式细胞术测定。

在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段以低于与人CD47的结合亲和力与食蟹猴CD47结合。例如，示例性抗体W3452-1.164.16-z11以低于与人CD47结合的EC₅₀值与食蟹猴CD47结合。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以不超过0.1nM、不超过0.15nM、不超过0.2nM、不超过0.25nM、不超过0.3nM、不超过0.35nM、不超过0.4nM或不超过0.45nM的EC₅₀值特异性地与重组食蟹猴CD47结合，所述EC₅₀值通过流式细胞术测定。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段具有足以用于诊断和/或治疗用途的与人CD47特异结合的亲和力。

在某些实施方式中，本申请所述抗体及其片段阻断人CD47与其配体结合并且从而促进(例如诱导或增加)吞噬作用，以及抗肿瘤活性，而不促进(例如诱导或增加)红细胞凝集反应。

本申请所述的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外而不是在动物体内使用重组方法制备的抗体。

抗体变体

本申请所述的抗体及其抗原结合片段还涵盖其多种变体。在某些实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段涵盖本申请所述的示例性抗体(即W3452-1.164.16、W3452-1.164.16-z11、W3452-2.683.2或W3452-2.683.2-z27)的多种变体。

在某些实施方式中，抗体变体在表1所示一个或多个的CDR序列中、一个或多个表2所示的可变区序列中(但不在任何所述CDR序列中)，和/或恒定区(例如Fc区)中包含一个或多个修饰或取代。这些变体保持其亲本与CD47特异结合的亲和力，但具有一种或多种所述修饰或取代带来的所需要的特性。例如抗体变体可以具有改进的抗原结合亲和力、改进的生产力、改进的稳定性、改进的糖基化模式、减少的糖基化风险、减少的脱氨基作用、减少的或消除的效应功能、改进的FcRn受体结合、提高的药代动力学半衰期、pH敏感性，和/或对缀合的兼容性(例如一个或多个引入的半胱氨酸残基)。

可以使用本领域公知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”，筛选亲本抗体序列以识别合适的或优选的待修饰或取代的残基(参见例如Cunningham和Wells，(1989)Science，244:1081-1085)。简要地说，可以识别靶残基(例如带正电的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并由不带电的或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)取代，产生被修饰的抗体，并且针对目标特性对其进行筛选。如果在一个特定的氨基酸位置上的取代表现出了目标功能性改变，则该位置可以被识别为潜在的用于修饰或取代的残基。可以通过用另一种残基(例如半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估所述潜在的残基。

亲和力变体

亲和力变体可以含有在如表1所示的一个或多个CDR序列中、一个或多个FR序列中，或者表2所示的重链或轻链可变区序列中的修饰或取代。本领域公知，在可变区中CDR区侧接两个FR区，因此本领域的技术人员基于表1中的CDR序列和表2中的可变区序列，可以容易地识别出FR序列。所述亲和力变体保持亲本抗体的与CD47特异性结合的亲和力，或者甚至相对于亲本抗体具有改进的与CD47特异性结合的亲和力。在某些实施方式中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一个(或全部)取代包含保守取代。

本领域技术人员将理解，在表1和表2所示的CDR序列和可变区序列中，一个或多个氨基酸残基可以被取代，而得到的抗体或抗原结合片段仍然保持与CD47结合的亲和力，或甚至具有改进的结合亲和力。可以使用本领域公知的各种方法来达到这一目的。例如，可以生成抗体变体库(如Fab或scFv变体)，并用噬菌体展示技术表达，随后针对与人CD47结合的亲和力对其进行筛选。又例如，可以使用电脑软件虚拟抗体与人CD47的结合，并识别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。在取代中可以避开这些残基以防止结合亲和力的降低，或者可以做为取代的靶标以获得更强的结合。

在某些实施方式中，本申请所述的人源化抗体或抗原决定片段在一个或多个CDR序列和/或一个或多个FR序列中包含一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体在CDR序列和/或FR序列中包含总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。

在某些实施方式中，所述抗CD47抗体及其抗原结合片段包含1、2或3个与表1中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的CDR序列，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与CD47结合的亲和力。

在某些实施方式中，所述抗CD47抗体及其抗原结合片段包含一个或多个与表2中列出的序列具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的可变区序列，而同时保持相对于其亲本抗体水平相似或更高的与CD47结合的亲和力。在一些实施方式中，在选自表2的可变区序列中，总共有1至10个氨基酸被取代、插入或缺失。在一些实施方式中，所述取代、插入或缺失发生在CDR之外的区(例如在FR)。

糖基化变体

本申请所述的抗CD47抗体和抗原结合片段还包含糖基化变体。可以获取该糖基化变体以提高或降低抗体或抗原结合片段糖基化的程度。

所述抗体或其抗原结合片段可以包含一个或多个带有侧链的氨基酸残基，碳水化合物部分(例如寡糖结构)可以附接至所述侧链。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接的是指碳水化合物部分附接至天冬氨酸残基的侧链，例如，三肽序列中的天冬氨酸残基，如天冬氨酸-X-丝氨酸和天冬氨酸-X-苏氨酸，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一的糖附接至羟基氨基酸，最常见的是附接至丝氨酸或苏氨酸。对天然糖基化位点的移除可以方便地完成，例如通过改变氨基酸序列，使得存在于该序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一个被取代。用相似的方式，可以通过引入这样的三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基，产生新的糖基化位点。

半胱氨酸工程化的变体

本申请所述的抗CD47抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化的变体，其包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。

游离半胱氨酸残基是不作为二硫键的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化的变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤乙酰基，在工程化的半胱氨酸的位点与例如细胞毒性和/或成像化合物、标签或放射性同位素，以及其他物质缀合。用于工程化抗体或抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域公知的，参见例如WO2006/034488。

Fc变体

本申请所述的抗CD47抗体和抗原结合片段还包括Fc变体，其包含一个或多个在其Fc区和/或铰链区的氨基酸残基修饰或取代。

在某些实施方式中，所述抗CD47抗体或抗原结合片段包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代改进与新生儿Fc受体(FcRn)pH依赖性的结合。这种变体在酸性pH下与FcRn结合，使其得以免于在溶酶体中的降解，并且随后被转移并释放到细胞外，因此，这种变体可具有更长的药代动力学半衰期。工程化的抗体及其抗原结合片段以提高与FcRn的结合亲和力的方法是本领域公知的，参见例如Vaughn,D.等，Structure，6(1):63-73，1998；Kontermann,R.等，Antibody Engineering，第1卷第27章：Engineering of the Fc regionfor improved PK，Springer出版，2010；Yeung,Y.等，Cancer Research，70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等，J.Immunology，176:346-356(2006)。

