WO2021185273A1 - 靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段及其制备和应用 - Google Patents
靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其包含轻链可变区和/或重链可变区,所述抗体或其抗原结合片段结合人Sirpα-V1和人Sirpα-V2,但微弱结合或不结合人Sirpβ、Sirpγ,且不结合人T细胞,并具有阻断Sirpα与CD47结合的功能。本发明还公开了包含其的双特异抗体、所述抗体或其抗原结合片段的制备方法及其应用。本发明抗体或其抗原结合片段独有的特性,使其更适合用于针对人Sirpα靶点的抗体或其抗原结合片段的药物开发,并且作为候选药物可单独或者联合给药,特别是为联合免疫治疗肿瘤提供了新的、甚至是更好的选择。
Description
本申请要求申请日为2020/3/20的中国专利申请2020102041302的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用,本发明还涉及一种包含所述靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体。
SIRP家族是隶属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白,根据跨膜区以及胞内区结构不同,一般分为Sirpα、Sirpβ、Sirpγ。三者胞外区结构高度同源,均由三个Ig样结构域构成。Sirpβ和Sirpγ胞内区很短,分别只有六个和四个氨基酸,均无与磷酸酶相互作用的信号基序。而Sirpα(Signal regulatory protein α,信号调节蛋白α,又称CD172α、SHPS-1、P84或BIT)胞质区的四个酪氨酸残基,形成两个典型的免疫受体酪氨酸抑制基序(Immune-receptor tyrosin-based inhibitory motif,ITIM),其可以被磷酸化而发生积聚反应,然后被与其自身相连的细胞溶质性蛋白酪氨酸磷酸酶激活,从而对细胞的生长、活化进行调控。在髓系细胞中,Sirpα常表现为抑制性受体,它通过招募带有SH2结构域的酪氨酸磷酸酶而抑制免疫细胞的激活。Sirpα于20世纪90年代末被鉴定出来,其表达在髓细胞包括所有类型的巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞及神经细胞膜表面上,在其他细胞上较少表达。编码人Sirpα的基因是一个多态性基因,包括多种变体。最常见的蛋白质变体是Sirpα-V1和Sirpα-V2(NCBI序列号NP_542970(P78324)和CAA71403)。人Sirpα中的多态性会导致表面暴露的氨基酸发生变化,但并不会影响与CD47的结合。在不同种族的人群中,Sirpα蛋白质变体的表达水平各不相同。在欧洲、非洲、美洲、南亚地区的人群中,Sirpα-V2高表达人群所占比例相对较低,在非洲仅占8.6%;但其在东亚人种中的比例非常高,高达41.3%。目前已有的抗Sirpα抗体均只针对Sirpα-V1高表达人群,但是临床上有20%人群是非V1形式,而已有的抗Sirpα抗体不能解决这一部分病人需求。例如目前进入临床试验的针对Sirpα的药物勃林格殷格翰的OSE-172(参见WO2017178653A2)。OSE-172是一种靶向在骨髓谱系细胞中表达的Sirpα的单克隆抗体,其仅与人Sirpα-V1结合,而并不结合人Sirpα-V2,作为药物开发时仅能够治疗高表达 SirpαV1的病人群体。此外,OSE-172与猕猴(cynomolgus,cyno)来源的Sirpα(Cyno Sirpα)不结合,对其在临床前安全性评价研究中选择灵长类动物猕猴带来了不便。在对Sirpβ的选择性方面,OSE-172结合Sirpβ,选择性不足够好,如果将其应用在临床药物开发过程中,有可能存在因脱靶效应而引发的副作用,带来安全性问题。
CD47与Sirpα的相互作用在1999年首次被发现,之后大量研究证实,CD47(又称整合素相关蛋白,Integrin-associated protein,IAP)在正常细胞表面广泛表达,通过与巨噬细胞表面的Sirpα结合,释放一种“别吃我”的信号,从而保护健康细胞不被巨噬细胞“吃掉”。而癌细胞也学会了这一机制:在其表面过量表达CD47,使巨噬细胞把它们当作“正常细胞”,从而逃避巨噬细胞介导的吞噬攻击。当Sirpα与CD47结合后,导致受体分子聚集引起酪氨酸的磷酸化和激活并且抑制巨噬细胞突触肌球蛋白的积累,在此过程中带有磷酸化ITIM的Sirpα可以募集并且激活酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2,传递抑制信号从而抑制巨噬细胞的吞噬作用,最终导致肿瘤细胞的免疫逃逸。因此阻断Sirpα与CD47结合可以恢复巨噬细胞的相关功能,最终达到治疗肿瘤的效果。
此外,CD47还与存在于人T细胞表面而非人骨髓细胞上的SIRP家族的另一个成员Sirpγ(也称为SIRPg,SIRPgamma,CD172g或SIRP beta 2)结合。与Sirpα在髓样细胞上的表达相反,Sirpγ限制性表达在T淋巴细胞上。Sirpγ在小鼠中不表达。有研究表明Sirpγ-CD47相互作用介导细胞-细胞粘附,增强超抗原依赖性T细胞介导的增殖并共同刺激T-细胞活化(Piccio et al,Blood,105:6,2005)。
由于Sirpα和Sirpγ之间的序列具有高度同源性,特别是与CD47结合的区域中,现有技术中公开的抗Sirpα抗体也能够结合Sirpγ,并且在人中具有不良作用,例如抑制T细胞的增殖并降低免疫反应。由于对现有已知抗体的测试是在不具有Sirpγ基因的小鼠模型中进行的,因此无法预测现有的抗CD47抗体或非选择性抗Sirpα抗体是否存在此类副作用。例如US20140242095A1中公开了一种针对Sirpα的抗体,但其与Sirpβ及Sirpγ都有比较强的结合,且与人T细胞结合,如果将其应用在临床药物开发过程中,有可能存在因脱靶效应而引发的副作用,带来安全性问题。
因此,本领域急需针对的病人群体更广泛(例如同时针对表达V1的人群和/或表达V2的人群)、能够结合Sirpα的同时不结合人Sirpβ和Sirpγ从而减少副作用、能够与灵长类动物来源的Sirpα结合从而使得临床前研究更便利等效果更佳的靶向Sirpα抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的抗体不能同时结合人Sirpα的 两种形式Sirpα-V1和Sirpα-V2从而针对更多的病人群体、不能在结合Sirpα的同时不结合人Sirpβ和Sirpγ从而减少副作用、经过人源化后表达量不高等缺陷,本发明提供了一种靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体及其制备方法和应用。与现有技术相比,本发明的抗体或其抗原结合片段与Sirpα结合活性好,不仅能够阻断人Sirpα(包括Sirpα-V1和Sirpα-V2)与人CD47的结合,使得该抗体或其抗原结合片段可以作为新药开发,靶向Sirpα和CD47结合而达到治疗肿瘤的目的,而且本发明的抗体或其抗原结合片段能同时结合人Sirpα的两种形式Sirpα-V1和Sirpα-V2,且结合活性显著高于现有技术,因而本发明的抗体或其抗原结合片段作为药物开发具有多方面优势,能针对更多的病人群体(表达Sirpα-V1的人群和/或表达Sirpα-V2的人群)。本发明的抗体或其抗原结合片段不结合人Sirpβ和Sirpγ;也不结合人T细胞,使得本发明的抗体或其抗原结合片段具有更好的选择性,避免临床上结合T细胞所带来的脱靶作用所致的副作用。本发明抗体或其抗原结合片段较佳地还能够与猕猴(cynomolgus,cyno)Sirpα(cyno Sirpα)结合,特别是和多种多态性cyno Sirpα都有很强的结合,使得临床前安全评价研究中可以选择灵长类动物猕猴(cynomolgus,cyno),为临床前药理、毒理等研究带来极大的便利。转录后修饰(Potential post-translational modification,PTM)分析结果表明,本发明抗体或其抗原结合片段具有免疫原性低、成药性风险小的特点。本发明的抗体或其抗原结合片段经过人源化后表达量更高,为下游生产及工艺提供便利、节约成本。在本发明某一较佳实施例中,本发明的人源化抗体的表达量高达275mg/L,较其嵌合的抗体和现有技术中的抗体OSE-172提高了4.5倍左右。基于本发明Sirpα抗体序列设计、筛选得到的双特异抗体,能够保留双靶点抗体的功能活性,对两个靶点的结合活性均与其相对应的单抗接近,且阻断抗原与相应配体结合的活性也和对应单抗的阻断活性一致。本发明双特异性抗体小鼠体内药效显著优于单抗,且有更便捷的给药优势。在某一制剂处方筛选实施例中,本发明双特异性抗体稳定性很好,40℃处理30天,纯度变化3%以内。这些双特异抗体(本发明称之为SBody)结构类似常规IgG,具有正常抗体一样完整的Fc,让其纯化工艺可以按照正常的抗体进行,因而工艺简单,具有生产成本低的优势。综合上述本发明抗体或其抗原结合片段独有的特性,使其更适合用于针对人Sirpα靶点的抗体或其抗原结合片段的药物开发,并且作为候选药物可单独或者联合给药,特别是为联合PD-1抗体等免疫治疗肿瘤提供了新的、甚至是更好的选择。
为了解决上述技术问题,本发明第一方面提供了一种靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其包含轻链可变区、即VL和/或重链可变区、即VH,所述抗体或其抗原结合片段结合人Sirpα-V1和人Sirpα-V2,但微弱结合或不结合人Sirpβ、Sirpγ,且不结合人T细 胞,并具有阻断Sirpα与CD47结合的功能。由此可知,本发明中所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段与现有技术抗体识别的抗原表位不同,体现出比现有技术更优异的技术效果。
优选地,所述抗体或其抗原结合片段还结合cyno Sirpα L932、L933、L936和L937中的一个或多个,但不结合cyno Sirpα L938和L939;其中,所述L932的氨基酸序列的NCBI参考序列(NCBI Reference Sequence)号为NP_001271679.1,所述L933的氨基酸序列的NCBI参考序列号为XP_015313155.1,所述L936的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述L937的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述L938的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,所述L939的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明中,所述抗体或其抗原结合片段结合人Sirpα-V1/人Sirpα-V2、所述抗体或其抗原结合片段还结合cyno Sirpα中的“结合”一般为“强结合”。所述的“强结合”一般为结合实验中EC
50低于0.2nM(更佳地为低于0.1nM),该定义主要基于表5、表13、表6、表15中的实验结果进行,一般所述抗体或其抗原结合片段与人Sirpα-V1/人Sirpα-V2的结合能力与Ref1与人Sirpα-V1/人Sirpα-V2的结合能力类似甚至更佳。
本发明中若无特殊说明,所述“结合”为结合实验中EC
50处于0.2nM至2nM之间(即0.2nM≤EC
50<2nM),所述“弱结合”为结合实验中EC
50介于2~10nM(即2nM≤EC
50<10nM),所述“微弱结合”一般为结合实验中EC
50高于10nM且低于50nM(即10nM≤EC
50<50nM)。所述“不结合”一般是指结合实验中的EC
50≥50nM或未能检测到结合信号。该定义主要基于表15中的实验结果进行,即Ref1与Sirpβ结合的EC
50数值大概为0.126nM、Ref2与Sirpβ结合的EC
50数值大概为0.167nM,Ref1与Sirpγ结合的EC
50数值无法检测、Ref2与Sirpγ结合的EC
50数值大概为1.46nM时的情况。
上述EC
50的值一般是根据本领域常规的实验方法例如ELISA检测所得,上述IC
50的值一般是根据本领域常规的阻断性ELISA实验检测所得。
更优选地,所述VL包含以下的互补决定区(CDR)(按CCG编号规则定义):如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示的VL CDR1;如SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的VL CDR2;和/或,如SEQ ID NO:13的氨基酸序列所示的VL CDR3;和/或,
所述VH包含以下的CDR:如SEQ ID NO:14的氨基酸序列所示的VH CDR1;如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的VH CDR2;和/或,如SEQ ID NO:16的氨基酸序列所示的VH CDR3;或者,所述VL在所述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的氨基酸序列上分别具有3、2或1个氨基酸突变,和/或,所述VH在所述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的氨基酸序列上分别具有3、2或1个氨基酸突变。
在类似“具有3、2或1个氨基酸突变”中“氨基酸突变”是指相较于原氨基酸序列而言,变体的序列存在氨基酸的突变,包括在原氨基酸序列的基础上发生氨基酸的插入、缺失或替换。示例性的解释是对CDR的突变可以包含3个、2个或1个氨基酸的突变,这些CDR之间可以任选地选择相同或不同数目的氨基酸残基进行突变,例如可以是对CDR1进行1个氨基酸的突变,对CDR2和CDR3不进行氨基酸突变。
本发明中,所述突变可以包括目前如本领域技术人员公知的突变,例如在抗体的生产或者应用过程中,可能会对抗体进行的一些突变,例如对可能存在的,特别是CDR区的PTM的位点进行突变,包括抗体的聚集、脱酰胺基敏感(asparagine deamidation,位点(NG、NS或NH等)、天冬氨酸异构(DG、DP)敏感位点、N糖基化(N-{P}S/T)敏感位点及氧化敏感位点等相关突变。
本发明所述的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat、Contact、CCG、AbM和Chothia等编号规则。在本发明中,上述所列CDR的氨基酸序列均是按照CCG定义规则所示出的(本发明的权利要求中也是按照CCG定义规则所示出的序列)。但是,本领域人员公知,在本领域中可以通过多种方法来定义抗体的CDR,例如基于序列可变性的Kabat定义规则(参见,Kabat等人,免疫学的蛋白质序列,第五版,美国国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州(1991))和基于结构环区域位置的Chothia定义规则(参见JMol Biol 273:927-48,1997)。给定CDR的边界可取决于用于识别的方案而变化,本发明所述定义规则以及所述抗体定义之CDR序列,见表7-12。例如,Kabat方案基于结构比对,而Chothia方案基于结构信息。用于Kabat及Chothia方案的编号基于最常用的抗体区序列长度,及通过插入字母调适插入物(例如,“30a”)及一些抗体中呈现删除部分。两种方案在不同位置放置某些插入物及删除部分(“插入/缺失(indel)”)导致差异性编号。Contact方案基于对复合物结晶结构的分析且在许多方面中类似于Chothia编号方案。因此,除非另有规定,否则术语给定抗体或其区(例如可变区)的“CDR”及“互补决定区”及该抗体或其区的个别CDR(例如,“VH CDR1、VH CDR2)应了解为涵盖如通过本发明描述的上述已知方案中的任何一种界定的互补决定区。虽然本发明的权利要求中请求保护的范围是基于CCG定义规则所示出的序列,但是根据其他CDR的定义规则所对应的氨基酸序列(例如以下列出来的按照不同CDR编号规则所对应序列)也应当落在本发明的保护范围中。
例如,按照Kabat编号规则定义,则所述VL包含以下的CDR:如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示的VL CDR1;如SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的VL CDR2;和/或,如SEQ ID NO:13的氨基酸序列所示的VL CDR3;和/或,所述VH包含以下的CDR: 如SEQ ID NO:17的氨基酸序列所示的VH CDR1;如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的VH CDR2;和/或,如SEQ ID NO:16的氨基酸序列所示的VH CDR3。
例如,按照AbM编号规则定义,则所述VL包含以下的CDR:如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示的VL CDR1;如SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的VL CDR2;和/或,如SEQ ID NO:13的氨基酸序列所示的VL CDR3;和/或,所述VH包含以下的CDR:如SEQ ID NO:14的氨基酸序列所示的VH CDR1;如SEQ ID NO:18的氨基酸序列所示的VH CDR2;和/或,如SEQ ID NO:16的氨基酸序列所示的VH CDR3。
例如,按照Chothia编号规则定义,则所述VL包含以下的CDR:如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示的VL CDR1;如SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的VL CDR2;和/或,如SEQ ID NO:13的氨基酸序列所示的VL CDR3;和/或,所述VH包含以下的CDR:如SEQ ID NO:19的氨基酸序列所示的VH CDR1;如SEQ ID NO:20的氨基酸序列所示的VH CDR2;和/或,如SEQ ID NO:16的氨基酸序列所示的VH CDR3。
例如,按照Contact编号规则定义,则所述VL包含以下的CDR:如SEQ ID NO:21的氨基酸序列所示的VL CDR1;如SEQ ID NO:22的氨基酸序列所示的VL CDR2;和/或,如SEQ ID NO:23的氨基酸序列所示的VL CDR3;和/或,所述VH包含以下的CDR:如SEQ ID NO:24的氨基酸序列所示的VH CDR1;如SEQ ID NO:25的氨基酸序列所示的VH CDR2;和/或,如SEQ ID NO:26的氨基酸序列所示的VH CDR3。
优选地,所述靶向Sirpα的抗体为鼠源抗体。
更优选地,所述鼠源抗体的VL为如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其突变;和/或,所述鼠源抗体的VH为如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其突变;更优选地,所述鼠源抗体的VL由如SEQ ID NO:7所示的核苷酸编码;和/或,所述鼠源抗体的VH由如SEQ ID NO:8所示的核苷酸编码;
所述突变为所述VL和/或VH的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加,且所述突变的氨基酸序列与所述VL和/或VH的氨基酸序列具有至少85%序列同一性,并保持或改善了所述抗体与Sirpα的结合;所述至少85%序列同一性优选为至少90%序列同一性;更优选为至少95%序列同一性;最优选为至少99%序列同一性。
优选地,所述靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段还包含鼠抗体恒定区或人抗体恒定区;所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区,所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区。
更优选地,当所述靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包含鼠源抗体的可变区和人抗 体恒定区时,所述人抗体恒定区包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:27所示的人IgG4的重链恒定区和κ型轻链恒定区。
优选地,所述靶向Sirpα的抗体为人源化抗体。
更优选地,所述人源化抗体的框架区包括人抗体重链框架区和人抗体轻链框架区;
