JPWO2018117237A1 - 抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 - Google Patents
抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2018117237A1 JPWO2018117237A1 JP2018558078A JP2018558078A JPWO2018117237A1 JP WO2018117237 A1 JPWO2018117237 A1 JP WO2018117237A1 JP 2018558078 A JP2018558078 A JP 2018558078A JP 2018558078 A JP2018558078 A JP 2018558078A JP WO2018117237 A1 JPWO2018117237 A1 JP WO2018117237A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- antibody
- seq
- antigen
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 403
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 403
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 400
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 398
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 320
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 264
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 262
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 253
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 184
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 179
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 152
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 152
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 97
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 claims description 53
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 50
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 49
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 49
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 37
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 34
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 28
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 26
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 26
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 24
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 24
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 24
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 21
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 21
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 21
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 15
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 13
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 12
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 12
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 10
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 claims description 8
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 claims description 8
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims description 4
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 313
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 72
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 70
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 61
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 44
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 42
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 42
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 42
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 37
- 101000946860 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Proteins 0.000 description 35
- 102100035794 T-cell surface glycoprotein CD3 epsilon chain Human genes 0.000 description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 33
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 30
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 30
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 29
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 26
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 24
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 23
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 21
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 21
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 21
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 20
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 20
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 19
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 19
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 17
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 17
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 17
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 14
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 14
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 14
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 14
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 14
- 101001036406 Homo sapiens Melanoma-associated antigen C1 Proteins 0.000 description 13
- 102100039447 Melanoma-associated antigen C1 Human genes 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 12
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 11
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 11
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 11
- 101150117918 Tacstd2 gene Proteins 0.000 description 11
- 102100027212 Tumor-associated calcium signal transducer 2 Human genes 0.000 description 11
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 11
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 11
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 11
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 10
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 9
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 9
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 8
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 7
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 7
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 6
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 6
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 208000017058 pharyngeal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 5
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 102000046001 human TACSTD2 Human genes 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- 101100368708 Homo sapiens TACSTD2 gene Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000012575 bio-layer interferometry Methods 0.000 description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 4
- -1 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 3
- 101000642536 Apis mellifera Venom serine protease 34 Proteins 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N Chromium-51 Chemical compound [51Cr] VYZAMTAEIAYCRO-BJUDXGSMSA-N 0.000 description 3
- 102100025698 Cytosolic carboxypeptidase 4 Human genes 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 101000932590 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 4 Proteins 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 208000025205 Mantle-Cell Lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 101001033003 Mus musculus Granzyme F Proteins 0.000 description 3
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229940127174 UCHT1 Drugs 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 3
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006226 wash reagent Substances 0.000 description 3
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanol Chemical compound OCCC1=CC=CC=C1 WRMNZCZEMHIOCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 2
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101150046281 NIP4-1 gene Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 2
- MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N atrazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N caffeine Chemical compound CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N=CN2C RYYVLZVUVIJVGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 2
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 2
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920006316 polyvinylpyrrolidine Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000000941 radioactive substance Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 125000000979 2-amino-2-oxoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(=O)N([H])[H] 0.000 description 1
- BFFPVEVGHKMWLT-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 BFFPVEVGHKMWLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIIIXQJBDGSIKL-UHFFFAOYSA-N 2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;hydrate Chemical compound O.OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 MIIIXQJBDGSIKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- DWGWCWDDNTVOGF-UHFFFAOYSA-N Cl.Cl.Cl.Cl.Cl.Cl Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.Cl.Cl DWGWCWDDNTVOGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007035 DNA breakage Effects 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101001054843 Homo sapiens Immunoglobulin lambda variable 1-40 Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108700029227 Immunoglobulin Light Chain Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100026911 Immunoglobulin lambda variable 1-40 Human genes 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 108010040765 Integrin alphaV Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N Isocaffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1N(C)C=N2 LPHGQDQBBGAPDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 102220470475 L-seryl-tRNA(Sec) kinase_C57L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101000822667 Mus musculus Something about silencing protein 10 Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical group CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000473945 Theria <moth genus> Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011126 aluminium potassium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N benzene-1,2-diamine;hydron;dichloride Chemical compound Cl.Cl.NC1=CC=CC=C1N RIIWUGSYXOBDMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960004365 benzoic acid Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 235000010338 boric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 229960001948 caffeine Drugs 0.000 description 1
- VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N caffeine Natural products CN1C(=O)N(C)C(=O)C2=C1C=CN2C VJEONQKOZGKCAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 1
- 230000005886 chromosome breakage Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 235000021310 complex sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 208000015806 constitutional megaloblastic anemia with severe neurologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013631 noncovalent dimer Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010702 perfluoropolyether Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229940050271 potassium alum Drugs 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BUKHSQBUKZIMLB-UHFFFAOYSA-L potassium;sodium;dichloride Chemical compound [Na+].[Cl-].[Cl-].[K+] BUKHSQBUKZIMLB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012910 preclinical development Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000006318 protein oxidation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 102200068593 rs281865221 Human genes 0.000 description 1
- 102220321873 rs764111643 Human genes 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 208000037921 secondary disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000006257 total synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N trappsol cyclo Chemical compound CC(O)COC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](COCC(C)O)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)COCC(O)C)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1COCC(C)O ODLHGICHYURWBS-LKONHMLTSA-N 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 229960000281 trometamol Drugs 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
2)OKT3はマウス由来の抗ヒトCD3モノクローナル抗体である(非特許文献1)。臓器の同種移植片拒絶を防ぐために、抗CD3モノクローナル抗体を投与し、抗体がヒトT細胞上のTCR複合体に結合しT細胞の活性化と増殖を抑えることで、移植臓器が拒絶されるのを防ぐ処置法が長い間用いられてきた(非特許文献2−4)。OKT3はそのような処置に用いられた最初の抗CD3抗体である。OKT3は強い免疫抑制効果を有する一方、その免疫原性及び分裂促進の潜在能力に関連する重篤な副作用が原因で、その臨床上の使用が阻まれている(非特許文献5−8)。
3)OKT3はインビトロにおいてT細胞増殖及びサイトカイン産生を誘導し、インビボにおいて大量のサイトカインを放出し、サイトカインシンドロームを引き起こした(非特許文献5)。これはOKT3が2価のIgGであるため、T細胞とFcγ受容体発現細胞へのクロスリンクが生じ、結果としてT細胞の増殖が引き起こされることによる(非特許文献8)。またOKT3はマウス抗体であるため、長期投与によりヒト抗マウス抗体(HAMA)のような異好性抗体が生じることが知られている(非特許文献7)。抗CD3抗体の治療への応用と副作用の報告は以下にまとめられている(特許文献1)。
4)このような問題を解決するため、OKT3のscFv(非特許文献9)、あるいはヒト化OKT3(非特許文献10)等が作製されている。またOKT3の更なる応用例として、T細胞活性化能を利用したOKT3の単鎖とがん細胞表面で発現する標的抗原に対する抗体の単鎖を結合させた二重特異性抗体が報告されている(特許文献2、非特許文献11)。
5)当技術分野で説明される抗CD3抗体を用いた多重特異性抗体は、悪性疾患の治療に対して大きな治療的可能性を有することが期待される。例えば、TROP2は種々の上皮細胞癌種において過剰発現していることが知られている(非特許文献12−16)。ヒトTROP2特異的な抗体の抗原結合性断片と抗CD3抗体の抗原結合性断片を遺伝子上でつなげて発現させた二重特異性抗体は、これまで報告されていない。
6)OKT3は、チンパンジーのCD3とは反応するが、カニクイザルなど他の霊長動物由来のCD3とは反応しない(非特許文献17)。抗CD3モノクローナル抗体であるUCHT−1もまた、チンパンジーに由来するCD3とは反応するがカニクイザル由来CD3とは反応しない(非特許文献18)。他方、カニクイザル抗原は認識するが、それらのヒト対応物は認識しないモノクローナル抗体の例も見られる。この群の一例は、カニクイザルに由来するCD3を指向するモノクローナル抗体であるFN−18である(非特許文献19)。
7)OKT3及びOKT3を改変した一連の抗体の限界は、ヒトCD3のみに特異的に結合することである。この限界はヒトの疾患を治療する治療薬剤として開発するにあたり、重大な障害となり得る。なぜならば、開発候補薬品は市場の承認を得るために、前臨床試験を実施する必要があり、前臨床試験では動物、特に高等霊長類であるカニクイザルを用いて行うことが望まれているからである。したがって、抗CD3抗体を用いた候補薬品の場合、ヒトとカニクイザル両方のCD3に結合可能な抗CD3抗体を用いることが非常に望ましい。
8)ヒトとカニクイザル両方と結合する抗体は、特許文献3、4、及び非特許文献20で報告されている。またこのような抗CD3抗体の単鎖と、がん細胞表面で発現する標的抗原に対する抗体の単鎖を結合させた二重特異性抗体が報告されている(特許文献5、非特許文献21)。しかし、多様性に富む癌標的に適応可能な多重特異性抗体や多重特異性分子を利用可能とするために、上述のものとは異なるエピトープと結合し、かつヒトとカニクイザル両方に結合する抗CD3抗体が望まれている。
(1)重鎖配列が
配列番号26に示されるアミノ酸配列を含むCDRH1、
配列番号98に示されるアミノ酸配列を含むCDRH2、及び、
配列番号28に示されるアミノ酸配列を含むCDRH3;
軽鎖配列が
配列番号29に示されるアミノ酸配列を含むCDRL1、
配列番号99に示されるアミノ酸配列を含むCDRL2、及び、
配列番号31に示されるアミノ酸配列を含むCDRL3
をそれぞれ含み;且つ、
ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合することを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(2)前記CDRH2の
1番目のXaaは、(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)からなる群より選択され
且つ2番目のXaaはSであるか、又は、
1番目のXaaはNであり、
且つ2番目のXaaは、(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)からなる群より選択され、
前記CDRL2の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択され、
ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合することを特徴とする前記(1)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(3)前記CDRH2の
