CN1406280A

CN1406280A - 祖细胞保护因子和相关的方法和产物

Info

Publication number: CN1406280A
Application number: CN99817102A
Authority: CN
Inventors: M·G·科卢西; M·J·克里斯皮尔斯; J·G·穆尔
Original assignee: PHYLOGIX
Current assignee: University of California
Priority date: 1999-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2003-03-26
Also published as: EP1246919A1; ES2249058T3; EP1246919B1; DE69926920D1; CA2395625A1; AU784361B2; AU2401400A; HK1050027A1; AU784361C; DE69926920T2; WO2001049851A1; JP2003521900A; HK1050027B; ATE302848T1

Abstract

公开了祖细胞保护因子FRIL家族和编码它的核酸。FRIL家族成员在体内和体外都保护祖细胞。FRIL家族成员可用作治疗剂，用于缓解和/或减轻许多癌症治疗剂引起的造血祖细胞耗竭。FRIL家族成员还可用于分离稀有的原代祖细胞。

Description

祖细胞保护因子和相关的方法和产物

本发明是1997年6月24日提交的美国系列号08/881,189的后续部分，其完整内容在此引入以供参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及祖细胞的保护。更具体的，本发明涉及在体内或在体外保护祖细胞，例如造血祖细胞。

相关领域的描述

多细胞真核生物组织中各式各样功能和表型各异的不同类型的细胞部分是从稀少的和大多静止的祖细胞群增殖和分化引起的。例如，血细胞生成与从在成年人骨髓中发现的祖细胞产生不同的血细胞的平衡补充有关。其它类型细胞的发育也依赖于从这些祖细胞产生分化的细胞。

祖细胞被信号，例如细胞-细胞接触或可溶性调节剂所激活，来产生与亲代相同的子代细胞(即亲代的自我更新)和/或产生比亲代更加分化的子代细胞，从而开始一个不可逆过程，其结果是产生分化的功能性细胞。在血细胞生成过程中，分化与增殖偶联，因为祖细胞产生更多的子代细胞，它们逐步变为只能产生仅一种类型的血细胞。为了适应身体内每日需要几百亿个新的成熟血细胞所必需的造血祖细胞的大量活化是在强力的可溶性调节剂(如集落刺激因子和细胞因子)指导下进行的，它们对造血祖细胞本身，及其更为分化的子代细胞起作用。

虽然祖细胞最终生成体内的许多成熟细胞，它们仍然是稀少的。另外，通常祖细胞越原始(即未分化)就越稀少。例如，目前据信最原始的造血祖细胞(称为造血干细胞)在骨髓中出现的频率仅约1∶10,000-1∶100,000个细胞。造血干细胞能产生10¹³个包括所有谱系的成熟血细胞，包括其它祖细胞，虽然比造血干细胞更分化，本身也能够产生多种不同类型的成熟血细胞。

造血干细胞负责在动物的一生中维持血细胞生产。一小群造血干细胞足够产生健康个体中的所有成熟血细胞；然而一些不健康的个体遭受着缺乏足够数量的祖细胞和/或成熟血细胞的痛苦。例如，接受设计用于杀死快速分化的癌细胞的化疗或放疗的癌症病人还会伴有白血细胞和血小板耗竭，因此这些病人会有危及生命的机会性感染和出血事件。事实上，该造血祖细胞耗竭作用很大程度上是这些化疗和放疗剂的剂量限制因素。

许多癌症病人常规接受细胞因子，包括G-CSF、GM-CSF、SCF、促红细胞生成素和IL-11的治疗，来加速恢复化疗后的红细胞生成(Moore，M.A.，Blood 78：1-19，1991)。然而这些细胞因子导致造血祖细胞，包括造血干细胞，不可逆地分化成更加分化的子代细胞。因此，在化疗中需要更好的保护造血祖细胞。

本领域的工作人员尝试了在小鼠中用细胞因子保护祖细胞免受化疗的毒性(Neta等，J.Immunol.136：2483-2485，1986；Neta等，J.Immunol.140：108-111，1988；Neta等，J.Exp.Med.173：1177-1182，1991；de Haan等，Blood 87：4581-4588，1996；Lyman和Jacobsen，Blood 91：1101-1134，1998；Dalmau等Bone MarrowTransplant 12：551-563，1993；Grzegorzewski等，J.Exp.Med.180：1046-1057，1994；Grzegorzewski等，blood 94：1066a(摘要)1999)。Marshall等(Euro.J.Cancer 34：1023-1029，1998)和Gilmore等(Exp.Hematol.27：195-202，1999)描述了在临床试验中，用假定抑制祖细胞增殖的趋化因子MIP1-α作为化学保护剂。Marshall(Marshall，A.，Nat.Biotechnol.16：129，1999)描述了在临床试验中，用假定抑制祖细胞增殖的趋化因子MIPF-1作为化学保护剂。

在癌症病人的化疗或放疗治疗过程中使用趋化因子、细胞因子和其它免疫调节剂作为化学保护剂有几个缺点。这些缺点包括生产成本和对病人有毒性。

因此，需要无毒并且生产低廉的改善的制剂，用于保护祖细胞。

发明简述

本发明提供了一类保护祖细胞的因子。该家族，FRIL家族的成员是无毒的生产低廉的制剂，能保护祖细胞。本发明提供了含有FRIL家族至少一个成员的组成成分，和用FRIL家族的成员在体内和体外保护祖细胞的方法。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种含有祖细胞保护因子FRIL家族的一个或多个成员的基本纯的组成成分。

在本发明第一个方面的某些实施例中，FRIL家族成员来自豆科植物。在一些实施例中，豆科植物是扁豆(Dolichos lablab)。在一些实施例中，豆科植物是菜豆(Phaseolus vulgaris)。在一些实施例中，豆科植物是豆薯(Sphenostylisstenocarpa)。

在本发明第一个方面的一些实施例中，FRIL家族成员是衍生自FRIL家族第二个成员的突变体，其中突变体选自取代突变体、缺失突变体、添加突变体或其组合。

在本发明的第一个方面的一些实施例中，FRIL家族成员是一种融合蛋白，包含第一部分和第二部分，其中第一部分衍生自FRIL家族的第二个成员。

在第二个方面，本发明提供了编码祖细胞保护因子FRIL家族成员的组成成分的重组核酸分子。

在第三个方面，本发明提供了一种药物制剂，它含有祖细胞保护家族的一个或多个成员的基本纯的组成成分和药物学上可接受的载体。

在本发明的第三个方面的一些实施例中，对患有一种病症的病人施用治疗有效量的制剂缓解和/或减轻了病人中的病症，所述病症是由病人的造血祖细胞耗竭造成的。

在本发明的第三个方面的一些实施例中，在用具有造血祖细胞耗竭活性的治疗性处理治疗病人前，对病人施用治疗有效量的制剂缓解和/或减少病人中治疗性处理的造血祖细胞耗竭活性。在一些实施例中，患者是人或是家养的哺乳动物。在一些实施例中，病人患有癌症。在一些实施例中，治疗处理是放疗或化疗处理，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、阿霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)或放疗和化疗的组合。

在第四个方面，本发明提供了一种缓解或减轻患者中治疗性处理的造血祖细胞耗竭活性的方法，包括在对患者进行治疗性处理前对动物施用治疗有效量的FRIL家族成员的组成成分。

在第四个方面的一些实施例中，患者是人或是家养的动物。在一些实施例中，患者患有癌症。在一些实施例中，治疗处理是放疗或化疗处理，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、阿霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)或放疗和化疗的组合。

在第五个方面，本发明提供了一种分离一群祖细胞的方法，包括使一群细胞与多个FRIL家族成员分子接触，并分离未结合的细胞，其中与FRIL家族成员分子结合的细胞是一群被分离的祖细胞。优选这群分离的祖细胞来自人类。

在本发明第五个方面的一些实施例中，FRIL家族成员分子可被检测性标记。在一些实施例中，经可检测标记的FRIL家族成员分子是被化学发光团标记。在一些实施例中，用流式细胞计数细胞分选机分离未结合的细胞，来分选与经化学发光团可检测性标记的FRIL家族成员分子结合的一群细胞。

在第五个方面的一些实施例中，FRIL家族成员分子固定在固相载体上。在一些实施例中，固相载体是珠，例如磁珠。在一些实施例中，通过对与固定在磁珠上的FRIL家族成员分子结合的细胞群施加磁性分离未结合的细胞。在另一个实施例中，在施加磁力的同时，用生理学上可接受的溶液漂洗与固定在磁珠上的FRIL家族成员分子结合的细胞群。

在第五个方面的一些实施例中，固相载体是组织培养板的底部。在一些实施例中，通过用生理学上可接受的溶液漂洗与固定在组织培养板底部的FRIL家族成员接触的细胞群，来分离未结合的细胞。

在本发明第五个方面的优选例中，祖细胞的分离群是一群造血祖细胞。在各种实施例中，细胞群是全血、脐带血、骨髓细胞或胎肝细胞。

在本发明第五个方面的实施例中，细胞群是分选过的细胞群，其中分选过的群中的一个细胞不表达选自CD11b、CD11c和CD38的细胞表面分子。在一些实施例中，分选过的细胞群是用流式细胞计数或磁珠选择分选的。

在第六个方面，本发明提供了一群分离的祖细胞，这些祖细胞是用通过使一群细胞与多个FRIL家族成员分子结合，并分离未结合的细胞的方法分离的，其中与FRIL家族成员的分子结合的细胞是一群分离的祖细胞。优选祖细胞来自人类。

在第六个方面的实施例中，分离的细胞群不表达CD34。在一些实施例中，分离的细胞群表达选自FLK1、FLT1、FLT3、FLT4和Kit的受体酪氨酸激酶。在一些实施例中，分离的细胞群表达选自CD11b和CD11c的细胞表面分子。在优选例中，分离的细胞群表达FLT3。

在本发明第六个方面的各种实施例中，分离的细胞群是成血管细胞、间质干细胞、骨祖细胞、肝祖细胞、内皮祖细胞、造血祖细胞、胚性干细胞、脑祖细胞或树突状祖细胞。优选分离的细胞群是造血祖细胞。

在本发明第六个方面的一些实施例中，当分离的细胞群是造血祖细胞时，将分离的群移植到缺乏足够使动物存活的数量的造血祖细胞的动物体内，重建动物，其中移植的动物存活。在一些实施例中，造血祖细胞来自人或小鼠，其中动物是小鼠。在一些实施例中，小鼠是SCID小鼠，或小鼠被亚致死辐射或小鼠经亚致死剂量的化疗剂处理。在一些实施例中，造血祖细胞来自人类，动物是人类。在一些实施例中，人类是接受治疗的癌症患者，该治疗耗竭了病人的造血祖细胞。在一些实施例中，治疗是放疗或化疗治疗，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、阿霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)或放疗剂和化疗剂的组合。

在第七个方面，本发明提供了一种在体外保护祖细胞的方法，包括使一群含有至少一种祖细胞的细胞与有效量的FRIL家族成员的组成成分接触一段有效的时间，其中使该群中的祖细胞休眠。

在第七个方面，祖细胞来自人类。在一些实施例中，细胞群是骨髓细胞。在一些实施例中，该群细胞中的非祖细胞则分化或死亡。

在第七个方面的一些实施例中，细胞群是在用具有造血祖细胞耗竭活性的治疗剂治疗癌症病人前从癌症病人取得的。在一些实施例中，治疗是放疗或化疗治疗，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、阿霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)或放疗剂和化疗剂的组合。

在第八个方面，本发明提供了一种在体内保护祖细胞的方法，包括对病人施用有效量的FRIL家族成员的组成成分一段有效时间，其中使病人中的祖细胞处于休眠。优选患者是人类或家养动物。

在本发明的第八个方面的一些实施例中，病人是癌症病人。在一些实施例中，在用具有造血祖细胞耗竭活性的治疗剂治疗癌症病人前施用有效量的FRIL家族成员的组成成分。在一些实施例中，治疗是放疗或化疗治疗，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、阿霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)或放疗剂和化疗剂的组合。

在第九个方面，本发明提供了一种鉴定祖细胞的方法，包括使候选细胞与FRIL家族分子接触，其中候选细胞与FRIL家族成员分子的结合将候选细胞鉴定为祖细胞。

在第九个方面的一些实施例中，候选细胞在一群细胞中，在一些实施例中，候选细胞来自人类。

在第十个方面，本发明提供了用一种方法鉴定的祖细胞，该方法包括使候选细胞与FRIL家族分子接触，其中候选细胞与FRIL家族成员分子的结合将候选细胞鉴定为祖细胞。

在第十一个方面，本发明提供了一种鉴定祖细胞保护因子的FRIL家族成员的组成成分的方法，包括使候选化合物与FLT3受体的糖基化的胞外结构域接触，其中FLT3受体胞外结构域的糖基化模式与正常糖基化的FLT3受体的胞外结构域糖基化模式相同，其中与FLT3受体的糖基化胞外结构域结合的候选化合物被鉴定为FRIL家族成员的组成成分。

在第十一个方面的一些实施例中，候选化合物是植物凝血素。在一些实施例中，植物凝血素是合成的。在一些实施例中，植物凝血素来自豆科植物。

在第十二个方面，本发明提供了用一种方法鉴定的FRIL家族成员基本纯的组成成分，该方法是使候选化合物与FLT3受体的糖基化的胞外结构域接触，其中FLT3受体胞外结构域的糖基化模式与正常糖基化的FLT3受体的胞外结构域糖基化模式相同，其中与FLT3受体的糖基化胞外结构域结合的候选化合物被鉴定为FRIL家族成员的组成成分。

根据本发明，FRIL家族成员的组成成分可用作治疗剂，来保护病人中的祖细胞，例如接受化疗的癌症病人，他们遭受祖细胞减少的痛苦。例如，FRIL家族成员的组成成分可以与药物学上可接受的载体(例如生理无菌盐水溶液)一起，通过任何给药途径施给接受化疗的癌症病人，来试验减少化疗剂的祖细胞耗竭效果，从而使病人能接受更高剂量的化疗剂，并且更为理想的，从癌症中康复。药物学上可接受的载体及其制剂是熟知的，在例如Remington’s PharmaceuticalSciences(18版，A.Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990)。

附图简述

图1是通过将本发明的cDNA连接到克隆载体pCR2.1的EcoRI位点产生的克隆载体pCR2.1-DLA的图谱。

图2显示了Gowda等(J.Biol.Chem.269：18789-18793，1994)描述的甘露糖植物凝血素和DI-FRIL，一种由本发明的代表性，非限制性核酸编码的本发明的代表性非限制性的FRIL家族成员衍生的氨基酸序列的直接氨基酸序列比较。

图3是通过将突变的cDNA连接到克隆载体pCR2.1的EcoRI位点产生的克隆载体pCR2.1-DLA(D)的图谱。

图4是通过将重组片段连接到克隆载体pBluescriptSK+的EcoRI位点产生的克隆载体pBS-SpDLA的图谱。

图5是通过将突变的重组克隆连接到克隆载体pCR2.1的EcoRI位点产生的克隆载体pCR2.1-SpM1(D)的图谱。

图6是通过将从pCW66载体获得的豌豆球蛋白启动子亚克隆入植物二分载体pBIN19的EcoRI/ClaI位点产生重组的表达载体pBIL-VicPro的图谱。

图7是通过将重组片段连接到pBINVicPro载体的EcoRI/SacI位点产生的重组表达载体pBINVicPro-SpDLA的图谱。

图8是通过将突变重组克隆连接到pBINVicPro载体的EcoRI位点产生的重组表达载体pBINVicPro-SpDLA(D)的图谱。

图9是通过将野生型的cDNA克隆连接到大肠杆菌表达载体pGEX4T-1的EcoRI/SalI位点产生的重组表达载体pGEX4T-1-DLA的图谱。

图10是通过将突变的cDNA克隆连接到大肠杆菌表达载体pGEX4T-1的EcoRI/XhoI位点产生的重组表达载体pGEX4T-1-DLA(D)的图谱。

图11是用重组表达载体pGEX4T-1-DLA和pGEX4T-1-DLA(D)转化的大肠杆菌细胞的全蛋白提取物RNA印迹分析的电泳图谱表现。

图12是用和不用凝血酶切割纯化的GST-融合蛋白的蛋白质印迹分析的电泳图谱表现。

图13A是显示含有表达的Dl-FRIL，一种本发明的代表性非限制性FRIL家族成员的大肠杆菌培养物的粗抽提物专一性的刺激hFLT3 3T3细胞的图；图13B是显示相同的抽提物不刺激未转染的3T3细胞的图。

图14A是一张柱状图，显示纯化的Dl-FRIL，一种本发明的代表性非限制性FRIL家族成员以剂量依赖性方式保护脐带血单核细胞。

图14B是一张柱状图，显示纯化的Dl-FRIL，一种本发明的代表性非限制性FRIL家族成员以剂量依赖性方式保护造血祖细胞。

图15A是一张照片，显示在40ng/mlDl-FRIL，一种本发明的代表性的非限制性FRIL家族成员中培养3周，然后再置于甲基纤维素集落分析培养基中的人脐带血单核细胞产生的集落。

图15B是一张照片，显示在40ng/mlDl-FRIL，一种本发明的代表性的非限制性FRIL家族成员中培养4周，然后再置于甲基纤维素集落分析培养基中的人脐带血单核细胞产生的集落。

图16是示意图，显示在Dl-FRIL，一种本发明的代表性的非限制性FRIL家族成员或Dl-FRIL+recFL(即重组FLT3-配体)中培养的祖细胞的系列替换。首先将人脐带血单核细胞培养在40ng/ml Dl-FRIL+40ng/ml recFL中的40ng/ml Dl-FRIL中(实心黑方块)。然后通过更换到甲基纤维素集落分析培养基中6周，收集并评估细胞的祖细胞活性(中间划斜线的方块)。然后从集落试验中收集细胞，再置于甲基纤维素集落分析培养基中4周(最右边的斜线方块)。在Dl-FRIL或DlFRIL+recFL中悬浮培养3周后，和在甲基纤维素培养物中另外6周后(无Dl-FRIL和/或recFL)测定祖细胞频率。

