KR20190121294A - 항-cd3 항체, 및 항-cd3 항체를 포함하는 분자 - Google Patents

항-cd3 항체, 및 항-cd3 항체를 포함하는 분자 Download PDF

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시호 고즈마
겐스케 나카무라
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준야 이치카와
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다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 인간 CD3에 결합할 수 있는 신규한 항체, 또는 항원에 결합할 수 있고 이러한 항체를 포함하는 분자에 관한 것이다. 본 발명은 인간 CD3에 결합할 수 있는 신규한 항체, 이러한 항체를 포함하고 항원에 결합할 수 있는 분자, 이러한 항체 또는 분자를 활성 성분으로서 포함하고 세포 독성 활성을 갖는 약학 조성물 등에 관한 것이다.

Description

항-CD3 항체, 및 항-CD3 항체를 포함하는 분자
본 발명은 인간 CD3에 결합하고 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 CD3에 결합하는 신규한 항체, 및 이러한 항체를 포함하는 분자에 관한 것이다.
1) 항-CD3 단일클론성 항체는, 임의의 다른 단일클론성 항체와 마찬가지로, 이들의 표적 분자의 정확한 인식에 의해 작용한다. 각각의 항-CD3 항체는 표적 CD3 분자 상의 단일한 에피토프만을 인식한다. CD3 복합체에 특이적인 단일클론성 항체들중에서, OKT3이 가장 널리 사용되고, 가잘 잘 특징지어져 있다.
2) OKT3은 마우스-유래된 항-인간 CD3 단일클론성 항체이다(비특허문헌 1). 항-CD3 단일클론성 항체는 이식된 기관이 거부되는 것을 방지하기 위해 투여되어 왔다. 항체는 인간 T 세포 상에서 TCR 복합체에 결합하고 이들의 활성화 및 증식을 억제한다. 이러한 처치는 기관의 동종이식 거부 반응을 방지하기 위해 오랜 기간 동안 사용되어 왔다(비특허문헌 2 내지 4). OKT3은 이러한 처치에 사용된 최초의 항-CD3 항체이다. OKT3은 강한 면역억제 효과를 갖는 반면, 그의 임상적 용도는 그의 면역원성 및 유사분열촉진 잠재성과 연관된 심각한 부작용으로 인해 방해된다(비특허문헌 5 내지 8).
3) OKT3은 T 세포 활성화 및 사이토킨 생산을 시험관내에서 유도하고 다량의 사이토킨을 생체내에서 방출하여 사이토킨 증후를 일으킨다(비특허문헌 5). 이는 OKT3이 2가의 IgG 분자이고, 이에 따라 T 세포 및 Fcγ 수용체-발현 세포에 가교결합하며, 결과적으로 T 세포 활성화를 야기하기 때문이다(비특허문헌 8). 또한, OKT3은 마우스 항체이고, 따라서 장기간의 투여를 통해 이호성(heterophilic) 항체, 예컨대 인간 항-마우스 항체(HAMA)를 야기하는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 7). 항-CD3 항체 치료의 응용 및 이들의 부작용에 대한 보고가 아래에 요약되어 있다(특허문헌 1).
4) 이러한 문제점들을 해결하기 위해, scFv-형식의 OKT3(비특허문헌 9) 및 인간화된 OKT3(비특허문헌 10)이 제작되고 있다. OKT3의 단일 쇄와 암 세포의 표면 상에서 발현되는 표적 항원에 대한 항체의 단일 쇄를 합친 이중특이적 항체는 OKT3의 응용에 대한 또 다른 예로서 보고되었다(특허문헌 2 및 비특허문헌 11).
5) 선행 기술 분야에 기재된 항-CD3 항체를 포함하는 다중특이적 항체는 악성 질환의 치료에 있어서 유의적인 치료 잠재성을 갖는 것으로 기대된다. 예를 들어, TROP2는 다양한 유형의 상피 종양에서 과발현되는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 12 내지 16). 항-CD3 항체의 항원-결합 단편에 대하여 인간 TROP2-특이적 항체를 유전적으로 연결시키는 발현된 이중특이적 항체는 아직 보고되지 않았다.
6) OKT3은 침팬지 CD3과 반응하지만, 다른 영장류, 예컨대 사이노몰구스 원숭이로부터 유래된 CD3과 반응하지 않는다(비특허문헌 17). 유사하게, 항-CD3 단일클론성 항체 UCHT-1은 또한 침팬지-유래된 CD3과 반응하지만, 사이노몰구스 원숭이-유래된 CD3과 반응하지 않는다(비특허문헌 18). 한편, 몇몇 단일클론성 항체는 사이노몰구스 원숭이 항원을 인식하지만, 이들의 인간 대응물을 인식하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이러한 군으로부터의 일례는 FN-18이고, 이는 사이노몰구스 원숭이-유래된 CD3으로 인도되는 단일클론성 항체이다(비특허문헌 19).
7) OKT3 및 일련의 변형된 OKT3 항체의 제한점은 인간 CD3에 대한 이들의 특이성이다. 이러한 제한점은 인간 질환을 치료하기 위한 치료 약제의 개발에 대한 상당한 장벽을 구성할 수 있다. 이는, 개발을 위한 후보 약제가 시판 승인을 얻기 위해 전임상 시험을 거칠 필요가 있고, 동물, 특별히 고등 영장류, 예컨대 사이노몰구스 원숭이에 대한 이러한 전임상 시험을 수행하는 것이 요망되기 때문이다. 이와 같이, 항-CD3 항체를 함유하는 후보 약제의 경우, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 둘 다에 결합할 수 있는 항-CD3 항체를 사용하는 것이 매우 요망된다.
8) 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 둘 다에 결합하는 교차-반응성 항체는 특허문헌 3 및 4 및 비특허문헌 20에 보고되어 있다. 또한, 이러한 항-CD3 항체의 단일 쇄가 암 세포 상에 발현된 표적 항원에 대한 항체의 단일 쇄와 결합된 이중특이적 항체가 보고되어 있다(특허문헌 5 및 비특허문헌 21). 그러나, 다중특이적 항체 또는 다중특이적 분자를 매우 다양한 적용가능한 암 표적에 이용할 수 있기 위해, 상기 언급된 이외의 에피토프에 결합하고 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3 둘 다에 결합하는 항-CD3 항체가 요구된다.
[특허문헌 1] 국제 특허출원 공개공보 제WO2012/162067호 [특허문헌 2] 국제 특허출원 공개공보 제WO2007/108152A1호 [특허문헌 3] 미국 특허 공고공보 제8,236,308B2호 [특허문헌 4] 국제 특허출원 공개공보 제WO2008/119567A1호 [특허문헌 5] 국제 특허출원 공개공보 제WO2015/026892A1호
[비특허문헌 1] 살메론(Salmeron A.) 등의 문헌[J. Immunol. (1991) 147, 3047-3052] [비특허문헌 2] 코스미(Cosmi AB.) 등의 문헌[Transplantation (1981) 32, 535-539] [비특허문헌 3] 길베르트(Gilbert EM.) 등의 문헌[Am. J. Med. (1987) 82, 202-206] [비특허문헌 4] 티스트레트웨이트(Thistlethwaite JR.) 등의 문헌[Transplanation (1987) 43, 176-184] [비특허문헌 5] 아브라모윅츠(Abramowicz D.) 등의 문헌[Transplanation (1989) 47, 606-608] [비특허문헌 6] 투사인트(Toussaint D.) 등의 문헌[Transplanation (1989) 48, 524-526] [비특허문헌 7] 티스트레트웨이트(Thistlethwaite, JR.) 등의 문헌[Am. J. Kidney Dis. (1988) 11, 112-119] [비특허문헌 8] 뮤어(Meuer, SC.) 등의 문헌[Eur. J. Immunol. (1986) 136, 4106-4112] [비특허문헌 9] 조지(George AJ.) 등의 문헌[J. Immunol. (1994) 152 (4), 1802-11] [비특허문헌 10] 우들(Woodle ES.) 등의 문헌[J Immunol. (1992) 148 (9), 2756-63] [비특허문헌 11] 양켈레비취(Yankelevich M.) 등의 문헌[Pediatr. Blood Cancer (2012) 59 (7), 1198-1205] [비특허문헌 12] 오마치(Ohmachi T.) 등의 문헌[Clin. Cancer Res. (2006) 12 (18), 3857-3863] [비특허문헌 13] 무흘만(Muhlmann G.) 등의 문헌[J. Clin. Pathol. (2009) 62 (2), 152-158] [비특허문헌 14] 퐁(Fong D.) 등의 문헌[Br. J. Cancer (2000) 99 (8), 1290-1295]. [비특허문헌 15] 퐁(Fong D.) 등의 문헌[Mod. Pathol. (2000) 21 (2) (2000), 186-191] [비특허문헌 16] 닝(Ning S.) 등의 문헌[Neurol. Sci. (2013) 34 (10), 1745-1750] [비특허문헌 17] 산두스키(Sandusky) 등의 문헌[J. Med. Primatol. (1986) 15, 441-451] [비특허문헌 18] http://www.nhpreagents.org/NHP/clonelist.aspx?ID=77 [비특허문헌 19] 우다(Uda) 등의 문헌[J. Med. Primatol. (2001) 30, 141-147] [비특허문헌 20] 콘라드(Conrad ML.) 등의 문헌[Cytometry A. (2007) 71 (11), 925-33] [비특허문헌 21] 룸(Lum LG.) 등의 문헌[BioDrugs (2011) 25 (6), 365-379].
본 발명의 목적은, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 신규한 항체 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편(이후, 또한 항체 등으로서 지칭됨), 항체 등을 포함하고 추가로 1개 또는 2개 이상의 추가적인 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 분자(이러한 분자는 다중특이적임), 및 이러한 항체 등 또는 분자를 활성 성분으로서 포함하는, 세포독성 활성을 갖는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 광범위한 연구를 수행하여 신규한 항-CD3 항체 및 이러한 항체를 포함하는 분자를 개발함으로써 상기 목적을 달성하고 본 발명을 실현하였다.
구체적으로, 본 발명은 하기 양태를 포함한다:
(1) 중쇄 서열이 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 98로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하고, 경쇄 서열이 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 99로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편으로서, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합함을 특징으로 하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(2) CDRH2에서, 첫 번째 Xaa가 A, E, G, H, I, L, T, V, R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이거나, 첫 번째 Xaa가 N이고, 두 번째 Xaa가 E, R, F, Y, L, V, I, K 및 T로 구성된 군으로부터 선택되고, CDRL2에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되고, 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는, (1)에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(3) CDRH2에서, 첫 번째 Xaa가 R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이고, CDRL2에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되고, 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는, (1) 또는 (2)에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(4) 중쇄 서열이 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 갖는 가변 영역을 포함하고, CDRH1이 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고, CDRH2가 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고, CDRH3이 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고, 경쇄 서열이 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 갖는 가변 영역을 포함하고, CDRL1이 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고, CDRL2가 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고, CDRL3이 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고고, 항체 또는 항원-결합 단편이 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는, (1)에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(5) 중쇄 가변 영역 서열이 서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (4)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(6) 서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열에서, 첫 번째 Xaa가 A, E, G, H, I, L, T, V, R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이거나, 첫 번째 Xaa가 N이고, 두 번째 Xaa가 E, R, F, Y, L, V, I, K 및 T로 구성된 군으로부터 선택되는, (5)에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
(7) 서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열에서, 첫 번째 Xaa가 R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S인, (5)에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
(8) 경쇄 가변 영역이 서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (7)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
(9) 서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는, (8)에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
(10) 중쇄 가변 영역 서열이 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, (5)에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(11) 경쇄 가변 영역 서열이 서열번호 17, 20 및 23중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, (8)에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(12) 항체 또는 항체의 항원-결합성 단편이 서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열에서, 첫 번째 Xaa가 A, E, G, H, I, L, T, V, R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이거나, 첫 번째 Xaa가 N이고, 두 번째 Xaa가 E, R, F, Y, L, V, I, K 및 T로 구성된 군으로부터 선택되고, 서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는, (1) 또는 (2)에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
(13) 서열번호 100에서, 첫 번째 Xaa가 R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이고, 서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는, (12)에 기재된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
(14) (13)에 기재된 바와 같은,
서열번호 60의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 60의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 64의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64의 135번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 66의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 68의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 70의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 72의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 74의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 74의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 76의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 76의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 78의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 78의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 80의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 80의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 82의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 또는
서열번호 84의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
(15) 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 연결기, 및 서열번호 17, 20 및 23중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, (1), (4), (5), (8), (10) 및 (11)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(16) 가변 영역이 아미노-말단으로부터 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 순서로 결합하거나, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 순서로 결합하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편으로서, 임의적으로 i) 양쪽 가변 영역 사이에 연결기를 갖고, ii) 아미노-말단 측의 가변 영역의 아미노-말단에 글리신 잔기를 갖고, iii) 카복실-말단 측의 가변 영역의 카복실-말단에 연결기, FLAG 태그 및/또는 HIS 태그를 갖는, (1) 내지 (15)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(17) 서열번호 64의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 66의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 68의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 70의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 72의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 74의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 75의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 76의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 80의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 82의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 또는
서열번호 84의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열
을 포함하는, (16)에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(18) 서열번호 19의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 22의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 25의 2번째 내지 267번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 60의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 64의 2번째 내지 267번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 66의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 68의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 70의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 72의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 74의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 76의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 78의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 80의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 82의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 또는
서열번호 84의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열
을 포함하는, (16)에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(19) (14) 내지 (18)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 상보성 가닥과 함께 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 함유된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(20) (14) 내지 (18)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 중쇄의 아미노산 서열에 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 (14) 내지 (18)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 경쇄의 아미노산 서열에 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(21) (14) 내지 (18)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 중쇄에 함유된 아미노산 서열로부터의 1개 이상의 아미노산(들)의 치환, 결실 또는 부가에 의해 유래된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 (14) 내지 (18)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 경쇄에 함유된 아미노산 서열로부터의 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 유래된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(22) (14) 내지 (18)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 결합하는 인간 CD3 상의 동일한 부위에 결합하고, 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(23) 인간 CD3에 결합하는 (14) 내지 (18)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 경쟁하고, 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(24) 항체가 결합하는 인간 CD3 상의 부위가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 55번째 세린(Ser), 56번째 글루탐산(Glu), 58번째 류신(Leu), 59번째 트립토판(Trp), 65번째 아스파라긴(Asn), 66번째 이소류신(Ile), 77번째 세린(Ser), 78번째 아스파르트산(Asp), 101번째 아르기닌(Arg), 101번째 글리신(Gly), 103번째 세린(Ser), 104번째 리신(Lys) 및 105번째 프롤린(Pro)으로부터 선택되는 7개 이상의 아미노산에 의해 구성되는, (22)에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(25) 항체가 IgG인, (1) 내지 (17) 및 (19) 내지 (24)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(26) 항원-결합 단편이 Fab, F(ab)', Fv, scFv 및 sdAb로 구성된 군으로부터 선택되는, (1) 내지 (23)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(27) 항체가 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 인간 항체인, (1) 내지 (17) 및 (19) 내지 (25)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(28) (1) 내지 (27)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(29) 서열번호 19의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
서열번호 22의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 25의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 60의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 64의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 66의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 68의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 70의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 72의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 74의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 76의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 78의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 80의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 82의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 또는
서열번호 84의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열
로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, (27)에 기재된 폴리뉴클레오티드.
(30) (28) 또는 (29)에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
(31) (28) 또는 (29)에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 (30)에 기재된 벡터를 포함하거나, (1) 내지 (27)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 생산하는 세포.
(32) (31)에 기재된 세포를 배양하는 단계; 및 인간 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 배양액으로부터 회수하는 단계를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
(33) 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하고, (32)에 기재된 방법에 의해 수득되는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
(34) (1) 내지 (27) 및 (33)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.
(35) (1) 내지 (27) 및 (33)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하고, 항원 결합 활성을 갖는 분자.
(36) 다중특이적인, (35)에 기재된 분자.
(37) (1) 내지 (27) 및 (33)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 더하여 1개 또는 2개 이상의 추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편을 추가로 포함하는, (35) 또는 (36)에 기재된 분자.
(38) 추가적인 항체의 항원-결합 단편이 Fab, F(ab)', Fv, scFv 또는 sdAb인, (37)에 기재된 분자.
(39) Fc를 포함하는, (38)에 기재된 분자.
(40) 추가적인 항체가 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 인간 항체인, (37) 내지 (39)중 어느 하나에 기재된 분자.
(41) 추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편이 (1) 내지 (27) 및 (33)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 연결기를 통해 또는 연결기 없이 결합되는, (37) 또는 (38)에 기재된 분자.
(42) 추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편의 아미노산 서열의 카복실-말단이 연결기와 결합되고, 상기 연결기의 아미노산 서열의 카복실-말단이 (1) 내지 (27) 및 (33)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 추가로 결합되는, (41)에 기재된 분자.
(43) 추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편의 아미노산 서열의 카복실-말단이 연결기와 결합되고, 상기 연결기의 아미노산 서열의 카복실-말단이 서열번호 19의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 서열번호 22의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 또는 서열번호 25의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 추가로 결합되는 아미노산 서열을 포함하는, (42)에 기재된 분자.
(44) (1) 내지 (27) 및 (33)중 어느 하나에 기재된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하되, 가변 영역이 아미노-말단으로부터 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 순서로 결합하거나, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 순서로 결합하는 분자로서, 임의적으로 i) 양쪽 가변 영역 사이에 연결기를 갖고, ii) 아미노-말단 측의 가변 영역의 아미노-말단에 글리신 잔기를 갖고, iii) 카복실-말단 측의 가변 영역의 카복실-말단에 연결기, FLAG 태그 및/또는 HIS 태그를 갖는, (35) 내지 (42)중 어느 하나에 기재된 분자.
(45) 추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편이
서열번호 19의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 25의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 60의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 64의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 66의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 68의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 70의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 72의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 74의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 76의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 78의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 80의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 82의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 또는
서열번호 84의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편
과 결합하는, (44)에 기재된 분자. 적용가능한 형태로는 하이브리드형, 듀얼(Dual)형의 이중특이적 분자가 포함된다.
(46) 추가적인 항체가 항암 표적 항체인, (36) 내지 (45)중 어느 하나에 기재된 분자.
(47) 이중특이적인, (36) 내지 (46)중 어느 하나에 기재된 분자.
(48) 폴리펩티드인, (35) 내지 (47)중 어느 하나에 기재된 분자.
(49) (48)에 기재된 분자의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
(50) (49)에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
(51) (49)에 기재된 폴리뉴클레오티드, (50)에 기재된 벡터, 또는 (48)에 기재된 분자를 생산하는 세포.
(52) (51)에 기재된 세포를 배양하는 단계; 및 인간 CD3에 결합하는 분자를 배양액으로부터 회수하는 단계를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 분자를 생산하는 방법.
(53) 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하고, (52)에 기재된 방법에 의해 수득되는 분자.
(54) (35) 내지 (48) 및 (53)중 어느 하나에 기재된 분자를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.
(55) T 세포를 표적 세포로 재인도(redirection)함으로써 표적 세포에서 세포독성을 유도하는, (54)에 기재된 약학 조성물.
본 발명은 인간 CD3에 결합하고 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 신규한 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 및 이러한 항체를 포함하는 항원 결합 활성을 갖는 신규한 분자를 수득할 수 있다. 또한 이러한 항체 등 또는 분자를 활성 성분으로서 포함하는 신규한 약학 조성물이 수득된다. 항체 등 또는 분자는 T 세포 의존성 세포독성 활성을 갖고, 각종 질환, 예컨대 암에 대한 치료제 또는 예방제로서 유용하다.
도 1은 인간 CD3ε의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 2는 인간 CD3δ의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 3은 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 4는 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 5는 중쇄 유전자 증폭용 센스 프라이머 Nhe-polyC-S의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 6은 중쇄 유전자 증폭용 1회차 안티센스 프라이머 rIgγ-AS1의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 7은 중쇄 유전자 증폭용 2회차 안티센스 프라이머 rIgγ-AS2의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 8은 경쇄 유전자 증폭용 센스 프라이머 Nhe-polyC-S2의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 9는 경쇄 유전자 증폭용 1회차 안티센스 프라이머 rIgL-AS1의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 10은 경쇄 유전자 증폭용 2회차 안티센스 프라이머 rIgL-AS2의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 11은 중쇄 서열 결정을 위한 센스 프라이머 rIgγ-seq의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 12는 경쇄 서열 결정용 안티센스 프라이머 1 rIgL-seq1의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 13은 경쇄 서열 결정용 안티센스 프라이머 2 rIgL-seq2의 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 14는 C3-147의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 15는 C3-147의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 16은 C3-147의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 17은 C3-147의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 18은 G4S 연결기 센스 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 19는 G4S 연결기 안티센스 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 20은 C3E-7000을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 21은 C3E-7000의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 22는 C3E-7034의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 23은 C3E-7034의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 24는 C3E-7000의 CDR-H1의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 25는 C3E-7000의 CDR-H2의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 26은 C3E-7000의 CDR-H3의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 27은 C3E-7000의 CDR-L1의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 28은 C3E-7000의 CDR-L2의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 29는 C3E-7000의 CDR-L3의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 30은 C3E-7035의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 31은 C3E-7035의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 32는 C3E-7036의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 33은 C3E-7036의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 34는 C3E-7034를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 35는 C3E-7035를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 36은 C3E-7036을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 37은 인간 CD3γ의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 38은 C3E-7034의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 39는 CD3εγ 및 C3E-7034의 복합체 구조를 보여주는 도면이다.
도 40은 C3E-7034의 중쇄 및 경쇄와 CD3εγ 사이의 상호작용을 보여주는 도면이다.
도 40A는 C3E-7034의 경쇄 가변 영역과 CD3ε에 관련된 도면이고, 여기서 서로 4 옹스트롬 이내의 거리에 있는 CD3ε의 아미노산 잔기는 모델에서 두꺼운 스틱으로 표시되고, 나머지 아미노산은 모델에서 얇은 스틱으로 표시된다.
도 40B는 C3E-7034의 중쇄 가변 영역과 CD3ε에 관련된 도면이고, 여기서 서로 4 옹스트롬 이내의 거리에 있는 CD3ε의 아미노산 잔기는 모델에서 두꺼운 스틱으로 표시되고, 나머지 아미노산은 모델에서 얇은 스틱으로 표시된다.
도 41은 C3E-7034에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열과 인간 CD3ε의 상호작용 부위를 보여주는 도면이다.
도 42는 OKT3에서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 43은 C3E-3007에서 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 44는 OKT3에서 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 45는 C3E-3007에서 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 46은 C3E-3007 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 47은 C3E-3007 scFv의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 48은 인간화된 항-CD3 scFv인 C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035 및 C3E-7036의 인간 CD3(PBMC)으로의 결합 활성을 보여주는 도면이다.
도 49는 인간화된 항-CD3 scFv인 C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035 및 C3E-7036의 사이노몰구스 원숭이 CD3(PBMC)으로의 결합 활성을 보여주는 도면이다.
도 50A는 인간화된 항-CD3 scFv인 C3E-7034 및 C3E-3007의 인간 CD8-양성 세포에 대한 활성화 작용을 보여주는 도면이고, 도 50B는 인간화된 항-CD3 scFv인 C3E-7034 및 C3E-3007의 사이노몰구스 원숭이 CD8-양성 세포에 대한 활성화 작용을 보여주는 도면이다.
도 51은 HT1-11 scFv의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 52는 HT1-11 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 53은 HT1-11 scFv가 인간 TROP2-양성 세포주에 대한 결합을 보여주는 한 쌍의 도면이다.
도 53A는 인두의 편평상피 세포 암 세포주 FaDu에 대한 결합을 보여주는 도면이다.
도 53B는 췌장암 세포주 HPAF-II에 대한 결합을 보여주는 도면이다.
도 54는 T2C-0001을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 55는 T2C-0003을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 56은 T2C-0005를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 57은 T2C-0006을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 58은 T2C-0001의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 59는 T2C-0003의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 60은 T2C-0005의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 61은 T2C-0006의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 62는 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 및 T2C-0006이 TROP2-양성 세포주에 결합함을 보여주는 한 쌍의 도면이다.
도 62A는 인두의 편평상피 세포 암 세포주 FaDu에 대한 결합을 보여주는 도면이다.
도 62B는 췌장암 세포주 HPAF-II에 대한 결합을 보여주는 도면이다.
도 63은 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 및 T2C-0006의 인간 CD3(PBMC)으로의 결합 활성을 보여주는 도면이다.
도 64는 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 및 T2C-0006의 사이노몰구스 원숭이 CD3(PBMC)으로의 결합 활성을 보여주는 도면이다.
도 65A는 인두의 편평상피 세포 암 세포주 FaDu에서 발현된 TROP2를 보여주는 도면이다.
도 65B는 췌장암 세포주 HPAF-II에서 발현된 TROP2를 보여주는 도면이다.
도 65C는 TROP2가 폐암 세포주 Calu-6에서 발현되지 않음을 보여주는 도면이다.
도 66A는 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 및 T2C-0006이 인간 PBMC의 존재하에 인두의 편평상피 세포 암 세포주 FaDu에 대하여 세포독성 활성을 가짐을 보여주는 도면이다.
도 66B는 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 및 T2C-0006이 인간 PBMC의 존재하에 췌장암 세포주 HPAF-II에 대하여 세포독성 활성을 가짐을 보여주는 도면이다.
도 66C는 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 및 T2C-0006이 인간 PBMC의 존재하에 인간 폐암 세포주 Calu-6에 대하여 세포독성 활성을 나타내지 않음을 보여주는 도면이다.
도 67은 C3E-7078을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 68은 C3E-7078의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 69는 C3E-7079를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 70은 C3E-7079의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 71은 C3E-7085를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 72는 C3E-7085의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 73은 C3E-7086을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 74는 C3E-7086의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 75는 C3E-7087을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 76은 C3E-7087의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 77은 C3E-7088을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 78은 C3E-7088의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 79는 C3E-7089를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 80은 C3E-7089의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 81은 C3E-7090을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 82는 C3E-7090의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 83은 C3E-7091을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 84는 C3E-7091의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 85는 C3E-7092를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 86은 C3E-7092의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 87은 C3E-7093을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 88은 C3E-7093의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 89는 C3E-7094를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 90은 C3E-7094의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 91은 C3E-7095를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 92는 C3E-7095의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 93은 프라이머 HN53R Fw를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 94는 프라이머 HN53R Rv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 95는 프라이머 HN53S Fw를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 96은 프라이머 HN53S Rv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 97은 AXC-0001을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 98은 AXC-0001의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 99는 AXC-0002를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 100은 AXC-0002의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 101은 MGC-0001을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 102는 MGC-0001의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 103은 MGC-0002를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열을 보여주는 도면이다.
도 104는 MGC-0002의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 105는 항-CD3 항체의 CDR 변이체의 제조에 사용되는 프라이머 목록을 보여준다.
도 106a는 항-CD3 항체의 CDR 변이체의 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3(PBMC)에 대한 결합 활성을 보여주는 도면이다.
도 106b는 항-CD3 항체의 CDR 변이체의 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3(PBMC)에 대한 결합 활성을 보여주는 도면이다.
도 107은 인간 폐암 세포주 A549(A), 인간 췌장암 세포주 PANC-1(B), 인간 췌장암 세포주 MIA PaCa-2(C), 인간 골수종 세포주 U266B1(D), 및 맨틀(mantle) 세포 림프종 세포주 Jeko-1(E)에서 Axl의 발현을 보여주는 도면이다.
도 108A, 108B 및 108C는 각각 항-Axl CD3 이중특이적 분자 AXC-0001 및 AXC-0002가 인간 PBMC의 존재하에 Axl-발현 세포주에 대하여 세포독성 활성을 가짐을 보여주는 도면이다. 도 108D 및 108E는 각각 항-Axl CD3 이중특이적 분자 AXC-0001 및 AXC-0002가 인간 PBMC의 존재하에 비-Axl-발현 세포주에 대하여 세포독성 활성을 나타내지 않음을 보여주는 도면이다.
도 109는 MAGEC1 펩티드(A) 또는 DMSO(B) 보충된 인간 림프아구 융합 세포주 T2 세포에서 MAG-032 scFv의 결합 활성을 보여주는 도면이다.
도 110A는 항-HLA-A2/MAGEC1-CD3 이중특이적 분자 MGC-0001 및 MGC-0002가 인간 PBMC의 존재하에 MAGEC1 펩티드 보충된 T2 세포에 대하여 세포독성 활성을 가짐을 보여주는 도면이다.
도 110B는 항-HLA-A2/MAGEC1-CD3 이중특이적 분자 MGC-0001 및 MGC-0002가 인간 PBMC의 존재하에 DMSO 보충된 T2에 대하여 세포독성 활성을 갖지 않음을 보여주는 도면이다.
도 111은 MAGEC1 펩티드의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다.
도 112는 CDR 변이체의 CDRH2 영역에서의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. 첫 번째 Xaa 및 두 번째 Xaa는 각각 임의적인 천연 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 113은 CDR 변이체의 CDRL2 영역에서의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. Xaa는 임의적인 천연 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 114는 C3E-7034의 CDR 변이체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. 첫 번째 Xaa 및 두 번째 Xaa는 각각 임의적인 천연 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 115는 C3E-7034의 CDR 변이체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. Xaa는 임의적인 천연 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 116은 C3E-7035의 CDR 변이체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. Xaa는 임의적인 천연 아미노산 잔기를 나타낸다.
도 117은 C3E-7036의 CDR 변이체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 보여주는 도면이다. Xaa는 임의적인 천연 아미노산 잔기를 나타낸다.