1番目のXaaは、(R、S)からなる群より選択され、2番目のXaaはSであり、且つ
前記CDRL2の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される、
ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合することを特徴とする前記(1)又は(2)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(4)重鎖配列がCDRH1、CDRH2、及び、CDRH3を有する可変領域を含み、
前記CDRH1は配列番号26に示されるアミノ酸配列からなり、
前記CDRH2は配列番号27に示されるアミノ酸配列からなり、
前記CDRH3は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなること;並びに
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、
前記CDRL1は配列番号29に示されるアミノ酸配列からなり、
前記CDRL2は配列番号30に示されるアミノ酸配列からなり、
前記CDRL3は配列番号31に示されるアミノ酸配列からなること;並びに、
ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合することを特徴とする、前記(1)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(5) 重鎖可変領域配列が、配列番号100に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記(1)乃至(4)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(6) 配列番号100に示されるアミノ酸配列の
1番目のXaaは、(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)からなる群より選択され
且つ2番目のXaaはSであるか、又は、
1番目のXaaはNであり
且つ2番目のXaaは、(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)からなる群より選択される、
前記(5)に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
(7) 配列番号100に示されるアミノ酸配列の
1番目のXaaは、(R、S)からなる群より選択され、且つ2番目のXaaはSである、
前記(5)に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
(8) 軽鎖可変領域が、配列番号101、102、及び、103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記(1)乃至(7)のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合性断片。
(9) 配列番号101、102、及び、103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される、前記(8)に記載の抗体又その抗原結合性断片。
(10) 重鎖可変領域配列が、配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記(5)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(11) 軽鎖可変領域配列が、配列番号17、20、及び、23のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする前記(8)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(12) 配列番号100に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号101、102、及び103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
配列番号100で示されるアミノ酸配列の1番目のXaaは、(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)からなる群より選択され、且つ、2番目のXaaはSであるか、又は、
1番目のXaaはNであり、且つ、2番目のXaaは、(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)からなる群より選択され、
配列番号101、102、及び、103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される、前記(1)又は(2)に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
(13) 配列番号100の
1番目のXaaは、(R、S)からなる群より選択され、
2番目のXaaはSであり、且つ、
配列番号101、102、及び、103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される、前記(12)に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
(14) 前記(13)に記載の
配列番号60の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号60の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号64の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号64の135乃至241のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号66の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号66の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号68の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号68の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号70の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号70の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号72の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号72の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号74の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号74の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号76の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号76の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号78の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号78の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号80の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号80の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号82の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号82の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号84の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号84の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(15) 配列番号16に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、リンカーと、配列番号17、20、及び、23のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む前記(1)、(4)、(5)、(8)、(10)、又は(11)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(16) 可変領域が、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合しており、又は、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合しており、任意で:i) 両可変領域の間にリンカーを有し;ii)アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有し;iii)カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、FLAGタグ、及び/又は、Hisタグが結合している:前記(1)乃至(15)のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合性断片。
(17) 配列番号60の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号64の2乃至241番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号66の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号68の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号70の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号72の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号74の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号76の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号78の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号80の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号82の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
又は、
配列番号84の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を含む前記(16)に記載の抗原又は該抗体の抗原結合性断片。
(18) 配列番号19の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号22の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号25の2乃至267のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号60の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号64の2乃至267のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号66の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号68の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号70の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号72の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号74の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号76の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号78の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号80の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号82の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、又は、
配列番号84の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を含む前記(16)に記載の抗原又は該抗体の抗原結合性断片。
(20) 前記(14)乃至(18)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖のアミノ酸配列と90%以上同一なアミノ酸配列を含む重鎖、及び、前記(14)乃至(18)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖のアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、且つ、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(21) 前記(14)乃至(18)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖が含むアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、前記(14)乃至(18)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖が含むアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、且つ、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(22) 前記(14)乃至(18)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトCD3上の同一の部位に結合し、且つ、カニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(23) 前記(14)乃至(18)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とヒトCD3上への結合において競合し、且つ、カニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(24) 前記抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトCD3上の部位が、配列番号1で示されるアミノ酸配列中の55番目のセリン(Ser)、56番目のグルタミン酸(Glu)、58番目のロイシン(Leu)、59番目のトリプトファン(Trp)、65番目のアスパラギン(Asn)、66番目のイソロイシン(Ile)、77番目のセリン(Ser)、78番目のアスパラギン酸(Asp)、101番目のアルギニン(Arg)、101番目のグリシン(Gly)、103番目のセリン(Ser)、104番目のリジン(Lys)、および105番目のプロリン(Pro)のうちの7アミノ酸以上から構成される、前記(22)に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(25) IgGである前記(1乃至17)、(19)乃至(24)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(26) Fab、F(ab)’、Fv、scFv及びsdAbからなる群から選択される前記(1)乃至(23)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(27) ヒト免疫グロブリン定常領域を含むヒト化抗体又はヒト抗体である、前記(1)乃至(17)、(19)乃至(25)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(28) 前記(1)乃至(27)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
(29) 配列番号19の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号22の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号25の2乃至241番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号60の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号64の2乃至241番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号66の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号68の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号70の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号72の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号74の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号76の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号78の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号80の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号82の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
又は、
配列番号84の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列を含む、前記(27)に記載のポリヌクレオチド。
(30) 前記(28)又は(29)のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(31) 前記(28)又は(29)のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド又は前記(30)に記載のベクターを含むか、又は前記(1)乃至(27)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を産生する細胞。
(32) 前記(31)に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を回収する工程を含む、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片の製造方法。
(33) 前記(32)に記載の方法により得られる、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
(34) 前記(1)乃至(27)、(33)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を有効成分として含有する医薬組成物。
(35) 前記(1)乃至(27)、(33)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む抗原結合性を有する分子。
(36) 多重特異的である前記(35)に記載の分子。
(38) さらなる抗体の抗原結合性断片が、Fab、F(ab)’、Fv、scFv、又は、sdAbである、前記(37)に記載の分子。
(39) Fcを含む前記(38)に記載の分子。
(40) さらなる抗体が、ヒト免疫グロブリン定常領域を含むヒト化抗体又はヒト抗体である、前記(37)乃至(39)のいずれか1つに記載の分子。
(41) 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、前記(1)乃至(27)、(33)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる前記(37)乃至(38)のいずれか1つに記載の分子。
(42) 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片の有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、リンカーとが結合しており、さらに該リンカーの有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、前記(1)乃至(27)、(33)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが結合してなる前記(41)に記載の分子。
(43) 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片の有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、リンカーとが結合しており、さらに該リンカーの有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、
配列番号19の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号22の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号25の2乃至241番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合してなるアミノ酸配列を含む前記(42)に記載の分子。
(44) 前記(1)乃至(27)、(33)のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片において、可変領域が、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合しており、あるいは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合しており、
任意で:i)両可変領域の間にリンカーを有し:ii)アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有し;iii)カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、FLAGタグ、及び/又は、Hisタグが結合している:前記(35)乃至(42)のいずれか1つに記載の分子。適用可能な形態には、Hybrid型、Dual型の二重特異的分子が含まれる。
(45) 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、
配列番号19の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号25の2乃至241番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
配列番号60の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、配列番号64の2乃至241番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、配列番号66の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号68の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号70の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号72の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号74の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号76の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号78の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号80の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号82の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号84の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片
を含む前記(44)に記載の分子。適用可能な形態には、Hybrid型、Dual型の二重特異的分子が含まれる。
(46) 該さらなる抗体が抗癌標的抗体である前記(36)乃至(45)のいずれかに記載の分子。
(47) 二重特異的である前記(36)乃至(46)のいずれか1つに記載の分子。
(48) ポリペプチドである前記(35)乃至(47)のいずれか1つに記載の分子。
(49) 前記(48)に記載の分子の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
(50) 前記(49)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(51) 前記(49)に記載のポリヌクレオチド若しくは前記(50に記載のベクター、又は、前記(48に記載の分子を産生する細胞。
(52) 前記(51)に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトCD3に結合する分子を回収する工程を含む、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する分子の製造方法。
(53) 前記(52)に記載の方法により得られる、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する分子。
(54) 前記(35)乃至(48)、(53)のいずれか1つに記載の分子を有効成分として含有する医薬組成物。
(55) 標的細胞へのT細胞リダイレクションによって、該標的細胞への細胞傷害を誘導することを特徴とする前記(54)に記載の医薬組成物。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチド又はその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードする塩基配列が含まれるヌクレオチド又はその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドであり、DNA鎖とRNA鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド(RNA)とデオキシリボヌクレオチド(DNA)が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。本発明において塩基配列とヌクレオチド配列は同義である。
本発明の抗体の定常領域としては、とくに限定されるものではないが、ヒトの疾患を治療又は予防するための本発明の抗体としては、好適にはヒト抗体のものが使用される。ヒト抗体の重鎖定常領域としては、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等を挙げることができる。ヒト抗体の軽鎖定常領域としては、例えば、Cκ、Cλ等を挙げることができる。
本発明において「細胞傷害活性」とは上記細胞傷害を引き起こすことを意味する。
2.抗原蛋白質 CD3(CD3複合体)
本発明において、「CD3」は、CD3蛋白質と同じ意味で用いている。
3.抗CD3抗体
(3−1)抗体の分類
本発明の抗CD3抗体及び該抗体の抗原結合性断片(以下、本発明の抗体等とも記す)は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明のモノクローナル抗体としては、非ヒト動物由来の抗体(非ヒト動物抗体)、ヒト抗体、キメラ化抗体(「キメラ抗体」ともいう)、ヒト化抗体などを挙げることができる。
(3−2)抗CD3抗体の結合特異性
本発明の抗体等はCD3を認識する。すなわち、本発明の抗体等はCD3に結合する。本発明の抗体等は、好適には、ヒトCD3、サルCD3等に結合し、より好適には、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する。
Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104、及びPro105。
上述の通り、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体等は、医薬品の非臨床開発(前臨床開発)に必須な霊長類、特にカニクイザルを用いた有効性や安全性に関する各種試験に供することができ好ましい。また、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体等は、細胞傷害活性を有し、単独で又は本発明の分子として、ヒト及びカニクイザルにおける癌等の疾患の治療又は予防に有用である。医薬組成物については後述する。
(3−3)モノクローナル抗体
本発明はモノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体には、ラット抗体、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、魚類抗体等の非ヒト動物由来のモノクローナル抗体、キメラ化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらの抗原結合性断片、それらの抗体変異体、それらの修飾体等が含まれる。
