CN110431231A - 抗-cd3抗体和包含所述抗体的分子 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了：能够与人CD3结合的新型抗体；或能够与抗原结合并含有所述抗体的分子。提供了：与人CD3结合的新型抗体；含有所述抗体并且能够与抗原结合的分子；含有所述抗体或所述分子作为活性成分并且具有细胞毒性活性的药物组合物；等等。

Description

抗-CD3抗体和包含所述抗体的分子
[技术领域]
本发明涉及与人CD3结合且与食蟹猴CD3结合的新型抗体，和包含所述抗体的分子。
[背景技术]
1）与任何其它单克隆抗体一样，抗CD3单克隆抗体通过精确识别其靶分子起作用。每种抗CD3抗体仅识别靶CD3分子上的单个表位。在对于CD3复合物特异的单克隆抗体中，OKT3是最广泛使用和最佳表征的。
2）OKT3是小鼠衍生的抗人CD3单克隆抗体（非专利文件1）。抗CD3单克隆抗体已在手术中施用，以预防移植的器官被排斥。抗体与人T细胞上的TCR复合物结合并且抑制其活化和增殖。该治疗已使用很长时间，以便预防器官的同种移植排斥（非专利文件2至4）。OKT3是用于此类手术中的第一种抗CD3抗体。OKT3具有强免疫抑制效应，但由于与其免疫原性和促有丝分裂潜力相关的严重不良反应，其临床使用受到阻碍（非专利文件5至8）。
3）OKT3在体外诱导T细胞活化和细胞因子产生，并且在体内释放大量细胞因子，导致细胞因子综合征（非专利文件5）。这是因为OKT3是二价IgG分子，并且因此使T细胞和表达Fcγ受体的细胞交联，因而引起T细胞活化（非专利文件8）。另外，OKT3是小鼠抗体，并且因此已知通过长期施用引起异嗜性抗体如人抗小鼠抗体（HAMA）（非专利文件7）。关于抗CD3抗体治疗的应用及其不良反应的报道在下文概括（专利文件1）。
4）为了解决这些问题，已产生了scFv格式化的OKT3（非专利文件9）和人源化的OKT3（非专利文件10）。在OKT3应用的另一个实例中已报道了将OKT3的单链与针对在癌细胞的表面上表达的靶抗原的单链抗体组合的双特异性抗体（专利文件2和非专利文件11）。
5）现有技术中描述的包含抗CD3抗体的多特异性抗体预期在恶性疾病的治疗中具有显著的治疗潜力。例如，已知TROP2在各种类型的上皮肿瘤中过表达（非专利文件12至16）。尚未报道表达的双特异性抗体，其将人TROP2特异性抗体与抗CD3抗体的抗原结合片段遗传连接。
6）OKT3与黑猩猩CD3反应，但不与衍生自其它灵长类动物如食蟹猴的CD3反应（非专利文件17）。同样地，抗CD3单克隆抗体UCHT-1也与黑猩猩衍生的CD3反应，但不与食蟹猴衍生的CD3反应（非专利文件18）。另一方面，已发现一些单克隆抗体，其识别食蟹猴抗原，但不识别其人配对物。来自该组的一个实例是FN-18，其是针对食蟹猴衍生的CD3的单克隆抗体（非专利文件19）。
7）OKT3和一系列修饰的OKT3抗体的局限性是其对人CD3的特异性。这种局限性可能对开发用于治疗人疾病的治疗药物构成相当大的障碍。这是因为用于开发的候选药物需要经受临床前试验以获得上市许可，并且期望对动物，特别是高等灵长类动物如食蟹猴进行此类临床前试验。因此，在含有抗CD3抗体的候选药物的情况下，非常期望使用能够与人CD3和食蟹猴CD3两者结合的抗CD3抗体。
8）在专利文件3和4以及非专利文件20中报道了与人CD3和食蟹猴CD3两者结合的交叉反应性抗体。另外，已报道了双特异性抗体，其中此类抗CD3抗体的单链与针对癌细胞表面上表达的靶抗原的单链抗体结合（专利文件5和非专利文件21）。然而，为了能够将多特异性抗体或多特异性分子应用于高度多样化的适用癌症靶，需要结合除上述那些外的表位并且与人和食蟹猴CD3两者结合的抗CD3抗体。
[现有技术]
[专利文件]
[专利文件1]国际公开号WO2012/162067
[专利文件2]国际公开号WO2007/108152A1
[专利文件3]美国专利公开号8236308B2
[专利文件4]国际公开号WO2008/119567A1
[专利文件5]国际公开号WO2015/026892A1
[非专利文件]
[非专利文件1] Salmeron A.等人，J. Immunol.（1991）147，3047-3052
[非专利文件2] Cosmi AB.等人，Transplantation（1981）32，535-539
[非专利文件3] Gilbert EM.等人，Am.J.Med.（1987）82，202-206
[非专利文件4] Thistlethwaite JR.等人，Transplanation（1987）43，176-184
[非专利文件5] Abramowicz D.等人，Transplanation（1989）47，606-608
[非专利文件6] Toussaint D.等人，Transplanation（1989）48，524-526
[非专利文件7] Thistlethwaite，JR.等人，Am. J. Kidney Dis.（1988）11，112-119
[非专利文件8] Meuer，SC.等人，Eur. J. Immunol.（1986）136，4106-4112
[非专利文件9] George AJ.等人，J. Immunol.（1994）152（4），1802-11
[非专利文件10] Woodle ES.等人，J Immunol.（1992）148（9），2756-63
[非专利文件11] Yankelevich M.等人，Pediatr. Blood Cancer（2012）59（7），1198-1205
[非专利文件12] Ohmachi T.等人，Clin. Cancer Res.（2006）12（18），3857-3863
[非专利文件13] Muhlmann G.等人，J. Clin. Pathol.（2009）62（2），152-158
[非专利文件14] Fong D.等人，Br. J. Cancer（2000）99（8），1290-1295.
[非专利文件15] Fong D.等人，Mod. Pathol.（2000）21（2）（2000），186-191
[非专利文件16] Ning S.等人，Neurol. Sci.（2013）34（10），1745-1750
[非专利文件17] Sandusky等人，J. Med. Primatol.（1986）15，441-451
[非专利文件18] http://www.nhpreagents.org/NHP/clonelist.aspxID=77
[非专利文件19] Uda等人，J.Med.Primatol.（2001）30，141-147
[非专利文件20] Conrad ML.等人，Cytometry A.（2007）71（11），925-33
[非专利文件21] Lum LG.等人，BioDrugs（2011）25（6），365-379。
[发明概述]
[待通过本发明解决的问题]
本发明的一个目的是提供与人CD3和食蟹猴CD3结合的新型抗体或抗体的抗原结合片段（下文中，也称为抗体等），包含该抗体等并且进一步包含1或2种或更多种另外的抗体或抗体的抗原结合片段的分子，所述分子是多特异性的，以及包括所述抗体等或分子作为活性成分的具有细胞毒性活性等的药物组合物。
[用于解决问题的手段]
本发明人已进行了广泛的研究以达到该目的，并且通过开发新型抗CD3抗体和包含该抗体的分子实现了本发明。
具体地，本发明涵盖下述方面：
（1）一种抗体或抗体的抗原结合片段，其特征在于：
包括以下的重链序列：
包含通过SEQ ID NO：26表示的氨基酸序列的CDRH1，
包含通过SEQ ID NO：98表示的氨基酸序列的CDRH2，和
包含通过SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列的CDRH3；
包括以下的轻链序列：
包含通过SEQ ID NO：29表示的氨基酸序列的CDRL1，
包含通过SEQ ID NO：99表示的氨基酸序列的CDRL2，和
包含通过SEQ ID NO：31表示的氨基酸序列的CDRL3；和
该抗体或抗原结合片段与人CD3和食蟹猴CD3结合。
（2）根据（1）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中
在CDRH2中
第一Xaa选自A、E、G、H、I、L、T、V、R和S，和
第二Xaa是S，或
第一Xaa是N，和
第二Xaa选自E、R、F、Y、L、V、I、K和T，
在CDRL2中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D，和
该抗体或抗原结合片段与人CD3和食蟹猴CD3结合。
（3）根据（1）或（2）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中
在CDRH2中，
第一Xaa选自R和S，并且第二Xaa是S，
在CDRL2中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D，和
该抗体或抗原结合片段与人CD3和食蟹猴CD3结合。
（4）根据（1）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中
重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，
CDRH1由通过SEQ ID NO：26表示的氨基酸序列组成，
CDRH2由通过SEQ ID NO：27表示的氨基酸序列组成，和
CDRH3由通过SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列组成；
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，
CDRL1由通过SEQ ID NO：29表示的氨基酸序列组成，
CDRL2由通过SEQ ID NO：30表示的氨基酸序列组成，和
CDRL3由通过SEQ ID NO：31表示的氨基酸序列组成；和
该抗体或抗原结合片段与人CD3和食蟹猴CD3结合。
（5）根据（1）至（4）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区序列包含通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列。
（6）根据（5）的抗体或其抗原结合片段，其中
在通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列中，
第一Xaa选自A、E、G、H、I、L、T、V、R和S，和
第二Xaa是S，或
第一Xaa是N，和
第二Xaa选自E、R、F、Y、L、V、I、K和T。
（7）根据（5）的抗体或其抗原结合片段，其中
在通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列中，
第一Xaa选自R和S，并且第二Xaa是S。
（8）根据（1）至（7）中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列。
（9）根据（8）的抗体或其抗原结合片段，其中
在通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D。
（10）根据（5）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区序列包含通过SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列。
（11）根据（8）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述轻链可变区序列包含通过SEQ ID NO：17、20和23中任何一个表示的氨基酸序列。
（12）根据（1）或（2）的抗体或其结合片段，其中所述抗体或抗体结合片段包括包含通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列的重链可变区，并且包含通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列的轻链可变区，其中
在通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列中，
第一Xaa选自A、E、G、H、I、L、T、V、R和S，并且第二Xaa是S，或
第一Xaa是N，并且第二Xaa选自E、R、F、Y、L、V、I、K和T，和
在通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D。
（13）根据（12）的抗体或其结合片段，其中
在SEQ ID NO：100中
第一Xaa选自R和S，和
第二Xaa是S，和
在通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D。
（14）根据（13）的抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：60的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：60的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：64的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：64的第135至第241氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：66的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：66的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：68的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：68的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：70的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：70的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：72的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：72的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：74的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：74的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：76的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：76的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：78的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：78的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：80的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：80的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：82的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：82的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，或
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：84的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：84的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区。
（15）根据（1）、（4）、（5）、（8）、（10）或（11）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含通过SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列的重链可变区，接头和包含通过SEQ ID NO：17、20和23中任何一个表示的氨基酸序列的轻链可变区。
（16）根据（1）至（15）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链可变区以这种次序与轻链可变区结合，或轻链可变区以这种次序与重链可变区结合，所述次序从氨基末端起，并且任选地：i）具有在两个可变区之间的接头，ii）具有在氨基末端侧上的可变区的氨基末端处的甘氨酸残基，以及iii）具有在羧基末端侧上的可变区的羧基末端处的接头、FLAG标签和/或HIS标签。
（17）根据（16）的抗体或抗体的抗原结合片段，其包括
包含SEQ ID NO：64的第2至第241氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：66的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：68的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：70的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：72的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：74的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：75的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：76的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：80的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：82的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，或
包含SEQ ID NO：84的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列。
（18）根据（16）的抗体或抗体的抗原结合片段，其包括
包含SEQ ID NO：19的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：22的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：25的第2至第267氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：60的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：64的第2至第267氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：66的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：68的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：70的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：72的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：74的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：76的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：78的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：80的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：82的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，或
包含SEQ ID NO：84的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列。
（19）一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含由多核苷酸中包含的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸在严格条件下与包括核苷酸序列的多核苷酸的互补链杂交，所述核苷酸序列编码根据（14）至（18）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的氨基酸序列，并且与人CD3和食蟹猴CD3结合。
（20）一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包括与根据（14）至（18）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的重链的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列，所述轻链包括与根据（14）至（18）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的轻链的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列，并且与人CD3和食蟹猴CD3结合。
（21）一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包括的氨基酸序列通过1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自根据（14）至（18）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的重链中包含的氨基酸序列，所述轻链包括的氨基酸序列通过1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自根据（14）至（18）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的轻链中包含的氨基酸序列，并且与人CD3和食蟹猴CD3结合。
（22）一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合人CD3上与由根据（14）至（18）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段所结合的相同的位点，并且与食蟹猴CD3结合。
（23）一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与根据（14）至（18）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段竞争结合人CD3，并且与食蟹猴CD3结合。
（24）根据（22）的抗体或抗体的抗原结合片段，其中在人CD3上由所述抗体结合的位点由选自以下的7个或更多个氨基酸构成：通过SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中的第55丝氨酸（Ser）、第56谷氨酸（Glu）、第58亮氨酸（Leu）、第59色氨酸（Trp）、第65天冬酰胺（Asn）、第66异亮氨酸（Ile）、第77丝氨酸（Ser）、第78天冬氨酸（Asp）、第101精氨酸（Arg）、第101甘氨酸（Gly）、第103丝氨酸（Ser）、第104赖氨酸（Lys）和第105脯氨酸（Pro）。
（25）根据（1）至（17）和（19）至（24）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体是IgG。
（26）根据（1）至（23）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F（ab）'、Fv、scFv和sdAb。
（27）根据（1）至（17）和（19）至（25）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体是包括人免疫球蛋白恒定区的人源化抗体或人抗体。
（28）一种多核苷酸，其包含编码根据（1）至（27）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列。
（29）根据（27）的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码通过以下表示的氨基酸序列的核苷酸序列：
包含SEQ ID NO：19的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：22的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：25的第2至第241氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：60的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：64的第2至第241氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：66的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：68的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：70的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：72的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：74的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：76的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：78的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：80的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：82的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
或
包含SEQ ID NO：84的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列。
（30）一种载体，其包含根据（28）或（29）的多核苷酸。
（31）一种细胞，其包含根据（28）或（29）的多核苷酸或者根据（30）的载体，或者产生（1）至（27）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。
（32）一种用于生产与人CD3和食蟹猴CD3结合的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，该方法包括以下步骤：培养根据（31）的细胞；并且从培养物中回收与人CD3结合的抗体或抗体的抗原结合片段。
（33）一种抗体或抗体的抗原结合片段，其与人CD3和食蟹猴CD3结合，该抗体或抗原结合片段通过根据（32）的方法获得。
（34）一种药物组合物，其包含根据（1）至（27）和（33）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段作为活性成分。
（35）一种具有抗原结合活性的分子，其包含根据（1）至（27）和（33）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。
（36）根据（35）的分子，其中所述分子是多特异性的。
（37）根据（35）或（36）的分子，除根据（1）至（27）和（33）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段之外，其还包含1或2种或更多种另外的抗体或抗体的抗原结合片段。
（38）根据（37）的分子，其中所述另外的抗体的抗原结合片段是Fab、F（ab）'、Fv、scFv或sdAb。
（39）根据（38）的分子，其中所述分子包含Fc。
（40）根据（37）至（38）中任一项的分子，其中所述另外的抗体是人源化抗体或包含人免疫球蛋白恒定区的人抗体。
（41）根据（37）至（38）中任一项的分子，其中所述另外的抗体或抗体的抗原结合片段经由接头或无需接头与根据（1）至（27）和（33）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段结合。
（42）根据（41）的分子，其中所述另外的抗体或抗体的抗原结合片段的氨基酸序列的羧基末端与接头结合，并且所述接头的氨基酸序列的羧基末端进一步由根据（1）至（27）和（33）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段结合。
（43）根据（42）的分子，其中所述分子包含氨基酸序列，其中所述另外的抗体或抗体的抗原结合片段的氨基酸序列的羧基末端与接头结合，并且所述接头的氨基酸序列的羧基末端进一步由以下结合：
包含SEQ ID NO：19的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：22的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，或
包含SEQ ID NO：25的第2至第241氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段。
（44）根据（35）至（42）中任一项的分子，其包含根据（1）至（27）和（33）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述可变区包含以这种次序的重链可变区和轻链可变区、或以这种次序的轻链可变区和重链可变区，所述次序从氨基末端起，并且任选地：i）具有在两个可变区之间的接头，ii）具有在氨基末端侧上的可变区的氨基末端处的甘氨酸残基，以及iii）具有在羧基末端侧上的可变区的羧基末端处的接头、FLAG标签和/或HIS标签。适用的形式包括杂合型和双型双特异性分子。
（45）根据（44）的分子，其中所述另外的抗体或抗体的抗原结合片段由以下结合：
包含SEQ ID NO：19的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：25的第2至第241氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：60的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：64的第2至第241氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：66的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：68的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：70的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：72的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：74的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：76的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：78的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：80的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：82的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，或