进一步更优选地,所述人抗体轻链框架区选自1)IGKV1-27*01、IGKV1-33*01、IGKV1-39*01、IGKV1-NL1*01,IGKV1/OR10-1*01、IGKV1D-33*01、IGKV1D-39*01、IGKV1-12*01、IGKV1-12*02和IGKV1-17*02中的一种或多种,以及J基因选自2)hJk1、hJk2.1、hJk2.2、hJk2.3、hJk2.4、hJk3、hJk4.1、hJk4.2或hJk5中的一种或多种,或其回复突变;和/或,所述人抗体重链框架区选自1)IGHV1-46*01、IGHV1-46*02、IGHV1-46*03、IGHV1-69*02、IGHV1-69*04、IGHV1-69*06、IGHV1-69*08、IGHV1-69*09、IGHV1-69*10或IGHV1-69*14中的一种或多种,以及J基因选自2)hJh1、hJh2、hJh3.1、hJh3.2、hJh4.1、hJh4.2、hJh4.3、hJh5.1、hJh5.2、hJh6.1、hJh6.2或hJh6.3中的一种或多种,或其回复突变;所述回复突变的氨基酸位点数目优选为0-10个。
最优选地,所述人源化抗体的VL包含如SEQ ID NO:29-34中任一个所示的氨基酸序列或其突变;和/或,所述人源化抗体的VH序列如包含如SEQ ID NO:35-41中任一个所示的氨基酸序列或其突变;所述突变为所述VL和/或VH的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或添加,且所述突变的氨基酸序列与所述VL和/或VH的氨基酸序列具有至少85%序列同一性,并保持或改善了所述抗体或其抗原结合片段与Sirpα的结合;所述至少85%序列同一性优选为至少90%序列同一性;更优选为至少95%序列同一性;最优选为至少99%序列同一性。
在本发明某一较佳实施例中,所述VL包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列;所述VH如包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列;所述VH包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL 包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述轻链可变区VL包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列;所述重链可变区VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人抗体κ或λ型轻链恒定区或其突变;和/或,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其突变。
更优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人抗体κ型轻链恒定区。
更优选地,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人IgG4的重链恒定区。
进一步更优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其突变;和/或,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或其突变。
在本发明某一较佳实施例中,所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包含以下轻链和重链:所述轻链如SEQ ID NO:42的氨基酸序列所示,所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示。
在本发明某一较佳实施例中,所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包含以下轻 链和重链:所述轻链如SEQ ID NO:44的氨基酸序列所示,所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示。
在本发明某一较佳实施例中,所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包含以下轻链和重链:所述轻链如SEQ ID NO:45的氨基酸序列所示,所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示。
在本发明某一较佳实施例中,所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包含以下轻链和重链:所述轻链如SEQ ID NO:46的氨基酸序列所示,所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示。
在本发明某一较佳实施例中,所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包含以下轻链和重链:所述轻链如SEQ ID NO:47的氨基酸序列所示,所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示。
在本发明某一较佳实施例中,所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包含以下轻链和重链:所述轻链如SEQ ID NO:48的氨基酸序列所示,所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示。
优选地,所述靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包括免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fv或单链Fv片段(scFv)、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体、单区抗体或者其他任何保留抗体特异性结合抗原的部分能力的抗体,或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。所述单克隆抗体可以由多种途径和技术进行研制,包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术等,主流是通过杂交瘤技术从野生型或转基因小鼠制备单克隆抗体。
为了解决上述技术问题,本发明第二方面提供了一种双特异性抗体,其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区,所述第一蛋白功能区为如本发明第一方面所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段;所述第二蛋白功能区为靶向非Sirpα抗原的抗体或其抗原结合片段。所述的双特异性抗体既能保留单个Sirpα抗体所具有的结合活性、功能活性,也能够保持另一个蛋白功能区的结合和功能活性。而且,所述双特异性抗体结构类似正常IgG抗体,可以按常规抗体表达纯化方法,完成表达和纯化,并且稳定。
本发明的双特异性抗体可以为序列特异的IgG结构类似的双特异抗体(Sequence-based IgG like bispecific antibody,SBody)。这些双特异抗体分子具有正常抗体一样完整的Fc,让其纯化工艺可以按照正常的抗体进行,因而工艺简单,具有生产成本低的优势。
在本发明的某一具体实施例中,如上所述的双特异性抗体中,所述非Sirpα抗原为免疫检查点抗原或肿瘤治疗靶点,所述免疫检查点抗原优选包括PD-1、PD-L1、Tim3、或 LAG3,所述肿瘤治疗靶点优选包括CLDN18.2(密蛋白18.2);更优选地,所述第二蛋白功能区为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗LAG3抗体或抗CLDN18.2抗体或其抗原结合片段;最优选地,所述抗PD-1抗体为Nivolumab(简称Nivo)或Pembrolizumab(简称Pem),所述抗PD-L1抗体为Atezolumab、Avelumab或者Durvalumab。
为了设计生产工艺简单且保留有效活性的双特异抗体,本发明的双特异性抗体的形式为类似正常IgG的结构,具体地,在其结构上设计能够靶向两个靶点的轻链和/或者重链可变区的蛋白功能区,两个蛋白功能区共享相同的重链Fc区域。较佳地,将一个靶点的抗体分子以一个或者多个scFv的形式连到另一靶点完整抗体的轻链或重链的一端。这样既避免表达不同重链Fc和/或不同轻链带来表达产物的不均一,例如Knob形式的Fc和Hole形式的Fc共表达,其表达过程中会有不均一的Fc-Fc配对形式,给纯化工艺带来很多不便利;也可以避免轻、重链部分区域交换(cross)设计可能对结构活性的影响,以及工艺过程中出现的Fc错配现象。通过一个或者多个scFv设计,还可以调节针对特定靶点的活性。通过筛选不同的设计,能够得到活性最优的SBody。所得的优选SBody因序列以及设计的不同,保留了双靶点活性,并具有成药性等方面的优势,从而可以作为正常的抗体进行药物开发。
在一些具体实施例中,如上所述的双特异性抗体,所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白,所述第二蛋白功能区为一个或多个、优选两个scFv;或者,所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白,所述的第一蛋白功能区为一个或多个、优选两个scFv;其中,所述scFv包括重链可变区与轻链可变区,所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接,所述连接子优选(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)
w[以下简称(G
4S)
w];所述scFv通过连接子与所述免疫球蛋白连接,所述连接子选自可以是本领域常见的肽段或(G4S)
w;所述的w优选为0~10之间的整数,更优选为1、2、3或者4。
所述双特异设计概括(通式1)如本发明的表17所示。表17中,含轻链的序列指该序列除了包括轻链序列以外,还可以包括与轻链序列连接的scFv;含重链的序列指该序列除了包括重链序列以外,还可以包括与重链序列连接的scFv。其中,T1代表针对靶点1(比如Sirpα)的第一蛋白功能区,T2代表针对靶点2(非Sirpα)的第二蛋白功能区。T1(scFv)代表针对靶点1抗体的scFv序列;T2(scFv)代表针对靶点2的scFv序列。
(scFv)
n1,(scFv)
n2,(scFv)
n3,(scFv)
n4中的n1,n2,n3,n4分别为自然数,可以是0、1、2、3等,在本发明的具体实施例中,n1,n2,n3,n4中其中至少1个数值为1,其余为0。VL,代表针对靶点1或者2的抗体轻链可变区序列;VH,代表针对靶点1或者2的抗体重链可变区序列。LC,代表轻链(κ或者λ)的恒定区序列,优选人轻 链恒定区序列;HC代表重链,包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的恒定区序列(缩写为HC-IgG1、HC-IgG2、HC-IgG3、HC-IgG4),优选人的重链恒定区序列(HC-hIgG)。重链恒定区C末端连接scFv或其它蛋白序列的时候,其C末端末位氨基酸K可以突变,优选突变为A。由此,在方案1中,T1为免疫球蛋白,T2为scFv;在方案2中,T2为免疫球蛋白,T1为scFv;scFv针对的靶点相同;在方案3、4中,两端的scFv针对两个不同的靶点。
表17中,所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区,其轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端;或所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区,其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。
需说明的是,当上述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区时,其连接方式为轻链可变区的C末端与连接子连接,所述连接子再与重链可变区的N末端连接,从而将scFv轻链可变区的N末端和重链可变区的C末端暴露出来,使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和/或重链连接。在本发明中,当其连接免疫球蛋白的轻链时,在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的C末端通过连接子与免疫球蛋白重链的N末端连接;当其连接免疫球蛋白的重链时,在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接。
当所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区时,其连接方式为轻链可变区的N末端与连接子连接,所述连接子再与重链可变区的C末端连接,从而将scFv轻链可变区的C末端和重链可变区的N末端暴露出来,使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和/或重链连接。在此情况下,当其连接免疫球蛋白的轻链时,在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的C末端与免疫球蛋白重链的N末端连接;当其连接免疫球蛋白的重链时,在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接。优选地,所述两个scFv对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端和/或N末端。
本发明中,双特异设计涉及的各个靶点抗体序列,除了本发明所述anti-Sirpα抗体序列或其抗原结合片段外,其它的靶点抗体序列来自已经公开的抗体序列。包括,抗PD-1抗体Nivolumab/Opidivo(简称Nivo)和Pembrolizumab/Keytruda(简称Pem)。Nivolumab和Pembrolizumab等序列都能从www.drugbank.ca等公开资源查到。
更佳地,所述的双特异性抗体可以为:所述第一蛋白功能区为scFv,所述第二蛋白 功能区为免疫球蛋白;其中,所述第一蛋白功能区的scFv包含如本发明第一方面中所述的VL和VH。
在本发明某一较佳实施例中,所述第一蛋白功能区的scFv包括的所述VL包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列;所述VH如包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述第一蛋白功能区的scFv包括的所述VL包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列;所述VH包含如SEQ ID NO:36-41中任一个所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述第一蛋白功能区的scFv包括的所述VL包含如SEQ ID NO:31-34中任一个所示的氨基酸序列;所述VH包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。在本发明某一较佳实施例中,所述第一蛋白功能区的scFv包括的所述VL包含如SEQ ID NO:29或31-34中任一个所示的氨基酸序列;所述VH包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
优选地,所述免疫球蛋白包括Pem的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Pem的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列;或,所述免疫球蛋白包括Nivo的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Nivo的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列;
两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端;且,所述scFv的轻链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区;或,
两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链可变区的N末端;且,所述scFv的轻链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区;或,
两个scFv的重链可变区的N末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端;且,所述scFv的轻链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区;或,
两个scFv的重链可变区的N末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链的C末端;且,所述scFv的轻链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区。
此外,所述的双特异性抗体还可以包括以下结构,所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白,所述免疫球蛋白包含轻链如SEQ ID NO:48所示、重链如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列;所述第二蛋白功能区为scFv:
所述scFv的轻链可变区的序列为Pem的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为Pem 的重链可变区。
更优选地,所述的双特异性抗体包括以下轻链氨基酸序列和重链氨基酸序列:如SEQ ID NO:50所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:51所示的重链氨基酸序列;或,如SEQ ID NO:52所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:53所示的重链氨基酸序列;或,如SEQ ID NO:54所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:51所示的重链氨基酸序列;或,如SEQ ID NO:52所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:55所示的重链氨基酸序列;或,如SEQ ID NO:56所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:57所示的重链氨基酸序列。
为了解决上述技术问题,本发明第三方面提供了一种分离的核酸,其编码如本发明第一方面所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段或如本发明第二方面所述的双特异性抗体。
所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法,较佳地,包括以下的步骤:通过基因克隆技术获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子,或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
本领域技术人员知晓,编码上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该抗体或其抗原结合片段的序列基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
为了解决上述技术问题,本发明第四方面提供了一种重组表达载体,其包含如本发明第三方面所述的分离的核酸。
所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得,即:将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体,只要其能够容载前述核酸分子即可。
优选地,所述表达载体包含真核细胞表达载体和/或原核细胞表达载体。
为了解决上述技术问题,本发明第五方面提供了一种转化体,其在宿主细胞中包含如本发明第四方面所述的重组表达载体。
所述转化体的制备方法可为本领域常规的制备方法,例如为:将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞,只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制,且所携带所述的核酸可被有效表达即可。优选地,所述宿主细胞包含真核细胞和/或原核细胞,所述原核细胞优选E.coli细胞如TG1或BL21(表达单链抗体或Fab抗体),所述真核细胞优选HEK293细胞或CHO细胞(表达全长 IgG抗体)。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中,即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法,较佳地为化学转化法,热激法或电转法。
为了解决上述技术问题,本发明第六方面提供了一种靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段的制备方法,其包含培养如本发明第五方面所述的转化体,从培养物中获得靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段。
为了解决上述技术问题,本发明第七方面提供了一种药物组合物,所述药物组合物包含如本发明第一方面所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段和/或如本发明第二方面所述的双特异性抗体,以及药学上可接受的载体。
优选地,所述药物组合物还包括其他抗肿瘤抗体作为活性成分。
所述的药学上可接受的载体可为本领域常规的载体,所述的载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料,较佳地包括药学上可接受的赋形剂(例如本领域常规的赋形剂如甘氨酸和/或海藻糖等)、填充剂、稀释剂、pH调节剂(例如缓冲液,优选自柠檬酸-柠檬酸钠、醋酸-醋酸钠、磷酸缓冲液和His-HCl中的一种或多种)和/或表面活性剂(例如吐温80)等。更佳地,所述的药物组合物包括0.01~99.99%的上述抗体或其抗原结合片段和/或双特异性抗体,和0.01~99.99%的药用载体,所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在某一较佳实施例中,所述药物组合物由如本发明第二方面所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段和/或所述的双特异性抗体,以及缓冲液、甘氨酸、海藻糖和吐温80组成。
此外,在所述药物组合物中:所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段和/或所述的双特异性抗体的浓度可以优选为5mg/mL-100mg/mL,优选5mg/mL;和/或,所述缓冲液的浓度可以优选为5mM-50mM,优选20mM;和/或,所述甘氨酸的浓度可以优选为0mM-200mM,优选125mM;和/或,所述海藻糖的浓度可以优选为0mM-300mM,优选125mM;和/或,所述吐温80占所述药物组合物的体积比可以优选为0.01-1%,优选0.02%;和/或,所述药物组合物的PH可以优选为5.0-7.0,例如5.5、6或6.5;和/或,所述的双特异性抗体的轻链氨基酸序列可以优选如SEQ ID NO:52所示,重链氨基酸序列可以优选如SEQ ID NO:55所示。
本发明中,所述药物组合物可以以例如制剂的形式存在。所述制剂的制备方法可为本领域常规,例如通过超滤的方法将抗体药物置换到制剂处方中。
在某一较佳实施例中,本发明的药物组合物由5±0.2mg/mL双特异性抗体(所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示,重链氨基酸序列如SEQ ID NO:55 所示,下文简称为LB504双特异性抗体)、20mM檬酸-柠檬酸钠,125mM甘氨酸,125mM海藻糖以及0.02%吐温80组成,且其pH为5.0。
在某一较佳实施例中,本发明的药物组合物由5±0.2mg/mL LB504双特异性抗体、20mM醋酸-醋酸钠,125mM甘氨酸,125mM海藻糖,0.02%吐温80组成,且其pH为5.0。
在某一较佳实施例中,本发明的药物组合物由5±0.2mg/mL LB504双特异性抗体、20mM His-HCl,125mM甘氨酸,125mM海藻糖以及0.02%ps80组成,且其pH为5.5。
在某一较佳实施例中,本发明的药物组合物由5±0.2mg/mL LB504双特异性抗体、20mM柠檬酸-柠檬酸钠,125mM甘氨酸,125mM海藻糖以及0.02%ps80组成,且其pH为5.5。
在某一较佳实施例中,本发明的药物组合物由5±0.2mg/mL LB504双特异性抗体、20mM His-HCl,125mM甘氨酸,125mM海藻糖以及0.02%ps80组成,且其pH为6.0。
在某一较佳实施例中,本发明的药物组合物由5±0.2mg/mL LB504双特异性抗体、20mM柠檬酸-柠檬酸钠,125mM甘氨酸,125mM海藻糖以及0.02%ps80组成,且其pH为6.0。
在某一较佳实施例中,本发明的药物组合物由5±0.2mg/mL LB504双特异性抗体、20mM His-HCl,125mM甘氨酸,125mM海藻糖以及0.02%ps80组成,且其pH为6.5。
在某一较佳实施例中,本发明的药物组合物由5±0.2mg/mL LB504双特异性抗体、20mM PB,125mM甘氨酸,125mM海藻糖以及0.02%ps80组成,且其pH为7.0。
较佳地,所述的药物组合物是抗肿瘤的药物。例如为治疗乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、胰腺癌、食管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肾癌、宫颈癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、甲状腺癌、子宫癌、膀胱癌、神经内分泌癌、头颈癌、肝癌、鼻咽癌、睾丸癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、基底细胞皮肤癌、鳞状细胞皮肤癌、皮肤纤维肉瘤突出症、梅克尔细胞癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、肉瘤、间皮瘤或骨髓发育不良综合征等血液肿瘤和实体瘤的药物。
本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型,较佳地为固体、半固体或液体的形式,即可以为水溶液、非水溶液或混悬液,更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。更佳地为经由血管内、皮下、腹膜内或肌内施用。较佳地,所述药物组合物还可以作为气雾剂或粗喷雾剂施用,即经鼻施用;或者,鞘内、髓内或心室内施用。更佳地,所述的药物组合物还可以透皮、经皮、 局部、肠内、阴道内、舌下或经直肠施用。
本发明所述的药物组合物的给药剂量水平可以根据达到所需诊断或治疗结果的组合物量而调整。施用方案也可以为单次注射或多次注射,或进行调整。所选择的剂量水平和方案依赖于包括所述药物组合物的活性和稳定性(即,半衰期)、制剂、施用途径、与其他药物或治疗的组合、待检测和/或治疗的疾病或病症、以及待治疗的受试者的健康状况和先前医疗史等各种因素而进行合理地调整。
对于组合疗法,上述靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段、上述双特异性抗体和/或另外的治疗或诊断剂可以各自作为单一药剂,在适合于执行预期治疗或诊断的任何时间范围内进行使用。因此,这些单一药剂可以基本上同时(即作为单一制剂或在数分钟或数小时内)或以按顺序连续施用。例如,这些单一药剂可以在一年内,或10、8、6、4或2个月内,或4、3、2、或1周内,或5、4、3、2或1天内施用。
关于制剂、剂量、施用方案和可测量的治疗结果的另外指导,参见Berkow等人(2000)The Merck Manual of Medical Information(Merck医学信息手册)和Merck&Co.Inc.,Whitehouse Station,New Jersey;Ebadi(1998)CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology(临床药理学手册)等著作。
为了解决上述技术问题,本发明第八方面提供了一种如本发明第一方面所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的双特异性抗体或如本发明第七方面所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。优选地,所述肿瘤为上述第七方面所述。
为解决上述技术问题,本发明还提供了如本发明第一方面所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的双特异性抗体或如本发明第七方面所述的药物组合物在诊断、预防和/或治疗肿瘤中的应用。优选地,所述肿瘤如本发明第七方面所述。
为解决上述技术问题,本发明还提供一种套装药盒,其包含药盒A和药盒B,所述的药盒A为如本发明第一方面所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段、如本发明第二方面所述的双特异性抗体或如本发明第七方面所述的药物组合物,所述的药盒B为其他抗肿瘤抗体或者包含所述其他抗肿瘤抗体的药物组合物。所述的药盒A和药盒B可以同时使用,也可以先使用药盒A再使用药盒B,还可以先使用药盒B再使用药盒A,可以根据具体应用时的实际需求而定。
在本发明中,除非另有说明,否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且,本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实 验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时,为了更好地理解本发明,下面提供相关术语的定义和解释。
在本发明中,术语“可变”通常是指这样的事实,即抗体的可变结构域的序列的某些部分变化强烈,它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,变异性并非均匀地分布在抗体的整个可变区中。它集中在轻链和重链可变区中的三个区段,被称为互补决定区(CDR)或高变区(HVR)。可变域中更高度保守的部分被称为框架区(FR,framework region)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR,大部分采用β-折叠构型,通过三个CDRs连接,形成环连接,并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDRs通过FR紧密靠近在一起,并与来自另一条链的CDRs一起形成抗体的抗原结合位点,恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如本领域技术人员熟知,或J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文使用的,术语“包括”或“包含”旨在表示组合物和方法包括所述的元素但不排除其他元素,但根据上下文的理解,也包括“由……组成”的情况。
术语“表位”指抗原(例如Sirpα)中与抗体分子特异性相互作用的部分。术语“竞争”在本发明中指抗体分子干扰抗Sirpα抗体分子与靶抗原(例如Sirpα)结合的能力。对结合作用的干扰可以是直接或间接的(例如通过结合抗体分子相同的抗原结合位点或靶抗原的变构调节作用)。可以使用竞争结合测定法(例如FACS测定法、ELISA或BIACORE测定法)确定抗体分子是否能够干扰另一种抗体分子与其靶点结合的程度。
本发明所述的术语“抗体”包括免疫球蛋白(Ig),是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同,故其抗原性也不同。据此,可将免疫球蛋白分为五类,或称为免疫球蛋白的同种型,即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE,其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别,又可分为不同的亚类,如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大,为可变区(V区);靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定,为恒定区(C区)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR和4个FR组成,从氨基端到羧基端依次排列的顺序为:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR指VL CDR1、VL CDR2和 VL CDR3;重链的3个CDR指VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3。
在轻链和重链内,可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接,重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由VH和重链恒定区(简称HC或者CH)组成。重链恒定区由3个结构域(分别简称HC1、HC2和HC3或者CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由VL和轻链恒定区(简称LC或者CL)组成,通常地,一条轻链包括一个轻链恒定区。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人Sirpα的单克隆抗体。制备时用Sirpα抗原注射试验对象,然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中,所述的鼠源Sirpα抗体或其抗原结合片段,可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区,或进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c或IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”,是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体,可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体,要选建立分泌鼠源单抗的杂交瘤,然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因,再要据需要克隆所得人抗体的恒定区基因,将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中,最后在真核细胞、工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中,所述的Sirpα嵌合抗体的抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ型或其变体的轻链FR。所述的Sirpα嵌合抗体的抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3或其变体的重链FR。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区,优选包含人源IgG1或IgG4重链恒定区,或者使用氨基酸突变后改变ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)、CDC(complement dependent cytotoxicity、CDC、补体依赖细胞毒作用)活性的IgG1。可通过对IgG上Fc段的修饰,可降低或消除,或增强抗体的ADCC、CDC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变,如选自IgG1的N297A、L234A或L235A;IgG2/4chimera,IgG4的F235E、L234A/E235A、F243L、或S239D/A330L/I332E突变等。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”,也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody),是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。特别的,本发明所述Sirpα抗体的CDR是按CCG、Kabat、AbM、Chothia或Contact等编号规则定义的各CDR序列,移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。优选地,本发明所述人 源化Sirpα抗体的轻链和/或重链可以包含0-10个回复突变。人抗体种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站www.imgt.org和www.vbase2.org得到。
如本文所用,关于抗体的术语“特异性结合”意指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如,特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或更多个物种的该抗原。但是,这种种间交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在另一个实例中,特异性结合抗原的抗体也可以结合该抗原的不同等位基因形式。然而,这种交叉反应性本身不改变抗体根据特异性的分类。在一些情况下,术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用,意味着该相互作用取决于化学物质上特定结构(例如,抗原决定簇或表位)的存在。
术语“脱氨基(deamidation)”指移除位点上或分子某个位点上的氨基。“脱氨基(deamidation)敏感位点”,指更容易、更倾向产生脱氨基化作用的分子和分子某个位点。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物,其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常,当基于摩尔来表示活性时,抗体片段保留至少10%的母体结合活性。优选地,抗体片段保留至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于:Fab、Fab’、F(ab’)
2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136中。
抗体分子包含双特异性抗体(diabody)和单链分子以及抗体的抗原结合片段(例如,Fab、F(ab’)
2,scFv和Fv)。抗体分子包含一条重链和一条轻链(在本发明中称作半抗体)或由其组成。Fab'、F(ab’)
2、Fc、Fd、Fv、单链抗体(例如scFv)、单一可变结构域抗体、双特异性抗体(Dab)(双价和双特异性)和嵌合(例如人源化)抗体,它们可以通过修饰完整抗体产生,或使用重组DNA技术从头合成的那些抗体分子。这些功能性抗体片段保留选择性地与其相应抗原或受体结合的能力。抗体和抗体片段可以来自任何抗体类别,包括但不限于IgG、IgA、IgM、IgD和IgE并且来自任何抗体亚类。抗体分子的制备可以是单克隆或多克隆的。抗体也可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或体外生成的抗体。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。 “Fab’片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分,由此可在两个Fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab’)
2分子。“F(ab’)
2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链,由此在两条重链间形成链间二硫键。因此F(ab’)
2片段由通过两条重链间的二硫键连接的两个Fab’片段组成。术语“Fv”意指向抗体的单臂的VL和VH结构域组成的抗体片段,但缺少恒定区。
在一些情况下,抗体的抗原结合片段是单链结合片段(例如,scFv),其中VL和VH结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见,例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988)]。此类scFv分子可具有一般结构:NH
2-VL-接头-VH-COOH或NH
2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的G
4S氨基酸序列或其变体组成。例如,可使用具有氨基酸序列(G
4S)
4或(G
4S)
3接头,但也可使用其变体。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用,涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于:包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体,其中该VH-VL单元具有多表位特异性;具有两个或多个VL和VH区的抗体,每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合;具有两个或更多个单可变区的抗体,每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合;全长抗体、抗体片段、双特异性抗体(diabodies)、和三抗体(triabodies)、共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
本发明所公开的抗体也可以是单结构域抗体。单结构域抗体可以包括其互补决定区是单结构域多肽组成部分的抗体。例子包括但不限于重链抗体、天然缺少轻链的抗体、衍生自常规4链抗体的单结构域抗体、工程化抗体和除衍生自抗体的那些支架之外的单结构域支架。单结构域抗体可以是现有技术的任何抗体,或将来的任何单结构域抗体。单结构域抗体可以衍生自任何物种,包括但不限于小鼠、人、骆驼、羊驼、山羊、兔和牛。根据一些方面,单结构域抗体是天然存在的单结构域抗体,称作缺少轻链的重链抗体。出于清晰原因,从天然缺少轻链的重链抗体衍生的这种可变结构域在本发明中称作VHH或纳米体以将它与四链免疫球蛋白的常规VH区分。这种VHH分子可以衍生自骆驼科(Camelidae)物种(例如骆驼、羊驼、单峰驼、驼羊和原驼)中产生的抗体。除骆驼之外的其他物种可以产生天然缺少轻链的重链抗体,这类VHH也被考虑。
单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术,合成技术(如CDR-grafting),或其它现有技术进行重组得到。生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到,如冷泉港的抗体实验技术指南。抗原结合片段 同样可以用常规方法制备。
“同一性”、“同源性”、“变异序列”、“突变”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时,例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时,那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同一性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如,在序列最佳比对时,如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源,那么两个序列为60%同源。一般而言,当比对两个序列而得到最大的同一性百分率时进行比较。“优化”指保持或改善了所述抗体与抗原结合的突变,在本发明中,指保持、维持或改善了与Sirpα的结合的突变。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”(如果为单链)在本发明中互换地使用。术语“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“多核苷酸序列”和“多核苷酸”互换使用。
术语“突变”包括氨基酸或核苷酸的取代、插入和/或缺失,“氨基酸取代”和“保守性氨基酸取代”分别是其中氨基酸残基以另一种氨基酸残基置换和以具有相似侧链的氨基酸残基置换。
本文所使用的“慢病毒”是指逆转录病毒科(Retroviridae family)下的慢病毒属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的,其能够感染非分裂细胞;它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中,因此它们是基因递送载体的一种最有效方法。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。来自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平基因转移的手段。
本文使用的术语“重组表达载体”是包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的组合物。在本领域中已知许多载体,包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此,术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物,例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。
本发明使用的表述“细胞”、“细胞系”可互换使用,并且所有这类名称都包括后代。术语“宿主细胞”是指,可用于导入载体的细胞,其包括但不限于,如大肠杆菌等原核细胞,如酵母细胞等的真菌细胞,或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
术语“转染”是指将外源核酸引入真核细胞。转染可以通过本领域已知的各种手段来实现,包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿 孔、显微注射、脂质体融合、脂质转染、原生质体融合、逆转录病毒感染和生物弹道技术(biolistics)。
“任选”、“任一”、“任一个”、“任意”或“任一项”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生,该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如,“任选包含1个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。本发明所用“一个”和“一种”在本发明中用来指的一个或多于一个的语法对象。除非内容明确提示,否则术语“或”在本发明中用来意指术语“和/或”并且与之互换使用。“约”和“大约”应当通常意指鉴于测量的性质或精度,所测量的量的可接受误差程度。示例性误差程度一般在其10%范围内和更一般在其5%范围内。本发明公开的方法和组合物涵盖这样的多肽和核酸,它们具有指定的序列,变异序列或与其基本上相同或相似的序列,例如,与序列指定至少85%、90%、95%、99%或更多相同的序列。在氨基酸序列的情况下,术语“基本上相同”在本发明中用来指第一氨基酸序列。
如本文中所使用的,术语EC
50是指半最大效应浓度(concentration for 50%of maximal effect),即能引起50%最大效应的浓度。术语IC
50是指半抑制浓度,即抑制50%的酶、细胞、细胞受体的活性或微生物的生长等所需的抑制剂浓度。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型,并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。
本发明所述的方法、组合物、联合治疗可以与其他活性剂或治疗方式,所述的方法包括向对象以有效治疗或预防疾病(例如癌症)的量,施用本发明所述的抗Sirpα抗体分子,任选地,与PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG-3、CTLA-4、Tim-3抗体(免疫治疗)或其它肿瘤治疗抗体,Her-2、EGFR、VEGF、VEGFR、CLDN18.2抗体等,以及ADC(如T-DM1),双特异抗体,化疗药物等的一种或多种抑制剂的组合,还包括施用抗Sirpα抗体分子、额外的活性剂或全部可以按这样的量或剂量施用,所述量或剂量高于、低于或等于单独(例如作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量。抗Sirpα抗体,额外的活性剂或全部的施用量或剂量比单独(例如作为单一疗法)使用的每种活性剂的量或剂量低(例如至少20%、至少30%、至少40%或至少50%)。
抗Sirpα抗体分子可以与以下一者或多者组合施用:基于免疫的策略、靶向药物(例如VEGF抑制剂如针对VEGF的单克隆抗体);VEGF酪氨酸激酶抑制剂如舒尼替尼、索拉非尼、阿帕替尼;RNAi抑制剂或VEGF信号传导的下游介导物的抑制剂,例如,雷帕霉素哺乳动物靶(mTOR)的抑制剂。
如本发明所用,术语“癌”、“癌症”、“肿瘤”意在包括全部类型的癌性生长物或致瘤过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官,无论组织病理学类型或侵袭力阶段是什么。例子包括但不限于实体瘤、血液学癌、软组织肿瘤和转移性病灶。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
1)与现有技术相比,本发明的抗体或其抗原结合片段与Sirpα结合活性好,不仅能够阻断人Sirpα(包括Sirpα-V1和Sirpα-V2)与人CD47的结合,使得所述抗体或其抗原结合片段可以作为新药开发,靶向Sirpα和CD47结合而达到治疗肿瘤的目的,而且本发明的抗体或其抗原结合片段能同时结合人Sirpα的两种形式Sirpα-V1和Sirpα-V2,且结合活性显著高于现有技术,因而本发明的抗体或其抗原结合片段作为药物开发具有多方面优势,能针对更多的病人群体(表达Sirpα-V1的人群和/或表达Sirpα-V2的人群)。
2)本发明的抗体或其抗原结合片段不结合人Sirpβ和Sirpγ;也不结合人T细胞。使得本发明的抗体或其抗原结合片段具有更好的选择性,避免临床上结合T细胞所带来的脱靶作用所致的副作用。
3)本发明的抗体或其抗原结合片段能与cyno Sirpα的多种不同多态性有很强的结合,使得临床前安评研究中可以选择灵长类动物猕猴(cynomolgus,cyno),为临床前药理、毒理等研究带来极大的便利。
4)PTM分析结果表明,本发明的抗体或其抗原结合片段具有免疫原性低,成药性风险小的特点。
5)本发明的抗体或其抗原结合片段经过人源化后表达量更高,为下游生产及工艺提供便利,节约成本。在本发明某一较佳实施例中,本发明的人源化抗体的表达量高达275mg/L,较其嵌合的抗体和现有技术中的抗体OSE-172提高了4.5倍左右。
6)基于本发明Sirpα抗体序列设计、筛选得到的序列特异双特异抗体SBody,能够保留针对双靶点抗体的功能活性,对两个靶点的结合活性均与其相对应的单抗接近,且阻断抗原与相应配体结合的活性也和对应的单抗的活性一致;并且能够有效抑制肿瘤生长;在优选的制剂处方中稳定性较好。这些双特异抗体(本发明称之为SBody)结构类似常规IgG,具有正常抗体一样完整的Fc,让其纯化工艺可以按照正常的抗体进行,因而工艺简单,具有生产成本低的优势。
综合上述本发明抗体或其抗原结合片段独有的特性,使其更适合用于针对人Sirpα靶点的抗体或其抗原结合片段的药物开发,并且作为候选药物可单独或者联合给药,特别 是为联合PD-1抗体等免疫治疗肿瘤提供了新的、甚至是更好的选择。
图1显示了本发明抗人Sirpα人鼠嵌合抗体mab14c和人T细胞的结合活性,其中1a、1b、1c、1d分别是阴性对照、对照抗体1、对照抗体2和本发明抗体的结果图。
图2显示了本发明抗人Sirpα人源化抗体和人Sirpβ(左图)、Sirpγ(右图)蛋白特异结合活性。
图3显示了本发明抗人Sirpα人源化抗体和cyno Sirpα(不同多态性)的结合活性。
图4显示了本发明Sirpα和PD-1双特异性抗体体内药效活性。
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1抗原、抗体的克隆、表达和纯化
本发明所用的抗原或购自如下不同公司。
北京义翘神州科技有限公司:人Sirpα-V1-his(货号:11612-H08H),人Sirpα-V1-mFc(货号:11612-H38H),小鼠Sirpα-his(货号:50956-M08H),人Sirpγ(货号:11828-H08H);或北京百普赛斯生物技术有限公司:人Sirpβ-hFc(货号:SIA-H5257),人Sirpγ-hFc(货号:SIG-H5253)或百英生物人CD47-his(货号:B2048)或由本发明表达纯化得到。
表达的人Sirpα-V1蛋白(his,或者Fc Tag)序列为NCBI Reference Sequence:NP_001035111,全长504个氨基酸,其中第1-30位为信号肽;胞外区域(ECD)为第31-373位氨基酸。其中ECD的第31-137位氨基酸为Ig-like-V-type区,第148-247位氨基酸为Ig-like C1-type1区,第254-348位氨基酸为Ig-like C1-type2区。
人Sirpα-V2(his,或者Fc tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_001317657.1,全长508个氨基酸,其中第1-30位为信号肽;ECD为第31-373位氨基酸。胞外区域中,第35-145位氨基酸为Ig-like 1区,147-250位氨基酸为Ig-like2区,252-333位氨基酸为Ig-like 3区。
人Sirpβ(his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_006056.2,全长398个氨基酸,其中第1-29位为信号肽;ECD区域为30-371位氨基酸。ECD中,第37-144位 氨基酸为Ig-like-V-type区,第142-253位氨基酸为Ig-like区,第265-344位氨基酸为Ig C区。
人Sirpγ(his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:AAH64532.1,全长387个氨基酸,其中第1-28位为信号肽;ECD为第29-360位氨基酸。ECD中,第29-137位氨基酸为Ig-like-V-type区,第146-245位氨基酸为Ig-like C1-type1区,第252-340位氨基酸为Ig-like C1-type2区。
NOD小鼠Sirpα(his tag)蛋白序列参考文章polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells(nature immunology,2007)。
Cyno Sirpα(cynomolgus Sirpα,猕猴Sirpα)有不同的多态(polymorphism)形式。本发明Cyno Sirpα蛋白氨基酸序列除了有两条来自NCBI公开的数据库之外,通过采集不同的食蟹猴,另外获得4个不同于NCBI公开的Cyno Sirpα的多态序列。并评估了本发明抗体和这些不同多态形式的Cyno Sirpα蛋白的结合活性。
Cyno Sirpα(his tag)蛋白序列来自NCBI数据库(见
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),Reference Sequence:NP_001271679.1,全长503个氨基酸,其中第1-30位为信号肽;ECD为第31-370位氨基酸。ECD中,第38-144位氨基酸为Ig-like-V-type区,第142-253位氨基酸为Ig区,第265-345位氨基酸为Ig-C区。NCBI Reference Sequence:XP_015313155.1,全长503个氨基酸。两者ECD序列有3个氨基酸不同(多态性)。
此外,本发明从肇庆实验动物中心购买食蟹猴(cynomolgus monkey,cyno)血样,用SEPMATE 50(加拿大干细胞技术有限公司北京办事处,货号86450)分离人外周血单核细胞(PBMC)细胞后,将PBMC细胞用含10%FBS(上海博升生物科技有限公司,Cat.No.BS-0002-500)的RPMI1640(HYCLONE,Cat.No.SH30809.01)培养,贴壁3h,去除上清中悬浮的淋巴细胞,用胰酶(上海源培生物科技股份有限公司,Cat.No.S310JV)将贴壁的巨噬细胞消化下来后利用Trizol法提取RNA反转录后PCR扩增目的片段,PCR所用引物为SI-2F:taaacggatctctaGCGAATTCatggagcccgccggcccggcccccg(SEQ ID NO:1)和SI-2R:cggccttgccggcctcGAGCGGCC GC tgtctgattcggacgaggtagag(SEQ ID NO:2),并将纯化后的PCR产物克隆至载体上测序,测序引物p63a-SEQ:cacaggtgtccactcccaggt(SEQ ID NO:49)。最终得到2条不同于上述NCBI公开的cyno Sirpα序列(多态性)。同时,从海南动物中心购买的食蟹猴血样以同样的方法得到另外2条不同的cyno Sirpα的序列(多态性)。
全基因合成(C端连接6×his)各cyno Sirpα蛋白的碱基序列,并克隆至pTT5载体(Biovector,Cat#:102762)上表达纯化得到不同cyno Sirpα蛋白。
表1 Cyno Sirpα不同多态分子
Cyno Sirpα蛋白编号 | 序列号 |
L932 | NP_001271679.1 |
L933 | XP_015313155.1 |
L936 | RB3-3 |
L937 | RB3-5 |
L938 | RB6-1 |
L939 | RB6-2 |
本发明发现的Cyno Sirpα蛋白(多态性)氨基酸序列:
RB3-3序列:
RB3-5序列:
RB6-1序列:
RB6-2序列:
人CD47(hFc/his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_001768.1,全长323个氨基酸,其中第1-18位为信号肽;ECD为第19-141位氨基酸。
人PD-1(hFc/his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_005009.2,全长288个氨基酸,其中第1-20位为信号肽;ECD为第21-167位氨基酸。
人PD-L1(hFc/his tag)蛋白序列为NCBI Reference Sequence:NP_054862.1,全长290个氨基酸,其中第1-18位为信号肽;ECD为第19-239位氨基酸。
本发明所用hFc tag均是在C-端连接IgG1Fc区域,his tag为在C-端连接6×his。
本发明所用抗体,包括阳性对照抗体1(简称Ref1,即OSE-172,序列来自WO2017178653A2,#55轻链,#42重链,#代表所参考文献中的序列编号)和阳性对照抗体2(简称Ref2,序列来自US20140242095A1中的SIRP29,#6轻链,#12重链,作为与Sirpγ结合时的阳性对照),均由本发明表达纯化。
用pTT5载体(Biovector,Cat#:102762)为表达载体。将所表达的重组蛋白,抗体轻、重链序列克隆到pTT5载体上,经瞬时转染HEK293F细胞(Life Technologies Cat.No.11625019,以下简称293F细胞)表达,后纯化得到。
具体地,293F细胞在Gibco FreeStyle 293 Expression Medium(Gibco,Cat#:12338018)培养基扩培。瞬转开始之前,调节细胞浓度至8×10
5cell/ml,1%FBS(AusGeneX FBS Excellent供应商:AusGeneX,China,Cat#:FBSSA500-S),37℃8%CO
2摇床培养24h,再次镜检存活率>95%,细胞浓度在1.2×10
6cell/ml。
准备300ml培养体系细胞,15ml Opti-MEM(Gibco,Cat#:31985070)溶入重链、轻链质粒或融合蛋白质粒各150μg(如果是重组蛋白,单个质粒用量为300μg),0.22μm过滤除菌。再取15ml Opti-MEM溶入1mg/ml PEI(Polysciences,Inc,Cat#:23966-2)600μl后静置5min。把PEI缓慢加入质粒中,室温孵育10min,边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒PEI混合溶液,37℃8%CO
2摇床培养5天收样,3300G 10min取上清进行纯化。
抗体或-Fc融合蛋白纯化:将样品高速离心去除杂质,用PBS pH7.4平衡含有Protein A(Mabselect,GE Healthcare Life Science,Cat#:71-5020-91AE)的重力柱(生工生物,Cat#:F506606-0001),2-5倍柱体积冲洗。将样品过柱。用5-10倍柱体积的PBS(生工生物,Cat#:B548117-0500)冲洗柱子。再用pH 3.5 0.1M乙酸洗脱目的蛋白,后用pH8.0的Tris-HCl调节至中性,酶标仪测定浓度,分装、储存备用。
His Tagged蛋白纯化:将样品高速离心去除杂质。平衡镍柱(Ni smart beads 6FF常州天地人和生物科技有限公司,Cat#:SA036010):用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBS pH7.4溶液平衡镍柱,2-5倍柱体积冲洗。将样品上清过柱。漂洗杂蛋白:使用含有10mM咪唑0.5M NaCl的PBS pH7.4溶液冲洗层析柱,除去非特异结合的杂蛋白,并收集流出液。用含有250mM咪唑0.5M NaCl的PBS pH7.4洗脱目的蛋白。buffer置换:将洗脱的目的蛋白过超滤管12000g 10min离心(超滤管,Merck Millipore,Cat#:UFC500308),再补加1ml PBS,测定浓度,分装、储存备用。
实施例2高表达细胞株构建及细胞活性(ELISA)检测
本发明所用的高表达细胞株均系本发明人通过本公司的稳定细胞株构建平台自行构建完成,以下以人Sirpα高表达细胞株构建为例说明构建过程。具体步骤如下:
实验开始第1天,将293T细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,Cat#:GNHu17)接种于两个6cm培养皿,每个培养皿里的细胞数达到7.5×10
5。第2天将包裹质粒(pGag-pol,pVSV-G等BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)和克隆有人Sirpα基因的质粒pBabe-hSirpα各4μg加入OPTI-MEM(Thermofisher Scientific,Cat#:31985070),使最终体积为200μl,另准备200μl OPTI-MEM加入36μl转染试剂fectin(上海源培生物科技股份有限公司生物科技股份有限公司,Cat#:F210),二者混匀,室温放置5min,然后将混合物(每皿各200μl)滴加入培养好的293T细胞。第3天将293T细胞培养液换为4ml DMEM高糖培养基(上海源培生物科技股份有限公司生物科技股份有限公司,Cat#:L130KJ)。第4天将CHO-K1细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,Cat#:SCSP-507)接种于10cm培养皿,使细胞数达到5×10
5。第5天收集293T细胞上清(病毒),用0.45μm滤膜过滤至培养好的CHO-K1细胞,同时加入10μg/ml polybrene(上海翊圣生物科技有限公司,Cat#:40804ES76),混匀后放置培养箱,3~4h后换成DMEM/F12 10%FBS培养基(上海源培生物科技股份有限公司生物,Cat#:L310KJ)。第7天将CHO-K1细胞传代,第8天传代的细胞开始加入10μg/ml puromycin进行筛选(上海源培生物科技股份有限公司生物,Cat#:S250J0)。2-3天细胞大量死亡,更换培养基继续培养,直到细胞不再死亡时,细胞大量扩增,筛选单克隆细胞株,扩培,冻存保种。
本实施例所用的人Sirpα(pBabe-hSirpα-V1)的氨基酸序列NP_001035111,全长1-504氨基酸,其中1-30位为信号肽;第31-504位为本发明构建CHO-K1hSirpα+细胞系所表达的蛋白序列。
hSirpα+细胞结合活性(ELISA)检测:
将上述得到的细胞,即人Sirpα高表达的单克隆细胞株扩增培养后,按10×10
4/孔铺 96孔板,37℃培养箱过夜孵育后去除上清,用免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司,Cat#:P0098)100μl/孔,室温固定半小时。PBS(上海源培生物科技股份有限公司生物,Cat#:B320)洗一遍后230μl 5%牛奶37℃封闭2小时,PBST洗3遍。每孔加入50μl,10μg/ml,5倍梯度稀释的待测样品。37℃孵育1小时后,用PBST洗5遍。加Anti-human HRP(Jackson Immuno Research,Cat#:109-035-003)1:2500 50μl/孔37℃孵育1小时后,用PBST洗5遍,每孔加入50μl TMB(Surmodic,Cat#:TTMB-1000-01)显色,加入50μl/孔1M H
2SO
4终止反应。酶标仪(MultiskanGO Thermo,型号51119200)读数,Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例3抗Sirpα抗体和抗原结合实验(ELISA)
用pH7.4的PBS缓冲液将实施例1中所述的人Sirpα-V1-hFc,Sirpα-V1-his,Sirpα-V2-his,Sirpβ-his,Sirpγ-his,猴Sirpα-his(cynoSirpα-his)或者NOD-mSirpα-his等不同抗原(重组蛋白)稀释至1μg/ml,2μg/ml,或者5μg/ml浓度,以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning,CLS3590-100EA)中,于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后,加入用PBS稀释的5%脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液230μl/孔,37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液,并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05%Tween-20)洗板5次后,加入50μl/孔上清(含检测抗体)或10μg/ml起始,5倍梯度稀释的待测抗体,37℃孵育1小时,PBST洗板5次,加入50μl/孔1:2500稀释的Anti-mouse or human HRP二抗(Jackson Immuno Research,Cat#:115-035-003or109-035-003),37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后,加入50μl/孔TMB显色底物(KPL,Cat#:52-00-03),室温孵育10-15min,加入50μl/孔1M H
2SO
4终止反应,用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher,Cat#:51119200)在450nm处读取吸收值,根据OD值挑选结合活性高的克隆或者计算EC
50值。
实施例4抗Sirpα抗体阻止Sirpα和CD47结合活性实验
用pH7.4的PBS缓冲液将人Sirpα-V1-hFc/Sirpα-V1-his等重组蛋白分别稀释至5μg/ml或者2μg/ml浓度,以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning,CLS3590-100EA)中,于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后,加入用PBS稀释的5%脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液230μl/孔,37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液,并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05%Tween-20)洗板5次后,加入25μl/孔上清(含检测抗体)或100μg/ml起始,3倍梯度稀释的待测抗体和25μl/孔,浓度为4μg/ml的Biotin labeled的CD47-hFc或3μg/ml的CD47-his,混匀后37℃孵育箱孵育1小时,洗板5次后加入50μl/孔1:1000稀释的streptavidin-HRP二抗(GenScript, M00091)或anti-his-HRP二抗(GenScript,A00612),37℃孵育1小时后,用PBST洗5遍,每孔加入50μl TMB(Surmodic,Cat#:TTMB-1000-01)显色,加入50μl/孔1M H
2SO
4终止反应。酶标仪(MultiskanGO Thermo型号51119200)读数,Graphpad prism 5进行数据分析。
实施例5抗人Sirpα抗体与人T细胞结合实验
本发明所用T细胞用SEPMATE 50(加拿大干细胞技术有限公司北京办事处,货号86450)分离自健康志愿者外周血,冻存液(RPMI1640培养基:FBS:DMSO=5:4:1)冻存于液氮罐中备用。取冻存的PBMC细胞,37℃融化后加入到3ml FACS buffer(1×PBS+2%FBS)中,1000rpm离心5min,去除上清后用FACS buffer重悬计数并调整密度至1×10
6cells/ml。将PBMC按100μl cells/孔加入到U型96-well板中,向细胞中加入待检测抗体,使其终浓度分别为10μg/ml、1μg/ml和0μg/ml。混匀后室温孵育20min,2000rpm,离心5min。去除上清,加入100μl FACS buffer重悬,2000rpm,离心5min。去上清,加入50μl 1:200稀释的PE anti-human IgG Fc(Biolegend,货号:409304),混匀后室温避光孵育20min。2000rpm,离心5min。去上清,用100μl FACS buffer洗一次后,用100μl FACS buffer重悬细胞,用流式细胞仪(Novosampler
TM pro,model:NS200)读数。实验数据用NovoExpress处理,以抗体浓度为0μg/ml的样品孔为阴性对照,以此为基础计算待测抗体特异结合T细胞的比例。
实施例6抗人Sirpα抗体的发现
本发明用人human Sirpα-V1-mFc(北京义翘神州生物技术有限公司,货号:11612-H38H)和hSirpα-V2-hFc(如实施例1中所表达)重组蛋白作为抗原,弗式完全佐剂交叉免疫小鼠4次后,电融合并筛选融合杂交瘤,从数以万计的杂交瘤克隆中筛选出和hSirpα-V1结合活性好的克隆。进一步筛选,意外发现有克隆能够同时结合human Sirpα-V1和human Sirpα-V2、具有blocking活性、并不与人PBMC(T细胞)结合。进一步,从这些意外发现的杂交瘤克隆中,通过多次亚克隆,得到单克隆细胞株,从中提取抗体序列,表达纯化得到本发明鼠源抗体。
具体地,实验用SJL小鼠,雌性,4周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,动物生产许可证号:SCXK(京)2016-0011。小鼠购进后,实验室环境饲养1周,白天光/夜晚暗周期调节,温度20-25℃;湿度40-60%。小鼠分成3只/组/笼。用实施例1准备的抗原进行免疫。首免佐剂为弗式完全佐剂(Sigma-Aldrich,SIGMA F5506-10M),从二免开始佐剂为弗式不完全佐剂(Sigma-Aldrich,SIGMA F5881-10M)。抗原与佐剂比例为1:1(v/v)。100μl/25μg/只首免,100μl/12.5μg/只二免、三免、四免,小腿肌肉注射。 融合前3天,100μl/25μg/只加强免疫。免疫时间为第0、14、28、42、和56天(加强免疫)。于第36、50天,用上述实施例3的ELISA方法检测小鼠血清抗体滴度,选择血清中抗体滴度高并且滴度处于平台期的小鼠进行脾细胞融合,将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
CRL-8287
TM)进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板,然后筛选,获得优选克隆。
对杂交瘤细胞株进行初次筛选,用实施例3的ELISA方法检测杂交瘤细胞株分泌上清中的抗体和人Sirpα的结合活性(部分结合数据如表2),并选择活性好的克隆。取上清,用实施例4所述方法检测所分泌的抗体阻止hSirpα和hCD47结合活性(Blocking活性),同时检测与人Sirpα-V2的结合活性。优选克隆,进一步有限稀释得到单克隆抗体细胞株,部分结果见表3。
表2杂交瘤融合细胞(克隆)上清与hSirpα-V1结合活性(OD450数值)
初始克隆号 | ELISA数值 | 初始克隆号 | ELISA数值 |
1E6 | 1.58 | 9G8 | 2.25 |
2D9 | 1.52 | 9H10 | 2.02 |
3C6 | 1.22 | 10A3 | 1.12 |
3B8 | 1.6 | 10G4 | 1.85 |
3C11 | 2.49 | 10Q5 | 1.98 |
4C1 | 3.0 | 10C11 | 2.39 |
5G7 | 1.54 | 11H1 | 1.4 |
5E 9 | 1.56 | 12C1 | 1.57 |
5B10 | 1.71 | 12E 2 | 1.22 |
6H1 | 1.57 | 12C3 | 1.56 |
6F12 | 1.59 | 12D7 | 1.54 |
7G4 | 1.32 | 13F10 | 1.0 |
7H4 | 1.85 | 13A11 | 1.24 |
8C4 | 2.2 | 13C11 | 1.7 |
8H4 | 2.14 | 14A4 | 1.41 |
8H7 | 2.11 | 14H6 | 1.81 |
9H1 | 2.48 | 15Q6 | 1.53 |
9F8 | 1.25 | 16G12 | 1.28 |
表3杂交瘤融合细胞(克隆)上清与hSirpα-V2结合活性及blocking活性数据(OD450数值)
表2中列出了部分初次筛选数据。数据显示,很多杂交瘤融合细胞在初始筛选时表现出了很高的结合活性,ELISA读值(OD450在2以上),比如4C1、8C4、8H7、9H1等克隆。但进一步筛选发现,几乎所有克隆或者和hSirpα-V2的结合活性不高,或者没有阻断hSirpα和hCD47结合的阻断活性(阻断活性OD450数值越低,且和ELISA数值相差越大,表明阻断活性越好),见表3。
非常意外地发现,和hSirpα-V1结合活性比较好的克隆14H6(表2,OD450数值1.81),表现出了与hSirpα-V2很强的结合活性(表3,OD450数值1.25),且能很好阻断hSirpα和hCD47结合(OD450数值0.33)。
对这株克隆进行多次有限稀释,每一次稀释7-10天,待克隆增殖后,用ELISA方法重新检测各个克隆所分泌的抗体(上清)和不同Sirpα的结合活性、blocking活性,结果见表4。
表4优选杂交瘤细胞亚克隆筛选活性
上述结果表明,由14H6经过多次亚克隆,得到的单克隆细胞株所分泌的抗体保留了和hSirpα-V1和hSirpα-V2结合活性,而且显示阻断hSirpα-V1-his和hCD47-Fc(dimer)结合活性,阻断hSirpα-V1-hFc(dimer)和hCD47-his结合活性。
更加意想不到的是,这些单克隆细胞株所分泌的抗体不结合Sirpγ(表4中和hSirpγ结合活性值在0.1以下,即本底值)。说明本发明抗体对Sirpα和Sirpγ有非常好的选择性。
本发明进一步从14H6的亚克隆之一14H6E5B5C8G2中提取抗体序列,即得到本发明优选鼠源mab14抗体序列,具体如下述实施例。
实施例7本发明鼠源抗人Sirpα抗体mab14抗体序列提取、分析鉴定
从上述杂交瘤14H6亚克隆优选得到的单克隆细胞株中提取抗体序列过程为本领域技术人员常用的方法。具体地,收集上述单克隆细胞株,扩增培养后,取1×10
6个细胞,用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)。将提取的RNA并反转录成cDNA,反转录试剂盒购自生工生物技术(上海)股份有限公司,Cat#:B532435。以反转录得到的cDNA为模板,进行PCR扩增。扩增产物测序,分别得到mab14抗体轻、重链可变区碱基/编码序列(如下)。所用引物参阅Novagen发表的手册TB326Rev.C0308。
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab14轻链可变区碱基序列(划线部分为编码序列):
本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab14重链可变区碱基序列(划线部分为编码序列):
本发明所得到的上述鼠源单克隆抗体mab14轻、重链可变区的碱基序列所编码的氨基酸序列为如下SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab14轻链可变区氨基酸序列:
本发明优选的杂交瘤细胞单克隆株中获得的鼠源单克隆抗体mab14重链可变区氨基酸序列:
本发明上述抗体轻、重链可变区序列和IgG不同型的恒定区,例如人IgG1(hIgG1)、人IgG2(hIgG2)、人IgG3(hIgG3)或人IgG4(hIgG4),人轻链κ、λ型;鼠mIgG1、mIgG2或mIgG3,鼠轻链κ、λ型等重组表达纯化得到完整的人鼠嵌合抗体、鼠抗体。本发明以重链恒定区为hIgG4、轻链κ型为例子,按实施例1表达纯化方法得到人鼠嵌合抗体mab14c。用实施例2、实施例3和实施例4之方法检测了mab14c对hSirpα-V1、hSirpα-V2、hSirpα+细胞的结合活性及阻断hSirpα与CD47的结合活性,并和对照抗体1进行了比较,结果见表5。
表5本发明人鼠嵌合抗体mab14c活性分析
上述结果表明,本发明意外发现的人鼠嵌合抗体mab14c不仅能阻断Sirpα和人CD47的结合,而且能和hSirpα-V1、hSirpα-V2、hSirpα+细胞都有很好的结合活性。这和Ref1不同,Ref1并不结合hSirpα-V2。
此外,用实施例4中方法检测mab14c与NOD小鼠的muSirpα及不同多态性的cyno Sirpα(包括L932、L933、L936-L939)结合活性,结果如表6。
表6本发明抗体mab14c和鼠、cyno Sirpα结合活性分析(EC
50,nM)
注:EC
50大于10nM且小于50nM时(10nM≤EC
50<50nM)为微弱结合,EC
50介于2~10nM(即2nM≤EC
50<10nM)时为弱结合;EC50大于50nM(EC
50≥50nM)或者检测不到信号值时为不结合。
上述结果表明,本发明抗体mab14c和食蟹猴(cyno)Sirpα的6个多态性蛋白中的4个有很好的结合,这和Ref1显著不同,Ref1不和这6个cyno Sirpα中的任一个结合。在新药开发临床前研究阶段,需要选择相关灵长类种属做临床前研究,如果不和灵长类比如cyno(最常用的灵长类动物)蛋白结合,就不能选择该灵长类做临床前研究,这会给临床前研究带来极大的不方便。因此,本发明抗体因和cyno Sirpα多种多态性蛋白均结合,这为临床前研究带来了很大的便利。
此外,因为人T细胞表达Sirpγ,为了评估本发明抗体和人T细胞的结合活性(选择性),用实施例5中的方法检测了本发明mab14c抗体与人T细胞的结合活性,结果见图1。其中,1a为阴性对照,即在没有抗体的情况下,只有0.39%的细胞(本底水平)荧光强度在10
3以上(阳性细胞)。即没有检测到有结合的细胞。在有10μg/ml对照抗体1(Ref1)时(1b),荧光强度在10
3以上的细胞比例0.49%(本底水平),即该抗体不和T细胞结合。同样条件下,检测到对照抗体2(Ref2)结合的细胞比例为51.3%,即该抗体和T细胞结合(1c)。同样条件下,检测本发明抗体结合的细胞比例为0.9%(本底水平,1d),即本发明抗体不和T细胞结合。
上述结果表明,本发明的抗体mab14c是既不同于Ref1也不同于Ref2的一种新的抗体。比Ref1有更好的选择性,能同时结合V1和V2两种形式的Sirpα,临床可以针对更多的病人人群(表达V1的人群和表达V2的人群)。比Ref1有更好的结合cyno Sirpα的活性,这为临床前药理、毒理研究带来极大便利。此外,本发明抗体也不同于Ref2,其比Ref2具有更好的选择性:其不结合Sirpγ或T细胞(表达Sirpγ),可以为作为药物开发,避免临床上结合T细胞带来非特异靶向作用所致的副作用。
实施例8本发明鼠源抗体人源化
为了避免用于药物开发过程中的免疫原性等方面的风险,本发明对鼠源抗体mab14进行了人源化设计和筛选,以及序列优化。具体过程描述如下。
抗体的CDR定义本领域还有多种不同的方法,这些标记CDR方法可总结如下表7。
表7本领域抗体CDR定义不同方法汇总*
Loop | CCG定义 | Kabat定义 | AbM定义 | Chothia定义 | Contact定义 |
轻链CDR1 | L24-L34 | L24-L34 | L24-L34 | L24-L34 | L30-L36 |
轻链CDR2 | L50-L56 | L50-L56 | L50-L56 | L50-L56 | L45-L55 |
轻链CDR3 | L89-L97 | L89-L97 | L89-L97 | L89-L97 | L89-L96 |
重链CDR1 | H26-H35 | H31-H35 | H26-H35 | H26-H32 | H30-H35 |
重链CDR2 | H50-H65 | H50-H65 | H50-H58 | H52-H56 | H47-H58 |
重链CDR3 | H95-H102 | H95-H102 | H95-H102 | H95-H102 | H93-H101 |
*更多信息可以参阅网站:
http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef
其中,表7中的Laa-Lbb可以指从抗体轻链的N端开始,第aa位至第bb位的氨基酸序列;Haa-Hbb可以指从抗体重链的N端开始,第aa位至第bb位的氨基酸序列。例如,L24-L34可以指从抗体轻链N端开始,按照CCG编码规则的从第24位至第34位的氨基酸序列;H26-H32可以指从抗体重链N端开始,按照CCG编码规则的从第26位至第35位的氨基酸序列。本领域技术人员公知,在编码CDR时,有些位置有时会有插入和/或位点缺失的情况。
上述所述鼠源抗人Sirpα抗体mab14可变区按照表7各种定义方法,其CDR序列标记/注释如下。
表8本发明抗hSirpα(anti-hSirpα)抗体mab14按CCG编号规则定义的CDR序列
抗体 | mab14 CDRs |
轻链CDR1 | RASQDIRNYLN(SEQ ID NO:11) |
轻链CDR2 | FTSTLHS(SEQ ID NO:12) |
轻链CDR3 | QQGNTLPWT(SEQ ID NO:13) |
重链CDR1 | GYNFNIYWIN(SEQ ID NO:14) |
重链CDR2 | NIYPSSISTNYNEKFKT(SEQ ID NO:15) |
重链CDR3 | SEGTYYGGRYEGDWFGY(SEQ ID NO:16) |
表9本发明抗hSirpα抗体按Kabat编号规则定义CDR序列
抗体 | mab14 CDRs |
轻链CDR1 | RASQDIRNYLN(SEQ ID NO:11) |
轻链CDR2 | FTSTLHS(SEQ ID NO:12) |
轻链CDR3 | QQGNTLPWT(SEQ ID NO:13) |
重链CDR1 | IYWIN(SEQ ID NO:17) |
重链CDR2 | NIYPSSISTNYNEKFKT(SEQ ID NO:15) |
重链CDR3 | SEGTYYGGRYEGDWFGY(SEQ ID NO:16) |
表10本发明抗体按AbM编号规则定义CDR序列
抗体 | mab14 CDRs |
轻链CDR1 | RASQDIRNYLN(SEQ ID NO:11) |
轻链CDR2 | FTSTLHS(SEQ ID NO:12) |
轻链CDR3 | QQGNTLPWT(SEQ ID NO:13) |
重链CDR1 | GYNFNIYWIN(SEQ ID NO:14) |
重链CDR2 | NIYPSSIST(SEQ ID NO:18) |
重链CDR3 | SEGTYYGGRYEGDWFGY(SEQ ID NO:16) |
表11本发明抗体按Chothia编号规则定义CDR序列
抗体 | mab14 CDRs |
轻链CDR1 | RASQDIRNYLN(SEQ ID NO:11) |
轻链CDR2 | FTSTLHS(SEQ ID NO:12) |
轻链CDR3 | QQGNTLPWT(SEQ ID NO:13) |
重链CDR1 | GYNFNIY(SEQ ID NO:19) |
重链CDR2 | YPSSI(SEQ ID NO:20) |
重链CDR3 | SEGTYYGGRYEGDWFGY(SEQ ID NO:16) |
表12本发明抗体按Contact编号规则定义CDR序列
抗体 | mab14 CDRs |
轻链CDR1 | RNYLNWY(SEQ ID NO:21) |
轻链CDR2 | KLLIYFTSTLH(SEQ ID NO:22) |
轻链CDR3 | QQGNTLPW(SEQ ID NO:23) |
重链CDR1 | NIYWIN(SEQ ID NO:24) |
重链CDR2 | WIGNIYPSSIST(SEQ ID NO:25) |
重链CDR3 | ARSEGTYYGGRYEGDWFG(SEQ ID NO:26) |
对本发明鼠源抗体mab14的CDR序列做上述分析、标记及定义后,如本领域许多文献公示的方法进行人源化。将鼠源抗体序列和人抗体种系数据库(v-base)比较,找出同源性高的人抗体轻、重链种系,在此基础上,计算机建模,模拟抗体结构中可能影响和抗原结合的位点,回复突变关键位点和组合,筛选出活性优选的人源化抗体分子。
具体地,通过序列同源性比较分析,发现和mab14轻链同源性比较好的人抗体种系包含有IGKV1-27*01、IGKV1-33*01、IGKV1-39*01、IGKV1-NL1*01,IGKV1/OR10-1*01、IGKV1D-33*01、IGKV1D-39*01、IGKV1-12*01、IGKV1-12*02、IGKV1-17*02等。进一步比较、分析,优选人抗体种系轻链IGKV1-39*01。序列比对发现mab14轻链的J基因区和人抗体种系hJk1、hJk2.1、hJk2.2、hJk2.3、hJk2.4、hJk3、hJk4.1、hJk4.2、hJk5同源性高,进一步比较、分析,优选hJk4.1用于mab14轻链人源化人抗体种系J区,进行人源化设计、筛选和序列优化。
通过序列同源性比较分析,发现和mab14重链同源性比较好的人抗体种系包含有IGHV1-46*01、IGHV1-46*02、IGHV1-46*03、IGHV1-69*02、IGHV1-69*04、IGHV1-69*06、IGHV1-69*08、IGHV1-69*09、IGHV1-69*10、IGHV1-69*14等。进一步比较、分析,优选人种系重链IGHV1-46*01序列用于本发明抗体人源化。序列比对发现和mab14的重链J基因区和人抗体种系重链J基因hJh1、hJh2、hJh3.1、hJh3.2、hJh4.1、hJh4.2、hJh4.3、hJh5.1、hJh5.2、hJh6.1、hJh6.2、hJh6.3等同源性高,进一步比较、分析,优选hJh4.1用于本发明鼠源抗体mab14重链人源化人抗体种系J区,进行人源化设计、筛选和序列优 化。
将本发明抗体以mab14的CDR(见上述CDR之定义,本实施例中主要按CCG定义)移植到所选择的人源化轻、重链人抗体种系模板上,再与IgG轻、重链恒定区重组。然后,以鼠源抗体的三维结构为基础,对包埋残基、与CDR有直接相互作用的残基,以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变,筛选这些突变以及突变组合,看对抗体活性的影响,并对CDR化学不稳定氨基酸残基优化,得到结构、活性等优化的抗体分子序列,即完成本发明鼠源抗体的人源化。
以下结合mab14的具体序列,以hIgG4重链,κ型轻链(序列如下)为例子进行说明。
人抗体轻链恒定区κ链:
人IgG4的重链恒定区:
本发明人源化轻链可变区优选序列如下:
本发明人源化重链可变区优选序列:
本发明鼠源抗体轻链的人源化序列中含有不同的回复突变,回复突变位点数目可以是10个或更多,优选0-10个,如上述所列序列。这些任意序列与人抗体轻链恒定区κ链或λ链的恒定区序列组合,得到本发明抗体的轻链序列,比如本发明轻链用κ型轻链恒定区,如上所列序列。同样,人源化所用重链可变区也有不同数目的回复突变,回复突变位点数目可以是10个或更多,优选0-10个,如上述所列重链可变区序列。这些含不同数量回复突变的重链可变区序列,同任选人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4链恒定区序列重组得到本发明的重链序列,比如本发明重链用hIgG4作为恒定区序列为例子加以说明。
本发明部分优化人源化抗体序列,以及所表达的抗体的表达量及活性评估(本发明实施例3之ELISA检测方法)结果如下表。
表13本发明人源化抗体序列(人κ型轻链,hIgG4重链恒定区为例子)
上述结果表明,本发明人鼠嵌合抗体mab14c与hSirpα-v1的结合活性与对照分子Ref1几乎一致(0.093VS 0.072)。由本发明人鼠嵌合抗体序列mab14c不同人源化程度的轻、重链序列经过3轮不同的组合得到的上述人源化抗体分子,均保留了与嵌合抗体几乎一致的结合活性。
更佳地,不同人源化程度的序列间不同的组合抗体表达量有显著的差别,其中mab14-h1、mab14-h11及mab14-h16等抗体的表达量高达200mg/L,其中mab14-h16的表达量最高,为275mg/L,较嵌合抗体mab14c的表达量提高了4.5倍(275mg/L VS 49mg/L)。
更加特别地,用实施例4所述的实验方法,检测了本发明人源化抗体阻断hSirpα(dimer)与hCD47结合以及阻断hSirpα与hCD47(dimer)结合的效果,结果如表14,本发明人源化抗体保留了嵌合抗体mab14c能很好的阻断hSirpα与hCD47结合的特性。这一结果表明,本发明的嵌合抗体、人源化抗体不仅同hSirpα蛋白结合,而且能有效地阻断hSirpα与hCD47的结合。
表14本发明人源化抗体活性(人κ型轻链,hIgG4重链恒定区为例子)
所述人源化抗体的轻、重链氨基酸(包括恒定区)序列(部分代表性分子)列示如 下。
人源化mab14-h5抗体氨基酸序列:
轻链:
重链:
人源化mab14-h12抗体氨基酸序列:
轻链:
人源化抗体mab14-h12重链序列同SEQ ID NO:43。
人源化mab14-h13抗体氨基酸序列:
轻链:
人源化抗体mab14-h13重链序列同SEQ ID NO:43。
人源化mab14-h14抗体氨基酸序列:
轻链:
人源化抗体mab14-h14重链序列同SEQ ID NO:43。
人源化mab14-h15抗体氨基酸序列:
轻链:
人源化抗体mab14-h15重链序列同SEQ ID NO:43。
人源化mab14-h16抗体氨基酸序列:
轻链:
人源化抗体mab14-h16重链序列同SEQ ID NO:43。
实施例9本发明人源化抗人Sirpα抗体,优选抗体结合活性综合评价
为了进一步评估本发明人源化抗体的结合活性,以本发明人源化优选抗体mab14-h16为例,将其和对照抗体Ref进行了平行/重复结合活性(ELISA)评价。检测了抗体与hSirpα-V1、hSirpα-V2、hSirpβ、hSirpγ及不同多态性Cyno Sirpα的结合活性,实验方法同上述
实施例3,结果见下表15及图2和图3。
表15本发明抗体和Sirpα结合活性(EC
50,nM)综合评价
抗原 | mab14-h16 | Ref1 | Ref2 |
hSirpα-V1 | 0.065 | 0.057 | 0.159 |
hSirpα-V2 | 0.094 | ND | 0.37 |
hSirpβ | 微弱结合 | 0.126 | 0.167 |
hSirpγ | ND | ND | 1.46 |
NOD小鼠mu-Sirpα | ND | ND | 弱结合 |
(2.82) | |||
Cyno Sirpα多态性1(L932) | 0.181 | ND | 0.209 |
Cyno Sirpα多态性2(L933) | 0.159 | ND | 0.164 |
Cyno Sirpα多态性3(L936) | 0.143 | ND | 0.198 |
Cyno Sirpα多态性4(L937) | 0.121 | 微弱结合 | 0.186 |
Cyno Sirpα多态性5(L938) | ND | 微弱结合 | 0.175 |
Cyno Sirpα多态性6(L939) | ND | 微弱结合 | 0.167 |
ND,未能检测到结合信号,即不结合;微弱结合,EC
50高于10nM;弱结合,EC
50介于2-10nM。
上述结果表明,本发明意想不到地发现的鼠源抗人Sirpα抗体、人源化抗人Sirpα抗体是一种非常特异的、新的抗体。该抗体和Ref1不同,能同时结合人Sirpα-V1、V2和多种cyno Sirpα(多态性),且不结合Sirpβ。
不仅如此,本发明新抗体和Ref2也显著不同。Ref2也能同时结合Sirpα-V1和V2,但结合活性比本发明抗体弱。本发明抗体mab14-h16和Sirpα-V1的结合活性比Ref2强1.4倍(上表中0.065nM vs 0.159nM),和Sirpα-V2的结合比Ref2强2.9倍(0.094nM vs 0.37nM)。更加显著不同的是,Ref2和Sirpβ及Sirpγ都有比较强的结合,EC
50分别为0.167nM和1.46nM。本发明抗体和Sirpβ及Sirpγ只有微弱或者完全不结合。本发明这一独特的选择性(特异结合Sirpα而不结合Sirpβ及Sirpγ),使其临床作为药物开发过程中,具有突出的优势,即可以避免脱靶带来的安全性问题。
此外,Ref2能结合cyno Sirpα多态性5和6。这点也和本发明抗体不同。
这些特点说明本发明抗体和Ref1、Ref2的结合位点(epitope)不同。
为了进一步评价本发明抗体的细胞结合活性,阻断Sirpα和相应配体CD47的活性,本发明以人源化优选抗体mab14-h16为例,用人Sirpα+高表达细胞株包板ELISA检测其与高表达人Sirpα的细胞株的结合活性,检测方法如实施例2。用实施例4中的方法检测本发明人源化抗体阻断人Sirpα与CD47的结合活性的能力,用实施例5中的方法检测人源化抗体与人T细胞结合情况。结果见表16a。
此外,进一步检测了本发明抗体阻断人Sirpα-V2与人CD47结合的情况。具体地,用pH7.4的PBS缓冲液将人Sirpα-V2-his重组蛋白稀释至2μg/ml浓度,以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning,CLS3590-100EA)中,于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后,加入用PBS稀释的5%脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液230μl/孔,37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液,并用PBST缓冲液(PH7.4PBS含0.05%tweeen-20)洗板5次后,加入25μl/孔,100μg/ml起始,3倍梯 度稀释的待测抗体和25μl/孔,浓度为4μg/ml的Biotin labeled的CD47-hFc或CD47-his,混匀后37℃孵育箱孵育1小时,洗板5次后加入50μl/孔1:1000稀释的streptavidin-HRP二抗(GenScript,M00091),37℃孵育1小时,后PBST洗5遍,每孔加入50μl TMB(Surmodic,Cat#TTMB-1000-01)显色,加入50μl/孔1M H
2SO
4终止反应。酶标仪(MultiskanGO Thermo,型号:51119200)读数,Graphpad prism 5进行数据分析。结果见表16b。
表16a本发明抗体细胞结合活性,阻断活性评价
抗体样品 | mab14-h16 | Ref1 | Ref2 |
T细胞结合活性(结合百分比%) | 1.95 | 1.79 | 47.6 |
hSirpα-v1+细胞株结合活性(EC50,nM) | 0.124 | 0.084 | 0.106 |
阻断hSirpα(dimer)结合CD47(IC50,nM) | 4.81 | 3.74 | 4.79 |
阻断hSirpα结合CD47(dimer),IC50(nM) | 5.28 | 4.16 | 5.44 |
表16b本发明抗体阻断人Sirpα-V2结合人CD47活性评价
抗体样品 | mab14-h16 | Ref1 | Ref2 |
阻断hSirpα-V2结合hCD47(IC50,nM) | 2.39 | ND | 1.29 |
阻断hSirpα-V2结合人CD47(dimer),IC50(nM) | 6.29 | ND | 3.09 |
ND:未能检测到blocking信号。
上表结果表明,本发明人源化抗体及优选抗体mab14-h16不结合人T细胞(该试验中阴性对照结合百分比为1.67%和mab14-h16结合比例1.95%接近,即本底水平)。和hSirpα-v1+细胞株的结合活性、阻断hSirpα-v1和人CD47结合的活性与对照Ref1,Ref2接近,且能够有效阻断hSirpα-V2和人CD47结合。
上述实施例的数据表明,本发明意外发现的鼠源抗人Sirpα抗体、人源化抗人Sirpα抗体除了能同时结合人Sirpα-V1、人Sirpα-V2,且结合人Sirpα-V1、人Sirpα-V2活性更强,结合多种cyno Sirpα(多态性),且不结合人Sirpβ和Sirpγ之外,还不结合人T细胞。
此外本发明抗体具有很好的阻断人Sirpα(包括Sirpα-V1和Sirpα-V2)与人CD47结合的活性,使得该抗体可以作为新药开发,靶向Sirpα和CD47结合而达到治疗肿瘤的目的。
这些突出的特点使得本发明抗体在临床上能显示独有的优势,表现在临床上可针对更多的病人群体(表达V1的人群和表达V2的人群)。不结合Sirpβ和Sirpγ,和T细胞,具有非常好的特异性,避免临床上脱靶导致的副作用。同时,本发明抗体能与多种Cyno Sirpα有很强的结合,临床前安全评价研究中可以选择灵长类动物cyno,为期临床前研究提供便利。
实施例10本发明人源化抗人Sirpα抗体PTM
借助MOE(molecular operating environment),
https://www.chemcomp.com/Products.htm;Schrodinger,
https://www.schrodinger.com/;或DS(Discovery Studio)等计算机分析软件,对本发明抗体进行序列转录后修饰(Post-translational Modification,PTM)位点分析。结果发现本发明优选抗体的轻链的M4、C23、W35、C88、W96和重链(H Chain)的C22、W33、W36、W47、M81、C96、W112中仅M4为低风险氧化位点,其它均属于非氧化热点。整个序列除了轻链的N92有轻微脱氨基(deamidation)风险,不存在其它脱氨基位点或热点。整个序列没有N-糖基化(N-glycoslation)热点,没有天冬氨酸异构化(Asp isomerization)位点或热点。因此本发明人源化序列为PTM分析优选序列。
实施例11针对Sirpα靶点的双特异抗体设计
基于上述发现的抗Sirpα抗体,本发明进行了多种双特异抗体的设计。所设计的双特异抗体的通式如下。
表17基于本发明抗Sirpα抗体进行的双特异设计(通式1)
方案 | 含轻链的序列 | 含重链的序列 |
1 | T2(scFv) n1-T1VL-LC-T2(scFv) n2 | T2(scFv) n3-T1VH-HC-T2(scFv) n4 |
2 | T1(scFv) n1-T2VL-LC–T1(scFv) n2 | T1(scFv) n3-T2VH-HC-T1(scFv) n4 |
3 | T2(scFv) n1-T1VL-LC–T1(scFv) n2 | T2(scFv) n3-T1VH-HC-T1(scFv) n4 |
4 | T1(scFv) n1-T2VL-LC–T2(scFv) n2 | T1(scFv) n3-T2VH-HC-T2(scFv) n4 |
表17中,含轻链的序列指该序列除了包括轻链序列以外,还可以包括与轻链序列连接的scFv;含重链的序列指该序列除了包括重链序列以外,还可以包括与重链序列连接的scFv。其中,T1代表针对靶点1(比如Sirpα)的第一蛋白功能区,T2代表针对靶点2(非Sirpα)的第二蛋白功能区。T1(scFv)代表针对靶点1抗体的scFv序列;T2(scFv)代表针对靶点2的scFv序列。
(scFv)
n1,(scFv)
n2,(scFv)
n3,(scFv)
n4中的n1,n2,n3,n4分别为自然数,可以是0、1、2、3等,在本发明的具体实施例中,n1,n2,n3,n4中其中至少1个数值为1,其余为0。VL,代表针对靶点1或者2的抗体轻链可变区序列;VH,代表针对靶点1或者2的抗体重链可变区序列。LC,代表轻链(κ或者λ)的恒定区序列,优选人轻链恒定区序列;HC代表重链,包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等的恒定区序列(缩写为HC-IgG1、HC-IgG2、HC-IgG3、HC-IgG4),优选人的重链恒定区序列(HC-hIgG)。重链恒定区C末端连接scFv或其它蛋白序列的时候,其C末端末位氨基酸K可以突变,优 选突变为A。由此,在方案1中,T1为免疫球蛋白,T2为scFv;在方案2中,T2为免疫球蛋白,T1为scFv;scFv针对的靶点相同;在方案3、4中,两端的scFv针对两个不同的靶点。
表17中,所述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区,其轻链可变区N末端或重链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端;或所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区,其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端。
需说明的是,当上述scFv为轻链可变区-连接子-重链可变区时,其连接方式为轻链可变区的C末端与连接子连接,所述连接子再与重链可变区的N末端连接,从而将scFv轻链可变区的N末端和重链可变区的C末端暴露出来,使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和/或重链连接。在本发明中,当其连接免疫球蛋白的轻链时,在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的C末端通过连接子与免疫球蛋白重链的N末端连接;当其连接免疫球蛋白的重链时,在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接。
当所述scFv为重链可变区-连接子-轻链可变区时,其连接方式为轻链可变区的N末端与连接子连接,所述连接子再与重链可变区的C末端连接,从而将scFv轻链可变区的C末端和重链可变区的N末端暴露出来,使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和/或重链连接。在此情况下,当其连接免疫球蛋白的轻链时,在一些具体的实施例中优选地使用scFv的轻链可变区的C末端与免疫球蛋白重链的N末端连接;当其连接免疫球蛋白的重链时,在一些具体的实施例中优选地使用scFv的重链可变区的N末端与免疫球蛋白重链的C末端连接。
所述连接子优选为(G
4S)
m,所述的m优选为0~10之间的整数。进一步优选地,所述连接子为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)
3,和/或,所述scFv的数量为一对,对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端和/或N末端。
上述双特异设计涉及的各个靶点抗体序列,除了本发明所述anti-Sirpα抗体序列外,其它的靶点抗体序列来自已经公开的抗体序列。包括,抗PD-1抗体Nivolumab/Opidivo(简称Nivo)和Pembrolizumab/Keytruda(简称Pem)。Nivolumab和Pembrolizumab等序列都能从www.drugbank.ca等公开资源查到。
实施例12抗原抗体结合(ELISA)实验
用pH 7.4的PBS缓冲液将本发明自行表达的人PD-1、Sirpα等抗原根据不同assay, 稀释至2μg/ml浓度,以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning,CLS3590-100EA)中,于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后,加入用PBS稀释的5%脱脂牛奶(上海生工生物工程有限公司,A600669-0250)封闭液200μl/孔,37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液,并用PBST缓冲液(pH7.4PBS含0.05%tweeen-20)洗板5次后,加入50μl/孔,用1%BSA 5倍连续稀释的待测抗体,37℃孵育1小时,PBST洗板5次,加入50μl/孔1:2500稀释的HRP标记的二抗(Jackson Immuno Research,115-035-003),37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后,加入50μl/孔TMB显色底物(KPL,52-00-03),室温孵育5-10min,加入50μl/孔1M H
2SO
4终止反应,用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher,51119200)在450nm处读取吸收值,根据OD值计算EC
50。
实施例13抗体阻断抗原抗体结合(Blocking)实验
用pH为7.4的PBS缓冲液将按实施例1中方法表达的抗原PD-1、Sirpα稀释至2μg/ml浓度,以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning,CLS3590-100EA)中,于37℃孵育2小时。弃去液体后,加入用PBS配制的5%脱脂牛奶(上海生工生物工程有限公司,A600669-0250)封闭液200μl/孔,37℃孵育3小时进行封闭。弃去封闭液,用PBST(pH7.4PBS含0.05%tweeen-20)洗板5次后,每孔加入25μl用1%BSA 3倍连续稀释的待测样品和25μl终浓度为1μg/ml或者12μg/ml的biotin标记的配体(CD47-his/CD47-hFc、PD-L1等,本发明表达纯化),37℃孵育1小时,PBST洗板5次,加入50μl/孔1:1000稀释的HRP标记的二抗(金斯瑞生物科技有限公司,M00091),37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后,加入50μl/孔TMB显色底物(KPL,52-00-03),室温孵育5-10min,加入50μl/孔1M H
2SO
4终止反应,用MULTISKAN Go酶标仪(ThermoFisher,51119200)在450nm处读取吸收值,根据OD值计算IC
50。
Biotin标记的试剂盒为Biotin Labeling Kit-NH2,购自东仁化学科技(上海)有限公司,货号LK03。操作方法按说明书进行,标记好的抗体用Multiskan GO(ThermoFisher)酶标仪检测浓度后使用。
实施例14针对Sirpα和PD-1双靶点的双特异抗体设计和活性评价
本发明针对Sirpα和PD-1两个靶点设计了不同序列结构的双特异抗体,见下表。
表18针对Sirpα和PD-1双靶点设计的双特异抗体
*:κ链表示轻链为人IgG的κ型轻链恒定区。#:IgG4的C末端连接连接子的时候,其最末端氨基酸K突变为A。以下重链C末端引入scFv的设计均将最末端K突变为A。
按本发明实施例1中所述的克隆表达纯化方法,分别克隆表达、纯化上述双特异抗体,用前述实施例12和13中的方法分别检测这些设计的双特异分子和人Sirpα以及PD-1的结合活性,发现LB501、LB502、LB503、LB504和LB506均能保留对两个靶点抗原的结合活性,结果如下表。
表19针对Sirpα和PD-1双靶点设计的双特异抗体的结合活性评价
#:括号里面的数值为同实验条件下,同靶点对应的单克隆抗体的结合活性EC
50。*:同样实验条件下,双特异抗体和对应的单克隆抗体的结合活性EC
50的比值。比值越大,说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多,比如比值为2,则说明所设计的双特异抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内(实验误差范围),说明结合活性没有受到影响。
上表中是本发明抗Sirpα抗体mab14-h16的scFv在PD-1抗体Pem的重链N末端,重链C末端;轻链N末端,轻链C末端设计成的双特异分子,或者在PD-1抗体Nivo重链N端,重链C端设计成的双特异分子,或者PD-1抗体Pem的scFv与本发明抗Sirpα抗体mab14-h16设计成的双特异分子。
结果表明,同是Sirpα抗体和scFv,不同的位置设计成的双特异,对Pem活性的影响较Nivo要小的多,如LB501、LB502、LB503和LB504(scFv连接在Pem上),对两个靶点的结合活性均与相对应的单抗接近,而相较于scFv连接在Nivo上的双特异性抗体,只有LB506对两个靶点的结合活性均与对应的单抗分子接近。说明不同位置连接Sirpα抗体scFv对Pem的活性影响不大,对Nivo的活性影响则不同。同样地,Pem的scFv连接至本发明抗Sirpα抗体mab14-h16重链的N末端(LB507)和重链的C末端(LB508)所形成的双特异抗体对抗体的结合活性也不同,LB507对Sirpα的结合活性相较于单抗减弱1倍,而对PD-1的结合活性与Pem接近,但LB508对两个靶点的结合活性均显著下降。
本发明这些设计的双特异抗体上述数据表明,同样的Sirpα抗体(本发明)和scFv,同样的设计方式,但PD-1抗体序列不同,所设计的双特异抗体分子活性差别巨大。同样的Sirpα抗体(本发明)scFv和PD-1抗体,但Sirpα抗体(本发明)scFv的位置不同,所设计的双特异抗体分子活性差别巨大。同样的PD-1抗体scFv和Sirpα抗体(本发明),但PD-1抗体scFv的位置不同,活性差别也很巨大。
这些数据表明,基于本发明Sirpα抗体序列所设计的双特异抗体,其序列不同,scFv和抗体位置等不同,活性不同。合适的位置、合适的序列设计得到能针对双靶点活性很好的双特异抗体,这些双特异抗体结构类似常规IgG,有完整的Fc,本发明称之为Sequence-based IgG like bispecific antibody format,即序列特异的IgG结构相似的双特异抗体(SBody)。这些双特异抗体分子具有正常抗体一样完整的Fc,让其纯化工艺可以按照正常的抗体进行,因而工艺简单,具有生产成本低的优势。
将上述保留了双靶点活性的SBody分别针对两个靶点进行功能(阻断抗原和相应配体结合实验)评估,结果见下表。
表20针对Sirpα和PD-1双靶点设计的双特异抗体功能活性评价
#:括号里面的数值为同实验条件下,同靶点对应的单克隆抗体阻断抗原和配体结合活性IC
50。*:IC
50改变倍数,即双特异抗体和对应的单克隆抗体(对照抗体)的IC
50的比值。比值越大,说明所设计的双特抗体对单靶点的功能活性减弱越多,比如比值为2,则说明所设计的双特异抗体对靶点功能活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内为实验误差范围,即活性没有受到影响。ND:该分子没有检测到阻止Sirpα和Daudi细胞结合活性。
上述功能活性结果表明,本发明设计的双特异抗体(SBody),阻断抗原与相应配体结合的活性变化与结合活性变化一致,如LB507,其结合人Sirpα和人PD-1的活性稍有减弱,阻断人Sirpα和人CD47结合的活性及阻断人PD-1结合人PD-L1的活性均稍有减弱(与相对应的单抗相比,变化倍数分别为2.46、2.59和2.20)。其他设计LB501、LB502、LB503、LB504和LB506均保留了对双靶点的功能活性。
为了评估本发明双特异抗体SBody的表达水平,用同样的方法在同一表达系统(293F细胞)瞬转所述SBody,用常规Protein A纯化,得到各自的表达量,结果如下表。
表21针对Sirpα和PD-1双靶点设计的双特异抗体表达水平评价
抗体编号 | 表达量(mg/L) | 抗体编号 | 表达量(mg/L) |
LB501 | 2.24 | LB504 | 7.35 |
LB502 | 2.43 | LB506 | 44.29 |
LB503 | 3.83 |
上述结果表明,本发明设计针对Sirpα和PD1双特抗体(SBody)表达产量差别很 大。综合上述数据分析,同一种设计模式,Sirpα抗体scFv相同,PD-1抗体序列不同的SBody,表达量不同,Nivo对应的SBody的表达量比Pem要高5倍,甚至17倍。比如,LB506比LB502产量高17倍(44.29/2.43);LB506比LB504产量高5倍(44.29/7.35)。同一种设计模式,PD-1序列相同,Sirpα抗体scFv序列也相同,但scFv位置不同的SBody,表达量也相差2倍以上,比如LB504(7.35mg/L)vs LB501(2.24mg/L)vs LB502(2.43mg/L)。
这些数据表明,本发明抗Sirpα抗体mab14-h16和PD1抗体设计的双特异抗体SBody不仅活性、功能,而且表达量也是序列特异的。
本发明抗Sirpα抗体mab14-h16和PD1抗体设计的双特异抗体SBody部分序列如下:
LB501轻链序列:
LB501重链序列(Pem重链):
LB502轻链序列(Pem轻链):
LB502重链序列:
LB503轻链序列:
LB503重链序列(Pem重链):同SEQ ID NO:51。
LB504轻链序列(Pem轻链):同SEQ ID NO:52。
LB504重链序列:
LB506轻链序列(Nivo轻链):
LB506重链序列:
实施例15本发明Sirpα和PD-1双特异性抗体在不同制剂处方中的稳定性评价
将上述实施例14中的双特异性抗体LB504用脱盐离心柱(Thermo,Cat#89890)置换至各制剂处方中,制剂处方方案如表22所示。各制剂buffer置换过程如下,对脱盐离心柱先进行预处理,以1000g离心2min,去除储存液后,向脱盐离心柱中加入1mL各制剂缓冲液,以1000g离心2min,重复进行3次,弃掉收集管中的缓冲液;将脱盐离心柱置于一个新的收集管中,将适量的LB504缓慢地加到柱子中,并加入20μL制剂缓冲液压层,以1000g离心2min,收集离心后的样品,混匀后用0.2μm滤膜过滤;将过滤后的各LB504制剂样品按200μL/管分装,其中3管置于40℃水浴锅中,分别在第9,20,30天进行SEC-HPLC和SDS-PAGE检测,即为40℃处理9天、20天和30天的样品;另取1管在无菌分装后进行SEC-HPLC和SDS-PAGE检测,即为40℃处理0天的样品。不同制剂处方的SEC-HPLC检测结果如表23所示。
表22本发明双特异性抗体LB504制剂处方方案
表23本发明双特异性抗体LB504各制剂处方样品SEC-HPLC检测结果
上述结果表明,本发明双特异抗体LB504在中浓度(5mg/mL)下,柠檬酸缓冲体系(pH5.0,pH5.5,pH6.0)和磷酸盐缓冲体系中,置换buffer后聚体增加,且随40℃处理时间增长,聚体增加明显,同时有少量片段产生,SEC-HPLC检测纯度下降至80%左右。LB504在醋酸缓冲体系(pH5.0)中表现较稳定,40℃处理30天后,聚体增加3.59%,片段增加0.36%,SEC-HPLC检测总纯度下降在5%以内。在组氨酸缓冲体系(包括pH5.5,pH6.0,pH6.5)中,LB504置换buffer后纯度较高,且40℃处理30天表现较为稳定,聚体增加较少,且随buffer的pH升高,产生聚体减少,在处方7(20mM His-HCl,125mM甘氨酸,125mM海藻糖,0.02%ps80,pH6.5)中LB504在40℃条件下处理30天,SEC-HPLC纯度下降2.1%,片段增加0.8%,纯度变化趋势较小,更优地,LB504在处方7中, 在40℃下处理20天,几乎无聚体和片段的产生,纯度下降为1.4%(分别产生0.83%聚体和0.57%片段)。SDS-PAGE结果同样表明,LB504在处方7中40℃处理20天几乎无聚体和降解片段产生。
上述结果表明本发明双特异抗体LB504在较高浓度下(5mg/mL),在制剂缓冲液(20mM His-HCl,125mM甘氨酸,125mM海藻糖,0.02%ps80,pH6.5)中的稳定性最好,经40℃处理30天可保持稳定,SEC-HPLC纯度仅下降2.9%,说明LB504稳定性较好。
实施例16本发明Sirpα和PD-1双特异性抗体优化设计分子动物体内药效评估
用人PD-1/Sirpα双转基因Balb/cJGPt品系小鼠Balb/cJGPt-hPD-1/hSirpα建立动物药效模型,对本发明双特异性抗体LB504进行体内药效评估。小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司,生产许可证编号:SCXK(苏)2018-0008。
利用实施例2中的方法,将人CD47全长序列(见实施例1)过表达于CT26细胞(购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)表面得到过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞系CT26-920。构建的CT26-920细胞培养于含10%胎牛血清(Gibco,Cat#10270-106)的RPMI1640培养基中(Hyclone,Cat#SH3080901),在含5%CO
2的37℃细胞培养箱中连续培养。Balb/cJGPt-hPD-1/hSirpα雌性小鼠,5只/笼饲养于SPF级环境,温度20~25℃;湿度40%~60%,自由进食进水,定期更换垫料。待CT26-920细胞培养至对数生长期(汇合度在80%-90%)时,用0.25%胰酶消化,收集细胞,用RPMI1640培养基洗涤细胞两次,并用RPMI1640培养基进行重悬计数后,将RPMI1640培养基与基质胶按2:1的比例混匀,最后用其调整细胞密度至6×10
6细胞/mL。将CT26细胞悬液100μL接种于小鼠左肋部皮下(0.6×10
6细胞/只小鼠),挑选肿瘤体积约100-120mm
3的小鼠进行随机分组,每组8只。
无菌环境下,用PBS配制待测样品和对照组样品。PBS为Blank组,PD-1抗体(a-PD1,即anti-PD1抗体Pembrolizumab/Keytruda(简称Pem),由本发明实施例1方法克隆表达)与Ref1分别为单独用药对照组。LB504为待测药物组。给药方式为腹腔注射,单独用药组给药剂量为10mg/kg,LB504给药剂量为13.3mg/kg,各组注射体积均为200μL/只(LB504和各对照抗体为等摩尔)。给药频率为2次/周,连续给药2周。
各剂量组第一次给药当天为第0天。每次给药前测量体重、肿瘤大小,记录数据。本次实验实际给药周期为2周,测量周期为16天。肿瘤测量结束后,计算肿瘤体积、肿瘤相对体积和抑瘤率。结果如图4和表24所示。
肿瘤大小计算公式:肿瘤体积TV(mm
3)=0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径
2);肿瘤相 对体积(RTV)=T/T0或者C/C0。相对肿瘤增长率(T/C%)=100%×(T-T0)/(C-C0);抑瘤率(TGI)=(1-T/C)×100%;其中T0、T分别为各给药组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积;C0、C分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。
图4和表24结果表明,Balb/cJGPt-hPD-1/hSirpα双敲入小鼠CT26结肠癌动物模型中,本发明双特异性抗体分子LB504对肿瘤生长表现出明显的抑制作用,小鼠体内药效显著优于等摩尔剂量的Ref1和a-PD1,更优的是,LB504给药组的抑瘤率可达71%。
表24给药16天后肿瘤相对体积分析结果及TGI计算
*代表p<0.05
同时在给药后第19天,每组各取5只小鼠进行TILs分析。具体地,将每只小鼠的肿瘤取出后放入皿中,剪成2-4mm的小组织块后转移至含有酶消化液(胶原酶Ⅳ+DNAseⅠ)的离心管中,于37℃消化,消化结束后用滤网过滤、离心(400g,5min),弃上清,加入红细胞裂解液裂红,离心去上清后加入PBS重悬细胞,计数后取1*10^6细胞/sample用于后续染色标记。取细胞加入Fc Block抗体,孵育10-15min后,分别加入各荧光抗体混合液,4℃孵育30min,200μL FACS buffer洗两次,弃去上清,加入100μL FACS buffer重悬细胞后,上机检测。结果如表25所示。
表25各给药组小鼠肿瘤TILs分析结果(平均值)
TILs分析结果显示,各给药组小鼠肿瘤微环境中,总淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞比例变化不大,CD4+T淋巴细胞比例下降,且LB504给药组显著下降,主要是由CD4+CD25+细胞(Treg)比例下降引起。LB504给药剂量组中CD206+细胞(M2型巨噬细胞)比例也显著下降,且下降比例达61.7%(同PBS组相比,4.25%vs 11.1%),各给 药组中CD11+/F4-80+细胞和CD206-细胞比例基本和PBS组一致。该结果说明,本发明双特异性抗体LB504是通过降低抑制性T细胞(Treg)和M2型巨噬细胞比例发挥抗肿瘤药效的。
实施例17本发明Sirpα和PD-1双特异性抗体PK评价
用同实施例16中一样的人Sirpα和PD-1双转基因小鼠,同样饲养条件进行本发明双特异性抗体的PK评价。随机挑选3只小鼠组成一组。小鼠尾静脉注射LB504,注射剂量为13.3mg/kg,注射体积为200μL/只。分别于注射前0小时、注射后0.25、0.5、1、5、24、48、72、101、120、144、168、192、216、288小时眼眶取血。所取血样离心,取上清,-20℃保存。待收集完所有时间点血液样本后,用双夹心ELISA检测LB504结合PD-1和Sirpα(双特异性抗体可同时结合PD-1和Sirpα)来评价LB504的PK特点。用EXCEL软件分析PK数据,计算LB504的T
1/2,结果见表26。
表26本发明PD-1和Sirpα双特异性抗体PK评价
上述结果表明,本发明双特异性抗体LB504单次尾注射小鼠体内后,浓度于0.25h达到最高值,Cmax和AUC0-101h分别为191.19g/mL和2507.67μg/mL*h。T
1/2为31.31小时。该结果说明本发明双特异性抗体LB504在小鼠体内PK参数在正常范围,具可开发性。
综合以上本发明数据表明,发明人通过创新性筛选,意外发现了一种抗人Sirpα抗体,它们和Sirpα结合活性好,能同时结合人Sirpα-V1和人Sirpα-V2;和非人灵长类食蟹猴Sirpα多种多态性蛋白均有很好的结合活性。能有效地阻断人Sirpα和人CD47的结合。比目前临床上的抗体(对照抗体Ref1和Ref2)有更好的活性;且不结合人Sirpβ和人Sirpγ,也不结合人T细胞,具有很好的选择性,可避免临床脱靶导致的脱靶效应,能更加有效地避免副作用。此外分子本身序列具有低PTM风险。人源化后抗体表达量高,为下游生产及工艺提供便利,节约成本。此外,基于本发明Sirpα抗体序列所设计的双特异抗体,能够保留双靶点抗体的功能活性,对两个靶点的结合活性均与其相对应的单抗接近,且阻断抗原与相应的配体结合的活性也和对应的单抗一致;并且能够有效抑制肿 瘤生长;稳定性好,在醋酸缓冲体系和组氨酸缓冲体系中均较稳定。这些双特异抗体(本发明称之为SBody)结构类似常规IgG,具有正常抗体一样完整的Fc,让其纯化工艺可以按照正常的抗体进行,因而工艺简单,具有生产成本低的优势。本发明抗体独特的特性,使其更适合用于针对人Sirpα靶点抗体药物开发,并且作为候选药物可单独或者联合给药,特别是为联合PD-1抗体治疗肿瘤提供了新的,甚至是更好的选择,且本发明优选出的双特异性抗体为肿瘤的多靶点治疗提供了另一种选择。
Claims (17)
- 一种靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,其包含轻链可变区和/或重链可变区,所述抗体或其抗原结合片段结合人Sirpα-V1和人Sirpα-V2,但微弱结合或不结合人Sirpβ、Sirpγ,且不结合人T细胞,并具有阻断Sirpα与CD47结合的功能;优选地,所述抗体或其抗原结合片段还结合cyno SirpαL932、L933、L936和L937中的一个或多个,但不结合cyno SirpαL938和L939;其中,所述L932的氨基酸序列的NCBI序列号为NP_001271679.1,所述L933的氨基酸序列的NCBI序列号为XP_015313155.1,所述L936的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,所述L937的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,所述L938的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示,所述L939的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;更优选地,所述轻链可变区包含以下的CDR:如SEQ ID NO:11的氨基酸序列所示的VL CDR1;如SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的VL CDR2;如SEQ ID NO:13的氨基酸序列所示的VL CDR3;和/或,所述重链可变区包含以下的CDR:如SEQ ID NO:14的氨基酸序列所示的VH CDR1;如SEQ ID NO:15的氨基酸序列所示的VH CDR2;如SEQ ID NO:16的氨基酸序列所示的VH CDR3;或,所述轻链可变区在所述的VL CDR1、VL CDR2、VL CDR3的氨基酸序列上分别具有3、2或1个氨基酸突变,和/或,所述重链可变区在所述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3的氨基酸序列上分别具有3、2或1个氨基酸突变。
- 如权利要求1所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述靶向Sirpα的抗体为鼠源抗体;优选地,所述鼠源抗体的轻链可变区为如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其突变;和/或,所述鼠源抗体的重链可变区为如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其突变;更优选地,所述鼠源抗体的轻链可变区由如SEQ ID NO:7所示的核苷酸编码;和/或,所述鼠源抗体的重链可变区由如SEQ ID NO:8所示的核苷酸编码;所述突变为所述轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入,且所述突变的氨基酸序列与所述轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列具有至少85%序列同一性,并保持或改善了所述抗体或其抗原结合片段与Sirpα的结合;所述至少85%序列同一性优选为至少90%序列同一性;更优选为至少95%序列同一性;最优选为至少99%序列同一性。
- 如权利要求2所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述靶 向Sirpα的抗体或其抗原结合片段还包含鼠抗体恒定区或人抗体恒定区;所述鼠抗体恒定区包括鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区,所述人抗体恒定区包括人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和κ或λ型轻链恒定区;优选地,当所述靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包含鼠源抗体的可变区和人抗体恒定区时,所述人抗体恒定区包括氨基酸序列分别如SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:27所示的人IgG4的重链恒定区和κ型轻链恒定区。
- 如权利要求1所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述靶向Sirpα的抗体为人源化抗体;优选地,所述人源化抗体的框架区包括人抗体重链框架区和人抗体轻链框架区;更优选地,所述人源化抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:29-34中任一个所示的氨基酸序列或其突变;和/或,所述人源化抗体的重链可变区序列包含如SEQ ID NO:35-41中任一个所示的氨基酸序列或其突变;所述突变为所述轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列上发生了一个或多个氨基酸残基的缺失、取代或插入,且所述突变的氨基酸序列与所述轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列具有至少85%序列同一性,并保持或改善了所述抗体或其抗原结合片段与Sirpα的结合;所述至少85%序列同一性优选为至少90%序列同一性;更优选为至少95%序列同一性;最优选为至少99%序列同一性;进一步更优选地,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列,所述重链可变区如包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列;或,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列,所述重链可变区包含如SEQ ID NO:36-41中任一个所示的氨基酸序列;或,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:31-34中任一个所示的氨基酸序列,所述重链可变区包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列;或,所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:29或31-34中任一个所示的氨基酸序列,所述重链可变区包含如SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。
- 如权利要求4所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人抗体κ或λ型轻链恒定区或其突变;和/或,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区或其突变;优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含人抗体κ型轻链恒定区;和/或,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含人IgG4的重链恒定区;更优选地,所述抗体或其抗原结合片段的轻链包含如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列或其突变;和/或,所述抗体或其抗原结合片段的重链包含如SEQ ID NO:43所示的氨 基酸序列或其突变。
- 如权利要求5所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其包含以下轻链和重链:所述轻链如SEQ ID NO:42或44-48中的任一条氨基酸序列所示,所述重链如SEQ ID NO:43的氨基酸序列所示。
- 如权利要求1-6中任一项所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段,其中所述靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段包括免疫球蛋白、Fab、Fab’、F(ab’) 2、Fv或scFv、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体、单区抗体或者其他任何保留抗体特异性结合抗原的部分能力的抗体,或者由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。
- 一种双特异性抗体,其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区,其特征在于,所述第一蛋白功能区为如权利要求1-7中任一项所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段;所述第二蛋白功能区为靶向非Sirpα抗原的抗体或其抗原结合片段;优选地,所述非Sirpα抗原为免疫检查点抗原或肿瘤治疗靶点,所述免疫检查点抗原或肿瘤治疗靶点抗原优选包括PD-1、PD-L1、Tim3、LAG3或CLDN18.2;更优选地,所述第二蛋白功能区为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗Tim3抗体、抗LAG3抗体或抗CLDN18.2抗体;最优选地,所述抗PD-1抗体为Nivolumab或Pembrolizumab,所述抗PD-L1抗体为Atezolumab、Avelumab或Durvalumab。
- 如权利要求8所述的双特异性抗体,其特征在于,所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白,所述第二蛋白功能区为一个或多个、优选两个scFv;或者,所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白,所述的第一蛋白功能区为一个或多个、优选两个scFv;其中,所述scFv包括重链可变区与轻链可变区,所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接;所述scFv通过连接子与所述免疫球蛋白连接,所述连接子优选(G 4S) w;所述的w优选为0~10之间的整数,更优选为1、2、3或者4。
- 如权利要求9所述的双特异性抗体,其特征在于,所述scFv的结构为轻链可变区-连接子-重链可变区,其轻链可变区N末端或重链可变区C末端分别通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端;或所述scFv的结构为重链可变区-连接子-轻链可变区,其重链可变区N末端或者轻链可变区C末端分别通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端或N末端;所述两个scFv对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的C末端和/或N末端;优选地,所述的双特异性抗体为:(1)所述第一蛋白功能区为scFv,所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白;其中,所述第一蛋白功能区的scFv包含如权利要求1-4中任一项所述的轻链可变区和所述的重链可变区;或,(2)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白,所 述第二蛋白功能区为scFv:其中,所述免疫球蛋白包含轻链如SEQ ID NO:48所示、重链如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列;所述scFv的轻链可变区的序列为Pem的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为Pem的重链可变区;更优选地,所述的双特异性抗体为(1)时,所述免疫球蛋白包括Pem的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Pem的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列;或,所述免疫球蛋白包括Nivo的轻链可变区、轻链恒定区为κ链、Nivo的重链可变区以及重链恒定区为hIgG4的氨基酸序列;进一步更优选地,所述两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的N末端;且,所述scFv的轻链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区;或,所述两个scFv的重链可变区的C末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链可变区的N末端;且,所述scFv的轻链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区;或,所述两个scFv的重链可变区的N末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的C末端;且,所述scFv的轻链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区;或,所述两个scFv的重链可变区的N末端通过连接子对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链的C末端;且,所述scFv的轻链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区,所述scFv的重链可变区为氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示的重链可变区。
- 如权利要求8-10任一项所述的双特异性抗体,其特征在于,所述的双特异性抗体包括以下轻链氨基酸序列和重链氨基酸序列:如SEQ ID NO:50所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:51所示的重链氨基酸序列;或,如SEQ ID NO:52所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:53所示的重链氨基酸序列;或,如SEQ ID NO:54所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:51所示的重链氨基酸序列;或,如SEQ ID NO:52所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:55所示的重链氨基酸序列;或,如SEQ ID NO:56所示的轻链氨基酸序列,如SEQ ID NO:57所示的重链氨基酸序列。
- 一种分离的核酸,其编码如权利要求1-7中任一项所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段或如权利要求8-11中任一项所述的双特异性抗体。
- 一种重组表达载体,其包含如权利要求12所述的分离的核酸;优选地,所述表 达载体包含真核细胞表达载体和/或原核细胞表达载体。
- 一种转化体,其在宿主细胞中包含如权利要求13所述的重组表达载体;优选地,所述宿主细胞为原核细胞和/或真核细胞,所述原核细胞优选E.coli细胞如TG1、BL21,所述真核细胞优选HEK293细胞或CHO细胞。
- 一种靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段的制备方法,其包含培养如权利要求14中所述的转化体,从培养物中获得靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段。
- 一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含如权利要求1-7中任一项所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段和/或如权利要求中8-11任一项所述的双特异性抗体,以及药学上可接受的载体;优选地:所述药物组合物还包括其他抗肿瘤抗体作为活性成分;和/或,所述药学上可接受的载体包括浓度为5mM-50mM的His-HCl缓冲液、浓度为0mM-200mM的甘氨酸、浓度为0mM-300mM的海藻糖和/或占所述药物组合物的体积比为0.01%-1%的吐温80;更优选地:所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段和/或所述的双特异性抗体的浓度为5mg/mL-100mg/mL,优选5mg/mL;和/或,所述His-HCl缓冲液的浓度为20mM;和/或,所述甘氨酸的浓度为125mM;和/或,所述海藻糖的浓度为125mM;和/或,所述吐温80占所述药物组合物的体积比为0.02%;和/或,所述药物组合物的PH为5.0-7.0,例如5.5、6或6.5;和/或,所述的双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:52所示,重链氨基酸序列如SEQ ID NO:55所示;进一步更优选地,所述药物组合物由:浓度为5mg/mL的轻、重链氨基酸序列分别如SEQ ID NO:52和55所示的双特异性抗体,浓度为20mM的His-HCl缓冲液,浓度为125mM的甘氨酸,浓度为125mM的海藻糖和占所述药物组合物的体积比为0.02%的吐温80组成。
- 一种如权利要求1-7中任一项所述的靶向Sirpα的抗体或其抗原结合片段、如权利要求8-11中任一项所述的双特异性抗体或如权利要求16所述的药物组合物在制备诊断、预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
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