本発明の抗体変異体には、好適には、蛋白質の分解もしくは酸化に対する感受性の低下、生物活性や機能の維持、改善もしくは低下や変化の抑制、抗原結合能の改善もしくは調節、又は理化学的性質もしくは機能的性質の付与等がなされ得る。蛋白質は、その表面にある特定のアミノ酸側鎖が変化して当該蛋白質の機能や活性が変化することが知られ、そのような例には、アスパラギン側鎖の脱アミド化、アスパラギン酸側鎖の異性化等が含まれる。そのようなアミノ酸側鎖の変化を防ぐために別のアミノ酸に置き換えたものも、本発明の抗体変異体の範囲に含まれる。
本発明の抗体変異体の例として、抗体の有するアミノ酸配列において保存的アミノ酸置換されてなるアミノ酸配列を有する抗体を挙げることができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸側鎖に関連のあるアミノ酸グループ内で生じる置換である。
(3−4)抗CD3抗体の抗原結合性断片
本発明の一つの態様として、本発明の抗CD3抗体の抗原結合性断片を提供する。抗体の抗原結合性断片とは、該抗体の有する機能のうち少なくとも抗原結合性を保持する断片又はその修飾物を意味する。かかる抗体の機能としては、一般的には、抗原結合活性、抗原の活性を調節する活性、抗体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞傷害活性等を挙げることができる。本発明の抗体等及び本発明の抗体等を含む多重特異的な分子とした場合の機能としては、例えばT細胞のリダイレクション、T細胞の活性化、T細胞を活性化することによる癌細胞の細胞傷害活性を挙げることができる。
(3−5)抗原結合性を有する分子
本発明の分子は、本発明の抗CD3抗体又はその抗原結合性断片を含む。
(3−6)多重特異的な分子、二重特異的な分子
本発明の多重特異的な分子は、2以上の抗原結合部位を持つ分子である。すなわち、1つの分子上の2つ以上の互いに異なるエピトープ又は2つ以上の分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能な分子であり、複数の互いに異なる抗原結合性断片を包む。このような多重特異的な分子には、IgG型多重特異性分子、2種類以上の可変領域を有する多重特異性分子、例えばタンデムscFv、一本鎖ダイアボディ、ダイアボディ、及びトリアボディのような抗体断片、共有結合又は非共有結合して連結されている抗体断片を含むが、これらに限定されない。多重特異的な分子はFcを含んでいてもよい。
本発明の多重特異的な分子の好適な例として、二重特異的な分子を挙げることができる。「二重特異的」とは、同一分子の2つの互いに異なるエピトープ又は2つ分子上の互いに異なるエピトープに結合することが可能であることを意味し、このような二重特異性を有する抗体又は抗原結合性断片を包含する。本発明の二重特異的な分子は、CD3に結合し、且つCD3は有さず他の抗原にあるエピトープに結合する。より具体的には、かかる二重特異的な分子は、(i)CD3上のあるエピトープ(エピトープ1)に結合し、且つ、(ii)CD3にあるエピトープ1とは異なるエピトープ(エピトープ2)に結合するか、又は、CD3以外の抗原にあるエピトープ(エピトープ3)に結合する。
IgG型の二重特異性分子では、異なるエピトープに結合する2種のFabが、二量体のFcの一方とそれぞれリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている。IgG型の二重特異性分子を、以下、Full−Size Antibody(FSA)型二重特異性分子、又は単にFSA型とも記す。
あるいは、本発明の二重特異性分子として、異なるエピトープに結合するFabとscFvが、二量体のFcの一方とそれぞれリンカーにて連結され又はリンカーなしで直接結合されている二重特異性抗体であってもよい。あるいは二量体のFcの一方に第一の抗体のFab,もう一方に第二の抗体のscFvをリンカーを介して結合させた二重特異性分子であっても良い。このような二重特異性分子を、以下Hybrid型二重特異性分子、又はHybrid型とも記す。
(3−7)ヒト化抗CD3抗体
本発明はその一つの態様において、ヒト化抗CD3抗体又はその抗原結合性断片を提供する。
配列番号26(図24)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1(GVTFNYYG)、
配列番号98(図112)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2(ITXaaXaaGGRI)(ここで、1番目のXaaと2番目のXaaは、それぞれ、任意の天然のアミノ酸残基である。以下、CDRH2の1番目のXaaをX1、2番目のXaaを、それぞれX1、X2とも記す。)、
及び、
配列番号28(図26)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3(TLDGRDGWVAY)を保有している。
配列番号29(図27)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1(TGNIGSNY)、
配列番号99(図113)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2(RXaaD)(ここで、Xaaは、任意の天然のアミノ酸残基である。以下、CDRL2のXaaをX3とも記す。)、
及び、
配列番号31(図29)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3(QSYSSGFI)を保有している。
上述のCDRL2(RX3D)において、好ましくは、X3は、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される。
上述のCDRL2(RX3D)において、更に好ましくは、X3は、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される。
配列番号100(図114)に示されるアミノ酸残基を含む重鎖可変領域を挙げることができる。
配列番号101(図115)、配列番号102(図116)、配列番号103(図117)に示されるアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を挙げることができる。
配列番号26(図24)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH1(GVTFNYYG)、
配列番号27(図25)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH2(ITNSGGRI)、及び
配列番号28(図26)に示されるアミノ酸配列からなるCDRH3(TLDGRDGWVAY)を保有している重鎖可変領域が挙げられる。
配列番号29(図27)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL1(TGNIGSNY)、
配列番号30(図28)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL2(RDD)、及び
配列番号31(図29)に示されるアミノ酸配列からなるCDRL3(QSYSSGFI)を保有している軽鎖可変領域が挙げられる。
配列番号60の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号60の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号64の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号64の135乃至241のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号66の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号66の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号68の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号68の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号70の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号70の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号72の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号72の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号74の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号74の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号76の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号76の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号78の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号78の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号80の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号80の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号82の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号82の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号84の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号84の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。
配列番号19の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号22の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号25の2乃至241番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片を挙げることができる。
配列番号60(図68)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7078)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号64(図72)の1乃至241番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7085)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号66(図74)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7086)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号68(図76)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7087)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号70(図78)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7088)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号72(図80)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7089)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号74(図82)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7090)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号76(図84)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7091)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号78(図86)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7092)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号80(図88)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7093)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号82(図90)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7094)又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号84(図92)の1乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体(Clone ID:C3E−7095)又は該抗体の抗原結合性断片
を挙げることができる。
配列番号22の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号25の2乃至267のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号60の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号64の2乃至267のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号66の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号68の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号70の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号72の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号74の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号76の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号78の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号80の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号82の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、又は、
配列番号84の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を含む前記(16に記載の抗原又は該抗体の抗原結合性断片が挙げられる。
本発明の提供する抗体等と「同一の部位に結合し、且つカニクイザルCD3にも結合する抗体」も本発明の抗体等に含まれる。ある抗体と「同一の部位に結合する抗体」とは、該抗体が認識する抗原分子上の部位に結合する他の抗体を意味する。第一抗体が結合する抗原分子上の部分ペプチド又は部分立体構造に第二抗体が結合すれば、第一抗体と第二抗体は同一の部位に結合すると判定することができる。
(3−9)抗CD3抗体又はその抗原結合性断片の修飾体
本発明は、抗体又はその抗原結合性断片の修飾体を提供する。本発明の抗体又はその抗原結合性断片の修飾体とは、本発明の抗体又はその抗原結合性断片に化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、N−結合又はO−結合炭水化物鎖の化学修飾体等が含まれる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾(例えば、N−結合又はO−結合への糖鎖付加、アミノ末端領域又はカルボキシル末端領域のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化)されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりアミノ末端にメチオニン残基が付加したもの等が含まれる。また、本発明の抗体又は抗原の検出又は単離を可能にするために標識されたもの、例えば、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティー標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。このような本発明の抗体又はその抗原結合性断片の修飾物は、元の本発明の抗体又はその抗原結合性断片の安定性及び血中滞留性の改善、抗原性の低減、かかる抗体又は抗原の検出又は単離等に有用である。
しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター抗原結合性(補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など)にはあまり影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体及び当該抗体の抗原結合性断片も含まれ、重鎖カルボキシル末端において1又は2つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体(例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖)、重鎖又は軽鎖のアミノ末端残基がピログルタミル化された抗体等も含まれる(それらをまとめて「欠失体」と呼ぶ)。但し、抗原結合能の全部又は一部が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖及び軽鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体が2本以上の鎖(例えば重鎖)を含む場合、当該2本以上の鎖(例えば重鎖)は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか2種以上を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比又は分子数比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件等の影響を受け得るが、本発明に係る抗体の欠失体としては、例えば、2本の重鎖の双方でカルボキシル末端の1つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。これらも全て本発明の抗体変異体、抗体の抗原結合性断片又はそれらの修飾体の意味に包含される。
4.抗体の製造
(4−1)ハイブリドーマを用いる方法
本発明の一つの態様として、抗CD3抗体は、例えば、コーラーとミルスタインの方法(Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495−497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365−367,Plenum Press,N.Y.(1980))に従って、CD3蛋白質で免疫した動物の脾臓より抗CD3抗体の産生細胞を単離し、該細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、かかるハイブリドーマの培養物からモノクローナル抗体を取得することができる。
(4−1−1)抗原の調製
抗CD3抗体を作製するための抗原は、天然型又は組換え型のCD3蛋白質(ヒトCD3εγ一本鎖抗原)の調製法等に従って取得することができる。そのようにして調製し得る抗原としては、CD3蛋白質若しくはCD3蛋白質断片、又はそれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体等(以下、まとめて「CD3」とよぶ)を挙げることができる。
(4−1−2)抗CD3モノクローナル抗体の製造
モノクローナル抗体の製造は、通常、下記のような工程を経る。
(a)抗原を調製する工程、
(b)抗体産生細胞を調製する工程、
(c)骨髄腫細胞(以下、「ミエローマ」という)を調製する工程、
(d)抗体産生細胞とミエローマとを融合させる工程、
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群を選別する工程、及び
(f)単一細胞クローンを得る工程(クローニング)。
(a)抗原を調製する工程
本発明のCD3蛋白質は、動物組織(体液を含む)、該組織由来の細胞もしくは該細胞培養物からの精製及び単離、遺伝子組換え、無細胞蛋白質合成、化学合成等により調製することができる。
(b)抗体産生細胞を調製する工程
工程(a)で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
(c)ミエローマを調製する工程
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の限定はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができるが、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT(Hypoxanthine−guanine phosphoribosyl transferase)欠損株、すなわちマウス由来のX63−Ag8(X63)、NS1−ANS/1(NS1)、P3X63−Ag8.Ul(P3Ul)、X63−Ag8.653(X63.653)、SP2/0−Ag14(SP2/0)、MPC11−45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等、ラット由来の210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、ヒト由来のU266AR(SKO−007)、GM1500・GTG−A12(GM1500)、UC729−6、LICR−LOW−HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4−1(NP41)等を用いるのが好ましい。これらのHGPRT欠損株は例えば、American Type Culture Collection (ATCC)等から入手することができる。
(d)抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させる工程
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)、Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Spigfield,Illinois(1964)等)に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で実施することができる。例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群を選別する工程
細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)選択法(Kohler et al.,Nature(1975)256,495;Milstein et al.,Nature(1977)266,550)が用いられる。この方法は、アミノプテリンで生存し得ないHGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをHAT培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
(f)単一細胞クローンを得る工程(クローニング)
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えば、メチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができるが(例えば、Barbara, B.M. and Stanley, M.S.:Selected Methods in Cellular Immunology,W.H. Freeman and Company,San Francisco(1980))、好適には限界希釈法である。
(g)ハイブリドーマの培養工程、ハイブリドーマを移植した動物の飼育工程
選択されたハイブリドーマを培養することにより、モノクローナル抗体を産生することができるが、好適には所望のハイブリドーマをクローニングしてから抗体の産生に供する。
(h)モノクローナル抗体の生物活性の測定工程・判定工程
各種生物試験を目的に応じて選択し、適用することができる。
(4−2)細胞免疫法
天然型のCD3を発現する細胞、組換え型CD3又はその断片を発現する細胞等を免疫原として使用することにより、前記のハイブリドーマ法により抗CD3抗体を調製することができる。
(4−3)DNA免疫法
本発明の抗CD3抗体は、DNA免疫法を使用して得ることもできる。抗原発現プラスミドをマウスやラットなどの動物個体に遺伝子導入し、抗原を個体内で発現させることによって、抗原に対する免疫を誘導する。遺伝子導入の手法には、直接プラスミドを筋肉に注射する方法や、リポソームやポリエチレンイミンなどの導入試薬を静脈注射する方法、ウイルスベクターを用いる手法、プラスミドを付着させた金粒子をGene Gunにより射ち込む手法、急速に大量のプラスミド溶液を静脈注射するHydrodynamic法などが存在する。
本発明の抗体は、その重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド(重鎖ヌクレオチド)及びその軽鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド(軽鎖ヌクレオチド)、又は、かかる重鎖ヌクレオチドが挿入されたベクター及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されたベクターを宿主細胞に導入し、該細胞を培養した後その培養物からかかる抗体を回収することにより調製することができる。一つのベクターに重鎖ヌクレオチド及び軽鎖ヌクレオチドが挿入されていてもよい。
(4−5)ヒト化抗体のデザイン法及び調製法
ヒト化抗体としては、非ヒト動物抗体のCDRのみがヒト由来の抗体に組込まれ抗体(Nature(1986)321,p.522−525参照)、CDR移植法によりCDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体(WO90/07861号、US6972323号公報参照)、それらのいずれかにおける非ヒト動物抗体の1つ又は2つ以上のアミノ酸がヒト型のアミノ酸で置換されてなる抗体等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
(4−6)ヒト抗体の調製法
本発明の抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。ヒト抗CD3抗体とは、ヒト由来の抗体のアミノ酸配列からなる抗CD3抗体を意味する。ヒト抗CD3抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒトゲノムDNA断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,133−143,; Kuroiwa,Y.et.al.,Nuc.Acids Res.(1998)26,3447−3448;Yoshida, H.et.al.,Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10,69−73(Kitagawa, Y.,Matuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,722−727等を参照。)によって取得することができる。
(4−7)抗体の抗原結合性断片の調製法
scFvを作成する方法は当技術分野において周知である(例えば、米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,513号、米国特許第5,455,030号等を参照)。このscFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される(Huston,J.S.et al.,PNAS(1988),85,5879−5883)。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
(4−8)抗体及び抗体の抗原結合性断片の精製
得られた抗体及び抗体の抗原結合性断片は、該抗体等以外を含まないよう均一に精製することができる。抗体及び抗体の抗原結合性断片の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。
(4−9)多重特異性分子、二重特異性分子
本発明の二重特異性分子及び多重特異的分子は、宿主細胞へ発現プラスミドを導入し、一過性で発現させる方法、宿主細胞にプラスミドを導入後、薬剤選択により安定発現細胞株を選び、恒常的に発現させる方法、無細胞的に合成する方法、それぞれの抗体あるいは抗原結合性断片を上記の方法で作製後、合成ペプチドリンカーを用いて化学的に結合させる方法が挙げられる。
5.医薬組成物
本発明は抗CD3抗体、その抗原結合性断片あるいはその修飾体、及び/又は、それらを含む本発明の分子、例えば、多重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。
医薬組成物の形態としては、注射剤(凍結乾燥製剤、点滴剤を含む)、坐剤、経鼻型吸収製剤、経皮型吸収製剤、舌下剤、カプセル、錠剤、軟膏剤、顆粒剤、エアーゾル剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
(実施例1)ラット抗ヒトCD3抗体の作製
1)−1 ヒトCD3εδ発現ベクターの構築
