TW202124438A - 新型抗ｓｉｒｐａ抗體 - Google Patents

新型抗ｓｉｒｐａ抗體 Download PDF

Info

Publication number
TW202124438A
TW202124438A TW109128460A TW109128460A TW202124438A TW 202124438 A TW202124438 A TW 202124438A TW 109128460 A TW109128460 A TW 109128460A TW 109128460 A TW109128460 A TW 109128460A TW 202124438 A TW202124438 A TW 202124438A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
seq
sequence shown
antibody
sequence
variable region
Prior art date
Application number
TW109128460A
Other languages
English (en)
Inventor
牛曉峰
于景豐
趙金鳳
王奉莉
徐丹
邢柔媚
吳志浩
杜慶林
邱陽生
羅伯特 Ｈ 阿奇
宏韜 盧
Original Assignee
中國大陸商科望（蘇州）生物醫藥科技有限公司
中國大陸商科望（上海）生物醫藥科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中國大陸商科望（蘇州）生物醫藥科技有限公司, 中國大陸商科望（上海）生物醫藥科技有限公司 filed Critical 中國大陸商科望（蘇州）生物醫藥科技有限公司
Publication of TW202124438A publication Critical patent/TW202124438A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明提供了抗SIRPα抗體或其抗原結合片段、編碼上述抗體或其抗原結合片段之分離的多核苷酸、包括上述抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物及其用途。

Description

新型抗SIRPA抗體
本發明總體上係關於新型抗SIRPα抗體。
信號調節蛋白α (SIRPα)為主要在骨髓細胞及樹突細胞上表現之抑制性受體。除了SIRPα之外，SIRP家族亦包括其他幾種跨膜糖蛋白，包括SIRPβ及SIRPγ。SIRP家族之每個成員包含3個相似的細胞外免疫球蛋白樣域，具有不同的跨膜域及胞內域。CD47為一種廣泛表現之跨膜糖蛋白，具有一個細胞外N末端IgV域、五個跨膜域及一個短的C末端細胞內尾部。CD47充當SIRPα之細胞配位體。CD47與SIRPα之結合會發出「別吃我」的信號來抑制吞噬作用，而阻斷CD47介導之SIRPα在吞噬細胞上之結合會導致帶有「吃我」信號之活細胞經清除。腫瘤細胞經常過度表現CD47，以逃避巨噬細胞介導之破壞。已顯示CD47及SIRPα之相互作用參與巨噬細胞介導之吞噬作用之調節(Takenaka等人,Nature Immunol), 8(12): 1313-1323, 2007)。在各種臨床前模型中，阻斷CD47及SIRPα相互作用之療法可在體外刺激癌細胞之吞噬作用，且在體內刺激抗腫瘤免疫反應。目前，靶向CD47之多種藥劑(抗CD47抗體及SIRPα融合蛋白)已進入臨床試驗。但是，此等藥劑與溶血性貧血及血小板減少症有關。除了安全性問題之外，CD47之普遍表現亦可能引起抗原沈降(antigen sink)，從而導致功效降低。
仍需要新型抗SIRPα抗體。
本申請全文中之冠詞「一種」(a/an)、「一個」(a/an)及「上述」在此用於指一種(個)或多於一種(個)(即，至少一種(個))該冠詞之文法對象。舉例而言，「一種抗體」係指一種抗體或多於一種抗體。
在一個態樣中，本發明提供了一種能夠特異性結合人類SIRPα之抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，上述重鏈可變區包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，上述輕鏈可變區包括LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中：a) 上述HCDR1包括選自下組之序列：RNYWMN (SEQ ID NO：1)、TDYAMH (SEQ ID NO：2)、TX1 YAMN (SEQ ID NO：3)、THYSMH (SEQ ID NO：4)、SDYFMT (SEQ ID NO：5)、TNYDIS (SEQ ID NO：6)、SSYWIH (SEQ ID NO：7)；且b)上述HCDR2包括選自下組之序列：EIX2 LKSNTYATHYAESVKG (SEQ ID NO：8)、WKNTETGESTYAEDFKG (SEQ ID NO：9)、X3 INTYTGEPTYAX4 X5 FKG (SEQ ID NO：10)、WINTETAEPTYVDDFKG (SEQ ID NO：11)、NVNYDGRSTYYLDSLKS (SEQ ID NO：12)、VIWTGGDTNFNSAFMS (SEQ ID NO：13)、或LIHPNSGNTDCSETFKN (SEQ ID NO：14)；且c) 上述HCDR3包括選自下組之序列：FTKVVADWHLDV (SEQ ID NO：15)、GGYGSNYVMDY (SEQ ID NO：16)、TRGYYDFDGGAFDY (SEQ ID NO：17)、GGLRQGDY (SEQ ID NO：18)、EGSQTPLYAVDY (SEQ ID NO：19)、VQYFGGSYGPMDY (SEQ ID NO：20)、DGASYDWFVH (SEQ ID NO：21)；且d) 上述LCDR1包括選自下組之序列：RSSQNIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO：22)、KASEDIYNRLA (SEQ ID NO：23)、X6 ASQNVGTHLA (SEQ ID NO：24)、SATSSVSASYLY (SEQ ID NO：25)、KASQNVGTAVA (SEQ ID NO：26)、EASDHINDWLA (SEQ ID NO：27)、KSSQSLLYTNGKTYLN (SEQ ID NO：28)；且e) 上述LCDR2包括選自下組之序列：KX7 SNRFS (SEQ ID NO：29)、GATSLET (SEQ ID NO：30)、SAX8 YRYI (SEQ ID NO：31)、STSNLAS (SEQ ID NO：32)、LASNRYT (SEQ ID NO：33)、LVSKLDS (SEQ ID NO：35)；且f) 上述LCDR3包括選自下組之序列：FQGSHVPFT (SEQ ID NO：36)、QQYWNSPRT (SEQ ID NO：37)、QQYNTYPLT (SEQ ID NO：38)、HQWSSYPYT (SEQ ID NO：39)、QQYSIYPFT (SEQ ID NO：40)、QQYWNTPLT (SEQ ID NO：41)、VQGTHFPRT (SEQ ID NO：42)；其中，X1 為N或D，X2 為S或T，X3 為F或W，X4 為Q或D，X5 為D或G，X6 為K或R，X7 為V或I，X8 為S或I。
在一些實施例中，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR2包括如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR2包括如SEQ ID NO：29所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之胺基酸序列，其中X2 及X7 如上文所定義。
在一些實施例中，上述HCDR2包括選自下組之胺基酸序列：EISLKSNTYATHYAESVKG (SEQ ID NO：48)、EITLKSNTYATHYAESVKG (SEQ ID NO：49)，及/或上述LCDR2包括選自下組之胺基酸序列：KVSNRFS (SEQ ID NO：55)及KISNRFS (SEQ ID NO：56)。
在一些實施例中，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR2包括如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列，及/或上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR1包括如SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR2包括如SEQ ID NO：31所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之胺基酸序列，其中X1 、X3 、X4 、X5 、X6 及X8 如上文所定義。
在一些實施例中，上述HCDR1包括選自下組之胺基酸序列：TNYAMN (SEQ ID NO：43) 及TDYAMN (SEQ ID NO：45)，及/或上述HCDR2包括選自下組之胺基酸序列：FINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO：50)、WINTYTGEPTYAQGFKG (SEQ ID NO：51)、及FINTYTGEPTYAQGFKG (SEQ ID NO：52)，及/或上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列，及/或上述LCDR1包括選自下組之胺基酸序列：KASQNVGTHLA (SEQ ID NO：53)、及RASQNVGTHLA (SEQ ID NO：54)，及/或上述LCDR2包括選自下組之胺基酸序列：SASYRYI (SEQ ID NO：57)、及SAIYRYI (SEQ ID NO：58)，及/或上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段中之上述重鏈可變區包括：a) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：48所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列；或b) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列；或c) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：9所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列；或d) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：50所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或e) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：51所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或f) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：45所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或g) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或h) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：11所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：18所示之序列；或i) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列；或j) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：6所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：13所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：20所示之序列；或k) HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：7所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：14所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：21所示之序列。
在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段中之上述輕鏈可變區包括：a) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或b) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：56所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或c) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：23所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：37所示之序列；或d) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：53所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或e) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或f) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：58所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或g) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：25所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：32所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：39所示之序列；或h) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列；或i) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：41所示之序列；或j) LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：35所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：42所示之序列。
某些實施例中，在本發明所述之抗體或其抗原結合片段中，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：48所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：56所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：9所示之序列，上述如HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：23所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：37所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：50所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：53所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：51所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：45所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：45所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：58所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：58所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：11所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：18所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：25所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：32所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：39所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：6所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：13所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：20所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：41所示之序列；或上述HCDR1包括如SEQ ID NO：7所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：14所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：21所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：35所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：42所示之序列。
某些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段進一步包括重鏈HFR1、HFR2、HFR3及HFR4中之一或多者，及/或輕鏈LFR1、LFR2、LFR3及LFR4中之一或多者，其中：a) 上述HFR1包括QX9 QLVQSGSELKKPGASVKVSCX10 AX11 GYX12 X13 (SEQ ID NO：92)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，b)上述HFR2包括WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO：93)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，c)上述HFR3包括RFVFSLDTSVSTAYLQIX14 SLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO：96)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，d)上述HFR4包括WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：97)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，e)上述LFR1包括DIQMTQSPSX15 LX16 ASVGDRVTITC (SEQ ID NO：100)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，f)上述LFR2包括WX17 QQKPGKX18 PKX19 LIX20 (SEQ ID NO：104)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，g)上述LFR3包括GVPSRFSGSGSGTDFTLTISX21 LQPEDFATYX22 C (SEQ ID NO：108)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，h)上述LFR4包括FX23 QGTKLEIKX24 (SEQ ID NO：47)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X9 為I或V，X10 為R或K，X11 為G或R或S，X12 為T或S，X13 為L或I或F，X14 為G或S，X15 為S或R，X16 為S或G，X17 為Y或F，X18 為A或S，X19 為S或A，X20 為Y或F，X21 為S或N，X22 為Y或F，X23 為G或D，X24 為R或缺失。
在一些實施例中，上述HFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：44、89、90及91，上述HFR2包括如SEQ ID NO：93所示之序列，上述HFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：94及95，上述HFR4包括如SEQ ID NO：97所示之序列，上述LFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：98及99，上述LFR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：101、102及103，上述LFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：105、106及107，且上述LFR4包括選自下組之序列：SEQ ID NO：109及46。
在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段中之上述重鏈可變區包括選自下組之序列：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類SIRPα特異性結合親和性之同源序列。
在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段中之上述輕鏈可變區包括選自下組之序列：SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類SIRPα特異性結合親和性之同源序列。
在一些實施例中，在本發明所述之抗體或其抗原結合片段中，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：59所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：73所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：74所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：75所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：63所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：64所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：80所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：66所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：81所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：82所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：67所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：83所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：68所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：82所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：84所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：85所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示之序列；或上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：88所示之序列。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段進一步包括一或多個胺基酸殘基取代或修飾，但仍保持與人類SIRPα之特異性結合親和性。在一些實施例中，上述取代或修飾中之至少一者在上述重鏈可變區或輕鏈可變區中之一或多個CDR序列及/或一或多個非CDR序列中。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段進一步包括Fc區，視情況包括人類免疫球蛋白(Ig)之Fc區，或視情況包括人類IgG之Fc區。在一些實施例中，上述Fc區源自人類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2或IgM。在一些實施例中，上述Fc區源自人類IgG4。在一些實施例中，上述源自人類IgG4之Fc區包括S228P突變及/或L235E突變。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段為人源化的。在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段，其為單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、重組抗體、嵌合抗體、標記抗體、雙價抗體、抗獨特型抗體(anti-idiotypic antibody)或融合蛋白。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段為雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2 、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體、域抗體(domain antibody)及雙價域抗體。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段具有選自下組的與人類SIRPα之一或多個結合性質：a) 與人類SIRPα之結合親和性不超過10-7 M，上述與人類SIRPα之結合親和性藉由Biacore檢定法測定，b) 以不超過1 nM之EC50 特異性地與人類SIRPα v1胞外域(ECD)結合，上述EC50 藉由ELISA檢定法測定，c) 以不超過1 nM之EC50 特異性地與人類SIRPα v2 ECD結合，上述EC50 藉由ELISA檢定法測定。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段具有選自下組之一或多個結合性質：a) 未偵測到與SIRPγ ECD之結合，b) 以不超過50 nM之EC50 與SIRPγ ECD結合，上述EC50 藉由ELISA檢定法測定，c) 以不超過1 nM之EC50 與SIRPβ ECD結合，上述EC50 藉由ELISA檢定法測定，d) 藉由ELISA檢定法未偵測到與SIRPβ ECD之結合，e)藉由FACS檢定法測到與人類SIRPα IgV域之特異性結合，f) 藉由FACS檢定法未偵測到與人類SIRPα IgV域之結合，g) 以不超過10-5 M之結合親和性特異性地與小鼠SIRPα結合，上述結合親和性藉由Biacore檢定法測定，h)以10 nM之濃度特異性地與食蟹猴SIRPα結合，上述濃度藉由FACS檢定法測定，i) 能夠以10 nM之濃度誘導巨噬細胞對表現CD47之目標細胞的吞噬作用，上述濃度藉由吞噬試驗測定；以及j) 不減少CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段與上文提供之抗體或其抗原結合片段競爭結合人類SIRPα。在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示之序列。在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：88所示之序列。在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示之序列，或與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如上述SEQ ID NO：85所示之序列。在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示之序列。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段為雙特異性的。在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段能夠特異性地與除SIRPα之外的第二抗原結合，或能夠特異性地與SIRPα上之第二抗原決定基結合。在一些實施例中，上述第二抗原選自下組：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279 (PD-1)、CD274 (PD-L1)、GPC-3、B7-H3、B7-H4、TROP2、CLDN18.2、EGFR、HER2、CD117、C-Met、PTHR2及HAVCR2 (TIM3)。
在一些實施例中，本發明所述之抗體或其抗原結合片段與一或多個綴合物部分連接。在一些實施例中，上述綴合物部分包括清除修飾劑、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記、酶受質標記、DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑、純化部分或其他抗癌藥物。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包括本發明所述之抗體或其抗原結合片段以及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供一種分離的多核苷酸，其編碼根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段。
在另一態樣中，本發明提供一種載體，其包括根據本發明所述之分離的多核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供一種宿主細胞，其包括根據本發明所述之載體。
在另一態樣中，本發明提供一種套組，其包括根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物，以及第二治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種表現根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段之方法，其包括在表現根據本發明所述之載體之條件下培養根據本發明所述之宿主細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種在個體中治療、預防或減輕與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之方法，其包括向上述個體投與治療有效量的根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物。在一些實施例中，上述疾病、病症或狀況為癌症、實體瘤、慢性感染、炎性疾病、多發性硬化、自體免疫性疾病、神經系統疾病、腦損傷、神經損傷、紅細胞增多症、血色素沉著病、創傷、感染性休克、纖維化、動脈粥樣硬化、肥胖症、II型糖尿病、移植功能障礙或關節炎。在一些實施例中，上述癌症為肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽囊癌、胃癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝膽管癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、腎盂及輸尿管癌、唾液腺癌、小腸癌、尿道癌、膀胱癌、頭頸癌、脊椎癌、腦癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、食道癌、胃腸道癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、陰道癌、甲狀腺癌、喉癌、膠質母細胞瘤、黑素瘤、骨髓增生異常症候群、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T或B細胞淋巴瘤、胃腸道間質瘤、軟組織腫瘤、肝細胞癌或腺癌。在一些實施例中，上述癌症為CD47陽性癌症。在一些實施例中，上述個體為人類。在一些實施例中，上述投與係經由口服、鼻內、靜脈內、皮下、舌下或肌內投與。在一些實施例中，上述方法進一步包括投與治療有效量的第二治療劑。在一些實施例中，上述第二治療劑選自下組：化療劑、抗癌藥物、放療劑、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑、抗病毒劑、抗生素、鎮痛藥、抗氧化劑、金屬螯合劑及細胞因子。