包含SEQ ID NO：84的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段。适用的形式包括杂合型和双型双特异性分子。
（46）根据（36）至（45）中任一项的分子，其中所述另外的抗体是抗癌靶抗体。
（47）根据（36）至（46）中任一项的分子，其中所述分子是双特异性的。
（48）根据（35）至（47）中任一项的分子，其中所述分子是多肽。
（49）一种多核苷酸，其包含编码根据（48）的分子的氨基酸序列的核苷酸序列。
（50）一种载体，其包含根据（49）的多核苷酸。
（51）一种细胞，其产生根据（49）的多核苷酸或根据（50）的载体、或者根据（48）的分子。
（52）一种用于产生与人CD3和食蟹猴CD3结合的分子的方法，该方法包括以下步骤：培养根据（51）的细胞；并且从培养物中回收与人CD3结合的分子。
（53）一种与人CD3和食蟹猴CD3结合的分子，该分子通过根据（52）的方法获得。
（54）一种药物组合物，其包含（35）至（48）和（53）中任一项的分子作为活性成分。
（55）根据（54）的药物组合物，其中所述药物组合物通过将T细胞重定向至靶细胞而在靶细胞中诱导细胞毒性。
[发明效果]
本发明能够获得新型抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段，其与人CD3结合并且与食蟹猴CD3结合，以及包括抗体等的具有抗原结合活性的新型分子。另外，获得了新型药物组合物，其包括此类抗体等或分子作为活性成分。抗体等或分子具有T细胞依赖性细胞毒性活性，并且可用作用于各种疾病如癌症的治疗剂或预防剂。
[附图简述]
[图1]图1是显示人CD3ε的氨基酸序列的图。
[图2]图2是显示人CD3δ的氨基酸序列的图。
[图3]图3是显示编码人CD3εγ单链抗原的核苷酸序列的图。
[图4]图4是显示人CD3εγ单链抗原的氨基酸序列的图。
[图5]图5是显示用于重链基因扩增的有义引物Nhe-polyC-S的核苷酸序列的图。
[图6]图6是显示用于重链基因扩增的第一反义引物rIgγ-AS1的核苷酸序列的图。
[图7]图7是显示用于重链基因扩增的第二反义引物rIgγ-AS2的核苷酸序列的图。
[图8]图8是显示用于轻链基因扩增的有义引物Nhe-polyC-S2的核苷酸序列的图。
[图9]图9是显示用于轻链基因扩增的第一反义引物rIgL-AS1的核苷酸序列的图。
[图10]图10是显示用于轻链基因扩增的第二反义引物rIgL-AS2的核苷酸序列的图。
[图11]图11是显示用于重链测序的有义引物rIgγ-seq的核苷酸序列的图。
[图12]图12是显示用于轻链测序的反义引物1 rIgL-seq1的核苷酸序列的图。
[图13]图13是显示用于轻链测序的反义引物2 rIgL-seq2的核苷酸序列的图。
[图14]图14是显示编码C3-147的重链可变区的核苷酸序列的图。
[图15]图15是显示C3-147的重链可变区的氨基序列的图。
[图16]图16是显示编码C3-147的轻链可变区的核苷酸序列的图。
[图17]图17是显示C3-147的轻链可变区的氨基序列的图。
[图18]图18是显示G4S接头有义链的寡核苷酸序列的图。
[图19]图19是显示G4S接头反义链的寡核苷酸序列的图。
[图20]图20是显示编码C3E-7000的核苷酸序列的图。
[图21]图21是显示C3E-7000中的氨基酸序列的图。
[图22]图22是显示C3E-7034的重链可变区的氨基酸序列的图。
[图23]图23是显示C3E-7034的轻链可变区的氨基酸序列的图。
[图24]图24是显示C3E-7000中的CDR-H1的氨基酸序列的图。
[图25]图25是显示C3E-7000中的CDR-H2的氨基酸序列的图。
[图26]图26是显示C3E-7000中的CDR-H3的氨基酸序列的图。
[图27]图27是显示C3E-7000中的CDR-L1的氨基酸序列的图。
[图28]图28是显示C3E-7000中的CDR-L2的氨基酸序列的图。
[图29]图29是显示C3E-7000中的CDR-L3的氨基酸序列的图。
[图30]图30是显示C3E-7035的轻链可变区的氨基酸序列的图。
[图31]图31是显示C3E-7035的氨基酸序列的图。
[图32]图32是显示C3E-7036的轻链可变区的氨基酸序列的图。
[图33]图33是显示C3E-7036的氨基酸序列的图。
[图34]图34是显示编码C3E-7034的核苷酸序列的图。
[图35]图35是显示编码C3E-7035的核苷酸序列的图。
[图36]图36是显示编码C3E-7036的核苷酸序列的图。
[图37]图37是显示人CD3γ的氨基酸序列的图。
[图38]图38是显示C3E-7034的氨基酸序列的图。
[图39]图39是显示CD3εγ和C3E-7034的复杂结构的图。
[图40]图40是显示CD3εγ与C3E-7034的重链和轻链之间的相互作用的一对图。
图40A是与C3E-7034和CD3ε的轻链可变区有关的图，其中在彼此4埃的距离内的CD3ε的氨基酸残基由模型中的粗棒指示，而另一个氨基酸由模型中的细棒指示。
图40B是与C3E-7034和CD3ε的轻链可变区有关的图，其中在彼此4埃的距离内的CD3ε的氨基酸残基由模型中的粗棒指示，而另一个氨基酸由模型中的细棒指示。
[图41]图41是显示人CD3ε与C3E-7034中的重链和轻链可变区序列的相互作用位点的图。
[图42]图42是显示OKT3中的重链可变区的氨基酸序列的图。
[图43]图43是显示C3E-3007中的重链可变区的氨基酸序列的图。
[图44]图44是显示OKT3中的轻链可变区的氨基酸序列的图。
[图45]图45是显示C3E-3007中的轻链可变区的氨基酸序列的图。
[图46]图46是显示编码C3E-3007 scFv的核苷酸序列的图。
[图47]图47是显示C3E-3007 scFv的氨基酸序列的图。
[图48]图48是显示C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036（其为人源化抗CD3scFv）与人CD3（PBMC）的结合活性的图。
[图49]图49是显示C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036（其为人源化抗CD3scFv）与食蟹猴CD3（PBMC）的结合活性的图。
[图50]图50A是显示C3E-7034和C3E-3007（其为人源化抗CD3 scFv）对人CD8阳性细胞的激活作用的图，并且图50B是显示C3E-7034和C3E-3007（其为人源化抗CD3 scFv）对食蟹猴CD8阳性细胞的激活作用的图。
[图51]图51是显示HT1-11 scFv的氨基酸序列的图。
[图52]图52是显示编码HT1-11 scFv的核苷酸序列的图。
[图53]图53是显示HT1-11 scFv与人TROP2阳性细胞系结合的一对图。
图53A是显示与咽部鳞状细胞癌细胞系FaDu的结合的图。
图53B是显示与胰腺癌细胞系HPAF-II的结合的图。
[图54]图54是显示编码T2C-0001的ORF核苷酸序列的图。
[图55]图55是显示编码T2C-0003的ORF核苷酸序列的图。
[图56]图56是显示编码T2C-0005的ORF核苷酸序列的图。
[图57]图57是显示编码T2C-0006的ORF核苷酸序列的图。
[图58]图58是显示T2C-0001的氨基酸序列的图。
[图59]图59是显示T2C-0003的氨基酸序列的图。
[图60]图60是显示T2C-0005的氨基酸序列的图。
[图61]图61是显示T2C-0006的氨基酸序列的图。
[图62]图62是显示抗TROP2-CD3双特异性分子T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005和T2C-0006与TROP2阳性细胞系结合的一对图。
图62A是显示与咽部鳞状细胞癌细胞系FaDu的结合的图。
图62B是显示与胰腺癌细胞系HPAF-II的结合的图。
[图63]图63是显示抗TROP2-CD3双特异性分子T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005和T2C-0006与人CD3（PBMC）的结合活性的图。
[图64]图64是显示抗TROP2-CD3双特异性分子T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005和T2C-0006与食蟹猴CD3（PBMC）的结合活性的图。
[图65]
图65A是显示在咽部鳞状细胞癌细胞系FaDu中表达的TROP2的图。
图65B是显示在胰腺癌细胞系HPAF-II中表达的TROP2的图。
图65C是显示TROP2不在肺癌细胞系Calu-6中表达的图。
[图66]
图66A是显示抗-TROP2-CD3双特异性分子T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005和T2C-0006在人PBMC的存在下具有针对咽部鳞状细胞癌细胞系FaDu的细胞毒性活性的图。
图66B是显示抗-TROP2-CD3双特异性分子T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005和T2C-0006在人PBMC的存在下具有针对胰腺癌细胞系HPAF-II的细胞毒性活性的图。
图66C是显示抗-TROP2-CD3双特异性分子T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005和T2C-0006在人PBMC的存在下未显示出针对人肺癌细胞系Calu-6的细胞毒性活性的图。
[图67]图67是显示编码C3E-7078的核苷酸序列的图。
[图68]图68是显示C3E-7078的氨基酸序列的图。
[图69]图69是显示编码C3E-7079的核苷酸序列的图。
[图70]图70是显示C3E-7079的氨基酸序列的图。
[图71]图71是显示编码C3E-7085的核苷酸序列的图。
[图72]图72是显示C3E-7085的氨基酸序列的图。
[图73]图73是显示编码C3E-7086的核苷酸序列的图。
[图74]图74是显示C3E-7086的氨基酸序列的图。
[图75]图75是显示编码C3E-7087的核苷酸序列的图。
[图76]图76是显示C3E-7087的氨基酸序列的图。
[图77]图77是显示编码C3E-7088的核苷酸序列的图。
[图78]图78是显示C3E-7088的氨基酸序列的图。
[图79]图79是显示编码C3E-7089的核苷酸序列的图。
[图80]图80是显示C3E-7089的氨基酸序列的图。
[图81]图81是显示编码C3E-7090的核苷酸序列的图。
[图82]图82是显示C3E-7090的氨基酸序列的图。
[图83]图83是显示编码C3E-7091的核苷酸序列的图。
[图84]图84是显示C3E-7091的氨基酸序列的图。
[图85]图85是显示编码C3E-7092的核苷酸序列的图。
[图86]图86是显示C3E-7092的氨基酸序列的图。
[图87]图87是显示编码C3E-7093的核苷酸序列的图。
[图88]图88是显示C3E-7093的氨基酸序列的图。
[图89]图89是显示编码C3E-7094的核苷酸序列的图。
[图90]图90是显示C3E-7094的氨基酸序列的图。
[图91]图91是显示编码C3E-7095的核苷酸序列的图。
[图92]图92是显示C3E-7095的氨基酸序列的图。
[图93]图93是显示编码引物HN53R Fw的核苷酸序列的图。
[图94]图94是显示编码引物HN53R Rv的核苷酸序列的图。
[图95]图95是显示编码引物HN53S Fw的核苷酸序列的图。
[图96]图96是显示编码引物HN53S Rv的核苷酸序列的图。
[图97]图97是显示编码AXC-0001的ORF核苷酸序列的图。
[图98]图98是显示AXC-0001的氨基酸序列的图。
[图99]图99是显示编码AXC-0002的ORF核苷酸序列的图。
[图100]图100是显示AXC-0002的氨基酸序列的图。
[图101]图101是显示编码MGC-0001的ORF核苷酸序列的图。
[图102]图102是显示MGC-0001的氨基酸序列的图。
[图103]图103是显示编码MGC-0002的ORF核苷酸序列的图。
[图104]图104是显示MGC-0002的氨基酸序列的图。
[图105]图105显示在抗CD3抗体的CDR变体制备中使用的引物列表。
[图106-1]图106-1是显示抗CD3抗体的CDR变体与人和食蟹猴CD3（PBMC）的结合活性的图。
[图106-2]图106-2是显示抗CD3抗体的CDR变体与人和食蟹猴CD3（PBMC）的结合活性的图。
[图107]图107是显示人肺癌细胞系A549（A）、人胰腺癌细胞系PANC-1（B）、人胰腺癌细胞系MIA PaCa-2（C）、人骨髓瘤细胞系U266B1（D）和套细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1（E）中的Axl表达的图。
[图108]图108A、108B和108C各自是显示抗Axl CD3双特异性分子AXC-0001和AXC-0002在人PBMC的存在下具有针对Axl表达细胞系的细胞毒性活性的图。图108D和108E各自是显示抗-CD1CD3双特异性分子AXC-0001和AXC-0002在人PBMC的存在下不具有针对非Ax1表达细胞系的细胞毒性活性的图。
[图109]图109是显示MAG-032 scFv在补充有MAGEC1肽（A）或DMSO（B）的人淋巴母细胞融合细胞系T2细胞中的结合活性的图。
[图110]
图110A是显示抗-HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子MGC-0001和MGC-0002在人PBMC的存在下具有针对补充有MAGEC1肽的T2细胞的细胞毒性活性的图。
图110B是显示抗-HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子MGC-0001和MGC-0002在人PBMC的存在下不具有针对补充有DMSO的T2的细胞毒性活性的图。
[图111]图111是显示MAGEC1肽的氨基酸序列的图。
[图112]图112是显示CDR变体的CDRH2区域中的氨基酸序列的图。第一Xaa和第二Xaa各自代表任意的天然氨基酸残基。
[图113]图113是显示CDR变体的CDRL2区域中的氨基酸序列的图。Xaa代表任意的天然氨基酸残基。
[图114]图114是显示C3E-7034的CDR变体的重链可变区的氨基酸序列的图。第一Xaa和第二Xaa各自代表任意的天然氨基酸残基。
[图115]图115是显示C3E-7034的CDR变体的轻链可变区中的氨基酸序列的图。Xaa代表任意的天然氨基酸残基。
[图116]图116是显示C3E-7035的CDR变体的轻链可变区中的氨基酸序列的图。Xaa代表任意的天然氨基酸残基。
[图117]图117是显示C3E-7036的CDR变体的轻链可变区中的氨基酸序列的图。Xaa代表任意的天然氨基酸残基。
[发明的实施方案]
1. 定义
在本发明中，术语“基因”意指包含编码蛋白质的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸或其互补链。“基因”意欲包括例如多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA和cRNA，作为包含编码蛋白质的氨基酸的核苷酸序列的核苷酸或其互补链。此类基因是单链、双链、三链或其它多链核苷酸。“基因”还意欲包括DNA和RNA链的聚集体，在一条核苷酸链上的核糖核苷酸（RNA）和脱氧核糖核苷酸（DNA）的混合物，和包含此类核苷酸链的双链、三链或其它多链核苷酸。在本发明中，术语“碱基序列”和“核苷酸序列”具有相同的含义。
在本发明中，术语“多核苷酸”具有与“核酸”和“核酸分子”相同的含义，并且还意欲包括例如任何DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。此类多核苷酸是单链、双链、三链或其它多链多核苷酸。“多核苷酸”还意欲包括DNA和RNA链的聚集体，在一条多核苷酸链上的核糖核苷酸（RNA）和脱氧核糖核苷酸（DNA）的混合物，和包含此类多核苷酸链的双条链或三条链或更多条链的聚集体。
在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”具有相同的含义。
在本发明中，术语“抗原”有时用于意指“免疫原”。
在本发明中，术语“细胞”还包括例如衍生自个别动物、传代培养细胞、原代培养细胞、细胞系、重组细胞和微生物细胞的任何细胞。
在本发明中，术语“抗体”具有与免疫球蛋白相同的含义。然而，用于本发明的抗CD3抗体的“抗体”意指具有恒定区和可变区的免疫球蛋白。抗体并无特别限制，并且可以是天然免疫球蛋白或者可以是通过部分或完全合成产生的免疫球蛋白。本发明的抗CD3抗体包括在下文描述的“分子”中。
四聚体抗体的基本结构由两条相同的轻（L）链和两条相同的重（H）链构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接。取决于重链的同种型，两条重链通过一个或多个二硫键彼此连接。轻链和重链各自具有规则间隔的链内二硫键。重链和轻链各自含有显示出极高程度的氨基酸序列相似性的恒定区和显示出低程度的氨基酸序列相似性的可变区。轻链具有在氨基末端处的可变区（VL），随后为恒定区（CL）。重链具有在氨基末端处的可变区（VH），随后为三个恒定区（CH1、CH2和CH3）。VL和VH配对，并且CL与重链的第一恒定区（CH1）对齐。VL和VH配对形成单个抗原结合位点。
本发明的抗体的恒定区并无特别限制。优选地，衍生自人抗体的恒定区用于本发明的抗体中，用于治疗或预防人中的疾病。人抗体中的重链恒定区的实例包括Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε。人抗体中的轻链恒定区的实例包括Cκ和Cλ。
Fab由重链CH1随后为VH，并且轻链CL随后为VL组成。VH和VL各自含有互补决定区（CDR）。
Fc由重链恒定区的羧基末端区域构成，并且是含有CH2和CH3的二聚体。本发明的Fc可以是具有天然序列的Fc，或者可以是在天然序列中含有突变的Fc的突变形式。
可变区由具有极端可变性、称为高变区（HVR）的区域，以及被高变区中断、称为构架区（FR）的相对不变的区域组成。天然重链和轻链可变区各自含有由三个高变区连接的四个FR。每条链的高变区连同通过FR的另一条链的高变区保持紧密接近，并且促成抗体中抗原结合位点的形成。
已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个互补决定区（CDR）。互补决定区也称为高变区。这些区域位于抗体重链和轻链的可变区中。这些位点具有特别高度可变的一级结构，并且通常在重链和轻链多肽链的相应一级结构上的三个位置处分开。在本发明中，抗体的互补决定区对于重链的互补决定区从重链氨基酸序列的氨基末端起称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，并且对于轻链的互补决定区从轻链氨基酸序列的氨基末端起称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。这些位点在三维结构中彼此接近，并且决定对于待结合的抗原的特异性。
在本发明中，CDR的位置和长度根据IMGT定义（Developmental and ComparativeImmunology 27（2003）55-77）确定。
构架区（FR）是除了CDR残基之外的可变区。每个可变区通常具有四个FR，即FR1、FR2、FR3和FR4。
CDR和FR的位置也可以根据本领域众所周知的其它定义来确定，例如，IMGT定义以及Kabat、Chothia、AbM和接触定义。
在本发明中，术语“抗体的抗原结合片段”意指具有重链和轻链可变区并且对抗原具有结合活性的部分抗体片段。“抗体中的抗原结合片段”的实例包括但不限于抗原结合片段，例如Fab、F（ab'）2、scFv、Fab'、Fv和单结构域抗体（sdAb）。此类抗体的抗原结合片段可以通过用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体蛋白质的全长分子来获得，或者可以是使用重组基因在适当的宿主细胞中产生的重组蛋白质。
在本发明中，抗体与之结合的“位点”，即由抗体识别的“位点”，意指由抗体结合或识别的抗原上的部分肽或部分高级结构。
在本发明中，此类位点也称为表位或抗体结合位点。
在本发明中，术语“抗体突变体”意指这样的多肽，其具有的氨基酸序列通过氨基酸的取代、缺失和/或添加（“添加”包括插入）（下文统称为“突变”）而衍生自原始抗体的氨基酸序列，并且与本发明的CD3结合。此类抗体突变体中的突变氨基酸数目是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40或50。此类抗体突变体可以是本发明的“抗体”。
在本发明中，“1或更多”中的术语“更多”指2至10的数目。
在本说明书中，术语“分子”是包含上述抗体或抗体的抗原结合片段的分子，并且还包括由抗体或由其衍生的多个抗原结合片段形成的多特异性分子。
在本说明书中，术语“其为多特异性的分子”具有与“多特异性分子”相同的含义。此类多特异性分子并无特别限制，只要该分子能够结合一个分子上彼此不同的多个表位，和/或两个或多个分子上彼此不同的表位。其为多特异性的分子还包括包含重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的抗体。此类多特异性分子的实例包括但不限于具有两种或更多种类型的重链和两种或更多种类型的轻链的全长抗体分子，即IgG型多特异性分子，以及由两种或更多种类型的具有VL和VH的抗原结合片段组成的分子，即通过Fab、Fab'、Fv、scFv、sdAb等的组合衍生的分子（即，串联scFv、双抗体、单链双抗体和三抗体）。另外，多特异性分子中还包括通过将具有抗原结合活性而无免疫球蛋白骨架的蛋白质与抗原结合片段遗传或化学连接形成的分子。
由本发明的抗CD3抗体、本发明的抗体的抗原结合片段、或本发明的多特异性分子实现的活性或性质的实例可以包括生物活性或物理化学性质，并且可以具体包括各种生物活性、针对抗原或表位的结合活性、在生产或贮存期间的稳定性，并且热稳定性。
在本发明中，短语“在严格条件下杂交”意指在涉及以下的条件下的杂交：在65℃下在含有5 × SSC的溶液中的杂交，随后为在65℃下在含有2 × SSC-0.1% SDS的水溶液中20分钟、在65℃下在含有0.5 × SSC-0.1% SDS的水溶液中20分钟，并且在65℃下在含有0.2 × SSC-0.1% SDS的水溶液中20分钟的洗涤，或在等价条件下的杂交。SSC意指150 mMNaCl-15 mM柠檬酸钠的水溶液，并且n × SSC意指具有n倍浓度的SSC。
在本发明中，术语“细胞毒性”指在细胞中造成的一些病理变化，并且不仅意指直接创伤，还意指对细胞的任何结构或功能损害，包括DNA切割、碱基二聚体的形成、染色体断裂、对有丝分裂器的损害以及各种酶的活性中的减少。
在本发明中，术语“细胞毒性活性”意指引起上述细胞毒性的活性。
在本发明中，术语“抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性”意指通过NK细胞经由抗体破坏靶细胞如肿瘤细胞的效应或活性。
在本发明中，术语“通过T细胞重定向的细胞毒性活性”意指细胞毒性由包含抗肿瘤抗原抗体和抗CD3抗体的多特异性分子引起。具体地，该术语意指抗肿瘤抗原抗体结合靶肿瘤细胞，而抗CD3抗体结合T细胞，使得靶肿瘤细胞和T细胞彼此接近，以诱导T细胞活化-介导的细胞毒性。该分子可以包含在药物组合物中。
2. 抗原蛋白质CD3（CD3复合物）
在本发明中，术语“CD3”具有与CD3蛋白相同的含义。
CD3作为多分子T细胞受体复合物的一部分在T细胞上表达，并且是5种类型的多肽（γ、δ、ε、ζ和η）链的复合物（其中分子量分别为25000至28000、21000、20000、16000和22000）。
本发明中使用的CD3可以通过从动物组织（包括体液）、衍生自组织的细胞、或细胞培养物中纯化或分离，基因重组，体外翻译，化学合成等来制备。
编码人CD3ε的cDNA的核苷酸序列以登录号NM_000733.3在GenBank登记。编码食蟹猴CD3的cDNA的核苷酸序列以登录号NM_001283615.1在GenBank登记。人CD3ε的氨基酸序列在序列表的SEQ ID NO：1中描述。
CD3ε cDNA可以使用例如使用所谓的PCR方法获得，其中聚合酶链反应（在下文中称为“PCR”）（ Saiki，R.K.等人，Science（1988）239，487-489）使用来自表达CD3ε mRNA的器官的cDNA文库作为模板，并且使用能够特异性扩增CD3ε cDNA的引物来执行。
CD3基因的核苷酸序列中还包括编码蛋白质的核苷酸序列，所述蛋白质由通过1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自CD3的氨基酸的氨基酸序列组成，并且具有与CD3等价的生物活性。CD3中还包括由通过1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自CD3的氨基酸序列的氨基酸序列组成，并且具有与CD3等价的生物活性的蛋白质。
CD3ε cDNA中还包括在严格条件下与多核苷酸杂交的多核苷酸，所述多核苷酸由与编码人或食蟹猴CD3ε的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成，并且编码具有与CD3ε等价的生物活性的蛋白质。另外，CD3ε cDNA中还包括由人或食蟹猴CD3ε基因基因座转录的剪接变体、或在严格条件下与其杂交并且编码具有与CD3ε等价的生物活性的蛋白质的多核苷酸。
3. 抗CD3抗体
（3-1）抗体的分类
本发明的抗CD3抗体和抗体的抗原结合片段（在下文中，也称为本发明的抗体等）可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的单克隆抗体的实例包括非人动物衍生的抗体（非人动物抗体）、人抗体、嵌合抗体和人源化抗体。
非人动物抗体的实例包括衍生自脊椎动物例如哺乳动物和鸟类的抗体。哺乳动物衍生的抗体的实例包括啮齿类动物衍生的抗体，例如小鼠抗体和大鼠抗体。鸟类衍生的抗体的实例包括鸡抗体。抗人CD3大鼠单克隆抗体的实例是本发明的C3-147[实施例1）-7]。
嵌合抗体的实例包括但不限于包含与人抗体（人免疫球蛋白）恒定区结合的非人动物抗体衍生的可变区的抗体。
人源化抗体的实例可以包括但不限于移植到非人动物抗体的可变区中的CDR的人抗体（人免疫球蛋白可变区）、移植到非人动物抗体中的CDR以及构架区的部分序列的人抗体，并且具有人抗体氨基酸取代这些人源化抗体中任一中的一种或多种非人动物抗体衍生的氨基酸的抗体。非人动物抗体的可变区中的CDR的实例包括衍生自本发明的大鼠抗CD3抗体C3E-7000的重链可变区中的CDRH1至CDRH3和轻链可变区中的CDRL1至CDRL3，以及通过不同的氨基酸取代1或2个氨基酸而衍生自这些CDR的氨基酸序列的CDR。
人抗体并无特别限制，只要抗体优选结合人CD3并且更优选结合人CD3和食蟹猴CD3。实例还包括结合与本发明的人源化抗体中的相同位点的人抗体。实例包括结合与C3E-7034相同的位点的人抗体。
优选地，本发明的抗体等与人CD3结合。更优选地，本发明的抗体等也对食蟹猴CD3具有结合活性。
本发明的抗体等可以由衍生自多种不同抗体的部分组成，只要该抗体与人CD3结合并且还与食蟹猴CD3结合。这些抗体的实例包括包含在多种不同抗体之间交换的重链和/或轻链的抗体，包含在其中交换的全长重链和/或轻链的抗体，包含在其中交换的可变区或恒定区的抗体，和包含在其中交换的所有或一些CDR的抗体。嵌合抗体的重链和轻链可变区可以衍生自本发明的不同抗体。人源化抗体的重链和轻链可变区中的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3可以衍生自本发明的两种或更多种不同抗体。人抗体的重链和轻链可变区中的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3可以是由本发明的两种或更多种不同抗体携带的CDR的组合。
本发明的单克隆抗体的同种型的实例可以包括但不特别限于IgG例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，IgM，IgA例如IgA1和IgA2，IgD和IgE。
单克隆抗体的同种型和亚类可以使用例如Ouchterlony测试、酶联免疫吸附测定（ELISA）或放射免疫测定（RIA）来确定。可以使用商购可得的用于鉴定的试剂盒（例如，RatImmunoglobulin Isotyping ELISA Kit（BD Pharmingen））。
（3-2）抗CD3抗体的结合特异性
本发明的抗体等识别CD3。换言之，本发明的抗体等与CD3结合。本发明的抗体等优选与人CD3和猴CD3结合，且更优选与人CD3和食蟹猴CD3结合。
更具体地，本发明的抗体及其抗原结合片段，并且其可变区结合存在于人CD3复合物的ε链（图1，SEQ ID NO：1）的细胞外区域中的Ig样结构域。此外，它们还结合存在于食蟹猴CD3复合物的ε链的细胞外区域中的Ig样结构域。
存在于由本发明的抗体等结合的人CD3复合物的ε链（图1，SEQ ID NO：1）的细胞外区域中的表位含有下述氨基酸：
Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104和Pro105。
优选地，本发明的抗体等可以通过与含有选自这13个氨基酸的至少7个氨基酸的表位区域结合而维持与人CD3的结合。
当抗体在4埃的距离内与这些氨基酸相邻时，此类抗体可以确认为具有与本发明的抗体等相同的表位特异性。另一方面，在表位氨基酸Arg101、Gly102、Ser103、Lys104和Pro105中存在如本领域已知的与抗CD3抗体OKT3或UCHT1相互作用的表位残基（Lars Kjer-Nielsen等人，PNAS（2004）；和Kelly L Arnett等人，PNAS（2004））。然而，OKT3或UCHT1与人CD3结合，但不与食蟹猴CD3结合。
在本发明中，“识别”，即“结合”，意指不是非特异性吸附的结合。用于确定是否达到识别，即是否达到结合的标准的实例，可以包括解离常数（在下文中，称为"KD"）。优选地，本发明的抗体等对于CD3具有1 × 10-5 M或更低、5 × 10-6 M或更低、2 × 10-6 M或更低、或者1 × 10-6 M或更低的KD值。
在本发明中，可以使用生物分子相互作用分析系统（例如SPR或BLI）、ELISA或RIA测定或确定抗体与抗原的结合。可以通过流式细胞术测定抗体与细胞表面上表达的抗原的结合。
SPR（表面等离振子共振分析）方法用作分析方法，用于通过经由动力学分析测量结合速率常数（ka值）和解离速率常数（kd值），来确定解离常数（KD值）等作为关于亲和力的指数。SPR分析中使用的设备的实例包括BIAcore（TM）（由GE Healthcare制造），ProteOn（TM）（由Bio-Rad Laboratories制造），SPR-Navi（TM）（由BioNavis制造），Spreeta（TM）（由Texas Instruments Inc.制造），SPRi-Plex II（TM）（由Horiba，Ltd.制造）和Autolab SPR（TM）（由Metrohm制造）。
BLI（生物层干涉测量法）是涉及使用生物层干扰测量生物分子相互作用的方法。BLI相互作用分析中使用的设备的实例包括Octet系统（由Pall ForteBio Corp.制造）。
ELISA是这样的方法，其涉及使用特异性抗体或抗原捕获样品溶液中包含的目的抗原或抗体，同时通过使用酶促反应检测且定量目的抗原或抗体。将酶标记的抗原或抗体掺入反应系统内，并且检测酶活性。对于酶活性检测，使用其吸收光谱通过反应改变的底物，并且通过吸光度测量将吸收光谱数字化。
细胞-ELISA是这样的方法，其涉及在逐个细胞的基础上捕获细胞表面上的分析物，同时通过使用酶促反应来检测且定量分析物。
RIA（放射免疫测定）可以通过用放射性材料标记抗体，并且测量来自抗体的放射性来定量抗体。
流式细胞术是用于通过将良好细胞分散在流体中，并且使细流体流流动来光学分析个别细胞的方法。荧光染料标记的抗体通过抗原-抗体反应与抗原的细胞表面结合，并且使用指示抗体的抗原结合活性的荧光强度测量与抗体结合的细胞数目。
如上文提到的，与人CD3和食蟹猴CD3结合的抗体等可以经受使用灵长类动物，特别是食蟹猴的各种功效或安全性测试，这对于药物产品的非临床开发（临床前开发）是必需的且因此是优选的。另外，与人CD3和食蟹猴CD3结合的抗体等具有细胞毒性活性，并且可单独或作为本发明的分子用于治疗或预防人和食蟹猴中的疾病如癌症。药物组合物在下文描述。
与人CD3和食蟹猴CD3结合的本发明的抗体等不与小鼠CD3结合。因此，使用人CD3基因转染的小鼠细胞、组织或个体（包括转基因动物、敲除动物和敲入动物）和抗体等的各种测定或免疫组织化学测试可以在不受宿主小鼠的CD3的影响下进行。因此，抗体等优选用于关于小鼠的包含抗体等的药物、动物药物和诊断药物的研究和非临床开发。