Gateway Vector Conversion System(Thermo Fisher Scientific社)によりDestination Vectorに改変したコントロールベクターpcDNA3.1−DESTを作製した。図1(配列番号1)に示すヒトCD3ε蛋白質(NCBI Reference Sequence: NP_000724.1)をコードするcDNAはSino Biologicalより購入し、Gateway LR Clonase Enzyme mix(Thermo Fisher Scientific社)を用いて、pcDNA3.1−DESTベクターにクローニングしhCD3ε−pcDNA3.1を構築した。図2(配列番号2)に示すヒトCD3δ蛋白質(NP_000723.1)をコードするcDNAは、当業者に公知な方法に従いヒトT細胞由来cDNAを鋳型としたPCR法により増幅し、pcDNA3.1(+)(Thermo Fisher Scientific社)にクローニングすることで発現ベクターhCD3δ−pcDNA3.1を構築した。各発現ベクターの大量調製には、Endofree Plasmid Giga Kit(QIAGEN社)を用いた。
1)−2 免疫
免疫にはWKY/Izmラットの雌(日本エスエルシー社)を使用した。まずラット両足下腿部をHyaluronidase(SIGMA−ALDRICH社)にて前処理後、同部位に実施例1)− 1で作製したhCD3ε−pcDNA3.1及びhCD3δ−pcDNA3.1発現ベクターを筋注した。続けて、ECM830(BTX社)を使用し、2ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。約二週間に一度、同様のインビボエレクトロポレーションを繰り返した後、ラットのリンパ節又は脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
1)−3 ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマSP2/0−ag14細胞(ATCC, No.CRL−1 581)とをLF301 Cell Fusion Unit(BEX社)を用いて電気細胞融合し、ClonaCell−HY Selection Medium D(StemCell Technologies社)に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーをClonaCell−HY Selection Medium E(StemCell Technologies社)を用いて培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗ヒトCD3抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
1)−4 Cell−ELISA法による抗体スクリーニング
1)−4−1 Cell−ELISA用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK293α細胞(インテグリンαv及びインテグリンβ3を発現するHEK293由来の安定発現細胞株) を10% FBS含有DMEM培地中7.5×105細胞/mLになるよう調製した。それに対し、Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific社)を用いた形質移入手順に従い、hCD3ε−pcDNA3.1及びhCD3δ−pcDNA3.1、もしくはコントロールとしてpcDNA3.1−DESTを導入し、96−well plate(Corning社)に100μLずつ分注し、10%FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Cell−ELISAに使用した。
1)−4−2 Cell−ELISA
実施例1)− 4− 1で調製した発現ベクター導入HEK293α細胞の培養上清を除去後、hCD3ε−pcDNA3.1及びhCD3δ−pcDNA3.1、又はpcDNA3.1−DEST導入HEK293α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBSで1回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG, HRP−Linked Whole Ab Goat(GE Healthcare Bioscience社)を加えて、4℃で1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、OPD発色液(OPD溶解液(0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5)にo−フェニレンジアミン二塩酸塩(和光純薬社)、H2O2をそれぞれ0.4mg/mL、0.6%(v/v)になるように溶解)を100μL/wellで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを100μL/wellを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー(ENVISION:PerkinElmer社)で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するヒトCD3に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのpcDNA3.1−DEST導入HEK293α細胞と比較し、hCD3ε−pcDNA3.1及びhCD3δ−pcDNA3.1発現ベクター導入HEK293α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ヒトCD3抗体産生陽性として選択した。
1)−5 ヒトT細胞活性化による抗体スクリーニング
得られたハイブリドーマが産生する抗CD3抗体によるT細胞の活性化を、CD69活性化マーカーの検出を指標に評価した。ヒトT細胞株であるJurkat細胞(ATCC,No.TIB−152)を、FBS含有RPMI1640培地中5×106細胞/mLの濃度に調製して、96−well plateに100μLずつ播種した。遠心して上清を除去したJurkat細胞に、実施例1)−4のCell−ELISAで抗ヒトCD3抗体産生陽性として選択したハイブリドーマの培養上清、あるいはラットIgGアイソタイプコントロール抗体(R&D Systams社)終濃度5μg/mLを添加し、37℃で30分間静置した。その後、クロスリンカーGoat Anti−rat IgG FcγFragment specific(JACKSON IMMUNORESEARCH社)を終濃度10μg/wellで添加し37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、上清を除去し、well中の細胞を5% FBS含有PBSで1回洗浄後、PE Mouse Anti−Human CD69抗体(BD Bioscience社)を20μL/well添加して4℃で30分間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター(FC500:BeckmanCoulter社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(Treestar社)で行った。PE蛍光強度のヒストグラムを作成し、ラットIgGアイソタイプコントロール抗体の蛍光強度ヒストグラムに対しPEの蛍光強度のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをヒトT細胞活性化能陽性抗ヒトCD3抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
1)−6 フローサイトメトリーによるヒト又はサルCD3への選択的結合性スクリーニング
1)−6−1 ヒト抗原遺伝子発現細胞の調製
Lenti−X293T細胞(TAKARA社,Cat#632180)を5.3×104細胞/cm2になるよう225cm2フラスコに播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、hCD3ε−pcDNA3.1及びhCD3δ−pcDNA3.1又は、コントロールとしてpcDNA3.1−DESTをそれぞれLenti−X293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5%CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入Lenti−X293T細胞をTrypLE Express(Thermo Fisher Scientific社)で処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSで5×106細胞/mLの濃度に調製した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
1)−6−2 ヒトCD3への結合性フローサイトメトリー解析
実施例1)−5でヒトT細胞活性化能陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトCD3に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例1)−6−1で調製したLenti−X293T細胞懸濁液を100μL/wellで96−well U底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。hCD3ε−pcDNA3.1及びhCD3δ−pcDNA3.1導入Lenti−X293T細胞及びpcDNA3.1−DEST導入Lenti−X293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで1回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugate(SIGMA社)を加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin D(Molecular Probes社)を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーターで検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1−DEST導入Lenti−X293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しhCD3ε−pcDNA3.1及びhCD3δ−pcDNA3.1導入Lenti−X293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをヒトCD3に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
1)−6−3 サルCD3εδ発現ベクターの構築
サルCD3ε蛋白質(NCBI Reference Sequence: NP_001270544.1)及びサルCD3δ蛋白質(NCBI Reference Sequence: NP_001274617.1)をコードするcDNAは、当業者に公知な方法に従いサルT細胞由来cDNAを鋳型としたPCR法により増幅し、pcDNA3.1(+)(Thermo Fisher Scientific社)にクローニングすることで発現ベクターcynoCD3ε−pcDNA3.1及びcynoCD3δ−pcDNA3.1を構築した。
1)−6−4 サル抗原遺伝子発現細胞の調製
Lenti−X293T細胞を5.3×104細胞/cm2になるよう225cm2フラスコに播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5%CO2の条件下で一晩培養した。翌日、cynoCD3ε−pcDNA3.1及びcynoCD3δ−pcDNA3.1又は、コントロールとしてpcDNA3.1−DESTをそれぞれLenti−X293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5% CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入Lenti−X293T細胞をTrypLE Expressで処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSで5×106細胞/mLの濃度に調製した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
1)−6−5 サルCD3への結合性フローサイトメトリー解析
実施例1)−6−2でヒトCD3に結合する抗体産生ハイブリドーマと判定されたハイブリドーマが産生する抗体のサルCD3に対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例1)−6−4で調製したLenti−X293T細胞懸濁液を100μL/wellで96−well U底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。cynoCD3ε−pcDNA3.1及びcynoCD3δ−pcDNA3.1導入Lenti−X293T細胞及びpcDNA3.1−DEST導入Lenti−X293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで1回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin Dを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーターで検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1−DEST導入Lenti−X293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しcynoCD3ε−pcDNA3.1及びcynoCD3δ−pcDNA3.1導入Lenti−X293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをサルCD3に結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
1)−6−6 ヒトCD3δ遺伝子発現細胞の調製
Lenti−X293T細胞を5.3×104細胞/cm2になるよう225cm2フラスコに播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37℃、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、hCD3δ−pcDNA3.1又は、コントロールとしてpcDNA3.1−DESTをそれぞれLenti−X293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37℃、5%CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入Lenti−X293T細胞をTrypLE Expressで処理し、10% FBS含有DMEMで細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSで5×106細胞/mLの濃度に調製した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
1)−6−7 ヒトCD3δへの結合性フローサイトメトリー解析
実施例1)−6−5でサルCD3に結合する抗体産生ハイブリドーマと判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトCD3δに対する結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。実施例1)−6−6で調製したLenti−X293T細胞懸濁液を100μL/wellで96−well U底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。hCD3δ−pcDNA3.1導入Lenti−X293T細胞及びpcDNA3.1−DEST導入Lenti−X293T細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで1回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin Dを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーターで検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1−DEST導入Lenti−X293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しhCD3δ−pcDNA3.1導入Lenti−X293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをヒトCD3δに結合する抗体産生ハイブリドーマとして除外した。
1)−6−8 サルT細胞株への結合性フローサイトメトリー解析
実施例1)−6−7で除外されなかった抗体産生ハイブリドーマが産生する抗体のサルT細胞株への結合特異性をフローサイトメトリー法によりさらに確認した。カニクイザルT細胞株であるHSC−F(JCRB細胞バンク,No.JCRB1164)を、FBS含有RPMI1640培地中5×106細胞/mLの濃度に調製して、96−well plateに100μLずつ播種した。遠心して上清を除去したHSC−F細胞に、実施例1)−5− 7で除外されなかった抗体産生ハイブリドーマの培養上清、あるいはラットIgGアイソタイプコントロール抗体を添加し、4℃で1時間静置した。その後、上清を除去し、well中の細胞を5% FBS含有PBSで1回洗浄後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti−Rat IgG FITC conjugateを加えて懸濁し、4℃で1時間静置した。5% FBS含有PBSで3回洗浄した後、2μg/ml 7−aminoactinomycin Dを含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーターで検出を行った。データ解析はFlowjoで行った。7−aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成し、ラットIgGアイソタイプコントロール抗体の蛍光強度ヒストグラムに対しFITCの蛍光強度のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしているサンプルを産生するハイブリドーマをサルT細胞株にも結合する抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
1)−7 抗体のアイソタイプ決定
実施例1)−6で取得したラット抗CD3抗体産生ハイブリドーマの中から、ヒト及びサルCD3εに結合し、サルT細胞株にも結合、ならびに高いヒトT細胞活性化能を有することが示唆されたC3−147を選抜し、抗体アイソタイプを同定した。アイソタイプは、Rat Immunoglobulin Isotyping ELISA Kit(BD Pharmingen社)により決定された。その結果、ラット抗CD3モノクローナル抗体C3−147のアイソタイプはIgG2b、λ鎖であることが確認された。
(実施例2)ラット抗CD3モノクローナル抗体(C3−147)のヒトCD3への結合性検討
2)−1 ハイブリドーマ上清からのモノクローナル抗体の調製
2)−1−1 C3−147を産生するハイブリドーマの培養
ラット抗CD3モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。まず、C3−147産生ハイブリドーマをClonaCell−HY Selection Medium E(StemCell Technologies社)で十分量まで増殖させた後、Ultra Low IgG FBS(Thermo Fisher Scientific社)を20%添加した、5μg/mLのゲンタマイシン(Thermo Fisher Scientific社)含有Hybridoma SFM(Thermo Fisher Scientific社)に培地交換し、7日間培養した。本培養上清を回収し、0.22μmのフィルター(Corning社)を通して滅菌した。
2)−1−2 精製
実施例2)−1−1で調製したハイブリドーマの培養上清から抗体をProtein Gアフィニティークロマトグラフィーで精製した。Protein Gカラム(GE Healthcare Bioscience社)に抗体を吸着させ、PBSでカラムを洗浄後に0.1M グリシン/塩酸水溶液(pH2.7)で溶出した。溶出液に1M Tris−HCl(pH9.0)を加えてpH7.0〜7.5に調整した後に、Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF30K、Sartorius社)にてPBSへのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を2mg/mLに調製した。最後にMinisart−Plus filter(Sartorius社)でろ過し、精製サンプルとした。
2)−2 取得ラット抗CD3抗体(C3−147)のヒト一本鎖抗原への結合
2)−2−1 ヒトCD3εγ一本鎖抗原の調製
CD3εあるいはCD3γをコードするアミノ酸配列は蛋白質データバンクに投稿されたOTK3−ヒトCD3εγ一本鎖抗原複合体の結晶構造(PDBID:1SY6)において用いられた配列を用いた。CD3εのカルボキシル末端とCD3γのアミノ末端をつなぐリンカーは参考文献(Kim,K.S.et al., (2000)J.Mol.Biol. 302,899−916)で報告されたものと同じ26アミノ酸から成るペプチドリンカーを用いた。図3(配列番号4)に示すヒトCD3εγ一本鎖抗原をコードする遺伝子は5‘末端、3’末端それぞれに制限酵素サイトBamHI、Hind IIIを付加させて合成した(GENEART社)。プラスミドpQE80L(Qiagen社)を制限酵素BamHI、Hind IIIで消化して得られる約4.8kbのフラグメントと、ヒトCD3εγ一本鎖抗原遺伝子をBamHI、Hind IIIで消化して得られる約0.6kbのフラグメントをLigation high(東洋紡)を用いて結合させ、大腸菌発現用プラスミドpQE80L−scCD3εγを作製した。生成するscCD3εγのアミノ酸配列は、図4(配列番号5)に記載されている。発現用大腸菌BL21(DE3)を発現用プラスミドpQE80L−scCD3εγで形質転換し、得られたコロニーを1L MagicMedia(Invitrogen社)/Ultrayieldフラスコ(Thomson社)に植菌し、30℃、250 rpmで21時間振盪培養した。培養後の菌体を回収し、1%Triton溶液を含むTris緩衝液存在下で超音波ホモジナイザーによる菌体破砕と凍結融解を繰り返し、最終的に4℃、15000 rpm、15分間遠心して、インクルージョンボディを回収した。インクルージョンボディーからの巻き戻しから精製までは参考文献(Kjer−Nielsen et al.(2004) PNAS vol. 101, no. 20,7675−7680)の手法に従って行なった。ただし、抗体カラムに用いた抗CD3抗体は文献で用いられた2C11ではなく、マウス抗CDモノクローナル抗体OKT3(Sgro、Toxicology 105(1995)、23〜29、Orthoclone、Janssen−Cilag社)を用いた。
2)−2−2 SPRによるヒトCD3εγ一本鎖抗原への結合性
抗体と抗原との結合は、Biacore 3000(GE Healthcare Bioscience社)を使用し、固定化した抗マウスIgG抗体に抗体をリガンドとして捕捉(キャプチャー)し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて測定した。抗原には、2)−2−1にて調製したヒトCD3εγを使用した。抗マウスIgG抗体(Mouse Antibody Capture Kit、GE Healthcare Bioscience社)は、センサーチップCM5(GE Healthcare Bioscience社)へアミンカップリング法にて約11000RU共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてHBS−EP+(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05%Surfactant P20)を用いた。抗マウスIgG抗体を固定化したチップ上に、抗体を約1分間添加しリガンドとして捕捉した後、100nMの抗原を流速30μl/分で120秒間添加し、抗原の結合をモニターした。再生溶液として、10mM glycine−HCl pH1.7を流速10μl/分で3分間添加した。その結果、C3−147では、120秒後の結合シグナルは34RUであった。
2)−3 SPRによる取得ラット抗CD3抗体(C3−147)の抗原結合部位の確認
抗原結合部位の確認方法は、2)−2−2に準じた。その結果、C3−147では、34RUの結合シグナルを得た。一方、比較例として、公知の抗CD3抗体であるSP34(BD Pharmingen社)についても同様に抗原結合部位の確認を行った。SP34では、34RUの結合シグナルが見られなかった。従って、C3−147が認識するCD3εγ表面の結合部位は、SP34とは異なることが示された。
(実施例3) ラット抗CD3抗体(C3−147)の可変領域をコードするcDNAの塩基配列の決定
ラット抗CD3抗体(C3−147)の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列は、以下の方法により決定した。
3)−1 cDNA合成
ラット抗CD3抗体(C3−147)産生ハイブリドーマの細胞溶解液(50mM Tris−HCl(pH7.5)、250mM LiCl、5mM EDTA(pH8)、0.5%ドデシル硫酸Li(LiDS)、2.5mM dithiothreitol(DTT))を、オリゴdT25が結合したDynabeads mRNA DIRECT Kit(Thermo Fisher Scientific社)の磁気ビーズと混合し、mRNAを磁気ビーズに結合させた。次に磁気ビーズをmRNA洗浄溶液A(10mM Tris−HCl(pH7.5)、0.15M LiCl、1mM EDTA、0.1% LiDS、0.1% TritonX−100)とcDNA合成用溶液(50mM Tris−HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM dNTP、0.2% TritonX−100、1.2unit RNase inhibitor(Thermo Fisher Scientific社)で1回ずつ洗浄した後、12unit SuperScriptIII Reverse Transcriptase(Thermo Fisher Scientific社)を加えたcDNA合成用溶液でcDNA合成を行った。続いて3’テーリング反応溶液(50mM リン酸カリウム、4mM MgCl2、0.5mM dGTP、0.2% TritonX−100、1.2unit RNase inhibitor)で洗浄した後、48unit Terminal Transferase, recombinant(Roche社)を加えた反応溶液で3’テーリング反応を行った。
3)−2 ラット免疫グロブリン重、軽鎖可変領域遺伝子断片の増幅及び配列決定
磁気ビーズをTE溶液(10mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.1% TritonX−100)にて洗浄後、5’−RACE PCR法を用いてラット免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子の増幅を行った。即ち、磁気ビーズをPCR反応溶液(0.2μM プライマー、0.2mM dNTP、0.25unit PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA社))に移し、94℃ 30秒−68℃ 90秒の反応を35サイクル行った。用いたプライマーセットは下記の通りである。
重鎖遺伝子増幅用 PCRプライマーセット
センスプライマー Nhe−polyC−S
5’−GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN−3’図5(配列番号50)
1回目アンチセンスプライマー rIgγ−AS1
5’−TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC−3’図6(配列番号51)
2回目アンチセンスプライマー rIgγ−AS2
5’−TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC−3’図7(配列番号52)
軽鎖遺伝子増幅用 PCRプライマーセット
センスプライマー Nhe−polyC−S2
5’−GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN−3’図8(配列番号53)
1回目アンチセンスプライマー rIgL−AS1
5’−TTCCACATCACTCGGGTAGAAATCAG−3’図9(配列番号54)
2回目アンチセンスプライマー rIgγ−AS2
5’−TAACACCAGGGTAGAAATCTGTCACCAT−3’図10(配列番号55)
上記PCR反応により増幅した断片について、塩基配列のシーケンス解析を実施した。
用いたプライマーは下記の通りである。
重鎖シーケンス用センスプライマー rIgγ−seq
5’−CTGGCTCAGGGAAATAGCC−3’図11(配列番号56)、
軽鎖用シーケンス用アンチセンスプライマー rIgL−seq1
5’−TCCCTGGAGCTCCTCAGT−3’図12(配列番号57)
軽鎖用シーケンス用アンチセンスプライマー rIgL−seq2
5’−GCCTTGTCAGTCTTGAGC−3’図13(配列番号58)
シークエンス解析は遺伝子配列解析装置(「ABI PRISM 3700 DNA Analyzer;Applied Biosystems」あるいは「Applied Biosystems 3730xl Analyzer;Applied Biosystems」)を用いて実施し、シークエンス反応は、Dye Terminator Cycle Sequencing System with AmpliTaq DNA polymerase(Life Technologies社)及びGeneAmp 9700(Applied Biosystems社)を用いた。
シーケンス解析により決定されたC3−147重鎖可変領域の塩基配列を図14(配列番号6)、アミノ酸配列を図15(配列番号7)、C3−147軽鎖可変領域の塩基配列を図16(配列番号8)、アミノ酸配列を図17(配列番号9)にそれぞれ記す。
(実施例4) ラット抗CD3 scFv(C3E−7000)、及びそのヒト化体(C3E−7034)の作製
4)−1 ラット抗CD3抗体(C3−147) scFvの作製
4)−1−1 ラット抗体CD3 scFv発現ベクター(pC3E−7000)の構築
