CN112218892B - 新型抗ctla-4抗体多肽 - Google Patents

Abstract

本公开提供抗CTLA‑4的抗体多肽、编码该多肽的多核苷酸、包含该多肽的药物组合物及其用途。

Description

新型抗CTLA-4抗体多肽

优先权声明

本专利申请要求于2018年3月19日提交的PCT申请号PCT/CN2018/079495的优先权的权益。

技术领域

本发明总体上涉及新型抗人CTLA-4抗体多肽。

背景技术

癌症免疫治疗已成为癌症治疗的热门研究领域。细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)是免疫稽查点的有效靶标之一。在T细胞激活后，CTLA-4一般在抗原与TCR结合后1小时内快速表达于该类T细胞。CTLA-4可以通过与CD28竞争抑制T细胞信号传导。除了在激活的T细胞诱导表达外，CTLA-4组成性的表达于调节T细胞(Treg)表面，提示CTLA-4可能是接触介导的抑制所必需的，并与Treg产生免疫抑制细胞因子如转化生长因子beta和白介素-10有关。

在许多临床前和临床研究中都证明了CTLA-4阻断可诱导肿瘤消退。有两种抗CTLA-4抗体在临床研制中。依匹单抗(MDX-010,BMS-734016)，全人抗CTLA-4单克隆抗体IgG1-kappa同型，是一种免疫调节剂，已被批准作为治疗晚期黑色素瘤的单一疗法。

单域抗体(sdAb)是一种包含一个单体可变抗体结构域的抗体。与全抗体一样，可以选择性结合特定抗原。单域抗体比由两条蛋白重链和两条轻链组成的普通抗体小很多。第一个单域抗体是从驼类中发现的重链抗体中设计出来的(Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,Hamers R(1993)不含轻链的天然抗体.Nature 363(6428):446–448.)，这些被称为VHH片段。现在，大多数单域抗体的研究是基于重链可变结构域的。

单域抗体具有很多优点。例如，它们通常有高溶解度和稳定性，并且可以很轻易的在酵母、植物和哺乳动物细胞中生产(Harmsen MM,De Haard HJ(2007)驼类单域抗体片段的特性、生产和应用.Appl Microbiol Biotechnol 77(1):13–22.)。此外，它们具有良好的热稳定性和良好的组织穿透性。并且它们还具有成本效益。单域抗体的优点使得它们适用于许多的生物技术和治疗应用。例如，它们可用于治疗疾病，包括但不限于癌症、传染性疾病、炎症和神经退行性疾病。

虽然抗CTLA-4的抗体已经开发出来，但作为治疗药物，抗CTLA-4抗体仍有改进的空间。因此，本领域希望开发新的抗CTLA-4抗体，特别是针对CTLA-4的单域抗体。

发明内容

本发明中，本公开中的冠词“一个(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”是指该条的语法宾语中的一个或多个(即，至少一个)。举例而言，“一种抗体”指一种或多种抗体。

本发明提供了新型抗CTLA-4单抗抗体，以及其氨基酸和核酸序列，及其使用。

一方面，本发明提供了一种包含可特异性结合CTLA-4的重链可变结构域的抗体多肽，其中所述重链可变结构域包含：

选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:10组成的组中1、2或3个重链互补性决定区(CDR)序列。

在某些实施例中，所述重链可变结构域包含含有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:3的重链可变结构域。在某些实施例中，所述重链可变结构域包含含有SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链可变结构域。

在某些实施例中，其中所述重链可变结构域包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组中的重链可变区及其同源序列，所述同源序列具有至少80％的序列同一性，而与CTLA-4保持特定的结合亲和力。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽还进一步包含一种或多种氨基酸残基替代或修饰，而与CTLA-4保持特定的结合亲和力。

在某些实施例中，至少一种替代或修饰是在一个或多个CDR序列中，和/或在一个或多个VH序列中，但不在任何CDR序列中。

在某些实施例中，所述抗体多肽是单域抗体或重链抗体。

在某些实施例中，所述重链可变结构域来源于VHH结构域。

在某些实施例中，所述抗体多肽进一步包含免疫球蛋白恒定区，可选的人Ig的恒定区，或者可选的人IgG的恒定区域。

在某些实施例中，所述抗体多肽是被分离的。

在某些实施例中，所述重链可变结构域是驼类源的或是人源化的。

在某些实施例中，所述抗体多肽是纳米体。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽可特异性结合人CTLA4，通过流式细胞术测定其EC₅₀值不超过0.5nM。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽可阻断CTLA4和细胞表面表达的CD80之间的结合，流式细胞术测定其IC₅₀值不超过0.15nM；或阻断CTLA4和细胞表面表达的CD86之间的结合，流式细胞术测定其IC₅₀值不超过0.25nM。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽可特异性结合食蟹猴CTLA-4，和/或鼠CTLA-4。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽与一个或多个共轭基团连接。

在某些实施例中，所述共轭基团包含清除修饰剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶底物标记、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白粘合剂或其他抗癌药物。

另一方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段，所述片段与上述任一权利要求的抗体多肽竞争相同的表位。

本发明还提供了一种包含本公开提供的抗体多肽的药物组合物，包括抗体或其抗原结合片段，和药学可接受的载体。

本发明还提供了一种编码本公开提供的抗体多肽的多核苷酸。在某些实施例中，所述多核苷酸是被分离的。

在某些实施例中，本公开提供的多核苷酸包含选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9组成的组中的核苷酸序列，和/或其具有至少80％(如至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的同源序列，和/或其仅具有简并替代的变体。

本发明还提供了一种包含本公开提供的多核苷酸的载体。

本发明还提供了一种包含本公开提供的载体的宿主细胞。

本发明还提供了一种表达本公开提供的抗体多肽的方法，包括在可表达本公开提供的载体的条件下培养本公开提供的宿主细胞。

本发明还提供了一种在将受益于CTLA-4活性的调节受试者中治疗疾病或病症的方法，包括向受试者施用本公开提供的任一抗体多肽或本公开所提供的药物组合物的治疗有效量。

在某些实施例中，所述疾病或病症是CTLA-4相关疾病或病症。

在某些实施例中，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病、炎症疾病、传染病、移植物抗宿主病(GVHD)或移植排斥。

在某些实施例中，所述癌症是淋巴瘤、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统癌、乳腺癌、子宫或子宫内膜癌、直肠癌、食管癌、头颈癌、肛门癌、胃肠道癌、上皮内肿瘤、肾(kidney)癌或肾细胞(renal)癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、胰腺癌，前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、阴茎癌、儿童实体瘤、肿瘤血管瘤、脊柱肿瘤、垂体腺瘤或表皮样癌。

在某些实施例中，所述疾病或病症是由石棉或血液系统恶性肿瘤引起的环境诱发的癌症，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓样淋巴瘤、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤，前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、蕈样真菌病、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和前体T淋巴细胞淋巴瘤，及上述癌症的任意组合。

在某些实施例中，受试者是人类。

在某些实施例中，所述给药方式为口服、鼻腔、静脉、皮下、舌下或肌肉注射。

另一方面，本发明还提供了一种在CTLA-4表达细胞内调节CTLA-4活性的方法，包括将CTLA-4表达细胞暴露于本公开提供的抗体多肽。

本发明还提供了一种在样品中检测CTLA-4存在或含量的方法，包括将样品与本公开提供的抗体多肽接触，并测定样品中CTLA-4的存在或含量。

本发明还提供了一种在受试者中诊断CTLA-4相关疾病或病症的方法，包括：a)将从受试者获得的样本与本公开提供的任何抗体多肽接触；b)测定样本中CTLA-4的存在或含量；以及c)关联CTLA-4的存在或含量和受试者CTLA-4相关疾病或病症的存在或状态。

本发明还提供了本公开提供的抗体多肽在制备用于治疗受试者的CTLA-4相关疾病或病症的药物中的用途。

本发明还提供了本公开提供的抗体多肽在制备用于诊断受试者的CTLA-4相关疾病或病症的试剂中的用途。

本发明还提供了一种试剂盒，包含用于检测CTLA-4的包含本公开提供的抗体多肽。

附图说明

图1A示出了通过FACS法测量W3166-z13和W3166-z17与细胞表面的人CTLA4的结合。

图1B示出了通过ELISA法测量W3166-z13和W3166-z17与人CTLA4的结合。

图2A示出了通过FACS法测量W3166-z13和W3166-z17与细胞表面的食蟹猴CTLA4的结合。

图2B示出了通过ELISA法测量W3166-z13和W3166-z17与食蟹猴CTLA4的结合。

图3A示出了通过ELISA法测量W3166-z13和W3166-z17对CD80结合人CTLA4的阻断。

图3B示出了通过ELISA法测量W3166-z13和W3166-z17对CD86结合人CTLA4的阻断。

图4A示出了通过FACS法测量显示W3166-z13和W3166-z17对CD80结合细胞表面人CTLA4的阻断比W316-BMK1更有效。

图4B示出了通过FACS法测量显示W3166-z13和W3166-z17对CD86结合细胞表面人CTLA4的阻断比W316-BMK1更有效。

图5A示出了人类异基因MLR试验显示W3166-z13和W3166-z17比W316-BMK1更能增强IFN-γ的产生。

图5B示出了W3166-z13和W3166-z17以剂量依赖性方式增强人类异基因MLR中IL-2的产生。效价与W316-BMK1相当。

图6示出了在表位结合ELISA测试中的测量显示W3166-z13和W3166-z17与W316-BMK1具有相似的表位组。

图7示出W3166-z13和W3166-z17可在人CTLA4转染细胞中诱导ADCC效果。

图8示出W3166-z13和W3166-z17不可在人CTLA4转染细胞中诱导CDC效果。

图9示出FACS法测量显示W3166-z13和W3166-z17在人血清稳定测试中是稳定的。

图10示出FACS法测量显示W3166-z13和W3166-z17特异性结合人CTLA-4，且不与hICOS、BTLA、hCD28和hPD1交叉反应。

具体实施方式

以下对本发明的描述仅用于说明本发明的各种实施例。因此，所讨论的具体修改不应解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，可以在不脱离本发明范围的情况下进行各种等效、改变和修改，并且应当理解，这些等效实施例将包括在本公开中。本公开引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请，均以全文引用方式整体并入本公开。

定义

本公开所用术语“抗体”包括任何与特定抗原结合的免疫球蛋白、单抗、多抗、多价抗体、二价抗体或单价抗体。本公开所用术语“抗体”旨在广泛地包含传统的四链抗体和较不传统的不具有四链的抗体(例如缺乏轻链的天然抗体)。

传统的完整抗体是由两条重(H)链和两条轻(L)链组成的异四聚体。哺乳动物重链分为α、δ、ε、γ和μ，每条重链包含一个可变区(V_H)和一个第一、第二和第三恒定区(相应的为C_H1、C_H2、C_H3)；哺乳动物轻链分为λ或κ，每条轻链包含一个可变区(V_L)和一个恒定区。传统的抗体呈“Y”形，Y的柄部由两条重链的第二和第三恒定区组成，通过二硫键结合在一起。Y的每一个臂包括单个重链的可变区和第一恒定区，该重链结合到单个轻链的可变和恒定区域。轻链和重链的可变区负责抗原结合。两条链中的可变区通常包含三个高度可变的环，称为互补决定区(CDRs)(轻链CDRs包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDRs包括HCDR1、HCDR2和HCDR3)。本公开公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可由Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani的惯例定义或识别(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,273(4),927(1997)；Chothia,C.et al.,J Mol Biol.Dec 5；186(3):651-63(1985)；Chothia,C.and Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.,196,901(1987)；Chothia,C.et al.,Nature.Dec 21-28；342(6252):877-83(1989)；Kabat E.A.et al.,免疫相关蛋白序列,第5版.公共卫生服务，国立卫生研究院，贝塞斯达,Md.(1991)；Marie-Paule Lefranc et al,发育与比较免疫学,27:55-77(2003)；Marie-Paule Lefranc et al,Immunome Research,1(3),(2005)；Marie-Paule Lefranc,B细胞分子生物学(第二版),26章,481-514,(2015))。三个CDRs位于侧翼延伸段之间，称为框架区(FRs)，它们比CDRs具有更高的保守性，并且形成了支持超变量环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出不同的效应器功能。抗体根据其重链恒定区的氨基酸序列进行分类。抗体的五大类或同型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特点是具有相应的α、δ、ε、γ和μ重链。几种主要的抗体可被分至各个亚类如IgG1(γ重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。

