TWI833738B - 新型抗lag-3抗體多肽 - Google Patents
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Abstract
本發明提供抗LAG-3之重鏈抗體或其抗原結合結構域、編碼其之分離的多核苷酸、包含其之醫藥組合物,及其用途。
Description
本發明係關於新型抗人LAG-3抗體多肽。
淋巴細胞活化基因-3或LAG-3(亦稱為CD223),為免疫球蛋白超級基因家族之成員,在結構上與CD4類似,胞外區含有4個免疫球蛋白結構域,但兩者之胺基酸序列僅有20%同源性(Dijkstra等(2006) Mol Immunol. 43:410-419)。與CD4相似,LAG-3與MHC II類分子相互作用,但親和力更高(Huard等(1995) Eur J Immunol.25:2718-2721)。不同於CD4, LAG-3不與人免疫缺陷病毒gp120蛋白相互作用(Baixeras等(1992) J. Exp. Med. 176:327-337)。
LAG-3不在靜息外周血淋巴細胞上表現,而在活化之T細胞及NK細胞上表現。LAG-3之最主要配位體為MHC-II,此外,有研究表明LAG-3之配位體亦包括半乳糖凝集素3 (Galectin-3),主要由腫瘤微環境中之非免疫細胞產生;以及肝竇內皮細胞凝集素(LSECtin),由肝臟及腫瘤細胞產生(Lawrence P. Andrews (2017) Immunol Rev; 276: 80-96)。LAG-3與MHC-II結合可調節樹突狀細胞之功能 (Andreae等. (2002) J Immunol 168:3874-3880)。對於T細胞,其LAG-3之表現上調及活化可抑制CD4及CD8 T細胞之增殖及功能(Monica V. Goldberg及Charles G. Drake(2011)Curr Top Microbiol Immunol 344: 269-278)。封閉Treg細胞之LAG-3可消除Treg之抑制功能(Workman and Vignali, (2005) J Immunol 174:688-695)。因此,LAG-3被視為免疫治療之有效候選靶點。
免疫檢查點之抑制抗體抗PD-1及抗CTLA4已在臨床中顯示出令人振奮的腫瘤治療療效,然而大部分病人對此等免疫檢查點抑制劑之單一療法應答率不足。與新候選靶點聯合應用之發現將極大提高及改善現有免疫治療之效果,LAG-3正是目前最有希望的候選靶點,因此免疫治療領域對新型抗LAG-3抗體或抗體多肽之研發有很大需求。高親和力重鏈單域抗體之研發,因其良好穩定性及組織穿透力(Harmsen MM, De Haard HJ (2007) Appl Microbiol Biotechnol 77(1):13-22),將給免疫治療領域之擴充帶來巨大益處。
本申請全文中之冠詞「一種」、「一個」及「該」在此用於指代一個或多於一個(即至少一個)該冠詞之語法對象。舉例而言,「一種抗體」係指一種抗體或多於一種抗體。
本申請提供新型單株抗LAG-3抗體,及其胺基酸及核苷酸序列,以及其用途。
在一個態樣中,本申請提供一種分離的抗體多肽,其包含特異性地與LAG-3結合之重鏈可變域,其中該重鏈可變域包含互補決定區1 (CDR1)、CDR2及CDR3,其中
該CDR1包含GLTLSQYTMG (SEQ ID NO: 1)之胺基酸序列或與其具有至少80%序列同一性之同源序列,
該CDR2包含AIHWTSSVTDYADSVX1
G (SEQ ID NO:33)之胺基酸序列或與其具有至少75%序列同一性之同源序列,及
該CDR3包含TX2
YYTHRGX3
FDY (SEQ ID NO:34)之胺基酸序列或與其具有至少75%序列同一性之同源序列,
其中X1
為K、Y、M、D或R,X2
為H或W,以及X3
為S或P。
在某些實施例中,本申請提供一種分離的抗體多肽,其包含特異性地與LAG-3結合之重鏈可變域,其中該重鏈可變域包含:包含SEQ ID NO: 1序列之CDR1,包含選自SEQ ID NO: 2、4、8、9及10序列之CDR2,及包含選自SEQ ID NO: 3、5、6及7序列之CDR3。
在某些實施例中,本申請提供一種分離的抗體多肽,其包含特異性地與LAG-3結合之重鏈可變域,其中該重鏈可變域包含:1、2或3個選自下組之重鏈CDR序列:SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽包含:a)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2及SEQ ID NO: 3之CDR序列;b)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 5之CDR序列;c)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 6之CDR序列;d)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 7之CDR序列;e)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 8及SEQ ID NO: 7之CDR序列;f)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 5之CDR序列;g)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 6之CDR序列;h)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 7之CDR序列;i)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 5之CDR序列;或j)重鏈可變區,該重鏈可變區包含1、2或3個選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 4及SEQ ID NO: 3之CDR序列。
在某些實施例中,該重鏈可變域包含選自下組之序列:SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21 、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29及SEQ ID NO: 31,以及與其具有至少80%序列同一性但仍保持與LAG-3之特異性結合親和力之同源序列。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽進一步包含一或多個胺基酸殘基替代或修飾,但仍保持與LAG-3之特異性結合親和力。在某些實施例中,至少一個該替代或修飾在一或多個該CDR序列中,及/或在一或多個該重鏈可變區序列中而不在任何該CDR序列中。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽為單域抗體或重鏈抗體。
在某些實施例中,該抗體多肽之重鏈可變域來源於VHH結構域。
在某些實施例中,該抗體多肽進一步包含免疫球蛋白恆定區,視情況包含人免疫球蛋白之恆定區,或視情況包含人IgG之Fc區(例如IgG4)。
在某些實施例中,該重鏈可變域為駱駝來源的或人源化的。
在某些實施例中,該抗體多肽為奈米抗體。
在某些實施例中,該抗體多肽能夠特異性地與人LAG-3、小鼠LAG-3及食蟹猴LAG-3結合。在某些實施例中,該抗體多肽能夠特異性地阻斷人LAG-3、小鼠LAG-3及食蟹猴LAG-3與其配位體在結合。
在某些實施例中,該抗體多肽能夠以不超過5×10-9
、2×10-10
、2.5×10-12
M之KD
值特異性地與在細胞表面上表現之人LAG-3結合,該KD
值係藉由表面電漿子共振(SPR)測定。
在某些實施例中,該抗體多肽能夠以不超過10-9
、5×10-10
、6×10-11
M之KD
值特異性地與在細胞表面上表現之人LAG-3結合,該KD
值係藉由流式細胞術測定。
在某些實施例中,該抗體多肽能夠特異性地與食蟹猴LAG-3及/或小鼠LAG-3結合。
在某些實施例中,該抗體多肽與一或多種綴合部分連接。在某些實施例中,該綴合部分包含清除調節劑、化療劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記、酶受質標記、DNA烷化劑、拓樸異構酶抑制劑、微管蛋白黏合劑或其他抗癌藥。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種抗體多肽或其抗原結合片段,其與本申請所述之抗體多肽競爭相同抗原決定基。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種醫藥組合物,其包含本申請所述之抗體多肽、本申請所述之抗體或其抗原結合片段,以及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種分離的多核苷酸,其編碼本申請所述之抗體多肽。在某些實施例中,該分離的多核苷酸包含選自下組之核苷酸序列:SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 30及SEQ ID NO: 32,及/或與其具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之同源序列,及/或其僅具有簡併替代之變體。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種載體,其包含本申請所述之分離的多核苷酸。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種宿主細胞,其包含本申請所述之載體。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種表現本申請所述之抗體多肽之方法,其包含在使本申請所述之載體表現之條件下培養本申請所述之宿主細胞。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種在個體中治療可受益於LAG-3活性調節之疾病或狀況之方法,其包含向該個體施用治療有效量的本申請所述之抗體多肽,或本申請所述之醫藥組合物。在某些實施例中,該疾病或狀況為與LAG-3相關之疾病或狀況。在某些實施例中,該疾病或狀況為癌症、自體免疫疾病或感染性疾病。
在某些實施例中,該癌症為膠質母細胞瘤、血液腫瘤、轉移性黑色素瘤、伯基特氏淋巴瘤(BL)、多發性骨髓瘤(MM)、B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、B細胞及T細胞急性淋巴細胞性白血病(ALL)、T細胞淋巴瘤(TCL)、多毛細胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、黑色素瘤、間皮瘤、威爾姆氏癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、骨癌、胰臟癌、肝細胞癌、皮膚癌、子宮內膜癌(endometrial cancer)、類癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌(carcinoma of the endometrium)、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金疾病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤(sarcoma of soft tissue)、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病,包括急性髓細胞白血病(AML)、慢性髓細胞白血病(CML)、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、兒童實體腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管再生、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、尤因氏肉瘤、軟骨肉瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原發性神經外胚層瘤、髓母細胞瘤、星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅細胞增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤(soft tissue sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘發之癌症、石棉誘發之癌症及轉移性癌症。
在某些實施例中,該感染性疾病為HIV、肝炎(A型、B型及C型)、人乳頭瘤病毒(HPV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、流感、疱疹、賈第鞭毛蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、黃病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、JC病毒、蟲媒病毒性腦炎病毒、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌及淋球菌、克雷伯菌、變形桿菌,沙雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病、萊姆病細菌、溶組織內阿米巴、結腸小袋蟲、福氏耐格里變形蟲、棘阿米巴、藍氏賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、卡氏肺孢子蟲、間日瘧原蟲、田鼠巴貝蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、弓形蟲及巴西日圓線蟲。
在某些實施例中,該自免疫疾病為阿茲海默氏病、過敏、哮喘、乳糜瀉、克羅恩氏病、格雷夫病、炎性腸病(IBD)、狼瘡、多發性硬化、重症肌無力、風濕性多肌痛、類風濕性關節炎、I類糖尿病及脈管炎。
在某些實施例中,該個體為人類。
在某些實施例中,該施用為經由口服、鼻內、靜脈內、皮下、舌下或肌內施用。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種在表現LAG-3之細胞中調節LAG-3活性之方法,其包含將該表現LAG-3之細胞暴露於本申請所述之抗體多肽。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種在樣品中偵測LAG-3之存在或含量之方法,其包含將該樣品與本申請所述之抗體多肽接觸,以及確定該樣品中LAG-3之存在或含量。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種在個體中診斷與LAG-3相關之疾病或狀況之方法,其包含:a)將獲取自該個體之樣品與本申請所述之抗體多肽接觸;b)確定在該樣品中LAG-3之存在或含量;及c)將該LAG-3之存在或含量與該與LAG-3相關之疾病或狀況在該個體中之存在或狀態相關聯。
在另一態樣中,本申請進一步提供本申請所述之抗體多肽在製備用於治療個體中與LAG-3相關之疾病或狀況之藥物中的用途。
在另一態樣中,本申請進一步提供本申請所述之抗體多肽在製備用於診斷LAG-3相關之疾病或狀況之診斷試劑中的用途。
在另一態樣中,本申請進一步提供一種套組,該套組包含本申請所述之抗體多肽或,其可用於偵測LAG-3。
優先權主張
本申請主張2018年3月20日申請之PCT申請案第PCT/CN2018/079682號及2018年7月5日申請之中國申請案第201810730302.2號之優先權。
本申請之以下描述僅為說明本申請之多個實施例。因此,此處討論之具體修改方式不應理解為對申請範圍之限制。熟習此項技術者在不偏離本申請範圍之情況下即可很容易地得出多種等同方式,變化及修改,應理解此類等同實施例包含在本發明範圍內。在本申請中引用之所有文獻,包含公佈出版物、專利及專利申請案均以全文引用之方式併入。
定義
本發明中之「抗體」一詞包含可結合某特定抗原之任意免疫球蛋白、單株抗體、多株抗體、多價抗體、雙價抗體、單價抗體或抗體。本發明中之「抗體」一詞旨在廣泛地涵蓋習知四鏈抗體以及不具有四條鏈之較不習知抗體(例如天然缺乏輕鏈之抗體)。
一種習知完整抗體為異四聚體,其包含兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈。哺乳動物之重鏈可分為α、δ、ε、γ及μ,每條重鏈由一可變區(VH
)及第一、第二、第三恆定區(分別為CH1
、CH2
、CH3
)組成;哺乳動物之輕鏈可分為λ或κ,每條輕鏈由一可變區(VL