C3−147重鎖可変領域(VH)と軽鎖可変領域(VL)の間に挿入するリンカーをコードするDNA配列の前後に15塩基の付加配列を有するDNA断片のセンス鎖オリゴヌクレオチド図18(配列番号10)及び、そのアンチセンス鎖オリゴヌクレオチド図19(配列番号11)を合成し(Sigma Aldrich社 カスタムオリゴ受託合成サービス)、100 pmol/μLに調整した後、それぞれ20μLずつ混合し、96℃で10分、70℃で2分、60℃で2分、40℃で2分、30℃で2分静置することにより、両者をアニーリングさせVHとVLの間に挿入するリンカー断片を作製した。次に動物細胞発現ベクターpcDNA−3.3TOPO(Thermo Scientific社)由来のベクター骨格にヒトIgG重鎖シグナル配列を付加するようにPCRで増幅したDNA断片と、図14(配列番号6)に示すラット抗CD3抗体C3−147のVHをPCRで増幅したDNA断片、VHとVLの間に挿入するリンカー断片、図16(配列番号8)に示すC3−147のVLを含む領域にFLAG−HisタグをコードするDNA配列をカルボキシル末端に付加させPCRで増幅したDNA断片をIn−Fusion HD クローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合させ、図20(配列番号14)のヌクレオチド配列をORFに含むscFv発現ベクターpC3E−7000を作製した。
4)−1−2 ラット抗CD3 scFv(C3E−7000)の発現・精製
Expi293F細胞(Thermo Scientific社)はマニュアルに従い、継代、培養を行った。対数増殖期のExpi293F細胞に上記のscFv発現ベクターを導入して一過性発現させ、フィルターろ過した後、精製に用いた。精製はHis Trap excel(GE Healthcare社)を用いたNiアフィニティークロマトグラフィーと、Superdex 200 increase (GE Healthcare社)を用いたゲルろ過の2段階工程で行い、scFvモノマー分子量に相当するピークを回収し、精製蛋白質サンプルとした。精製にはAKTAクロマトグラフィーシステムを用い、全ての工程を4℃下で行なった。精製蛋白質のバッファーはHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH5.0)を用いた。精製蛋白質サンプルは分析用SECに供し、純度と濃度を決定したのち、各種アッセイに用いた。C3E−7000のアミノ酸配列は、図21(配列番号15)に記載されている。
4)−2 ラット抗CD3 scFv(C3E−7000)のヒト化
4)−2−1 抗CD3抗体のヒト化設計
ラット抗体の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法(Methods in Enzymology,203,121−153,(1991))に従い、市販の蛋白質立体構造解析プログラムDiscovery Studio3.5(Dassault Systems社)を用いて行った。
4)−2−2 C3E−7000のヒト化アミノ酸配列の設計
実施例4)−2−1に記載の手法に基づき、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のγ3及びλ6をアクセプターとして、C3E−7000のヒト化体となるC3E−7034のアミノ酸配列を設計した。図15(配列番号7)に示されるC3−147VHのアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号16番目のアルギニンをグリシンに、アミノ酸番号17番目のアラニンをセリンに、アミノ酸番号19番目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号23番目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号24番目のバリンをアラニンに、アミノ酸番号88番目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号93番目のスレオニンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたC3E−7034VHのアミノ酸配列は、図22(配列番号16)に記載されている。
IMGTのCDR定義におけるC3E−7000及びC3E−7034のCDR配列はそれぞれ、CDR−H1は図24(配列番号26)に、CDR−H2は図25(配列番号27)に、CDR−H3は図26(配列番号28)に、CDR−L1は図27(配列番号29)に、CDR−L2は図28(配列番号30)に、CDR−L3は図29(配列番号31)に記載されている。
4)−2−3 ヒト化抗CD3 scFvC3E−7034の改変
サルCD3εへの交差性を維持しつつ、結合活性や細胞傷害性活性に差を有するバリアントを作製するために、C3E−7034のVLに対して、実施例4)−2−1に記載の手法と同様にVLのフレームワーク領域のアミノ酸を、scFvのVL(IGLV1−40*01にA2S, S8P, V13A, F80Lの4変異が入った配列)に置き換えたバリアントを設計した。
4)−2−3−1 C3E−7035のアミノ酸配列設計
C3E−7034の改変体となるC3E−7035のアミノ酸配列を設計した。図23(配列番号17)に示されるC3E−7034の軽鎖のうち可変領域のアミノ酸番号1番目のアスパラギンをグルタミンに、アミノ酸番号2番目のフェニルアラニンをアラニンに、アミノ酸番号3番目のメチオニンをバリンに、アミノ酸番号8番目のヒスチジンをセリンに、アミノ酸番号12番目のグルタミン酸をグリシンに、アミノ酸番号13番目のセリンをバリンに、アミノ酸番号16番目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号17番目のスレオニンをアルギニンに、アミノ酸番号40番目のヒスチジンをロイシンに、アミノ酸番号41番目のグルタミン酸をプロリンに、アミノ酸番号43番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号44番目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号46番目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号47番目のスレオニンをロイシンに、アミノ酸番号48番目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号57番目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号60番目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号67番目のイソロイシンをリジンに、アミノ酸番号68番目のアスパラギン酸を欠損に、アミノ酸番号69番目のアルギニンを欠損に、アミノ酸番号71番目のセリンをグリシンに、アミノ酸番号72番目のリジンをスレオニンに、アミノ酸番号77番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号79番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号80番目のアスパラギンをグリシンに、アミノ酸番号81番目のロイシンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号82番目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号83番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号90番目のフェニルアラニンをチロシンに、置き換えることを伴い設計されたC3E−7035軽鎖のアミノ酸配列は、図30(配列番号20)に記載されており、軽鎖の可変領域の直前にメチオニンとアラニンが挿入されたC3E−7035の全長配列は図31(配列番号22)に記載されている。
4)−2−3−2 C3E−7036のアミノ酸配列設計
C3E−7034の改変体となるC3E−7036のアミノ酸配列を設計した。図23(配列番号17)に示されるC3E−7034の軽鎖のうち可変領域のアミノ酸番号8番目のヒスチジンをセリンに、アミノ酸番号12番目のグルタミン酸をグリシンに、アミノ酸番号13番目のセリンをバリンに、アミノ酸番号16番目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号17番目のスレオニンをアルギニンに、アミノ酸番号23番目のリジンをスレオニンに、アミノ酸番号24番目のアルギニンをグリシンに、アミノ酸番号40番目のヒスチジンをロイシンに、アミノ酸番号41番目のグルタミン酸をプロリンに、アミノ酸番号43番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号44番目のセリンをアラニンに、アミノ酸番号46番目のスレオニンをリジンに、アミノ酸番号47番目のスレオニンをロイシンに、アミノ酸番号48番目のイソロイシンをロイシンに、アミノ酸番号57番目のアスパラギン酸をセリンに、アミノ酸番号60番目のセリンをプロリンに、アミノ酸番号67番目のイソロイシンをリジンに、アミノ酸番号68番目のアスパラギン酸を欠損に、アミノ酸番号69番目のアルギニンを欠損に、アミノ酸番号71番目のセリンをグリシンに、アミノ酸番号72番目のリジンをスレオニンに、アミノ酸番号77番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号79番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号80番目のアスパラギンをグリシンに、アミノ酸番号81番目のロイシンをフェニルアラニンに、アミノ酸番号82番目のリジンをグルタミンに、アミノ酸番号83番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号90番目のフェニルアラニンをチロシンに、置き換えることを伴い設計されたC3E−7036軽鎖のアミノ酸配列は、図32(配列番号23)に記載されており、C3E−7036の全長アミノ酸配列は図33(配列番号25)に記載されている。
4)−2−3−3 CDR改変体のアミノ酸配列設計
C3E−7034のCDRH2(図25、配列番号27)に存在する脱アミノ化部位を除去する目的で、図22(配列番号16)に示されるC3E−7034の重鎖可変領域のアミノ酸番号53番目のアスパラギンをアルギニンに置き換えたC3E−7078、およびセリンに置き換えたC3E−7079を設計した。また、C3E−7036の重鎖可変領域のアミノ酸番号53番目のアスパラギンをアルギニンに置き換えたC3E−7085を設計した。C3E−7078の全長アミノ酸配列は図_68(配列番号60)に、C3E−7079の全長アミノ酸配列は図70(配列番号62)に、C3E−7085の全長アミノ酸配列は図72(配列番号64)に記載されている。
さらにC3E−7078のヒトCD3親和性を低下させる目的で、C3E−7078の軽鎖可変領域のアミノ酸番号52番目のアスパラギン酸をグリシンに置き換えたC3E−7086、グルタミンに置き換えたC3E−7087、アスパラギンに置き換えたC3E−7088、セリンに置き換えたC3E−7089、アラニンに置き換えたC3E−7090を設計した。同様に、C3E−7079のヒトCD3親和性を低下させる目的で、C3E−7079の軽鎖可変領域のアミノ酸番号52番目のアスパラギン酸をグリシンに置き換えたC3E−7091、グルタミンに置き換えたC3E−7092、アスパラギンに置き換えたC3E−7093、セリンに置き換えたC3E−7094、アラニンに置き換えたC3E−7095を設計した。C3E−7086の全長アミノ酸配列は図74(配列番号66)に、C3E−7087の全長アミノ酸配列は図76(配列番号68)に、C3E−7088の全長アミノ酸配列は図78(配列番号70)に、C3E−7089の全長アミノ酸配列は図80(配列番号72)に、C3E−7090の全長アミノ酸配列は図82(配列番号74)に、C3E−7091の全長アミノ酸配列は図84(配列番号76)に、C3E−7092の全長アミノ酸配列は図86(配列番号78)に、C3E−7093の全長アミノ酸配列は図88(配列番号80)に、C3E−7094の全長アミノ酸配列は図90(配列番号82)に、C3E−7095の全長アミノ酸配列は図92(配列番号84)に記載されている。
4)−3 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−7034、C3E−7035, C3E−7036)の作製
4)−3−1 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−7034)発現ベクターpC3E−7034の構築
図22(配列番号16)に示すC3E−7034重鎖のカルボキシル末端に15アミノ酸フレキシブルリンカーを介して図23(配列番号17)に示すC3E−7034軽鎖を含む領域をつなげたscFvDNA配列、及び前後15塩基の付加配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。これを鋳型としてC3E−7034と前後の付加配列を含む領域をPCR法を用いて増幅し、インサートDNA断片を得た。また実施例4)−1−1で作製した発現ベクターpC3E−7000を鋳型として、scFv領域を除いたベクター領域をPCR法を用いて増幅し、ベクター断片を得た。それぞれのDNA断片をIn−Fusion HD クローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合させ、図34(配列番号18)のヌクレオチド配列をORFに含むヒト化抗CD3 scFv発現ベクターpC3E−7034を作製した。
4)−3−2 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−7035)発現ベクターpC3E−7035の構築
図22(配列番号16)に示すC3E−7034重鎖のカルボキシル末端に17アミノ酸から成るフレキシブルリンカーを介して図30(配列番号20)に示すC3E−7035軽鎖をつなげたscFvDNA配列及び前後15塩基の付加配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例4)−3−1と同様の方法で図35(配列番号21)のヌクレオチド配列をORFに含むC3E−7035発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pC3E−7035」と命名した。
4)−3−2 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−7036)発現ベクターpC3E−7036の構築
図22(配列番号16)に示すC3E−7034重鎖のカルボキシル末端に15アミノ酸から成るフレキシブルリンカーを介して図32(配列番号23)に示すC3E−7036軽鎖をつなげたscFvDNA配列及び前後15塩基の付加配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例4)−3−1と同様の方法で図36(配列番号24)のヌクレオチド配列をORFに含むC3E−7036発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pC3E−7036」と命名した。
4)−3−4CDR改変ヒト化抗体CD3 scFvの発現ベクターの構築
図34(配列番号18)に示すC3E−7034のヌクレオチド配列をORFに含むpC3E−7034を鋳型とし、図93、94(配列番号85、86)に示す塩基配列を有するプライマーを用いて、PCRを用いた部位特異的変異導入を行い、C3E−7034の重鎖可変領域のアミノ酸番号53番目のアスパラギンをアルギニンに置き換えたC3E−7078のヌクレオチド配列をORFに含むC3E−7078発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを「pC3E−7078」と命名した。同様にpC3E−7034を鋳型とし、図95、96(配列番号87、88)をプライマーとして、PCRを用いた部位特異的変異導入を行い、C3E−7034の重鎖可変領域のアミノ酸番号53番目のアスパラギンをセリンに置き換えたC3E−7079のヌクレオチド配列をORFに含むC3E−7079発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを「pC3E−7079」と命名した。同様にpC3E−7036を鋳型とし、図93,94(配列番号85、86)をプライマーとして、PCRを用いた部位特異的変異導入を行い、C3E−7036の重鎖可変領域のアミノ酸番号53番目のアスパラギンをアルギニンに置き換えたC3E−7085のヌクレオチド配列をORFに含むC3E−7085発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターを「pC3E−7085」と命名した。
C3E−7034、C3E−7035、C3E−7036の発現・精製は、実施例4)−1−2と同様の方法で行なった。
4)−3−6 CDR改変ヒト化抗CD3 scFvの発現・精製
C3E−7078、C3E−7079、C3E−7085、C3E−7086、C3E−7087、C3E−7088、C3E−7089、C3E−7090、C3E−7091、C3E−7092、C3E−7093、C3E−7094、C3E−7095の各CDR改変体の発現・精製は、実施例4)−1−2と同様の方法で行なった。
(実施例5) ヒト化抗CD3 scFv(C3E−7034)の結晶構造解析
5)−1 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−7034)−ヒトCD3εγ一本鎖抗原複合体の調製
実施例2)−2−1で作製したCD3εγと実施例4)−3−1で作製したC3E−7034をモル比1:2で混合し、AmiconUltra15 MWCO 10キロ(Millipore社)で10mM Tris HCl(pH7.5)、50mM NaClに緩衝液を置換し、3.5mg/mLに濃縮した。これをSuperdex200 10/300GL(GE Healthcare)を用いてゲルろ過クロマトグラフィーで精製し、複合体の画分をAmiconUltra15MWCO 10キロ(Millipore社)を用いて約4.0mg/mLに濃縮した。
5)−2 結晶化
得られたCD3εγとC3E−7034の複合体を蒸気拡散法により結晶化した。蛋白質溶液0.5μLに沈殿剤溶液(0.1M MES monohydrate(pH 6.5)、1.6M Ammonium sulfate、10% v/v 1,4−Dioxane)を等量加えた溶液を、0.05mLの沈殿剤溶液を入れた密閉容器に両溶液が触れ合わないように収め、25℃で静置した。1ヶ月後に0.1mm×0.05mm×0.05mmの棒状晶が得られた。
5)−3 X線結晶構造解析とエピトープの同定
得られた結晶をPerfluoropolyether PFO−X175/08 (Hampton Research)に浸し、続いて液体窒素で凍結した。ビームラインBL41XU (SPring−8, Hyogo)にてX線回折デ―タを収集した。得られた回折像からソフトウェアimosflm(CCP4:Collaborative Computational Project No.4)を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は六方晶系で空間群はP62、結晶の単位格子はa=193.54 Å、b=193.54 Å、c=43.88 Åであった。
ソフトウェアRefmac5(CCP4:Collaborative Computational Project No.4)を用いて構造の精密化を行い、ソフトウェアcootを用いてモデルの修正を行った。この操作を繰り返し行い、3.3 Å分解能で最終のR値22.1%、free R値27.0%を得た。最終のモデルはC3E−7034の軽鎖領域(図23、配列番号17)のアミノ酸残基1−108、C3E−7034の重鎖領域(図22、配列番号16)のアミノ酸残基1−118、CD3ε領域(図1、配列番号1)のアミノ酸残基33−67及び71−118、及びCD3γ領域(図37、配列番号3)のアミノ酸残基23−103を含む。CD3ε領域(図1、配列番号1)のアミノ酸残基68−70、及びC3E−7034 (図38、配列番号19)のアミノ末端領域(アミノ酸残基1)、リンカー部分(アミノ酸残基120−134)、及びカルボキシル末端領域(アミノ酸残基243−269)はそれぞれ電子密度が明瞭でなかったためモデル構築していない。図39に複合体全体のリボンモデルと表面を示す。
図40にCD3εとC3E−7034の軽鎖及び重鎖との相互作用を示す。パネルAはC3E−7034の軽鎖可変領域から4Å以内の距離にあるCD3εのアミノ酸残基を太いスティックモデルで、それ以外のアミノ酸残基を細いスティックモデルで表示した図である。図中において四角内に残基名と残基番号が標識されたSer55、Glu56、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104、及びPro105はC3E−7034の軽鎖可変領域から4Å以内の距離にあるCD3εのアミノ酸残基であり、各アミノ酸番号は配列表の配列番号1に対応している。パネルBはC3E−7034の重鎖可変領域から4Å以内の距離にあるCD3εのアミノ酸残基を太いスティックモデルで、それ以外のアミノ酸を細いスティックモデルで表示した図である。図中において四角内に残基名と残基番号が標識されたSer55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、及びArg101はCD3εのアミノ酸であり、各アミノ酸番号は配列表の配列番号1に対応している。C3E−7034から4Å以内の距離にあり、C3E−7034に対するCD3εのエピトープと解釈されるアミノ酸残基は次のとおりであった:Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104、及びPro105。
(実施例6) ヒト化OKT3 scFvの作製
6)−1 OKT3 scFv発現ベクターpC3E−3000の構築
実施例4)−1−1と同様の手法でマウス抗CD3モノクローナル抗体OKT3(Sgro、Toxicology 105(1995)、23〜29、Orthoclone、Janssen−Cilag社)のscFvを作製し、pcDNA3.3由来動物細胞発現ベクターに導入した。得られた発現ベクターを「pC3E−3000」と命名した。
6)−2 OKT3 scFv(C3E−3000)のヒト化アミノ酸配列の設計
実施例4)−2−1に記載の手法に基づき、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のgamma1及びkappa4をアクセプターとして、OKT3のヒト化体となるC3E−3007のアミノ酸配列を設計した。なお、免疫原性スコア及び物性への影響を勘案して、一部の箇所においてはkappa1のアミノ酸を導入した。図42(配列番号36)に示されるOKT3の重鎖のうち可変領域のアミノ酸番号5番目のグルタミンをバリンに、アミノ酸番号11番目のロイシンをセリンに、アミノ酸番号12番目のアラニンをリジンに、アミノ酸番号13番目のアルギニンをリジンに、アミノ酸番号20番目のメチオニンをバリンに、アミノ酸番号38番目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号40番目のアルギニンをアラニンに、アミノ酸番号48番目のイソロイシンをメチオニンに、アミノ酸番号67番目のリジンをアルギニンに、アミノ酸番号68番目のアラニンをバリンに、アミノ酸番号70番目のロイシンをイソロイシンに、アミノ酸番号72番目のスレオニンをアラニンに、アミノ酸番号76番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号82番目のグルタミンをグルタミン酸に、アミノ酸番号87番目のスレオニンをアルギニンに、アミノ酸番号91番目のセリンをスレオニンに、アミノ酸番号114番目のスレオニンをロイシンに、アミノ酸番号115番目のロイシンをバリンに、置き換えることを伴い設計されたC3E−3007重鎖のアミノ酸配列は、図43(配列番号38)に記載されている。
6)−3 ヒト化OKT3 scFv(C3E−3007)発現ベクターpC3E−3007の構築
図43(配列番号38)に示すC3E−3007重鎖のカルボキシル末端に15アミノ酸フレキシブルリンカーを介して図45(配列番号39)に示すC3E−3007軽鎖を含む領域をつなげたscFvDNA配列及び前後15塩基の付加配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。実施例4)−3−1と同様の方法で図46(配列番号34)のヌクレオチド配列をORFに含むC3E−3007発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pC3E−3007」と命名した。
6)−4 ヒト化OKT3 scFv(C3E−3007)の発現・精製
C3E−3007の発現・精製は、実施例4)−1−2と同様の方法で行なった。C3E−3007のアミノ酸配列は、図47(配列番号35)に記載されている。
(実施例7) ヒト化抗CD3 scFvのin vitro活性7)− 1 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034、C3E−7035、C3E−7036)のヒトCD3との結合性検討
7)−1−1 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034、C3E−7035、C3E−7036)のフローサイトメトリーによるヒトCD3への結合性検討
市販ヒトPBMC(CTL社)を5% FBS含有PBSで適当な濃度に調製し、LIVE/DEAD Fixable Near−IR Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific社)と抗CD19抗体(Beckman Coulter社)を添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで1×106細胞/mLの濃度に調製し、100μL/wellで96−well U底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。5% FBS含有PBSで希釈したヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034、C3E−7035、C3E−7036)を100μL/well添加し、4℃で60分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで希釈したPenta−His Alexa Fluor 488(QIAGEN社)を30μL/well添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで再懸濁し、フローサイトメーター(FACSCanto(商標) II:BD社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(Treestar社)で行い、死細胞とCD19陽性細胞を除去した画分のAlexa Fluor 488の平均蛍光強度(MFI)を算出し、scFv添加サンプルのMFI値から抗体未添加サンプルのMFI値を引いて、MFI値の相対値(rMFI)を計算した。図48に示す通り、ヒト化抗CD3 scFvはヒトCD3に結合することが示された。
7)−1−2 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034、C3 E−7035、C3E−7036)のSPRによるヒトCD3への結合性検討
ヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034、C3E−7035、C3E−7036)のCD3に対するアフィニティーはBIAcore T−200(GE Healthcare社)を用いた表面プラズモン共鳴法により決定した。センサーチップ上に固定化したCD3に異なる5つの濃度の該scFvを流し、得られたレスポンスからRmaxを推定して、その1/2を与える抗体濃度を該scFvのCD3に対する解離定数とした。その結果、該scFvのCD3に対する解離定数はそれぞれ400、4.5、22、25nMであった。
7)−2 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034、C3E−7036)のカニクイザルCD3との結合性検討
7)−2−1 カニクイザルPBMCの調製
SepMate(STEMCELL社)とLymphocyte Separation Solution(ナカライテスク社)を使用して、カニクイザルの血液からPBMCを定法に従い採取した。
7)−2−2 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034、C3E−7035、C3E−7036)のフローサイトメトリーによるカニクイザルCD3への結合性検討
実施例7)−2−1で取得したカニクイザルPBMCを5% FBS含有PBSで適当な濃度に調製し、実施例7)−1−1と同様の方法で染色、解析を実施した。図49に示す通り、ヒト化抗CD3 scFv(C3E−7034、C3E−7035、C3E−7036)はカニクイザルCD3に結合することが示された。
7)−3 ヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034)のT細胞活性化
ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、Lympholyte−H(Cedarlane社)を用いた濃度勾配密度分離法により、無作為のドナーの新鮮なバフィーコートより単離した。LR10(10% ultra low IgG FBS含有RPMI1640(Thermo Fisher Scientific社))で100nMに希釈したヒト化抗CD3 scFv(C3E−3007、C3E−7034)と、同濃度のAnti−His antibody(Qiagen社)を同量混和した。ヒトあるいはサルPBMCをLR10にて2×105細胞に調製し、96−well U底マイクロプレートに、Anti−His antibodyを混和したヒト化抗CD3 scFvと同量混和し、37℃で24時間、5%CO2条件下にて培養した。反応終了後、遠心し、sorter buffer(HBSS(―)(Thermo Fisher Scientific社)、0.1% BSA(Sigma−Aldrich社)、0.1% sodium azide(Sigma−Aldrich社))を添加し、遠心後、細胞にLIVE/DEAD Fixable Near−IR Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific社)を添加し、4℃で20分静置した。Sorter bufferで洗浄後、sorter bufferで希釈したPEラベル抗CD69抗体(Becton、Dickinson社)、FITCラベル抗CD8抗体(Becton、Dickinson社)を添加し、4℃で20分静置した。Sorter bufferで洗浄後、1% paraformaldehyde含有PBS(和光純薬工業社)で再懸濁し、フローサイトメーター(FACSCanto II:Becton、Dickinson社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(Treestar社)で行い、死細胞を除去した画分から、CD8高発現かつPE高発現画分の割合を母集団からの百分率(% of parents)として算出した。図50に示す通り、ヒト化抗CD3 scFvはヒト及びサルCD8高発現細胞を活性化することが示された。