1. 정의
본 발명에 있어서, 용어 "유전자"는 단백질의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드, 또는 그의 상보성 가닥을 의미한다. "유전자"의 의미에, 예를 들어, 단백질의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드, 또는 그의 상보성 가닥으로서의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA, 및 cRNA가 포함된다. 이러한 유전자는 단일-가닥, 2중-가닥, 3중-가닥, 또는 이상의 다중-가닥 뉴클레오티드이다. "유전자"의 의미에 또한 DNA 및 RNA 가닥의 회합체, 1개의 뉴클레오티드 가닥 상의 리보뉴클레오티드(RNA) 및 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)의 혼합물, 및 이러한 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 2중-가닥, 3중-가닥 또는 이상의 다중-가닥 뉴클레오티드가 포함된다. 본 발명에서, 용어 "염기 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 있어서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 "핵산" 및 "핵산 분자"와 동일한 의미를 갖고, 또한 예를 들어, 임의의 DNA, RNA, 프로브(probe), 올리고뉴클레오티드, 및 프라이머가 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥, 2중-가닥, 3중-가닥, 또는 이상의 다중-가닥 폴리뉴클레오티드이다. 또한 "폴리뉴클레오티드"의 의미에 DNA 및 RNA 가닥의 회합체, 1개의 폴리뉴클레오티드 가닥 상의 리보뉴클레오티드(RNA) 및 데옥시리보뉴클레오티드(DNA)의 혼합물, 및 이러한 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함하는 2개의 가닥 또는 3개 이상의 가닥의 회합체가 포함된다.
본 발명에 있어서, 용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 있어서, 용어 "항원"은 때때로 "면역원"을 의미하기 위해 사용된다.
본 발명에 있어서, 용어 "세포"는 또한 예를 들어, 동물 개체로부터 유래된 임의의 세포, 계대 배양된 세포, 초대 배양된 세포, 세포주, 재조합 세포, 및 미생물 세포를 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "항체"는 면역글로불린과 동일한 의미를 갖는다. 그러나, 본 발명의 항-CD3 항체에 대해 사용되는 "항체"는 불변 및 가변 영역을 갖는 면역글로불린을 의미한다. 항체는 특별히 제한되지 않고 천연 면역글로불린일 수 있거나 부분적 또는 완전 합성에 의해 생산된 면역글로불린일 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 아래에 기재된 "분자"에 포함된다.
4쇄 항체의 기본 구조는 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결된다. 2개의 중쇄는 중쇄의 이소타입(isotype)에 따라 1개 이상의 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된다. 각각의 경쇄 및 중쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 매우 높은 정도의 아미노산 서열 유사성을 나타내는 불변 영역 및 낮은 정도의 아미노산 서열 유사성을 나타내는 가변 영역을 함유한다. 경쇄는 불변 영역(CL)이 수반되는 가변 영역(VL)을 아미노-말단에 갖는다. 중쇄는 3개의 불변 영역(CH1, CH2, 및 CH3)이 수반되는 가변 영역(VH)을 아미노-말단에 갖는다. VL 및 VH는 쌍을 이루고, CL은 중쇄의 제1의 불변 영역(CH1)과 정렬된다. VL 및 VH는 단일 항원-결합 부위를 형성하도록 쌍을 이룬다.
본 발명의 항체의 불변 영역은 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 인간 항체로부터 유래된 불변 영역은 인간에서 질환을 치료하거나 예방하기 위해 본 발명의 항체에서 사용된다. 인간 항체에서 중쇄 불변 영역의 예로는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cμ, Cδ, Cα1, Cα2, 및 Cε이 포함된다. 인간 항체에서 경쇄 불변 영역의 예로는 Cκ 및 Cλ가 포함된다.
Fab는 VH가 수반되는 중쇄 CH1, 및 VL이 수반되는 경쇄 CL로 구성된다. VH 및 VL은 각각 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한다.
Fc는 중쇄 불변 영역의 카복실-말단 영역으로 구성되고, CH2 및 CH3을 함유한 이량체이다. 본 발명의 Fc는 천연 서열을 갖는 Fc이거나, 천연 서열에 돌연변이를 함유한 Fc의 돌연변이 형태일 수 있다.
가변 영역은 극도의 가변성을 갖는 초가변 영역(HVR)으로 지칭되는 영역, 및 초가변 영역에 의해 중단되는, 골격구조 영역(FR)으로 지칭되는 비교적 불변의 영역으로 구성된다. 천연 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 4개의 FR을 함유한다. 각각의 쇄의 초가변 영역은 FR에 의해 또 다른 쇄의 초가변 영역과 함께 아주 근접하여 존재하고, 항체에서 항원-결합 부위의 형성에 기여한다.
항체 분자의 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 것으로 알려져 있다. 상보성 결정 영역은 또한 초가변성 도메인으로 지칭된다. 이들 영역은 항체 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 위치된다. 이들 부위는 특별히 매우 가변성의 1차 구조를 갖고, 통상적으로 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 가닥의 개개의 1차 구조 상에서 3개의 위치에 분리된다. 본 발명에 있어서, 항체의 상보성 결정 영역은, 중쇄의 상보성 결정 영역의 경우 중쇄 아미노산 서열의 아미노-말단으로부터 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3으로서 지칭되고, 경쇄의 상보성 결정 영역의 경우 경쇄 아미노산 서열의 아미노-말단으로부터 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3으로서 지칭된다. 이들 부위는 입체 구조에서 서로 근접하고, 결합되는 항원에 대한 특이성을 결정한다.
본 발명에 있어서, CDR의 위치 및 길이는 IMGT 정의에 따라 결정되었다[문헌 "Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77)"].
골격구조 영역(FR)은 CDR 잔기를 제외하고 가변 영역이다. 각각의 가변 영역은 통상적으로 4개의 FR, 즉, FR1, FR2, FR3, 및 FR4를 갖는다.
CDR 및 FR의 위치는 또한 당분야에 공지된 다른 정의, 예를 들어, IMGT 정의 뿐만 아니라 카밧(Kabat), 코티아(Chothia), AbM, 및 컨택트(contact) 정의에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 용어 "항체의 항원-결합 단편"은 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖고 항원에 대한 결합 활성을 갖는 부분적 항체 단편을 의미한다. "항체의 항원-결합 단편"의 예로는, 예컨대 Fab, F(ab')2, scFv, Fab', Fv, 및 단일-도메인 항체(sdAb)와 같은 항원-결합 단편이 포함되지만 이로 제한되지 않는다. 항체의 이러한 항원-결합 단편은 항체 단백질의 전장 분자를 효소, 예컨대 파파인(papain) 또는 펩신으로 처리함으로써 수득될 수 있거나, 재조합 유전자를 사용하여 적절한 숙주 세포에서 생산된 재조합 단백질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체가 결합되는 "부위", 즉 항체에 의해 인식되는 "부위"는 항체에 의해 결합되거나 인식되는 항원 상의 부분적 펩티드 또는 부분적 고차 구조를 의미한다.
본 발명에 있어서, 이러한 부위는 또한 에피토프 또는 항체 결합 부위로서 지칭된다.
본 발명에 있어서, 용어 "항체 변이체"는, 고유의 항체의 아미노산 서열로부터 아미노산(들)의 치환, 결실, 및/또는 부가("부가"는 삽입을 포함함)(이하, "돌연변이"로서 총칭됨)에 의해 유래된 아미노산 서열을 갖고 본 발명의 CD3에 결합하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 항체 변이체에서 돌연변이된 아미노산의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 또는 50개이다. 이러한 항체 변이체는 본 발명의 "항체"일 수 있다.
본 발명에 있어서, "1개 이상의"에서 용어 "이상"은 2 내지 10개를 지칭한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "분자"는 전술된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 분자이고, 또한 항체 또는 이로부터 유래된 복수개의 항원-결합 단편에 의해 형성된 다중특이적 분자를 포함한다.
본 명세서에 있어서, 용어 "다중특이적인 분자"는 "다중특이적 분자"와 동일한 의미를 갖는다. 이러한 다중특이적 분자는, 이러한 분자가 하나의 분자 상의 서로 상이한 복수개의 에피토프, 및/또는 둘 이상의 분자 상의 서로 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 다중특이적인 분자는 또한 중쇄 가변성(VH) 및 경쇄 가변성(VL) 영역을 포함하는 항체를 포함한다. 이러한 다중특이적 분자의 예로는, 2종류 이상의 중쇄 및 2종류 이상의 경쇄를 갖는 전장 항체 분자, 즉, IgG-형 다중특이적 분자, 및 2종류 이상의 VL 및 VH를 갖는 항원-결합 단편으로 구성된 분자, 즉, Fab, Fab', Fv, scFv, sdAb 등의 조합에 의해 유래된 분자[즉, 탠덤(tandem) scFv, 디아바디(diabody), 단일 쇄 디아바디, 및 트리아바디(triabody)]가 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 또한, 면역글로불린 골격 없이 항원 결합 활성을 갖는 단백질을 항원-결합 단편에 유전적으로 또는 화학적으로 연결시킴으로써 형성된 분자가 또한 다중특이적 분자에 포함된다.
본 발명의 항-CD3 항체, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편, 또는 본 발명의 다중특이적 분자에 의해 실현되는 활성 또는 특성의 예로는 생물학적 활성 또는 생화학적 활성이 포함될 수 있고, 구체적으로는 다양한 생물학적 활성, 항원 또는 에피토프에 대한 결합 활성, 제조 또는 저장 동안의 안정성, 및 열 안정성이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, "엄격한 조건하에서의 하이브리드화"라는 문구는 65℃에서 5 × SSC가 함유된 용액중에서 하이브리드화한 후, 2 × SSC-0.1% SDS가 함유된 수용액중에서 65℃에서 20 분 동안, 0.5 × SSC-0.1% SDS가 함유된 수용액중에서 65℃에서 20 분 동안, 및 0.2 × SSC-0.1% SDS가 함유된 수용액중에서 65℃에서 20 분 동안 각각 세정하는 조건하에서 하이브리드화함, 또는 동등한 조건하에서 하이브리드화함을 의미한다. SSC는 150 mM NaCl-15 mM 시트르산 나트륨의 수용액을 의미하고, n × SSC는 n 배 농도의 SSC를 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "세포독성"은 세포에서 야기되는 병리학적 변화를 지칭하고, 단지 직접적인 외상 뿐만 아니라, DNA 절단, 염기 이량체의 형성, 염색체 파괴, 유사분열 장치의 손상, 및 각종 효소의 활성의 저하를 비롯한 세포에 대한 구조적 또는 기능적 손상을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "세포독성 활성"은 상기 언급된 세포독성을 야기하는 활성을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "항체 의존성 세포독성(ADCC) 활성"은 항체를 통해 NK 세포에 의해 표적 세포, 예컨대 종양 세포를 손상시키는 작용 또는 활성을 의미한다.
본 발명에 있어서, 용어 "T 세포의 재인도에 의한 세포독성 활성"은 세포독성이 항-종양 항원 항체 및 항-CD3 항체를 포함하는 다중특이적 분자에 의해 야기됨을 의미한다. 구체적으로, 이 용어는 항-종양 항원 항체가 표적 종양 세포에 결합하는 한편 항-CD3 항체 T 세포에 결합하여 표적 종양 세포 및 T 세포가 서로 더 가까워지게 되어 T 세포 활성화-중재된 세포독성을 유도함을 의미한다. 분자는 약학 조성물에 함유될 수 있다.
2. 항원 단백질 CD3(CD3 복합체)
본 발명에 있어서, 용어 "CD3"은 CD3 단백질과 동일한 의미를 갖는다.
CD3은 다분자 T 세포 수용체 복합체의 일부분으로서 T 세포 상에서 발현되고, 5 종류의 폴리펩티드(γ, δ, ε, ζ, η) 쇄(각각, 25000 내지 28000, 21000, 20000, 16000, 및 22000의 분자량을 갖는다)의 복합체이다.
본 발명에서 사용된 CD3은, 동물 조직(체액 포함), 조직 유래된 세포, 또는 세포 배양액으로부터의 정제 또는 단리, 유전자 재조합, 시험관내 번역, 화학 합성 등에 의해 제조될 수 있다.
인간 CD3ε을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 젠뱅크(GenBank)에 수탁번호 NM_000733.3으로 등록되어 있다. 사이노몰구스 원숭이 CD3을 코딩하는 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 젠뱅크에 수탁번호 NM_001283615.1로 등록되어 있다. 인간 CD3ε의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 1에 기재되어 있다.
CD3ε cDNA는, 예를 들어, CD3ε mRNA-발현 기관으로부터의 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고 CD3ε cDNA를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응(이하, "PCR"로 지칭됨)[사이키(Saiki, R.K.) 등의 문헌 "Science (1988) 239, 487-489"]을 수행하는, 소위 PCR 방법을 사용하여 수득될 수 있다.
CD3의 아미노산으로부터 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 유래된 아미노산 서열로 구성되고 CD3에 동등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열도 CD3 유전자의 뉴클레오티드 서열에 포함된다. 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 CD3의 아미노산으로부터 유래된 아미노산 서열로 구성되고 CD3에 동등한 생물학적 활성을 갖는 단백질 또한 CD3에 포함된다.
인간 또는 사이노몰구스 원숭이 CD3ε을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상보성인 뉴클레오티드 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드에 엄격한 조건하에 하이브리드화하고, CD3ε과 동등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 CD3ε cDNA에 포함된다. 또한, 인간 또는 사이노몰구스 원숭이 CD3ε 유전자좌로부터 전사된 스플라이싱(splicing) 변이체, 또는 엄격한 조건하에 이에 하이브리드화하고 CD3ε과 동등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 CD3ε cDNA에 포함된다.
3. 항-CD3 항체
(3-1) 항체의 분류
본 발명의 항-CD3 항체 및 항체의 항원-결합 단편(이하, 본 발명의 항체 등으로서도 지칭됨)은 단일클론성 또는 다중클론성 항체일 수 있다. 본 발명의 단일클론성 항체의 예로는 비-인간 동물-유래된 항체(비-인간 동물 항체), 인간 항체, 키메라화 항체, 및 인간화된 항체가 포함된다.
비-인간 동물 항체의 예로는 포유류 및 조류와 같은 척추동물로부터 유래된 항체가 포함된다. 포유류-유래된 항체의 예로는 마우스 항체 및 래트 항체와 같은 설치류-유래된 항체가 포함된다. 조류-유래된 항체의 예로는 닭 항체가 포함된다. 항-인간 CD3 래트 단일클론성 항체의 일례는 본 발명의 C3-147[실시예 1)-7]이다.
키메라화 항체의 예로는, 인간 항체(인간 면역글로불린) 불변 영역에 결합된 비-인간 동물 항체-유래된 가변 영역을 포함하는 항체가 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
인간화된 항체의 예로는, 비-인간 동물 항체의 가변 영역중의 CDR에 이식된 인간 항체(인간 면역글로불린 가변 영역), CDR 뿐만 아니라 비-인간 동물 항체중의 골격구조 영역의 일부 서열에 이식된 인간 항체, 및 임의의 이들 인간화된 항체에서 1개 이상의 비-인간 동물 항체-유래된 아미노산이 인간 항체 아미노산으로 치환된 항체가 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 비-인간 동물 항체의 가변 영역중의 CDR의 예로는 본 발명의 래트 항-CD3 항체 C3E-7000으로부터 유래된 중쇄 가변 영역중의 CDRH1 내지 CDRH3 및 경쇄 가변 영역중의 CDRL1 내지 CDRL3, 및 이러한 CDR의 아미노산 서열에서 1 또는 2개의 아미노산이 상이한 아미노산에 의해 치환된 CDR이 포함된다.
인간 항체는, 항체가 바람직하게는 인간 CD3에 결합하고, 더욱 바람직하게는 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 한 특별히 제한되지 않는다. 예로서 본 발명의 인간화된 항체와 동일한 부위에 결합하는 인간 항체가 또한 포함된다. 예로서 C3E-7034와 동일한 부위에 결합하는 인간 항체가 포함된다.
바람직하게는, 본 발명의 항체 등은 인간 CD3에 결합한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 항체 등은 또한 사이노몰구스 원숭이 CD3에 대한 결합 활성을 갖는다.
본 발명의 항체 등은, 항체가 인간 CD3에 결합하고 또한 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 한, 복수개의 상이한 항체로부터 유래되는 부분으로 구성될 수 있다. 이들 항체의 예로는 복수개의 상이한 항체들 사이에서 교환된 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체, 이들 사이에서 중쇄 및/또는 경쇄의 전장을 교환하는 항체, 이들 사이에서 가변성 또는 불변 영역을 교환하는 항체, 및 이들 사이에서 CDR 전부 또는 일부를 교환하는 항체가 포함된다. 키메라화 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 상이한 본 발명의 항체로부터 유래될 수 있다. 인간화된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역중의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3은 상이한 본 발명의 항체로부터 유래될 수 있다. 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역중의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3은 2종 이상의 상이한 본 발명의 항체가 갖는 CDR의 조합일 수 있다.
본 발명의 단일클론성 항체의 이소타입의 예로는, IgG, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgM, IgA, 예컨대 IgA1 및 IgA2, IgD, 및 IgE가 포함될 수 있지만, 이로 특별히 제한되지 않는다.
단일클론성 항체의 이소타입 및 하위부류는, 예를 들어, 옥털로니(Ouchterlony) 검사, 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), 또는 방사면역검정(RIA: radio immunoassay)을 사용하여 결정될 수 있다. 시판되는 동정용 키트[예를 들어, 래트 면역글로불린 이소타입결정 ELISA 키트(비디 파르민겐: BD Pharmingen)]가 사용될 수 있다.
(3-2) 항-CD3 항체의 결합 특이성
본 발명의 항체 등은 CD3을 인식한다. 달리 말하면, 본 발명의 항체 등은 CD3에 결합한다. 본 발명의 항체 등은 바람직하게는 인간 CD3 및 원숭이 CD3에 결합하고, 더욱 바람직하게는 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합한다.
더욱 상세하게, 본 발명의 항체 및 이의 항원-결합 단편, 및 이들의 가변 영역은, 인간 CD3 복합체의 ε 쇄(도 1, 서열번호 1)의 세포외 영역에 존재하는 Ig-유사 도메인에 결합한다. 더욱이, 이들은 또한 사이노몰구스 원숭이 CD3 복합체의 ε 쇄의 세포외 영역에 존재하는 Ig-유사 도메인에 결합한다.
본 발명의 항체 등에 의해 결합되는 인간 CD3 복합체의 ε 쇄(도 1, 서열번호 1)의 세포외 영역에 존재하는 에피토프는 다음의 아미노산을 함유한다: Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104, 및 Pro105.
바람직하게는, 본 발명의 항체 등은 이들 13개 아미노산으로부터 선택된 7개 이상의 아미노산을 함유하는 에피토프 영역에 결합함으로써 인간 CD3으로의 결합을 유지할 수 있다.
항체가 이들 아미노산과 4 옹스트롬 거리 이내에 인접하여 있는 경우, 이러한 항체는 본 발명의 항체 등과 동일한 에피토프 특이성을 갖는 것으로 판단될 수 있다. 한편, 에피토프 아미노산중에서 Arg101, Gly102, Ser103, Lys104, 및 Pro105는 당분야에 공지된 바와 같은 항-CD3 항체 OKT3 또는 UCHT1과 상호작용하는 에피토프 잔기에도 존재한다[라스 크제르-니엘센(Lars Kjer-Nielsen) 등의 문헌 "PNAS (2004)"; 및 켈리 아르넷(Kelly L Arnett) 등의 문헌 "PNAS (2004)"]. 그러나, OKT3 또는 UCHT1은 인간 CD3에 결합하지만, 사이노몰구스 원숭이 CD3에는 결합하지 않는다.
본 발명에 있어서, "인식" 즉, "결합"은, 비-특이적 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 인식이 달성되는지 아닌지, 결합이 달성되는지 아닌지를 결정하기 위한 판정 기준의 예로는 해리 상수(이하, "KD"로서 지칭됨)가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 등은 CD3에 대해 1 × 10-5 M 이하, 5 × 10-6 M 이하, 2 × 10-6 M 이하, 또는 1 × 10-6 M 이하의 KD 값을 갖는다.
본 발명에 있어서, 항원에 대한 항체의 결합은 생체분자 상호작용 분석 시스템(예를 들어, SPR 또는 BLI), ELISA, 또는 RIA를 사용하여 측정되거나 판정될 수 있다. 세포 표면 상에서 발현된 항원에 대한 항체의 결합은 유세포분석에 의해 분석될 수 있다.
SPR(표면 플라스몬 공명 분석) 방법은, 반응속도론적 해석에 의해 결합 속도 상수(ka 값) 및 해리 속도 상수(kd 값)를 측정함으로써 친화도에 대한 지표로서 해리 상수(KD 값)를 구하기 위한 분석 수법으로서 사용된다. SPR 분석에 사용되는 기기의 예로는 비아코어(BIAcore)(상표)[지이 헬쓰케어(GE Healthcare) 제조], 프로테온(ProteOn)(상표)[바이오-래드 래보레이토리스(Bio-Rad Laboratories) 제조], SPR-나비(Navi)(상표)[바이오나비스(BioNavis) 제조], 스프리타(Spreeta)(상표)[텍사스 인스트루먼츠 인코포레이티드(Texas Instruments Inc.) 제조], SPRi-플렉스(Plex) II(상표)[호리바 리미티드(Horiba, Ltd.) 제조], 및 오토랩(Autolab) SPR(상표)[메트롬(Metrohm) 제조]이 포함된다.
생물층 간섭법(BLI: biolayer interferometry)은 생물층 간섭을 사용하여 생물분자 상호작용을 계측하는 방법이다. BLI 상호작용 분석에 사용되는 기기의 예로는 옥테트(Octet) 시스템[폴 포르테바이오 코포레이션(Pall ForteBio Corp.) 제조]이 포함된다.
ELISA는 특이적 항체 또는 항원을 사용하여 샘플 용액에 함유된 목적하는 항원 또는 항체를 포획하는 동시에, 효소 반응을 사용하여 목적하는 항원 또는 항체를 검출하고 정량화하는 방법이다. 효소-표식된 항원 또는 항체는 반응 시스템내로 혼입되고, 효소 활성이 검출된다. 효소 활성 검출을 위해, 반응에 의해 흡광 스펙트럼이 바뀌는 기질이 사용되고, 흡광 스펙트럼은 흡광도 측정에 의해 수치화된다.
세포-ELISA는 세포 표면상의 피분석물을 세포마다 포획하는 동시에 효소 반응을 통해 피분석물을 검출하고 정량화하는 방법이다.
RIA(방사면역검정)는 방사성물질을 사용하여 항체를 표식하고 항체로부터의 방사능을 측정함으로써 항체를 정량화할 수 있다.
유세포분석은 미세한 세포를 유체중에 분산시키고 유체를 얇은 흐름으로 흘려보냄으로써 개개의 세포를 광학적으로 분석하기 위해 사용되는 수법이다. 형광 색소-표식된 항체는 항원-항체 반응을 통해 항원의 세포 표면에 결합하고, 항체에 결합된 세포의 수는 항체의 항원 결합 활성을 지시하는 형광 강도를 사용하여 측정된다.
상기 언급된 바와 같이, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 등은 영장류, 특별히 사이노몰구스 원숭이를 사용하여 효능 또는 안전성에 대해 다양하게 시험될 수 있고, 이는 의약품의 비임상 개발(전임상 개발)을 위해 필수적이고, 따라서 바람직하다. 또한 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 등은 세포독성 활성을 갖고 단독으로 또는 본 발명의 분자로서 인간 및 사이노몰구스 원숭이에서 암과 같은 질환의 치료 또는 예방에 있어서 유용하다. 약학 조성물이 후술된다.
인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 본 발명의 항체 등은 마우스 CD3에 결합하지 않는다. 그러므로, 인간 CD3 유전자-형질도입 마우스 세포, 조직, 또는 개체[유전자이식 동물, 넉-아웃(knock-out) 동물, 및 넉-인(knock-in) 동물 포함] 및 항체 등을 이용하는 다양한 검정 또는 면역조직화학적 검사는 숙주 마우스의 CD3에 의해 영향받지 않으면서 실시될 수 있다. 이와 같이, 항체 등을 포함하는 의약, 동물약, 및 진단약 등의 마우스를 이용한 연구 및 비임상 개발이 바람직하다.
(3-3) 단일클론성 항체
본 발명은 단일클론성 항체를 제공한다. 이들 단일클론성 항체로는, 예를 들어, 비-인간 동물-유래된 단일클론성 항체, 예컨대 래트, 마우스, 토끼, 닭, 및 어류 항체, 키메라화 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 이의 항원-결합 단편, 이들 항체 또는 항원-결합 단편의 항체 변이체, 및 이들 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체가 포함된다.
예를 들어, 실시예 1에 기재된 방법에 의해 수득된 C3-147은 항-CD3 래트 단일클론성 항체이다.
C3-147의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 6(도 14)에 기재되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 7(도 15)에 기재되어 있다. C3-147의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 서열목록의 서열번호 8(도 16)에 기재되어 있고, 그의 아미노산 서열은 서열번호 9(도 17)에 기재되어 있다.
본 발명의 항체 변이체는 바람직하게는, 예를 들어, 단백질 분해 또는 산화에 대한 감수성의 저하, 생물학적 활성 또는 기능의 개선 또는 유지, 이러한 생물학적 활성 또는 기능의 저하 또는 악화의 억제, 항원(들)에 결합하는 능력의 개선, 또는 이에 대한 생화학적 또는 기능적 특성의 부여를 나타낼 수 있다. 단백질에서 특정 아미노산의 측쇄가 변경될 수 있고, 이로써 단백질의 활성 또는 기능이 변경된다는 사실은 흔히 알려져 있다. 이러한 변경의 예로는 아스파라긴 측쇄의 탈아미드화 및 아스파라긴 측쇄의 이성화가 포함된다. 본 발명의 항체 변이체로는 이러한 변경을 방지하기 위해 1개 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이체가 포함된다.
본 발명의 이러한 항체 변이체의 예로는 보존적 아미노산 치환에 의해 고유의 항체의 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 항체가 포함된다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 측쇄에 관련된 아미노산 기에서 발생된 치환이다.
바람직한 아미노산 기는 다음과 같다: 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 산성 기; 리신, 아르기닌, 및 히스티딘을 포함하는 염기성 기; 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 및 트립토판을 포함하는 비극성 기; 및 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 및 티로신을 포함하는 비하전 극성 기. 다른 바람직한 아미노산 기는 다음과 같다: 세린 및 트레오닌을 포함하는 지방족 하이드록시 기; 아스파라긴 및 글루타민을 포함하는 아미드-함유 기; 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신을 포함하는 지방족 기; 및 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신을 포함하는 방향족 기. 항체 변이체에서 아미노산 치환은 고유의 항체의 항원 결합 활성을 저하시키지 않으면서 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명은 C3-147을 포함한 상기 언급된 (1)에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 아미노산 서열에 있어서, 보존적 아미노산 치환 및/또는 몇몇 다른 아미노산 돌연변이가 발생된(또는 수행된) 아미노산 서열을 갖는 항체 변이체; C3-147을 포함한 상기 언급된 (1)에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 유래된 임의의 CDRH1 내지 CDRH3 및 CDRL1 내지 CDRL3의 아미노산 서열에서 보존적 아미노산 돌연변이 및/또는 몇몇 다른 아미노산 돌연변이가 발생된(또는 수행된) 아미노산 서열을 갖는 CDR로 구성된 마우스 항체, 래트 항체, 키메라화 항체, 인간화된 항체, 또는 인간 항체; 임의의 이들 항체 변이체 및 돌연변이된 항체의 항원-결합 단편; 및 이러한 항체 변이체, 돌연변이된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 분자를 포함한다.
(3-4) 항-CD3 항체의 항원-결합 단편
하나의 양태에 따라서, 본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체의 항원-결합 단편을 제공한다. 항체의 항원-결합 단편은 항체, 또는 이의 변이체의 기능들중에서 적어도 항원 결합 활성을 유지하는 단편을 의미한다. 항체의 기능의 예는 일반적으로 항원 결합 활성, 항원 활성-조절 활성, 항체 의존성 세포독성 활성, 및 보체 의존성 세포독성 활성을 포함한다. 본 발명의 항체 등 및 본 발명의 항체 등을 포함하는 다중특이적 분자의 기능의 예로는 T 세포의 재인도, T 세포의 활성화, 및 T 세포의 활성화에 의한 암 세포에 대한 세포독성 활성이 포함된다.
항체의 항원-결합 단편은, 항체의 단편이 항체의 활성들중 적어도 항원 결합 활성을 유지하는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예로는, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 적절한 연결기를 통해 연결된 중쇄 및 경쇄 Fv를 포함하는 단일 쇄 Fv(scFv), 및 단일 도메인 항체(sdAb)가 포함되지만, 이로 제한되지 않는다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편의 의미에는 또한 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 뿐만 아니라, 다른 부분, 예컨대 연결기 부분을 보유하는 scFv를 포함하는 분자가 포함된다.
아미노-말단 및/또는 카복실-말단에서 1개 이상의 아미노산의 결실에 의해 항체 단백질로부터 유래되고 항체의 기능의 적어도 일부를 보유하는 분자는 또한 항체의 항원-결합 단편의 의미에 포함된다. 항체의 항원-결합 단편의 이러한 변이체는 또한 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체(후술됨)에 의해 포함된다.
하나의 양태에 따라서, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 scFv이다. scFv는 폴리펩티드 연결기를 경유하여 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 연결시킴으로써 수득된다[플럭툰(Pluckthun A.)의 문헌 "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg and Moore, ed., Springer Verlag, New York, 269-315 (1994)"; 및 문헌 "Nature Biotechnology (2005), 23, 1126-1136"]. 또한, 폴리펩티드 연결기를 경유하여 연결된 2개의 scFv를 포함하는 탠덤 scFv는 이중특이적 분자로서 사용될 수 있다. 다르게는, 3개 이상의 scFv를 포함하는 트리아바디 등의 분자도 다중특이적 분자로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는 단일한 중쇄 가변 영역을 갖고 경쇄 서열을 갖지 않는 항체일 수 있다. 단일 도메인 항체(sdAb) 또는 나노바디(nanobody)로서 지칭되는 이러한 항체는, 항원에 결합하는 능력을 보유하는 것으로 보고된다[무일데만스(Muyldemans S.) 등의 문헌 "Protein Eng ., (1994), 7 (9), 1129-35"; 및 하머스-캐스터만(Hamers-Casterman C.) 등의 문헌 "Nature (1993), 363 (6428), 446-448"]. 이들 항체는 또한 본 발명에 따른 항체의 항원-결합 단편의 의미에 포함된다.