图17是一张照片，显示衍生自最初在40ng/ml Dl-FRIL，本发明的一种代表性非限制性FRIL家族成员中培养3周，然后替换到甲基纤维素集落分析培养基中6周，然后再次替换到甲基纤维素集落分析培养基4周的人脐带血单核细胞的集落。

图18是一张条状图，显示本发明的代表性非限制性核酸编码的本发明的代表性非限制性FRIL家族成员Dl-FRIL足够在体外保护祖细胞，而细胞因子混合物不能保护这些细胞。

图19A和19B是线状图，显示受体转染的3T3细胞的生物专一性。图19A显示rhM-CSF在生物学筛选试验中以剂量依赖的方式专一性刺激Fms 3T3(实心圆)，但不刺激mFlt3/Fms 3T3(空心圆)或亲本3T3细胞(实心方块)。

图20A-20D代表检测到的用阴离子交换层析级分的PHA-LCM的生物活性。图20A显示显微镜观察到的存活脐带血细胞的数量。图20B显示用阴离子交换柱组分对mFlt3/Fms 3T3细胞的刺激。图20C显示用阴离子交换柱组分对Stk 3T3细胞的刺激。图20D显示用阴离子交换柱组分对Fms 3T3细胞的刺激。

图21A和21B代表线状图，显示在Pv-FRIL，一种本发明的代表性的而非限制性的FRIL家族成员纯化过程中F1t3 3T3试验所需的辅助因子。图21A显示在从粗的10倍浓缩的PHA-LCM中纯化过程中(实心圆)，部分纯化(空心圆)和高度纯化(实心方块)Flt3 3T3细胞减少的平台刺激。显示培养基对照是空心方块。图21B显示加入亚最佳浓度(1∶200)的粗PLA-LCM(实心方块)使Flt3 3T3细胞下降(实心圆)的平台恢复。相应的培养基对照以空心符号显示。

图22A-22D代表一系列流式细胞计数直方图，显示在与合并的AQS亲和柱组分悬浮培养2周后脐带血CD34⁺细胞CD34表达的再分析。用流式细胞计数在合并的AQS亲和柱组分1-5(图22A)、组分6-10(图22B)、组分11-15(图22C)和组分16-20(图2D)上再分析CD34表达。图22A-22D在横坐标上是荧光强度，纵坐标上是事件频率。

图23代表线状图，显示mFlt3/Fms 3T3细胞对从市售红菜豆抽提物中分离的FRIL的Il-1依赖性应答。mFlt3/Fm 3T3细胞在rhIL1存在下(实心圆)与FRIL有反应，但在IL1不存在下(实心方块)不反应。相应的仅含培养基的对照用空心符号表示。

图24A是通过将本发明的cDNA连接到克隆载体pCR2.1的EcoRI位点产生的克隆载体pCR2.1-Pv-FRIL的图谱。

图24B显示了Pv-FRIL，一种本发明的代表性的而非限制性的FRIL家族成员与Dl-FRIL-本发明的另一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员，以及PHA植物凝集素，PHA-E的直接氨基酸序列比较。

图25是通过将本发明的cDNA连接到克隆载体pCR2.1的XhoI位点产生的克隆载体pCR2.1-SpPv-FRIL的图谱。

图26是通过将本发明的cDNA连接到克隆载体SpPv-FRIL的Bg1II/XhoI位点产生的克隆载体pM-SpPv-FRIL的图谱。

图27A-27B代表线状图，显示在Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员或细胞因子的存在下总细胞数和祖细胞水平。富含CB CD34+的细胞在Dl-FRIL(实心符号)或细胞因子(空心符号)的存在下培养3，6，10或13天。在第14天评分集落，基于总细胞数计算祖细胞水平。显示的值代表达10次实验的平均±SEM。图27A显示随时间的总细胞数目。图27B显示随时间培养物中的祖细胞水平。

图28A-28D代表线状和条状图，显示首先在Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员存在下和然后在细胞因子存在下的总细胞数和祖细胞水平。图28A显示与Dl-FRIL培养整10天(实心符号)或6天，然后用细胞因子刺激4天(空心符号)的总细胞数。图28B显示与Dl-FRIL培养整10天(实心符号)或6天，然后用细胞因子刺激4天(空心符号)的祖细胞水平。图28C显示与Dl-FRIL培养整13天(实心符号)或10天，然后用细胞因子刺激3天(空心符号)的总细胞数。图28D显示与Dl-FRIL培养13天(实心符号)或10天，然后用细胞因子刺激3天(空心符号)的祖细胞水平。

图29A-29D代表显示与DI-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员或细胞因子体外培养，然后移植入小鼠后对SRC的定量分析的RNA印迹分析。图29A显示RNA印迹，显示与Dl-FRIL培养6天(泳道1)，与Dl-FRIL培养10天(泳道2)，或与Dl-FRIL培养6天，然后用细胞因子刺激4天(泳道3)的细胞移植的小鼠骨髓中的人DNA。图29B代表RNA印迹，显示与Dl-FRIL培养10天(泳道1-2)，或与Dl-FRIL培养6天，然后用细胞因子刺激4天(泳道3-4)的细胞移植的小鼠骨髓中的人DNA。图29C代表RNA印迹，显示接种前(泳道1)，或与Dl-FRIL培养13天(泳道2)的细胞移植的小鼠骨髓中的人DNA。图29D代表RNA印迹，显示与FRIL培养10天(泳道1)，与Dl-FRIL培养6天，然后用细胞因子刺激4天(泳道2)，与Dl-FRIL培养13天(泳道3)，或与Dl-FRIL培养10天，然后用细胞因子刺激3天(泳道4)的细胞移植的小鼠骨髓中的人DNA。

图29E代表Soathern印迹分析，显示在小鼠DNA中检测0％、0.1％、1％和10％人DNA。

图30代表存活图表，总结在Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员中培养10天(左栏)或在Dl-FRIL存在下培养6天，然后在细胞因子存在下培养4天的CD34+细胞移植的小鼠骨髓中的人细胞移入物水平。

图31代表Southern印迹分析，显示在Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员存在下，培养的CD34⁺CD38^-/low细胞移植的NOD/SCIDB2M^null小鼠骨髓中人细胞移入物的水平。在Dl-FRIL存在下培养6天，然后再接触细胞因子4天，或单独用Dl-FRIL接触10天，培养分选的细胞(2×10⁵原始细胞/处理)。10天后，将从细胞因子培养物中收集的3.6×10⁵个细胞分开并移植到3只小鼠中(泳道1-3)，同时将从Dl-FRIL单独培养物中收集的3.5×10⁴细胞移植到一只小鼠(泳道4)中。从移植的小鼠骨髓收集DNA，用放射性标记的人染色体17-特异性α-卫星探针(p17H8)进行Southern印迹分析。显示了4次实验中的代表性实验。

图32代表条状图，显示用与Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员培养6天和细胞因子培养4天(右条)，与单独用Dl-FRIL培养10天(左条)的CD34+CD38-/low细胞获得的移植物水平的平均增加倍数的比较。数据表示成4次实验的平均值±SE。

图33A-33F代表条状图(33A)和流式细胞计数直方图(图33B-33F)，显示与Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员，一起培养的SRC在移植的小鼠骨髓中的多谱系分化。图33A显示每2×10⁵个细胞中的集落数，其中如前所述细胞处理，移植到小鼠中，从小鼠骨髓中取核酸，接种到筛选人集落的半固体培养基中。根据移植小鼠骨髓中总人细胞数(2×10⁵个细胞)计算祖细胞水平。显示的值代表3次实验，每次处理9只小鼠的平均±SEM数据。图33B显示代表性流式细胞计数分析，显示非特异性标记，其中用小鼠IgG作为同种型对照。图33C和33D显示小鼠骨髓细胞的代表性流式细胞计数分析，其中移植了预先与Dl-FRIL培养10天的CD34+细胞(图33C)或CD34+CD38-/low细胞(图33D)，其中骨髓细胞用抗人CD45和抗人CD19染色。图33E和33F显示骨髓细胞的代表性流式细胞计数分析，其中移入了预先与Dl-FRIL培养10天的CD34+细胞(图33E)或CD34+CD38-/low细胞(图33F)，其中收集的骨髓细胞然后与SCF+IL-15培养10天，其中收集的骨髓细胞随后与SCF+IL-15培养10天，然后用人特异性单克隆抗-CD45和抗-CD56染色。

图34A-34B代表条状图，显示Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员对CD34+细胞和祖细胞与Flt3配体和细胞因子的组合的生长效力的比较。(+)表示整10天的因子共培养，而(-＞)表示6天后用细胞因子替换第一种因子，如x轴下表明的。图34A显示总细胞数。图34B显示CFU-GEMM在总集落中的百分数。所示值是每2×10⁵个接种细胞，代表5次实验数据的平均±SEM。

图35A-35G代表流式细胞计数直方图，显示与Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员，或各种细胞因子，或与其组合一起培养的CD34+细胞的细胞周期分析。用碘丙锭染色的流式细胞计数测定DNA含量。不处理(图35A)、Dl-FRIL(图35B)、Flt3-L(图35C)、Dl-FRIL+Flt3-L(图35D)、SCF+G-CSF+IL-3+IL-6(SG36)(图35E)、SG36+Dl-FRIL(图35F)和SG36+Flt3-L(图35G)培养富含CD34+的细胞3天。

图36A-36C代表线状图，显示CB mnc化疗剂在D1-FRIL下存在和不存在，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员下的剂量应答。在CBMNC(2×105细胞/0.1ml)上在含有Agar-SCM(StemCe1l Technologies)的AIMV(LifeTechnologies)中试验5-对数剂量范围内的化疗剂。培养5天后通过XTT测定存活细胞。实心方块表明不含Di-FRIL的化疗药物；实心三角表明在所有孔中含有10ng/ml D1-FRIL的培养物；空心圆圈表明所有孔中Dl-FRIL是10ng/ml；空心圆表明所有孔中Dl-FRIL是100ng/ml。图36A显示对Ara-C的剂量应答；图36B显示对阿霉素的剂量应答；图36C显示对5FU的剂量应答。

图37代表用SDS-PAGE分析分辨经纯化的Dl-FRIL，本发明的一种代表性的而非限制性的FRIL家族成员的照片。出现对应于α和β亚基的5条清晰的条带，各进行氨基末端测序。表明了5条条带的氨基酸序列。

详细描述

本发明涉及用祖细胞保护因子的FRIL家族成员保护祖细胞。更具体的，本发明涉及在体内或体外用祖细胞保护因子的FRIL家族成员保护祖细胞，例如造血祖细胞。

本发明提供了保护祖细胞的因子的家族。该家族，FRIL家族的成员是无毒的，生产成本低廉的保护祖细胞的因子。本发明提供了含有FRIL家族至少一个成员的组成成分，以及用FRIL家族成员在体内和体外保护祖细胞的方法。

本文引用的所有专利和出版物再次反映了现有技术的知识，以相同程度完整在此引入以供参考，如同它们各自特别指出引入以供参考。这些专利和出版物与本公开之间的任何不符合将以本公开为准。

在第一个方面，本发明提供了一种祖细胞保护因子FRIL成员的基本纯的组成成分。术语“祖细胞保护因子的FRIL家族”用于指植物凝血素家族，其中各FRIL家族成员分子与正常糖基化的Flt3受体结合，其中各FRIL家族成员分子保护祖细胞，其中一种从白扁豆(即扁豆)分离的FRIL家族成员分子具有含有下列8个氨基酸的序列：TNNVLQXT(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列。“FRIL家族成员”或“FRIL家族成员分子”意味着一种或多种祖细胞保护因子的FRIL家族的分子。

根据本发明的第一个方面，FRIL成员的组成成分，其中包含另一种FRIL家族成员分子的突变体或融合蛋白，该融合蛋白含有一部分衍生自FRIL家族成员分子或其突变体，其中各FRIL家族成员分子与正常糖基化的FLT3受体结合，该组成成分与另一种FRIL家族的成员的氨基酸序列具有至少约45％的氨基酸序列相同性，与第二种蛋白的序列有优选至少约50％相同性，甚至更优选至少约55％相同性，更优选至少约60％相同性。就具有高序列相同性的蛋白质而言，第一种蛋白质的氨基酸序列与FRIL家族的另一个成员的氨基酸序列共有至少约75％的序列相同性，优选至少约85％相同性，更优选至少约95％的相同性。

根据标准方法可测量两种蛋白质或两种核酸分子之间的氨基酸序列相同性和核酸序列相同性。例如为了确定两条序列之间的相同性百分数，而比较第一个氨基酸序列和第二个氨基酸序列，或第一个核酸序列和第二个核酸序列，对齐序列，来使相同氨基酸或核酸残基的数目最大化。可通过目测观察排列具有至少约50％氨基酸序列相同性或至少约45％的核酸序列相同性的蛋白质序列。如果目测观察不够，可根据Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448，1988)的FASTA法或优选George，D.G.等，于Macromolecular Sequencing andSynthesis，Selected Methods and Applications，127-149，Alan，R.Liss Inc.(1988)描述的任何方法，例如137页使用匹配评分1，错配评分0，缺口补偿-1的式4排列蛋白质或核酸。从该方法，可确定第一个和第二个氨基酸序列或第一个和第二个核酸之间的序列相同性百分数。

测定氨基酸或核酸序列相同性的其它方法在Feng和Doolittle(Journal ofMolecular Evolution 25：351-360，1987)和Higgins和Sharp(CABIOS 5：151-153，1989)中有所描述。

测定两条蛋白质或核酸之间的氨基酸或核酸序列相同性的另一种方法是用具有其中规定的默认参数的序列分析软件。各种软件包包括Genetics ComputerGroup(University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，WI)的Sequence Analysis软件包和gezNational Center forBiotechnologyhogn(National Library of Medicine，Bethsda，MD)的各种BLAST程序。

除非另外说明，用National Center for Biotechnology(National Library ofMedicine，Bethsda，MD)的挤出BLAST程序，使用其中规定的默认设置测定氨基酸序列相同性百分数或核酸序列相同性百分数。

另一种对两条核酸序列相同性百分数的测试是它们是否在正常杂交条件下，优选严格杂交条件下杂交。因此，在本发明中还包括在高度严格条件下与和SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：7互补的序列杂交的核酸分子编码的蛋白质。本文所用的术语“严格条件”等价于“高度严格条件”和“高严格度”。这些术语在本领域中互换使用。

严格条件用许多方式定义。在一个定义中，选择严格条件是比特定序列在特定离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约50℃。Tm是50％靶序列与完全匹配的序列杂交的温度(在特定的离子强度和pH下)。通常严格条件是其中盐浓度在pH7时至少约0.02M，温度是至少约60℃。“严格条件”在针对杂交环境的相同性百分数(例如同源性)或基本相似性的情况下，可以是盐、温度、有机溶剂或其它通常已知控制杂交反应的参数的组合条件。参数的组合比测定任何单一的参数更重要。如果不完整的互补序列彼此在严格条件下识别，那么这些序列在高度严格条件下杂交(见美国专利号5,786,210；Wetmur和davidson，J.Mol.Biol.31，349-370，1968)。杂交条件的控制，和杂交条件和同源性程度之间的关系是本领域技术人员理解的。见例如，Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989。严格条件的其它例子可在Goeddel等，美国专利号5,789,550中发现。

在非限制性例子中，可用各种方法，例如在含有：20％甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/毫升变性的剪切鲑鱼精DNA的溶液中42℃过夜保温。另外，严格条件的特征是含有30％甲酰胺的5xSSPE(0.18M NaCl，0.01M NaPO4、pH7.7，0.0001MEDTA)缓冲液的杂交缓冲液，42℃，然后在42℃用0.2×SSPE洗涤。优选严格条件涉及使用含有50％甲酰胺的5×SSPE的杂交缓冲液，42℃，在相同温度下用0.2×SSPE洗涤。

本文所用的“保护祖细胞”意味着FRIL家族成员分子(或其突变体或含有FRIL家族成员分子或其突变体的融合蛋白)能维持(即保护)祖细胞在不分化的状态，可用下文(例如SCID小鼠重建细胞试验和基于甲基纤维素或其它半固体培养基的造血祖细胞试验)所述的试验确定。根据本发明， “祖细胞”指任何能通过分化和增殖产生完全分化的功能性子代的正常体细胞。祖细胞包括任何组织或器官系统的祖细胞，包括但不限于血液、间质、胚性、神经、肌肉、皮肤、肠、骨骼、肾、肝、胰、胸腺、脑等。祖细胞和“分化的细胞”不同，后者定义为可以或不可以具有增殖，即自我复制的能力，但在正常生理条件下不能经过进一步分化成为不同的细胞类型。另外，祖细胞还与异常细胞，例如本文定义的肿瘤细胞不同。例如，淋巴瘤细胞增殖(自我复制)，但通常不进一步分化，尽管可能是不成熟或未分化的。

祖细胞包括所有在分化的谱系中和在大部分分化或完全成熟的细胞之前增殖的细胞。因此例如，祖细胞包括成熟个体内的皮肤祖细胞。皮肤祖细胞能分化成仅一类细胞，但本身不完全成熟或完全分化。

“造血”意味着产生成熟的有功能的血细胞。产生成熟有功能的血细胞的祖细胞称为造血祖细胞。最常见的未分化造血祖细胞称为造血干细胞。造血干细胞通常位于骨髓内，主要是休眠状态，可通过称为“自更新”的过程形成相同的子代细胞。