)及一恆定區組成。習知抗體呈「Y」型,「Y」型結構之頸部由兩條重鏈之第二及第三恆定區組成,其藉由二硫鍵結合。「Y」型結構之每條臂包含其中一條重鏈之可變區及第一恆定區,其與一條輕鏈之可變區及恆定區結合。輕鏈及重鏈之可變區決定抗原之結合。每條鏈之可變區均含有三個高變區,稱互補決定區(CDR)(輕鏈之CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3,重鏈之CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本發明中揭示之抗體及抗原結合片段之CDR邊界可藉由Kabat,IMGT,Chothia或 Al-Lazikani命名法命名或識別。(Al-Lazikani, B.,Chothia, C.,Lesk, A. M.,J. Mol. Biol.,273(4), 927 (1997);Chothia, C.等,J Mol Biol. Dec 5;186(3):651-63 (1985);Chothia, C及Lesk, A.M.,J.Mol.Biol.,196,901 (1987);Chothia, C.等,Nature. Dec 21-28;342(6252):877-83 (1989);Kabat E.A.等,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service,National Institutes of Health,馬里蘭州Bethesda (1991);Marie-Paule Lefranc et al, Developmental and Comparative Immunology, 27: 55-77 (2003); Marie-Paule Lefranc et al, Immunome Research, 1(3), (2005); Marie-Paule Lefranc, Molecular Biology of B cells (second edition), chapter 26, 481-514, (2015))。其中,三個CDR由稱為框架區(FR)之側面連續部分間隔開,框架區比CDR更加高度保守且形成一個支架支撐超變環。重鏈及輕鏈之恆定區與抗原結合無關,但具有多種效應功能。抗體依據重鏈恆定區之胺基酸序列可分成幾類。根據是否含有α、δ、ε、γ及μ重鏈,抗體可分別分為五個主要分類或異構體:IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。幾個主要抗體分類亦可分為亞類,如IgG1 (γ1重鏈)、IgG2 (γ2重鏈)、IgG3 (γ3重鏈)、IgG4 (γ4重鏈)、IgA1 (α1重鏈)或IgA2 (α2重鏈)等。
與異四聚體之習知抗體不同,存在同源二聚體免疫球蛋白且天然缺乏輕鏈。此等抗體發現於,例如駝科(駱駝、單峰駝、美洲駝、羊駝等)中,亦稱為重鏈抗體,分子量約為80 kD(Hamers-Casterman C.等,1993, Nature, 363:446-448)。
本申請中之「抗體多肽」一詞係指包含抗體片段(如CDR及/或可變區序列)之多肽或抗原結合蛋白。抗體多肽可包含或可為例如重鏈抗體(VHH抗體)、重鏈抗體之可變域、VHH域或含有單個可變域之域抗體。抗體多肽可進一步包含另外的結構域,如恆定區、Fc結構域及/或與不同抗原或不同抗原決定基特異性結合之第二可變域。
「重鏈抗體」及「VHH抗體」在本申請中可互換使用,且均係指含有兩個VH
域而不含輕鏈之抗體(Riechmann L.及Muyldermans S.,J Immunol Methods. Dec 10;231(1-2):25-38 (1999);Muyldermans S., J Biotechnol. Jun;74(4):277-302 (2001);WO94/04678;WO94/25591;美國專利第6,005,079號)。雖然缺失輕鏈,但重鏈抗體有確證之抗原結合全部功能(Hamers-Casterman C.等,1993, Nature, 363:446-448;Nguyen VK.等, Immunogenetics. Apr; 54(1):39-47 (2002);Nguyen VK.等,Immunology. May;109(1):93-101 (2003))。
本申請所述之「VHH域」係指來源於重鏈抗體之重鏈可變域。VHH域為最小的已知獲得性免疫產生之抗原結合單位(Koch-Nolte F.等,FASEB J. Nov;21(13):3490-8. Epub 2007 Jun 15 (2007))。
「單域抗體」係指僅含有單個重鏈可變區或單個輕鏈可變區之抗體片段。在某些實施例中,該單域抗體具有或僅由重鏈抗體之單個重鏈可變域組成。
「奈米抗體」係指一種抗體片段,其由一個來自重鏈抗體之VHH域及兩個恆定區CH2及CH3組成。
在某些情況下,兩個或更多個VHH域由肽接頭共價結合以形成雙價域或多價域抗體。雙價域抗體之兩個VHH域可靶向作用於相同或不同抗原。
本申請中之術語「雙價」係指具有兩個抗原結合位點之抗體或抗體多肽;術語「單價」係指僅具有一個單一抗原結合位點之抗體或抗體多肽;而術語「多價」係指具有多個抗原結合位點之抗體或抗體多肽。在一些實施例中,該抗體或抗體多肽為雙價或多價的。
本申請中使用之術語「嵌合」係指具有來源於一種物種之序列之一部分,且該序列其餘部分來源於不同物種之抗體或抗體多肽。在一個例示性實例中,嵌合抗體可包含來源於人之恆定區及來源於非人動物例如駱駝之可變區。在一些實施例中,該非人動物為哺乳動物,例如駱駝、小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豚鼠或倉鼠。
本申請中使用之術語「人源化」係指包含來源於非人動物之CDR、來源於人之FR區,以及來源於人之恆定區(若適用)之抗體。
本申請中之「LAG-3」可來源於任何脊椎動物來源,包含哺乳物動,如靈長類(例如人、猴)及嚙齒類(例如小鼠及大鼠)。人LAG-3之例示性序列包含人LAG-3蛋白(部分的,Genbank寄存編號:GI: 4379038)。LAG-3之例示性序列包含Mus musculus(小鼠)LAG-3蛋白(Genbank寄存編號:GI: 111308743);Rattus norvegicus(大鼠)LAG-3 (Genbank寄存編號:GI: 37921547)。
本申請中之術語「LAG-3」旨在涵蓋任意形式之LAG-3,例如1)天然未經處理之LAG-3分子、「全長」LAG-3鏈或LAG-3天然存在之變體(包含例如剪接變體或等位基因變體);2) LAG-3由在細胞中之處理而產生之任何形式;或3)藉由重組方法產生之LAG-3亞單位之全長、片段(例如截短形式、胞外/跨膜域)或修飾形式(例如突變形式、糖基化/聚乙二醇化形式、組胺酸標籤/免疫螢光融合形式)。
術語「抗LAG-3」抗體多肽係指能夠特異性地結合LAG-3 (例如人或猴或小鼠或大鼠LAG-3)之抗體多肽。
本申請中之「特異性結合」或「特異性的結合」係指,指兩分子之間的非隨機結合反應,如抗體及抗原之間的反應。在某些實施例中,本申請之抗體多肽與人及/或猴LAG-3特異性結合,且其結合親和力(KD
)≤10-6
M(如:≤5×10-7
M、≤2×10-7
M、≤10-7
M、≤5×10-8
M、≤2×10-8
M、≤10-8
M、≤5×10-9
M、≤4×10-9
M、≤3×10-9
M、≤2×10-9
M或≤10-9
M)。本申請中之KD係指解離速度與結合速度之比值(koff/kon),其可藉由使用任何此項技術中常用之方法測定,包含但不限於表面電漿子共振法、微量熱流動法、HPLC-MS法及流式細胞術(如FACS)。在某些實施例中,KD
值可適當地藉由使用流式細胞術測定。
本申請中之「阻斷結合」或「競爭相同抗原決定基」之能力係指抗體多肽將兩個分子間結合(例如人LAG-3及抗LAG-3抗體)之相互作用抑制到任何可偵測程度之能力。在某些實施例中,阻斷兩個分子間結合之抗體多肽可將兩個分子間結合之相互作用抑制至少85%或至少90%。在某些實施例中,此類抑制作用可大於85%或大於90%。
本申請中使用之「抗原決定基」係指抗原分子中與抗體結合之彼部分胺基酸或原子基團。若兩種抗體表現出對抗原之競爭性結合,則可能結合抗原上之相同或密切相關的抗原決定基。例如,若抗體多肽阻斷參比抗體與抗原至少85%或至少90%或至少95%之結合,則該抗體多肽可被視為與該參比抗體結合相同或密切相關的抗原決定基。
熟習此項技術者將認識到,可藉由有限的實驗,確定給定抗體是否阻止本申請所述之抗體(例如駱駝單株抗體 W3396親本,以及人源化抗體WBP3396-P2R2(L)-1E1 W3396-Z4、W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、 W3396-R2-12、 W3396-R2-13及 W3396-R1-26H2)結合至LAG-3抗原多肽,從而確定給定抗體與本申請所述之抗體是否結合至相同抗原決定基。若本申請所述之抗體與LAG-3抗原多肽之結合下降,表示該給定抗體與本申請所述之抗體競爭,則此兩種抗體結合至相同或密切相關的抗原決定基。或者,若給定抗體與LAG-3抗原多肽之結合受本申請所述之抗體抑制,則此兩種抗體結合至相同或密切相關的抗原決定基。
在本申請中當「保守替代」用於胺基酸序列時,係指將一個胺基酸殘基用另一個具有相似理化性質之側鏈之胺基酸殘基替代。例如,可在疏水側鏈胺基酸殘基間(例如Met、Ala、Val、Leu及Ile)、中性親水側鏈殘基間(例如Cys、Ser、Thr、Asn及Gln)、酸性側鏈殘基間(例如Asp、Glu)、鹼性側鏈胺基酸間(例如His、Lys及Arg)或方向側鏈殘基間(例如Trp、Tyr及Phe)進行保守替代。此項技術中已知保守替代通常不會引起蛋白構象結構之顯著變化,因此能夠保留蛋白質之生物活性。
本申請所述之術語「同源」及「同源的」可互換使用,指當最佳比對時核酸序列(或其互補鏈)或胺基酸序列具有與另一條序列至少80%(如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之同一性。
當「百分比序列同一性」用於胺基酸序列(或核酸序列)時,係指將序列進行比對,且在必要時引入間隔,使相同胺基酸(或核酸)數目達到最多,此時在候選序列中,與參比序列相同之胺基酸(或核酸)殘基占該候選序列之胺基酸(或核酸)殘基之百分比。該胺基酸殘基之保守替代可視為或可不視為相同殘基。可藉由此項技術中揭示之工具,例如BLASTN, BLASTp(美國國家生物技術資訊中心網站(NCBI),亦可參見,Altschul S.F.等,J. Mol. Biol.,215:403-410 (1990);Stephen F.等,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402 (1997))、ClustalW2 (歐洲生物資訊研究所網站,可參見,Higgins D.G.等,Methods in Enzymology,266:383-402 (1996);Larkin M.A.等,Bioinformatics (Oxford、England),23(21): 2947-8 (2007))及ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟體,對序列進行比對以確定胺基酸(或核酸)序列之百分比序列同一性。熟習此項技術者可使用該工具之默認參數或根據比對需要適當調整參數,例如藉由挑選適合之算法。
本申請中使用之「效應功能」係指抗體之Fc區與其效應器例如C1複合物及Fc受體結合之生物活性。例示性效應功能包含抗體與C1複合物上之C1q相互作用誘導之補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體之Fc區與效應細胞上之Fc受體結合誘導之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)以及吞噬。
對某種狀況之「治療」或「療法」包含預防或減輕某種狀況,降低某種狀況興起或發展之速度,減少發展出某種狀況之風險,預防或延遲與某種狀況相關之症狀發展,減少或終止與某種狀況相關之症狀,產生某種狀況之完全或部分逆轉,治癒某種狀況,或以上之組合。
「經分離」之物質已經人工由自然狀態改變。若自然界中出現某種「經分離」之物質或成分,則其已經被改變或脫離其原始狀態,或二者均有發生。例如,某一活體動物體內天然存在之多核苷酸或多肽為未經分離的,但若此等多核苷酸或多肽與之在天然狀態下共存的物質足夠分離且以足夠純的狀態存在,則可視為「經分離」。「經分離之核酸序列」係指經分離之核酸分子之序列。在某些實施例中,「經分離之抗體多肽」係指純度為至少60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之抗體多肽,其由電泳方法(如SDS-PAGE、等電聚焦、毛細管電泳),或層析法(如離子交換層析或反相HPLC)確定。
本發明中「載體」係指,可將編碼某蛋白之多核苷酸操作性地插入其中且使該蛋白獲得表現之一種運載工具。載體可用於轉化、轉導或轉染宿主細胞,使其攜帶之遺傳物質元件在宿主細胞內得以表現。舉例而言,載體包括:質體、噬菌粒、柯斯質體、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1衍生之人工染色體(PAC)、噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體,以及動物病毒等。用作載體之動物病毒種類有逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。載體可含有多種控制表現之元件,包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外,載體亦可含有複製起始位點。載體亦可包括協助其進入細胞之成分,包括但不限於,病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼。載體可為表現載體或選殖載體。本申請提供之載體(例如表現載體)含有本申請所述之編碼抗體多肽之核酸序列、至少一個可操作地連接至該核酸序列之啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α),以及至少一個選擇標記。載體之實例包括但不限於逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌體及M13噬菌體、質體pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
本發明中「宿主細胞」係指導入外源多核苷酸及/或載體之細胞。
本發明中之「與LAG-3相關的」疾病或狀況係指任何由LAG-3增加或減少之表現或活動所引起、加劇的,或另外與其相關的疾病或症狀。在一些實施例中,LAG-3相關之狀況為免疫相關疾病,例如癌症、自體免疫疾病或感染性疾病。
本申請中使用之「癌症」係指以惡性細胞生長或腫瘤、異常增生、浸潤或轉移為特徵之任何醫學狀況,且包括實體腫瘤及例如白血病之非實體癌症(血液惡性腫瘤)。本申請中使用之「實體瘤」係指腫瘤及/或惡性細胞之實體團塊。癌症或腫瘤之實例包括血液科惡性疾病、口腔癌(例如唇、舌或咽的癌症)、消化器官癌(例如食道、胃、小腸、結腸、大腸或直腸)、腹膜癌、肝或膽道癌、胰臟癌、呼吸系統,如喉或肺(小細胞或非小細胞)癌、骨癌、結締組織癌、皮膚癌(例如黑色素瘤)、乳腺癌、生殖器官(輸卵管、子宮、子宮頸、睾丸、卵巢或前列腺)癌、尿道(例如膀胱或腎)癌、腦及內分泌腺(如甲狀腺)癌。在某些實施例中,癌症選自卵巢癌、乳腺癌、頭頸癌、腎癌、膀胱癌、肝細胞癌,以及結直腸癌。在某些實施例中,癌症選自淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、及B細胞淋巴瘤。
「藥用可接受之」係指所指載劑、溶媒、稀釋劑、輔料及/或鹽一般在化學上及/或在物理上與製劑中之其他配料相兼容,且在生理上與接受者相兼容。
抗 LAG-3 抗體多肽
在一個態樣中,本申請提供抗體多肽,其包含特異性地與LAG-3 (例如,人LAG-3)結合之重鏈可變域,其中該重鏈可變域包含CDR1、CDR2及CDR3,其中該CDR1包含GLTLSQYTMG (SEQ ID NO: 1),該CDR2包含AIHWTSSVTDYADSVX1
G(SEQ ID NO:33),及該CDR3包含TX2
YYTHRGX3
FDY(SEQ ID NO:34),其中X1
為K、Y、M、D或R,X2
為H或W,以及X3
為S或P。在某些實施例中,本申請進一步涵蓋對SEQ ID NO: 1、33及34中之任一者具有不超過1、2或3個胺基酸殘基取代之抗體多肽,其中X1
為K、Y、M、D或R,X2
為H或W,以及X3
為S或P。
在某些實施例中,本申請提供了抗LAG-3抗體多肽,其包含抗LAG-3VHH抗體W3396親本、W3396-Z4、W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13及W3396-R1-26H2之一或多個(例如1、2或3個)CDR序列。
本申請中之「W3396親本」係指具有包含SEQ ID NO: 11序列之重鏈可變區之VHH抗體。
「W3396-Z4」係指包含含有SEQ ID NO: 13序列之重鏈可變區之基於W3396之人源化VHH抗體。
「W3396-R2-1」係指包含含有SEQ ID NO: 15序列之重鏈可變區之基於 W3396-Z4之親和力成熟VHH抗體。
「W3396-R2-2」係指包含含有SEQ ID NO: 17序列之重鏈可變區之基於 W3396-Z4之親和力成熟VHH抗體。
「W3396-R2-3」係指包含含有SEQ ID NO: 19序列之重鏈可變區之基於 W3396-Z4之親和力成熟抗體。
「W3396-R2-6」係指包含含有SEQ ID NO: 21序列之重鏈可變區之基於 W3396-Z4之親和力成熟VHH抗體。
「W3396-R2-10」係指包含含有SEQ ID NO: 23序列之重鏈可變區之基於 W3396-Z4之親和力成熟VHH抗體。
「W3396-R2-11」係指包含含有SEQ ID NO: 25序列之重鏈可變區之基於W3396-Z4之親和力成熟VHH抗體。
「W3396-R2-12」係指包含含有SEQ ID NO: 27序列之重鏈可變區之基於 W3396-Z4之親和力成熟VHH抗體。
「W3396-R2-13」係指包含含有SEQ ID NO: 29序列之重鏈可變區之基於 W3396-Z4之親和力成熟VHH抗體。