본 발명은 적절한 연결기를 경유하여 연결된 항체의 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하는 단일 쇄 면역글로불린을 또한 포함한다[리(Lee, H-S) 등의 문헌 "Molecular Immunology (1999) 36, 61-71"; 및 쉬르만(Shirrmann, T.) 등의 문헌 "mAbs (2010), 2 (1), 1-4"]. 이러한 단일 쇄 면역글로불린은 본래 4량체인 항체와 유사한 구조 및 활성을 보유하도록 이량체화될 수 있다.
(3-5) 항원 결합 활성을 갖는 분자
본 발명의 분자는 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명의 분자는, 예를 들어, 신호 서열, 정제용 태그, 아미노-말단 Gly, ADC의 약물 연결기 부분, 알부민-결합 폴리펩티드, 중합체, 예컨대 PEG, 항-CD3 항체 이외의 항체, 이의 항원-결합 단편, 및 면역글로불린 골격을 갖지 않고 항원 결합 활성을 갖는 단백질(이는 후술될 것임)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 분자는 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합한다.
본 발명의 분자는 후술되는 다중특이적 분자를 포함한다.
본 발명의 분자는, CAR-T 등과 같이, 세포에 도입되는 형태, 또는 세포 표면 상에 표시되는 형태일 수 있다.
(3-6) 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자
본 발명의 다중특이적 분자는 둘 이상의 항원-결합 부위를 갖는 분자이다. 구체적으로, 본 발명의 다중특이적 분자는 하나의 분자 상에서 서로 상이한 둘 이상의 에피토프에, 또는 둘 이상의 분자 상에서 서로 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 분자이고, 서로 상이한 복수개의 항원-결합 단편을 포함하는 분자이다. 다중특이적 분자의 예로는, IgG-형 다중특이적 분자 및 2종류 이상의 가변 영역을 갖는 다중특이적 분자, 예를 들어, 항체 단편, 예컨대 탠덤 scFv, 단일-쇄 디아바디, 디아바디, 트리아바디, 및 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 연결된 항체 단편을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 다중특이적 분자는 Fc를 함유할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 분자는 본 발명의 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 다중특이적 분자는 본 발명의 항체 등 및 1 또는 2종 이상의 추가적인 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편의 예로는 Fab, F(ab)', Fv, scFv 및 sdAb가 포함된다.
본 발명의 다중특이적 분자는 CD3에 특이적으로 결합하거나, 효과기(effector) 세포 상에서 표적, 예컨대 Fc 수용체에 추가로 결합할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 분자의 바람직한 예로는 이중특이적 분자가 포함된다. 용어 "이중특이적"은 하나의 분자 상에서 서로 상이한 2개의 에피토프에, 또는 둘 이상의 분자 상에서 서로 상이한 에피토프에 결합하는 능력을 의미한다. 이러한 이중특이성을 갖는 항체 또는 항원-결합 단편은 본 발명에 의해 포함된다. 본 발명의 이중특이적 분자는 CD3에 결합하고, CD3에 존재하지 않지만 또 다른 항원에 존재하는 에피토프에 결합한다. 더욱 상세하게, 이러한 이중특이적 분자는 (i) CD3 상의 에피토프(에피토프 1)에 결합하고, (ii) CD3 상의 에피토프 1과 상이한 에피토프(에피토프 2)에 결합하거나, CD3 이외의 항원 상의 에피토프(에피토프 3)에 결합한다.
예를 들어, BiTE로 대표되는 탠덤 scFv-형 이중특이적 분자에서, 제1 항체의 중쇄 가변 영역중의 항원-결합 부위 및 제1 항체의 경쇄 가변 영역중의 항원-결합 부위는 연결기를 경유하여, 또는 연결기 없이 직접적으로 연결되어 제1 폴리펩티드를 형성한다. 또한, 제2 항체의 중쇄 가변 영역중의 항원-결합 부위 및 제2 항체의 경쇄 가변 영역중의 항원-결합 부위는 연결기를 경유하여, 또는 연결기 없이 직접적으로 연결되어 제2 폴리펩티드를 형성한다. 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 연결기를 경유하여, 또는 연결기 없이 직접적으로 연결된다. 다르게는, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 추가적인 분자를 경유하여 연결될 수 있다.
디아바디-형 이중특이적 분자에서, 제1 항체의 중쇄 가변 영역중의 항원-결합 부위 및 제2 항체의 경쇄 가변 영역중의 항원-결합 부위는 연결기를 경유하여, 또는 연결기 없이 직접적으로 연결된다. 또한, 제1 항체의 경쇄 가변 영역중의 항원-결합 부위 및 제2 항체의 중쇄 가변 영역중의 항원-결합 부위는 연결기를 경유하여, 또는 연결기 없이 직접적으로 연결된다. 또한, 이중특이적 분자는 디아바디-형 이중특이적 분자의 추가의 이량체화에 의해 제조될 수 있다. 또한, 디아바디-형 이중특이적 분자는 Fc의 단일 쇄 또는 양쪽 쇄에 연결기를 경유하여 연결될 수 있다(디아바디-Fc-형 이중특이적 분자).
이중의 scFv-형 이중특이적 분자에서, 상이한 에피토프에 결합되는 2종의 scFv가 이량체의 Fc의 2개의 쇄에 연결기를 경유하여, 또는 연결기 없이 직접적으로 연결된다. 다르게는, 상이한 에피토프에 결합되는 2종의 scFv는 각각 CH 및 CL에 연결기를 경유하여 연결되고, 추가로 각각, 이량체의 Fc의 2개의 쇄에 연결기를 경유하여 연결된다.
IgG-형 이중특이적 분자에서, 상이한 에피토프에 결합되는 2개의 Fab는 이량체의 Fc의 2개의 쇄에 연결기를 경유하여, 또는 연결기 없이 직접적으로 연결된다.
다르게는, 본 발명의 이중특이적 분자는, 상이한 에피토프에 결합되는 Fab 및 scFv가 이량체의 Fc의 2개의 쇄에 연결기를 경유하여, 또는 연결기 없이 직접적으로 연결되는 이중특이적 항체일 수 있다. 다르게는, 본 발명의 이중특이적 분자는 제1 항체중의 Fab 및 제2 항체중의 scFv가 이량체의 Fc의 2개의 쇄에 연결기를 경유하여 연결되는 이중특이적 항체일 수 있다.
본 발명의 이중특이적 분자에 함유된 scFv 및 Fab는 바람직하게는 인간화된 항체 또는 인간 항체의 scFv 및 Fab이고, Fc는 바람직하게는 인간 항체의 Fc이다.
본 발명의 이중특이적 항체에 포함된 가변 영역에서, 아미노-말단으로부터, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 순서로 결합되거나, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 순서로 결합될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 임의적으로 두 가변 영역 사이에 연결기를 갖고, (임의적으로) 아미노-말단 측에 위치된 가변 영역의 아미노-말단에 글리신 잔기를 가질 수 있다. 본 발명의 탠덤 scFv-형의 이중특이적 항체는 임의적으로 카복실-말단 측에 위치된 가변 영역의 카복실-말단에 연결기, FLAG-태그, 및/또는 HIS-태그를 가질 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체의 바람직한 예로는 아미노-말단으로부터 중쇄 가변 영역, 제1 연결기, 경쇄 가변 영역, 제2 연결기, FLAG-태그, 및 His-태그의 순서로 결합된 이중특이적 항체가 포함된다.
연결기는 또한 단일 쇄 폴리펩티드 또는 단일 쇄 올리고펩티드, 또는 합성 합성 생성물, 예컨대 PEG, 뉴클레오티드, 당쇄, 및 화합물을 포함한다. 또한, 당분야에 공지된 임의의 연결기는 연결기가 2개의 폴리펩티드를 연결하기만 하면 특별한 제한없이 사용될 수 있다.
연결기의 길이는, 예를 들어, 펩티드 연결기의 경우 5 내지 30 아미노산이다. 이중특이적 분자가 복수개의 연결기를 함유하는 경우, 사용되는 모든 펩티드 연결기는 동일한 길이를 가질 수 있거나, 사용되는 펩티드 연결기는 상이한 길이를 가질 수 있다.
펩티드 연결기의 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 반복 단위이다. Gly 및 Ser 이외의 1개 이상의 아미노산 잔기가 부가될 수 있다.
(3-7) 인간화된 항-CD3 항체
하나의 양태에 따라서, 본 발명은 인간화된 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명의 인간화된 항체는 단지 상보성 결정 영역(CDR)만을 함유한 인간-유래된 항체[문헌 "Nature (1986) 321, 522-525"], 및 CDR 이식법에 의해 골격구조 영역의 CDR 서열 및 일부 아미노산 잔기에 이식된 인간 항체(국제 특허출원 공개공보 제WO1990/07861A1호)를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 중쇄 가변 영역은, 서열번호 26(도 24)으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRH1(GVTFNYYG), 및 서열번호 98(도 112)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRH2(IT Xaa Xaa GGRI)(여기서 첫 번째 Xaa 및 두 번째 Xaa는 각각 임의적인 천연 아미노산 잔기를 나타냄. 이하, 첫 번째 Xaa는 또한 X1로서 지칭되고, 두 번째 Xaa는 또한 X2로서 지칭됨), 및 서열번호 28(도 26)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRH3(TLDGRDGWVAY)을 보유한다.
또한 바람직하게는, 본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 경쇄 가변 영역은, 서열번호 29(도 27)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRL1(TGNIGSNY), 서열번호 99(도 113)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRL2(R Xaa D)(여기서 Xaa는 임의적인 천연 아미노산 잔기를 나타냄. 이하, CDRL2의 Xaa는 또한 X3로서 지칭됨), 및 서열번호 31(도 29)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRL3(QSYSSGFI)을 보유한다.
상기 언급된 CDRH2(ITX1X2GGRI)에서, 바람직하게는, X1은 A, E, G, H, I, L, T, V, R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, X2는 S이거나; X1은 N이고, X2는 E, R, F, Y, L, V, I, K 및 T로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 언급된 CDRL2(RX3D)에서, 바람직하게는, X3은 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 언급된 CDRH2(ITX1X2GGRI)에서, 더욱 바람직하게는, X1은 R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, X2는 S이다.
상기 언급된 CDRL2(RX3D)에서, 더욱 바람직하게는, X3은 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 이러한 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 중쇄 가변 영역의 바람직한 예는 서열번호 100(도 114)으로 표시되는 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
또한, 본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 경쇄 가변 영역의 바람직한 예는, 서열번호 101(도 115), 서열번호 102(도 116), 또는 서열번호 103(도 117)으로 표시되는 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 중쇄 가변 영역의 구체적인 바람직한 예는, 서열번호 26(도 24)으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRH1(GVTFNYYG), 서열번호 27(도 25)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRH2(ITNSGGRI), 및 서열번호 28(도 26)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRH3(TLDGRDGWVAY)을 보유하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 경쇄 가변 영역의 구체적인 바람직한 예는, 서열번호 29(도 27)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRL1(TGNIGSNY), 서열번호 30(도 28)으로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRL2(RDD), 및 서열번호 31(도 29)로 표시되는 아미노산 서열로 구성된 CDRL3(QSYSSGFI)을 보유하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 있어서, CDR의 위치 및 길이는 IMGT 정의에 따라 결정되었다[문헌 "Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77"].
본 발명의 중쇄 가변 영역의 구체적인 예는 서열번호 16의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 경쇄 가변 영역의 구체적인 예는 서열번호 17, 20 또는 23의 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 구체적인 바람직한 예로는,
서열번호 60의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 60의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 64의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64의 135번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 66의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 68의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 70의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 72의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 74의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 74의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 76의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 76의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 78의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 78의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 80의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 80의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 82의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 또는
서열번호 84의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 포함된다.
본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 구체적인 예로는, 항체 또는 항원-결합 단편이 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 연결기, 및 서열번호 17, 20 및 23중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 포함된다.
본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편에 포함된 가변 영역에서, 아미노-말단으로부터, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 순서로 결합될 수 있거나, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 순서로 결합될 수 있다. 가변 영역은 이들의 아미노-말단에 글리신 잔기를 포함할 수 있다. 연결기, FLAG-태그, 및/또는 HIS-태그는 가변 영역의 카복실-말단에 결합될 수 있다.
본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 구체적인 바람직한 예로는, 서열번호 19의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 서열번호 22의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 및 서열번호 25의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 포함된다.
본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 더욱 구체적인 바람직한 예로는,
서열번호 60(도 68)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7078) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 64(도 72)의 1번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7085) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 66(도 74)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7086) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 68(도 76)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7087) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 70(도 78)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7088) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 72(도 80)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7089) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 74(도 82)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7090) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 76(도 84)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7091) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 78(도 86)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7092) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 80(도 88)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7093) 또는 항체의 항원-결합 단편,
서열번호 82(도 90)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7094) 또는 항체의 항원-결합 단편, 및
서열번호 84(도 92)의 1번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체(클론 ID: C3E-7095) 또는 항체의 항원-결합 단편이 포함된다.
아미노-말단에서 중쇄 가변 영역, 연결기 및 경쇄 가변 영역 순서로 결합하고, 추가적으로 제2 연결기, FLAG-태그, 및 HIS-태그가 경쇄 가변 영역의 카복실-말단에 결합하는, 본 발명의 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 구체적인 바람직한 예로는,
서열번호 22의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 25의 2번째 내지 267번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 60의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 64의 2번째 내지 267번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 66의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 68의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 70의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 72의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 74의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 76의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 78의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 80의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
서열번호 82의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 또는
서열번호 84의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 상기-언급된(16) 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 포함된다.
본 발명의 항체 등은, 본 발명의 전술된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 등을 포함하는 분자일 수 있다.
본 발명의 항체 등은 CD3에 대한 결합 능력이 전술된 인간화된 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 돌연변이를 도입함으로서 최적화될 수 있는 항체일 수 있다. 돌연변이를 도입하기 위한 방법의 구체적인 예로는 오류발생이 쉬운(error-prone) PCR을 사용하는 랜덤 변이유발, NNK 라이브러리를 사용하는 부위-특이적(site-directed) 아미노산 변이유발, 구조 정보를 사용하는 부위-특이적 변이유발, 및 이들의 조합이 포함된다.
본 발명의 항체 등의 ADCC 및 CDC 활성은 항체의 효과기 활성을 감소시키기 위해 불변 영역의 치환에 의해 감소될 수 있다.
인간 CD3을 발현하는 정상 세포에서 세포독성을 방지하기 위해, 항체는 낮은 효과기 활성을 갖는 것이 요망된다. 효과기 활성은 항체 하위부류 사이에서 상이한 것으로 알려져 있다. 예를 들어, IgG4는 낮은 ADCC 및 CDC 활성을 갖고, IgG2는 CDC 활성을 갖지만 낮은 ADCC 활성을 갖는다. 이들 특징을 사용하여, IgG1의 불변 영역을 IgG2 또는 IgG4의 불변 영역으로 치환함으로써 ADCC 및 CDC 활성이 감소된 항체가 제조될 수 있다. 또한, IgG1의 불변 영역의 일부를 IgG2 또는 IgG4를 참고하여 치환함으로써 ADCC 및 CDC 활성이 감소된 IgG1 항체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 마잔 헤자레(Marjan Hezareh) 등의 문헌[Journal of Virology, 75 (24): 12161-12168 (2001)]은, IgG1의 234번째 및 235번째 류신 잔기[숫자는 카밧(Kabat) 등에 따른 EU 인덱스(index)에 기초함]를 알라닌 잔기로 치환함으로써 ADCC 및 CDC 활성이 감소됨을 보여준다.
(3-8) 동일한 부위에 결합하고 또한 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체
본 발명에 제공되는 항체 등과 "동일한 부위에 결합하고" "사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는" 항체는 또한 본 발명의 항체 등에 포함된다. 특정 항체의 경우와 "동일한 부위에 결합하는 항체"는 항체에 의해 인식되는 항원 분자 상의 부위에 결합하는 또 다른 항체를 의미한다. 제2 항체가 제1 항체에 의해 결합되는 항원 분자 상에서 부분적 펩티드 또는 부분적 3차원 구조에 결합한다면, 제1 및 제2 항체는 동일한 부위에 결합하는 것으로 판정된다.
다르게는, 특이적 결합 부위의 펩티드 서열 또는 3차원 구조가 결정되지 않을지라도, 제1 및 제2 항체는 제2 항체가 항원에 결합하기 위해 제1 항체와 경쟁함, 즉, 제2 항체가 항원으로의 제1 항체의 결합을 방해함을 확인함으로써 동일한 부위에 결합하는 것으로 판정된다.
제1 및 제2 항체가 동일한 부위에 결합하고 제1 항체가 본 발명의 항체의 하나의 양태의 효과적 특징, 예컨대 세포독성 활성을 가질 경우, 제2 항체는 또한 동일한 활성을 가질 가능성이 극히 높다.
이와 같이, 제2 항-CD3 항체가 제1 항-CD3 항체에 의해 결합되는 부위에 결합하고 제2 항-CD3 항체가 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합한다면, 제1 및 제2 항체가 CD3 단백질 상에서 동일한 부위에 결합하는 것으로서 판정될 수 있다. 인간 CD3 상에서 본 발명의 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 의해 결합되는 부위와 동일한 부위에 결합하고 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편은 또한 본 발명의 항체 등에 포함된다.
다르게는, 제2 항-CD3 항체가 CD3 단백질로의 결합에 대해 제1 항-CD3 항체와 경쟁하고 제2 항-CD3 항체가 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합함을 확인함으로써, 제1 및 제2 항-CD3 항체가 CD3 단백질 상에서 동일한 부위에 결합하는 것으로 판정될 수 있다. 인간 CD3으로의 결합에 대해 본 발명의 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 경쟁하고 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편 또한 본 발명의 항원 등에 포함된다.
항체 결합 부위는 숙련가에 의해 공지된 임의의 방법, 예컨대 면역검정을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 일련의 펩티드는 적절하게는 항원의 아미노산 서열을 그의 카복실-말단 또는 아미노-말단으로부터 순차적으로 분할한 다음, 항체의 반응성을 연구하여 인식 부위를 대략적으로 결정함으로써 제조될 수 있다. 이어서, 더 짧은 펩티드가 합성되고, 이들 펩티드에 대한 항체의 반응성을 연구하여 결합 부위를 결정할 수 있다. 항원 단편 펩티드는 유전자 재조합 또는 펩티드 합성과 같은 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 항체 등은 CD3의 3차원 구조를 구성하는 영역, 즉, Ig-유사 도메인을 인식하고 이에 결합한다. 항체에 대한 이러한 결합 부위(에피토프)는 X-선 구조 분석을 사용하여 항체에 인접한 항원 상의 아미노산 잔기를 식별함으로써 결정될 수 있다.
(3-9) 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 변이체
본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 변이체를 제공한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 변이체는 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 화학적 또는 생물학적 변형이 제공됨을 의미한다. 화학적 변이체로는, 예를 들어, 아미노산 골격에 화학 부분이 컨주게이트된 형태, 및 화학적으로 변형된 N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 쇄를 갖는 형태가 포함된다. 생물학적 변이체로는, 예를 들어, 번역후 변형(예를 들어, N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화, 아미노-말단 또는 카복실-말단 영역의 처리, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 또는 메티오닌의 산화)이 수행된 형태, 및 원핵 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로써 아미노-말단에 부가된 메티오닌 잔기를 함유하는 형태가 포함된다. 이러한 변이체의 의미에는 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 허용하도록 표식된 형태, 예를 들어, 효소-표식된 형태, 형광 표식된 형태, 또는 친화도-표식된 형태가 포함된다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 이러한 변이체는, 본 발명의 본래의 항체 또는 이의 본래의 항원-결합 단편의 안정성 및 혈액 보유능 개선, 항원성 저하, 및 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.
화학적 변이체에 함유된 화학 부분의 예로는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 및 폴리비닐 알코올이 포함된다.
생물학적 변이체의 예로는 효소 처리 또는 세포 처리에 의해 변형된 형태, 유전자 재조합에 의해 태그와 같은 다른 펩티드가 부가된 융합 형태, 및 내인성 및 외래성 당 쇄-변형 효소를 발현하는 숙주 세포로부터 제조된 형태가 포함된다.
이러한 변형은 항체 또는 이의 항원-결합 단편중의 임의적인 위치 또는 바람직한 위치에서 이루어질 수 있다. 다르게는, 동일하거나 상이한 변형이 하나 또는 둘 이상의 위치에서 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, "항체의 항원-결합 단편의 변이체"의 의미에는 "항체 변이체의 단편"이 포함된다.
예를 들어, 배양된 포유류 세포에 의해 생산된 항체의 중쇄는 카복시 말단에서 리신 잔기가 결핍된 것으로 알려져 있다[문헌 "Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)"]. 또한, 이러한 항체의 중쇄는 카복시 말단에서 2개의 아미노산 잔기(글리신 및 리신)가 결핍되고 그 대신 카복시 말단에 아미드화된 프롤린 잔기를 갖는 것으로 알려져 있다[문헌 "Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)"]. 더욱이, 항체의 중쇄 또는 경쇄에서 N(아미노)-말단 글루타민 또는 글루탐산 잔기는 항체의 제조 동안에 피로글루타밀화(pyroglutamylation)에 의해 변형되는 것으로 알려져 있고, 본 발명의 항체는 이러한 변형을 가질 수 있다(국제 특허출원 공개공보 제WO2013/147153A1호).
그러나, 이들 중쇄 서열에서의 결실 또는 이들 중쇄 또는 경쇄 서열에서의 변형은, 항원에 결합하는 항체의 능력 및 그의 효과기 기능(보체 활성화, 항체 의존성 세포독성 효과 등)에 그다지 영향을 주지 않는다. 이와 같이, 본 발명은 결실되거나 변형된 항체(이하 결실 변이체로 지칭됨)를 포함한다. 예로는 카복실-말단에서 1 또는 2개의 아미노산의 결실에 의해 중쇄로부터 유래된 결실 변이체, 결실 변이체의 아미드화 형태(예를 들어, 카복실-말단 부위에서 아미드화된 프롤린 잔기를 갖는 중쇄), 및 중쇄 또는 경쇄에 피로글루타밀화 아미노-말단 잔기를 갖는 항체가 포함된다. 그러나, 본 발명에 따른 항체 중쇄 및 경쇄의 카복실-말단에서의 결실 변이체는, 항원에 결합하는 능력을 적어도 어느 정도 보유하는 한, 상기 기재된 유형으로 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 항체에 존재하는 2개 이상의 쇄(예를 들어, 중쇄)는 전장 쇄(예를 들어, 중쇄) 및 상기 기재된 결실 변이체, 뿐만 아니라 이로부터 선택된 임의의 두 유형의 2개 이상의 쇄(예를 들어, 중쇄)의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 유형의 쇄(예를 들어, 중쇄)일 수 있다. 각각의 결실 변이체의 정량적 또는 분자 비는 본 발명에 따른 항체를 생산하는 배양된 포유류 세포 유형, 및 배양 조건에 의해 영향받을 수 있다. 예로는 본 발명에 따른 항체의 주요 성분으로서 2개의 중쇄 각각에서 1개의 카복실-말단 아미노산 잔기가 결실되는 경우가 포함된다. 본 발명에 있어서, "항체의 항원-결합 단편의 변이체"는 "항체의 변이체의 단편"을 포함함을 의미한다
본 발명의 항체의 항체 의존성 세포독성 활성은 항체에 결합된 당쇄의 변형(글리코실화, 탈푸코스화 등)을 조절함으로써 증진될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO99/54342A1호, 제WO00/61739A1호, 및 제WO02/31140A1호에 항체의 당쇄 변형을 조절하기 위한 기법이 공지되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체 및 항체의 항원-결합 단편은 또한 당쇄 변형되어 조절된 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 "결실" 및 "변이체", 및 이의 혼합물은 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"의 범주에 속한다. 또한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 "결실" 및 "변이체", 및 이의 혼합물은, (3-5) 및 (3-6)에 개시된 본 발명의 항원, 다중특이적 분자, 이중특이적 분자 등에 결합하는 분자에 포함된 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"의 범주에 속한다.
4. 항체의 생산
(4-1) 하이브리도마를 이용하는 방법
본 발명의 한 양태에 따라서, 항-CD3 항체-생산 세포는, 예를 들어, 코흘러(Kohler) 및 밀스타인(Milstein)의 방법[코흘러 및 밀스타인의 문헌 "Nature (1975) 256, p. 495-497"; 및 켄네트(Kennet, R.)의 문헌 "Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)"]에 따라 CD3 단백질에 의해 면역화된 동물의 비장으로부터 단리된다. 세포는 골수종 세포와 융합되어 하이브리도마를 확립한다. 단일클론성 항체는 이들 하이브리도마의 배양물로부터 수득될 수 있다.
(4-1-1) 항원의 제조
항-CD3 항체의 제조를 위한 항원은, 예를 들어, 천연형 또는 재조합 CD3 단백질(인간 CD3εγ 단일-쇄 항원)을 제조하는 방법에 따라 수득될 수 있다. 이와 같이 제조될 수 있는 항원의 예로는 CD3 단백질, CD3 단백질 단편, 및 추가로 임의적인 아미노산 서열을 포함하거나 담체가 부가된 이들의 유도체(이하, 총괄하여 "CD3"으로 지칭됨)가 포함된다.
천연형 CD3은, 예를 들어, 인간 조직-유래된 세포 또는 세포의 배양물로부터 정제되고 단리될 수 있다. 재조합 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원은 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 숙주 세포에 도입하고, 세포 배양물로부터 항원을 회수함으로써 제조될 수 있다. CD3 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자로부터의 시험관내 번역 시스템에서 무세포 단백질 합성에 의해 수득되는 CD3은 또한 본 발명의 "CD3 항원"에 포함된다.
(4-1-2) 항-CD3 단일클론성 항체의 생산
단일클론성 항체는 전형적으로 하기 단계를 통해 생산된다:
(a) 항원을 제조하는 단계,
(b) 항체-생산 세포를 제조하는 단계,
(c) 골수종 세포(이하, "골수종"으로 지칭됨)를 제조하는 단계,
(d) 항체-생산 세포를 골수종과 융합하는 단계,
(e) 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마 군을 선별하는 단계, 및
(f) 단일 세포 클론을 수득하는 단계(클로닝).
이러한 생산 방법은 (g) 하이브리도마를 배양하는 단계, 하이브리도마-이식 동물 등을 사육하는 단계, 및 (h) 필요하다면, 단일클론성 항체의 생물 활성 등을 분석 또는 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
이제, 단일클론성 항체를 제조하는 이러한 방법은 이들 단계를 참고하여 상세히 기재될 것이다. 그러나, 항체를 제조하는 방법은 이들 단계로 제한되지 않는다. 예를 들어, 비장 세포 및 골수종 이외의 항체-생산 세포가 사용될 수 있다.
(a) 항원을 제조하는 단계
본 발명의 CD3 단백질은 동물 조직(체액 포함), 조직으로부터 유래된 세포, 또는 세포의 배양물로부터의 정제 및 단리, 유전자 재조합, 무세포 단백질 합성, 화학적 합성 등에 의해 제조될 수 있다.
(b) 항체-생산 세포를 제조하는 단계
단계 (a)에서 수득된 항체는 보조제, 예컨대 완전 또는 불완전 프런드(Freund)의 보조제 또는 황산 알루미늄 칼륨과 혼합되고, 실험실 동물은 생성된 면역원에 의해 면역화된다. 당분야에 공지된 하이브리도마 제조 방법에 사용되는 임의의 실험실 동물은 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 및 말이 사용될 수 있다. 단리된 항체-생산 세포와 융합되는 골수종 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 면역화되는 동물은 바람직하게는 마우스 또는 래트이다.
실제로 사용되는 마우스 또는 래트의 계통은 특별히 제한되지 않는다. 마우스의 경우, 예를 들어, A, AKR, BALB/c, BALB/cAnNCrj, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, 또는 129가 사용될 수 있다. 래트의 경우, 예를 들어, 위스타(Wistar), 로우(Low), 루이스(Lewis), 스프라그-돌리(Sprague-Dawley), ACI, BN, 또는 피셔(Fischer)가 사용될 수 있다.
이들 마우스 및 래트는 실험실 동물 사육 판매업자, 예를 들어, 씨엘이에이 재팬 인코포레이티드(CLEA Japan, Inc.) 또는 찰스 리버 래보레이토리즈 재팬 인코포레이티드(Charles River Laboratories Japan, Inc.)로부터 입수가능하다.
이들 마우스 및 래트중, 이후 기재되는 골수종 세포와의 융합 화합성을 고려하여, 면역화되는 동물로서 BALB/c 마우스 계통 또는 위스타 및 로우 래트 계통이 특히 바람직하다.
또한, 인간 및 마우스 항원 사이의 상동성을 고려하여, 자기항체를 제거하는 생체 기작을 저하시킨 마우스, 즉, 자가면역 질환 마우스를 사용하는 것 또한 바람직하다.
이와 관련하여, 이들 마우스 또는 래트는 면역화 시점에 5 내지 12 주령인 것이 바람직하고, 6 내지 8 주령인 것이 더욱 바람직하다.
동물은 와이어(Weir, D. M.) 등의 문헌[Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987)], 또는 카밧(Kabat, E. A.) 및 메이어(Mayer, M. M.)의 문헌[Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964)]의 방법을 사용하여 CD3 단백질에 의해 면역화될 수 있다.
항체 역가를 결정하는 방법의 예로는 RIA 및 ELISA와 같은 면역검정이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.