一些成熟的有功能的血细胞的产生是“单功能祖细胞”的增殖和分化导致的，即这些仅产生一种血细胞的祖细胞。对于红血细胞(红细胞)的产生，一个称为“CFU-E”(集落形成单位-红细胞样细胞)的单功能祖细胞能产生2-32个成熟的子代细胞。各种其它造血祖细胞已被确定特征。例如，造血祖细胞包括能连续循环分化和增殖，得到8种不同的成熟造血细胞谱系的细胞。

不受约束的祖细胞，例如造血干细胞可被描述成“全能的”，即对于产生所有类型的成熟细胞是必要和充分的。维持产生全部细胞谱系，但不能自更新的祖细胞称为“多能性的”。可产生一些但不是全部血液谱系，而且不能自更新的细胞称为“多效的”。

可通过特异性调节祖细胞或作为谱系关键的基因mRNA水平限定祖细胞。例如，在原始人造血祖细胞中诱导的基因包括编码IL3、IL5和/或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体的共有β亚基，称为β共有链(McClanahan等，Blood81：3903-2915，1993)的基因；CD34基因；和/或Kit(Turner等，Blood 88：3383-3390，1996)、FLT1、FLT4(galland等，Oncogene 8：3233-1240，1993)、FLK1(Broxmeyer等，Int.J.Hematol.62：303-215，1995)和FLT3(Lyman和Jacobsen，Blood 91：3101-1134，1998)的受体。中间祖细胞的基因包括c-Fms、G-CSF受体，和/或CD34基因；和IL-7受体基因，一种诱导B淋巴组织生成的基因。

小鼠原始祖细胞群包括白细胞介素-1α(IL-1α)、IL-3、IL-6、粒细胞集落-刺激因子(G-CSF)，和/或FLK1-1(与VEGF结合的人KDR的小鼠同源物)(Broxmeyer，见上)的受体，但缺乏巨噬细胞集落刺激因子(M-GSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和淋巴瘤抑制因子(LIF)的受体。中间祖细胞群中的细胞包括GM-CSF、G-CSF、IL-6和/或IL-1α的受体。

根据本发明的第一个方面，术语“结合”、“与……结合”或“结合的”互换使用，意味着本发明的FRIL家族成员分子与正常糖基化的FLT3受体结合的亲和力比FLT3配体与该FLT3受体结合的亲和力大。优选FRIL家族成员分子与正常糖基化的FLT3受体结合的亲和力比抗体与其特异性配体结合的亲和力至少一样大。更优选的，FRIL家族成员分子与正常糖基化的FLT3受体结合的亲和力比抗体与其特异性配体结合的亲和力高。更优选的，FRIL家族成员分子与正常糖基化的FLT3受体结合具有至少10^-7M，优选10^-8M，甚至更优选10^-9M，更优选至少10^-10M的解离常数(K_D)，最优选本发明的FRIL家族成员分子与正常糖基化的FLT3受体结合具有至少10^-11M的解离常数(K_D)。测定结合和结合亲和力的标准方法是已知的。

根据本发明，“正常糖基化的FLT3受体”指一种FLT3受体，其具有正常细胞糖基化的FLT3细胞的糖基化模式。根据本发明的所有方面，本文所用的“正常细胞”意味着不是肿瘤性的细胞。本文所用的“肿瘤细胞”意味着显示异常增殖的细胞，特别是增殖增加，不受细胞-细胞接触抑制和可溶性调节剂(例如细胞因子或激素)调控，不正常糖基化FLT3受体，例如肿瘤细胞上的糖基化模式是异常的，肿瘤细胞上的FLT3受体不与FRIL家族成员分子结合。

根据本发明的第一个方面， “基本纯”意味着核酸或蛋白质(例如FRIL家族成员分子)等分子或分子组成成分，它更加不含其它天然作为杂质分子存在的有机分子(例如糖类、核酸、蛋白质和脂类)，基本无在纯化过程中使用的物质。例如如果蛋白质或核酸分子至少约60％，优选至少约75％，更优选至少约85％，最优选至少约90％，最佳至少约95％纯，即无其它与其天然一起存在的有机分子和在纯化过程中使用的物质，将其视为基本纯。纯化蛋白质的方法是本领域已知的，包括但不限于HPLC、SDS-PAGE、免疫沉淀、重组蛋白质产生、用特异性抗体亲和层析、离子交换、尺寸排阻和疏水性相互作用层析、或任何这些方法的组合。这些和其它合适的方法在例如Marston“大肠杆菌中表达的真核蛋白的纯化”，于DNACloning，Glover D.M.编，III卷，IRL Press Ltd.，Oxford，1987；Marston和Hartley，“蛋白质聚集物的溶解”，pp.266-267于蛋白质纯化指南，Deutscher MP编，Academic Press，San Diego，1990；Laemmli，U.K.，Nature 227：680-685，1970中描述了这些和其它合适的方法。还可通过与可偶联在固相载体(例如琼脂糖珠)上的甘露糖结合，纯化FRIL家族成员分子。

纯化核酸的方法是本领域已知的，包括但不限于盐酸胍抽提，聚合酶链式反应，CsCl梯度分级，苯酚：氯仿抽提，乙醇沉淀和标准的重组DNA方法。纯化蛋白质和核酸分子的标准方法在例如Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，New York，NY，1994；Sambrook等，见上中提供。

根据本发明的第一个方面，可从天然来源中用本领域已知的方法纯化FRIL家族成员分子。例如扁豆的Dl-FRIL的纯化在下文实施例1中所述。菜豆的Pv-FRIL纯化在下文实施例5中所述。豆薯的YamFRIL的纯化在下文实施例22中描述。这些方法还包括例如Moore在PCT申请PCT/US97/22486和Gowda等，见上所述。纯化FRIL家族成员分子的合适的天然来源包括植物，尤其是豆科植物。豆科植物，例如菜用豌豆或常见的菜豆是来自在根上携带根瘤(固氮细菌)的双子叶草本、灌木和乔木的豆科(Leguminosae)植物。这些植物通常与其种子关联(例如菜用豌豆或菜豆)。

更具体的，本发明第一个方面的FRIL家族成员分子可从菜豆(Phaseoleae)族的成员中纯化。例如，FRIL家族成员分子可从各种扁豆(例如红菜豆和白菜豆)、豆薯或通常称为黑眼豆的豇豆(Vigna sinensis)中纯化。

如下文实施例所示，来自豆科植物的FRIL家族成员分子的纯化是迅速和低廉的，得到大量基本纯的植物凝血素。天然的FRIL家族成员分子能简单的从豆科植物，例如白扁豆(无杀虫剂)中，通过甘露糖亲和层析或卵清蛋白亲和层析纯化，比生产常规的细胞因子便宜100倍。根据本发明的第一个方面，“植物凝血素”意味着一种以高亲和力与糖残基结合的蛋白质。最优选的，FRIL家族成员分子是甘露糖/葡萄糖-特异性豆科植物凝血素。

如下文实施例所示，FRIL家族成员分子和FRIL家族成员分子的组成成分具有许多性质，作为缓解治疗剂(例如化疗剂)的祖细胞耗竭活性，或缓解病人祖细胞被耗竭的病症的症状的制剂。例如，FRIL家族成员具有独特的性质，是第一种被报道即使在存在增殖和分化的强刺激剂的情况下，也能保护造血干细胞和延长休眠状态的祖细胞的可溶性调节剂。另外，因为小鼠耐受非常高水平的FRIL家族成员分子，这可能允许更有效的保护干细胞和祖细胞，因为在针对化疗剂的提高频率和剂量水平的进攻剂量增强疗法过程中防止其恢复。虽然Dl-FRIL的生物活性与细胞因子相似(ng/ml范围)，如下文实施例所示，小鼠耐受的Dl-FRIL比细胞因子高1,000倍。

另外，通过将造血干细胞和其它祖细胞维持在休眠状态，FRIL家族的一个或多个成员使得能够以更高的频率和更高的剂量施用广泛范围的细胞周期活性化疗药物。因此，施用含有一种或多种FRIL家族成员的组成成分可允许广泛的化疗药物的更强剂量的增强化疗。施用FRIL家族成员的组成成分还提供了更大的祖细胞储备，能够在完成化疗后快速响应刺激信号。

在本发明的一些实施例中，本发明的FRIL家族成员是来自豆科植物(例如菜豆植株)。

在一些实施例中，本发明的FRIL家族成员分子来自白扁豆(即扁豆)，具有含SEQ ID NO：24的序列的氨基酸序列。优选从白扁豆分离的本发明的FRIL家族成员分子具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或含有具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的信号序列，甚至更优选的，由具有SEQ ID NO：1的核酸序列或SEQ ID NO：3的核酸序列的核酸编码。

在一些实施例中，本发明的FRIL家族成员分子来自红菜豆(即菜豆)。优选从红菜豆分离的本发明的FRIL家族成员具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列，甚至更优选的，由具有SEQ ID NO：5的核酸序列的核酸编码。

在一些实施例中，本发明的FRIL家族成员分子来自豆薯(即Sphenostylisstenocarpa)。优选从豆薯分离的本发明的FRIL家族成员具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列，更优选具有含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的氨基酸序列的β亚基，甚至更优选的具有含有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的氨基酸序列的α亚基，和甚至更优选的，由具有SEQ ID NO：7的核酸序列的核酸编码。

在本发明的一些实施例中，FRIL家族成员分子是衍生自FRIL家族第二个成员的突变体，其中突变体选自取代突变体、缺失突变体、添加突变体或其组合(例如DI-FRIL或Pv-FRIL下文所述的突变体)。例如优选用等价的氨基酸取代序列中的氨基酸。通常已知等价的氨基酸组是：(1)Ala(A)、Ser(S)、Thr(T)、Pro(P)、和Gly(G)；(2)Asn(N)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)；(3)His(H)、Arg(R)、Lys(K)；(4)Met(M)、Leu(L)、Ile(I)、Val(V)；和(5)Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(M)。可在氨基酸序列中制造取代、添加和/或缺失，只要突变的FRIL家族成员分子继续满足本文所述的关键功能。基本与另一条序列相同，但是由于一个或多个取代、添加和/或缺失与其它序列不同的氨基酸序列可考虑作为等价序列。优选序列中少于50％，更优选少于25％，甚至更优选少于10％的氨基酸残基数取代、加到或从来自FRIL家族成员分子除去，衍生出突变的FRIL家族成员。

在本发明的第一个方面的一些实施例中，FRIL家族成员分子是一种融合蛋白，含有第一部分和第二部分，其中第一部分衍生自FRIL家族的第二个成员。“融合蛋白”意味着一个含有至少两个连接在一起的蛋白或多肽片段的分子，其中蛋白质或其多肽片段在衍生出该蛋白质或其多肽片段的天然存在的生物中不连接在一起。融合蛋白的两种蛋白质或其多肽片段可用任何方法，包括但不限于化学接头、多肽键或非共价键，例如离子键连接。“蛋白质”或“多肽”意味着两个或多个用肽键连接的氨基酸残基链，不论长度或经酰化、糖基化、脂化、乙酰化或磷酸化等翻译后修饰。

作为融合蛋白的FRIL家族成员分子可含有衍生自FRIL家族成员的第一部分和衍生自与FRIL家族不相关的蛋白质或其它分子的第二部分(例如抗体的重链)。

作为融合蛋白的另一种FRIL家族成员分子是含有来自第一个FRIL家族成员的α亚基和来自第二个FRIL家族成员的β亚基的FRIL家族成员。这种融合蛋白可以通过例如将编码第一种FRIL家族成员的α亚基的核酸序列与编码第二种FRIL家族成员的β亚基的核酸序列连接在阅读框内产生。编码这种融合蛋白的核酸可工程改造，来编码第一种FRIL家族成员的α亚基和第二种FRIL家族成员的β亚基的部分之间的酶特异性切割位点。

当FRIL家族成员是融合蛋白时，作为FRIL家族成员的融合蛋白的相同性由融合蛋白的FRIL家族成员衍生的部分和第二种FRIL家族成员之间的序列相同性决定，其中融合蛋白的FRIL家族成员衍生部分和第二种FRIL家族成员的氨基酸序列具有至少约45％的氨基酸序列相同性，甚至更优选至少约50％相同性，甚至更优选至少约55％相同性，更优选至少约60％相同性，更优选至少约65％相同性，更优选至少约75％序列相同性，更优选至少约85％相同性和最优选至少约95％相同性。

根据本发明的第一个方面的FRIL家族成员还可以是重组的蛋白，它是通过在合适的宿主中表达编码FRIL的重组核酸产生的。因此，在第二个方面，本发明的特征是编码祖细胞保护因子的FRIL家族成员的基本纯的核酸分子。从扁豆和菜豆纯化本发明的核酸分子的示范性纯化在下文描述。如熟知的，如果氨基酸序列(一级结构)已知，然后可构建核酸家族，各具有与其它至少有一个核苷酸不同的序列，但各不同的核酸仍然编码相同的蛋白质。例如，如果蛋白质已测序，但是其相应的基因还未被鉴定，可通过用一组对所有可能的编码蛋白质的序列特异性的简并引物扩增基因组DNA来获得基因。因此，根据本发明的该方面的核酸不需要是天然存在的序列，但仅需要编码根据本发明的第一个方面的FRIL家族成员。

根据本发明的第二个方面，“祖细胞保护因子的FRIL家族成员”如上本发明的第一方面所述。用对于本发明的第一方面所述的“基本纯”。

“重组核酸”意味着一条核酸，该核酸编码FRIL家族成员分子或其编码至少其15个连续氨基酸的部分，或其突变体，或含有大分子的融合蛋白，其部分或其突变体，或能表达与其特异性互补的反义分子，或与其具有核酸序列相同性的有义分子，其中重组核酸可以是线性DNA或RNA，共价闭合的环状DNA或RNA，或作为染色体的一部分，条件是它不能是FRIL家族成员分子的天然染色体座位。优选本发明的重组核酸是载体，它可以包括复制起始点因此能在一种或多种细胞类型中复制。一些优选的重组核酸是表达载体，还包含至少一个启动子和被动终止子，从而使得能在细菌、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞中转录重组核酸。本文所用的“核酸”或“核酸分子”意味着任何脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括但不限于互补DNA(cDNA)、基因组DNA、RNA、hnRNA、信使RNA(mRNA)、DNA/RNA杂交子、或含有核糖核酸和/或脱氧核糖核酸或其合成变体的合成的核酸(例如寡核苷酸)。本发明的核酸包括但不限于寡核苷酸或多核苷酸。核酸可以是单链的或部分或完全双链(二倍体)。二倍体核酸可以是同二倍体或异二倍体。

在本发明的第二个方面，编码FRIL家族成员的核酸与编码FRIL家族的另一个成员的核酸具有至少约50％核酸序列相同性，优选至少约55％核酸序列相同性，更优选约60％核酸序列相同性，更优选约75％核酸序列相同性，甚至更优选约85％核酸序列相同性，最优选约95％核酸序列相同性。可如本发明第一方面所述测定核酸序列相同性百分数。

根据本发明第二方面的重组核酸还可以用本领域已知的方法化学合成。例如，可用本领域已知的方法从4个核苷酸完整或部分地化学合成重组DNA。这些方法包括Caruthers，M.H.，Science 230(4723)：281-285，1985所述的方法。DNA还可以通过制备重叠的双链寡核苷酸，填充缺口，连接末端合成。一般见Sambrook等，见上和Glover和Hames编，DNA Cloning，第2版，卷1-4，IRL Press，Oxford，1995。

可通过定点诱变(见例如Zoller和Smith，Nucleic.Acids Res.10：6487-6500，1982；Zoller，M.J.Methods Enzymol.100：468-500，1983；Zoller，M.J.，DNA3(6)：479-488，1984；和McPherson，M.J.编，Directed Mutagenesis：APractical Approach，IRL Press，Oxford，1991)从野生型DNA制备本发明编码突变的FRIL家族成员的重组核酸分子。可用本领域已知的方法扩增本发明第二方面的重组核酸。一种合适的方法是聚合酶链式反应(PCR)法，在Saiki等，Science，239：487，1988，Mullis等，美国专利号4,683,195和Sambrook等，见上中有所描述。用λ-gt10或λgt11特异性寡聚物座位扩增物(购自Clonetech，PaloAlto，CA)可方便的在λgt10或λgt11中扩增克隆。较大的合成核酸和结构还可以用本发明的特定和可识别的方法产生。例如，已知载体(例如重组表达载体)允许掺入感兴趣的核酸，用于克隆和转化其它细胞。因此，本发明还包括载体(例如质粒、噬菌体和粘粒)，它们掺入有本发明的核苷酸序列，尤其是包含本发明的重组核酸分子用于表达FRIL家族成员的载体。

可复制本发明的重组核酸，并在各种克隆和表达载体内插入各种宿主细胞，用于表达FRIL家族成员。宿主可以是原核或真核生物。核酸可以从天然来源获得，也可任选的修饰。基因还可以是完全或部分合成的。

克隆载体可含有染色体、非染色体和合成性DNA序列的区段。一些合适的原核克隆载体包括来自大肠杆菌的质粒，包括colE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核载体还包括噬菌体DNA的衍生物，例如M13fd和其它线状单链DNA噬菌体。

在细菌，尤其是大肠杆菌中表达蛋白质的载体也是已知的。这些载体包括pK233(或任何tac家族的质粒)、T7和λP_L。表达融合蛋白的载体的例子是Dieckmann和Tzagoloff(J.Biol. Chem.260(3)：1513-1520，1985)中所述的PATH载体。这些载体含有编码邻氨基苯甲酸酯合成酶(TrpE)，在羧基端接上一个多接头的DNA序列。其它表达载体系统基于β-半乳糖苷酶(pEX)；麦芽糖结合蛋白(pMAL)；谷胱甘肽S-转移酶(pGST)(见例如Smith，D.B.，Gene 67：31-40，1988和Abath，F.G.，Peptide Research3(4)：167-168，1990)。在酵母中用于克隆和表达的载体也是可得的。合适的例子是2μ环状质粒。