「W3396-R1-26H2」係指包含含有SEQ ID NO: 31序列之重鏈可變區之基於W3396-Z4之人源化VHH抗體。
與其親本抗體W3396相比,人源化抗體W3396-Z4具有與其相當的與LAG-3之親和力。與人源化親本抗體W3396-Z4相比,親和力成熟抗體W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13及/或W3396-R1-26H2具有比其更好的與LAG-3之親和力。
表1示出了此11種抗LAG-3單域抗體之CDR序列。下文亦在表2及表3中提供重鏈可變區序列。表 1. CDR 胺基酸序列 表 2. 可變區胺基酸序列 表 3. 可變區核苷酸序列
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽為單域抗體。
在某些實施例,本申請所述之抗體多肽之重鏈可變域來源於VHH域。VHH域為來源於天然缺少輕鏈之抗體(例如來源於駝駝物種(參見例如WO9404678)(例如駱駝、美洲駝、單峰駝、羊駝及原駝之抗體)的重鏈可變域。VHH域為單一多肽,且為穩定的。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽之重鏈可變域為駱駝來源的。
已知CDR負責抗原結合,然而已發現6個CDR並非均為不可缺少或不可改變的。換言之,可替換或改變或修飾抗LAG-3單域抗體W3396親本、W3396-Z4、W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13或W3396-R1-26H2中之一或多個CDR,而基本上保持與LAG-3特異性結合之親和力。
在某些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽包含抗LAG-3單域抗體W3396親本、W3396-Z4、W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13或W3396-R1-26H2之重鏈CDR3序列。在某些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽包含選自下組之重鏈CDR3序列:SEQ ID NO: 3、5、6及7。重鏈CDR3區位於抗原結合位點之中心,且因此被認為與抗原接觸最多,且對抗體與抗原之親和力提供最多自由能。此外亦認為重鏈CDR3由於多種多樣化機制在長度、胺基酸組成及構象方面而為目前抗原結合位點最多樣化的CDR(Tonegawa S.,Nature. 302:575-81)。重鏈CDR3之多樣化足以產生多數抗體特異性(Xu JL, Davis MM. Immunity. 13:37-45)以及所需抗原結合親和性(Schier R等,J Mol Biol. 263:551-67)。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽包含適當框架區(FR)序列,只要所述之抗體多肽可特異性地結合至LAG-3即可。表1中所示之CDR序列獲取自駱駝抗體,但其可使用此項技術中公知之適合方法(如重組技術)移植至任何適合物種(如小鼠、人、大鼠、兔以及其他)之任何適合之FR序列。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽為人源化的。人源化抗體多肽理想地在人體具有降低之免疫原性。人源化抗體多肽在其可變區為嵌合的,因為非人CDR序列移植至人或基本上為人之FR序列中。抗體多肽之人源化基本上可藉由在人免疫球蛋白基因上將非人(如小鼠)CDR基因替換為對應的人CDR基因來完成(參見例如Jones等(1986) Nature 321:522-525;Riechmann等(1988) Nature 332:323-327;Verhoeyen等(1988) Science 239:1534-1536)。
可使用此項技術中公知之方法選擇適合之人重鏈可變域,以達到此目的。在一個例示性實例中,可使用最佳擬合之方法,其中對非人(例如駱駝)抗體可變域序列進行篩選,或者將其與已知人可變域序列之資料庫進行BLAST比對,且識別出最接近非人查詢序列之人序列,用作用於移植非人CDR序列之人框架(參見例如Sims等(1993) J. Immunol. 151:2296;Chothia等(1987) J. Mot. Biol. 196:901)。或者,可將源自所有人抗體之共有序列之框架用於移植非人CDR(參見例如Carter等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285;Presta等(1993) J. Immunol.,151:2623)。
在某些實施例中,本申請所述之人源化抗體多肽除了非人CDR序列以外,基本上全部由人序列組成。在一些實施例中,可變區FR及恆定區(若存在)全部或基本上來自人免疫球蛋白序列。人FR序列及人恆定區序列可源自不同人免疫球蛋白基因,例如,FR序列源自一個人抗體,恆定區來自另一個人抗體。在一些實施例中,人源化抗體多肽包含人FR1-4。
在某些實施例中,本申請所述之人源化抗體多肽包含W3396-Z4、W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13或W3396-R1-26H2之一或多個FR序列。
此10種例示性人源化抗LAG-3單域抗體W3396-Z4、W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13或W3396-R1-26H2全部保留了與LAG-3特異性結合之親和力,且在此方面至少與親本駱駝抗體相當,甚至優於親本駱駝抗體。
在一些實施例中,源自人之FR區可包含與其所源自之人免疫球蛋白相同之胺基酸序列。在一些實施例中,人FR之一或多個胺基酸殘基由來自親本非人抗體之對應殘基取代。在某些實施例中此為所需的,以使人源化抗體多肽密切接近於非人親本抗體結構。在某些實施例中,本申請所述之人源化抗體多肽包含在各個人FR序列中不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代,或者在重或輕鏈可變域之所有FR不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基取代。在一些實施例中,此胺基酸殘基變化可能僅存在於重鏈FR區、僅存在於輕鏈FR區,或在兩條鏈上均存在。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽包含選自下組之重鏈可變域序列:SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 31。
在一些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽包含重鏈可變域之全部或部分。在一個實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽為由本申請所述之重鏈可變域之全部或部分組成之單域抗體。此單域抗體之更多資訊可在先前技術中得到(參見例如美國專利第6,248,516號)。
在某些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽進一步包含免疫球蛋白恆定區。在一些實施例中,免疫球蛋白恆定區包含重鏈。重鏈恆定區包含CH1、鉸鏈及/或CH2-CH3區。在某些實施例中,重鏈恆定區包含Fc區。在某些實施例中,該重鏈恆定區包含或為CH2-CH3區。
在一些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽具有免疫球蛋白(Ig),較佳人Ig,較佳人IgG之恆定區。在某些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽包括IgG1同型之恆定區,其可能導致ADCC或CDC,或者IgG4或IgG2同型之恆定區,其具有減少或消除之效應功能。效應功能(如ADCC及CDC)可對表現LAG-3之細胞產生細胞毒性。可使用各種測定來評估效應功能,如Fc受體結合測定、C1q結合測定及細胞裂解測定。
本申請所述之抗體多肽之結合親和力可由KD
值表示,其表示當抗原及抗原結合分子之間的結合達到平衡時解離速率與結合速率之比值(koff
/kon
)。使用此項技術中公知之適合方法,包括例如流式細胞術測定,可恰當地確定抗原結合親和力(例如KD
)。在一些實施例中,可藉由流式細胞術確定不同濃度下抗體多肽與抗原之結合,可首先將確定的平均螢光強度(MFI)對抗體濃度製圖,此時藉由使用Prism第5版(GraphPad Software,聖地亞哥,CA),將特異性結合螢光強度(Y)與抗體濃度(X)之相關性擬合至一個位點之飽和公式:Y=Bmax
*X/(KD
+ X),可計算出KD
值,其中Bmax
係指待測抗體多肽與抗原之最大特異性結合。
在一些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽能夠以不超過5×10-9
M、不超過4×10-9
M、不超過3×10-9
M、不超過2×10-9
M、不超過10-9
M、不超過5×10-10
M、不超過4×10-10
M、不超過3×10-10
M、不超過2×10-10
M、不超過10-10
M、不超過5×10-11
M、不超過4×10-11
M、不超過3×10-11
M、不超過2.5×10-11
M、不超過2×10-11
M、不超過10-11
M、不超過5×10-12
M、不超過4×10-12
M、不超過3×10-12
M、不超過2.5×10-12
M、不超過2×10-12
M、不超過10-12
M之結合親和力(KD
)特異性地與人LAG-3結合,該KD
值藉由表面電漿子共振(SPR)或藉由流式細胞術測定。
在某些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽與食蟹猴LAG-3及小鼠LAG-3交叉反應。在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽以與人LAG-3相似之結合親和力與食蟹猴或小鼠LAG-3 結合。
在一些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽能夠以不超過5×10-9
M、不超過4×10-9
M、不超過3×10-9
M、不超過2×10-9
M、不超過10-9
M、不超過5×10-10
M、不超過4×10-10
M、不超過3×10-10
M、不超過2×10-10
M、不超過10-10
M、不超過5×10-11
M、不超過4×10-11
M、不超過3×10-11
M、不超過2.5×10-11
M、不超過2×10-11
M、不超過10-11
M、不超過5×10-12
M、不超過4×10-12
M、不超過3×10-12
M、不超過2.5×10-12
M、不超過2×10-12
M、不超過10-12
M之結合親和力(KD
)特異性地與食蟹猴LAG-3結合,該KD
值藉由表面電漿子共振(SPR)或藉由流式細胞術測定。
在一些實施例中,本申請所述之抗LAG-3抗體多肽能夠以不超過5×10-9
M、不超過4×10-9
M、不超過3×10-9
M、不超過2×10-9
M、不超過10-9
M、不超過5×10-10
M、不超過4×10-10
M、不超過3×10-10
M、不超過2×10-10
M、不超過10-10
M、不超過5×10-11
M、不超過4×10-11
M、不超過3×10-11
M、不超過2.5×10-11
M、不超過2×10-11
M、不超過10-11
M、不超過5×10-12
M、不超過4×10-12
M、不超過3×10-12
M、不超過2.5×10-12
M、不超過2×10-12
M、不超過10-12
M、不超過5×10-13
M、不超過4×10-13
M、不超過3×10-13
M、不超過2.5×10-13
M、不超過2×10-13
M、或不超過10-13
M之結合親和力(KD
)特異性地與小鼠LAG-3結合,該KD
值藉由表面電漿子共振(SPR)或藉由流式細胞術測定。
抗體多肽與人LAG-3之結合亦可用「半最大效應濃度」(EC50
)值表示,其係指觀察到其最大效應(例如結合或抑制等)之50%時抗體之濃度。EC50
值可藉由此項技術中公知之方法測得,例如夾心法(如ELISA、Western印記)、流式細胞術,以及其他結合試驗。在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽以不超過0.1 n M、不超過0.2 n M、不超過0.25 n M、不超過0.3 n M、不超過0.4 n M、不超過0.5 n M、不超過1 n M、不超過1.5n M、不超過3n M、不超過5n M、不超過10或不超過20 n M之EC50
值特異性地與人LAG-3結合,該EC50
值藉由流式細胞術測定。
在某些實施例中,抗體多肽以與人LAG-3相似之結合親和力與食蟹猴或小鼠LAG-3結合。例如,例示性單域抗體W3396-Z4、W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13或W3396-R1-26H2以與人LAG-3結合之結合親和力或EC50
值與食蟹猴或小鼠LAG-3結合。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽以不超過0.1 nM、不超過0.2 nM、不超過0.3 nM、不超過0.5 nM、不超過1 nM、不超過1.5 nM、不超過2 nM、不超過2.5 nM、不超過3 nM、不超過3.5 nM、不超過4 nM或不超過4.5 nM之EC50
值特異性地與重組食蟹猴LAG-3結合,該EC50
值藉由流式細胞術測定。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽以不超過0.01 nM、不超過0.05 nM、不超過0.1 nM、不超過0.15 nM、不超過0.2 nM、不超過0.3 nM、不超過0.4 nM、不超過0.5 nM、不超過0.6 nM、不超過0.7 nM、不超過0.8 nM、不超過0.9 nM或不超過1nM之EC50
值特異性地與重組小鼠LAG-3結合,該EC50
值藉由流式細胞術測定。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽具有足以用於診斷及/或治療用途的與人LAG-3特異結合之親和力。
在某些實施例中,本申請該抗體多肽阻斷人LAG-3與其配位體結合且從而恢復效應細胞之活性、減少Treg之抑制活性,及/或增強抗腫瘤活性。LAG-3之配位體包括例如MHC-II、LSECtin及半乳糖凝集素-3。LSECtin為II型跨膜蛋白,具有C末端C型碳水化合物識別結構域(CRD),其藉由中間的頸結構域自細胞膜表面投射。其受體似乎為二硫鍵連接之二聚體,且作為C型凝集素家族之其他成員之模型,該C型凝集素家族之其他成員在竇內皮細胞上表現,且促進病毒感染,但缺乏內吞作用。半乳糖凝集素-3為人體中由LGALS3基因編碼之蛋白。半乳糖凝集素-3為凝集素家族之成員,在凝集素家族中確認了14種哺乳動物半乳糖凝集素。半乳糖凝集素-3(Gal-3)亦為β半乳糖苷結合蛋白家族之成員,其在細胞黏附、細胞活化及化學性誘導、細胞生長及分化、細胞週期,以及細胞凋亡中有著重要作用。鑒於半乳糖凝集素-3之廣泛生物功能,證明了半乳糖凝集素-3參與癌症、炎症及纖維化、心臟疾病以及中風。研究亦顯示,與心力衰竭相關之多種過程(包括肌纖維母細胞增生、纖維發生、組織修復、炎症,以及心室重構)涉及半乳糖凝集素-3之表現。對LAG-3與MHC-II、LSECtin及半乳糖凝集素-3之結合的阻斷可使用此項技術中已知之方法(例如藉由ELISA)測定。
本申請所述之抗體多肽可為單株抗體多肽、人源化抗體多肽、嵌合抗體多肽、重組抗體多肽、標記抗體多肽、二價抗體多肽或抗獨特型抗體多肽。重組抗體多肽為在活體外使用重組方法製備而非在動物體內製備之抗體多肽。
抗體變體
本申請所述之抗體多肽亦涵蓋其多種變體。在某些實施例中,該抗體多肽涵蓋本申請所述之例示性抗體(即W3396親本、W3396-Z4、W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13或W3396-R1-26H2)之多種變體。
在某些實施例中,抗體多肽變體在表1所示之一或多個CDR序列中、一或多個表2所示之可變區序列中(但不在任何該CDR序列中),及/或恆定區(例如Fc區)中包含一或多個修飾或取代。此等變體保持其親本與LAG-3特異結合之親和力,但具有一或多種該修飾或取代帶來的所需特性。例如抗體多肽變體可具有改進之抗原結合親和力、改進之生產力、改進之穩定性、改進之糖基化模式、減少之糖基化風險、減少之脫胺基作用、減少或消除之效應功能、改進之FcRn受體結合、提高之藥代動力學半衰期、pH敏感性,及/或對綴合之兼容性(例如一或多個引入之半胱胺酸殘基)。
可使用此項技術中公知之方法,例如「丙胺酸掃描誘變」,篩選親本抗體序列以識別適合或較佳之待修飾或取代之殘基(參見例如Cunningham及Wells,(1989) Science,244:1081-1085)。簡言之,可識別靶殘基(例如帶正電殘基,如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且由不帶電或帶負電之胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)取代,產生經修飾之抗體多肽,且針對目標特性對其進行篩選。若在一個特定胺基酸位置上之取代表現出目標功能性改變,則該位置可被識別為潛在的用於修飾或取代之殘基。可藉由用另一殘基(例如半胱胺酸殘基、帶正電殘基等)取代來進一步評估該潛在殘基。
親和力變體