면역화된 동물로부터 분리된 비장 세포 또는 림프구로부터 유래된 항체-생산 세포는 당분야에 공지된 방법, 예를 들어, 코흘러(Kohler) 등의 문헌[Nature (1975) 256, 495]; 코흘러 등의 문헌[Eur . J. Immnol . (1977) 6, 511]; 밀스타인(Milstein) 등의 문헌[Nature (1977), 266, 550]; 또는 왈쉬(Walsh) 등의 문헌[Nature (1977) 266, 495]에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
비장 세포의 경우, 비장을 세절하고, 세포를 스테인레스-스틸 메쉬를 통해 여과하고, 이어서 생성된 세포를 이글(Eagle)의 최소 필수 배지(MEM)에 부유시켜 항체-생산 세포를 분리하는 일반적 방법이 채택된다.
(c) 골수종을 제조하는 단계
세포 융합에 사용되는 골수종 세포는 특별히 제한되지 않고, 사용을 위해 당분야에 공지된 세포주로부터 선택될 수 있다. 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택하는데 있어서의 편리함을 고려하여, 예를 들어, 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 전달효소(HGPRT)-결손주, 즉, 마우스-유래된 X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, 또는 BU.1, 래트-유래된 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3), 또는 인간-유래된 U266AR(SKO-007), GM1500-GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2), 또는 8226AR/NIP4-1(NP41)(이들의 선별 절차는 이미 확립됨)을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 HGPRT-결손주는, 예를 들어, 미국 종균 협회(ATCC: American Type Culture Collection)로부터 입수가능하다.
이들 세포주는 적절한 배지, 예를 들어, 8-아자구아닌 배지[글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타미신(gentamicin), 및 소 태아 혈청(이하, "FCS"로 지칭됨)가 보충되고 추가로 8-아자구아닌이 보충된 RPMI-1640 배지], 이스코브(Iscove)의 변형된 둘베코(Dulbecco)의 배지(이하, "IMDM"으로 지칭됨), 또는 둘베코의 변형된 이글(Eagle) 배지(이하, "DMEM"으로 지칭됨)에서 계대배양되고, 세포 융합의 3 내지 4 일 전에 정상 배지[예를 들어, 10% FCS가 함유된 ASF104 배지(아지노모토 캄파니 인코포레이티드: Ajinomoto Co., Inc.) 제작]에서 계대배양되어, 세포 융합일에 2 × 107 이상의 세포 수를 확보한다.
(d) 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합하는 단계
항체-생산 세포는, 당분야에 공지된 임의의 방법[예를 들어, 와이어(Weir, D.M.) 등의 문헌 "Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987)", 카밧(Kabat, E. A.) 및 메이어(Mayer, M. M.) 등의 문헌 "Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964)"]에 따라서, 세포 생존율을 극도로 저하시키는 것을 방지하는 조건하에 골수종 세포와 융합될 수 있다. 예를 들어, 항체-생산 세포를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체의 고농도 용액중에서 골수종 세포와 혼합하는 화학적 방법, 또는 전기 자극을 이용하는 물리적 방법이 사용될 수 있다.
(e) 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마 군을 선별하는 단계
세포 융합에 의해 수득된 하이브리도마를 선택하는데 사용되는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 선택 방법[코흘러(Kohler) 등의 문헌 "Nature (1975) 256, 495"; 밀스타인(Milstein) 등의 문헌 "Nature (1977) 266, 550"]이 전형적으로 사용된다. 이러한 방법은 아미노프테린의 존재하에 생존할 수 없는 HGPRT-결손 골수종 세포주를 사용하여 하이브리도마를 수득하는데 효과적이다. 구체적으로, 융합되지 않은 세포 및 하이브리도마는, 아미노프테린 내성 하이브리도마가 선택적으로 생존하여 성장할 수 있도록 허용하는 HAT 배지에서 배양될 수 있다.
(f) 단일-세포 클론을 수득하는 단계(클로닝)
하이브리도마는 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 연질 아가로스, 또는 한계 희석법[예를 들어, 바바라(Barbara, B.M.) 및 스탠리(Stanley, M.S.)의 문헌 "Selected Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Company, San Francisco (1980)"]을 사용하여 클로닝될 수 있다. 한계 희석법이 바람직하다.
(g) 하이브리도마를 배양하는 단계 및 하이브리도마-이식된 동물을 사육하는 단계
선택된 하이브리도마를 배양하여 단일클론성 항체가 생산될 수 있다. 바람직하게는, 원하는 하이브리도마를 클로닝하고, 이어서 항체를 생산한다.
이러한 하이브리도마에 의해 생산된 단일클론성 항체는 하이브리도마의 배양물로부터 회수될 수 있다. 또한, 재조합 항체는 단일클론성 항체 유전자가 도입된 세포의 배양물로부터 회수될 수 있다. 다르게는, 하이브리도마는 동일한 균주의 마우스(예를 들어, 상기 기재된 BALB/cAnNCrj) 또는 Nu/Nu 마우스내로 복강내 주사되어 성장될 수 있다. 이어서, 단일클론성 항체는 이들의 복수로부터 회수될 수 있다.
(h) 단일클론성 항체의 생물 활성을 분석하거나 판정하는 단계
목적에 따라서 각종 생물 시험이 선택되고 적용될 수 있다.
(4-2) 세포 면역화 방법
상기 기재된 하이브리도마 방법을 사용하여 항-CD3 항체를 제조하기 위해 천연형 CD3을 발현하는 세포 또는 재조합 CD3 또는 그의 단편을 발현하는 세포가 면역원으로서 사용될 수 있다.
천연형 CD3을 발현하는 세포의 예로는 인간 흉선 세포 및 T 림프구가 포함된다. 이들 CD3-발현 세포는 1회의 면역화에 1 × 105 내지 1 × 109개, 바람직하게는 1 × 106 내지 1 × 108개, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2 × 107 개, 더 더욱 바람직하게는 1 × 107개 세포의 양으로 사용된다. 면역화에 사용되는 세포의 수는 CD3의 발현 수준에 따라서 변경될 수 있다. 면역원은 일반적으로 복강내로 투여되지만, 피내 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이브리도마는 섹션 (4-1-2)에 기재된 방법을 적용함으로써 제조될 수 있다.
(4-3) DNA 면역화 방법
본 발명의 항-CD3 항체는 또한 DNA 면역화 방법의 사용에 의해 수득될 수 있다. 이러한 방법은 개별 동물, 예를 들어, 마우스 또는 래트에 항원 발현 플라스미드를 형질도입하고, 개별 동물에서 항원을 발현시킴으로써 항원에 대한 면역을 유도함을 포함한다. 형질도입 수법의 예로는 플라스미드를 근육내로 직접 주사하는 방법, 형질도입 시약, 예컨대 리포솜 또는 폴리에틸렌이민을 정맥내로 주사하는 방법, 바이러스 벡터를 사용하는 수법, 플라스미드-부착된 금 입자를 유전자 건(gun)에 의해 주사하는 수법, 및 다량의 플라스미드 용액을 정맥내로 신속히 주사하는 수력학적 방법이 포함된다.
이렇게 수득되는 래트 항-인간 CD3 항체의 실제 예는 C3-147이다. C3-147의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 9(도 17)에 제시된다. C3-147의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 7(도 15)에 제시된다.
(4-4) 유전자 재조합
본 발명의 항체를 제조하기 위해, 그의 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드(중쇄 뉴클레오티드) 및 그의 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드(경쇄 뉴클레오티드), 또는 중쇄 뉴클레오티드의 삽입물을 갖는 벡터 및 경쇄 뉴클레오티드의 삽입물을 갖는 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 세포를 배양하고, 항체를 배양물로부터 회수한다. 중쇄 뉴클레오티드 및 경쇄 뉴클레오티드는 하나의 벡터에 삽입될 수 있다.
원핵 또는 진핵 세포가 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 숙주 진핵 세포가 사용될 경우, 동물 세포, 식물 세포, 또는 진핵 미생물이 사용될 수 있다.
동물 세포의 예로는 포유류-유래된 세포, 즉, 인간 배아 신장 세포 HEK293F 세포[수베디(Subedi GP) 등의 문헌 "J Vis Exp. (2015) 106"], 원숭이 신장-유래된 COS 세포[글루츠만(Gluzman, Y.)의 문헌 "Cell (1981), 23, 175-182, ATCC CRL-1650"], 마우스 섬유아세포 NIH3T3(ATCC No. CRL-1658), 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포, ATCC CCL-61), 이의 이수소엽산 환원효소-결손주[CHOdhfr-; 우를라우브(Urlaub, G.) 및 채신(Chasin, L.A.)의 문헌 "PNAS (1980), 77, 4126-4220"], 닭과 같은 조류 유래된 세포, 및 곤충 유래된 세포가 포함된다.
또한, 당쇄 구조의 변형에 의해 항체의 생물 활성이 증진되도록 변형된 세포가 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 결합된 복합형 N-글리코시드-연결된 당쇄중 당쇄 환원 말단에서 N-아세틸글루코사민이 결합되지 않은 푸코스를 갖는 당쇄의 비율이 20% 이상이도록 변형된 CHO 세포는, ADCC 활성 또는 CDC 활성이 증진된 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다(국제 특허출원 공개공보 제WO02/31140A1호).
진핵 미생물의 예로는 효모가 포함된다. 원핵 세포의 예로는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis)가 포함된다.
본 발명의 항체(각각의 동물로부터 유래된 단일클론성 항체, 래트 항체, 마우스 항체, 키메라화 항체, 인간화된 항체, 인간 항체 등)의 분비를 위한 신호 펩티드는 본 발명의 항체와 동일한 종, 동일한 유형, 또는 동일한 아형의 항체의 분비 신호, 또는 본 발명의 항체 자체의 분비 신호로 제한되지 않는다. 상이한 유형 또는 아형의 항체의 임의의 분비 신호, 또는 상이한 진핵 종 또는 원핵 종으로부터 유래된 단백질의 임의의 분비 신호가 선택되고 사용될 수 있다.
신호 펩티드를 함유한 분비된 항체 등은 또한 본 발명의 항체 등 또는 본 발명의 분자에 포함된다.
(4-5) 인간화된 항체를 설계하고 제조하는 방법
인간화된 항체의 예로는, 제한되지 않지만, CDR이 비-인간 동물 항체의 CDR에 의해 대체된 인간-유래된 항체[문헌 "Nature (1986), 321, p. 522-525" 참조], CDR 서열 및 골격구조 영역의 일부 아미노산 잔기에 CDR 이식법에 의해 이식된 인간 항체(국제 특허출원 공개공보 제WO90/07861A1호 및 미국 특허 공고공보 제6,972,323B2호 참조), 및 임의의 이들 인간화된 항체에서 1개 이상의 인간 항체 아미노산이 1개 이상의 비-인간 동물 항체-유래된 아미노산에 의해 대체된 항체가 포함된다.
(4-6) 인간 항체를 제조하는 방법
본 발명의 항체의 다른 예로는 인간 항체가 포함된다. 인간 항-CD3 항체는 인간-유래된 항체의 아미노산 서열로 구성된 항-CD3 항체를 의미한다. 인간 항-CD3 항체는 인간 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 인간 게놈 DNA 단편을 수반한 인간 항체-생산 마우스를 사용하는 방법[예를 들어, 도미츠카(Tomizuka, K.) 등의 문헌 "Nature Genetics (1997) 16, 133-143"; 구로이와(Kuroiwa, Y.) 등의 문헌 "Nuc. Acids Res. (1998) 26, 3447-3448"; 요시다(Yoshida, H.) 등의 문헌 "Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999."; 도미츠카(Tomizuka, K.) 등의 문헌 "Proc . Natl . Acad . Sci . USA (2000) 97, 722-727" 참조]에 의해 수득될 수 있다.
구체적으로, 인간 항체-생산 동물은 비-인간 포유류의 내재성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌를 파괴하고, 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌를, 예를 들어, 효모 인공 염색체(YAC: yeast artificial chromosome) 벡터를 경유하여 도입함으로써 제조될 수 있다. 다르게는, 진핵 세포는 각각 이러한 인간 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA에 의해, 바람직하게는 cDNA를 포함하는 벡터에 의해 유전자 재조합 기법을 통해 형질전환될 수 있다. 재조합 인간 단일클론성 항체를 생산하는 형질전환된 세포가 배양될 수 있다. 이러한 항체는 배양 상청액으로부터 수득될 수 있다.
이와 관련하여, 예를 들어, 진핵 세포, 바람직하게는 HEK293F 세포 또는 CHO 세포와 같은 포유류 세포가 숙주로서 사용될 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리로부터 선택된 파아지 디스플레이(phage display)-유래된 인간 항체를 수득하는 방법이 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 인간 항체의 가변 영역이 파아지 표면 상에서 scFv로서 발현되도록 허용하고, 항원에 결합하는 파아지를 선택하는 파아지 디스플레이 방법이 사용될 수 있다. 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 결정하기 위해 항원에 결합하는 능력에 기초하여 선택된 파아지가 유전자 분석될 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 결정될 경우, 이러한 서열을 갖는 발현 벡터가 제조되고 적합한 숙주로 도입되어 이들이 인간 항체를 발현할 수 있도록 한다(국제 특허출원 공개공보 제WO92/01047A1호, 제WO92/20791A1호, 제WO93/06213A1호, 제WO93/11236A1호, 제WO93/19172A1호, 제WO95/01438A1호, 제WO95/15388A1호, 문헌 "Annu. Rev. Immunol (1994) 12, 433-455").
(4-7) 항체의 항원-결합 단편을 생산하는 방법
scFv를 제조하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 공고공보 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,091,513호, 및 제5,455,030호 참조). 이러한 scFv에서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 이들이 컨주게이트, 바람직하게는 폴리펩티드 연결기를 형성하는 것을 방지하는 연결기를 경유하여 연결된다[허스턴(Huston, J.S.) 등의 문헌 "PNAS (1988), 85, 5879-5883"]. scFv중의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 동일한 항체로부터 유래될 수 있거나 상이한 항체로부터 유래될 수 있다.
예를 들어, 5 내지 30개의 잔기로 구성된 임의적인 단일 쇄 펩티드는 이들 가변 영역을 연결하는 폴리펩티드 연결기로서 사용된다.
항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA 및 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA의 서열중 scFv-인코딩 DNA를 수득하기 위해, 전체 또는 원하는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 부분 각각을 주형으로 하고 주형의 양단을 규정하는 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. 후속적으로, 폴리펩티드 연결기 부분을 코딩하는 DNA를 DNA의 양단을 규정하는 프라이머 쌍과 함께 증폭시켜, 생성된 단편은 그의 단부에서 중쇄 및 경쇄 DNA에 연결될 수 있다. 다르게는, 전체 scFv 영역을 코딩하는 DNA는 전합성(net synthesis)에 의해 수득될 수 있다.
scFv-인코딩 DNA를 사용하여, 일상적 방법에 따라서, DNA를 함유하는 발현 벡터 및 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제조할 수 있다. 또한, 숙주 세포를 배양하고, 일상적 방법을 사용하여 배양물로부터 scFv를 회수할 수 있다.
또한, 임의의 다른 항체의 항원-결합 단편을 수득하기 위해, 상기 기재된 방법에 따라서 항원-결합 단편을 코딩하는 유전자가 수득되고, 세포에 도입된다. 목적하는 항원-결합 단편은 세포의 배양물로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 항체 등은 항원에 대한 그의 친화도를 증진시키기 위해 다량화될 수 있다. 이러한 경우, 동일한 유형의 항체가 다량화될 수 있거나, 각각, 동일한 항원의 복수개의 에피토프를 인식하는 복수개의 항체가 다량화될 수 있다. 이들 항체를 다량화할 수 있는 방법의 예로는 2개의 scFv의 IgG CH3 도메인으로의 결합, 이들의 스트렙타비딘(streptavidin)으로의 결합, 및 나선-회전-나선 모티프(helix-turn-helix motif)의 도입이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체 등은 아미노산 서열이 상이한 복수 종의 항-CD3 항체의 혼합물, 즉, 다중클론성 항체일 수 있다. 다중클론성 항체의 예로는 전체적으로 또는 부분적으로 상이한 CDR 세트를 갖는 다수 종의 항체의 혼합물을 포함할 수 있다. 이러한 다중클론성 항체는 혼합된-배양된 상이한 항체-생산 세포의 배양으로부터 수득될 수 있다(국제 특허출원 공개공보 제WO2004/061104A1호). 다르게는, 별도로 제조된 항체가 혼합될 수 있다. 다중클론성 항체의 하나의 양태인 항혈청은 표준 방법에 따라서 동물을 원하는 항원으로 면역화시키고 동물로부터 혈청을 회수함으로써 제조될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 다양한 분자와 컨주게이트한 항체가 또한 항체의 변이체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 항체 등은 연결기를 경유하여 다른 분자와 함께 이들 항체에 의해 형성되는 임의의 컨주게이트일 수 있다(면역컨주게이트). 항체가 방사성 물질 또는 약리 작용을 갖는 화합물(약물)과 컨주게이트된 항체-약물 복합체는 ADC(항체-약물 컨주게이트)를 포함할 수 있다[문헌 "Methods Mol Biol. (2013) 1045: 1-27"].
본 발명의 항체 등은 다른 기능성 폴리펩티드에 연결된 임의의 항체일 수 있다. 이러한 항체-펩티드 복합체의 예는 항체 및 알부민-결합 폴리펩티드의 복합체이다[문헌 "Protein Eng Des Sel. (2012) (2): 81-8"].
(4-8) 항체 및 항체의 항원-결합 단편의 정제
생성된 항체 및 항체의 항원-결합 단편은 항체 등 이외의 물질을 함유하지 않도록 균질해질 때까지 정제될 수 있다. 항체 및 항체의 항원-결합 단편의 분리 및 정제를 위해 통상의 단백질 분리 및 정제 방법이 사용될 수 있다.
항체는 적절히 선택되거나 조합된 수법, 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 및 등전점 전기영동에 의해 분리 및 정제될 수 있다.
분리 및 정제 방법은 바람직하게는, 예를 들어, His 태그 또는 FLAG 태그를 코딩하는 DNA 서열을 항체 가변 영역의 카복실-말단에 첨가하여 사용함으로써 발현 벡터를 제조하고, 이러한 벡터로 세포를 형질전환시키고, 이어서 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 발현하는 세포를 배양하고, 배양 완료 후 배양 상청액을 추출한 후, 금속(예를 들어, Ni 또는 Co) 친화도 크로마토그래피, 항-FLAG 태그 항체 칼럼, 겔 여과, 또는 이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 정제함으로써 수행된다.
His 태그 또는 FLAG 태그와 같은 태그를 코딩하는 아미노산 서열을 함유하는 발현된 항체 및 항체의 항원-결합 단편은 또한 본 발명의 항원 등 또는 본 발명의 분자에 포함된다.
(4-9) 다중특이적 분자 및 이중특이적 분자
본 발명의 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자를 생산하는 방법의 예로는 발현 플라스미드를 숙주 세포에 도입하여 일시적 발현을 일으키는 방법, 숙주 세포에 플라스미드를 도입한 다음 약제 선택에 의해 안정적으로 발현하는 세포주를 선택하여 영구적 발현을 일으키는 방법, 무세포 합성을 포함하는 방법, 및 상기 기재된 임의의 방법에 의해 항체 또는 항원-결합 단편을 제조한 다음, 합성 펩티드 연결기를 사용하여 이들 항체 또는 단편을 화학적으로 연결시키는 방법이 포함된다.
항체 가변 영역을 사용하여 이중특이적 분자를 제조함에 있어서, 그 예로는 펩티드 연결기를 경유하여 2개의 단일-쇄 항체(scFv)를 연결하는 방법(탠덤 scFv), 특이성이 상이한 2개의 항체의 도메인을 교차-짝형성(cross-pairing)하고 비공유 결합에 의해 이량체를 형성하는 방법(디아바디), 특이성이 상이한 2개의 항체의 도메인을 교차-짝형성하고 단일 쇄를 형성하는 방법(단일-쇄 디아바디), 및 단일-쇄 디아바디를 제조한 다음 비공유 결합에 의해 이량체를 형성하는 방법(TandAb, 미국 특허 공고공보 제7,129,330B2호)이 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 또는 항원 등의 변이체를 코딩하는 유전자, 이러한 유전자의 삽입물을 갖는 재조합 벡터, 이러한 유전자 또는 벡터가 형질도입된 세포, 및 본 발명의 항체를 생산하는 세포를 제공한다.
5. 약학 조성물
본 발명은 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체, 및/또는 이들중 임의의 것을 포함하는 본 발명의 분자, 예를 들어 다중특이적 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 질환의 치료 및/또는 예방으로는, 질환의 개시의 예방, 이의 악화 또는 진행의 억제 또는 저해, 질환으로 고통받는 개체에 의해 나타나는 하나 또는 둘 이상의 증상의 경감, 이의 악화 또는 진행의 억제 또는 차도, 및 2차성 질환의 치료 또는 예방 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다. 분자의 경우, 질환의 예로는 암이 포함된다.
본 발명의 약학 조성물은 치료 또는 예방 효과량의 항-CD3 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 비히클(vehicle), 가용화제, 유화제, 보존제, 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다.
"치료 또는 예방 효과량"은 특정 투여형 및 투여 경로에 의해 특정 질환에 대한 치료 또는 예방 효과를 갖는 양을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은 조성물 또는 이에 포함된 항체(이하, "약학 물질"로 지칭됨)의 pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 또는 안정성, 용해성, 서방성, 흡수성, 투과성, 투여형, 강도, 특성, 형상 등을 변화시키거나, 유지하거나, 보유하기 위한 물질을 포함할 수 있다. 약학 물질은, 이러한 물질이 약리학적으로 허용가능하기만 하면, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 비-독성 또는 저 독성은 이들 약학 물질에 의해 소유되는 바람직한 특성이다.
약학 물질의 예로는 다음이 포함되나 이로 제한되지 않는다: 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 및 리신과 같은 아미노산; 항미생물제; 아스코르브산, 황산 나트륨, 및 중아황산 나트륨과 같은 항산화제; 인산염, 시트르산염, 또는 붕산염 버퍼, 중탄산 나트륨, 및 트리스(Tris)-HCl 용액과 같은 완충제; 만니톨 및 글리신과 같은 충전제; 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 킬레이트제; 카페인, 폴리비닐피롤리돈, β-사이클로덱스트린, 및 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린과 같은 착화제; 글루코스, 만노스, 및 덱스트린과 같은 증량제; 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스, 및 덱스트린과 같은 탄수화물; 착색제; 향미제; 희석제; 유화제; 폴리비닐피롤리딘과 같은 친수성 중합체; 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 대이온; 염화 벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살(thimerosal), 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 및 과산화수소와 같은 방부제; 글리세린, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 용매; 만니톨 및 소르비톨과 같은 당 알코올; 현탁제; PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 및 콜레스테롤과 같은 계면활성제; 수크로스 및 소르비톨과 같은 안정성 증강제; 염화 나트륨, 염화 칼륨, 만니톨, 및 소르비톨과 같은 탄성 증강제; 수송제; 희석제; 부형제; 및 약학 첨가제.
첨가되는 이들 약학 물질의 양은 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체, 또는 분자, 예컨대 다중특이적 분자의 중량에 대하여 0.001 내지 1000배, 바람직하게는 0.01 내지 100배, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10배이다.
리포솜에 캡슐화된 본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체, 또는 분자, 예컨대 다중특이적 분자를 포함하는 면역리포솜, 또는 리포솜과 컨주게이트된 항체를 비롯한 변형된 항체 형태를 포함하는 약학 조성물(미국 특허 공고공보 제6,214,388호 등)은 또한 본 발명의 약학 조성물에 포함된다.
부형제 또는 담체는, 이들이 통상적으로 주사용수, 생리식염수, 인공 뇌척수액, 및 경구 또는 비경구 투여를 위한 기타 제제에 사용되는 액체 또는 고체 물질이기만 하면, 특별히 제한되지 않는다. 생리식염수의 예로는 중성 생리식염수 및 혈청-알부민-함유 생리식염수가 포함된다.
완충제의 예로는 약학 조성물의 최종 pH가 7.0 내지 8.5이도록 조정하는 트리스 버퍼, 최종 pH가 4.0 내지 5.5이도록 조정하는 아세트산염 버퍼, 최종 pH가 5.0 내지 8.0이도록 조정하는 시트르산염 버퍼, 및 최종 pH가 5.0 내지 8.0이도록 조정하는 히스티딘 버퍼가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 고체, 액체, 또는 현탁액이다. 본 발명의 약학 조성물의 또 다른 예는 동결-건조된 제제이다. 동결-건조된 제제는 수크로스와 같은 부형제를 사용하여 형성될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 위한 투여 경로는 경장(enteral) 투여, 국소 투여, 또는 비경구 투여일 수 있고, 바람직하게는 대상으로 하는 질환에 따라 선택된다. 구체적인 예로는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 골내 투여, 및 관절내 투여가 포함된다.
약학 조성물의 조성은 투여 방법, CD3 단백질에 대한 항체의 결합 친화도 등에 기초하여 결정될 수 있다.
본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체, 또는 분자, 예컨대 다중특이적 분자의 투여량은 개체의 종, 질환의 종류, 증후, 성별, 연령, 기존의 증상, CD3 단백질에 대한 항체의 결합 친화도, 또는 그의 생물 활성, 및 기타 요인에 기초하여 결정될 수 있다. 통상적으로 0.01 내지 1000 mg/kg, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 투여량은 180 일 동안 1 일 1회, 1 일 2회 또는 3회 이상 투여될 수 있다.
약학 조성물을 위한 형태의 예로는 주사제(동결-건조된 제제 및 점적제 포함), 좌제, 경비형(transnasal) 흡수 제제, 경피형 흡수 제제, 설하 제형, 캡슐, 정제, 연고, 과립, 에어로졸, 환제, 분말, 현탁제, 유화제, 점안제, 및 생체 이식 제형이 포함된다.
본 발명의 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 항체 또는 항원-결합 단편의 변이체, 및/또는 이를 포함하는 본 발명의 분자, 예컨대 다중특이적 분자(이하, "항-CD3 항체 등"으로서 지칭됨)는 또 다른 약제와 조합하여 사용될 수 있다. 항-CD3 항체 등, 또는 항-CD3 항체 등을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물은 나머지 약제, 즉, 항-CD3 항체 등 이외의 약제를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물과 동시에 또는 별도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-CD3 항체 등을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물은 나머지 약제의 투여 후에 투여될 수 있거나, 나머지 약제는 항-CD3 항체 등을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물을 투여한 후에 투여될 수 있다. 다르게는, 항-CD3 항체 등을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물 및 나머지 약제는 동시에 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서, 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제가 둘 다 단일 약학 조성물중에 활성 성분으로서 함유된 경우 및 이들 활성 성분이 복수개의 약학 조성물에 분리되어 함유된 경우는 둘 다 항-CD3 항체 등 및 다른 약제를 포함하는 약학 조성물"의 범주에 포함된다. 본 발명에 있어서, "약학 조성물"은 "항-CD3 항체 등이 다른 약제와 함께 투여되는 약학 조성물"과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 있어서, 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제에 대해 사용되는 "조합하여 투여되는"이라는 문구는 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제가 특정 기간 이내에 수여자의 체내에 도입됨을 의미한다. 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제를 함유하는 단일 제제가 투여되거나, 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제는 별도로 제형화되어 별도의 제제로서 투여될 수 있다. 별도의 제제의 경우, 투여 시기는 특별히 제한되지 않고, 제제는 동시에 투여되거나 상이한 시점 또는 상이한 날짜에 교대 방식으로 투여될 수 있다. 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제가 상이한 시간 또는 상이한 날짜에 별도로 투여되는 경우, 투여의 순서는 특별히 제한되지 않는다. 통상적으로 별도의 제제는 이들 개개의 투여 방법에 따라 투여되므로, 투여 빈도는 동일하거나 상이할 수 있다. 추가로, 별도의 제제는 동일한 투여 방법(투여 경로)으로 투여되거나 상이한 투여 방법(투여 경로)으로 투여될 수 있다. 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제가 동시에 체내에 존재할 필요는 없고, 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제가 일정 기간 동안(예를 들어, 1 개월, 바람직하게는 1 주, 더욱 바람직하게는 수 일, 더욱 바람직하게는 1 일 동안) 체내에 도입되면 충분하다. 다르게는, 활성 성분중 하나가 투여될 경우, 나머지 활성 성분은 신체로부터 이미 소실될 수도 있다.
"항-CD3 항체 등이 나머지 약제와 조합되어 투여되는 약학 조성물"에 대한 투여 형태의 예로는 1) 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제를 함유한 단일 제제의 투여, 2) 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제를 별도로 제형화함으로써 수득된 2종의 제제의 동일한 투여 경로를 통한 동시적인 투여, 3) 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제를 별도로 제형화함으로써 수득된 2종의 제제의 동일한 투여 경로를 통한 시간차를 둔 투여, 4) 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제를 별도로 제형화함으로써 수득된 2종의 제제의 상이한 투여 경로를 통한 동시적인 투여, 및 5) 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제를 별도로 제형화함으로써 수득된 2종의 제제의 상이한 투여 경로를 통한 시간차를 둔 투여가 포함된다. "항-CD3 항체 등이 나머지 약제와 조합하여 투여되는 약학 조성물"의 투여량, 투여 간격, 투여 형태, 제제 등은 항-CD3 항체 등을 포함하는 약학 조성물에 따라 달라지지만, 제한되지 않는다.
2종의 상이한 제제로 제형화된 약학 조성물은 이들 제제를 함유하는 키트의 형태로 존재할 수 있다.
본 발명에 있어서, 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제의 "조합"은 항-CD3 항체 등 및 나머지 약제가 "조합하여 투여됨"을 의미한다.
추가적인 약제가 또한 본 발명의 약학 조성물과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 CD3-관련 질환을 치료하거나 예방하는 방법, 이러한 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학 조성물을 제조하는데 있어서의 본 발명의 항체의 용도, 및 이러한 질환을 치료 또는 예방하는데 있어서의 본 발명의 항체의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항체를 포함하는 치료 또는 예방용 키트를 포함한다.