用于在哺乳动物细胞的合适的克隆和表达载体也是已知的。这些载体包括SV-40的熟知衍生物、腺病毒、巨细胞病毒(CMV)、基于反转录病毒熟知的DNA序列。当与衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，即穿梭载体偶联时，任何这些载体能够在原核生物中分离和鉴定编码蛋白质的序列。

其它真核表达质粒也是本领域已知的(例如Southern和Berg，J.Mol.Appl.Genet，1：327-341，1982；Subramani等，Mol.Cell.Biol.1：854-864，1981；Kaufmann和Sharp，J.Mol.Biol.159：601-664，1982；Scahill等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4654-4659，1983；Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)。

用于本发明的表达载体含有至少一个表达控制序列，它与要表达的重组核酸分子或其片段可操纵性连接。控制序列插入载体中，以控制和调节本发明的重组核酸的表达。可用的表达控制序列的例子是lac系统、trp系统、trc系统、主要操纵子和噬菌体λ的启动子区、fd外壳蛋白的控制区、酵母的糖酵解启动子，例如3-磷酸甘油激酶的启动子、酵母酸性磷酸酶的启动子(如Pho5)，酵母α-杂交因子，和衍生自多瘤、腺病毒、反转录病毒和猿病毒的启动子，例如SV40的早期和晚期启动子、和其它已知控制原核或真核细胞及其病毒的基因或其组合表达的序列。

用于表达本发明的重组核酸的表达宿主包括熟知的原核和真核细胞。一些合适的原核宿主包括例如大肠杆菌(例如大肠杆菌SG-936、大肠杆菌HB101、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌X2282、大肠杆菌DHI和大肠杆菌MRC1)，假单胞菌，杆菌(例如枯草杆菌)和链霉菌。合适的真核细胞包括酵母和其它真菌、昆虫、动物细胞，例如COS细胞和CHO细胞，组织培养物中的人细胞和植物细胞。

根据本文公开的重组核酸序列，技术人员能进一步设计出在不同类型的应用中具有特定功能的重组核酸。例如，技术人员能构建寡核苷酸或多核苷酸，用作核酸扩增过程，例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、修复链式反应(RCR)、PCR寡核苷酸连接法(PCR-OLA)等的引物。可构建在杂交研究，例如原位杂交中，用作探针的寡核苷酸。用放射性同位素、荧光标记、酶、结合基团(例如生物素)等标记探针的各种方法是已知的，因此本发明的探针可适应方便的可检测性。

还可为了其它目的设计和制造寡核苷酸。例如，本发明使技术人员能设计反义寡核苷酸和形成三联体的寡核苷酸等，用于研究结构/功能关系。通过使本发明的核酸适用作靶向分子，可实施同源重组。

可进一步修饰如上所述产生的本发明的重组核酸，用于通过本领域已知的技术改变生理或生物学性质。例如，可修饰重组核酸来提高其对抗核酸酶的稳定性(例如“末端加帽”)，或改变其亲脂性、溶解度或与互补序列的结合亲和性。修饰核酸实现特定目的的方法在本领域中有所公开，例如在Sambrook等，见上中。另外，本发明的重组核酸可包括FRIL家族成员非编码的核苷酸序列的一个或多个部分。

在第三个方面，本发明提供了一种药物制剂，含有一种基本纯的组成成分，该组成成分含有祖细胞保护因子FRIL家族的一个或多个成员和一种药物学上可接受的载体。“药物学上可接受的载体”意味着任何惰性载体，它们对于所施用的动物无毒，并保留与其一起施用的化合物(即FRIL家族成员)治疗作用。药物学上可接受的载体及其制剂是熟知的，在例如Remington’s PharmaceuticalScience(18版，A.Gennaro，Mack Publishing Co.，Easton，Power ofAtternoy，1990)中一般描述。一种示范性药物学上可接受的载体是生理盐水。本发明的药物制剂可使用任何药物学上可接受的载体，视施用组合物的途径而定。

可安全有效地用FRIL家族成员的组成成分作为治疗剂。动物胃肠道稳定地与生的和/或煮熟的植物和水果中的植物凝血素，例如FRIL家族成员，接触。许多植物凝血素以生物学上完整的形式通过胃肠道(Pusztai，A.Eur.J.Clin.Nutr.47：691-699，1993)。一些植物凝血素与肠道相互作用，转运到外周血循环。例如，近来的研究发现在摄取200克生花生后1个小时，人血液中花生凝集素(PNA)水平达到1-5微克/毫升(Wang等，Lancet 52：1831-1832，1998)。在人中常发现约1微克/毫升水平的针对食用植物凝血素的抗体(Tchernychey和Wilchek，FEBSlett.397：139-142，1996)。这些循环血不封闭植物凝血素的糖类结合。

在本发明第三个方面的一些实施例中，对患有造血祖细胞耗竭的病状的病人施用治疗有效量的药物制剂，缓解和/或减轻了病人的病状。

根据本发明的第三个方面，“治疗有效量”意味着FRIL家族成员的组成成分或含有FRIL家族成员药物组合物的药物制剂的剂量，该剂量有效地缓解和/或减轻一种病况，该病况是病人的造血祖细胞耗竭或治疗剂(例如化疗剂)的造血祖细胞耗竭作用引起的。优选给药是全身性的(例如通过静脉注射)。当全身给药时，治疗有效量是每天约500纳克-5毫克的FRIL家族成员/公斤总体重。更优选的，治疗有效量是每天约5微克-50微克的FRIL家族成员/公斤总体重。最优选的，治疗有效量是每天传递约50微克的FRIL家族成员/公斤总体重。

本发明的FRIL家族成员的组成成分和含有本发明的FRIL家族成员的组成成分的药物制剂可施给患有或倾向发生病人造血祖细胞耗竭的病况的病人。这种病况可以是先天的。例如，病人可能患有严重的联合免疫缺乏或再生障碍性贫血。

病况还可能是由药物引起的。例如在本发明的第三个方面的一些实施例中，在用具有造血祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗病人之前，对病人施用治疗有效量的药物制剂缓解了病人中治疗剂的造血祖细胞耗竭作用。例如，癌症病人常用具有造血祖细胞耗竭作用的放疗剂或化疗剂治疗。“造血祖细胞耗竭作用”意味着一种治疗剂治疗的作用，通过其能通过杀死祖细胞或诱导祖细胞经历不可逆分化，使的用该治疗剂治疗的病人体内的造血祖细胞耗竭。具有造血祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗的非限制性例子是化疗剂阿糖胞苷(Ara-c)、阿霉素(dox)、柔红霉素和5-氟尿苷(5-FU)。

在一些实施例中，在用具有造血祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗前，对病人施用本发明的药物制剂使得能用更高剂量的治疗剂疗法治疗病人。更高剂量的治疗剂治疗可以通过增加治疗剂治疗的剂量和/或延长治疗剂治疗的持续时间实现。例如，诊断出儿童期急性骨髓性白血病(AML)的儿童通常在一开始的7天内，在第1-3天用45mg/m²的柔红霉素，加7天的100mg/m²的Ara-C和7天的100mg/m²的GTG。预先用本发明的该方面的组合物治疗的同一儿童可以忍受任何或全部这些化疗剂的更高的剂量(即更高的剂量和/或延长的治疗期)。在癌症病人中这种具有造血祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗(例如化疗剂)的剂量耐受的提高是理想的，因为更高的剂量将导致更多癌细胞的破坏。

本发明的药物制剂和/或组合物可以任何合适的方式施用。例如，本发明的药物制剂和/或组合物可存在于药物学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中，以单剂形式根据常规药物实践施给哺乳动物。给药可以在哺乳动物具有造血祖细胞耗竭病况的症状之前开始。例如，对癌症病人施用本发明第三方面的药物制剂可在病人接受放疗和/或化疗治疗前开始。

可使用本发明的药物制剂和/或组合物的任何合适给药途径，包括但不限于胃肠外、静脉内、动脉内、皮下、舌下、透皮、外用、肺内、肌肉内、腹膜内、吸入、鼻内、气溶胶、直肠内、阴道内、或通过口服给药。本发明的药物制剂和/或组合物可以是液态溶液或混悬液的形式；对于口服给药，制剂可以是片剂或胶囊的形式；对于鼻内给药，是粉末、鼻滴剂或气溶胶。药物制剂和/或组合物可以局部用于患有病人造血祖细胞被耗竭的区域。例如，本发明的药物制剂和/或组合物可直接施用到病人的骨髓内。本发明的药物制剂和/或组合物可以全身性给药。

在本发明的第三个方面的一些实施例中，患者是指人或家养的动物。“家养的动物”意味着人驯养的动物，包括但不限于猫、犬、象、马、绵羊、牛、猪和山羊。在一些实施例中，患者患有癌症。

在本发明的第三个方面的一些实施例中，治疗是放疗或化疗，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)或放疗剂和化疗剂的组合。

在第四个方面，本发明提供了一种在患者中缓解和/或减轻治疗剂治疗的造血祖细胞耗竭作用的方法，包括在对患者施用治疗剂治疗前，对动物施用治疗有效量的FRIL家族成员的组成成分。“造血祖细胞耗竭作用”如本发明第三方面所述。施用本发明该方面的FRIL家族成员的组成成分的途径如施用本发明第三方面的药物制剂所述。“治疗有效量”如本发明第三方面所述。

在本发明的第四方面的一些实施例中，患者是人或家养的动物。“家养的动物”如本发明第三方面所述。在一些实施例中，患者患有癌症。在一些实施例中，治疗剂治疗是放疗剂或化疗剂治疗，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)或放疗剂或化疗剂的组合。

在第五个方面，本发明提供了一种方法，用于分离一群祖细胞，包括使一群细胞与多个FRIL家族成员分子接触，并分离未结合的细胞，其中与FRIL家族成员分子结合的细胞是被离的祖细胞群。“FRIL家族成员分子”和“祖细胞”如本发明第一方面所述。“未结合的细胞”意味着细胞不和FRIL家族成员结合。“结合”如本发明第一方面所述。

“分离”意味着一群从更大的细胞群中分离出来的祖细胞，其中分离的群中祖细胞百分数至少比更大的群中祖细胞百分数高两倍。优选分离的群中祖细胞百分数至少比更大的群中祖细胞百分数高四倍。本发明的分离的祖细胞群中祖细胞百分数的提高的非限制性例子如下文表11中所示。优选，本发明的分离的祖细胞群至少是脐带血单核细胞(CMmnc)总数的2％。优选，本发明的分离的祖细胞群最多是脐带血单核细胞(CMmnc)总数的1％。优选分离的祖细胞群与正常糖基化的FLT3受体结合。“正常糖基化的FLT3受体”如上限定。

在优选例中，分离的祖细胞群来自人或来自家养的动物。

在本发明的第五个方面的一些实施例中，FRIL家族成员分子是可检测标记的。“可检测标记”意味着FRIL家族成员与可目测或通过仪器检测的分子结合。可检测标记(例如酶和显色分子)可以与二醛、碳二亚胺和马来酸氢亚胺。许多标记蛋白质的方法是本领域已知的。标记还可以直接通过FRIL家族成员上的官能团结合。这样的标记基团可存在于要可检测标记的FRIL家族成员分子上；另外，可用标准技术修饰FRIL家族成员分子，使其含有官能团。一些合适的官能团的例子包括但不限于氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺、异氰酸酯、异硫氰酸酯。

在一些实施例中，可检测标记是放射性或非放射性的。有用的放射性标记的一些例子包括³²P、¹²⁵I、¹³¹I和³H。放射性标记的使用在英国专利文件2,034,323和美国专利号4,358,535和4,302,204中有所描述。一些非放射性标记的例子包括可用电镜检测的酶、显色团、原子和分子，和可通过其磁性检测的金属离子。

在本发明第五个方面的一些实施例中，可检测标记是酶标记。一些有用的酶标记包括导致底物可检测改变的酶。一些有用的酶及其底物包括例如辣根过氧化物酶(连苯三酚和邻苯二胺)、β-半乳糖苷酶(荧光素β-D-半乳糖吡喃糖)和碱性磷酸酶(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基蓝四氮唑)。酶标记的使用在英国2,019,404和EP63,879中有所描述，在此引入以供参考，以及Rotman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 47：1981-1991，1961中描述。

在本发明的该方面的一些实施例中，可检测标记的FRIL家族成员分子是通过与可检测标记的抗体特异性结合而被标记的。

在本发明的该方面的一些实施例中，FRIL家族成员分子与受体(或配体)缀合，并且通过使受体(或配体)与配体(或受体)结合而可检测标记，其中配体(或受体)被可检测标记。任何已知的配体-受体组合是合适的。一些合适的配体-受体配体包括例如生物素-亲和素或链霉亲和素，和抗体-抗原。在一些实施例中，生物素-亲和素组合是优选的。

在一些实施例中，可检测标记是显色团。有用的显色团包括例如荧光、化学发光、生物发光分子，以及染料。一些在本发明中使用的特定化学团包括例如荧光素、罗丹明、Texas red、藻红蛋白、伞形酮、鲁米诺。

在本发明的该方面的一些实施例中，FRIL家族成员分子被显色团而可检测标记，未结合的细胞通过流式细胞分选机与被荧光标记可检测标记的FRIL家族成员分子接触的细胞群分选。

在本发明第五个方面的一些实施例中，FRIL家族成员分子固定在固相载体上。“固相载体”包括任何表面，包括但不限于琼脂糖珠、凝胶、基质、磁珠的表面和塑料表面(例如组织培养板或烧瓶底部)。

在一些实施例中，固相载体是珠，例如磁珠。在一些实施例中，当固相载体是磁珠时，通过对与固定在磁珠上的FRIL家族成员分子接触的细胞群施加磁性，分离未结合的细胞。在其它实施例中，当使用磁铁时，用生理上可接受的溶液漂洗固定在磁珠上的FRIL家族成员分子结合的细胞群。“生理上可接受的溶液”指惰性溶液，例如无菌盐溶液或组织培养液，它对细胞是无毒性的。

下文实施例16描述了分离与FRIL家族成员分子包裹的磁珠结合的细胞的方法。磁珠是商品购得的(例如来自Dynabeads Tosylactivated，Lake Success，NY；或来自Miltenyi Biotec，Auburn，CA)。由于FRIL家族成员是蛋白质，它可以与磁珠通过蛋白质的氨基或巯基缀合。FRIL家族成员分子还可以通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在磁珠上。

优选的磁珠是极小的MACS超-顺磁性MicroBeads(来自Miltenyi Biotec)，直径约50纳米(MACS珠的体积比真核细胞大约小一百万倍)。由于MACS珠象磁性抗体一样反应，在几分钟内就可实现磁性标记。MACS MicroBeads形成稳定的胶态悬液，不在磁场中沉淀或聚集。由于它们的大小和组成(氧化铁和多糖)使得MACS可生物降解，因此标记的细胞保留了它们的生理功能。MACS珠的这种性质对于珠-分选的FRIL家族成员结合细胞特别有用，这些珠以高亲和力结合FRIL家族成员，难于除去珠。

在第五个方面的一些实施例中，固相载体是组织培养板的底部。在一些实施例中，通过用生理学上可接受的溶液漂洗与固定在组织培养板底部的FRIL家族成员分子接触的细胞群，分离未结合的细胞。

FRIL家族成员分子可以直接或间接与组织培养板底部结合。根据标准“摇动”法(见例如Stengelin等，EMBO J，7(4)：1053-1059，1988；Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(23)：8573-8577，1987)，在板上培养怀疑含有FRIL家族成员结合的祖细胞的细胞群。然后用生理学上可接受的溶液温和地漂洗板，从而除去未结合的细胞，留下与FRIL家族成员包裹的板结合的与FRIL家族成员结合的细胞群。

在本发明第五个方面的优选例中，祖细胞的分离群是造血祖细胞群。在各种实施例中，细胞群是全血、脐带血、骨髓细胞或胎肝细胞。

在本发明第五个方面的一些实施例中，细胞群是分选过的细胞群，其中分选过的群中的细胞不表达CD11b、CD11c或CD38。由于更原始的祖细胞通常几乎不表达细胞表面分子，在分离与FRIL家族成员结合的祖细胞群前，优选分选细胞群，首先除去表达一种或多种以下细胞表面分子的细胞：CD11b、CD11c和CD38。在该阴性分选(即其中保留的细胞不表达CD11b、CD11c和/或CD38的分选)后，分选过的群阳性分选能与FRIL家族成员结合的能力。

在一些实施例中，分选过的细胞群用流式细胞计数或磁珠筛选分选。因此，一群细胞(例如人脐带血细胞)可以首先与特异性结合CD11b、CD11c和/或CD38的用显色团标记的抗体(或其它分子，例如配体)接触。结合后，细胞群然后用流式细胞计数分选，其中保留了不和抗体结合的细胞(因此不表达CD11b、CD11c和/或CD38)，进一步分选与FRIL家族成员结合的能力，其中与FRIL家族成员结合的细胞群是分离的本发明的祖细胞群。

一群细胞还可以与分子，例如抗体接触，这些分子与CD11b、CD11c和/或CD38特异性结合，其中这些分子与固相载体，例如磁珠结合。然后对珠施加磁力阴性分选细胞群，保留不与珠结合，因此不与磁铁结合的细胞。这些分选过的细胞再次分选与FRIL家族成员结合的能力，其中与FRIL家族成员结合的细胞群是分离的本发明的祖细胞群。

在第六个方面，本发明提供了一种经分离的祖细胞群，该细胞群是通过一种方法分离的，该方法包括使一群细胞与多个FRIL家族成员分子接触，分离未结合的细胞，其中与FRIL家族成员结合的细胞是分离的祖细胞群。“FRIL家族成员分子”、“祖细胞”、“未结合的细胞”和“结合”如上所述。

在优选例中，祖细胞的分离群来自人或家养的动物。

在第六个方面的一些实施例中，分离的细胞群在其细胞表面不表达CD34。在一些实施例中，分离的细胞群表达FLK1、FLT1、FLT3、FLT4或Kit受体酪氨酸激酶。在一些实施例中，分离的细胞群表达CD11b和CD11c细胞表面分子。在优选例中，分离的细胞群表达FLT3。