在某些实施方式中，所述抗CD47抗体或抗原结合片段包含一个或多个改变抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的氨基酸取代。在Fc区的CH2域的某些氨基酸残基可被取代以提高ADCC活性。可替代地或额外地，可以改变所述抗体上的碳水化合物结构，以提高ADCC活性。通过抗体工程化改变ADCC活性的方法已经记述于现有技术中，参见例如Shields RL等，JBiol Chem.2001.276(9):6591-604；Idusogie EE等，J Immunol.2000.164(8):4178-84；Steurer W.等，J Immunol.1995，155(3):1165-74；Idusogie EE.等，J Immunol.2001，166(4):2571-5；Lazar GA.等，PNAS，2006，103(11):4005-4010；Ryan MC.等，Mol.CancerTher.，2007，6:3009-3018；Richards JO.等，Mol Cancer Ther.2008，7(8):2517-27；Shields R.L.等，J.Biol.Chem，2002，277:26733-26740；Shinkawa T.等，J.Biol.Chem，2003，278:3466-3473。

在某些实施方式中，所述抗CD47抗体或抗原结合片段包含一个或多个改变补体依赖的细胞毒性(CDC)的氨基酸取代，例如通过增强或减弱C1q结合和/或CDC(关于其他Fc区变体的实例，参见例如WO99/51642；Duncan&Winter Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；以及WO94/29351)。在某些实施方式中，所述抗CD47抗体多肽包含人IgG4恒定区，其中改变第228个氨基酸残基，例如Ser228Pro(S228P其可能阻止或减少链交换)，和/或改变第235个氨基酸残基，例如Leu235Glu(L235E，其可能改变Fc受体相互作用)。在某些其他实施方式中，所述抗CD47抗体多肽包含人IgG1恒定区。

在某些实施方式中，所述抗CD47抗体或抗原结合片段包含一个或多个位于Fc区界面的氨基酸取代，以便于和/或促进异二聚体化。这些修饰包含在第一Fc多肽中引入突起，以及第二Fc多肽中引入空洞，其中所述突起可位于所述空洞内，以促进所述第一和第二Fc多肽的相互作用，以形成异二聚体或复合体。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域公知的，例如，如美国专利号5,731,168所述。

抗原结合片段

本申请还提供抗CD47抗原结合片段。抗原结合片段的多种类型是本领域公知的，并且可基于本申请所述的抗CD47抗体进行研发，包括例如其CDR和可变序列示于表1和表2的示例性抗体，及其不同的变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程化抗体等等)。

在某些实施方式中，本申请所述的抗CD47抗原结合片段是骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、单链Fv片段(scFv)、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')₂、双功能抗体(dsdiabody)、纳米抗体、域抗体、单域抗体或双价域抗体。

多种技术可用于这种抗原结合片段的生产。示例性的方法包括对完整抗体进行酶消化(参见例如Morimoto等，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992)；以及Brennan等，Science，229:81(1985))、由宿主细胞(如大肠杆菌)重组表达(例如对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)、如上文讨论的噬菌体展示文库筛选(例如对于ScFv)，以及化学耦合两个Fab'-SH片段以形成F(ab')₂片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。生产抗体片段的其它技术对于本领域技术人员将是显而易见的。

在某些实施方式中，所述抗原结合片段是scFv。scFv的生成记述于例如WO 93/16185；美国专利号5,571,894；和5,587,458。scFv可以在氨基末端或羧基末端与效应蛋白融合以获得融合蛋白(参见例如Antibody Engineering，Borrebaeck编)。

缀合物

在某些实施方式中，所述抗CD47抗体及其抗原结合片段进一步包含缀合物部分。所述缀合物部分可以连接至所述抗体及其抗原结合片段。缀合物部分是可以附接至所述抗体或其抗原结合片段的非蛋白质部分。可以设想，本发明中的抗体或其抗原结合片段可与多种缀合物部分连接(见例如"Conjugate Vaccines"，Contributions to Microbiologyand Immunology，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编)，Carger Press，纽约(1989))。这些缀合物部分可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、协同结合(coordinate binding)、络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体或抗原结合片段连接。

在某些实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段可以工程化以在表位结合部分之外含有特定位点，所述特定位点可以用于与一个或多个缀合物部分结合。例如，该位点可以包含一个或多个反应性的氨基酸残基(例如半胱氨酸或组氨酸残基)，以便于与缀合物部分的共价连接。

在某些实施方式中，抗体可间接连于缀合物部分，或通过另一个缀合物部分相连。例如，所述抗体或其抗原结合片段可结合生物素，然后间接结合第二个缀合物部分，其与亲和素相连。所述缀合物部分可以是清除调节剂、毒素(例如化疗剂)、可检测标记(例如放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记或酶底物标记)或纯化部分。

“毒素”可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。毒素的示例包括但不限于，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴)、烷化剂(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(以前的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))、抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春碱)、拓扑异构酶抑制剂，以及微管蛋白粘合剂。

可检测的标记的示例可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)、酶-底物标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H、¹¹¹In、¹¹²In、¹⁴C、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、²¹¹At、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、and ³²P、其他镧系元素)、发光标记、发色基团、地高辛、生物素/亲和素、用于检测的DNA分子或金。

在某些实施方式中，所述缀合部分可以是帮助增加抗体半衰期的清除调节剂。说明性的示例包括水溶性聚合物，如PEG、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇共聚物等等。聚合物可以是任意分子量的，并且可以是支链的或非支链的。附接至抗体的聚合物的数量可以不同，而且如果附接了多于一个聚合物，其可以是相同或不同的分子。

在某些实施方式中，所述缀合部分可以是纯化部分，如磁珠。

在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其抗原结合片段用作缀合部分的基底。

多核苷酸和重组方法

本申请提供了编码抗CD47抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。

本申请中的术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，及其单链或双链形式的聚合物。除非明确限定，否则这一术语包括含有已知的天然核苷酸类似物的多核苷酸，所述类似物具有与参照核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另有明示，特定的多核苷酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源体、SNP和互补序列，以及明确标示的序列。特别地，通过生成一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列，可以获取简并密码子取代(参见Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包含一个或多个如SEQ ID NO:14、16、18、20、22、24、26和/或28所示的核酸序列，和/或与之具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的序列同一性的同源序列，和/或仅具有简并替代的变体，并且编码如本申请所述的示例性抗体。。编码所述单克隆抗体的DNA可以通过常规的方法分离和测序(例如可以使用寡核苷酸探针，该探针可特异性与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合)。所述编码DNA也可以通过合成的方法获得。

使用本领域公知的重组技术，可以将包含编码所述抗-CD47抗体和其抗原结合片段的多核苷酸(例如包含表3所示的序列)引入载体用于克隆(扩增DNA)或基因表达。多种载体可供选择。载体组分通常包括，但不限于，以下的一种或多种：信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强序列、启动子(例如：SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。

本申请提供的载体(例如表达载体)含有本申请所述的编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个可操作地连接至所述核酸序列的启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一个选择标记。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

可以将包含编码所述抗体和其抗原结合片段的多核苷酸的载体引入宿主细胞用于克隆或基因表达。本发明中适用于克隆或表达所述载体中的DNA的宿主细胞为原核细胞、酵母或上述高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细胞包含真细菌如，革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如，肠杆菌科，如，大肠杆菌，肠杆菌属，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门(氏)杆菌，沙雷氏菌属，如，粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属如，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌如，绿脓杆菌和链霉菌。