在另一態樣中，本發明提供一種調節SIRPα陽性細胞中SIRPα活性之方法，其包括將上述SIRPα陽性細胞暴露於本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物。在一些實施例中，上述細胞為吞噬細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種偵測樣品中SIRPα之存在或含量之方法，其包括將上述樣品與本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物接觸，且在上述樣品中測定SIRPα之存在或含量。
在另一態樣中，本發明提供一種在個體中診斷與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之方法，其包括：a) 將獲取自上述個體之樣品與本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或本發明所述之醫藥組合物接觸；b) 測定在上述樣品中SIRPα之存在或含量；以及c) 將上述SIRPα之存在或含量與上述個體的與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之存在或狀態相關聯。
在某些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列。
在另一態樣中，本發明提供根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物在製備用於治療、預防或減輕與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之藥物中的用途。
在另一態樣中，本發明提供根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物在製備用於診斷與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之診斷試劑中的用途。在另一態樣中，本發明提供一種用於偵測SIRPα之套組，其包括根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物。在某些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列。
在另一態樣中，本發明提供一種在個體中誘導吞噬作用之方法，包括以有效誘導吞噬作用之劑量向上述個體投與根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明醫藥組合物。在一些實施例中，上述個體為人類。在一些實施例中，上述個體具有選自下組之疾病、病症或狀況：癌症、實體瘤、慢性感染、炎性疾病、多發性硬化、自體免疫性疾病、神經系統疾病、腦損傷、神經損傷、紅細胞增多症、血色素沉著病、創傷、感染性休克、纖維化、動脈粥樣硬化、肥胖症、II型糖尿病、移植功能障礙及關節炎。
在另一態樣中，本發明提供一種在體外誘導吞噬作用之方法，包括在根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物的存在下，將目標細胞與SIRPα陽性之吞噬細胞樣本接觸，從而藉由上述SIRPα陽性之吞噬細胞誘導上述目標細胞之上述吞噬作用。在一些實施例中，上述目標細胞為表現CD47之細胞。
本發明之以下描述只為說明本發明之多種實施例。因此，此處討論之具體修改方式不應理解為對申請範圍之限制。熟習此項技術者在不偏離本發明範圍之情況下即可很容易地得出多種等同方式，變化及修改，應理解此類等同實施例包括在本發明範圍內。在本發明中引用之所有文獻，包括公佈出版物、專利及專利申請均以引用之方式全文併入。定義
本發明中之術語「抗體」包括任何可結合某特定抗原之免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、雙價抗體、單價抗體、多特異性抗體或雙特異性抗體。一個天然的完整抗體包含兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。哺乳動物之重鏈可分為α、δ、ε、γ及μ，每條重鏈由一個可變區(VH)以及第一、第二、第三及第四(視情況存在的)恆定區(分別為CH1、CH2、CH3、CH4)組成；哺乳動物之輕鏈可分為λ或κ，而每條輕鏈由一個可變區(VL)以及一個恆定區組成。抗體呈「Y」型，「Y」型結構之莖部由經由二硫鍵結合之兩條重鏈之第二及第三恆定區組成。「Y」型結構之每條臂包括與單條輕鏈之可變區及恆定區結合之單條重鏈的可變區及第一恆定區。輕鏈及重鏈之可變區決定抗原之結合。每條鏈之可變區通常含有三個高變區，稱互補決定區(CDR)(輕鏈CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本發明中揭示之抗體及抗原結合片段之CDR邊界可藉由Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani命名法命名或識別(Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M.,J. Mol. Biol. , 273(4), 927 (1997); Chothia, C.等人,J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985); Chothia, C.及Lesk, A.M.,J. Mol. Biol. , 196,901 (1987); Chothia, C.等人,Nature . Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989); Kabat E.A.等人, Sequences of Proteins of immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Marie-Paule Lefranc等人,Developmental and Comparative Immunology , 27: 55-77 (2003); Marie-Paule Lefranc等人,Immunome Research , 1(3), (2005); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (第二版), 第26章, 481-514, (2015))。其中，三個CDR由稱為框架區(FR)(輕鏈FR包含LFR1、LFR2、LFR3及LFR4，重鏈FR包含HFR1、HFR2、HFR3及HFR4)之側翼部分間隔開，框架區比CDR更加高度保守，且形成一個支架支撐高度可變環。重鏈及輕鏈之恆定區與抗原結合無關，但具有多種效應功能。抗體依據其重鏈恆定區之胺基酸序列可分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ及μ重鏈，抗體可分別分為五個主要的分類或同種型：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。幾個主要的抗體分類亦可分為亞類，如IgG1(γ1重鏈)、IgG2(γ2重鏈)、IgG3(γ3重鏈)、IgG4(γ4重鏈)、IgA1(α1重鏈)或IgA2(α2重鏈)等。
在某些實施例中，本發明提供之上述抗體包括其任何抗原結合片段。本發明中之術語「抗原結合片段」係指由含有一或多個CDR之抗體之一部分形成的抗體片段，或與抗原結合但不具有完整天然抗體結構之任何其他抗體片段。抗原結合片段之例子包括但不限於，如雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2 、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價雙功能抗體)、雙特異性抗體、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、域抗體(domain antibody)及雙價域抗體(bivalent domain antibody)。抗原結合片段能夠與親本抗體結合相同抗原。
抗體之「Fab」係指由單條輕鏈(包括可變區及恆定區)及單條重鏈之可變區及第一恆定區經二硫鍵結合起來組成之抗體的一部分。
「Fab'」係指包含部分鉸鏈區之Fab片段。
「F(ab')2 」係指Fab'之二聚體。
抗體(例如IgG、IgA或IgD同種型)之「Fc」係指由第一重鏈之第二及第三恆定區經由二硫鍵與第二重鏈之第二及第三恆定區連接組成之抗體的一部分。IgM及IgE同種型抗體之Fc亦包含第四恆定區。抗體之Fc部分負責多種不同的效應功能，例如，抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)，但在抗原結合中不起作用。
抗體之「Fv」係指含有完整抗原結合位點之最小抗體片段。Fv片段由單條輕鏈之可變區與單條重鏈之可變區結合組成。
「單鏈Fv抗體」或「scFv」係指由輕鏈可變區與重鏈可變區直接相互連接或藉由肽連接子序列連接而成的經改造之抗體(Huston JS等人,Proc Natl Acad Sci USA , 85:5879 (1988))。
「單鏈Fv-Fc抗體」或「scFv-Fc」係指由與抗體Fc部分連接之scFv組成的經改造之抗體。
「駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)」、「重鏈抗體」或「HCAb(Heavy-chain-only antibody)」均指含有兩個VH 域而不含有輕鏈之抗體(Riechmann L.及Muyldermans S.,J Immunol Methods. Dec 10; 231(1-2):25-38 (1999); Muyldermans S.,J Biotechnol. Jun; 74(4):277-302 (2001); WO94/04678; WO94/25591; 美國專利號6,005,079)。重鏈抗體最初來源於駝科(駱駝、單峰駝及美洲駝)。雖然缺失輕鏈，但駱駝化抗體(camelized antibody)有確證的抗原結合全部功能(Hamers-Casterman C.等人,Nature . Jun 3; 363(6428):446-8 (1993); Nguyen VK.等人,Immunogenetics. Apr; 54(1):39-47 (2002); Nguyen VK.等人, Immunology. May; 109(1):93-101 (2003))。重鏈抗體之可變區(VHH域)為獲得性免疫產生之已知最小抗原結合單位(Koch-Nolte F.等人,FASEB J. Nov; 21(13):3490-8. Epub 2007年6月15日 (2007))。
「奈米抗體(nanobody)」係指一種抗體片段，其由來自重鏈抗體之VHH域以及兩個恆定區CH2及CH3組成。
「雙功能抗體(diabody)」或「dAb」包括帶有兩個抗原結合位點之小抗體片段，其中上述片段含有在同一條多肽鏈上相連之VH 域及VL 域(VH -VL 或VL -VH )(請參見，例如，Holliger P.等人,Proc Natl Acad Sci USA . Jul 15;90(14):6444-8 (1993); EP404097; WO93/11161)。兩個域之間的連接子很短，使同一條鏈上之兩個域不能互相配對，從而迫使兩個域與另一條鏈之互補域配對，從而形成兩個抗原結合位點。此兩個抗原結合位點可靶向相同或不同的抗原(或抗原決定基)。在一些實施例中，「雙特異性ds雙功能抗體」為靶向兩種不同抗原(或抗原決定基)之雙功能抗體。
「域抗體(domain antibody)」係指僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之抗體片段。在某些情況下，兩個或多個VH 域由肽連接子共價連接形成雙價或多價域抗體。雙價域抗體之兩個VH 域可靶向相同或不同的抗原。
本發明中使用之術語「價」係指給定分子中存在特定數量之抗原結合位點。術語「單價」係指僅具有一個抗原結合位點之抗體或抗原結合片段。術語「多價」係指具有多個抗原結合位點之抗體或抗原結合片段。由此，術語「雙價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。在一些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段為雙價的。
在本發明中，「雙特異性」抗體係指具有來源於兩個不同單株抗體之片段，且能夠與兩個不同抗原決定基結合之人工抗體。上述兩個抗原決定基可存在於同一個抗原，或其可存在於兩個不同抗原。
在一些實施例中，「scFv二聚體」為雙價雙功能抗體或雙特異性scFv(BsFv)，包含二聚化的兩個VH -VL (由肽連接子連接)部分，使得一個部分之VH 與另一個部分之VL 協作形成兩個結合位點，此兩個結合位點可靶向相同抗原(或抗原決定基)或不同抗原(或抗原決定基)。在另一些實施例中，「scFv二聚體」為雙特異性雙功能抗體，包含相互連接之VL1 -VH2 (由肽連接子連接)及VH1 -VL2 (由肽連接子連接)，使得VH1 及VL1 協作，VH2 及VL2 協作，且各協作之配對具有不同的抗原特異性。
「dsFv」係指二硫鍵穩定的Fv片段，其單條輕鏈之可變區與單條重鏈之可變區之間的連接為二硫鍵。在一些實施例中，「(dsFv)2 」或「(dsFv-dsFv')」含有三條肽鏈：兩個VH 部分藉由肽連接子(例如長的可撓性連接子)相連，且藉由二硫鍵分別與兩個VL 部分結合。在一些實施例中，dsFv-dsFv'具有雙特異性，其中每對藉由二硫鍵配對之重鏈及輕鏈具有不同抗原特異性。
本發明中使用之術語「嵌合」係指具有來源於一種物種之重鏈及/或輕鏈之一部分，且上述重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於另一不同物種之抗體或抗原結合片段。在一個例示性實例中，嵌合抗體可包括來源於人之恆定區及來源於非人動物(例如小鼠)之可變區。在一些實施例中，上述非人動物為哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。
本發明中使用之術語「人源化」係指包括來源於非人動物之CDR、來源於人之FR區、以及來源於人之恆定區(當適用時)的抗體或抗原結合片段。
本發明中使用之術語「親和力」係指免疫球蛋白分子(即，抗體)或其片段與抗原之間非共價相互作用之強度。
本發明中之「特異性結合」或「特異性地結合」係指兩分子間的非隨機結合反應，例如，抗體及抗原間的反應。特異性結合之特徵可在於結合親和力，例如由KD 值表示，即，當抗原及抗原結合分子之間的結合達到平衡時解離速度與結合速度之比值(koff /kon )。可藉由使用此項技術中熟知之任何傳統方法測定KD ，包括但不限於，表面電漿子共振法、微量熱泳法、HPLC-MS方法及流動式細胞測量術(例如FACS)方法。≤10-6 M(例如 ≤5×10-7 M、≤2×10-7 M、≤10-7 M、≤5×10-8 M、≤2×10-8 M、≤10-8 M、≤5×10-9 M、≤4×10-9 M、≤3×10-9 M、≤2×10-9 M、或≤10-9 M)之KD 值可表示抗體或其抗原結合片段與SIRPα(例如人類SIRPα)之間的特異性結合。
本發明中之「競爭結合人類SIRPα」之能力係指第一抗體或其抗原結合片段抑制人類SIRPα與第二抗SIRPα抗體之間結合的相互作用至任何可偵測程度之能力。在一些實施例中，競爭結合人類SIRPα之抗體或抗原結合片段可將人類SIRPα與第二抗SIRPα抗體之間結合的相互作用抑制至少85%或至少90%。在一些實施例中，此類抑制作用可大於95%或大於99%。
本發明中使用之術語「抗原決定基」係指抗原上與抗體結合之特定原子基團或胺基酸。若兩種抗體表現出對抗原之競爭性結合，則可能結合抗原上相同或密切相關的抗原決定基。抗原決定基可為線性或構形的(即包括間隔開的胺基酸殘基)。例如，若抗體或其抗原結合片段對參考抗體與抗原之結合阻斷達到至少85%、或至少90%或至少95%，則上述抗體或其抗原結合片段可被視為與上述參考抗體結合相同/密切相關的抗原決定基。
本發明所用之術語「胺基酸」係指含有胺基(-NH2 )及羧基(-COOH)官能基以及每個胺基酸特有的側鏈之有機化合物。胺基酸名稱在本發明中亦以標準的單字母或三字母代碼表示，總結如下：
胺基酸名稱 三字母代碼 單字母代碼
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天冬醯胺 Asn N
天冬胺酸 Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩胺酸 Glu E
麩醯胺酸 Gln Q
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異白胺酸 Ile I
白胺酸 Leu L
離胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
苯丙胺酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
在本發明中當「保守取代」用於胺基酸序列時，係指將一個胺基酸殘基用另一個具有相似理化性質之側鏈之胺基酸殘基替代。例如，可在具有疏水側鏈之胺基酸殘基之間(例如Met、Ala、Val、Leu及Ile)、具有中性親水側鏈之胺基酸殘基之間(例如Cys、Ser、Thr、Asn及Gln)、具有酸性側鏈之胺基酸殘基之間(例如Asp、Glu)、具有鹼性側鏈之胺基酸殘基之間(例如His、Lys及Arg)或具有芳族側鏈之胺基酸殘基之間(例如Trp、Tyr及Phe)進行保守取代。此項技術中已知，保守取代通常不會引起蛋白構形結構之顯著變化，因此能夠保留蛋白質之生物活性。
本發明所述之術語「同源的」係指當最佳比對時核酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列與另一條序列具有至少60%(例如，至少65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性。
當「百分比(%)序列同一性」用於胺基酸序列(或核酸序列)時，係指在進行序列比對，且必要時引入間隔使相同胺基酸(或核酸)數目達到最多後，在候選序列中，與參比序列相同的胺基酸(或核酸)殘基占上述候選序列之胺基酸(或核酸)殘基之百分比。換言之，可藉由用與其比較之參比序列相同的胺基酸殘基(或鹼基)數除以候選序列或參比序列(以較短者為凖)中之胺基酸殘基(或鹼基)總數來計算胺基酸序列(或核酸序列)之百分比(%)序列同一性。上述胺基酸殘基之保守取代可視為或可不視為相同殘基。可藉由此項技術中揭示之工具，例如BLASTN、BLASTp(美國國家生物技術資訊中心網站(NCBI)，亦可參見Altschul S.F.等人,J. Mol. Biol. , 215:403-410 (1990); Stephen F.等人,Nucleic Acids Res. , 25:3389-3402 (1997))、ClustalW2(歐洲生物資訊研究所網站，可參見Higgins D.G.等人,Methods in Enzymology , 266:383-402 (1996); Larkin M.A.等人, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007))及ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體，對序列進行比對以確定胺基酸(或核酸)序列之百分比序列同一性。熟習此項技術者可使用上述工具之默認參數或根據比對的需要適當調整參數，例如藉由挑選合適的算法。
本發明中使用之「效應功能」係指抗體之Fc區與其效應子(例如，C1複合體及Fc受體)結合之生物活性。例示性效應功能包括抗體與C1複合體上之C1q相互作用介導之補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體之Fc區與效應細胞上之Fc受體結合介導之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)以及吞噬作用。可使用各種檢定法(例如Fc受體結合測定、C1q結合測定及細胞裂解測定)評估效應功能。
「分離的」物質已經經人工由自然狀態改變。若自然界中出現某種「分離的」組合物或物質，則其已被改變或脫離其原始狀態，或二者均有發生。例如，某一活體動物體內天然存在之多核苷酸或多肽並非「分離的」，但若此等多核苷酸或多肽與其在天然狀態下共存之物質足夠分離且以基本上純的狀態存在，則可視為「分離的」。「分離的核酸序列」係指分離的核酸分子之序列。在一些實施例中，「分離的抗體或其抗原結合片段」係指純度為至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之抗體或其抗原結合片段，其中純度由電泳方法(例如，SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳)，或層析法(例如，離子交換層析或反相HPLC)確定。
本發明中之術語「載體」係指可將遺傳元件操作性地插入其中且使該遺傳元件獲得表現之一種運載工具，例如生產由該遺傳元件編碼之蛋白質、RNA或DNA，或複製上述遺傳元件。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶之遺傳元件在宿主細胞內得以表現。舉例而言，載體包括：質體、噬菌粒、黏質體(cosmid)、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生之人工染色體(PAC)、噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體，以及動物病毒等。載體可含有多種控制表現之元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報導基因。另外，載體亦可含有複製起始位點。載體亦可包括協助其進入細胞之成分，包括但不限於，病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼。載體可為表現載體或選殖載體。本發明提供之載體(例如表現載體)含有本發明所述之編碼抗體或其抗原結合片段之核酸序列、至少一個可操作地連接至上述核酸序列之啟動子(例如，SV40、CMV、EF-1α)，以及至少一個選擇標記。
本發明中之「宿主細胞」係指可導入或已導入外源多核苷酸及/或載體之細胞。
術語「個體」包括人類及非人類動物。非人類動物包括所有脊椎動物，例如，哺乳動物及非哺乳動物(例如，非人類靈長類、小鼠、大鼠、貓、兔子、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物及爬行動物)。除另有說明外，否則術語「患者」或「個體」在本發明中可互換使用。
術語「抗腫瘤活性」係指腫瘤細胞增殖、生存力或轉移活性之降低。例如，抗腫瘤活性可藉由在治療期間出現之異常細胞之生長速率之下降或腫瘤尺寸之穩定或減少、或由於與未治療之對照相比由於治療所致之更長生存期來顯示。可使用可接受之體外或體內腫瘤模型(包括但不限於異種移植物模型、同種異體移植物模型、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)模型及此項技術中已知之研究抗腫瘤活性之其他已知模型)來評估抗腫瘤活性。
本發明中使用的對某種疾病、病症或狀況之「治療」或「療法」包括預防或減輕某種疾病、病症或狀況，降低某種疾病、病症或狀況之發生或發展速度，降低發展出某種疾病、病症或狀況之風險，預防或延遲與某種疾病、病症或狀況相關之症狀發展，減少或終止與某種疾病、病症或狀況相關之症狀，產生某種疾病、病症或狀況之完全或部分逆轉，治癒某種疾病、病症或狀況，或以上之組合。
術語「診斷(diagnosis)」、「診斷(diagnose)」或「診斷(diagnosing)」係指病理狀態、疾病或狀況之鑑定，例如SIRPα相關疾病之鑑定，或指患有SIRPα相關疾病的可能會受益於特定治療方案之個體之鑑定。在一些實施例中，診斷包含鑑定SIRPα之異常含量或活性。在一些實施例中，診斷係指在個體中鑑定癌症或自體免疫性疾病。
如本發明所用，術語「生物樣品」或「樣品」係指獲自或源自目標個體之生物組合物，其包含待表徵及/或待鑑定之細胞及/或其他分子實體，例如基於物理、生化、化學及/或生理特徵來表徵及/或鑑定。生物樣品包括但不限於藉由熟習此項技術者已知之任何方法獲得的個體之細胞、組織、器官及/或生物流體。在一些實施例中，生物樣品為流體樣品。在一些實施例中，流體樣品為全血、血漿、血清、黏液(包括鼻腔排泄物及痰)、腹膜液、胸膜液、胸腔液、唾液、尿液、滑液、腦脊髓液(CSF)、胸腔穿刺液、腹部流體、腹水或心包積液。在一些實施例中，生物學樣品係獲自個體之心臟、肝、脾、肺、腎、皮膚或血管之組織或細胞。
如本發明所用，「SIRPα」係指信號調節蛋白(SIRP)家族之調節膜糖蛋白，其主要由髓樣細胞、樹突狀細胞以及幹細胞或神經元表現。SIRPα之結構包括胞外域及胞質域。SIRPα之胞外域由膜遠端Ig可變樣(IgV)摺疊及兩個膜近端Ig恆定樣(IgC)摺疊組成。SIRPα之IgV域負責與CD47之胞外Ig域結合。在某些實施例中，SIRPα為人類SIRPα。編碼人類SIRPα之基因為多態性基因，且在人類中描述了幾種變體。最常見的蛋白質變體為SIRPα v1及SIRPα v2(編號NP_542970(P78324)及CAA71403)。本發明所用之SIRPα可來自其他動物物種，例如小鼠及食蟹猴等。Mus musculus (小鼠)SIRPα蛋白之例示性序列揭示於NCBI Ref Seq No.NP_031573或BAA20376.1或BAA13521.1中。食蟹猴(猴子)SIRPα蛋白之例示性序列揭示於NCBI Ref Seq No.NP_001271679中。
除了SIRPα之外，SIRP家族亦包括其他幾種跨膜糖蛋白，包括SIRPβ及SIRPγ。SIRP家族之每個成員包含3個相似的胞外Ig樣域，但具有不同的跨膜及胞質域。由SIRP beta基因編碼之「SIRPβ」藉由與稱為DNAX激活蛋白12或DAP12之跨膜蛋白結合，藉由胞質尾部之細胞內信號傳導產生正信號。DAP12之胞質尾部具有基於免疫受體酪胺酸之激活基序(ITAM)，該基序將SIRPβ1連接至激活機制。「SIRPγ」，亦稱為SIRPg，由SIRPG基因編碼，且與SIRPα及SIRPβ之胞外Ig域高度同源，但SIRPγ之胞質尾部為不同的。SIRPγ亦顯示出與CD47結合，但其親和力比SIRPα低。
術語「抗SIRPα抗體」係指能夠與SIRPα(例如，人類或猴SIRPα)特異性結合之抗體。術語「抗人類SIRPα抗體」係指能夠與人類SIRPα特異性結合之抗體。
如本發明所用，「SIRPα相關」的疾病、病症或狀況係指由SIRPα之表現或活性之增加或減少引起的、加劇的或與之相關的任何疾病或狀況。在一些實施例中，SIRPα相關疾病、病症或狀況為免疫相關病症，例如自體免疫性疾病。在一些實施例中，SIRPα相關疾病、病症或狀況為與過度細胞增殖有關的病症，例如癌症。在某些實施例中，SIRPα相關疾病或狀況之特徵在於表現或過表現SIRPα基因。在某些實施例中，SIRPα相關疾病或狀況之特徵在於表現或過表現CD47。
術語「醫藥學上可接受之」係指所指的載劑、溶媒、稀釋劑、賦形劑及/或鹽，總體而言在化學上及/或在物理上與製劑中之其他配料相容，且在生理上與其接收者相容。
如本發明所用，術語「SIRPα陽性細胞」係指在細胞表面上表現SIRPα之細胞(例如，吞噬細胞)。在一些實施例中，「SIRPα陽性細胞」亦可在細胞表面上表現SIRPβ或SIRPγ。抗 SIRPα 抗體
本發明提供了抗SIRPα抗體及其抗原結合片段。本發明提供之抗SIRPα抗體及抗原結合片段能夠與SIRPα特異性結合。
在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過10-7 M、不超過8×10-8 M、不超過5×10-8 M、不超過2×10-8 M、不超過8×10-9 M、不超過5×10-9 M、不超過2×10-9 M、不超過10-9 M、不超過8×10-10 M、不超過7×10-10 M或不超過6×10-10 M之KD 值與人類SIRPα特異性結合，上述KD 值係藉由Biacore檢定法測定。Biacore檢定法基於表面電漿子共振技術(參見，例如，Murphy, M.等人,Current protocols in protein science , 第19章, 第19.14單元, 2006)。在某些實施例中，藉由本發明之實例4.3中所述之方法測定KD 值。
本發明提供之抗體或其抗原結合片段與人類SIRPα之結合亦可用「半最大有效濃度」(EC50 )值表示，該值係指觀察到抗體之最大結合之50%時的抗體濃度。可藉由此項技術中已知之結合檢定法，例如直接或間接結合檢定法(例如酶聯免疫吸附檢定法(ELISA)、流動式細胞測量術檢定法及其他結合檢定法)來測定EC50 值。在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過1nM、不超過0.9 nM、不超過0.8 nM、不超過0.7 nM、不超過0.6 nM、不超過0.5 nM、不超過0.4 nM、不超過0.3 nM、不超過0.2 nM、不超過0.1 nM、不超過0.09 nM、不超過0.08 nM、不超過0.07 nM、不超過0.06 nM或不超過0.05 nM之EC50 (即50%結合濃度)與人類SIRPα特異性結合，上述EC50 值係藉由ELISA檢定法測定。
在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過1 nM(例如，不超過5 × 10-10 M、不超過3 × 10-10 M、不超過1 × 10-10 M)之EC50 值與人SIRPα v1胞外域(ECD)特異性結合，上述EC50 值係藉由ELISA檢定法測定。在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過1 nM(例如，不超過5 × 10-10 M、不超過3 × 10-10 M、不超過1 × 10-10 M)之EC50 值與人SIRPα v2胞外域(ECD)特異性結合，上述EC50 值係藉由ELISA檢定法測定。
在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過50 nM(例如不超過40 nM、不超過30 nM、不超過20 nM、不超過10 nM、不超過1 nM)之EC50 值與人SIRPγ ECD特異性結合，上述EC50 值係藉由ELISA檢定法測定。
與SIRPγ ECD「不可偵測地結合」之抗體或其抗原結合片段係在同等測定條件下與SIRPγ之結合不可偵測或與SIRPγ之結合與對照抗體之結合水準相當的抗體或其抗原結合片段。對照抗體可為已知不與SIRPγ結合之任何抗體。
在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過1 nM(例如，不超過5 × 10-10 M、不超過3 × 10-10 M、不超過1 × 10-10 M)之EC50 值與人SIRPβ ECD特異性結合，上述EC50 值係藉由ELISA檢定法測定。在某些實施例中，如藉由ELISA檢定法所測定，本發明提供之抗體及其抗原結合片段不可偵測地結合SIRPβ ECD。
在某些實施例中，如藉由FACS檢定法所測定，本發明提供之抗體及其抗原結合片段與人SIRPα IgV域特異性結合。在某些實施例中，如藉由FACS檢定法所測定，本發明提供之抗體及其抗原結合片段不可偵測地結合人SIRPα IgV域。
在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過10-5 M(例如，不超過5 × 10-6 M、不超過3 × 10-6 M、不超過1 × 10-6 M、不超過5 × 10-7 M、不超過3 × 10-7 M、不超過1 × 10-7 M、不超過5 × 10-8 M、不超過3 × 10-8 M、不超過1 × 10-8 M)之結合親和力與小鼠SIRPα特異性結合，上述結合親和力係藉由Biacore檢定法測定。在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段以不超過10 nM之濃度與食蟹猴SIRPα特異性結合，上述濃度係藉由FACS檢定法測定。
在某些實施例中，本發明所提供之抗體及其抗原結合片段能夠以不超過10 nM之濃度誘導巨噬細胞吞噬表現CD47之目標細胞，上述濃度係藉由吞噬作用測定法測定。
在某些實施例中，本發明提供之抗體及其抗原結合片段不減少CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖。據報導，人T細胞藉由SIRPγ-CD47相互作用與抗原呈遞細胞之黏附共同刺激T細胞增殖。本發明提供之抗體及其抗原結合片段不與SIRPγ特異性結合，或不阻斷SIRPγ-CD47相互作用以達到降低CD4+ T細胞或CD8+ T細胞增殖之程度。可使用此項技術中已知之方法來確定T細胞增殖，例如，藉由T細胞增殖測定法，例如本發明之實例5.4中描述之彼等方法，例如，藉由使用CellTrace Violet(Life Technologies)標記來確定增殖量。例示之抗 SIRPα 抗體