在本发明的第六个方面的各种实施例中，分离的细胞群是血管生成细胞、间质干细胞、骨祖细胞、肝脏祖细胞、内皮祖细胞、造血祖细胞、胚胎祖细胞、脑祖细胞或枝状祖细胞。“血管生成细胞”意味着造血和内皮谱系的祖细胞。优选分离的细胞群是造血祖细胞。“间质干细胞”意味着一群细胞，它是骨髓基质细胞的祖细胞，包括但不限于脂肪组织细胞、软骨生成细胞、肌肉细胞和骨骼细胞。本发明的该方面的这些细胞可用于例如组织修复。

确定本发明的祖细胞将产生哪种类型的细胞是通过下文所述的各种祖细胞试验进行的。例如，如果祖细胞被怀疑是内皮祖细胞，在血管内皮生长因子存在下，在甲基纤维素祖细胞试验中培养该细胞。如果该培养产生的细胞具有内皮细胞标记，本发明的祖细胞是内皮祖细胞或血管生成细胞。

在本发明的第六个方面的一些实施例中，其中分离的细胞群是造血祖细胞，将细胞移植到缺乏足够使动物存活的数量的造血祖细胞的动物中重建该动物，其中受移植的动物存活。可用下文用于NOD-SCID小鼠的方法确定造血祖细胞重建缺乏足够使动物存活的造血祖细胞数量的动物的能力。

在一些实施例中，造血祖细胞来自小鼠或人，动物是小鼠。在一些实施例中，小鼠是严重的联合免疫缺乏(SCID)小鼠(例如下文所述的NOD-SCID小鼠)，或接触亚致死剂量的辐射和/或化疗的小鼠。

在本发明的第六个方面的一些实施例中，造血祖细胞来自人，动物是人。在一些实施例中，人是接受耗竭病人造血祖细胞的治疗的癌症病人。在一些实施例中，治疗是放疗或化疗治疗，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)灭火放疗剂和化疗剂的组合。

在第七个方面，本发明提供了一种在体外保护祖细胞的方法，包括使一群含有至少一种祖细胞的细胞群与有效量的FRIL家族成员的组成成分接触一段有效的时间，其中该群中的祖细胞保持静止态。“FRIL家族成员”和“祖细胞”如上文本发明第一个方面所述。

根据本发明的该方面，术语“有效量”和“一段有效时间”用于说明以对保护祖细胞有效的剂量和时间期处理。当施给病人，优选这种给药是全身性的(例如通过静脉注射)。可用本文所述的模型和试验确定有效量和有效时间期。例如，下文的实施例描述了保护具有SCID-重建能力的祖细胞。根据本发明，有效量的范围是培养物中约0.1ng/ml-1μg/mL，更优选是约1.0ng/ml-100ng/ml，甚至更优选是约10ng/ml-50ng/ml，最优选是约50ng/ml FRIL家族成员。根据本发明，有效时间期包括在FRIL家族成员存在下培养细胞约2小时-5天，更优选约12小时-3天，最优选约24小时。

在第七个方面的一些实施例中，祖细胞来自人或来自家养的动物。在一些实施例中，细胞群是骨髓细胞。

在一些实施例中，细胞群中的非祖细胞将分化或死亡。因此，虽然培养物中的祖细胞实际上在数目上不增加，但是它们相对于培养物中的细胞数富集了。

在第七个方面的一些实施例中，在用具有造血祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗癌症病人前，从癌症病人取出细胞群。在一些实施例中，治疗剂是放疗剂或化疗剂，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)或放疗剂和化疗剂的组合。

在第八个方面，本发明提供了一种体内保护祖细胞的方法，包括对病人施用治疗有效量的FRIL家族成员的组成成分一段治疗有效时段，其中使病人中的祖细胞静止。“FRIL家族成员”和“祖细胞”如上文本发明的第一个方面所述。“治疗有效量”如本发明的第三个方面所述。

“治疗有效时段”意味着治疗一段有效保护祖细胞的时间。当施给病人时，优选该给药是全身性的(例如通过静脉注射)。有效量和有效时段可以用本文所述的模型和试验确定。例如，例如，下文的实施例描述了保护具有SCID-重建能力的祖细胞。根据本发明，有效时段是在病人接受具有祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗(例如化疗剂)之前约5日，到用治疗剂治疗前约2小时之间注射治疗有效量的FRIL家族成员的组成成分和/或药物制剂，其中每日施用FRIL家族成员的组成成分和/或药物制剂的治疗有效量。根据本发明，优选的治疗有效时段是在病人接受具有祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗(例如化疗剂)前约2天，到用治疗剂治疗前约1天，注射给病人(例如癌症病人)治疗有效量的FRIL家族成员的组成成分和/或药物制剂，其中每日施用FRIL家族成员的组成成分和/或药物制剂的治疗有效量。应理解一旦病人开始接受具有祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗，FRIL家族成员的组成成分和/或药物制剂的治疗有效量可以和在接受治疗剂治疗前病人接受的FRIL家族成员的组成成分和/或药物制剂的治疗有效量不同。

优选病人是人或家养的动物。“家养的动物”如本发明第三个方面所述。

在本发明第八个方面的实施例中，病人是癌症病人。在一些实施例中，在用具有造血祖细胞耗竭作用的治疗剂治疗病人前，施给病人有效量的FRIL家族成员的组成成分。在一些实施例中，治疗剂治疗是放疗剂或化疗剂治疗，包括但不限于阿糖胞苷(Ara-C)、柔红霉素(Dox)或5-氟尿苷(5-FU)，或放疗剂和化疗剂的组合。

在第9个方面，本发明提供了一种鉴定祖细胞的方法，包括使候选细胞与FRIL家族成员分子接触，其中候选细胞与FRIL家族成员分子的结合将候选细胞鉴定为祖细胞。“FRIL家族成员分子”和“祖细胞”如本发明的第一个方面所述。

在第九个方面的一些实施例中，候选细胞在细胞群中。在一些实施例中，候选细胞来自人类。

在第十个方面，本发明提供了一种用一种方法鉴定出的祖细胞，该方法包括使候选细胞与FRIL家族成员分子接触，其中候选细胞与FRIL家族成员分子的结合将候选细胞鉴定为祖细胞。“FRIL家族成员分子”和“祖细胞”如本发明的第一个方面所述。

在第十一个方面，本发明提供了一种鉴定祖细胞保护因子FRIL家族成员的组成成分的方法，该方法包括使候选化合物与FLT3受体糖基化的胞外结构域接触，其中FLT3受体胞外结构域糖基化的模式与正常糖基化的FLT3受体的胞外结构域的糖基化模式相同，其中与FLT3受体的糖基化胞外结构域结合的候选化合物鉴定为FRIL家族成员。“FRIL家族成员”、“祖细胞”和“正常糖基化的FLT3受体”如本发明的第一个方面所述。

根据本发明的第十一个方面，FLT3受体的正常糖基化的胞外结构域可在细胞表面表达(例如在NIH 3T3细胞表面上表达，如下文实施例所述)。可用编码FLT3受体(来自人或小鼠)的胞外结构域的核酸序列转染任何正常细胞，只要正常糖基化细胞表面上表达的FLT3受体。应注意细胞不需要用编码完整FLT3受体的核酸序列转染。例如，细胞可用编码含有非FLT3受体(例如Fms受体)和FLT3受体的胞外结构域的融合蛋白的核酸分子转染。然后将根据本发明的该方面候选的化合物与表达FLT3受体的正常糖基化的胞外结构域的细胞一起培养，候选化合物与细胞的结合(可如下通过细胞的存活测定)将该候选化合物鉴定为FRIL家族成员。

另外，FLT3受体的正常糖基化的胞外结构域不需要被细胞表达，相反，可检测标记FLT3受体的正常糖基化的胞外结构域，或固定在固相载体(例如磁珠)上。例如，可将FLT3受体的正常糖基化的胞外结构域与96孔微量滴定板结合。可检测标记含有不同的候选化合物的组合物(或这些化合物的库)，并加到孔中。培养与阳性对照(例如已知的FRIL家族成员的组成成分)结合的一定量的时间后，洗涤板并在各孔中加入可检测标记的亲和素。然后在标准微量滴定板读数器上对板进行读数，来测定候选化合物的组合物与与板结合的正常糖基化的FLT3受体的胞外结构域的结合，其中结合(如结合的可检测标记亲和素检测测定的)将组合物中的候选化合物鉴定为FRIL家族成员。

在第十一方面的一些实施例中，候选化合物是植物凝血素。在一些实施例中，植物凝血素是合成的。在一些实施例中，植物凝血素来自豆科植物。

在第十二个方面，本发明提供了一种基本纯的FRIL家族成员的组成成分，该组成成分是用使候选化合物与FLT3受体的糖基化胞外结构域接触，其中FLT3受体的胞外结构域的糖基化模式与正常糖基化的FLT3受体的胞外结构域的糖基化模式相同，其中与其中与FLT3受体的糖基化胞外结构域结合的候选化合物鉴定为FRIL家族成员的方法鉴定出来的。“FRIL家族成员”、“祖细胞”和“正常糖基化的FLT3受体”如本发明的第一个方面所述。

下面的实施例要进一步说明本发明的一些优选例，不是为了限制。本领域技术人员不用常规实验以外就将认识到，或能够确定许多本文所述的特定物质和方法的等价物。这些等价物被视为在本发明的范围内，并且由权利要求覆盖。

实施例1

FRIL家族成员，DI-FRIL的纯化和克隆

从扁豆中纯化Dl-FRIL

从Stokes Seeds(Buffalo，NY)购得扁豆(Dolichos lablab)的种子，在温室中生长。在咖啡磨中磨碎干燥种子，用5倍体积的含MgCl₂和CaCl₂各1mM的50mMTris/HCl中4℃提取粉末4小时。豆固体通过10,000xg离心20分钟沉淀。用乙酸将上清液的pH酸化到pH4.0，然后第二次离心澄清上清液，最后用氢氧化钠将pH重新调节到8.0。将该粗抽提物储藏在-20℃。

通过与甘露糖-Sepharose基质(Sigma)结合一步纯化FRIL家族成员。凝胶(即基质)与融化的粗抽提物4℃翻滚4-12小时，用分别含有1nMMgCl₂和CaCl₂的50mMTris/HCl小心洗涤数次，然后用20mMα-D-甘露糖苷洗涤。由于该FRIL家族成员是从扁豆分离的，在本文中被称为D1-FRIL。

Dl-FRIL的RNA分离和cDNA合成

根据Pawloski等，Mol.Plant.Biol.Manual 5：1-13，1994，从半成熟的扁豆制备总RNA。用PolyATract mRNA分离系统(Promega)根据厂商的说明书从该总RNA获得Poly(A⁺)RNA。用禽髓母细胞过多症病毒反相转录酶(Promega)从0.5微克poly(A⁺)RNA，或从3.0微克总RNA，用1微克oligo(dT)在标准反应条件下(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1989)产生cDNA。

聚合酶链式反应和Dl-FRIL的cDNA克隆

基于Gowda等，J.Biol.Chem.269：18789-18793，1994出版的氨基酸序列，用菜豆密码子用法(usage)(Devereux等，Nucleic Acids Res 12：387-394，1984)设计两条简并寡核苷酸引物：

MLA AA(AG)TT(TC)GA(TC)CC(AT)AA(TC)CA(AG)GA(AG)GA (SEQ ID NO：＿)

MLZ TT(AT)CC(AG)TT(TC)TGCCA(AG)TCCCA (SEQ ID NO：＿ )

从如上制备的cDNA中用30轮聚合酶链式反应(PCR)，各轮为94℃40秒，50℃40秒，72℃60秒，然后72℃延伸10分钟，扩增出500+bp的产物。在50微升含有30pmol各种引物、0.2mM脱氧核糖核酸和0.5单位在相应缓冲液中的AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer，Norwalk，CT)中进行反应。

在克隆载体pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中克隆PCR获得的500bp产物，并且通过测序酶双脱氧链终止法(United States Biochemicals)用下列引物测序：

GTACCGAGCTCGGAT (SEQ ID NO：＿)

TCTAGATGCATGCTCGAG (SEQ ID NO：＿)

该序列称为“Dl-FRILa”，与编码感兴趣的蛋白质的基因，上文称为“Dl-FRIL”的相关。

基于Dl-FRILa扩增的产物序列，制备了专一性引物：

MLX GTTGGACGTCAATTCCGATGTG(SEQ ID NO：＿)

还制备了对应于Gowda等，J.Biol.Chem.269：18789-18793，1994出版的序列开始5个氨基酸的简并引物：

MLI GC(TC)CA(AG)TC(TC)CT(TC)TC(TC)TT(SEQ ID NO：＿)

联合使用MLX和MLI引物，通过30轮PCR，使用上述相同的条件，从如上制备的cDNA中扩增出480bp产物。该二次扩增的片段克隆入pCR2.1载体，如上测序，称为“Dl-FRILb”。

用5’/3’RACEKIT(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)根据厂商的说明书通过聚合酶链式反应快速扩增cDNA末端(RACE-PCR)(见例如Frohman“RACE：快速扩增cDNA末端”，pp8-38于PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications.Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ和White TJ编，Academic Press，San Diego，1990)获得Dl-FRIL的3’末端。在3’RACE的cDNA合成中，用在该实施例中上文所述的标准条件，以32.5μM的浓度使用补充试剂盒的oligo(dT)锚定引物(“AP”)。

AP GACCACGCGTATCGATGTCGAC(SEQ ID NO：＿)

用AP锚定引物联合具有下列序列的专一性引物进行嵌套PCR扩增：

MLB AAGTTAGACAGTGCAGGAAAC (SEQ ID NO：＿)

扩增条件仍然是30轮94℃40秒，55℃40秒，72℃60秒，和72℃10分钟的延伸步骤。获得900+bp的产物，将其亚克隆入pCR2.1，如上测序，称为“Dl-FRILc”(SEQ ID NO：ID NO：1)

为了获得全长的cDNA克隆，联合对应于5’末端编码的开始5个氨基酸的专一性引物使用锚定引物AP：

MLII GCACAGTCATTGTCATTTAG (SEQ ID NO：＿)

用30轮PCR，各轮包括94℃60秒，58℃60秒，72℃90秒，加上72℃10分钟的延伸步骤获得全长cDNA。在100微升含有30pmol各种引物、0.2mM脱氧核糖核苷酸、1.0单位Pfu聚合酶(Stratagene，La Jolla，CA)进行反应。设计MLII和AP引物在多核苷酸序列的各末端(3’和5’)产生EcoRI位点。将全长cDNA连接入克隆载体pCR2.1的EcoRI位点，得到图1中示意性描述的终产物“pCR2.1-DLA”。

Dl-FRIL的核苷酸序列

用双脱氧链终止法对Dl-FRILc克隆进行完整测序。确定全长cDNA的核苷酸序列为：

1 GCACAGTCAT TGTCATTTAG TTTCACCAAG TTTGATCCTA ACCAAGAGGA

51 TCTTATCTTC CAAGGTCATG CCACTTCTAC AAACAATGTC TTACAAGTCA

101 CCAAGTTAGA CAGTGCAGGA AACCCTGTGA GTTCTAGTGC GGGAAGAGTG

151 TTATATTCTG CACCATTGCG CCTTTGGGAA GACTCTGCGG TATTGACAAG

201 CTTTGACACC ATTATCAACT TTGAAATCTC AACACCTTAC ACTTCTCGTA

251 TAGCTGATGG CTTGGCCTTC TTCATTGCAC CACCTGACTC TGTCATCAGT

301 TATCATGGTG GTTTTCTTGG ACTCTTTCCC AACGCAAACA CTCTCAACAA

351 CTCTTCCACC TCTGAAAACC AAACCACCAC TAAGGCTGCA TCAAGCAACG

401 TTGTTGCTGT TGAATTTGAC ACCTATCTTA ATCCCGATTA TGGTGATCCA

451 AACTACATAC ACATCGGAAT TGACGTCAAC TCTATTAGAT CCAAGGTAAC

501 TGCTAAGTGG GACTGGCAAA ATGGGAAAAT AGCCACTGCA CACATTAGCT

551 ATAACTCTGT CTCTAAAAGA CTATCTGTTA CTAGTTATTA TGCTGGGAGT

601 AAACCTGCGA CTCTCTCCTA TGATATTGAG TTACATACAG TGCTTCCTGA

651 ATGGGTCAGA GTAGGGTTAT CTGCTTCAAC TGGACAAGAT AAAGAAAGAA

701 ATACCGTTCA CTCATGGTCT TTCACTTCAA GCTTGTGGAC CAATGTGGCG

751 AAGAAGGAGA ATGAAAACAA GTATATTACA AGAGGCGTTC TGTGATGATA

801 TATGTGTATC AATGATTTTC TATGTTATAA GCATGTAATG TGCGATGAGT

851 CAATAATCAC AAGTACAGTG TAGTACTTGT ATGTTGTTTG TGTAAGAGTC

901 AGTTTGCTTT TAATAATAAC AAGTGCAGTT AGTACTTGT(SEQ ID NO：1)

Dl-FRIL核苷酸序列能影响Dl-FRIL蛋白质的下列衍生的氨基酸序列：

AQSLSFSFTK FDPNQEDLIF QGHATSTNNV LQVTKLDSAG NPVSSSAGRV

LYSAPLRLWE DSAVLTSFDT IINFEISTPY TSRIADGLAF FIAPPDSVIS

YHGGFLGLFP NANTLNNSST SENQTTTKAA SSNVVAVEFD TYLNPDYGDP

NYIHIGIDVN SIRSKVTAKW DWQNGKIATA HISYNSYSKR LSVTSYYAGS

KPATLSYDIE LHTVLPEWVR VGLSASTGQD KERNTVHSWS FTSSLWTNVA

KKENENKYIT RGVL (SEQ ID NO：2)