（3-3）单克隆抗体
本发明提供了单克隆抗体。这些单克隆抗体包括例如非人动物衍生的单克隆抗体，如大鼠、小鼠、兔、鸡和鱼抗体，嵌合抗体，人源化抗体，人抗体，其抗原结合片段，这些抗体或抗原结合片段的抗体突变体，以及这些抗体或抗原结合片段的变体。
例如，通过实施例1中描述的方法获得的C3-147是抗CD3大鼠单克隆抗体。
编码C3-147的重链可变区的DNA的核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO：6（图14）中描述，并且其氨基酸序列在SEQ ID NO：7（图15）中描述。编码C3-147的轻链可变区的DNA的核苷酸序列在序列表的SEQ ID NO：8（图16）中描述，并且其氨基酸序列在SEQ ID NO：9（图17）中描述。
本发明的抗体突变体优选地可以显示出例如对蛋白质降解或氧化减少的敏感性，改善或维持的生物活性或功能，此类生物活性或功能的受抑制的减少或恶化，改善的结合抗原的能力，或者对其赋予的物理化学或功能性质。通常已知可以改变蛋白质中特定氨基酸的侧链，从而改变蛋白质的活性或功能。此类改变的实例包括天冬氨酸侧链的脱酰胺和天冬氨酸侧链的异构化。本发明的抗体突变体包括其中一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代以防止此类改变的那些。
本发明的这些抗体突变体的实例包括具有的氨基酸序列通过保守氨基酸取代而衍生自原始抗体的氨基酸序列的抗体。保守氨基酸取代是在与氨基酸侧链有关的氨基酸基团中发生的取代。
优选的氨基酸基团如下：酸性基团，包括天冬氨酸和谷氨酸；碱性基团，包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸；非极性基团，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；以及不带电的极性家族，包括甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。其它优选的氨基酸基团如下：脂肪族羟基，包括丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的基团，包括天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族基团，包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；以及芳香族基团，包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。优选执行抗体突变体中的氨基酸取代而不减少原始抗体的抗原结合活性。
本发明还涵盖了具有氨基酸序列的抗体突变体，所述氨基酸序列衍生自由上文提到的根据（1）的抗体或其抗原结合片段例如C3-147组成的氨基酸序列，在其中发生（或执行）保守氨基酸取代和/或一些其它氨基酸突变；小鼠抗体、大鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或由具有氨基酸序列的CDR组成的人抗体，其中保守氨基酸突变和/或一些其它氨基酸突变在衍生自上文提到的根据（1）的抗体或其抗原结合片段，例如C3-147的CDRH1至CDRH3和CDRL1至CDRL3中任一种的氨基酸序列中发生（或执行）；这些抗体突变体和突变抗体中任一种的抗原结合片段；和包含此类抗体突变体、突变抗体或其抗原结合片段的分子。
（3-4）抗CD3抗体的抗原结合片段
根据一个方面，本发明提供了本发明的抗CD3抗体的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段意指在抗体的功能中维持至少抗原结合活性的片段或其变体。抗体功能的实例一般包括抗原结合活性，抗原活性调节活性，抗体依赖性细胞毒性活性和补体依赖性细胞毒性活性。本发明的抗体等和本发明的包含抗体等的多特异性分子的功能的实例包括T细胞的重定向，T细胞的活化和通过T细胞的活化针对癌细胞的细胞毒性活性。
抗体的抗原结合片段并无特别限制，只要抗体片段在抗体的活性中维持至少抗原结合活性。实例包括但不限于Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、包含经由适当接头连接的重链和轻链Fv的单链Fv（scFv）和单结构域抗体（sdAb）。本发明的抗体的抗原结合片段还意欲包括包含本发明抗体的抗原结合片段，并且其它部分例如保留接头部分的scFv的分子。
通过在其氨基末端和/或羧基末端处1个或多个或多个氨基酸的缺失而衍生自抗体蛋白质，并且保留抗体功能的至少一部分的分子也涵盖在抗体的抗原结合片段的含义中。抗体的抗原结合片段的此类变体也由本发明的抗体或其抗原结合片段、或者抗体或抗原结合片段的变体（以后描述）涵盖。
根据一个方面，本发明抗体的抗原结合片段是scFv。scFv通过经由多肽接头连接抗体的重链和轻链可变区而获得（Pluckthun A.，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies 113，Rosenburg和Moore，编辑，Springer Verlag，New York，269-315（1994）；以及Nature Biotechnology（2005），23，1126-1136）。另外，包含经由多肽接头连接的两个scFv的串联scFv可以用作双特异性分子。可替代地，包含三个或更多个scFv的三抗体等可以用作多特异性分子。
本发明的抗体可以是具有单个重链可变区且不具有轻链序列的抗体。称为单结构域抗体（sdAb）或纳米抗体的此类抗体据报道保留了与抗原结合的能力（Muyldemans S.等人，Protein Eng.，（1994），7（9），1129-35；以及Hamers-Casterman C.等人，Nature（1993），363（6428），446-448）。这些抗体也在根据本发明抗体的抗原结合片段的含义中涵盖。
本发明还包括单链免疫球蛋白，其包含经由适当接头连接的抗体的全长重链和轻链序列（Lee，H-S等人，Molecular Immunology（1999）36，61-71；以及Shirrmann，T.等人，mAbs（2010），2（1），1-4）。此类单链免疫球蛋白可以二聚化，以保留与抗体的那些相似的结构和活性，所述抗体最初是四聚体。
（3-5）具有抗原结合活性的分子
本发明的分子包含本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段。
本发明的分子可以进一步包含例如信号序列、用于纯化的标签、氨基末端Gly、ADC的药物接头部分、白蛋白结合多肽、聚合物例如PEG、除抗CD3抗体外的抗体、其抗原结合片段和具有抗原结合活性而无免疫球蛋白骨架的蛋白质，其将在下文描述。
本发明的分子与人CD3和食蟹猴CD3结合。
本发明的分子包括下文描述的多特异性分子。
本发明的分子可以是引入细胞内的形式或在细胞表面上展示的形式，例如CAR-T等。
（3-6）多特异性分子和双特异性分子
本发明的多特异性分子是具有两个或更多个抗原结合位点的分子。具体地，本发明的多特异性分子是能够结合一个分子上彼此不同的两个或更多个表位、或者两个或更多个分子上彼此不同的表位的分子，并且包含彼此不同的多个抗原结合片段。多特异性分子的实例包括但不限于IgG型多特异性分子和具有两种或更多种类型的可变区的多特异性分子，例如抗体片段，例如串联scFv、单链双抗体、双抗体、三抗体和通过共价键或非共价键连接的抗体片段。多特异性分子可以含有Fc。
本发明的多特异性分子包含本发明的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段。本发明的多特异性分子包含本发明的抗体等和1或2种或更多种另外的抗体或抗体的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段的实例包括Fab、F（ab）'、Fv、scFv和sdAb。
本发明的多特异性分子特异性结合CD3，或可以进一步结合靶例如效应细胞上的Fc受体。
本发明的多特异性分子的优选实例包括双特异性分子。术语“双特异性”意指结合一个分子上彼此不同的两个表位，或两个分子上彼此不同的表位的能力。具有此类双特异性的抗体或抗原结合片段由本发明涵盖。本发明的双特异性分子结合CD3，并且结合CD3中不存在但另一种抗原中存在的表位。更具体地，此类双特异性分子（i）结合CD3上的表位（表位1）和（ii）结合CD3上不同于表位1的表位（表位2），或结合除CD3外的抗原上的表位（表位3）。
例如，在以BiTE为代表的串联scFv型双特异性分子中，第一抗体的重链可变区中的抗原结合位点和第一抗体的轻链可变区中的抗原结合位点经由接头连接或无需接头直接连接，以形成第一多肽。另外，第二抗体的重链可变区中的抗原结合位点和第二抗体的轻链可变区中的抗原结合位点经由接头连接或无需接头直接连接，以形成第二多肽。第一多肽和第二多肽经由接头连接或无需接头直接连接。可替代地，第一多肽和第二多肽可以经由另外的分子连接。
在双抗体型双特异性分子中，第一抗体的重链可变区中的抗原结合位点和第二抗体的轻链可变区中的抗原结合位点经由接头连接或无需接头直接连接。另外，第一抗体的轻链可变区中的抗原结合位点和第二抗体的重链可变区中的抗原结合位点经由接头连接或无需接头直接连接。另外，双特异性分子可以通过双抗体型双特异性分子的进一步二聚化来制备。另外，双抗体型双特异性分子可以经由接头与Fc的一条链或两条链连接（双抗体-Fc型双特异性分子）。
在双scFv型双特异性分子中，与不同表位结合的两个scFv经由接头或无需接头直接与二聚体Fc的两条链连接。可替代地，待与不同表位结合的两种类型的scFv经由接头分别与CH和CL连接，并且进一步经由接头分别与二聚体Fc的两条链连接。
在IgG型双特异性分子中，待与不同表位结合的两个Fab经由接头或无需接头直接与二聚体Fc的两条链连接。
可替代地，本发明的双特异性分子可以是双特异性抗体，其中待与不同表位结合的Fab和scFv经由接头或无需接头直接与二聚体Fc的两条链连接。可替代地，本发明的双特异性分子可以是双特异性分子，其中第一抗体中的Fab和第二抗体中的scFv经由接头与二聚体Fc的两条链连接。
本发明的双特异性分子中包含的scFv和Fab优选为人源化抗体或人抗体的scFv和Fab，并且Fc优选为人抗体的Fc。
在本发明的双特异性抗体中包含的可变区中，重链可变区和轻链可变区可以以这种次序结合，或者轻链可变区和重链可变区可以以这种次序结合，从氨基末端起。本发明的双特异性抗体任选地具有在两个可变区之间的接头，并且可以（任选地）具有在置于氨基末端侧上的可变区的氨基末端处的甘氨酸残基。本发明的串联scFv型的双特异性抗体任选地具有在置于羧基末端侧上的可变区的羧基末端处的接头、FLAG-标签和/或HIS-标签。本发明的双特异性抗体的优选实例包括双特异性抗体，其中重链可变区、第一接头、轻链可变区、第二接头、FLAG-标签和His-标签从氨基末端起以这种次序结合。
接头还包括单链多肽或单链寡肽，或合成产物例如PEG、核苷酸、糖链和化合物。另外，可以使用本领域已知的任何接头而无特别限制，只要接头连接两个多肽。
对于例如肽接头，接头的长度为5至30个氨基酸。当双特异性分子含有多个接头时，使用的所有肽接头都可以具有相同的长度，或者使用的肽接头可以具有不同的长度。
肽接头的实例是（Gly·Gly·Gly·Gly·Ser）重复单元。可以添加除Gly和Ser外的一个或多个氨基酸残基。
（3-7）人源化的抗CD3抗体
根据一个方面，本发明提供了人源化的抗CD3抗体或其抗原结合片段。
本发明的人源化抗体的实例包括仅含有互补决定区（CDR）的人源抗体（Nature（1986）321，522-525），以及通过CDR移植而移植到CDR序列和构架区的一些氨基酸残基的人抗体（国际公开号WO1990/07861A1）。
优选地，在本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段中包含的重链可变区保留
由通过SEQ ID NO：26（图24）（GVTFNYYG）表示的氨基酸序列组成的CDRH1，以及由通过SEQ ID NO：98（图112）（IT Xaa Xaa GGRI）表示的氨基酸序列组成的CDRH2（其中第一Xaa和第二Xaa各自代表任意的天然氨基酸残基。在下文中，第一Xaa也称为X1，并且第二Xaa也称为X2。），和
由通过SEQ ID NO：28（图26）（TLDGRDGWVAY）表示的氨基酸序列组成的CDRH3。
还优选地，在本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段中包含的轻链可变区保留
由通过SEQ ID NO：29（图27）（TGNIGSNY）表示的氨基酸序列组成的CDRL1，
由通过SEQ ID NO：99（图113）（R Xaa D）表示的氨基酸序列组成的CDRL2（其中Xaa代表任意的天然氨基酸残基。在下文中，CDRL2的Xaa也称为X3。），和
由通过SEQ ID NO：31（图29）（QSYSSGFI）表示的氨基酸序列组成的CDRL3。
在上文提到的CDRH2（ITX1X2GGRI）中，优选地，X1选自A、E、G、H、I、L、T、V、R和S，并且X2是S；或者X1是N，并且X2选自E、R、F、Y、L、V、I、K和T。
在上文提到的CDRL2（RX3D）中，优选地，X3选自Q、A、G、S、N和D。
在上文提到的CDRH2（ITX1X2GGRI）中，更优选地，X1选自R和S，并且X2是S。
在上文提到的CDRL2（RX3D）中，更优选地，X3选自Q、A、G、S、N和D。
本发明的此类人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段中包含的重链可变区的优选实例，包括包含通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸残基的重链可变区（图114）。
另外，本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段中包含的轻链可变区的优选实例包括
包含通过SEQ ID NO：101（图115）、SEQ ID NO：102（图116）、或SEQ ID NO：103（图117）表示的氨基酸残基的轻链可变区。
在本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段中包含的重链可变区的具体优选实例包括
保留以下的重链可变区：
由通过SEQ ID NO：26（图24）（GVTFNYYG）表示的氨基酸序列组成的CDRH1，
由通过SEQ ID NO：27（图25）（ITNSGGRI）表示的氨基酸序列组成的CDRH2，和
由通过SEQ ID NO：28（图26）（TLDGRDGWVAY）表示的氨基酸序列组成的CDRH3。
在本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段中包含的轻链可变区的具体优选实例包括
保留以下的轻链可变区：
由通过SEQ ID NO：29（图27）（TGNIGSNY）表示的氨基酸序列组成的CDRL1，
由通过SEQ ID NO：30（图28）（RDD）表示的氨基酸序列组成的CDRL2，和
由通过SEQ ID NO：31（图29）（QSYSSGFI）表示的氨基酸序列组成的CDRL3。
在本发明中，CDR的位置和长度根据IMGT定义（Developmental and ComparativeImmunology 27（2003）55-77）来确定。
本发明的重链可变区的具体实例包括包含SEQ ID NO：16的氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的轻链可变区的具体实例包括包含SEQ ID NO：17、20或23的氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段的具体优选实例包括
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：60的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：60的第135至第241氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：64的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：64的第135至第241氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：66的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：66的第135至第243氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：68的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：68的第135至第243氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：70的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：70的第135至第243氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：72的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：72的第135至第243氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：74的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：74的第135至第243氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：76的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：76的第135至第243氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：78的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：78的第135至第243氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：80的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：80的第135至第243氨基酸残基，
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：82的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：82的第135至第243氨基酸残基，或
包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗体的抗原结合片段，所述重链可变区包含SEQ ID NO：84的第2至第119氨基酸残基，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：84的第135至第243氨基酸残基。
本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段的具体实例包括抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含包括通过SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列的重链可变区，接头以及包括通过SEQ ID NO：17、20和23中任何一个表示的氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明抗体的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的可变区中，重链可变区和轻链可变区可以以这种次序结合，或者轻链可变区和重链可变区可以以这种次序结合，从氨基末端起。可变区可以在其氨基末端处包含甘氨酸残基。接头、FLAG-标签和/或HIS-标签可以在可变区的羧基末端的端部处结合。
本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段的具体优选实例包括
包含SEQ ID NO：19的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：22的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，和
包含SEQ ID NO：25的第2至第241氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段。
本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段的更具体的优选实例包括
包含SEQ ID NO：60的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7078）或抗体的抗原结合片段（图68），
包含SEQ ID NO：64的第1至第241氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7085）或抗体的抗原结合片段（图72），
包含SEQ ID NO：66的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7086）或抗体的抗原结合片段（图74），
包含SEQ ID NO：68的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7087）或抗体的抗原结合片段（图76），
包含SEQ ID NO：70的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7088）或抗体的抗原结合片段（图78），
包含SEQ ID NO：72的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7089）或抗体的抗原结合片段（图80），
包含SEQ ID NO：74的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7090）或抗体的抗原结合片段（图82），
包含SEQ ID NO：76的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7091）或抗体的抗原结合片段（图84），
包含SEQ ID NO：78的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7092）或抗体的抗原结合片段（图86），
包含SEQ ID NO：80的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7093）或抗体的抗原结合片段（图88），
包含SEQ ID NO：82的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7094）或抗体的抗原结合片段（图90），和
包含SEQ ID NO：84的第1至第243氨基酸残基的抗体（克隆ID：C3E-7095）或抗体的抗原结合片段（图92）。
其中重链可变区、接头和轻链可变区在氨基末端的端部处以这种次序结合，并且另外，第二接头、FLAG-标签和HIS-标签在轻链可变区的羧基末端末端的端部处结合的，本发明的人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段的具体优选实例，包括在上文提到的（16）中所述的抗体或抗体的抗原结合片段，其包括
包含SEQ ID NO：22的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：25的第2至第267氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：60的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：64的第2至第267氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：66的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：68的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：70的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：72的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：74的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：76的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：78的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：80的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：82的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
或
包含SEQ ID NO：84的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的抗体等可以是包括抗体等的分子，所述抗体包含的重链可变区的氨基酸序列和/或轻链可变区的氨基酸序列，与上述本发明的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段中包含的重链可变区的氨基酸序列和/或轻链可变区的氨基酸序列70%、71%、72%、73%、74%,75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同，并且与人CD3和食蟹猴CD3结合。
本发明的抗体等可以是这样的抗体，其与CD3结合的能力可以通过向上述人源化的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段引入突变得到优化。用于引入突变的方法的具体实例可以包括使用易错PCR的随机诱变，使用NNK文库的定点氨基酸诱变，使用结构信息的定点诱变及其组合。
本发明的抗体等的ADCC和CDC活性可以通过恒定区的取代来减少，以降低抗体的效应子活性。
为了避免在表达人CD3的正常细胞中的细胞毒性，期望抗体应当具有低效应子活性。效应子活性已知在抗体亚类中不同。例如，IgG4具有低ADCC和CDC活性，并且IgG2具有CDC活性但具有低ADCC活性。使用这些特点，通过用IgG2或IgG4的恒定区取代IgG1的恒定区，可以制备具有减少的ADCC和CDC活性的抗体。另外，通过用IgG2或IgG4取代IgG1的恒定区的一部分，可以制备具有减少的ADCC和CDC活性的IgG1抗体。例如，Marjan Hezareh等人，Journal of Virology，75（24）：12161-12168（2001）显示，ADCC和CDC活性通过用丙氨酸残基取代IgG1的第234个和第235亮氨酸残基（编号基于根据Kabat等人的EU指数）得到减少。
（3-8）与相同位点结合并且还与食蟹猴CD3结合的抗体
“与相同位点结合的抗体”包括本发明的抗体等，并且“与食蟹猴CD3结合的抗体”也包括本发明的抗体等。如在某一抗体的情况下，“与相同位点结合的抗体”意指与由抗体识别的抗原分子上的位点结合的另一种抗体。如果第二抗体结合由第一抗体结合的抗原分子上的部分肽或部分三维结构，则第一抗体和第二抗体确定为与相同位点结合。
可替代地，通过确认第二抗体与第一抗体竞争结合抗原，即第二抗体干扰第一抗体与抗原的结合，第一抗体和第二抗体确定为与相同位点结合，甚至即使未确定特异性结合位点的肽序列或三维结构。
当第一抗体和第二抗体结合相同位点，并且第一抗体具有本发明抗体的一个方面的效应特征例如细胞毒性活性时，第二抗体也具有极高的概率具有相同活性。
因此，如果第二抗CD3抗体结合由第一抗CD3抗体结合的位点，并且第二抗CD3抗体结合食蟹猴CD3，则第一抗体和第二抗体可以确定为与CD3蛋白上的相同位点结合。在本发明的抗体等中还包括抗体或抗体的抗原结合片段，其结合人CD3上与由本发明的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段结合的相同位点，并且与食蟹猴CD3结合。
可替代地，通过确认第二抗CD3抗体与第一抗CD3抗体竞争结合CD3蛋白，并且第二抗CD3抗体与食蟹猴CD3结合，第一抗CD3抗体和第二抗CD3抗体可以确定为与CD3蛋白上的相同位点结合。在本发明的抗原等中还包括抗体或抗体的抗原结合片段，其与本发明的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段竞争结合人CD3，并且与食蟹猴CD3结合。
抗体结合位点可以使用本领域技术人员众所周知的任何方法例如免疫测定来确定。例如，可以通过从其羧基末端或氨基末端适当地序贯切割抗原的氨基酸序列，然后研究抗体的反应性以大致确定识别位点来制备一系列肽。然后，合成较短的肽，并且可以研究抗体对这些肽的反应性以确定结合位点。可以使用技术如基因重组或肽合成来制备抗原片段肽。
本发明的抗体等识别且结合构成CD3的三维结构的区域，即Ig样结构域。通过使用X射线结构分析鉴定抗原上与抗体相邻的氨基酸残基，可以确定关于抗体的此类结合位点（表位）。
（3-9）抗CD3抗体或其抗原结合片段的变体
本发明提供了抗体或其抗原结合片段的变体。本发明的抗体或其抗原结合片段的变体意指具有化学或生物学修饰的本发明的抗体或其抗原结合片段。化学变体包括例如具有与化学部分缀合的氨基酸骨架的形式，以及具有化学修饰的N-连接或O-连接的碳水化合物链的形式。生物学变体包括例如已经历翻译后修饰（例如，N-连接或O-连接的糖基化、氨基末端或羧基末端区域的加工、脱酰胺、天冬氨酸的异构化或甲硫氨酸的氧化）的形式，以及通过使用原核宿主细胞的表达含有添加到氨基末端的甲硫氨酸残基的形式。此类变体还意欲包括标记的形式以允许检测或分离本发明的抗体或抗原，例如酶标记的形式、荧光标记的形式或亲和力标记的形式。本发明的抗体或其抗原结合片段的此类变体可用于改善本发明的原始抗体或其原始抗原结合片段的稳定性和血液保留，减少抗原性，并且检测或分离抗体或抗原等。
化学变体中包含的化学部分的实例包括水溶性聚合物，例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖和聚乙烯醇。
生物学变体的实例包括通过酶促处理或细胞处理修饰的形式，与通过基因重组添加的其它肽（例如标签）融合的形式，以及由表达内源或外源糖链修饰酶的宿主细胞制备的形式。
此类修饰可以在抗体或其抗原结合片段中的任意位置或所需位置处进行。可替代地，可以在其中的一个或两个或更多个位置处进行相同或不同的修饰。
在本发明中，“抗体的抗原结合片段的变体”也意欲包括“抗体变体的片段”。
例如，由培养的哺乳动物细胞产生的抗体的重链已知缺乏在羧基末端处的赖氨酸残基（Journal of Chromatography A，705：129-134（1995））。另外，此类抗体的重链已知缺少在羧基末端处的两个氨基酸残基（甘氨酸和赖氨酸），并且相反具有在羧基末端处的酰胺化脯氨酸残基（Analytical Biochemistry，360：75-83（2007））。此外，抗体重链或轻链中的N（氨基）-末端谷氨酰胺或谷氨酸残基已知在抗体制备期间通过焦谷氨酰化进行修饰，并且本发明的抗体可以具有此类修饰（国际公开号WO2013/147153A1）。
然而，这些重链序列中的缺失或者这些重链或轻链序列中的修饰不会很大地影响抗体与抗原结合的能力及其效应子功能（补体活化、抗体依赖性细胞毒性效应等）。因此，本发明还涵盖了已经受缺失或修饰的抗体（在下文中称为“缺失变体”）。实例包括通过在羧基末端处的1或2个氨基酸的缺失而衍生自重链的缺失变体，缺失变体的酰胺化形式（例如，在羧基末端位点处具有酰胺化脯氨酸残基的重链），以及在其重链或轻链中具有焦谷氨酰化的氨基末端残基的抗体。然而，根据本发明的抗体重链和轻链的羧基末端处的缺失变体并不限于上述类型，只要缺失变体保留至少一些结合抗原的能力。存在于根据本发明的抗体中的两条或更多条链（例如，重链）可以是选自全长链（例如，重链）和上文描述的缺失变体的任何类型的链（例如，重链），以及选自其中的任何两种类型的两条或更多条链（例如，重链）的任何组合。每种缺失变体的定量或分子比可能受产生根据本发明抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件的影响。实例包括作为根据本发明抗体的主要组分的两条重链各自的一个羧基末端氨基酸残基的缺失。