与传统异四聚体抗体不同，还存在天然缺乏轻链的二聚体免疫球蛋白。例如，这种抗体存在于驼类动物(骆驼、单峰驼、美洲驼、羊驼等)中，也被称为分子量约为80kD的重链抗体(Hamers-Casterman C.et al.,1993,Nature,363:446-448)。

本公开所用术语“抗体多肽”是指抗原结合蛋白或含有抗体片段(如CDR，和/或可变区序列)的多肽。抗体多肽可以包含或可以是例如重链抗体(VHH抗体)、重链抗体的可变结构域、VHH结构域或包含单个可变结构域的单域抗体。抗体多肽可进一步包含额外的结构域，例如恒定区、Fc结构域和/或特异性结合到不同抗原或不同表位的第二可变结构域。

“重链抗体”和“VHH抗体”在本公开中交替使用，是指包含两个V_H结构域并且不含轻链的抗体(Riechmann L.and Muyldermans S.,J Immunol Methods.Dec 10；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,J Biotechnol.Jun；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利号6,005,079)。虽然缺乏轻链，重链抗体有一个真正的抗原结合库(Hamers-Casterman C.et al.,1993,Nature,363:446-448；Nguyen VK.et al.,2002,Immunogenetics,54(1):39-47；Nguyen VK.et al.,2003,Immunology,109(1):93-101)。

本公开所用“VHH结构域”是指来源于重链抗体的重链可变结构域。VHH结构域表示由适应性免疫反应产生的最小已知抗原结合单元(Koch-Nolte F.et al.,2007,FASEB J.,21(13):3490-8.Epub 2007 Jun 15)。

“单域抗体”是指仅包含重链的单个可变区或轻链的单个可变区的抗体片段。在某些实施例中，单域抗体仅具有或包含重链抗体的单个重链可变结构域。

“纳米体”是指由重链抗体的一个VHH结构域和两个恒定结构域CH2和CH3组成的抗体片段。

在某些情况下，两个或多个VHH结构域可与肽连接体共价连接，以产生一个二价或多价结构域抗体。双价结构域抗体的两个VHH结构域可以靶向相同或不同抗原。

本公开所用术语“二价”是指具有两个抗原结合位点的抗体或抗体多肽；术语“单价”指仅具有一个抗原结合位点的抗体或抗体多肽；以及术语“多价”指具有多个抗原结合位点的抗体或抗体多肽。在某些实施例中，抗体或抗体多肽是二价的。

本公开所用术语“嵌合的”是指一部分重链来源于一个物种且重链其他部分来源于其他物种的抗体或抗体多肽。在说明性示例中，嵌合抗体可包含源于人类的恒定区域和来自诸如驼科的非人动物的可变区域。在某些实施例中，非人动物是一种哺乳动物，例如驼科、小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。

本公开所用术语“人源化的”是指抗体或抗体多肽包括来源于非人动物的CDRs、来源于人类的FR区以及在适用的情况下来源于人类的恒定区。

本公开所用“CTLA-4”是指来源于任何脊椎动物，包括哺乳动物如灵长类动物(如人类、猴子)和啮齿动物(如小鼠和大鼠)的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4。人CTLA-4的示例性序列包括人CTLA-4蛋白(NCBI参考序列号AAL07473.1)。CTLA-4的示例性序列包括食蟹猴(猴)CTLA-4蛋白(NCBI参考序列号XP_005574071.1)。

本公开所用术语“CTLA-4”旨在包含任何形式的CTLA-4，例如，1)天然未经处理的CTLA-4分子、“全长”CTLA-4链或天然产生的CTLA-4变体，包括，例如，剪接变体或等位基因变体；2)细胞内处理后产生的任何形式的CTLA-4；或3)通过重组方法产生的全长、CTLA-4亚单位片段(例如，截短形式，细胞外/跨膜结构域)或其修饰形式(如突变形式、糖基化/聚乙二醇化、His-tag/免疫荧光融合形式)。

本公开所用术语“抗CTLA-4”抗体多肽是指可以特异性结合CTLA-4(如人或猴CTLA-4)的抗体多肽。

本公开所用术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体和抗原之间的结合反应。在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽特异性结合人CTLA-4，其结合亲和力(K_D)≤10^-6M(例如，≤5x10^-7M、≤2x10^-7M、≤10^-7M、≤5x10^-8M、≤2x10^-8M、≤10^-8M、≤5x10^-9M、≤4x10^-9M、≤3x10^-9M、≤2x10^-9M或≤10^-9M)。本公开所用K_D指解离率与结合率之比(k_off/k_on)，其可通过使用本领域已知的任何常规方法来测定，包括但不限于表面等离子体共振方法、微尺度热泳法、高效液相色谱-质谱法和流式细胞术(如FACS)法。在某些实施例中，可以用流式细胞仪适当测定K_D值。

本公开所用术语“阻断结合”或“竞争相同表位”是指抗体多肽的在任何可检测的程度上抑制两个分子(如人类CTLA-4和抗CTLA-4抗体)之间结合作用的能力。在某些实施例中，阻断两个分子之间结合的抗体多肽抑制两个分子之间的结合作用至少为85％或至少90％。在某些实施例中，该抑制可大于85％或大于90％。

公开所用术语“表位”是指抗体结合的抗原上原子或氨基酸的特异组。如果两个抗体表现出对抗原的竞争性结合，则其可能结合抗原中相同或密切相关的表位。例如，如果抗体多肽阻止参考抗体与抗原的结合至少为85％、或至少90％、或至少95％，则该抗体多肽可被视为与参考抗体结合相同/密切相关的表位。

本领域的技术人员将认识到，在无需过度实验的情况下，通过确定给定抗体是否阻止本发明的抗体与CTLA-4抗原多肽结合，可以测定前者是否与后者(例如，驼类VHH抗体W3166、以及人源化抗体W3166-z13和W3166-z17)结合的表位相同。如果给定抗体与本发明的抗体竞争，如示出的本发明抗体与CTLA-4抗原多肽结合减少，则两种抗体结合到相同或密切相关的表位上。或者，如果本发明的抗体抑制了给定抗体与CTLA-4抗原多肽的结合，则这两种抗体与相同或密切相关的表位结合。

关于氨基酸序列的“保守替代”是指用具有类似理化性质的侧链的不同氨基酸残基替换氨基酸残基。例如，保守替代可以发生在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间、在具有中性亲水性侧链的残基(例如Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间、在具有酸性侧链的氨基酸(例如Asp、Glu)之间、在具有碱性侧链的氨基酸(例如His、Lys和Arg)之间，或在具有芳香侧链的残基中(例如Trp、Tyr和Phe)之间。如本领域所知，保守取代通常不会引起蛋白质构象结构的显著改变，因此可保持蛋白质的生物活性。

本公开所用术语“同源”和“同源的”可互相替换，且是指核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列，其序列与另一序列进行优化比对时同一性至少为80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)。

关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(％)”是指在对序列进行比对并在必要时插入空隙以达到相同氨基酸(或核酸)的最大数量后，与参考序列中氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列中氨基酸(或核酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守替代可以被视为相同的残基，也可不被认为是相同的残基。用于确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的比对可以通过使用例如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上查阅，另见Altschul S.F.et al,J.Mol.Biol.,215:403–410(1990)；Stephen F.etal,Nucleic Acids Res.,25:3389–3402(1997))、ClustalW2(可在欧洲生物信息学研究所的网站上查阅，另见Higgins D.G.et al,Methods in Enzymology,266:383-402(1996)；Larkin M.A.et al,生物信息学(英国牛津),23(21):2947-8(2007))，以及ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件等公共可用的工具实现。本领域技术人员可以使用工具提供的默认参数，或者可以例如通过选择合适的算法来定制适合于比对的参数。

本公开所用“效应器功能”是指由于抗体的Fc区与其效应物如C1复合物和Fc受体结合而产生的生物活性。示例性效应器功能包括：C1复合物上抗体与C1q相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)；效应细胞上抗体与Fc受体Fc区结合诱导的抗体依赖性细胞介导细胞毒性(ADCC)；以及吞噬作用。

本公开所用的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”病症包括预防或减轻病症、减缓病症的发生或发展速度、降低病症发展的风险、防止或延迟与病症有关的症状的发展、减轻或结束与病症有关的症状、使病症完全或部分消退、治愈某种病症、或其某些组合。

一种“分离的”物质已是被人类从天然状态中改变了的。如果一种“分离的”成分或物质在自然界中出现，则它已是被改变或从其原始环境中移除，或者两者兼而有之。例如，在活体动物中天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但如果同一个多核苷酸或多肽已经与天然状态的共存物质充分分离，从而基本上以纯净的状态存在，则该多核苷酸或多肽是被“分离的”。“分离核酸序列”是指一个分离的核酸分子的序列。在某些实施例中，“分离核酸序列”是指通过电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱法(如离子交换色谱法或反相HPLC)测定的纯度至少为60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体多肽。

本公开所用术语“载体”是指一种载体，其中可以操作性的插入编码一种蛋白质的多核苷酸以使该蛋白质得到表达。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，以使其携带的遗传元素在宿主细胞内表达。示例性载体包括质粒、噬菌粒、黏粒、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体、例如λ噬菌体或M13噬菌体、和动物病毒。用作载体的动物病毒种类包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒和巴氏病毒(例如SV40)。载体可包含多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。此外，载体可包含复制起点。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包被。载体可以是表达载体或克隆载体。本发明提供的载体(例如表达载体)包含编码抗体多肽的本公开提供的核酸序列的载体、至少一个可操作地连接到核酸序列的启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择性标记。示例性载体包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、巴氏病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

本公开所用术语“宿主细胞”是指被导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。

本公开中使用的“CTLA-4相关”疾病或症状是指由CTLA-4表达或活性增加或减少引起、加剧或以其他方式与之相关的任何疾病或症状。在某些实施例中，CTLA-4相关症状是免疫相关疾病，例如癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病或传染病、移植物抗宿主病(GVHD)或移植排斥。

本公开所用“癌症”是指任何以恶性细胞生长或肿瘤、异常增殖、浸润或转移为特征的任何病症，包括实体瘤和非实体癌(血液恶性肿瘤)，如白血病。本公开所用“实体瘤”是指肿瘤细胞和/或恶性细胞的实体团。

术语“药学可接受的”表示指定的携带者、载体、稀释剂、赋形剂、和/或盐通常在化学和/或物理上与构成该制剂的其他成分相容，并且在生理上与其接受方相容。

抗CTLA-4抗体多肽

本发明提供抗CTLA-4抗体多肽，包含抗CTLA-4单域抗体W3166的一或多(例如1、2或3)个CDR序列。

本公开所用“W3166”是指一种VHH抗体，其重链可变区包括SEQ ID NO:4的序列。

本公开所用“W3166-z13”是指一种基于W3166的人源化VHH抗体，其包含含有SEQID NO:6的序列的重链可变区。W3166-z13的抗原的亲和力与其亲本抗体W3166相比具有可比性。

本公开所用“W3166-z17”是指一种基于W3166的人源化VHH抗体，其包含含有SEQID NO:8的序列的重链可变区。W3166-z17的抗原的亲和力与其亲本抗体W3166相比具有可比性。

表1示出了抗CTLA-4单域抗体的CDR序列。表2和表3中还提供了重链可变区序列。

表1 CDR氨基酸序列

表2可变区氨基酸序列

表3可变区核苷酸序列

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽是单域抗体。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽的重链可变结构域来源于VHH结构域。VHH结构域是源于天然无轻链抗体的重链可变结构域，例如来自驼科的抗体(参见，例如WO9404678)，例如在骆驼、美洲驼、单峰驼、羊驼和原驼中。VHH结构域是单一多肽，并且是稳定的。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽的重链可变结构域来源于驼类。