从扁豆分离的FRIL家族成员(即Dl-FRIL)的天然存在的信号序列具有下列序列：

MASSNLLTLA LFLVLLTHAN SA(SEQ ID NO：4)

该序列直接位于SEQ ID NO：2的第一个氨基酸的N-末端。天然存在的Dl-FRIL蛋白的核酸序列如下提供。

1 ATGGCTTCCT CCAACTTACT CACCCTAGCC CTCTTCCTTG TGCTTCTCAC

51 CCACGCAAAC TCAGCCGCAC AGTCATTGTC ATTTAGTTTC ACCAAGTTTG

101 ATCCTAACCA AGAGGATCTT ATCTTCCAAG GTCATGCCAC TTCTACAAAC

151 AATGTCTTAC AAGTCACCAA GTTAGACAGT GCAGGAAACC CTGTGAGTTC

201 TAGTGCGGGA AGAGTGTTAT ATTCTGCACC ATTGCGCCTT TGGGAAGACT

251 CTGCGGTATT GACAAGCTTT GACACCATTA TCAACTTTGA AATCTCAACA

301 CCTTACACTT CTCGTATAGC TGATGGCTTG GCCTTCTTCA TTGCACCACC

351 TGACTCTGTC ATCAGTTATC ATGGTGGTTT TCTTGGACTC TTTCCCAACG

401 CAAACACTCT CAACAACTCT TCCACCTCTG AAAACCAAAC CACCACTAAG

451 GCTGCATCAA GCAACGTTGT TGCTGTTGAA TTTGACACCT ATCTTAATCC

501 CGATTATGGT GATCCAAACT ACATACACAT CGGAATTGAC GTCAACTCTA

551 TTAGATCCAA GGTAACTGCT AAGTGGGACT GGCAAAATGG GAAAATAGCC

601 ACTGCACACA TTAGCTATAA CTCTGTCTCT AAAAGACTAT CTGTTACTAG

651 TTATTATGCT GGGAGTAAAC CTGCGACTCT CTCCTATGAT ATTGAGTTAC

701 ATACAGTGCT TCCTGAATGG GTCAGAGTAG GGTTATCTGC TTCAACTGGA

751 CAAGATAAAG AAAGAAATAC CGTTCACTCA TGGTCTTTCA CTTCAAGCTT

801 GTGGACCAAT GTGGCGAAGA AGGAGAATGA AAACAAGTAT ATTACAAGAG

851 GCGTTCTGTG ATGATATATG TGTATCAATG ATTTTCTATG TTATAAGCAT

901 GTAATGTGCG ATGAGTCAAT AATCACAAGT ACAGTGTAGT ACTTGTATGT

951 TGTTTGTGTA AGAGTCAGTT TGCTTTTAAT AATAACAAGT GCAGTTAGTA1001 CTTGT(SEQ ID NO：3)

图2显示了Gowda等(J.Biol.Chem.269：18789-18793，1994)确定的衍生的Dl-FRIL氨基酸序列和报道的甘露糖植物凝血素氨基酸序列的比较说明。对于Dl-FRIL蛋白质衍生的一条序列含有与Gowda等，见上所述的蛋白质的α亚基(SEQID NO：ID NO：12)和β亚基(SEQ ID NO：ID NO：11)直接对应和基本同源的结构域。当Gowda等(见上)蛋白质的β亚基与N-末端结构域对齐，然后α亚基线性跟随时，多肽的排列显示与其它豆科植物凝血素的同源性。然而衍生的Dl-FRIL氨基酸序列含有额外的7个氨基酸残基(aa27-34)，它们不存在于Gowda等，见上描述的氨基酸序列中。Dl-FRIL的氨基酸序列与Gowda等，见上描述的氨基酸序列之间的几个其它差异也能从图2清楚的辨别。

位点专一性诱变

为了建立Dl-FRIL cDNA编码的蛋白质的同源物的功能性，在Dl-FRIL cDNA克隆中进行突变。含有突变位点的衍生的蛋白质和豌豆植物凝血素的结构域如下所示：

Dl-FRIL . Y L N P D Y G . D P N Y I H I G I D V(SEQ ID NO：＿)

豌豆 F Y . N A A W D P S N R D R H I G I D V(SEQ ID NO：＿)

已知豌豆植物凝血素中的天冬酰胺残基(标出的“N”)与糖配体的结合有关。Dl-FRIL中对应的天冬酰胺(SEQ ID NO：2的氨基酸序列中的141位)突变成天冬氨酸(″D″)。为了方便，该突变称为“N141D”。

为了引入突变，进行重组PCR(见例如Higuchi，R.，PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications，Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ和White TJ编，Academic Press，San Diego，1990)。用含有相同突变的两个引物在全长cDNA上分别进行两次PCR反应，产生具有重叠区域的两种产物：

MutI CCATAATCGGGATCAAGATAGGTG (SEQ ID NO：＿)

MutII CACCTATCTTGATCCCGATTATGG (SEQ ID NO：＿)

用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Valencia，CA)根据厂商说明书纯化最初的PCR产物。然后合并重叠的原始产物，在二次反应中用旁侧引物一起扩增：

M1 Forw AACTCAGCCGCACAGTCATTGTCA (SEQ ID NO：＿)

APEcoRI GAATTCGACCACGCGTATCGATGTCGAC(SEQ ID NO：＿)

在100微升含有50pmol各种引物，0.4mM脱氧核糖核苷酸和1.0单位Pfu聚合酶(Stratagene)的相应缓冲液中进行初次和二次PCR反应。初次PCR反应在30轮，各轮包括94℃40秒，50℃40秒，72℃60秒，加上10分钟的72℃延伸步骤，扩增出两条不同的片段。二次PCR反应在12轮中用上述相同条件扩增出重组片段。

得到的全长片段含有突变。将重组的突变产物克隆如克隆载体pCR2.1的EcoRI位点，如图3示意性描述，并如上测序。该质粒称为“pCR2.1-DLA(D)”。

表达Dl-FRIL的植物表达载体的构建和烟草(Nicotiana tabacum)的转化

用重组PCR修饰野生型和突变型DL-FRIL克隆的5’末端，以使蛋白质浸入内质网。根据Higuchi，见上的方法，在两次独立的初次PCR反应中扩增编码信号肽和全长cDNA克隆的序列。从携带完整α-淀粉酶抑制蛋白基因(Hoffman等，Nucleic Acids Res 10：7819-7828，1982；Moreno等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：7885-7889，1989)的二元载体pTA4扩增获得信号肽序列。

用下列引物扩增信号肽序列：

Sigforw GAATTCATGGCTTCCTCCAAC(SEQ ID NO：＿)

Sigrev TGACTGTGCGGCTGAGTTTGCGTGGGTG(SEQ ID NO：＿)

用扩增上述Dl-FRIL cDNA的引物M1Forw(SEQ ID NO：＿)和APEcoRI(SEQ ID NO：＿)再次用于扩增Dl-FRIL cDNA。

二次反应的引物是Sigforw和AP EcoRI，它们设计成在5’和3’末端产生EcoRI位点。如上所述进行初次和二次PCR反应用于定点诱变。

将野生型重组产物SpDLA克隆到pBluescript SK+克隆载体(Stratagene)的EcoRI位点，得到载体PBS-SpDLA，如图4所示。将突变SpDLA(D)克隆到克隆载体pCR2.1的相同位点，得到载体pCR2.1-SpM1，如图5所示。各PCR产物的核酸序列如上所述确定，来证实信号肽的正确结合。SEQ ID NO：22确定了SpDLA的核苷酸序列，SEQ ID NO：23确定了衍生的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23的序列如下：

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22atggcttcct ccaacttact caccctagcc ctcttccttg tgcttctcac ccacgcaaac 60tcagccgcac agtcattgtc atttagtttc accaagtttg atcctaacca agaggatctt 120atcttccaag gtcatgccac ttctacaaac aatgtcttac aagtcaccaa gttagacagt 180gcaggaaacc ctgtgagttc tagtgcggga agagtgttat attctgcacc attgcgcctt 240tgggaagact ctgcggtatt gacaagcttt gacaccatta tcaactttga aatctcaaca 300ccttacactt ctcgtatagc tgatggcttg gccttcttca ttgcaccacc tgactctgtc 360atcagttatc atggtggttt tcttggactc tttcccaacg caaacactct caacaactct 420tccacctctg aaaaccaaac caccactaag gctgcatcaa gcaacgttgt tgctgttgaa 480tttgacacct atcttaatcc cgattatggt gatccaaact acatacacat cggaattgac 540gtcaactcta ttagatccaa ggtaactgct aagtgggact ggcaaaatgg gaaaatagcc 600actgcacaca ttagctataa ctctgtctct aaaagactat ctgttactag ttattatgct 660gggagtaaac ctgcgactct ctcctatgat attgagttac atacagtgct tcctgaatgg 720gtcagagtag ggttatctgc ttcaactgga caagataaag aaagaaatac cgttcactca 780tggtctttca cttcaagctt gtggaccaat gtggcgaaga aggagaatga aaacaagtat 840attacaagag gcgttctgtg atgatatatg tgtatcaatg attttctatg ttataagcat 900gtaatgtgcg atgagtcaat aatcacaagt acagtgtagt acttgtatgt tgtttgtgta 960agagtcagtt tgcttttaat aataacaagt gcagttagta cttgt 1005

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23Met Ala Ser Ser Asn Leu Leu Thr Leu Ala Leu Phe Leu Val Leu Leu1 5 10 15Thr His Ala Asn Ser Ala Ala Gln Ser Leu Ser Phe Ser Phe Thr Lys

20 25 30Phe Asp Pro Asn Gln Glu Asp Leu Ile Phe Gln Gly His Ala Thr Ser

35 40 45Thr Asn Asn Val Leu Gln Val Thr Lys Leu Asp Ser Ala Gly Asn Pro

50 55 60Val Ser Ser Ser Ala Gly Arg Val Leu Tyr Ser Ala Pro Leu Arg Leu65 70 75 80Trp Glu Asp Ser Ala Val Leu Thr Ser Phe Asp Thr Ile Ile Asn Phe

85 90 95Glu Ile Ser Thr Pro Tyr Thr Ser Arg Ile Ala Asp Gly Leu Ala Phe

100 105 110Phe Ile Ala Pro Pro Asp Ser Val Ile Ser Tyr His Gly Gly Phe Leu

115 120 125Gly Leu Phe Pro Asn Ala Asn Thr Leu Asn Asn Ser Ser Thr Ser Glu

130 135 140Asn Gln Thr Thr Thr Lys Ala Ala Ser Ser Asn Val Val Ala Val Glu145 150 155 160Phe Asp Thr Tyr Leu Asn Pro Asp Tyr Gly Asp Pro Asn Tyr Ile His

165 170 175Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile Arg Ser Lys Val Thr Ala Lys Trp

180 185 190Asp Trp Gln Asn Gly Lys Ile Ala Thr Ala His Ile Ser Tyr Asn Ser

195 200 205Val Ser Lys Arg Leu Ser Val Thr Ser Tyr Tyr Ala Gly Ser Lys Pro

210 215 220Ala Thr Leu Ser Tyr Asp Ile Glu Leu His Thr Val Leu Pro Glu Trp225 230 235 240Val Arg Val Gly Leu Ser Ala Ser Thr Gly Gln Asp Lys Glu Arg Asn

245 250 255Thr Val His Ser Trp Ser Phe Thr Ser Ser Leu Trp Thr Asn Val Ala

260 265 270Lys Lys Glu Asn Glu Asn Lys Tyr Ile Thr Arg Gly Val Leu

275 280 285

编码重组Dl-FRIL的植物表达载体

构建二元载体用于Dl-FRIL的种子特异性表达。对于种子表达，将从pCW66(Higgins等，Plant.Mol.Biol.11：683-695，1988)获得的豌豆球蛋白启动子克隆入植物表达载体pBIN19的EcoRI/KpnI位点，形成pBINVicPro，如图6所示。在豌豆球蛋白启动子下游，将SpDLA cDNA序列连接入EcoRI/SacI位点，产生pBINVicPro-SpDLA，如图7所述。突变的cDNA克隆SpDLA(D)连接入pBINVicPro载体的EcoRI位点，得到pBINVicPro-SpDLA(D)，如图8所述。不加入其它终止序列，依靠DLA和DLA(D)cDNA克隆的终止密码子和聚腺苷酸位点。将两种载体根据An等，“二元载体”于Plant Molecular Biology Manual，A3卷，Gelvin SB，Schilperoort RA和Verma DPS编，Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，TheNetherlands，偏僻-19，1988报道的冻融法转移入根癌土壤杆菌菌株LBA4404。

用携带种子特异性表达载体pBINVicPro-SpDLA的LBA4404如所述进行并测定(Horsch等，Science 227：1229-1231，1985)土壤杆菌介导的烟草叶培养皿的转化。对卡那霉素抗性植物(抗性是由于携带该基因的基于pBIN19的载体转化赋予的)评价其在含有3％蔗糖和100mg/ml的硫酸卡那霉素(sigmaSt.Louis，MC)Murashige-Skoog培养基中的两个连续增殖步骤中形成根的能力。

在体内转化的植物细胞切割重组Dl-FRIL融合蛋白。因此，转化的植物细胞产生成熟的Dl-FRIL，当纯化时，其具有60kDa的分子量，并含有4个亚基，两个α亚基和两个β亚基(即α₂β₂异二聚体)，其中各亚基约15-18kDa。

重组Dl-FRIL在大肠杆菌中的表达

将Dl-FRIL野生型cDNA和突变克隆(没有信号序列)连接入表达载体pGEX4T-1(Pharmacia Biotech，Uppsala Sweden)的EcoRI/SalI和EcoRI/XhoI，形成表达构建物pGEX-M1和pGEX M1(D)，分别在图9和10中有说明。宿主大肠杆菌菌株BL21(D3)购自Novagen(Madison，WI)，用上述构建物用氯化钙法转化(见Sambrook等，见上；Gelvin和Schilperoort，Plant Molecular Biology Manual，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，the Netherlands，1988；Altabella等，Plant Physiol 93：805-810，1990；和Pueyo等，Planta 196：586-596，1995)。当细胞在600nm处光密度达到0.4-0.6时，以1.0mM的最终浓度加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(Sigma)，实现tac启动子(Ptac)的诱导。使培养物在加入IPTG后在37℃生长12小时。对照非诱导的培养物维持在相似的条件下。用4mg/ml溶菌酶在含有1％TRITON^_X-100的磷酸缓冲盐中裂解细胞。

从转化的大肠杆菌细胞抽提总细胞蛋白质并在SDS-PAGE中在15％凝胶上用标准方法(Sambrook，见上)分析。将来自1毫升大肠杆菌的细胞悬浮在相同体积的上样缓冲液(50mM Tris HCl，pH6.8，100mM DTT、2％SDS、10％甘油、0.1％溴酚蓝)中并旋转。转移到硝基纤维素膜上后，用考马斯亮蓝R250染色蛋白质。图11显示了代表性的分离，泳道在下文表1中表明。

表 1

图11的要点

泳道号	内容
泳道号	内容	1	分子量标记(Bio-Rad)
2	未诱导的BL21(D3)pGEX-M1的总蛋白提取物	1	分子量标记(Bio-Rad)
2	未诱导的BL21(D3)pGEX-M1的总蛋白提取物	3	诱导的BL21(D3)pGEX-M1的总蛋白提取物
4	未诱导的BL21(D3)pGEX-M1(D)的总蛋白提取物	3	诱导的BL21(D3)pGEX-M1的总蛋白提取物
4	未诱导的BL21(D3)pGEX-M1(D)的总蛋白提取物	5	诱导的BL21(D3)pGEX-M1(D)的总蛋白提取物

图11中蛋白质的分离显示诱导的细胞(泳道3，5)都产生大量具有约60kDa的多肽(用箭头标出)。未诱导的细胞不能产生任何显著量的该蛋白(图11，泳道2，4)。

从转化的大肠杆菌中纯化重组的Dl-FRIL

37℃诱导12小时后，通过5000g离心10分钟收集如上所述诱导过的大肠杆菌细胞(200毫升)。用50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA洗涤沉淀，悬浮在1/10体积的1％Triton表面活性剂的TBS(20mM Tris pH7.5，500mM NaCl)溶液中。加入4mg/ml溶菌酶，并在室温下孵育30-60分钟裂解细胞。5000g离心后，丢弃含有全部可溶性蛋白的上清液，用8M盐酸胍提取其中含有包流体并含有积聚的重组融合蛋白质的所得到的沉淀(Martson和Hartley，“蛋白质聚集物的溶解”于Guideto Protein Purification，卷182，Deutscher，M.P.编，pp266-267，1993)。

用盐酸胍溶解的重组融合蛋白质在GST-Sepharose珠(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)根据厂商说明书纯化，并在1毫升还原的谷胱甘肽(Sigma)中洗涤。用凝血酶(Novagen)以5个切割单位/ml纯化的融合蛋白质切割纯化的融合蛋白的样品。

对于免疫印迹分析(Western blot)，用SDS-PAGE根据上述方法分离纯化的蛋白质。凝胶在转移缓冲液(25mM Tris，pH8.3，192mM甘氨酸，20％MeOH)中平衡，并以100V用Bio-Rad电转移装置转印到硝基纤维素(Bio-Rad，Hercules，CA)上1小时。在含有3％明胶的1XTBS(20mM Tris，pH7.5，500mM NaCl)中孵育印迹至少1小时，封闭非特异性结合。然后印迹与一抗(多克隆家兔血清，针对菜豆FRIL(即Pv-FRIL)的β亚基N-末端肽产生，1∶100稀释，3小时，如下在实施例5中所述)一起孵育，再与二抗(山羊抗兔IgG，与辣根过氧化物酶以1∶1000的稀释度偶联1小时)一起孵育。洗涤印迹，用显色试剂(Bio-Rad)显色。代表性结果如图12所示，泳道在下文表2中鉴定出。