在本发明中，“抗体的抗原结合片段的变体”也意欲包括“抗体的变体的片段”。
通过调节由抗体结合的糖链的修饰（糖基化、去糖基化等），可以增强本发明抗体的抗体依赖性细胞毒性活性。例如，国际公开号WO99/54342A1、WO00/61739A1和WO02/31140A1公开了用于调节抗体的糖链修饰的技术，尽管该技术并不限于此。本发明的抗体和抗体的抗原结合片段还包括已经历如此调节的糖链修饰的抗体和抗体的抗原结合片段。
在本发明中，抗体或其抗原结合片段的“缺失”和“修饰”及其混合物落入“抗体或其抗原结合片段”的范围内。并且，抗体或其抗原结合片段的“缺失”和“修饰”及其混合物落入分子中包含的“抗体或其抗原结合片段”的范围内，所述分子结合（3-5）和（3-6）中公开的本发明的抗原、多特异性分子、双特异性分子等等。
4. 抗体的产生
（4-1）使用杂交瘤的方法
根据本发明的一个方面，根据例如Kohler和Milstein的方法（Kohler和Milstein，Nature（1975）256，第495-497页；以及Kennet，R.编辑，Monoclonal Antibodies，第365-367页，Plenum Press，N.Y.（1980）），从用CD3蛋白免疫的动物的脾中分离产生抗CD3抗体的细胞。将细胞与骨髓瘤细胞融合以建立杂交瘤。单克隆抗体可以从这些杂交瘤的培养物中获得。
（4-1-1）抗原的制备
用于制备抗CD3抗体的抗原可以根据例如用于制备天然或重组CD3蛋白（人CD3εγ单链抗原）的方法获得。可以因此制备的抗原的实例包括CD3蛋白、CD3蛋白片段及其衍生物，其进一步包含添加的任意氨基酸序列或载体（在下文中，统称为“CD3”）。
天然CD3可以从例如人组织衍生的细胞或细胞培养物中纯化且分离。重组人CD3εγ单链抗原可以通过以下进行制备：用包含编码人CD3εγ单链抗原的氨基酸序列的核苷酸序列的基因转染宿主细胞，并且从细胞培养物中回收抗原。通过由包含编码CD3抗原的氨基酸序列的核苷酸序列的基因在体外翻译系统中的无细胞蛋白质合成获得的CD3也包括在本发明的“CD3抗原”中。
（4-1-2）抗CD3单克隆抗体的产生
单克隆抗体通常通过下述步骤产生：
（a）制备抗原，
（b）制备抗体产生细胞，
（c）制备骨髓瘤细胞（在下文中，称为“骨髓瘤”），
（d）将抗体产生细胞与骨髓瘤融合，
（e）筛选产生目标抗体的杂交瘤组，和
（f）获得单细胞克隆（克隆）。
需要时，该生产方法还涉及（g）培养杂交瘤的步骤，饲养杂交瘤移植动物的步骤等，以及（h）测定或确定单克隆抗体的生物活性的步骤等。
现在将参考这些步骤详细描述用于制备单克隆抗体的这种方法。然而，用于制备抗体的方法并不限于这些步骤。例如，可以使用除脾细胞和骨髓瘤外的抗体产生细胞。
（a）制备抗原的步骤
本发明的CD3蛋白可以通过从动物组织（包括体液）、衍生自组织的细胞、或细胞培养物中纯化或分离，基因重组，无细胞蛋白质合成，化学合成等来制备。
（b）制备抗体产生细胞的步骤
将步骤（a）中获得的抗原与佐剂例如完全或不完全弗氏佐剂或者硫酸铝钾混合，并且用所得到的免疫原免疫实验动物。可以无限制地使用本领域已知的杂交瘤制备方法中使用的任何实验动物。例如，可以使用小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛和马。从待与分离的抗体产生细胞等融合的容易获得的骨髓瘤细胞观点来看，待免疫的动物优选是小鼠或大鼠。
实际使用的小鼠或大鼠品系并无特别限制。在小鼠的情况下，例如，可以使用A、AKR、BALB/c、BALB/cAnNCrj、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB或129。在大鼠的情况下，例如，可以使用Wistar、Low、Lewis、Sprague-Dawley、ACI、BN或Fischer。
这些小鼠和大鼠可从实验动物育种者或分销商处，例如CLEA Japan，Inc.或Charles River Laboratories Japan，Inc获得。
在这些小鼠和大鼠中，考虑到以后描述的与骨髓瘤细胞的融合相容性，BALB/c小鼠品系或Wistar和Low大鼠品系作为待免疫的动物是特别优选的。
另外，考虑到人和小鼠抗原之间的同源性，还优选使用其去除自身抗体的生物学机制已减少的小鼠，即自身免疫疾病小鼠。
在该上下文中，这些小鼠或大鼠在免疫时优选为5至12周龄，且更优选为6至8周龄。
使用例如Weir，D. M.，Handbook of Experimental Immunology第I. II. III.卷，Blackwell Scientific Publications，Oxford（1987），或Kabat，E. A.和Mayer，M. M.，Experimental Immunochemistry，Charles C Thomas Publisher Spigfield，Illinois（1964）的方法，可以用CD3蛋白免疫动物。
用于确定抗体滴度的方法的实例可以包括但不限于免疫测定，例如RIA和ELISA。
衍生自从免疫动物中分离的脾细胞或淋巴细胞的抗体产生细胞可以根据本领域已知的方法制备，所述方法例如Kohler等人，Nature（1975）256，495；Kohler等人，Eur. J.Immnol.（1977）6，511；Milstein等人，Nature（1977），266，550；或Walsh，Nature（1977）266，495。
在脾细胞的情况下，可以采用一般方法，其涉及切碎脾脏，通过不锈钢网过滤细胞，然后使所得到的细胞漂浮在伊格尔最小必需培养基（MEM）中，以分离抗体产生细胞。
（c）制备骨髓瘤的步骤
细胞融合中使用的骨髓瘤细胞并无特别限制，并且可以从本领域已知的细胞系中选择用于使用。例如，考虑到从融合细胞中选择杂交瘤的方便性，优选使用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）缺陷系，即其筛选程序已经建立的小鼠衍生的X63-Ag8（X63）、NS1-ANS/1（NS1）、P3X63-Ag8.Ul（P3Ul）、X63-Ag8.653（X63.653）、SP2/0-Ag14（SP2/0）、MPC11-45.6TG1.7（45.6TG）、FO、S149/5XXO或BU.1，大鼠衍生的210.RSY3.Ag.1.2.3（Y3），或人衍生的U266AR（SKO-007）、GM1500-GTG-A12（GM1500）、UC729-6、LICR-LOW-HMy2（HMy2）或8226AR/NIP4-1（NP41）。这些HGPRT缺陷系可从例如美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得。
这些细胞系在适当的培养基中进行传代培养，所述培养基例如8-氮鸟嘌呤培养基[补充有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清（在下文中，称为“FCS”），并且进一步补充有8-氮鸟嘌呤的RPMI-1640培养基]、Iscove改良达尔贝科培养基（在下文中，称为“IMDM”）、或达尔贝科改良伊格尔培养基（在下文中，称为“DMEM”），并且在细胞融合在正常培养基 [例如，含有10% FCS的ASF104培养基（由Ajinomoto Co.，Inc.制造）]中进行传代培养共3至4天，以确保在细胞融合当天时细胞数目等于或大于2 × 107个细胞。
（d）将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合的步骤
根据本领域已知的任何方法（例如，Weir，D.M.，Handbook of ExperimentalImmunology第I. II. III.卷，Blackwell Scientific Publications，Oxford（1987），Kabat，E. A.和Mayer，M. M.，Experimental Immunochemistry，Charles C ThomasPublisher Spigfield，Illinois（1964）），在防止细胞活力过度减少的条件下，可以将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。例如，可以使用涉及在聚合物如聚乙二醇的高浓度溶液中将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞混合的化学方法、或使用电刺激的物理方法。
（e）筛选产生目标抗体的杂交瘤组的步骤
用于选择通过细胞融合获得的杂交瘤的方法并无特别限制，但通常使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷（HAT）选择方法（Kohler等人，Nature（1975）256，495；Milstein等人，Nature（1977）266，550）。该方法对于使用HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞系获得杂交瘤是有效的，所述HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞系在氨基蝶呤的存在下不能存活。具体地，未融合细胞和杂交瘤可以在HAT培养基中培养，以允许对氨基蝶呤抗性的杂交瘤选择性地存活且生长。
（f）获得单细胞克隆（克隆）的步骤
可以使用本领域已知的任何方法克隆杂交瘤，所述方法例如甲基纤维素、软琼脂糖或有限稀释方法（例如，Barbara，B.M.和Stanley，M.S.：Selected Methods in CellularImmunology，W.H. Freeman and Company，San Francisco（1980））。有限稀释方法是优选的。
（g）培养杂交瘤的步骤和饲养杂交瘤移植动物的步骤
可以培养选择的杂交瘤以产生单克隆抗体。优选地，克隆所需的杂交瘤，然后经受抗体产生。
可以从杂交瘤的培养物中回收由此类杂交瘤产生的单克隆抗体。另外，可以从用单克隆抗体基因转染的细胞培养物中回收重组抗体。可替代地，可以将杂交瘤腹膜内注射到相同品系（例如，上述BALB/cAnNCrj）的小鼠或Nu/Nu小鼠内，且允许生长。然后，可以从它们的腹水中回收单克隆抗体。
（h）测定或确定单克隆抗体的生物活性的步骤
可以根据目的选择且应用各种生物测试。
（4-2）细胞免疫方法
表达天然CD3的细胞或者表达重组CD3或其片段的细胞可以用作免疫原，以使用上述杂交瘤方法制备抗CD3抗体。
表达天然CD3的细胞的实例包括人胸腺细胞和T淋巴细胞。这些表达CD3的细胞以每次免疫注射1 × 105至1 × 109个细胞，优选1 × 106至1 × 108个细胞，更优选0.5至2× 107个细胞，且甚至更优选1 × 107个细胞的量使用。用于免疫的细胞数目可以根据CD3的表达水平而改变。免疫原一般腹膜内施用，但可以通过皮内途径施用。杂交瘤可以通过应用节段（4-1-2）中描述的方法进行制备。
（4-3）DNA免疫方法
还可以通过使用DNA免疫方法获得本发明的抗CD3抗体。该方法涉及用抗原表达质粒转染个别动物，例如小鼠或大鼠，并且在个体中表达抗原，从而诱导针对抗原的免疫。转染方法的实例包括将质粒直接注射到肌肉内的方法，将转染试剂如脂质体或聚乙烯亚胺注射到静脉内的方法，使用病毒载体的方法，使用基因枪注射质粒附着的金颗粒的方法，以及将大量质粒溶液快速注射到静脉内的流体动力学方法。
因此获得的大鼠抗人CD3抗体的实际例子是C3-147。C3-147的轻链可变区的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO：9中（图17）。C3-147的重链可变区的氨基酸序列显示于序列表的SEQ ID NO：7中（图15）。
（4-4）基因重组
为了制备本发明的抗体，包含编码其重链的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸（重链核苷酸）和包含编码其轻链的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸（轻链核苷酸）、或具有重链核苷酸插入片段的载体和具有轻链核苷酸插入片段的载体引入宿主细胞内，培养细胞，并且从培养物中回收抗体。重链核苷酸和轻链核苷酸可以插入一个载体中。
原核或真核细胞可以用作宿主细胞。当使用宿主真核细胞时，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。
动物细胞的实例包括哺乳动物衍生的细胞，即人胚肾细胞HEK293F细胞（SubediGP等人，J Vis Exp.（2015）106）、猴肾衍生的COS细胞（Gluzman，Y. Cell（1981），23，175-182，ATCC CRL-1650）、小鼠成纤维细胞NIH3T3（ATCC，编号CRL-1658）、中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞，ATCC CCL-61）、其二氢叶酸还原酶缺陷系（CHOdhfr-；Urlaub，G.和Chasin，L.A.PNAS（1980），77，4126-4220）、衍生自鸟类如鸡的细胞和衍生自昆虫的细胞。
另外，通过修饰糖链结构进行修饰以增强抗体的生物活性的细胞可以用作宿主。例如，这样修饰CHO细胞，使得在其还原端处具有未由N-乙酰葡糖胺结合的岩藻糖糖链的比例在待与抗体的Fc区结合的复合型N-糖苷连接的糖链中为20%或更多，可以用于制备具有增强的ADCC活性或CDC活性的抗体（国际公开号WO02/31140A1）。
真核微生物的实例包括酵母。原核细胞的实例包括大肠杆菌（E. coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
用于分泌本发明抗体（衍生自每种动物的单克隆抗体、大鼠抗体、小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等）的信号肽并不限于与本发明的抗体相同物种、相同类型或相同亚型的分泌信号，或者本发明的抗体的自身分泌信号。可以选择且使用衍生自不同真核物种或原核物种的不同类型或亚型的抗体的任何分泌信号或者蛋白质的任何分泌信号。
含有信号肽的分泌抗体等也由本发明的抗体等或本发明的分子涵盖。
（4-5）用于设计和制备人源化抗体的方法
人源化抗体的实例包括但不限于具有被非人动物抗体的CDR替换的CDR的人衍生的抗体（参见Nature（1986），321，第522-525页），通过CDR移植而移植至CDR序列和构架区的一些氨基酸残基的人抗体（参见WO90/07861A1和US6972323B2），以及在这些人源化抗体中任一中具有一个或多个人抗体氨基酸替换为一种或多种非人动物抗体衍生的氨基酸的抗体。
（4-6）用于制备人抗体的方法
本发明抗体的其它实例包括人抗体。人抗CD3抗体意指由人衍生的抗体的氨基酸序列组成的抗CD3抗体。人抗CD3抗体可以通过使用人抗体产生小鼠的方法获得，所述小鼠携带包含人抗体重链和轻链基因的人基因组DNA片段（参见例如Tomizuka，K.等人，NatureGenetics（1997）16，133-143；Kuroiwa，Y.等人，Nuc. Acids Res.（1998）26，3447-3448；Yoshida，H.等人，Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects第10卷，69-73（Kitagawa，Y.，Matuda，T.和Iijima，S.编辑），Kluwer Academic Publishers，1999.；Tomizuka，K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA（2000）97，722-727）。
具体地，可以通过破坏非人哺乳动物的内源性免疫球蛋白重链和轻链基因基因座，并且经由例如酵母人工染色体（YAC）载体引入人免疫球蛋白重链和轻链基因基因座来制备人抗体产生动物。可替代地，可以通过基因重组技术，分别用编码此类人抗体的重链和轻链的cDNA，优选用含有cDNA的载体转化真核细胞。可以培养产生重组人单克隆抗体的转化细胞。该抗体可以从培养上清液中获得。
在该上下文中，例如，真核细胞，优选哺乳动物细胞如HEK293F细胞或CHO细胞可以用作宿主。
另外，还已知用于获得选自人抗体文库的噬菌体展示衍生的人抗体的方法。例如，可以使用噬菌体展示方法，其涉及允许人抗体的可变区在噬菌体表面上作为scFv表达，并且选择与抗原结合的噬菌体。基于其结合抗原的能力选择的噬菌体可以经受基因分析，以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果确定了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以制备具有该序列的表达载体，并且引入合适的宿主中，以允许其表达人抗体（（WO92/01047A1，WO92/20791 A1，WO93/06213 A1，WO93/11236 A1，WO93/19172 A1，WO95/01438 A1，WO95/15388 A1，Annu. Rev. Immunol（1994）12，433-455）。
（4-7）用于制备抗体的抗原结合片段的方法
用于制备scFv的方法是本领域众所周知的（参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030）。在该scFv中，重链可变区和轻链可变区经由接头连接，所述接头阻止它们形成缀合物，优选多肽接头（Huston，J.S.等人，PNAS（1988），85，5879-5883）。scFv中的重链可变区和轻链可变区可以衍生自相同的抗体或可以衍生自不同的抗体。
例如，使用由5至30个残基组成的任意单链肽作为连接这些可变区的多肽接头。
为了获得编码抗体重链或重链可变区的DNA和编码轻链或其轻链可变区的DNA序列的scFv编码DNA，编码完整或所需氨基酸序列的每个DNA部分用作模板，并且使用侧接模板两端的引物对通过PCR扩增。随后，编码多肽接头部分的DNA与侧接DNA两端的引物对组合进一步扩增，使得所得到的片段可以在其端部处与重链和轻链DNA连接。可替代地，编码整个scFv区域的DNA可以通过净合成获得。
根据常规方法，scFv编码DNA可以用于制备含有DNA的表达载体和用表达载体转化的宿主细胞。另外，可以培养宿主细胞，并且可以使用常规方法从培养物中回收scFv。
另外，为了获得抗体的任何其它抗原结合片段，根据上述方法获得编码抗原结合片段的基因并且引入细胞。可以从细胞培养物中回收目的抗原结合片段。
可以将本发明的抗体等多聚化以增强其对于抗原的亲和力。在这种情况下，可以使相同类型的抗体多聚化，或者可以使分别识别相同抗原的多个表位的多种抗体多聚化。用于使这些抗体多聚化的方法的实例可以包括两种scFv与IgG CH3结构域的结合，这些与链霉抗生物素蛋白的结合，以及螺旋-转角-螺旋基序的引入。
本发明的抗体等可以是在氨基酸序列中不同的多个类型的抗CD3抗体的混合物，即多克隆抗体。多克隆抗体的实例可以包括多种类型抗体的混合物，其中CDR集合整体或部分不同。可以从混合培养的不同抗体产生细胞的培养物中回收此类多克隆抗体（WO2004/061104A1）。可替代地，可以混合分开制备的抗体。其为多克隆抗体的一个方面的抗血清，可以通过用所需抗原免疫动物且根据标准方法从动物中回收血清来制备。
与各种分子如聚乙二醇（PEG）缀合的抗体也可以用作抗体的变体。
本发明的抗体等可以是通过这些抗体经由接头与其它分子形成的任何缀合物（免疫缀合物）。其中抗体与放射性材料或具有药理作用的化合物（药物）缀合的抗体-药物复合物可以包括ADC（抗体-药物缀合物）（Methods Mol Biol.（2013）1045：1-27）。
本发明的抗体等可以进一步是与其它功能性多肽连接的抗体中的任一种。此类抗体-肽复合物的实例是抗体和白蛋白结合多肽的复合物（Protein Eng Des Sel.（2012）（2）：81-8）。
（4-8）抗体和抗体的抗原结合片段的纯化
得到的抗体和抗体的抗原结合片段可以纯化直至均质，以便不含除抗体等外的材料。常用的蛋白质分离和纯化方法可以用于分离和纯化抗体和抗体的抗原结合片段。
可以通过适当选择或组合的方法来分离且纯化抗体，所述方法例如层析柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦，尽管分离和纯化方法不受限制。
分离和纯化方法优选例如通过以下来执行：使用编码添加到抗体可变区的羧基末端的His标签或FLAG标签的DNA序列来制备表达载体，用该载体转化细胞，然后培养细胞以表达抗体和抗体的抗原结合片段，并且培养完成后提取培养上清液，随后为使用金属（如Ni或Co）亲和层析、抗FLAG标签抗体柱、凝胶过滤或离子交换层析的纯化。
含有编码标签如His标签或FLAG标签的氨基酸序列的表达抗体和抗体的抗原结合片段也由本发明的抗原等或本发明的分子涵盖。
（4-9）多特异性分子和双特异性分子
用于制备本发明的双特异性分子和多特异性分子的方法的实例包括涉及将表达质粒引入宿主细胞以引起瞬时表达的方法，涉及将质粒引入宿主细胞，然后通过药物选择来选择稳定表达的细胞系以引起永久表达的方法，涉及无细胞合成的方法，以及涉及通过上述方法中任一制备抗体或抗原结合片段，然后使用合成肽接头化学连接这些抗体或片段的方法。
至于使用抗体可变区的双特异性分子制备，实例包括涉及经由肽接头连接两个单链抗体（scFv）（串联scFv）的方法，涉及交叉配对在特异性中不同的两种抗体的结构域，并且通过非共价键形成二聚体（双抗体）的方法，涉及交叉配对在特异性中不同的两种抗体的结构域且形成单链（单链双抗体）的方法，以及涉及制备单链双抗体然后通过非共价键形成二聚体的方法（TandAb，US7129330B2）。
本发明还提供了编码本发明的抗体或抗体的抗原结合片段、或抗原的变体等的基因，具有该基因插入片段的重组载体，用该基因或载体转染的细胞和产生本发明抗体的细胞。
5. 药物组合物
本发明提供了药物组合物，其包含抗CD3抗体或其抗原结合片段，或抗体或抗原结合片段的变体，和/或包含其中任一种的本发明的分子，例如多特异分子。
在本发明中，疾病的治疗和/或预防包括但不限于预防疾病的发作，抑制或抑制其前进或进展，减轻由受疾病影响的个体显示出的一种或两种或更多种症状，抑制或缓解其前进或进展，以及治疗或预防继发疾病等。在分子的情况下，疾病的实例包括癌症。
本发明的药物组合物可以包含治疗或预防有效量的抗CD3抗体或抗体的抗原结合片段和药学上可接受的稀释剂、媒介物、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或添加剂。
“治疗或预防有效量”意指借助于特定剂型和施用途径对特定疾病具有治疗或预防作用的量。
本发明的药物组合物可以包含用于改变、维持或保持组合物或其中包含的抗体的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、张力、无菌或稳定性、溶解性、持续释放、吸收性、渗透性、剂型、强度、性质、形状等的材料（在下文中，称为“药物材料”）。药物材料并无特别限制，只要该材料是药理学上可接受的。例如，无毒或低毒性是由这些药物材料优选具有的性质。
药物材料的实例包括但不限于下述：氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；抗菌剂；抗氧化剂，例如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠；缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐或硼酸盐缓冲液，碳酸氢钠和Tris-HCl溶液；填料例如甘露醇和甘氨酸；螯合剂，例如乙二胺四乙酸（EDTA）；络合剂，例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；增量剂，例如葡萄糖、甘露糖和糊精；烃，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖和糊精；着色剂；矫味剂；稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；低分子量多肽；成盐抗衡离子；防腐剂，例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢；溶剂，例如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇，例如甘露醇和山梨糖醇；悬浮剂；表面活性剂，例如PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇；稳定性增强剂，例如蔗糖和山梨糖醇；弹性增强剂，例氯化钠、氯化钾、甘露醇和山梨糖醇；转运试剂；稀释剂；赋形剂；和药物添加剂。
所添加的这些药物材料的量是抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗体或抗原结合片段的变体、或本发明的分子例如多特异性分子的重量的0.001至1000倍，优选0.01至100倍，且更优选0.1至10倍。
包封在脂质体中的包含本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗体或抗原结合片段的变体、或本发明的分子例如多特异性分子的免疫脂质体，或包含与脂质体缀合的抗体的包含修饰抗体形式的药物组合物（美国专利号6214388等）也包括在本发明的药物组合物中。
赋形剂或载体并无特别限制，只要它们是通常用于可注射的水、盐水、人工脑脊液和用于经口或肠胃外施用的其它制剂中的液体或固体材料。盐水的实例可以包括中性盐水和含血清白蛋白的盐水。
缓冲液的实例可以包括经调节以使药物组合物的最终pH达到7.0至8.5的Tris缓冲液，经调节以使最终pH达到4.0至5.5的乙酸盐缓冲液，经调节以使最终pH达到5.0至8.0的柠檬酸盐缓冲液，并且经调节以使最终pH达到5.0至8.0的组氨酸缓冲液。
本发明的药物组合物是固体、液体或悬浮液。本发明的药物组合物的另一个实例是冷冻干燥的制剂。可以使用赋形剂如蔗糖形成冷冻干燥的制剂。
用于本发明的药物组合物的施用途径可以是肠内施用、局部施用或肠胃外施用中的任一种，并且优选根据靶向疾病进行选择。具体实例包括静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、经皮施用、骨内施用和关节内施用。
药物组合物的组成可以基于施用方法、抗体对于CD3蛋白的结合亲和力等来确定。
本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗体或抗原结合片段的变体、或本发明的分子例如多特异性分子的剂量可以基于个体的物种、疾病的类型、症状、性别、年龄、预先存在的状况、抗体对于CD3蛋白的结合亲和力或其生物活性，并且其它因素来确定。通常0.01至1000 mg/kg，优选0.1至100 mg/kg的剂量可以每天施用一次共180天，或者每天施用两次或三次或更多次。
关于药物组合物的形式的实例包括注射剂（包括冷冻干燥制剂和滴剂）、栓剂、经鼻吸收制剂、经皮吸收制剂、舌下制剂、胶囊、片剂、软膏、颗粒剂、气雾剂、丸剂、粉末、悬浮液、乳剂、滴眼液和生物植入物制剂。
本发明的抗CD3抗体或其抗原结合片段、或抗体或抗原结合片段的变体、和/或包含其中任一种的本发明的分子例如多特异性分子（在下文中，称为“抗CD3抗体等”）可以与另一种药物组合使用。抗CD3抗体等或包含抗CD3抗体等作为活性成分的药物组合物可以与其它药物同时或分开施用，所述其它药物即包含除抗CD3抗体等外的药物作为活性成分的药物组合物。例如，包含抗CD3抗体等作为活性成分的药物组合物可以在其它药物施用后施用，或者其它药物可以在包含抗CD3抗体等作为活性成分的药物组合物施用后施用。可替代地，可以同时施用包含抗CD3抗体等作为活性成分的药物组合物和其它药物。在本发明中，其中抗CD3抗体等和其它药物均作为活性成分包含在单一药物组合物中的情况，以及其中这些活性成分分别包含在多种药物组合物中的情况，均包括在“包含抗CD3抗体等和另一种药物的药物组合物”的范围内。在本发明中，“药物组合物”具有与“其中抗CD3抗体等与另一种药物组合施用的药物组合物”相同的含义。
在本发明中，用于抗CD3抗体等和其它药物的短语“组合施用”意指抗CD3抗体等和其它药物在某一时期内被引入受体的体内。可以施用含有抗CD3抗体等和其它药物的单一制剂，或者抗CD3抗体等和其它药物可以分开配制并且作为分开的制剂施用。在分开制剂的情况下，施用时机并无特别限制，并且制剂可以同时施用，或者可以在不同时间或不同天以交替方式施用。在其中抗CD3抗体等和其它药物在不同时间或不同天分开施用的情况下，施用次序并无特别限制。由于分开的制剂通常根据其分别的施用方法施用，施用频率可以相同或不同。进一步地，分开的制剂可以通过相同的施用方法（施用途径）施用，或者可以通过不同的施用方法（施用途径）施用。抗CD3抗体等和其它药物不必同时存在于体内，并且抗CD3抗体等和其它药物对于某一时间段（例如，1个月，优选1周，更优选几天，甚至更优选1天）引入体内就足够了。可替代地，当施用活性成分之一时，另一种活性成分可能已经从体内消失。
关于“其中抗CD3抗体等与其它药物组合施用的药物组合物”的剂型的实例可以包括1）含有抗CD3抗体等和其它药物的单一制剂的施用，2）通过分开配制抗CD3抗体等和其它药物获得的两种制剂经由相同施用途径的同时施用，3）通过分开配制抗CD3抗体等和其它药物获得的两种制剂经由相同施用途径以交替方式的施用，4）通过分开配制抗CD3抗体等和其它药物获得的两种制剂经由不同施用途径的同时施用，和5）通过分开配制抗CD3抗体等和其它药物获得的两种制剂经由不同施用途径以交替方式的施用。“其中抗CD3抗体等与其它药物组合施用的药物组合物”的剂量、给药间隔、剂型、制剂等取决于包含抗CD3抗体的药物组合物，但不限于此。
配制成两种不同制剂的药物组合物可以是含有这些制剂的试剂盒形式。
在本发明中，抗CD3抗体等与其它药物的“组合”意指抗CD3抗体等和其它药物“组合施用”。
另外的药物也可以用于本发明的组合或药物组合物中。
本发明提供了用于治疗或预防CD3相关疾病的方法，本发明的抗体用于制备用于治疗或预防疾病的药物组合物的用途，以及本发明的抗体用于治疗或预防疾病的用途。本发明还涵盖了包含本发明的抗体用于治疗或预防的试剂盒。
[实施例]
现在将参考实施例更详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。除非另有说明，否则根据"Molecular Cloning"（Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989）中描述的方法，或使用商购可得的试剂或试剂盒根据说明手册，执行与以下实施例中的基因操作相关的程序。
（实施例1）大鼠抗人CD3抗体的制备
1）-1人CD3εδ表达载体的构建
使用Gateway Vector Conversion System（Thermo Fisher Scientific Inc.）制备改造为目的载体的对照载体pcDNA3.1-DEST。图1中所示的编码人CD3ε蛋白（NCBI参考序列：NP_000724.1）的cDNA（SEQ ID NO：1）购自Sino Biological Inc.，并且使用Gateway LRClonase Enzyme mix（Thermo Fisher Scientific Inc.）克隆到pcDNA3.1-DEST载体中，以构建hCD3ε-pcDNA3.1。根据本领域技术人员已知的方法，使用人T细胞衍生的cDNA作为模板，通过PCR扩增编码图2中所示的人CD3δ蛋白（NP_000723.1）（SEQ ID NO：2）的cDNA，并且在pcDNA3.1（+）（Thermo Fisher Scientific Inc.）中克隆，以构建表达载体hCD3δ-pcDNA3.1。对于每种表达载体的大规模制备，使用Endofree Plasmid Giga Kit（QiagenN.V.）。
1）-2免疫
对于免疫，使用WKY/Izm雌性大鼠（Japan SLC，Inc.）。首先，用透明质酸酶（Sigma-Aldrich Corp.）预处理每只大鼠的两只后部大腿。然后，在这些部位处肌内注射实施例1）-1中制备的hCD3ε-pcDNA3.1和hCD3δ-pcDNA3.1表达载体。随后，使用ECM830（BTX）和双针电极进行这些部位的体内电穿孔。与上述相同的体内电穿孔大约每两周重复一次。然后，从大鼠中收获淋巴结或脾脏并且用于杂交瘤制备中。
1）-3杂交瘤制备
使用LF301 Cell Fusion Unit（BEX Co.，Ltd.），将淋巴结细胞或脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞（ATCC，编号CRL-1 581）电融合。用ClonaCell-HY Selection Medium D（StemCell Technologies Inc.）稀释融合细胞并培养。回收杂交瘤集落以制备单克隆杂交瘤。使用ClonaCell-HY Selection Medium E（StemCell Technologies Inc.）培养因此回收的每个杂交瘤集落，并且所得到的杂交瘤培养上清液用于筛选产生抗人CD3抗体的杂交瘤。