已知CDR负责抗原结合，但是并非所有6个CDRs都是不可或缺或不变的。换言之，在抗CTLA-4单域抗体W3166中可以替换、改变或修饰一个或多个CDRs，仍基本上保留了其与CTLA-4的特异性结合亲和力。

在某些实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽包含W3166的重链CDR3序列。在某些实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽包含SEQ ID NO:3的重链CDR3序列。重链CDR3区位于抗原结合位点中心，因此被认为与抗原接触最多，为抗体对抗原的亲和力提供最大的自由能。重链CDR3还被认为是迄今为止在抗原结合位点上的长度、氨基酸组成和构象等方面最具多样性的CDR(Tonegawa S.Nature.302:575-81)。重链CDR3的多样性足以产生大多数抗体特异性(Xu JL,Davis MM.Immunity.13:37-45)以及理想的抗原结合亲和力(Schier R,etc.J Mol Biol.263:551-67)。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽包含合适的框架区(FR)序列，只要抗体多肽能够特异地结合到CTLA-4。表1中提供的CDR序列是从驼类抗体中获得的，但是可以使用本领域已知的合适方法例如重组技术将其嫁接到任何合适物种(例如小鼠、人类、大鼠、兔等)的任何合适的FR序列。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽是人源化的。人源化抗体多肽适用于降低人体内的免疫原性。因为非人类CDR序列被嫁接到人类或基本上是人类的FR序列，人源化抗体多肽在其可变区是嵌合的。抗体多肽的人源化基本上可以通过将非人类(例如鼠类)的CDR基因替换为人类免疫球蛋白基因中相应的人类CDR基因来实现(参见，例如，Jones etal.(1986)Nature 321:522-525；Riechmann et al.(1988)Nature 332:323-327；Verhoeyen et al.(1988)Science 239:1534-1536)。

使用本领域已知的方法，可以选择合适的人类重链可变域来实现此目的。在说明性示例中，可使用“最佳拟合”方法，其中根据已知人类可变域序列的数据库筛选或BLAST出非人(例如，驼类)抗体可变结构域序列，识别出最接近非人类检索序列的人类序列，并将其作为嫁接非人CDR序列的人源骨架(参见，例如Sims et al,(1993)J.Immunol.151:2296；Chothia et al.(1987)J.Mot.Biol.196:901)。或者，用从来源自所有人类抗体的保守序列的框架嫁接非人CDRs(参见，例如Carter et at.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285；Presta et al.(1993)J.Immunol.,151:2623)。

在某些实施例中，本公开提供的人源化抗体多肽基本上由除非人类的CDR序列以外的所有人类序列组成。在某些实施例中，如果存在可变区FRs和恒定区，则完全或基本上来自人类免疫球蛋白序列。人类FR序列和人类恒定区序列可以来源于不同的人类免疫球蛋白基因，例如，FR序列来源于一种人类抗体，恒定区来源于另一种人类抗体。在一些实施例中，人源化抗体多肽包含人FR1-4。

在某些实施例中，本公开提供的人源化抗体多肽包括W3166-z13或W3166-z17的一个或多个FR序列。

两个示例性人源化抗CTLA-4单域抗体W3166-z13和W3166-z17都保留了与CTLA-4的特异性结合亲和力，并且在这方面至少与亲本驼类抗体相当，甚至更好。

在某些实施例中，来源于人类的FR区可能包含与人类免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在某些实施例中，人FR的一个或多个氨基酸残基被来自亲本非人抗体的相应残基替代。在某些实施例中，这可能适用于使人源化抗体多肽接近非人源亲本抗体结构。在某些实施例中，本公开提供的人源化抗体多肽在每个人FR序列中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基替代，或者在重链或轻链可变结构域的所有FRs中包含不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基替代。在某些实施例中，这种氨基酸残基的变化可能只存在于重链FR区域，只存在于轻链FR区域，或同时存在于两条链中。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽包含选自由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8组成的组中的重链可变结构域。

在某些实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽包含重链可变结构域的所有或一部分。在一个实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽是由本公开提供的重链可变结构域所有或一部分所组成的单域抗体。在本领域可获得此类单域抗体的更多信息(参见，例如，美国专利号6,248,516)。

在某些实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽进一步包含免疫球蛋白恒定区。在某些实施例中，免疫球蛋白恒定区包含一条重链。重链恒定区包含CH1、铰链，和/或CH2-CH3区。在某些实施例中，重链恒定区包含一个Fc区。在某些实施例中，重链恒定区包含或是一个CH2-CH3区。

在某些实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽具有免疫球蛋白(Ig)、可选人类Ig、可选人类IgG的恒定区。恒定区可以是任意合适的同型。在某些实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽包含可诱导ADCC或CDC的IgG1同型恒定区，或具有降低或耗尽效应器功能的IgG4或IgG2同型恒定区。效应器功能例如ADCC和CDC能够导致表达CTLA-4细胞的细胞毒性。效应器功能可以通过各种方法来评估，如Fc受体结合试验、C1q结合试验和细胞裂解试验。

本公开提供的抗体多肽的结合亲和力可用K_D值表示，K_D值表示抗原与抗原结合分子结合达到平衡时的解离率与结合率之比(k_off/k_on)。抗原结合亲和力(例如K_D)可使用本领域已知的合适的方法适当地测定，包括，例如流式细胞术。在某些实施例中，可藉由流式细胞术来测定抗体多肽与抗原在不同浓度下的结合，可首先绘制所测定的平均荧光强度(MFI)与抗体浓度的关系，然后用Prims第5版(GraphPad软件，加利福尼亚圣地亚哥)通过将特定结合荧光强度(Y)及抗体浓度(X)拟合入单点饱和方程进行计算：Y＝B_max*X/(K_D+X)，其中B_max是指被测抗体多肽与抗原的最大特异性结合。

在某些实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽可特异性结合人CTLA-4，其结合亲和力(K_D)用流式细胞术测量为不超过5x10^-11M、不超过1x10^-10M、不超过5x10^-10M、不超过1x10^-9M、不超过5x10^-9M。

抗体多肽与人CTLA-4的结合还可用“半最大效应浓度”(EC₅₀)值表示，其是指当一个抗体50％的最大效果(如结合或抑制等)被观察到时的浓度。EC₅₀值可通过本领域已知的方法来测量，例如，夹心法如ELISA、免疫印迹、流式细胞术和其他结合分析。在某些实施例中，通过流式细胞术分析，本公开提供的抗体多肽以不超过0.5nM、不超过1nM、不超过2nM的EC₅₀(即50％结合浓度)与人CTLA-4特异性结合。

在某些实施例中，本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽可与食蟹猴CTLA-4交叉反应。

在某些实施例中，抗体多肽结合食蟹猴CTLA-4的结合亲和力与其结合人CTLA-4的相似。例如，示例性单域抗体W3166、W3166-z13或W3166-z17与食蟹猴CTLA-4的结合具有与人类CTLA-4相似的K_D或EC₅₀值。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽在流式细胞术下以不超过0.1nM、不超过0.5nM、不超过1nM的EC₅₀，或在流式细胞术下以不超过10nM、不超过5nM、不超过2nM或不超过1.2nM的EC₅₀与食蟹猴CTLA-4特异性结合。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽与人CTLA-4具有的特异性结合亲和力，足以用于诊断和/或治疗。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽阻断人CTLA-4与其配体CD80和CD86的结合，从而提供生物学活性，包括，例如，包括由活化的T细胞(如CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞)产生细胞因子，诱导活化T细胞(如CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞)增殖，并逆转T reg的抑制功能。示例性的细胞因子包括IL-2和IFNγ。可使用本领域已知的方法，如通过ELISA，来测定细胞因子的产生。包括[³H]胸腺嘧啶核苷掺入法等的方法也可用于检测T细胞增殖。

本公开提供的抗体多肽可以是单克隆、人源化、嵌合、重组、标记、二价或抗独特型的。重组抗体多肽是利用重组方法在体外而不是在动物体内制备的抗体多肽。

变体

本公开提供的抗体多肽还包括其各种变体。在某些实施例中，抗体多肽包含本公开提供的示例性抗体的各种类型变体，即W3166、W3166-z13和W3166-z17。

在某些实施例中，抗体多肽变体包括表1中提供的一个或多个CDR序列中、表2中提供的一个或多个可变区序列(但不在任何CDR序列中)和/或恒定区(例如Fc区)中的一个或多个修饰或替代。这类变异体保持了它们的亲本抗体的CTLA-4特异性结合亲和力，但具有一种或多种通过修饰或替代所赋予的特性。例如，抗体多肽变体可具有改善的抗原结合亲和力、提高的生产力、改善的稳定性、改善的糖基化模式、降低的糖基化风险、减少的脱氨基、减少或耗尽的效应器功能、改善的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性，和/或共轭相容性(如一个或多个引入的半胱氨酸残基)。

可使用本领域已知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”，对亲本抗体序列进行筛选，以识别待修饰或待替代的合适或优选的残基(参见，例如Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085)。简而言之，目标残基(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)可被识别并被中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替代，并且制备修饰的抗体多肽和筛选感兴趣的特性。如果在一个特定的氨基酸位置上的替代显示了一个感兴趣的功能变化，那么这个位置就可以被确定为一个潜在的修饰或替代残基。潜在残基可通过用不同类型的残留物(例如半胱氨酸残基、带正电荷残基等)替代来进一步评估。

亲和力变体

亲和力变体可能包含表1中提供的一个或多个CDR序列、一个或多个FR序列或表2中提供的重链可变区序列的修饰或替代。根据表1中的CDR序列和表2中的可变区序列，本领域技术人员可以容易地识别FR序列，因为本领域所熟知，CDR区域的两侧是可变区中的两个FR区。亲和力变体保留了与亲本抗体CTLA-4的特异性结合亲和力，甚至比亲本抗体具有更高的CTLA-4特异性结合亲和力。在某些实施例中，CDR序列、FR序列或可变区序列中的至少一个(或全部)的替代包括保守替代。

技术人员将理解，在表1和表2中提供的CDR序列和可变区域序列中，可以替换一个或多个氨基酸残基，且所得抗体多肽仍然保持与CTLA-4的结合亲和力，甚至具有改进的结合亲和力。可以使用本领域已知的各种方法来实现此目的。例如，抗体变体库(如Fab或scFv变体)可通过噬菌体展示技术生成和表达，然后筛选与人CTLA-4的结合亲和力。又如，计算机软件可以用来模拟抗体与人CTLA-4的结合，并识别抗体上形成结合界面的氨基酸残基。这些残基可在替代中进行规避以防止降低结合亲和力，或进行靶向性替代以提供更强的结合。

在某些实施例中，本公开提供的人源化抗体多肽包括一个或多个CDR序列，和/或一个或多个FR序列中的一个或多个氨基酸残基替代。在某些实施例中，亲和力变体包含在CDR序列和/或FR序列中总共不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个替代。

在某些实施例中，抗CTLA-4抗体多肽包含1、2或3个具有与表1中所列的那种(或那些)至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的CDR序列，同时还保持了与亲本抗体相近甚至更高的CTLA-4的结合亲和力水平。

在某些实施例中，抗CTLA-4抗体多肽包含一个或多个具有与表2中所列的那种(或那些)至少80％(如至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性的可变区序列，同时还保持了与亲本抗体相近甚至更高的CTLA-4的结合亲和力水平。在某些实施例中，在表2中列出的可变区序列中，总共有1到10个氨基酸被替代、插入或删除。在一些实施例中，替代、插入或删除发生在CDRs之外的区域(例如，在FRs中)。

糖基化变体

本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽还包含糖基化变体，其可以通过增加或减少抗体多肽的糖基化程度来获取。

抗体多肽可包含可附着碳水化合物部分(例如低聚糖结构)的具有侧链的一个或多个氨基酸残基。抗体的糖基化通常是N-连接或O-连接。N-连接是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基的侧链上，例如，天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸等三肽序列中的天冬酰胺残基，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。O-连接糖基化是指糖N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖或木糖中的一种附着至羟基氨基酸上，最常见的是丝氨酸或苏氨酸。天然糖基化位点的去除可以方便地完成，例如，通过改变氨基酸序列，使得存在于序列中的上述三肽序列(对于N-连接糖基化位点)或丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接糖基化位点)之一被替代。通过引入这种三肽序列或丝氨酸或苏氨酸残基，可以以类似的方式创建新的糖基化位点。在某些实施例中，本公开提供的抗体的重链CDR2包含N55Q替代(kabat编号)，使得潜在的糖基化位点被移除。