表 2

图12的要点

泳道1	内容
泳道1	内容	1	纯化的融合蛋白M1
2	纯化的融合蛋白M1(D)	1	纯化的融合蛋白M1
2	纯化的融合蛋白M1(D)	3	对照
4	用凝血酶切割后的纯化的融合蛋白M1	3	对照
4	用凝血酶切割后的纯化的融合蛋白M1	5	用凝血酶切割后的纯化的融合蛋白M1(D)
6	对照	5	用凝血酶切割后的纯化的融合蛋白M1(D)

图12中所示的分离显示两种形式的融合蛋白具有相似的约60kDa的分子量，凝血酶切开两种类型的融合蛋白，产生新的分子量30kDa的多肽。

实施例2

重组Dl-FRIL特别刺激表达FLT3受体的3T3细胞

Dl-FRIL与哺乳动物FLK2/FLT3酪氨酸激酶受体相互作用。可用一种专一和定量的生物学试验评价纯化过程中的植物凝血素生物活性，该试验使用用嵌合受体或全长的人受体(Small等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：459-463，1994)转染NIH 3T3成纤维细胞，该嵌合受体具有小鼠FLT3受体的胞外部分联合人Fms受体(Dosil等，Mol.Cell.Biol.13(10)：6572-6585，1993)的胞内部分。96孔板上系列2倍稀释的植物凝血素样品横列使得获得FLT3 3T3生物活性的范围扩大了1000倍。发现小鼠或人FLT3配体(FL)(Lyman等，Cell 75：1157-1167，1993；Hannum等，Nature 368：643-648，1994)或FRIL在该试验中能拯救转染了FLT3的细胞不死亡。

特别是，从板中除去在组织培养板(Beckon Dickinson Labware，LincolnPark，NJ)培养的3T3细胞，用Hank缓冲盐溶液(HBSS，Gibco laboratories，GrandIsland，NY)洗涤细胞两次。在室温下用15分钟加入非酶性细胞分解缓冲液(Gibco)。得到的细胞用培养液洗涤。FLT3 3T3细胞以最终浓度为3,000细胞/孔，在体积为100微升的血清限制培养液(含有10mg/ml rhIL1-α、10％AIMV(Gibco，Grand Island，NY)和90％Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM；Gibco))中培养。在这些试验条件下，细胞在37℃，5％CO₂的湿润温箱中2-4天后死亡，除非外源加入配体拯救细胞免受死亡。各96孔平板含有细胞孔，其中含有胎牛血清，刺激所有的3T3细胞，作为阳性对照，仅含培养基的细胞作为阴性对照(″空白″)。全长的Fms-转染的3T3细胞(生物学反应如Tessler等，J.Biol.Chem.269：12456-12461，1994中所示)作为受体-转染的对照靶细胞，亲本3T3细胞作为未转染的对照细胞。加入XTT(2，3-二[甲氧基-4-硝基-5-硫代苯基]-2H-四唑-5-甲酰替苯胺内盐)(Diagnostic Chemicals Ltd，Charlottetown，Prince EdwardIsland，Canada)，它是活性呼吸的细胞(Roehm等，J.Immunol.Methods142：257-265，1991)切割的四甲_盐，定量测定增殖和细胞存活。用Vmax动态平板读数器(Molecular Devices corp.，Mountain View，CA)分光光度定量增殖和细胞存活，并记录为相对活力(单位/毫升)或比活力(单位/毫克)。一个单位的生物学活性定义为检测到细胞的半最大刺激的稀释度的倒数。

测试上文实施例1中描述的大肠杆菌培养物中提取的粗蛋白质，来测定用该测定法表达的重组的Dl-FRIL拥有任何活性。该实验总结在图13A和13B中。特别是13A是一张图，显示含有表达的Dl-FRIL的大肠杆菌培养物的粗提取物专一性刺激hFLT3细胞；图13B是一张图，显示相同的提取物不刺激未转染的3T3细胞。在图13A和13B中，培养基对照用实线表示。纵坐标(吸光度)表示用XTT在三天测定的细胞存活率；横坐标显示提取样品的倒数稀释。不理解在更高浓度观察到明显的增殖抑制(图13)，但可能与粗大肠杆菌提取物中的有毒成分，或剂量依赖性的3T3成纤维细胞的保护有关。

实施例3

重组Dl-FRIL保护液体培养中的单核细胞和祖细胞

重组Dl-FRIL蛋白质保护液体培养物中的功能性祖细胞至少4周。图14A和14B，以及表3说明了实验结果，其中重组Dl-FRIL显示以剂量依赖方式保护人脐带血祖细胞。

为了实现该目的，从健康的捐献者以100单位/毫升的肝素中收集脐带血。在4个小时内用FICOLL-PAQUE^_分离(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)根据厂商指示分离脐带血单核细胞(CBmnc)，在X-VIVO 10培养液(BioWhittaker，Walkersville，MD)中洗涤。然后CB mnc在6孔组织培养板(Corning Inc.，Corning，NY)中以浓度200,000细胞/毫升，4毫升的X-VIVO 10(即800,000个细胞/孔)体积培养CB mnc。以40ng/ml的浓度在开始(不作为对照加入)加入Dl-FRIL和/或重组大肠杆菌Flt3-L(recFL；BioSource International，Camarillo，CA)。在湿室中不更换培养液培养29天。

培养后，通过在X-VIVO 10中洗涤收集培养过的CB mnc细胞(即收集的细胞沉淀并重新悬浮在X-VIVO 10中)来除去Dl-FRIL和/或recFL，然后用台盼蓝(Sigma)排除法测定存活细胞数。这些结果如图14A所示。将洗涤的细胞一式三份铺在无胎牛血清的含IL-2、粒细胞-巨噬细胞CSF和kit配体(StemCell Technologies，Vancouver，BC，Canada)的甲基纤维素集落试验培养基平板上，评估收集的细胞的祖细胞数目和能力。2周后，评分一式三份孔中各孔得到的集落数，结果如图14B所示。因此图14A和14B显示了重组Dl-FRIL在液态培养物中以剂量依赖方式保护脐带血单核细胞和祖细胞。

表3显示15、21或29天培养后得到的集落，显示Dl-FRIL，而不是recFL保护悬浮培养物中的祖细胞。

表 3

天	培养基	髓样^*	红细胞样^*	混合物^*	未成熟细胞^*
天	培养基	髓样^*	红细胞样^*	混合物^*	未成熟细胞^*	15	Dl-FRIL	1,033±12	67±12	7±12	0
	recFL	40±69	0	0	0	15	Dl-FRIL	1,033±12	67±12	7±12	0
	recFL	40±69	0	0	0		Dl-FRIL+recFL	933±250	167±95	0	0
	无添加	0	0	0	0		Dl-FRIL+recFL	933±250	167±95	0	0
	无添加	0	0	0	0	21	Dl-FRIL	387±83	7±12	0	167±64
	recFL	0	0	0	0	21	Dl-FRIL	387±83	7±12	0	167±64
	recFL	0	0	0	0		Dl-FRIL+recFL	473±133	53±42	0	300±34
	无添加	0	0	0	0		Dl-FRIL+recFL	473±133	53±42	0	300±34
	无添加	0	0	0	0	29	Dl-FRIL	0	0	0	80±72
	recFL	0	0	0	0	29	Dl-FRIL	0	0	0	80±72
	recFL	0	0	0	0		Dl-FRIL+recFL	0	0	0	40±20

无添加

0

^*数据报道成一式三份的甲基纤维素集落试验的三个值的±SD。

报道的实验是4个实验的代表。

在图14A和14B以及表3中，“未成熟细胞”指包括原始、形态未分化的细胞的集落；“混合物”指含有髓样和红细胞样细胞的集落；“红细胞样”指含有红细胞样细胞的集落；“髓样”指髓样细胞组成的集落。在图14A和14B中，细胞数(图14A)或集落数(图14B)如纵坐标所示；横坐标显示样品稀释度的倒数。

如表3所示，衍生自成熟髓样和红细胞样祖细胞的集落是从在FRIL或FRIL+recFL15天内培养的细胞形成的；单独在recFL中培养的细胞形成的成熟集落少24倍；如果都不存在，不存在集落。在培养21天后，表3显示仅从接触Dl-FRIL的细胞形成髓样和红细胞样集落。仅Dl-FRIL的培养物中髓样集落的频率(基于CBmnc的原始数目)从培养2周后的1/774降低了2.7倍，到3周后的1/2,067；红细胞样集落的频率从1/11,940降低了9.6倍，到1/114,287(见表3)。

在各时间点对该试验的集落拍照。如图15A所示，除了髓样和红细胞样集落，21天的培养物含有由未分化细胞构成的小集落。图15B显示当细胞在Dl-FRIL中培养29天时，仅观察到未成熟细胞样集落(另见表3)。

对于最初在Dl-FRIL、recFL、无添加或Dl-FRIL+recFL中培养3周，然后不加这些调节剂在甲基纤维素菌落试验中培养6周后的细胞，再次检测未成熟细胞样集落的祖细胞的能力。从在recFL单独或培养基对照中培养21天的细胞中未检测到任何集落。从最初用Dl-FRIL单独培养的细胞中收集到存活的细胞，并在集落试验(在甲基纤维素集落试验培养基)中替换，用于另4周。图16显示了该实验的示意图。如图16示意性说明的，单独在Dl-FRIL中培养的未成熟细胞样集落的频率从21-29天下降了2.1倍，从1/4,790-1/10,000，在Dl-FRIL+recFL培养物中下降了7.5倍，从1/2,667-1/20,000最初的CB mnc细胞培养液。根据图16示意性图解的方法，对于Dl-FRIL中培养的细胞检测到频率为1/67(900个集落/600,000 CB mnc)的小的弥散未成熟样细胞集落，对于在Dl-FRIL+recFL中培养的细胞频率是1/132(990个集落/131,000CB mnc)(见例如图17的集落)。

实施例4

重组Dl-FRIL对祖细胞直接起作用。

为了评估重组Dl-FRIL直接还是间接通过辅助细胞对祖细胞起作用，首先通过免疫磁珠分离，富集脐带血单核细胞，用作表达CD34抗原的祖细胞(Dynal Corp.，Lake Success，NY)。将500个CD34⁺细胞在含recFL(PeproTech，Princeton，NJ)或重组人白细胞介素3(rhIL3)+重组人白细胞介素6(rhIL6)+重组人白细胞介素11(rhIL11)+rhTpo血小板蛋白+FL(FLT3-配体)(BioSource International，Camarillo，CA)的细胞因子鸡尾酒的情况下，置于96孔板含100微升无血清培养基(BIT9500，StemCell Technologies，Vancouver，BC，Canada)的孔中，培养4周，不替换培养基。将细胞铺在无血清甲基纤维素集落试验培养基(StemCellTechnologies)中，评估这些培养物中功能性祖细胞的数目。2周后，评分得到的集落，结果如图18所示(实心条＝重组DI-FRIL；空心条＝细胞因子鸡尾酒)。明显祖细胞仅在含重组Dl-FRIL的培养物中受到保护(图18)。因此纯化的重组Dl-FRIL直接对原始造血祖细胞起作用。

实施例5

在PHA-LCM培养基中鉴定和克隆Pv-FRIL，第二种FRIL家族成员的FRIL活性

用含小鼠和人Flt3和相关Fms受体的cDNA的表达载体转染的NIH 3T3细胞开发出用于搜索新Flt3受体刺激剂的生物学筛选试验。mFlt3/Fms 3T3细胞系是用编码融合了人Fms(Dr.Ihor lemischka，Princeton university，Princeton，NJ提供)跨膜和胞内域的小鼠Flt3受体胞外域构成的融合蛋白的核酸转染的。Stk 3T3细胞系是一种被全长人Flt3受体(Dr.Donald Small，Johns Hopkins University，Baltimore，MD提供)转染的3T3细胞系。人FMS 3T3细胞系是一种被全长人Fms受体(Dr.Charles Sherr，Saint Jude Children’s Research Hospital，Memphis，TN提供)转染的细胞系。亲本3T3细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)。转染有受体的细胞含有Neo抗性基因，维持在含有750g/mlG418(Life Technologies，Rockville，MD)的培养基中。

为了建立转染了受体的3T3细胞的因子依赖性，生长条件妥协到仅配体拯救细胞免受死亡。为了该目的，在含有3,000个细胞的100微升无血清培养液(由10％AIMV(Life Technologies)和90％DMEM组成)的96孔板(Becton DickinsonLabware，Lincoln Park，NJ)中进行试验。在各实验中，样品横向从1∶10稀释度开始系列稀释2倍。在3-5天后用XTT(2，3-二[甲氧基-4-硝基-5-硫代苯基]-2H-四唑-5-甲酰替苯胺内盐)(Sigma，St.Louis，MO)定量存活的细胞(Roehm等，见上)。相对活力(单位/毫升)或比活力(单位/毫克)定义为检测到细胞的半最大刺激的稀释度的倒数。

FMS 3T3细胞(被编码人Fms酪蛋白激酶受体的cDNA转染)及其配体人M-CSF作为模式系统。系列稀释重组人M-CSF储液(其中第一次稀释1∶20是50ng/ml)，用于刺激Fms3T3细胞。如图19a所示，Fms 3T3细胞以剂量应答方式响应M-CSF。mFlt3/Fms 3T3细胞和亲本未转染的3T3细胞都不响应M-CSF(图19A)。

筛选各种条件培养基来源中Flt3 3T3刺激活性的存在。最强大的来源是从人外周血细胞收集的条件培养基，该细胞被衍生自不纯的红菜豆提取物的有丝分裂性豆科植物凝血素，植物血球凝血素(PHA)激活，分泌高水平和广泛的细胞因子。该来源通常被称为PHA白细胞-条件培养基(PHA-LCM)，在20年来被用作造血集落试验中的标准阳性对照(Sharon和Lis，Science 246：227，1989)。为了产生PHA-LCM，从North American Biologicals Inc.，Miami，FL购得来自正常捐献者的白细胞分离置换的血液。用FICOLL-PAQUE^_分离单核细胞，在AIMV中洗涤，以浓度为2×10⁶细胞/毫升在含有1％体积的含Life Technologies(目录号10576-015)的PHA粗红菜豆提取物的AIMV中，在T150烧瓶(Beckon Dickinson Labware，LincolnPark，NJ)或摇瓶(Beckon Dickinson Labware)中培养1周。离心除去细胞和碎片，并在-20℃储藏条件培养基。

PHA-LCM诱导mFlt3/Fms 3T3细胞和Stk 3T3(表达人Flt3受体)以不可分辨的方式在约200单位/毫升处增殖(图19B)。未转染的3T3细胞不响应PHA-LCM(图19B)，对Fms 3T3细胞的响应很弱(数据未显示)。

从PHA刺激的白细胞条件培养基中纯化Pv-FRIL。

在无血清培养基中用来自各正常捐献者的细胞产生各批PHA-LCM。为了开始纯化，将具有Flt3 3T3活性的PHA-LCM合并成30升/批，具有约10⁷Flt3 3T3单位。将25升PHA-LCM透析入50mM Tris-HCl，pH7.6，50mM NaCl，然后在10kDa分子量截留膜(Pellicon，Millipore，Bedford，MA)上通过切向流超滤浓缩成2-2.5升。用50mM Tris-HCl，pH7.4，50mm NaCl平衡蓝色Sepharose FF(PharmaciaBiotech)柱(10厘米×15厘米)。为了除去人血清清蛋白，将浓缩的PHA-LCM用泵以25ml/min加到柱上，收集流穿液。对Blue-sepharose的流穿片段进行阴离子交换层析，将其加到用10mM Tris-HCl，pH7.6平衡Q-sepharose FF(PharmaciaBiotech)柱(5cm×5cm)上。用平衡缓冲液洗涤柱，然后以12ml/min用0-0.7M NaCl的10mM Tris连续梯度洗脱。收集组分(6ml/组分)，在96孔板中对各组分中的等份测试Flt3 3T3活性(即刺激mFlt3/Fms 3T3细胞和/或Stk 3T3细胞的活性)。

证实一个组分含有Flt3 T3活性后，用20mM磷酸盐，pH7，1.5M NH₄SO₄平衡苯基琼脂糖HP(Pharmacia Biotech)柱(1.6cm×10cm)。将来自Q-琼脂糖的合并的样品调节到1.5M NH₄SO₄，加到苯基-琼脂糖柱上。用平衡缓冲液洗涤柱，用1ml/min的速度，1.5-0.1M NH₄SO₄的20mM磷酸盐，pH7洗脱。收集组分(1毫升)，测试Flt3 3T3活性。合并具有Flt3 3T3活性的组分，针对50mM Tris-HCl，pH7.2，100mM NaCl透析，真空离心浓缩。

用50mM trisHCl，pH7.4，100mM NaCl平衡Superdex75(Pharmacia Biotech)柱(1.6cm×60cm)。将来自苯基-琼脂糖的合并的样品加到Superdex 75柱上，以0.6ml/min洗脱。收集组分(1.8ml)，测试Flt3 3T3活性。针对Tris-HCl，pH7.2透析活性组分，真空离心浓缩。

用0.1％三氟乙酸(TFA)在HPLC级H₂O中平衡C4反相柱(4.6cm×100mm，Vydac，Hesperia，CA)。将来自Superdex 75层析的合并和浓缩的样品加到C4柱上，以10-55％乙腈，0.1％TFA以0.5ml/min经70分钟洗脱。收集0.5毫升的组分，真空离心蒸发。

用从R&D Systems(Minneapol is，MN)购得的试剂盒进行ELISA分析Pv-FRIL纯化过程中的细胞因子(IL1-α、IL1-β、IL2、IL3、IL4、IL6、GM-CSF、G-CSF和SCF)。