7)−4 CDR改変ヒト化抗CD3 scFvのフローサイトメトリーによるヒト及びカニクイザルCD3への結合性比較
実施例7)−1−1で取得したヒトPBMC、及び7)−2−1で取得したカニクイザルPBMCを5% FBS含有PBSで適当な濃度に調製し、実施例7)−1−1と同様の方法で染色、解析を実施した。図106で示す通り、CDR改変ヒト化抗CD3 scFvのヒト及びサルCD3に対する結合性が確認された。
(実施例8) ヒト化抗TROP2 scFvの作製
8)−1 HT1−11 scFv発現ベクターpHT1−11scFvの構築
図51(配列番号41)に示すHT1−11 scFvのアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社)。In−Fusion HD PCRクローニングキット(Clontech社)を用いて、pcDNA−3.3TOPO(Thermo Scientific社)由来のベクターに合成したDNA断片を挿入することにより図52(配列番号40)に示すヌクレオチド配列をORFに含むヒト化抗TROP2 scFv発現ベクターpHT1−11scFvを構築した。
8)−2 HT1−11 scFvの発現・精製
HT1−11scFvの発現・精製は、実施例4)−1−2と同様の方法で行なった。
(実施例9) ヒト化抗TROP2 scFv(HT1−11scFv)のフローサイトメトリーによるヒトTROP2への結合性評価
咽頭扁平上皮癌細胞株FaDu(ATCC)と膵臓癌細胞株HPAF−II(ATCC)を5% FBS含有PBSで適当な濃度に調製し、LIVE/DEAD Fixable Near−IR Dead Cell Stain Kitを添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで1×106細胞/mLの濃度に調製し、100μL/wellで96−well U底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。5% FBS含有PBSで希釈したヒト化抗TROP2 scFv(HT1−11scFv)を100μL/well添加し、4℃で60分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで希釈したPenta−His Alexa Fluor 488を30μL/well添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで再懸濁し、フローサイトメーター(FACSCanto(商標) II)で検出を行った。データ解析はFlowjoで行い、死細胞を除去した画分のAlexa Fluor 488の平均蛍光強度(MFI)を算出し、scFv添加サンプルのMFI値から抗体未添加サンプルのMFI値を引いて、MFI値の相対値(rMFI)を計算した。図53に示す通り、ヒト化抗TROP2 scFvはヒトTROP2に結合することが示された。
(実施例10) 抗TROP2−CD3二重特異性分子の作製
10)−1 抗TROP2−CD3二重特異性分子発現ベクターの構築
10)−1−1 HT1−11scFv/C3E−7034二重特異性分子(T2C−0001)発現ベクターの構築
実施例8)−1で作製したpHT1−11scFvを鋳型として5’側にHT1−11scFvとヒト抗体重鎖シグナル配列の一部、3’側にscFv間を繋ぐリンカーが付加するようにデザインしたプライマーを用いてPCRを行い、インサートDNA断片を得た。また4)−3−1で作製した発現ベクターpC3E−7034を鋳型として、シグナル配列、及び抗CD3 scFvのアミノ末端配列をコードするプライマーを用いてPCRを行い、抗CD3 scFvを含むベクター全領域を含むベクターDNA断片を得た。それぞれのDNA断片をIn−Fusion HD クローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合させ、図54(配列番号42)のヌクレオチド配列をORFに含む抗TROP2−CD3二重特異性分子発現ベクターpT2C−0001を作製した。
10)−1−2 HT1−11scFv/C3E−3007二重特異性分子(T2C−0003)発現ベクターの構築
実施例10)−1−1と同様の方法で図55(配列番号44)のヌクレオチド配列をORFに含む抗TROP2−CD3二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてpC3E−3007を用いた。得られた発現ベクターを「pT2C−0003」と命名した。
10)−1−3 HT1−11scFv/C3E−7035二重特異性分子(T2C−0005)発現ベクターの構築
実施例10)−1−1と同様の方法で図56(配列番号46)のヌクレオチド配列をORFに含む抗TROP2−CD3二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてpC3E−7035を用いた。得られた発現ベクターを「pT2C−0005」と命名した。
10)−1−4 HT1−11scFv/C3E−7036二重特異性分子(T2C−0006)発現ベクターの構築
実施例10)−1−1と同様の方法で図57(配列番号48)のヌクレオチド配列をORFに含む抗TROP2−CD3二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてpC3E−7036を用いた。得られた発現ベクターを「pT2C−0006」と命名した。
10)−2 抗TROP2−CD3二重特異性分子の発現・精製
T2C−0001、T2C−0003、T2C−0005、T2C−0006の発現・精製は、実施例4)−1−2と同様の方法で行なった。T2C−0001のアミノ酸配列は、図58(配列番号43)に記載されている。T2C−0003のアミノ酸配列は、図59(配列番号45)に記載されている。T2C−0005のアミノ酸配列は、図60(配列番号47)に記載されている。T2C−0006のアミノ酸配列は、図61(配列番号49)に記載されている。
(実施例11) 抗TROP2−CD3二重特異性分子のin vitro活性評価
11)−1 SPRによる結合活性評価
11)−1−1 抗TROP2−CD3二重特異性分子のTROP2への結合
二重特異性分子とTROP2との結合は、BIAcore 3000(GE Healthcare Bioscience社)を使用し、抗ヒトIgG抗体にて捕捉(キャプチャー)した抗原に対して、二重特異性分子をアナライトとして測定するキャプチャー法にて測定した。抗原は、組み換えヒトTROP−2/ヒトIgG Fc融合体(R&D SYSTEMS)を使用した。抗ヒトIgG(Fc)抗体(Human Antibody Capture Kit、GE Healthcare Bioscience社)は、センサーチップCM5(GE Healthcare Bioscience社)へアミンカップリング法にて約2000RU共有結合させた。リファレンスセルにも同様に固定化した。ランニングバッファーとしてHBS−P(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl,0.005% Surfactant P20)を用いた。二重特異性分子は、200nMから2倍希釈にて1nMまで調製した。抗ヒトIgG(Fc)抗体を固定化したチップ上に、1μg/mlの抗原を約30秒間添加した後、各濃度の二重特異性分子を流速30μl/分で300秒間添加し、引き続き600秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、3M塩化マグネシウム溶液を30秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウ ェア(BIAevaluation software, version 4.1.1)の 1:1結合モデルを用いて、結合速度定数ka、解離速度定数kd及び解離定数(KD; KD=kd/ka)を算出した。
11)−1−2 抗TROP2−CD3二重特異性分子のヒトCD3εγ一本鎖抗原への結合
二重特異性分子とCD3εγ抗原との結合は、BIAcore 3000(GE Healthcare Bioscience社)を使用し、固定化した抗原に対して、抗体をアナライトとして測定する方法にて測定した。抗原には、2)−2−1にて調製したヒトCD3εγ一本鎖抗原を使用し、センサーチップCM5(GE Healthcare Bioscience社)へアミンカップリング法にて約100RU共有結合させた。リファレンスセルには抗原蛋白を添加せず固定化処理のみ行った。ランニングバッファーとしてHBS−P(10mM HEPES pH7.4、0.15M NaCl,0.005% Surfactant P20)を用いた。二重特異性分子は、最高濃度1μMから2倍希釈にて4nMまで、あるいは200nMから2倍希釈にて1nMまで調製した。抗原を固定化したチップ上に、各濃度の二重特異性分子を流速10μl/分で25分間添加し、結合量をモニターした。再生溶液として、10mMグリシン塩酸溶液pH1.5を30秒間添加した。データの解析には、分析ソフトウ ェア(BIAevaluation software, version 4.1.1)を用いて、各濃度における結合量から解離定数KDを算出した。結果を表2、表3に記載した。
11)−2−1 抗TROP2−CD3二重特異性分子のTROP2への結合
実施例9と同様の癌細胞株を用いて、同様の方法で染色、解析を実施した。図62に示す通り、抗TROP2−CD3二重特異性分子はTROP2に結合することが示された。
11)−2−2 抗TROP2−CD3二重特異性分子のヒトCD3εγ一本鎖抗原への結合
実施例7)−1−1と同様の方法で染色、解析を実施した。図63に示す通り、抗TROP2−CD3二重特異性分子はヒトCD3εγ一本鎖抗原に結合することが示された。
11)−2−3 抗TROP2−CD3二重特異性分子のカニクイザルCD3抗原への結合
実施例7)−2−1で取得したカニクイザルPBMCを5% FBS含有PBSで適当な濃度に調製し、実施例7)−1−1と同様の方法で染色、解析を実施した。図64に示す通り、抗TROP2−CD3二重特異性分子(T2C−0001、T2C−0005、T2C−0006)はカニクイザルCD3抗原に結合することが示された。
11)−3 抗TROP2−CD3二重特異性分子の細胞傷害活性評価
11)−3−1 標的細胞におけるTROP2の発現解析
咽頭扁平上皮癌細胞株FaDu(ATCC)、膵臓癌細胞株HPAF−II(ATCC)、及びヒト肺癌細胞株Calu−6を5% FBS含有PBSで適当な濃度に調製し、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific社)を添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで2×106細胞/mLの濃度に調製し、100μL/wellで96−well U底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。5% FBS含有PBSで希釈した抗TROP2 Alexa Fluor 488抗体(eBioscience社)及びIsotype Control抗体(eBioscience社)を25μL/well添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで再懸濁し、フローサイトメーター(Cytomics FC500、BeckmanCoulter社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(Treestar社)で行い、死細胞除去画分のAlexa Fluor 488の幾何学的平均蛍光強度(geometric MFI)を算出した。図65 (A、B、C)に示す通り、FaDu、及びHPAF−IIにおいてTROP2の発現が認められ、Calu−6においては発現が認められなかった。
11)−3−2 標的細胞の調製
FaDu、HPAF−II、及びCalu−6を10% FBS含有RPMI1640培地(Thermo Fisher Scientific社)で2×106細胞/mLの濃度に調製し、細胞懸濁液1mLあたり100μLのChromium−51 Radionuclide(PerkinElmer社)を添加し、37℃、5% CO2の条件下で2時間培養した。10% FBS含有RPMI1640培地で2回洗浄した後、10% FBS含有RPMI1640培地で2×105細胞/mLになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。
11)−3−3 エフェクター細胞の調製
市販の凍結PBMC(Cellular Technology Limited社)を37℃で解凍し、10% FBS含有RPMI1640培地にAnti−aggregate Wash試薬(Cellular Technology Limited社)を添加した溶液に移して2回洗浄した後に10% FBS含有RPMI1640培地で1×106細胞/mLになるよう調製し、エフェクター細胞とした。
11)−3−4 細胞傷害アッセイ
実施例11)−3−2で取得したFaDu、HPAF−II、及びCalu−6を50μL/wellで96−well U底マイクロプレートに添加した。そこに各濃度に調製した各種抗TROP2−CD3二重特異性分子を50μL/wellで添加し、11)−3−1−3で調製したエフェクター細胞を100μL/well添加し、室温で1000rpm×1分間遠心後、37℃、5% CO2の条件下で20−24時間培養した。上清50μLをLumaPlate(PerkinElmer社)に回収し、50℃で約2時間乾燥させた後、プレートリーダー(TopCount:PerkinElmer社)で測定した。細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率(%)=(A−B)/(C−B)×100
A:サンプルウェルのカウント。
B:バックグラウンド(抗体非添加ウェル)カウントの平均値(n=3)。抗体添加時にアッセイ用培地を50μL添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
C:最大放出(標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル)カウントの平均値(n=3)。抗体添加時にアッセイ培地を50μL添加した。界面活性剤は100μL添加し、サンプルウェルと同様に50μL分をLumaPlateに移して測定を実施した。
図66 (A、B、C)に示す通り、FaDu、及びHPAF−IIに対する各種TROP2−CD3二重特異性分子の細胞傷害活性が示された)。一方Calu−6に対する細胞傷害活性は認められなかった。
(実施例12) 抗Axl−CD3二重特異性分子の作製
12)−1 抗Axl−CD3二重特異性分子発現ベクターの構築
12)−1−1 11D5−T3scFv/C3E−7034二重特異性分子(AXC−0001)発現ベクターの構築
h#11D5−T3H(欧州特許出願公開第2270053号明細書のFigure 12に記載)のN末端にグリシンを加えた配列と、h#11D5−T3L(欧州特許出願公開第2270053号明細書のFigure 6に記載)の配列を、(GGGGS)を三回繰り返した配列からなるポリペプチドリンカーを介して連結した抗Axl一本鎖抗体、11D5−T3scFvのアミノ酸配列を設計し、これをコードするヌクレオチド配列を合成した(GENEART,Thermo Fisher Science社)。これを鋳型として5‘側にヒト抗体重鎖シグナル配列の一部、3’側にscFv間を繋ぐリンカーが付加するようにデザインしたプライマーを用いてPCRを行い、インサートDNA断片を得た。また4)−3−1で作製した発現ベクターpC3E−7034を鋳型として、ヒト抗体重鎖シグナル配列、及び抗CD3 scFvをコードするヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて抗CD3 scFvを含むベクター全領域をPCR法により増幅し、ベクターDNA断片を得た。それぞれのDNA断片をIn−Fusion HD クローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合させ、図97(配列番号89)に示すヌクレオチド配列をORFに含む抗Axl−CD3二重特異性分子発現ベクターpAXC−0001を作製した。
12)−1−2 11D5−T3scFv/C3E−7036二重特異性分子(AXC−0002)発現ベクターの構築
実施例10)−1−1と同様の方法で図99(配列番号91)に示すヌクレオチド配列をORFに含む抗Axl−CD3二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてpC3E−7036を用いた。得られた発現ベクターを「pAXC−0002」と命名した。
12)−2 抗Axl−CD3二重特異性分子の発現・精製
AXC−0001、AXC−0002の発現・精製は、実施例4)−1−2と同様の方法で行なった。AXC−0001のアミノ酸配列は、図98(配列番号90)に記載されている。AXC−0002のアミノ酸配列は、図100(配列番号92)に記載されている。
(実施例13) 抗Axl−CD3二重特異性分子のin vitro活性評価
13)−1 標的細胞におけるAxlの発現解析
ヒト肺癌細胞株A549(ATCC)、ヒト膵臓癌細胞株PANC−1(ATCC)、MIA PaCa−2(ATCC)、ヒト骨髄腫細胞株U266B1(ATCC)、マントル細胞リンパ腫細胞株Jeko−1(ATCC)を5% FBS含有PBSで適当な濃度に調製し、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific社)を添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで2×106細胞/mLの濃度に調製し、100μL/wellで96−well U底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。5% FBS含有PBSで希釈した抗Axl抗体(RD−SYSTEMS社)及びIsotype Control抗体(RD−SYSTEMS社)を25μL/well添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで希釈したAlexa Fluor488抗マウスIgG抗体(Thermo Fisher Scientific社)を25μL/well添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで再懸濁し、フローサイトメーター(Cytomics FC500、BeckmanCoulter社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(Treestar社)で行い、死細胞除去画分のAlexa Fluor 488の幾何学的平均蛍光強度(geometric MFI)を算出した。図107(A、B、C、D、E)に示す通り、A549、PANC−1、及びMIA PaCa−2においてAxlの発現が認められ、U266B1、Jeko−1においては発現が認められなかった。
13)−2 標的細胞の調製
A549、PANC−1、MIA PaCa−2、U266B1、及びJeko−1を10% FBS含有RPMI1640培地(Thermo Fisher Scientific社)で2×106細胞/mLの濃度に調製し、細胞懸濁液1mLあたり100μLのChromium−51 Radionuclide(PerkinElmer社)を添加し、37℃、5% CO2の条件下で2時間培養した。10% FBS含有RPMI1640培地で2回洗浄した後、10% FBS含有RPMI1640培地で2×105細胞/mLになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。
13)−3 エフェクター細胞の調製
市販の凍結PBMC(Cellular Technology Limited社)を37℃で解凍し、10% FBS含有RPMI1640培地にAnti−aggregate Wash試薬(Cellular Technology Limited社)を添加した溶液に移して2回洗浄した後に10% FBS含有RPMI1640培地で1×106細胞/mLになるよう調製し、エフェクター細胞とした。
13)−4 細胞傷害アッセイ
実施例13)−2で取得したA549、PANC−1、MIA PaCa−2、U266B1、及びJeko−1を50μL/wellで96−well U底マイクロプレートに添加した。そこに各濃度に調製した各種抗Axl−CD3二重特異性分子を50μL/wellで添加し、13)−3で調製したエフェクター細胞を100μL/well添加し、室温で1000rpm×1分間遠心後、37℃、5% CO2の条件下で20−24時間培養した。上清50μLをLumaPlate(PerkinElmer社)に回収し、50℃で約2時間乾燥させた後、プレートリーダー(TopCount:PerkinElmer社)で測定した。細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率(%)=(A−B)/(C−B)×100
A:サンプルウェルのカウント。
B:バックグラウンド(抗体非添加ウェル)カウントの平均値(n=3)。抗体添加時にアッセイ用培地を50μL添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
C:最大放出(標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル)カウントの平均値(n=3)。抗体添加時にアッセイ培地を50μL添加した。界面活性剤は100μL添加し、サンプルウェルと同様に50μL分をLumaPlateに移して測定を実施した。
(実施例14) 抗HLA−A2/MAGEC1−CD3二重特異性分子発現ベクターの作製
14)−1 抗HLA−A2/MAGEC1−CD3二重特異性分子発現ベクターの構築
14)−1−1 MAG−032scFv/C3E−7034二重特異性分子(MGC−0001)発現ベクターの構築
HLA−A2/MAGEC1特異的に結合するMAG−032 scFvはヒト抗体ファージライブラリーより取得した。MAG−032 scFvのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、5‘側にヒト抗体重鎖シグナル配列の一部、3’側にscFv間を繋ぐリンカー、及びC3E−7034の一部をコードするヌクレオチド配列が付加するようにデザインしたプライマーを用いたPCR法により、MAG−032 scFvのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むインサートDNA断片を得た。また4)−3−1で作製した発現ベクターpC3E−7034を鋳型として、ヒト抗体重鎖シグナル配列、及び抗CD3 scFvのアミノ末端配列をコードするヌクレオチド配列からなるプライマーを用いて抗CD3 scFvを含むベクター全領域をPCR法により増幅し、ベクターDNA断片を得た。それぞれのDNA断片をIn−Fusion HD クローニングキット(CLONTECH社)を用いて結合させ、図101(配列番号93)に示すヌクレオチド配列をORFに含む抗HLA−A2/MAGEC1−CD3二重特異性分子発現ベクターpMGC−0001を作製した。
14)−1−2 MAG−032scFv/C3E−7036二重特異性分子(MGC−0002)発現ベクターの構築
実施例14)−1−1と同様の方法で図103(配列番号95)に示すヌクレオチド配列をORFに含む抗HLA−A2/MAGEC1−CD3二重特異性分子発現ベクターを構築した。ただし、ベクター断片を作製する際の鋳型としてpC3E−7036を用いた。得られた発現ベクターを「pMGC−0002」と命名した。
14)−2 抗HLA−A2/MAGEC1−CD3二重特異性分子の発現・精製
MGC−0001、MGC−0002の発現・精製は、実施例4)−1−2と同様の方法で行なった。MGC−0001のアミノ酸配列は、図102(配列番号94)に記載されている。MGC−0002のアミノ酸配列は、図104(配列番号96)に記載されている。
(実施例15) 抗HLA−A2/MAGEC1−CD3二重特異性分子のin vitro活性評価
15)−1 標的細胞におけるHLA−A2/MAGEC1の発現解析
ヒトリンパ芽球細胞融合細胞株T2(ATCC)細胞を20%FBS含有AIM−V培地(Thermo Fisher Scientific社)で適当な濃度に調整し、図106(配列番号97)MAGEC1ペプチド(Sigma Genosys社)、もしくはDMSOを添加し、37℃で4時間インキュベートした。20%FBS含有AIM−V培地で2回洗浄後、5% FBS含有PBSで適当な濃度に調製し、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher Scientific社)を添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで2×106細胞/mLの濃度に調製し、100μL/wellで96−well U底マイクロプレートに播種し、遠心後上清を除去した。5% FBS含有PBSで希釈した抗HLA−A2/MAGEC1抗体(MAG032 scFv)を25μL/well添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで希釈したPenta−His Alexa Fluor 488(QIAGEN社)を25μL/well添加し、4℃で30分静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄後、5% FBS含有PBSで再懸濁し、フローサイトメーター(Cytomics FC500、BeckmanCoulter社)で検出を行った。データ解析はFlowjo(Treestar社)で行い、死細胞除去画分のAlexa Fluor 488の幾何学的平均蛍光強度(geometric MFI)を算出した。図109 (A、B)に示す通り、MAGEC1ペプチドを添加したT2細胞においてHLA−A2/MAGEC1の発現が認められ、DMSOを添加したT2細胞においては発現が認められなかった。
15)−2 標的細胞の調製
T2細胞を20%FBS含有AIM−V培地(Thermo Fisher Scientific社)で適当な濃度に調整し、MAGEC1ペプチド、もしくはDMSOを添加し、37℃で4時間インキュベートした。10% FBS含有RPMI1640培地(Thermo Fisher Scientific社)で2×106細胞/mLの濃度に調製し、細胞懸濁液1mLあたり100μLのChromium−51 Radionuclide(PerkinElmer社)を添加し、37℃、5% CO2の条件下で2時間培養した。10% FBS含有RPMI1640培地で2回洗浄した後、10% FBS含有RPMI1640培地で2×105細胞/mLになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。
15)−3 エフェクター細胞の調製
市販の凍結PBMC(Cellular Technology Limited社)を37℃で解凍し、10% FBS含有RPMI1640培地にAnti−aggregate Wash試薬(Cellular Technology Limited社)を添加した溶液に移して2回洗浄した後に10% FBS含有RPMI1640培地で1×106細胞/mLになるよう調製し、エフェクター細胞とした。
15)−4 細胞傷害アッセイ
実施例15)−2で取得したT2細胞を50μL/wellで96−well U底マイクロプレートに添加した。そこに各濃度に調製した各種抗HLA−A2/MAGEC1−CD3二重特異性分子を50μL/wellで添加し、15)−3で調製したエフェクター細胞を100μL/well添加し、室温で1000rpm×1分間遠心後、37℃、5% CO2の条件下で20−24時間培養した。上清50μLをLumaPlate(PerkinElmer社)に回収し、50℃で約2時間乾燥させた後、プレートリーダー(TopCount:PerkinElmer社)で測定した。細胞溶解率は次式で算出した。
細胞溶解率(%)=(A−B)/(C−B)×100
A:サンプルウェルのカウント。
B:バックグラウンド(抗体非添加ウェル)カウントの平均値(n=3)。抗体添加時にアッセイ用培地を50μL添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
C:最大放出(標的細胞を界面活性剤で溶解させたウェル)カウントの平均値(n=3)。抗体添加時にアッセイ培地を50μL添加した。界面活性剤は100μL添加し、サンプルウェルと同様に50μL分をLumaPlateに移して測定を実施した。
配列番号2:ヒトCD3δのアミノ酸配列
配列番号3:ヒトCD3γのアミノ酸配列
配列番号4:ヒトCD3εγ一本鎖抗原をコードするヌクレオチド配列
配列番号5:His−scCD3抗原のアミノ酸配列
配列番号6:C3−147の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号7:(C3−147_VH AA):C3−147の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号8:(C3−147_VL DNA):C3−147の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列
配列番号9:(C3−147_VL AA):C3−147の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号10:(G4S linker センス):
配列番号11:(G4S linker アンチセンス):
配列番号12:(C3E−7000_VH AA):C3E−7000の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号13:(C3E−7000_VL AA):C3E−7000の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号14:(C3E−7000 ORF):C3E−7000をコードするヌクレオチド配列
配列番号15:(C3E−7000 AA):C3E−7000のアミノ酸配列
配列番号16:(C3E−7034_VH AA):C3E−7034の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号17:C3E−7034の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号18:(C3E−7034 ORF):C3E−7034をコードするヌクレオチド配列
配列番号19:(C3E_7034 AA):C3E−7034のアミノ酸配列