半胱氨酸工程变体

本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽还包含半胱氨酸工程变体，其包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。

游离的半胱氨酸残基不是二硫键桥的一部分。半胱氨酸工程变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤代乙酰基，在设计的半胱氨酸位点与例如细胞毒性和/或成像化合物、标签或放射性异构体等结合。本领域已知设计抗体多肽以引入游离半胱氨酸残基之方法，参见，例如WO2006/034488。

变体

本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽还包含Fc变体，在其Fc区和/或铰链区包含一个或多个氨基酸残基修饰或替代。

在某些实施例中，抗CTLA-4抗体多肽包含一个或多个可改善与新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合的氨基酸替代。这种变体的药代动力学半衰期较长，因为其在酸性pH条件下与FcRn结合，从而使其免于溶酶体的降解，然后转位并释放出细胞。在本领域已熟知设计抗体多肽以改善与FcRn的结合亲和力的方法，参见，例如，Vaughn,D.et al,Structure,6(1):63-73,1998；Kontermann,R.et al,抗体工程，第1卷第27章：改进PK的Fc区域工程，斯普林格出版，2010；Yeung,Y.et al,Cancer Research,70:3269-3277(2010)；and Hinton,P.et al,J.Immunology,176:346-356(2006)。

在某些实施例中，抗CTLA-4抗体多肽包含改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的一个或多个氨基酸替代。Fc区域(例如CH2结构域)的某些氨基酸残基可被替代以提供改变(例如增强、降低或耗尽)的ADCC活性。或者或另外，抗体上的碳水化合物结构可以变化以改变(例如增强、减少或耗尽)ADCC活性。本领域已经描述了通过抗体工程改变ADCC活性的方法，参见，例如，Shields RL.et al.,J Biol Chem.2001.276(9):6591-604；Idusogie EE.etal.,J Immunol.2000.164(8):4178-84；Steurer W.et al.,J Immunol.1995,155(3):1165-74；Idusogie EE.et al.,J Immunol.2001,166(4):2571-5；Lazar GA.et al.,PNAS,2006,103(11):4005-4010；Ryan MC.et al.,Mol.Cancer Ther.,2007,6:3009-3018；Richards JO,.et al.,Mol Cancer Ther.2008,7(8):2517-27；Shields R.L.et al,J.Biol.Chem,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.et al,J.Biol.Chem,2003,278:3466-3473。

在某些实施例中，抗CTLA-4抗体多肽包含改变补体依赖性细胞毒性(CDC)的一个或多个氨基酸替代，例如，通过改善或减少C1q结合和/或CDC(参见，例如，WO99/51642；Duncan&Winter Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821)；以及关于Fc区域变体其他示例的WO94/29351。

在某些实施例中，抗CTLA-4抗体多肽在Fc区域的界面上包含一个或多个氨基酸替代，以加速和/或促进异源二聚化。这些修饰包括将突起引入到第一Fc多肽中并且将空腔引入到第二Fc多肽中，其中突起可以定位在空腔中以促进第一和第二Fc多肽的相互作用以形成异二聚体或复合物。本领域已知利用这些修饰产生抗体的方法，例如，如美国专利号5,731,168中所述。

多种技术可用于产生VHH或单域抗体。例如，可使用本领域已知的方法获得VHH，例如通过免疫骆驼并从中获得杂交瘤，或通过使用本领域已知的分子生物学技术克隆单域抗体库并随后使用噬菌体展示来选择获得VHH。

在本发明的另一方面，本公开提供的抗体多肽可包含两个或多个已连接的单域抗体。单域抗体的序列可能相同，并且针对同一靶点或抗原。根据所连接的VHH的数量，抗体多肽可以是二价(2VHHs)、三价(3VHHs)、四价(4VHHs)或具有更高价的分子。

共轭物

在某些实施例中，抗CTLA-4抗体多肽进一步包含共轭基团。共轭基团可与抗体多肽连接。共轭基团是可以附着在抗体多肽上的非蛋白质部分。可以预期可以有多种共轭基团与本公开提供的抗体多肽连接(参见，例如，“共轭疫苗”，献给微生物学和免疫学，J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.编辑，纽约卡格出版社，(1989))。这些共轭基团可通过共价结合、亲和结合、插层、配位结合、络合、联合、混合或添加等方法与抗体多肽连接。

在某些实施例中，本公开公布的抗体多肽可被设计成包含表位结合部分之外的特定位点，该表位结合部分可用于与一个或多个共轭基团结合。例如，这样的位点可以包括一个或多个活性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以促进与共轭基团的共价连接。

在某些实施例中，抗体可以间接地或通过另一个共轭基团连接到某个共轭基团。例如，抗体多肽可以与生物素共轭，然后间接地与第二共轭物共轭，该第二共轭物与阿维丁共轭。共轭物可以是清除修饰剂、毒素(例如，化疗剂)、可检测标签(例如，放射性同位素、镧系物、发光标签、荧光标签或酶底物标签)或纯化基团。

“毒素”可以是任何对细胞有害或能损害或杀死细胞的试剂。示例性的毒素包括，但不限于，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、MMAE、MMAF、DM1、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌、米托蒽醌、米特拉霉素、放线菌素D、1-脱氢蛋白甾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶去甲肼)、烷基化剂(例如，三氯甲烷、氯丁硫脲、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、丁磺酰亚胺、二溴硝基苯、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类(例如，柔红霉素(原多诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，达金霉素(原名放线菌素)、博莱霉素、米特拉霉素和蒽霉素(AMC))，抗核分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)、拓扑异构酶抑制剂和微管蛋白粘合剂。

示例性的可检测标签可包括荧光标签(例如，荧光素、罗丹明、丹西尔、藻红蛋白或德州红)、酶底物标签(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、糖化酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如，¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S、³H、¹¹¹In、¹¹²In、¹⁴C、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁸⁶Y、⁸⁸Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、²¹¹At、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi和³²P、其他镧系元素)、发光标记、发色基团、地高辛素、生物素/亲和素、用于检测的DNA分子或金。

在某些实施例中，共轭基团可以是有助于增加抗体半衰期的清除修饰剂。说明性示例包括水溶性多聚体，例如PEG、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。多聚体可以是任意分子量的，并且可以是有支链的或无支链的。附着在抗体上的多聚体的数量可能会有所不同，如果附着了一种以上的多聚体，则其可以是相同或不同的分子。

在某些实施例中，共轭基团可以是纯化的基团，如磁珠。

在某些实施例中，本公开提供的抗体多肽可用作共轭的基底。

多核苷酸和重组方法

本发明提供了编码抗CTLA-4抗体多肽的多核苷酸。

本公开所用术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其单链或双链形式的多聚体。除非特别限定，该术语包括含有已知天然核苷酸类似物的多核苷酸，其具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于天然生成的核苷酸的方式代谢。除非另有说明，特定多核苷酸序列还隐含地包含其保守修饰的变体(例如，简并密码子替代)、等位基因、同源序列、SNPs和互补序列以及明确表明的序列。具体地说，简并密码子替代可以通过用混合碱基和/或脱氧核糖残基替代一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置而产生的序列来实现(参见Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；and Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

在某些实施例中，多核苷酸包含一个或多个核苷酸序列，如SEQ ID No:5、7、9(例如，至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)，和/或其具有至少80％序列同一性的同源序列、和/或其仅具有简并替代的变体，并对本公开提供的示例性抗体的可变区进行编码。使用常规程序(例如，使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)可轻易地分离编码单克隆抗体的DNA并对其进行测序。编码DNA也可以通过合成的方法获得。

使用本领域已知的重组技术，可以将编码抗CTLA-4抗体多肽的分离多核苷酸(例如，包括表3所示的序列)插入载体中，以进一步克隆(扩增DNA)或表达。有许多载体可用。载体组件通常包括但不限于以下一个或多个：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。

本发明提供载体(例如，表达载体)，其包含编码抗体多肽的本公开提供的核酸序列可操作地连接到核酸序列的至少一个启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)，和至少一个选择性标记。示例性载体包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、巴氏病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。

包含编码抗体多肽的多核苷酸序列的载体可被导入到宿主细胞以进行克隆或基因表达。本公开所述载体中的克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上述原核生物、酵母或高等真核生物细胞。适于该目的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科如大肠杆菌、例如E.coli、肠杆菌、厄尔文氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌、沙门氏菌、例如鼠伤寒沙门氏菌、沙雷菌、例如如粘质沙雷菌、和志贺氏菌，以及杆菌、例如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌、假单胞菌、例如铜绿假单胞菌、和链霉菌。

除原核生物外，丝状真菌、酵母等真核微生物是表达抗CTLA-4抗体多肽的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母，或普通面包酵母，是最常用的低等真核宿主微生物。然而，许多其他属、种和菌株在本公开中也很常见和使用，例如波姆裂殖酵母；克鲁维酵母宿主，例如，如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(ATCC 24,178)、沃尔蒂克鲁维酵母(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906)、耐温克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母；耶罗维亚酵母(EP 402,226)；甲醇酵母(EP 183,070)；假丝酵母；里氏木霉(EP 244,234)；粗糙脉孢霉；许旺酵母属例如许旺酵母；和丝状真菌例如，如脉胞菌、青霉菌、弯颈霉、和曲霉菌宿主例如构巢曲霉菌和黑曲霉菌。

本公开提供的用于表达糖基化抗体或抗原片段的合适宿主细胞源于多细胞生物。示例性无脊椎动物细胞包括植物细胞和昆虫细胞。许多来自宿主的杆状病毒株和变种以及相应的许可昆虫宿主细胞已经被鉴定出来，例如草地贪夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊子)、黑腹果蝇(果蝇)和家蚕。用于转染的多种病毒株都可公开获得，例如，苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并且根据本发明，这些病毒可用作本公开中的病毒，尤其是用于转染草地贪夜蛾细胞。培养的棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞也可以用作宿主。

然而，人们对脊椎动物细胞的兴趣最大，脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的传代已成为常规方法。示例性的可用哺乳动物宿主细胞系为SV40转化猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL 1651)；人胚胎肾系(293或为悬浮培养生长亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.GenVirol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK,，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HepG2)。在某些优选实施例中，宿主细胞是293F细胞。

宿主细胞用上述表达或克隆载体转化，以产生抗CTLA-4抗体多肽，并在以诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因为目的适当改良的常规营养培养基中进行培养。在另一实施例中，抗体多肽可藉由本领域已知的同源重组产生。

用于产生本公开提供的抗体多肽的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售培养基例如Ham's F10(西格玛)、最低必需培养基(MEM)(西格玛)、RPMI-1640(西格玛)和Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(西格玛)适用于培养宿主细胞。此外，任何在Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979)，Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980)，美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国再版专利30,985中描述的培养基可用作培养宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种可根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸腺嘧啶核苷)、抗生素(如庆大霉素药物)、微量元素(定义为无机化合物，通常以微摩尔范围内的终浓度存在)，以及葡萄糖或等效能源。本领域技术人员已知也可包括适当浓度的任何其他必要的补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是先前选择用于表达的宿主细胞的培养条件，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。

当使用重组技术时，抗体多肽可在胞内、间质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体是在细胞内产生的，作为第一步，要通过例如离心或超滤去除微粒碎片，宿主细胞或裂解的碎片。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了一种分离分泌到大肠杆菌间质空间的抗体的方法。简而言之，在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻细胞糊约30分钟。细胞碎片可通过离心法去除。当抗体分泌到培养基中时，通常首先使用诸如Amicon或密理博Pellicon超滤装置的市售蛋白质浓缩过滤器浓缩来自此类表达系统的上清液。在上述任何步骤中，可包括蛋白酶抑制剂例如PMSF以抑制蛋白质水解，并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。

从细胞制备的抗CTLA-4抗体多肽可使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳法、透析法、DEAE纤维素离子交换色谱法、硫酸铵沉淀法、盐析法和亲和层析法进行纯化，亲和层析法是优选的纯化技术。