親和力變體可含有在如表1所示之一或多個CDR序列中、一或多個FR序列中,或者表2所示之重鏈可變區序列中之修飾或取代。此項技術中公知,在可變區中CDR區側接兩個FR區,因此熟習此項技術者基於表1中之CDR序列及表2中之可變區序列,可容易地識別出FR序列。該親和力變體保持親本抗體之與LAG-3特異性結合之親和力,或者甚至相對於親本抗體具有改進的與LAG-3特異性結合之親和力。在某些實施例中,CDR序列、FR序列或可變區序列中之至少一者(或全部)取代包含保守取代。
熟習此項技術者將理解,在表1及表2所示之CDR序列及可變區序列中,一或多個胺基酸殘基可經取代,而所得抗體多肽仍保持與LAG-3結合之親和力,或甚至具有改進之結合親和力。可使用此項技術中公知之各種方法來達到此目的。例如,可生成抗體變體庫(如Fab或scFv變體),且用噬菌體展示技術表現,隨後針對與人LAG-3結合之親和力對其進行篩選。又例如,可使用電腦軟體虛擬抗體與人LAG-3之結合,且識別抗體上形成結合界面之胺基酸殘基。在取代中可避開此等殘基以防止結合親和力降低,或者可作為取代靶標以獲得更強結合。
在某些實施例中,本申請所述之人源化抗體多肽在一或多個CDR序列及/或一或多個FR序列中包含一或多個胺基酸殘基取代。在某些實施例中,親和力變體在CDR序列及/或FR序列中包含總共不超過10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代。
在某些實施例中,該抗LAG-3抗體多肽包含1、2或3個與表1中列出之序列具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性之CDR序列,而同時保持相對於其親本抗體水平相似或更高的與LAG-3結合之親和力。
在某些實施例中,該抗LAG-3抗體多肽包含一或多個與表2中列出之序列具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)之序列同一性之可變區序列,而同時保持相對於其親本抗體水平相似或更高的與LAG-3結合之親和力。在一些實施例中,在選自表2之可變區序列中,總共1至10個胺基酸經取代、插入或缺失。在一些實施例中,該取代、插入或缺失發生在CDR之外的區(例如在FR)。
糖基化變體
本申請所述之抗LAG-3抗體多肽亦包含糖基化變體。可獲取該糖基化變體以提高或降低抗體多肽糖基化之程度。
該抗體多肽可包含一或多個帶有側鏈之胺基酸殘基,碳水化合物部分(例如寡糖結構)可附接至該側鏈。抗體之糖基化通常為N連接的或O連接的。N連接的係指碳水化合物部分附接至天冬胺酸殘基之側鏈,例如,三肽序列中之天冬胺酸殘基,如天冬胺酸-X-絲胺酸及天冬胺酸-X-蘇胺酸,其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸。O連接的糖基化係指N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖之一的糖附接至羥基胺基酸,最常見的為附接至絲胺酸或蘇胺酸。天然糖基化位點之移除可方便地完成,例如藉由改變胺基酸序列,使得存在於該序列中之上述三肽序列(對於N連接的糖基化位點)或絲胺酸或蘇胺酸殘基(對於O連接的糖基化位點)中之一者經取代。以類似方式,可藉由引入此類三肽序列或絲胺酸或蘇胺酸殘基,產生新糖基化位點。
半胱胺酸工程化變體
本申請所述之抗LAG-3抗體多肽亦涵蓋半胱胺酸工程化變體,其包含一或多個引入之游離半胱胺酸胺基酸殘基。
游離半胱胺酸殘基係不作為二硫鍵之一部分的半胱胺酸殘基。半胱胺酸工程化變體可用於藉由例如順丁烯二醯亞胺或鹵乙醯基,在工程化半胱胺酸之位點與例如細胞毒性及/或成像化合物、標籤或放射性同位素,以及其他物質綴合。用於工程化抗體多肽以引入游離半胱胺酸殘基之方法為此項技術中公知的,參見例如WO2006/034488。
Fc 變體
本申請所述之抗LAG-3抗體多肽亦包括Fc變體,其包含一或多個在其Fc區及/或鉸鏈區之胺基酸殘基修飾或取代。
在某些實施例中,該抗LAG-3抗體多肽包含一或多個胺基酸取代,該胺基酸取代改進與新生兒Fc受體(FcRn)之pH依賴性結合。此變體在酸性pH下與FcRn結合,使其得以免於在溶酶體中之降解,且隨後被轉移且釋放至細胞外,因此,此變體可具有更長藥代動力學半衰期。工程化抗體多肽以提高與FcRn之結合親和力之方法為此項技術中公知的,參見例如Vaughn, D.等,Structure,6(1): 63-73,1998;Kontermann, R.等,Antibody Engineering,第1卷第27章:Engineering of the Fc region for improved PK,Springer出版,2010;Yeung, Y.等,Cancer Research,70: 3269-3277 (2010);及Hinton, P.等,J. Immunology,176:346-356 (2006)。
在某些實施例中,該抗LAG-3抗體多肽包含一或多個改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之胺基酸取代。在Fc區之CH2域之某些胺基酸殘基可經取代以提高ADCC活性。可替代地或額外地,可改變該抗體上之碳水化合物結構,以提高ADCC活性。藉由抗體工程化改變ADCC活性之方法已記述於先前技術中,參見例如Shields RL等,J Biol Chem. 2001. 276(9): 6591-604;Idusogie EE等,J Immunol. 2000.164(8):4178-84;Steurer W.等,J Immunol. 1995,155(3): 1165- 74;Idusogie EE.等,J Immunol. 2001,166(4): 2571-5;Lazar GA.等,PNAS,2006,103(11): 4005-4010;Ryan MC.等,Mol. Cancer Ther.,2007,6: 3009-3018;Richards JO.等,Mol Cancer Ther. 2008,7(8): 2517-27;Shields R. L.等,J. Biol. Chem,2002,277: 26733-26740;Shinkawa T.等,J. Biol. Chem,2003,278: 3466-3473。在某些實施例中,該抗LAG-3抗體多肽包含人IgG4恆定區,其中改變第228個胺基酸殘基,例如Ser228Pro(S228P其可能阻止或減少鏈交換),及/或改變第235個胺基酸殘基,例如Leu235Glu(L235E,其可能改變Fc受體相互作用)。
在某些實施例中,該抗LAG-3抗體或抗原結合片段包含一或多個改變補體依賴性細胞毒性(CDC)之胺基酸取代,例如藉由增強或減弱C1q結合及/或CDC(關於其他Fc區變體之實例,參見例如WO99/51642;Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988);美國專利第5,648,260號;美國專利第5,624,821號;以及WO94/29351)。
在某些實施例中,該抗LAG-3抗體多肽包含一或多個位於Fc區界面之胺基酸取代,以便於及/或促進異二聚體化。此等修飾包含在第一Fc多肽中引入突起,以及第二Fc多肽中引入空洞,其中該突起可位於該空洞內,以促進該第一及第二Fc多肽之相互作用,以形成異二聚體或複合體。生成具有此等修飾之抗體之方法為此項技術中公知的,例如,如美國專利第5,731,168號所述。
可使用多種技術用於VHH或單域抗體之生產。例如,可使用此項技術中已知之方法獲得VHH,如藉由免疫駱駝且由此獲得雜交瘤,或者藉由使用此項技術中已知之分子生物學技術選殖單域抗體之文庫,且隨後使用噬菌體展示進行篩選。
在本發明所揭示之另一態樣中,本申請所述之抗體多肽可包含相互連接之兩個或更多個單域抗體。該單域抗體可在序列上相同,且針對同一靶標或抗原。取決於相互連接之VHH之數量,抗體多肽可為二價(2 VHH)、三價(3 VHH)、四價(4 VHH)或具有更高價之分子。
綴合物
在某些實施例中,該抗LAG-3抗體多肽進一步包含綴合物部分。該綴合物部分可連接至該抗體多肽。綴合物部分為可附接至該抗體多肽之非蛋白質部分。可設想,本發明中之抗體多肽可與多種綴合物部分連接(見例如「Conjugate Vaccines」,Contributions to Microbiology and Immunology,J. M. Cruse及R. E. Lewis, Jr.(編),Carger Press,紐約(1989))。此等綴合物部分可藉由共價結合、親和結合、嵌入、協同結合(coordinate binding)、絡合、結合、混合或加入等其他方式與該抗體多肽。
在某些實施例中,本發明揭示之抗體多肽可經工程化以在抗原決定基結合部分之外含有特定位點,該特定位點可用於與一或多個綴合物部分結合。例如,該位點可包含一或多個反應性胺基酸殘基(例如半胱胺酸或組胺酸殘基),以便於與綴合物部分共價連接。
在某些實施例中,抗體可間接連於綴合物部分,或經由另一綴合物部分相連。例如,該抗體多肽可結合生物素,然後間接結合第二個綴合物,其與親和素相連。該綴合物可為清除調節劑、毒素(例如化療劑)、可偵測標記(例如放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記或酶受質標記)或純化部分。
「毒素」可為對細胞有害或可能損壞或殺死細胞之任何試劑。毒素之示例包括但不限於,紫杉醇、細胞鬆弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根鹼、絲裂黴素、依託泊苷、替尼泊苷、長春新鹼、長春鹼、秋水仙鹼、阿黴素、柔紅黴素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神黴素、放線菌素D、1-去氫睾酮、糖皮質激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、嘌呤黴素及其類似物、抗代謝物(例如,甲胺蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶達卡巴)、烷化劑(例如氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲黴素、絲裂黴素C及順-二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環類抗生素(例如柔紅黴素(以前的道諾黴素)及阿黴素)、抗生素(例如更生黴素(以前稱為放線菌素)、博來黴素、光神黴素及氨茴黴素(AMC))、抗有絲分裂劑(例如長春新鹼及長春鹼)、拓樸異構酶抑制劑,以及微管蛋白黏合劑。
可偵測標記之示例可包括螢光標記(例如螢光素、羅丹明、丹醯、藻紅蛋白或德克薩斯紅)、酶-受質標記物(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶、葡糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如、123
I、124
I、125
I、131
I、35
S、3
H、111
In、112
In、14
C、64
Cu、67
Cu、86
Y、88
Y、90
Y、177
Lu、211
At、186
Re、188
Re、153
Sm、212
Bi、及32
P、其他鑭系元素)、發光標記、發色基團、地高辛、生物素/親和素、用於偵測之DNA分子或金。
在某些實施例中,該綴合部分可為幫助增加抗體半衰期之清除調節劑。說明性示例包括水溶性聚合物,如PEG、羧甲基纖維素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、乙二醇/丙二醇共聚物等等。聚合物可為任意分子量的,且可為支鏈的或非支鏈的。附接至抗體之聚合物之數量可不同,且若附接多於一種聚合物,則其可為相同或不同分子。
在某些實施例中,該綴合部分可為純化部分,如磁珠。
在某些實施例中,本申請所述之抗體多肽用作綴合物之基底。
多核苷酸及重組方法
本申請提供編碼抗LAG-3抗體多肽之分離的多核苷酸。
本申請中之術語「核酸」或「多核苷酸」係指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA),及其單鏈或雙鏈形式之聚合物。除非明確限定,否則此術語包括含有已知的天然核苷酸類似物之多核苷酸,該類似物具有與參照核酸相似之結合特性且以與天然存在之核苷酸相似之方式代謝。除非另有明示,特定多核苷酸序列亦隱含地包括其保守修飾之變體(例如簡併密碼子取代)、等位基因、直系同源體、SNP及互補序列,以及明確標示之序列。特別地,藉由生成一或多個選定(或全部)密碼子之第三位置用混合鹼基及/或脫氧肌苷殘基取代之序列,可獲取簡併密碼子取代(參見Batzer等,Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991);Ohtsuka等,J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);以及Rossolini等,Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
在某些實施例中,該分離的多核苷酸包含一或多個如SEQ ID NO: 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30及/或32所示之核酸序列,及/或與之具有至少80%(例如至少85%、88%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)序列同一性之同源序列,及/或僅具有簡併替代之變體,且編碼如本申請所述之例示性抗體。編碼該單株抗體之DNA可藉由習知方法分離及測序(例如可使用寡核苷酸探針,該探針可特異性與編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因結合)。該編碼DNA亦可藉由合成方法獲得。
使用此項技術中公知之重組技術,可將包含編碼該抗-LAG-3抗體多肽之多核苷酸(例如包含表3所示之序列)引入載體用於選殖(擴增DNA)或基因表現。多種載體可供選擇。載體組分通常包括但不限於以下中之一或多者:信號序列、複製起始點、一或多種標記基因、增強序列、啟動子(例如:SV40、CMV、EF-1α)及轉錄終止序列。
本申請提供之載體(例如表現載體)含有本申請所述之編碼該抗體多肽之核酸序列、至少一個可操作地連接至該核酸序列之啟動子(例如SV40、CMV、EF-1α),以及至少一個選擇標記。載體之實例包括但不限於逆轉錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒(例如單純疱疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌體及M13噬菌體、質體pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
可將包含編碼該抗體多肽之多核苷酸之載體引入宿主細胞用於選殖或基因表現。本發明中適用於選殖或表現該載體中之DNA之宿主細胞為原核細胞、酵母或上述高級真核細胞。適用於本發明用途之原核細胞包含真細菌如,革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽性菌,例如,腸桿菌科,如,大腸桿菌,腸桿菌屬,歐文氏菌屬,克雷白氏桿菌屬,變形桿菌屬,沙門氏菌屬,如,鼠傷寒沙門(氏)桿菌,沙雷氏菌屬,如,黏質沙雷氏菌,以及志賀氏菌屬,及桿菌屬如,枯草芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌,假單胞菌如,綠膿桿菌及鏈黴菌。
除了原核細胞以外,真核微生物如絲狀真菌或酵母亦可作表現抗LAG-3抗體多肽之選殖或表現宿主細胞。釀酒酵母,或麵包酵母為最常用的低等真核宿主微生物。但是,許多其他屬、種及株均比較常用且在本發明中適用,如粟酒裂殖酵母;克魯維酵母屬宿主如,乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母(ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母(ATCC 16,045)、魏氏克魯維酵母(ATCC 24,178)、克魯雄酵母(ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母及馬克斯克魯維酵母;解脂耶氏酵母(EP 402,226);巴斯德畢赤酵母(EP 183,070);假絲酵母;里氏木黴(EP 244,234);鏈孢黴;西方許旺酵母,如:西方許旺酵母;及絲狀真菌,如:脈孢菌、青黴菌、彎頸黴及曲黴菌,如:鉤巢麯黴及黑麯黴。
本發明中提供之適用於表現糖基化抗體或其抗原結合片段之宿主細胞由多細胞生物衍生得到。無脊椎細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已發現多種桿狀病毒株(baculoviral strains)及其變體以及對應的許可性昆蟲宿主細胞(permissive insect host cells),來自於諸如以下之宿主:草地夜蛾(毛蟲)、埃及斑蚊(蚊子)、白紋伊蚊(蚊子)、黑腹果蠅(果蠅)及家蠶。多種用於轉染之病毒株為公眾可得,例如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒及家蠶核型多角體病毒之Bm-5變種,此等病毒均可在本發明中使用,特別是用於轉染草地夜蛾細胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牽牛花、番茄及菸草之植物細胞培養亦可用作宿主。