[실시예]
본 발명은 이제 실시예를 참고하여 더욱 상세히 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예로 제한되지 않는다. 아래의 실시예에서 유전자 조작과 관련된 절차는, 달리 명시되지 않는 한, 문헌[Molecular Cloning (Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 방법에 따라서, 또는 시판되는 시약 또는 키트를 지시 매뉴얼에 따라 사용하여 수행된다.
( 실시예 1) 래트 항-인간 CD3 항체의 제조
1)-1 인간 CD3εδ 발현 벡터의 구축
게이트웨이 벡터 전환 시스템(Gateway Vector Conversion System)[써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드(Thermo Fisher Scientific Inc.)]을 사용하여 목표(destination) 벡터로서 조작된 대조용 벡터 pcDNA3.1-DEST를 제조하였다. 도 1(서열번호 1)에 제시된 인간 CD3ε 단백질(NCBI 기준 서열: NP_000724.1)을 코딩하는 cDNA를 시노 바이올로지칼 인코포레이티드(Sino Biological Inc.)로부터 구매하고, 게이트웨이 LR 클로나아제(Clonase) 효소 믹스(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에 의해 pcDNA3.1-DEST 벡터에서 클로닝하여 hCD3ε-pcDNA3.1을 구축하였다. 인간 T 세포-유래된 cDNA를 주형으로 하여 당분야에 공지된 방법에 따라서 PCR에 의해 도 2(서열번호 2)에 제시된 인간 CD3δ 단백질(NP_000723.1)을 코딩하는 cDNA를 증폭시키고, pcDNA3.1(+)(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에서 클로닝하여 발현 벡터 hCD3δ-pcDNA3.1을 구축하였다. 각각의 발현 벡터의 대규모 제조를 위해, 엔도프리 플라스미드 기가 키트(Endofree Plasmid Giga Kit)[퀴아겐 엔 브이(Qiagen N.V.)]를 사용하였다.
1)-2 면역화
면역화를 위해, WKY/Izm 암컷 래트[재팬 에스엘씨 인코포레이티드(Japan SLC, Inc.)]를 사용하였다. 우선, 각각의 래트의 양쪽 하퇴부를 히알루로니다제(hyaluronidase)[시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corp.)]로 전처리하였다. 이어서, 실시예 1)-1에서 제조된 hCD3ε-pcDNA3.1 및 hCD3δ-pcDNA3.1 발현 벡터를 이들 부위에 근육내로 주사하였다. 후속적으로, ECM830(BTX) 및 2-바늘 전극을 사용하여 이들 부위의 생체내 전기천공을 수행하였다. 상기와 동일한 생체내 전기천공을 거의 2주마다 1번씩 반복하였다. 이어서, 림프절 또는 비장을 래트로부터 수거하고 하이브리도마 제조에 사용하였다.
1)-3 하이브리도마 제조
LF301 세포 융합 유닛(Cell Fusion Unit)[비이엑스 캄파니 리미티드(BEX Co., Ltd.)]을 사용하여 림프절 세포 또는 비장 세포를 마우스 골수종 SP2/0-ag14 세포(ATCC, No. CRL-1 581)와 전기적으로 융합시켰다. 융합된 세포를 클로나셀(ClonaCell)-HY 선택 배지 D[스템셀 테크놀로지스 인코포레이티드(StemCell Technologies Inc.)]에 의해 희석하고 배양하였다. 하이브리도마 콜로니를 제거하여 단일클론성 하이브리도마를 제조하였다. 이와 같이 회수된 각각의 하이브리도마 콜로니를 클로나셀-HY 선택 배지 E(스템셀 테크놀로지스 인코포레이티드)에서 배양하고, 생성된 하이브리도마 배양 상청액을 사용하여 항-인간 CD3 항체-생산 하이브리도마를 선별하였다.
1)-4 세포-ELISA에 의한 항체 선별
1)-4-1 세포-ELISA를 위한 항원 유전자-발현 세포의 제조
HEK293α 세포(인테그린 αν 및 인테그린 β3을 발현하는 HEK293-유래된 안정 발현 세포주)를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지중 7.5 × 105 세포/㎖로 조정하였다. 형질도입 절차에 따라서 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)을 사용하여, 이에 hCD3ε-pcDNA3.1 및 hCD3δ-pcDNA3.1, 또는 대조용 pcDNA3.1-DEST를 형질도입하였다. 생성된 세포를 100 ㎕/웰의 양으로 96-웰 플레이트[코닝 인코포레이티드(Corning Inc.)]에 분배하고, 하룻밤 37℃에서 5% CO2 조건하에 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 생성된 형질도입 세포를 접착 상태로 세포-ELISA에서 사용하였다.
1)-4-2 세포-ELISA
실시예 1)-4-1에서 제조된 발현 벡터-형질도입된 HEK293α 세포로부터 배양 상청액을 제거한 후, 각각의 하이브리도마 배양 상청액을 hCD3ε-pcDNA3.1- 및 hCD3δ-pcDNA3.1-, 또는 pcDNA3.1-DEST-형질도입된 HEK293α 세포에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 웰중의 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 5% FBS가 함유된 PBS로 500-배 희석된 항-래트 IgG 및 HRP-연결된 전체 Ab 염소[지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)]를 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 웰중의 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, OPD 발색 용액[OPD 용액(0.05 M 시트르산 삼나트륨 및 0.1 M 인산 수소 이나트륨 12 수화물, pH 4.5)중 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(웨이코 퓨어 케미칼스 인더스트리즈 리미티드: Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) 및 H2O2가 각각 0.4 mg/㎖ 및 0.6%(v/v)의 농도로 용해됨]을 100 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 가끔씩 교반하면서 발색 반응을 수행하였고, 100 ㎕/웰의 농도로 1 M HCl을 첨가하여 정지시켰다. 이어서, 플레이트 판독기[인비전(ENVISION); 퍼킨 엘머 인코포레이티드(PerkinElmer, Inc.)]를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 막 표면 상에서 발현된 인간 CD3에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하기 위해, 대조용 pcDNA3.1-DEST-형질도입된 HEK293 세포와 비교하여 hCD3ε-pcDNA3.1 및 hCD3δ-pcDNA3.1 발현 벡터-형질도입된 HEK293α 세포에 대해 더 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청액을 산출하는 하이브리도마를 항-인간 CD3 항체 생산-양성 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-5 인간 T 세포의 활성화에 기초한 항체 선별
하이브리도마로부터 수득된 항-CD3 항체를 T 세포의 그의 활성화에 대해, CD69 활성화 마커의 검출을 지표로 하여 평가하였다. 인간 T 세포주 주르캣(Jurkat) 세포(ATCC, No. TIB-152)를 FBS가 함유된 RPMI1640 배지중 5 × 106 세포/㎖의 농도로 조정하고, 100 ㎕/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 원심분리에 의해 상청액을 제거한 후, 실시예 1)-4에서 세포-ELISA에 의해 선택된 각각의 항-인간 CD3 항체 생산-양성 하이브리도마의 배양 상청액 또는 래트 IgG 이소타입 대조군 항체[알앤디 시스템스 인코포레이티드(R&D Systems, Inc.)]를 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 주르캣 세포에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 30분 동안 정치시켰다. 이어서, 가교결합기 염소 항-래트 IgG Fcγ 프래그먼트 스페시픽(Fragment specific)[잭슨 이뮤노리써치 래보레이토리즈 인코포레이티드(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)]를 10 ㎍/웰의 최종 농도로 첨가하고, 세포를 하룻밤 37℃에서 5% CO2 조건하에 배양하였다. 다음날, 상청액을 제거하고, 웰중의 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, PE 마우스 항-인간 CD69 항체[비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)]를 20 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 웰중의 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척하고, 이어서 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시킨 후, 유세포분석기[FC500; 베크만 쿨터 인코포레이티드(Beckman Coulter Inc.)]를 사용하여 검출하였다. 플로우조(Flowjo)[트리 스타 인코포레이티드(Tree Star Inc.)]를 사용하여 데이터를 분석하였다. PE 형광 강도를 히스토그램(histogram)으로 도표화하였다. 래트 IgG 이소타입 대조용 항체의 형광 강도 히스토그램에서 보다 PE의 형광 강도 히스토그램에서 더 강한 형광 강도로 전이하는 샘플을 산출하는 하이브리도마를 인간 T 세포를 활성화시키는 능력에 대해 양성인 항-인간 CD3 항체-생산 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-6 유세포분석에 의한, 인간 또는 원숭이 CD3에 대한 선택적 결합 활성에 기초한 선별
1)-6-1 인간 항원 유전자-발현 세포의 제조
렌티(Lenti)-X293T 세포[다카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.), 카탈로그 번호 632180]를 5.3 × 104 세포/㎠의 밀도로 225-㎠ 플라스크에 첨가하고, 하룻밤 37℃에서 5% CO2 조건하에 10% FBS가 함유된 DMEM 배지중에서 배양하였다. 다음날, hCD3ε-pcDNA3.1 및 hCD3δ-pcDNA3.1 또는 대조용 pcDNA3.1-DEST를 렌티-X293T 세포에 리포펙타민 2000을 사용하여 형질도입하고, 세포를 하룻밤 37℃에서 5% CO2 조건하에 추가로 배양하였다. 다음날, 발현 벡터-형질도입된 렌티-X293T 세포를 TrypLE 익스프레스(Express)(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)로 처리하고, 10% FBS가 함유된 DMEM으로 세척하고, 이어서 5% FBS가 함유된 PBS중 5 × 106 세포/㎖의 농도로 조정하였다. 생성된 세포 현탁액을 유세포분석에 사용하였다.
1)-6-2 인간 CD3으로의 결합 활성에 대한 유세포분석
실시예 1)-5에서 인간 T 세포를 활성화시키는 능력에 대해 양성인 것으로 결정된 하이브리도마 각각에 의해 생산된 항체의 인간 CD3 결합 특이성을 유세포분석에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 1)-6-1에서 제조된 각각의 렌티-X293T 세포 현탁액을 100 ㎕/웰의 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 첨가하고 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하여 hCD3ε-pcDNA3.1- 및 hCD3δ-pcDNA3.1-형질도입된 렌티-X293T 세포 또는 pcDNA3.1-DEST-형질도입된 렌티-X293T 세포를 현탁시키고 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 1회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 500-배 희석된 항-래트 IgG FITC 컨주게이트(시그마-알드리치 코포레이션)의 첨가에 의해 현탁시키고 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 2 ㎍/㎖의 7-아미노악티노마이신(aminoactinomycin) D[몰레큘라 프로브스 인코포레이티드(Molecular Probes, Inc.)] 및 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시키고, 이후 유세포분석에 의해 검출하였다. 플로우조를 사용하여 데이터를 분석하였다. 7-아미노악티노마이신 D-양성 사세포를 게이트하여(gating) 제거한 후, 생세포의 FITC 형광 강도를 히스토그램으로 도표화하였다. 대조용 pcDNA3.1-DEST-형질도입된 렌티-X293T 세포의 형광 강도 히스토그램에서 보다 hCD3ε-pcDNA3.1- 및 hCD3δ-pcDNA3.1-형질도입된 렌티-X293T 세포의 히스토그램에서 더 강한 형광 강도로의 전이를 나타내는 샘플을 산출하는 하이브리도마를, 인간 CD3에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-6-3 원숭이 CD3εδ 발현 벡터의 구축
원숭이 T 세포-유래된 cDNA를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 당분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 원숭이 CD3ε 단백질(NCBI 기준 서열: NP_001270544.1) 및 원숭이 CD3δ 단백질(NCBI 기준 서열: NP_001274617.1)을 코딩하는 cDNA를 증폭시키고, pcDNA3.1(+)(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에서 클로닝하여 발현 벡터 cynoCD3ε-pcDNA3.1 및 cynoCD3δ-pcDNA3.1을 구축하였다.
1)-6-4 원숭이 항원 유전자-발현 세포의 제조
렌티-X293T 세포를 5.3 × 104 세포/㎠의 밀도로 225-㎠ 플라스크에 접종하고, 하룻밤 37℃에서 5% CO2 조건하에 10% FBS가 함유된 DMEM 배지중에서 배양하였다. 다음날, cynoCD3ε-pcDNA3.1 및 cynoCD3δ-pcDNA3.1 또는 대조용 pcDNA3.1-DEST를 렌티-X293T 세포에 리포펙타민 2000을 사용하여 형질도입하고, 세포를 하룻밤 37℃에서 5% CO2 조건하에 추가로 배양하였다. 다음날, 발현 벡터-형질도입된 렌티-X293T 세포를 TrypLE 익스프레스로 처리하고, 10% FBS가 함유된 DMEM으로 세척하고, 이어서 5% FBS가 함유된 PBS중 5 × 106 세포/㎖의 농도로 조정하였다. 생성된 세포 현탁액을 유세포분석에 사용하였다.
1)-6-5 원숭이 CD3으로의 결합 활성에 대한 유세포분석
실시예 1)-6-2에서 인간 CD3에 결합하는 항체를 생산하는 것으로 결정된 하이브리도마 각각에 의해 생산된 항체의 원숭이 CD3 결합 특이성을 유세포분석에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 1)-6-4에서 제조된 각각의 렌티-X293T 세포 현탁액을 100 ㎕/웰의 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 첨가하고 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하여 cynoCD3ε-pcDNA3.1- 및 cynoCD3δ-pcDNA3.1-형질도입된 렌티-X293T 세포 또는 pcDNA3.1-DEST-형질도입된 렌티-X293T 세포를 현탁시키고 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 1회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 500-배 희석된 항-래트 IgG FITC 컨주게이트를 첨가하여 현탁시키고 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 2 ㎍/㎖의 7-아미노악티노마이신 D 및 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시키고, 이후 유세포분석에 의해 검출하였다. 플로우조를 사용하여 데이터를 분석하였다. 7-아미노악티노마이신 D-양성 사세포를 게이트하여 제거한 후, 생세포의 FITC 형광 강도를 히스토그램으로 도표화하였다. 대조용 pcDNA3.1-DEST-형질도입된 렌티-X293T 세포의 형광 강도 히스토그램에서 보다 cynoCD3ε-pcDNA3.1- 및 cynoCD3δ-pcDNA3.1-형질도입된 렌티-X293T 세포의 히스토그램에서 더 강한 형광 강도로의 전이를 나타내는 샘플을 산출하는 하이브리도마를, 원숭이 CD3에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-6-6 인간 CD3δ 유전자-발현 세포의 제조
렌티-X293T 세포를 5.3 × 104 세포/㎠의 밀도로 225-㎠ 플라스크에 접종하고, 하룻밤 37℃에서 5% CO2 조건하에 10% FBS가 함유된 DMEM 배지중에서 배양하였다. 다음날, hCD3δ-pcDNA3.1 또는 대조용 pcDNA3.1-DEST를 렌티-X293T 세포에 리포펙타민 2000을 사용하여 형질도입하고, 세포를 하룻밤 37℃에서 5% CO2 조건하에 추가로 배양하였다. 다음날, 발현 벡터-형질도입된 렌티-X293T 세포를 TrypLE 익스프레스로 처리하고, 10% FBS가 함유된 DMEM으로 세척하고, 이어서 5% FBS가 함유된 PBS중 5 × 106 세포/㎖의 농도로 조정하였다. 생성된 세포 현탁액을 유세포분석에 사용하였다.
1)-6-7 인간 CD3δ로의 결합 활성에 대한 유세포분석
실시예 1)-6-5에서 원숭이 CD3에 결합하는 항체를 생산하는 것으로 결정된 하이브리도마 각각에 의해 생산된 항체의 인간 CD3δ 결합 특이성을 유세포분석에 의해 추가로 확인하였다. 실시예 1)-6-6에서 제조된 각각의 렌티-X293T 세포 현탁액을 100 ㎕/웰의 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 첨가하고 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하여 hCD3δ-pcDNA3.1-형질도입된 렌티-X293T 세포 또는 pcDNA3.1-DEST-형질도입된 렌티-X293T 세포를 현탁시키고 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 1회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 500-배 희석된 항-래트 IgG FITC 컨주게이트를 첨가하여 현탁시키고 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 2 ㎍/㎖의 7-아미노악티노마이신 D 및 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시키고, 이후 유세포분석에 의해 검출하였다. 플로우조를 사용하여 데이터를 분석하였다. 7-아미노악티노마이신 D-양성 사세포를 게이트하여 제거한 후, 생세포의 FITC 형광 강도를 히스토그램으로 도표화하였다. 대조용 pcDNA3.1-DEST-형질도입된 렌티-X293T 세포의 형광 강도 히스토그램에서 보다 hCD3δ-pcDNA3.1-형질도입된 렌티-X293T 세포의 히스토그램에서 더 강한 형광 강도로의 전이를 나타내는 샘플을 산출하는 하이브리도마를, 인간 CD3δ에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-6-8 원숭이 T 세포주로의 결합 활성에 대한 유세포분석
실시예 1)-6-7에서 배제되지 않는 항체-생산 하이브리도마 각각에 의해 생산된 항체의 원숭이 T 세포주 결합 특이성을 유세포분석에 의해 추가로 확인하였다. 사이노몰구스 원숭이 T 세포주 HSC-F(JCRB 세포 은행 No. JCRB1164)를 FBS가 함유된 RPMI1640 배지중 5 × 106 세포/㎖의 농도로 조정하고, 100 ㎕/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 원심분리에 의해 상청액을 제거한 후, 실시예 1)-5-7에서 배제되지 않는 항체-생산 하이브리도마의 배양 상청액, 또는 래트 IgG 이소타입 대조용 항체를 HSC-F 세포에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 이어서, 상청액을 제거하고, 웰중의 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 1회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 500-배 희석된 항-래트 IgG FITC 컨주게이트를 첨가하여 현탁시키고, 4℃에서 1 시간 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 3회 세척한 다음, 2 ㎍/㎖의 7-아미노악티노마이신 D 및 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시키고, 이후 유세포분석기를 사용하여 검출하였다. 플로우조를 사용하여 데이터를 분석하였다. 7-아미노악티노마이신 D-양성 사세포를 게이트하여 제거한 후, 생세포의 FITC 형광 강도를 히스토그램으로 도표화하였다. 래트 IgG 이소타입 대조용 항체의 형광 강도 히스토그램에서 보다 FITC의 형광 강도 히스토그램에서 더 강한 형광 강도로의 전이를 나타내는 샘플을 산출하는 하이브리도마를, 원숭이 T 세포주에 또한 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마로서 선택하였다.
1)-7 항체의 이소타입 결정
실시예 1)-6에서 수득된 래트 항-CD3 항체-생산 하이브리도마중에서, 인간 및 원숭이 CD3ε에 결합하고, 원숭이 T 세포주에도 결합하며, 인간 T 세포를 활성화시키는 능력이 높은 것으로 시사된 C3-147을 선택하여, 항체 이소타입을 동정하였다. 래트 면역글로불린 이소타입 결정 ELISA 키트(비디 파르민겐)를 사용하여 이소타입을 결정하였다. 결과로서, 래트 항-CD3 단일클론성 항체 C3-147의 이소타입은 IgG2b 및 λ 쇄인 것으로 확인되었다.
( 실시예 2) 인간 CD3으로의 래트 항-CD3 단일클론성 항체(C3-147)의 결합 활성에 대한 연구
2)-1 하이브리도마 상청액으로부터의 단일클론성 항체의 제조
2)-1-1 C3-147을 생산하는 하이브리도마의 배양
래트 항-CD3 단일클론성 항체를 하이브리도마 배양 상청액으로부터 정제하였다. 우선, C3-147-생산 하이브리도마를 클로나셀-HY 선택 배지 E(스템셀 테크놀로지스 인코포레이티드)에서 충분한 양으로 성장시켰다. 이어서, 배지를 20% 울트라 로우(Ultra Low) IgG FBS(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)가 보충된 5 ㎍/㎖의 젠타미신(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드) 함유 하이브리도마 SFM(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)으로 대체한 후, 7 일 동안 배양하였다. 이렇게 배양된 상청액을 회수하고 0.22 ㎛ 필터(코닝 인코포레이티드)를 통해 멸균하였다.
2)-1-2 정제
실시예 2)-1-1에서 제조된 하이브리도마 배양 상청액으로부터 단백질 G 친화도 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하였다. 항체를 단백질 G 칼럼(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션) 상으로 흡착시키고, 칼럼을 PBS로 세척하고, 이후 0.1 M 글리신/염산의 수용액(pH 2.7)으로 용출시켰다. 1 M 트리스-HCl(pH 9.0)의 첨가에 의해 용출액을 pH 7.0 내지 7.5로 조정하였다. 이어서, 센트리퓨걸(Centrifugal) UF 필터 디바이스(Filter Device) VIVASPIN20[분자량 컷오프: UF30K, 사토리우스 재팬 케이 케이(Sartorius Japan K.K.)]을 사용하여 PBS로 버퍼를 대체하면서, 항체를 농축시키고 2 mg/㎖의 항체 농도로 조정하였다. 최종적으로, 미니스타-플러스(Minisart-Plus) 필터(사토리우스 재팬 케이 케이)를 통해 농축물을 여과하고 정제 샘플로서 사용하였다.
2)-2 인간 단일-쇄 항원으로의 수득된 래트 항-CD3 항체(C3-147)의 결합
2)-2-1 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원의 제조
CD3ε 또는 CD3γ를 코딩하는 아미노산 서열을 단백질 데이터 은행에 기탁된 OTK3-인간 CD3εγ 단일-쇄 항원 복합체의 결정 구조(PDBID: 1SY6)로부터 수득하였다. CD3ε의 카복실-말단을 CD3γ의 아미노-말단에 연결시키기 위한 연결기로서 김(Kim, K.S.) 등의 문헌[(2000) J. Mol . Biol. 302, 899-916]에 보고된 26개 아미노산으로 구성된 동일한 펩티드 연결기를 사용하였다. 서열목록의 도 3(서열번호 4)에 제시된 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원을 코딩하는 유전자는 제한 부위 BamHI 및 HindIII을 각각 5' 및 3' 말단에 첨가함으로써 합성되었다[진아트 진 신테시스 서비스(GeneArt Gene Synthesis Service)/써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드]. 플라스미드 pQE80L(퀴아겐 엔 브이)을 제한 효소 BamHI 및 HindIII에 의해 소화시킴으로써 수득된 약 4.8 kb의 단편을, 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원 유전자를 BamHI 및 HindIII에 의해 소화시켜 수득된 약 0.6 kb의 단편과, 라이게이션 하이(Ligation High)[도요보 캄파니 리미티드(Toyobo Co., Ltd.)]를 사용하여 결찰시킴으로써, 에스케리키아 콜라이 발현용 플라스미드 pQE80L-scCD3εγ를 제조하였다. 생성된 scCD3εγ의 아미노산 서열은 서열목록의 도 4(서열번호 5)에 기대되어 있다. 발현용 에스케리키아 콜라이 BL21(DE3)을 발현용 플라스미드 pQE80L-scCD3εγ에 의해 형질전환시키고, 생성된 콜로니를 울트라 일드(Ultra Yield) 플라스크(상표)[톰슨 인트스루먼트 캄파니(Thomson Instrument Company)]중 1 ℓ 매직미디어(MagicMedia)[인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.)]에 첨가하고, 250 rpm으로 30℃에서 21 시간 동안 진탕배양하였다. 이렇게 배양된 균체를 회수하였다. 1% 트리톤 용액이 함유된 트리스 완충액의 존재하에 초음파 분쇄기를 사용하여 균체를 파쇄하고, 동결-해동 주기를 반복하였다. 최종적으로, 15000 rpm으로 4℃에서 15 분 동안 원심분리하여 봉입체를 회수하였다. 봉입체의 재접힘(refolding)으로부터 정제까지의 절차는, 항체 칼럼에 사용된 항-CD3 항체가 문헌에 사용된 2C11 대신에 마우스 항-CD 단일클론성 항체 OKT3[Sgro, "Toxicology 105 (1995), 23-29", 오르토클론(Orthoclone), 얀센-실라그(Janssen-Cilag)]인 점을 제외하고, 참고문헌[크제르-니엘센(Kjer-Nielsen) 등의 문헌 "(2004) PNAS vol. 101, no. 20, 7675-7680"]의 수법에 따라 수행되었다.
2)-2-2 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원으로의 결합 활성에 대한 SPR 측정
고정화된 항-마우스 IgG 항체 상에 리간드로서의 항체를 포획하고 항원을 피분석물로서 분석하는 포획 방법에 의해 비아코어(BIAcore) 3000(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)을 사용하여 항체와 항원의 결합을 분석하였다. 사용된 항원은 실시예 2)-2-1에서 제조된 인간 CD3εγ였다. 약 11000 RU의 항-마우스 IgG 항체(마우스 항체 캡처 키트, 지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)를 센서 칩 CM5(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)에 아민 커플링 방법에 의해 공유 결합시켰다. 유사하게, 이러한 항체를 기준 세포 상에 고정화시켰다. 사용된 이동 버퍼는 HBS-EP+[10 mM HEPES(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 서팩탄트(Surfactant) P20]였다. 항체를 항-마우스 IgG 항체-고정화 칩 상에 약 1 분 동안 첨가한 다음, 리간드로서 포획하였다. 이어서, 100 nM의 항원을 30 ㎕/분의 유속으로 120 초 동안 첨가하고, 항원으로의 결합을 모니터링하였다. 10 mM 글리신-HCl(pH 1.7)을 재생 용액으로서 10 ㎕/분의 유속으로 3 분 동안 첨가하였다. 결과로서, 120 초 이후 C3-147의 결합 신호는 34 RU였다.
2)-3 생성된 래트 항-CD3 항체(C3-147)에서 SPR에 의한 항원-결합 부위의 확인
항원-결합 부위를 확인하는 방법을 실시예 2)-2-2와 동일한 방식으로 수행하였다. 결과로서, C3-147에 대해 수득된 결합 신호는 34 RU였다. 한편, 당분야에 공지된 항-CD3 항체인 SP34(비디 파르민겐)에서의 항원-결합 부위는 비교예로서 유사하게 확인되었다. 34 RU의 결합 신호는 SP34에서 관찰되지 않았다. 이들 결과는 C3-147에 의해 인식된 CD3εγ 상의 결합 부위가 SP34에 의해 인식된 부위와 상이함을 보여준다.
( 실시예 3) 래트 항-CD3 항체(C3-147)중의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 서열 결정
래트 항-CD3 항체(C3-147)의 가변 영역을 코딩하는 cDNA의 서열을 하기 방법에 의해 결정하였다.
3)-1 cDNA 합성
래트 항-CD3 항체(C3-147)-생산 하이브리도마의 세포 용해물[50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 250 mM LiCl, 5 mM EDTA(pH 8), 0.5% 리튬 도데실 설페이트(LiDS), 및 2.5 mM 디티오트레이톨(DTT)]을 다이나비즈(Dynabeads) mRNA 디렉트 키트(DIRECT Kit)(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)의 올리고 dT25-결합된 자기 비이드와 혼합하여, mRNA가 자기 비이드에 결합하도록 하였다. 그런 다음, 자기 비이드를 mRNA 세척 용액 A[10 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS, 및 0.1% 트리톤 X-100] 및 cDNA 합성용 용액[50 mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0.5 mM dNTP, 0.2% 트리톤 X-100, 및 1.2 유닛의 RN아제 저해제(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)]으로 각각 1회 세척하였다. 이어서, 12 유닛의 수퍼스크립트(SuperScript) III 역전사효소(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)가 보충된 cDNA 합성용 용액을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 후속적으로, cDNA를 3' 테일링(tailing) 반응 용액(50 mM 인산 칼륨, 4 mM MgCl2, 0.5 mM dGTP, 0.2% 트리톤 X-100, 및 1.2 유닛의 RN아제 저해제)으로 세척한 후, 48 유닛의 말단 전이효소, 재조합물[로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science)]이 보충된 반응 용액에 의해 3' 테일링 반응을 수행하였다.
3)-2 래트 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 단편의 증폭 및 서열 결정
자기 비이드를 TE 용액[10 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1 mM EDTA, 및 0.1% 트리톤 X-100]으로 세척하였다. 이어서, 래트 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 5'-RACE PCR에 의해 증폭시켰다. 구체적으로, 자기 비이드를 PCR 반응 용액[0.2 μM 프라이머, 0.2 mM dNTP, 및 0.25 유닛의 프라임스타(PrimeSTAR) HS DNA 폴리머라아제(다카라 바이오 인코포레이티드)]으로 옮기고, 각각 94℃에서 30 초 및 68℃에서 90 초의 반응 사이클을 35회 수행하였다. 사용된 프라이머 세트는 아래에 기재된다.
중쇄 유전자 증폭용 PCR 프라이머 세트
센스 프라이머 Nhe-polyC-S
5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3'; 도 5(서열번호 50)
1회차 안티센스 프라이머 rIgγ-AS1
5'-TCACTGAGCTGGTGAGAGTGTAGAGCCC-3'; 도 6(서열번호 51)
2회차 안티센스 프라이머 rIgγ-AS2
5'-TCACCGAGCTGCTGAGGGTGTAGAGCCC-3'; 도 7(서열번호 52)
경쇄 유전자 증폭용 PCR 프라이머 세트
센스 프라이머 Nhe-polyC-S2
5'-GCTAGCGCTACCGGACTCAGATCCCCCCCCCCCCCDN-3'; 도 8(서열번호 53)
1회차 안티센스 프라이머 rIgL-AS1
5'-TTCCACATCACTCGGGTAGAAATCAG-3'; 도 9(서열번호 54)
2회차 안티센스 프라이머 rIgγ-AS2
5'-TAACACCAGGGTAGAAATCTGTCACCAT-3'; 도 10(서열번호 55)
서열 분석을 PCR 반응에 의해 증폭된 단편의 뉴클레오티드 서열 상에서 수행하였다. 사용된 프라이머는 아래에 기재된다.