在某些实施例中，固定在固相上的蛋白A被用于抗体多肽的免疫亲和纯化。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同型。蛋白A可用于纯化基于人类γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有的小鼠同型和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:15671575(1986))。亲和配体所附着的基质通常是琼脂糖，但也有其他基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质，如可控孔玻璃或多聚(苯乙烯二乙烯基)苯，具有更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，新泽西菲利普斯堡)可用于纯化。根据要回收的抗体，也可使用蛋白质纯化的其他技术，如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅上的色谱、阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的肝素SEPHAROSE^TM色谱法、色谱聚焦法、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可使用洗脱缓冲液(pH值在约2.5-4.5之间)对包含感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱分析，优选在低盐浓度(例如，从约0-0.25M盐)下进行。

药物成分

本发明进一步提供了包含本公开提供的抗CTLA-4抗体多肽的药物组合物和一种或多种药学上可接受的载体。

用于本公开所公开的药物组合物中的药学上可接受载体可包括，例如，药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性载体、非水性载体、抗菌剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/分散剂、隔离剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域已知的其他成分或其各种组合。

合适的成分可以包括例如抗氧化剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，例如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如蛋氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙醇酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基甲苯、丁基化羟甲基甲苯、和/或没食子酸丙酯。如本公开所公开的，将一种或多种抗氧化剂例如蛋氨酸包含在含有如本公开所提供的抗体多肽和共轭物的组合物中可降低抗体多肽的氧化。这种氧化的降低可以防止或减少结合亲和力的丧失，从而提高抗体的稳定性，最大限度地延长保质期。因此，在某些实施例中，提供的组合物包含本公开所公开的一种或多种抗体多肽以及一种或多种抗氧化剂例如蛋氨酸。进一步提供的是通过将抗体多肽与一种或多种抗氧化剂例如蛋氨酸混合来防止本公开所述抗体多肽的氧化、延长其保质期和/或提高其功效的方法。

为进一步说明，药学上可接受载体可包括例如水性载体例如氯化钠注射液、林格氏注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液或葡萄糖和乳酸林格氏注射液、非水性载体例如植物源固定油、棉籽油、玉米油，芝麻油或花生油、抑制细菌或抑制真菌浓度的抗菌剂、等渗剂例如氯化钠或葡萄糖、缓冲剂例如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液、抗氧化剂例如硫酸氢钠、局部麻醉剂例如盐酸普鲁卡因、悬浮剂和分散剂例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮、乳化剂例如聚山梨酯80(吐温-80)、隔离剂或螯合剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载体使用的抗菌剂可添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述多剂量容器包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄乙溴铵。合适的赋形剂可包括例如水、生理盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或诸如乙酸钠、山梨醇酐单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或环糊精之类的试剂。

药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、丸剂、胶囊、片剂、缓释制剂或粉末剂。口服制剂可包括标准载体，如医药级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

在某些实施例中，药物组合物配制成可注射组合物。可注射药物组合物可制备成任何常规形式，例如液体溶液、悬浮液、乳液或适合产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射用制剂可包括准备注射的无菌和/或非热溶液、在使用前准备好与溶剂混合的无菌干溶性产品、例如冻干粉末，包括皮下药片、准备注射的无菌悬浮液、在使用前准备与载体结合的无菌干不溶性产品，以及无菌和/或非发热乳液。溶液可以是水溶液，也可以是非水溶液。

在某些实施例中，单位剂量的肠外制剂包装在安瓶、小瓶或带针头的注射器中。肠外给药的所有制剂应无菌且不发热，如本领域已知和实施的。

在某些实施例中，通过将本公开所公开的抗体多肽溶解在合适的溶剂中制备无菌冻干粉末。溶剂可含有提高稳定性的赋形剂，或粉末的其他药理成分，或由该粉末制备的重组溶液。可使用的赋形剂包括但不限于水、葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他合适的试剂。溶剂可含有诸如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂，在一个实施例中，该缓冲剂约为中性pH。随后对溶液进行无菌过滤，然后在本领域技术人员已知的标准条件下进行冻干，可提供理想的配方。在一个实施例中，所得溶液将分配到用于冻干的小瓶中。每一小瓶可含有单剂量或多剂量的抗CTLA-4抗体多肽或其组合物。可接受小瓶的过量灌装，其量高于一剂量或一组剂量所需的量(例如，约10％)，以便于准确提取样本和准确给药。冻干粉可在适当的条件下储存，例如在约4℃至室温下。

用注射用水对冻干粉进行重组，可提供一种用于肠外给药的制剂。在一个实施例中，为了重组，将无菌和/或不发热的水或其他液体适合的载体添加到冻干粉末中。确切的剂量取决于所选择的治疗方法，并且可以根据经验确定。

使用方法

本发明还提供了治疗方法，包括：向需要的受试者施用治疗有效量的抗体多肽，从而治疗或预防CTLA-4相关的病症或疾病。在一些实施例中，CTLA-4相关的病症或疾病是癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、传染病、移植物抗宿主病(GVHD)或移植排斥。

示例性癌症包括但不限于淋巴瘤、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统癌、乳腺癌、子宫或子宫内膜癌、直肠癌、食管癌、头颈癌、肛门癌、胃肠道癌、上皮内肿瘤、肾(kidney)癌或肾细胞(renal)癌、白血病、肝癌、肺癌(非小细胞肺癌或小细胞肺癌)、黑色素瘤、骨髓瘤、胰腺癌，前列腺癌、肉瘤、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、阴茎癌、儿童实体瘤、肿瘤血管瘤、脊柱肿瘤、垂体腺瘤或表皮样癌。

示例性自身免疫性疾病包括但不限于获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，一种具有自身免疫成分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞病、心肌病、腹腔积液性肝炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性天疱疮、冷凝集素病，CREST综合征，克罗恩病，德戈斯病，青少年皮肌炎、盘状狼疮，原发性混合冷球蛋白血症，纤维肌痛，纤维肌炎，格雷夫斯病、格林-巴利综合征，桥本甲状腺炎，特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖性糖尿病、青少年慢性关节炎(斯蒂尔氏病)、青少年类风湿性关节炎，梅尼埃病，混合性结缔组织病，多发性硬化、重症肌无力、狼疮性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多发性多发综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎，原发性无丙种球蛋白血症，原发性胆汁性肝硬化，银屑病，银屑病性关节炎、雷诺氏现象，雷特综合征，风湿热，类风湿关节炎、结节病，硬皮病(进行性系统性硬化症(PSS)，也称为系统性硬化症(SS))、干燥综合征，硬汉综合征，系统性红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。

炎症疾病，包括慢性和急性炎症疾病。示例性炎症疾病包括阿尔茨海默病、哮喘、特应性过敏、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病视网膜病变和呼吸机诱导的肺损伤。

示例性传染病包括但不限于真菌感染、寄生虫/原生动物感染或慢性病毒感染，例如，疟疾、球虫病、支原体病、组织胞浆菌病、甲真菌病、曲菌病、芽生菌病、白色念珠菌病、副球虫病、微孢子虫病、棘阿米巴角膜炎、阿米巴虫病、蛔虫病、巴贝虫病、龟头虫病、贝氏蛔虫病、恰加斯病、支睾吸虫病、隐孢子虫病、双肺吸虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、象皮病、蛲虫病、片形吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢子虫病、钉螺热、利什曼病、莱姆病、变角绦虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥螨病、血吸虫病、昏睡病、线虫病、绦虫病、弓形虫病、旋毛虫病、鞭虫病、锥虫病、蠕虫感染、乙型肝炎(HBV)感染、丙型肝炎(HCV)感染、疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、艾滋病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、人乳头状瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒I、人类免疫缺陷病毒II、卡波西-韦斯特肉瘤相关疱疹病毒流行病、薄环病毒、人T淋巴细胞营养型病毒I型、人T淋巴细胞营养病毒Ⅱ型、水痘带状疱疹、JC病毒或BK病毒。

本公开提供的抗体多肽的治疗有效量将取决于本领域已知的各种因素，例如体重、年龄、既往病史、现用药物、受试者的健康状况和交叉反应的可能性、过敏性、敏感性和不良副作用，以及给药途径和疾病发展程度。如这些和其他情况或要求说明，剂量可由本领域的普通技术人员(例如医生或兽医)按比例减少或增加。

在某些实施例中，如本公开所提供之抗体多肽可以约0.01mg/kg至约100mg/kg之治疗有效剂量给药。在这些实施例中的某几个中，以约50mg/kg或以下的剂量施用抗体多肽，并且在这些实施例中的某几个中，剂量为10mg/kg或以下、5mg/kg或以下、3mg/kg或以下、1mg/kg或以下、0.5mg/kg或以下、或0.1mg/kg或以下。在某些实施例中，给药剂量可在治疗过程中改变。例如，在某些实施例中，初始给药剂量可高于随后给药剂量。在某些实施例中，给药剂量可在治疗过程中根据受试者的反应而变化。

可以调整剂量方案，以提供最佳预期反应(例如，治疗反应)。例如，可以给药一个剂量，也可以随时间给药几个分开的剂量。

本公开所公开之抗体多肽可藉由本领域已知的任何路径给药，例如经肠外(例如皮下、腹腔内、静脉内，包括静脉输注、肌内或皮内注射)或非肠外(例如经口、鼻内、眼内、舌下、直肠，或局部)路线。

在某些实施例中，本公开公开的抗体多肽可单独施用或与一种或多种额外治疗手段或药剂联合施用。例如，本公开公开的抗体多肽可与另一治疗剂(例如，化疗剂或抗癌药物)联合施用。

在某些实施例中，如本公开所公开的与一种或多种附加治疗剂联合施用的抗体多肽可以与一种或多种其它治疗剂同时给药，并且在这些实施例中的某几个中，抗体多肽和附加治疗剂可作为相同的药物成分施用。然而，与另一治疗剂“联合”施用的抗体多肽不必与该药剂同时施用或在药剂的同一的成分中施用。在另一药剂之前或之后施用的抗体多肽被视为与该药剂“联合”施用(如本公开所使用的短语)，即便该抗体多肽及第二药剂是经由不同途径给药的。在可能的情况下，与本公开公开的抗体多肽组合施用的附加治疗剂根据附加治疗剂的产品信息表中所列的一览表，或根据医生桌上参考手册2003(医生桌上参考手册，第57版；医药经济公司；ISBN:1563634457；第57版(2002年11月))或本领域公知的规程来施用。

本发明进一步提供了使用抗CTLA-4抗体多肽的方法。

在某些实施例中，本发明提供了样品中检测CTLA-4存在或含量的方法，包括将样品与本公开提供的抗体多肽接触，并测定样品中CTLA-4的存在或含量。

在某些实施例中，本发明提供了一种在受试者中诊断CTLA-4相关疾病或病症的方法，包括：a)将从受试者获得的样本与本公开提供的任何抗体多肽接触；b)测定样本中CTLA-4的存在或含量；c)关联CTLA-4的存在和受试者的CTLA-4相关疾病或病症。

在某些实施例中，本发明提供了包含本公开提供的抗体多肽的试剂盒，所述抗体多肽可选与可检测基团结合。该试剂盒可用于检测CTLA-4或诊断CTLA-4相关疾病。

在某些实施例中，本发明还提供了本公开提供的抗体多肽在制备用于治疗受试者的CTLA-4相关疾病或病症的药物、制备用于诊断CTLA-4相关疾病或病症的诊断试剂中的用途。

优点

本公开提供的抗体多肽在许多方面优于现有疗法。例如，本公开提供的抗体多肽对细胞表面人CTLA4具有更好的亲和力，与伊匹单抗相比，可更有效地阻断CTLA4与细胞表面CD80和CD86的结合，并且更有效地诱导hCTLA4转染细胞的ADCC效果。

以下示例的提供是为了更好地说明所要求保护的发明，并且不应被解释为限制本发明的范围。下文所述的全部或部分特定组合物、材料和方法均属于本发明的范围。这些特定组合物、材料和方法并非旨在限制本发明，而是仅用于说明属于本发明范围内的具体实施例。本领域技术人员可以在不运用发明能力和不脱离本发明范围的情况下开发等效的组合物、材料和方法。应当理解，在仍然保持在本发明的范围内的同时，可以对本公开所描述的过程作出许多变化。发明人的意图是将这些变化包括在本发明的范围内。