配列番号20:(C3E−7035_VL AA):C3E−7035の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号21:(C3E−7035 ORF):C3E−7035をコードするヌクレオチド配列
配列番号22:(C3E_7035 AA):C3E−7035のアミノ酸配列
配列番号23:(C3E−7036_VL_AA):C3E−7036の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号24:(C3E−7036 ORF):C3E−7036をコードするヌクレオチド配列
配列番号25:(C3E_7036 AA):C3E−7036のアミノ酸配列
配列番号26:(7000_CDR−H1):C3E−7000系のCDR−H1のアミノ酸配列
配列番号27:(7000_CDR−H2):C3E−7000系のCDR−H2のアミノ酸配列
配列番号28:(7000_CDR−H3):C3E−7000系のCDR−H3のアミノ酸配列
配列番号29:(7000_CDR−L1):C3E−7000系のCDR−L1のアミノ酸配列
配列番号30:(7000_CDR−L2):C3E−7000系のCDR−L2のアミノ酸配列
配列番号31:(7000_CDR−L3):C3E−7000系のCDR−L3のアミノ酸配列
配列番号32:(C3E−3000 ORF): OKT3 scFvをコードするヌクレオチド配列
配列番号33:(C3E−3000 AA): OKT3 scFvのアミノ酸配列
配列番号34:(C3E−3007 ORF): C3E−3007 scFvをコードするヌクレオチド配列
配列番号35:(C3E−3007 AA): C3E−3007 scFvのアミノ酸配列
配列番号36:(C3E−3000_VH AA): OKT3の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号37:(C3E−3000_VL AA): OKT3の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号38:(C3E−3007_VH AA): C3E−3007の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号39:(C3E−3007_VL AA): C3E−3007の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号40:(HT1−11 ORF):HT1−11 scFvをコードするヌクレオチド配列
配列番号41:(HT1−11 AA):HT1−11 scFvのアミノ酸配列
配列番号42:(T2C−0001 ORF):T2C−0001をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号43:(T2C−0001 AA):T2C−0001のアミノ酸配列
配列番号44:(T2C−0003 ORF):T2C−0003をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号45:(T2C−0003 AA):T2C−0003のアミノ酸配列
配列番号46:(T2C−0005 ORF):T2C−0005をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号47:(T2C−0005 AA):T2C−0005のアミノ酸配列
配列番号48:(T2C−0006 ORF):T2C−0006をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号49:(T2C−0006 AA):T2C−0006のアミノ酸配列
配列番号50:重鎖遺伝子増幅用 センスプライマーのアミノ酸配列
配列番号51:重鎖遺伝子増幅用 1回目アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号52:重鎖遺伝子増幅用 2回目アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号53:軽鎖遺伝子増幅用 センスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号54:軽鎖遺伝子増幅用 1回目アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号55:軽鎖遺伝子増幅用 2回目アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号56:重鎖シーケンス用センスプライマーのヌクレオチド配列
配列番号57:軽鎖シーケンス用アンチセンスプライマー1のヌクレオチド配列
配列番号58:軽鎖シーケンス用 アンチセンスプライマー2のヌクレオチド配列
配列番号59:C3E−7078をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号60:C3E−7078のアミノ酸配列
配列番号61:C3E−7079をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号62:C3E−7079のアミノ酸配列
配列番号63:C3E−7085をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号64:C3E−7085のアミノ酸配列
配列番号65:C3E−7086をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号66:C3E−7086のアミノ酸配列
配列番号67:C3E−7087をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号68:C3E−7087のアミノ酸配列
配列番号69:C3E−7088をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号70:C3E−7088のアミノ酸配列
配列番号71:C3E−7089をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号72:C3E−7089のアミノ酸配列
配列番号73:C3E−7090をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号74:C3E−7090のアミノ酸配列
配列番号75:C3E−7091をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号76:C3E−7091のアミノ酸配列
配列番号77:C3E−7092をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号78:C3E−7092のアミノ酸配列
配列番号79:C3E−7093をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号80:C3E−7093のアミノ酸配列
配列番号81:C3E−7094をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号82:C3E−7094のアミノ酸配列
配列番号83:C3E−7095をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号84:C3E−7095のアミノ酸配列
配列番号85:HN53R Fwのヌクレオチド配列
配列番号86:HN53R Rvのヌクレオチド配列
配列番号87:HN53S Fwのヌクレオチド配列
配列番号88:HN53S Rvのヌクレオチド配列
配列番号89:(AXC−0001 ORF):AXC−0001をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号90:(AXC−0001 AA):AXC−0001のアミノ酸配列
配列番号91:(AXC−0002 ORF):AXC−0002をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号92:(AXC−0002 AA):AXC−0002のアミノ酸配列
配列番号93:(MGC−0001 ORF):MGC−0001をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号94:(MGC−0001 AA):MGC−0001のアミノ酸配列
配列番号95:(MGC−0002 ORF):MGC−0002をコードするORFヌクレオチド配列
配列番号96:(MGC−0002 AA):MGC−0002のアミノ酸配列
配列番号97:(MAGEC1ペプチド):MAGEC1ペプチドのアミノ酸配列
配列番号98:(CDRH2 of variants):CDR改変体CDRH2のアミノ酸配列
配列番号99:(CDRL2 of variants):CDR改変体CDRL2のアミノ酸配列
配列番号100:(VH of C3E−7034 variants):C3E−7034のCDR改変体の重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号101:(VL of C3E−7034 variants):C3E−7034のCDR改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号102:(VL of C3E−7035 variants):C3E−7035のCDR改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号103:(VL of C3E−7036 variants):C3E−7036のCDR改変体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列
Claims (55)
- 重鎖配列が
配列番号26に示されるアミノ酸配列を含むCDRH1、
配列番号98に示されるアミノ酸配列を含むCDRH2、及び、
配列番号28に示されるアミノ酸配列を含むCDRH3;
軽鎖配列が
配列番号29に示されるアミノ酸配列を含むCDRL1、
配列番号99に示されるアミノ酸配列を含むCDRL2、及び、
配列番号31に示されるアミノ酸配列を含むCDRL3
をそれぞれ含み;且つ、
ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合することを特徴とする抗体又は該抗体の抗原結合性断片。 - 前記CDRH2の
1番目のXaaは、(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)からなる群より選択され
且つ2番目のXaaはSであるか、又は、
1番目のXaaはNであり、
且つ2番目のXaaは、(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)からなる群より選択され、
前記CDRL2の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択され、
ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合することを特徴とする請求項1に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。 - 前記CDRH2の
1番目のXaaは、(R、S)からなる群より選択され、2番目のXaaはSであり、且つ
前記CDRL2の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される、
ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合することを特徴とする請求項1又は2に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。 - 重鎖配列がCDRH1、CDRH2、及び、CDRH3を有する可変領域を含み、
前記CDRH1は配列番号26に示されるアミノ酸配列からなり、
前記CDRH2は配列番号27に示されるアミノ酸配列からなり、
前記CDRH3は配列番号28に示されるアミノ酸配列からなること;並びに
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、
前記CDRL1は配列番号29に示されるアミノ酸配列からなり、
前記CDRL2は配列番号30に示されるアミノ酸配列からなり、
前記CDRL3は配列番号31に示されるアミノ酸配列からなること;並びに、
ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合することを特徴とする、請求項1記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。 - 重鎖可変領域配列が、配列番号100に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 配列番号100に示されるアミノ酸配列の
1番目のXaaは、(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)からなる群より選択され
且つ2番目のXaaはSであるか、又は、
1番目のXaaはNであり
且つ2番目のXaaは、(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)からなる群より選択される、
請求項5に記載の抗体又はその抗原結合性断片。 - 配列番号100に示されるアミノ酸配列の
1番目のXaaは、(R、S)からなる群より選択され、且つ2番目のXaaはSである、
請求項5に記載の抗体又はその抗原結合性断片。 - 軽鎖可変領域が、配列番号101、102、及び、103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1乃至7のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合性断片。
- 配列番号101、102、及び、103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される、
請求項8に記載の抗体又その抗原結合性断片。 - 重鎖可変領域配列が、配列番号16に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項5に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 軽鎖可変領域配列が、配列番号17、20、及び、23のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項8に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 配列番号100に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号101、102、及び103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、
配列番号100で示されるアミノ酸配列の1番目のXaaは、(A、E、G、H、I、L、T、V、R、S)からなる群より選択され、且つ、2番目のXaaはSであるか、又は、
1番目のXaaはNであり、且つ、2番目のXaaは、(E、R、F、Y、L、V、I、K、T)からなる群より選択され、
配列番号101、102、及び、103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される、
請求項1又は2に記載の抗体又はその抗原結合性断片。 - 配列番号100の
1番目のXaaは、(R、S)からなる群より選択され、
2番目のXaaはSであり、且つ、
配列番号101、102、及び、103のいずれか1つに示されるアミノ酸配列の
Xaaは、(Q、A、G、S、N、D)からなる群より選択される、
請求項12に記載の抗体又はその抗原結合性断片。 - 請求項13に記載の
配列番号60の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号60の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号64の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号64の135乃至241のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号66の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号66の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号68の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号68の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号70の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号70の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号72の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号72の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号74の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号74の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号76の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号76の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号78の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号78の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号80の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号80の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号82の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号82の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号84の2乃至119のアミノ酸残基を含む重鎖可変領域と、配列番号84の135乃至243のアミノ酸残基を含む軽鎖可変領域を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片。 - 配列番号16に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、リンカーと、配列番号17、20、及び、23のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む請求項1、4、5、8、10、又は11に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 可変領域が、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合しており、又は、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合しており、任意で:i) 両可変領域の間にリンカーを有し;ii)アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有し;iii)カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、FLAGタグ、及び/又は、Hisタグが結合している:請求項1乃至15のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合性断片。
- 配列番号60の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号64の2乃至241番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号66の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号68の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号70の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号72の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号74の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号76の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号78の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号80の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号82の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
又は、
配列番号84の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を含む請求項16に記載の抗原又は該抗体の抗原結合性断片。 - 配列番号19の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号22の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号25の2乃至267のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号60の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号64の2乃至267のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号66の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号68の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号70の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号72の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号74の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号76の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号78の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号80の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号82の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、又は、
配列番号84の2乃至269のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
を含む請求項16に記載の抗原又は該抗体の抗原結合性断片。 - 請求項14乃至18のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、且つ、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 請求項14乃至18のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖のアミノ酸配列と90%以上同一なアミノ酸配列を含む重鎖、及び、請求項14乃至18のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖のアミノ酸配列と70%以上同一なアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、且つ、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 請求項14乃至18のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる重鎖が含むアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含む重鎖、並びに、請求項14乃至18のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片に含まれる軽鎖が含むアミノ酸配列において1乃至数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されてなるアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、且つ、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 請求項14乃至18のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトCD3上の同一の部位に結合し、且つ、カニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 請求項14乃至18のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とヒトCD3上への結合において競合し、且つ、カニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 前記抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合するヒトCD3上の部位が、配列番号1で示されるアミノ酸配列中の55番目のセリン(Ser)、56番目のグルタミン酸(Glu)、58番目のロイシン(Leu)、59番目のトリプトファン(Trp)、65番目のアスパラギン(Asn)、66番目のイソロイシン(Ile)、77番目のセリン(Ser)、78番目のアスパラギン酸(Asp)、101番目のアルギニン(Arg)、101番目のグリシン(Gly)、103番目のセリン(Ser)、104番目のリジン(Lys)、および105番目のプロリン(Pro)のうちの7アミノ酸以上から構成される、請求項22に記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- IgGである請求項1乃至17、19乃至24のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- Fab、F(ab)’、Fv、scFv及びsdAbからなる群から選択される請求項1乃至23のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- ヒト免疫グロブリン定常領域を含むヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項1乃至17、19乃至25のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 請求項1乃至27のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号19の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号22の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号25の2乃至241番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号60の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号64の2乃至241番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号66の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号68の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号70の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号72の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号74の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号76の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号78の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号80の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
配列番号82の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列、
又は、
配列番号84の2乃至243番目のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項27に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項28又は29のいずれか1つに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項28又は29のいずれか1つに記載のポリヌクレオチド又は請求項30に記載のベクターを含むか、又は請求項1乃至27のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を産生する細胞。
- 請求項31に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片を回収する工程を含む、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片の製造方法。
- 請求項32に記載の方法により得られる、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
- 請求項1乃至27、33のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を有効成分として含有する医薬組成物。