但是,最感興趣的為脊椎細胞,且脊椎細胞之培養(組織培養)已成為習知操作。可用之哺乳動物宿主細胞實例有,SV40轉化之猴腎細胞CV1系(COS-7, ATCC CRL 1651);人胚胎腎細胞株(293或懸浮培養之293細胞次純系,Graham等,J. Gen Virol. 36:59 (1977));幼地鼠腎細胞(BHK,ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR (CHO,Urlaub等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980));小鼠睾丸支持細胞(TM4,Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人子宮頸癌細胞(HELA,ATCC CCL 2);犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34);布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442);人肺細胞(W138,ATCC CCL 75);人肝細胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等,Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982));MRC 5細胞;FS4細胞;及人肝癌細胞株(Hep G2)。在某些較佳實施例中,該宿主細胞為293F細胞。
用上述可產生抗LAG-3抗體多肽之表現或選殖載體轉化宿主細胞,且將其在習知營養培養基中培養,該營養培養基經修飾後適宜於誘導啟動子、選擇轉化細胞或擴增編碼目的序列之基因。在另一實施例中,該抗體多肽可藉由此項技術中公知之同源重組方法製得。
本發明中用於產生該抗體多肽之宿主細胞可在多種培養基中培養。市售培養基如Ham's F10 (Sigma)、最低基本培液 (MEM, (Sigma))、RPMI-1640 (Sigma)及Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM),Sigma)可用於培養該宿主細胞。另外,任何在Ham等人,Meth. Enz. 58:44 (1979);Barnes等,Anal. Biochem. 102:255 (1980);美國專利第4,767,704號;第4,657,866號;第4,927,762號;第4,560,655號;或第5,122,469號;WO 90/03430;WO 87/00195;或美國專利申請Re. 30,985中說明之培養基均可用作該宿主細胞之培養基。此等培養基均可添加必要之激素及/或其他生長因子(如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽類(如氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂及磷酸鹽)、緩衝液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸及胸腺嘧啶)、抗生素(如慶大黴素)、微量元素(定義為終濃度通常在微莫耳範圍無機化合物),及葡萄糖或與其等同之能量源。該培養基亦可含有此項技術中公知之適當濃度之任何其他必要添加劑。該培養基之條件,如溫度、pH值等類似條件,為選擇用於表現之宿主細胞此前所使用之條件,為一般熟習此項技術者所熟知。
在使用重組技術時,該抗體多肽可在胞內、壁膜空間生成,或直接分泌至培養基中。若該抗體在胞內生成,則首先除去宿主細胞或裂解片斷之顆粒殘骸,例如,可藉由離心或超音波方法。Carter等,Bio/Technology 10:163-167 (1992)描述了將分泌至大腸桿菌壁膜空間之抗體分離之方法。簡言之,在醋酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯甲磺醯氟 (PMSF)存在之條件下化開細胞糊(cell paste)約30分鐘以上。離心除去細胞碎片。如該抗體分泌至培養基中,則通常首先使用市售蛋白濃度過濾器,如Amicon或Millipore Pellicon ultrafiltration unit,濃縮該表現系統之上清液。在任何前述步驟中均可加入蛋白酶抑制劑如PMSF以抑制蛋白降解,以及抗生素以防止偶然污染物之生長。
自該細胞中製得之抗LAG-3抗體多肽可採用純化方法進行純化,例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、DEAE-纖維素離子交換層析管柱、硫酸銨沈澱、鹽析以及親和層析,其中親合層析為較佳純化技術。
在某些實施例中,使用固定在固相上之蛋白A用於對該抗體多肽進行免疫親和純化。該抗體之種類以及該抗體中存在任何免疫球蛋白之Fc結構域決定了蛋白A作為親和配位體是否適合。蛋白A可用於純化基於人γ1,γ2或γ4重鏈之抗體(Lindmark等,J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。蛋白G適用於所有鼠源異構體及人γ3(Guss等,EMBO J. 5:1567 1575 (1986))。瓊脂糖為最常用的親和配位體附著基質,但亦可選用其他基質。機械力穩定之基質如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯)苯與用瓊脂糖相比可實現更快之流速及更短之處理時間。如該抗體含有CH3結構域,則可用Bakerbond ABXTM
樹脂進行純化(J. T. Baker,新澤西菲利普斯堡)。亦可根據需要獲得之抗體確定其他蛋白純化之技術,如離子交換管柱中之分餾、乙醇沈澱、反相HPLC、矽膠層析、基於陰離子或陽離子交換樹脂之肝素瓊脂糖凝膠層析(如聚天冬胺酸管柱)、層析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸銨沈澱。
在任意初步純化步驟之後,可用低pH疏水相互作用層析之方法處理含有感興趣的抗體及雜質之混合物,用pH約2.5-4.5之洗滌緩衝液,較佳在低鹽濃度下進行(例如,約0至0.25 M鹽濃度)。
醫藥組合物
本申請進一步提供了本申請所述之包含該抗-LAG-3抗體多肽之醫藥組合物及一或多種醫藥學上可接受之載劑。
用於本申請揭示之醫藥組合物中之藥用可接受載劑可包含例如藥用可接受液體、凝膠或固體載劑、水相介質、非水相介質、抗微生物物質、等滲物質、緩衝液、抗氧劑、麻醉劑、懸浮劑/分散劑、螯合劑、稀釋劑、佐劑、輔料或無毒輔助物質,其他此項技術中公知之組分或以上之多種組合。
適用之組分可包括,例如,抗氧劑、填充劑、黏合劑、崩解劑、緩衝液、防腐劑、潤滑劑、攪味劑、增稠劑、著色劑、乳化劑或穩定劑例如糖及環糊精。適用之抗氧劑可包括,例如,甲硫胺酸、抗壞血酸、EDTA、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱胺酸、巰基甘油、巰基乙酸、巰基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羥基甲苯及/或沒食子酸丙酯。如本發明所揭示,在一種含有本發明揭示之抗體多肽之組合物中包括一或多種抗氧劑如甲硫胺酸,可將降低該抗體多肽之氧化。對氧化作用之減少可防止或減少結合親和力之降低,從而提高抗體穩定性且延長保質期。因此,在某些實施例中,本發明提供之組合物中含有一或多種所述之抗體多肽以及一或多種抗氧劑例如甲硫胺酸。本發明進一步提供了多種方法,藉由將本發明中提供之抗體多肽與一或多種抗氧劑混合,例如甲硫胺酸,可防止該抗體多肽氧化、延長其保質期及/或提高其活性。
進一步地說,藥用可接受載劑可包含,例如,水相介質如氯化鈉注射液、林格氏液注射液、等滲葡萄糖注射液、無菌水注射液、或葡萄糖及乳酸林格注射液、非水介質例如:植物來源之不揮發性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、細菌抑制或真菌抑制濃度下之抗菌物質、等滲劑如:氯化鈉或葡萄糖、緩衝液如:磷酸鹽或枸櫞酸酸鹽緩衝液,抗氧化劑如:硫酸氫鈉,局部麻醉劑如:鹽酸普魯卡因,助懸劑及分散劑如:羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素或聚乙烯吡咯啶酮,乳化劑如:聚山梨醇酯80 (Tween-80)、螯合試劑如EDTA (乙二胺四乙酸) 或EGTA (乙二醇雙(2-胺基乙基醚)四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。作為載劑之抗菌劑可加入多次劑量容器中之醫藥組合物中,其包含酚類或甲酚、汞製劑、苯甲醇、氯代丁醇、甲基及丙基對羥基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷銨及氯苯乙銨。適用之輔料可包含,例如,水、鹽、葡萄糖、甘油或乙醇。適用之無毒輔助物質可包含,例如,乳化劑、pH值緩衝劑、穩定劑、增溶劑,或者醋酸鈉、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者環糊精之類的物質。
該醫藥組合物可為液體溶液、懸浮液、乳劑、丸劑、膠囊、片劑、持續釋放製劑或粉末。口服製劑可包含標準載體如藥物級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
在某些實施例中,該醫藥組合物被製劑成可注射組合物。可注射醫藥組合物可以任何習知形式製備,例如,液體溶劑、懸浮劑、乳化劑或適用於產生液體溶劑、懸浮劑或乳化劑之固體形式。注射製劑可包含現用之無菌及/或無熱原溶液、使用前現與溶劑結合之無菌乾燥可溶物,如凍乾粉,包含皮下片、注射即用之無菌懸浮劑、使用前現與介質結合之無菌乾燥不溶產品,及無菌及/或無熱原乳劑。溶劑可為水相或非水相。
在某些實施例中,單位劑量之注射製劑包裝在一個安瓿、一支管或一支帶有針之針筒中。此項技術中習知,所有注射給藥之製劑應為無菌無熱原。
在某些實施例中,藉由將本申請揭示之抗體多肽溶解於某適當溶劑中可製備無菌凍乾粉末。該溶劑可含有一種可提高粉或由粉末製得之重組溶液之穩定性,或改善粉末或重組溶液之其他藥理組分。適用之輔料包含但不限於水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他適用物質。溶劑可含有緩衝液,如枸櫞酸緩衝液、磷酸鈉或磷酸鉀緩衝液或其他熟習此項技術者公知之緩衝液,在一種實施例中,緩衝液之pH為中性。在此項技術中公知之標準條件下進行對該溶解進行隨後的過濾除菌,然後凍乾製得理想製劑。在一種實施例中,將所得溶劑分裝至小管中凍乾。每支小管可容納單次劑量或多次劑量之該抗LAG-3抗體多肽或其組合物。每支小管中之裝入量可略微高於每次劑量所需或多次劑量所需(例如10%過量),從而保證取樣精確及給藥精確。凍乾粉可在適當條件下儲存,如在約4℃至室溫範圍。
用注射用水將凍乾粉重溶得到用於注射給藥之製劑。在一種實施例中,可將凍乾粉加至無菌無熱原水或其他適用之液體載劑中重溶。精確量由選擇之療法決定,可根據經驗值決定。
使用方法
本申請亦提供了治療方法,包含將治療有效量的本申請所述之抗體多肽施用給有需要之個體,由此治療或預防與LAG-3相關之狀況或病症。在一些實施例中,該與LAG-3相關之狀況或病症為癌症、自體免疫疾病、或感染性疾病。
癌症之實例包含但不限於淋巴瘤、膀胱癌、骨癌、腦及中樞神經系統癌、乳腺癌、子宮或子宮內膜癌、直腸癌、食道癌、頭頸癌、肛門癌、胃腸道癌、上皮內腫瘤、腎癌、白血病、肝癌、肺癌(例如非小細胞肺癌及小細胞肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、胰臟癌、前列腺癌、肉瘤、皮膚癌、鱗狀細胞癌、胃癌、睾丸癌、外陰癌、內分泌系統癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、兒童實體腫瘤、腫瘤血管生成、脊柱軸腫瘤、垂體腺瘤或表皮樣癌。
自體免疫疾病之實例包含但不限於獲得性免疫缺陷症候群(AIDS,其為具有自體免疫成分之病毒疾病)、斑禿、強直性脊柱炎、抗磷脂症候群、自體免疫性阿狄森氏病、自體免疫性溶血性貧血、自體免疫性肝炎、自體免疫性內耳病(AIED)、自體免疫性淋巴細胞增生症候群(ALPS)、自體免疫性血小板減少性紫癜(ATP)、貝切特氏病、心肌病、乳糜瀉乳糜性皮炎;慢性疲勞免疫功能障礙症候群(CFIDS)、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病(CIPD)、瘢痕性類天疱瘡、冷凝集素病、CREST症候群、克羅恩氏病、德哥斯病、幼年皮肌炎、盤狀狼瘡、原發性混合冷球蛋白血症、纖維肌痛性纖維肌炎、Graves病、吉蘭-巴雷症候群、橋本氏甲狀腺炎、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜(ITP)、IgA腎病、胰島素依賴型糖尿病、幼年型慢性關節炎(斯蒂爾病)、幼年類風濕性關節炎、梅尼埃氏病、混合結締組織病、多發性硬化、重症肌無力、頑固性貧血、結節性多動脈炎、多軟骨炎、多腺體症候群、風濕性多肌痛、多發性肌炎及皮肌炎、原發性無丙種球蛋白血症、原發性膽汁性肝硬化、牛皮癬、牛皮癬關節炎、雷諾現象、萊特爾氏症候群、風濕熱、類風濕性關節炎、結節病、硬皮病(進行性系統性硬化症(PSS),亦稱為系統性硬化症(SS))、乾燥症候群、全身肌強直症候群、系統性紅斑狼瘡、高安動脈炎、顳動脈炎/巨細胞性動脈炎、潰瘍性結腸炎、葡萄膜炎、白癜風及韋格納肉芽腫病。
感染性疾病之示例包含但不限於真菌感染、寄生蟲/原生動物感染或慢性病毒感染,例如瘧疾、球孢子菌病、組織胞漿菌病、甲真菌病、麯黴病、芽生菌病、白色念珠菌病、副球孢子菌病、微孢子蟲病、棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔蟲病、巴貝斯蟲病、小袋蟲病、貝利斯蟲病、美洲錐蟲病、華支睾吸蟲病、錐蠅病、隱孢子蟲病、裂頭絛蟲病、龍線蟲病、棘球蚴病、象皮腫、蟯蟲病、片形吸蟲病、薑片吸蟲病、絲蟲病、賈第蟲病、頜口線蟲病、膜殼絛蟲病、等孢子球蟲病、釘螺熱、利什曼病、萊姆病、後殖吸蟲病、蠅蛆病、盤尾絲蟲病、虱病、疥瘡、血吸蟲病、昏睡病、圓線蟲病、絛蟲病、弓蛔蟲病、弓形蟲病、旋毛蟲病、鞭蟲病、錐蟲病、蠕蟲感染、乙型肝炎(HBV)、丙型肝炎(HCV)、疱疹病毒, EB病毒、HIV、巨細胞病毒、單純疱疹病毒I型、單純疱疹病毒II型、人乳頭瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒I、人類免疫缺陷病毒II、卡波西西肉瘤相關疱疹病毒流行病、薄環病毒(指環病毒)、人T淋巴營養性病毒I型、人T淋巴營養性病毒II型、水痘帶狀疱疹、JC病毒或BK病毒之感染。
本申請中提供之抗體多肽之治療有效劑量依賴於此項技術中公知之多種因素,例如體重、年齡、過往病史、現用治療、對象之健康狀況及交叉感染之潛力、過敏、超敏及副作用,以及給藥途徑及疾病發展程度。熟習此項技術者(例如醫生或獸醫)可根據此等或其他條件或要求按比例降低或升高劑量。
在某些實施例中,本發明提供之抗體多肽可在治療有效劑量約0.01 mg/kg至約100 mg/kg之間給藥。在某些實施例中,該抗體多肽以約50 mg/kg或更少之劑量給藥,在某些實施例中,給藥劑量為10 mg/kg或更少、5 mg/kg或更少、3 mg/kg或更少、1 mg/kg或更少、0.5 mg/kg或更少或0.1 mg/kg或更少。某特定劑量可在多個間隔給藥,例如每天一次、每天兩次或更多、每月兩次或更多、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次或每兩月或更多月一次。在某些實施例中,給藥劑量可隨治療進程變化。例如,在某些實施例中,初始給藥劑量可比後續給藥劑量高。在某些實施例中,給藥劑量在治療進程中根據給藥對象之反應進行調整。
給藥方案可藉由調整達到最優反應(如治療反應)。例如,可進行單劑量給藥或在一段時間分多個分隔之劑量給藥。
本發明中揭示之抗體多肽可藉由此項技術中公知之給藥方式給藥,例如注射給藥(如,皮下注射、腹腔注射、靜脈注射,包含靜脈滴注,肌肉注射或皮內注射)或非注射給藥(如,口服給藥、鼻腔給藥、舌下給藥、直腸給藥或局部給藥)。
在一些實施例中,本發明揭示之抗體多肽可單獨給藥或與一或多種其他治療手段或物質聯合給藥。例如,本發明揭示之抗體多肽可與另一種治療劑,例如化療劑或抗癌藥聯合施用。
在某些此類實施例中,本發明揭示之抗體多肽與一或多種上述治療物質聯用時,可與所述之一或多種治療物質同時給藥,在某些此類實施例中,所述之抗體多肽可作為同一種醫藥組合物之一部分同時給藥。但是,與其他治療物質「聯用」之抗體多肽不需要同時給藥或與該治療物質在同一組合物中給藥。本發明中「聯用」之含義亦包含在另一種治療物質之前或之後給藥之抗體多肽亦被視為與該治療物質「聯用」,即使該抗體多肽與第二種物質藉由不同給藥方式給藥。在可能的情況下,與本發明揭示之抗體多肽聯用之其他治療物質可參照該其他治療物質之產品說明書之方法用藥,或參照外科醫生之案頭參考書2003(Physicians' Desk Reference,57th Ed; Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 第57版 (2002年11月)),或參照其他此項技術中公知之方法。
本申請進一步提供了使用該抗LAG-3抗體多肽之方法。
在一些實施例中,本申請提供了偵測樣品中LAG-3之存在或含量之方法,其包含將該樣品與該抗體多肽接觸,以及確定樣品中LAG-3之存在或含量。
在一些實施例中,本申請提供了診斷在個體中與LAG-3相關之疾病或狀況之方法,其包含:a)將獲取自該個體之樣品與該抗體多肽接觸;b) 確定該樣品中LAG-3之存在或含量;及c)將該LAG-3之存在與該個體中之該與LAG-3相關之疾病或狀況相關聯。