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體(例如，抗人類SIRPα抗體)及其抗原結合片段包括一或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個或6個)CDR，上述CDR包括選自下組之序列：RNYWMN (SEQ ID NO：1), TDYAMH (SEQ ID NO：2)、TX1 YAMN (SEQ ID NO：3)、THYSMH (SEQ ID NO：4)、SDYFMT (SEQ ID NO：5)、TNYDIS (SEQ ID NO：6)、SSYWIH (SEQ ID NO：7)、EIX2 LKSNTYATHYAESVKG (SEQ ID NO：8)、WKNTETGESTYAEDFKG (SEQ ID NO：9)、X3 INTYTGEPTYAX4 X5 FKG (SEQ ID NO：10)、WINTETAEPTYVDDFKG (SEQ ID NO：11)、NVNYDGRSTYYLDSLKS (SEQ ID NO：12)、VIWTGGDTNFNSAFMS (SEQ ID NO：13)、或 LIHPNSGNTDCSETFKN (SEQ ID NO：14)、FTKVVADWHLDV (SEQ ID NO：15)、GGYGSNYVMDY (SEQ ID NO：16)、TRGYYDFDGGAFDY (SEQ ID NO：17)、GGLRQGDY (SEQ ID NO：18)、EGSQTPLYAVDY (SEQ ID NO：19)、VQYFGGSYGPMDY (SEQ ID NO：20)、DGASYDWFVH (SEQ ID NO：21)、RSSQNIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO：22)、KASEDIYNRLA (SEQ ID NO：23)、X6 ASQNVGTHLA (SEQ ID NO：24)、SATSSVSASYLY (SEQ ID NO：25)、KASQNVGTAVA (SEQ ID NO：26)、EASDHINDWLA (SEQ ID NO：27)、KSSQSLLYTNGKTYLN (SEQ ID NO：28)、KX7 SNRFS (SEQ ID NO：29)、GATSLET (SEQ ID NO：30)、SAX8 YRYI (SEQ ID NO：31)、STSNLAS (SEQ ID NO：32)、LASNRYT (SEQ ID NO：33)、LVSKLDS (SEQ ID NO：35)、FQGSHVPFT (SEQ ID NO：36)、QQYWNSPRT (SEQ ID NO：37)、QQYNTYPLT (SEQ ID NO：38)、HQWSSYPYT (SEQ ID NO：39)、QQYSIYPFT (SEQ ID NO：40)、QQYWNTPLT (SEQ ID NO：41)、VQGTHFPRT (SEQ ID NO：42)，其中，X1 為N或D，X2 為S或T，X3 為F或W，X4 為Q或D，X5 為D或G，X6 為K或R，X7 為V或I，X8 為S或I。在某些實施例中，本發明進一步包括對SEQ ID NO：1-42中之任一個序列具有不超過一個、兩個或三個胺基酸殘基取代之抗體及其抗原結合片段，其中，X1 為N或D，X2 為S或T，X3 為F或W，X4 為Q或D，X5 為D或G，X6 為K或R，X7 為V或I，X8 為S或I。
本發明所使用之抗體「001」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：59所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：73所示之序列。
本發明所使用之抗體「002」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：74所示之序列。
本發明所使用之抗體「022」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：62所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：76所示之序列。
本發明所使用之抗體「032」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：61所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：75所示之序列。
本發明所使用之抗體「035」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：63所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：77所示之序列。
本發明所使用之抗體「050」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：69所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：85所示之序列。
本發明所使用之抗體「055」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：70所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：86所示之序列。
本發明所使用之抗體「060」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：71所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：87所示之序列。
本發明所使用之抗體「074」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之單株抗體，其中上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：72所示之序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：88所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供抗SIRPα抗體及其抗原結合片段，其包括抗體001、002、022、032、035、050、055、060或074之一或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個或6個)CDR序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：1-7；上述HCDR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：8-14；上述HCDR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：15-21；上述LCDR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：22-28；上述LCDR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：29-33及35；上述LCDR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：36-42。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：48所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：56所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：9所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：23所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：37所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：50所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：53所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：11所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：18所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：25所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：32所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：39所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：6所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：13所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：20所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：41所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，及/或LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：7所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：14所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：21所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：35所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：42所示之序列。
以下表1中顯示了抗體001、002、022、032、035、050、055、060及074之CDR胺基酸序列。CDR邊界根據Kabat規則定義或鑑定。以下表2中顯示了抗體001、002、022、032、035、050、055、060及074之重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列。表 1 ： 9 個抗體之 CDR 胺基酸序列
抗體 CDR1 CDR2 CDR3
001 HCDR SEQ ID NO：1 RNYWMN SEQ ID NO：48 EISLKSNTYATHYAESVKG SEQ ID NO：15 FTKVVADWHLDV
LCDR SEQ ID NO：22 RSSQNIVHSNGNTYLE SEQ ID NO：55 KVSNRFS SEQ ID NO：36 FQGSHVPFT
002 HCDR SEQ ID NO：1 RNYWMN SEQ ID NO：49 EITLKSNTYATHYAESVKG SEQ ID NO：15 FTKVVADWHLDV
LCDR SEQ ID NO：22 RSSQNIVHSNGNTYLE SEQ ID NO：56 KISNRFS SEQ ID NO：36 FQGSHVPFT
032 HCDR SEQ ID NO：1 RNYWMN SEQ ID NO：49 EITLKSNTYATHYAESVKG SEQ ID NO：15 FTKVVADWHLDV
LCDR SEQ ID NO：22 RSSQNIVHSNGNTYLE SEQ ID NO：55 KVSNRFS SEQ ID NO：36 FQGSHVPFT
022 HCDR SEQ ID NO：2 TDYAMH SEQ ID NO：9 WKNTETGESTYAEDFKG SEQ ID NO：16 GGYGSNYVMDY
LCDR SEQ ID NO：23 KASEDIYNRLA SEQ ID NO：30 GATSLET SEQ ID NO：37 QQYWNSPRT
035 HCDR SEQ ID NO：43 TNYAMN SEQ ID NO：50 FINTYTGEPTYADDFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：53 KASQNVGTHLA SEQ ID NO：57 SASYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
050 HCDR SEQ ID NO：4 THYSMH SEQ ID NO：11 WINTETAEPTYVDDFKG SEQ ID NO：18 GGLRQGDY
LCDR SEQ ID NO：25 SATSSVSASYLY SEQ ID NO：32 STSNLAS SEQ ID NO：39 HQWSSYPYT
055 HCDR SEQ ID NO：5 SDYFMT SEQ ID NO：12 NVNYDGRSTYYLDSLKS SEQ ID NO：19 EGSQTPLYAVDY
LCDR SEQ ID NO：26 KASQNVGTAVA SEQ ID NO：33 LASNRYT SEQ ID NO：40 QQYSIYPFT
060 HCDR SEQ ID NO：6 TNYDIS SEQ ID NO：13 VIWTGGDTNFNSAFMS SEQ ID NO：20 VQYFGGSYGPMDY
LCDR SEQ ID NO：27 EASDHINDWLA SEQ ID NO：30 GATSLET SEQ ID NO：41 QQYWNTPLT
074 HCDR SEQ ID NO：7 SSYWIH SEQ ID NO：14 LIHPNSGNTDCSETFKN SEQ ID NO：21 DGASYDWFVH
LCDR SEQ ID NO：28 KSSQSLLYTNGKTYLN SEQ ID NO：35 LVSKLDS SEQ ID NO：42 VQGTHFPRT
表 2 ： 9 個抗體之可變區之胺基酸序列
抗體 VH VL
001 SEQ ID NO：59 EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFRNYWMNWVRQSPERGLEWIAEISLKSNTYATHYAESVKGRFAISRDGSKSSFYLQMNDLRAEDTGIYYCTTFTKVVADWHLDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO：73 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK
002 SEQ ID NO：60 EVKLEESGGGLVQPGGSMILSCVASGFTFRNYWMNWVRQSPERGLEWIAEITLKSNTYATHYAESVKGRFAISRDDSKSSFYLQMNDLRPEDTGIYYCTTFTKVVADWHLDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO：74 DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIQ
032 SEQ ID NO：61 EVRLEESGGGLVQPGGSMKLSCVVSGFTFRNYWMNWVRQSPERGLEWIAEITLKSNTYATHYAESVKGRFAISRDDSKSSFYLQMNDLRPEDTGIYYCTTFTKVVADWHLDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO：75 DVLMTQTPLSLPVNLGDQASISCRSSQNIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK
022 SEQ ID NO：62 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYAMHWVKQAPGKGLKWMGWKNTETGESTYAEDFKGRFAFFLETSASTAYLQINNVKNEDTATYFCARGGYGSNYVMDYWGQGTSVIVSS SEQ ID NO：76 DIQMTQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWNSPRTFGGGTKLEIK
035 SEQ ID NO：63 QIQLVQSGPELRKPGETVKISCKASGYSFTNYAMNWVKQAPGKVLKWMGFINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRTRGYYDFDGGAFDYWGQGTSLTVSS SEQ ID NO：77 DIVMTQSQKFMSTSIGDRVSVTCKASQNVGTHLAWYQQKPGQSPKALIFSASYRYIGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLAEYFCQQYNTYPLTFGAGTKLELK
050 SEQ ID NO：69 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTHYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETAEPTYVDDFKGRFAFSLEASASTAFFQINNLKNEDTATYFCARGGLRQGDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO：85 QIVLTQSPPIMSASPGEKVTLTCSATSSVSASYLYWFQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISNMEPADAASYFCHQWSSYPYTFGGGTKLEIK
055 SEQ ID NO：70 EVKLVESEGGLVQPGDSMKLSCTASGFTFSDYFMTWIRQVPEKGLEWIANVNYDGRSTYYLDSLKSRFIISRDNANNILYLQMSSLKSEDTATYYCAREGSQTPLYAVDYWGQGTSVTVSS SEQ ID NO：86 DIVMTQSQKFMSTTVGDRVNITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYLASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTVSDMRSEDLADYFCQQYSIYPFTFGSGTKLEIK
060 SEQ ID NO：71 QVQLKESGPGLVAPSESLSITCTVSGFSLTNYDISWIRQSPGKGLEWLGVIWTGGDTNFNSAFMSRLSISKDKSKSQVFLKLNSLQTDDTAIYYCVRVQYFGGSYGPMDYWGQGISVTVSS SEQ ID NO：87 DIQMTQASSYLSVSLGGRVTITCEASDHINDWLAWYQQTPGNAPRLLISGATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDIATYYCQQYWNTPLTFGAGTRLELK
074 SEQ ID NO：72 QVQLQQPRAELVKPGASVMLSCKASGYTFSSYWIHWVRQGPGQGLEWIGLIHPNSGNTDCSETFKNKATLTVDTSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARDGASYDWFVHWGQGTLVTVSA SEQ ID NO：88 DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYTNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGTHFPRTFGGGTKLEIK
假設抗體001、002、022、032、035、050、055、060及074均可結合至SIRPα，且抗原結合特異性主要由CDR1、CDR2及CDR3區提供，抗體001、002、022、032、035、050、055、060及074之HCDR1、HCDR2及HCDR3序列以及LCDR1、LCDR2及LCDR3序列可經「混合且匹配」(即，來自不同抗體之CDR可經混合且匹配，但各抗體必須包含HCDR1、HCDR2及HCDR3以及LCDR1、LCDR2及LCDR3)，以產生本發明之抗SIRPα結合分子。可使用上文及實例中所述之結合測定法來測試此類「混合且匹配」抗體之SIRPα結合。較佳地，當VH CDR序列經混合且匹配時，來自特定VH序列之HCDR1、HCDR2及/或HCDR3序列經結構相似的CDR序列取代。同樣，當VL CDR序列經混合且匹配時，來自特定VL序列之LCDR1、LCDR2及/或LCDR3序列較佳經結構相似的CDR序列取代。例如，抗體001及035之HCDR1具有一些結構相似性，因此易於混合且匹配。對於熟習此項技術者顯而易見的是，可藉由將一或多個VH及/或VL CDR區序列用本發明揭示之單株抗體001、002、022、032、035、050、055、060及074之CDR序列中結構相似的序列替換來產生新的VH及VL序列。
已知CDR負責抗原結合。然而，已發現並非所有6個CDR均為必不可少的或不可改變的。換言之，可替換或改變或修飾抗SIRPα抗體001、002、022、032、035、050、055、060及074中之一或多個CDR，但基本上保留與SIRPα之特異性結合親和性。
在某些實施例中，本發明所述之抗體及其抗原結合片段包含適當的框架區(FR)序列，只要上述抗體及其抗原結合片段可與SIRPα特異性結合。上述表1中所示之CDR序列獲取自小鼠抗體，但可使用此項技術中熟知之合適方法(例如，重組技術)將其移植至任何合適物種(例如，小鼠、人、大鼠、兔以及其他)之任何合適的FR序列。
在某些實施例中，本發明所述之抗體及其抗原結合片段為人源化的。預期人源化抗體或抗原結合片段在人體具有降低的免疫原性。人源化抗體或其抗原結合片段在其可變區係嵌合的，因為非人CDR序列被移植至人或基本上為人的FR序列中。抗體或抗原結合片段之人源化基本上可藉由在人類免疫球蛋白基因上用非人(例如，小鼠)CDR基因替換對應的人CDR基因來完成(參見，例如Jones等人 (1986)Nature 321:522-525; Riechmann等人 (1988)Nature 332:323-327; Verhoeyen等人 (1988)Science 239:1534-1536)。
可使用此項技術中熟知之方法選擇合適的人重鏈及輕鏈可變域，以達到此目的。在一個例示性實例中，可使用「最佳擬合(best-fit)」之方法，其中對非人(例如，嚙齒動物)抗體可變域序列進行篩選，或將其與已知的人可變域序列之資料庫進行BLAST比對，且識別出最接近非人查詢序列之人序列，用作用於移植非人CDR序列之人框架(參見，例如Sims等人, (1993)J. Immunol. 151:2296; Chothia等人 (1987)J. Mot. Biol. 196:901)。或者，可將源自所有人抗體之共有序列之框架用於移植非人CDR(參見例如Carter等人 (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285; Presta等人 (1993)J. Immunol. ,151:2623)。
下表3顯示了針對抗體035之8種人源化抗體之CDR胺基酸序列，其被命名為hu035.01、hu035.02、hu035.03、hu035.09、hu035.10、hu035.13、hu035.14及hu035.17。CDR邊界係根據Kabat規則定義或鑑定。下表4顯示了8種人源化抗體hu035.01、hu035.02、hu035.03、hu035.09、hu035.10、hu035.13、hu035.14及hu035.17之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列。下表5顯示了8種人源化抗體hu035.01、hu035.02、hu035.03、hu035.09、hu035.10、hu035.13、hu035.14及hu035.17之FR胺基酸序列。表 3 ： 8 種人源化抗體之 CDR 胺基酸序列
抗體 CDR1 CDR2 CDR3
hu035.01 HCDR SEQ ID NO：43 TNYAMN SEQ ID NO：51 WINTYTGEPTYAQGFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：54 RASQNVGTHLA SEQ ID NO：57 SASYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
hu035.02 HCDR SEQ ID NO：45 TDYAMN SEQ ID NO：52 FINTYTGEPTYAQGFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：54 RASQNVGTHLA SEQ ID NO：57 SASYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
hu035.03 HCDR SEQ ID NO：45 TDYAMN SEQ ID NO：52 FINTYTGEPTYAQGFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：54 RASQNVGTHLA SEQ ID NO：57 SASYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
hu035.09 HCDR SEQ ID NO：45 TDYAMN SEQ ID NO：52 FINTYTGEPTYAQGFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：54 RASQNVGTHLA SEQ ID NO：58 SAIYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
hu035.10 HCDR SEQ ID NO：45 TDYAMN SEQ ID NO：52 FINTYTGEPTYAQGFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：54 RASQNVGTHLA SEQ ID NO：58 SAIYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
hu035.13 HCDR SEQ ID NO：43 TNYAMN SEQ ID NO：52 FINTYTGEPTYAQGFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：54 RASQNVGTHLA SEQ ID NO：58 SAIYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
hu035.14 HCDR SEQ ID NO：45 TDYAMN SEQ ID NO：52 FINTYTGEPTYAQGFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：54 RASQNVGTHLA SEQ ID NO：58 SAIYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
hu035.17 HCDR SEQ ID NO：45 TDYAMN SEQ ID NO：52 FINTYTGEPTYAQGFKG SEQ ID NO：17 TRGYYDFDGGAFDY
LCDR SEQ ID NO：54 RASQNVGTHLA SEQ ID NO：58 SAIYRYI SEQ ID NO：38 QQYNTYPLT
表 4 ： 8 種人源化抗體之可變區之胺基酸序列
抗體 VH VL
hu035.01 SEQ ID NO：64 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTRGYYDFDGGAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：78 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTHLAWFQQKPGKAPKSLIYSASYRYIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPLTFGQGTKLEIK
hu035.02 SEQ ID NO：65 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRARGYTLTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGFINTYTGEPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCARTRGYYDFDGGAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：79 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKSLIYSASYRYIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPLTFGQGTKLEIK
hu035.03 SEQ ID NO：65 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRARGYTLTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGFINTYTGEPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCARTRGYYDFDGGAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：80 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTHLAWYQQKPGKSPKALIFSASYRYIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPLTFGQGTKLEIK
hu035.09 SEQ ID NO：66 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRAGGYTLTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGFINTYTGEPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCARTRGYYDFDGGAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：81 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKSLIYSAIYRYIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPLTFGQGTKLEIK
hu035.10 SEQ ID NO：65 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRARGYTLTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGFINTYTGEPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCARTRGYYDFDGGAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：82 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTHLAWYQQKPGKSPKALIFSAIYRYIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQYNTYPLTFGQGTKLEIK
hu035.13 SEQ ID NO：67 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSITNYAMNWVRQAPGQGLEWMGFINTYTGEPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTRGYYDFDGGAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：83 DIQMTQSPSRLGASVGDRVTITCRASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKSLIYSAIYRYIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNTYPLTFDQGTKLEIKR
hu035.14 SEQ ID NO：68 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSITDYAMNWVRQAPGQGLEWMGFINTYTGEPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARTRGYYDFDGGAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：82 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTHLAWYQQKPGKSPKALIFSAIYRYIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQYNTYPLTFGQGTKLEIK
hu035.17 SEQ ID NO：65 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRARGYTLTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGFINTYTGEPTYAQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCARTRGYYDFDGGAFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：84 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVGTHLAWYQQKPGKAPKSLIYSAIYRYIGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYNTYPLTFDQGTKLEIKR
表 5 ： 8 種人源化抗體之 FR 胺基酸序列
抗體 FR1 FR2 FR3 FR4
hu035.01 HFR SEQ ID NO：44 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID NO：93 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：95 RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO：97 WGQGTLVTVSS
LFR SEQ ID NO：98 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SEQ ID NO：103 WFQQKPGKAPKSLIY SEQ ID NO：105 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC SEQ ID NO：109 FGQGTKLEIK
hu035.02 HFR SEQ ID NO：90 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRARGYTL SEQ ID NO：93 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：94 RFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO：97 WGQGTLVTVSS
LFR SEQ ID NO：98 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SEQ ID NO：101 WYQQKPGKAPKSLIY SEQ ID NO：105 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC SEQ ID NO：109 FGQGTKLEIK
hu035.03 HFR SEQ ID NO：90 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRARGYTL SEQ ID NO：93 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：94 RFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO：97 WGQGTLVTVSS
LFR SEQ ID NO：98 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SEQ ID NO：102 WYQQKPGKSPKALIF SEQ ID NO：105 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC SEQ ID NO：109 FGQGTKLEIK
hu035.09 HFR SEQ ID NO：89 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRAGGYTL SEQ ID NO：93 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：94 RFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO：97 WGQGTLVTVSS
LFR SEQ ID NO：98 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SEQ ID NO：101 WYQQKPGKAPKSLIY SEQ ID NO：105 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC SEQ ID NO：109 FGQGTKLEIK
hu035.10 HFR SEQ ID NO：90 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRARGYTL SEQ ID NO：93 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：94 RFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO：97 WGQGTLVTVSS
LFR SEQ ID NO：98 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SEQ ID NO：102 WYQQKPGKSPKALIF SEQ ID NO：106 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYC SEQ ID NO：109 FGQGTKLEIK
hu035.13 HFR SEQ ID NO：91 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSI SEQ ID NO：93 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：95 RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO：97 WGQGTLVTVSS
LFR SEQ ID NO：99 DIQMTQSPSRLGASVGDRVTITC SEQ ID NO：101 WYQQKPGKAPKSLIY SEQ ID NO：107 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFC SEQ ID NO：46 FDQGTKLEIKR
hu035.14 HFR SEQ ID NO：91 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSI SEQ ID NO：93 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：95 RFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO：97 WGQGTLVTVSS
LFR SEQ ID NO：98 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SEQ ID NO：102 WYQQKPGKSPKALIF SEQ ID NO：106 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISNLQPEDFATYYC SEQ ID NO：109 FGQGTKLEIK
hu035.17 HFR SEQ ID NO：90 QIQLVQSGSELKKPGASVKVSCRARGYTL SEQ ID NO：93 WVRQAPGQGLEWMG SEQ ID NO：94 RFVFSLDTSVSTAYLQIGSLKAEDTAVYYCAR SEQ ID NO：97 WGQGTLVTVSS
LFR SEQ ID NO：98 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC SEQ ID NO：101 WYQQKPGKAPKSLIY SEQ ID NO：107 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFC SEQ ID NO：46 FDQGTKLEIKR
在某些實施例中，本發明提供之人源化抗體或其抗原結合片段基本上由除了非人CDR序列以外的所有人之序列組成。在一些實施例中，可變區FR及恆定區(若存在)全部或基本上來自人類免疫球蛋白序列。人FR序列及人恆定區序列可源自不同的人類免疫球蛋白基因，例如，源自一種人抗體之FR序列及源自另一種人抗體之恆定區。在一些實施例中，人源化抗體或其抗原結合片段包含人重鏈HFR1-4及/或輕鏈LFR1-4。
在一些實施例中，源自人之FR區可包含與其所源自之人類免疫球蛋白相同的胺基酸序列。在一些實施例中，人FR之一或多個胺基酸殘基由來自親本非人抗體之對應殘基取代。此在某些實施例中係需要的，以使人源化抗體或其片段密切接近非人親本抗體結構，以最優化結合特徵(例如，增加結合親和性)。在某些實施例中，本發明所述之人源化抗體或其抗原結合片段包含在各個人FR序列中不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代，或在重鏈可變區或輕鏈可變區之所有FR序列中不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代。在一些實施例中，此胺基酸殘基之變化可能僅存在於重鏈FR區、僅存在於輕鏈FR區，或在兩條鏈上均存在。在某些實施例中，人FR序列之一或多個胺基酸經隨機突變以增加結合親和性。在某些實施例中，人FR序列之一或多個胺基酸經反向突變為親本非人抗體之相應胺基酸，以增加結合親和性。
在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗SIRPα抗體及其抗原結合片段，其包括重鏈HFR1、重鏈HFR2、重鏈HFR3及重鏈HFR4，其中上述重鏈HFR1包括序列QX9 QLVQSGSELKKPGASVKVSCX10 AX11 GYX12 X13 (SEQ ID NO：92)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR2包括序列WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO：93)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR3包括序列RFVFSLDTSVSTAYLQIX14 SLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO：96)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述重鏈HFR4包括序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：97)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X9 為I或V，X10 為R或K，X11 為G或R或S，X12 為T或S，X13 為L或I或F，X14 為G或S。
在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗SIRPα抗體及其抗原結合片段，其包括輕鏈LFR1、輕鏈LFR2、輕鏈LFR3及輕鏈LFR4，其中上述輕鏈LFR1包括序列DIQMTQSPSX15 LX16 ASVGDRVTITC (SEQ ID NO：100)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR2包括序列WX17 QQKPGKX18 PKX19 LIX20 (SEQ ID NO：104)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR3包括序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISX21 LQPEDFATYX22 C (SEQ ID NO：108)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，上述輕鏈LFR4包括序列FX23 QGTKLEIKX24 (SEQ ID NO：47)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列，其中X15 為S或R，X16 為S或G，X17 為Y或F，X18 為A或S，X19 為S或A，X20 為Y或F，X21 為S或N，X22 為Y或F，X23 為G或D，X24 為R或缺失。
在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗SIRPα抗體及其抗原結合片段，其包括重鏈HFR1、重鏈HFR2、重鏈HFR3、重鏈HFR4、輕鏈LFR1、輕鏈LFR2、輕鏈LFR3及輕鏈LFR4，其中上述重鏈HFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：44、89、90及91，上述重鏈HFR2包括如SEQ ID NO：93所示之序列，上述重鏈HFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：94及95，上述重鏈HFR4包括如SEQ ID NO：97所示之序列，上述輕鏈LFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：98及99，上述輕鏈LFR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：101、102及103，上述輕鏈LFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：105、106及107，且上述輕鏈LFR4包括選自下組之序列：SEQ ID NO：109及46。
在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗SIRPα抗體及其抗原結合片段，其包括包含在選自下組之重鏈可變區內之HFR1、HFR2、HFR3及/或HFR4序列：hu035.01-VH (SEQ ID NO：64)、hu035.02-VH/hu035.03-VH/hu035.10-VH/hu035.17-VH (SEQ ID NO：65)、hu035.09-VH (SEQ ID NO：66)、hu035.13-VH (SEQ ID NO：67)以及hu035.14-VH (SEQ ID NO：68)。
在某些實施例中，本發明亦提供人源化抗SIRPα抗體及其抗原結合片段，其包括包含在選自下組之輕鏈可變區內之LFR1、LFR2、LFR3及/或LFR4序列：hu035.01-VL (SEQ ID NO：78)、hu035.02-VL (SEQ ID NO：79)、hu035.03-VL (SEQ ID NO：80)、hu035.09-VL (SEQ ID NO：81)、hu035.10-VL/hu035.14-VL (SEQ ID NO：82)、hu035.13-VL (SEQ ID NO：83)以及hu035.17-VL (SEQ ID NO：84)。
在某些實施例中，本發明提供之人源化抗SIRPα抗體及其抗原結合片段包括重鏈可變區序列及/或輕鏈可變區序列，其中上述重鏈可變區序列包括選自下組之序列：SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67及SEQ ID NO：68；上述輕鏈可變區序列包括選自下組之序列：SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83及SEQ ID NO：84。
本發明亦提供例示性035之人源化抗體，包括： 1) 「hu035.01」，其包括如hu035.01-VH (SEQ ID NO：64)所示之重鏈可變區以及如hu035.01-VL (SEQ ID NO：78)所示之輕鏈可變區； 2) 「hu035.02」，其包括如hu035.02-VH (SEQ ID NO：65)所示之重鏈可變區以及如hu035.02-VL (SEQ ID NO：79)所示之輕鏈可變區； 3) 「hu035.03」，其包括如hu035.03-VH (SEQ ID NO：65)所示之重鏈可變區以及如hu035.03-VL (SEQ ID NO：80)所示之輕鏈可變區； 4) 「hu035.09」，其包括如hu035.09-VH (SEQ ID NO：66)所示之重鏈可變區以及如hu035.09-VL (SEQ ID NO：81)所示之輕鏈可變區； 5) 「hu035.10」，其包括如hu035.10-VH (SEQ ID NO：65)所示之重鏈可變區以及如hu035.10-VL (SEQ ID NO：82)所示之輕鏈可變區； 6) 「hu035.13」，其包括如hu035.13-VH (SEQ ID NO：67)所示之重鏈可變區以及如hu035.13-VL (SEQ ID NO：83)所示之輕鏈可變區； 7) 「hu035.14」，其包括如hu035.14-VH (SEQ ID NO：68)所示之重鏈可變區以及如hu035.14-VL (SEQ ID NO：82)所示之輕鏈可變區； 8) 「hu035.17」，其包括如hu035.17-VH (SEQ ID NO：65)所示之重鏈可變區以及如hu035.17-VL (SEQ ID NO：84)所示之輕鏈可變區。
此等例示性人源化抗SIRPα抗體保留了對SIRPα之特異性結合能力或親和性，且在該方面至少與親本小鼠抗體035相當或甚至更好。例如，實例5中提供了資料。
在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包括上述重鏈可變區之全部或一部分，及/或上述輕鏈可變區之全部或一部分。在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段為單域抗體，其由本發明所述之重鏈可變區之全部或一部分組成。關於單域抗體之更多資訊係此項技術中已知的(參見例如美國專利號6,248,516)。
在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段進一步包括免疫球蛋白(Ig)恆定區，其視情況進一步包含重鏈及/或輕鏈恆定區。在某些實施例中，重鏈恆定區包含CH1、鉸鏈及/或CH2-CH3區(或視情況選用之CH2-CH3-CH4區)。在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包括人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之重鏈恆定區。在某些實施例中，輕鏈恆定區包含Cκ或Cλ。本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段可與野生型恆定區序列相同或在一或多個突變點上不同。
在某些實施例中，上述重鏈恆定區包括Fc區。已知Fc區介導效應功能，例如抗體之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)。不同Ig同種型之Fc區誘導效應功能之能力不同。例如，已認識到IgG1及IgG3之Fc區比IgG2及IgG4之Fc區更有效地誘導ADCC及CDC。在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包括IgG1或IgG3同種型之Fc區，其可誘導ADCC或CDC；或包括IgG4或IgG2同種型之恆定區，其具有降低的或耗竭的效應功能。在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包括野生型人類IgG4之Fc區或其他野生型人類IgG4對偶基因。在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包括人類IgG4之Fc區，上述Fc區包括S228P突變。在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包括人類IgG4之Fc區，上述Fc區包括L235E突變。
在某些實施例中，本發明所述之抗體或其片段具有足以用於診斷及/或治療用途的與人類SIRPα特異結合之親和性。
本發明所述之抗體或其片段可為單株抗體、多株抗體、人源化抗體、嵌合抗體、重組抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、標記抗體、二價抗體、抗獨特型抗體或融合蛋白。重組抗體係在體外使用重組方法(而非在動物體內)製備之抗體。
在某些實施例中，本發明提供抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其與根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段競爭結合人類SIRPα。在某些實施例中，本發明提供抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示之序列。在某些實施例中，本發明提供抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：88所示之序列。在某些實施例中，本發明提供抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示之序列，或與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如上述SEQ ID NO：85所示之序列。在某些實施例中，本發明提供抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示之序列。
在某些實施例中，本發明提供抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其與選自下組之抗體競爭結合人類SIRPα：a) 包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：59所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：73所示之序列；b) 包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：75所示之序列；c) 包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：74所示之序列；d) 包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體，其中上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：63所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示之序列，且其中上述抗體或其抗原結合片段並非KWAR23、HEFLB、29-AM4-5、ALX H21及3F9-22中之任一者。
本發明所使用之「KWAR23」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：111所示之胺基酸序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：114所示之胺基酸序列。
本發明所使用之「HEFLB」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：112所示之胺基酸序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列。
本發明所使用之「29-AM4-5」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：110所示之胺基酸序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：113所示之胺基酸序列。
本發明所使用之「ALX H21」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：115所示之胺基酸序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：117所示之胺基酸序列。
本發明所使用之「3F9-22」係指包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合片段，上述重鏈可變區具有如SEQ ID NO：116所示之胺基酸序列，上述輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：118所示之胺基酸序列。抗體 變體
本發明提供之抗體及其抗原結合片段亦包含本發明提供之抗體序列之多種變體。
在某些實施例中，抗體變體在以上表1及表3所示之一或多個CDR序列中、以上表2及表4所示之本發明所述之重鏈可變區或輕鏈可變區序列之一或多個非CDR序列中、及/或恆定區(例如，Fc區)中包含一或多個修飾或取代。此等抗體變體保持其親本與SIRPα特異結合之親和性，但具有一或多種上述修飾或取代帶來的所需特性。例如上述抗體變體可具有改善的抗原結合親和性、改善的糖基化模式、降低的糖基化風險、減少的脫胺基作用、減少的或耗竭的效應功能、改善的FcRn受體結合、提高的藥代動力學半衰期、pH敏感性，及/或對綴合之相容性(例如一或多個引入之半胱胺酸殘基)。
可使用此項技術中熟知之方法，例如「丙胺酸掃描誘變」，篩選親本抗體序列以識別合適的或較佳的待修飾或取代之殘基(參見例如Cunningham及Wells, (1989) Science，244:1081-1085)。簡言之，可識別目標殘基(例如帶電的殘基，如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且由不帶電的或帶負電的胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)取代，產生經修飾之抗體，且針對目標特性對其進行篩選。若在一個特定胺基酸位置上之取代表現出了目標功能性改變，則該位置可被識別為潛在的用於修飾或取代之殘基。可藉由用另一種殘基(例如半胱胺酸殘基、帶正電荷的殘基等)取代來進一步評估上述潛在的殘基。親和性變體
抗體之親和性變體可在以上表1及表3所示之一或多個CDR序列、以上表5所示之一或多個FR序列，或以上表2及表4所示之重鏈或輕鏈可變區序列中包含修飾或取代。熟習此項技術者基於以上表1及3中之CDR序列以及以上表2及4中之可變區序列可容易地確定FR序列，因為在此項技術中眾所周知，在可變區中，CDR區之兩側為兩個FR區。上述親和性變體保持親本抗體的與SIRPα特異性結合之親和性，或甚至相對於親本抗體具有改進的與SIRPα特異性結合之親和性。在某些實施例中，CDR序列、FR序列或可變區序列中之至少一者(或全部)取代包含保守取代。
熟習此項技術者將理解，在以上表1及表3所提供之CDR序列、在以上表2及表4提供之可變區序列中，一或多個胺基酸殘基可經取代，而得到的抗體或抗原結合片段仍然保持與SIRPα之結合親和性或結合能力，或甚至具有改進的結合親和性或能力。可使用此項技術中熟知之各種方法來達到此目的。例如，可生成抗體變體庫(例如，Fab或scFv變體)，且用噬菌體展示技術表現，隨後針對與人類SIRPα結合之親和性對其進行篩選。又例如，可使用電腦軟體虛擬抗體與人類SIRPα之結合，且識別抗體上形成結合界面之胺基酸殘基。在取代中可避開此等殘基以防止結合親和性降低，或可作為取代之目標以獲得更強結合。
在某些實施例中，本發明所述之人源化抗體或其抗原結合片段在一或多個CDR序列中及/或一或多個FR序列中包含一或多個胺基酸殘基取代。在某些實施例中，親和性變體在CDR序列及/或FR序列中包含總共不超過20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代。
在某些實施例中，上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包含1、2或3個CDR序列，上述CDR序列與以上表1及表3中列出之序列具有至少80%(例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性，而同時保持相對於其親本抗體水準相似或更高的與SIRPα特異之結合親和性。
在某些實施例中，上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包含一或多個可變區序列，上述可變區序列與以上表2及表4中列出之序列具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性，而同時保持相對於其親本抗體水準相似或更高的與SIRPα特異之結合親和性。在一些實施例中，在以上表2及表4列出之可變區之序列中，總共有1至10個胺基酸經取代、插入或缺失。在一些實施例中，上述取代、插入或缺失發生在CDR之外的區域(例如，在FR)。糖基化 變體
本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段亦包含糖基化變體，可獲取該糖基化變體以提高或降低抗體或其抗原結合片段之糖基化程度。
上述抗體或其抗原結合片段可包括一或多個引入或移除糖基化位點之修飾。糖基化位點為一種帶有側鏈之胺基酸殘基，碳水化合物部分(例如，寡糖結構)可附接至上述側鏈。抗體之糖基化通常為N連接的或O連接的。N連接的係指碳水化合物部分附接至天冬胺酸殘基之側鏈，例如，三肽序列中之天冬胺酸殘基，如天冬胺酸-X-絲胺酸及天冬胺酸-X-蘇胺酸，其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸。O連接的糖基化係指N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一的糖附接至羥基胺基酸，最常見的是附接至絲胺酸或蘇胺酸。可方便地移除天然糖基化位點，例如藉由改變胺基酸序列，使得存在於該序列中之上述三肽序列(對於N連接的糖基化位點)或絲胺酸或蘇胺酸殘基(對於O連接的糖基化位點)中之一者經取代。用相似的方式，可藉由引入此類三肽序列或絲胺酸或蘇胺酸殘基，產生新的糖基化位點。
在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗體及抗原結合片段在N297(例如N297A、N297Q或N297G)處包含一個突變以移除糖基化位點。半胱胺酸 工程化之變體
本發明所述之抗SIRPα抗體及抗原結合片段亦包括半胱胺酸工程化之變體，其包括一或多個引入之游離半胱胺酸胺基酸殘基。
游離半胱胺酸殘基為並非二硫鍵之一部分的半胱胺酸殘基。半胱胺酸工程化變體可用於藉由例如順丁烯二醯亞胺或鹵乙醯基，在工程化之半胱胺酸的位點與例如細胞毒性化合物及/或成像化合物、標籤或放射性同位素以及其他物質綴合。用於改造抗體或其抗原結合片段以引入游離半胱胺酸殘基之方法為此項技術中熟知的，參見例如WO2006/034488。Fc 變體
本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段亦包括Fc變體，其包括在Fc區及/或鉸鏈區之一或多個胺基酸殘基修飾或取代，例如，以提供改變的效應功能，例如ADCC及CDC。藉由抗體工程化改變ADCC活性之方法已經描述於先前技術中，參見，例如Shields RL.等人,J Biol Chem. 2001. 276(9): 6591-604; Idusogie EE.等人,J Immunol. 2000.164(8):4178-84; Steurer W.等人,J Immunol . 1995, 155(3): 1165- 74; Idusogie EE.等人,J Immunol . 2001, 166(4): 2571-5; Lazar GA.等人,PNAS , 2006, 103(11): 4005-4010; Ryan MC.等人,Mol. Cancer Ther. , 2007, 6: 3009-3018; Richards JO,.等人,Mol Cancer Ther. 2008, 7(8): 2517-27; Shields R. L.等人,J. Biol. Chem , 2002, 277: 26733-26740; Shinkawa T.等人,J. Biol. Chem , 2003, 278: 3466-3473。
本發明提供之抗體或抗原結合片段之CDC活性亦可例如藉由改善或減少C1q結合及/或CDC而改變(參見，例如WO99/51642；Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；美國專利號5648260；美國專利號5624821；及關於Fc區變體之其他實例之WO94/29351)。可將選自Fc區之胺基酸殘基329、331及322之一或多個胺基酸替換為不同胺基酸殘基，以改變C1q結合及/或減少或消除補體依賴性細胞毒性(CDC)(參見No. Idusogie等人之美國專利號6194551)。亦可引入一或多個胺基酸取代，以改變抗體固定補體之能力(參見Bodmer等人之PCT公開號WO 94/29351)。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段具有降低的效應功能，且在IgG1選自下組之位點中包含一或多個胺基酸取代：234、235、237及238、268、297、309、330及331。在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段為IgG1同種型，且包含一或多個選自下組之胺基酸取代：N297A、N297Q、N297G、L235E、L234A、L235A、L234F、L235E、P331S及其任何組合。在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段為IgG2同種型，且包含一或多個選自下組之胺基酸取代：H268Q、V309L、A330S、P331S、V234A、G237A、P238S、H268A及其任何組合(例如，H268Q/V309L/A330S/P331S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S)。在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段為IgG4同種型，且包含一或多個選自下組之胺基酸取代：N297A、N297Q、N297G、L235E、L234A、L235A及其任何組合。在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段為IgG2/IgG4交叉同種型。IgG2/IgG4交叉同種型之實例在Rother RP等人,Nat Biotechnol 25:1256-1264 (2007)中進行了描述。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及抗原結合片段為IgG4同種型，且在228及235之一或多個位點包含一或多個胺基酸取代。在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及抗原結合片段為IgG4同種型，且在Fc區具有S228P突變。在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體及抗原結合片段為IgG4同種型，且在Fc區具有L235E突變。
在某些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段包含一或多個胺基酸取代，上述胺基酸取代可改善與新生兒Fc受體(FcRn)之pH依賴性結合。此類變體可具有延長的藥代動力學半衰期，因為其在酸性pH下與FcRn結合，使其得以免於在溶酶體中降解，且隨後經轉移且釋放至細胞外。工程化抗體或其抗原結合片段以改善與FcRn之結合親和性之方法為此項技術中熟知的，參見，例如，Vaughn, D.等人,Structure , 6(1): 63-73, 1998; Kontermann, R.等人,Antibody Engineering , 第1卷, 第27章: Engineering of the Fc region for improved PK, published by Springer, 2010; Yeung, Y.等人,Cancer Research , 70: 3269-3277 (2010);及Hinton, P.等人,J. Immunology , 176:346-356 (2006)。
在某些實施例中，上述抗SIRPα抗體或抗原結合片段包含位於Fc區界面之一或多個胺基酸取代，以便於及/或促進異二聚體化。此等修飾包括將突起引入至第一Fc多肽，以及將空腔引入第二Fc多肽，其中上述突起可位於上述空腔內，以促進上述第一及第二Fc多肽之相互作用，以形成異二聚體或複合體。產生具有此等修飾之抗體之方法為此項技術中熟知的，例如，如美國專利號5731168所述。抗原結合片段
本發明亦提供了抗SIRPα抗原結合片段。抗原結合片段之多種類型為此項技術中熟知的，且可基於本發明所述之抗SIRPα抗體進行研發，包括例示性抗體，其CDR示於上述表1及表3中，其可變區序列示於上述表2及表4中，及其不同的變體(例如，親和力變體、糖基化變體、Fc變體、半胱胺酸工程化抗體等等)。
在某些實施例中，本發明所述之抗SIRPα抗原結合片段為雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fd、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2 、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、域抗體(domain antibody)及雙價域抗體。
多種技術可用於此抗原結合片段之生產。例示性方法包括對完整抗體進行酶消化(參見例如Morimoto等人,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); 以及Brennan等人,Science , 229:81 (1985))、由宿主細胞(如大腸桿菌)重組表現(例如對於Fab、Fv及ScFv抗體片段)、如上文討論之噬菌體展示庫篩選(例如對於ScFv)，以及化學耦合兩個Fab'-SH片段以形成F(ab')2 片段(Carter等人,Bio/Technology 10:163-167 (1992))。生產抗體片段之其他技術對於熟習此項技術者將為顯而易見的。
在某些實施例中，上述抗原結合片段為scFv。scFv之生成記述於例如WO 93/16185；美國專利號5571894；及5587458。scFv可在胺基末端或羧基末端與效應蛋白融合以獲得融合蛋白(參見例如Antibody Engineering，Borrebaeck編)。
在某些實施例中，本發明提供之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段為二價、四價、六價或多價的。任何大於二價的分子係視為多價的，包括例如三價、四價、六價等。
若兩個結合位點均能特異性結合相同抗原或相同抗原決定基，則二價分子可為單特異性的。在某種實施例中，此提供了比對應單價分子更強的與抗原或抗原決定基之結合。類似地，多價分子亦可為單特異性的。在某些實施例中，在二價或多價抗原結合部分中，結合位點之第一價及結合位點之第二價在結構上相同(即，具有相同序列)或在結構上不同(即，具有不同序列，但具有相同特異性)。
若兩個結合位點對不同抗原或抗原決定基具有特異性，則二價亦可為雙特異性的。此亦適用於多價分子。例如，當兩個結合位點對於第一抗原(或抗原決定基)而言為單特異性的，而第三結合位點對第二抗原(或抗原決定基)而言為特異性時，三價分子可為雙特異性的。雙特異性抗體
在某些實施例中，抗SIRPα抗體或其抗原結合片段為雙特異性的。在某些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段進一步與具有不同於上述SIRPα抗體或其抗原結合片段之結合特異性之第二功能部分連接。
在某些實施例中，本發明提供之雙特異性抗體或其抗原結合片段能夠特異性結合至除SIRPα以外的第二抗原或SIRPα上之第二抗原決定基。在某些實施例中，上述第二抗原選自下組：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279 (PD-1)、CD274 (PD-L1)、GPC-3、B7-H3、B7-H4、TROP2、CLDN18.2、EGFR、HER2、CD117、C-Met、PTHR2及HAVCR2 (TIM3)。綴合物
在一些實施例中，上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段亦包括一或多個綴合物部分。上述綴合物部分可連接至上述抗體或其抗原結合片段。綴合物部分為可附接至上述抗體或其抗原結合片段之部分。可設想，本發明所述之抗體或其抗原結合片段可與多種綴合物部分連接(參見例如「Conjugate Vaccines」, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse及R. E. Lewis, Jr. (編), Carger Press, New York, (1989))。此等綴合物部分可藉由共價結合、親和結合、嵌入、協同結合(coordinate binding)、錯合(complexation)、結合(association)、混合(blending)或加入(addition)等其他方式與上述抗體或其抗原結合片段連接。在某些實施例中，上述抗體或其抗原結合片段經連接子與一或多個綴合物連接。
在某些實施例中，本發明中提供之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段可經工程化以在抗原決定基結合部分之外含有特定位點，上述特定位點可用於與一或多個綴合物部分結合。例如，該位點可包括一或多個反應性的胺基酸殘基(例如半胱胺酸或組胺酸殘基)，以便於與綴合物部分之共價連接。
在某些實施例中，抗體或其抗原結合片段可間接地或藉由另一綴合物部分與綴合物部分連接。例如，本發明提供之抗體或其抗原結合片段可與生物素綴合，然後間接地與第二綴合物綴合，上述第二綴合物與抗生物素蛋白綴合。在某些實施例中，上述綴合物部分包括清除修飾劑(例如，延長半衰期之聚合物(例如PEG))、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、可偵測標記(例如，發光標記、螢光標記、酶受質標記)、DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑、純化部分或其他抗癌藥物。
「毒素」可為對細胞有害或可損害或殺死細胞之任何試劑。毒素之示例包括但不限於：紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊甙、長春新鹼、MMAE、MMAF、DM1、長春鹼、秋水仙鹼、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物(例如甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴嗪)、烷化劑(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C及二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類抗生素(例如柔紅黴素(以前的道諾黴素)及阿黴素)、抗生素(例如更生黴素(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素及胺茴黴素(AMC))、抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)、拓樸異構酶抑制劑及微管蛋白結合劑。
可偵測標記之實例可包括螢光標記(例如螢光素、若丹明、丹磺醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅)、酶-受質標記(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如123 I、124 I、125 I、131 I、35 S、3 H、111 In、112 In、14 C、64 Cu、67 Cu、86 Y、88 Y、90 Y、177 Lu、211 At、186 Re、188 Re、153 Sm、212 Bi及32 P、其他鑭系元素)、發光標記、發色團部分、地高辛、生物素/親和素、DNA分子或用於偵測之金。
在某些實施例中，綴合物部分可為清除修飾劑，其有助於增加抗體之半衰期。說明性實例包括水溶性聚合物(例如PEG、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇共聚物等)。該聚合物可具有任何分子量，且可為支鏈或非支鏈的。連接至抗體之聚合物之數量可變化，且若連接之聚合物多於一種，則其可為相同或不同分子。
在某些實施例中，綴合物部分可為純化部分，例如磁珠。
在某些實施例中，本發明提供之抗體或其抗原結合片段用作綴合物之基礎。多核苷酸及重組方法
本發明提供編碼上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段之分離的多核苷酸。本發明所用之術語「核酸」或「多核苷酸」係指單鏈或雙鏈形式之脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非另有說明，否則特定多核苷酸序列亦隱含地涵蓋其保守修飾之變體(例如簡併的密碼子取代)、對偶基因、直向同源物、SNP及互補序列以及明確指出的序列。具體而言，簡併的密碼子取代可藉由產生此類序列來實現：其中一或多個選定的(或全部)密碼子之第三位置經混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代(參見Batzer等人,Nucleic Acid Res . 19:5081 (1991); Ohtsuka等人,J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);及Rossolini等人,Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
使用傳統步驟，可容易地對編碼上述單株抗體之DNA進行分離及定序(例如藉由使用能夠與編碼上述抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合之寡核苷酸探針)。編碼DNA亦可藉由合成方法獲得。
使用此項技術中熟知之重組技術，可將編碼上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段之分離的多核苷酸插入載體，用於進一步選殖(DNA擴增)或用於表現。有多種載體可供選擇。載體組分通常包括但不限於下列中之一或多者：信號序列、複製起始點、一或多種標記基因、增強子元件、啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α)及轉錄終止序列。
本發明提供包括分離的多核苷酸之載體。在某些實施例中，本發明提供之多核苷酸編碼抗體或其抗原結合片段、與核酸序列可操作連接之至少一種啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α)及至少一種選擇標記。載體之實例包括但不限於：逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌體及M13噬菌體、質體pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
可將包含編碼上述抗體或其抗原結合片段之多核苷酸序列之載體引入宿主細胞，用於選殖或基因表現。適用於選殖或表現本發明中所述之載體中之DNA的宿主細胞為上述原核、酵母或高等真核細胞。適用於本發明用途之原核細胞包括真細菌，如革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌，例如，腸桿菌科(Enterobacteriaceae )，例如，埃希氏菌屬(Escherichia )(例如，大腸桿菌(E. coli ))、腸桿菌屬(Enterobacter )、歐文氏菌屬(Erwinia )、克雷白氏桿菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門氏菌屬(Salmonella )(例如，鼠傷寒沙門(氏)桿菌(Salmonella typhimurium ))、沙雷氏菌屬(Serratia )(例如，黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans ))、志賀氏菌屬(Shigella )、桿菌屬(Bacilli )(例如，枯草芽孢桿菌(B. subtilis )及地衣芽孢桿菌(B. licheniformis ))、假單胞菌屬(Pseudomonas )(例如，綠膿桿菌(P. aeruginosa )、以及鏈黴菌屬(Streptomyces )。
除了原核細胞以外，真核微生物如絲狀真菌或酵母亦可用作編碼抗SIRPα抗體之載體的合適純系或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )，或麵包酵母為最常用的低等真核宿主微生物。但是，許多其他屬、種及株均比較常用且在本發明中適用，例如，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；克魯維酵母屬(Kluyveromyces )宿主，例如，乳酸克魯維酵母(K. lactis )、脆壁克魯維酵母(K. fragilis )(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(K. bulgaricus )(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(K. wickeramii )(ATCC 24,178)、克魯雄酵母(K. waltii )(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K. drosophilarum )(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母(K. thermotolerans )及馬克斯克魯維酵母(K. marxianus )；解脂耶氏酵母(yarrowia )(EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris )(EP 183,070)；假絲酵母(Candida )；里氏木黴(Trichoderma reesia )(EP 244,234)；鏈孢黴(Neurospora crassa )；西方許旺酵母(Schwanniomyces )，例如，西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentali )；及絲狀真菌，例如，脈孢菌(Neurospora )、青黴菌(Penicillium )、彎頸黴(Tolypocladium )及曲黴菌(Aspergillus )(例如，鉤巢麴黴(A. nidulans )及黑麴黴(A. niger ))。
本發明中提供的適用於表現糖基化抗體或其抗原結合片段之宿主細胞由多細胞生物衍生得到。無脊椎細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已發現多種桿狀病毒株(baculoviral strains)及其變體以及對應的許可性昆蟲宿主細胞(permissive insect host cells)，來自於諸如以下之宿主：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)、埃及斑蚊(Aedes aegypti )(蚊子)、白紋伊蚊(Aedes albopictus )(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )(果蠅)及家蠶(Bombyx mori )。多種用於轉染之病毒株為公眾可得，例如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica NPV)之L-1變種，以及家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori NPV)之Bm-5變種，此等病毒均可在本發明中使用，特別是用於轉染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛花、番茄及菸草之植物細胞培養亦可用作宿主。
但是，最感興趣的為脊椎細胞，且脊椎細胞之培養(組織培養)已成為習知操作。可用的哺乳動物宿主細胞實例有，SV40轉化之猴腎細胞CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎腎細胞株(293或懸浮培養之293細胞次純系，Graham等人,J. Gen Virol. 36:59 (1977))；幼地鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；小鼠睾丸支持細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人子宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人,Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人肝癌細胞株(Hep G2)。在某些實施例中，上述宿主細胞為哺乳動物培養之細胞株，例如CHO、BHK、NS0、293及其衍生物。
用上述可產生抗SIRPα抗體之表現或選殖載體轉化宿主細胞，且將其在習知營養培養基中培養，上述營養培養基經修飾後適宜於誘導啟動子、選擇轉化細胞或擴增編碼目的序列之基因。在另一實施例中，上述抗體可藉由此項技術中熟知之同源重組方法製得。在某些實施例中，上述宿主細胞能夠產生本發明中之抗體或其抗原結合片段。
本發明亦提供一種表現本發明之抗體或其抗原結合片段之方法，包括在表現本發明所述之載體之條件下培養本發明提供之宿主細胞。本發明中用於產生上述抗體或其抗原結合片段之宿主細胞可在多種培養基中培養。市售之培養基如Ham's F10(Sigma)、最低基本培液(MEM，(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)，Sigma)可用於培養上述宿主細胞。另外，任何在Ham等人,Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等人,Anal. Biochem. 102:255 (1980)，美國專利號4767704；4657866；4927762；4560655；或5122469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美國專利號Re. 30985中描述之培養基均可用作上述宿主細胞之培養基。此等培養基均可添加必要的激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(如氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂及磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸及胸腺嘧啶)、抗生素(如慶大黴素)、微量元素(定義為終濃度通常在微莫耳範圍無機化合物)，及葡萄糖或與之等同的能量源。上述培養基亦可含有此項技術中熟知之適當濃度的任何其他必要添加劑。上述培養基之條件，如溫度、pH值等類似條件，為選擇用於表現之宿主細胞此前所使用之條件，為一般熟習此項技術者所熟知。
使用重組技術時，可在壁膜間隙細胞內產生抗體，或直接分泌進入基質。若在細胞內產生抗體，則第一步為移除顆粒碎片(宿主細胞或裂解的片段)，例如藉由離心或超濾。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167 (1992)描述了將分泌至大腸桿菌之壁膜間隙之抗體分離的方法。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲基磺醯氟(PMSF)存在下將細胞漿解凍30分鐘以上。可藉由離心移除細胞碎片。抗體分泌進入基質時，通常首先使用市售的蛋白濃縮過濾器，例如Amicon或Millipore Pellicon超濾裝置，將來自該表現系統之上清濃縮。任何前述步驟可包括蛋白酶抑制劑，如PMSF，以抑制蛋白水解，且可包括抗生素，以防止偶然污染物的生長。
自上述細胞中製得的抗SIRPα抗體或其抗原結合片段可採用純化方法進行純化，例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換層析管柱、硫酸銨沈澱、鹽析以及親和層析，其中親合層析為較佳純化技術。
在某些實施例中，固定於固相之蛋白A用於上述抗體及其抗原結合片段之免疫親和純化。上述抗體之種類以及上述抗體中存在任何免疫球蛋白之Fc域決定了蛋白A作為親和配位體是否適合。蛋白A可用於純化基於人γ1、γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等人, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白G適用於所有鼠源同種型及人γ3(Guss等人,EMBO J. 5:1567 1575 (1986))。瓊脂糖為最常用的親和配位體附著基質，但亦可選用其他基質。機械力穩定的基質如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯與用瓊脂糖相比可實現更快的流速及更短的處理時間。如該抗體含有CH3域，則可用Bakerbond ABXTM 樹脂進行純化(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)。亦可根據需要獲得的抗體確定其他蛋白純化技術，如離子交換管柱中之分餾、乙醇沈澱、反相HPLC、矽膠層析、基於陰離子或陽離子交換樹脂之肝素瓊脂糖凝膠層析(如聚天冬胺酸管柱)、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟之後，可用低pH疏水相互作用層析之方法處理包含目標抗體及雜質之混合物，用pH約2.5-4.5之洗滌緩衝液，較佳在低鹽濃度下進行(例如，約0至0.25M鹽濃度)。醫藥組合物
本發明進一步提供包含本發明所述之抗SIRPα抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物，及一或多個醫藥學上可接受之載劑。
用於本發明中揭示之醫藥組合物之醫藥學上可接受之載劑可包括，例如，醫藥學上可接受之液體、凝膠或固體載劑、水相溶媒、非水相溶媒、抗微生物物質、等滲物質、緩衝液、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、輔料或無毒輔助物質，其他此項技術中熟知之組分或以上之多種組合。
適用的組分可包括，例如，抗氧劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、攪味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑例如糖及環糊精。適用的抗氧劑可包括例如，甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱胺酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羥基甲苯及/或沒食子酸丙酯。如本發明所揭示，在包含本發明揭示之抗體或其抗原結合片段之組合物中包括一或多種抗氧劑如甲硫胺酸，可降低上述抗體或其抗原結合片段的氧化。對氧化作用的減少可防止或減少結合親和力的降低，從而提高抗體穩定性且延長保質期。因此，在某些實施例中，本發明提供之醫藥組合物中包含一或多種本發明所述之抗體或其抗原結合片段以及一或多種抗氧化劑例如甲硫胺酸。本發明進一步提供多種防止上述抗體或其抗原結合片段氧化、延長其保質期及/或提高其活性之方法，例如，藉由將本發明中提供之抗體或其抗原結合片段與一或多種抗氧劑(例如，甲硫胺酸)混合來實現。
進一步而言，醫藥學上可接受之載劑可包括例如水相介質如氯化鈉注射液、林格氏液注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、或葡萄糖及乳酸林格注射液、非水介質例如：植物來源的不揮發性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或花生油、細菌抑制或真菌抑制濃度下之抗菌物質、等滲劑如：氯化鈉或葡萄糖、緩衝液如：磷酸鹽或檸檬酸酸鹽緩衝液，抗氧化劑如：硫酸氫鈉，局部麻醉劑如：鹽酸普魯卡因，助懸劑及分散劑如：羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮，乳化劑如：聚山梨醇酯80(Tween-80)、螯合試劑如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇雙(2-胺基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。作為載劑之抗菌劑可加入多劑量容器中之醫藥組合物中，其包括酚類或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯代丁醇、甲基及丙基對羥基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷銨及氯苯乙銨。適用的輔料可包括，例如，水、鹽、葡萄糖、甘油或乙醇。適用的無毒輔助物質可包括例如濕潤劑、乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、增溶劑，或醋酸鈉、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或環糊精之類的物質。
上述醫藥組合物可為液體溶液、懸浮液、乳劑、丸劑、膠囊、片劑、持續釋放製劑或粉末。口服製劑可包括標準載劑如醫藥級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
在某些實施例中，上述醫藥組合物被製備成可注射組合物。可注射醫藥組合物可以任何習知形式製備，例如，液體溶劑、懸浮劑、乳化劑或適用於產生液體溶劑、懸浮劑或乳化劑之固體形式。注射製劑可包括現用的無菌及/或無熱原溶液、使用前現與溶劑結合之無菌乾燥的可溶物，如凍乾粉，包括皮下片、注射即用的無菌懸浮劑、使用前現與介質結合之無菌乾燥不溶產品，及無菌及/或無熱原乳劑。溶劑可為水相或非水相。
在某些實施例中，單位劑量之注射製劑包裝在一個安瓿、一支管或一支帶有針之針筒中。此項技術中習知，所有注射給藥之製劑應為無菌無熱原。
在某些實施例中，藉由將本發明中揭示之抗體或其抗原結合片段溶解於某適當的溶劑中可製備無菌凍乾粉末。上述溶劑可含有一種可提高粉末或由粉末製得之重組溶液之穩定性，或改善粉末或重組溶液之其他藥理組分。適用的輔料包括，但不限於，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適用的物質。溶劑可含有緩衝液，如檸檬酸緩衝液、磷酸鈉或磷酸鉀緩衝液或其他熟習此項技術者熟知之緩衝液，在一個實施例中，緩衝液之pH為中性。在此項技術中熟知之標準條件下進行對上述溶解進行隨後的過濾除菌，然後凍乾製得理想的製劑。在一種實施例中，將所得溶劑分裝至小管中凍乾。每支小管可容納單次劑量或多次劑量之上述抗SIRPα抗體或其抗原結合片段或其組合物。每支小管中之裝入量可略微高於每次劑量所需或多次劑量所需(例如10%過量)，從而保證取樣精確及給藥精確。凍乾粉可在適當條件下儲存，如在約4℃至室溫範圍。
用注射用水將凍乾粉重溶得到用於注射給藥之製劑。在一個實施例中，可將凍乾粉加至無菌無熱原水或其他適用的液體載劑中重溶。精確量由選擇之療法決定，可根據經驗值決定。套組
在某些實施例中，本發明提供了一種套組，其包含本發明提供之抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，本發明提供了一種套組，其包含本發明提供之抗體或其抗原結合片段及第二治療劑。在某些實施例中，第二治療劑選自化療劑、抗癌藥物、放療劑、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑、抗病毒劑、抗生素、鎮痛藥、抗氧化劑、金屬螯合劑及細胞因子。
若需要，此類套組可進一步包括各種習知藥物套組組分中之一或多者，例如具有一或多種醫藥學上可接受之載體的容器、另外的容器等，此對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。套組中亦可包括指示待投與之組分之量的說明書(作為插入物或標籤)、投與指南及/或混合組分之指南。使用方法
本發明亦提供了在個體中治療與SIRPα相關的疾病、病症或狀況之方法，其包括向上述個體投與治療有效量的根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物。在某些實施例中，上述個體為人類。
在一些實施例中，與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之特徵在於表現或過表現SIRPα及/或SIRPα簽名基因。
在某些實施例中，與SIRPα相關之疾病、病症或狀況包括但不限於癌症、實體瘤、慢性感染、炎性疾病、多發性硬化、自體免疫性疾病、神經系統疾病、腦損傷、神經損傷、紅細胞增多症、血色素沉著病、創傷、感染性休克、纖維化、動脈粥樣硬化、肥胖症、II型糖尿病、移植功能障礙或關節炎。
在某些實施例中，上述癌症為表現SIRPα之癌症。在某些實施例中，上述癌症為CD47陽性癌症。在某些實施例中，上述癌症選自下組：肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽囊癌、胃癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝膽管癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、腎盂及輸尿管癌、唾液腺癌、小腸癌、尿道癌、膀胱癌、頭頸癌、脊椎癌、腦癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、食道癌、胃腸道癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、陰道癌、甲狀腺癌、喉癌、膠質母細胞瘤、黑素瘤、骨髓增生異常症候群、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T或B細胞淋巴瘤、胃腸道間質瘤、軟組織腫瘤、肝細胞癌及腺癌。
在一些實施例中，上述癌症為CD47陽性癌症。在一些實施例中，待治療之個體已被鑑定為患有CD47陽性癌症。本發明中所用之「CD47陽性」癌症係指特徵在於在癌細胞中表現CD47蛋白或在癌細胞中表現CD47之水準顯著高於正常細胞所預期水準之癌症。在感興趣的生物學樣品中CD47之存在及/或含量可指示生物學樣品所源自之個體是否可能對抗SIRPα抗體作出反應。可使用多種方法來確定來自個體之測試生物樣品中CD47之存在及/或含量。例如，測試生物樣品可暴露於抗CD47抗體或其抗原結合片段，其結合至且偵測表現之CD47蛋白。或者，亦可使用諸如qPCR、逆轉錄酶PCR、微陣列、SAGE、FISH等方法在核酸表現水準上偵測CD47。在一些實施例中，測試樣品源自癌細胞或組織或腫瘤浸潤之免疫細胞。在某些實施例中，受試生物樣品中CD47之存在或上調水準表明有反應的可能性。如本發明所用，術語「上調」係指與使用相同方法偵測之參照樣品中之CD47表現量相比，測試樣品中之CD47表現量有不低於10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或更高的整體提高。參考樣品可為自健康或未患病個體獲得的對照樣品，或為自獲得測試樣品之同一個人獲得的健康或未患病樣品。例如，參考樣品可為與測試樣品(例如腫瘤)相鄰或附近的未患病樣品。
在另一態樣中，提供在將自SIRPα活性之調節中受益的個體中治療疾病、病症或狀況之方法，上述方法包含向有需要之個體投與如本發明所述之治療有效量的抗體或其抗原結合片段及/或醫藥組合物。在某些實施例中，上述疾病或狀況為與SIRPα相關之疾病、病症或狀況。
本發明所述之抗體或其抗原結合片段的治療有效劑量依賴於此項技術中熟知的多種因素，例如體重、年齡、過往病史、現用治療、對象之健康狀況及交叉感染的潛力、過敏、超敏及副作用，以及給藥途徑及腫瘤發展程度。熟習此項技術者(例如醫生或獸醫)可根據此等或其他條件或要求按比例降低或升高劑量。
在某些實施例中，如本發明所述之抗體或抗原結合片段可在治療有效劑量約0.01 mg/kg至約100 mg/kg之間給藥。在某些實施例中，給藥劑量可隨治療進程變化。例如，在某些實施例中，初始給藥劑量可比後續給藥劑量高。在某些實施例中，給藥劑量在治療進程中根據給藥對象的反應進行調整。
給藥方案可藉由調整達到最優反應(如治療反應)。例如，可進行單劑量給藥或在一段時間分多個分隔的劑量給藥。
本發明中揭示之抗體或其抗原結合片段可藉由此項技術中熟知的給藥方式給藥，例如腸胃外給藥(如，皮下注射、腹腔注射、靜脈注射，包括靜脈滴注，肌肉注射或皮內注射)或非腸胃外給藥途徑(如，口服給藥、鼻腔給藥、舌下給藥、直腸給藥或外用給藥)。
在一些實施例中，本發明中揭示之抗體或其抗原結合片段可單獨給藥或與治療有效量的第二治療劑聯合給藥。例如，本發明揭示之抗體或其抗原結合片段可與第二治療劑(例如，化療劑、抗癌藥、放療劑、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑、抗病毒劑、抗生素、鎮痛藥、抗氧化劑、金屬螯合劑或細胞因子)聯合給藥。
本發明使用之術語「免疫療法」係指刺激免疫系統對抗疾病(例如癌症)或以一般方式增強免疫系統的一種療法。免疫療法之實例包括但不限於檢查點調節劑、過繼性細胞轉移、細胞因子、溶瘤病毒及治療性疫苗。
「靶向療法」為一種作用於與癌症有關的特定分子之療法，例如存在於癌細胞中但不存在於正常細胞中或在癌細胞中更為豐富的特定蛋白質，或癌症微環境中有助於癌症生長及生存之目標分子。靶向療法將治療劑瞄準腫瘤，從而使正常組織免受治療劑的影響。
在某些此類實施例中，本發明揭示之抗體或其抗原結合片段與一或多種另外的治療劑聯用時，可與所述之一或多種另外的治療劑同時給藥，在某些此類實施例中，上述抗體或其抗原結合片段及上述另外的治療劑可作為相同醫藥組合物之一部分同時給藥。但是，與其他治療劑「聯用」之抗體或其抗原結合片段不需要同時給藥或與該治療劑在同一組合物中給藥。本發明中「聯用」之含義亦包括，在另一個治療劑之前或之後給藥的抗體或其抗原結合片段亦係視為與該治療劑「聯用」，即使上述抗體或其抗原結合片段與第二種物質藉由不同給藥方式給藥。在可能的情況下，與本發明中揭示之抗體或其抗原結合片段聯用的其他治療劑可參照該其他治療劑的產品說明書的方法用藥，或參照外科醫生的案頭參考書2003(Physicians' Desk Reference, 第57版; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 第57版 (2002年11月))，或參照其他此項技術中熟知的方法。
在另一態樣中，本發明進一步提供了調節SIRPα陽性細胞中SIRPα活性之方法，包括將SIRPα陽性細胞暴露於本發明提供之抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，SIRPα陽性細胞為吞噬細胞(例如，巨噬細胞)。
在另一態樣中，本發明提供了偵測樣品中SIRPα之存在或含量之方法，其包括將上述樣品與上述抗體或其抗原結合片段接觸，以及確定樣品中SIRPα之存在或含量。
在另一態樣中，本發明提供了一種在個體中診斷與SIRPα相關的疾病、病症或狀況之方法，其包括：a)將獲取自上述個體之樣品與本發明所述之抗體或其抗原結合片段接觸；b)確定在上述樣品中SIRPα之存在或含量；以及c)將SIRPα之存在或含量與上述與SIRPα相關的疾病、病症或狀況在個體中之存在情況或狀況相關聯。
在另一態樣中，本發明提供套組，上述套組包含本發明所述之抗體或其抗原結合片段，其視情況與可偵測部分綴合，可用於偵測與SIRPα相關的疾病、病症或狀況。上述套組可進一步包括使用說明書。
在另一態樣中，本發明亦提供本發明所述之抗體或其抗原結合片段在製備用於在個體中治療、預防或減輕與SIRPα相關的疾病、病症或狀況之藥物中之用途、在製備用於診斷與SIRPα相關的疾病、病症或狀況的診斷試劑中之用途。
在另一態樣中，本發明提供一種在個體中誘導吞噬作用之方法，包括以有效誘導吞噬作用之劑量向個體投與本發明提供之抗體或其抗原結合片段及/或本發明提供之醫藥組合物。例如，可投與本發明提供之抗體或其抗原結合片段以誘導表現CD47之癌細胞、炎性細胞及/或慢性感染細胞之吞噬作用。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體具有選自下組之疾病、病症或狀況：癌症、實體瘤、慢性感染、炎性疾病、多發性硬化、自體免疫性疾病、神經系統疾病、腦損傷、神經損傷、紅細胞增多症、血色素沉著病、創傷、感染性休克、纖維化、動脈粥樣硬化、肥胖症、II型糖尿病、移植功能障礙及關節炎。
在另一態樣中，本發明提供一種在體外誘導吞噬作用之方法，包括在根據本發明所述之抗體或其抗原結合片段及/或根據本發明所述之醫藥組合物存在下，將目標細胞與SIRPα陽性的吞噬細胞樣本接觸，從而藉由上述SIRPα陽性的吞噬細胞誘導上述目標細胞之吞噬作用。
以下實例旨在更好地說明本發明，且不應理解為限制本發明之範圍。所有下述的特定組合物、材料及方法，其整體或部分，均在本發明之範圍內。此等特定組合物、材料及方法並非為了限制本發明，而僅為說明特定實施例在本發明之範圍內。熟習此項技術者可不經過創造性勞動以及不偏離本發明範圍而開發出等同的組合物、材料及方法。應理解，在對本發明之方法作出的多種改動仍可包括在本發明範圍內。發明人意在將此類變動包括在本發明之範圍內。實例 實例 1. 試劑之產生 1.1 參考抗體之產生
將編碼抗SIRPα參考抗體29-AM4-5(參見US20140242095)、KWAR23(參見US20170073414A1)、HEFLB(參見WO2017178653A2)、ALX H21(參見US20180105600A1)或3F9-22(參見US20190359707A1)之可變區的DNA序列選殖至表現人類IgG恆定區之載體中。參考抗體29-AM4-5、KWAR23、HEFLB、ALX H21及3F9-22之可變區胺基酸序列如下表6所示。將表現質體轉染的Expi293細胞(Invitrogen)在37℃下培養一週。然後收集培養基且離心除去細胞沈澱。使用蛋白A親和層析管柱(Mabselect Sure，GE Healthcare)純化收穫之上清液。表 6. 五種參考抗體之可變區胺基酸序列
抗體 VH VL
29-AM4-5 SEQ ID NO：110 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNISYYFIHWVRQAPGKGLEWVASVYSSFGYTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARFTFPGLFDGFFGAYLGSLDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：113 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAVNWVGALVTFGQGTKVEIK
KWAR23 SEQ ID NO：111 EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVQQRTEQGLEWIGRIDPEDGETKYAPKFQDKATITADTSSNTAYLHLSSLTSEDTAVYYCARWGAYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：114 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAASYFCHQWSSYPRTFGAGTKLELK
HEFLB SEQ ID NO：112 EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKASGYSFTSYWVHWVRQMPGKGLEWMGNIDPSDSDTHYSPSFQGHVTLSVDKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCVRGGTGTLAYFAYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：34 DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVHSYGNTYLYWFQQRPGQSPRLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGTHVPYTFGGGTKVEIK
ALX H21 SEQ ID NO：115 EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSSNAMSWVRQAPGKGLEWVAGISAGGSDTYYPASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETWNHLFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：117 SYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGGSYSSYYYAWYQQKPGQAPVTLIYSDDKRPSNIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCGGYDQSSYTNPFGGGTKLTVL
3F9-22 SEQ ID NO：116 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVATISEYGGSYTYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPPYDDYYGGFQYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO：118 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKSVSSGGYSYMHWYQQKPGKAPKLLIYLASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSVQPEDFATYYCQHNRELPVTFGQGTKLEIK
1.2 人、食蟹猴、小鼠 SIRPα 穩定表現細胞株之建立
分別將編碼全長人SIRPα v1(NP_542970)、食蟹猴SIRPα(NP_001271679)或C57BL/6小鼠SIRPα(NP_031573)之DNA序列選殖至pIRES載體(Clontech)中。將用人SIRPα v1表現質體轉染之293F細胞(Invitrogen)在含有0.5 μg/ml嘌呤黴素之培養基中選擇培養2週。然後藉由有限稀釋分離穩定表現人SIRPα v1之單細胞純系，且使用抗人SIRPα抗體(Biolegend，323802)藉由FACS進行篩選。
以類似的方式，將用人SIRPα v1、食蟹猴SIRPα或C57BL/6小鼠SIRPα表現質體轉染之CHOK1細胞(Invitrogen)在含有6 μg/ml嘌呤黴素之培養基中選擇培養2週。然後藉由有限稀釋分離穩定表現人SIRPα v1、食蟹猴SIRPα或C57BL/6小鼠SIRPα之單細胞純系，且使用抗人SIRPα抗體(Biolegend，323802)或抗小鼠SIRPα抗體(Sino Biological，50956-R001)藉由FACS進行篩選。1.3 重組蛋白之產生
將編碼人CD47胞外區(NP_001768.1，M1-E141)、人SIRPα v1胞外區(NP_542970，M1-R370)、人SIRPα v2胞外區(CAA71403.1，M1-R369)、人SIRPβ胞外區(O00241，M1-L371)或人SIRPγ胞外區(Q9P1W8，M1-P360)之DNA序列選殖至表現人類IgG Fc區(hFc)之pCPC載體(Chempartner)中。將表現ECD蛋白之重組質體轉染的Expi293細胞(Invitrogen)在37℃下培養1週。然後收集培養基且離心除去細胞沈澱。使用蛋白A親和層析管柱(Mabselect Sure，GE Healthcare)純化收穫之上清液。
6xHis標記的人SIRPα v1 ECD及人SIRPα v8 ECD之重組蛋白購自Biointron。6xHis標記的人CD47 ECD、人SIRPα v2 ECD及C57BL/6小鼠SIRPα ECD之重組蛋白購自Novoprotein。實例 2. 抗體之產生 2.1 製備用於蛋白質免疫之免疫原
將Fc標記的人SIRPα v1 ECD重組蛋白用作蛋白質免疫之免疫原(參見實例1.3)。2.2 製備用於細胞免疫之免疫原
將穩定表現人SIRPα v1的293F細胞用作細胞免疫之免疫原(參見實例1.2)。2.3 製備用於基因免疫之免疫原
將編碼全長人SIRPα v1蛋白(NP_542970)之DNA序列選殖至pCP載體(Chempartner)中。然後將製備之質體包被於膠體金彈(Bio-Rad)上作為免疫原進行基因免疫。2.4 免疫
採取三種不同的免疫策略，使用人SIRPα v1 ECD重組蛋白進行蛋白質免疫、使用穩定表現人SIRPα v1之293F細胞進行細胞免疫以及使用包被人SIRPα v1表現質體之金彈進行基因免疫，對Balb/c及SJL/J小鼠(SLAC)進行免疫。用人SIRPα v1 ECD重組蛋白進行ELISA分析，且用穩定表現人SIRPα v1之293F細胞進行FACS分析，以偵測免疫小鼠之血清滴度。選擇具有高血清滴度之小鼠用於雜交瘤融合。2.5 雜交瘤之產生
最後一次加強之後的第5天，處死小鼠且收集脾細胞。將1% (v/v) NH4 OH添加至已裂解的紅細胞中。然後藉由高效電融合或PEG法將洗滌後的脾細胞與SP2/0小鼠骨髓瘤細胞(ATCC)進行融合。細胞融合後，將融合細胞以2×104 個細胞/孔之密度接種至96孔盤中，孔中有200 μl含20% FBS及1% HAT之DMEM培養基。2.6 雜交瘤之篩選
融合之後的第10-12天，藉由人SIRPα v1 ECD重組蛋白之ELISA測定法或具有穩定表現人SIRPα v1之293F細胞的Acumen測定法(TTP Labtech)初次篩選融合盤。將選自陽性孔之雜交瘤細胞擴增至24孔盤中進行第二次篩選。在第二次篩選中，藉由人SIRPα v1 ECD重組蛋白之ELISA測定法及穩定表現人SIRPα v1之293F細胞的FACS測定法評估結合活性。選擇具有最高結合活性之純系作為次純系。另外，在第二次雜交瘤鑑定中亦偵測了對人SIRPα v2/β/γ之特異性、物種交叉反應性、對CD47及SIRPα相互作用之阻斷活性、對CD47及SIRPβ相互作用之阻斷活性，來表徵雜交瘤(表徵測定方法參見實例3)。2.7 雜交瘤之次選殖
藉由有限稀釋法，將每個選擇之純系的雜交瘤細胞以1個細胞/孔之密度接種至96孔盤中。藉由與雜交瘤初次篩選相同的方式篩選接種盤(參見實例2.6)。挑選陽性單個純系且藉由與雜交瘤第二次篩選相同的方法進行表徵(參見實例2.6)。然後獲得具有最高結合活性之單株雜交瘤細胞株，用於進一步的雜交瘤抗體的產生、表徵及定序。
總共鑑定出9個抗體純系為功能性命中物，且將自此等純系純化之雜交瘤抗體分別命名為001、002、022、032、035、050、055、060及074。實例 3. 抗體表徵 3.1 雜交瘤抗體之產生及純化
培養約14天後，收集雜交瘤細胞培養基且離心除去細胞。經由0.22μm PES膜過濾且將pH調節至7.2後，將獲取之上清液上樣至蛋白A親和層析管柱(GE)。用0.1 M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.0)洗脫抗體，然後立即用Tris緩衝液(pH8.0)進行中和。用PBS緩衝液透析後，藉由Nano Drop (Thermo Fisher)測定抗體濃度。藉由SDS-PAGE及HPLC-SEC(Agilent)評估蛋白質之純度。用Endochrome-K套組(Charles River)偵測內毒素水準。3.2 單核細胞衍生之巨噬細胞吞噬試驗
藉由基於流動式細胞測量術之吞噬試驗評估純化的雜交瘤抗體之功能效能。簡而言之，將人單核細胞衍生之巨噬細胞與CellTrace Violet(Life Technologies)標記的表現CD47之Jurkat及Raji癌細胞在50nM/2nM抗SIRPα抗體存在下共培養。藉由確定對CellTrace Violet染料呈陽性之巨噬細胞百分比來分析吞噬作用。
如表7中所示，抗SIRPα雜交瘤抗體001、002、032、035、055、074、022、050及060在2nM之濃度下刺激巨噬細胞對Jurkat細胞及Raji細胞之強效吞噬作用，而其他已知的抗SIRPα抗體29-AM4-5、KWAR23及HEFLB則無作用或作用較弱。此9種抗體係視為功能性抗體。表 7. 抗 SIRPα雜交瘤抗體表徵總結
抗體 FACS ELISA (EC50，nM) 阻斷試驗 (IC50，nM) 血凝 吞噬作用 (MDM/目標細胞) 抗原決定基群
CHOK1-人SIRPα V1 (EC50，nM) CHOK1-食蟹猴SIRPα (10 nM MFI) CHOK1-C57BL/6 小鼠SIRPα (100 nM MFI) α VI α V2 β γ hSIRPα /CD47 hSIRPγ /CD47 Jurkat Raji
001 1.0 8030 - 0.07 0.07 0.12 - 1.4 - - + + I-a
002 1.0 7540 - 0.11 0.10 0.16 - 1.3 - - + + I-a
032 0.4 6864 - 0.03 0.04 0.02 - 0.2 - - + + I-a
035 0.7 8306 2370 0.03 0.04 0.02 2.22 4.9 - - + + I-b
29-AM4-5 13.6 37904 - 0.15 0.20 0.21 0.22 1.4 3.4 - - - I-a
KWAR23 2.8 12269 - 0.17 0.22 0.18 0.15 0.6 1.0 - 弱 - I-a
HEFLB 11.2 - - 0.17 - 0.17 13.4 0.5 43.2 - - - I-c
055 1.2 4672 - 0.04 0.04 - - - - - + + II
074 1.0 14256 - 0.02 0.02 0.02 - - - - + + III
022 2.1 6427 - 0.04 0.04 0.03 0.76 - - - + + IV
050 1.3 13555 - 0.08 0.08 0.11 0.38 - - - + + IV
060 0.9 - - 0.03 - 0.04 - ＞1000 - - + + V
減號表示無特定信號或無活性。MFI表示指定的FACS分析中之平均螢光強度。EC50或IC50為達到指定的EUSA或阻斷試驗中信號之50%的指定抗體濃度。加號表示在指定的吞噬試驗中，被測抗體單獨在2 nM濃度時能刺激巨噬細胞對腫瘤細胞吞噬作用(可自不同批次的實驗中偵測到此等值。)3.3 結合特異性偵測
使用Fc標記的人SIRPα v1 ECD、人SIRPα v2 ECD、人SIRPβ ECD及人SIRPγ ECD之重組蛋白藉由ELISA測定法偵測純化的雜交瘤抗體對SIRP家族成員之結合特異性。簡而言之，將抗體與ELISA微孔盤包被的抗原在37℃下培育1小時。洗滌後，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗小鼠或抗人類IgG 2nd 抗體(Sigma)，且在37℃下培育1小時。然後，加入100微升/孔的TMB溶液(Biotechnology)。在室溫下培育15分鐘後，藉由添加50μl的1N HCl終止反應。讀取OD 450 nm，且計算EC50 。表7總結了9種功能性抗體之結合特異性。除了060及HEFLB之外，所有偵測之抗體均可與人SIRPα v1及SIRPα v2結合。060及HEFLB可與人SIRPα v1結合，但不能與v2結合。除了055以外，所有偵測之抗體均可與人SIRPβ結合。與其他已知的抗SIRPα抗體相比，僅022、035及050可與人SIRPγ較弱地結合。3.4 物種交叉反應性偵測
用穩定表現SIRPα蛋白之CHOK1人SIRPα v1-1B4細胞、CHOK1-食蟹猴SIRPα-2A2細胞及CHOK1-C57BL/6小鼠SIRPα-2.22細胞，藉由流式細胞儀偵測純化的抗人、食蟹猴及小鼠SIRPα的雜交瘤抗體的物種交叉反應性。簡而言之，將抗體與2×105 個目標細胞在4℃下培育1小時。洗滌後，加入螢光標記的抗小鼠或抗人類IgG 2nd 抗體(Life Technologies)，且在4℃下培育1小時。偵測螢光強度的幾何中值且計算EC50 。表7總結了9種功能性抗體的物種交叉反應性。特別值得注意的是，與同一實驗中偵測的其他抗體相比，060無法與食蟹猴SIRPα結合，而035與C57BL/6小鼠SIRPα具有交叉反應性。3.5 對 CD47/SIRPα 、 CD47/SIRPγ 相互作用之阻斷活性偵測
採用競爭ELISA法確定純化的雜交瘤抗體是否能阻斷CD47與SIRPα之相互作用或CD47與SIRPγ之相互作用。簡而言之，為了偵測對CD47及SIRPα相互作用的阻斷活性，抗體及生物素標記的可溶性SIRPα v1 ECD重組蛋白與包被人CD47 ECD重組蛋白的ELISA微盤進行共培育。
為了偵測對CD47及SIRPγ相互作用的阻斷活性，抗體及生物素標記的可溶性人CD47 ECD重組蛋白與包被人SIRPγ ECD重組蛋白的ELISA微盤進行共培育。洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的鏈黴親和素(HRP-SA，Sigma)且在37℃下培養1小時。然後，加入100微升/孔之TMB溶液(Biotechnology)。在室溫下培育15分鐘後，藉由添加50μl之1N HCl終止反應。讀取OD 450nm。計算阻斷率及IC50 。表7總結了9種功能性抗體對CD47與SIRPα相互作用、CD47與SIRPγ相互作用之阻斷活性。與其他已知的抗SIRPα抗體相比，022、050、055及074不能阻斷CD47及SIRPα的相互作用。尤其，本發明之所有抗體均不能阻斷CD47及SIRPγ之相互作用。3.6 血凝活性
抗CD47抗體可能會促進紅細胞(RBC)之血凝，此可導致潛在的安全風險。偵測純化的雜交瘤抗體的血凝活性。簡而言之，人紅細胞在PBS中稀釋至10%，且在37℃下在100nM抗體中培育1小時。藉由存在未沈降的紅細胞來證明血凝，與未血凝的紅細胞的點狀紅點相比，未沈降的紅細胞呈霧狀。藉由定量在有抗體存在的情況下的紅細胞顆粒面積來測定血凝指數，且以無抗體存在時的面積為標準進行歸一化。如表7所示，所有9種功能性抗體均無血凝活性。3.7 抗原決定基分組 (Epitope Binning)
採用競爭ELISA法對9種功能性抗體進行抗原決定基分組。簡而言之，將過量的競爭抗體及生物素標記的可溶性人SIRPα v1 ECD重組蛋白與包被抗體的ELISA微盤共培育。洗滌後加入HRP-SA，37℃培育1小時。然後，添加100微升/孔之TMB溶液(Biotechnology)。在室溫下培育15分鐘後，藉由添加50μl的1N HCl終止反應。讀取OD 450nm。計算競爭率。能相互競爭結合SIRPα的抗體具有相似的結合抗原決定基。
如表8所示，9種抗SIRPα抗體屬於5個不同的抗原決定基群(Epitope group)。001、002、032及035與參考抗體29-AM4-5、KWAR23及HEFLB屬於同一大類，其均為CD47及SIRPα相互作用的阻斷劑。其他阻斷劑060及非阻斷劑055、074、022及050屬於其他四個不同的獨特抗原決定基群。
具體而言，抗SIRPα抗體001、002、032及參考抗體29-AM4-5、KWAR23相互競爭結合人SIRPα，此表明其可能與一個相同或密切相關的抗原決定基結合，該抗原決定基被歸為I-a，如表7所示。抗SIRPα抗體035亦與001、002及032相互競爭結合人SIRPα。然而，035不能被參考抗體29-AM4-5及KWAR23完全競爭，此表明035可能有一個稍微不同的抗原決定基，該抗原決定基被歸為I-b，如表7所示。參考抗體HEFLB及抗SIRPα抗體001、002、032、035之間的競爭並非雙向的。因此，HEFLB的結合抗原決定基被歸為I-c，如表7所示。I-a、I-b及I-c係視為一個密切相關的大群I。同樣，抗體022及050相互競爭結合人SIRPα，表明其可能與相同或密切相關的抗原決定基結合，該抗原決定基被歸為IV，如表7所示。抗體055、074及060與試驗中之任何其他抗體均未顯示與人SIRPα之競爭性結合，此表明其可能各自結合至一個不同的抗原決定基上，此等抗原決定基分別被歸為II、III及V，如表7所示。3.8 雜交瘤定序
使用SMARTer RACE 5'/3'套組(Clontech)將自單株雜交瘤細胞中分離出的RNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，用Mouse Ig-Primer Set (Novagen)的引子擴增出重鏈及輕鏈可變區。用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。收集大小正確的DNA片段，用NucleoSpin Gel及PCR Clear-up套組(MACHEREY-NAGEL)純化，然後用pMD18-T載體(Takara)連接。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞。篩選純系，且藉由DNA定序分析插入片段。實例 4. 嵌合抗體之產生與表徵 4.1 嵌合抗體之產生與生產
為了驗證雜交瘤定序結果，將小鼠抗體轉化為具有S228P突變之人類IgG4嵌合抗體。簡而言之，將編碼重鏈可變區之DNA序列選殖至攜帶人類IgG4重鏈恆定區之pcDNA3.4-hIgG4P載體(Biointron)中。將編碼輕鏈可變區之DNA序列選殖至攜帶人kappa輕鏈恆定區之pcDNA3.4-hIgGk載體(Biointron)中。所得嵌合抗體在本文中稱為001c、002c、022c、032c、035c、050c、055c、060c及074c，其中後綴「c」表示嵌合。 表8.抗SIRPα雜交瘤抗體抗原決定基分組總結
Figure 02_image001
共轉染抗體重鏈及輕鏈表現質體之Expi293細胞(Life Technologies)在37℃下增殖1週。然後收集培養基且離心移除細胞。將收集之上清液上樣至蛋白A親和層析管柱(Nanomicrotech)。用0.1 M檸檬酸鈉緩衝液(pH3.4)洗脫抗體，然後立即用Tris緩衝液(pH8.0)中和。用PBS緩衝液透析後，用Nano Drop(ThermoFisher)測定抗體濃度。用SDS-PAGE及HPLC-SEC(Agilent)評價蛋白質純度。用Endochrome-K套組(Charles River)偵測內毒素水準。4.2 嵌合抗體之表徵
純化的嵌合抗體用於結合特異性分析及物種交叉反應性分析(參見實例3.3及3.4描述之方法)。圖1A至1D顯示了抗SIRPα嵌合抗體對人SIRPα v1 ECD(A)、人SIRPα v2 ECD(B)、人SIRPβ ECD(C)及人SIRPγ ECD(D)重組蛋白之結合特異性。
所有9種測試之嵌合抗體均顯示了與人SIRPα v1 ECD結合的根據ELISA法測得的亞奈莫耳級的EC50 (圖1A，表9)。參考抗體29-AM4-5、KWAR23及HEFLB亦顯示出相似的結合親和力。
除了060c及HEFLB以外，所有其他嵌合抗體及參考抗體均顯示了與人SIRPα v2 ECD結合的根據ELISA法測得的亞奈莫耳級的EC50 (圖1B，表10)。
除了055c以外，所有其他嵌合抗體及參考抗體均顯示了與人SIRPβ ECD結合的根據ELISA法測得的亞奈莫耳級EC50 (圖1C，表11)。表 9
抗體 EC50 (nM)
29-AM4-5 0.11
KWAR23 0.10
HEFLB 0.11
001c 0.12
002c 0.06
022c 0.11
032c 0.12
035c 0.08
050c 0.11
055c 0.11
060c 0.08
074c 0.14
表 10
抗體 EC50 (nM)
29-AM4-5 0.08
KWAR23 0.09
HEFLB N/A
001c 0.09
002c 0.06
022c 0.11
032c 0.11
035c 0.08
050c 0.10
055c 0.11
060c N/A
074c 0.14
表 11
抗體 EC50 (nM)
29-AM4-5 0.08
KWAR23 0.08
HEFLB 0.08
001c 0.12
002c 0.11
022c 0.08
032c 0.12
035c 0.08
050c 0.08
055c N/A
060c 0.24
074c 0.11
如ELISA法所測，嵌合抗體001c、002c、032c、055c、060c、074c未顯示出與SIRPγ ECD的特異性結合(圖1D，表12)。如ELISA法所測，嵌合抗體022c、035c及050c與參考抗體29-AM4-5、KWAR23及HEFLB相似，均顯示出與人SIRPγ ECD之特異性結合(圖1D，表12)。表 12
抗體 EC50 (nM)
29-AM4-5 0.11
KWAR23 0.05
HEFLB 15.52
001c N/A
002c N/A
022c 18.73
032c N/A
035c 6.11
050c 0.27
055c N/A
060c N/A
074c N/A
圖2A至圖2C顯示了抗SIRPα嵌合抗體之物種交叉反應性。圖2A顯示了針對CHOK1-人SIRPα v1-1B4細胞的抗體之FACS結合曲線。圖2B及2C顯示了針對CHOK1-食蟹猴SIRPα-2A2細胞及CHOK1-C57BL/6小鼠SIRPα-2.22細胞之10 nM抗體的FACS結合。
如FACS法所測，偵測的所有9種嵌合抗體均顯示出了與CHOK1-人SIRPα v1-1B4細胞結合的亞奈莫耳級的EC50 (圖2A，表13)。參考抗體29-AM4-5、KWAR23及HEFLB亦顯示出相似的結合親和力。表 13
抗體 EC50 (nM)
29-AM4-5 13.6
KWAR23 2.8
HEFLB 11.2
001c 1.7
002c 2.4
022c 1.7
032c 3.0
035c 1.3
050c 2.4
055c 3.4
060c 2.8
074c 5.5
如圖2B所示，結果表明，除了060c以外，所有抗體(即001c、002c、022c、032c、035c、050c、055c及074c)均對食蟹猴SIRPα具有良好的交叉反應性。如圖2C所示，僅035c與C57BL/6株小鼠SIRPα有交叉反應性。
亦在吞噬試驗中偵測了純化的嵌合抗體(參考實例3.2描述的方法)。圖3A至3D顯示在指定的抗SIRPα抗體(具有S228P突變的人類IgG4嵌合抗體)存在下，人類巨噬細胞對Jurkat細胞、Raji細胞及DLD-1細胞之吞噬作用。
如圖3A至3D所示，當單獨使用時，9種嵌合抗體刺激巨噬細胞對Jurkat細胞(圖3A，3D)、Raji細胞(圖3B)及DLD-1細胞(圖3C)之劑量依賴性的強吞噬作用，而參考抗體29-AM4-5、KWAR23及HEFLB則無效果或有較弱效果。
吾人推測，抗SIRPα嵌合抗體可藉由與SIRPα IgV域結合來阻斷CD47及SIRPα之相互作用，SIRPα IgV域係SIRPα與CD47相互作用之關鍵區域。為了證明吾人之假設，吾人偵測了抗SIRPα嵌合抗體與B-hSIRPA小鼠(Biocytogen)衍生之原生單核細胞的FACS結合(圖4B)。
如圖4A所示，編碼與CD47相互作用的SIRPα IgV域的B-hSIRPA小鼠Sirpa 基因外顯子2經人源化。人源化小鼠表現嵌合SIRPα，包括人SIRPα的IgV域及IgC1/C2、小鼠SIRPα的跨膜域及胞內域。簡而言之，取B-hSIRPA小鼠的脾細胞，用抗SIRPα嵌合抗體在4℃下培育1小時。洗滌後，加入螢光標記的抗人類IgG 2nd 抗體(Life Technologies)，且在4℃下培育1小時。小鼠CD11b及F4/80亦經染色以顯示單核細胞。計算mCD11b及mF4/80雙陽性子集中的抗SIRPα陽性染色群體。
如圖4B所示，CD47及SIRPα相互作用的阻斷劑001c、002c、032c、035c及060c可與B-hSIRPA小鼠衍生的原生單核細胞結合，表明其與人SIRPα IgV域結合。然而，CD47及SIRPα相互作用的非阻斷劑022c、050c、055c及074c並非如此。
所有此等表徵資料與吾人自雜交瘤抗體中獲得的結果一致，表明獲得的可變區序列係正確的。表14總結了表徵資料。表 14. 抗 SIRPα嵌合抗體表徵總結
抗體 交叉反應性(FACS) 特異性(ELISA，EC50，nM) 吞噬作用(MDM/目標細胞) 親和力(KD，M) 結合 域 抗原決定基 群
chok1-A SIRPα v1 (EC50,nM) CHOK1-食蟹猴SIRPα (10 nMMFI) CHOK1-C57BL/6 小鼠SIRPα (10 nM MFl) hSIRPα VI hSIRPα V2 hSMPβ hSIRPγ Jurkat Raji DLD1 α V1 α V2 IgV
001c 1.7 24911 - 0.12 0.09 0.12 - +++ ++ ++ 1.14E-08 2.06e-08 是 l-a
002c 2.4 17074 - 0.06 0.06 0.11 - +++ ++ ++ 1.61E-08 2_83e-08 是 l-a
032c 3.0 18967 - 0.12 0.11 0.12 - +++ ++ ++ 8.92E-09 1.47e-08 是 l-a
035c 1.3 24634 13386 0.08 0.08 0.08 6.11 +++ +++ ++ 1.11E-09 2.62e-09 是 l-b
29-AM4-5 13.6 27642 - 0.11 0.08 0.08 0.11 - - - N/A N/A N/A l-a
KWAR23 2.8 12269 - 0.10 0.09 0,08 0.05 弱 - + 2.66E-09 1.47E-08 N/A l-a
HEFLB 11.2 - - 0.11 - 0.08 15.52 - - - N/A N/A N/A l-c
055c 3.4 8061 - 0.11 0.11 - - + + + 1.66E-08 2.85e-08 否 II
074c 5.5 12220 - 0.14 0.14 0.11 - ++ +++ ++ 4.40E-09 2.52e-08 否 III
022c 1.7 23451 - 0.11 0.11 0.08 18.73 ++ +++ ++ 5.90E-09 2.56e-08 否 IV
050c 2.4 20510 - 0.11 0.10 0.08 0.27 +++ +++ ++ 3.07E-09 4.72e-09 否 IV
060c 2.8 - - 0.08 - 0.24 - +++ ++ + 1.49E-09 - 是 V
N / A表示無可用資料。減號表示無特定信號或無活性。MFI表示指定的FACS測定中之平均螢光弧度。EC50係在指定的FACS或ELISA分析中達到50%信號時之抗體的濃度。 加號表示在上述吞噬實驗中，被測抗體單獨在10 nM濃度下刺激巨噬細胞對腫瘤細胞之吞噬作用。加號之數量用來表示相對活性水準(+++＞++＞+)。4.3 由表面電漿子共振 (SPR) 確定的結合親和力
使用Biacore(GE)表徵抗SIRPα嵌合抗體對人SIRPα v1、人SIRPα v2及C57BL/6小鼠SIRPα的結合親和力。簡而言之，使用Human Antibody Capture套組(GE)將待測抗體捕獲至CM5晶片(GE)中。將6xHis標記的人SIRPα v1、人SIRPα v2及C57BL/6小鼠SIRPα ECD重組蛋白的抗原連續稀釋多次劑量，且以30μl/min之速度注射180秒。保持緩衝液流解離400秒。用3M MgCl2 進行晶片再生。用1:1結合模型擬合結合曲線及解離曲線，計算各抗體之Ka/Kd/KD值。表15及表14總結了抗SIRPα嵌合抗體之親和力資料。實例 5. 抗體人源化與親和力成熟 5.1 人源化
在人抗體序列資料庫中檢索035抗體之重鏈及輕鏈可變區序列。根據與原始小鼠抗體序列之同源性，選擇VH7-4-1及VK1-16作為人源化模板。然後將小鼠抗體序列中之CDR與殘基一起移植至模板上，以保持抗體的上核及中心核結構。獲得的035人源化抗體命名為hu035.01，前綴「hu」表示「人源化」，後綴中之數字表示人源化抗體之序列號。表 15. 抗 SIRPα嵌合抗體親和力總結
抗體 抗原
hSIRPα V1 hSIRPα V2 mSIRPα (C57BL/6)
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD(M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD(M)
001c 7.49E+04 8.55E-04 1.14E-08 3.97E+04 8.16E-04 2.06E-08 - - -
002c 9.20E+04 1.48E-03 1.61E-08 5.16E+04 1.46E-03 2.83E-08 - - -
022c 1.25E+05 7.40E-04 5.90E-09 5.61E+04 1.44E-03 2.56E-08 - - -
032c 9.35E+04 8.34E-04 8.92E-09 5.26E+04 7.74E-04 1.47E-08 - - -
035c 1.83E+05 2.03E-04 1.11E-09 5.90E+04 1.54E-04 2.62E-09 4.69E+03 2.47E-02 5.27E-06
050c 2.52E+05 7.74E-04 3.07E-09 1.12E+05 5.29E-04 4.72E-09 - - -
055c 8.51E+04 1.41E-03 1.66E-08 4.83E+04 1.38E-03 2.85E-08 - - -
060c 9.44E+04 1.41E-04 1.49E-09 - - - - - -
074c 5.21E+04 2.29E-04 4.40E-09 2.04E+04 5.15E-04 2.52E-08 - - -
減號表示抗體與所指定的抗原無可偵測相互作用。5.2 人源化抗體的表徵
藉由使用CHOCK1-人SIRPα v1-1B4細胞之FACS分析、使用Fc標記的人SIRPα v2 ECD重組蛋白的ELISA分析及使用6xHis標記的人SIRPα v2 ECD重組蛋白的抗原的SPR分析來表徵hu035.01，其為人源化035之第一版(參考實例3.4、實例3.3及實例4.3中描述的方法)。與親本抗體035c相比，人源化hu035.01在FACS分析中顯示出與CHOK1-人SIRPα v1-1B4細胞之結合相對較弱(圖5A)，在ELISA分析中顯示出與人SIRPα v2 ECD重組蛋白之結合相對較弱(圖5B)。用人SIRPα v2 ECD重組蛋白抗原進行SPR分析，證實hu035.01(53.4nM)的結合親和力低於035c(0.61nM)(圖5C)。尤其，在ELISA試驗中無法偵測到hu035.01與C57BL/6小鼠SIRPα ECD結合，可能是由於結合活性降低(圖5B)。5.3 親和力成熟
由於結合親和力降低，藉由親和力成熟優化hu035.01。簡而言之，藉由隨機突變scFV單鏈抗體形式之重鏈及輕鏈，且篩選與人SIRPα及/或小鼠SIRPα更好的結合物，完成第一個CDR移植序列的親和力成熟。對最佳的結合物進行定序且選殖至哺乳動物表現載體中，在ExpiCHO細胞中表現且純化以用於進一步表徵。親和力成熟後獲得的人源化抗體被命名為hu035.02、hu035.03，直至hu035.17，其中前綴「hu」表示「人源化」，後綴中之數字表示人源化抗體之序列號。5.4 親和力成熟後的人源化抗體的表徵
最後選擇7個人源化成熟候選物(分別被命名為hu035.02、hu035.03、hu035.09、hu035.10、hu035.13、hu035.14及hu035.17)用於結合特異性分析及物種交叉反應性分析(參見實例3.3及3.4中描述之方法)。
在ELISA偵測試驗中，與親本抗體035c相比，優化後的hu035候選物對人SIRPα v1 ECD(圖6A)、人SIRPα v2 ECD(圖6B)、人SIRPα v8 ECD(圖6C)及人SIRPβ ECD(圖6D)的重組蛋白保持相當的結合能力。特別是在ELISA偵測試驗中，其對人SIRPγ ECD(圖6E)及C57BL/6小鼠SIRPα ECD(圖6F)的重組蛋白有不同程度的增強結合。表17計算且總結了EC50 值。
藉由FACS流式細胞儀分析，優化的hu035候選物亦可保持與人SIRPα(圖7A)、食蟹猴SIRPα(圖7B)及C57BL/6小鼠SIRPα(圖7C)相當的物種交叉反應性。與ELISA試驗獲得的資料一致，其在不同水準上均顯示了對CHOK1-C57BL/6小鼠SIRPα-2.22細胞之結合增強(圖7C)。表17計算且總結了EC50 值。
偵測了優化後的hu035候選物阻斷CD47及SIRPα相互作用之能力(圖8，參考實例3.5中描述的方法)。與親本抗體035c相比，優化後的hu035候選物hu035.02、hu035.03、hu035.09、hu035.10、hu035.13、hu035.14及hu035.17經證實維持相當的對CD47及SIRPα相互作用的阻斷活性。表17計算且總結了IC50 值。
藉由SPR分析進一步證實，與親本抗體035c相比，優化的hu035候選物hu035.02、hu035.03、hu035.09、hu035.10、hu035.13、hu035.14及hu035.17顯示出對人SIRPα對偶基因的相當的結合親和力，且對C57BL/6小鼠SIRPα的結合親和力有所提高(參見實例4.3中描述的方法)。表16及表17總結了動力學資料。表 16. 優化的 hu035 候選物之親和力動力學總結
抗體 抗原
hSIRPα V1 hSIRPα V2 mSIRPα (C57BL/6)
ka (1/Ms) kd (1/s) KD(M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD(M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
hu035.02 1.04E+05 1.70E-04 1.64E-09 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
hu035.03 5.92E+04 1.89E-04 3.20E-09 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
hu035.09 8.83E+04 1.91E-04 2.17E-09 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
hu035.10 6.21E+04 2.38E-04 3.82E-09 1.04E+05 1.70E-04 1.64E-09 4.50E+04 1.52E-03 3.38E-08
hu035.13 1.92E+05 1.17E-04 6.10E-10 5.92E+04 1.89E-04 3.20E-09 5.66E+04 2.59E-03 4.58E-08
hu035.14 8.92E+04 1.29E-04 1.44E-09 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
hu035.17 1.40E+05 1.20E-04 8.60E-10 8.83E+04 1.91E-04 2.17E-09 5.79E+04 1.50E-03 2.59E-08
035c 1.45E+05 2.74E-04 1.89E-09 6.21E+04 2.38E-04 3.82E-09 4.69E+03 2.47E-02 5.27E-06
N/A表示無可用資料。
亦在吞噬試驗中偵測了優化後的hu035候選物，以進行功能評估(參考實例3.2描述的方法)。如圖9所示，與親本抗體035c相比，優化後的hu035候選物hu035.02、hu035.03、hu035.09、hu035.10、hu035.13、hu035.14及hu035.17能夠刺激巨噬細胞對Jurkat細胞(圖9A)、DLD1細胞(圖9B)及Raji細胞(圖9C)產生更強的或相當的吞噬作用，而兩種已知的抗SIRPα抗體ALX H21及3F9-22則顯示無效果或效果較弱。
據報導，人類T細胞藉由SIRPγ-CD47相互作用與抗原呈遞細胞黏附共同刺激T細胞增殖。由於與親本抗體035c相比，此7種優化的hu035候選物顯示出對人SIRPγ的結合活性增強(圖6E)，以排除中斷干擾T細胞增殖的可能性，在T細胞活化試驗中對此等優化的hu035候選物以及一些嵌合抗體進行了偵測。簡而言之，用ImmunoCult™人CD3/CD28 T細胞激活劑(STEMCELL)或體外培養5天的同種異體成熟樹突細胞刺激CellTrace Violet(Life Technologies)標記的人原代T細胞4天。自測試開始便以飽和濃度(10ug/ml)添加指示的抗體。用低染度CellTrace Violet確定增殖種群。用人IFNγ套組(Cisbio)偵測IFNγ的分泌。
如圖10所示，當用CD3/CD28 T細胞激活劑刺激T細胞時，優化的hu035候選物hu035.02、hu035.03、hu035.09、hu035.10、hu035.14及hu035.17以及嵌合抗體035c、022c、032c、050c、055c、060c及074c對CD4+ T細胞增殖(圖10B、10D)、CD8+ T細胞增殖(圖10C、10D)無負面影響；當用CD3/CD28 T細胞激活劑刺激T細胞時，優化的hu035候選物hu035.02及hu035.17以及嵌合抗體022c、032c、035c、050c、055c，060c及074c對IFNγ的分泌無負面影響(圖10A)。類似地，當用同種異體樹突狀細胞刺激T細胞時，優化的hu035候選物hu035.02、hu035.17以及嵌合抗體035c、022c、032c、050c、055c、060c及074c對CD4+ T細胞增殖(圖11B)、CD8+ T細胞增殖(圖11C)以及IFNγ分泌(圖11A)無負面影響。如所預期的，抗SIRPγ抗體LSR2.20(Biolegend)為T細胞活化的抑制劑。
表17總結了所有表徵資料，以表明成功的人源化及親和力成熟。表 17. 優化的 hu035 候選物的表徵總結
抗體 交叉反應性(FACS) 特異性(ELISA, ECSO, nM) 吞噬作用 (MDM/Jurkat, 0.1μ g/ml 時吞噬指數，%) 親和力 (KD，M) hSIRPα/CD 47阻斷(IC50，nM)
CHOK1-人 SIRPα v1 (EC50，nM) CHOK1-食蟹猴 SIRPα (EC50，nM) CHOK1- C57BL/6 小鼠SIRPα (2μg/ml MFl) hSIRPα V1 hSIRPα V2 hSIRPα V8 hSIIPβ hSIRPγ hSIRPα V1 hSIRPα V2 小鼠 (C57B L/6)
hu035.02 0.97 0.29 549 0.16 0.16 0.23 0.20 6.24 16.76 1.64E-09 N/A N/A 1.74
hu035.03 1.46 0.30 626 0.13 0.11 0.23 0.17 6.78 16.25 3.20E-09 N/A N/A 1.43
hu035.09 1.45 0.36 950 013 0.19 0.21 0.23 1.05 17.67 2.17E-09 N/A N/A 1.36
hu035.10 1.44 0.33 1107 0.19 0.16 0.18 0.19 034 18.65 3.82E-09 2.15E-09 3.38E-08 1.49
hu035.13 1.03 0.26 876 0.14 0.17 0.16 0.18 0.67 18.64 6.10E-10 1.24E-09 4.58E-08 1.33
hu035.14 1.31 0.36 1046 0,15 0.16 0.28 0.23 0.52 18.0 1.44E-09 N/A N/A 1.46
hu035.17 1.15 0,24 1123 0,18 0.15 0.26 0.15 0.54 17.3 8.60E-10 1.43E-09 2.59E-08 1.22
035c 1.50 0.42 310 0.16 0.13 0.20 0.13 16.44 15.13 1.89E-09 1.39E-09 5.27E-06 1.03
N / A表示無可用資料。 MFI表示指定的FACS測定中的平均螢光強度。EC50或IC50為在指定的FACS、ELISA或阻斷實驗中達到50%信號時的抗體的濃度。
圖1顯示了抗SIRPα抗體(具有S228P突變之人類IgG4嵌合抗體)對人類SIRPα v1 ECD(圖1A)、人類SIRPα v2 ECD(圖1B)、人類SIRPβ ECD(圖1C)及人類SIPRγ ECD(圖1D)之重組蛋白之ELISA結合特異性。 圖2顯示了抗SIRPα抗體(具有S228P突變之人類IgG4嵌合抗體)針對CHOK1-人SIRPα v1-1B4細胞(圖2A)、CHOK1-食蟹猴SIRPα-2A2細胞(圖2B)及CHOK1-C57BL/6小鼠SIRPα -2.22細胞(圖2C)之FACS結合曲線。 圖3顯示了在所示之抗SIRPα抗體(具有S228P突變之人類IgG4嵌合抗體)存在下，人類巨噬細胞對Jurkat細胞(圖3A，3D)、Raji細胞(圖3B)及DLD-1細胞(圖3C)之吞噬作用。 圖4A說明了B-hSIRPα小鼠(Biocytogen)之靶向策略。圖4B顯示了抗SIRPα抗體(具有S228P突變之人類IgG4嵌合抗體)與B-hSIRPA小鼠單核細胞之結合。 圖5A顯示了人源化抗體hu035.01與CHOK1-人SIRPα v1-1B4細胞之FACS結合曲線。圖5B顯示了人源化抗體hu035.01與人SIRPα v2 ECD及小鼠SIRPα(C57BL/6)ECD重組蛋白之ELISA結合。圖5C顯示了由表面電漿共振測定的人源化抗體hu035.01與人SIRPα v2結合親和力之全動力學。 圖6顯示了優化的hu035候選物與人類SIRPα v1 ECD(圖6A)、人類SIRPα v2 ECD(圖6B)、人類SIRPα v8 ECD(圖6C)、人類SIRPβ ECD(圖6D)、人類SIRPγ ECD(圖6E)及小鼠SIRPα(C57BL/6)ECD(圖6F)之重組蛋白之ELISA特異性結合。 圖7顯示了優化的hu035候選物與CHOK1-人SIRPα v1-1B4細胞(圖7A)、CHOK1-食蟹猴SIRPα-2A2細胞(圖7B)及CHOK1-C57BL/6小鼠SIRPα-2.22細胞(圖7C)之FACS結合曲線。 圖8顯示了藉由競爭ELISA測定法對優化的hu035候選物之CD47及SIRPα相互作用阻斷活性進行偵測。 圖9顯示了在存在嵌合抗體035c及優化的hu035候選物之情況下，人類巨噬細胞對Jurkat細胞(圖9A)、DLD1細胞(圖9B)及Raji細胞(圖9C)之吞噬作用。 圖10顯示了在存在抗SIRPα抗體(具有S228P突變之IgG4嵌合抗體)及優化的hu035候選物之情況下，CD3/CD28激活劑刺激之T細胞IFNγ之分泌(圖10A)、CD4+ T細胞(圖10B)及CD8+ T細胞(圖10C)之增殖率。 圖11顯示在存在抗SIRPα抗體(具有S228P突變之人類IgG4嵌合抗體)及優化的hu035候選物之情況下，同種樹突細胞刺激之T細胞IFNγ之分泌(圖11A)、CD4+ T細胞(圖11B)及CD8+ T細胞(圖11C)之增殖率。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049
Figure 12_A0101_SEQ_0050
Figure 12_A0101_SEQ_0051
Figure 12_A0101_SEQ_0052
Figure 12_A0101_SEQ_0053
Figure 12_A0101_SEQ_0054

Claims (63)

  1. 一種能夠特異性結合人類SIRPα之抗體或其抗原結合片段，其包括重鏈可變區及/或輕鏈可變區，上述重鏈可變區包括HCDR1、HCDR2及HCDR3，上述輕鏈可變區包括LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中： a)   上述HCDR1包括選自下組之序列：RNYWMN (SEQ ID NO：1)、TDYAMH (SEQ ID NO：2)、TX1 YAMN (SEQ ID NO：3)、THYSMH (SEQ ID NO：4)、SDYFMT (SEQ ID NO：5)、TNYDIS (SEQ ID NO：6)、SSYWIH (SEQ ID NO：7)；且 b)   上述HCDR2包括選自下組之序列：EIX2 LKSNTYATHYAESVKG (SEQ ID NO：8)、WKNTETGESTYAEDFKG (SEQ ID NO：9)、X3 INTYTGEPTYAX4 X5 FKG (SEQ ID NO：10)、WINTETAEPTYVDDFKG (SEQ ID NO：11)、NVNYDGRSTYYLDSLKS (SEQ ID NO：12)、VIWTGGDTNFNSAFMS (SEQ ID NO：13)、或LIHPNSGNTDCSETFKN (SEQ ID NO：14)；且 c)   上述HCDR3包括選自下組之序列：FTKVVADWHLDV (SEQ ID NO：15)、GGYGSNYVMDY (SEQ ID NO：16)、TRGYYDFDGGAFDY (SEQ ID NO：17)、GGLRQGDY (SEQ ID NO：18)、EGSQTPLYAVDY (SEQ ID NO：19)、VQYFGGSYGPMDY (SEQ ID NO：20)、DGASYDWFVH (SEQ ID NO：21)；且 d)   上述LCDR1包括選自下組之序列：RSSQNIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO：22)、KASEDIYNRLA (SEQ ID NO：23)、X6 ASQNVGTHLA (SEQ ID NO：24)、SATSSVSASYLY (SEQ ID NO：25)、KASQNVGTAVA (SEQ ID NO：26)、EASDHINDWLA (SEQ ID NO：27)、KSSQSLLYTNGKTYLN (SEQ ID NO：28)；且 e)   上述LCDR2包括選自下組之序列：KX7 SNRFS (SEQ ID NO：29)、GATSLET (SEQ ID NO：30)、SAX8 YRYI (SEQ ID NO：31)、STSNLAS (SEQ ID NO：32)、LASNRYT (SEQ ID NO：33)、LVSKLDS (SEQ ID NO：35)；且 f)    上述LCDR3包括選自下組之序列：FQGSHVPFT (SEQ ID NO：36)、QQYWNSPRT (SEQ ID NO：37)、QQYNTYPLT (SEQ ID NO：38)、HQWSSYPYT (SEQ ID NO：39)、QQYSIYPFT (SEQ ID NO：40)、QQYWNTPLT (SEQ ID NO：41)、VQGTHFPRT (SEQ ID NO：42)； 其中，X1 為N或D，X2 為S或T，X3 為F或W，X4 為Q或D，X5 為D或G，X6 為K或R，X7 為V或I，X8 為S或I。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中： 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列，及/或 上述HCDR2包括如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列，及/或 上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列，及/或 上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之胺基酸序列，及/或 上述LCDR2包括如SEQ ID NO：29所示之胺基酸序列，及/或 上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之胺基酸序列， 其中X2 及X7 如請求項1中所定義。
  3. 如請求項2之抗體或其抗原結合片段，其中： 上述HCDR2包括選自下組之胺基酸序列：EISLKSNTYATHYAESVKG (SEQ ID NO：48)、EITLKSNTYATHYAESVKG (SEQ ID NO：49)，及/或 上述LCDR2包括選自下組之胺基酸序列：KVSNRFS (SEQ ID NO：55)及KISNRFS (SEQ ID NO：56)。
  4. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中： 上述HCDR1包括如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列，及/或 上述HCDR2包括如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列，及/或 上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列，及/或 上述LCDR1包括如SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列，及/或 上述LCDR2包括如SEQ ID NO：31所示之胺基酸序列，及/或 上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之胺基酸序列， 其中X1 、X3 、X4 、X5 、X6 及X8 如請求項1中所定義。
  5. 如請求項4之抗體或其抗原結合片段，其中： a)   上述HCDR1包括選自下組之胺基酸序列：TNYAMN (SEQ ID NO：43) 及TDYAMN (SEQ ID NO：45)，及/或 b)   上述HCDR2包括選自下組之胺基酸序列：FINTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO：50)、WINTYTGEPTYAQGFKG (SEQ ID NO：51)、及FINTYTGEPTYAQGFKG (SEQ ID NO：52)，及/或 c)   上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列，及/或 d)   上述LCDR1包括選自下組之胺基酸序列：KASQNVGTHLA (SEQ ID NO：53)、及RASQNVGTHLA (SEQ ID NO：54)，及/或 e)   上述LCDR2包括選自下組之胺基酸序列：SASYRYI (SEQ ID NO：57)、及SAIYRYI (SEQ ID NO：58)，及/或 f)    上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之胺基酸序列。
  6. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中上述重鏈可變區包括： a)   HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：48所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列；或 b)   HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列；或 c)   HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：9所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列；或 d)   HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：50所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或 e)   HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：51所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或 f)    HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：45所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或 g)   HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列；或 h)   HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：11所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：18所示之序列；或 i)    HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列；或 j)    HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：6所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：13所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：20所示之序列；或 k)   HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中上述HCDR1包括如SEQ ID NO：7所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：14所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：21所示之序列。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中上述輕鏈可變區包括： a)   LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或 b)   LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：56所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或 c)   LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：23所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：37所示之序列；或 d)   LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：53所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或 e)   LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或 f)    LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：58所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或 g)   LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：25所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：32所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：39所示之序列；或 h)   LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列；或 i)    LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：41所示之序列；或 j)    LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中上述LCDR1包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：35所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：42所示之序列。
