CN115873114A - Ctla-4结合分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CTLA‑4结合分子及其应用。本发明的CTLA‑4结合分子包含抗CTLA‑4单域抗体，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列。本发明还提供所述CTLA‑4结合分子的编码序列、表达载体，以及相应的宿主细胞、药物组合物和用途。本发明的CTLA‑4结合分子能够高特异性地结合CTLA‑4胞外区，具有较高的亲和力和生物活性，以及低的免疫原性，结构稳定，成药性良好。

Description

CTLA-4结合分子及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4)结合分子及其应用。本发明的CTLA-4结合分子能够高特异性地结合CTLA-4胞外区，具有较高的亲和力和生物活性，以及低的免疫原性，结构稳定，成药性良好。
背景技术
T细胞活化需要两个信号：第一信号由T细胞受体复合物(TCR)识别APC表面的抗原肽-MHC复合物(p-MHC)所启动(Weiss,J.Clin.Invest.86:1015(1990))；第二信号由T细胞和APC间共刺激分子的相互作用所启动(Schwartz,Science248:1349(1990))。最重要的一对共刺激分子是表达在专职APC表面的B7分子和T细胞表面的二聚体分子CD28之间的结合，CD28向T细胞内传递信号可启动T细胞应答，包括促进产生IL-2分子和初始T细胞分化成效应T细胞和记忆T细胞。
而细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyte associatedantigen 4，CTLA-4)与CD28分子同为T细胞表面共刺激受体，属B7分子家族。CTLA-4分子也是免疫球蛋白(Ig)超家族成员，含有单一胞外Ig结构域；CTLA-4包含有6个氨基酸序列MYPPPY，与CD28分子结构具有70％的同源性，两者结合相同的配体，即B7-1(CD80)和B7-2(CD86)。但CTLA-4分子的作用与CD28分子相反，CD28分子表达于静止或活性T细胞，与配体结合后促使T细胞激活及产生细胞因子；而CTLA-4仅表达于激活后的T细胞，其高峰出现在T细胞激活后的24小时左右，而在静止T细胞中几乎检测不到，具有抑制T细胞增殖和减少细胞因子IL-2产生的作用，与维持机体的免疫自稳及外周耐受功能有关(Linsley PS等.JExp Med，1992,176(6)：1595—1604；Bour-Jordan H等,Immunol Rev,2011,241(1):180-205.)。CTLA-4也在调节性T细胞(treg)中发现，并有助于其抑制功能。同时，CTLA-4比CD28具有更高的结合亲和力，这使其成为一种潜在的自身免疫性疾病的治疗方法。
鉴于CTLA-4分子的免疫抑制功能，阻断CTLA-4可以增强T细胞的活化和增殖。目前针对CTLA-4分子的药物开发主要以融合蛋白、单克隆抗体、双特异性抗体等为主，分别用于治疗自身免疫性疾病和肿瘤。目前，全球已有2个CTLA-4融合蛋白和1个CTLA-4抗体上市，分别是2005年上市的Orencia(Abatacept)，2011年上市的Nulojix(Belatacept)以及Yervoy(ipilimumab)。其中，Abatacept融合蛋白被批准用于类风湿性关节炎的治疗，可有效地改善症状和体征，并可延缓关节放射学的进展；Belatacept被批准用于预防成人肾移植受者发生急性排斥反应。而ipilimumab单抗则被批准与纳武单抗联合用于包括黑色素，肾癌，肺癌，结直肠癌等癌症的治疗，显示出比单一抗体更优的抗肿瘤效果。在双特异性抗体方面，国内康宁杰瑞开发了针对CTLA-4和PD-L1的双特异性抗体(KN046)，开始进入澳大利亚的I期临床，该抗体还获得了中国国家药品监督管理局的I临床批件，并将进入国内的临床试验。KN046被靶向用于肿瘤微环境，从而减少对人类外周系统的副作用。在临床前研究中，KN046具有绝佳的抗肿瘤功效，与现有的CTLA-4抗体ipilimumab相比，其毒性显著降低。正在进行的临床试验也显示出其对人类的良好耐受性。
纳米抗体具有易表达、稳定性高、亲和力高等天然优势，根据纳米抗体自身优势和CTLA-4生物学机制，开发CTLA-4纳米抗体具有非常广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供CTLA-4结合分子及其应用。
本发明第一方面提供一种CTLA-4结合分子，包含抗CTLA-4单域抗体，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:1是GX1X2X3X4X5X6X7，其中，X1为S、L、D、F或G，X2为T、N或S，X3为L、F或S，X4为D、G或E，X5为P、I、S、D或Y，X6为F、Y、H、Q或W，X7为V、D、A或S。
在一个或多个实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:4-10中任一所示的序列。
SEQ ID NO:2是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为I或M，X2为N、G、S或R，X3为R、P、S或G，X4为S、N、D或T，X5为R或G，X6为T、A、D、E、R、G或L，X7为I、F、T、S、G、R或无，X8为T或无。
在一个或多个实施方案中，CDR2包含SEQ ID NO:11-18中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，SEQ ID NO:3是X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X1 6X17X18X19X20X21X22，其中，X1为A、G或T，X2为A、L、S或G，X3为S、G、E、V、A或K，X4为P、R或L，X5为D、E、L、T、I或A，X6为K、R、V、L、S或H，X7为P、A、Y、F、G或Q，X8为F、H、T、V或S，X9为Y、S、L、A、H或M，X10为T、I、C、A或W，X11为D、Y、S、L或V，X12为Q、A、L、M或C，X13为T、S、N或C，X14为M、E、H、Q、A或无，X15为C、Y、G、H、A、N或无，X16为N、D、M、Y、S、E或无，X17为K、I、Y、R、F或无，X18为H、D、S、G或无，X19为Y、T、D、L或无，X20为Y或无，X21为G或无，X22为Y或无。
在一个或多个实施方案中，CDR3包含SEQ ID NO:19-26中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的CDR1包含SEQ ID NO:4-10中任一所示的序列，CDR2包含SEQ ID NO:11-18中任一所示的序列，和CDR3包含SEQ ID NO:19-26中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体含有以下组a1到组a9中任一组的SEQ IDNO所示的CDR1、CDR2和CDR3：
组 CDR1 CDR2 CDR3
a1 4 11 19
a2 4 12 20
a3 4 12 20
a4 5 13 21
a5 6 14 22
a6 7 15 23
a7 8 16 24
a8 9 17 25
a9 10 18 26
。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体VHH的FR1可选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR1，VHH的FR2可选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR2，VHH的FR3可选自SEQ IDNO:27-73的任一VHH的FR3，VHH的FR4可选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR4。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体的FR区为选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR区。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体VHH如SEQ ID NO:27-73中任一所示。
在一个或多个实施方案中，所述CTLA-4结合分子是包含一条、两条或多条本文所述的抗CTLA-4单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
在一个或多个实施方案中，所述多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
在一个或多个实施方案中，所述重链抗体的抗原结合片段是单链重链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述重链抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述重链抗体还包含重链恒定区。
在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是骆驼重链抗体的恒定区，包含CH2和CH3。在一个或多个实施方案中，所述CH2和CH3是人IgG Fc的CH2和CH3，例如IgG1或IgG4的CH2和CH3。优选地，所述重链恒定区为IgG4的CH2和CH3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示。
在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是软骨鱼重链抗体的恒定区，包含CH1、CH2、CH3、CH4和CH5。
在一个或多个实施方案中，所述抗体是包含所述抗CTLA-4单域抗体作为重链可变结构域的抗体。
在一个或多个实施方案中，所述抗体还包含轻链可变结构域、重链恒定域和轻链恒定域。
在一个或多个实施方案中，抗体的抗原结合片段选自Fab、F(ab’)2、Fv、scFv。
在一个或多个实施方案中，本发明任一实施方案所述的结合分子为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。
本发明还提供多核苷酸，选自：
(1)本文任一实施方案所述单域抗体或本文所述抗体或其抗原结合片段的编码序列；
(2)(1)的互补序列；
(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。
在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。
本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的多核苷酸。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是重组载体或表达载体。
本发明还提供包含本文任一实施方案所述CTLA-4结合分子的噬菌体。
在一个或多个实施方案中，所述CTLA-4结合分子展示于所述噬菌体表面。
本发明还提供一种宿主细胞，选自：
(1)表达本文任一实施方案所述CTLA-4结合分子；
(2)包含本文所述的多核苷酸；和/或
(3)包含本文所述的核酸构建物。
本发明还提供一种产生CTLA-4结合分子的方法，包括：在适合产生CTLA-4结合分子(例如单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段)的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述CTLA-4结合分子。
本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述CTLA-4结合分子、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗癌症。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是CTLA-4相关癌症。优选地，所述癌症选自：肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶行血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤等。
本发明还提供本文任一实施方案所述CTLA-4结合分子在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是CTLA-4相关癌症。优选地，所述癌症选自：肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶行血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤等。
本发明还提供一种治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的CTLA-4结合分子，或含有本发明任一实施方案所述的CTLA-4结合分子的药物组合物。
在一个或多个实施方案中，所述癌症是CTLA-4相关癌症。优选地，所述癌症选自：肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶行血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤等。
本发明还提供一种检测CTLA-4的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述CTLA-4结合分子、多核苷酸、核酸构建物、噬菌体、宿主细胞。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测CTLA-4与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测结合试剂是能与CTLA-4结合分子连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述CTLA-4结合分子或分离地存在于试剂盒中。
本发明还提供一种检测样品中CTLA-4存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述CTLA-4结合分子与样品孵育，和检测CTLA-4与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合，从而确定样品中CTLA-4存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。
本发明还提供本文任一实施方案所述CTLA-4结合分子在制备用于检测样品中CTLA-4、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。
附图说明
图1为针对人CTLA-4蛋白的羊驼抗血清效价检测。
图2为抗人CTLA-4抗体在过表达人CTLA-4的293T细胞上的结合检测结果。
图3A为抗人CTLA-4抗体在过表达人CTLA-4的293T细胞上阻断B7-1分子结合的检测结果。图3B为抗人CTLA-4抗体在过表达CTLA-4的293T细胞上阻断B7-2分子结合的检测结果。
图4为在报告基因试验中抗人CTLA-4抗体对IL-2分泌量的影响。
图5A-图5C分别为抗人CTLA-4人源化抗体与人、食蟹猴、小鼠CTLA-4蛋白的交叉结合检测数据。
图6为抗人CTLA-4人源化抗体在过表达人CTLA-4的293T细胞上的结合检测结果。
图7为抗人CTLA-4人源化抗体在过表达CTLA-4的293T细胞上阻断生物素标记的B7-1分子结合的检测结果。
图8A-图8B分别为抗人CTLA-4人源化抗体NB-27-z5、NGS-12-z1与5300种膜蛋白交叉反应结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，发现一类包含抗CTLA-4单域抗体的CTLA-4结合分子。本发明的CTLA-4结合分子能够高特异性地结合CTLA-4，具有较高的亲和力和生物活性，以及低的免疫原性，结构稳定，成药性良好。本发明单域抗体生成简便。
抗体
本文中，“CTLA-4结合分子”是特异性结合CTLA-4的蛋白质，包括但不仅限于：抗体、抗体的抗原结合片段、重链抗体、纳米抗体、微型抗体、亲和体、受体的靶结合区、细胞粘附分子、配体、酶、细胞因子、和趋化因子。
本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2和Fv)。本文中，术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可互换地使用。
基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元及称作J链的另外多肽组成，包含10个抗原结合位点；而IgA抗体包含2-5个基本的4链单元，其可与J链组合聚合形成多价装配物。在IgG的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链，CH1、CH2和CH3)和四个(对于μ和ε同种型，CH1、CH2、CH3和CH4)恒定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区(Hinge)。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域(CL)。VL与VH排列在一起，而CL与重链的第一恒定结构域(CH1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology，第八版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和TristramG.Parsolw编辑，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
本文所述“重链抗体”是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。相比上述4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，仅包含2条由可变区(VHH)和其他恒定区组成的重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(CH1-CH5)。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。
如本文所用，术语“单域抗体”、“抗CTLA-4单域抗体”、“重链抗体的重链可变区结构域”、“VHH”、“纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于CTLA-4的单域抗体。单域抗体是重链抗体的可变区。通常，单域抗体含有三个CDR和四个FR。优选地，本发明的单域抗体具有SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3。单域抗体是最小的功能性抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
包含两条或多条单域抗体的结合分子是多价单域抗体；包含两条或多条不同特异性单域抗体的结合分子是多特异性单域抗体。多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子通常由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
本文中，重链抗体和抗体旨在区分抗体的不同组合方式。由于二者的结构具有相似性，下述针对抗体的结构描述除涉及轻链外也均适用于重链抗体。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3(重链抗体中可简称为CDR1、CDR2、CDR3)以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。
“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成；IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。如本文所使用的，Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“Fc”片段，其具有易于结晶的能力。Fab片段由完整轻链及重链可变结构域(VH)和一条重链第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大F(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的Fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。Fab’片段因在CH1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与Fab片段有所不同。F(ab’)2抗体片段最初是作为成对Fab’片段生成的，在Fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。Fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由Fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)所识别的区。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。
本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法、噬菌体展示法、重组DNA法、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术、单细胞测序法。
单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生。本发明中，抗体、单域抗体、重链抗体等均包括各所述抗体的经人源化的变体。
“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。
在一些实施方案中，本发明还提供与本发明的任何抗CTLA-4单域抗体结合CTLA-4相同表位的单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段，即能够与本发明的任何单域抗体交叉竞争与CTLA-4的结合的单域抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段。
本发明中，单域抗体的CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列，SEQ ID NO:1是GX1X2X3X4X5X6X7，其中，X1为S、L、D、F或G，X2为T、N或S，X3为L、F或S，X4为D、G或E，X5为P、I、S、D或Y，X6为F、Y、H、Q或W，X7为V、D、A或S。在一个或多个实施方案中，CDR1包含SEQ ID NO:4-10中任一所示的序列。
本发明中，单域抗体的CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列，SEQ ID NO:2是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为I或M，X2为N、G、S或R，X3为R、P、S或G，X4为S、N、D或T，X5为R或G，X6为T、A、D、E、R、G或L，X7为I、F、T、S、G、R或无，X8为T或无。在一个或多个实施方案中，CDR2包含SEQ ID NO:11-18中任一所示的序列。
本发明中，单域抗体的CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列，SEQ ID NO:3是X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22，其中，X1为A、G或T，X2为A、L、S或G，X3为S、G、E、V、A或K，X4为P、R或L，X5为D、E、L、T、I或A，X6为K、R、V、L、S或H，X7为P、A、Y、F、G或Q，X8为F、H、T、V或S，X9为Y、S、L、A、H或M，X10为T、I、C、A或W，X11为D、Y、S、L或V，X12为Q、A、L、M或C，X13为T、S、N或C，X14为M、E、H、Q、A或无，X15为C、Y、G、H、A、N或无，X16为N、D、M、Y、S、E或无，X17为K、I、Y、R、F或无，X18为H、D、S、G或无，X19为Y、T、D、L或无，X20为Y或无，X21为G或无，X22为Y或无。在一个或多个实施方案中，CDR3包含SEQ ID NO:19-26中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体含有表A中组a1到组a9中任一组SEQ IDNO所示的CDR1、CDR2和CDR3：
表A
组 CDR1 CDR2 CDR3
a1 4 11 19
a2 4 12 20
a3 4 12 20
a4 5 13 21
a5 6 14 22
a6 7 15 23
a7 8 16 24
a8 9 17 25
a9 10 18 26
。
在一个或多个实施方案中，所述单域抗体VHH的FR1可选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR1，VHH的FR2可选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR2，VHH的FR3可选自SEQ IDNO:27-73的任一VHH的FR3，VHH的FR4可选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR4。
在优选的实施方案中，本发明单域抗体VHH的FR区为选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR区。进一步优选地，这类抗体的CDR选自前述组a1到组a9中的任一组。在一个或多个实施方案中，所述单域抗体VHH如SEQ ID NO:27-73中任一所示。
本文所述CTLA-4结合分子可以是包含一条、两条或多条本文所述的抗CTLA-4单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文的CTLA-4结合分子包含抗CTLA-4单域抗体和免疫球蛋白Fc区。可用于本发明的Fc区可以来自不同亚型的免疫球蛋白，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc区为IgG4Fc，其氨基酸序列如SEQ ID NO:74所示。
在一些实施方案中，本文所述CTLA-4结合分子是重链抗体。所述重链抗体还包含重链恒定区，例如骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体的恒定区。优选地，所述重链恒定区如SEQ ID NO:74所示。
本发明还包括所述抗体衍生物和类似物。“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的衍生物或类似物可以是(i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列改变一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在可变区的FR和/或CDR区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。
本文所述抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
在一些实施方案中，本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
可采用本领域常规的方法制备本发明的抗体，如本领域熟知的杂交瘤技术。可采用本领域常规的方法制备本发明的重链抗体，如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者，本发明的抗体或重链抗体可在其他细胞系中表达。可用编码本发明抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。尤其优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有基本CTLA-4结合特性的抗体来进行选择。
核酸
本发明还提供了编码上述抗体或其片段的多核苷酸。本文提供编码重链可变区、轻链可变区、重链、轻链以及各CDR的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的抗体或其抗原结合片段。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
所以，本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的核酸构建物，例如表达载体和重组载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
治疗用途和药物组合物
通过构建纳米抗体文库，发明人发现并表达纯化多个可以结合CTLA-4蛋白的纳米抗体。本文所述的抗体的所有方面都可用于制备用以预防或治疗本文所述各种病况和疾病的药物，所述病况和疾病尤其病况与表达CTLA-4的细胞相关的疾病或病况。在一些实施方案中，所述病况和疾病是癌症，包括但不限于：肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶行血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤等。
本文的药物组合物含有本文所述结合分子，以及药学上可接受的辅料，包括但不限于稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。辅料优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。这类辅料包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的pH、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的物质。这些物质为现有技术已知。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术内。其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制物中包含抗体的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复水的形式(例如，冻干)。本发明还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有含水配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
本发明也提供通过施用本发明任一实施方案所述的结合分子或其药物组合物来治疗患者(尤其是患者的CTLA-4相关疾病)的方法。本文中，术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方案可根据多种因素(比如患者的疾病状态、年龄、体重及疗法激发受试者的抗癌反应的能力)而变。
将采用的含有本发明结合分子的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。
给药频率将取决于所用配制物中结合分子的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如经口、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。
诊断、检测和试剂盒
本发明的结合分子因其与CTLA-4的高亲合力可用于测定，例如结合测定来检测和/或定量在组织或细胞中表达的CTLA-4。结合分子例如单域抗体可用在进一步研究CTLA-4在疾病中的作用的研究中。检测CTLA-4的方法大致如下：获得细胞和/或组织样本；检测样本中CTLA-4的水平。
本发明的CTLA-4结合分子可用于诊断目的，用来检测、诊断或监控与CTLA-4相关的疾病和/或病况。本发明提供使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测样本中CTLA-4的存在。可以体内或体外进行CTLA-4的检测。适用于检测CTLA-4的存在的方法实例包括ELISA、FACS、RIA等。
对于诊断应用来说，通常用可检测的标记基团来标记结合分子例如单域抗体。合适的标记基团包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基基团或由二级报导体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。
本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合CTLA-4的测试分子的存在的方法。一种所述测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量CTLA-4的溶液中的游离抗体的量。游离抗体(即，未结合CTLA-4的抗体)的量增加将表示测试分子能与该抗体竞争结合CTLA-4。在一个实施方案中，用标记基团标记抗体。或者，标记测试分子并在存在或不存在抗体的情形下监控游离测试分子的量。
本发明还提供了用于检测CTLA-4水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别CTLA-4蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
实施例1：羊驼免疫
1.1免疫原制备：
根据NCBI上查询CTLA-4蛋白序列，与人IgG Fc片段序列进行融合，委托南京金斯瑞公司进行合成构建pCDNA3.4(Thermo)质粒的真核表达载体，将合成后的质粒利用EXpiCHOTM(Thermo Fisher)表达系统表达，表达后用5mL的Protein A预装柱(GE)进行一步亲和纯化，将纯化后样品置换入PBS缓冲液中，经SDS-PAGE电泳凝胶与HPLC鉴定纯度，ELISA鉴定活性后，分装冻存于-80度冰箱用于后续免疫。
1.2羊驼免疫：
首次免疫抗原(CTLA-4.hFc)量为1000μg，与佐剂(GERBU FAMA)混匀，选取羊驼背部皮下四点注射免疫，每点免疫量为1mL。间隔3周进行第2次免疫。第2至9次免疫：免疫抗原量为500μg，选取羊驼背部皮下四点注射免疫，每点免疫量为1mL，每次免疫间隔时间为一周。
1.3免疫血清效价检测：
1.3.1蛋白水平效价检测
4度过夜包被CTLA-4.His抗原(Acrobiosystems)，封闭洗涤后，将梯度稀释的血清加入ELISA板进行孵育后，再使用anti-llama IgG HRP(Abcam)抗体进行孵育，洗涤后加入TMB显色液显色，用2M HCl终止反应，然后用酶标仪检测OD450纳米处吸光值。实验结果如图1所示，经过9次免疫后羊驼效价达到较高水平(>64000)。
实施例2：针对于CTLA-4的纳米抗体免疫文库的构建及筛选
(1)9次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA。RNA的提取参照TAKARA公司RNAiso试剂说明书进行。
(2)以RNA为模板，oligo dT为引物，参照TAKARA公司反转录酶说明书合成cDNA第一链。
(3)采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，经巢式PCR获得重链抗体的可变区编码基因。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：
第一轮PCR：
上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC(SEQ ID NO:77)
下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC(SEQ ID NO:78)
扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，55℃退火，30个循环；回收约600bp的DNA片段，作为第二轮PCR的模板。
第二轮PCR：
上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(SEQ ID NO:79)
下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT(SEQ ID NO:80)
扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)，55℃退火，30个循环，回收目的片段，结果显示该片段的大小约为500bp，即纳米抗体基因电泳带约为500bp。
(4)将噬菌粒pME207和PCR扩增产物分别用Sfi I和Not I双酶切(NEB)，回收、定量后，以1∶3摩尔比，用T4 DNA连接酶(TaKaRa)连接两个片段，在16℃，过夜连接。
(5)连接产物经乙醇沉淀后，溶于100μL无菌水，分十次进行电穿孔转化大肠杆菌TG1。取100μL电击、培养后的菌液倍比稀释，涂布氨苄青霉素LB培养板，计算库容，其余部分全部涂布于氨苄青霉素2×YT培养板，37℃，倒置培养13～16h。用10mL，2×YT培养基将培养板上的菌苔刮洗后，加入终浓度25％甘油，分装，-80℃保存备用。库容的大小为4.3×109。为检测文库的插入率，随机选取48个克隆做菌落PCR，结果显示插入率已达到90％以上。
(6)根据计算的库容量结果，接种10倍库容量的活细胞于200mL的2×YT(含2％葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200r/min培养至OD600达0.5，按感染复数20∶1加入辅助噬菌体，37℃静置30min后，37℃，200r/min，30min。将培养物离心，用200mL的2×YT(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素)重悬沉淀，37℃，250r/min过夜培养后，8000rpm离心取上清，加入5×PEG/NaCl溶液，冰上放置60min，8000rpm离心30min，重悬沉淀于5mL的PBS中，即得到抗CTLA-4的单域重链抗体(VHH)免疫文库，取10μL测定滴度，其余分装于-80℃保存备用。
(7)将CTLA-4蛋白按5μg/mL，100μL每孔包被在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。第二天五个孔中分别加入200μL，3％BSA，室温封闭2小时。2小时后用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗3遍。洗板后先在每个负筛孔加入100μL用5％脱脂牛奶预封闭的噬菌体(2～3×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，在室温下作用1.5小时，再将负筛后上清转移至目的抗原包被孔中，室温下作用1.5小时。用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗12遍，以洗掉不结合的噬菌体。用Glycine(SIGMA)将与CTLA-4特异性结合的噬菌体解离下，洗脱的噬菌体经Tris(Invitrogen，1M，PH 8.0)中和后感染处于对数期的TG1，经繁殖扩增，进行下一轮“吸附-洗脱”。最后洗脱下的噬菌体浸染TG1，利用IPTG(Thermo)诱导TG1表达纳米抗体，取TG1表达的上清做ELISA结合检测与阻断活性检测。ELISA结合检测使用二抗为anti-c-myc Antibody HRP(Bethyl)，阻断Biotinylated Human B7-1/CD80 Protein,Fc分子(Acrobiosystem)结合检测使用二抗为HRP标记的链亲和素(Thermo)。同时取TG1表达的上清在过表达293T的CTLA-4细胞上做FACS结合检测，一抗用的是biotin-anti-his抗体(金斯瑞)，荧光抗体使用的是PE Streptavidin(Biolegend)。
(8)通过序列分析后，结合ELISA和FACS检测结果，选择有阻断活性的9个纳米抗体作为候选抗体。
实施例3：候选抗体表达纯化
将纳米抗体构建到pCDNA3.4-IgG4载体上，构建成VHH-IgG4形式，然后经EXpiCHOTM(Thermo Fisher)表达系统表达，表达一周后收取上清进行Protein A(GE)纯化。然后使用Nanodrop检测蛋白质量，HPLC检测蛋白纯度。所得蛋白纯度及产量满足后续试验需要。
实施例4：候选抗体表征
(1)蛋白水平亲和力检测：
使用表面等离子共振技术(SPR)测定抗体对人CTLA-4his tag抗原的结合动力学和亲和力。将纯化的抗体流经预先固定protein A的传感器芯片，抗体被protein A捕获，然后将5个不同浓度的CTLA-4.his蛋白作为流动相，结合时间和解离时间分别为30min和60min。使用Biacore Evaluation Software 2.0(GE)分析结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡常数(KD)。选择上市的CTLA-4抗体药物Yevory为对照。BMK1是根据https://www.drugbank.ca/提供的Yevory序列制备的IgG4抗体，BMK2是根据苏州康宁杰瑞生物科技有限公司CN 107400166 A专利中的序列制备的IgG4抗体。各候选抗体、BMK1、BMK2的氨基酸序列如表5所示，各候选抗体的CDR序列如表6所示。蛋白水平亲和力检测结果如下表1所示。
表1.不同抗体亲和力检测结果
Figure BDA0003287702920000201
(2)蛋白水平配体竞争试验
使用ELISA鉴定VHH-IgG4抗体是否与配体Biotinylated Human B7-1/CD80Protein,Fc蛋白(Acrobiosystem)竞争结合人CTLA-4.hFc胞外蛋白。简而言之，将CTLA-4.his抗原用PBS稀释到1.5μg/mL，在酶标板中每孔加入100μL抗原于4℃包被过夜；第二天，用PBST(添加0.5％TWEEN-20)洗涤板两次，然后用3％BSA在37℃下封闭板1.5h，然后用PBST洗涤板两次。将Biotinylated Human B7-1/CD80 Protein,Fc蛋白稀释至5.2μg/mL；将VHH-IgG4抗体稀释至2000nM，再4倍比连续稀释8个梯度；每个孔加入50μL Biotinylated HumanB7-1/CD80 Protein,Fc蛋白和50μL稀释抗体，将酶标板置于37℃孵育1h；洗涤3遍后，每孔加入100μL按照1:2000稀释好的HRP-SA抗体(Biolegend)孵育30min；然后用PBST洗涤板3次，按照100μL/孔加入TMB显色液，反应3～5min；按照100μL/孔加入3N的盐酸终止反应。终止反应后，在Tecan酶标仪上选择OD450/650进行检测。并用Graphprism 8.0软件制作剂量-效应曲线，计算IC50。结果表明除同型对照抗体(Isotype，其氨基酸序列如CN 106146653A中的SEQ ID NO:2所示)外其他所有9个候选抗体和BMK及Yervoy都显示有配体竞争活性；结果总结见表2。
(3)同源蛋白结合试验
分别将CTLA-4及其同源蛋白PD-1.his tag蛋白(ACRO Biosystems)、ICOS.Histag(ACRO Biosystems)、CD28.His tag(ACRO Biosystems)包被酶标板，浓度为1μg/ml，4℃放置过夜。封闭和洗涤后，将稀释好的抗体分别加入酶标板中，室温孵育2小时。洗涤后，加入Goat anti-Human IgG-Fc Fragment Antibody HRP(Bethyl)二抗，室温孵育1小时。洗涤后加入TMB显色液，然后用3N HCl终止反应，使用酶标仪读取OD450数值。结果显示9个候选抗体、Yervory、BMK等抗体都只结合CTLA-4蛋白，与CTLA-4同源蛋白(PD-1、ICOS、CD28)都无交叉反应。9个候选抗体结果总结见表2。
(4)种属交叉试验
分别将不同种属(人、食蟹猴、鼠科)CTLA-4.his tag蛋白(ACRO Biosystems)包被酶标板，浓度为1μg/ml，4℃放置过夜。封闭和洗涤后，将稀释好的抗体分别加入酶标板中，室温孵育2小时。洗涤后，加入Goat anti-Human IgG-Fc Fragment Antibody HRP(Bethyl)二抗，室温孵育1小时。洗涤后加入TMB显色液，然后用2M HCl终止反应，使用酶标仪读取OD450数值。
结果表明所有9个候选抗体、BMK1均结合人和食蟹猴CTLA-4、不结合鼠CTLA-4，结果如表2所示。
表2.抗CTLA-4抗体ELISA检测结果汇总表
Figure BDA0003287702920000211
Figure BDA0003287702920000221
(5)细胞水平结合活性检测
将表达CTLA-4胞外区的HEK293T细胞铺于96孔板中，每孔3×105细胞，再将梯度稀释的候选抗体与过表达CTLA-4的293T细胞于2～8℃孵育；半小时后，洗涤后加入检测抗体anti-human IgG PE(Jackson Immuno Research，Code：109-117-008)孵育，然后使用CytoFLEX流式细胞仪检测。通过Graphprism软件进行曲线拟合，计算抗体的EC50(nM)。Isotype为同型对照(阴性对照，序列来源于专利CN 106146653A的SEQ ID NO:2)。部分候选抗体的结果如图2所示。其余候选抗体的EC50为0.4～0.7nM。
(6)细胞水平配体竞争活性检测
配体Biotinylated Human B7-1/CD80 Protein,Fc蛋白(Acrobiosystem)、Biotinylated Human B7-2/CD80 Protein,Fc蛋白(Acrobiosystem)分别稀释至固定浓度。将表达CTLA-4胞外区的HEK293T细胞铺于96孔板中，每孔3×105细胞，再加入50μL梯度稀释的抗体与50μL配体，于4℃孵育；30min后，洗涤后加入检测试剂PE streptivin(Biolegend)再孵育30min；孵育结束后洗涤，重悬，使用CytoFLEX流式细胞仪检测。通过Graphprism软件进行曲线拟合，计算抗体的IC50。结果表明除NB-784抗体外，所有候选抗体均可竞争配体与CTLA-4的结合，其中部分候选抗体的结果如图3A和图3B所示。
实施例5：抗体功能活性测试(报告基因试验)
将测试缓冲液(RMPI1640+10％FBS buffer)调节GS-J1/CD28细胞(金斯瑞)密度至2×106个/mL；将GS-C1/CD80细胞(金斯瑞)靶细胞用无抗生素培养基调整密度至1×106个/mL。待测抗体用测试缓冲液进行梯度稀释，CTLA-4蛋白用测试缓冲液稀释至100μg/mL。在384孔板中每孔依次加入调整好密度的20μL GS-J1/CD28、20μL GS-C1/CD80细胞、20μLCTLA-4蛋白、20μL待测抗体或测试缓冲液，将384孔板置于细胞培养箱培养24小时。24小时后，离心取细胞上清，用IL-2定量检测试剂盒(Cisbio)定量IL-2浓度，通过Graphprism软件对检测结果进行曲线拟合，计算抗体的EC50(nM)。
如图4所示，各候选抗体在报告基因试验功能检测方法中具有良好的功能活性，其中NB-27、NB-57、NB-783、NB-879的EC50在4～6nM之间，BMK1、BMK2、Yervory的EC50在7nM左右。NB-784功能活性不佳。
实施例6：VHH抗体人源化改造及亲和力检测
参考对纳米抗体做人源化的方法(J.Biol.Chem.2009；284:3273-3284)，使用CDR区移植的方法对NB-27、NGS-12、NGS-16、NB-879等4个VHH抗体做了人源化。各抗体的改型抗体序列如下表5所示。在IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)数据库筛选与NB-27、NGS-12、NGS-16、NB-879等4个同源性较高的种系(germline)为模板。使用Biacore对人源化前后的抗体做亲和力检测，将纯化的抗体流经预先固定protein A的传感器芯片，抗体被protein A捕获，然后将5个不同浓度的CTLA-4.His蛋白作为流动相，结合时间和解离时间分别为30min和60min。使用Biacore Evaluation Software 2.0(GE)分析结合速率(ka)、解离速率(kd)和平衡常数(KD)。检测结果如表3所示，改造后各抗体的亲和力没有下降，甚至有所提高。
表3.人源化改造后抗体亲和力(SPR)检测结果
Figure BDA0003287702920000231
Figure BDA0003287702920000241
实施例7：人源化改造后VHH抗体表征
(1)种属交叉试验
通过ELISA方法检测了3个人源化改造后VHH抗体(NB-27-Z5、NGS-12-Z1、NGS-16-Z2)分别与人、食蟹猴、鼠CTLA-4蛋白的结合情况，检测方法如实施例4中种属交叉试验所示，结果如图5A-5C所示，3个人源化抗体都与人、食蟹猴、鼠CTLA-4蛋白有较好的结合。
(2)细胞水平结合活性检测
通过FACS检测人源化改造后VHH抗体与过表达CTLA-4的293T细胞的结合活性，检测方法如实施例4中细胞水平结合活性检测部分所示。结果如图6所示，3个改造后抗体与过表达CTLA-4的293T细胞的结合EC50在7～10nM之间。
(3)细胞水平配体竞争试验
通过FACS检测人源化改造后VHH抗体竞争B7-1蛋白与过表达CTLA-4的293T细胞结合的情况，检测方法如实施例4中细胞水平配体竞争活性检测部分所示。结果如图7所示，NGS-12-Z1、NGS-16-Z2、NB-27-Z5等3个VHH抗体的IC50分别为2.6nM、2.4nM、1.8nM，改造均保持了较好的配体竞争活性。
实施例8：人源化改造后VHH抗体特异性验证
1)膜蛋白交叉反应
利用美国Integral molecular公司开发的膜蛋白阵列筛选平台(MembraneProteome Array，MPA)做膜蛋白交叉反应。将人的5300种不同膜蛋白通过转染HEK293细胞展示在细胞表面，通过FACS检测抗体在这些蛋白上的结合信号，以此评价待检测抗体的特异性。MPA筛选结果(图8A和图8B)显示，NB-27-Z5和NGS-12-Z1抗体只与人的CTLA-4蛋白结合，与其它5000多种蛋白均不结合。
2)组织交叉反应
选取34种组织做冰冻切片，常温晾干后使用丙酮固定。使用内源性生物素阻断试剂盒(生工，E674001)的试剂A和试剂B进行封闭，将生物素标记的抗体样品孵育30min，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Abcam，ab7403)孵育15min。使用DAB显色和苏木素复染，中性塑胶封片，自然风干后待镜检。阳性对照为Anti-CTLA-4抗体BMK1、BMK2，阴性对照为IgG4同型对照。
结果如表4所示。BMK1和BMK2在个别组织(睾丸、扁桃体)有少量阳性反应(小于5％)；NGS-16-Z2在个别组织有少量阳性反应(小于5％)。NGS-12-Z1和NB-27-Z5未见到明显的阳性反应，即与34种正常人体组织无明显特异性结合。
表4. 34种人体组织交叉反应试验结果汇总
Figure BDA0003287702920000261
Figure BDA0003287702920000271
实施例9：序列汇总
表5.抗体序列汇总表
Figure BDA0003287702920000272
Figure BDA0003287702920000281
Figure BDA0003287702920000291
Figure BDA0003287702920000301
Figure BDA0003287702920000311
Figure BDA0003287702920000321
Figure BDA0003287702920000331
表6.抗体CDR序列汇总表
Figure BDA0003287702920000332
序列表
<110> 浙江纳米抗体技术中心有限公司
<120> CTLA-4结合分子及其应用
<130> 217672
<160> 80
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR1
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa为S、L、D、F或G
<220>
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<222> (3)..(3)
<223> Xaa为T、N或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa为L、F或S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa为D、G或E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa为P、I、S、D或Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa为F、Y、H、Q或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa为V、D、A或S
<400> 1
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 2
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR2
<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa为T或无
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> CDR3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<220>
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<222> (2)..(2)
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<220>
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<222> (6)..(6)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa为Y、S、L、A、H或M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa为T、I、C、A或W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa为D、Y、S、L或V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa为Q、A、L、M或C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> Xaa为T、S、N或C
<220>
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<222> (14)..(14)
<223> Xaa为M、E、H、Q、A或无
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> Xaa为C、Y、G、H、A、N或无
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
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<223> Xaa为Y或无
<400> 3
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
20
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1 5
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Lys His Tyr Tyr Gly Tyr
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Ala Ala Ser Pro Asp Lys Ala Phe Tyr Thr Asp Gln Thr Met Cys Asn
1 5 10 15
Ile His Tyr Tyr Gly Tyr
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Ala Leu Gly Pro Glu Arg Tyr Phe Ser Ile Tyr Ala Thr
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Ala Ala Glu Arg Leu Val Phe His Leu Cys Ser Leu Ser Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr Asp Thr
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Ala Ser Val Pro Thr Leu Gly Thr Ala Cys Leu Met Thr His Gly Met
1 5 10 15
Arg Ser Asp
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Gly Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val His Ala Val Cys Asn Gln His Tyr
1 5 10 15
Phe Gly Tyr
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<213> Artificial
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Ala Ser Val Pro Ala Val Gln Thr Met Cys Leu Met Thr His Ala Ser
1 5 10 15
Arg Asp Asp
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<213> Artificial
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<223> CDR3
<400> 26
Thr Gly Lys Leu Leu His Pro Ser Leu Trp Ser Ala Cys Ala Asn Glu
1 5 10 15
Tyr Asp Leu
<210> 27
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Leu Asp Pro Phe
20 25 30
Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Val
35 40 45
Ala Cys Ile Asn Arg Ser Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
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115 120 125
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Leu Asp Pro Phe
20 25 30
Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Val
35 40 45
Ser Cys Ile Asn Arg Asn Arg Ala Ser Tyr Ala Asp Gly Val Lys Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
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100 105 110
Tyr Tyr Gly Tyr Trp Ala Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Ser Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ser Thr Leu Asp Pro Phe
20 25 30
Val Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Thr Val
35 40 45
Ser Cys Ile Asn Arg Asn Arg Ala Ser Tyr Ala Asp Gly Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ala Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
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100 105 110
Tyr Tyr Gly Tyr Trp Ala Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Asn Phe Gly Ile Tyr
20 25 30
Asp Phe Thr Trp Gly Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Asp Thr Leu Glu Ser Phe
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Leu
35 40 45
Ala Cys Ile Gly Arg Thr Gly Glu Phe Thr Asp Tyr Pro Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Val Asn Leu Lys Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Arg Leu Val Phe His Leu Cys Ser Leu Ser Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp His
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Gly Arg Thr Thr Tyr Leu Leu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Val Pro Thr Leu Gly Thr Ala Cys Leu Met Thr His Gly Met Arg
100 105 110
Ser Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Ser Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Asp Pro Glu Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val His Ala Val Cys Asn Gln His Tyr
100 105 110
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 125
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Asp Gln
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Cys Ile Ser Ser Ser Gly Arg Gly Thr Tyr Leu Leu Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Thr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Arg Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ser Val Pro Ala Val Gln Thr Met Cys Leu Met Thr His Ala Ser Arg
100 105 110
Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 35
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asp Tyr Trp
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Leu Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Ser Val Ile
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
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Thr Gly Lys Leu Leu His Pro Ser Leu Trp Ser Ala Cys Ala Asn Glu
100 105 110
Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 36
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val His Ala Val Cys Asn Gln His Tyr
100 105 110
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val His Ala Val Cys Asn Gln His Tyr
100 105 110
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 38
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Glu Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val His Ala Val Cys Asn Gln His Tyr
100 105 110
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 39
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Asp Pro Glu Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val His Ala Val Cys Asn Gln His Tyr
100 105 110
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 40
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ser Asp Tyr Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Asp Pro Glu Lys Glu Arg Glu Met Val
35 40 45
Ser Cys Ile Arg Ser Ser Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Leu Ala Pro Ile Ser Pro Val His Ala Val Cys Asn Gln His Tyr
100 105 110
Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 41
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asp Tyr Trp
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Leu Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Lys Leu Leu His Pro Ser Leu Trp Ser Ala Cys Ala Asn Glu
100 105 110
Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 42
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asp Tyr Trp
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Leu Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Ile
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Lys Leu Leu His Pro Ser Leu Trp Ser Ala Cys Ala Asn Glu
100 105 110
Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 43
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asp Tyr Trp
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Leu Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Lys Leu Leu His Pro Ser Leu Trp Ser Ala Cys Ala Asn Glu
100 105 110
Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 44
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Thr Leu Asp Tyr Trp
20 25 30
Ser Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Gly Thr Gly Leu Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Ile
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Lys Leu Leu His Pro Ser Leu Trp Ser Ala Cys Ala Asn Glu
100 105 110
Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 45
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<223> 抗体的氨基酸序列
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<223> 抗体的氨基酸序列
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<223> 抗体的氨基酸序列
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<223> 抗体的氨基酸序列
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<223> 抗体的氨基酸序列
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20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Val
35 40 45
Ala Cys Ile Gly Arg Thr Gly Glu Phe Thr Asp Tyr Pro Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Arg Leu Val Phe His Leu Cys Ser Leu Ser Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 72
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Thr Leu Glu Ser Phe
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Leu
35 40 45
Ala Cys Ile Gly Arg Thr Gly Glu Phe Thr Asp Tyr Pro Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Arg Leu Val Phe His Leu Cys Ser Leu Ser Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 73
<211> 126
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Asp Thr Leu Glu Ser Phe
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Glu Leu
35 40 45
Ala Cys Ile Gly Arg Thr Gly Glu Phe Thr Asp Tyr Pro Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Val Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Arg Leu Val Phe His Leu Cys Ser Leu Ser Glu Tyr Asp
100 105 110
Tyr Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 74
<211> 229
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 74
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 75
<211> 247
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr
130 135 140
Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu
145 150 155 160
Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe
180 185 190
Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 76
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 抗体的氨基酸序列
<400> 76
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ile Tyr Ser Ala Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Ala Ile Tyr Ile Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Val Ile Pro Thr Glu Thr Cys Leu Gly Gly Ser Trp Ser
100 105 110
Gly Pro Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Ser Ser
115 120 125
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 77
gtcctggctg ctcttctaca aggc 24
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 78
ggtacgtgct gttgaactgt tcc 23
<210> 79
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 79
gatgtgcagc tgcaggagtc tggrggagg 29
<210> 80
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 引物
<400> 80
ggactagtgc ggccgctgga gacggtgacc tgggt 35

Claims (13)

1.一种CTLA-4结合分子，包含抗CTLA-4单域抗体，所述单域抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:2所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:3所示的序列，其中，
SEQ ID NO:1是GX1X2X3X4X5X6X7，其中，X1为S、L、D、F或G，X2为T、N或S，X3为L、F或S，X4为D、G或E，X5为P、I、S、D或Y，X6为F、Y、H、Q或W，X7为V、D、A或S，
SEQ ID NO:2是X1X2X3X4X5X6X7X8，其中，X1为I或M，X2为N、G、S或R，X3为R、P、S或G，X4为S、N、D或T，X5为R或G，X6为T、A、D、E、R、G或L，X7为I、F、T、S、G、R或无，X8为T或无，
SEQ ID NO:3是X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22，其中，X1为A、G或T，X2为A、L、S或G，X3为S、G、E、V、A或K，X4为P、R或L，X5为D、E、L、T、I或A，X6为K、R、V、L、S或H，X7为P、A、Y、F、G或Q，X8为F、H、T、V或S，X9为Y、S、L、A、H或M，X10为T、I、C、A或W，X11为D、Y、S、L或V，X12为Q、A、L、M或C，X13为T、S、N或C，X14为M、E、H、Q、A或无，X15为C、Y、G、H、A、N或无，X16为N、D、M、Y、S、E或无，X17为K、I、Y、R、F或无，X18为H、D、S、G或无，X19为Y、T、D、L或无，X20为Y或无，X21为G或无，X22为Y或无。
2.如权利要求1所述的CTLA-4结合分子，其特征在于，所述单域抗体的CDR1包含SEQ IDNO:4-10中任一所示的序列，CDR2包含SEQ ID NO:11-18中任一所示的序列，和CDR3包含SEQID NO:19-26中任一所示的序列，
优选地，所述单域抗体含有以下组a1到组a9中任一组的SEQ ID NO所示的CDR1、CDR2和CDR3：
Figure FDA0003287702910000011
Figure FDA0003287702910000021
3.如权利要求1或2所述的CTLA-4结合分子，其特征在于，
所述单域抗体的FR区包含选自SEQ ID NO:27-73的任一VHH的FR区，和/或
所述单域抗体VHH如SEQ ID NO:27-73中任一所示，或与如SEQ ID NO:27-73中任一的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，和/或
所述CTLA-4结合分子是包含一条、两条或多条所述单域抗体的单价或多价单域抗体、多特异性单域抗体、重链抗体或其抗原结合片段、抗体或其抗原结合片段。
4.一种多核苷酸分子，其多核苷酸序列选自：
(1)权利要求1-3中任一项所述的CTLA-4结合分子的编码序列；
(2)(1)的互补序列；
(3)(1)或(2)中任一序列的长5-50bp的片段。
5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物包含权利要求4所述的多核苷酸分子；优选地，所述核酸构建物是重组载体或表达载体。
6.包含权利要求1-3中任一项所述的CTLA-4结合分子的噬菌体；优选地，所述CTLA-4结合分子展示于所述噬菌体表面。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞：
(1)表达权利要求1-3中任一项所述的CTLA-4结合分子；和/或
(2)包含权利要求4所述的多核苷酸分子；和/或
(3)包含权利要求5所述的核酸构建物。
8.一种产生CTLA-4结合分子的方法，包括：在适合产生CTLA-4结合分子的条件下培养权利要求7所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述CTLA-4结合分子。
9.一种药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的CTLA-4结合分子、权利要求4所述的多核苷酸分子、权利要求5所述的核酸构建物、权利要求6所述的噬菌体或权利要求7所述的宿主细胞，和药学上可接受的辅料；优选地，所述药物组合物用于治疗癌症。
10.权利要求1-3中任一项所述的CTLA-4结合分子在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
11.一种检测CTLA-4的试剂盒，用于评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含权利要求1-3中任一项所述的CTLA-4结合分子、权利要求4所述的多核苷酸分子、权利要求5所述的核酸构建物、权利要求6所述的噬菌体或权利要求7所述的宿主细胞；
优选地，所述试剂盒还包括用于检测CTLA-4与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合的试剂；
更优选地，所述试剂是通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
12.一种检测样品中CTLA-4存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以权利要求1-3中任一项所述的CTLA-4结合分子与样品孵育，和检测CTLA-4与单域抗体、抗体或其抗原结合片段的结合，从而确定样品中CTLA-4存在情况。
13.权利要求1-3中任一项所述的CTLA-4结合分子在制备用于检测样品中CTLA-4、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。
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