在一些實施例中,本申請提供了套組,該套組包含本申請所述之抗體多肽,視情況與可偵測部分綴合。該套組可用於偵測LAG-3或診斷LAG-3相關之疾病。
在一些實施例中,本申請亦提供了本申請所述之抗體多肽在製備用於治療個體中與LAG-3相關之疾病或狀況之藥物中的用途,在製備用於診斷LAG-3相關之疾病或狀況之診斷試劑中的用途。
優勢 本申請所述之抗體多肽在多個態樣中優於現有療法。例如,與現有的LAG-3抗體相比,本申請所述之抗體多肽具有更好與人及猴LAG-3之結合親和力,更有效地阻斷LAG-3與細胞表面MHC-II之結合,更有效地阻斷LAG-3與LSECtin及半乳糖凝集素-3之結合、增強IL-2通路活性,且更有效地誘導產生IFNɣ。本申請所述之抗體多肽之優勢亦在於結合不同於對照抗體所結合之抗原決定基。本申請所述抗體多肽與小鼠LAG3結合,且親和力達到皮莫耳水平,有利於利用小鼠模型進行活體內功能學偵測。
以下實例旨在更好地說明本發明,且不應理解為限制本發明之範圍。所有下述之特定組合物、材料及方法,其整體或部分,均在本發明之範圍內。此等特定組合物、材料及方法不是為了限制本發明,而只是為了說明特定實施例在本發明之範圍內。熟習此項技術者可不添加創造性及不偏離本發明範圍而開發出等同的組合物、材料及方法。應理解,對本發明之方法作出之多種改動可仍包含在本發明範圍內。本發明人意欲將此類變動包含於本發明之範圍內。
實例1. 材料與方法1.1 免疫原產生
由Sangon Biotech合成編碼人LAG-3 ECD (Genbank:NP_002277.),食蟹猴(cyno) LAG-3 ECD(Genbank:XP_005570011.1)及小鼠LAG-3 ECD (Genbank:NP_032505)之核酸序列。將自合成核酸擴增之LAG-3基因片段分別插入至含有人Fc-,小鼠Fc-或組胺酸標籤之表現載體pcDNA3.3(ThermoFisher)中。用純化之ECD表現載體轉染Expi293細胞(Invitrogen-A14527),且在37℃,5% CO2
下在Expi293TM
表現培養基(ThermoFisher)中培養5天。收集之上清液用於蛋白質純化。使用Ni-NTA管柱(GE healthcare-17-5247-01)純化組胺酸標籤之蛋白質,使用蛋白質A管柱(GE healthcare-17-5438-02)純化Fc-標籤之蛋白質。
1.2 生產基準抗體 (BMK 抗體 )(W339-BMK1 、 W339-BMK7 、 W339-BMK8)
基於在專利US20110150892 A1及US 2017/0101472 A1中揭示之資訊分別合成抗人LAG-3基準抗體W339-BMK1及W339-BMK7之基因序列。W339-BMK1基於純系「25F7」之序列,W339-BMK7基於純系「H4sH15482P」之序列。W339-BMK8基於WO2015138920 A1中純系「BAP050-hum01」之序列。用具有S228P突變之IgG4同型之人恆定區修飾所有基準抗體。
將合成之基因序列插入質體pcDNA3.3中且瞬時轉染expi293F細胞。培養5天後,將自瞬時轉染細胞之培養物中收集之上清液用於蛋白質純化。藉由蛋白質A管柱(GE healthcare-17-5438-02)自上清液中純化基準抗體。
1.3 建立穩定細胞株
建立人、小鼠及食蟹猴LAG-3轉染細胞株。簡而言之,根據製造商之方案,使用Lipofectamine 2000轉染套組(ThermoFisher-11668027),用含有全長人LAG-3基因(Genbank寄存編號:NP_002277)之pcDNA3.3表現載體轉染Flp-In-293或CHO-K1。分別用小鼠及食蟹猴LAG-3(Genbank寄存編號:NP_032505及XP_005570011.1)轉染Flp-In-CHO及293F細胞。在轉染後48-72小時,將轉染之細胞在含有滅瘟素之培養基中培養以供選擇。藉由流式細胞術測試LAG-3表現。藉由有限稀釋獲得表現人、食蟹猴及小鼠LAG-3之穩定細胞株。
2. VHH 之產生 2.1 免疫接種
為了在駝科動物中誘導針對LAG-3之體液免疫反應,分別對動物皮下注射重組mFc標籤之人LAG-3 ECD及重組hFc標籤之小鼠LAG-3 ECD蛋白。免疫接種間隔為1至3週,劑量範圍為每次注射50μg至200μg,共注射8次。
2.2 血清效價偵測
用人LAG-3.ECD. his及鼠LAG-3.ECD.his蛋白藉由ELISA法分別偵測免疫動物血清中抗人LAG-3及抗小鼠LAG-3之效價。用人或小鼠LAG-3 ECD可溶性蛋白包被96孔板(Nunc),於4℃隔夜。封閉且洗滌包被之孔板後,將免疫前或免疫後之血清之倍數稀釋液轉移至包被之孔板,且在室溫下培育1小時。然後清洗孔板,隨後用二抗山羊抗駝羊IgG-HRP(NB7242)培育1小時。洗滌後,加入TMB受質,用2M HCl終止顯色反應。使用酶標儀(Molecular Device)讀取450nm處之吸光度。
2.3 文庫構建
在最後兩次注射後的6-7天分別收集50 ml血液樣品。在Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare,Little Chalfont,英國)中,藉由密度梯度離心純化外周血單核細胞(PBMC),導致分離約8×107
個PBMC。根據製造商之推薦,使用oligo-dT及隨機引物以及SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix System(Invitrogen,卡爾斯巴德,加利福尼亞州,美國)自此等PBMC中提取總RNA且轉錄成cDNA。
用純化之cDNA作為模板以使用信號肽結構域特異性引物組及CH2結構域特異性引物組擴增編碼Ig重鏈之基因區段之文庫。該擴增產生約900bp(代表習知IgG)及700bp(代表缺少CH1結構域之僅具有重鏈之IgG)之PCR片段。然後將兩類編碼重鏈之基因在瓊脂糖凝膠上按大小分離,且藉由QIAquick凝膠提取套組(Qiagen,希爾登,德國)純化僅編碼重鏈IgG之基因。使用純化片段作為模板,使用框架1(FR1)及框架4(FR4)特異性引物對擴增VHH文庫。該擴增程序在FR1之5'末端引入Sfi I
限制性位點,且在FR4之3'末端引入Not I
限制性位點。將約300-400 bp之PCR擴增之VHH基因文庫上樣至瓊脂糖凝膠上,且藉由QIAquick凝膠提取套組純化。然後用Sfi I
及Not I
切割純化片段,且藉由QIAquick PCR純化套組(Qiagen,希爾登,德國)進行純化。將VHH基因片段最終連接至噬菌粒載體pFL249中且電轉化至大腸桿菌TG1中。轉化後,將TG1細胞在SOC培養基中以200rpm振盪培養1h,然後將大腸桿菌TG1鋪板於補充有100 μg/mL Carb及1% (w/v)葡萄糖之2YT瓊脂平板上,37℃培養隔夜。第二天,將菌落刮入含有1/3 (v/v)之80%甘油之液體2YT培養基中且於-80℃下儲存。
2.4 淘選
為了選擇能有效結合LAG-3之VHH片段,採用了蛋白質淘選方法。將20 µg LAG-3 ECD蛋白質固定在5 ml免疫試管(Nunc,羅切斯特,明尼蘇達州,美國)中,在4℃以400rpm振盪隔夜。第二天,在洗去未結合之蛋白質後,將試管於25℃下用10%脫脂牛奶封閉1小時。將來自上述免疫噬菌體文庫之大約1012
個cfu噬菌體添加至用10%脫脂牛奶封閉之非包被免疫試管中以移除非特異性結合之噬菌體,然後將上述處理之噬菌體加入包被LAG-3 ECD蛋白之試管中,且在25℃下培育2小時。用PBST充分洗滌後,丟棄未結合之噬菌體,用甘胺酸-HCl (pH2.2)溶離用1M Tris-HCl (pH8.0)中和目標特異性結合之噬菌體,然後感染指數生長之TG1細胞。將感染之TG1細胞鋪在含有2% (w/v)葡萄糖及100 μg/ml胺苄青黴素之2YT瓊脂平板上且在37℃下培養隔夜。第二天,將菌落自2YT之平板上刮下,且加入1/3 (v/v)80%甘油在-80℃下冷凍。將刮下之細菌文庫接種至含有100 μg/ml胺苄青黴素之2YT-Carb中,在含有50 μg/ml卡那黴素及1mM IPTG之2YT培養基中用輔助噬菌體M13Ko7感染用於拯救噬菌體,且用作下一輪淘選之投入。為了找出將與猴及小鼠LAG-3交叉反應在噬菌體顆粒,可用猴LAG-3及小鼠LAG-3蛋白交替淘選。
2.5 篩選
在所需淘選步驟後,刮下在平板上生長之噬菌體感染之TG1細胞菌落,使用NucleoSpin®質體(Macherey-Nagel)提取含有VHH片段之pFL249噬菌粒。藉由用Sfi I
及Not I
(10-20U/μg,NEB)消化pFL249質體來選殖VHH片段,然後將其連接至含有6-his及c-Myc-標籤基因之表現載體pETbac中。將連接產物轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞(TIANGEN)中,然後在25℃在ZYM-5052培養基中以230rpm振盪培養48小時。將大腸桿菌BL21培養物以4000 rpm離心20分鐘以收集上清液。藉由ELISA及FACS結合測定篩選上清液以鑑定抗LAG-3陽性VHH純系。
採用ELISA測定作為第一篩選方法來測試VHH大腸桿菌培養物上清液與LAG-3 ECD蛋白之結合。簡而言之,將96孔板(Nunc)在4℃下用人或小鼠LAG-3 ECD蛋白之可溶性蛋白包被隔夜。封閉且洗滌後,將大腸桿菌上清液轉移至包被之孔板,且在室溫下培育1小時。然後洗滌孔板,隨後用二抗山羊抗c-Myc-HRP(Bethyl)培育1小時。洗滌後,加入TMB受質,用2M HCl終止顯色反應。使用酶標儀(Molecular Device)讀取450 nm處之吸光度。
為了證實LAG-3抗體與細胞膜上表現之構象性LAG-3分子之天然結合,用LAG-3轉染之細胞株及親本對照細胞株進行流式細胞術分析。首先將細胞以1×105
個細胞/孔之密度與VHH大腸桿菌上清液樣品在96孔U形底板(BD)中4℃培育1小時,然後與第二抗體小鼠抗c-Myc-生物素(Sigma)在4℃下培育30分鐘,然後在4℃與鏈黴親和素PE(eBioscience)避光培育20分鐘。在每個步驟之間洗滌2次,且將細胞再懸浮於1× PBS/1% BSA中用於流式細胞術(Intellicyt)分析。
2.6 測序
將藉由ELISA及FACS篩選之陽性大腸桿菌純系送到Biosune(中國上海),用於VHH基因之核苷酸測序。使用CLC Main Workbench(Qiagen,希爾登,德國)分析測序結果。
2.7 VHH 蛋白產生
將攜帶VHH基因之BL21大腸桿菌純系在25℃下在40 ml ZYM-5052培養基中以230 rpm振盪培養48小時。藉由SDS-PAGE確認BL21上清中組胺酸及c-Myc標籤融合之VHH蛋白之表現,然後使用Ni-NTA管柱純化。藉由SDS-PAGE及分析SEC-HPLC測定VHH之純度。對於低上清液表現純系,使用超音波(Scientz,寧波,中國)破碎之大腸桿菌細胞釋放可溶性之VHH蛋白,且純化全部細胞裂解物。
2.8 嵌合 VHH-Fc(hIgG4) 蛋白產生
將目標純系轉化為VHH-Fc(uIgG4)融合抗體。簡而言之,使用含有適合限制性位點之VHH特異性選殖引物自pET-bac載體PCR擴增VHH基因,然後藉由融合選殖至經修飾之人IgG4 Fc(S228P)表現pcDNA3.3載體中以產生相應之VHH-Fc (uIgG4)嵌合抗體之純系。用載體瞬時轉染293F細胞用於抗體表現。收集含有抗體之細胞培養物上清液,且使用蛋白A層析進行純化。
3. 抗體優化 3.1 人源化
選擇對LAG-3具有高親和性及特異性之VHH用於人源化。使用「最佳擬合(Best Fit)」方法將VHH鏈人源化。將VHH框架區之胺基酸序列與人種系V基因資料庫進行blast比對,藉由使用Kabat CDR定義,將命中最高之人CDR序列替換為VHH CDR序列。框架區中之某些殘基被回復突變為駝源殘基以維持親和力。將人源化基因回譯,針對哺乳動物表現進行密碼子優化,且由GENEWIZ合成。用含有適合限制性位點之選殖引物重新擴增此等基因,且將其選殖至修飾之pcDNA3.3載體中以表現與人IgG4 Fc(S228P)區連接之人源化VHH。在使用表面電漿共振(SPR)對LAG-3結合進行測試之後,選擇具有適當親和力之變體作為終選人源化抗體。
3.2 親和力成熟
採用定點誘變方法將親本VHH純系之三個互補決定區(CDR1、CDR2及CDR3)中之每個胺基酸分別突變為其他20個胺基酸。使用含有編碼20個胺基酸之NNS密碼子之DNA引物將突變引入每個靶向CDR位置。單個簡併引物用於定點誘變反應。將200 ng反應產物電穿孔入BL21,且在96孔深孔板(Axygen)中表現。用96孔深孔板中生長之細菌上清液藉由ELISA測定篩選VHH突變體。呈現出OD 450大於親本純系1.5倍之純系進一步藉由SPR篩選突變體之親和力。
將確定有利於與抗原結合之VHH中之點突變進一步組合以獲得提高親和力之協同作用。組合突變體在GENEWIZ中合成且在BL21中表現。藉由SPR偵測突變體之上清液。在親和力成熟後,選擇在報告基因測定反應(RGA)中具有強烈反應之總共9種人源化VHH抗體,且與人IgG4 Fc(S228P)區進行融合。9種成熟VHH-Fc嵌合抗體(VHH抗體)簡稱為:W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396- R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13及W3396-R2-26H2。如圖1A及1B所示,9種親和力成熟VHH抗體(簡寫為W3396-Z4)與親本VHH抗體相比,在RGA測定中顯示出增強之反應性。
4. 抗體表徵 4.1 LAG-3 抗體與細胞表面 LAG-3 之結合
將測試抗體(W3396-R2-2及W3396-R2-1)之連續倍數稀釋液、基準抗體(W339-BMK1、W339-BMK7及W339-BMK8)及陰性對照抗體(同型IgG4)分別與人LAG-3轉染之細胞一起培育,然後藉由PE標記之二抗經由流式細胞術(FACS)偵測抗體與細胞表面LAG-3之結合。類似地,採用食蟹猴或鼠LAG-3轉染之細胞株藉由FACS測試對食蟹猴或鼠LAG-3之交叉反應性。圖2A及2B顯示W3396-R2-2及W3396-R2-1分別與細胞表面之人及小鼠LAG-3結合。與人LAG-3之結合EC50比基準抗體(BMK抗體)更好。BMK抗體不與小鼠LAG-3結合(圖2B)。亦測試W3396-R2-13及W3396-R2-1與細胞表面猴LAG-3之結合,且顯示出與BMK抗體相比相當或更好的EC50值(參見圖2C)。
4.2 藉由 FACS 測定 LAG3 抗體阻斷 LAG-3 結合至細胞表面 MHC-II
將連續稀釋之抗體在4℃下與1% BSA-PBS中之小鼠Fc(mFc)標籤之人LAG-3預混合30分鐘。將混合物轉移至用Raji細胞接種之96孔板中。使用山羊抗小鼠IgG Fc-PE抗體來偵測LAG-3蛋白與Raji細胞之結合。藉由流式細胞術評估平均螢光強度(MFI)且藉由FlowJo進行分析。為了測試阻斷小鼠LAG-3結合至小鼠細胞表面MHC-II,使用mFc標籤之小鼠蛋白及A20細胞。圖3A顯示W3396-R2-1及W3396-R2-13阻斷人LAG-3與Raji細胞上MHC-II之結合,其具有比BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7、W339-BMK8)相當或更好的IC50。圖3C顯示W3396-R2-1及W3396-R2-13阻斷小鼠LAG-3與A20細胞上小鼠MHC-II之結合,其IC50為2.4-2.9 nM。圖3B顯示W3396-R2-1及W3396-R2-2阻斷人LAG-3與A20細胞上人MHC-II之結合,其IC50為0.99-1.78 nM。
4.3 藉由 ELISA 測定阻斷 LAG-3 結合至 LSECtin 及半乳糖凝集素 -3
分別用0.5 μg/ml之人LSECtin或半乳糖凝集素-3在4℃下將96孔板包被隔夜。將測試抗體(W3396-R2-1及W3396-R2-13)、基準抗體(W339-BMK1、W339-BMK7 及W339-BMK8)及陰性對照抗體(同型IgG4)之連續稀釋液在4℃下與1% BSA-PBS中之mFc標籤之人LAG-3預混合30分鐘。封閉且洗滌後,將混合物轉移至孔板且在室溫下培育1小時。然後洗滌孔板,隨後與二抗山羊抗小鼠IgG Fc-HRP培育1小時。洗滌後,加入TMB受質,用2M HCl終止顯色反應。使用酶標儀讀取450nm處之吸光度。圖4A及圖4B顯示了W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13阻斷人LAG-3與LSECtin之結合,其具有比BMK抗體相當或更好的IC50。圖4C及4D顯示了W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13阻斷人LAG-3與半乳糖凝集素-3之結合。
4.4 藉由表面電漿子共振 (SPR) 測試 LAG-3 之結合動力學親和力
使用Biacore 8K藉由SPR測定來表徵針對人LAG-3之抗體之親和力及結合動力學。將山羊抗人Fc預固定至感測器晶片(CM5)上,且當抗LAG-3抗體注入晶片時被捕獲。將各種濃度之人LAG-3蛋白及運行緩衝液以30 μL/min之流速流過感測器晶片,結合相為300s,隨後3600s解離。使用Biacore 8K評估軟體藉由1:1 Langmuir結合模型擬合結合(Kon
)及解離曲線(Koff
)。平衡解離常數(KD)以比率Koff
/Kon
計算所得。表4A及4B顯示W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13對人LAG-3之親和力,及對小鼠LAG-3之親和力。表 4A.
藉由SPR測定結合動力學親和力。 表 4B
4.5 藉由 FACS 測試 LAG-3 抗體對細胞表面 LAG-3 分子之結合親和力
藉由FACS分析測定抗體對細胞表面LAG-3之結合親和力。將人LAG-3轉染之細胞以5×105
個細胞/ml之密度轉移至96孔U形底板中。將測試之抗體在洗滌緩衝液(1×PBS/1%BSA)中連續稀釋,且在4℃下與細胞培育1小時。加入二抗山羊抗人IgG Fc FITC(每莫耳IgG含有3.5莫耳FITC),且在4℃避光培育0.5小時。然後洗滌細胞一次且再懸浮於1×PBS/1% BSA中,且藉由流式細胞術分析。基於定量珠粒(Quantum TM MESF套組,Bangs Laboratories, Inc.)將螢光強度轉化為結合之分子/細胞。表5A及5B顯示了在不同批次之實驗中,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13對細胞表面之人、食蟹猴及小鼠LAG-3之親和力,且與BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7、W339-BMK8)進行比較。表 5A.
藉由FACS測定親和力 表 5B
4.6 與人 CD4 之交叉反應性
藉由ELISA測定與人CD4之交叉反應性。在4℃下用1 μg/ml之人CD4包被平板隔夜。封閉及洗滌後,將1 μg/ml之LAG-3抗體加入平板且在室溫下培育1小時。然後洗滌平板,隨後與山羊抗人IgG Fc-HRP培育45分鐘。洗滌後,加入TMB受質,且用2M HCl終止顯色反應。使用酶標儀讀取450 nm處之吸光度。該測定表明W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13與人CD4無交叉反應性(圖5A及5B)。
4.7 對 W339-BMK1 、 W339-BMK7 及 W339-BMK8 之抗原決定基分組
藉由FACS測試,將LAG-3抗體之結合抗原決定基針對基準抗體W339-BMK1、W339-BMK7及W339-BMK8進行分組。簡言之,將0.3 μg/ml之生物素化W339-BMK1與W3396-R2-1、W3396-R2-13或W339-BMK1抗體之連續稀釋液預混合,然後將混合物與人LAG-3轉染之細胞一起培育1小時。使用鏈黴親和素-PE抗體(Jackson Immunoresearch Lab)來偵測基準抗體與細胞之結合。類似地,如上所述進行針對W339-BMK7及W339-BMK8之分組測試(生物素化W339-BMK7及W339-BMK8以1 μg/ml使用)。藉由流式細胞術評估MFI且藉由FlowJo進行分析。圖6顯示W3396-R2-1及W3396-R2-13分別與W339-BMK1 (圖6A)、W339-BMK7 (圖6B)及W339-BMK8 (圖6C)具有不同抗原決定基分組。
4.8 抗原決定基作圖
對人LAG-3進行丙胺酸掃描實驗,且評估其對抗體結合之影響。人LAG-3上之丙胺酸殘基突變為甘胺酸密碼子,且所有其他殘基(半胱胺酸殘基除外)突變為丙胺酸密碼子。對於人LAG-3細胞外結構域(ECD)之各殘基,使用兩個連續的PCR步驟進行單點胺基酸取代。使用編碼人LAG-3之ECD結構域1及結構域2及C末端mFC標籤之pcDNA3.3-LAG-3-D12.mFC質體作為模板,且採用QuikChange閃電多位點定點誘變套組(Agilent technologies,帕羅奧圖,加利福尼亞州)使用一組誘變引物進行第一步PCR。在突變鏈合成反應後,使用Dpn I
內切核酸酶消化親本模板。在第二步PCR中,擴增由CMV啟動子,LAG-3之細胞外結構域1及結構域2(D12),mFc標籤及單純疱疹病毒胸苷激酶(TK)多聚腺苷酸化組成之線性DNA表現卡匣,於37℃下在Expi293細胞中瞬時表現(Life Technologies,蓋瑟斯堡,馬里蘭州),藉由蛋白A-HPLC及mFC-ELISA定量套組(Bethyl,美國)進行定量。將單株抗體W3396-R2-2及3個BMK抗體(即W339-BMK1、W339-BMK7、W339-BMK8)(2μg /ml)包被在平板中用於ELISA結合測定。在與含有定量LAG-3突變體或人LAG-3-ECD.D12.mFC蛋白之上清液相互作用後,加入HRP綴合之抗mFC抗體(1:5000;BetHyl,美國)作為偵測抗體。根據對照突變體之平均值對吸光度進行歸一化。在設定結合倍數變化之額外截止值(<0.75)後,鑑定最終確定之抗原決定基殘基。
結果顯示LAG-3具有422個胺基酸之細胞外結構域(V29-L450),且結構域1 (G37-Q168)之132個胺基酸在丙胺酸掃描實驗中進行抗原決定基作圖。由於缺少現有的LAG-3結構,基於髓鞘相關糖蛋白(PDB:5FLU,序列同一性18%)之已知結構進行LAG-3(胺基酸:31-431)之結構建模。基於丙胺酸掃描結果,如表6A-6D及圖12A-12E所示鑑定熱點。總之,LAG-3具有422個胺基酸之細胞外結構域(V29-L450),且結構域1 (G37-Q168)之132個胺基酸在丙胺酸掃描實驗中進行抗原決定基作圖。由於序列同一性僅為18%,因此模型及標記之熱點僅供參考。在BMK抗體中,W339-BMK1(BMS)聲稱其抗原決定基與吾人之抗原決定基作圖結果一致。如W339-BMK1/BMK7之抗體之一個特徵為與屬於外環(G70-Y99)之W92結合,而如W339-BMK8之抗體與L134-P138區結合。W3396-R2-2屬於如W339-BMK8之抗體,然而,W3396-R2-2結合獨特抗原決定基,即V104,其在三種測試之基準抗體中未發現。表 6A
. W339-BMK1抗體之熱點 表 6B
. W339-BMK7抗體之熱點 表 6C
. W339-BMK8抗體之熱點 表 6D
. W3396-R2-2抗體之熱點
4.9 人 LAG-3 抗體在報告基因測試中之作用
在實驗室中製備了用人LAG-3及IL-2螢光素酶報告基因(Promega)穩定共轉染之Jurkat細胞。在葡萄球菌腸毒素E(SEE)(毒素技術-ET404)存在下,將該細胞與Raji細胞一起接種在96孔板中。將測試抗體之系列稀釋液加入至細胞中,且在37℃、5% CO2
下培育隔夜。培育後,加入重組螢光素酶受質,且藉由微孔板分光光度計測定螢光素酶強度。圖7A-7B中顯示之資料表明,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13在RGA測定中增強IL-2通路活性,具有比BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7、W339-BMK8)相當或更好的EC50。
4.10 人 LAG-3 抗體對人同種異體混合淋巴細胞反應之影響
採用Ficoll-Paque PLUS梯度離心自健康供體新鮮分離人PBMC。根據製造商之說明書(Miltenyi,biotec-130-050-201),使用人單核細胞富集套組分離單核細胞。將單核細胞在含有GM-CSF(R&D)及IL-4(R&D)之培養基中培養5-7天以產生未成熟的樹突細胞(iDC)。根據製造商之方案(Stemcell,19052),使用人CD4+
T細胞富集套組分離人CD4+
T細胞。將與同種異體iDC共培養之純化CD4+
T細胞在96孔板中與各種濃度之LAG-3抗體一起進行培育。在第5天,收集培養上清液進行IFN-γ測試。使用匹配之抗體對藉由ELISA測定人IFN-γ。使用重組IFN-γ作為標準(Peprotech)。用對人IFN-γ特異性捕獲抗體(Pierce-M700A)對孔板進行預包被。使用生物素綴合之抗IFN-γ抗體(Pierce-M701B)作為偵測抗體。結果顯示W3396-R2-1及W3396-R2-13在MLR測定中比BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7、W339-BMK8)更有效(圖8A)。在一個單獨的測定中,與同型對照相比,W3396-R2-1及W3396-R2-2將人T細胞IFN-γ之分泌提高約50%,且其效力與BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7、W339-BMK8)相當(圖8B)。
4.11 ADCC
將人LAG-3轉染之細胞及各種濃度之LAG-3抗體在96孔圓底板中預培育30分鐘;然後以50:1之效應細胞/靶細胞之比例加入PBMC作為效應細胞。將96孔板在37℃下,5% CO2
下培育4小時。藉由基於LDH之細胞毒性偵測套組(Roche-11644793001)測定靶細胞裂解。使用酶標儀讀取492 nm處之吸光度。使用赫賽汀及表現HER2之細胞株SK-Br-3作為陽性對照。W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13在人LAG-3轉染之細胞上不誘導ADCC效應(圖9A及9B)。
4.12 CDC 測試
將人LAG-3轉染之細胞及各種濃度之LAG-3抗體在96孔圓底板中混合。以1:50之最終稀釋度加入人補體。將96孔板在37℃,5% CO2
下培育2小時。藉由Cell Titer-Glo (Promega)測定靶細胞裂解。使用酶標儀讀取發光。使用利妥昔單抗及表現CD20之Raji細胞株作為陽性對照。W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13在人LAG-3轉染之細胞上不誘導CDC效應(圖10A及10B)。
4.13 血清穩定性測試
將W3396-R2-1及W3396-R2-13於37℃在新鮮分離之人血清(血清含量> 95%)中培育。在指定時間點(0天,1天,4天,7天,14天),將一等份血清處理之樣品自培養箱中取出且在液氮中快速冷凍,然後儲存在-80℃下以備測試。在穩定性測試之前將所有樣品快速解凍。將人LAG-3轉染之細胞與倍數稀釋之血清處理的W3396-R2-1及W3396-R2-13在4℃下培育1小時。使用PE標記之山羊抗人IgG來偵測W3396-R2-1及W3396-R2-13與細胞之結合。藉由流式細胞術量測細胞之MFI且藉由FlowJo進行分析。結果顯示,W3396-R2-1 (圖11A)及W3396-R2-13 (圖11B)在人血清穩定性測試中穩定。
4.14 藉由差示掃描螢光測定法 (DSF) 測定熱穩定性
使用實時螢光定量 PCR(QuantStudio 7 Flex, Thermo Fisher Scientific)進行DSF測定。簡而言之,將19 μL抗體溶液與1 μL 62.5 X SYPRO Orange溶液(Invitrogen)混合且加入至96孔板(Biosystems)中。以2℃/分鐘之速率將孔板自26℃加熱至95℃,且收集得到的螢光資料。計算不同溫度下之螢光變化之負導數,且將最大值定義為熔化溫度Th
。若蛋白質具有多個解摺疊轉變,則報告前兩個Th
,命名為Tm1
及Tm2
。Tm1
即為熔化溫度Tm
,用於不同蛋白質之間的比較。資料收集及Th
計算由操作軟體(QuantStudioTM
Real-Time PCR PCR Software v1.3)自動進行。不同緩衝液中W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13之Tm
1及Tm
2值如表7所示。表 7
藉由DSF測定熱穩定性
4.15 小鼠活體內藥代動力學 (PK) 研究
在C57BL/6小鼠中進行測試抗體之PK研究。在該研究中使用6-8週齡之雌性C57BL/6小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)。
將30隻動物(10隻動物/組)分成三組:組1、組2及組3。藉由靜脈注射一次性向動物分別施用10mg/kg W339-BMK1、W3396-R2-1及W3396-R2-2。用PBS調配抗體。在給藥前、0.3h、2h、6h、24h、第2天(48 h)、第4天(96 h)、第7天(144 h)、第10天(240 h)、第14天(312 h)、第21天(480 h)收集PK血樣。 藉由ELISA測定血清樣品中W3396-R2-1及W3396-R2-2之血清濃度。將注射當天視為第0天。本研究中所有與動物馴養、護理及處理相關之程序均按照生物模型之動物管理委員會(IACUC)批准的指南進行,遵循實驗動物評估及認可委員會(AAALAC)之指導。
藉由使用Phoenix WinNonlin軟體(版本6.3,Pharsight,Mountain View,加利福利亞州)對小鼠中W3396-R2-1、W3396-R2-2及W339-BMK1之血清濃度進行非房室藥代動力學分析。
在研究期間未觀察到不利影響。
PK參數總結列於表8及圖13中。結果表明W3396-R2-2及W339-BMK1在小鼠中顯示出相似PK曲線。表 8.
小鼠PK研究中PK參數總結
4.16 在幼年雄性及雌性食蟹猴中 W3396-R2-1 及 W3396-R2-2 之單劑量研究
由海南金港生物技術股份有限公司提供四隻幼年食蟹猴。雄性之體重範圍為2.46至2.72 kg,雌性之體重範圍為2.50至2.58 kg。
將4隻動物(2隻動物/組)分成2組:組1及組2。組1及組2之動物藉由靜脈輸注30分鐘,分別一次性施用30 mg/kg W3396-R2-1及W3396-R2-2。用PBS調配製劑。在給藥前、0.25h、1h、4h、8h、24h、第3天(48 h)、第5天(96 h)、第7天(144 h)、第9天(192 h)、第11天(240 h)、第14天(312 h)、第21天(480 h)、第28天(648 h)收集PK血樣。在給藥前、第14天及第28天收集抗藥抗體(ADA)樣品。藉由ELISA測定血清樣品中W3396-R2-1、W3396-R2-2及ADA之血清濃度。在給藥前、24h、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天收集樣品用於血液學及臨床化學測試。
對一般健康及外觀進行籠側觀察,尤其為皮膚刺激。分別藉由血液學分析儀(ADVIA2120)及化學(HITACHI 7180)進行血液學(CBC)之全血樣品分析及化學偵測之血清分析。
在各時間點藉由頭靜脈或隱靜脈自每隻研究動物收集約1.0 mL血液用於PK及1.0 mL血液用於抗藥抗體(ADA)。記錄各樣品採集之實際時間。所有採樣時間均被接受(對於給藥前或給藥後1小時之時間點,採樣時間偏差小於1分鐘,對於給藥後1小時以後的時間點,採樣時間偏差小於標稱時間之5%)。將所有血液樣品轉移至含有聚合物二氧化矽活化劑之市售試管中。在離心前,含有血液樣品之試管在室溫下保持不超過1小時(直至出現血清)。然後藉由以約4℃、2000 g離心血樣20分鐘來製備血清樣品。然後將所有血清樣品用乾冰快速冷凍,且在-60℃或更低溫度下保存直至ELISA分析。
本研究中所有與動物馴養、護理及處理相關的程序均按照無錫藥明康德新藥開發股份有限公司(蘇州)之動物管理委員會(IACUC)批准之指南進行,遵循實驗動物評估及認可委員會(AAALAC)之指導。
藉由使用Phoenix WinNonlin軟體(版本6.3,Pharsight,Mountain View,加利福利亞州)對猴子中W3396-R2-1,W3396-R2-2之血清濃度進行非房室藥代動力學分析。將線性/對數梯形法則用於獲得PK參數。所有BLQ被排除在PK參數計算之外。所有血清濃度及藥代動力學參數均報告有三個有效數字。個體BLQ被排除在平均濃度計算之外。標稱劑量水準及標稱採樣時間用於計算所有藥代動力學參數。
結果表明在研究期間未觀察到不利影響。在食物消耗及體重上無明顯變化。血液學及臨床化學參數,包括AST、ALT、WBC、HGB及HCT通常在參考範圍內(未顯示資料)。PK參數之總結列於表9及圖14中。血液中ADA效價總結在表10中。總之,W3396-R2-2在猴子中顯示出良好T1/2
,約212小時。在猴子中,W3396-R2-2之ADA效價低於W3396-R2-1之效價。表 9
. 猴PK研究中PK參數(平均值)總結
縮寫說明 表 10
. 以30 mg / kg單次靜脈推注給藥後,食蟹猴中W3396-R2-1及W3396-R2-2之個體ADA結果
備註:「-」表示ADA結果為陰性,「+」表示ADA結果為陽性
圖1A及1B示出了如藉由IL-2螢光素酶報告基因偵測(RGA)測定的,與人源化親本VHH抗體(W3396-Z4)相比,9種親和力成熟VHH抗體(W3396-R2-1、W3396-R2-2、W3396-R2-3、W3396-R2-6、W3396-R2-10、W3396-R2-11、W3396-R2-12、W3396-R2-13及W3396-R2-26H2)顯示出增強之反應性。
圖2A示出了如藉由螢光激活細胞分離技術(FACS)測定的,W3396-R2-1及W3396-R2-2與細胞表面人LAG-3結合,具有與基準抗體(BMK抗體)(W339-BMK1、W339-BMK7、W339-BMK8)相比相當或更好的EC50。
圖2B示出了如藉由FACS測定的,W3396-R2-1及W3396-R2-2與細胞表面小鼠LAG -3結合,EC50為0.1或0.13 nM。
圖2C示出了如藉由FACS測定的,W3396-R2-1及W3396-R2-13與細胞表面食蟹猴LAG-3結合,EC50為2.34或2.16 nM。
圖3A及圖3B示出了如藉由FACS測定的,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13阻斷人LAG-3與細胞表面之人MHC-II的結合,具有比BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7及W339-BMK8)相比相當或更好的IC50。
圖3C示出了如藉由FACS測定的,W3396-R2-1及W3396-R2-13阻斷小鼠LAG-3與細胞表面之小鼠MHC-II的結合,IC50為2.9或2.4 nM。
圖4A及圖4B示出了如藉由酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定的,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13阻斷人LAG-3與肝竇內皮細胞凝集素(LSECtin)的結合,具有比BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7及W339-BMK8)相當/更好的IC50。
圖4C及圖4D示出了如藉由ELISA測定的,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13阻斷人LAG-3與半乳糖凝集素-3(Gal-3)的結合,具有比BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7及W339-BMK8)相當或更好的IC50。
圖5A及圖5B示出了如藉由ELISA測定的,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13不與人CD4結合。
圖6A-6C示出了如藉由FACS測定的,W3396-R2-1及W3396-R2-13具有與W339-BMK1、W339-BMK7及W339-BMK8不同的抗原決定基分組(epitope bin)。
圖7A及7B示出了如藉由RGA測定的,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13增強IL-2通路活性,具有比BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7及W339-BMK8)相當或更好的EC50。
圖8A及8B示出了如藉由人混合淋巴細胞反應(MLR)測定的,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13在促進人T細胞IFN-γ分泌中與BMK抗體(W339-BMK1、W339-BMK7及W339-BMK8)相比相當或更有效。
圖9A及9B示出了如藉由ADCC測定的,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13在人LAG-3轉染之細胞上不誘導ADCC效應。
圖10A及10B示出了如藉由CDC測定的,W3396-R2-1、W3396-R2-2及W3396-R2-13在人LAG-3轉染之細胞上不誘導CDC效應。
圖11A及11B示出了如藉由血清穩定性測試中FACS測定的,W3396-R2-1及W3396-R2-13在人血清中於37℃下培育1天、4天、7天及14天,其抗原結合能力保持穩定。
圖12A-12E示出了抗原決定基作圖之結果。圖12A示出了LAG-3之模型(基於PDB:5FLU)。圖12B示出了在模型結構上標記之W339-BMK1之熱點(黑色:倍數變化<0.55,帶白點之灰色:倍數變化0.55-0.75)。圖12C示出了在模擬結構上標記之W339-BMK7之熱點(黑色:倍數變化<0.55,帶白點之灰色:倍數變化0.55-0.75)。圖12D顯示在模型結構上標記之W339-BMK8之熱點(黑色:倍數變化<0.55,帶白點之灰色:倍數變化0.55-0.75)。圖12E示出了在模型結構上標記之W3396-R2-2之熱點(黑色:倍數變化<0.55,帶白點之灰色:倍數變化0.55-0.75)。
圖13示出了W3396-R2-2及W339-BMK1在小鼠中顯示類似藥代動力學(PK)曲線。
圖14示出了如在食蟹猴PK研究中所證明的,W3396-R2-2在猴子中具有約212小時之活體內半衰期。
<110> 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司(WUXI BIOLOGICS (SHANGHAI) CO.,LTD.)
<120> 新型抗LAG-3抗體多肽
<130> 053674-8021TW01
<140> TW108108992
<141> 2019-03-15
<150> PCT/CN2018/079682
<151> 2018-03-20
<150> CN201810730302.2
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<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<223> Xaa可以為Lys、Tyr、Met、Asp或Arg
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<222> (2)..(2)
<223> 2位之Xaa可以為His或Trp
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<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 9位之Xaa可以為Ser或Pro
Claims (34)
- 一種經分離的單域抗體多肽,其包含特異性地與LAG-3結合之重鏈可變域,其中該重鏈可變域包含CDR1、CDR2及CDR3,其中:該CDR1之胺基酸序列為GLTLSQYTMG(SEQ ID NO:1),該CDR2之胺基酸序列為AIHWTSSVTDYADSVX1G(SEQ ID NO:33),及該CDR3之胺基酸序列為TX2YYTHRGX3FDY(SEQ ID NO:34),其中X1為K、Y、M、D或R,X2為H或W,且X3為S或P。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其中:該CDR1之序列為SEQ ID NO:1,該CDR2之序列選自SEQ ID NO:2、4、8、9及10,且該CDR3之序列選自SEQ ID NO:3、5、6及7。
- 如請求項1或2之單域抗體多肽,其包含:a)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:3所示之胺基酸序列的CDR3;b)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:5所示之胺基酸序列的CDR3;c)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基 酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:6所示之胺基酸序列的CDR3;d)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列的CDR3;e)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:8所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列的CDR3;f)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:5所示之胺基酸序列的CDR3;g)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:6所示之胺基酸序列的CDR3;h)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:9所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:7所示之胺基酸序列的CDR3;i)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:10所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:5所示之胺基酸序列的CDR3;或j)重鏈可變區,該重鏈可變區包含如SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的CDR1、如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列的CDR2及如SEQ ID NO:3所示之胺基酸序列的CDR3。
- 如請求項1或2之單域抗體多肽,其包含選自下組之胺基酸序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29及SEQ ID NO:31。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其中該重鏈可變域來源於VHH結構域。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其進一步包含免疫球蛋白恆定區。
- 如請求項6之單域抗體多肽,其中該免疫球蛋白恆定區為人類免疫球蛋白之恆定區。
- 如請求項6之單域抗體多肽,其中該免疫球蛋白恆定區為人類IgG之Fc區。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其為駱駝來源的或人源化的。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其為奈米抗體。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其能夠以不超過5×10-9、2×10-10或2.5×10-12M之KD值特異性地與人LAG-3結合,該KD值係藉由表面電漿共振(SPR)測定。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其能夠以不超過10-9、5×10-10或6×10-11M之KD值特異性地與在細胞表面上表現之人LAG-3結合,該KD值係藉由流式細胞術測定。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其能夠特異性地與食蟹猴LAG-3及/或小鼠LAG-3結合。
- 如請求項1之單域抗體多肽,其與一或多種綴合部分連接。
- 如請求項14之單域抗體多肽,其中該綴合部分選自清除調節劑、毒素、放射性同位素、鑭系元素、發光標記、螢光標記、酶受質標記、DNA烷化劑或抗癌藥。
- 如請求項14之單域抗體多肽,其中該綴合部分選自化療劑、拓樸異構酶抑制劑或微管蛋白黏合劑。
- 一種醫藥組合物,其包含如請求項1至16中任一項之單域抗體多肽,以及醫藥學上可接受之載劑。
- 一種分離的多核苷酸,其編碼如請求項1至16中任一項之單域抗體多肽。
- 如請求項18之分離的多核苷酸,其包含選自下組之核苷酸序列:SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30及SEQ ID NO:32。
- 一種載體,其包含如請求項18或19之分離的多核苷酸。
- 一種宿主細胞,其包含如請求項20之載體。
- 一種表現如請求項1至13中任一項之單域抗體多肽之方法,其包含在使如請求項20之載體表現之條件下培養如請求項21之宿主細胞。
- 一種如請求項1至16中任一項之單域抗體多肽或如請求項17之醫藥組合物之用途,其係用於製備在個體中治療與LAG-3活性調節相關之疾病或病況之醫藥品。
- 如請求項23之用途,其中該疾病或病況為與LAG-3相關之疾病或病況。
- 如請求項24之用途,其中該疾病或病況為癌症、自體免疫疾病或感染性疾病。
- 如請求項25之用途,其中該癌症為膠質母細胞瘤、血液腫瘤、轉移 性黑色素瘤、伯基特氏淋巴瘤(BL)、多發性骨髓瘤(MM)、B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、B細胞及T細胞急性淋巴細胞性白血病(ALL)、T細胞淋巴瘤(TCL)、多毛細胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、黑色素瘤、間皮瘤、威爾姆氏癌、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、肺癌、骨癌、胰臟癌、肝細胞癌、皮膚癌、子宮內膜癌、類癌、頭頸癌、皮膚或眼內惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、睾丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金疾病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病,包括急性髓細胞白血病(AML)、慢性髓細胞白血病(CML)、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、兒童實體腫瘤、淋巴細胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)腫瘤、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管再生、脊髓軸腫瘤、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、尤因氏肉瘤、軟骨肉瘤、腦膜瘤、垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原發性神經外胚層瘤、髓母細胞瘤、星形細胞瘤、間變性星形細胞瘤、少突神經膠質瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、真性紅細胞增多症、血小板增多症、特發性骨髓纖維化、軟組織肉瘤、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、環境誘發之癌症、石棉誘發之癌症及轉移性癌症。
- 如請求項25之用途,其中該感染性疾病為HIV、肝炎(A型、B型及C型)、人乳頭瘤病毒(HPV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、流感、疱疹、賈第鞭毛蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、黃病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯薩奇病 毒、冠狀病毒、呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、細小病毒、牛痘、HTLV病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質炎病毒、狂犬病毒、JC病毒、蟲媒病毒性腦炎病毒、衣原體、立克次體細菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎鏈球菌、腦膜炎球菌及淋球菌、克雷伯菌、變形桿菌,沙雷氏菌、假單胞菌、軍團桿菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風、肉毒桿菌、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病、萊姆病細菌、溶組織內阿米巴、結腸小袋蟲、福氏耐格里變形蟲、棘阿米巴、藍氏賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、卡氏肺孢子蟲、間日瘧原蟲、田鼠巴貝蟲、布氏錐蟲、克氏錐蟲、杜氏利什曼原蟲、弓形蟲及巴西日圓線蟲。
- 如請求項25之用途,其中該自免疫疾病為阿茲海默氏病、過敏、哮喘、乳糜瀉、克羅恩氏病、格雷夫病、炎性腸病(IBD)、狼瘡、多發性硬化、重症肌無力、風濕性多肌痛、類風濕性關節炎、I類糖尿病及脈管炎。
- 如請求項23之用途,其中該個體為人類。
- 如請求項23之用途,其中該醫藥品係用於經由口服、鼻內、靜脈內、皮下、舌下或肌內投與。
- 一種如請求項1至16中任一項之單域抗體多肽之用途,其係用於製備在表現LAG-3之細胞中調節LAG-3活性的醫藥品。
- 一種在樣品中偵測LAG-3之存在或含量之體外方法,其包含將該樣品與如請求項1至16中任一項之單域抗體多肽接觸,以及確定該樣品中LAG-3之存在或含量。
- 一種如請求項1至16中任一項之單域抗體多肽之用途,其係用於製備診斷LAG-3相關之疾病或病況之診斷試劑。
- 一種套組,其包含如請求項1至16中任一項之單域抗體多肽,其可用於偵測LAG-3。
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Patent Citations (1)
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TW201726740A (zh) | 2015-11-18 | 2017-08-01 | 默沙東藥廠 | Pd1及/或lag3結合劑 |
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