  8. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中： a)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：48所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或 b)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：56所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或 c)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：1所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：49所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：15所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：22所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：55所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：36所示之序列；或 d)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：2所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：9所示之序列，上述如HCDR3包括如SEQ ID NO：16所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：23所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：37所示之序列；或 e)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：50所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：53所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或 f)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：51所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或 g)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：45所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：57所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或 h)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：45所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：58所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或 i)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：43所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：52所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：17所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：54所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：58所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：38所示之序列；或 j)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：4所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：11所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：18所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：25所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：32所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：39所示之序列；或 k)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列；或 l)     上述HCDR1包括如SEQ ID NO：6所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：13所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：20所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：27所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：30所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：41所示之序列；或 m)    上述HCDR1包括如SEQ ID NO：7所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：14所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：21所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：28所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：35所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：42所示之序列。
  9. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其進一步包括重鏈HFR1、HFR2、HFR3及HFR4中之一或多者，及/或輕鏈LFR1、LFR2、LFR3及LFR4中之一或多者，其中： a)     上述HFR1包括QX9 QLVQSGSELKKPGASVKVSCX10 AX11 GYX12 X13 (SEQ ID NO：92)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， b)     上述HFR2包括WVRQAPGQGLEWMG (SEQ ID NO：93)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， c)     上述HFR3包括RFVFSLDTSVSTAYLQIX14 SLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO：96)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， d)     上述HFR4包括WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO：97)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， e)     上述LFR1包括DIQMTQSPSX15 LX16 ASVGDRVTITC (SEQ ID NO：100)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， f)     上述LFR2包括WX17 QQKPGKX18 PKX19 LIX20 (SEQ ID NO：104)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， g)     上述LFR3包括GVPSRFSGSGSGTDFTLTISX21 LQPEDFATYX22 C (SEQ ID NO：108)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， h)     上述LFR4包括FX23 QGTKLEIKX24 (SEQ ID NO：47)或與其具有至少80%序列同一性之同源序列， 其中X9 為I或V，X10 為R或K，X11 為G或R或S，X12 為T或S，X13 為L或I或F，X14 為G或S，X15 為S或R，X16 為S或G，X17 為Y或F，X18 為A或S，X19 為S或A，X20 為Y或F，X21 為S或N，X22 為Y或F，X23 為G或D，X24 為R或缺失。
  10. 如請求項9之抗體或其抗原結合片段，其中： 上述HFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：44、89、90及91， 上述HFR2包括如SEQ ID NO：93所示之序列， 上述HFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：94及95， 上述HFR4包括如SEQ ID NO：97所示之序列， 上述LFR1包括選自下組之序列：SEQ ID NO：98及99， 上述LFR2包括選自下組之序列：SEQ ID NO：101、102及103， 上述LFR3包括選自下組之序列：SEQ ID NO：105、106及107，且 上述LFR4包括選自下組之序列：SEQ ID NO：109及46。
  11. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中上述重鏈可變區包括選自下組之序列：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類SIRPα特異性結合親和性之同源序列。
  12. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中上述輕鏈可變區包括選自下組之序列：SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88，以及與其具有至少80%序列同一性，但仍然保持與人類SIRPα特異性結合親和性之同源序列。
  13. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中 a)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：59所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：73所示之序列；或 b)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：60所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：74所示之序列；或 c)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：61所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：75所示之序列；或 d)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示之序列；或 e)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：63所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：77所示之序列；或 f)    上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：64所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：78所示之序列；或 g)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：79所示之序列；或 h)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：80所示之序列；或 i)    上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：66所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：81所示之序列；或 j)    上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：82所示之序列；或 k)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：67所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：83所示之序列；或 l)    上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：68所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：82所示之序列；或 m)  上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：65所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：84所示之序列；或 n)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：85所示之序列；或 o)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示之序列；或 p)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示之序列；或 q)   上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：88所示之序列。
  14. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其進一步包括一或多個胺基酸殘基取代或修飾，但仍保持與人類SIRPα之特異性結合親和性。
  15. 如請求項14之抗體或其抗原結合片段，其中上述取代或修飾中之至少一者在上述重鏈可變區或輕鏈可變區中之一或多個CDR序列及/或一或多個非CDR序列中。
  16. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其進一步包括Fc區，視情況包括人類免疫球蛋白(Ig)之Fc區，或視情況包括人類IgG之Fc區。
  17. 如請求項16之抗體或其抗原結合片段，其中上述Fc區源自人類IgG4。
  18. 如請求項17之抗體或其抗原結合片段，其中上述源自人類IgG4之Fc區包括S228P突變及/或L235E突變。
  19. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為人源化的。
  20. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為單株抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體、重組抗體、嵌合抗體、標記抗體、雙價抗體、抗獨特型抗體或融合蛋白。
  21. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為雙功能抗體(diabody)、Fab、Fab'、Fd、F(ab')2 、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2 、雙特異性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫鍵穩定的雙功能抗體(ds diabody)、單鏈抗體分子(scFv)、scFv二聚體(雙價雙功能抗體)、多特異性抗體、駱駝化單域抗體(camelized single domain antibody)、奈米抗體(nanobody)、域抗體(domain antibody)及雙價域抗體。
  22. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其具有選自下組的與人類SIRPα之一或多個結合性質： a) 與人類SIRPα之結合親和性不超過10-7 M，上述與人類SIRPα之結合親和性藉由Biacore檢定法測定， b) 以不超過1 nM之EC50 特異性地與人類SIRPα v1胞外域(ECD)結合，上述EC50 藉由ELISA檢定法測定， c) 以不超過1 nM之EC50 特異性地與人類SIRPα v2 ECD結合，上述EC50 藉由ELISA檢定法測定。
  23. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其具有選自下組之一或多個結合性質： a) 未偵測到與SIRPγ ECD之結合， b) 以不超過50 nM之EC50 與SIRPγ ECD結合，上述EC50 藉由ELISA檢定法測定， c) 以不超過1 nM之EC50 與SIRPβ ECD結合，上述EC50 藉由ELISA檢定法測定， d) 藉由ELISA檢定法未偵測到與SIRPβ ECD之結合， e) 藉由FACS檢定法測到與人類SIRPα IgV域之特異性結合， f) 藉由FACS檢定法未偵測到與人類SIRPα IgV域之結合， g) 以不超過10-5 M之結合親和性特異性地與小鼠SIRPα結合，上述結合親和性藉由Biacore檢定法測定， h) 以10 nM之濃度特異性地與食蟹猴SIRPα結合，上述濃度藉由FACS檢定法測定， i) 能夠以10 nM之濃度誘導巨噬細胞對表現CD47之目標細胞的吞噬作用，上述濃度藉由吞噬試驗測定；以及 j) 不減少CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖。
  24. 一種抗SIRPα抗體或其抗原結合片段，其與如請求項1至23之抗體或其抗原結合片段競爭結合人類SIRPα。
  25. 如請求項24之抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：70所示之序列，上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：86所示之序列。
  26. 如請求項24之抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：72所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：88所示之序列。
  27. 如請求項24之抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：62所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：76所示之序列，或與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：69所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如上述SEQ ID NO：85所示之序列。
  28. 如請求項24之抗體或其抗原結合片段，其與包括重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體競爭結合人類SIRPα，上述重鏈可變區包括如SEQ ID NO：71所示之序列，且上述輕鏈可變區包括如SEQ ID NO：87所示之序列。
  29. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其為雙特異性的。
  30. 如請求項29之抗體或其抗原結合片段，其能夠特異性地與除SIRPα之外的第二抗原結合。
  31. 如請求項29之抗體或其抗原結合片段，其能夠特異性地與SIRPα上之第二抗原決定基結合。
  32. 如請求項30之抗體或其抗原結合片段，其中上述第二抗原選自下組：CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD44、CD52、CD56、CD70、CD96、CD97、CD99、CD123、CD279 (PD-1)、CD274 (PD-L1)、GPC-3、B7-H3、B7-H4、TROP2、CLDN18.2、EGFR、HER2、CD117、C-Met、PTHR2及HAVCR2 (TIM3)。
  33. 如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其與一或多個綴合物部分連接。
  34. 如請求項33之抗體或其抗原結合片段，其中上述綴合物部分包括清除修飾劑、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記、酶受質標記、DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白結合劑、純化部分或其他抗癌藥物。
  35. 一種醫藥組合物，其包括如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段以及一或多種藥學上可接受之載劑。
  36. 一種分離的多核苷酸，其編碼如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段。
  37. 一種載體，其包括如請求項36之分離的多核苷酸。
  38. 一種宿主細胞，其包括如請求項37之載體。
  39. 一種套組，其包括如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物，以及第二治療劑。
  40. 一種表現如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段之方法，其包括在表現如請求項37之載體之條件下培養如請求項38之宿主細胞。
  41. 一種在個體中治療、預防或減輕與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之方法，其包括向上述個體投與治療有效量的如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物。
  42. 如請求項41之方法，其中上述疾病、病症或狀況為癌症、實體瘤、慢性感染、炎性疾病、多發性硬化、自體免疫性疾病、神經系統疾病、腦損傷、神經損傷、紅細胞增多症、血色素沉著病、創傷、感染性休克、纖維化、動脈粥樣硬化、肥胖症、II型糖尿病、移植功能障礙或關節炎。
  43. 如請求項42之方法，其中上述癌症為肛門癌、闌尾癌、星形細胞瘤、基底細胞癌、膽囊癌、胃癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、肝膽管癌、胰臟癌、乳癌、肝癌、卵巢癌、睾丸癌、腎癌、腎盂及輸尿管癌、唾液腺癌、小腸癌、尿道癌、膀胱癌、頭頸癌、脊椎癌、腦癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、結腸癌、結直腸癌、直腸癌、食道癌、胃腸道癌、皮膚癌、前列腺癌、垂體癌、陰道癌、甲狀腺癌、喉癌、膠質母細胞瘤、黑素瘤、骨髓增生異常症候群、肉瘤、畸胎瘤、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多發性骨髓瘤、T或B細胞淋巴瘤、胃腸道間質瘤、軟組織腫瘤、肝細胞癌或腺癌。
  44. 如請求項42至43中任一項之方法，其中上述癌症為CD47陽性癌症。
  45. 如請求項41至44中任一項之方法，其中上述個體為人類。
  46. 如請求項41至45中任一項之方法，其中上述投與係經由口服、鼻內、靜脈內、皮下、舌下或肌內投與。
  47. 如請求項41至46中任一項之方法，進一步包括投與治療有效量的第二治療劑。
  48. 如請求項47之方法，其中上述第二治療劑選自下組：化療劑、抗癌藥物、放療劑、免疫治療劑、抗血管生成劑、靶向治療劑、細胞治療劑、基因治療劑、激素治療劑、抗病毒劑、抗生素、鎮痛藥、抗氧化劑、金屬螯合劑及細胞因子。
  49. 一種調節SIRPα陽性細胞中SIRPα活性之方法，其包括將上述SIRPα陽性細胞暴露於如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物。
  50. 如請求項49之方法，其中上述細胞為吞噬細胞。
  51. 一種偵測樣品中SIRPα之存在或含量之方法，其包括將上述樣品與如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物接觸，且確定上述樣品中SIRPα之存在或含量。
  52. 一種在個體中診斷與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之方法，其包括：a)將獲取自上述個體之樣品與如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物接觸；b)測定在上述樣品中SIRPα之存在或含量；以及c)將上述SIRPα之存在或含量與上述個體的與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之存在或狀態相關聯。
  53. 如請求項51或52之方法，其中上述抗體或其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列。
  54. 一種如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物，在製備用於治療、預防或減輕與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之藥物中之用途。
  55. 一種如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物，在製備用於診斷與SIRPα相關之疾病、病症或狀況之診斷試劑中之用途。
  56. 如請求項55之用途，其中上述抗體或其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列。
  57. 一種用於偵測SIRPα之套組，其包括如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物。
  58. 如請求項57之套組，其中上述抗體或其抗原結合片段包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，上述HCDR1包括如SEQ ID NO：5所示之序列，上述HCDR2包括如SEQ ID NO：12所示之序列，上述HCDR3包括如SEQ ID NO：19所示之序列，上述LCDR1包括如SEQ ID NO：26所示之序列，上述LCDR2包括如SEQ ID NO：33所示之序列，上述LCDR3包括如SEQ ID NO：40所示之序列。
  59. 一種在個體中誘導吞噬作用之方法，包括以有效誘導吞噬作用之劑量向上述個體投與如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物。
  60. 如請求項59之方法，其中上述個體為人類。
  61. 如請求項59或60之方法，其中上述個體具有選自下組之疾病、病症或狀況：癌症、實體瘤、慢性感染、炎性疾病、多發性硬化、自體免疫性疾病、神經系統疾病、腦損傷、神經損傷、紅細胞增多症、血色素沉著病、創傷、感染性休克、纖維化、動脈粥樣硬化、肥胖症、II型糖尿病、移植功能障礙及關節炎。
  62. 一種在體外誘導吞噬作用之方法，包括在如請求項1至34中任一項之抗體或其抗原結合片段及/或如請求項35之醫藥組合物的存在下，將目標細胞與SIRPα陽性的吞噬細胞樣本接觸，從而藉由上述SIRPα陽性的吞噬細胞誘導上述目標細胞之上述吞噬作用。
  63. 如請求項62之方法，其中上述目標細胞為表現CD47之細胞。
TW109128460A 2019-08-20 2020-08-20 新型抗ｓｉｒｐａ抗體 TW202124438A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019101564 2019-08-20
WOPCT/CN2019/101564 2019-08-20
CN202010818127.X 2020-08-14
CN202010818127 2020-08-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202124438A true TW202124438A (zh) 2021-07-01

Family

ID=74660490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109128460A TW202124438A (zh) 2019-08-20 2020-08-20 新型抗ｓｉｒｐａ抗體

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210347908A1 (zh)
EP (1) EP3810197A1 (zh)
JP (1) JP2022545300A (zh)
CN (1) CN112867507A (zh)
AU (1) AU2020286285A1 (zh)
CA (1) CA3102331A1 (zh)
TW (1) TW202124438A (zh)
WO (1) WO2021032078A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11945858B2 (en) * 2018-05-18 2024-04-02 National Research Council Of Canada Antibodies and antibody fragments against HNAV1.7 channel and their use in pain and cancer indications
WO2022247933A1 (zh) * 2021-05-28 2022-12-01 百奥泰生物制药股份有限公司 抗SIPRα抗体及其应用
KR20240027677A (ko) * 2021-06-04 2024-03-04 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 항-sirp-알파 항체
TW202313699A (zh) * 2021-07-28 2023-04-01 中國大陸商科望（蘇州）生物醫藥科技有限公司 新型抗ｓｉｒｐａ抗體
CN113583979B (zh) * 2021-08-03 2022-11-22 杭州荣谷生物科技有限公司 一种重组溶瘤痘苗病毒、制备方法及其用途
WO2023056474A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 University Of Washington Mouse anti-human monoclonal antibody against glypican-3
WO2023202672A1 (en) * 2022-04-20 2023-10-26 Biosion Inc. Antibodies targeting sirp-alpha and uses thereof
CN116120461B (zh) * 2022-04-29 2023-09-29 德琪(杭州)生物有限公司 新型抗药抗体以及其用途
WO2024105180A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Boehringer Ingelheim International Gmbh Predictive efficacy biomarkers for anti-sirpa antibodies
CN116731175B (zh) * 2023-05-19 2024-03-08 四川大学 一种抗cd47的纳米抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013056352A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
CN106456749B (zh) * 2014-03-11 2021-03-30 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗SIRPα抗体和双特异性巨噬细胞增强型抗体
SG11201808465UA (en) * 2016-04-14 2018-10-30 Ose Immunotherapeutics NEW ANTI-SIRPa ANTIBODIES AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS
JP7369620B2 (ja) * 2016-08-03 2023-10-26 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー マクロファージ上のＦｃ受容体結合の破壊による抗ＳｌＲＰα抗体療法の効果増強
JOP20190009A1 (ar) * 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
CA3071193A1 (en) * 2017-07-26 2019-01-31 Forty Seven, Inc. Anti-sirp-alpha antibodies and related methods

Also Published As

Publication number Publication date
CA3102331A1 (en) 2021-02-20
US20210347908A1 (en) 2021-11-11
WO2021032078A1 (en) 2021-02-25
AU2020286285A1 (en) 2021-03-11
EP3810197A1 (en) 2021-04-28
CN112867507A (zh) 2021-05-28
JP2022545300A (ja) 2022-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210347908A1 (en) Novel anti-sirpa antibodies
CA2987118C (en) A pdl-1 antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
WO2019179366A1 (en) Novel anti-cd47 antibodies
AU2020286284B2 (en) Novel anti-CD39 antibodies
TWI564306B (zh) 雙特異性抗體
CA3107192A1 (en) Antibody constructs for cldn18.2 and cd3
JP2023106392A (ja) Ｃｄ３抗原結合性断片及びその使用
JPWO2018117237A1 (ja) 抗ｃｄ３抗体及び該抗体を含む分子
TW202030206A (zh) 新型雙特異性cd3/cd20多肽複合物
TW201940516A (zh) 新型抗cd47抗體
US20220324976A1 (en) Novel anti-cd4 antibodies
WO2023072294A1 (en) Novel anti-lag3 antibodies
WO2024131962A1 (zh) 新型抗gprc5d抗体
TW202313699A (zh) 新型抗ｓｉｒｐａ抗體
WO2022063272A1 (en) Novel anti-claudin18 antibodies
TW202417494A (zh) 新穎抗ｌｉｌｒｂ４抗體及其用途