实施例1：材料和方法

1.1蛋白制备

1.1.1人CTLA-4和食蟹猕猴(食蟹猴)CTLA-4ECD蛋白的制备

将人和食蟹猴(cyno)的CTLA-4胞外结构域(ECD)基因和6-组氨酸(6xHis)标签或Fc标签克隆到表达载体pcDNA3.3中，然后用Expi293表达系统试剂盒(英潍捷基A14524)转染Expi293细胞(英潍捷基A14527)。将细胞培养在Expi293表达培养基(英潍捷基A1435101)中，置于含有8％的CO2的37℃增湿培养箱中，在轨道摇床平台上以135rpm摇转。所得上清液用于蛋白质纯化。His标签蛋白用Ni-NTA柱(GE医疗17-5247-01)纯化，Fc标签蛋白用蛋白A柱(GE医疗17-5438-02)纯化。

1.1.2基准抗体

参考基准抗体W316-BMK1

抗CTLA-4抗体伊匹单抗可变区(VH和VL)的DNA序列(序列基于美国专利US6984720B1中的克隆10D1)由生工科技(中国上海)合成，然后克隆到具有人IgG1或人IgG4恒定区的改良pcDNA3.4表达载体中。将包含VH和BL基因的质粒共转染至Expi293细胞。将细胞培养5天，收集上清液进行抗体蛋白纯化。IgG1形式的抗CTLA-4基准W316-BMK1抗体在以下实施例中被简称为“W316-BMK1”，除非另有说明(例如，为区别于其IgG4对应物“W316-BMK1.IgG1”，在少数情况下称为“W316-BMK1.IgG4”)。

1.1.3抗体纯化

收集含有抗体蛋白的细胞培养上清液调节pH至7.0后装入蛋白A柱。抗体用甘氨酸-HCl(pH 2.5)洗脱，然后立即用1M Tris中和。用Nano Drop测量抗体浓度。用SDS-PAGE和HPLC-SEC测定蛋白纯度。

1.2.细胞和细胞系制备

1.2.1.工程细胞系的制备

用包含全长人CTLA-4，食蟹猴CTLA-4，人CD80或人CD86相应的编码基因的pcDNA3.3表达质粒通过Lipofectamine2000(英潍捷基)转染CHO-K1或293F细胞。细胞用含有合适筛选压力的培养基培养。采用有限稀释法筛选人CTLA-4、CD80、CD86高表达稳定细胞系和食蟹猴CTLA-4细胞池。

1.2.2细胞系的培养

用T-75烧瓶和含10％FBS和8μg/ml杀稻瘟菌素的完全生长培养基F12-K继代培养CHO-K1细胞系。每隔2～3天更新培养基，用胰蛋白酶EDTA溶液分离CHO-K1细胞。为了长期保存，细胞被冷冻在含有5％(v/v)DMSO的完全生长培养基中，并保存在液氮气相中。

1.3 VHH的生成

1.3.1免疫

为了诱导一只美洲驼体内针对CTLA-4的体液免疫反应，该动物每隔一至两周接受共七剂CTLA-4ECD蛋白质的交替皮下注射。每次注射的剂量范围为500ug到1000ug。

1.3.2血清滴度检测

用ELISA法检测免疫前血清和免疫血清中CTLA-4特异性抗体效价。用1μg/mlCTLA-4ECD蛋白包被ELISA平板(Nunc，美国明尼苏达州罗切斯特)，并在4℃下培养过夜。封闭和漂洗后，加入免疫前血清和免疫血清的系列稀释液，在室温下培养1h，然后在室温下加入山羊抗美洲驼IgG HRP(Novas生物，美国科罗拉多州利特尔顿市)30分钟。漂洗后，加入TMB底物，用2M HCl停止反应。使用微板检测器(美谷分子仪器)读取450nm处的吸光度。

1.3.3噬菌体文库构建

最后一次注射后7天，收集50毫升血液，在Ficoll-Hypaque(GE医疗，英国小查尔丰)上通过密度梯度离心制备外周血单个核细胞(PBMC)。将1x10⁷/ml PBMCs与生物素化CTLA4-ECD蛋白偶联微球在4℃孵育30分钟，并通过MACS分离(美天旎生物技术)纯化与微球结合的细胞。用RNeasy Plus Mini试剂盒(凯杰)从所选细胞中提取总RNA，并用SuperScript III第一链合成SuperMix(英潍捷基)转录成cDNA。以纯化的cDNA为模板，用信号肽结构域特异性引物和CH2结构域特异性引物扩增Ig重链编码基因片段。扩增得到约900bp(代表传统IgG)和700bp(代表缺乏CH1结构域的纯重链IgG)的PCR片段。然后在琼脂糖凝胶上对两类重链编码基因进行大小分离，并用QIAquick凝胶提取试剂盒(凯杰，德国希尔登)纯化只编码重链IgG的基因。以纯化后的片段作为模板，用框架1(FR1)和框架4(FR4)特异性引物对扩增VHH库。该扩增程序在FR1的5'端引入了Sfi I限制位点，在FR4的3'端引入了Not I限制位点。PCR扩增出的VHH基因库约300-400bp，加入琼脂糖凝胶并用QIAquick凝胶抽提试剂盒进行纯化。然后用Sfi I和Not I切割纯化片段，并用QIAquick-PCR纯化试剂盒(凯杰，德国希尔登)纯化。VHH基因片段最终连接到噬菌体载体pFL249中，并电转化到大肠杆菌TG1中。转化后，TG1细胞在SOC培养基中以200rpm振荡培养1h，然后将大肠杆菌TG1接种于添加有100μg/mL Carb和1％(w/v)葡萄糖的2YT琼脂平板上，在37℃下培养过夜。第二天，将菌落刮入添加有1/3(v/v)80％甘油的液体2YT培养基中，并在-80℃下保存。

1.3.4淘选和筛选

为了筛选与人CTLA4特异结合的VHH，应用噬菌体展示技术对固定的CTLA-4ECD蛋白进行筛选。简单地说，将10ug CTLA-4ECD蛋白质包被在免疫板(Nunc，美国明尼苏达州罗切斯特)上，在1ml包被缓冲液(Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.2)中于4℃过夜。用10％脱脂牛奶封闭1h后，加入1x10¹²噬菌体库，室温孵育2h。用含0.5％(v/v)吐温20(PBST)的PBS漂洗10次后，丢弃非特异性吸附的噬菌体，用pH2.2的甘氨酸-HCl洗脱靶特异性噬菌体，并用1MTris-HCl pH8.0中和以感染指数生长期G1细胞，37℃孵育45min，不用摇晃。将感染的TG1细胞置于2YT琼脂平板上，在37℃下培养过夜。第二天，用3ml 2YT将菌落从平板上刮下，加入1/3(v/v)80％甘油，在-80℃下冷冻。将刮取的菌库接种到含100μg/ml氨苄西林的2YT-Carb中，用辅助噬菌体M13KO7在含50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG的2YT培养基中进行噬菌体挽救，以用作下一轮淘选。

经过所需的淘洗步骤，刮去培养在平板上的噬菌体感染的TG1细胞菌落，并提取含有VHH片段的pFL249噬菌粒。将pFL249质粒用Sfi I和Not I消化，构建VHH表达载体，并将其连接到含有6-组氨酸和c-Myc标签基因的线性表达载体pET-bac中。将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞内，在ZYM-5052培养基中25℃培养48h，转速180rpm。用ELISA和FACS检测his-和c-Myc标签融合VHH蛋白在BL21培养上清中的表达。

ELISA法作为第一筛选方法，用于检测VHH大肠杆菌培养上清与CTLA-4ECD蛋白的结合。简而言之，用CTLA-4ECD蛋白对96孔板(Nunc)4℃下包被过夜。封闭和漂洗后，将3倍稀释的大肠杆菌上清液转移到涂层板上，在室温下培养1h。然后漂洗培养皿，随后与抗体山羊抗c-Myc-HRP(Bethyl)二抗孵育1h。漂洗后，加入TMB底物，用2M HCl停止显色反应。使用微板检测器(美谷分子仪器)读取450nm处的吸光度。

为了确认CTLA-4抗体与细胞膜上表达的构象CTLA-4分子的天然结合，对转染CTLA-4的293F细胞系和阴性对照的亲代293F细胞系进行流式细胞术分析。首先用VHH大肠杆菌上清液样品在96孔U底培养板(BD)中以1×10⁵个细胞/孔的密度在4℃下培养1h，然后在4℃下用小鼠抗c-Myc-生物素二抗(Sigma)孵育30分钟，然后在4℃黑暗中孵育20分钟。在每个步骤之间进行2次冲洗，然后将细胞重悬在1X PBS/1％BSA中进行流式细胞术(Intellicyt)分析。

1.3.5测序

经ELISA和FACS筛选筛出的阳性大肠杆菌克隆送至铂尚(中国上海)进行VHH基因核苷酸测序。测序结果使用CLC主工作台(凯杰，德国希尔顿)进行分析。

1.3.6 VHH蛋白生成

携带VHH基因的BL21大肠杆菌克隆体在40ml ZYM-5052培养基中培养48小时，转速为230转/分。用SDS-PAGE法言之his-和c-Myc标签融合VHH蛋白在BL21上清液中的表达，并用Ni-NTA柱纯化。用SDS-PAGE和SEC-HPLC法测定VHH的纯度。对于低上清液表达的克隆，采用超声波(新芝，中国宁波)破碎大肠杆菌细胞释放可溶性VHH蛋白，纯化全细胞裂解液。

1.3.7 VHH-Fc(hIgG1)嵌合蛋白的生成

将相关克隆转化为VHH-Fc hIgG1融合抗体。简而言之，用含有合适限制位点的VHH特异性克隆引物从pET-bac载体中扩增VHH基因，然后通过融合克隆到修饰的人Fc(IgG1)表达pcDNA3.3载体以创建相应的VHH-Fc hIgG1嵌合抗体克隆。瞬时转染Expi-293细胞以表达嵌合抗体。收集含有抗体的培养上清液并用蛋白A色谱法进行纯化。

1.4抗体人源化和PTM的移除

选择对CTLA-4具有高亲和力和特异性的VHHs进行人源化。将“最佳匹配”法用于VHH链的人性化。利用人生殖系V基因数据库对VHH框架区的氨基酸序列进行冲击，利用Kabat CDR定义，用VHH CDR序列代替最佳匹配的人类CDR序列，生成人源化VHH序列。回复突变框架区的某些残基，使其与VHH的亲和力保持一致。反向翻译人源化基因，优化密码子以适应哺乳动物的表达，并由GENEWIZ合成。用含有合适限制性位点的克隆引物对这些基因进行重新扩增，并克隆到改良的pcDNA3.3载体上，以表达与人IgG1 Fc区相连的人源化VHHs。同时，用Q(N55Q，kabat编号)替代W3166的CDR2中的翻译后修饰(PTM)N-连接糖基化残基N55(kabat编号)。通过SPR检测CTLA-4的结合，获得了两个人源化和PTM移除的克隆W3166-z13和W3166-z17。W3166VHH抗体与人IgG1同型Fc融合，本公开简称“W3166-z13”和“W3166-z17”。

1.5体外鉴定

1.5.1人CTLA-4的结合(ELISA和FACS)

对于ELISA结合，用1.0μg/ml的自制人CTLA4 ECD蛋白预包被96孔板(Nunc)，在4℃下过夜。用2％BSA-PBS封闭后，将系列稀释的抗体加入每个孔中，在室温下孵育1小时。用HRP标记的羊抗人IgG(Bethyl A80-304P)作为二抗，孵育1h。用TMB底物显色，再用2N-HCl终止。用微板分光光度计在450nm处读取吸光度(

M5e)。

对于FACS结合，将表达CTLA-4的工程人CTLA-4表达细胞以1×10⁵个细胞/孔接种在U底96孔板(COSTAR 3799)中。在4℃下以1500rpm离心4分钟后，移除上清液并将系列稀释于1％BSA-DPBS中抗体添加到细胞中。在4℃下孵育培养皿1小时。漂洗后，添加PE标记的山羊抗人IgG抗体(Jackson 109-115-098)，并在4℃下孵育1小时。用流式细胞仪检测抗体与细胞的结合情况，用FlowJo分析抗体的平均荧光强度(MFI)。

图1A和1B显示，W3166-z13和W3166-z17以剂量依赖的方式分别与细胞表面的人CTLA-4和固定的人CTLA-4ECD蛋白结合。W3166-z13和W3166-z17与细胞表面人CTLA-4结合，EC₅₀值分别为0.3252nM和0.2975nM；相比之下，W316-BMK1以0.5898nM的EC₅₀与细胞表面的人CTLA-4结合。W3166-z13和W3166-z17与固定的人CTLA-4ECD蛋白结合，EC₅₀值分别为0.0983nM和0.0512nM；相比之下，W316-BMK1与固定的人CTLA-4ECD蛋白结合，其EC₅₀为0.0800nM。W3166-z13和W3166-z17的结合EC₅₀与W316-BMK1的相似。

1.5.2食蟹猴CTLA-4的结合((ELISA和FACS)

如上所述，通过ELISA和FACS评估检测抗体与食蟹猴ELISA的结合。对于ELISA结合，用1.0μg/ml的自制食蟹猴CTLA4 ECD蛋白包被96孔板。对于FACS结合，使用工程化食蟹猴CTLA4表达细胞池。

图2A和2B显示，W3166-z13和W3166-z17以剂量依赖的方式分别与细胞表面的食蟹猴CTLA-4和固定的食蟹猴CTLA-4ECD蛋白结合。W3166-z13和W3166-z17与细胞表面食蟹猴CTLA-4结合，EC₅₀值分别为1.501nM和1.162nM；相比之下，W316-BMK1以1.737nM的EC₅₀与细胞表面的食蟹猴CTLA-4结合。W3166-z13和W3166-z17与固定的食蟹猴CTLA-4ECD蛋白结合，EC₅₀值分别为0.0732nM和0.0401nM；相比之下，W316-BMK1与固定的食蟹猴CTLA-4ECD蛋白结合，其EC₅₀为0.0348nM。W3166-z13和W3166-z17的结合EC₅₀与W316-BMK1的相似。

1.5.3竞争性ELIS

使用竞争性ELISA检测W3166-z13和W3166-z17是否能阻断hCTLA4与hCD80或hCD86蛋白的结合。

简而言之，用1.0μg/ml人CTLA4-ECD蛋白包被96孔板(Nunc)，4℃(室内)。用2％牛血清白蛋白封闭后，用系列稀释的待测抗体与0.25μg/ml his标签的人CD80或CD86蛋白(室内)预先混合并用吸管加入每个孔中，在室温下孵育1小时。用PBST洗涤后，加入生物素标记的抗His单克隆抗体(金斯瑞，A00613)并孵育1小时。洗涤6次后，用链霉亲和素HRP(Lifetechnologies，SNN1004)检测hCD80或hCD86与hCTLA-4的结合。以TMB为底物显色，用2N-HCl终止反应。用微板分光光度计在450nm处读取吸光度(

M5e)。

用竞争性ELISA检测，结果显示W3166-z13和W3166-z17阻断了hCD80与hCTLA-4的结合，IC₅₀值分别为1.1000nM和0.9076nM。相比而言，W316-BMK1以0.8379nM的IC₅₀阻断hCD80与hCTLA-4的结合(图3A)。结果还显示W3166-z13和W3166-z17阻断了hCD86与hCTLA-4的结合，IC₅₀值分别为2.0610nM和1.6670nM。相比而言，W316-BMK1以0.7546nM的IC₅₀阻断hCD80与hCTLA-4的结合(图3B)。可以看出，W3166-z13和W3166-z17可以像W316-BMK1一样有效地阻断hCTLA4与hCD80或hCD86蛋白的结合。

1.5.4竞争性FACS

使用竞争性FACS检测W3166-z13和W3166-z17是否能阻断hCTLA4与hCD80或hCD86蛋白的结合。

将人CD80或CD86转染细胞(室内)以每孔1x 10⁵个细胞加入96孔板(COSTAR3799)，并在4℃下以1500rpm离心4分钟，然后去除上清液。用1％BSA-DPBS系列稀释检测抗体，并与生物素化的人CTLA4-ECD蛋白预先混合(室内)，然后将混合物加入到培养板中表达CD80或CD86的细胞中，并在4℃下孵育1小时。漂洗后，将链霉亲和素PE(BD-Pharmingen，554061)加入细胞中，在4℃下孵育1小时。用流式细胞仪测定荧光值并用FlowJo分析。

用竞争性FACS检测，结果显示W3166-z13和W3166-z17阻断了hCD80与hCTLA-4的结合，IC₅₀值分别为0.1089nM和0.0786nM。相比而言，W316-BMK1以0.4281nM的IC₅₀阻断hCD80与hCTLA-4的结合(图4A)。结果还显示W3166-z13和W3166-z17阻断了hCD86与hCTLA-4的结合，IC₅₀值分别为0.2203nM和0.1632nM。相比而言，W316-BMK1以1.1140nM的IC₅₀阻断hCD80与hCTLA-4的结合(图4B)。图4A和4B显示W3166-z13和W3166-z17比W316-BMK1更有效地阻断hCTLA4与细胞表面hCD80或hCD86蛋白的结合。

1.5.5原发性PBMC SEB刺激试验

使用Ficoll-Paque(STEMCELL-07861)PLUS梯度离心法从健康献血者中新鲜分离出人外周血单个核细胞(PBMC)。在完整的RPMI-1640(含10％FBS和1％PS)中的分离出的PBMC与浓度为系列稀释的W3166-z13、W3166-z17和0.1ng/mL的SEB(葡萄球菌肠毒素B)混合，并添加到96孔圆底板的RPMI-1640培养基。培养皿在37℃，5％CO2下孵育。孵育后第3天测定IL-2和IFN-γ的含量。

采用配对抗体对用ELISA法测定人干扰素-γ和IL-2。分别以重组人IFN-γ(派普泰克，300-02-250UG)和重组人IL-2(安迪，202IL)为标准品。用干扰素-γ(英潍捷基，M700A)和IL-2(安迪，MAB602)的特异性捕获抗体(英潍捷基，M700A)预包被培养板。封闭后，将标准品或样品加入培养板中，在室温下培养2小时。去除未结合物质后，将针对干扰素-γ(英潍捷基，M701B)或IL-2(安迪，BAF202)的生物素共轭的检测抗体添加到孔中，培养1小时，然后在室温下用HRP共轭链霉亲和素孵育30分钟。在每个步骤之间进行漂洗。通过分配100μL TMB底物来显色，然后用100μL 2N HCl终止。用微板分光光度计在450nm处读取吸光度(

M5e)。

结果表明，在SEB刺激试验中，W3166-z13和W3166-z17增强了IFN-γ(图5A)和IL-2(图5B)的产生，其效力与W316-BMK1相当。

1.5.6表位结合ELISA

通过ELISA将W3166-z13和W3166-z17的结合表位与W316-BMK1进行表位结合。

简而言之，用1.0μg/ml人CTLA4蛋白包被96孔板(Nunc)，4℃(室内)。用2％牛血清白蛋白封闭后，预混合系列稀释的抗体与0.02μg/ml W316-BMK1-生物素，加入并在室温下孵育1小时。漂洗后，加入HRP共轭链霉亲和素，并孵育1小时。漂洗6次后，用链霉亲和素HRP(Lifetechnologies，SNN1004)检测hCD80或hCD86与hCTLA-4的结合。以TMB为底物显色，用2N-HCl终止反应。用微板分光光度计在450nm处读取吸光度(

M5e)。

图6示出了W3166-z13和W3166-z17与W316-BMK1具有相似的表位组(“bin”)。

1.5.7抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)试验

使用

EuTDA细胞毒性试剂(珀金埃尔默AD0116)进行ADCC测试。简而言之，每孔1x10⁵的人CTLA4转染细胞载入BATDA试剂，接种到含有系列稀释的W3166-z13和W3166-z17的96孔板中。然后将PBMCs作为效应细胞，以效应/靶比50:1加入到培养板中。将培养板置于37℃的5％CO₂培养箱中4小时。靶细胞裂解用DELFIA铕溶液(珀金埃尔默)测定。铕和配体形成一种高荧光和稳定的螯合物(EuTDA)，可以用

M5e读取。

图7示出W3166-z13和W3166-z17在hCTLA4转染细胞上诱导ADCC效应。以标准抗体的IgG1和IgG4同型为参考，分别命名为W316-BMK1.IgG1和W316-BMK1.IgG4。如图7所示，W3166-z13和W3166-z17均可在hCTLA4转染细胞上诱导ADCC效应。W3166-z17诱导ADCC效应的EC₅₀为0.2474nM，W316-BMK1.IgG1诱导ADCC的EC₅₀为1.279nM。

1.5.8补体依赖性细胞毒性(CDC)试验

将自制的工程化人CTLA4表达细胞和系列稀释的W3166-z13和W3166-z17混合并加入到96孔板中。以1:50的稀释比添加人补体。将培养板置于37℃的5％二氧化碳培养箱中4小时。靶细胞裂解用CellTiter-Glo(普洛麦格)法测定。以利妥昔单抗诱导的Raji细胞裂解作为阳性对照。

图8示出W3166-z13和W3166-z17在hCTLA4转染细胞上不诱导CDC效应。

1.5.9 FACS测量的亲和力

将人CTLA-4或食蟹猴CTLA-4转染的细胞以5x10⁴个细胞/孔的密度接种到96孔U底板(BD)中。检测抗体在1％BSA-PBS中连续稀释1:2倍，并与细胞在4℃下培养1小时。在1500rpm离心4分钟后，移除上清液。添加FITC共轭山羊抗人IgG Fc二抗(Jackson免疫研究实验室)，并在4℃黑暗中孵育30分钟。细胞漂洗一次，重悬于1％BSA-PBS中，用流式细胞仪(BD CantoII)进行分析。基于定量珠(QuantumTM MESF试剂盒，Bangs实验室)将荧光强度转换为结合的分子数/细胞。用Graphpad Prism5计算K_D。表4显示，W3166--z17对细胞表面人CTLA4的亲和力K_D(M)优于W316-BMK1。

表4 FACS测量的亲和力

1.5.10表面等离子体共振法(通过Biacore)测定动力学结合亲和力

本实验采用SPR技术测定CTLA-4ECD抗体的结合率常数(ka)和解离率常数(kd)。由此确定亲和常数(KD)。Biacore T200、S系列传感器芯片CM5、胺耦合试剂盒和10XHBS-EP来自GE医疗。山羊抗人IgG Fc抗体来自Jackson免疫研究实验室(货号109-005-098)。在固定步骤中，通过在注射前立即混合400mM EDC和100mM NHS制备活化缓冲液。CM5传感器芯片用激活缓冲液激活420秒。将在10mM NaAc(pH 4.5)中的30μg/mL的山羊抗人IgG-Fc抗体以5μL/min的流速注入到Fc1-Fc4通道中200s。用1M乙醇胺-HCl(GE)使失活芯片。然后在芯片上捕获抗体。简单地说，以10μL/min的流速将流动缓冲液(HBS-EP+)中的4μg/mL抗体单独注入Fc3通道30s。以30μL/min的流速将8种不同浓度(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125和0.15625nM)的人CTLA-4(W316.hpro1.ECD.his)分析物和空白流动缓冲液依次注入Fc1-Fc4通道，结合阶段120s，然后解离阶段2400s。在每个解离阶段后，以10μL/min的速度注入再生缓冲液(10mM甘氨酸pH 1.5)，持续30s。表5示出W3166-z17对人CTLA-4蛋白的亲和力与W316-BMK1相似。