除了原核细胞以外，真核微生物如丝状真菌或酵母也可作宿主细胞克隆或表达编码抗CD47抗体的载体。酿酒酵母，或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属宿主如，乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；解脂耶氏酵母(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(EP183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；链孢霉；西方许旺酵母，如：西方许旺酵母；和丝状真菌，如：脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如：钩巢曲霉和黑曲霉。

本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株(baculoviral strains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insecthost cells)，来自于诸如以下的宿主：草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可用作宿主。

但是，最感兴趣的是脊椎细胞，且脊椎细胞的培养(组织培养)已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼地鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(HepG2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；及人肝癌细胞系(Hep G2)。在某些优选的实施方式中，所述宿主细胞是293F细胞。

用上述的可产生抗CD47抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。在另一实施方式中，所述抗体可通过本领域公知的同源重组的方法制得。

本发明中用于产生所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等，Meth.Enz.58:44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利申请Re.30,985中说明的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终浓度通常在微摩尔范围无机化合物)，和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。

在使用重组技术时，所述抗体可在胞内、壁膜空间生成，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生成，首先除去宿主细胞或裂解片断的颗粒残骸，例如，可通过离心或超声的方法。Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲磺酰氟(PMSF)存在的条件下化开细胞糊(cell paste)约30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体分泌到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器，如Amicon或Millipore Pelliconultrafiltration unit，浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生长。

从所述细胞中制得的抗CD47抗体可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。

在某些实施方式中，使用固定在固相上的蛋白A用于对所述抗体和抗原结合片段进行免疫亲和纯化。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适合。蛋白A可用于纯化基于人γ1，γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G适用于所有鼠源异构体和人γ3(Guss等，EMBO J.5:1567 1575(1986))。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3结构域，则可用Bakerbond ABX^TM树脂进行纯化(J.T.Baker，新泽西菲利普斯堡)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。

在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行(例如，从约0到0.25M盐浓度)。

药物组合物

本申请进一步提供了本申请所述的包含所述抗-CD47抗体或其抗原结合片段的药物组合物和一个或多个药学上可接受的载剂。

用在本申请公开的药物组合物中的药用可接受载剂可包含，例如，药用可接受的液体、凝胶或固体载剂、水相介质、非水相介质、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。

适用的组分可包括，例如，抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在一种含有本发明公开的抗体或其抗原结合片段的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述抗体或其抗原结合片段的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，本发明提供的组合物中含有一种或多种所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种抗氧剂例如甲硫氨酸。本发明进一步提供了多种方法，通过将本发明中提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧剂混合，例如甲硫氨酸，可防止所述抗体或其抗原结合片段氧化、延长其保质期和/或提高其活性。

进一步的说，药用可接受的载剂可包含，例如，水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如：植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如：氯化钠或葡萄糖、缓冲液如：磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如：硫酸氢钠，局部麻醉剂如：盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如：羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包含酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包含，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的无毒辅助物质可包含，例如，乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。

所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂或粉末。口服制剂可以包含标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包含现用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包含皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。

在某些实施方式中，单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一支带有针的针筒中。本领域习知，所有注射给药的制剂应为无菌无热原。

在某些实施方式中，通过将本申请公开的抗体或其抗原结合片段溶解于某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的稳定性，或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适用的辅料包含，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液，在一种实施方式中，缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中，将所得的溶剂分装至小管中冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗CD47抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10％过量)，从而保证取样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4℃到室温范围。

用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式中，可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定，可根据经验值决定。

使用方法

本申请还提供了治疗方法，包含将治疗有效量的本申请所述的抗体或其抗原结合片段施用给需要其的个体，由此治疗或预防与CD47相关的状况或病症。在一些实施方式中，所述与CD47相关的状况或病症是癌症、自体免疫疾病、纤维化病、炎性疾病或感染性疾病。

癌症的实例包含但不限于肺癌、支气管癌、骨癌、肝和胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、恶性肉瘤、畸胎瘤、腺癌、白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。

自体免疫疾病的实例包含但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其为具有自体免疫成分的病毒疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴细胞增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、乳糜泻乳糜性皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合征、克罗恩氏病、德哥斯病、幼年皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合冷球蛋白血症、纤维肌痛性纤维肌炎、Graves病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯蒂尔病)、幼年类风湿性关节炎、梅尼埃氏病、混合结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、顽固性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷诺现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病(进行性系统性硬化症(PSS)，又称系统性硬化症(SS))、干燥综合征、全身肌强直综合征、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。

炎性疾病包含例如慢性和急性炎性疾病。炎性疾病的示例包含阿尔茨海默病、哮喘、特应性变态反应、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、脓毒病、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病变和呼吸机所致肺损伤。

感染性疾病的示例包含但不限于真菌感染、寄生虫/原生动物感染或慢性病毒感染，例如疟疾、球孢子菌病、组织胞浆菌病、甲真菌病、曲霉病、芽生菌病、白色念珠菌病、副球孢子菌病、微孢子虫病、棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝斯虫病、小袋虫病、贝利斯虫病、美洲锥虫病、华支睾吸虫病、锥蝇病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、龙线虫病、棘球蚴病、象皮肿、蛲虫病、片形吸虫病、姜片吸虫病、丝虫病、贾第虫病、颌口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子球虫病、钉螺热、利什曼病、莱姆病、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病、鞭虫病、锥虫病、蠕虫感染、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、疱疹病毒,EB病毒、HIV、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人乳头瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒I,人类免疫缺陷病毒II、卡波西西肉瘤相关疱疹病毒流行病、薄环病毒(指环病毒)、人T淋巴营养性病毒I型人T淋巴营养性病毒II型、水痘带状疱疹、JC病毒或BK病毒的感染。

本申请中提供的抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素，例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况和交叉感染的潜力、过敏、超敏和副作用，以及给药途径和疾病发展的程度。本领域熟练人员(例如医生或兽医)可根据这些或其它条件或要求按比例降低或升高剂量。

在某些实施方式中，本发明提供的抗体或其抗原结合片段可在治疗有效剂量约0.01mg/kg到约100mg/kg之间给药。在某些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段以约50mg/kg或更少的剂量给药，在某些实施方式中，给药剂量为10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少或0.1mg/kg或更少。某特定剂量可在多个间隔给药，例如每天一次、每天两次或更多、每月两次或更多、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月或更多月一次。在某些实施方式中，给药剂量可随治疗进程变化。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可比后续给药剂量高。在某些实施方式中，给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。

给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如，可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。

本发明中公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的给药方式给药，例如注射给药(如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包含静脉滴注，肌肉注射或皮内注射)或非注射给药(如，口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药或局部给药)。

在一些实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段可单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联合给药。例如，本发明公开的抗体和抗原结合片段可与另一种治疗剂，例如化疗剂或抗癌药联合施用。

在某些这样的实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段与一种或多种上述治疗物质联用时，可与所述的一种或多种治疗物质同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗体和抗原结合片段可作为同一个药物组合物的一部分同时给药。但是，与其他治疗物质“联用”的抗体和抗原结合片段不需要同时给药或与该治疗物质在同一组合物中给药。本发明中“联用”的含义还包含在另一个治疗物质之前或之后给药的抗体和抗原结合片段也被认为是与该治疗物质“联用”，即使所述抗体或其抗原结合片段与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下，与本发明公开的抗体或其抗原结合片段联用的其他治疗物质可参照该其他治疗物质的产品说明书的方法用药，或参照外科医生的案头参考书2003(Physicians'Desk Reference，57th Ed；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))，或参照其他本领域公知的方法。