1）-4通过细胞ELISA的抗体筛选
1）-4-1用于细胞ELISA的抗原基因表达细胞的制备
HEK293α细胞（表达整联蛋白αv和整联蛋白β3的稳定表达HEK293衍生的细胞系）在含有10% FBS的DMEM培养基中调节至7.5 × 105个细胞/mL。使用Lipofectamine 2000（ThermoFisher Scientific Inc.），根据转染程序，将hCD3ε-pcDNA3.1和hCD3δ-pcDNA3.1或对照pcDNA3.1-DEST转染至其中。所得到的细胞以100 μL/孔的量分配到96孔板（Corning Inc.）中，并且在含有10% FBS的DMEM培养基中在37℃下在5% CO2条件下培养过夜。所得到的转染细胞在细胞ELISA中以附着状态使用。
1）-4-2细胞ELISA
从实施例1）-4-1中制备的表达载体转染的HEK293α细胞中去除培养上清液后，将每种杂交瘤培养上清液加入hCD3ε-pcDNA3.1-和hCD3δ-pcDNA3.1-、或pcDNA3.1-DEST转染的HEK293α细胞中，并且使板在4℃下静置1小时。用含有5% FBS的PBS洗涤孔中的细胞一次。然后，加入用含有5% FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgG和HRP-Linked Whole Ab Goat（GEHealthcare Bio-Sciences Corp.），并且使板在4℃下静置1小时。用含有5% FBS的PBS洗涤孔中的细胞两次。然后，OPD显色溶液（
OPD溶液（分别以0.4 mg/mL和0.6%（v/v）的浓度溶解于0.05 M柠檬酸三钠和0.1 M磷酸氢二钠十二水合物，pH 4.5中的邻苯二胺二盐酸盐（Wako Pure Chemicals Industries，Ltd.）和H2O2）以100 μL/孔的浓度加入。显色反应伴随偶尔搅拌执行，并且通过加入浓度为100 μL/孔的1 M HCl终止。然后，使用酶标仪（ENVISION；PerkinElmer，Inc.）在490 nm处测量吸光度。为了选择产生与细胞膜表面上表达的人CD3结合的抗体的杂交瘤，与对照pcDNA3.1-DEST转染的HEK293细胞相比，得到对于hCD3ε-pcDNA3.1和hCD3δ-pcDNA3.1表达载体转染的HEK293α细胞显示出更高吸光度的培养上清液的杂交瘤被选择作为抗人CD3抗体产生阳性杂交瘤。
1）-5基于人T细胞活化的抗体筛选
使用CD69活化标记物的检测作为指数，就抗CD3抗体对于T细胞的活化评估从杂交瘤获得的抗CD3抗体。将人T细胞系Jurkat细胞（ATCC，编号TIB-152）在含有FBS的RPMI1640培养基中调节至5 × 106个细胞/mL的浓度，并且以100 μL/孔的浓度加入96孔板中。通过离心去除上清液后，在实施例1）-4中通过细胞ELISA选择的每种抗人CD3抗体产生阳性杂交瘤的培养上清液或大鼠IgG同种型对照抗体（R＆D Systems，Inc.）以5 μg/mL的最终浓度加入Jurkat细胞中，并且使板在37℃下静置30分钟。然后，交联剂山羊抗大鼠IgG Fcγ片段特异性（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）以10 μg/孔的最终浓度加入，并且将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养过夜。在第二天时，去除上清液，并且用含有5% FBS的PBS洗涤孔中的细胞一次。然后，以20 μL/孔的浓度加入PE小鼠抗人CD69抗体（BDBiosciences），并且使板在4℃下静置30分钟。用含有5% FBS的PBS洗涤孔中的细胞两次，然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后为使用流式细胞仪（FC500；Beckman Coulter Inc.）的检测。使用Flowjo（Tree Star Inc.）分析数据。将PE荧光强度绘制为直方图。得到的样品在PE的荧光强度直方图中显示出比在大鼠IgG同种型对照抗体的荧光强度直方图中更强的荧光强度转变的杂交瘤，被选择作为对于激活人T细胞的能力阳性的产生抗人CD3抗体的杂交瘤。
1）-6通过流式细胞术基于对人或猴CD3的选择性结合活性的筛选
1）-6-1表达人抗原基因的细胞的制备
Lenti-X293T细胞（Takara Bio Inc.，目录# 632180）以5.3 × 104个细胞/cm2的密度加入225-cm2的烧瓶中，并且在含有10% FBS的DMEM培养基中在37℃下在5% CO2条件下培养过夜。在第二天时，使用Lipofectamine 2000，将hCD3ε-pcDNA3.1和hCD3δ-pcDNA3.1或对照pcDNA3.1-DEST转染到Lenti-X293T细胞中，并且将细胞在37℃下在5% CO2条件下进一步培养过夜。在第二天时，用TrypLE Express（Thermo Fisher Scientific Inc.）处理表达载体转染的Lenti-X293T细胞，用含有10% FBS的DMEM洗涤，然后在含有5% FBS 的PBS中调节至5× 106个细胞/mL的浓度。所得到的细胞悬浮液用于流式细胞术分析中。
1）-6-2对人CD3的结合活性的流式细胞术分析
通过流式细胞术进一步确认了由每个杂交瘤产生的抗体的人CD3结合特异性，所述杂交瘤在实施例1）-5中被确定为对于激活人T细胞的能力呈阳性。将实施例1）-6-1中制备的每种Lenti-X293T细胞悬浮液以100 μL/孔的浓度加入96孔U形底微量培养板中，并且离心以去除上清液。通过加入杂交瘤培养上清液悬浮hCD3ε-pcDNA3.1-和hCD3δ-pcDNA3.1转染的Lenti-X293T细胞或pcDNA3.1-DEST转染的Lenti-X293T细胞，并且在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤一次，然后通过加入用含有5% FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgGFITC缀合物（Sigma-Aldrich Corp.）进行悬浮，并且在4℃下静置30分钟。细胞用含有5%FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于含有5% FBS和2 μg/ml 7-氨基放线菌素D（MolecularProbes，Inc.）的PBS中，随后为使用流式细胞仪的检测。使用Flowjo分析数据。通过门控去除7-氨基放线菌素D-阳性死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度绘制为直方图。得到的样品在hCD3ε-pcDNA3.1-和hCD3δ-pcDNA3.1转染的Lenti-X293T细胞的直方图中显示出比在对照pcDNA3.1-DEST转染的Lenti-X293T细胞的荧光强度直方图中更强的荧光强度转变的杂交瘤，被选择作为产生与人CD3结合的抗体的杂交瘤。
1）-6-3猴CD3εδ表达载体的构建
根据本领域技术人员已知的方法，使用猴T细胞衍生的cDNA作为模板，通过PCR扩增编码猴CD3ε蛋白（NCBI参考序列：NP_001270544.1）和猴CD3δ蛋白（NCBI参考序列：NP_001274617.1）的cDNA，并且克隆到pcDNA3.1（+）（Thermo Fisher Scientific Inc.）中，以构建表达载体cynoCD3ε-pcDNA3.1和cynoCD3δ-pcDNA3.1。
1）-6-4表达猴抗原基因的细胞的制备
Lenti-X293T细胞以5.3 × 104个细胞/cm2的密度接种到225-cm2的烧瓶中，并且在含有10% FBS的DMEM培养基中在37℃下在5% CO2条件下培养过夜。在第二天时，使用Lipofectamine 2000，将cynoCD3ε-pcDNA3.1和cynoCD3δ-pcDNA3.1或对照pcDNA3.1-DEST转染到Lenti-X293T细胞中，并且将细胞在37℃下在5% CO2条件下进一步培养过夜。在第二天时，用TrypLE Express处理表达载体转染的Lenti-X293T细胞，用含有10% FBS的DMEM洗涤，然后在含有5% FBS 的PBS中调节至5 × 106个细胞/mL的浓度。所得到的细胞悬浮液用于流式细胞术分析中。
1）-6-5对猴CD3的结合活性的流式细胞术分析
通过流式细胞术进一步确认了由每个杂交瘤产生的抗体的猴CD3结合特异性，所述杂交瘤在实施例1）-6-2中被确定为产生与人CD3结合的抗体。将实施例1）-6-4中制备的每种Lenti-X293T细胞悬浮液以100 μL/孔的浓度加入96孔U形底微量培养板中，并且离心以去除上清液。通过加入杂交瘤培养上清液悬浮cynoCD3ε-pcDNA3.1-和cynoCD3δ-pcDNA3.1转染的Lenti-X293T细胞或pcDNA3.1-DEST转染的Lenti-X293T细胞，并且在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤一次，然后通过加入用含有5% FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgG FITC缀合物进行悬浮，并且在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于含有5% FBS和2 μg/ml 7-氨基放线菌素D的PBS中，随后为使用流式细胞仪的检测。使用Flowjo分析数据。通过门控去除7-氨基放线菌素D-阳性死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度绘制为直方图。得到的样品在cynoCD3ε-pcDNA3.1-和cynoCD3δ-pcDNA3.1转染的Lenti-X293T细胞的直方图中显示出比在对照pcDNA3.1-DEST转染的Lenti-X293T细胞的荧光强度直方图中更强的荧光强度转变的杂交瘤，被选择作为产生与猴CD3结合的抗体的杂交瘤。
1）-6-6表达人CD3δ基因的细胞的制备
Lenti-X293T细胞以5.3 × 104个细胞/cm2的密度接种到225-cm2的烧瓶中，并且在含有10% FBS的DMEM培养基中在37℃下在5% CO2条件下培养过夜。在第二天时，使用Lipofectamine 2000，将hCD3δ-pcDNA3.1或对照pcDNA3.1-DEST转染到Lenti-X293T细胞中，并且将细胞在37℃下在5% CO2条件下进一步培养过夜。在第二天时，用TrypLE Express处理表达载体转染的Lenti-X293T细胞，用含有10% FBS的DMEM洗涤，然后在含有5% FBS 的PBS中调节至5 × 106个细胞/mL的浓度。所得到的细胞悬浮液用于流式细胞术分析中。
1）-6-7针对人CD3δ的结合活性的流式细胞术分析
通过流式细胞术进一步确认了由每个杂交瘤产生的抗体的人CD3δ结合特异性，所述杂交瘤在实施例1）-6-5中被确定为产生与猴CD3结合的抗体。将实施例1）-6-6中制备的每种Lenti-X293T细胞悬浮液以100 μL/孔的浓度加入96孔U形底微量培养板中，并且离心以去除上清液。通过加入杂交瘤培养上清液悬浮hCD3δ-pcDNA3.1转染的Lenti-X293T细胞或pcDNA3.1-DEST转染的Lenti-X293T细胞，并且在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤一次，然后通过加入用含有5% FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgG FITC缀合物进行悬浮，并且在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于含有5% FBS和2 μg/ml 7-氨基放线菌素D的PBS中，随后为使用流式细胞仪的检测。使用Flowjo分析数据。通过门控去除7-氨基放线菌素D-阳性死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度绘制为直方图。得到的样品在hCD3δ-pcDNA3.1转染的Lenti-X293T细胞的直方图中显示出比在对照pcDNA3.1-DEST转染的Lenti-X293T细胞的荧光强度直方图中更强的荧光强度转变的杂交瘤，被排除作为产生与人CD3δ结合的抗体的杂交瘤。
1）-6-8对猴T细胞系的结合活性的流式细胞术分析
通过流式细胞术进一步确认了由每个产生抗体的杂交瘤产生的抗体的猴T细胞系结合特异性，所述杂交瘤在实施例1）-6-7中未排除。将食蟹猴T细胞系HSC-F（JCRB Cell Bank，编号JCRB1164）在含有FBS的RPMI1640培养基中调节至5 × 106个细胞/mL的浓度，并且以100 μL/孔的浓度加入96孔板中。通过离心去除上清液后，将实施例1）-5-7中未排除的抗体产生杂交瘤的培养上清液、或大鼠IgG同种型对照抗体加入HSC-F细胞中，并且使板在4℃下静置1小时。然后，去除上清液，并且孔中的细胞用含有5% FBS的PBS洗涤一次，然后通过加入用含有5% FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgG FITC缀合物进行悬浮，并且在4℃下静置1小时。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤三次，然后重悬浮于含有5% FBS和2 μg/ml 7-氨基放线菌素D的PBS中，随后为使用流式细胞仪的检测。使用Flowjo分析数据。通过门控去除7-氨基放线菌素D-阳性死细胞后，将活细胞的FITC荧光强度绘制为直方图。得到的样品在FITC的荧光强度直方图中显示出比在大鼠IgG同种型对照抗体的荧光强度直方图中更强的荧光强度转变的杂交瘤，被选择作为产生也与猴T细胞系结合的抗体的杂交瘤。
1）-7抗体的同种分型
从实施例1）-6中获得的大鼠抗CD3抗体产生杂交瘤中选择提示与人和猴CD3ε结合且还与猴T细胞系结合，并且具有激活人T细胞的高能力的C3-147，并且通过抗体同种分型鉴定。使用Rat Immunoglobulin Isotyping ELISA Kit（BD Pharmingen）测定同种型。结果，大鼠抗CD3单克隆抗体C3-147的同种型确认为IgG2b和λ链。
（实施例2）大鼠抗CD3单克隆抗体（C3-147）与人CD3的结合活性的研究
2）-1从杂交瘤上清液制备单克隆抗体
2）-1-1产生C3-147的杂交瘤的培养
从杂交瘤培养上清液中纯化大鼠抗CD3单克隆抗体。首先，允许产生C3-147的杂交瘤在ClonaCell-HY Selection Medium E（StemCell Technologies Inc.）中生长至足够的量。然后，将培养基替换为含有5 μg/mL庆大霉素（Thermo Fisher Scientific Inc.）的Hybridoma SFM（Thermo Fisher Scientific Inc.），所述Hybridoma SFM补充有20% UltraLow IgG FBS（Thermo Fisher Scientific Inc.），随后培养7天。回收该培养的上清液，并且通过0.22 μm过滤器（Corning Inc.）灭菌。
2）-1-2纯化
通过蛋白G亲和层析从实施例2）-1-1中制备的杂交瘤培养上清液中纯化抗体。将抗体吸附到蛋白G柱（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.）上，并且用PBS洗涤柱，随后为用0.1M甘氨酸/盐酸（pH 2.7）的水溶液的洗脱。通过加入1 M Tris-HCl（pH9.0）将洗脱液调节至pH 7.0至7.5。然后，使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20（分子量截止：UF30K，Sartorius Japan K.K.），将缓冲液替换为PBS，同时将抗体浓缩并调节至2 mg/mL的抗体浓度。最后，将浓缩物通过Minisart-Plus过滤器（Sartorius Japan K.K.）过滤并用作纯化的样品。
2）-2获得的大鼠抗CD3抗体（C3-147）与人单链抗原的结合
2）-2-1人CD3εγ单链抗原的制备
编码CD3ε或CD3γ的氨基酸序列从提交给蛋白质数据库的OTK3-人CD3εγ单链抗原复合物的晶体结构（PDBID：1SY6）获得。参考文献（Kim，K.S.等人，（2000）J. Mol. Biol. 302，899-916）中报道的由26个氨基酸组成的相同肽接头，用作用于将CD3ε的羧基末端连接到CD3γ的氨基末端的接头。通过将限制性位点BamHI和HindIII分别添加到5'和3'端部，来合成编码序列表的图3（SEQ ID NO：4）中所示的人CD3εγ单链抗原的基因（GeneArt GeneSynthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.）。使用Ligation High（ToyoboCo.，Ltd.），使通过用限制性酶BamHI和HindIII消化质粒pQE80L（Qiagen N.V.）获得的大约4.8 kb的片段，与通过用BamHI和HindIII消化人CD3εγ单链抗原基因获得的大约0.6 kb的片段连接，以制备用于在大肠杆菌中表达的质粒pQE80L-scCD3εγ。所得到的scCD3εγ的氨基酸序列描述于序列表的图4（SEQ ID NO：5）中。用质粒pQE80L-scCD3εγ转化用于表达的大肠杆菌BL21（DE3）用于表达，并且使用Ultra Yield flasksTM（Thomson InstrumentCompany），将所得到的菌落加入1 L MagicMedia（Invitrogen Corp.）中，并且在250 rpm下在30℃下振荡培养21小时。回收因此培养的细菌细胞。在含有1% Triton溶液的Tris缓冲溶液的存在下，使用超声波均质机破碎细菌细胞，并且重复冻融循环。最后，通过在4℃下以15000 rpm离心15分钟回收包涵体。根据参考文献的方法（Kjer-Nielsen等人（2004）PNASvol. 101，no. 20，7675-7680），执行从包涵体的重折叠到纯化的程序，除了代替文献中使用的2C11，在抗体柱中使用的抗CD3抗体是小鼠抗CD单克隆抗体OKT3（Sgro，Toxicology105（1995），23-29，Orthoclone，Janssen-Cilag）之外。
2）-2-2对人CD3εγ单链抗原的结合活性的SPR测量
通过捕获方法，使用BIAcore 3000（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.），就其与抗原的结合测定抗体，所述捕获方法涉及在固定的抗小鼠IgG抗体上捕获作为配体的抗体，并且测定作为分析物的抗原。使用的抗原是实施例2）-2-1中制备的人CD3εγ。通过胺偶联方法，将大约11000 RU的抗小鼠IgG抗体（Mouse Antibody Capture Kit，GE HealthcareBio-Sciences Corp.）共价结合至传感器芯片CM5（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.）。类似地，将该抗体固定到参考细胞上。使用的运行缓冲液是HBS-EP+（10 mM HEPES（pH7.4）、0.15 M NaCl、3 mM EDTA和0.05%表面活性剂P20）。将抗体添加到固定抗小鼠IgG抗体的芯片上大约1分钟，然后作为配体捕获。然后，以30 μl/分钟的流速加入100 nM抗原共120秒，并且监测与抗原的结合。以10 μl/分钟的流速加入作为再生溶液的10 mM甘氨酸-HCl（pH 1.7）共3分钟。结果，在120秒后C3-147的结合信号为34 RU。
2）-3通过SPR确认所得到的大鼠抗CD3抗体（C3-147）中的抗原结合位点
以与实施例2）-2-2相同的方式执行用于确认抗原结合位点的方法。结果，对于C3-147获得的结合信号是34 RU。另一方面，类似地确认本领域已知的抗CD3抗体SP34（BDPharmingen）中的抗原结合位点作为比较实例。在SP34中未观察到34RU的结合信号。这些结果指示由C3-147识别的CD3εγ表面上的结合位点不同于由SP34识别的那种。
（实施例3）编码大鼠抗CD3抗体（C3-147）中的可变区的cDNA的测序
编码大鼠抗CD3抗体（C3-147）的可变区的cDNA通过下述方法进行测序。
3）-1 cDNA合成
产生大鼠抗CD3抗体（C3-147）的杂交瘤的细胞裂解产物（50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、250 mM LiCl、5 mM EDTA（pH 8）、0.5%十二烷基硫酸锂（LiDS）和2.5 mM二硫苏糖醇（DTT）），与Dynabeads mRNA DIRECT试剂盒（Thermo Fisher Scientific Inc.）的寡核苷酸dT25结合的磁珠混合，使得mRNA与磁珠结合。接下来，磁珠用mRNA洗涤溶液A（10 mM Tris-HCl（pH7.5）、0.15 M LiCl、1 mM EDTA、0.1% LiDS和0.1% Triton X-100），并且用于cDNA合成的溶液（50 mM Tris-HCl（pH 8.3）、75 mM KCl、3 mM MgCl2、5 mM DTT、0.5 mM dNTP、0.2%Triton X-100和1.2单位的RNA酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific Inc.）各洗涤一次。然后，使用补充有12单位的SuperScript III Reverse Transcriptase（Thermo FisherScientific Inc.）的用于cDNA合成的溶液合成cDNA。随后，用3'加尾反应溶液（50 mM磷酸钾、4 mM MgCl2、0.5 mM dGTP、0.2% Triton X-100和1.2单位的RNA酶抑制剂）洗涤cDNA，随后为用补充有48单位的重组末端转移酶（Roche Applied Science）的反应溶液的3'加尾反应。
3）-2大鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区基因片段的扩增和测序
用TE溶液（10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM EDTA和0.1% Triton X-100）洗涤磁珠。然后，通过5'-RACE PCR扩增大鼠免疫球蛋白重链和轻链基因。具体地，将磁珠转移至PCR反应溶液（0.2 μM引物、0.2 mM dNTP和0.25单位的PrimeSTAR HS DNA Polymerase（Takara BioInc.）），并且经受各自涉及94℃共30秒和68℃共90秒的35个反应循环。使用的引物组在下文描述。
用于重链基因扩增的PCR引物组
有义引物Nhe-polyC-S
5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3'；图5（SEQ ID NO：50）
第一反义引物rIgγ-AS1
5'-TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC-3'；图6（SEQ ID NO：51）
第二反义引物rIgγ-AS2
5'-TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC-3'；图7（SEQ ID NO：52）
用于轻链基因扩增的PCR引物组
有义引物Nhe-polyC-S2
5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3'；图8（SEQ ID NO：53）
第一反义引物rIgL-AS1
5'-TTCCACATCACTCGGGTAGAAATCAG-3'；图9（SEQ ID NO：54）
第二反义引物rIgγ-AS2
5'-TAACACCAGGGTAGAAATCTGTCACCAT-3'；图10（SEQ ID NO：55）
对通过PCR反应扩增的片段的核苷酸序列进行序列分析。使用的引物在下文描述。
用于重链测序的有义引物rIgγ-seq
5'-CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3'；图11（SEQ ID NO：56）
用于轻链测序的反义引物rIgL-seq1
5'-TCCCTGGAGCTCCTCAGT-3'；图12（SEQ ID NO：57）
用于轻链测序的反义引物rIgL-seq2
5'-GCCTTGTCAGTCTTGAGC-3'；图13（SEQ ID NO：58）
使用基因序列分析仪（"ABI PRISM 3700 DNA Analyzer；Applied Biosystems，Inc."或"Applied Biosystems 3730xl Analyzer；Applied Biosystems，Inc."）进行序列分析。具有AmpliTaq DNA聚合酶（Life Technologies Corp.）和GeneAmp 9700（AppliedBiosystems，Inc.）的Dye Terminator Cycle Sequencing System用于测序反应中。
通过序列分析确定的C3-147重链可变区的核苷酸序列描述于图14（SEQ ID NO：6）中，并且其氨基酸序列描述于图15（SEQ ID NO：7）中。C3-147轻链可变区的核苷酸序列描述于图16（SEQ ID NO：8）中，并且其氨基酸序列描述于图17（SEQ ID NO：9）中。
（实施例4）大鼠抗CD3 scFv（C3E-7000）及其人源化形式（C3E-7034）的制备
4）-1大鼠抗CD3抗体（C3-147）scFv的制备
4）-1-1大鼠抗体CD3 scFv表达载体（pC3E-7000）的构建
合成（Sigma-Aldrich Corp.，Custom Oligo Synthesis Service）DNA片段的有义链寡核苷酸（图18（SEQ ID NO：10））、及其反义链寡核苷酸（图19（SEQ ID NO：11）），所述DNA片段具有在编码接头的DNA序列上游和下游的15个碱基的另外序列，所述接头待插入C3-147的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）之间，并且调节至100 pmol/ml L。然后，将20 μL这些寡核苷酸中的每一种混合，并且在96℃下静置10分钟、在70℃下静置2分钟、在60℃下静置2分钟、在40℃下静置2分钟和在30℃下静置2分钟用于退火，以制备待插入VH和VL之间的接头的DNA片段。接下来，通过PCR扩增以添加人IgG重链信号序列DNA片段、通过PCR扩增的大鼠抗CD3抗体C3-147的VH的DNA片段（显示于图14（SEQ ID NO：6）中）、待插入VH和VL之间的接头的DNA片段，并且通过PCR扩增的DNA片段，其中将编码FLAG-His标签的DNA序列加入含有C3-147VL DNA序列的区域中（显示于图16（SEQ ID NO：8）中），使得FLAG-His标签位于羧基末端处，使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.），与衍生自用于动物细胞的表达载体pcDNA-3.3TOPO（Thermo Fisher Scientific Inc.）的载体主链连接，以制备在ORF中含有图20（SEQ ID NO：14）的核苷酸序列的scFv表达载体pC3E-7000。
4）-1-2大鼠抗CD3 scFv（C3E-7000）的表达和纯化
根据手册，将Expi293F细胞（Thermo Fisher Scientific Inc.）进行传代培养和培养。将scFv表达载体转染至在对数生长期中的Expi293F细胞。将scFv瞬时表达，过滤，然后用于纯化中。通过两个步骤执行纯化，所述两个步骤涉及使用His Trap Excel（GE HealthcareBio-Sciences Corp.）的Ni亲和层析，并且使用Superdex 200increase（GE HealthcareBio-Sciences Corp.）的凝胶过滤。回收对应于scFv单体的分子量的峰，并且用作纯化的蛋白质样品。对于纯化，使用AKTA层析系统，并且所有步骤都在4℃下执行。HBSor（25 mM组氨酸/5%山梨糖醇，pH 5.0）用作用于纯化蛋白质的缓冲液。将纯化的蛋白质样品施加于SEC用于分析，以确定其纯度和浓度。然后，将样品用于各种测定中。C3E-7000中的氨基酸序列描述于图21（SEQ ID NO：15）中。
4）-2大鼠抗CD3 scFv（C3E-7000）的人源化
4）-2-1抗CD3抗体的人源化设计
使用商购可得的蛋白质三维结构分析程序Discovery Studio 3.5（Dassault SystemsS.A.），根据本领域已知的方法如同源建模（Methods in Enzymology，203，121-153，（1991）），执行大鼠抗体可变区的分子建模。
通过一般称为CDR移植的方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，10029-10033（1989））执行人源化。受体抗体选自由KABAT等人（Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.（1991））指定的人亚组共有序列，或基于构架区内的氨基酸同一性的种系序列、预期免疫原性预测评分或物理性质等。另外，通过使用由上述方法构建的三维结构模型，参考由Queen等人（PNAS（1989）86，10029-10033）提供的标准等选择回复突变。
4）-2-2人源化氨基酸序列C3E-7000的设计
基于实施例4）-2-1中描述的方法，设计充当C3E-7000的人源化形式的C3E-7034的氨基酸序列，具有人亚组共有序列γ3和λ6作为受体。在图22（SEQ ID NO：16）中描述了通过以下由图15（SEQ ID NO：7）中所示的C3-147VH的氨基序列设计的C3E-7034VH的氨基酸序列：在氨基酸位置16处的精氨酸替换为甘氨酸、在氨基酸位置17处的丙氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置19处的赖氨酸替换为精氨酸、在氨基酸位置23处的缬氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置24处的缬氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置88处的丝氨酸替换为丙氨酸，并且在氨基酸位置93处的苏氨酸替换为缬氨酸。
在图23（SEQ ID NO：17）中描述了通过以下由图17（SEQ ID NO：9）中所示的C3-147VL的氨基序列设计的C3E-7034VL的氨基酸序列：在氨基酸位置1处的谷氨酰胺替换为天冬酰胺、在氨基酸位置3处的缬氨酸替换为甲硫氨酸、在氨基酸位置8处的天冬酰胺替换为组氨酸、在氨基酸位置12处的苏氨酸替换为谷氨酸、在氨基酸位置13处的天冬酰胺替换为丝氨酸、在氨基酸位置14处的亮氨酸替换为脯氨酸、在氨基酸位置16处的苏氨酸替换为赖氨酸、在氨基酸位置19处的谷氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置20处的亮氨酸替换为异亮氨酸、在氨基酸位置43处的精氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置75处的亮氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置79处的天冬酰胺替换为丝氨酸、在氨基酸位置81处的缬氨酸替换为亮氨酸，并且在氨基酸位置82处的谷氨酰胺替换为赖氨酸。
基于IMGT的CDR定义的C3E-7000和C3E-7034的CDR序列对于CDR-H1在图24（SEQ IDNO：26）中描述，对于CDR-H2在图25（SEQ ID NO：27）中描述，对于CDR-H3在图26（SEQ ID NO：28）中描述，对于CDR-L1在图27（SEQ ID NO：29）中描述，对于CDR-L2在图28（SEQ ID NO：30）中描述，并且对于CDR-L3在图29（SEQ ID NO：31）中描述。
4）-2-3人源化的抗CD3 scFv C3E-7034的修饰
为了制备具有独特结合活性和细胞毒性活性同时维持与猴CD3ε的交叉反应性的变体，通过将C3E-7034的VL的构架区中的氨基酸替换为scFv的VL中的相应氨基酸（在IGLV1-40*01中含有四个突变A2S、S8P、V13A和F80L的序列），以与实施例4）-2-1中描述的方法相同的方式设计变体。