- 請求項1乃至27、33のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む抗原結合性を有する分子。
- 多重特異的である請求項35に記載の分子。
- 請求項1乃至27、33のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、1つ又は2つ以上のさらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片を含む請求項35又は36に記載の分子。
- さらなる抗体の抗原結合性断片が、Fab、F(ab)’、Fv、scFv、又は、sdAbである、請求項37に記載の分子。
- Fcを含む請求項38に記載の分子。
- さらなる抗体が、ヒト免疫グロブリン定常領域を含むヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項37乃至39のいずれか1つに記載の分子。
- 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、請求項1乃至27、33のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが、リンカーにより結合してなる、あるいはリンカーなしで結合してなる請求項37乃至38のいずれか1つに記載の分子。
- 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片の有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、リンカーとが結合しており、さらに該リンカーの有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、請求項1乃至27、33のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片とが結合してなる請求項41に記載の分子。
- 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片の有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、リンカーとが結合しており、さらに該リンカーの有するアミノ酸配列のカルボキシル末端と、
配列番号19の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号22の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号25の2乃至241番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片が結合してなるアミノ酸配列を含む請求項42に記載の分子。 - 請求項1乃至27、33のいずれか1つに記載の抗体又は該抗体の抗原結合性断片において、可変領域が、抗体のアミノ末端側から重鎖可変領域、軽鎖可変領域の順で結合しており、あるいは、軽鎖可変領域、重鎖可変領域の順で結合しており、
任意で:i)両可変領域の間にリンカーを有し:ii)アミノ末端側の可変領域のアミノ末端にグリシン残基を有し;iii)カルボキシル末端側の可変領域のカルボキシル末端に、リンカー、FLAGタグ、及び/又は、Hisタグが結合している:請求項35乃至42のいずれか1つに記載の分子。 - 該さらなる抗体又は該抗体の抗原結合性断片と、
配列番号19の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号25の2乃至241番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片。
配列番号60の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、配列番号64の2乃至241番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、配列番号66の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号68の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号70の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号72の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号74の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号76の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号78の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号80の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
配列番号82の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片、
又は、
配列番号84の2乃至243番目のアミノ酸残基を含む抗体又は該抗体の抗原結合性断片
を含む請求項44に記載の分子。 - 該さらなる抗体が抗癌標的抗体である請求項36乃至45のいずれかに記載の分子。
- 二重特異的である請求項36乃至46のいずれか1つに記載の分子。
- ポリペプチドである請求項35乃至47のいずれか1つに記載の分子。
- 請求項48に記載の分子の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項49に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項49に記載のポリヌクレオチド若しくは請求項50に記載のベクター、又は、請求項48に記載の分子を産生する細胞。
- 請求項51に記載の細胞を培養する工程、及び、該培養物からヒトCD3に結合する分子を回収する工程を含む、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する分子の製造方法。
- 請求項52に記載の方法により得られる、ヒトCD3及びカニクイザルCD3に結合する分子。
- 請求項35乃至48、53のいずれか1つに記載の分子を有効成分として含有する医薬組成物。
- 標的細胞へのT細胞リダイレクションによって、該標的細胞への細胞傷害を誘導することを特徴とする請求項54に記載の医薬組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022206884A JP7478222B2 (ja) | 2016-12-22 | 2022-12-23 | 抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016249148 | 2016-12-22 | ||
JP2016249148 | 2016-12-22 | ||
PCT/JP2017/046006 WO2018117237A1 (ja) | 2016-12-22 | 2017-12-21 | 抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022206884A Division JP7478222B2 (ja) | 2016-12-22 | 2022-12-23 | 抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2018117237A1 true JPWO2018117237A1 (ja) | 2019-10-31 |
JP7202185B2 JP7202185B2 (ja) | 2023-01-11 |
Family
ID=62627719
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018558078A Active JP7202185B2 (ja) | 2016-12-22 | 2017-12-21 | 抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 |
JP2022206884A Active JP7478222B2 (ja) | 2016-12-22 | 2022-12-23 | 抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022206884A Active JP7478222B2 (ja) | 2016-12-22 | 2022-12-23 | 抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11618785B2 (ja) |
EP (1) | EP3561057A4 (ja) |
JP (2) | JP7202185B2 (ja) |
KR (1) | KR20190121294A (ja) |
CN (1) | CN110431231B (ja) |
AU (1) | AU2017379382A1 (ja) |
BR (1) | BR112019012901A2 (ja) |
CA (1) | CA3048174A1 (ja) |
CO (1) | CO2019007823A2 (ja) |
IL (2) | IL267567B1 (ja) |
MX (1) | MX2019007347A (ja) |
PH (1) | PH12019501387A1 (ja) |
SG (1) | SG10201912366YA (ja) |
TW (1) | TW201829467A (ja) |
WO (1) | WO2018117237A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BR112019012901A2 (pt) | 2016-12-22 | 2020-01-07 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e uma molécula que se ligue ao cd3 humano e ao cd3 de macaco cinomolgo, composição farmacêutica, e, molécula |
TW202016144A (zh) * | 2018-06-21 | 2020-05-01 | 日商第一三共股份有限公司 | 包括cd3抗原結合片段之組成物及其用途 |
EP3973000A4 (en) * | 2019-06-07 | 2023-09-06 | Adimab, LLC | HIGH AFFINITY ANTI-CD3 ANTIBODIES AND METHODS OF GENERATION AND USE THEREOF |
KR20220160598A (ko) * | 2020-03-30 | 2022-12-06 | 고쿠리츠다이가쿠호진 미에다이가쿠 | 이중 특이적 항체 |
CN114656562B (zh) * | 2020-12-23 | 2023-11-03 | 北京天广实生物技术股份有限公司 | 结合人和猴cd3的抗体及其应用 |
EP4317435A1 (en) | 2021-03-29 | 2024-02-07 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Stable multispecific molecule and use thereof |
WO2023061419A1 (en) * | 2021-10-12 | 2023-04-20 | Concept To Medicine Biotech Co., Ltd. | Anti-cd3 antibodies with cross-reactivity to human and cynomolgus proteins |
WO2023169419A1 (en) * | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Antengene (Hangzhou) Biologics Co., Ltd. | Novel anti-cd3 antibodies and uses thereof |
WO2023183766A1 (en) * | 2022-03-20 | 2023-09-28 | Abcellera Biologics Inc. | Anti-cd3 antibodies and t-cell engagers and methods of use |
WO2023178645A1 (zh) * | 2022-03-25 | 2023-09-28 | 嘉和生物药业有限公司 | 靶向cd3的抗体及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009511521A (ja) * | 2005-10-11 | 2009-03-19 | ミクロメット・アクチェンゲゼルシャフト | 交差種特異的(cross−species−specific)抗体を含む組成物および該組成物の使用 |
JP2014517844A (ja) * | 2011-05-21 | 2014-07-24 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | ヒト及び非ヒトcd3に結合可能なcd3結合分子 |
WO2015181098A1 (en) * | 2014-05-28 | 2015-12-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies binding to human and cynomolgus cd3 epsilon |
WO2016076345A1 (ja) * | 2014-11-11 | 2016-05-19 | 中外製薬株式会社 | 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ |
WO2016116626A1 (en) * | 2015-01-23 | 2016-07-28 | Sanofi | Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123 |
Family Cites Families (30)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
US5091513A (en) | 1987-05-21 | 1992-02-25 | Creative Biomolecules, Inc. | Biosynthetic antibody binding sites |
IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
CA2109602C (en) | 1990-07-10 | 2002-10-01 | Gregory P. Winter | Methods for producing members of specific binding pairs |
EP0605522B1 (en) | 1991-09-23 | 1999-06-23 | Medical Research Council | Methods for the production of humanized antibodies |
DE69233782D1 (de) | 1991-12-02 | 2010-05-20 | Medical Res Council | Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken |
EP0656941B1 (en) | 1992-03-24 | 2005-06-01 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
EP0731842A1 (en) | 1993-12-03 | 1996-09-18 | Medical Research Council | Recombinant binding proteins and peptides |
US6214388B1 (en) | 1994-11-09 | 2001-04-10 | The Regents Of The University Of California | Immunoliposomes that optimize internalization into target cells |
US6972323B1 (en) | 1997-04-01 | 2005-12-06 | Sankyo Company, Limited | Anti-Fas antibodies |
WO1999054342A1 (en) | 1998-04-20 | 1999-10-28 | Pablo Umana | Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity |
DE19819846B4 (de) | 1998-05-05 | 2016-11-24 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Multivalente Antikörper-Konstrukte |
ES2568899T3 (es) | 1999-04-09 | 2016-05-05 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional |
JP3871503B2 (ja) | 1999-08-30 | 2007-01-24 | 日本たばこ産業株式会社 | 免疫性疾患治療剤 |
PL357939A1 (en) | 2000-04-11 | 2004-08-09 | Genentech, Inc. | Multivalent antibodies and uses therefor |
ES2651952T3 (es) | 2000-10-06 | 2018-01-30 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Células que producen unas composiciones de anticuerpo |
SI1583830T1 (sl) | 2003-01-07 | 2006-12-31 | Symphogen As | Postopek za pripravo rekombinantnih poliklonskih proteinov |
US7612181B2 (en) | 2005-08-19 | 2009-11-03 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof |
EP2006379B1 (en) | 2006-03-23 | 2016-08-31 | Tohoku University | High functional bispecific antibody |
BRPI0809594A2 (pt) | 2007-04-03 | 2019-08-27 | Micromet Ag | polipeptídeo, seqüência de ácido nucléico, vetor, hospedeiro, processo para a produção de um polipeptídeo, composição farmacêutica, uso de um polipeptídeo, método para prevenção, tratamento ou melhora de uma doença, em um indivíduo com necessidade do mesmo, kit, método para a identificação de um polipeptídeo(s) |
NZ580755A (en) | 2007-04-03 | 2012-05-25 | Micromet Ag | Cross-species-specific cd3-epsilon binding domain |
EP2352765B1 (en) * | 2008-10-01 | 2018-01-03 | Amgen Research (Munich) GmbH | Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody |
EP2270053A1 (en) | 2009-05-11 | 2011-01-05 | U3 Pharma GmbH | Humanized AXL antibodies |
EP2832856A4 (en) | 2012-03-29 | 2016-01-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | ANTI-LAMP5 ANTIBODIES AND USE THEREOF |
EP2839842A1 (en) | 2013-08-23 | 2015-02-25 | MacroGenics, Inc. | Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof |
EP3070168A4 (en) | 2013-11-11 | 2017-06-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule containing modified antibody variable region |
BR112019012901A2 (pt) | 2016-12-22 | 2020-01-07 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do anticorpo, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para produzir um anticorpo ou um fragmento de ligação a antígeno do anticorpo e uma molécula que se ligue ao cd3 humano e ao cd3 de macaco cinomolgo, composição farmacêutica, e, molécula |
-
2017
- 2017-12-21 BR BR112019012901-4A patent/BR112019012901A2/pt unknown
- 2017-12-21 KR KR1020197021178A patent/KR20190121294A/ko active IP Right Grant
- 2017-12-21 IL IL267567A patent/IL267567B1/en unknown
- 2017-12-21 EP EP17884717.4A patent/EP3561057A4/en active Pending
- 2017-12-21 US US16/472,346 patent/US11618785B2/en active Active
- 2017-12-21 CN CN201780079717.1A patent/CN110431231B/zh active Active
- 2017-12-21 MX MX2019007347A patent/MX2019007347A/es unknown
- 2017-12-21 WO PCT/JP2017/046006 patent/WO2018117237A1/ja active Application Filing
- 2017-12-21 IL IL311136A patent/IL311136A/en unknown
- 2017-12-21 AU AU2017379382A patent/AU2017379382A1/en active Pending
- 2017-12-21 JP JP2018558078A patent/JP7202185B2/ja active Active
- 2017-12-21 SG SG10201912366YA patent/SG10201912366YA/en unknown
- 2017-12-21 CA CA3048174A patent/CA3048174A1/en active Pending
- 2017-12-22 TW TW106145218A patent/TW201829467A/zh unknown
-
2019
- 2019-06-18 PH PH12019501387A patent/PH12019501387A1/en unknown
- 2019-07-19 CO CONC2019/0007823A patent/CO2019007823A2/es unknown
-
2022
- 2022-12-23 JP JP2022206884A patent/JP7478222B2/ja active Active
-
2023
- 2023-04-03 US US18/194,987 patent/US20230287119A1/en active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009511521A (ja) * | 2005-10-11 | 2009-03-19 | ミクロメット・アクチェンゲゼルシャフト | 交差種特異的(cross−species−specific)抗体を含む組成物および該組成物の使用 |
JP2014517844A (ja) * | 2011-05-21 | 2014-07-24 | マクロジェニクス,インコーポレーテッド | ヒト及び非ヒトcd3に結合可能なcd3結合分子 |
WO2015181098A1 (en) * | 2014-05-28 | 2015-12-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Antibodies binding to human and cynomolgus cd3 epsilon |
WO2016076345A1 (ja) * | 2014-11-11 | 2016-05-19 | 中外製薬株式会社 | 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ |
WO2016116626A1 (en) * | 2015-01-23 | 2016-07-28 | Sanofi | Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110431231B (zh) | 2024-01-02 |
US11618785B2 (en) | 2023-04-04 |
EP3561057A4 (en) | 2020-09-16 |
BR112019012901A2 (pt) | 2020-01-07 |
SG10201912366YA (en) | 2020-02-27 |
EP3561057A1 (en) | 2019-10-30 |
CO2019007823A2 (es) | 2019-10-09 |
IL311136A (en) | 2024-04-01 |
IL267567A (ja) | 2024-04-01 |
PH12019501387A1 (en) | 2020-02-10 |
US20190359712A1 (en) | 2019-11-28 |
IL267567B1 (en) | 2024-04-01 |
US20230287119A1 (en) | 2023-09-14 |
KR20190121294A (ko) | 2019-10-25 |
CA3048174A1 (en) | 2018-06-28 |
MX2019007347A (es) | 2019-12-05 |
TW201829467A (zh) | 2018-08-16 |
JP7202185B2 (ja) | 2023-01-11 |
AU2017379382A1 (en) | 2019-07-11 |
RU2019122411A3 (ja) | 2021-03-05 |
JP2023027374A (ja) | 2023-03-01 |
JP7478222B2 (ja) | 2024-05-02 |
WO2018117237A1 (ja) | 2018-06-28 |
CN110431231A (zh) | 2019-11-08 |
RU2019122411A (ru) | 2021-01-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7478222B2 (ja) | 抗cd3抗体及び該抗体を含む分子 | |
WO2018147245A1 (ja) | 抗gprc5d抗体及び該抗体を含む分子 | |
US11472880B2 (en) | Humanized antibodies for CD3 | |
TW202124438A (zh) | 新型抗sirpa抗體 | |
AU2020286284A1 (en) | Novel anti-CD39 antibodies | |
KR20220110177A (ko) | 항인간 클라우딘 18.2 항체 및 그의 적용 | |
US11952423B2 (en) | Bispecific antibody | |
US20220041721A1 (en) | Cd3 antigen binding fragment and application thereof | |
US20220324976A1 (en) | Novel anti-cd4 antibodies | |
WO2019022187A1 (ja) | 抗cd147抗体 | |
WO2018047894A1 (ja) | 自己免疫疾患治療用抗体 | |
KR20230074192A (ko) | 인간 cd3 엡실론에 결합하는 신규의 인간 항체 | |
RU2790326C2 (ru) | Анти-сd3-антитело и молекула, содержащая это антитело | |
JP7384668B2 (ja) | 細胞傷害性t細胞枯渇用組成物 | |
CN118126180A (zh) | 抗cd3抗体和包含所述抗体的分子 | |
TW202313699A (zh) | 新型抗sirpa抗體 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20201211 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211102 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220225 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220620 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220818 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20221031 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20221129 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20221223 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7202185 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |