CN1125401A - 促红细胞生成素类似物组合物和方法 - Google Patents

Abstract

人促红细胞生成素的类似物，包括[X³³，Cys¹³⁹，des-Arg¹⁶⁶]和[Cys¹³⁹，des-Arg¹⁶⁶]类似物，以及生产和使用所述类似物的方法和含有所述类似物的组合物。

Description

促红细胞生成素类似物组合物和方法

本申请是未决美国专利申请系列No.08/055,076，(1993年4月29日申请)的部分连续申请。

技术领域

本发明涉及人促红细胞生成素的类似物，它是一种已知可用于诱导红细胞生成和治疗因红细胞或网状细胞数量低所引起的疾病(如贫血)的糖蛋白。本发明还涉及制备所述类似物的方法和组合物以及用所述类似物诱导红细胞生成并治疗因红细胞或网状细胞数不足而引起的疾病(如贫血)的方法。

本发明的背景

促红细胞生成素是一种天然存在的糖蛋白激素，首次报告的分子量约为39,000道尔顿(T.Miyaki et al.，J.Biol.Chem.252：5558-5564(1977))。成熟激素的长为166个氨基酸，带前导肽的激素“前原”形式为193个氨基酸长(F.Lin，美国专利4,703,008)。根据其氨基酸序列计算，成熟激素的分子量为18,399道尔顿(K.Jacobs et al.，Nature 313：806-810(1985)；J.K，Browne et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：693-702(1986))。

已鉴定了人尿促红细胞生成素的结构特征为des-Arg166形式，由特异性除去成熟蛋白质C末端的Arg残基而形成(M.A.Recnyet al.，J.Biol.Chem.262：17156-17163(1987)。Recny等人(同上文)认为，在人血浆中循环的促红细胞生成素的生理活化形式为des-Arg166形式。

人促红细胞生成素含三个N-连接的碳水化合物链(H.Sasakiet al.，J.Biol.Chem.262：12059-12076(1987)；E.Tsudaet al.，Biochemistry 27：5646-5654(1988)；和M Takeuchi etal.，J.Biol，Chem.263：3657-3663(1988))。在天然存在的尿促红细胞生成素和通过于培养的哺乳动物细胞中表达已转染至细胞并编码激素前原形式的克隆DNA而生产的激素两者中，促红细胞生成素的碳水化合物内含物相似。N-连接的糖基化位点位于氨基酸残基24，38和83。在氨基酸残基126，尿和重组促红细胞生成素还均含有一个O-连接的糖基化位点(H.Sasaki et al.，上文；E.Tsudaet al.，上文：M.Takeuchi et al.，上文；和M.Goto et al.，Biotechnology 6：67-71(1988))。促红细胞生成素的碳水化合物内含物是含有或不含N-乙酰乳糖胺重复单位(M.Takeuchi etal.，上文)的复合岩藻糖基化(fucosylated)四触角型链，并占促红细胞生成素质量的大约40％。

人促红细胞生成素作为一种糖蛋白激素主要由成年人肾产生(H.P.Koeffler and E.Goldwasser，Ann.Zutern.Med.97：44-47(1981))。在肾中产生促红细胞生成素的细胞稀少而且位于肾小管间质中肾实质的内皮层(S.T.Koury et al.，Blood 71：524-528(1988)，和C.Lacombe et al.，J.Clin.Invest.81：620-623(1988))。结果，肾组织的破坏，如发生肾功能衰竭，就会导致促红细胞生成素的产生减少，进而随之红细胞数减少，并发生贫血。

尽管胎肝细胞体外可产生促红细胞生成素(A.Kurtz et al.，Endocrinology 118：567-572(1986))，但在大多数晚期肾功能衰竭患者中，没有代偿性促红细胞生成素产生，而且只有在进行了成功的肾移植后，血清的促红细胞生成素水平才恢复正常(W.F.Dennyet al.，J.Lab.Clin.Med.67：386(1966))。

在大多数情况下，晚期红细胞生成是通过在一种组织中产生的一种糖基化激素-促红细胞生成素进行的。在具有高血细胞比容的人无肾患者中已报道了一种罕见的红细胞生成途径。已经表明在这类患者中分离的红细胞生成因子是人胰岛素样生长因子I或IGF-I(A.Brox et al.，Exp.Hematol.17：769-773(1989)和L.F.Congote et al.，J.Clin.Endocrin.Metab.72：727-729)。毫无疑问，IGF-1是L.F.Congote(Biochem.Biophys.Res.Comm.115：477-483(1983))描述的有体内和体外活性的牛红细胞向性因子的人对应物。已知IGF-1受体存在于人红细胞上，而且通过IGF-1和其特异性受体的相互作用，这些受体使得可以产生这种罕见的晚期促红细胞生成替代途径。(T.Izami et al.，J.Clin.Endocrinal Metab.62：1206-1212(1986)和C.D.Costigan etal.，Clin.Inuest.Med.11：4751(1988))。然而，促红细胞生成素受体基因的核苷酸序列是已知的，而且与人IGF-I受体的核苷酸序列没有序列同源性(A.D.D′Andrea et al.，Cell 57：277-285(1989))，这说明通过IGF-I的红细胞生成替代途径与促红细胞生成素介导的晚期促红细胞生成途径没有关系。

尽管还不了解其它的晚期红细胞生成替代途径，但已描述了几种可加强促红细胞生成素作用的因子。虽然早期的红细胞生成除取决于促红细胞生成素外，还取决于猝发启动活性，但晚期红细胞生成不但依赖于促红细胞生成素，而且受睾酮，雌激素，和类红细胞(erythroid)加强因子的影响(N.N.Iscove in HematopoieticCell Differentiation，eds.D.W.Golde，M.J.Cline and C.F.Fox[Academic Press，New York]pp 37-52)。已知象IL-3、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素9这类因子有猝发形成活性。但还不清楚这些活性是否对红细胞生成有任何生理学作用(J.Suda et al.，Blood 67：1002-1006(1986)；C.A.Sieff etal.，Science 230：1171-1173(1985)；和R.E.Donahoe et al.，Blood 75：2271-2275(1989))。最近，已表明一种称为“类红细胞分化因子”的因子能增强促红细胞生成素的体内和体外活性(H.E.Broxmeyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.85：9052-9056(1988)；J.Yu et al.，Nature 330：765-767(1987))。已证明这种因子与苯丙酸诺龙A(促滤泡素释放蛋白质)相同，并且受follistatin(一种苯丙酸诺龙A的特异性抑制剂)的抑制，但还未确定苯丙酸诺龙A的生理学作用(M.Shiozaki et al.，Proc.Netl.Acad.Sci.89：1553-1556(1992))。因此，研究了近二十年后，还不清楚红细胞生成除红细胞生成素外，还由什么激素控制。

在找不到影响红细胞生成的任何其他激素的情况下，在文献中已报道进行了若干种尝试以探索促红细胞生成素的结构并且通过定点诱变显著改善促红细胞生成素的特征。编码促红细胞生成素之人基因的分子克隆表明其DNA序列编码193个氨基酸的前原激素和166个氨基酸的成熟激素。由于可得到编码该激素和其前体(即前原形式)的克隆DNA，从而提供了用分子生物学中的标准方法进行诱变的机会(参见美国专利4,703,008上文)。

已经表明，通过氨基酸取代和缺失而制备的第一个突变促红细胞生成素(即促红细胞生成素类似物)其活性降低或未得到提高。如在美国专利4,703,008中描述的，用Phe置换15、49和145位的Tyr残基，用His置换7位的Cys，用Asp取代2位的Pro，缺失残基2-6，缺失残基163-166和缺失残基27-55并未使生物学活性得到显著的提高。Cys⁷到His⁷的突变使生物学活性丧失。在Asp残基24、38或83有一个氨基酸取代的一系列突变促红细胞生成素严重降低了活性(在24位的取代)或在细胞内迅速降解并显然不能分泌(在残基38或183的取代)。除去Ser126的O-连接的糖基化位点使促红细胞生成素类似物迅速降解或不能分泌(S.Dube et al.，J.Biol.Chem.33：17516-17521(1988))。这些作者得出结论：位于残基38、83和126的糖基化位点对于适当分泌是必需的，而且位于残基24和38的糖基化位点可能与成熟的促红细胞生成素的生物活性有关。

促红细胞生成素的糖基化对于体外生物活性是必需的这一观点与在体外生物检测中去糖基化的促红细胞生成素仍有全部活性的报道背道而驰(M.S.Dordel.et al.，Endocrinology 116：2293-2299(1985)；J.K.Browne et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quan.Biol.51：693-702(1986)；美国专利4,703,008；E.Tsuda.et al.，Eur.J.Biochem.188：405-411(1990)；和K.Yamaguchi，et al.，J.Biol.Chem.266：20434-20439(1991))。用寡核苷酸定向诱变己构建了一组与Dube等人(上文)研究的那些物质相似的促红细胞生成素类似物，以研究糖基化位点在促红细胞生成素之生物合成和生物活性中的作用(K.Yamaguchi et al.上文)。这些研究人员得出结论：糖基化对于促红细胞生成素的正确生物合成和分泌是至关重要的，但并影响该分子的体外活性。然而，Yamaguchi等人研究的、涉及改变糖基化位点的所有突变促红细胞生成素在体内没有生物活性。

普遍接受这一观点：促红细胞生成素的糖基化对于该激素的体内活性起着至关重要的作用(P.H.Lowy et al.，Nature 185：102-105(1060)；E.Goldwasser and C.K.H.Kund，Ann.N.Y.Acad.Science 149：49-53(1968)；W.A.Lukowsky and R.H.Painter，Can.J.Biochem.50：909-917(1972)；D.W.Briggset al.，Amer.J.Phys.201：1385-1388(1974)；J.C.Schooley.Exp.Hematol.13：994-998：N.Imai et al.，Eur.J.Biochem.194：457-462(1990)；M.S.Dordal et al.，Endocrinology 116：2293-2299(1985)：E.Tsuda et al.，Eur.J.Biochem.188：405-411(1990)；美国专利4,703,008；J.K.Brown et al.，Cold Spring Harbor Sympoia on Quant.Biol.51：693-702(1986)和K.Yamaguchi et al.，J.Biol.Chem.266：20434-20439(1991))。

据认为去糖基化的促红细胞生成素类似物在体内没有生物活性是由于去糖基化的激素从被处理动物的循环中迅速清除而造成的。通过直接比较糖基化和去糖基化促红细胞生成素的血浆半衰期而使这一观点得到支持(J.D.Spivak and B.B.Hoyans，Blood 73：90-99(1989)，和M.N.Fukada et al.，Blood 73：84-89(1989))。

促红细胞生成素糖基化位点的寡核苷酸定向诱变已有效地研究了糖基化作用的功能，但仍未能提供深入了解有关显著改善治疗用该激素之特征的有效策略。

已构建了涉及氨基酸残基15、24、49、76、78、83、143、145、160、161、162、163、164、165和166的一系列单氨基酸取代的缺失突变体。在这些突变体中，改变了促红细胞生成素的C末端、糖基化位点和Try残基。已将所述突变体施用于动物，同时监测血红蛋白、血细胞比容和网状细胞水平(EP 0409113)。尽管许多这类的突变体保持了体内生物活性，但与天然促红细胞生成素相比，没有一个能显著提高血红蛋白、血细胞比容或网状细胞(一种红细胞的直接前体)水平。

还构建了另一组突变体以研究残基99-119(第一功能区)和残基111-129(第二功能区)的功能(Y.Chern et al.，Eur.J.Biochem.202：225-230(1991))。第一功能区突变体被迅速降解并在体外生物检测中失活，而第二功能区突变体充其量不过保持了体外活性。与野生型人促红细胞生成素相比，这些突变体的体内生物活性没有提高。这些作者得出结论：残基99-119在促红细胞生成素的结构中起了重要作用。

人促红细胞生成素含两个二硫键，一个连接7位和161位的Cys残基，第二个连接29位和33位的Cys(P.-H.Lai et al.，J.Biol.Chem.261：3116-3121(1986))。用寡核苷酸定向诱变研究连接Cys 29和33的二硫键在人促红细胞生成素中的作用。将位置33的Cys变成Pro残基，在该残基模拟鼠促红细胞生成素的结构。所得突变体大大降低了体外活性。活性的丧失非常严重以致作者得出结论：残基29和33间的二硫键对于促红细胞生成素的功能是必需的(F.-K Lin，Molecular and Cellular Aspects ofErythropietin and Erythropiesis，pp.23-36：ed.I.N.Rich.Springer-Verlag.Berlin(1987))。

在人促红细胞生成素54位Met残基的位点特异性寡核苷酸定向诱变得到一个分子，它保持了母本(野生型)分子的体内生物活性，同时由于对氧化作用不敏感而有利于促红细胞生成素的制备(Shoemaker，美国专利4,835,260)。

在数种科学文献和专利申请中已描述了大量的人促红细胞生成素基因的突变体。这些突变体覆盖了该分子的全长，产生了部分或完全的去糖基化分子，改变了该分子中二硫键的结构，而且试图提高该分子的治疗活性。所有这些改变促红细胞生成素的努力，没有一种能成功地生产出体内生物活性提高或治疗应用特性有其它改善的分子。

不能鉴定后期红细胞生成的天然替代途径，因而也就不能成功地生产出体内活性提高的促红细胞生成素类似物，这使得无法进一步了解如何可以生产出经改善的促红细胞生成素分子。

本发明综述

现已发现，在人促红细胞生成素及其类似物139位用Cys取代Arg(包括其中33位的Cys用另一种氨基取代的那些)得到一种糖激素，它的体内红细胞生成活性和其治疗应用上的效力，如诱导红细胞生成和治疗贫血，有明显的改善。

另外，出乎意料地发现，通过在天然存在的野生型蛋白质的氨基酸序列中进行一种附加的、代偿性改变(在第二位置)，可以将哺乳动物，特别是人促红细胞生成素的第一类似物[由于在天然存在的野生型蛋白质氨基酸序列中的改变(在第一位置)而使其体外或体内生物活性明显降低甚至丧失]变成活性明显提高的第二类似物。在蛋白质的一级序列中，即使第二位置与第一位置相隔也能得到这种结果。确实已发现，所述第二类似物具有几乎相同或甚至大于野生型促红细胞生成素的体内或体外活性。在本文中，“相隔”指至少一个氨基酸位置，更好是至少约10个氨基酸位置，可能甚至多于100个氨基酸位置的间隔。很容易鉴别所述双突变体，其中，在一个位置上氨基酸的改变因另一相隔位置上的氨基酸改变而代偿或甚至克服了活性的降低。

还首次发现并公开了通过在哺乳动物细胞中表达编码类似物之前原形式(即在其氨基末端带有哺乳动物促红细胞生成素前导序列的类似物)的DNA序列，制备本发明之改进的促红细胞生成素类似物的方法和组合物。令人惊奇地是，当施用于贫血或非贫血哺乳动物时，本发明的大部分类似物实质上比天然促红细胞生成素在红细胞生成方面更具有活性，而且令人惊异的附加的且显著的优点是，以比天然促红细胞生成素低的施用频度就可达到预期的治疗效果。

本发明的哺乳动物(特制是人)促红细胞生成素的类似物保持了与相应的天然促红细胞生成素相似的免疫特征或体外生物活性，以致于通过天然糖激素所用的常规方法就可以很容易地测量并监测所述类似物在血液、培养基、药物制剂等中的浓度。附图的简要说明

结合附图描述本发明，其中：

图1是质粒pEPOw5的图示说明，在实施例1中描述了该质粒的构建。

图2是实施例1中描述的，用于从质粒pEPOw5(被修正的)和质粒SV2dhfrSVdeltaSJneo制备表达载体SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO的方法的图示，可以用所述的表达载体转化培养基中的哺乳动物细胞以制备天然人促红细胞生成素。

图3图示说明天然的“非重组”人促红细胞生成素(hEPO标准物)、天然的“重组”人促红细胞生成素和“重组”人促红细胞生成素类似物pm25的活性，其中天然的“重组”人促红细胞生成素(rEPO)是在已用表达载体SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO转化的dhfr-中国仓鼠卵巢细胞培养基中生产的，“重组”人促红细胞生成素类似物(pm25)是在已用表达载体SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO的类似物转化的dhfr-中国仓鼠卵巢细胞培养基中生产的，其残基33为Pro并且残基139为Cys，所述的表达载体类似物包含编码所述类似物前原形式而不是天然人促红细胞生成素的前原形式的DNA；和

图4是天然人促红细胞生成素和pm25的图示说明。本发明的详细描述

一方面，本发明是用Cys残基取代了天然糖激素139位Arg的人促红细胞生成素的类似物。

另一方面，本发明是一种进一步修饰的类似物，其中在野生型促红细胞生成素33位的Cys残基由另外19种天然存在的氨基酸中的一种(优选的是Pro)所取代。

在各例中，本发明类似物的优选实例是在166位缺乏Arg残基的那些分子(即：des-Arg¹⁶⁶)。

另一方面，本发明是双链DNA序列，它含有编码本发明促红细胞生成素类似物的498或495个核苷酸的片段。

另一方面，本发明还要求含有两个连续亚片段的双链DNA序列，其中，第一亚片段是上述498或495个核苷酸的片段，另一亚片段编码哺乳动物前原促红细胞生成素的前导肽，而且其中的两个亚片段是相连的，以便在由所述连续亚片段编码的单一多肽中，前导肽的C-末端与促红细胞生成素类似物的N-末端相邻。优选的前导肽是鼠、猴、仓鼠和人前原促红细胞生成素的那些，而且最优选的是人的前导肽。下文SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7列出了人和猴前导肽的氨基酸序列。

另一方面，本发明还要求一双链DNA序列，它是用于在培养的哺乳动物细胞中表达本发明前原促红细胞生成素类似物的真核表达载体。任何哺乳动物细胞均可用于该目的，但CHO(中国仓鼠卵巢)细胞是优选的。正如本领域所理解的，通过将编码所需类似物的cDNA序列与转录物转译所需的信号一起连接至将转录cDNA的载体中的某一位置而构建所述表达载体，届时，所述载体位于细胞(如哺乳动物细胞)中，所述细胞提供识别载体上启动转录的信号和从载体(包括相应于插入的cDNA的片段)转录的RNA上影响cDNA所编码之多肽的转译和生产的信号所必需的蛋白质和其它组分。在表达载体中定位“可操作表达”的cDNA指将其定位以便从载体转录并最终在用载体转化的细胞中转译RNA以得到由cDNA编码的蛋白质。

本发明还要求培养的哺乳动物细胞，在所述细胞中含有用于表达编码本发明前原促红细胞生成素类似物之cDNA的真核表达载体。所述表达导致成熟、糖基化的类似物分泌到培养基中。

本发明还包括使用哺乳动物细胞的方法，所述哺乳动物细胞包括一种适于在所述细胞中表达由共同编码前体多肽的两个相邻片段组成之DNA序列的真核表达载体。该前体多肽由哺乳动物前原促红细胞生成素的前导肽和人促红细胞生成素类似物组成，前者的C-端与后者的N-端相连。因此，所述片段之一编码所述前导肽，而所述片段的另一部分有498或495个碱基对，并编码本发明的促红细胞生成素类似物。上述方法包括在一定条件下于培养基中培养所述细胞，由此所述细胞将所述促红细胞类似物分泌至培养基中。然后从培养基中分离、纯化类似物，然后配制成用于哺乳动物，特别是人的药物组合物。

本发明还包括在红细胞生成中具有比活性的第二种人促红细胞生成素类似物，所述的比活性远大于第一种类似物，而第一种类似物在红细胞生成中的比活性明显低于天然人促红细胞生成素的。除在所述序列中的第一和第二位置上所述第二种类似物含有的氨基酸不同于在天然人促红细胞生成素序列之相同位置的氨基酸外，第二种类似物是一种与天然人促红细胞生成素具有相同氨基酸数量和序列的促红细胞生成素，而除在所述第一或第二位置上第一种类似物中的氨基酸与天然人促红细胞生成素序列中的氨基酸相同外，所述第一种类似物是一种与所述第二种类似物有相同氨基酸数量和序列的类似物。本发明“第二种类似物”的发现是基于我们发现可在氨基酸序列中进行代偿性改变以至少恢复因在“第一种类似物”中存在与天然糖蛋白之相应位置上的氨基酸不同的氨基酸而丧失的某些活性。在某些情况下，期望第二种类似物比天然糖激素更有活性(即在刺激红细胞生成时，具有更高的体内比活性)，而第一种类似物在体内无活性。

本发明还提供制备上文所述的第二种促红细胞生成素类似物的方法，该方法包括(a)制备都含有一cDNA序列的真核表达载体文库，为了表达将所述载体可操作性定位在哺乳动物细胞中，所述序列(i)编码天然人前原促红细胞生成素的双突变体(即，在天然糖激素中存在的氨基酸上，有两个位置的氨基酸改变的突变体)，(ii)含有编码第一种天然人促红细胞生成素类似物之非天然氨基酸的三联体(密码子)，其中第一种类似物基本没有刺激红细胞生成的活性，与天然人促红细胞生成素有相同的氨基酸数目，但在其序列中的一个位置上有一个氨基酸不同于天然人促红细胞生成素中相应位置上之氨基酸，和(iii)在cDNA的一个片段中含有一随机突变，该cDNA片段不编码天然前原促红细胞生成素之前导肽的任何部分，而且不包括编码所述第一种类似物之所述非天然氨基酸的三联体；(b)将所述表达载体文库转染至哺乳动物细胞中进行表达；和(c)筛选分泌所需第二种类似物的细胞。

本发明还提供用所述第二种双突变体类似物制备比第二种类似物有更高的刺激红细胞生成之体内活性的第三种类似物的方法，与第一种单突变体类似物相比，第二种双突变体类似物的活性得到提高，而第一种单突变体类似物的活性低于天然糖激素。该方法包括将在第一种类似物中见到的但在天然人促红细胞生成素中没有的所述第二种类似物中的氨基酸完成在天然人促红细胞生成素的相应位置上存在的氨基酸。

本发明还要求人促红细胞生成素的类似物，除在所述序列中一个位置上的氨基酸有差异外，所述类似物与天然人促红细胞生成素有相同的氨基酸数目和序列，而且它的红细胞生成活性远大于天然人促红细胞生成素，用刚才描述的方法，即使用其自身具有体内刺激红细胞生成比活性，且所述比活性至少与天然糖激素相同的第二种类似物制备所述类似物。

本发明还要求在哺乳动物(特别是人)中用于诱导红细胞生成和/或治疗贫血的药物组合物，所述组合物含有治疗有效量的本发明的人促红细胞类似物和药物学可接受的载体。在医生或兽医的指导下，以诱导所需红细胞生成有效量的所述数量或浓度施用所述的药物组合物，如本发明的类似物。所用的载体可以是任何生理学耐受的载体，包括但不限于以适于经注射(通常是静脉内或皮下)或其它方式施用的形式与糖激素结合的缓冲液、盐、稳定剂、防腐剂或其它辅剂。

基于与人促红细胞生成素相比的类似物的体内比活性和基于涉及施用人促红细胞生成素在人体中诱导红细胞生成并治疗各种疾病如贫血(包括肾衰竭患者中的贫血)所为本领域现已知道的，按本领域技术人员很容易确定的剂量方案施用。根据特定的类似物和其体内比活性，施用途径、患者的病情、年龄、体重或性别，患者对类似物或载体组分的敏感性，以及经管医生能够很容易考虑的其它因素，本发明类似物的剂量可随个体的不同而改变。有关本发明类似物的治疗用途，可以参考美国专利4,703,008和4,835,260；参见Physician′s.Desk Reference，46th Edition(Medical Economics Data，Montvale，New Jersey(1992))中p591-595有关(重组)[des-Arg¹⁶⁶]人促红细胞生成素的章节。市售重组[des-Arg¹⁶⁶]人促红细胞生成素制剂在每ml无防腐剂的含水溶液中含有2,000、3,000、4,000或10,000单位的糖激素，所述含水溶液含2.5mg/ml人血清白蛋白、5.8mg/ml柠檬酸钠、5.8mg/ml NaCl和0.06mg/ml柠檬酸，pH6.9(+/-0.3)。

本文涉及的促红细胞生成素，除特别说明，均指不含前导肽和166位Arg的“成熟”人蛋白质。

“前原促红细胞生成素”指编码前原形式的cDNA在哺乳动物细胞中表达后，加工成糖基化形式并最终将成熟蛋白质分泌到培养基中之前而包括前导肽和Arg¹⁶⁶的蛋白质。在SEQ ID NO：1中列出了天然人蛋白质和天然人前原蛋白质的氨基酸序列。

本文所用的术语“天然”和“野生型”是同义词。

本文用下列20种“天然存在的”氨基酸的标准缩写。L-丙氨酸      AlaL-精氨酸      ArgL-天冬酰胺    AsnL-天冬氨酸    AspL-半胱氨酸    CysL-谷氨酸      GluL-谷氨酰胺    Gln甘氨酸      GlyL-组氨酸      HisL-异亮氨酸    IleL-亮氨酸      LeuL-赖氨酸      LysL-甲硫氨酸    MetL-苯丙氨酸    PheL-脯氨酸      ProL-丝氨酸      SerL-苏氨酸      ThrL-色氨酸      TrpL-酪氨酸      TyrL-缬氨酸      Val

本文用标准的一字母密码子“A”“C”“G”和“T”分别代表核苷酸腺苷酸、胞苷酸、鸟苷酸、胸苷酸。本领域专业人员应知道，在DNA序列中，核苷酸是2′-脱氧核糖核苷酸-5′-磷酸(或，在5′-末端是三磷酸)，而在RNA序列中，核苷酸是核糖核苷酸-5′-磷酸(或在5′-末端是三磷酸)，而且尿苷酸(U)代替T。“N”指任何四种核苷酸之一。

本文涉及的一种类似物蛋白质“蛋白质X”，写作“[X^a，Y^b，des-Z^c]蛋白质X”，所指的类似物中已经用氨基酸X取代了天然蛋白质X中位置a上的氨基酸，已用氨基酸Y取代了天然蛋白质X中位置b上的氨基酸，并缺失了天然蛋白质X中位置c上正常存在的氨基酸Z。

本文所用的“SV2dhfrSVdeltaSJneo([X¹，Y^b]hEPO])”指表达裁体SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO，该表达载体带有编码前原促红细胞生成素(见SEQ ID NO：1)的cDNA，该cDNA由另一cDNA取代以便用所述载体转染后培养的哺乳动物细胞将分泌成熟促红细胞类似物的[X^a，Y^b]类似物。

用下列实施例详细说明而不是限制本发明。

本领域很容易得到并已知与完成本文所述各种方法有关的详细情况，如克隆，插入可操作表达的cDNA于表达载体中，将真核或哺乳动物表达载体转染至哺乳动物细胞中，并筛选转染的细胞，培养哺乳动物细胞以通过向培养基的分泌作用得到所需的异源蛋白质，测定DNA的序列，用聚合酶链反应(PCR)完成核酸扩增，合成用于完成所述扩增的引物，蛋白质或核酸纯化技术，等，以及如哺乳动物表达载体，适用于从所述载体表达的细胞系，培养转染细胞系的培养基，除人和猴之外的哺乳动物前原促红细胞生成素的前导肽，核酸扩增方法等之类的进一步的实例(参见例如，Current Protocols inMolecular Biology，eds.F.M.Ausubel et al.，WileyInterscience，John Wiley and Sons，Inc.New York(1993)through Supplement 21：the ATCC Catalogue of Cell Lines andHybridomas，7th Ed.，American Type Culture Collection，Rockville，Maryland，USA(1992)；and the ATCC MediaHandbook，American Type Culture Collection，Rockville，Maryland(1984))。

                  实施例1

     制备质粒表达载体SV2dhfrSVdeltaSJneoA.构建编码人促红细胞生成素的合成基因

用标准亚磷酰胺化学方法制备8个具有SEQ ID NO：8-15之序列的双链寡核苷酸，然后，借助Mandecki和Bolling在Gene 68：101-108中描述的Fok-1基因合成法用8个寡核苷酸制备编码全长人前原促红细胞生成素的DNA。将SEQ ID NO：8-14的各寡核苷酸连至pWM 500的SmaI位点，然后在该载体中克隆，Mandecki和Bolling(上文)描述了pWM500的构建。将SEQ ID NO：15的寡核苷酸连至pWM501(Mandecki和Bolling(上文)描述了其构建)的SmaI位点，然后在该载体中克隆。通过用Fok-1消化载体并经电洗脱从聚丙烯酰胺凝胶上纯化而得到克隆后的每个寡核苷酸。然后将8个寡核苷酸彼此相连以得到一个640个碱基对(“bp”)的多核苷酸，它含有625 bp的BamHI片段，该片段带有与含有编码前原促红细胞生成素之片段的SEQ ID NO：1的序列相同的预定序列。设计的640bp片段在5′-末端含有一个HindIII位点，在3′-末端含有唯一的EcoRI位点以便于随后的亚克隆。连接作用提供了640bp片段后，用EcoRI消化，用HindIII部分消化该片段，然后将所得的640bp片段连接到经相似消化的pUC19中以得到图1所示的质粒pEPOw5。确定pEPOw5中640bp片段的序列以证实前原促红细胞生成素编码片段确实编码人前原促红细胞生成素。B.通过寡核苷酸定向诱变纠正合成错误

pEPOw5的前原促红细胞生成素编码片段有两个核苷酸错误，这会导致人促红细胞生成素残基84和95位氨基酸的改变。为了更正该错误，以便位置84和95位上的氨基酸与人促红细胞生成素中的相同，要将SEQ ID NO：1中352位上的C变成T；353位上的T变成C；385位上的C变成G；387位上的A变成G。因此，用EcoRI完全消化并用HindIII部分消化pEPOw5。消化的质粒在0.7％的琼脂糖凝胶上电泳，用UEA型电洗脱仪(International Biotechnologies Inc.，New Haven，Connecticut，USA)以100V经1小时从琼脂糖上电洗脱约640bp的片段成7.5M醋酸铵盐桥。用HindIII和EcoRI完全消化M13mp18的复制形式，然后与洗脱片段相连。将连接的DNA转染至E.coli(DH5αF¹菌株)中，然后将噬菌斑转移到2×YT培养基中。在E.coli DH5αF¹细胞中制备性繁殖噬菌体。对E.coli CJ236细胞[dut-1，ung-1]滴定噬菌体，然后按MutaGene诱变盒(Bio-Rad Laboratories，Richmond，Califormia，USA)之制备商的说明，以0.2M.O.I.感染相同菌株而制备含尿嘧啶的噬菌体。按制造商的说明从噬菌体中提取模板DNA。通过将磷酸化的寡核苷酸1(SEQID NO：2的序列)和寡核苷酸2(SEQ ID NO：3的序列)同时退火而特定地诱变84和95残基以形成模板DNA。按诱变盒之制造商的说明，体外合成经过适当序列更正的DNA。将突变(更正的)DNA转染到DH5αF¹细胞中，然后分离噬菌体斑以进行DNA序列。序列确定后，亚克隆突变的(序列更正的)前原促红细胞生成素-编码DNA片段以按下述进行表达。合成的人前原促红细胞生成素的DNA序列列于SEQID NO：1。C.经寡核苷酸定向诱变构建编码前原-pm25之DNA

通过上述方法经寡核苷酸定向诱变，构建编码前原-pm25(即[Pro³³，Cys¹³⁹]人前原促红细胞生成素以得到正确的编码天然人前原促红细胞生成素的DNA。用编码正确的前原促红细胞生成素之DNA作为模板DNA以得到编码前原-pm25的DNA。DNA诱变引物是(i)具有SEQ ID NO：4所述序列的寡核苷酸3，其中在SEQ ID NO：4的199和200位上的核苷酸均变成了C，和(ii)具有SEQ ID NO：5所述序列的寡核苷酸4，其中在SEQ ID NO：1中517位上的核苷酸变成了T。D.将编码前原促红细胞生成素和编码前原pm25之DNA亚克隆到真核表达载体中

用XbaI将真核表达载体SV2dhfrSVdeltaSJneo消化2小时，用等体积的饱和酚/氯仿(1∶1)的缓冲液，接着用氯仿提取DNA。乙醇-沉淀消化的DNA，然后干燥并重悬于50ml TE(10mM Tris，pH8.0，10mM EDTA)中。在37℃，用牛碱性磷酸酶将消化的载体处理1小时。用酚∶氯仿和氯仿提取磷酸酶处理的载体，然后干燥并重悬于REact 2缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，10mM MgCl₂，50mMNaCl)(Gibco-BRL，Gaithersburg，Maryland，USA)中。通过与DNA聚合酶I的大片段(klenow)和0.1mM 2′-脱氧核糖核苷三磷酸于室温经30分钟填平反应以补平XbaI消化的载体的5′突起末端。经酚/氯仿提取除去klenow片段，乙醇沉淀DNA，并重悬于TE(50μl)中。

将编码人前原促红细胞生成素和前原pm25的DNA片段亚克隆至XbaI消化且klenow补平的表达载体中作为BamHI片段(也是补平的)。在E.coli菌株HB-101中作为质粒部分繁殖所说片段。通过用SDS在pH8.0裂解，随后经氯化铯梯度密度离心(T.Maniatiset al.，Molecular Cloning，pp 89-94，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，New York，1982)从1升培养物中制备纯化的质粒。用在260nm的吸光率确定质粒DNA的浓度。用BamHI消化制备量产物，然后在Tris-乙酸缓冲液中的0.7％琼脂糖凝胶上电泳。用UEA型电洗脱仪(Intemational Technologies Inc.)在100V经1小时从琼脂糖上电洗脱一个约625bp带至7.5M乙酸铵盐桥。乙醇沉淀洗脱的DNA，然后重悬于TE中。按上述有关表达载体的酶修复补平5′突起末端。用T4DNA连接酶在15℃经16小时连接平整的表达载体和片段。用连接的混合物转化E.coli，然后用标准方法鉴定正确的克隆。在1升阶段繁殖克隆，如上述用十二烷基磺酸钠(SDS)裂解和氯化铯密度梯度离心制备质粒DNA。将质粒(表达载体)于4℃贮存于TE中。将人前原促红细胞生成素的表达载体称为SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO，[Pro³³，Cys¹³⁹]人前原促红细胞生成素的表达载体称为SV2dhfrSVdeltaSJneopm25。在图2中图示说明了SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO的构建和亚克隆。

通过将新霉素抗性基因表达盒和SVdeltaSJ表达盒加到公开质粒pSV2-dhfr(美国典型培养物收集中心，Rockyille，Maryland，USA，寄存号：37146；Berg et al.，Mol.Cell.Biol，1：854-864(1981)中而构建SV2dhfrSVdeltaSJneo。质粒pSV2-dhfr有一个得自pBR322的2.3kbp Pvull-到-EcoRI片段(在图2中称为“oriPBR amp”)，包括来自pBR322的细菌复制原点(“ori”)及β-乳胺酶基因(提供氨苄青霉素抗性)(“amp”)。质粒pSV2-dhfr也有一个1.9kbp的表达盒，含有带T-抗原启动子(在图2中称为“SVE”的猿猴病毒40(SV40)DNA的0.34kbp的PvuII-到-HindIII片段，带编码鼠二氢叶酸还原酶(在图2中称为“dhfr”)之cDNA序列的0.74kbp HindIII-到-BglII片段，包括具有SV40 T-抗原mRNA拼接和多腺苷酸信号的0.82kbp BglII-到-BamHI片段之1.6kbp SV40 DNA BglII-到-EcoRI片段(图2中称为“SV40-A”)，以及具有未知功能之0.75kbp BamHI-到-EcoRI片段(图2中称为“SV40-B”)。用常规亚克隆方法(如，Maniatis et al.，上文)将新霉素抗性基因表达盒(以便给用载体转化的细胞提供新霉素抗性)插入质粒pSV2-dhfr的PvuII位点。新霉素抗性基因表达盒是一个1.8kbp的片段，含有带胸苷激酶启动子之单纯疱疹病毒-1(“HSV1”)DNA的0.25kbp PvuII到SmaI片段，编码提供新霉素抗性酶之转座子TnS的1.0kbp BglII-到-SmaI片段，和编码胸苷激酶mRNA多腺苷酸位点和信号之HSV 1 DNA的0.6kbp SmaI-到-PvuII片段，所有上述片段均是本领域专业人员很容易得到的。SVdeltaSJ表达盒是一2.5kbp的片段，含有带T-抗原启动子之SV40 DNA的0.34kbp PvuII-到-HindIII片段(在图2中“SVE”)，和用于插入异源DNA以使其在SV40 T抗原启动子控制下进行表达的XbaI位点，带有乙型肝炎病毒表面抗原基因的3′增强子的乙型肝炎病毒(adw亚型)DNA之0.44kbp的HpaI到BamHI片段(图中称“deltas”)，来自HSV1 DNA BamHIJ片段的1.85kbp BamHI-到-PvuII片段。预装配SVdeltaSJ盒，然后插入SV 2-dhfr的BamHI位点(用klenow补平后)。将新霉素抗性基因表达盒和SVdeltaSJ表达盒插入质粒pSV2-dhfr得到图2所示的质粒表达载体SV2dhfrSVdeltaSJneo。

                    实施例2

        另外构建编码pm25的合成基因

用另一种方法制备上述的SV2dhfrSVdeltaSJneopm25表达载体，用标准氨基亚磷酸脂化学法再合成编码全长pm25的DNA，按与实施例1所述相同的方法，制备一系列的双链寡核苷酸；但与实施例1的方法不同，当装配寡核苷酸形成一基因时，已在天然促红细胞生成素序列中含有突变，如编码位置33的Pro残基和139位的Cys残基发生变化。用Mandecki和Bolling(上文)的Fok-1基因合成法，或本领域技术人员已知的其他基因合成方法装配合成的寡核苷酸。通过装配的前原-pm25基因的标准DNA测序确定所得合成pm25基因的序列。

然后用以前所述的标准方法，如在合成前原-pm25基因的5′和3′端导入特有的限制位点，随后经核酸内切酶消化和亚克隆而将装配的前原-pm25基因亚克隆到质粒载体/表达载体。

                  实施例3

      经诱变RT-PCR另外构建前原-pm25基因

用反转录-聚合酶链反应也可以制备前原促红细胞类似物基因。所述方法的代表是制备编码前原pm25的DNA序列，其中用已知提高编码天然促红细胞生成素之基因的表达水平的方法(H.scholz etal.，Am.J.Physiol.263：474-479(1992))，用100μM氧化钴处理培养中的哺乳动物细胞。然后用冷盐溶液洗涤细胞，经离心从培养物中收集。通过再悬于含1％ Triton X-100的盐中而溶解细胞颗粒，然后离心除去核，得到含总mRNA的上清液。另外，可以用异氰酸胍溶解细胞颗粒以制备总RNA。

然后按制造商的说明，通过与Dynabeads Oligo dt25(脱氧胸苷)带寡核苷酸的珠(Dynal A/S，N-0212 Oslo，Norway)退火而分离mRNA。用标准方法，从异氰酸胍溶解的细胞中制备总RNA。用随机六聚引物和反转录酶，从由约10⁵个细胞中分离的Oligo dt-筛选的mRNA或约0.1μg的总RNA合成互补DNA。用cDNA作为模板进行诱变聚合酶链反应。用三组引物完成PCR反应，按各用一组引物的三种不同片段(氨基、中间和羧基)合成前原-pm25基因。

氨基片段的5′引物含有用于随后分子操作的限制位点和与cDNA模板5′末端互补的序列。氨基片段的3′引物含有用于分子操作的限制位点和与cDNA模板互补的序列。

中间片段的5′引物含有能氨基片段3′限制位点退火的限制位点，编码前原-pm25 33位Pro残基的密码子和与cDNA模板互补的序列。中间片段的3′引物含有编码前原-pm25 139位上Cys残基的密码子，用于随后分子操作的限制位点和与cDNA模板互补的序列。

羧基片段的5′引物含有能与中间片段的5′引物之5′限制位点退火的限制位点和与cDNA模板互补的序列。羧基片段的3′引物含有与cDNA模板互补的序列和用于随后操作的限制位点。

亚克隆各片段，在最后装配成完整前原-pm25基因前，确定序列。使用掺入各引物中的限制位点，经核酸内切酶限制消化并连接所得的互补末端而装配前原pm25基因。装配后的前原pm25基因含有在编码促红细胞生成素的信使以及前原pm25基因的编码序列中最初见到的5′和3′非转译序列。用本领域已知的方法，通过与前原pm25基因之编码序列互补的引物，经随后的PCR反应除去这些非转译序列。然后将编码前原pm25的完整基因亚克隆到以前所述的适宜表达载体中。

                   实施例4

          用转化的细胞系表达蛋白质A.转染二氢叶酸还原酶缺乏的中国仓鼠卵巢细胞

用阳离子脂质体介导的方法(P.L.Felgner，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.84：7413-7414(1987))，将质粒SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO和SV2dhfrSVdeltaSJneopm25转染到CHO/dhfr细胞[dxb-111](Uriacio et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.77：4461-4466(1980)；美国典型培养物收集中心，寄存号：CRL9096)(它是本领域专业人员可以得到的)中。用表达乙型肝炎病毒表面抗原的表达质粒进行相似的转染，用所得的转染细胞作为下述体内生物检测试验的阴性对照培养液。在用10％胎牛血清，L-Gln(1μM)补充的Ham′s F-12培养基中培养CHO/dhfr-细胞，在转染前24小时，以每瓶5－8×10⁵个细胞的密度新鲜接种到25cm烧瓶中，将10mg质粒DNA加到含2.4g/L碳酸氢钠(Gibco-BRL)的1.5ml Opti-MEM I还原的血清培养基中，将100mlLipofectin试剂(Gibco-BRL)(该试剂用于使DNA径脂质体介导的转染而至组织培养的细胞中)加到另一1.5ml Opti-MEM I培养基中。在聚苯乙烯试管中制备这两种溶液。将这两种溶液混合，并在室温下温育20分钟。从细胞中除去培养基，然后用Opti-MEM I-Lipofectin-DNA溶液代替。筛选前用培养基代替Opti-MEM I-Lipofectin-DNA溶液培养另一24小时，然后将细胞于37℃温育3小时。B.筛选和扩增

转染一天后，细胞传代1∶3，然后用dhfr/G418选择培养基(下文“F-12减培养基G”)温育。选择培养基是含L-Gln不含次黄嘌呤，含有胸苷或Gly(Gibco-BRL)，用透析的胎牛血清(JRH Biosciences，Lenexa，Kansas，USA)和每ml G418(Gibco-BRL)300μg。

用F-12减培养基将转染细胞培养4-5天后，出现了表明存在二氢叶酸还原酶(Ringold et al.，J.Mol.Appl.Genet.1：165-174(1981))加氨基苷磷酸转移酶(P.J.Southern and P.Berg.J.Mol Appl.Genet.1：327-341(1981))的菌落。约两星期后，充分扩大DHFR/G418细胞以传代并连续保持在F-12减培养基G中。

逐步用氨甲蝶呤筛选DHFR+，G418+细胞以扩增转染的促红细胞生成素或pm25基因(由R.Schimke，Cell 37：705-713(1984)综述的)。用含150nM氨甲蝶呤(MTX)的F-12减培养基G将细胞培养约2星期直到出现抗性菌落。将MTX抗性细胞传代并保持在适当的选择培养基中。用5μM MTX筛选进行进一步扩增，将细胞连续保持在适当的选择培养基中。C.细胞系的维持和贮存

每星期3次用适当的培养基更换在培养并进行各种筛选或扩增过程中的细胞。用标准方法，适当的培养基，将细胞传代1∶5入75cm²烧瓶中。在含5％ DMSO(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)的1.8ml适当培养基中再悬2－4×10⁶个细胞，进行低温贮存，然后在-80℃冷贮存24小时，再于-135℃永久贮存。D.在无血清培养基中生产促红细胞生成素和pm25

在含300μg/ml G418的F-12减培养基G中，使用表达促红细胞生成素(即，rEPO)或pm25的DNA转染的细胞生长至汇合，然后除去培养并用生产培养基(5ml/25cm²表面积)代替。生产培养基是含L-Gln，HEPES缓冲液，不含酚红(JRH Biosciences)的VAS培养基(用鱼硫酸鱼精蛋白补充的无血清培养基)将细胞在37℃培养3天，然后用条件培养基作为rEPO或pm25的来源。

从条件培养基得到的rEPO和pm25多肽均是des-Arg¹⁶⁶。

                实施例5

        表达蛋白质的体外生物活性A.体外生物检测

将放射性标记的胸苷掺入苯肼所处理之小鼠(G.Kvystal，Exp.Hematol.11：649-660(1983))的脾细胞从而确定促红细胞生成素活性。颈错位前72和96小时，经腹膜内(ip)经至少10周龄的雌性C57/6小鼠注射两次苯肼(60mg/kg)。取出最大的脾，轻轻梳理放到用0.2％牛血清白蛋白(BSA)补充的αMEM培养基(不含核苷酸)中。在50ml聚丙烯试管中将组织悬浮液温育1分钟，从大组织聚集物中取出脾细胞。用分析离心机以1,500rpm将脾细胞离心10分钟，然后重悬于脾培养基(SCM)中。SCM是含有抗生素、0.4％ BSA、2.0％ Nutridoma NS(Boehringer MannheimBiochemicals，Indianapolis，Indiana，USA)、有关红细胞生长所选的30％胎牛血清(Hyclone，Logan，Utah)和0.1mM 2-巯基乙醇的αMEM(不舍核苷酸)。使细胞悬浮液通过尼龙筛(200)以除去剩余的聚集物；然后用红细胞计数器计数成核的细胞。以8×10⁶细胞/ml使细胞于室温在SCM中温育约3小时，同时偶尔搅拌。将50ml等份的细胞悬液接种到U形96孔微滴定板上，向其中加入SCM中的等体积样品。在CO₂培养箱(5％ CO₂)中，将细胞于37℃温育22-24小时，然后向各孔加入0.6μCi氚标记的胸苷，然后再培养2小时。通过将微滴板放在冰上而终止反应。用PHD细胞收集器(Cambridge Technology，Watertown，Massachusetts，USA)将细胞收集到玻璃纤维盘上，用蒸馏水至少洗10次，用95％乙醇洗一次。用闪烁计数器(Beckman Instruments，Fullerton，California，USA)测量放射活性。在所有检测中，天然人非重组促红细胞生成素(Toyobo New York，Znc.，New York，USA)(hEPO)以0.25-16毫单位/孔作为阳性对照。每个数据点是至少3个孔/样品之三份确定值的平均数。

如图3所示，检测hEPO(即促红细胞生成素标准)、rEPO(即从用SV2dhfrSVdeltaSJneoEPO转染的CHO细胞得到的重组天然促红细胞生成素)和pm25时，得到了剂量浓赖性反应。图3中说明的数据是从系列稀释的纯化pm25和rEPO的检测中得到的，pm25从15μg/ml开始，rEPO从18μg/ml开始。这些数据清楚地说明；虽然pm25在33位上没有Cys残基，而且因此在残基29和33位之间不能形成本领域专业人员认为对于促红细胞生成素活性所必需的二硫键，但突变促红细胞生成素pm25([Pro³³，Cys¹³⁹])人促红细胞生成素)具有与人促红细胞生成素相同的体外活性。

B.放射免疫检测和体外比活性

除为得到标准曲线而包括作为阳性对照的hEPO外，其余均按制造商所述用商业放射免疫检测盒(Incstar，Stillwater，Minnesota，USA)确定rEPO和pm25的量。按如下所述，将rEPO纯化至匀质，并用氨基酸组合物分析确定质量。用Pico Tag Work站(Waters，Milford，Massachusetls，USA)，在155℃真空下，用约50-300pmol的蛋白质完成标准水解。在-80℃贮存纯化的标准，将一新鲜等份样品用于各放射性免疫检测的标准曲线。当所用的浓度范围在0.25-2.0ng/ml时，纯化的标准得到一线性反应(log浓度对计数)。在2ng/ml标准，观察到约1050计数；在1ng/ml，观察到约2000计数；在0.5ng/ml，观察到约3200计数；在0.25ng/ml，观察到约4250计数。因此，常规地计算出来自转染CHO细胞培养上清液的rEPO或pm25的体外比活性，而且范围在90,000到130,000单位/mg。

                  实施例6

           表达蛋白质的体内生物活性A.小麦胚凝集素层析

使来自各用rEPO，pm25和HbSAg(作为阴性对照)转染之细胞的条件培养基通过小麦胚凝集素-Sepharose标以进行部分纯化(约10倍)并浓缩促红细胞活性。将30ml条件培养基通过预先用磷酸缓冲盐(PBS)平衡的含1ml小麦胚凝集素-Sepharose(Sigma)的一次性微型柱(Spectrum Medical Industries，Inc.，Houston，Texax，USA)。收集流出物，然后第二次通过柱，接着用9个柱体积的PBS洗涤该拄，用1.5个柱体积的N，N-diacetylchitibiose(J.L.Spi yak et al.，Blood 52：1178-1188(1978))洗脱促红细胞活性。于-80℃贮存洗脱的物质直到用于体内生物检测。来自小麦胚凝集素层析之rEPO或pm25的体外活性与从条件生产培养基得到的数值没有区别。B.rEPO和pm25的饥饿大鼠的体内生物检测

用改良的饥饿大鼠生物检测(W.Fried et al.，Proc.Soc.Exp.Med.94：237-241(1957))确定rEPO和pm25的体内活性。在该检测中，监测网状细胞计数而不是放射性铁的掺入。用已经分别用上述小麦胚凝集素层析部分纯化的rEPO或pm25处理4或5组动物。阴性对照动物用从来自HbSAg转染细胞的条件生产培养基制备的小麦胚洗脱物处理。在一典型检测中，将大鼠从星期一到星期五断食，在星期二、星期三和星期四静脉内注射rEPO或pm25。在星期一和星期二确定网状细胞计数，取两个开始的网状细胞计数的平均值。星期五确定网状细胞计数，计算每个动物剩余网状细胞百分比，并计算每组的平均值。阴性对照大鼠通常保持了其开始网状细胞的约50％。将用rEPO或pm25处理之大鼠的结果表示为处理组的平均值与阴性对照的比率，用60或100ng的rEPO或pm25处理的大鼠在网状细胞方面表现出剂量依赖性的增加(见表1)。

                        表1

               体内生物检测结果

样品    处理            ％网状细胞数    处理/对照

模拟    T，W，Th            53            ---

EPO     60ng T，W，Th       81            1.54

EPO     100ng T，W，Th      102           1.94

pm25    60ng T，W，Th       108           2.05

pm25    100ng T，W，Th      132           2.50

用等剂量(按放射免疫检测确定的)的pm25处理之大鼠的剂量依赖性反应明显大于用rEPO处理所见到的。再用经体外单位确定的等剂量pm25或rEPO处理大鼠。与用等剂量rEPO处理的动物相比，用pm25处理的动物表现出反应提高(见表2)。

                       表2

              体内生物检测结果样品     处理         ％网状细胞数    处理/对照模拟     T，W，Th           36          ---EPO      1.75u T，W，Th     75          2.08EPO      5.25u T，W，Th     89          2.45EPO      8.75u T，W，Th    116          3.20pm25     1.75u T，W，Th     85          2.35pm25     5.25u T，W，Th    119          3.29pm25     8.75u T，W，Th    133          3.66

在用单剂量pm25处理的动物中，pm25的提高的效力也很明显。在星期二施用了单剂量pm25的大鼠与用三个剂量的rEPO处理的大鼠有基本相同的反应(见表3)。

                    表3

             体内生物检测结果

样品    处理            ％网状细胞数  处理/对照

模拟    T，W，Th          54           ---

EPO     20ng T，W，Th     78           1.45

EPO     60ng T，W，Th     80           1.48

EPO     100ng T，W，Th   106           1.97

pm25    100ng T only      92           1.71

与用3个剂量的rEPO(每天一次)处理的动物相比，用单剂量rEPO在星期二、星期三或星期四处理的大鼠没有这种相同反应(见表4)。

                       表4

              体内生物检测结果

样品    处理         ％网状细胞数    处理/对照

模拟    T，W，Th           38           ---

EPO    20ng T，W，Th       69           1.83

EPO    60ng T，W，Th       80           2.11

EPO    100ng T，W，Th     106           2.78

EPO    仅100ng T           59           1.55

EPO    仅100ng W           62           1.64

EPO    仅100ng Th          56           1.46

这些数据表明：在单剂量施用后(即：有效而不是多剂量)，pm25体内效力提高而且也是有效的促红细胞生成剂。C.流式细胞计数确定网状细胞

用噻唑橙染色，经流式细胞计数分析外周血网状细胞(L.G.Lee et al.，Cytometry 7：508-517(1986))确定网状细胞计数。按制造商的说明，制备肝素化的大鼠全血以用于使用Retic-COUNT^_噻唑橙染料(Becton Dickinson，San Jose，Cal ifornia，USA)的流式细胞计数。将各5ml的血样品与1ml噻唑橙染料混合，然后在室温黑暗中温育45分钟。用相类似的方法但没有噻唑而含有PBS制备不染色对照。由于延长染色会得到不正常的高值，在染色温育后90分钟内进行分析。

用配有488nm和15MW功率的氩离子激光的EPICS ELITE流式细胞计数器(Coulter Electronics，Hialeah，Florida USA)分析样品。收集对数(log)前倾再光散射，对数侧散射(90度)和对数绿荧光参数。使用标准ELITE滤光器；前倾光散射为中密度1，侧散射为488二色光长光径，绿荧光为525波数光径。

每天用Immuno-Check荧光球(Coulter Electronics)校准流式细胞计数器，然后用Immuno-Brite LevelII荧光球(CoulterElectroni cs)使之标准化。标准化补偿了在仪器刻度上每天的差异。建立计算机程序以收集三个频率分布曲线，二元参数对数侧散射对对数前倾散射，对数荧光对对数前散射，以及一元参数对数绿荧光。

分析着色样品以建立仅包括红细胞的栅栏口(gate)。在对数前倾散射对对数测散射曲线上，含淋巴和红细胞的群体周围画一不定形栅栏口，消除了血小板和背景残片。然后在对数荧光对对数前倾散射频率分布曲线上表示所述的口控群体。在阴性红细胞群体和阳性染色的网状细胞群体周围，但不包括高度染色的淋巴细胞群体，画一长方形栅栏口。在一元参数对数绿荧光频率分布曲线上表示口控红细胞群体。在仪器上分析未染色的对照样品，然后收集25,000个结果。光标放置于包括0.1％自荧光细胞，然后分析染色的样品。以全部红细胞的百分比表示网状细胞。

                    实施例7

                 纯化表达的蛋白质A.纯化rEPO

用离子交换、小麦胚植物凝集素和反相层析相结合，从条件生产培养基中纯化蛋白质rEPO。一般情况下，离心澄清10L条件培养基，然后用带10,000道尔顿分子量的截留膜的旋转浓缩器(Membrex，Garfield，New Jersey，USA)于4℃浓缩10倍。将浓缩的收集物以15,000×g离心30分钟，然后，如果需要，在将pH调到7.3-7.4后，用等体积含25KIU(千国际单位)抑肽酶/ml的冷蒸馏水稀释。将稀释的浓缩物通过系列相连的两个离子交换柱。第一个柱是S-Sepharose Fast Flow树脂(Pharmacia-LKB，Inc.，Piscattaway，New Jersy，USA)，第二个是DEAE Sepharose FastFlow树脂(Pharmacia-LKB)。每个柱均为1.6×33cm，用20mMNaH₂PO₄，pH7.4，20mM NaCl平衡。在这些条件下，rEPO不与任何一个柱结合，但由于其它蛋白质会结合从而达到基本纯化。将流出物和200ml洗液负载到预先用20mM NaH₂PO₄，pH7.4，20mM NaCl平衡的20ml小麦胚凝集素Sepharose柱(Sigma)上，然后用含135mNNaCl的缓冲液彻底洗涤。用含10mM N，N-diacetylclitibiose(J.L.Spivac et al，上文)的洗涤缓冲液洗脱rEPO。收集分离的部分(3.5ml)，将其调整到各含25KIU抑肽酶/ml，用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测每个rEPO(U.K.Laemmli，Nature 227：680-685(1970)；H.Schagger and G.von Jagow，Anal.Biochem，166：368-379(1987))。

收集由Coomassie Blue³染色检测的含最高水平rEPO的部分，用TFA(三氟乙酸)(30μl/ml)酸化，在POROS R2/H柱(2.1×100mm)(一种反相柱，PerSeptive Biosystems，Cambridge，Massachusetts，USA)上层析。平衡缓冲液是5％ CH₃CN中的0.1％TFA，洗脱缓冲液是80％ CH₃CN中的0.08％ TFA。上样后6分钟，进行15分钟的梯度洗脱(从0％到100％缓冲液)。人工收集分离的部分，用SDS-PAGE检测纯度。将rEPO于-80℃贮存。

在SDS-PAGE上，rEPO迁移到31,000和43,000道尔顿标记之间，近似分子量为36,000道尔顿。随后用蛋白酶Lys-C消化和氨基酸序列分析(见下文)证实存在rEPO而且没有其它蛋白质。B.纯化pm25

经与用于rEPO所述的相同方法纯化从条件生产培养基得到的蛋白质pm25。但不像rEPO，纯化pm25的SDS-PAGE电泳表明存在与pm25共纯化的电泳迁移率约60,000的一种或几种高分子蛋白质。由于这种高分子量蛋白质污染物，需要用一种改变的纯化方法将该高分子量成份与pm25分离。经前述的小麦胚凝集素-Sepharose层析步骤后，用5％CH₃CN(100μl/ml)中的10％ TFA酸化洗脱物。在SMART³高效液体层析系统(Pharmacia)上层析样品，用Pharmacia URPCC2/C18柱(2.1×100mm)，流速为200ml/分，通过监测吸光率自动收集含产物的部分。开始的缓冲液是5％ CH₃CN中的0.1％ TFA，洗脱缓冲液为80％ CH₃CN中的0.08％ TFA。上样5分钟后，洗脱缓冲液的浓度在1分钟内从0％增加到40％。30分钟内用40％到70％梯度的洗脱缓冲液洗脱pm25。用SMRAT系统“峰检测”能力收集分离的部分，用SDS-PAGE鉴别pm25。将部分纯化的pm25干燥，然后再溶于100mN CH₃CO₂NH₄，pH4.1，6M脲中。将样品上样到Mono-S阳离子交换柱(Pharmacia)(1.6×50mm)上，用相同的缓冲液平衡，然后用SMART系统在室温下层析。以100μl/分上样，以150μl/分层析。上样5分钟后，用内20分钟0-50％梯度的洗脱缓冲液(100mM CH₃CO₂NH₄，pH4.1，1M NaCl，6M脲)洗脱。用SMART系统“峰检测”能力收集分离的部分，用SDS-PAGE鉴定pm25。然后如上所述将冼脱的pm25在URPC C2/C18柱(2.1×100mm)上再层析。用5％ TFA酸化样品，以200μl/分上样到柱上。开始的缓冲液是5％ CH₃CN中的0.1％ TFA，洗脱缓冲液是在80％CH₃CN中的0.08％ TFA。用SMART系统“峰检测”能力收集分离的部分，用SDS-PAGE检测评估纯度。电泳分析表明在29,000和43,000道尔顿标记之间迁移出一个单带，表观分子量为约36,000道尔顿。随后用Lys-C的蛋白酶消化和序列分析表明存在pm25而且没有其它蛋白质。

                实施例8

           纯化蛋白质的生物活性A.在非贫血大鼠模型中，rEPO和pm25的体内活性

通过测量处理和模拟处理大鼠的血细胞比容，在长期非贫血大鼠模型中比较纯化的rEPO和pm25的生物活性。用rEPO或pm25每星期对5只大鼠的组处理3次或用载体(含0.2％ BSA的PBS)模拟处理，总共四个星期。用载体中的150、300、450或600ng rEPO静脉内注射处理四组动物，用载体中的150或300ng pm25以相同方法处理两组。用一组动物作对照并且每星期3次共4周用载体静脉内处理。在四周末确定每个动物的血细胞比容，并从每组计算平均血细胞比容值。用150ng pm25处理的动物与用300ng rEPO处理的动物有基本相同的反应。相似地，用300ng pm25处理的动物与用600ng rEPO处理的动物有基本相同的反应。因此，在该长期模型中，在提高被处理动物的血细胞比容方面，pm25的效力约是天然重组促红细胞生成素的2倍(见表5)。

                   表5

          长期体内生物检测结果

样品    处理          血细胞比容(最终的)

模拟    M，W，F         52.3

EPO    150ng M，W，F    53.3

EPO    300ng M，W，F    58.0

EPO    450ng M，W，F    60.2

EPO    600ng M，W，F    62.6

pm25   150ng M，W，F    58.3

pm25   300ng M，W，F    65.8

在相似的实例中，用每周一剂pm25与rEPO每周3次的剂量相比。一组动物用300ng rEPO处理每周3次共4周。两组动物用450或600ng pm25每周处理一次。一组动物用载体每周处理3次并作为模拟处理对照。在每周的处理期末，测定每个动物的血细胞比容，然后计算每组的平均血细胞比容值。用pm25每周处理一次的动物与用300ng rEPO每同处理3次的动物有基本相同的反应。这些数据表明与促红细胞生成素相比，pm25具有降低给药频率的优点(见表6)。

                  表6

       长期体内生物检测结果

样品    处理          血细胞比容(最终的)

模拟    M，W，F          52.8

EPO     300ng M，W，F    58.4

pm25    450ng W only     56.2

pm25    600ng W only     58.8

在另一相关实验中，通过在一长期非贫血大鼠模型中每周施用一次rEPO，并比较模拟处理和rEPO处理动物的血细胞比容来检测rEPO的每周一次的剂量。5只动物的组用载体(含0.2％ BSA的PBS)模拟处理、用rFPO每周处理3次或用rEPO每周处理一次共四周。

一组动物单用载体每周处理3次共四周，并作为载体对照。三组动物用150,300或450ng在载体中的rEPO每周处理3次共四周。另三组动物用300,600或900ng在载体中的rEPO每周处理一次共四周。

每周处理3次的动物在55.3％到60.8％的范围内，血细胞比容水平呈剂量依赖性增加(见表7)。与载体处理的对照相比，用300或600ng rEPO每周处理一次的动物血细胞比容没有明显的增加，但与载体处理的动物相比，用900ng每周处理一次的动物血细胞比容只有中度的增加，而明显比在用最低剂量rEPO每周施用3次处理的动物中所见到的增加程度低。与表6中所列的每周施用pm25所得的数据相比，这些数据说明在每周给药一次后，本发明类似物产生的体内促红细胞生成作用大于天然促红细胞生成素。

                 表7长期体内生物检测结果

样品    处理              血细胞比容(最终的)

模拟    每周3次(TIW)         51.0

EPO     150ng TIW            55.3

EPO     300ng TIW            57.0

EPO     450ng TIW            60.8

EPO     每周一次300ng(QW)    51.3

EPO     600ng QW             50.5

EPO     900ng QW             53.0B.在非贫血Cynomolus猴模型中rEPO和pm25的体内活性

在长期非贫血Cynomolus猴模型中，通过测量每周用rEPO处理3次或每周用pm25处理一次的Cynomolus猴的血细胞比容和血红蛋白浓度而比较纯化rEPO和pm25的生物活性。雄性动物分成两组，每组5只。处理前，一周中每间隔48小时取0.5ml血测定三次血细胞比容和血红蛋白浓度。用每组三次测定结果的平均值作为每组动物的预处理值。

一组动物用2μg/kg rEPO每周处理3次共4星期。第二组动物用4μg/kg pm25每周处理一次共四同。已知用促红细胞生成素处理会减少循环铁，而且会因可用铁的减少而降低药物的效力(J.Eschbach et al.，New Eng.J.of Med.316：73-78(1987))；结果，每星期用10mg胨化铁(Rogenic，Forest Pharmaceuticals，st.Louis，Missouri，USA)处理两种治疗组的Cynomolus猴以消除可能因rEPO或pm25而产生的或者限制rEPO或pm25效力的任何铁缺乏。

在处理期末，以72小时的间隔测量两次血细胞比容和血红蛋白浓度。最后的血细胞比容和血红蛋白浓度是这些值的平均值；发现用rEPO每周处理3次的动物和用pm25每周处理一次的动物的血细胞比容和血红蛋白质基本相同(见表8)。

                       表8

               长期体内生物检测结果

                      血细胞比容      血红蛋白(g/dl)样品    处理             预处理   最终   预处理   最终EPO    200单位/kg TIW     37.8    41.5    10.3    11.5pm25   240单位/kg QW      37.7    40.8    10.2    11.2

                     实施例9

               表达蛋白质的结构特征A.蛋白酶Lys-C消化纯化的rEPO和pm25

用Lys-C(K.L.Stone et al.，A Practical Guide toProtein and Peptide Purification for Microsequencing pp.31-471.ed.P.L.Maztsudaira，Academic Press(1989))消化rEPO和pm25，分析所得的肽以绘制这些分子中二硫键的位置图谱。典型情况下，将100μg纯化蛋白质在微离心管中干燥，用50μl400mM NH₄HCO₃，pH8.2，2mM EDTA，8M脲(去离子的)溶解蛋白质。在Lys-C消化前，还原每种的第二个样品。在氮气下，用4.5mM的二硫苏糖醇于37℃还原30分钟；还原后，将样品平衡到室温，在氨气和黑暗中于室温用10mM碘乙酸烷基化。用蒸馏水稀释还原和非还原样品以使脲浓度达到2M。在氮气下，于37℃用1.5μgLys-C将蛋白质消化2-3小时，然后再加入1.5μg的酶，继续消化15小时。通过加入TFA到0.5％而终止消化。经使用uPCR C2/C18柱(2.1×100mm)和SMART系统(Pharmacia)的反相高效液体层析(HPLC)分离肽。平衡缓冲液是5％ CH₃CN中的0.1％ TFA，洗脱缓冲液是80％ CH₃CN中的0.08％ TFA。流速为200μl/分。上样后5分钟，进行55分钟的梯度洗脱(从0到100％缓冲液)。用SMART系统“峰检测”能力收集洗脱的峰。在氨基酸测序前，将分离的部分贮存于-20℃。用备有ABI型120A PTH分析仪的ABI型470A或477A测序仪(Applied Biosystems，Inc.Foster City，Califomia，USA)经氨基酸测序(R.M.Hewick et al.J.Biol.Chem.256：7990-7997(1981))确定Lys-C肽的特性。收集数据，并用带有层析数据管理软件包的用于氨基酸序列分析的PE Nelson软件系统(Access^* Chrom，Micro Vax 2000，Cupertino，California，USA)分析。B.鉴定二硫键在rEPO和pm25中的位置

估计在分子中所推测的促红细胞生成素氨基酸序列有8个Lys残基。实施例1中描述的pm25的构建并未改变Lys残基的数目或位置。因此，这两种分子应有相似的Lys-C肽，只是因在pm25中33和139位氨基酸的改变而会稍有差异。由氨基酸序列预计，当rEPO或pm25被Lys-C消化时将由这些分子产生9种Lys-C肽。在图4中描述了这两种分子的Lys-C片段的位置。用K1到K9表示这些片段，括号中表示每种肽内所含的促红细胞生成素残基。包括了已知在促红细胞生成素中存在的二硫键位置(P.H.Lai et al.，J.Biol.Chem.261：3116-3121(1986))以及在pm25中连接29和139位Cys残基的可能的新二硫键。

rEPO的Lys-C消化产物的反相层析表明其模式与以前报道的一种非重组促红细胞生成素(hEPO)(M.A.Recny et al.，J.Biol.Chem.262：17156-17163(1967))非常接近，而且与图4所示的一致。层析肽的分布是以肽片段的氨基酸定序为基础。比较还原和非还原rEPO的肽图谱表明：在未还原样品中，肽K1和K9共层折，在还原样品中以不同的保留时间冼脱。这是在rEPO(和hEPO)中肽K1和K9间存在二硫键的有利证据。还原的非还原pm25的肽图谱检测说明肽K1和K9的肽图谱相同。但是，还原和非还原样品中的肽K2和K6也表现出改变的保留时间。在非还原pm25样品中，肽K2与K6共层析，在还原pm25样品中，有完全不同的保留时间。认为这是肽K2和K6由图4所示二硫肽相连的有利证据。

                  实施例10

           制备促红细胞生成素的双突变体

按如下步骤制备哺乳动物促红细胞生成素的双突变体，其中导致活性明显损失的第一位置上的突变(氨基酸变化)为第二位置上的突变所补偿，以致双突变体的活性明显大于在第一位置上有使活性降低之突变的突变体之活性，在蛋白质的一级结构中，所述第二位置与第一位置相隔。在本实施例的内容中，正如本领域专业人员所知的，除非特别说明，“活性”指体内红细胞生成中的比活性。

第一种人促红细胞生成素的双突变体是pm25，其中在残基33上的第一突变基本降低了红细胞生成的活性，而在残基139从Arg变成Cys的第二突变完全恢复了活性而且可能甚至比野生型糖激素的促红细胞生成活性都高。这说明在哺乳动物促红细胞生成素中细胞内代偿突变是可能的，可得到各种该糖激素的双突变体，包括红细胞生成活性实质上提高后高于相应野生型糖激素的所述双突变体。

由于在一个位置上的氨基酸有变化，所以第一突变体活性降低(且和典型情况下基本上没有活性)，本领域技术人员很容易由编码第一突变体的第一cDNA开始，产生大量的第二突变体。它不同于第一突变体，在第二或随后的位置上有一个或多个氨基酸改变，因此可以表达-筛选编码具有所需水平之红细胞生成活性的第二突变体的第二cDNA。

将用人促红细胞生成素和典型例子说明该方法，其中第一突变体没有体外红细胞生成活性。然而，显而易见地，用任何哺乳动物促红细胞生成素和例子均可应用本方法，在所述例子中，与野生型相比，第一突变体的活性有所降低但未失去。

该方法要求四个步骤，从编码人促红细胞生成素的前原第一突变之第一cDNA开始。典型地是，编码前导肽的cDNA片段将编码前原人促红细胞生成素的前导肽。在第一步中，在第一cDNA的位点上产生大量随机突变，以便在成熟糖蛋白的一级序列中，任何所得的氨基酸改变均在与第一突变体中氨基酸改变之位置相隔的位置上。甚至当突变必需是沿编码前原第一突变体之整个cDNA随机分布时，它们大部分在核苷酸三联体(密码子)中，所述三联体在第一cDNA编码前导肽的片段之外并在成熟蛋白质的一级序列中，相当于在与第一失活突变糖激素中氨基酸改变之位置相隔的位置上的氨基酸。“相隔”指至少1个或者更典型地至少10个氨基酸位置的间隔。

第二，将第一步的所有随机突变的第二cDNA连接，以克隆到真核表达裁体中，然后在适宜的宿主中克隆所得的会随机突变的第二cDNA之载体的文库(“随机文库”)以制备适合需要数量的文库载体。

第三，将随机文库转染到真核细胞(如CHO细胞或其它适宜的哺乳动物细胞)中，其中在文库表达载体中的随机突变的第二cDNA能够被表达并加工，从而分泌成熟的第二突变体。然后培养细胞，然后筛选所得的细胞群以分离单细胞克隆，所述克隆产生在体外检测中具有所述活性的促红细胞生成素活性。具有所述活性的克隆生产作为第二突变体的促红细胞生成素类似物，其中第二突变补偿了第一突变体中缺乏的活性。

第四，用聚合酶链反应(“PCR”)或任何其它核酸扩增技术扩增编码促红细胞生成素第二突变体的第二cDNA，所述第二突变体来自生产它的克隆，将扩增的核酸测序以确定第二、代偿突变的位置和氨基酸改变。尽管用刚才所述的随机诱变编码前原第一突变体之DNA的方法生产的“代偿突变”可以包括不止一个位置上的氨基酸改变，或氨基酸加入或缺失，但也可能所述突变仅包括一个位置上的氨基酸改变。

然后将所得的新鉴定的编码双突变体促红细胞生成素的cDNA用在适当真核表达载体中，通过培养用载体转化的哺乳动物细胞而生产双突变体糖激素，在适宜的动物模型(如上文所述有关pm25的)中，检测所产生之双突变体的体内比活性。

PCR诱变方法是一种在与天然蛋白质中的第一突变之位点相隔的位点上可导入导致代偿性氨基酸改变的第二突变的方法。在所述方法中，两个PCR引物的3′末端包括其目的在于导入第二突变的cDNA片段，PCR引物之一与包括第一突变的片段退火，结果使第一突变在PCR过程中不会进一步突变。与引物链之一退火进行引物延伸的第一cDNA的片段受到保护而不发生诱变。将突变随机导入为引物3′末端所包括的第一cDNA的片段中。引物之间的距离越大，则暴露于突变的第一cDNA(编码失活或活性降低的第一突变体)之区域越大，所述突变会在糖激素中导入补偿性细胞内氨基酸突变。每个引物要么包括限制性位点的一条链要么与包括限制性位点一条链的第一cDNA之片段退火以利于将PCR扩增的片段导入表达载体，从而表达促红细胞生成素的任何前原双突变体。在有利于核苷酸掺入错误的条件下完成PCR过程。所述条件包括在PCR扩增反应混合物中使用浓度为1mM的三种2′-脱氧核糖核苷-5′-三磷酸，浓度为200μM的第四种，及0.5mM Mn⁺²，6mM Mg⁺²和Taq聚合酶。

更具体地说，对于双突变体pm25来说，按如下所述完成该过程：用编码失活或活性降低之促红细胞生成素类似物的第一cDNA(如在位置33有Cys变成Pro的一种突变)作为模板开始使用PCR的诱变。一种所述的带一cDNA仅因在199和200位有CC而具有不同SEQ IDNO：1所示的序列。以这种第一cDNA为例进行说明，使用第一PCR引物，它与cDNA链的片段(包括199和200位上之CC)杂交，所述cDNA(除199-200位外)具有SEQ ID NO：1所述的序列。还使用了第二引物，它与第一引物不与之退火的那条cDNA链杂交。第二引物和其3′末端与SEQ ID NO：1所示3′517位碱基配对的那条链的片段退火。因此，在PCR诱变过程中，可能是将相当于SEQ ID NO：1中碱基517之第一cDNA的碱基对可诱变成T，这样将三联体517-519变成编码Cys的密码子。

然后利用上述掺入PCR产物中的位点，用限制酶消化PCR诱变的产物，它包括在界定扩增产物末端的引物间含有随机突变的一些序列。然后将来自消化的、其大小包括带有随机突变之片段的片段连到适当的真核表达载体中，可操作表达并从培养的哺乳动物细胞中分泌双突变的促红细胞生成素类似物。所述表达载体将提供在成熟双突变体N末端的哺乳动物(在本文情况下最好是人)的促红细胞生成素前导肽，这将使其糖基化和分泌，当然也提供适宜的转录信号以及在哺乳动物细胞中表达前原促红细胞生成素双突变体所需的其它步骤。该载体也适用于克隆，以提供足够量用于哺乳动物细胞转染和其它用途的载体。例如，首先可将PCR扩增的片段与编码部分前原促红细胞生成素的片段相连，以得到含编码全长前原促红细胞生成素双突变体之cDNA的片段。然后可将编码全长蛋白质的这些片段连到载体如SV2dhfrSVdeltaSJneo中，以提供用于双突变体的适当表达载体。

然后在适宜的宿主，如E.coli中克隆含掺入双突变cDNA的所得的表达载体文库，以得到足够量的文库进行进一步的工作。

将带有双突变cDNA的表达载体文库转染到上文实施例2所述的哺乳动物细胞(如CHO细胞)中。可将细胞培养为单细胞克隆或少量(如，约10)细胞的菌落。然后筛选每个培养物的体内红细胞生成活性。筛选阳性(对于所述体内活性)的培养物仅是其中表达促红细胞生成素类似物的那些培养物，所述类似物具有第二随机突变，可代偿因第一(如Cys³³到Pro³³)突变而导致的活性减弱。将具有活性但由不止一个细胞生长成的培养物亚培养成单细胞克隆以分离产生双突变的活性类似物的细胞。

从产生生物活性糖激素的细胞中可分离编码类似物的cDNA，然后用标准技术测序以鉴别在来自所述细胞的促红细胞生成素中的第二代偿性突变。

可以培养生产具有生物活性之糖激素的细胞，然后从培养基中可分离并纯化糖激素，在适当的动物模型内检测体内红细胞生成活性。因此，由于提高的效力，延长的半衰期等，可以发现具有提高之药物效用的双突变类似物。

可以认识到，通过消除第一失活突变，可以将促红细胞生成素的双突变体变成甚至更有活性的突变体，所述的双突变体具有恢复第一失活突变体之体内红细胞生成活性的代偿性突变。因此，本发明还提供有体内红细胞生成活性的哺乳动物(优选的是人)促红细胞生成素的单突变类似物。本发明的所述单突变类似物在成熟野生型糖激素的序列中有一个第一氨基酸改变，其中当所说的第一改变产生于已有一个第二氨基酸改变而且体内红细胞生成活性低于野生型糖激素的类似物中时，所述第一改变可以提高具有一个第二氨基酸改变之单突变类似物的体内红细胞生成活性。本发明的所述单突变类似物的范例是人促红细胞生成素[Cys¹³⁹]类似物。

尽管已在上文详细描述了本发明的实施例，但对本领域专业人员显而易见的所描述的修改和变化也完全在由下列权利要求所限定的本发明主旨和其范围内。

                  序列表(1)一般资料

(i)申请人：Okasinski，Gregory F.

           DeVries，Peter J.

           Mellovitz，Barry S.

           Meuth，Joseph L.

           Schaefer，Verlyn G.

(ii)发明题目：促红细胞生成素类似物组合物和方法

(iii)序列数目：15

(iv)相关地址：

    (A)收件人：Abbott Laboratories

    (B)街道：Dept.377-AP6D One Abbott Park Road

    (C)城市：North Chicago

    (D)街道：Illinois

    (E)国家：United States

    (F)邮政编码：60064-3500

    (V)计算机可读形式：

    (A)介质类型：Floppy disk

    (B)计算机：IBM PC兼容的

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：MS-DOS Ver.5.0 ASCII Text Editor

(vi)目前的申请资料：

    (A)申请号：US 08/055,076

    (B)申请日：29-APR-1993

    (C)分类号：

(viii)代理人/代理资料：

    (A)姓名：Weinstock，Steven W.

    (B)注册号：30,117

    (C)参考/备案号：5282.US.01

(ix)电讯资料：

    (A)电话：(708)937-2341

    (B)传真：(708)938-2623(2)SEQ ID NO：1的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：625个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GGATCCCCGC CAGGCGCCAC C ATG GGG GTG CAC GAA TGT CCT GCC   45

                    Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala

                            -25                 -20TGG CTG TGG CTT CTC CTG TCC CTG CTG TCG CTC CCT CTG GGC   87Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro Leu Gly

            -15                 -10CTC CCA GTA CTG GGC GCC CCA CCA CGC CTC ATA TGT GAC TCG  129Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser-5                   1               5CGA GTC CTC GAG AGG TAC CTC TTG GAG GCC AAG GAG GCC GAG  171Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu10                  15                  20AAT ATT ACG ACG GGC TGT GCT GAG CAC TGC AGC TTG AAT GAG  213Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

 25                  30                  35AAT ATC ACT GTC CCA GAC ACC AAA GTT AAC TTC TAT GCA TGG  255Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp

     40                  45                  50AAG AGA ATG GAG GTC GGG CAG CAG GCC GTA GAA GTC TGG CAG  297Lys Arg Mer Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln

         55                  60                  65GGC CTG GCC CTG CTG TCG GAA GCT GTT CTG CGG GGC CAG GCC  339Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala

             70                  75CTG TTG GTC AAT TCC TCC CAG CCG TGG GAG CCC CTG CAG CTG  381Leu Leu Val Ash Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu80                  85                  90CAT GTG GAT AAA GCC GTC AGT GGC CTT CGC AGC CTC ACC ACT  423His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr

 95                 100                 105CTG CTT CGA GCT CTG GGG GCC CAG AAG GAA GCC ATC TCC CCT  465Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro

    110                 115                 120CCA GAT GCG GCC TCA GCT GCT CCA CTC CGA ACA ATC ACT GCT  507Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala

        125                 130                 135GAC ACT TTC CGC AAA CTC TTC CGA GTC TAC TCC AAT TTC CTC  549Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Ash Phe Leu

            140                 145CGC GGA AAG CTG AAG CTT TAC ACA GGG GAG GCA TGC AGG ACA  591Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr150                 155                 160GGG GAC AGA TGATGACCAG GTGTTACCTG GATCC                  625Gly Asp Arg

165(2)SEQ ID NO：2的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：28个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

CCCTGTTGGT CAATTCCTCC CAGCCGTG                  28(2)SEQ ID NO：3的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：30个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

CCTGCAGCTG CATGTGGATA AAGCCGTCAG               30(2)SEQ ID NO：4的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：32个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

GCTGTGCTGA GCACCCCAGC TTGAATGAGA AT            32(2)SEQ ID NO：5的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：32个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

ACTGCTGACA CTTTCTGCAA ACTCTTCCGA GT               32(2)SEQ ID NO：6的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：27个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu

                5                   10

Ser Leu Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly

15                  20                  25(2)SEQ ID NO：7的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：27个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu

                5                   10

Ser Leu Val Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Pro Gly

15                  20                  25(2)SEQ ID NO：8的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：85个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：AGCTTGTGTG GATCCCCGCC AGGCGCCACC ATGGGGGTGC ACGAATGTCC    50TGCCTGGCTG TGGCTTCTCC TGTCCCTGCT GTCGC                    85(2)SEQ ID NO：9的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：82个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：TCGCTCCCTC TGGGCCTCCC AGTACTGGGC GCCCCACCAC GCCTCATATG    50TGACTCGCGA GTCCTCGAGA GGTACCTCTT GG                       82

(2)SEQ ID NO：10的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：85个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：TTGGAGGCCA AGGAGGCCGA GAATATTACG ACGGGCTGTG CTGAGCACTG    50CAGCTTGAAT GAGAATATCA CTGTCCCAGA CACCA                    85(2)SEQ ID NO：11的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：82个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：ACCAAAGTTA ACTTCTATGC ATGGAAGAGA ATGGAGGTCG GGCAGCAGGC    50CGTAGAAGTC TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GT                       82(2)SEQ ID NO：12的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：79个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：CTGTCGGAAG CTGTTCGGCG GGGCCAGGCC CTGTTGGTCA ATCTCTCCCA    50GCCGTGGGAG CCCCTGCAGC TGCATCTAG                           79(2)SEQ ID NO：13的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：88个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：CTAGATAAAG CCGTCAGTGG CCTTCGCAGC CTCACCACTC TGCTTCGAGC    50TCTGGGGGCC CAGAAGGAAG CCATCTCCCC TCCAGATG                 88(2)SEQ ID NO：14的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：82个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GATGCGGCCT CAGCTGCTCC ACTCCGAACA ATCACTGCTG ACACTTTCCG   50CAAACTCTTC CGAGTCTACT CCAATTTCCT CC                      82

(2)SEQ ID NO：15的资料

(i)序列特征：

    (A)长度：85个碱基

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：合成的DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CTCCGCGGAA AGCTGAAGCT TTACACAGGG GAGGCATGCA GGACAGGGGA    50CAGATGATGA CCAGGTGTTA CCTGGATCCT GAATT                    85

Claims (32)

1.一种人促红细胞生成素类似物，含有选自[X³³，Cys¹³⁹]人促红细胞生成素和[X³³.Cys¹³⁹，des-Arg¹⁶⁶]人促红细胞生成素之序列的氨基酸序列，其中X³³选自20种天然存在的氨基酸。

2.根据权利要求1的类似物，它是des-Arg¹⁶⁶。

3.根据权利要求2的类似物，其中X³³是Pro。

4.根据权利要求2的类似物，其中X³³是Cys。

5.一种在序列中含有498个核苷酸之片段或495个核苷酸之片段的双链DNA，所述498个核苷酸之片段编码具有选自[X³³，Cys¹³⁹]人促红细胞生成素之序列的氨基酸序列的人促红细胞生成素类似物，所述495个核苷酸之片段编码具有选自[X³³，Cys¹³⁹，des-Arg¹⁶⁶]人促红细胞生成素之序列的氨基酸序列的人促红细胞生成素类似物，其中X³³选自20种天然存在的氨基酸。

6.根据权利要求5的双链DNA，其中X³³是Pro。

7.根据权利要求5的双链DNA，其中X³³是Cys。

8.根据权利要求6的双链DNA，其中所述片段有498个核苷酸。

9.根据权利要求7的双链DNA，其中所述片段有498个核苷酸。

10.根据权利要求5-9的任一权项的双链DNA，其中所述498或495个核苷酸的片段是两个连续亚片段之一，而另一亚片段编码哺乳动物前原促红细胞生成素之前导肽并与498核苷酸或495核苷酸亚片段相连，以致在由连续亚片段编码的多肽中，前导肽的C末端与促红细胞生成素类似物的N末端相邻。

11.根据权利要求10的双链DNA，其中由编码前导肽之亚片段编码的前导肽具有序列Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp LeuTrp Leu Leu Leu Ser Leu X³ Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro ValX⁴ Gly，其中X³选自Leu和Val，并且X⁴选自Leu和Pro。

12.根据权利要求11的双链DNA，其中X³和X⁴分别均是Leu。

13.根据权利要求10的双链DNA，它是在培养的哺乳动物细胞中表达前原促红细胞生成素类似物的表达载体，所述前原促红细胞生成素类似物含有由其C末端与人促红细胞生成素类似物之序列N末端相连的前导肽之序列组成的序列。

14.根据权利要求11的双链DNA，它是在培养的哺乳动物细胞中表达前原促红细胞生成素类似物的表达载体，所述前原促红细胞生成素类似物含有由其C末端与人促红细胞生成素类似物之序列N末端相连的前导肽之序列组成的序列。

15.根据权利要求12的双链DNA，它是在培养的哺乳动物细胞中表达前原促红细胞生成素类似物的表达载体，所述前原促红细胞生成素类似物含有由其C末端与人促红细胞生成素类似物之序列N末端相连的前导肽之序列组成的序列。

16.根据权利要求15的表达载体，由含有一种双链DNA的SV2dhfrSVdeltaSJneo组成，所述双链DNA含有编码前原促红细胞生成素类似物之片段，并且插入于可操作表达前原促红细胞生成素类似物之载体的XbaI位点。

17.表达载体SV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro³³，Cys¹³⁹]hEPO)。

18.表达载体SV2dhfrSVdeltaSJneo([Cys¹³⁹]hEPO)。

19.一种培养的含有表达载体的哺乳动物细胞，所述载体用于在所述细胞中表达由共同编码前体多肽之两个连续片段组成的DNA，所述前体多肽由其C末端与人促红细胞生成素类似物之N末端相连的哺乳动物前原促红细胞生成素之前导肽组成，所述片段之一编码所述前导肽，另一片段含有498个碱基对并编码含有选自[X³³，Cys¹³⁹]人促红细胞生成素之序列的所述促红细胞生成素类以物，其中X³³选自20种天然存在的氨基酸。

20.根据权利要求19的哺乳动物细胞，它是dhfr-，其中表达载体由SV2dhfrSVdeltaSJneo组成，所述SV2dhfrSVdeltaSJneo带有含有两个连续片段的所述DNA，所述DNA插入可操作表达前原促红细胞生成素之载体的XbaI位点。

21.根据权利要求20的哺乳动物细胞，它是中国仓鼠卵巢细胞，其中，表达载体选自SV2dhfrSVdeltaSJneo([Pro³³，Cys¹³⁹]hEPO)和SV2dhfrSVdeltaSJneo([Cys¹³⁹]hEPO)。

22.用于诱导红细胞生成的药物组合物，含有(a)治疗有效量的人促红细胞生成素类似物，所述类似物含有选自[X³³，Cys¹³⁹，des-Arg¹⁶⁶]人促红细胞生成素之序列的氨基酸序列，其中X³³选自20种天然存在的氨基酸，(b)药物学可接受的载体。

23.根据权利要求22的药物组合物，其中X³³是Pro。

24.根据权利要求22的药物组合物，其中X³³是Cys。

25.用于治疗贫血的药物组合物，含有(a)治疗有效量的人促红细胞生成素类似物，所述类似物含有选自[X³³，Cys¹³⁹，des-Arg¹⁶⁶]人促红细胞生成素之序列的氨基酸序列，其中X³³选自20种天然存在的氨基酸，和(b)药物学可接受的载体。

26.根据权利要求25的药物组合物，其中X³³是Pro。

27.根据权利要求25的药物组合物，其中X³³是Cys。

28.一种人促红细胞生成素的第二类似物，它所具有的促红细胞生成比活性明显大于第一类似物，第一类似物的促红细胞生成比活性明显低于天然人促红细胞生成素，所述第二类似物除在所述序列的第一和第二位置外，具有与天然人促红细胞生成素相同的氨基酸数目和序列，其中第二类似物所含有的氨基酸不同于天然人促红细胞生成素序列之相同位置上的氨基酸，而除所述第一或所述第二位置外，所述第一类似物具有与第二类似物相同的氨基酸数目和序列，其中所述氨基酸与天然人促红细胞生成素序列中的氨基酸相同。

29.根据权利要求28的第二类似物，它所具有的促红细胞生成活性基本上相同或大于天然人促红细胞生成素，而第一类似物没有或实质上降低了促红细胞生成活性。

30.生产权利要求29之促红细胞生成素第二类似物的方法，包括下列步骤：

(a)制备真核表达载体文库，每个载体均含有在哺乳动物细胞中可操作表达的cDNA，所述cDNA(i)编码天然人促红细胞生成素的双突变体，(ii)含有编码天然人促红细胞生成素第一类似物之氨基酸的三联体，所述第一类似物没有或降低了促红细胞生成活性而且具有与天然人促红细胞生成素相同的氨基酸数目，但在其序列的一个位置上，其氨基酸不同于天然人促红细胞生成素中相应位置的氨基酸，和(iii)在不编码天然前原促红细胞生成素之前导肽的任何部分并且不包括编码所述第一类似物之所述氨基酸的三联体的片段中，含有一个随机突变；

(b)将表达载体文库转染到用于表达的哺乳动物细胞中：和

(c)筛选分泌第二类似物的细胞。

31.用权利要求29的第二类似物生产促红细胞生成素第三类似物的方法，所述第三类似物的体内促红细胞生成活性大于天然人促红细胞生成素，该方法包括将存在于第一类似物而不是天然人促红细胞生成素的第二类似物中的氨基酸变成天然人促红细胞生成素中相应位置上的氨基酸。

32.人促红细胞生成素的第三类似物，所述第三类似物除在其序列中一个位置上的一个氨基酸不同外，具有与天然人促红细胞生成素相同的氨基酸数目和序列，其促红细胞生成活性大于天然人促红细胞生成素，所述类似物由权利要求31的方法用权利要求29的第二类似物生产。

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