4）-2-3-1 C3E-7035的氨基酸序列设计
设计了充当C3E-7034的变体的C3E-7035的氨基酸序列。在图30（SEQ ID NO：20）中描述了通过以下由图23（SEQ ID NO：17）中所示的C3E-7034轻链可变区设计的C3E-7035轻链的氨基酸序列：在氨基酸位置1处的天冬酰胺替换为谷氨酰胺、在氨基酸位置2处的苯丙氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置3处的甲硫氨酸替换为缬氨酸、在氨基酸位置8处的组氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置12处的谷氨酸替换为甘氨酸、在氨基酸位置13处的丝氨酸替换为缬氨酸、在氨基酸位置16处的赖氨酸替换为谷氨酰胺、在氨基酸位置17处的苏氨酸替换为精氨酸、在氨基酸位置40处的组氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置41处的谷氨酸替换为脯氨酸、在氨基酸位置43处的丝氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置44处的丝氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置46处的苏氨酸替换为赖氨酸、在氨基酸位置47处的苏氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置48处的异亮氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置57处的天冬氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置60处的丝氨酸替换为脯氨酸、在氨基酸位置67处的异亮氨酸替换为赖氨酸、在氨基酸位置68处的天冬氨酸缺失、在氨基酸位置69处的精氨酸缺失、在氨基酸位置71处的丝氨酸替换为甘氨酸、在氨基酸位置72处的赖氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置77处的苏氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置79处的丝氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置80处的天冬酰胺替换为甘氨酸、在氨基酸位置81处的亮氨酸替换为苯丙氨酸、在氨基酸位置82处的赖氨酸替换为谷氨酰胺、在氨基酸位置83处的苏氨酸替换为丙氨酸，并且在氨基酸位置90处的苯丙氨酸替换为酪氨酸。紧在轻链可变区之前插入的含有甲硫氨酸和丙氨酸的C3E-7035的全长序列描述于序列表的图31（SEQ ID NO：22）中。
4）-2-3-2 C3E-7036的氨基酸序列设计
设计了充当C3E-7034的变体的C3E-7036的氨基酸序列。在图32（SEQ ID NO：23）中描述了通过以下由图23（SEQ ID NO：17）中所示的C3E-7034轻链可变区设计的C3E-7036轻链的氨基酸序列：在氨基酸位置8处的组氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置12处的谷氨酸替换为甘氨酸、在氨基酸位置13处的丝氨酸替换为缬氨酸、在氨基酸位置16处的赖氨酸替换为谷氨酰胺、在氨基酸位置17处的苏氨酸替换为精氨酸、在氨基酸位置23处的赖氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置24处的精氨酸替换为甘氨酸、在氨基酸位置40处的组氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置41处的谷氨酸替换为脯氨酸、在氨基酸位置43处的丝氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置44处的丝氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置46处的苏氨酸替换为赖氨酸、在氨基酸位置47处的苏氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置48处的异亮氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置57处的天冬氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置60处的丝氨酸替换为脯氨酸、在氨基酸位置67处的异亮氨酸替换为赖氨酸、在氨基酸位置68处的天冬氨酸缺失、在氨基酸位置69处的精氨酸缺失、在氨基酸位置71处的丝氨酸替换为甘氨酸、在氨基酸位置72处的赖氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置77处的苏氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置79处的丝氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置80处的天冬酰胺替换为甘氨酸、在氨基酸位置81处的亮氨酸替换为苯丙氨酸、在氨基酸位置82处的赖氨酸替换为谷氨酰胺、在氨基酸位置83处的苏氨酸替换为丙氨酸，并且在氨基酸位置90处的苯丙氨酸替换为酪氨酸。C3E-7036的全长氨基酸序列描述于图33（SEQ ID NO：25）中。
4）-2-3-3 CDR变体中的氨基酸设计
为了去除C3E-7034 CDRH2（图25，SEQ ID NO：27）中存在的脱氨基位点的目的，设计了在图22（SEQ ID NO：16）中所示的C3E-7034重链可变区的氨基酸位置53处具有取代天冬酰胺的精氨酸的C3E-7078，并且具有为此被取代的丝氨酸的C3E-7079。另外，设计了在C3E-7036重链可变区的氨基酸位置53处具有取代天冬酰胺的精氨酸的C3E-7085。C3E-7078的完整氨基酸序列在图68（SEQ ID NO：60）中列出。C3E-7079的完整氨基酸序列在图70（SEQ IDNO：62）中列出。C3E-7085的完整氨基酸序列在图72（SEQ ID NO：64）中列出。
为了减少C3E-7078对于人CD3的亲和力的目的，设计了在C3E-7078轻链可变区的氨基酸位置52处具有取代天冬氨酸的甘氨酸的C3E-7086、具有为此被取代的谷氨酰胺的C3E-7087、具有为此被取代的天冬酰胺的C3E-7088、具有为此被取代的丝氨酸的C3E-7089，并且具有为此被取代的丙氨酸的C3E-7090。同样地，为了减少C3E-7079对于人CD3的亲和力的目的，设计了在C3E-7079轻链可变区的氨基酸位置52处具有取代天冬氨酸的甘氨酸的C3E-7091、具有为此被取代的谷氨酰胺的C3E-7092、具有为此被取代的天冬酰胺的C3E-7093、具有为此被取代的丝氨酸的C3E-7094，并且具有为此被取代的丙氨酸的C3E-7095。C3E-7086的完整氨基酸序列在图74（SEQ ID NO：66）中列出。C3E-7087的完整氨基酸序列在图76（SEQ ID NO：68）中列出。C3E-7088的完整氨基酸序列在图78（SEQ ID NO：70）中列出。C3E-7089的完整氨基酸序列在图80（SEQ ID NO：72）中列出。C3E-7090的完整氨基酸序列在图82（SEQ ID NO：74）中列出。C3E-7091的完整氨基酸序列在图84（SEQ ID NO：76）中列出。C3E-7092的完整氨基酸序列在图86（SEQ ID NO：78）中列出。C3E-7093的完整氨基酸序列在图88（SEQ ID NO：80）中列出。C3E-7094的完整氨基酸序列在图90（SEQ ID NO：82）中列出。C3E-7095的完整氨基酸序列在图92（SEQ ID NO：84）中列出。
4）-3人源化的抗CD3 scFv（C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036）的制备
4）-3-1人源化的抗CD3 scFv（C3E-7034）表达载体pC3E-7034的构建
合成包含scFv的DNA序列的DNA片段，所述scFv含有经由15氨基酸的柔性接头、与C3E-7034重链（显示于图22（SEQ ID NO：16）中）的羧基末端连接的C3E-7034轻链（显示于图23（SEQ ID NO：17）中），具有在上游和下游附着的15碱基的另外序列（GeneArt GeneSynthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.）。使用该DNA片段作为模板，通过PCR扩增含有C3E-7034 DNA以及在上游和下游的另外序列的区域，以获得插入DNA片段。使用实施例4）-1-1中制备的表达载体pC3E-7000作为模板，通过PCR扩增除了scFv区域之外的载体区域，以获得载体片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.），使这些DNA片段退火，以制备在ORF中含有图34（SEQ ID NO：18）的核苷酸序列的人源化抗CD3 scFv表达载体pC3E-7034。
4）-3-2人源化的抗CD3 scFv（C3E-7035）表达载体pC3E-7035的构建
合成包含scFv的DNA序列的DNA片段，所述scFv含有经由17氨基酸的柔性接头、与C3E-7034重链（显示于图22（SEQ ID NO：16）中）的羧基末端连接的C3E-7035轻链（显示于图30（SEQ ID NO：20）中），具有在上游和下游附着的15碱基的另外序列（GeneArt GeneSynthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.）。以与实施例4）-3-1相同的方式，构建在ORF中含有图35（SEQ ID NO：21）的核苷酸序列的C3E-7035表达载体。所得到的表达载体命名为“pC3E-7035”。
4）-3-3人源化的抗CD3 scFv（C3E-7036）表达载体pC3E-7036的构建
合成包含scFv的DNA序列的DNA片段，所述scFv含有经由15氨基酸的柔性接头、与C3E-7034重链（显示于图22（SEQ ID NO：16）中）的羧基末端连接的C3E-7036轻链（显示于图32（SEQ ID NO：23）中），具有附着至其上游和下游的15碱基的另外序列（GeneArt GeneSynthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.）。以与实施例4）-3-1相同的方式，构建在ORF中含有图36（SEQ ID NO：24）的核苷酸序列的C3E-7036表达载体。所得到的表达载体命名为“pC3E-7036”。
4）-3-4 CDR修饰的人源化抗体CD3 scFv表达载体的构建
使用在ORF中含有图34（SEQ ID NO：18）中所示的C3E-7034的核苷酸序列的pC3E-7034作为模板，并且使用具有图93和94（SEQ ID NO：85和86）中所示的核苷酸序列的引物，执行基于PCR的定点诱变，以制备含有C3E-7078的核苷酸序列的C3E-7078表达载体，其在ORF中的C3E-7034重链可变区中的氨基酸位置53处具有取代天冬酰胺的精氨酸。所得到的表达载体命名为“pC3E-7078”。同样地，使用pC3E-7034作为模板，并且使用图95和96（SEQ ID NO：87和88）的引物，执行基于PCR的定点诱变，以制备含有C3E-7079的核苷酸序列的C3E-7079表达载体，其在C3E-7034重链可变区中的氨基酸位置53处具有取代天冬酰胺的丝氨酸。所得到的表达载体命名为“pC3E-7079”。同样地，使用pC3E-7036作为模板，并且使用图93和94（SEQ ID NO：85和86）的引物，执行基于PCR的定点诱变，以制备含有C3E-7085的核苷酸序列的C3E-7085表达载体，其在C3E-7036重链可变区中的氨基酸位置53处具有取代天冬酰胺的精氨酸。所得到的表达载体命名为“pC3E-7085”。
还通过与上述相同的方法制备在ORF中含有以下的核苷酸序列的表达载体：在C3E-7078轻链可变区中的氨基酸位置52处具有取代天冬氨酸的甘氨酸的C3E-7086、具有为此被取代的谷氨酰胺的C3E-7087、具有为此被取代的天冬酰胺的C3E-7088、具有为此被取代的丝氨酸的C3E-7089、或具有为此被取代的丙氨酸的C3E-7090，以及在ORF中含有以下的核苷酸序列的表达载体：在C3E-7079轻链可变区的氨基酸位置52处具有取代天冬氨酸的甘氨酸的C3E-7091、具有为此被取代的谷氨酰胺的C3E-7092、具有为此被取代的天冬酰胺的C3E-7093、具有为此被取代的丝氨酸的C3E-7094、或具有为此被取代的丙氨酸的C3E-7095。表1中概括了制备的载体、模板和引物的名称列表，并且在图105中概括了引物列表。
[表1]
4）-3-5人源化的抗CD3 scFv的表达和纯化
以与实施例4）-1-2相同的方式表达且纯化C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036。
4）-3-6 CDR修饰的人源化抗CD3 scFv的表达和纯化
以与实施例4）-1-2相同的方式表达且纯化CDR变体C3E-7078、C3E-7079、C3E-7085、C3E-7086、C3E-7087、C3E-7088、C3E-7089、C3E-7090、C3E-7091、C3E-7092、C3E-7093、C3E-7094和C3E-7095。
（实施例5）人源化的抗CD3 scFv（C3E-7034）的晶体结构分析
5）-1人源化的抗CD3 scFv（C3E-7034）-人CD3εγ单链抗原复合物的制备
将实施例2）-2-1中制备的CD3εγ和实施例4）-3-1中制备的C3E-7034以1：2的摩尔比混合。使用Amicon Ultra 15 MWCO 10K（Merck Millipore），将缓冲溶液替换为10 mM TrisHCl（pH 7.5）和50 mM NaCl，并且将所得到的溶液浓缩至3.5 mg/mL。使用Superdex 20010/300GL（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.），通过凝胶过滤层析法纯化该浓缩物。使用Amicon Ultra 15 MWCO 10K（Millipore），将复合物的一部分浓缩为大约4.0 mg/mL。
5）-2结晶
通过蒸气扩散法使所得到的CD3εγ和C3E-7034复合物结晶。向0.5 μL蛋白质溶液中加入等量的沉淀剂溶液（0.1 M MES一水合物（pH 6.5）、1.6 M硫酸铵和10% v/v 1,4-二噁烷），并且将所得到的溶液置于含有0.05 mL沉淀剂溶液的密封容器中，使得溶液彼此不接触。将容器在25℃下静置。一个月后，获得0.1 mm × 0.05 mm × 0.05 mm的杆状晶体。
5）-3 X射线晶体结构分析和表位鉴定
将所得到的晶体浸入Perfluoropolyether PFO-X175/08（Hampton Research Corp.）中，随后在液氮中冷冻。使用束线BL41XU（SPring-8，Hyogo，日本）收集X射线衍射数据。使用软件imosflm（CCP4：Collaborative Computational Project No. 4），从所得到的衍射图像数字化衍射强度，以确定晶体结构因子。晶体为六方晶系，具有P62的空间群，以及a =193.54埃、b = 193.54埃和c = 43.88埃的晶胞。
使用所得到的结构因子和同源模型的三维结构坐标执行分子置换方法，以确定相。软件相位器（CCP4：Collaborative Computational Project No. 4）用于计算中。晶体包含以不对称单元的一个复合物。
使用软件Refmac5（CCP4：Collaborative Computational Project No. 4）执行结构精修，并且使用Coot软件执行模型校正。重复执行该操作，以得到22.1%的最终R因子和27.0%的游离R因子，其分辨率为3.3埃。最终模型含有C3E-7034轻链区（图23，SEQ ID NO：17）的氨基酸残基1至108、C3E-7034重链区（图22，SEQ ID NO ：16）的氨基酸残基1至118、CD3ε区域（图1，SEQ ID NO：1）的氨基酸残基33至67和71至118，并且CD3γ区域（图37，SEQID NO：3）的氨基酸残基23至103。CD3ε区域（图1，SEQ ID NO：1）的氨基酸残基68至70以及C3E-7034（图38，SEQ ID NO：19）的氨基末端区域（氨基酸残基1）、接头部分（氨基酸残基120至134）和羧基末端区域（氨基酸残基243至269）由于其模糊的电密度而未包括在模型中。图39显示了整个复合物和表面的带状模型。
图40显示了CD3ε与C3E-7034的轻链和重链之间的相互作用。小图A是其中距离在C3E-7034的轻链可变区的4埃内的CD3ε的氨基酸由模型中的粗棒指示，并且其它氨基酸由模型中的细棒指示的图。在该图中，Ser55、Glu56、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104和Pro105由残基名称和残基编号指出。内部框是距离在C3E-7034的轻链可变区的4埃内的CD3ε的氨基酸残基，并且每个氨基酸位置对应于序列表的SEQ ID NO：1中的位置。小图B是其中距离在C3E-7034的重链可变区的4埃内的CD3ε的氨基酸残基由模型中的粗棒指示，并且其它氨基酸由模型中的细棒指示的图。在该图中，Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78和Arg101由残基名称和残基编号指出。内部框是CD3ε的氨基酸，并且每个氨基酸位置对应于序列表的SEQ ID NO：1中的位置。下述氨基酸残基具有在C3E-7034的4埃内的距离，并且已被解释为CD3ε上关于C3E-7034的表位：Ser55、Glu56、Leu58、Trp59、Asn65、Ile66、Ser77、Asp78、Arg101、Gly102、Ser103、Lys104和Pro105。
在CD3ε上关于C33-7034的这些表位中，Arg101、Gly102、Ser103、Lys104和Pro105是CD3ε上关于OKT3和UCHT1的常见表位残基（Kjer-Nielsen等人，PNAS 101（2004），第7675-80页；以及Arnett等人，PNAS 101（2004），第16268-73页）。还已揭示C3E-7034不与SEQ IDNO：1中的氨基酸位置22至48相互作用，其对应于如WO2008/119565A2中所述的关于抗CD3抗体如I2C和H2C的表位。图41显示了CD3ε的序列上的相互作用残基。CD3ε的信号序列由斜体字母指示，并且具有C3E-7034的4埃内的距离的氨基酸是加下划线的。
（实施例6）人源化OKT3 scFv的制备
6）-1 OKT3 scFv表达载体pC3E-3000的构建
通过与实施例4）-1-1相同的方法制备小鼠抗CD3单克隆抗体OKT3（Sgro，Toxicology105（1995），23-29，Orthoclone，Janssen-Cilag）的scFv，并且插入用于动物细胞的pcDNA3.3衍生的表达载体。所得到的表达载体命名为“pC3E-3000”。
6）-2 OKT3 scFv（C3E-3000）的人源化氨基酸序列的设计
基于实施例4）-2-1中描述的方法，设计充当OKT3的人源化形式的C3E-3007的氨基酸序列，具有人亚组共有序列γ1和κ4作为受体。考虑到对免疫原性评分和物理性质的影响，将κ1氨基酸引入一些位点中。在图43（SEQ ID NO：38）中描述了通过以下由图42（SEQ ID NO：36）中所示的OKT3重链可变区设计的C3E-3007轻链的氨基酸序列：在氨基酸位置5处的谷氨酰胺替换为缬氨酸、在氨基酸位置11处的亮氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置12处的丙氨酸替换为赖氨酸、在氨基酸位置13处的精氨酸替换为赖氨酸、在氨基酸位置20处的甲硫氨酸替换为缬氨酸、在氨基酸位置38处的赖氨酸替换为精氨酸、在氨基酸位置40处的精氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置48处的异亮氨酸替换为甲硫氨酸、在氨基酸位置67处的赖氨酸替换为精氨酸、在氨基酸位置68处的丙氨酸替换为缬氨酸、在氨基酸位置70处的亮氨酸替换为异亮氨酸、在氨基酸位置72处的苏氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置76处的丝氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置82处的谷氨酰胺替换为谷氨酸、在氨基酸位置87处的苏氨酸替换为精氨酸、在氨基酸位置91处的丝氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置114处的苏氨酸替换为亮氨酸，并且在氨基酸位置115处的亮氨酸替换为缬氨酸。
在图45（SEQ ID NO：39）中描述了通过以下由图44（SEQ ID NO：37）中所示的OKT3轻链可变区设计的C3E-3007轻链的氨基酸序列：在氨基酸位置3处的缬氨酸替换为谷氨酰胺、在氨基酸位置4处的亮氨酸替换为甲硫氨酸、在氨基酸位置9处的丙氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置10处的异亮氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置11处的甲硫氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置12处的丝氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置13处的丙氨酸替换为缬氨酸、在氨基酸位置15处的脯氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置18处的赖氨酸替换为精氨酸、在氨基酸位置19处的缬氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置21处的甲硫氨酸替换为异亮氨酸、在氨基酸位置39处的丝氨酸替换为脯氨酸、在氨基酸位置41处的苏氨酸替换为赖氨酸、在氨基酸位置42处的丝氨酸替换为丙氨酸、在氨基酸位置59处的丙氨酸替换为天冬氨酸、在氨基酸位置60处的组氨酸替换为精氨酸、在氨基酸位置62处的精氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置69处的丝氨酸替换为天冬氨酸、在氨基酸位置70处的酪氨酸替换为苯丙氨酸、在氨基酸位置71处的丝氨酸替换为苏氨酸、在氨基酸位置76处的甘氨酸替换为丝氨酸、在氨基酸位置77处的甲硫氨酸替换为亮氨酸、在氨基酸位置78处的谷氨酸替换为谷氨酰胺、在氨基酸位置82处的丙氨酸替换为缬氨酸、在氨基酸位置99处的丝氨酸替换为谷氨酰胺，并且在氨基酸位置103处的亮氨酸替换为缬氨酸。
6）-3人源化的OKT3 scFv（C3E-3007）表达载体pC3E-3007的构建
合成包含scFv的DNA序列的DNA片段，所述scFv含有经由15氨基酸的柔性接头、与C3E-3007重链（显示于图43（SEQ ID NO：38）中）的羧基末端连接的C3E-3007轻链（显示于图45（SEQ ID NO：39）中）区域，以及在其上游和下游的15碱基的另外序列（GeneArt GeneSynthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.）。以与实施例4）-3-1相同的方式，构建在ORF中含有图46（SEQ ID NO：34）的核苷酸序列的C3E-3007表达载体。所得到的表达载体命名为“pC3E-3007”。
6）-4人源化的OKT3 scFv（C3E-3007）的表达和纯化
以与实施例4）-1-2相同的方式表达且纯化C3E-3007。C3E-3007的氨基酸序列描述于图47（SEQ ID NO：35）中。
（实施例7）人源化的抗CD3 scFv的体外活性
7）-1人源化的抗CD3 scFv（C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036）针对人CD3的结合活性的研究
7）-1-1通过流式细胞术研究人源化的抗CD3 scFv（C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036）与人CD3的结合活性
用含有5% FBS的PBS将商购可得的人PBMC（Cellular Technology Ltd.（CTL））调节至适当的浓度。将LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit（Thermo FisherScientific Inc.）和抗CD19抗体（Beckman Coulter Inc.）加入细胞中，所述细胞然后在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至1 ×106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的浓度加入96孔U形底微量培养板中，并且离心以去除上清液。以100 μL/孔的浓度加入用含有5% FBS的PBS稀释的每种人源化的抗CD3 scFv（C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036），并且使板在4℃下静置60分钟。用含有5% FBS的PBS洗涤细胞两次。然后，以30 μL/孔的浓度加入用含有5% FBS的PBS稀释的Penta-HisAlexa Fluor 488（Qiagen N.V.），并且使板在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后为使用流式细胞仪（FACSCanto（TM）II；Becton，Dickinson and Company）的检测。使用Flowjo（Tree Star Inc.）分析数据。计算Alexa Fluor 488在不含死细胞和CD19阳性细胞的级分中的平均荧光强度（MFI）。从补充scFv的样品的MFI值中扣除未补充scFv的样品的MFI值，以计算MFI的相对值（rMFI）。如图48中所示，发现人源化的抗CD3 scFv与人CD3结合。
7）-1-2通过SPR研究人源化的抗CD3 scFv（C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036）对人CD3的结合活性
使用BIAcore T-200（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.），通过表面等离振子共振方法，测定每种人源化的抗CD3 scFv（C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036）对于CD3的亲和力。将五种不同浓度的scFv注射到固定在传感器芯片上的CD3内。由所得到的响应估计Rmax，并且将达到其1/2的抗体浓度定义为scFv对于CD3的解离常数。结果，这些scFv对于CD3的解离常数分别为400、4.5、22和25 nM。
7）-2人源化抗体CD3 scFv（C3E-3007、C3E-7034和C3E-7036）与食蟹猴CD3的结合活性的研究
7）-2-1食蟹猴PBMC的制备
根据标准方法，使用SepMate（StemCell Technologies Inc.）和LymphocyteSeparation Solution（Nacalai Tesque Inc.），从食蟹猴的血液中收集PBMC。
7）-2-2通过流式细胞术研究人源化的抗CD3 scFv（C3E-3007、C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036）与食蟹猴CD3的结合活性
用含有5% FBS的PBS将实施例7）-2-1中得到的食蟹猴PBMC调节至适当的浓度，并且以与实施例7）-1-1相同的方式染色并分析。如图49中所示，发现人源化的抗CD3 scFv（C3E-7034、C3E-7035和C3E-7036）与食蟹猴CD3结合。
7）-3人源化的抗CD3 scFv（C3E-3007和C3E-7034）的T细胞活化
通过使用Lympholyte-H（Cedarlane）的密度梯度离心法，从随机供体的新鲜血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞（PBMC）。用LR10（含有10%超低IgG FBS（Thermo FisherScientific Inc.）的RPMI1640）稀释至100 nM的每种人源化的抗CD3 scFv（C3E-3007和C3E-7034）和相同浓度的抗His抗体（Qiagen N.V.）以相同的量混合。用LR10将人或猴PBMC调节至2 × 105个细胞，并且在96孔U形底微量培养板中以相同的量与人源化的抗CD3scFv和抗His抗体的混合物混合，并且在37℃下在5% CO2条件下培养24小时。在反应完成后，将反应溶液离心，并且添加分选器缓冲液（HBSS（-）（Thermo Fisher ScientificInc.）、0.1% BSA（Sigma-Aldrich Corp.）和0.1%叠氮化钠（Sigma-Aldrich Corp.））。离心后，将LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit（Thermo Fisher ScientificInc.）加入细胞中，所述细胞然后在4℃下静置20分钟。用分选器缓冲液洗涤细胞。然后，将用分选器缓冲液稀释的PE标记的抗CD69抗体（Becton，Dickinson and Company）和FITC标记的抗CD8抗体（Becton，Dickinson and Company）加入细胞中，所述细胞然后在4℃下静置20分钟。细胞用分选器缓冲液洗涤，然后重悬浮于含有1%多聚甲醛的PBS（Wako PureChemicals Industries，Ltd.）中，随后为使用流式细胞仪（FACSCanto II；Becton，Dickinson and Company）的检测。使用Flowjo（Tree Star Inc.）分析数据。高度表达CD8和高度表达PE的级分与不含死细胞的级分的比率计算为关于群体的百分比（亲本的%）。如图50中所示，发现人源化的抗CD3 scFv激活高度表达人和猴CD8的细胞。
7）-4通过流式细胞术比较CDR修饰的人源化的抗CD3 scFv与人和食蟹猴CD3的结合活性
用含有5% FBS的PBS将实施例7）-1-1中获得的人PBMC和实施例7）-2-1中获得的食蟹猴PBMC各自调节至适当的浓度，并且以与实施例7）-1-1相同的方式染色并分析。如图106中所示，CDR修饰的人源化的抗CD3 scFv确认为具有关于人和猴CD3两者的结合活性。
（实施例8）人源化的抗TROP2 scFv的制备
8）-1 HT1-11 scFv表达载体pHT1-11scFv的构建
合成（GeneArt Gene Synthesis Service/Thermo Fisher Scientific Inc.）包含编码图51（SEQ ID NO：41）中所示的HT1-11 scFv的氨基酸的DNA序列的DNA片段。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.），将合成的DNA片段插入衍生自pcDNA-3.3TOPO（Thermo Fisher Scientific Inc.）的载体内，以构建人源化的抗TROP2scFv表达载体pHT1-11scFv，其在ORF中含有图52（SEQ ID NO：40）中所示的核苷酸序列。
8）-2 HT1-11 scFv（HT1-11 scFv）的表达和纯化
以与实施例4）-1-2相同的方式表达且纯化HT1-11 scFv。
（实施例9）通过流式细胞术评估人源化的抗TROP2 scFv（HT1-11 scFv）针对人TROP2的结合活性