중쇄 서열 결정용 센스 프라이머 rIgγ-seq
5'-CTGGCTCAGGGAAATAGCC-3'; 도 11(서열번호 56)
경쇄 서열 결정용 안티센스 프라이머 rIgL-seq1
5'-TCCCTGGAGCTCCTCAGT-3'; 도 12(서열번호 57)
경쇄 서열 결정용 안티센스 프라이머 rIgL-seq2
5'-GCCTTGTCAGTCTTGAGC-3'; 도 13(서열번호 58)
유전자 서열 분석기["ABI PRISM 3700 DNA 분석기; 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드(Applied Biosystems, Inc.)" 또는 "어플라이드 바이오시스템스 3730xl 분석기; 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드"]를 사용하여 서열 분석을 수행하였다. 앰플리택(AmpliTaq) DNA 폴리머라아제를 갖는 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱 시스템(Dye Terminator Cycle Sequencing System)[라이프 테크놀로지스 코포레이션(Life Technologies Corp.)] 및 진앰프(GeneAmp) 9700(어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드)을 서열 결정 반응에 사용하였다.
서열 분석에 의해 결정된 C3-147 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 도 14(서열번호 6)에 기재되고, 그의 아미노산 서열은 도 15(서열번호 7)에 기재되어 있다. C3-147 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 도 16(서열번호 8)에 기재되고, 그의 아미노산 서열은 도 17(서열번호 9)에 기재되어 있다.
( 실시예 4) 래트 항-CD3 scFv ( C3E -7000) 및 그의 인간화된 형태( C3E - 7034)의 제조
4)-1 래트 항-CD3 항체(C3-147) scFv의 제조
4)-1-1 래트 항체 CD3 scFv 발현 벡터(pC3E-7000)의 구축
C3-147의 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL) 사이에 삽입되는 연결기를 코딩하는 DNA 서열의 전 후에 15-염기의 부가 서열을 갖는 DNA 단편의 센스 가닥 올리고뉴클레오티드(도 18(서열번호 10)), 및 이의 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드(도 19(서열번호 11))를 합성하고[시그마-알드리치 코포레이션, 커스텀 올리고 합성 서비스(Custom Oligo Synthesis Service)], 100 pmol/㎕로 조정하였다. 이어서, 각각 20 ㎕의 이들 올리고뉴클레오티드를 혼합하고, 96℃에서 10 분 동안, 70℃에서 2 분 동안, 60℃에서 2 분 동안, 40℃에서 2 분 동안, 및 30℃에서 2 분 동안 어닐링(annealing)을 위해 정치시켜 VH 및 VL 사이에 삽입되는 연결기의 DNA 단편을 제조하였다. 그런 다음, 인간 IgG 중쇄 신호 서열을 부가하기 위해 PCR에 의해 증폭된 DNA 단편, PCR에 의해 증폭된 래트 항-CD3 항체 C3-147의 VH의 DNA 단편(도 14(서열번호 6)에 제시됨), VH와 VL 사이에 삽입되는 연결기의 DNA 단편, 및 FLAG-His 태그가 카복실-말단에 위치되도록 FLAG-His 태그를 코딩하는 DNA 서열이 C3-147 VL DNA 서열(도 16(서열번호 8)에 제시됨)을 함유하는 영역에 부가되는, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을, 인-퓨전(In-Fusion) HD 클로닝 키트[클론텍 래보레이토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.)]에 의해, 동물 세포용 발현 벡터 pcDNA-3.3TOPO(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)로부터 유래된 벡터 골격과 결찰시켜서, ORF중 도 20(서열번호 14)의 뉴클레오티드 서열이 포함된 scFv 발현 벡터 pC3E-7000을 제조하였다.
4)-1-2 래트 항-CD3 scFv(C3E-7000)의 발현 및 정제
Expi293F 세포(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)를 매뉴얼에 따라 계대배양하고 배양하였다. scFv 발현 벡터를 대수증식기의 Expi293F 세포에 형질도입하였다. scFv를 일시적으로 발현시키고, 이를 여과한 다음 정제에 사용하였다. 히스 트랩 엑셀(His Trap Excel)(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)을 사용하는 Ni 친화도 크로마토그래피 및 수퍼덱스(Superdex) 200 인크리스(increase)(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)를 사용하는 겔 여과를 포함하는 2 단계 공정으로 정제를 수행하였다. scFv 단량체의 분자량에 상응하는 피이크를 회수하고 정제된 단백질 샘플로서 사용하였다. 정제를 위해, AKTA 크로마토그래피 시스템을 사용하였고, 모든 단계를 4℃에서 수행하였다. HBSor(25 mM 히스티딘/5% 소르비톨, pH 5.0)을 정제된 단백질용 버퍼로서 사용하였다. 정제된 단백질 샘플을 분석하기 위해 SEC에 적용하여 그의 순도 및 농도를 결정하였다. 이어서, 샘플을 다양한 검정에 사용하였다. C3E-7000의 아미노산 서열은 도 21(서열번호 15)에 기재되어 있다.
4)-2 래트 항-CD3 scFv(C3E-7000)의 인간화
4)-2-1 항-CD3 항체의 인간화 설계
시판되는 단백질 3차원 구조 분석 프로그램 디스커버리 스튜디오(Discovery Studio) 3.5[다솔트 시스템스 에스 에이(Dassault Systems S.A.)]를 사용하여, 래트 항체의 가변 영역의 모델링을 상동성 모델링으로서 당분야에 공지된 방법에 따라 수행하였다[문헌 "Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)"].
일반적으로 CDR 그래프팅(grafting)으로서 공지된 방법[문헌 "Proc . Natl . Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)"]에 의해 인간화를 수행하였다. 억셉터(acceptor) 항체를, 카밧(KABAT) 등[문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)"]에 의해 한정된 인간 하위군 컨센서스 서열 또는 생식계열 서열로부터, 골격구조 영역내의 아미노산 동일성, 기대되는 면역원성 예측 스코어 또는 물성 등에 기초하여 선택하였다. 또한, 퀸(Queen) 등[문헌 "PNAS (1989) 86, 10029-10033"]에 의해 제공된 기준 등을 참고하여 상기 기재된 수법에 의해 구축된 3차원 구조 모델의 사용을 통해 복귀 돌연변이를 선택하였다.
4)-2-2 인간화된 아미노산 서열 C3E-7000의 설계
실시예 4)-2-1에 기재된 수법에 기초하여, 인간 하위군 컨센서스 서열 γ3 및 λ6을 억셉터로 하는, C3E-7000의 인간화된 형태로서 작용하는 C3E-7034의 아미노산 서열을 설계하였다. 도 15(서열번호 7)에 제시된 C3-147VH의 아미노산 서열로부터, 아미노산 16에서 아르기닌이 글리신으로 치환되고, 아미노산 위치 17에서 알라닌인 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 19에서 리신이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 23에서 발린이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 24에서 발린이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 88에서 세린이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 93에서 트레오닌이 발린으로 치환됨으로써 설계된 C3E-7034VH의 아미노산 서열이 도 22(서열번호 16)에 기재되어 있다.
도 17(서열번호 9)에 제시된 C3-147VL의 아미노산 서열로부터, 아미노산 위치 1에서 글루타민이 아스파라긴으로 치환되고, 아미노산 위치 3에서 발린이 메티오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 8에서 아스파라긴이 히스티딘으로 치환되고, 아미노산 위치 12에서 트레오닌이 글루탐산으로 치환되고, 아미노산 위치 13에서 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 14에서 류신이 프롤린으로 치환되고, 아미노산 위치 16에서 트레오닌이 리신으로 치환되고, 아미노산 위치 19에서 글루탐산이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 20에서 류신이 이소류신으로 치환되고, 아미노산 위치 43에서 아르기닌이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 75에서 류신이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 79에서 아스파라긴이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 81에서 발린이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 82에서 글루타민이 리신으로 치환됨으로써 설계된 C3E-7034VL의 아미노산 서열이 도 23(서열번호 17)에 기재되어 있다.
IMGT의 CDR 정의에 기초한 C3E-7000 및 C3E-7034의 CDR 서열은, CDR-H1의 경우 도 24(서열번호 26)에, CDR-H2의 경우 도 25(서열번호 27)에, CDR-H3의 경우 도 26(서열번호 28)에, CDR-L1의 경우 도 27(서열번호 29)에, CDR-L2의 경우 도 28(서열번호 30)에, 및 CDR-L3의 경우 도 29(서열번호 31)에 기재되어 있다.
4)-2-3 인간화된 항-CD3 scFv C3E-7034의 변형
원숭이 CD3ε과 교차 반응성을 유지하면서도 결합 활성 및 세포독성 활성에 있어서 차이를 갖는 변이체를 제조하기 위해, 실시예 4)-2-1에 기재된 수법과 동일한 방식으로, C3E-7034의 VL의 골격구조 영역의 아미노산을 scFv의 VL(IGLV1-40*01에서 4가지 돌연변이 A2S, S8P, V13A, 및 F80L을 갖는 서열)중의 상응하는 아미노산으로 치환함으로써 변이체를 설계하였다.
4)-2-3-1 C3E-7035의 아미노산 서열 설계
C3E-7034의 변이체로서 작용하는 C3E-7035의 아미노산 서열을 설계하였다. 도 23(서열번호 17)에 제시된 C3E-7034 경쇄 가변 영역으로부터, 아미노산 위치 1에서 아스파라긴이 글루타민으로 치환되고, 아미노산 위치 2에서 페닐알라닌이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 3에서 메티오닌이 발린으로 치환되고, 아미노산 위치 8에서 히스티딘이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 12에서 글루탐산이 글리신으로 치환되고, 아미노산 위치 13에서 세린이 발린으로 치환되고, 아미노산 위치 16에서 리신이 글루타민으로 치환되고, 아미노산 위치 17에서 트레오닌이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 40에서 히스티딘이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 41에서 글루탐산이 프롤린으로 치환되고, 아미노산 위치 43에서 세린이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 44에서 세린이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 46에서 트레오닌이 리신으로 치환되고, 아미노산 위치 47에서 트레오닌이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 48에서 이소류신이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 57에서 아스파르트산이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 60에서 세린이 프롤린으로 치환되고, 아미노산 위치 67에서 이소류신이 리신으로 치환되고, 아미노산 위치 68에서 아스파르트산이 결실되고, 아미노산 위치 69에서 아르기닌이 결실되고, 아미노산 위치 71에서 세린이 글리신으로 치환되고, 아미노산 위치 72에서 리신이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 77에서 트레오닌이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 79에서 세린이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 80에서 아스파라긴이 글리신으로 치환되고, 아미노산 위치 81에서 류신이 페닐알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 82에서 리신이 글루타민으로 치환되고, 아미노산 위치 83에서 트레오닌이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 90에서 페닐알라닌이 티로신으로 치환됨으로써 설계된 C3E-7035 경쇄의 아미노산 서열이 도 30(서열번호 20)에 기재되어 있다. 경쇄 가변 영역 바로 앞에 메티오닌 및 알라닌이 삽입된 C3E-7035의 전장 서열이 서열목록의 도 31(서열번호 22)에 기재되어 있다.
4)-2-3-2 C3E-7036의 아미노산 서열 설계
C3E-7034의 변이체로서 작용하는 C3E-7036의 아미노산 서열을 설계하였다. 도 23(서열번호 17)에 제시된 C3E-7034 경쇄 가변 영역으로부터, 아미노산 위치 8에서 히스티딘이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 12에서 글루탐산이 글리신으로 치환되고, 아미노산 위치 13에서 세린이 발린으로 치환되고, 아미노산 위치 16에서 리신이 글루타민으로 치환되고, 아미노산 위치 17에서 트레오닌이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 23에서 리신이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 24에서 아르기닌이 글리신으로 치환되고, 아미노산 위치 40에서 히스티딘이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 41에서 글루탐산이 프롤린으로 치환되고, 아미노산 위치 43에서 세린이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 44에서 세린이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 46에서 트레오닌이 리신으로 치환되고, 아미노산 위치 47에서 트레오닌이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 48에서 이소류신이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 57에서 아스파르트산이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 60에서 세린이 프롤린으로 치환되고, 아미노산 위치 67에서 이소류신이 리신으로 치환되고, 아미노산 위치 68에서 아스파르트산이 결실되고, 아미노산 위치 69에서 아르기닌이 결실되고, 아미노산 위치 71에서 세린이 글리신으로 치환되고, 아미노산 위치 72에서 리신이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 77에서 트레오닌이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 79에서 세린이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 80에서 아스파라긴이 글리신으로 치환되고, 아미노산 위치 81에서 류신이 페닐알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 82에서 리신이 글루타민으로 치환되고, 아미노산 위치 83에서 트레오닌이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 90에서 페닐알라닌이 티로신으로 치환됨으로써 설계된 C3E-7036 경쇄의 아미노산 서열이 도 32(서열번호 23)에 기재되어 있다. C3E-7036의 전장 아미노산 서열이 도 33(서열번호 25)에 기재되어 있다.
4)-2-3-3 CDR 변이체에서의 아미노산 설계
C3E-7034 CDRH2(도 25, 서열번호 27)에 존재하는 탈아미노화 부위를 제거하기 위해, 도 22(서열번호 16)에 제시된 C3E-7034 중쇄 가변 영역중 아미노산 위치 53에서 아스파라긴이 아르기닌으로 치환된 C3E-7078 및 이에 대해 세린이 치환된 C3E-7079를 설계하였다. 또한, C3E-7036 중쇄 가변 영역중 아미노산 위치 53에서 아스파라긴이 아르기닌으로 치환된 C3E-7085를 설계하였다. C3E-7078의 전체 아미노산 서열이 도 68(서열번호 60)에 열거되어 있다. C3E-7079의 전체 아미노산 서열이 도 70(서열번호 62)에 열거되어 있다. C3E-7085의 전체 아미노산 서열이 도 72(서열번호 64)에 열거되어 있다.
인간 CD3에 대한 C3E-7078의 친화도를 감소시키기 위해, C3E-7078 경쇄 가변 영역중 아미노산 위치 52에서 아스파르트산이 글리신으로 치환된 C3E-7086, 이에 대해 글루타민으로 치환된 C3E-7087, 이에 대해 아스파라긴으로 치환된 C3E-7088, 이에 대해 세린으로 치환된 C3E-7089, 및 이에 대해 알라닌으로 치환된 C3E-7090을 설계하였다. 유사하게, 인간 CD3에 대한 C3E-7079의 친화도를 감소시키기 위해, C3E-7079 경쇄 가변 영역중 아미노산 위치 52에서 아스파르트산이 글리신으로 치환된 C3E-7091, 이에 대해 글루타민으로 치환된 C3E-7092, 이에 대해 아스파라긴으로 치환된 C3E-7093, 이에 대해 세린으로 치환된 C3E-7094, 및 이에 대해 알라닌으로 치환된 C3E-7095를 설계하였다. C3E-7086의 전체 아미노산 서열이 도 74(서열번호 66)에 열거되어 있다. C3E-7087의 전체 아미노산 서열이 도 76(서열번호 68)에 열거되어 있다. C3E-7088의 전체 아미노산 서열이 도 78(서열번호 70)에 열거되어 있다. C3E-7089의 전체 아미노산 서열이 도 80(서열번호 72)에 열거되어 있다. C3E-7090의 전체 아미노산 서열이 도 82(서열번호 74)에 열거되어 있다. C3E-7091의 전체 아미노산 서열이 도 84(서열번호 76)에 열거되어 있다. C3E-7092의 전체 아미노산 서열이 도 86(서열번호 78)에 열거되어 있다. C3E-7093의 전체 아미노산 서열이 도 88(서열번호 80)에 열거되어 있다. C3E-7094의 전체 아미노산 서열이 도 90(서열번호 82)에 열거되어 있다. C3E-7095의 전체 아미노산 서열이 도 92(서열번호 84)에 열거되어 있다.
4)-3 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036)의 제조
4)-3-1 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-7034) 발현 벡터 pC3E-7034의 구축
C3E-7034 중쇄(도 22(서열번호 16)에 제시됨)의 카복실-말단에 15-아미노산 가요성 연결기를 통해 연결된 C3E-7034 경쇄(도 23(서열번호 17)에 제시됨)를 함유한 scFv의 DNA 서열, 및 이의 전 후에 부착된 15-염기 부가 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(진아트 진 신테시스 서비스/써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드). 이러한 DNA 단편을 주형으로 하여 PCR에 의해 C3E-7034 DNA 및 전 후의 부가 서열을 함유한 영역을 증폭시켜 인서트 DNA 단편을 수득하였다. 실시예 4)-1-1에서 제조된 발현 벡터 pC3E-7000을 주형으로 하여 PCR에 의해 scFv 영역을 제외한 벡터 영역을 증폭시켜 벡터 단편을 수득하였다. 이들 DNA 단편을 인-퓨전 HD 클로닝 키트(클론텍 래보레이토리즈 인코포레이티드)에 의해 어닐링하여, ORF중 도 34(서열번호 18)의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 인간화된 항-CD3 scFv 발현 벡터 pC3E-7034를 제조하였다.
4)-3-2 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-7035) 발현 벡터 pC3E-7035의 구축
C3E-7034 중쇄(도 22(서열번호 16)에 제시됨)의 카복실-말단에 17-아미노산 가요성 연결기를 통해 연결된 C3E-7035 경쇄(도 30(서열번호 20)에 제시됨)를 함유한 scFv의 DNA 서열, 및 이의 전 후에 부착된 15-염기 부가 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(진아트 진 신테시스 서비스/써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드). 실시예 4)-3-1과 동일한 방식으로 ORF중 도 35(서열번호 21)의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 C3E-7035 발현 벡터를 구축하였다. 생성된 발현 벡터를 "pC3E-7035"로서 명명하였다.
4)-3-3 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-7036) 발현 벡터 pC3E-7036의 구축
C3E-7034 중쇄(도 22(서열번호 16)에 제시됨)의 카복실-말단에 15-아미노산 가요성 연결기를 통해 연결된 C3E-7036 경쇄(도 32(서열번호 23)에 제시됨)를 함유한 scFv의 DNA 서열, 및 이의 전 후에 부착된 15-염기 부가 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(진아트 진 신테시스 서비스/써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드). 실시예 4)-3-1과 동일한 방식으로 ORF중 도 36(서열번호 24)의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 C3E-7036 발현 벡터를 구축하였다. 생성된 발현 벡터를 "pC3E-7036"으로서 명명하였다.
4)-3-4 CDR 변형된 인간화된 항체 CD3 scFv 발현 벡터의 구축
도 34(서열번호 18)에 제시된 C3E-7034의 뉴클레오티드 서열을 ORF에 함유하는 pC3E-7034를 주형으로 하고, 도 93 및 94(서열번호 85 및 86)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR-기반의 부위-특이적 변이유발을 수행함으로써, ORF에서 C3E-7034 중쇄 가변 영역중 아미노산 위치 53에서 아스파라긴이 아르기닌으로 치환된 C3E-7078의 뉴클레오티드 서열을 함유한 C3E-7078 발현 벡터를 제조하였다. 생성된 발현 벡터를 "pC3E-7078"로서 명명하였다. 유사하게, pC3E-7034를 주형으로 하고, 도 95 및 96(서열번호 87 및 88)의 프라이머를 사용하여 PCR-기반의 부위-특이적 변이유발을 수행함으로써, C3E-7034 중쇄 가변 영역중 아미노산 위치 53에서 아스파라긴이 세린으로 치환된 C3E-7079의 뉴클레오티드 서열을 함유한 C3E-7079 발현 벡터를 제조하였다. 생성된 발현 벡터를 "pC3E-7079"로서 명명하였다. 유사하게, pC3E-7036을 주형으로 하고, 도 93 및 94(서열번호 85 및 86)의 프라이머를 사용하여 PCR-기반의 부위-특이적 변이유발을 수행함으로써, C3E-7036 중쇄 가변 영역중 아미노산 위치 53에서 아스파라긴이 아르기닌으로 치환된 C3E-7085의 뉴클레오티드 서열을 함유한 C3E-7085 발현 벡터를 제조하였다. 생성된 발현 벡터를 "pC3E-7085"로서 명명하였다.
ORF에서 C3E-7078 경쇄 가변 영역중 아미노산 위치 52에서 아스파르트산이 글리신으로 치환된 C3E-7086, 이에 대해 글루타민으로 치환된 C3E-7087, 이에 대해 아스파라긴으로 치환된 C3E-7088, 이에 대해 세린으로 치환된 C3E-7089, 또는 이에 대해 알라닌으로 치환된 C3E-7090의 뉴클레오티드 서열을 함유한 발현 벡터, 및 ORF에서 C3E-7079 경쇄 가변 영역중 아미노산 위치 52에서 아스파르트산이 글리신으로 치환된 C3E-7091, 이에 대해 글루타민으로 치환된 C3E-7092, 이에 대해 아스파라긴으로 치환된 C3E-7093, 이에 대해 세린으로 치환된 C3E-7094, 또는 이에 대해 알라닌으로 치환된 C3E-7095의 뉴클레오티드 서열을 함유한 발현 벡터를 또한 상기와 동일한 수법에 의해 제조하였다. 제조된 벡터, 주형, 및 프라이머의 명칭에 대한 목록이 표 1에 요약되고, 프라이머 목록이 도 105에 요약되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
4)-3-5 인간화된 항-CD3 scFv의 발현 및 정제
C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036을 실시예 4)-1-2와 동일한 방식으로 발현시키고 정제하였다.
4)-3-6 CDR 변형된 인간화된 항-CD3 scFv의 발현 및 정제
CDR 변이체 C3E-7078, C3E-7079, C3E-7085, C3E-7086, C3E-7087, C3E-7088, C3E-7089, C3E-7090, C3E-7091, C3E-7092, C3E-7093, C3E-7094, 및 C3E-7095를 실시예 4)-1-2와 동일한 방식으로 발현시키고 정제하였다.
( 실시예 5) 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-7034)의 결정 구조 분석
5)-1 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-7034)-인간 CD3εγ 단일-쇄 항원 복합체의 제조
실시예 2)-2-1에서 제조된 CD3εγ 및 실시예 4)-3-1에서 제조된 C3E-7034를 1:2의 몰 비로 혼합하였다. 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 15 MWCO 10K[메르크 밀리포어(Merck Millipore)]를 사용하여 완충 용액을 10 mM 트리스 HCl(pH 7.5) 및 50 mM NaCl로 대체하고, 생성된 용액을 3.5 mg/㎖로 농축시켰다. 수퍼덱스 200 10/300GL(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 이러한 농축물을 정제하였다. 아미콘 울트라 15 MWCO 10K(밀리포어)를 사용하여 복합체의 분별물을 약 4.0 mg/㎖로 농축시켰다.
5)-2 결정화
CD3εγ 및 C3E-7034의 생성된 복합체를 증기 확산법에 의해 결정화하였다. 0.5 ㎕의 단백질 용액에, 동량의 침전제 용액(0.1 M MES 일수화물(pH 6.5), 1.6 M 황산 암모늄, 및 10% v/v 1,4-디옥산)을 첨가하고, 생성된 용액을 0.05 ㎖의 침전제 용액이 함유된 밀봉 용기에서 두 용액이 서로 접촉되지 않도록 두었다. 용기를 25℃에서 정치시켰다. 1 개월 후, 0.1 mm × 0.05 mm × 0.05 mm의 막대형 결정이 수득되었다.
5)-3 X-선 결정 구조의 분석 및 에피토프의 동정
생성된 결정을 퍼플루오로폴리에테르 PFO-X175/08[햄프턴 리서치 코포레이션(Hampton Research Corp.)]에 침지시키고, 후속적으로 액체 질소에서 동결시켰다. X-선 회절 데이터를 빔라인(beamline) BL41XU[SPring-8, 효고(Hyogo), 일본]에 의해 수집하였다. 생성된 회절 상으로부터 소프트웨어 imosflm[CCP4: 공동 컴퓨터 프로젝트(Collaborative Computational Project) No. 4]을 사용하여 회절 강도를 수치화함으로써 결정 구조 인자를 결정하였다. 결정은 6방정계로서 공간 군은 P62이고, 단위 격자는 a = 193.54 옹스트롬, b = 193.54 옹스트롬, 및 c = 43.88 옹스트롬이었다.
생성된 구조 인자 및 상동성 모델의 3차원 구조 좌표를 사용하여 분자 치환법을 수행함으로써 위상을 결정하였다. 계산에 소프트웨어 페이저(phaser)(CCP4: 공동 컴퓨터 프로젝트 No. 4)를 사용하였다. 결정은 비대칭 단위에 1개의 복합체를 함유하였다.
소프트웨어 Refmac5(CCP4: 공동 컴퓨터 프로젝트 No. 4)를 사용하여 구조의 정밀화를 수행하고, 쿠트(Coot) 소프트웨어를 사용하여 모델 수정을 수행하였다. 이러한 조작을 반복적으로 수행하여, 3.3 옹스트롬의 분해능으로 22.1%의 최종 R값 및 27.0%의 자유 R값을 수득하였다. 최종 모델은 C3E-7034 경쇄 영역(도 23, 서열번호 17)의 아미노산 잔기 1 내지 108, C3E-7034 중쇄 영역(도 22, 서열번호 16)의 아미노산 잔기 1 내지 118, CD3ε 영역(도 1, 서열번호 1)의 아미노산 잔기 33 내지 67 및 71 내지 118, 및 CD3γ 영역(도 37, 서열번호 3)의 아미노산 잔기 23 내지 103을 포함하였다. CD3ε 영역(도 1, 서열번호 1)의 아미노산 잔기 68 내지 70, 및 C3E-7034(도 38, 서열번호 19)의 아미노-말단 영역(아미노산 잔기 1), 연결기 부분(아미노산 잔기 120 내지 134), 및 카복실-말단 영역(아미노산 잔기 243 내지 269)은, 이들의 불분명한 전자 밀도때문에 모델에 포함되지 않았다. 도 39는 전체 복합체의 리본 모델과 표면을 보여준다.
도 40은 CD3ε과 C3E-7034의 경쇄 및 중쇄와의 상호작용을 보여준다. 패널 A는, C3E-7034의 경쇄 가변 영역으로부터 4 옹스트롬 거리내에 있는 CD3ε의 아미노산이 모델에서 두꺼운 스틱으로 지시되고, 나머지 아미노산이 모델에서 얇은 스틱으로 지시되는 도면이다. 도면에서, 박스중 잔기 명칭 및 잔기 번호로 표시되는 Ser55, Glu56, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104, 및 Pro105는 C3E-7034의 경쇄 가변 영역으로부터 4 옹스트롬 거리내에 있는 CD3ε의 아미노산 잔기이고, 각각의 아미노산 위치는 서열목록의 서열번호 1중의 위치에 상응한다. 패널 B는, C3E-7034의 중쇄 가변 영역으로부터 4 옹스트롬 거리내에 있는 CD3ε의 아미노산 잔기가 모델에서 두꺼운 스틱으로 지시되고, 나머지 아미노산이 모델에서 얇은 스틱으로 지시되는 도면이다. 도면에서, 박스중 잔기 명칭 및 잔기 번호로 표시되는 Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78, 및 Arg101은 CD3ε의 아미노산이고, 각각의 아미노산 위치는 서열목록의 서열번호 1중의 위치에 상응한다. C3E-7034로부터 4 옹스트롬 이내의 거리내에 있고, C3E-7034에 대한 CD3ε 상의 에피토프로서 해석되는 아미노산 잔기는 다음과 같다: Ser55, Glu56, Leu58, Trp59, Asn65, Ile66, Ser77, Asp78, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104, 및 Pro105.
C3E-7034에 대한 CD3ε 상의 에피토프중에서, Arg101, Gly102, Ser103, Lys104, 및 Pro105가 OKT3 및 UCHT1에 대한 CD3ε 상의 공통적인 에피토프 잔기이다[크제르-니엘센(Kjer-Nielsen) 등의 문헌 "PNAS 101 (2004), p. 7675-80"; 및 아르넷(Arnett) 등의 문헌 "PNAS 101 (2004), p. 16268-73"]. 또한, C3E-7034는, 국제 특허출원 공개공보 제WO2008/119565A2호에 기재된 I2C 및 H2C를 비롯한 항-CD3 항체에 대한 에피토프에 상응하는 서열번호 1에 있는 아미노산 위치 22 내지 48과 상호작용하지 않는 것으로 밝혀졌다. 도 41은 CD3ε의 서열 상의 상호작용 잔기를 보여준다. CD3ε의 신호 서열은 이탤릭체로 표시되고, C3E-7034로부터 4 옹스트롬 거리내에 있는 아미노산은 밑줄쳐져 있다.
( 실시예 6) 인간화된 OKT3 scFv의 제조
6)-1 OKT3 scFv 발현 벡터 pC3E-3000의 구축
마우스 항-CD3 단일클론성 항체 OKT3[Sgro, "Toxicology 105 (1995), 23-29", 오르토클론, 얀센-실라그]의 scFv를 실시예 4)-1-1과 동일한 수법에 의해 제조하고, pcDNA3.3-유래된 동물 세포 발현 벡터에 삽입하였다. 생성된 발현 벡터를 "pC3E-3000"으로서 명명하였다.