本申请进一步提供了使用所述抗CD47抗体或其抗原结合片段的方法。

在一些实施方式中，本申请提供了检测样品中CD47的存在或含量的方法，其包含将所述样品与所述抗体或其抗原结合片段接触，以及确定样品中CD47的存在或含量。

在一些实施方式中，本申请提供了诊断在个体中与CD47相关的疾病或状况的方法，其包含：a)将获取自所述个体的样品与所述抗体或其抗原结合片段接触；b)确定在所述样品中CD47的存在或含量；和c)将所述CD47的存在与所述个体中的所述与CD47相关的疾病或状况相关联。

在一些实施方式中，本申请提供了试剂盒，所述试剂盒包含本申请所述的抗体或其抗原结合片段，任选地与可检测部分缀合。所述试剂盒可以用于检测CD47或诊断CD47相关的疾病。

在一些实施方式中，本申请还提供了本申请所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗个体中的与CD47相关的疾病或状况的药物中的用途，在制备用于诊断CD47相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。

优势

本申请所述的抗体及抗原结合片段具有与CD47结合的高亲和力。其可以阻断CD47-SIRPα相互作用，在体外和体内条件下诱导高效的巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬作用。由于CD47在人正常细胞中的普遍表达，据报道现有技术中的抗体具有副作用，如贫血和血小板耗竭。值得关注的是，本申请所述的抗体及抗原结合片段不产生贫血和血小板耗竭，表明其可能不产生副作用并且在临床试验中具有优势。

以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包含在本发明范围内。发明人意在将这样的变动包含在本发明的范围内。

实施例

实施例1：杂交瘤抗体的产生

1.1动物免疫

人CD47的细胞外结构域(ECD)蛋白被用作动物免疫的免疫原。SD大鼠购自上海SLAC实验动物有限公司，并被笼养在IACUC批准的动物设施中。在免疫之前和之后收集动物血液，并根据一般ELISA程序通过ELISA检测针对靶蛋白的血清效价。

1.2杂交瘤的产生

选择具有最高血清效价的SD大鼠用于细胞融合。根据一般电融合程序通过电融合将来自脾脏和淋巴结的B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。细胞融合后，将细胞铺板在补充有20％FBS和1％HAT选择性试剂的DMEM培养基的96孔板中。

1.3抗体人源化

使用“最佳拟合(BestFit)”方法对抗体的轻链和重链进行人源化。对于轻链，将W3452-1.164.16和W3452-2.683.2的相应V基因的氨基酸序列与公司内部的人种系V-基因数据库比对。人源化的VL-基因的序列来源于使用Kabat CDR定义，将命中最高的人CDR序列替换为小鼠的CDR序列。对于重链，衍生出人源化序列。第一个序列来源于轻链。通过将小鼠框架与人种系V-基因数据库比对来产生另外的序列。使用扩展的CDR定义来定义框架，其中Kabat CDR1在N末端延长5个氨基酸。使用命中最高的三个来获得人源化VH基因序列。人源化基因经回译、密码子优化用于哺乳动物表达，并且通过GeneWiz(苏州)合成。将合成的基因重新分别克隆到人IgG表达载体中，表达并纯化。

获得2个人源化克隆W3452-2.683.2-z27和W3452-1.164.16-z11，并用不同的人恒定区进行表达。本申请所述的“W3452-2.683.2-z27-IgG1L”是指进一步包含人IgG1恒定区的抗体W3452-2.683.2-z27。本申请所述的“W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L”是指进一步包含含有S228P和L235E突变的人IgG4恒定区的抗体W3452-2.683.2-z27。本申请所述的“W3452-1.164.16-z11-IgG1K”是指进一步包含人IgG1恒定区的抗体W3452-1.164.16-z11。

还制备了基准抗体，并将其作为对照用于表征测定和研究中。总共制备了4种基准抗体，即：WBP345-BMK1.uIgG4PE.K(序列在WO 2016/109415 A1中公开)，WBP345-BMK2.uIgG4P.K(在Liu J.等，PLoS One,2015,10:e0137345中公开为Hu5F9-G4)，WBP345-BMK3.uIgG1K(C47B222-IgG1，C47B222的序列公开在WO 2016/081423 A1中)，WBP345-BMK4.uIgG4.SPK(在US 2017/0081407 A1中公开为2.3D11IgG4)。

同种型对照抗体W332-1.80.12xAb.hIgG1和W332-1.80.12xAb.hIgG4不与CD47结合并，并用作阴性对照。

实施例2：体外表征

1.靶向结合(ELISA/FACS)

1.1靶向结合(FACS)

表达人CD47的细胞系(W345-CHOK1.hPro1.D1)，CCRF-CEM(ATCC#CRM-CCL-119)由药明生物技术有限公司(WuXi Biologics)制备或购买。

通过流式细胞术测定CD47抗体与表达CD47的细胞(W345-CHOK1.hPro1.D1，CCRF-CEM)的结合。简而言之，将1×10⁵个细胞/孔加入到96孔板的每个孔中，并在4℃下以1500rpm离心5分钟，然后除去上清液。将测试抗体的连续稀释液以及阳性和阴性对照抗体加入到沉淀的细胞中并在4℃下孵育1小时。细胞用含1％BSA的200μl PBS洗涤两次。将用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG Fc(Jackson，#109-115-098)加入到细胞中，并在4℃孵育30分钟。用200μl FACS缓冲液进行两次另外的洗涤步骤，然后在4℃下以1500rpm离心5分钟。最后，将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中，通过流式细胞术测量荧光值并通过FlowJo分析。

使用稳定转染人CD47的CHOK1细胞，通过FACS测定

W3452-1.164.16-z11-IgG1K和W3452-2.683.2-z27-IgG1L和

W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的抗原结合活性。如图1所示，

W3452-1.164.16-z11-IgG1K和W3452-2.683.2-z27-IgG1L和

W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L与CD47转染的细胞结合，但不与亲本CHOK1空白细胞结合。具体数据如下表4所示。

表4示出了通过FACS测定的人CD47结合结果

1.2交叉结合(FACS)

食蟹猴PBMC用于食蟹猴CD47的表达细胞，其从食蟹猴新鲜血液中分离。

通过流式细胞术测定CD47抗体与表达CD47的细胞(食蟹猴PBMC)的结合。简而言之，将1×10⁵个细胞/孔加入到96孔板的每个孔中，并在4℃下以1500rpm离心5分钟，然后去除上清液。将测试抗体的连续稀释液以及阳性和阴性对照抗体加入沉淀的细胞中，并在4℃下孵育1小时。细胞用含1％BSA的200μl PBS洗涤两次。将用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG Fc(Jackson，#109-115-098)加入到细胞中，并在4℃孵育30分钟。用200μl FACS缓冲液进行两次另外的洗涤步骤，然后在4℃下以1500rpm离心5分钟。最后，将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中，通过流式细胞术测量荧光值并通过FlowJo分析。

使用食蟹猴PBMC，通过FACS测定W3452-1.164.16-z11-IgG1K和W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的抗原结合活性。结果显示W3452-1.164.16-z11-IgG1K可与食蟹猴PBMC很好的结合，具有低的EC₅₀和最大MFI。W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L显示出相似的EC₅₀和MFI(参见如下表5和图2)。表中的W332-1.80.12.xAb.hIgG1和W332-1.80.12.xAb.hIgG4分别是IgG1和IgG4同种型对照抗体。

表5示出了通过FACS测定的食蟹猴CD47结合结果

2.亲和力(FACS)

收集细胞并计数活细胞(W345.CHO-K1.hPro1.FL.G4(P1))，离心细胞并重悬于适当体积的1％BSA/1XPBS中，密度为1×10⁶细胞/ml，并在96孔U形板的每个孔中加入50μl细胞悬液。然后以1500rpm离心4分钟并弃去上清液。

用1％BSA/1XPBS稀释W3452-1.164.16-z11-IgG1K和W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L(初始浓度为10μg/ml，稀释2倍)，并以100μl/孔加入FACS板中，在4℃孵育1小时。然后以1500rpm离心4分钟并弃去上清液，以100μl/孔加入山羊抗人IgG Fc FITC(用1％BSA/1XPBS稀释至14μg/ml)以重悬细胞，在4℃孵育30分钟。之后，用180μl/孔的1％BSA/1XPBS洗涤细胞一次，并弃去上清液。在最终洗涤之后，将细胞重悬于100μl/孔的1％BSA/1XPBS中。将细胞避光4℃保存，直到运行。通过流式细胞术(BD Canto II)测量荧光强度并通过FlowJo分析。

使用稳定转染人CD47的CHOK1细胞，通过FACS测定

W3452-1.164.16-z11-IgG1K和W3452-2.683.2-z27-IgG1L和

W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的抗原结合亲和力(表6)。3个抗体均显示与人CD47具有高亲和力。

表6示出了通过FACS测定的人CD47结合亲和力结果

3.基于细胞的配体竞争测定

表达人CD47的细胞系(W345-CHOK1.hPro1.D1)，CCRF-CEM(ATCC#CRM-CCL-119)由药明生物技术有限公司(WuXi Biologics)制备或购买。人SIRPα(W345-hPro1L1.His(sino))购自Sino Biological(Cat#11612-H08H-50)。

通过流式细胞术测定CD47表达细胞(W345-CHOK1.hPro1.D1，CCRF-CEM)上CD47抗体与人SIRPα配体的竞争。简而言之，以1×10⁵个细胞/孔将细胞加入到96孔圆底培养板的每个孔中，并在4℃下以1500rpm离心5分钟，然后除去上清液。将测试抗体的连续稀释液以及具有1μg/ml人SIRPα的阳性和阴性对照抗体加入到沉淀的细胞中，并在4℃孵育2小时。细胞用含1％BSA的200μlPBS洗涤两次。将用FACS缓冲液以1:400稀释的生物素缀合的抗组氨酸标签的抗体(GenScript，#A00613)加入到细胞中，并在4℃孵育30分钟。将用FACS缓冲液以1:200稀释的PE缀合的链霉亲和素(Affymetrix，#12-4317)加入到细胞中，并在4℃孵育30分钟。用200μl FACS缓冲液进行两次另外的洗涤步骤，然后在4℃下以1500rpm离心5分钟。最后，将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中，通过流式细胞术测量荧光值并通过FlowJo分析。

为了评价W3452-1.164.16-z11-IgG1K和W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的配体(SIRPα)阻断活性，使用稳定转染人CD47的CHOK1，通过FACS测定，采用竞争性结合以测试上述3种抗体阻断CD47-SIRPα的相互作用活性。结果显示W3452-1.164.16-z11-IgG1K和W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L阻断率均超过90％(参见如下表7和图3)。表中的W332-1.80.12.xAb.hIgG1和W332-1.80.12.xAb.hIgG4分别是IgG1和IgG4同种型对照抗体。

表7示出了通过FACS测定的配体(SIRPα)竞争测试结果

4.人RBC血凝测定(HA)

为了评价CD47抗体(即W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L)的血液凝集能力，将新鲜的人血用PBS洗涤三次、以2000rpm离心5分钟后获得的人RBC，用PBS稀释至4％，并在圆底96孔板中与一定滴度的CD47抗体，以及阳性和阴性对照抗体在37℃孵育1小时。结果图用相机记录。通过存在未沉降的红细胞来证实血液凝集，未沉降的红细胞表现为雾状，而非凝集的RBC则为点状红点。结果显示，在任何测试浓度下，W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE都没有表现出血凝活性(见图4)。相比之下，基准对照抗体WBP345-BMK2.uIgG4P.K表现出血凝活性。

5.基于细胞的吞噬作用测定

从人血中分离PBMC，并通过hCD14微珠(Miltenyi Biotec，#130-050-201)从PBMC中分离CD14阳性单核细胞。通过将CD14阳性单核细胞在含有100ng/ml rhM-CSF(R&DSystems，#216-MC/CF)的10％FBS RPIM1640培养基中培养7天使其分化成巨噬细胞。这些单核细胞来源的巨噬细胞(MDM)变得能够附着，而其他细胞被冲洗掉。将MDM刮下来并在96孔板中重新铺板。选择人CD47高表达的肿瘤细胞系Jurkat.2B8、CCRF-CEM，Raji和hRBC作为靶细胞类型。靶细胞用1μM CFSE(Life-technology，#C34570)在37℃下标记30分钟，然后洗涤并以肿瘤细胞比吞噬细胞1:1的比例加入到MDM中，再加入不同浓度的CD47抗体。靶细胞的吞噬作用持续2个小时。随后，用与APC(BD Pharmingen，#561708)缀合的巨噬细胞标记物CD14的抗体染色，并通过流式细胞术分析。通过对FL4阳性的活细胞(CD14+)进行筛选来测量吞噬作用，然后评估FL1(CFSE+)阳性细胞的百分比。

通过使用人PBMC衍生的巨噬细胞和Jurkat.2B8和Raji细胞来测定吞噬活性，计算摄入肿瘤细胞的巨噬细胞的数目占总巨噬细胞数的比例。结果显示W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L诱导肿瘤细胞的强效吞噬作用(参见如下表8和表9以及图5A和图5B)。表中的W332-1.80.12.xAb.hIgG1和W332-1.80.12.xAb.hIgG4分别是IgG1和IgG4同种型对照抗体。

表8示出了Jurkat.2B8细胞吞噬试验结果

表9示出了Raji细胞吞噬试验结果

6.ADCC和CDC测定

6.1 ADCC测定

简而言之，将人PBMC在含有10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素溶液和50单位/mLhIL-2的RPMI1640培养基中孵育过夜。第二天，将PBMC用作效应细胞，和将CCRF-CEM或Raji用作靶细胞。在U形底的96孔板中每孔加入在含有1％FBS的50μL RPMI1640(无苯酚)培养基中的2x10⁴个靶细胞。然后，将每个孔中加入10μL溶于含有1％FBS的RPMI1640(无苯酚)培养基中的系列稀释抗体。在37℃孵育15分钟后，向每个孔中加入在含有1％FBS的40μL RPMI1640(无苯酚)培养基中的4×10⁵个PBMC，以得到20：1的E/T比率。在37℃下孵育4小时后，将混合物以1500rpm离心5分钟并转移70μL上清液。根据生产商的说明使用LDH细胞毒性检测试剂盒(Roche)以评价细胞死亡的情况。

6.2 CDC测定

在U形底的96孔板中每孔加入在含有1％FBS的50μL RPMI1640(无苯酚)培养基中的5x10⁴个靶细胞。然后，在每个孔中加入在含有1％FBS的10μL RPMI1640(无苯酚)培养基中的系列稀释抗体。在37℃孵育15分钟后，在每个孔中加入溶于含有1％FBS的40μLRPMI1640(无苯酚)培养基中的人血清，以得到20％的最终浓度。在37℃孵育2小时后，将10μL碘化丙锭(Invitrogen)加入到每个孔中并在室温下孵育10分钟。通过FACS分析评价细胞死亡情况。

6.3结果

如图6A-6D所示，W3452-1.164.16-z11-IgG1K和W3452-2.683.2-z27-IgG1L对CCRF-CEM和Raji细胞均诱导有效的ADCC活性，而只有W3452-1.164.16-z11-IgG1K对肿瘤细胞诱导CDC活性。W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L不诱导或诱导弱的ADCC和CDC活性。

7.热稳定性

使用7500Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems)进行差示扫描荧光(DSF)测定以检测W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的热稳定性。简而言之，将19μL抗体溶液与1μL 62.5X SYPROOrange溶液(Invitrogen)混合并加入到96孔板(Biosystems)中。以2℃/分钟的速率将孔板从26℃加热至95℃，并收集得到的荧光数据。计算不同温度下的荧光变化的负导数，并将最大值定义为熔化温度T_h。如果蛋白质具有多个解折叠转变，则报告前两个T_h，命名为T_h1和T_h2。T_h1常常被解读为正式的熔化温度T_m以便于不同蛋白质之间的比较。数据收集和T_h计算由其操作软件自动执行。一旦软件报告了不同温度的负导数图，则曲线从预过渡基线开始下降的曲线上的点可以粗略估计为起始温度T_on。

如下图7和表10所示，与人mAb正常值相比，W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L显示出良好的热稳定性，并且与基准对照抗体(WBP345-BMK1.uIgG4PE.K和WBP345-BMK2.uIgG4P.K)一样好或更好。

表10热稳定性结果

8.血清稳定性

为了促进体内研究，在人血清上进行W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的血清稳定性测试。将新鲜收集的人血置于不含抗凝剂的聚苯乙烯管中在室温下孵育30分钟。血液以4000rpm离心10分钟后收集血清。重复离心步骤直至血清澄清。将抗体与血清轻轻混合，并在37℃在指定的时间(第0、1、4、7和14天)等分取样。在指定的时间在液氮中快速冷冻样品，并将其储存在-80℃直至使用。使用样品通过FACS评价它们对W345-CHOK1.hPro1.D1细胞和CCRF-CEM细胞的结合能力。简而言之，将抗体的系列稀释液加入到W345-CHOK1.hPro1.D1细胞或CCRF-CEM细胞中，并在4℃孵育1小时。细胞用200μl含1％BSA的PBS洗涤两次。将用FACS缓冲液以1:100稀释的PE缀合的山羊抗人IgG Fc(Jackson，#109-115-098)加入到细胞中，并在4℃孵育30分钟。用200μl FACS缓冲液进行两次另外的洗涤步骤，然后在4℃下以1500rpm离心4分钟。最后，将细胞重悬于100μl FACS缓冲液中，通过流式细胞术测量荧光值并通过FlowJo分析。

如图8A-8C所示，14天的血清培养对测试抗体的人CD47结合没有影响，所述结合通过FACS测定。

9.抗CD47单克隆抗体对B-NSG小鼠中Raji细胞的影响

在B-NSG小鼠的淋巴瘤的Raji-Luc模型中评价W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的抗肿瘤活性。通过静脉注射将50万Raji细胞/小鼠植入小鼠体内。对小鼠体内成像以确定荧光水平，并将小鼠随机分为9组(每组6只小鼠，第0天)，在第0、4、7和11天以3mg/kg或0.5mg/kg每周给予两次治疗。

如图9所示，W3452-1.164.16-z11-IgG1K、W3452-2.683.2-z27-IgG1L和特别是W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L在该淋巴瘤动物模型中显示出最强的抗肿瘤活性。3mg/kg治疗显示出最好的抗肿瘤能力，比WBP345-BMK2.uIgG4P.K(3mg/kg)好很多。当给药量为0.5mg/kg时，W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L显示出比W3452-2.683.2-z27-IgG1L更好的抗肿瘤能力。由于CD47在正常人细胞中普遍表达，特别是在人红细胞中，IgG1形式可能引起严重的副作用，如贫血。为了进一步减少基于Fc的效应功能，我们用位点突变技术设计了IgG4版本。W3452-1.164.16-z11-IgG1K诱导了轻度抗肿瘤能力，其表现出能够良好的结合CD47和阻断CD47与其配体的相互作用的能力，甚至诱导更好的吞噬能力，这表明体内抗肿瘤能力与体外性能不一致。

10.在非幼年雄性食蟹猴中W3452-2.683.2-z27-IgG1L和

W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的药代动力学

10.1临床毒性研究

为测定单次静脉推注给药后非幼年雄性食蟹猴中W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的药代动力学，将8只动物(2只动物/组)分成4组：低剂量组和高剂量组(30和150mg/kg)，2种抗体单剂量给药(见表11)。对动物分别静脉施用W3452-2.683.2-z27-IgG1L和W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L。将抗体在pH 5.0的20mM组氨酸，5％蔗糖溶液中进行配制。在给药前(1天)，给药后0.25小时、0.5小时、1小时、4小时、8小时、24小时、第3天、第7天、第14天、第21天和第28天收集血液样品，并用ELISA法测定抗体浓度，用WinNonlin软件分析药代动力学(PK)数据。定期笼侧观察一般的健康、外观状况，尤其是皮肤刺激状况。分别通过血液学分析仪(ADVIA2120)和化学(HITACHI 7180)对全血样品的血液学(CBC)和血清化学进行分析。

表11分组和剂量信息

在早期抗体给药后，未发现关于一般健康，外观和皮肤刺激的异常体征。W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L组(IgG4形式)中的动物在临床观察中显示正常体征和正常RBC计数。但在第7天，RBC和HGB计数降低，表明低剂量和高剂量组均有轻度贫血。如图10A-10B所示，红细胞(RBC)和血红蛋白(HGB)在抗体给药后的7天中减少。然而，RBC和HGB计数早在第7天开始恢复，并在第28天左右达到正常范围。此外，网织红细胞(RET)计数早在第3天就显著升高，并补偿了血液中的RBC损失(图10D)。因此，我们得出结论，贫血是短暂且良好耐受的或者可补偿的。

与IgG4形式相比，对于W3452-2.683.2-z27-IgG1L在30和150mg/kg的血液学研究中，参数RBC、HGB和血细胞比容(HCT)在第7天均降低，并且在所有动物中引起贫血，在第8天导致一只动物死亡。由于严重贫血，在第12天对2只动物实施了安乐死(图10A-10C)。这种严重贫血可能是由于IgG形式或Fc功能引起的。

10.2W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的药动学参数

如图11和表12所示，对于30mg/kg和150mg/kg两个组，W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的平均半衰期分别为147和79小时。当剂量从30mg/kg增加到150mg/kg时，W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的系统暴露C₀增加了5.99倍。W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的半衰期比Hu5F9-G4(Hu5F9-G4是如Liu,J.等人(2015)Pre-Clinical Development of aHumanized Anti-CD47Antibody with Anti-Cancer Therapeutic Potential.PLoS ONE10,e0137345中所述的抗体，其在本申请中也作为WBP345-BMK2.uIgG4P.K被测试)的半衰期长，这表明W3452-2.683.2-z27-IgG4PE,L的PK比Hu5F9-G4相当或更好(如表13所示)。

表12示出了PK参数总结

表13示出了Hu5F9-G4的药动学参数

备注：在第1天施用1或3mg/kg的初始剂量(PD)，一周后接下来给予每周维持剂量(MD)30mg/kg，持续6周。

缩写说明

AUC 血清浓度-时间曲线下面积

AUC_0-last 从零时到最后可定量浓度时间的血清浓度-时间曲线下面积

AUC_0-inf 使用线性/对数梯形法则计算的从零外推至无穷大时间的血清浓度-时间

曲线下面积

C₀ 最大血清浓度

CL 全身清除率

MRT 平均滞留时间

MRT_0-last 从零时到最后可定量浓度时间的平均滞留时间

MRT_0-inf 从零到无穷大时间的平均滞留时间

T_1/2 半衰期

T_max 达到C_max的时间

Vdss 稳态分布体积

序列表

<110> 上海药明生物技术有限公司

<120> 新型抗CD47抗体

<130> 053674-8022CN03

<160> 29

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr His Val Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 2

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 3

<211> 16

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 3

Val Met Trp Asn His Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Pro Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 4

Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 5

Gly Gly Tyr Val Pro Asp Tyr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 6

Leu Gln Thr Thr His Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 7

Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Met Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 8

Ser Gly Ile Glu Leu Ser Asn Lys Tyr Ala His

1 5 10

<210> 9

<211> 17

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 9

Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 10

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 11

Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Arg Leu Ala Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 12

Leu Ser Thr Asn Ser Asp Asp Asp Leu Pro Val

1 5 10

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 13

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

His Val Tyr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Met Trp Asn His Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Pro Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Asn Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Glu Met Ser Gly Leu Gln Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Val Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 345

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 14

caggtgcaac tgaaggagtc aggacctggc ctggtgcagc cctcacagac cctgtctctc 60

acctgcactg tctctgggtt ctctttaacc aactatcatg tgtactgggt tcgacagcct 120

ccagggcaag gtctggaatg gatgggagta atgtggaatc atggagacac atcatataat 180

tcacctctca aatcccgact gaacatcagc agggacacct ccaagagcca agttttctta 240

gaaatgagcg gtctgcaaac tgaagactca gccacttact actgtgccag aggtggctac 300

gtccctgatt actggggcca aggagtcatg gtcacagtct cctca 345

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 15

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Pro Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Leu Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Thr Glu Asp Leu Gly Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 336

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 16

gatgttgtga tgacacagac tccagtctcc ctgcctgtca gccctggagg tcaagcctct 60

atctcttgcc ggtcaagtca gagcctggta cacagtaatg gaaaaaccta tttgcattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccacag ctcctcatct atcgggtttc caacagattt 180

tctgggctgc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggga cagatttcac cctcaagatc 240

agcagagtag agactgagga cttgggagat tattactgct tacaaactac acattttccg 300

tacacgtttg gagctgggac caagctggaa ctgaaa 336

<210> 17

<211> 115

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 17

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

His Val Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Met Trp Asn His Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Ser Pro Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Ser Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly Tyr Val Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 18

<211> 345

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 18

caggtgcagc tgcaggagag cggacctggc ctggtgaagc ccagcgagac cctgagcctg 60

acctgcaccg tgtccggctt cagcctgacc aactaccacg tgtactggat caggcagccc 120

cccggcaagg gactggaatg gatcggcgtg atgtggaacc acggcgacac cagctacaac 180

agccccctga agagcagggt gaccatcagc gtggacacca gcaagagcca gttcagcctg 240

aagctgagca gcgtgaccgc tgccgatacc gccgtgtact actgcgccag aggcggctat 300

gtgcccgact actggggcca gggcaccatg gtgaccgtga gcagc 345

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 19

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Ala Lys Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Thr

85 90 95

Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 20

gacatcgtga tgacccagag ccctctgagc ctgcctgtga cccctggaga gcctgccagc 60

atcagctgta ggagcagcca gagcctggtg cacagcaacg ccaagaccta cctccactgg 120

tacctgcaga agcccggcca gagccctcag ctgctgatct acagggtgag caacaggttc 180

agcggcgtgc ccgacagatt cagcggaagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240

tccagggtgg aggccgagga tgtgggcgtg tactactgcc tgcagaccac ccacttcccc 300

tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336

<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 21

Glu Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Arg Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 357

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 22

gaggtagaac tggtggagtc tgggggcgac ttagtgcagc ctggaaggtc catgaaactc 60

tcctgtgcag cctcaggatt cactttcagt acctatggca tggcctgggt ccgccagact 120

ccaacgaagg gtctggagtg ggtcgcatcc attagtacta gtggtggcag cacttactat 180

cgagactccg tgcagggccg attcactatt tccagagata atgcaaagag caccctatac 240

ctacaaatgg acagtctgac gtctgaggac acggccactt attactgtac aactaagggg 300

gggagaacct ataggcttgc ttactggggc caaggcactc tggtcactgt ctcttca 357

<210> 23

<211> 108

<212> PRT

<213> 大鼠

<400> 23

Ser Tyr Glu Leu Ile Gln Pro Pro Ser Ala Ser Val Thr Leu Glu Asn

1 5 10 15

Thr Val Ser Leu Thr Cys Ser Gly Ile Glu Leu Ser Asn Lys Tyr Ala

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Lys Thr Ile Leu Glu Val Met Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Arg Ser Gly Thr Thr Ala Ile Leu Thr Ile Arg Asp Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Thr Asn Ser Asp Asp Asp Leu