用含有5% FBS的PBS将咽部鳞状细胞癌细胞系FaDu（ATCC）或胰腺癌细胞系HPAF-II（ATCC）调节至适当的浓度。将LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit加入细胞中，所述细胞然后在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5%FBS的PBS调节至1 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的浓度加入96孔U形底微量培养板中，并且离心以去除上清液。以100 μL/孔的浓度加入用含有5% FBS的PBS稀释的人源化的抗TROP2 scFv（HT1-11 scFv），并且使板在4℃下静置60分钟。用含有5% FBS的PBS洗涤细胞两次。然后，以30 μL/孔的浓度加入用含有5% FBS的PBS稀释的Penta-His Alexa Fluor488，并且使板在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后为使用流式细胞仪（FACSCanto（TM）II）的检测。使用Flowjo分析数据。计算Alexa Fluor 488在不含死细胞的级分中的平均荧光强度（MFI）。从补充scFv的样品的MFI值中扣除未补充抗体的样品的MFI值，以计算MFI的相对值（rMFI）。如图53中所示，发现人源化的抗TROP2scFv与人TROP2结合。
（实施例10）抗TROP2-CD3双特异性分子的制备
10）-1抗TROP2-CD3双特异性分子表达载体的构建
10）-1-1 HT1-11 scFv/C3E-7034双特异性分子（T2C-0001）表达载体的构建
使用实施例8）-1中制备的pHT1-11 scFv作为模板，并且使用设计为将HT1-11 scFv的核苷酸序列和人抗体重链信号序列的一部分加入5'侧，且将连接scFv的接头的核苷酸序列加入3'侧的引物，通过PCR获得插入DNA片段。另外，使用实施例4）-3-1中制备的表达载体pC3E-7034作为模板，并且使用编码信号序列和抗CD3 scFv的氨基末端序列的引物，通过PCR获得含有包括抗CD3 scFv DNA的整个载体区域的载体DNA片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.）连接这些DNA片段，以制备在ORF中含有图54（SEQID NO：42）的核苷酸序列的抗TROP2-抗CD3双特异性分子表达载体pT2C-0001。
10）-1-2 HT1-11 scFv/C3E-3007双特异性分子（T2C-0003）表达载体的构建
除了使用pC3E-3007作为用于制备载体片段的模板之外，以与实施例10）-1-1相同的方式构建在ORF中含有图55（SEQ ID NO：44）的核苷酸序列的抗TROP2-CD3双特异性分子表达载体。所得到的表达载体命名为“pT2C-0003”。
10）-1-3 HT1-11 scFv/C3E-7035双特异性分子（T2C-0005）表达载体的构建
除了使用pC3E-7035作为用于制备载体片段的模板之外，以与实施例10）-1-1相同的方式构建在ORF中含有图56（SEQ ID NO：46）的核苷酸序列的抗TROP2-CD3双特异性分子表达载体。所得到的表达载体命名为“pT2C-0005”。
10）-1-4 HT1-11 scFv/C3E-7036双特异性分子（T2C-0006）表达载体的构建
除了使用pC3E-7036作为用于制备载体片段的模板之外，以与实施例10）-1-1相同的方式构建在ORF中含有图57（SEQ ID NO：48）的核苷酸序列的抗TROP2-CD3双特异性分子表达载体。所得到的表达载体命名为“pT2C-0006”。
10）-2抗TROP2-CD3双特异性分子的表达和纯化
以与实施例4）-1-2相同的方式表达且纯化T2C-0001、T2C-0003、T2C-0005和T2C-0006。T2C-0001的氨基酸序列描述于图58（SEQ ID NO：43）中。T2C-0003的氨基酸序列描述于图59（SEQ ID NO：45）中。T2C-0005的氨基酸序列描述于图60（SEQ ID NO：47）中。T2C-0006的氨基酸序列描述于图61（SEQ ID NO：49）中。
（实施例11）抗TROP2-CD3双特异性分子的体外活性的评估
11）-1通过SPR的结合活性评估
11）-1-1抗TROP2-CD3双特异性分子与TROP2的结合活性
通过捕获方法，使用BIAcore 3000（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.），就其与TROP2的结合测定双特异性分子，所述捕获方法涉及通过抗人IgG抗体捕获抗原，并且测定作为分析物的双特异性分子。使用的抗原是重组人TROP-2/人IgG Fc融合形式（R＆DSystems，Inc.）。通过胺偶联方法，将大约2000 RU的抗人IgG（Fc）抗体（Human AntibodyCapture Kit，GE Healthcare Bio-Sciences Corp.）共价结合至传感器芯片CM5（GEHealthcare Bio-Sciences Corp.）。类似地，将该抗体固定到参考细胞上。使用的运行缓冲液是HBS-P（10 mM HEPES（pH 7.4）、0.15 M NaCl和0.005%表面活性剂P20）。制备以2倍稀释比从200nM到1 nM的双特异性分子。将1 μg/ml抗原溶液添加到固定抗人IgG（Fc）抗体的芯片上大约30秒。然后，以30 μl/分钟的流速加入每种浓度的双特异性分子共300秒。随后，监测解离相600秒。加入作为再生溶液的3 M氯化镁溶液共30秒。使用分析软件（BIAevaluation软件，版本4.1.1）的1：1结合模型分析数据，以计算结合速率常数（ka）、解离速率常数（kd）和解离常数（KD；KD = Kd/ka）。
11）-1-2抗TROP2-CD3双特异性分子与人CD3εγ单链抗原的结合活性
通过涉及固定抗原且测定作为分析物的抗体的方法，使用BIAcore 3000（GEHealthcare Bio-Sciences Corp.），就其与CD3εγ抗原的结合测定双特异性分子。使用的抗原是实施例2）-2-1中制备的人CD3εγ单链抗原。通过胺偶联方法，将大约100 RU的抗原共价结合至传感器芯片CM5（GE Healthcare Bio-Sciences Corp.）。执行固定化处理，而不添加作为参考细胞的抗原蛋白质。使用的运行缓冲液是HBS-P（10 mM HEPES（pH 7.4）、0.15M NaCl和0.005%表面活性剂P20）。制备以2倍稀释比从1 μM（最高浓度）到4 nM或以2倍稀释比从200 nM到1 nM的双特异性分子。将每种浓度的双特异性分子以10 μl/分钟的流速加入抗原固定的芯片中共25分钟，并且监测与其结合的双特异性分子的量。加入作为再生溶液的10 mM甘氨酸-盐酸溶液（pH 1.5）共30秒。使用分析软件（BIAevaluation软件，版本4.1.1）分析数据，以从在每种浓度下结合的双特异性分子的量计算解离常数KD。结果显示于表2和3中。
[表2]
名称 CD3εγ KD（nM）
1 T2C-0001 13.9
2 T2C-0003 171
3 T2C-0005 126
4 T2C-0006 171
[表3]
名称 TROP2 KD（nM）
1 T2C-0001 12.8
2 T2C-0003 6.7
3 T2C-0005 11.9
4 T2C-0006 9.3
11）-2通过流式细胞术的结合活性评估
11）-2-1抗TROP2-CD3双特异性分子与TROP2的结合活性
使用与实施例9中的那些相同的癌细胞系，并且以与实施例9相同的方式染色并分析。如图62中所示，发现抗TROP2-CD3双特异性分子与TROP2结合。
11）-2-2抗TROP2-CD3双特异性分子与人CD3εγ单链抗原的结合活性
以与实施例7）-1-1相同的方式染色并分析细胞。如图63中所示，发现抗TROP2-CD3双特异性分子与人CD3εγ单链抗原结合。
11）-2-3抗TROP2-CD3双特异性分子与食蟹猴CD3抗原的结合活性
用含有5% FBS的PBS将实施例7）-2-1中得到的食蟹猴PBMC调节至适当的浓度，并且以与实施例7）-1-1相同的方式染色并分析。如图64中所示，发现抗TROP2-CD3双特异性分子（T2C-0001、T2C-0005和T2C-0006）与食蟹猴CD3抗原结合。
11）-3抗TROP2-CD3双特异性分子的细胞毒性活性的评估
11）-3-1 TROP2在靶细胞中的表达分析
用含有5% FBS的PBS将咽部鳞状细胞癌细胞系FaDu（ATCC）、胰腺癌细胞系HPAF-II（ATCC）、或人肺癌细胞系Calu-6细胞调节至适当的浓度。将LIVE/DEAD Fixable Dead CellStain Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）加入细胞中，所述细胞然后在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至2 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的浓度接种至96孔U形底微量培养板，并且离心以去除上清液。以25μL/孔的浓度加入用含有5% FBS的PBS稀释的抗TROP2 Alexa Fluor 488抗体（AffymetrixeBioscience）和同种型对照抗体（Affymetrix eBioscience），并且使板在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后为使用流式细胞仪（Cytomics FC500，Beckman Coulter Inc.）的检测。使用Flowjo（Tree Star Inc.）分析数据。计算Alexa Fluor 488在不含死细胞的级分中的几何平均荧光强度（几何MFI）。如图65A、65B和65C中所示，在FaDu和HPAF-II细胞中观察到TROP2的表达，但在Calu-6细胞中未观察到。
11）-3-2靶细胞的制备
用含有10% FBS的RPMI1640培养基（Thermo Fisher Scientific Inc.），将FaDu、HPAF-II或Calu-6细胞调节至2 × 106个细胞/mL的浓度。向每个细胞系中，加入100 μL的铬-51放射性核素（PerkinElmer，Inc.）/mL细胞悬浮液，并且细胞在37℃下在5% CO2条件下培养2小时。细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基洗涤两次，然后在含有10% FBS的RPMI1640培养基中重悬浮至2 × 105个细胞/mL，并且用作靶细胞。
11）-3-3效应细胞的制备
商购可得的冷冻PBMC（Cellular Technology Limited）在37℃下解冻，转移至补充有抗聚集物洗涤试剂（Cellular Technology Limited）含有10% FBS的RPMI1640培养基溶液中，洗涤两次，然后用含有10% FBS的RPMI1640培养基调节至1 × 106个细胞/mL，并且用作效应细胞。
11）-3-4细胞毒性测定
将实施例11）-3-2中获得的FaDu细胞、HPAF-II细胞或Calu-6细胞以50 μL/孔的浓度加入96孔U形底微量培养板中。调节至不同浓度的每种抗TROP2-CD3双特异性分子以50 μL/孔的浓度加入。实施例11）-3-1-3中制备的效应细胞以100 μL/孔的浓度加入。在室温下以1000 rpm离心1分钟后，将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养20至24小时。将50 μL等分试样的上清液回收到LumaPlate（PerkinElmer，Inc.）内，并且在50℃下干燥大约2小时，随后为使用酶标仪（TopCount；PerkinElmer，Inc.）的测量。根据下述表达式计算裂解细胞的百分比：
裂解细胞的百分比（%）=（A-B）/（C-B）× 100
A：样品孔计数
B：平均本底计数（未补充抗体的孔）（n = 3）。加入50 μL用于测定的培养基，代替添加抗体。其它程序与样品孔的情况相同。
C：最大释放计数（含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔）的平均值（n = 3）。加入50 μL用于测定的培养基，代替添加抗体。加入100 μL表面活性剂，并且将50 μL等分试样转移至LumaPlate，与样品孔一样，并且进行测定。
如图66A、66B和66C中所示，这些抗TROP2-CD3双特异性分子显示出针对FaDu细胞和HPAF-II细胞的细胞毒性活性）。另一方面，这些双特异性分子在Calu-6细胞中没有显示出细胞毒性活性。
（实施例12）抗Axl-CD3双特异性分子的制备
12）-1抗Axl-CD3双特异性分子表达载体的构建
12）-1-1 11D5-T3 scFv/C3E-7034双特异性分子（AXC-0001）表达载体的构建
通过经由由具有（GGGGS）的3个重复的序列组成的多肽接头，将h#11D5-T3H（在欧洲专利申请公开号2270053的说明书中的图12中描述）和h#11D5-T3L（在欧洲专利申请公开号2270053的说明书中的图6中描述）连接，来设计抗Axl单链抗体11D5-T3 scFv的氨基酸序列。合成（GENEART，Thermo Fisher Scientific）编码该氨基酸序列的核苷酸序列。使用该核苷酸序列作为模板，并且使用设计为将人抗体重链信号序列的一部分的核苷酸序列加入5’端部，且将连接scFv的接头的核苷酸序列加入3'端部的引物，通过PCR获得插入DNA片段。另外，使用实施例4）-3-1中制备的表达载体pC3E-7034作为模板，并且使用由编码人抗体重链信号序列和CD3 scFv的核苷酸序列组成的引物，通过PCR扩增包括CD3 scFv DNA的整个载体区域，获得载体DNA片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.）连接的DNA片段导致在ORF中含有图97（SEQ ID NO：89）中所示的核苷酸序列的抗AXL-抗CD3双特异性分子表达载体pAXC-0001。
12）-1-2 11D5-T3 scFv/C3E-7036双特异性分子（AXC-0002）表达载体的构建
除了使用pC3E-7036作为用于制备载体片段的模板之外，以与实施例10）-1-1相同的方式构建在ORF中含有图99（SEQ ID NO：91）中所示的核苷酸序列的抗Axl-CD3双特异性分子表达载体。所得到的表达载体命名为“pAXC-0002”。
12）-2抗AxL-CD3双特异性分子的表达和纯化
以与实施例4）-1-2相同的方式表达且纯化AXC-0001和AXC-0002。AXC-0001的氨基酸序列描述于图98（SEQ ID NO：90）中。AXC-0002的氨基酸序列描述于图100（SEQ ID NO：92）中。
（实施例13）抗Axl-CD3双特异性分子的体外活性的评估
13）-1 Axl在靶细胞中的表达分析
用含有5% FBS的PBS将人肺癌细胞系A549（ATCC）、人胰腺癌细胞系PANC-1（ATCC）或MIAPaCa-2（ATCC）、人骨髓瘤细胞系U266B1（ATCC）、或套细胞淋巴瘤细胞系Jeko-1（ATCC）调节至适当的浓度。将LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit（Thermo Fisher ScientificInc.）加入细胞中，所述细胞然后在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至2 × 106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的浓度接种至96孔U形底微量培养板，并且离心以去除上清液。以25 μL/孔的浓度加入用含有5% FBS的PBS稀释的抗Axl抗体（RD Systems，Inc.）和同种型对照抗体（RD Systems，Inc.），并且使板在4℃下静置30分钟。用含有5% FBS的PBS洗涤细胞两次。然后，以25μL/孔的浓度加入用含有5%FBS的PBS稀释的Alexa Fluor 488抗小鼠IgG抗体（Thermo Fisher Scientific Inc.），并且使板在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后为使用流式细胞仪（Cytomics FC500，Beckman Coulter Inc.）的检测。使用Flowjo（Tree Star Inc.）分析数据。计算Alexa Fluor 488在不含死细胞的级分中的几何平均荧光强度（几何MFI）。如图107A、107B、107C、107D和107E中所示，在A549、PANC-1和MIAPaca-2中观察到Axl的表达，但在U266B1和Jeko-1中未观察到。
13）-2靶细胞的制备
用含有10% FBS的RPMI1640培养基（Thermo Fisher Scientific Inc.），将A549、PANC-1、MIA PaCa-2、U266B1和Jeko-1各自调节至2 × 106个细胞/mL的浓度。向每个细胞系中，加入100 μL的铬-51放射性核素（PerkinElmer，Inc.）/mL细胞悬浮液，并且细胞在37℃下在5% CO2条件下培养2小时。细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基洗涤两次，然后在含有10%FBS的RPMI1640培养基中重悬浮至2 × 105个细胞/mL，并且用作靶细胞。
13）-3效应细胞的制备
商购可得的冷冻PBMC（Cellular Technology Limited）在37℃下解冻，转移至补充有抗聚集物洗涤试剂（Cellular Technology Limited）含有10% FBS的RPMI1640培养基溶液中，洗涤两次，然后用含有10% FBS的RPMI1640培养基调节至1 × 106个细胞/mL，并且用作效应细胞。
13）-4细胞毒性测定
将实施例13）-2中获得的A549、PANC-1、MIA PaCa-2、U266B1或Jeko-1细胞以50 μL/孔的浓度加入96孔U形底微量培养板中。调节至不同浓度的每种抗Axl-CD3双特异性分子以50μL/孔的浓度加入。实施例13）-3中制备的效应细胞以100 μL/孔的浓度加入。在室温下以1000 rpm离心1分钟后，将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养20至24小时。将50 μL等分试样的上清液转移至LumaPlate（PerkinElmer，Inc.），并且在50℃下干燥大约2小时，随后为使用酶标仪（TopCount；PerkinElmer，Inc.）的测量。根据下式计算裂解细胞的百分比：
裂解细胞的百分比（%）=（A-B）/（C-B）× 100
A：样品孔计数
B：平均本底计数（未补充抗体的孔）（n = 3）。加入50 μL用于测定的培养基，代替添加抗体。其它程序与样品孔的情况相同。
C：最大释放计数（含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔）的平均值（n = 3）。加入50 μL用于测定的培养基，代替添加抗体。加入100 μL表面活性剂，并且将50 μL等分试样转移至LumaPlate，与样品孔一样，并且进行测定。
如图108A、108B、108C、108D和108E中所示，这些抗Axl CD3双特异性分子显示出针对A549、PANC-1和MIA PaCa-2的细胞毒性活性。然而，这些双特异性分子没有显示出针对U266B1或Jeko-1的细胞毒性活性。
（实施例14）抗HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子表达载体的制备
14）-1抗HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子表达载体的构建
14）-1-1 MAG-032 scFv/C3E-7034双特异性分子（MGC-0001）表达载体的构建
从人抗体噬菌体文库获得特异性结合HLA-A2/MAGEC1的MAG-032 scFv。使用编码MAG-032 scFv的氨基酸序列的核苷酸序列作为模板，并且使用设计为将编码人抗体重链信号序列的核苷酸序列加入5’端部，且将编码连接scFv和C3E-7034的一部分的接头的核苷酸序列加入3'端部的引物，通过PCR获得含有编码MAG-032 scFv的氨基酸序列的核苷酸序列的插入DNA片段。另外，使用实施例4）-3-1中制备的表达载体pC3E-7034作为模板，并且使用由编码人抗体重链信号序列和抗CD3 scFv的氨基末端序列的核苷酸序列组成的引物，通过PCR扩增包括抗CD3 scFv DNA的完整载体区域，获得载体DNA片段。使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.）连接这些DNA片段，以制备在ORF中含有图101（SEQ IDNO：93）中所示的核苷酸序列的抗HLA-A2/MAGEC1-抗CD3双特异性分子表达载体pMGC-0001。
14）-1-2 MAG-032 scFv/C3E-7036双特异性分子（MGC-0002）表达载体的构建
除了使用pC3E-7036作为用于制备载体片段的模板之外，以与实施例14）-1-1相同的方式构建在ORF中含有图103（SEQ ID NO：95）中所示的核苷酸序列的抗HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子表达载体。所得到的表达载体命名为“pMGC-0002”。
14）-2抗HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子的表达和纯化
以与实施例4）-1-2相同的方式表达且纯化MGC-0001和MGC-0002。MGC-0001的氨基酸序列在图102（SEQ ID NO：94）中列出。MGC-0002的氨基酸序列在图104（SEQ ID NO：96）中列出。
（实施例15）抗HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子的体外活性的评估
15）-1 HLA-A2/MAGEC1在靶细胞中的表达分析
用含有20% FBS的AIM-V培养基（Thermo Fisher Scientific Inc.），将人淋巴母细胞融合细胞系T2（ATCC）细胞调节至适当的浓度。将图106（SEQ ID NO：97）的MAGEC1肽（SigmaGenosys）或DMSO加入细胞中，所述细胞然后在37℃下温育4小时。细胞用含有20% FBS的AIM-V培养基洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至适当的浓度。将LIVE/DEAD FixableDead Cell Stain Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.）加入细胞中，所述细胞然后在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后用含有5% FBS的PBS调节至2 ×106个细胞/mL的浓度，以100 μL/孔的浓度接种至96孔U形底微量培养板，并且离心以去除上清液。以25 μL/孔的浓度加入用含有5% FBS的PBS稀释的抗HLA-A2/MAGEC1抗体（MAG032scFv），并且使板在4℃下静置30分钟。用含有5% FBS的PBS洗涤细胞两次。然后，以25μL/孔的浓度加入用含有5% FBS的PBS稀释的Penta-His Alexa Fluor 488（Qiagen N.V.），并且使板在4℃下静置30分钟。细胞用含有5% FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于含有5% FBS的PBS中，随后为使用流式细胞仪（Cytomics FC500，Beckman Coulter Inc.）的检测。使用Flowjo（Tree Star Inc.）分析数据。计算Alexa Fluor 488在不含死细胞的级分中的几何平均荧光强度（几何MFI）。如图109A和109B中所示，在补充有MAGEC1肽的T2细胞中观察到HLA-A2/MAGEC1的表达，但在补充有DMSO的T2细胞中未观察到。
15）-2靶细胞的制备
用含有20% FBS的AIM-V培养基（Thermo Fisher Scientific Inc.），将T2细胞调节至适当的浓度。将MAGEC1肽或DMSO加入细胞中，所述细胞然后在37℃下温育4小时。用含有10%FBS的RPMI1640培养基（Thermo Fisher Scientific Inc.），将细胞调节至2 × 106个细胞/mL的浓度。向该细胞系中，加入100 μL的铬-51放射性核素（PerkinElmer，Inc.）/mL细胞悬浮液，并且细胞在37℃下在5% CO2条件下培养2小时。细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基洗涤两次，然后在含有10% FBS的RPMI1640培养基中重悬浮至2 × 105个细胞/mL，并且用作靶细胞。
15）-3效应细胞的制备
商购可得的冷冻PBMC（Cellular Technology Limited）在37℃下解冻，转移至补充有抗聚集物洗涤试剂（Cellular Technology Limited）含有10% FBS的RPMI1640培养基溶液中，洗涤两次，然后用含有10% FBS的RPMI1640培养基调节至1 × 106个细胞/mL，并且用作效应细胞。
15）-4细胞毒性测定
将实施例15）-2中获得的T2细胞以50 μL/孔的浓度加入96孔U形底微量培养板中。调节至不同浓度的每种抗HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子以50 μL/孔的浓度加入。实施例15）-3中制备的效应细胞以100 μL/孔的浓度加入。在室温下以1000 rpm离心1分钟后，将细胞在37℃下在5% CO2条件下培养20至24小时。将50 μL等分试样的上清液回收到LumaPlate（PerkinElmer，Inc.），并且在50℃下干燥大约2小时，随后为使用酶标仪（TopCount；PerkinElmer，Inc.）的测量。根据下式计算裂解细胞的百分比：
裂解细胞的百分比（%）=（A-B）/（C-B）× 100
A：样品孔计数
B：平均本底计数（未补充抗体的孔）（n = 3）。加入50 μL用于测定的培养基，代替添加抗体。其它程序与样品孔的情况相同。
C：最大释放计数（含有在表面活性剂中裂解的靶细胞的孔）的平均值（n = 3）。加入50 μL用于测定的培养基，代替添加抗体。加入100 μL表面活性剂，并且将50 μL等分试样转移至LumaPlate，与样品孔一样，并且进行测定。
如图110A和110B中所示，这些抗HLA-A2/MAGEC1-CD3双特异性分子显示出针对补充有MAGEC1肽的T2细胞的细胞毒性活性。另一方面，这些双特异性分子在补充有DMSO的T2细胞中没有显示出细胞毒性活性。
[工业适用性]
本发明的人源化的抗CD3抗体与人CD3结合，并且还与食蟹猴CD3结合。因此，本发明的人源化的抗CD3抗体可以有利地在非临床试验中用于药物开发。
[序列表自由文本]
SEQ ID NO：1：人CD3ε的氨基酸序列
SEQ ID NO：2：人CD3δ的氨基酸序列
SEQ ID NO：3：人CD3γ的氨基酸序列
SEQ ID NO：4：编码人CD3εγ单链抗原的核苷酸序列
SEQ ID NO：5：His-scCD3抗原的氨基酸序列
SEQ ID NO：6：编码C3-147的重链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO：7：（C3-147_VH AA）：C3-147的重链可变区的氨基序列
SEQ ID NO：8：（C3-147_VL DNA）：编码C3-147的轻链可变区的核苷酸序列
SEQ ID NO：9：（C3-147_VL AA）：C3-147的轻链可变区的氨基序列
SEQ ID NO：10：（G4S接头有义）：
SEQ ID NO：11：（G4S接头反义）：
SEQ ID NO：12：（C3E-7000_VH AA）：C3E-7000中的重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：13：（C3E-7000_VL AA）：C3E-7000中的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：14：（C3E-7000 ORF）：编码C3E-7000的核苷酸序列
SEQ ID NO：15：（C3E-7000 AA）：C3E-7000中的氨基酸序列
SEQ ID NO：16：（C3E-7034_VH AA）：C3E-7034的重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：17：C3E-7034的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：18：（C3E-7034 ORF）：编码C3E-7034的核苷酸序列
SEQ ID NO：19：（C3E_7034 AA）：C3E-7034的氨基酸序列
SEQ ID NO：20：（C3E-7035_VL AA）：C3E-7035的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：21：（C3E-7035 ORF）：编码C3E-7035的核苷酸序列
SEQ ID NO：22：（C3E_7035 AA）：C3E-7035的氨基酸序列
SEQ ID NO：23：（C3E-7036_VL_AA）：C3E-7036的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：24：（C3E-7036 ORF）：编码C3E-7036的核苷酸序列
SEQ ID NO：25：（C3E_7036 AA）：C3E-7036的氨基酸序列
SEQ ID NO：26：（7000_CDR-H1）：C3E-7000系列中的CDR-H1的氨基酸序列
SEQ ID NO：27：（7000_CDR-H2）：C3E-7000系列中的CDR-H2的氨基酸序列
SEQ ID NO：28：（7000_CDR-H3）：C3E-7000系列中的CDR-H3的氨基酸序列
SEQ ID NO：29：（7000_CDR-L1）：C3E-7000系列中的CDR-L1的氨基酸序列
SEQ ID NO：30：（7000_CDR-L2）：C3E-7000系列中的CDR-L2的氨基酸序列
SEQ ID NO：31：（7000_CDR-L3）：C3E-7000系列中的CDR-L3的氨基酸序列
SEQ ID NO：32：（C3E-3000 ORF）：编码OKT3 scFv的核苷酸序列
SEQ ID NO：33：（C3E-3000 AA）：OKT3 scFv的氨基酸序列
SEQ ID NO：34：（C3E-3007 ORF）：编码C3E-3007 scFv的核苷酸序列
SEQ ID NO：35：（C3E-3007 AA）：C3E-3007 scFv的氨基酸序列
SEQ ID NO：36：（C3E-3000_VH AA）：OKT3的重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：37：（C3E-3000_VL AA）：OKT3的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：38：（C3E-3007_VH AA）：C3E-3007的重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：39：（C3E-3007_VL AA）：C3E-3007的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：40：（HT1-11 ORF）：编码HT1-11 scFv的核苷酸序列
SEQ ID NO：41：（HT1-11 AA）：HT1-11 scFv的氨基酸序列
SEQ ID NO：42：（T2C-0001 ORF）：编码T2C-0001的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：43：（T2C-0001AA）：T2C-0001的氨基酸序列
SEQ ID NO：44：（T2C-0003 ORF）：编码T2C-0003的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：45：（T2C-0003 AA）：T2C-0003的氨基酸序列
SEQ ID NO：46：（T2C-0005 ORF）：编码T2C-0005的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：47：（T2C-0005AA）：T2C-0005的氨基酸序列
SEQ ID NO：48：（T2C-0006 ORF）：编码T2C-0006的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：49：（T2C-0006 AA）：T2C-0006的氨基酸序列
SEQ ID NO：50：用于重链基因扩增的有义引物的氨基酸序列