6)-2 OKT3 scFv(C3E-3000)의 인간화된 아미노산 서열의 설계
실시예 4)-2-1에 기재된 수법에 기초하여, 인간 하위군 컨센서스 서열 감마 1 및 카파 4를 억셉터로 하여, OKT3의 인간화된 형태로서 작용하는 C3E-3007의 아미노산 서열을 설계하였다. 면역원성 스코어 및 물성에 대한 영향을 고려하여 카파 1 아미노산을 일정 부위에 도입하였다. 도 42(서열번호 36)에 제시된 OKT3 중쇄 가변 영역으로부터, 아미노산 위치 5에서 글루타민이 발린으로 치환되고, 아미노산 위치 11에서 류신이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 12에서 알라닌이 리신으로 치환되고, 아미노산 위치 13에서 아르기닌이 리신으로 치환되고, 아미노산 위치 20에서 메티오닌이 발린으로 치환되고, 아미노산 위치 38에서 리신이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 40에서 아르기닌이 알라닌이 치환되고, 아미노산 위치 48에서 이소류신이 메티오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 67에서 리신이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 68에서 알라닌이 발린으로 치환되고, 아미노산 위치 70에서 류신이 이소류신으로 치환되고, 아미노산 위치 72에서 트레오닌이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 76에서 세린이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 82에서 글루타민이 글루탐산으로 치환되고, 아미노산 위치 87에서 트레오닌이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 91에서 세린이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 114에서 트레오닌이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 115에서 류신이 발린으로 치환되어 설계된 C3E-3007 경쇄의 아미노산 서열이 도 43(서열번호 38)에 기재되어 있다.
도 44(서열번호 37)에 제시된 OKT3 경쇄 가변 영역으로부터, 아미노산 위치 3에서 발린이 글루타민으로 치환되고, 아미노산 위치 4에서 류신이 메티오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 9에서 알라닌이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 10에서 이소류신이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 11에서 메티오닌이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 12에서 세린이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 13에서 알라닌이 발린으로 치환되고, 아미노산 위치 15에서 프롤린이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 18에서 리신이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 19에서 발린이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 21에서 메티오닌이 이소류신으로 치환되고, 아미노산 위치 39에서 세린이 프롤린으로 치환되고, 아미노산 위치 41에서 트레오닌이 리신으로 치환되고, 아미노산 위치 42에서 세린이 알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 59에서 알라닌이 아스파르트산으로 치환되고, 아미노산 위치 60에서 히스티딘이 아르기닌으로 치환되고, 아미노산 위치 62에서 아르기닌이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 69에서 세린이 아스파르트산으로 치환되고, 아미노산 위치 70에서 티로신이 페닐알라닌으로 치환되고, 아미노산 위치 71에서 세린이 트레오닌으로 치환되고, 아미노산 위치 76에서 글리신이 세린으로 치환되고, 아미노산 위치 77에서 메티오닌이 류신으로 치환되고, 아미노산 위치 78에서 글루탐산이 글루타민으로 치환되고, 아미노산 위치 82에서 알라닌이 발린으로 치환되고, 아미노산 위치 99에서 세린이 글루타민으로 치환되고, 아미노산 위치 103에서 류신이 발린으로 치환되어 설계된 C3E-3007 경쇄의 아미노산 서열이 도 45(서열번호 39)에 기재되어 있다.
6)-3 인간화된 OKT3 scFv(C3E-3007) 발현 벡터 pC3E-3007의 구축
C3E-3007 중쇄(도 43(서열번호 38)에 제시됨)의 카복실-말단에 15-아미노산 가요성 연결기를 통해 연결된 C3E-3007 경쇄(도 45(서열번호 39)에 제시됨) 영역을 함유한 scFv의 DNA 서열, 및 이의 전 후의 15-염기 부가 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(진아트 진 신테시스 서비스/써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드). 실시예 4)-3-1과 동일한 방식으로 ORF중 도 46(서열번호 34)의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 C3E-3007 발현 벡터를 구축하였다. 생성된 발현 벡터를 "pC3E-3007"로서 명명하였다.
6)-4 인간화된 OKT3 scFv(C3E-3007)의 발현 및 정제
C3E-3007을 실시예 4)-1-2와 동일한 방식으로 발현시키고 정제하였다. C3E-3007의 아미노산 서열은 도 47(서열번호 35)에 기재되어 있다.
( 실시예 7) 인간화된 항-CD3 scFv의 시험관내 활성
7)-1 인간 CD3으로의 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036)의 결합 활성에 대한 연구
7)-1-1 인간 CD3으로의 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036)의 결합 활성에 대한 유세포분석에 의한 연구
시판되는 인간 PBMC[셀룰라 테크놀로지 리미티드(CTL: Cellular Technology Ltd.)]를 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 적절한 농도로 조정하였다. LIVE/DEAD 고정성 근적외선 사세포 염색 키트(Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit)(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드) 및 항-CD19 항체(베크만 쿨터 인코포레이티드)를 세포에 첨가하고, 이어서 이를 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척하고, 이어서 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 1 × 106 세포/㎖의 농도로 조정하고, 100 ㎕/웰의 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 첨가하고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 각각의 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036)를 100 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 60 분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 펜타-히스 알렉사 플루오르(Penta-His Alexa Fluor) 488(퀴아겐 엔 브이)을 30 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시키고, 이후 유세포분석기[FACS칸토(FACSCanto) II; 벡턴, 딕킨슨 앤 캄파니(Bectron, Dickinson and Comapny)]를 사용하여 검출하였다. 플로우조(트리스타 인코포레이티드)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 사세포 및 CD19-양성 세포가 제거된 분별물에서 알렉사 플루오르 488의 평균 형광 강도(MFI)를 계산하였다. scFv-비보충 샘플의 MFI 값을 scFv-보충 샘플의 MFI 값에서 차감하여 MFI의 상대치(rMFI)를 계산하였다. 도 48에서 볼 수 있듯이, 인간화된 항-CD3 scFv는 인간 CD3에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
7)-1-2 인간 CD3으로의 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036)의 결합 활성에 대한 SPR에 의한 연구
CD3에 대한 각각의 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036)의 친화도를 표면 플라스몬 공명법에 의해 비아코어 T-200(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)을 사용하여 결정하였다. 5가지 상이한 농도의 scFv를 센서 칩 상의 고정화된 CD3내로 주입하였다. 생성된 반응으로부터 R최대값을 추정하고, 이의 1/2에 도달하는 항체 농도를 CD3에 대한 scFv의 해리 상수로서 정의하였다. 결과로서, CD3에 대한 이들 scFv의 해리 상수는 각각 400, 4.5, 22, 및 25 nM였다.
7)-2 인간화된 항체 CD3 scFv(C3E-3007, C3E-7034, 및 C3E-7036)의 사이노몰구스 원숭이 CD3과의 결합 활성에 대한 연구
7)-2-1 사이노몰구스 원숭이 PBMC의 제조
사이노몰구스 원숭이의 혈액으로부터 표준 방법에 따라 셉메이트(SepMate)(스템셀 테크놀로지스 인코포레이티드) 및 림프구 분리 용액[나칼라이 테스크 인코포레이티드(Nacalai Tesque Inc.)]을 사용하여 PBMC를 수집하였다.
7)-2-2 사이노몰구스 원숭이 CD3으로의 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-3007, C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036)의 결합 활성에 대한 유세포분석에 의한 연구
실시예 7)-2-1에서 수득된 사이노몰구스 원숭이 PBMC를 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 적절한 농도로 조정하고, 실시예 7)-1-1과 동일한 방식으로 염색하고 분석하였다. 도 49에서 볼 수 있듯이, 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-7034, C3E-7035, 및 C3E-7036)가 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
7)-3 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-3007 및 C3E-7034)의 T 세포 활성화
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심분리법에 의해 림포라이트(Lympholyte)-H[세다레인(Cedarlane)]를 사용하여 무작위 공여자의 신선한 버피 코트(buffy coat)로부터 분리하였다. LR10[10% 초저 IgG FBS가 함유된 RPMI1640(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)]에 의해 100 nM로 희석된 각각의 인간화된 항-CD3 scFv(C3E-3007 및 C3E-7034) 및 동일한 농도의 항-His 항체(퀴아겐 엔 브이)를 동일한 양으로 혼합하였다. 인간 또는 원숭이 PBMC를 LR10에 의해 2 × 105 세포로 조정하고, 인간화된 항-CD3 scFv 및 항-His 항체의 혼합물과 동일한 양으로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에서 혼합하고, 37℃에서 24 시간 동안 5% CO2 조건하에 배양하였다. 반응 완료후, 반응 용액을 원심분리하고, 분류 버퍼[HBSS(-)(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드), 0.1% BSA(시그마-알드리치 코포레이션), 및 0.1% 아지드화 나트륨(시그마-알드리치 코포레이션)]를 첨가하였다. 원심분리 후, LIVE/DEAD 고정성 근적외선 사세포 염색 키트(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)를 세포에 첨가하고, 이어서 이를 4℃에서 20 분 동안 정치시켰다. 세포를 분류 버퍼로 세척하였다. 이어서, 분류 버퍼로 희석된 PE-표식된 항-CD69 항체(벡턴, 딕킨슨 앤 캄파니) 및 FITC-표식된 항-CD8 항체(벡턴, 딕킨슨 앤 캄파니)를 세포에 첨가하고, 이어서 이를 4℃에서 20 분 동안 정치시켰다. 세포를 분류 버퍼로 세척한 다음, 1% 파라포름알데히드가 함유된 PBS(웨이코 퓨어 케미칼스 인더스트리즈 리미티드)에 재현탁시키고, 이후 유세포분석기[FACS칸토 II; 벡턴, 딕킨슨 앤 캄파니]를 사용하여 검출하였다. 플로우조(트리 스타 인코포레이티드)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 사세포를 제거한 분별물에 대한 CD8 고 발현 및 PE 고 발현 분별물의 비율을 모집단으로부터 백분율(부모의 %)로서 계산하였다. 도 50에서 볼 수 있듯이, 인간화된 항-CD3 scFv는 인간 및 원숭이 CD8 고 발현 세포를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다.
7)-4 인간 및 사이노몰구스 원숭이 CD3과 CDR 변형된 인간화된 항-CD3 scFv의 결합 활성에 대한 유세포분석에 의한 비교
실시예 7)-1-1에서 수득된 인간 PBMC 및 실시예 7)-2-1에서 수득된 사이노몰구스 원숭이 PBMC를 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 적절한 농도로 각각 조정하고, 실시예 7)-1-1과 동일한 방식으로 염색하고 분석하였다. 도 106a 및 106b에서 볼 수 있듯이, CDR 변형된 인간화된 항-CD3 scFv는 인간 및 원숭이 CD3 둘 다에 대하여 결합 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
( 실시예 8) 인간화된 항- TROP2 scFv의 제조
8)-1 HT1-11 scFv 발현 벡터 pHT1-11scFv의 구축
도 51(서열번호 41)에 제시된 HT1-11 scFv의 아미노산을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다(진아트 진 신테시스 서비스/써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드). 합성된 DNA 단편을 pcDNA-3.3TOPO(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)로부터 유래된 벡터내로 인-퓨전 HD PCR 클로닝 키트(클론텍 래보레이토리즈 인코포레이티드)를 사용하여 삽입함으로써, ORF중 도 52(서열번호 40)에 제시된 뉴클레오티드 서열이 함유된 인간화된 항-TROP2 scFv 발현 벡터 pHT1-11scFv를 구축하였다.
8)-2 HT1-11 scFv(HT1-11 scFv)의 발현 및 정제
HT1-11 scFv를 실시예 4)-1-2와 동일한 방식으로 발현시키고 정제하였다.
( 실시예 9) 인간 TROP2로의 인간화된 항- TROP2 scFv(HT1-11 scFv)의 결합 활성에 대한 유세포분석에 의한 평가
인두의 편평상피 세포 암 세포주 FaDu(ATCC) 또는 췌장암 세포주 HPAF-II(ATCC)를 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 적절한 농도로 조정하였다. LIVE/DEAD 고정성 근적외선 사세포 염색 키트를 세포에 첨가하고, 이어서 이를 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 1 × 106 세포/㎖ 농도로 조정하고, 100 ㎕/웰 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 첨가하고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 인간화된 항-TROP2 scFv(HT1-11 scFv)를 100 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트 4℃에서 60 분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 펜타-히스 알렉사 플루오르 488을 30 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척하고, 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시킨 후, 유세포분석기(FACS칸토(상표) II)를 사용하여 검출하였다. 플로우조를 사용하여 데이터를 분석하였다. 사세포가 제거된 분별물에서 알렉사 플루오르 488의 평균 형광 강도(MFI)를 계산하였다. scFv-비보충 샘플의 MFI 값을 scFv-보충 샘플의 MFI 값에서 차감하여 MFI의 상대치(rMFI)를 계산하였다. 도 53에서 볼 수 있듯이, 인간화된 항-TROP2 scFv는 인간 TROP2에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
( 실시예 10) 항- TROP2 -CD3 이중특이적 분자의 제조
10)-1 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터의 구축
10)-1-1 HT1-11 scFv/C3E-7034 이중특이적 분자(T2C-0001) 발현 벡터의 구축
실시예 8)-1에서 제조된 pHT1-11 scFv를 주형으로 하고, HT1-11 scFv의 뉴클레오티드 서열 및 인간 항체 중쇄 신호 서열의 일부를 5' 측에 첨가하고 scFv를 연결하는 연결기의 뉴클레오티드 서열을 3' 측에 첨가하도록 설계된 프라이머를 사용하여, 인서트 DNA 단편을 PCR에 의해 수득하였다. 또한, 실시예 4)-3-1에서 제조된 발현 벡터 pC3E-7034를 주형으로 하고, 신호 서열 및 항-CD3 scFv의 아미노-말단 서열을 코딩하는 프라이머를 사용하여, 항-CD3 scFv DNA가 함유된 전체 벡터 영역을 포함하는 벡터 DNA 단편을 PCR에 의해 수득하였다. 인-퓨전 HD 클로닝 키트(클론텍 래보레이토리즈 인코포레이티드)를 사용하여 이들 DNA 단편을 결찰시켜, ORF중 도 54(서열번호 42)의 뉴클레오티드 서열을 함유한 항-TROP2-항-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터 pT2C-0001을 제조하였다.
10)-1-2 HT1-11 scFv/C3E-3007 이중특이적 분자(T2C-0003) 발현 벡터의 구축
벡터 단편을 제조하기 위한 주형으로서 pC3E-3007을 사용함을 제외하고, 실시예 10)-1-1과 동일한 방식으로 ORF중 도 55(서열번호 44)의 뉴클레오티드 서열을 함유한 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터를 구축하였다. 생성된 발현 벡터를 "pT2C-0003"으로서 명명하였다.
10)-1-3 HT1-11 scFv/C3E-7035 이중특이적 분자(T2C-0005) 발현 벡터의 구축
벡터 단편을 제조하기 위한 주형으로서 pC3E-7035를 사용함을 제외하고, 실시예 10)-1-1과 동일한 방식으로 ORF중 도 56(서열번호 46)의 뉴클레오티드 서열을 함유한 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터를 구축하였다. 생성된 발현 벡터를 "pT2C-0005"로서 명명하였다.
10)-1-4 HT1-11 scFv/C3E-7036 이중특이적 분자(T2C-0006) 발현 벡터의 구축
벡터 단편을 제조하기 위한 주형으로서 pC3E-7036을 사용함을 제외하고, 실시예 10)-1-1과 동일한 방식으로 ORF중 도 57(서열번호 48)의 뉴클레오티드 서열을 함유한 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터를 구축하였다. 생성된 발현 벡터를 "pT2C-0006"으로서 명명하였다.
10)-2 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자의 발현 및 정제
T2C-0001, T2C-0003, T2C-0005 및 T2C-0006을 실시예 4)-1-2와 동일한 방식으로 발현시키고 정제하였다. T2C-0001의 아미노산 서열은 도 58(서열번호 43)에 기재되어 있다. T2C-0003의 아미노산 서열은 도 59(서열번호 45)에 기재되어 있다. T2C-0005의 아미노산 서열은 도 60(서열번호 47)에 기재되어 있다. T2C-0006의 아미노산 서열은 도 61(서열번호 49)에 기재되어 있다.
( 실시예 11) 항- TROP2 -CD3 이중특이적 분자의 시험관내 활성에 대한 평가
11)-1 SPR에 의한 결합 활성 평가
11)-1-1 TROP2로의 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자의 결합 활성
항-인간 IgG 항체에 의해 항원을 포획하고 이중특이적 분자를 피분석물로서 분석하는 포획 방법에 의해, 비아코어 3000(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)을 사용하여 이중특이적 분자를 TROP2로의 그의 결합에 대해 분석하였다. 사용된 항원은 재조합 인간 TROP-2/인간 IgG Fc 융합 형태(알앤디 시스템스 인코포레이티드)였다. 약 2000 RU의 항-인간 IgG(Fc) 항체(인간 항체 캡처 키트, 지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)를 센서 칩 CM5(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)에 아민 커플링 방법에 의해 공유 결합시켰다. 유사하게, 이러한 항체를 기준 세포 상에 고정화시켰다. 사용된 이동 버퍼는 HBS-P[10 mM HEPES(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 및 0.005% 서팩탄트 P20]였다. 이중특이적 분자를 200 nM로부터 1 nM까지 2배 희석 비로 제조하였다. 1 ㎍/㎖ 용액의 항원을 항-인간 IgG(Fc) 항체-고정화 칩 상으로 약 30 초 동안 첨가하였다. 이어서, 각각의 농도의 이중특이적 분자를 30 ㎕/분의 유속으로 300 초 동안 첨가하였다. 후속적으로, 해리 상을 600 초 동안 모니터링하였다. 3 M 염화 마그네슘 용액을 재생 용액으로서 30 초 동안 첨가하였다. 분석 소프트웨어[비아이에이평가(BIAevaluation) 소프트웨어, 버전 4.1.1]의 1:1 결합 모델을 사용하여 데이터를 분석하여, 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 및 해리 상수(KD; KD = kd/ka)를 계산하였다.
11)-1-2 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원으로의 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자의 결합 활성
항원을 고정화하고 항체를 피분석물로서 분석하는 방법에 의해 비아코어 3000(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)을 사용하여 이중특이적 분자를 CD3εγ 항원으로의 그의 결합에 대해 분석하였다. 사용된 항원은 실시예 2)-2-1에서 제조된 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원이었다. 약 100 RU의 항원을 센서 칩 CM5(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시즈 코포레이션)에 아민 커플링 방법에 의해 공유 결합시켰다. 기준 세포로서 항원 단백질을 부가하지 않고 고정화 처리를 수행하였다. 사용된 이동 버퍼는 HBS-P[10 mM HEPES(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 및 0.005% 서팩탄트 P20]였다. 이중특이적 분자를 1 μM(최고 농도)로부터 4 nM까지 2배 희석 비로, 또는 200 nM로부터 1 nM까지 2배 희석 비로 제조하였다. 각각의 농도의 이중특이적 분자를 10 ㎕/분의 유속으로 25 분 동안 항원-고정화 칩에 첨가하고, 이에 결합된 이중특이적 분자의 양을 모니터링하였다. 10 mM 글리신-염산 용액(pH 1.5)을 재생 용액으로서 30 초 동안 첨가하였다. 분석 소프트웨어(비아이에이평가 소프트웨어, 버전 4.1.1)에 의해 데이터를 분석하여, 각각의 농도에서 결합된 이중특이적 분자의 양으로부터 해리 상수 KD를 계산하였다. 결과는 표 2 및 3에 제시되어 있다.
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
11)-2 유세포분석에 의한 결합 활성 평가
11)-2-1 TROP2로의 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자의 결합 활성
실시예 9에서와 동일한 암 세포주를 사용하고, 실시예 9와 동일한 방식으로 염색하고 분석하였다. 도 62에서 볼 수 있듯이, 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자는 TROP2에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
11)-2-2 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원으로의 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자의 결합 활성
세포를 실시예 7)-1-1과 동일한 방식으로 염색하고 분석하였다. 도 63에서 볼 수 있듯이, 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자는 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
11)-2-3 사이노몰구스 원숭이 CD3 항원으로의 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자의 결합 활성
실시예 7)-2-1에서 수득된 사이노몰구스 원숭이 PBMC를 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 적절한 농도로 조정하고, 실시예 7)-1-1과 동일한 방식으로 염색하고 분석하였다. 도 64에서 볼 수 있듯이, 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자(T2C-0001, T2C-0005 및 T2C-0006)는 사이노몰구스 원숭이 CD3 항원에 결합하는 것으로 밝혀졌다.
11)-3 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자의 세포독성 활성에 대한 평가
11)-3-1 표적 세포에서 TROP2의 발현 분석
인두의 편평상피 세포 암 세포주 FaDu(ATCC), 췌장암 세포주 HPAF-II(ATCC), 또는 인간 폐암 세포주 Calu-6 세포를 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 적절한 농도로 조정하였다. LIVE/DEAD 고정성 사세포 염색 키트(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)를 세포에 첨가하고, 이어서 이를 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 2 × 106 세포/㎖ 농도로 조정하고, 100 ㎕/웰 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 접종하고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 항-TROP2 알렉사 플루오르 488 항체[어피메트릭스 이바이오사이언스(Affymetrix eBioscience)] 및 이소타입 대조용 항체(어피메트릭스 이바이오사이언스)를 25 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30 분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시키고, 이후 유세포분석기[사이토믹스(Cytomics) FC500, 베크만 쿨터 인코포레이티드]를 사용하여 검출하였다. 플로우조(트리 스타 인코포레이티드)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 사세포가 제거된 분별물에서 알렉사 플루오르 488의 기하 평균 형광 강도(기하 MFI)를 계산하였다. 도 65A, 65B, 및 65C에서 볼 수 있듯이, TROP2의 발현은 FaDu 및 HPAF-II 세포에서 관찰되었지만, Calu-6 세포에서는 관찰되지 않았다.
11)-3-2 표적 세포의 제조
FaDu, HPAF-II, 또는 Calu-6 세포를 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에 의해 2 × 106 세포/㎖ 농도로 조정하였다. 각각의 세포주에, 세포 현탁액 1 ㎖ 당 100 ㎕의 크롬-51 방사성핵종(퍼킨 엘머 인코포레이티드)을 첨가하고, 세포를 37℃에서 2 시간 동안 5% CO2 조건하에 배양하였다. 세포를 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지로 2회 세척한 다음, 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지중 2 × 105 세포/㎖로 재현탁시키고, 표적 세포로서 사용하였다.
11)-3-3 효과기 세포의 제조
시판되는 동결 PBMC[셀룰라 테크놀로지 리미티드(Cellular Technology Limited)]를 37℃에서 해동시키고, 항-응집물 세정 시약(셀룰라 테크놀로지 리미티드)이 보충된 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지의 용액으로 옮기고, 2회 세척하고, 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지에 의해 1 × 106 세포/㎖로 조정하고, 효과기 세포로서 사용하였다.
11)-3-4 세포독성 검정
실시예 11)-3-2에서 수득된 FaDu 세포, HPAF-II 세포, 또는 Calu-6 세포를 50 ㎕/웰의 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 첨가하였다. 다양한 농도로 조정된 각각의 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자를 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 실시예 11)-3-1-3에서 제조된 효과기 세포를 100 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 실온에서 1000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 후, 세포를 37℃에서 20 내지 24 시간 동안 5% CO2 조건하에 배양하였다. 50 ㎕ 분취량의 상청액을 루마플레이트(LumaPlate)(퍼킨 엘머 인코포레이티드)내로 회수하고, 50℃에서 약 2 시간 동안 건조시킨 후, 플레이트 판독기[탑카운트(TopCount); 퍼킨 엘머 인코포레이티드]를 사용하여 측정하였다. 용해된 세포의 백분율을 다음과 같이 계산하였다:
용해된 세포의 백분율(%) = (A - B) / (C - B) × 100
A: 샘플 웰 카운트
B: 배경(항체-비보충 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체를 첨가하는 대신에 검정을 위한 배지 50 ㎕를 첨가하였다. 나머지 절차는 샘플 웰의 경우와 동일하였다.
C: 최대 방출(계면활성제에 용해된 표적 세포를 함유하는 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체를 첨가하는 대신에 검정을 위한 배지 50 ㎕를 첨가하였다. 100 ㎕의 계면활성제를 첨가하고, 샘플 웰과 동일하게 50 ㎕ 분취량을 루마플레이트로 옮기고, 분석하였다.
도 66A, 66B, 및 66C에서 볼 수 있듯이, 이들 항-TROP2-CD3 이중특이적 분자는 FaDu 세포 및 HPAF-II 세포에 대하여 세포독성 활성을 나타내었다. 한편, 이들 이중특이적 분자는 Calu-6 세포에서 세포독성 활성을 나타내지 않았다.
( 실시예 12) 항- Axl -CD3 이중특이적 분자의 제조
12)-1 항-Axl-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터의 구축
12)-1-1 11D5-T3 scFv/C3E-7034 이중특이적 분자(AXC-0001) 발현 벡터의 구축
h#11D5-T3H(유럽 특허 출원 공개공보 제2270053호의 명세서중 도 12에 기재됨)의 N-말단에 글리신이 첨가된 서열 및 h#11D5-T3L(유럽 특허 출원 공개공보 제2270053호의 명세서중 도 6에 기재됨)을, (GGGGS)를 3회 반복하여 갖는 서열로 구성된 폴리펩티드 연결기를 경유하여 연결시킴으로써 항-Axl 단일 쇄 항체 11D5-T3 scFv의 아미노산 서열을 설계하였다. 이러한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 합성하였다[진아트(GENEART), 써모 피셔 사이언티픽]. 이러한 뉴클레오티드 서열을 주형으로 하고, 인간 항체 중쇄 신호 서열의 일부의 뉴클레오티드 서열을 5' 말단에 첨가하고 scFv를 연결하는 연결기의 뉴클레오티드 서열을 3' 말단에 첨가하도록 설계된 프라이머를 사용하여, 인서트 DNA 단편을 PCR에 의해 수득하였다. 또한, 실시예 4)-3-1에서 제조된 발현 벡터 pC3E-7034를 주형으로 하고 인간 항체 중쇄 신호 서열 및 항-CD3 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여, CD3 scFv DNA가 함유된 전체 벡터 영역을 PCR 증폭시킴으로써 벡터 DNA 단편을 수득하였다. 인-퓨전 HD 클로닝 키트(클론텍 래보레이토리즈 인코포레이티드)를 사용하여 결찰된 DNA 단편은, ORF중 도 97(서열번호 89)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유한 항-AXL-항-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터 pAXC-0001을 생성하였다.
12)-1-2 11D5-T3 scFv/C3E-7036 이중특이적 분자(AXC-0002) 발현 벡터의 구축
벡터 단편을 제조하기 위한 주형으로서 pC3E-7036을 사용함을 제외하고, 실시예 10)-1-1과 동일한 방식으로 ORF중 도 99(서열번호 91)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유한 항-AXl-항-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터를 구축하였다. 생성된 발현 벡터를 "pAXC-0002"로서 명명하였다.
12)-2 항-AxL-CD3 이중특이적 분자의 발현 및 정제
AXC-0001 및 AXC-0002를 실시예 4)-1-2와 동일한 방식으로 발현시키고 정제하였다. AXC-0001의 아미노산 서열은 도 98(서열번호 90)에 기재되어 있다. AXC-0002의 아미노산 서열은 도 100(서열번호 92)에 기재되어 있다.
( 실시예 13) 항- Axl -CD3 이중특이적 분자의 시험관내 활성에 대한 평가
13)-1 표적 세포에서 Axl의 발현 분석
인간 폐암 세포주 A549(ATCC), 인간 췌장암 세포주 PANC-1(ATCC) 또는 MIA PaCa-2(ATCC), 인간 골수종 세포주 U266B1(ATCC), 또는 맨틀 세포 림프종 세포주 Jeko-1(ATCC)을 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 적절한 농도로 조정하였다. LIVE/DEAD 고정성 사세포 염색 키트(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)를 세포에 첨가하고, 이어서 이를 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 2 × 106 세포/㎖ 농도로 조정하고, 100 ㎕/웰 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 접종하고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 항-Axl 항체[알디 시스템스 인코포레이티드(RD Systems, Inc.)] 및 이소타입 대조용 항체(알디 시스템스 인코포레이티드)를 25 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30 분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 알렉사 플루오르 488 항-마우스 IgG 항체(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)를 25 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30 분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시키고, 이후 유세포분석기(사이토믹스 FC500, 베크만 쿨터 인코포레이티드)를 사용하여 검출하였다. 플로우조(트리 스타 인코포레이티드)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 사세포가 제거된 분별물에서 알렉사 플루오르 488의 기하 평균 형광 강도(기하 MFI)를 계산하였다. 도 107A, 107B, 107C, 107D, 및 107E에서 볼 수 있듯이, Axl의 발현은 A549, PANC-1, 및 MIA PaCa-2에서 관찰되었지만, U266B1 및 Jeko-1에서는 관찰되지 않았다.
13)-2 표적 세포의 제조
A549, PANC-1, MIA PaCa-2, U266B1, 및 Jeko-1을 각각 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에 의해 2 × 106 세포/㎖의 농도로 조정하였다. 각각의 세포주에, 세포 현탁액 1 ㎖ 당 100 ㎕의 크롬-51 방사성핵종(퍼킨 엘머 인코포레이티드)을 첨가하고, 세포를 37℃에서 2 시간 동안 5% CO2 조건하에 배양하였다. 세포를 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지로 2회 세척한 다음, 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지중 2 × 105 세포/㎖로 재현탁시키고, 표적 세포로서 사용하였다.
13)-3 효과기 세포의 제조
시판되는 동결 PBMC(셀룰라 테크놀로지 리미티드)를 37℃에서 해동시키고, 항-응집물 세정 시약(셀룰라 테크놀로지 리미티드)이 보충된 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지의 용액으로 옮기고, 2회 세척한 다음, 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지에 의해 1 × 106 세포/㎖로 조정하고, 효과기 세포로서 사용하였다.
13)-4 세포독성 검정
실시예 13)-2에서 수득된 A549, PANC-1, MIA PaCa-2, U266B1, 또는 Jeko-1 세포를 50 ㎕/웰의 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 첨가하였다. 다양한 농도로 조정된 각각의 항-Axl CD3 이중특이적 분자를 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 실시예 13)-3에서 제조된 효과기 세포를 100 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 실온에서 1000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 후, 세포를 37℃에서 20 내지 24 시간 동안 5% CO2 조건하에 배양하였다. 50 ㎕ 분취량의 상청액을 루마플레이트(퍼킨 엘머 인코포레이티드)로 옮기고, 50℃에서 약 2 시간 동안 건조시킨 후, 플레이트 판독기(탑카운트; 퍼킨 엘머 인코포레이티드)를 사용하여 측정하였다. 용해된 세포의 백분율을 하기 식에 따라 계산하였다:
용해된 세포의 백분율(%) = (A - B) / (C - B) × 100
A: 샘플 웰 카운트
B: 배경(항체-비보충 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체를 첨가하는 대신에 검정을 위한 배지 50 ㎕를 첨가하였다. 나머지 절차는 샘플 웰의 경우와 동일하였다.