表5表面等离子体共振法(通过Biacore)测定动力学结合亲和力

1.5.11人血清稳定性试验

在37℃下，在新鲜分离的人血清(血清含量>90％)中培养试验抗体。在指定的时间点，从培养箱中取出经血清处理的小份样品，并在液氮中快速冷冻，然后在-80℃下储存，直至试验。在稳定性试验前立即解冻样品。将抗体的系列稀释液与CTLA-4转染细胞在4℃下培养1小时。漂洗后，将FITC结合的山羊抗人IgG抗体(Jackson免疫实验)添加到细胞中，并在4℃下培养1小时。最后，将细胞漂洗并用1％BSA-PBS重悬。流式细胞仪测定MFI荧光值，并用FlowJo分析。

如图9所示，在整个试验期间(0-14天)，W3166-z13和W3166-z17显示了稳定的EC₅₀值，分别在0.2137-0.2440nM和0.1900-0.2212nM之间，表明它们在人血清稳定性试验中是稳定的。

1.5.12跨家族结合试验

分别用1.0μg/ml的hCTLA-4.His，hICOS.mFC，hCD28.mFc，hBTLA.His和hPD-1.mFc包被96孔板(Nunc)，于4℃过夜。用2％BSA-PBS封闭后，分别向培养板中加入10μg/ml和1.0μg/ml的测试抗体，并在室温下孵育1小时。然后加入HRP标记的羊抗人IgG二抗(Bethyl A80-304P)并孵育1小时。在每个步骤之间进行PBST漂洗。以TMB为底物显色，2N-HCl终止显色反应。用微板分光光度计在450nm处读取吸光度(

M5e)。

图10显示，W3166-z13和W3166-z17与人CTLA-4特异性结合，与hICOS、BTLA、hCD28和hPD1没有交叉反应。

1.5.13非特异性结合试验(FACS)

用不同的人肿瘤细胞系进行非特异性结合试验。简而言之，活细胞以1500rpm离心4分钟，然后用适当体积的1％BSA-PBS重悬，浓度为1x10⁶个细胞/ml。在96孔U形板的每孔中加入100μl细胞悬浮液。离心后，用100μl/孔的稀释后W3166-z17和在1％BSA-PBS中的10μg/ml的同型对照抗体重悬细胞。在4℃孵育1小时后，用1％BSA-PBS漂洗细胞两次，然后在4℃下用5μg/ml山羊抗人IgG Fc-PE(Jackson，109-115-098和126973)孵育30分钟。两次漂洗后，用100μl/孔的1％BSA-PBS重选并并在黑暗中保持4℃，直到FACS分析(BD Canto II)。

结果表明W3166-z17没有非特异性结合(表6)。以不与CTLA-4结合的IgG1κ同型抗体和IgG1λ同种型抗体作为同型对照。以PE标记的山羊抗人抗体作为二抗的唯一对照。

表6

1.5.14 DSF法测定热稳定性

使用实时荧光定量PCR(QuantStudio 7Flex，赛默飞世尔科技)进行DSF分析。简而言之，将19μL抗体溶液与1μL 62.5X SYPRO橙色溶液(英潍捷基)混合，并添加到96孔板(Biosystems)中。以2℃/min的速率将板从26℃加热到95℃，并收集由此产生的荧光数据。计算荧光随温度变化的负导数，并将最大值定义为熔解温度Th。如果一个蛋白质有多个未折叠转变，则报道前两个Tm，命名为T_m1和T_m2。T_m1通常被解释为形式化温度Tm，以便于不同蛋白质之间的比较。数据采集和Tm计算由其操作软件(QuantStudio实时PCR，PCR软件v1.3)自动进行。

表7显示DSF试验结果。W3166-z17的Tm为54.1℃。

序列表

<110> 上海药明生物技术有限公司

<120> 新型抗CTLA-4抗体多肽

<130> AJ3297PCT2007CN

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 羊驼（Lama glama）

<400> 1

Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly

1               5                   10

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 羊驼（Lama glama）

<400> 2

Ser Ile Arg Trp Ser Asp Asn Thr Thr Tyr Val Pro Asn Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 羊驼（Lama glama）

<400> 3

Gly Pro Thr Arg Leu Ser Phe Tyr Ser Gly Asn Tyr Arg Thr Tyr Asp

1               5                   10                  15

Ser

<210> 4

<211> 126

<212> PRT

<213> 羊驼（Lama glama）

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Glu Arg Glu Phe Val

        35                  40                  45

Ala Ser Ile Arg Trp Ser Asp Asn Thr Thr Tyr Val Pro Asn Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Gly Pro Thr Arg Leu Ser Phe Tyr Ser Gly Asn Tyr Arg Thr

            100                 105                 110

Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210> 5

<211> 378

<212> DNA

<213> 羊驼（Lama glama）

<400> 5

caggtgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcgg cctctggacg caccttcagt agctatgcca tgggctggtt ccgccaggct 120

ccagggatgg agcgtgagtt tgtagcatct attaggtgga gtgataatac gacatacgtc 180

cctaactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgtat 240

ctgcaaatga acaccctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc aacagggccc 300

acgagactat cattttatag tggtaattat agaacttatg actcctgggg ccaggggacc 360

ctggtcaccg tctcctca 378

<210> 6

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工合成的

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Met Glu Arg Glu Phe Val

        35                  40                  45

Ala Ser Ile Arg Trp Ser Asp Gln Thr Thr Tyr Val Pro Asn Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Gly Pro Thr Arg Leu Ser Phe Tyr Ser Gly Asn Tyr Arg Thr

            100                 105                 110

Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210> 7

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工合成的

<400> 7

caggtgcagc tggtggagag cggaggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60

agctgcgccg ccagcggcag aaccttcagc agctacgcca tgggctggtt cagacaggcc 120

cctggcatgg agagagagtt cgtggccagc atcaggtggt ccgaccagac cacctacgtg 180

cccaacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctccagatga acagcctgag acccgaggat accgccgtgt actattgcgc caccggcccc 300

accagactga gcttctacag cggcaactac aggacctacg acagctgggg ccagggaacc 360

ctggtgaccg tgagcagc 378

<210> 8

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工合成的

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1               5                   10                  15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

            20                  25                  30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

        35                  40                  45

Ala Ser Ile Arg Trp Ser Asp Gln Thr Thr Tyr Val Pro Asn Ser Val

    50                  55                  60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Thr Gly Pro Thr Arg Leu Ser Phe Tyr Ser Gly Asn Tyr Arg Thr

            100                 105                 110

Tyr Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120                 125

<210> 9

<211> 378

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工合成的

<400> 9

caggtgcagc tggtggagag cggaggcgga gtggtgcagc ctggaggaag cctgagactg 60

agctgcgccg ccagcggcag aaccttcagc agctacgcca tgggctggtt cagacaggcc 120

cctggcaagg agagagagtt cgtggccagc atcaggtggt ccgaccagac cacctacgtg 180

cccaacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240

ctccagatga acagcctgag acccgaggat accgccgtgt actattgcgc caccggcccc 300

accagactga gcttctacag cggcaactac aggacctacg acagctgggg ccagggaacc 360

ctggtgaccg tgagcagc 378

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 人工合成的

<400> 10

Ser Ile Arg Trp Ser Asp Gln Thr Thr Tyr Val Pro Asn Ser Val Lys

1               5                   10                  15

Gly

Claims (37)

1.一种包含特异性结合CTLA-4的重链可变结构域的抗体多肽，其中所述重链可变结构域包含：

1)如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:2所示的CDR2，以及如SEQ ID NO:3所示的CDR3；或

2)如SEQ ID NO:1所示的CDR1，如SEQ ID NO:10所示的CDR2，以及如SEQ ID NO:3所示的CDR3；

所述抗体多肽是单域抗体或重链抗体。

2.如权利要求1所述的抗体多肽，其中所述重链可变结构域选自由SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8组成的组中的重链可变区。

3.如权利要求1或2所述的抗体多肽，其中所述重链可变结构域来源于VHH结构域。

4.如权利要求1或2所述的抗体多肽，进一步包含免疫球蛋白恒定区。

5.如权利要求4所述的抗体多肽，其中所述免疫球蛋白恒定区为人Ig的恒定区。

6.如权利要求5所述的抗体多肽，其中所述人Ig的恒定区为人IgG的恒定区域。

7.如权利要求1或2所述的抗体多肽，所述抗体多肽是驼类源的或是人源化的。

8.如权利要求1或2所述的抗体多肽，所述抗体多肽是纳米抗体。

9.如权利要求1或2所述的抗体多肽，所述抗体多肽可特异性结合人CTLA4，通过流式细胞术测定其EC₅₀值不超过0.5nM。

10.如权利要求1或2所述的抗体多肽，所述抗体多肽可阻断CTLA4和细胞表面表达的CD80之间的结合，流式细胞术测定其IC₅₀值不超过0.15nM，或阻断CTLA4和细胞表面表达的CD86之间的结合，流式细胞术测定其IC₅₀值不超过0.25nM。

11.如权利要求1或2所述的抗体多肽，所述抗体多肽可特异性结合食蟹猴CTLA-4。

12.如权利要求1或2所述的抗体多肽，所述抗体多肽与一个或多个共轭基团连接，其中所述共轭基团选自清除修饰剂、化学治疗剂、毒素、放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记、酶底物标记、DNA烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂、微管蛋白粘合剂或其他抗癌药物。

13.一种药物组合物，包含如权利要求所述1至12中任一项的抗体多肽，和一种药学可接受的载体。

14.一种多核苷酸，编码如权利要求1至12中任一项所述的抗体多肽。

15.如权利要求14中所述的多核苷酸，包含选自由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:9组成的组中的核苷酸序列。

16.一种载体，包含如权利要求14或15中所述的多核苷酸。

17.一种宿主细胞，包含如权利要求16中所述的载体。

18.一种表达如权利要求1-12中任一项所述的抗体多肽的方法，包括在可使权利要求16中所述的载体表达的条件下培养如权利要求17中所述的宿主细胞。

19.如权利要求1-12中任一项所述的抗体多肽或如权利要求13所述的药物组合物在制备用于将受益于CTLA-4活性的调节受试者中治疗疾病或病症的药物中的用途，包括向受试者施用治疗有效量的如权利要求1-12中任一项所述的抗体多肽或如权利要求13所述的药物组合物，其中所述疾病或病症是癌症。

20.如权利要求19中所述的用途，其中所述癌症是淋巴瘤、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统癌、乳腺癌、子宫癌、食管癌、头颈癌、肛门癌、胃肠道癌、皮肤癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌，前列腺癌、肉瘤、睾丸癌、外阴癌、内分泌系统癌、阴茎癌、儿童实体瘤、肿瘤血管瘤。

21.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为子宫内膜癌。

22.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为胃癌或直肠癌。

23.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为鳞状细胞癌。

24.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为骨髓瘤。

25.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为肾细胞癌。

26.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为甲状旁腺癌、肾上腺癌或垂体腺瘤。

27.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为脊柱肿瘤。

28.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症是由石棉或血液系统恶性肿瘤引起的环境诱发的癌症，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、急性髓样淋巴瘤、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、间变性大细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤，及上述癌症的任意组合。

29.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为原发性纵隔B细胞淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

30.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为前体B淋巴母细胞淋巴瘤。

31.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为前体T淋巴细胞淋巴瘤。

32.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症为蕈样真菌病。

33.如权利要求19-32中任一项所述的用途，其中所述受试者是人类。

34.如权利要求19-32中任一项所述的用途，其中所述施用为口服、鼻腔、静脉、皮下、舌下或肌肉注射。

35.一种非诊断目的的在样品中检测CTLA-4存在或含量的方法，包括将样品与如权利要求1-12中任一项所述的抗体多肽接触，并测定样品中CTLA-4的存在或含量。

36.如权利要求1-12中任一项所述的抗体多肽在制备用于在受试者中诊断CTLA-4相关疾病或病症的试剂中的用途，包括：a)将从受试者获得的样本与如权利要求1-12中任一项所述的抗体多肽接触；b)测定样本中CTLA-4的存在或含量；以及c)关联CTLA-4的存在或含量和受试者CTLA-4相关疾病或病症的存在或状态，所述疾病或病症是癌症、自身免疫性疾病、炎症疾病、传染病、移植物抗宿主病(GVHD)或移植排斥。

37.一种试剂盒，包含用于检测CTLA-4的如权利要求1-12中任一项所述的抗体多肽。

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