SEQ ID NO：51：用于重链基因扩增的首次运行反义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：52：用于重链基因扩增的二次运行反义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：53：用于轻链基因扩增的有义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：54：用于轻链基因扩增的首次运行反义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：55：用于轻链基因扩增的二次运行反义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：56：用于重链测序的有义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：57：用于轻链测序的反义引物1的核苷酸序列
SEQ ID NO：58：用于轻链测序的反义引物2的核苷酸序列
SEQ ID NO：59：编码C3E-7078的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：60：C3E-7078的氨基酸序列
SEQ ID NO：61：编码C3E-7079的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：62：C3E-7079的氨基酸序列
SEQ ID NO：63：编码C3E-7085的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：64：C3E-7085的氨基酸序列
SEQ ID NO：65：编码C3E-7086的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：66：C3E-7086的氨基酸序列
SEQ ID NO：67：编码C3E-7087的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：68：C3E-7087的氨基酸序列
SEQ ID NO：69：编码C3E-7088的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：70：C3E-7088的氨基酸序列
SEQ ID NO：71：编码C3E-7089的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：72：C3E-7089的氨基酸序列
SEQ ID NO：73：编码C3E-7090的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：74：C3E-7090的氨基酸序列
SEQ ID NO：75：编码C3E-7091的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：76：C3E-7091的氨基酸序列
SEQ ID NO：77：编码C3E-7092的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：78：C3E-7092的氨基酸序列
SEQ ID NO：79：编码C3E-7093的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：80：C3E-7093的氨基酸序列
SEQ ID NO：81：编码C3E-7094的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：82：C3E-7094的氨基酸序列
SEQ ID NO：83：编码C3E-7095的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：84：C3E-7095的氨基酸序列
SEQ ID NO：85：关于C3E-7078的有义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：86：关于C3E-7078的反义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：87：关于C3E-7079的有义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：88：关于C3E-7079的反义引物的核苷酸序列
SEQ ID NO：89：（AXC-0001 ORF）：编码AXC-0001的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：90：（AXC-0001 AA）：AXC-0001的氨基酸序列
SEQ ID NO：91：（AXC-0002 ORF）：编码AXC-0002的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：92：（AXC-0002 AA）：AXC-0002的氨基酸序列
SEQ ID NO：93：（MGC-0001 ORF）：编码MGC-0001的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：94：（MGC-0001 AA）：MGC-0001的氨基酸序列
SEQ ID NO：95：（MGC-0002 ORF）：编码MGC-0002的ORF核苷酸序列
SEQ ID NO：96：（MGC-0002 AA）：MGC-0002的氨基酸序列
SEQ ID NO：97：（MAGEC1肽）：MAGEC1肽的氨基酸序列
SEQ ID NO：98 :（变体的CDRH2）：CDR变体的CDRH2的氨基酸序列
SEQ ID NO：99 :（变体的CDRL2）：CDR变体的CDRL2的氨基酸序列
SEQ ID NO：100：（C3E-7034变体的VH）：C3E-7034的CDR变体的重链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：101：（C3E-7034变体的VL）：C3E-7034的CDR变体的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：102：（C3E-7035变体的VL）：C3E-7035的CDR变体的轻链可变区的氨基酸序列
SEQ ID NO：103：（C3E-7036变体的VL）：C3E-7036的CDR变体的轻链可变区的氨基酸序列

Claims (55)

1.一种抗体或抗体的抗原结合片段，其特征在于：
包括以下的重链序列：
包含通过SEQ ID NO：26表示的氨基酸序列的CDRH1，
包含通过SEQ ID NO：98表示的氨基酸序列的CDRH2，和
包含通过SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列的CDRH3；
包括以下的轻链序列：
包含通过SEQ ID NO：29表示的氨基酸序列的CDRL1，
包含通过SEQ ID NO：99表示的氨基酸序列的CDRL2，和
包含通过SEQ ID NO：31表示的氨基酸序列的CDRL3；和
所述抗体或抗原结合片段与人CD3和食蟹猴CD3结合。
2.根据权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段，其中
在CDRH2中
第一Xaa选自A、E、G、H、I、L、T、V、R和S，和
第二Xaa是S，或
第一Xaa是N，和
第二Xaa选自E、R、F、Y、L、V、I、K和T，
在CDRL2中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D，和
所述抗体或抗原结合片段与人CD3和食蟹猴CD3结合。
3.根据权利要求1或2的抗体或抗体的抗原结合片段，其中
在CDRH2中，
第一Xaa选自R和S，并且第二Xaa是S，
在CDRL2中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D，和
所述抗体或抗原结合片段与人CD3和食蟹猴CD3结合。
4.根据权利要求1的抗体或抗体的抗原结合片段，其中
重链序列包含具有CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变区，
CDRH1由通过SEQ ID NO：26表示的氨基酸序列组成，
CDRH2由通过SEQ ID NO：27表示的氨基酸序列组成，和
CDRH3由通过SEQ ID NO：28表示的氨基酸序列组成；
轻链序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，
CDRL1由通过SEQ ID NO：29表示的氨基酸序列组成，
CDRL2由通过SEQ ID NO：30表示的氨基酸序列组成，和
CDRL3由通过SEQ ID NO：31表示的氨基酸序列组成；和
所述抗体或抗原结合片段与人CD3和食蟹猴CD3结合。
5.根据权利要求1至4中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区序列包含通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列。
6.根据权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中
在通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列中，
第一Xaa选自A、E、G、H、I、L、T、V、R和S，和
第二Xaa是S，或
第一Xaa是N，和
第二Xaa选自E、R、F、Y、L、V、I、K和T。
7.根据权利要求5的抗体或其抗原结合片段，其中
在通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列中，
第一Xaa选自R和S，并且第二Xaa是S。
8.根据权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包含通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列。
9.根据权利要求8的抗体或其抗原结合片段，其中
在通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D。
10.根据权利要求5的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述重链可变区序列包含通过SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列。
11.根据权利要求8的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述轻链可变区序列包含通过SEQ ID NO：17、20和23中任何一个表示的氨基酸序列。
12.根据权利要求1或2的抗体或其结合片段，其中所述抗体或抗体结合片段包括包含通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列的重链可变区，并且包含通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列的轻链可变区，其中
在通过SEQ ID NO：100表示的氨基酸序列中，
第一Xaa选自A、E、G、H、I、L、T、V、R和S，并且第二Xaa是S，或
第一Xaa是N，并且第二Xaa选自E、R、F、Y、L、V、I、K和T，和
在通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D。
13.根据权利要求12的抗体或其结合片段，其中
在SEQ ID NO：100中
第一Xaa选自R和S，和
第二Xaa是S，和
在通过SEQ ID NO：101、102和103中任何一个表示的氨基酸序列中，
Xaa选自Q、A、G、S、N和D。
14.根据权利要求13的抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：60的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：60的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：64的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：64的第135至第241氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：66的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：66的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：68的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：68的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：70的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：70的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：72的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：72的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：74的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：74的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：76的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：76的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：78的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：78的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：80的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：80的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：82的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：82的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区，或
抗体或抗体的抗原结合片段，其包括包含SEQ ID NO：84的第2至第119氨基酸残基的重链可变区，并且包含SEQ ID NO：84的第135至第243氨基酸残基的轻链可变区。
15.根据权利要求1、4、5、8、10或11的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含通过SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列的重链可变区，接头和包含通过SEQ ID NO：17、20和23中任何一个表示的氨基酸序列的轻链可变区。
16.根据权利要求1-15中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链可变区以这种次序与轻链可变区结合，或轻链可变区以这种次序与重链可变区结合，所述次序从氨基末端起，并且任选地：i）具有在两个可变区之间的接头，ii）具有在氨基末端侧上的可变区的氨基末端处的甘氨酸残基，以及iii）具有在羧基末端侧上的可变区的羧基末端处的接头、FLAG标签和/或HIS标签。
17.根据权利要求16的抗体或抗体的抗原结合片段，其包括
包含SEQ ID NO：64的第2至第241氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：66的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：68的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：70的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：72的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：74的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：75的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：76的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：80的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：82的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列，或
包含SEQ ID NO：84的第2至第243氨基酸残基的氨基酸序列。
18.根据权利要求16的抗体或抗体的抗原结合片段，其包括
包含SEQ ID NO：19的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：22的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：25的第2至第267氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：60的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：64的第2至第267氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：66的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：68的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：70的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：72的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：74的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：76的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：78的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：80的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，
包含SEQ ID NO：82的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列，或
包含SEQ ID NO：84的第2至第269氨基酸残基的氨基酸序列。
19.一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含由多核苷酸中包含的核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸在严格条件下与包括核苷酸序列的多核苷酸的互补链杂交，所述核苷酸序列编码根据权利要求14至18中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的氨基酸序列，并且与人CD3和食蟹猴CD3结合。
20.一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包括与根据权利要求14至18中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的重链的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列，所述轻链包括与根据权利要求14至18中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的轻链的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列，并且与人CD3和食蟹猴CD3结合。
21.一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，所述重链包括的氨基酸序列通过1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自根据根据权利要求14至18中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的重链中包含的氨基酸序列，所述轻链包括的氨基酸序列通过1个或多个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自根据根据权利要求14至18中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段中包含的轻链中包含的氨基酸序列，并且与人CD3和食蟹猴CD3结合。
22.一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合人CD3上与由根据权利要求14至18中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段所结合的相同的位点，并且与食蟹猴CD3结合。
23.一种抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与根据权利要求14至18中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段竞争结合人CD3，并且与食蟹猴CD3结合。
24.根据权利要求22的抗体或抗体的抗原结合片段，其中在人CD3上由所述抗体结合的位点由选自以下的7个或更多个氨基酸构成：通过SEQ ID NO：1表示的氨基酸序列中的第55丝氨酸（Ser）、第56谷氨酸（Glu）、第58亮氨酸（Leu）、第59色氨酸（Trp）、第65天冬酰胺（Asn）、第66异亮氨酸（Ile）、第77丝氨酸（Ser）、第78天冬氨酸、第101精氨酸（Arg）、第101甘氨酸（Gly）、第103丝氨酸（Ser）、第104赖氨酸（Lys）和第105脯氨酸（Pro）。
25.根据权利要求1至17和19至24中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体是IgG。
26.根据权利要求1至23中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、F（ab）'、Fv、scFv和sdAb。
27.根据权利要求1至17和19至25中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中所述抗体是包括人免疫球蛋白恒定区的人源化抗体或人抗体。
28.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求1至27中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段的氨基酸序列的核苷酸序列。
29.根据权利要求27的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码通过以下表示的氨基酸序列的核苷酸序列
由SEQ ID NO：19的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：22的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：25的第2至第241氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：60的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：64的第2至第241氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：66的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：68的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：70的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：72的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：74的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：76的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：78的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：80的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
由SEQ ID NO：82的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列，
或
由SEQ ID NO：84的第2至第243氨基酸残基组成的氨基酸序列。
30.一种载体，其包含根据权利要求28至29中任一项的多核苷酸。
31.一种细胞，其包含根据权利要求28至29中任一项的多核苷酸或者根据权利要求30的载体，或者产生根据权利要求1至27中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。
32.一种用于生产与人CD3和食蟹猴CD3结合的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，所述方法包括以下步骤：培养根据权利要求31的细胞；并且从培养物中回收与人CD3结合的抗体或抗体的抗原结合片段。
33.一种抗体或抗体的抗原结合片段，其与人CD3和食蟹猴CD3结合，所述抗体或抗原结合片段通过根据权利要求32的方法获得。
34.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至27和33中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段作为活性成分。
35.一种具有抗原结合活性的分子，其包含根据权利要求1至27和33中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。
36.根据权利要求35的分子，其中所述分子是多特异性的。
37.根据权利要求35或36的分子，除根据权利要求1至27和33中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段之外，其还包含1或2种或更多种另外的抗体或抗体的抗原结合片段。
38.根据权利要求37的分子，其中所述另外的抗体的抗原结合片段是Fab、F（ab）'、Fv、scFv或sdAb。
39.根据权利要求38的分子，其中所述分子包含Fc。
40.根据权利要求37至39中任一项的分子，其中所述另外的抗体是人源化抗体或包含人免疫球蛋白恒定区的人抗体。
41.根据权利要求37至38中任一项的分子，其中所述另外的抗体或抗体的抗原结合片段经由接头或无需接头与根据权利要求1至27和33中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段结合。
42.根据权利要求45的分子，其中所述另外的抗体或抗体的抗原结合片段的氨基酸序列的羧基末端与接头结合，并且所述接头的氨基酸序列的羧基末端进一步由根据权利要求1至27和33中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段结合。
43.根据权利要求42的分子，其中所述分子包含氨基酸序列，其中所述另外的抗体或抗体的抗原结合片段的氨基酸序列的羧基末端与接头结合，并且所述接头的氨基酸序列的羧基末端进一步由以下结合：
由SEQ ID NO：19的第2至第243氨基酸残基组成的抗体或抗体的抗原结合片段，
由SEQ ID NO：22的第2至第243氨基酸残基组成的抗体或抗体的抗原结合片段，或
由SEQ ID NO：25的第2至第241氨基酸残基组成的抗体或抗体的抗原结合片段。
44.根据权利要求1至35和42中任一项的分子，其包含根据（1）至（27）和（33）中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中重链可变区以这种次序与轻链可变区结合，或轻链可变区以这种次序与重链可变区结合，所述次序从氨基末端起，并且任选地：i）具有在两个可变区之间的接头，ii）具有在氨基末端侧上的可变区的氨基末端处的甘氨酸残基，以及iii）具有在羧基末端侧上的可变区的羧基末端处的接头、FLAG标签和/或HIS标签。
45.根据权利要求44的分子，其中所述另外的抗体或抗体的抗原结合片段经由接头或无需接头与以下结合：
包含SEQ ID NO：19的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：25的第2至第241氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：60的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：64的第2至第241氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：66的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：68的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：70的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：72的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：74的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：76的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：78的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：80的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，
包含SEQ ID NO：82的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段，或
包含SEQ ID NO：84的第2至第243氨基酸残基的抗体或抗体的抗原结合片段。
46.根据权利要求36至45中任一项的分子，其中所述另外的抗体是抗癌靶抗体。
47.根据权利要求36至46中任一项的分子，其中所述分子是双特异性的。
48.根据权利要求35至47中任一项的分子，其中所述分子是多肽。
49.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求48的分子的氨基酸序列的核苷酸序列。
50.一种载体，其包含根据权利要求49的多核苷酸。
51.一种细胞，其产生根据权利要求49的多核苷酸或根据权利要求50的载体、或者根据权利要求48的分子。
52.一种用于产生与人CD3和食蟹猴CD3结合的分子的方法，所述方法包括以下步骤：培养根据权利要求51的细胞；并且从培养物中回收与人CD3结合的分子。
53.一种与人CD3和食蟹猴CD3结合的分子，所述分子通过根据权利要求52的方法获得。
54.一种药物组合物，其包含根据权利要求35至48和53中任一项的分子作为活性成分。
55.根据权利要求54的药物组合物，其中所述药物组合物通过将T细胞重定向至靶细胞而在靶细胞中诱导细胞毒性。
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