85 90 95

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 24

<211> 324

<212> DNA

<213> 大鼠

<400> 24

agctatgagc tgatccaacc accatcagca tcagtcactc tggaaaatac tgtctcactc 60

acttgttctg gaattgaatt atcaaacaaa tatgctcatt ggtttcaaca aaagccagac 120

aagaccattt tggaagtgat gtacaaagat agtgagcggc cctcaggcat ctctgaccga 180

ttctctgggt ccaggtcagg gacaacagcc attctgacaa tccgtgatgc ccaggctgag 240

gatgaggctg attattactg tttgtcaaca aatagtgatg atgatctccc tgttttcggt 300

ggtggaaccg agctcactgt ccta 324

<210> 25

<211> 119

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 25

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Thr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Thr Lys Gly Gly Arg Thr Tyr Arg Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 357

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 26

gaggtgcagc tggtggagag cggaggagga ctggtgcagc ccggaagaag cctgagactg 60

agctgcgccg ccagcggctt taccttcagc acctacggca tggcctgggt gagacaggcc 120

cccggcaaag gactggagtg ggtgagcagc atcagcacca gcggcggcag cacctactac 180

agggacagcg tgcagggaag gttcaccatc agcagggaca acgccaagag cagcctgtat 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccacct actactgcac caccaagggc 300

ggcaggacct acaggctggc ctattggggc cagggcaccc tggtgacagt gagctcc 357

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 27

Ser Tyr Glu Leu Met Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Ile Glu Leu Ser Asn Lys Tyr Ala

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Glu Val Met Tyr

35 40 45

Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Arg Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Ser Thr Asn Ser Asp Asp Asp Leu

85 90 95

Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 28

<211> 324

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 28

agctacgagc tgatgcagcc tcctagcgtg agcgtgagcc ccggacagac agccaggatc 60

acctgcagcg gcatcgagct gagcaacaag tacgcccact ggtaccagca gaagcctggc 120

caggcccctg tggaggtgat gtacaaggac agcgagagac ccagcggcat ccccgagagg 180

tttagcggca gcaggagcgg caccaccgtg accctgacca tcagcggagt gcaggccgag 240

gatgaggccg actactactg cctgagcacc aacagcgatg acgacctgcc tgtgttcggc 300

ggcggcacca agttaaccgt ccta 324

<210> 29

<211> 16

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 合成的

<400> 29

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Ala Lys Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

Claims

1.一种分离的抗CD47抗体或其抗原结合片段，其包含：

1、2或3个选自下组的重链互补决定区(CDR)序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11；和/或

1、2或3个选自下组的轻链CDR序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:29。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含选自下组的重链可变区：

a)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQID NO:5的CDR序列；和

b)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQID NO:11的CDR序列。

3.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包含选自下组的轻链可变区：

a)轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQID NO:6的CDR序列；

b)轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:4和SEQID NO:6的CDR序列；和

c)轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQID NO:12的CDR序列。

4.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

a)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQID NO:5的CDR序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:2、SEQID NO:4和SEQ ID NO:6的CDR序列；

b)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQID NO:5的CDR序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:29、SEQID NO:4和SEQ ID NO:6的CDR序列；和

c)重链可变区，所述重链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQID NO:11的CDR序列；和轻链可变区，所述轻链可变区包含1、2或3个选自SEQ ID NO:8、SEQID NO:10和SEQ ID NO:12的CDR序列。

5.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区选自下组：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25，以及与其具有至少80％序列同一性但仍然保持与CD47的特异性的结合亲和力的同源序列。

6.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区，所述轻链可变区选自下组：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:27，以及与其具有至少80％序列同一性但仍然保持与CD47的特异性的结合亲和力的同源序列。

7.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：

8.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含一个或多个氨基酸残基替代或修饰，但仍然保持与CD47的特异性的结合亲和力。

9.如权利要求8所述的抗体或其抗原结合片段，其中至少一个所述替代或修饰在一个或多个所述CDR序列里，和/或在一个或多个所述重链可变区或轻链可变区序列里而不在任何所述CDR序列里。

10.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含免疫球蛋白恒定区，可选地包含人免疫球蛋白的恒定区，或可选地包含人IgG的恒定区。

11.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。

12.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其为骆驼化单域抗体(camelized single chain domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)₂、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体或双价抗体。

13.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其能够以不超过10^-9M、5×10^-10M、10^-10M或7.5×10^-11M的K_D值特异性地与人CD47结合，所述K_D值通过流式细胞术测定。

14.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其能够特异性地与食蟹猴CD47结合。

15.如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，其与一种或多种缀合部分连接。

16.如权利要求15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合部分包含清除调节剂、化疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶底物标记、DNA烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白粘合剂或其他抗癌药。

17.一种抗体或其抗原结合片段，其与如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段竞争相同的表位。

18.一种药物组合物，其包含如前述任意一项权利要求所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂。

19.一种分离的多核苷酸，其编码如权利要求1-17所述的抗体或其抗原结合片段。

20.如权利要求19所述的分离的多核苷酸，其包含选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:28，和/或与其具有至少80％(例如至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列，和/或其仅具有简并替代的变体。

21.一种载体，其包含如权利要求19或20所述的分离的多核苷酸。

22.一种宿主细胞，其包含如权利要求21所述的载体。

23.一种表达如权利要求1-17中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含在使如权利要求21所述的载体表达的条件下培养如权利要求22所述的宿主细胞。

24.一种在个体中治疗可受益于CD47活性调节的疾病或状况的方法，其包含向所述个体施用治疗有效量的如权利要求1-17中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，或如权利要求18所述的药物组合物。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述疾病或状况是与CD47相关的疾病或状况。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述疾病或状况是癌症、自体免疫疾病、纤维化病、炎性疾病或感染性疾病。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述癌症是肺癌、支气管癌、骨癌、肝和胆管癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、脊柱癌、脑癌、宫颈癌、子宫癌、子宫内膜癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、肛门癌、食道癌、胃肠癌、皮肤癌、前列腺癌、垂体癌、胃癌、阴道癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、恶性肉瘤、畸胎瘤、腺癌、白血病、骨髓瘤和淋巴瘤。

28.如权利要求23-27中任意一项所述的方法，其中所述疾病或状况是血液科癌症，所述血液科癌症选自非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病(CML)、多发性骨髓瘤(MM)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、Richter综合征、伯基特氏淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤。

29.如权利要求23-28中任意一项所述的方法，其中所述个体是人。

30.如权利要求23-29中任意一项所述的方法，其中所述施用是经由口服、鼻内、静脉内、皮下、舌下或肌内施用。

31.一种在表达CD47的细胞中调节CD47活性的方法，其包含将所述表达CD47的细胞暴露于如权利要求1-17中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段。

32.一种在样品中检测CD47的存在或含量的方法，其包含将所述样品与如权利要求1-17中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段接触，以及确定所述样品中CD47的存在或含量。

33.一种在个体中诊断与CD47相关的疾病或状况的方法，其包含：a)将获取自所述个体的样品与如权利要求1-17中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；b)确定在所述样品中CD47的存在或含量；和c)将所述CD47的存在或含量与所述与CD47相关的疾病或状况在所述个体中的存在或状态相关联。

34.如权利要求1-17中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗个体中的与CD47相关的疾病或状况的药物中的用途。

35.如权利要求1-17中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于诊断CD47相关的疾病或状况的诊断试剂中的用途。

36.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-17中任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，其可用于检测CD47。