C: 최대 방출(계면활성제에 용해된 표적 세포를 함유하는 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체를 첨가하는 대신에 검정을 위한 배지 50 ㎕를 첨가하였다. 100 ㎕의 계면활성제를 첨가하고, 샘플 웰과 동일하게 50 ㎕ 분취량을 루마플레이트로 옮기고, 분석하였다.
도 108A, 108B, 108C, 108D, 및 108E에서 볼 수 있듯이, 이들 항-Axl CD3 이중특이적 분자는 A549, PANC-1, 및 MIA PaCa-2에 대하여 세포독성 활성을 나타내었다. 한편, 이들 이중특이적 분자는 U266B1 또는 Jeko-1에 대하여 세포독성 활성을 나타내지 않았다.
( 실시예 14) 항- HLA -A2/ MAGEC1 -CD3 이중특이적 분자 발현 벡터의 제조
14)-1 항-HLA-A2/MAGEC-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터의 구축
14)-1-1 MAG-032 scFv/C3E-7034 이중특이적 분자(MGC-0001) 발현 벡터의 구축
HLA-A2/MAGEC1에 특이적으로 결합하는 MAG-032 scFv를 인간 항체 파아지 라이브러리로부터 수득하였다. MAG-032 scFv의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 주형으로 하고, 인간 항체 중쇄 신호 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 5' 말단에 첨가하고 scFv를 연결하는 연결기 및 C3E-7034의 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 3' 말단에 첨가하도록 설계된 프라이머를 사용하여, MAG-032 scFv의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인서트 DNA 단편을 PCR에 의해 수득하였다. 또한, 실시예 4)-3-1에서 제조된 발현 벡터 pC3E-7034를 주형으로 하고 인간 항체 중쇄 신호 서열, 및 항-CD3 scFv의 아미노-말단 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머를 사용하여, 항-CD3 scFv DNA가 함유된 전체 벡터 영역의 PCR 증폭에 의해 벡터 DNA 단편을 수득하였다. 인-퓨전 HD 클로닝 키트(클론텍 래보레이토리즈 인코포레이티드)를 사용하여 DNA 단편을 결찰시켜, ORF중 도 101(서열번호 93)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유한 항-HLA-A2/MAGEC1-항-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터 pMGC-0001을 제조하였다.
14)-1-2 MAG-032 scFv/C3E-7036 이중특이적 분자(MGC-0002) 발현 벡터의 구축
벡터 단편을 제조하기 위한 주형으로서 pC3E-7036을 사용함을 제외하고, 실시예 14)-1-1과 동일한 방식으로 ORF중 도 103(서열번호 95)에 제시된 뉴클레오티드 서열을 함유한 항-HLA-A2/MAGEC1-CD3 이중특이적 분자 발현 벡터를 구축하였다. 생성된 발현 벡터를 "pMGC-0002"로서 명명하였다.
14)-2 항-HLA-A2/MAGEC1-CD3 이중특이적 분자의 발현 및 정제
MGC-0001 및 MGC-0002를 실시예 4)-1-2와 동일한 방식으로 발현시키고 정제하였다. MGC-0001의 아미노산 서열은 도 102(서열번호 94)에 나열되어 있다. MGC-0002의 아미노산 서열은 도 104(서열번호 96)에 나열되어 있다.
( 실시예 15) 항- HLA -A2/ MAGEC1 -CD3 이중특이적 분자의 시험관내 활성에 대한 평가
15)-1 표적 세포에서 HLA-A2/MAGEC1의 발현 분석
인간 림프아구 융합 세포주 T2(ATCC) 세포를 20% FBS가 함유된 AIM-V 배지(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에 의해 적절한 농도로 조정하였다. 도 106a 및 106b(서열번호 97)의 MAGEC1 펩티드[시그마 제노시스(Sigma Genosys)] 또는 DMSO를 세포에 첨가하고, 이어서 37℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 20% FBS가 함유된 AIM-V 배지로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 적절한 농도로 조정하였다. LIVE/DEAD 고정성 사세포 염색 키트(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)를 세포에 첨가하고, 이어서 이를 4℃에서 30분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 2 × 106 세포/㎖ 농도로 조정하고, 100 ㎕/웰 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 접종하고, 원심분리하여 상청액을 제거하였다. 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 항-HLA-A2/MAGEC1 항체(MAG032 scFv)를 25 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30 분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척하였다. 이어서, 5% FBS가 함유된 PBS에 의해 희석된 펜타-히스 알렉사 플루오르 488(퀴아겐 엔 브이)을 25 ㎕/웰의 농도로 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30 분 동안 정치시켰다. 세포를 5% FBS가 함유된 PBS로 2회 세척한 다음, 5% FBS가 함유된 PBS에 재현탁시키고, 이후 유세포분석기(사이토믹스 FC500, 베크만 쿨터 인코포레이티드)를 사용하여 검출하였다. 플로우조(트리 스타 인코포레이티드)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 사세포가 제거된 분별물에서 알렉사 플루오르 488의 기하 평균 형광 강도(기하 MFI)를 계산하였다. 도 109A 및 109B에서 볼 수 있듯이, HLA-A2/MAGEC1의 발현은 MAGEC1 펩티드가 보충된 T2 세포에서 관찰되었지만, DMSO가 보충된 T2 세포에서는 관찰되지 않았다.
15)-2 표적 세포의 제조
T2 세포를 20% FBS가 함유된 AIM-V 배지(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에 의해 적절한 농도로 조정하였다. MAGEC1 펩티드 또는 DMSO를 세포에 첨가하고, 이어서 이를 37℃에서 4 시간 동안 항온처리하였다. 세포를 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지(써모 피셔 사이언티픽 인코포레이티드)에 의해 2 × 106 세포/㎖의 농도로 조정하였다. 이러한 세포주에, 세포 현탁액 1 ㎖ 당 100 ㎕의 크롬-51 방사성핵종(퍼킨 엘머 인코포레이티드)을 첨가하고, 세포를 37℃에서 2 시간 동안 5% CO2 조건하에 배양하였다. 세포를 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지로 2회 세척한 다음, 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지중 2 × 105 세포/㎖로 재현탁시키고, 표적 세포로서 사용하였다.
15)-3 효과기 세포의 제조
시판되는 동결 PBMC(셀룰라 테크놀로지 리미티드)를 37℃에서 해동시키고, 항-응집물 세정 시약(셀룰라 테크놀로지 리미티드)이 보충된 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지의 용액으로 옮기고, 2회 세척한 다음, 10% FBS가 함유된 RPMI1640 배지에 의해 1 × 106 세포/㎖로 조정하고, 효과기 세포로서 사용하였다.
15)-4 세포독성 검정
실시예 15)-2에서 수득된 T2 세포를 50 ㎕/웰의 농도로 96-웰 U-형 바닥의 마이크로플레이트에 첨가하였다. 다양한 농도로 조정된 각각의 항-HLA-A2/MAGEC1-CD3 이중특이적 분자를 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 실시예 15)-3에서 제조된 효과기 세포를 100 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 실온에서 1000 rpm으로 1 분 동안 원심분리한 후, 세포를 37℃에서 20 내지 24 시간 동안 5% CO2 조건하에 배양하였다. 50 ㎕ 분취량의 상청액을 루마플레이트(퍼킨 엘머 인코포레이티드)에 회수하고, 50℃에서 약 2 시간 동안 건조시킨 후, 플레이트 판독기(탑카운트; 퍼킨 엘머 인코포레이티드)를 사용하여 측정하였다. 용해된 세포의 백분율을 하기 식에 따라 계산하였다:
용해된 세포의 백분율(%) = (A - B) / (C - B) × 100
A: 샘플 웰 카운트
B: 배경(항체-비보충 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체를 첨가하는 대신에 검정을 위한 배지 50 ㎕를 첨가하였다. 나머지 절차는 샘플 웰의 경우와 동일하였다.
C: 최대 방출(계면활성제에 용해된 표적 세포를 함유하는 웰) 카운트의 평균치(n = 3). 항체를 첨가하는 대신에 검정을 위한 배지 50 ㎕를 첨가하였다. 100 ㎕의 계면활성제를 첨가하고, 샘플 웰과 동일하게 50 ㎕ 분취량을 루마플레이트로 옮기고, 분석하였다.
도 110A 및 110B에서 볼 수 있듯이, 이들 항-HLA-A2/MAGEC1-CD3 이중특이적 분자는 MAGEC1 펩티드가 보충된 T2 세포에 대하여 세포독성 활성을 나타내었다. 한편, 이들 이중특이적 분자는 DMSO가 보충된 T2 세포에 대하여 세포독성 활성을 나타내지 않았다.
[산업상의 이용가능성]
본 발명의 인간화된 항-CD3 항체는 인간 CD3에 결합하고, 또한 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합한다. 그러므로, 본 발명의 인간화된 항-CD3 항체는 의약품 개발을 위한 비임상적 시험에서 유리하게 사용될 수 있다.
[서열목록 프리 텍스트]
서열번호 1: 인간 CD3ε의 아미노산 서열
서열번호 2: 인간 CD3δ의 아미노산 서열
서열번호 3: 인간 CD3γ의 아미노산 서열
서열번호 4: 인간 CD3εγ 단일-쇄 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 5: His-scCD3 항원의 아미노산 서열
서열번호 6: C3-147의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 7: (C3-147_VH AA): C3-147의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 8: (C3-147_VL DNA): C3-147의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 9: (C3-147_VL AA): C3-147의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 10: (G4S 연결기 센스):
서열번호 11: (G4S 연결기 안티센스):
서열번호 12: (C3E-7000_VH AA): C3E-7000의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 13: (C3E-7000_VL AA): C3E-7000의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 14: (C3E-7000 ORF): C3E-7000을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 15: (C3E-7000 AA): C3E-7000의 아미노산 서열
서열번호 16: (C3E-7034_VH AA): C3E-7034의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 17: C3E-7034의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 18: (C3E-7034 ORF): C3E-7034를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 19: (C3E_7034 AA): C3E-7034의 아미노산 서열
서열번호 20: (C3E-7035_VL AA): C3E-7035의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 21: (C3E-7035 ORF): C3E-7035를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 22: (C3E_7035 AA): C3E-7035의 아미노산 서열
서열번호 23: (C3E-7036_VL_AA): C3E-7036의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 24: (C3E-7036 ORF): C3E-7036을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 25: (C3E_7036 AA): C3E-7036의 아미노산 서열
서열번호 26: (7000_CDR-H1): C3E-7000계의 CDR-H1의 아미노산 서열
서열번호 27: (7000_CDR-H2): C3E-7000계의 CDR-H2의 아미노산 서열
서열번호 28: (7000_CDR-H3): C3E-7000계의 CDR-H3의 아미노산 서열
서열번호 29: (7000_CDR-L1): C3E-7000계의 CDR-L1의 아미노산 서열
서열번호 30: (7000_CDR-L2): C3E-7000계의 CDR-L2의 아미노산 서열
서열번호 31: (7000_CDR-L3): C3E-7000계의 CDR-L3의 아미노산 서열
서열번호 32: (C3E-3000 ORF): OKT3 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 33: (C3E-3000 AA): OKT3 scFv의 아미노산 서열
서열번호 34: (C3E-3007 ORF): C3E-3007 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 35: (C3E-3007 AA): C3E-3007 scFv의 아미노산 서열
서열번호 36: (C3E-3000_VH AA): OKT3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 37: (C3E-3000_VL AA): OKT3의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 38: (C3E-3007_VH AA): C3E-3007의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 39: (C3E-3007_VL AA): C3E-3007의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 40: (HT1-11 ORF): HT1-11 scFv를 코딩하는 뉴클레오티드 서열
서열번호 41: (HT1-11 AA): HT1-11 scFv의 아미노산 서열
서열번호 42: (T2C-0001 ORF): T2C-0001을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 43: (T2C-0001 AA): T2C-0001의 아미노산 서열
서열번호 44: (T2C-0003 ORF): T2C-0003을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 45: (T2C-0003 AA): T2C-0003의 아미노산 서열
서열번호 46: (T2C-0005 ORF): T2C-0005를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 47: (T2C-0005 AA): T2C-0005의 아미노산 서열
서열번호 48: (T2C-0006 ORF): T2C-0006을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 49: (T2C-0006 AA): T2C-0006의 아미노산 서열
서열번호 50: 중쇄 유전자 증폭을 위한 센스 프라이머의 아미노산 서열
서열번호 51: 중쇄 유전자 증폭을 위한 1회차 안티센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 52: 중쇄 유전자 증폭을 위한 2회차 안티센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 53: 경쇄 유전자 증폭을 위한 센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 54: 경쇄 유전자 증폭을 위한 1회차 안티센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 55: 경쇄 유전자 증폭을 위한 2회차 안티센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 56: 중쇄 서열 결정용 센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 57: 경쇄 서열 결정을 위한 안티센스 프라이머 1의 뉴클레오티드 서열
서열번호 58: 경쇄 서열 결정을 위한 안티센스 프라이머 2의 뉴클레오티드 서열
서열번호 59: C3E-7078을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 60: C3E-7078의 아미노산 서열
서열번호 61: C3E-7079를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 62: C3E-7079의 아미노산 서열
서열번호 63: C3E-7085를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 64: C3E-7085의 아미노산 서열
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서열번호 66: C3E-7086의 아미노산 서열
서열번호 67: C3E-7087을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 68: C3E-7087의 아미노산 서열
서열번호 69: C3E-7088을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 70: C3E-7088의 아미노산 서열
서열번호 71: C3E-7089를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 72: C3E-7089의 아미노산 서열
서열번호 73: C3E-7090을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 74: C3E-7090의 아미노산 서열
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서열번호 76: C3E-7091의 아미노산 서열
서열번호 77: C3E-7092를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 78: C3E-7092의 아미노산 서열
서열번호 79: C3E-7093을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 80: C3E-7093의 아미노산 서열
서열번호 81: C3E-7094를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 82: C3E-7094의 아미노산 서열
서열번호 83: C3E-7095를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 84: C3E-7095의 아미노산 서열
서열번호 85: C3E-7078에 대한 센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 86: C3E-7078에 대한 안티센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 87: C3E-7079에 대한 센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 88: C3E-7079에 대한 안티센스 프라이머의 뉴클레오티드 서열
서열번호 89: (AXC-0001 ORF): AXC-0001을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 90: (AXC-0001 AA): AXC-0001의 아미노산 서열
서열번호 91: (AXC-0002 ORF): AXC-0002를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 92: (AXC-0002 AA): AXC-0002의 아미노산 서열
서열번호 93: (MGC-0001 ORF): MGC-0001을 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 94: (MGC-0001 AA): MGC-0001의 아미노산 서열
서열번호 95: (MGC-0002 ORF): MGC-0002를 코딩하는 ORF 뉴클레오티드 서열
서열번호 96: (MGC-0002 AA): MGC-0002의 아미노산 서열
서열번호 97: (MAGEC1 펩티드): MAGEC1 펩티드의 아미노산 서열
서열번호 98: (변이체의 CDRH2): CDR 변이체의 CDRH2의 아미노산 서열
서열번호 99: (변이체의 CDRL2): CDR 변이체의 CDRL2의 아미노산 서열
서열번호 100: (C3E-7034 변이체의 VH): C3E-7034의 CDR 변이체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 101: (C3E-7034 변이체의 VL): C3E-7034의 CDR 변이체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 102: (C3E-7035 변이체의 VL): C3E-7035의 CDR 변이체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
서열번호 103: (C3E-7036 변이체의 VL): C3E-7036의 CDR 변이체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열
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ccagatgggt gctgagcgga 60 caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 120 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gactacgaca tggactgggt ccgccaggct 180 ccagggaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatctg atgaaaacac taaatactac 240 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 300 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc aacctatacc 360 agcacctggt atgccgttga ctcctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 420 ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcggga gtgatgttgt gatgactcag 480 tctccactct ccctgcccgt cacccctgga gagccggcct ccatctcctg caggtctagt 540 cagagcctcc tgcatagtaa cggaaagaac tatttggatt ggtacctgca gaagccaggg 600 cagtctccac agctcctgat ctatttgggt tctaatcggg cctccggggt ccctgacagg 660 ttcagtggca gtggatcagg cacagatttt acactgaaga tcagcagagt ggaggctgag 720 gatgttgggg tttattactg catgcaaact cttcaaaccc cctacacttt tggccagggg 780 accaaggtgg aaatcaaacg tgggggaggc ggttcagaag tgcagctggt ggaatccggg 840 gggggcctgg tgcagcctgg ggggagcctg agactgagtt gtgccgcctc tggggtgaca 900 tttaactact atggcatgtc ttggatccgc caggcacctg gaaagggcct ggagtgggtg 960 gccagcatca ctaattccgg cgggcgaatc tactatcccg acagcgtcaa gggcaggttc 1020 acaatttccc gcgagaacac acagaaaact ctgtacctgc agatgaatag cctgagagcc 1080 gaagatacag ctgtgtacta ttgcactctg gacggcaggg atgggtgggt cgcctattgg 1140 gggcagggaa ccctggtgac agtcagctcc ggaggaggag gatctggcgg aggaggcagt 1200 gggggaggcg ggtcaaactt tatgctcact cagccgtcct ctgtttctgg cgtacctggc 1260 caacgggtga ccattagctg tacgggtaat accgggaata tcgggtctaa ctacgtgaac 1320 tggtatcagc agcttccagg gacagctccc aagttgctga tctatcgcga cgacaaaaga 1380 ccctcagggg tccctgaccg atttagtggc agcaaaagcg gtacttccgc ttccctggcg 1440 ataaccggct ttcaggccga agatgaggca gactactatt gccagtcata ttccagcggc 1500 ttcatcttcg gaggcggaac taagctgaca gtgttgggcg cggccgcagg tgcaggtggt 1560 gattacaaag atgatgacga taaaggtgca gcggcgcatc accatcatca ccac 1614 <210> 96 <211> 519 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MGC-0002 AA <400> 96 Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp 20 25 30 Tyr Asp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ala Val Ile Ser Ser Asp Glu Asn Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Thr Tyr Thr Ser Thr Trp Tyr Ala Val Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu 130 135 140 Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Lys Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr 165 170 175 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser 180 185 190 Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Met Gln Thr Leu Gln Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln 225 230 235 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 245 250 255 Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 260 265 270 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Thr Phe Asn Tyr Tyr Gly Met Ser 275 280 285 Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile 290 295 300 Thr Asn Ser Gly Gly Arg Ile Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg 305 310 315 320 Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Thr Gln Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met 325 330 335 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Leu Asp 340 345 350 Gly Arg Asp Gly Trp Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 355 360 365 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 370 375 380 Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Val Pro 385 390 395 400 Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Thr Gly Asn Ile Gly 405 410 415 Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys 420 425 430 Leu Leu Ile Tyr Arg Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg 435 440 445 Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly 450 455 460 Phe Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ser Ser 465 470 475 480 Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala 485 490 495 Ala Gly Ala Gly Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ala Ala 500 505 510 Ala His His His His His His 515 <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ile Leu Phe Gly Ile Ser Leu Arg Glu Val 1 5 10 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of variants <220> <221> Xaa <222> (3)..(3) <223> the first Xaa is any naturally occurring amino acid <220> <221> Xaa <222> (4)..(4) <223> the second Xaa is any naturally occurring amino acid <400> 98 Ile Thr Xaa Xaa Gly Gly Arg Ile 1 5 <210> 99 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of variants <220> <221> X <222> (2)..(2) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid <400> 99 Arg Xaa Asp 1 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naturally occurring amino acid <400> 101 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr Gly Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln His Glu Gly Ser Ser Pro Thr Thr Ile 35 40 45 Ile Tyr Arg Xaa Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Lys Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Asn 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Ser Tyr Ser Ser 85 90 95 Gly Phe Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 102 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of C3E-7035 variants <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid <400> 102 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Val Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Arg Asn Thr Gly Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Xaa Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Phe Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe 85 90 95 Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 103 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL of C3E-7036 variants <220> <221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52) <223> Xaa is any naturally occurring amino acid <400> 103 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Val Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Asn Thr Gly Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Xaa Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Phe Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ser Ser Gly Phe 85 90 95 Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

Claims (55)

  1. 중쇄 서열이 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열번호 98로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하고,
    경쇄 서열이 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열번호 99로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 포함하는
    항체 또는 항체의 항원-결합 단편으로서,
    인간 CD3 및 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    CDRH2에서, 첫 번째 Xaa가 A, E, G, H, I, L, T, V, R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이거나, 첫 번째 Xaa가 N이고, 두 번째 Xaa가 E, R, F, Y, L, V, I, K 및 T로 구성된 군으로부터 선택되고,
    CDRL2에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는,
    인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    CDRH2에서, 첫 번째 Xaa가 R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이고,
    CDRL2에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는,
    인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    중쇄 서열이 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 갖는 가변 영역을 포함하고,
    CDRH1이 서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고,
    CDRH2가 서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고,
    CDRH3이 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고,
    경쇄 서열이 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 갖는 가변 영역을 포함하고,
    CDRL1이 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고,
    CDRL2가 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열로 구성되고,
    CDRL3이 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는,
    인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 서열이 서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는. 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서,
    서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열에서, 첫 번째 Xaa가 A, E, G, H, I, L, T, V, R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이거나, 첫 번째 Xaa가 N이고, 두 번째 Xaa가 E, R, F, Y, L, V, I, K 및 T로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  7. 제5항에 있어서,
    서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열에서, 첫 번째 Xaa가 R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S인, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄 가변 영역이 서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  9. 제8항에 있어서,
    서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  10. 제5항에 있어서,
    중쇄 가변 영역 서열이 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  11. 제8항에 있어서,
    경쇄 가변 영역 서열이 서열번호 17, 20 및 23중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편으로서,
    서열번호 100으로 표시되는 아미노산 서열에서, 첫 번째 Xaa가 A, E, G, H, I, L, T, V, R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이거나, 첫 번째 Xaa가 N이고, 두 번째 Xaa가 E, R, F, Y, L, V, I, K 및 T로 구성된 군으로부터 선택되고,
    서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는,
    항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서,
    서열번호 100에서, 첫 번째 Xaa가 R 및 S로 구성된 군으로부터 선택되고, 두 번째 Xaa가 S이고,
    서열번호 101, 102 및 103중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열에서, Xaa가 Q, A, G, S, N 및 D로 구성된 군으로부터 선택되는,
    항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    서열번호 60의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 60의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 64의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 64의 135번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 66의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 66의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 68의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 68의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 70의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 70의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 72의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 72의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 74의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 74의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 76의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 76의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 78의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 78의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 80의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 80의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 82의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 82의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하거나,
    서열번호 84의 2번째 내지 119번째 아미노산 잔기를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 84의 135번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는
    항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  15. 제1항, 제4항, 제5항, 제8항, 제10항 및 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 연결기, 및 서열번호 17, 20 및 23중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
    가변 영역이 아미노-말단으로부터 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 순서로 결합하거나, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 순서로 결합하는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편으로서,
    임의적으로 i) 양쪽 가변 영역 사이에 연결기를 갖고, ii) 아미노-말단 측의 가변 영역의 아미노-말단에 글리신 잔기를 갖고, iii) 카복실-말단 측의 가변 영역의 카복실-말단에 연결기, FLAG 태그 및/또는 HIS 태그를 갖는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  17. 제16항에 있어서,
    서열번호 64의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 66의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 68의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 70의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 72의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 74의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 75의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 76의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 80의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 82의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 또는
    서열번호 84의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열
    을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  18. 제16항에 있어서,
    서열번호 19의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 22의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 25의 2번째 내지 267번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 60의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 64의 2번째 내지 267번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 66의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 68의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 70의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 72의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 74의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 76의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 78의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 80의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열,
    서열번호 82의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열, 또는
    서열번호 84의 2번째 내지 269번째 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열
    을 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  19. 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 상보성 가닥과 함께 엄격한 조건하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 함유된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  20. 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 중쇄의 아미노산 서열에 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 경쇄의 아미노산 서열에 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  21. 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 중쇄에 함유된 아미노산 서열로부터의 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 유래된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 함유된 경쇄에 함유된 아미노산 서열로부터의 1개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 유래된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  22. 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 결합하는 인간 CD3 상의 동일한 부위에 결합하고, 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  23. 인간 CD3에 결합하는 제14항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 경쟁하고, 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  24. 제22항에 있어서,
    항체가 결합하는 인간 CD3 상의 부위가 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에서 55번째 세린(Ser), 56번째 글루탐산(Glu), 58번째 류신(Leu), 59번째 트립토판(Trp), 65번째 아스파라긴(Asn), 66번째 이소류신(Ile), 77번째 세린(Ser), 78번째 아스파르트산, 101번째 아르기닌(Arg), 101번째 글리신(Gly), 103번째 세린(Ser), 104번째 리신(Lys) 및 105번째 프롤린(Pro)으로 구성된 군으로부터 선택되는 7개 이상의 아미노산에 의해 구성되는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  25. 제1항 내지 제17항 및 제19항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 IgG인, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  26. 제1항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단편이 Fab, F(ab)', Fv, scFv 및 sdAb로 구성된 군으로부터 선택되는, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  27. 제1항 내지 제17항 및 제19항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서,
    항체가 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 인간 항체인, 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  28. 제1항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 제27항에 있어서,
    서열번호 19의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 22의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 25의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 60의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 64의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 66의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 68의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 70의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 72의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 74의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 76의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 78의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 80의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열,
    서열번호 82의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열, 또는
    서열번호 84의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 서열
    로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  30. 제28항 또는 제29항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  31. 제28항 또는 제29항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제30항에 따른 벡터를 포함하거나, 제1항 내지 제27항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 생산하는 세포.
  32. 제31항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및
    인간 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 배양액으로부터 회수하는 단계
    를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
  33. 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하고, 제32항에 따른 방법에 의해 수득되는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편.
  34. 제1항 내지 제27항 및 제33항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.
  35. 제1항 내지 제27항 및 제33항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하고, 항원 결합 활성을 갖는 분자.
  36. 제35항에 있어서,
    다중특이적인 분자.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서,
    제1항 내지 제27항 및 제33항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 더하여 1개 또는 2개 이상의 추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편을 추가로 포함하는 분자.
  38. 제37항에 있어서,
    추가적인 항체의 항원-결합 단편이 Fab, F(ab)', Fv, scFv 또는 sdAb인, 분자.
  39. 제38항에 있어서,
    Fc를 포함하는 분자.
  40. 제37항 내지 제39항중 어느 한 항에 있어서,
    추가적인 항체가 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 인간화된 항체 또는 인간 항체인, 분자.
  41. 제37항 또는 제38항에 있어서,
    추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편이 제1항 내지 제27항 및 제33항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 연결기를 통해 또는 연결기 없이 결합되는, 분자.
  42. 제41항에 있어서,
    추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편의 아미노산 서열의 카복실-말단이 연결기와 결합되고, 상기 연결기의 아미노산 서열의 카복실-말단이 제1항 내지 제27항 및 제33항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편과 추가로 결합되는, 분자.
  43. 제42항에 있어서,
    추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편의 아미노산 서열의 카복실-말단이 연결기와 결합되고,
    상기 연결기의 아미노산 서열의 카복실-말단이
    서열번호 19의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 22의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기로 구성된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 또는
    서열번호 25의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기로 구성된 항체 또는 항체의 항원-결합 단편
    과 추가로 결합되는
    아미노산 서열을 포함하는
    분자.
  44. 제35항 내지 제42항중 어느 한 항에 있어서,
    제1항 내지 제27항 및 제33항중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하되, 가변 영역이 아미노-말단으로부터 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 순서로 결합하거나, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 순서로 결합하는, 분자로서,
    임의적으로 i) 양쪽 가변 영역 사이에 연결기를 갖고, ii) 아미노-말단 측의 가변 영역의 아미노-말단에 글리신 잔기를 갖고, iii) 카복실-말단 측의 가변 영역의 카복실-말단에 연결기, FLAG 태그 및/또는 HIS 태그를 갖는 분자.
  45. 제44항에 있어서,
    추가적인 항체 또는 추가적인 항체의 항원-결합 단편이
    서열번호 19의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 25의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 60의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 64의 2번째 내지 241번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 66의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 68의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 70의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 72의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 74의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 76의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 78의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 80의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편,
    서열번호 82의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편, 또는
    서열번호 84의 2번째 내지 243번째 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편
    과 연결기를 통해 또는 연결기 없이 결합되는,
    분자.
  46. 제36항 내지 제45항중 어느 한 항에 있어서,
    추가적인 항체가 항암 표적 항체인, 분자.
  47. 제36항 내지 제46항중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이적인 분자.
  48. 제35항 내지 제47항중 어느 한 항에 있어서,
    폴리펩티드인 분자.
  49. 제48항에 따른 분자의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  50. 제49항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  51. 제49항에 따른 폴리뉴클레오티드, 제50항에 따른 벡터, 또는 제48항에 따른 분자를 생산하는 세포.
  52. 제51항에 따른 세포를 배양하는 단계; 및
    인간 CD3에 결합하는 분자를 배양액으로부터 회수하는 단계
    를 포함하는, 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하는 분자를 생산하는 방법.
  53. 인간 CD3 및 사이노몰구스 원숭이 CD3에 결합하고, 제52항에 따른 방법에 의해 수득되는 분자.
  54. 제35항 내지 제48항 및 제53항중 어느 한 항에 따른 분자를 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.
  55. 제54항에 있어서,
    T 세포를 표적 세포로 재인도(redirection)함으로써 표적 세포에서 세포독성을 유도하는 약학 조성물.
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