Rv-FRIL特异性家兔抗血清

在Pv-FRIL纯化过程中，用粗PHA-LCM(用含Flt3 3T3活性的逐渐纯化的样品)免疫New Zealand White Rabbit(HRP，Denver，PA)，最后用对应Pv-FRIL的肽(AQSLSF[N，C，S]FTKFDLD)，称为AQS-肽免疫。样品是与匙孔_血蓝蛋白(KLH，Sigma)偶联的戊二醛。用完全弗氏佐剂(Sigma)或Hunter’sTitermax(Vaxcel，Inc.，Norcross，GA)和含KLH-AQS肽的样品免疫家兔。在ELISA中抗血清显示对AQS肽的1∶5,000滴度(数据未显示)。由于抗血清含有对其它蛋白质的反应性，通过耗竭交叉反应性抗体，或用与琼脂糖载体(AminoLink偶联凝胶，Pierce)共价偶联的AQS肽实现AQS肽特异性抗体的富集。

通过从高滴度家兔抗血清用蛋白质A亲和层析(ImmunoPure Kit，Pierce)纯化IgG，或从AQS肽柱分离的抗体，然后将抗体与活化的琼脂糖载体(AminoLink偶联凝胶，Pierce)共价连接，制备抗AQS亲和柱。

纯化的Pv-FRIL的活性

为了将Pv-FRIL对转染了受体的3T3细胞的活性的观察结果与表达Flt3受体的造血祖细胞比较，将通过CD34免疫磁珠选择，富集Flt3⁺祖细胞的人脐带血细胞悬浮培养液制备成96孔板形式。为此，在100单位/毫升肝素(FujisawaHealthcare，Deerfield，IL)中收集来自健康供体的脐带血。用FICOLL-PAQUE^_(Pharmacia Biotech，Pitscataway，NJ)分离单核细胞，用HBSS洗涤，重新悬浮在血清确定的培养基，AIMV或XVIVO-10(bioWhittaker，Walkersville，MD)中。通过CD34免疫磁珠选择(Dynal Corporation，Lake Success，NY)富集单核细胞中的Flt3⁺祖细胞。在6孔板(Becton Dickinson Labware)中培养CD34⁺细胞，浓度为1毫升含10ng/ml重组人IL-3(BioSource International，Camarillo，CA)和10％胎牛血清的DMEM中10⁵个细胞。用显微镜检评价存在于培养孔中的反光细胞数。

培养基总是含有IL-3，因为早期激活的细胞因子需要其它辅助因子来存活和增殖。图20A显示对应于从阴离子交换柱上洗脱出的物质的两个区域中的柱组分的脐带血细胞。活性的第一个区域对应于Flt3 3T3刺激活性(图20B和20C)；第二个与Fms 3T3细胞(图20D)检测到的活性有关；在未转染的3T3细胞中未检测到反应(数据未显示)。进一步确定对应于Flt3 3T3活性的活性物质(图20A中的峰1)，并在不同的层析基质，包括阳离子交换树脂、肝素琼脂糖、羟基磷灰石、ConA-琼脂糖、苯基琼脂糖和凝胶过滤(Superdex 75)上纯化(数据未显示)。

在上述Flt3 3T3试验中使用进一步纯化的Pv-FRIL。Flt3 3T3细胞的平台刺激随着随后的纯化步骤逐渐下降(见图21A)，提示除去了必需的辅助因子。在纯化后期获得的Pv-FRIL中加入亚最佳水平的粗PHA-LCM，使该部分纯化的pv-FRIL的活性恢复到最大平台水平(见图21B)。

ELISA分析在含有纯化到接近均一的Pv-FRIL的组分中作用于造血祖细胞的细胞因子(白细胞介素1-α(IL1-α)、白细胞介素1-β(IL1-β)、白细胞介素2(IL2)、白细胞介素3(IL3)、白细胞介素4(IL4)、白细胞介素6(IL6)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)和干细胞因子(SCF))，揭示了Il1-α在纯化的每一步中都和Pv-FRIL一起留下来(数据未显示)。

加入IL-1的中和抗体或用抗体亲和层析除去IL-1耗竭但不消除Flt3 3T3活性。然而在含有纯化的Pv-FRIL的组分中发现的水平(＜1ng/ml)下，外源重组hIL1-α本身没有刺激活性(数据未显示)。该观察结果提示可能IL1-α起到必需辅助因子的作用，以获得Pv-FRIL的最大刺激。在当测试纯化Pv-FRIL的随后实验中，加入本身不刺激Flt3 3T3的细胞的浓度的Il1-α或PHA-LCM符合辅助因子需要。

用加入亚刺激量的Il-1α或PHA-LCM的改良Flt3 3T3试验，在三个独立实验中将活性蛋白质纯化到接近均一。表4总结了一个实验的结果，其中1％的回收伴有80,000倍的纯化，得到具有244,500单位/mg比活力的组分。

表4

纯化步骤	总蛋白(mg)	总活力(单位)	比活力(u/mg)	纯化倍数n	回收(％)
纯化步骤	总蛋白(mg)	总活力(单位)	比活力(u/mg)	纯化倍数n	回收(％)	PHA-LCM	231,774	7,500,000	3	1	100
蓝琼脂糖FF	1,294	2,600,000		670	35	PHA-LCM	231,774	7,500,000	3	1	100
蓝琼脂糖FF	1,294	2,600,000		670	35	Q-琼脂糖FF	347	1,400,000	4,035	1,345	19
苯基琼脂糖HP	14	1,200,000	85,174	28,571	16	Q-琼脂糖FF	347	1,400,000	4,035	1,345	19
苯基琼脂糖HP	14	1,200,000	85,174	28,571	16	Superdex 75	0.12	29,340	244,500	81,500	1

用4种不同的层析介质根据它刺激表达Flt3的3T3细胞的能力纯化Pv-FRIL。得到纯化倍数是80,000倍，产率为1％。

纯化的Pv-FRIL

SDS-PAGE显示纯化的物质含有有限数量的多肽，通过从在非还原条件下运行的SDS-PAGE凝胶块上洗脱出蛋白质，测试洗脱物质的活性，测定活性物质的多肽和分子量大小。通常在含有14-22kDa多肽的凝胶块中发现Flt3 3T3活性，有时在含32-43kDa多肽的凝胶块中发现(数据未显示)。

对应于14-22kDa范围的活性组分中的多肽进行了Edman降解的氨基末端测序。为此，用SDS-PAGE分辨来自C4反相层析柱的18kDa物质，在聚二氟乙烯(PVDF)膜(Immobilon-P，Millepore)上电印迹，用Ponceau S(Bio-RadLaboratories，Inc.Hercules，CA)染色。从PVDF膜上切下18kDa条带，用自动Edman降解法在ABI 477A型蛋白质测序仪(PF Applied Biosystems，Foster，CA)上测定N-末端序列。将衍生的肽序列与SwissProt蛋白质序列数据库比较。

在三个实验中，各从18kDa多肽获得了序列AQSLSFXFTKDALD(其中X是未知的氨基酸)。对于在染料前沿的物质(14kDa和以下)两次发现TDSRVVAVEFDXFP的氨基末端序列。两次发现平滑肌蛋白(SM22-α)的氨基末端，发现一次肌红蛋白的氨基末端。由于从AQS开始的序列是在各实验中识别的唯一序列，该多肽被认为负责Flt3 3T3活性。

用上述针对对应于18kDa多肽的N-末端的13个氨基酸的合成多肽产生的家兔抗血清(称为抗-AQS)，通过免疫亲和层析获得了Pv-FRIL的进一步纯化。将粗PHA-LCM加到家兔抗-AQS层析柱上，洗涤后，在酸性条件下洗脱结合的蛋白质。在两种不同的试验系统中测试4个合并组分的活性。Flt3 3T3细胞对合并的组分反应微弱(＜100u/mL)(数据未显示)。图22A-22D显示一个实验的结果，其中在IL3存在下在脐带血细胞上测定合并的组分。悬浮培养2周后，评估活细胞数和CD34表达状态。图22A-22D显示了三个AQS亲和层析实验的代表。补充有两个早期柱组分合并物的细胞培养物含有比接种100,000个细胞约多4倍的细胞(分别是426,000细胞和466,250细胞)，无可察觉的CD34染色(图22A和22B)。细胞数目的提高和CD34表达的下降是由于Il-3诱导的增殖和分化的预期结果。相反，用晚洗脱组分合并物处理的细胞培养物(图22D)含有少于10,000个细胞，或1/10的输入细胞，和一群一致表达CD34的细胞。晚系统AQS亲和合并物不显示IL-3的潜在影响(高细胞数量和耗竭的培养基)；而在悬浮培养物中两周后维持表达CD34的活细胞提示活性成分可保护CD34⁺Flt3⁺祖细胞。

Pv-FRIL衍生自菜豆

由于PHA衍生自红菜豆提取物，并由于FRIL家族成员，Dl-FRIL是从另一种豆科植物，即扁豆中分离的，用标准方法，例如(Rudiger，h.，Isolation of Plantlectins，H.-J.Gabius和S.Gabius编，pp.31-46，Berlin，1993)的方法从红菜豆(Phaseolus vulgaris)提取物中分离了结合甘露糖的植物凝血素。菜豆结合甘露糖的植物凝血素由分子量为18kDa和15kDa的多肽组成，这两条多肽的氨基末端是分别从AQSLFXFKFDPN和TDSRVVAVEDF开始的(其中X是未知的氨基酸)。

测试了从菜豆分离的Pv-FRIL在Flt3 3T3细胞实验中的活性。如图23所示，Flt3 3T3细胞以剂量依赖方式响应Pv-FRIL，而亲本未转染的3T3细胞不响应。

从菜豆纯化Pv-FRIL

从W.Atlee Burpee&Company，Warminster，PA购得来自红和白菜豆(菜豆)的干种子。用标准方法洗脱植物凝血素。简单说，在家用咖啡磨中研磨豆，加入4℃的50mM Tris/HCl，pH8.0，MgCl₂和CaCl₂各1nM持续混合4小时。10,000xg离心沉淀豆固体20分钟。用乙酸将上清液的pH调节到pH4.0，持续混合，除去污染的储藏蛋白质，然后离心澄清上清液，最后用氢氧化钠将pH调节到8.0，然后储藏在-20℃。

Pv-FRIL与甘露糖的特异性结合能从豆提取物的上清液中一步纯化植物凝血素。将50微升红或白菜豆的提取物和1毫升与琼脂糖粒(Sigma)共价结合的甘露糖保温在锥形试管中，4℃持续搅拌4小时过夜。与200mM α-甲基甘露糖苷(Sigma)或100mM甘氨酸，pH2.8一起保温洗涤后，从甘露糖粒洗脱出结合甘露糖的蛋白质。

Pv-FRIL编码核酸的DNA分离和PCR扩增

从幼菜豆芽中根据Dellaporta(″Plant miniprep and microprep：Version2.1-2.3″，Freeling，M.和V.Walbot(编)，The Maize HandbookXXVI+759p.Springer-Verlag New York，Inc.：New York，New York，USA；Berlin，Germany)的方法分离出总基因组DNA，并储藏在-20℃。基于确定的Pv FRIL的N-末端氨基酸序列，用菜豆密码子用法设计4种简并寡核苷酸(Pvβ1、PVβ2、Pvα1、PVα2)。引物序列如下：

PVβ1：TTY ACY AAR TTY GAY YTN GA

PVβ2：ATY TTY CAR GGW GAY GC

PVα1：TTR ACR TCR ATW CCR ATR TG

PVα2：TAR TTW GGR TCR ATR TTR GCR TT

进行两次聚合酶链式反应(PCR)。在第一次反应中，用30轮PCR，各轮包括94℃40秒、50℃40秒、72℃60秒，和10分钟的72℃延伸步骤扩增10ng豆基因组DNA。反应在50微升含30pmol各引物PVβ1和PVα1、0.2mM脱氧核糖核苷酸和0.5单位的Ampli-Taq聚合酶(Perkin Elmer)在相应的缓冲液中进行反应。用30轮PCR，用上述相同的条件扩增1微升PCR产物。反应在50微升含30pmol两种引物PVβ2和PVα2溶液中，用0.2mM脱氧核糖核苷酸和0.5单位的Ampli-Taq聚合酶(Perkin Elmer)在相应缓冲液中进行反应。在T/A质粒、pCR2.1(Invitrogen)中克隆460bp片段，通过测序酶双脱氧链终止法(United States Biochemicals)测序。

Pv-FRIL编码的核酸的RNA分离和cDNA合成。

从储藏在-70℃的中度成熟的菜豆种子中，根据Pawloski等(Mol.Plant.Biol.Mannual 5：1-13，1994)报道的方法制备总RNA。用5’/3’RACEKIT(BoehringerMannheim)从5.0微克总RNA，根据厂商说明书产生cDNA。在3’RACE的cDNA合成中，在标准条件下oligo(dT)锚定引物的浓度是32.5μM。对于5’RACE，cDNA纯化和随后的去尾反应根据厂商说明书进行。

聚合酶链式反应和Pv-FRIL编码的核酸的cDNA克隆

用5’/3’RACEKIT(Boehringer Mannheim)根据厂商的说明书通过聚合酶链式反应快速扩增Pv-FRIL的3’末端(RACE-PCR)。在两个连续的扩增反应中，用PCR-锚定引物和特异性引物(PV3和PV4)进行嵌套PCR扩增。这些引物的序列如下：

PV3：CAA TGT CTT ACA ACT CAC TAA G

PV4：AGT GTG GGA AGA GTG TTA TTC

扩增条件是30轮PCR，每轮94℃40秒、55℃40秒、72℃60秒，和10分钟的72℃延伸。反应在50微升含30pmol各引物，PV3和PCR-锚定引物(第一次，PV4和PCR锚定引物(第二次)、0.2mM脱氧核糖核酸和0.5单位的Ampli-Taq聚合酶(Perkin Elmer)在相应的缓冲液中进行。获得的831bp产物亚克隆入pCR2.1，如上报道进行测序。

对于5’RACE，联合锚定引物，用特异性引物SPV2和SPV3进行嵌套PCR反应。这些引物序列如下：

SPV2：ACC AAA GCT TTG GTT TTC AGA

SPV3：TCT GAA AAC GTT TGA GTA GAG

两个反应的扩增条件是30轮，94℃40秒，50℃40秒，72℃60秒，延伸步骤是72℃10分钟。反应在50微升含30pmol各引物，SPV2和PCR-锚定引物(第一次)，SPV3和PCR锚定引物(第二次)、0.2mM脱氧核糖核酸和0.5单位的Ampli-Taq聚合酶(Perkin Elmer)在相应的缓冲液中进行。

为了获得全长cDNA克隆，进行重组PCR(Higuchi R.见上)。分别进行两次PCR反应，一次在5’片段，另一次在3’RACE产物上，使用具有重叠区域的引物。然后用旁侧引物重新扩增重叠的原始产物，获得全长片段。

用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)根据厂商说明书纯化的原始PCR产物，并一起在单独的第二次反应中扩增。对于第二次PCR反应，使用引物PVEcoRI和APEcoRI。这些引物序列如下：

PVEcoRI：TAC ATG AAT TCG CTC AGT CAT TAT CTT TTA AC

APEcoRI：GAA TTC GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGAC

在100微升含有50微升各种引物，0.4mM脱氧核糖核苷酸和1.0单位Pfu聚合酶(Stratagene)的相应缓冲液中进行初次和二次PCR反应。初次PCR反应用30轮，每轮94℃40秒，50℃40秒，72℃60秒，和72℃的延伸步骤10分钟扩增出两条独立片段。二次PCR反应在12轮中用上述报道的相同条件扩增出重组片段。在克隆载体pGR2.1的EcoRI位点中克隆出全长的产物(图24A)，并如上测序。该质粒优选是pCR2.1-Pv-FRIL。

Pv-FRIL cDNA的核酸序列如下：

1 GCTCAGTCAT TATCTTTTAA CTTTACCAAG TTTGATCTTG ACCAAAAAGA

51 TCTTATCTTC CAAGGTGATG CCACTTCTAC AAACAATGTC TTACAACTCA

101 CTAAGTTAGA CAGTGGAGGA AACCCTGTGG GTGCTAGTGT GGGAAGAGTG

151 TTATTCTCTG CACCATTTCA TCTTTGGGAA AACTCTATGG CAGTGTCAAG

201 CTTTGAAACT AATCTCACCA TTCAAATCTC AACACCTCAC CCTTATTATG

251 CAGCTGATGG CTTTGCCTTC TTCCTTGCAC CACATGACAC TGTCATCCCT

301 CCAAATTCTT GGGGCAAATT CCTTGGACTC TACTCAAACG TTTTCAGAAA

351 CTCCCCCACC TCTGAAAACC AAAGCTTTGG TGATGTCAAT ACTGACTCAA

401 GAGTTGTTGC TGTCGAATTT GACACCTTCC CTAATGCCAA TATTGATCCA

451 AATTACAGAC ACATTGGAAT CGATGTGAAC TCTATTAAGT CCAAGGAAAC

501 TGCTAGGTGG GAGTGGCAAA ATGGGAAAAC GGCCACTGCA CGCATCAGCT

551 ATAACTCTGC CTCTAAAAAA TCAACTGTTA CTACGTTTTA TCCTGGGATG

601 GAAGTTGTGG CTCTCTCCCA TGATGTTGAC TTACATGCAG AGCTTCCTGA

651 ATGGGTTAGA GTAGGGTTAT CTGCTTCAAC TGGAGAGGAG AAACAAAAAA

701 ATACCATTAT CTCATGGTCT TTCACTTCAA GCTTGAAGAA CAACGAGGTG

751 AAGGAGCCGA AAGAAGACAT GTATATTGCA AACGTTGTGC GATCATATAC

801 ATGGATCAAT GACGTTCTAT CTTATATAAG CAATAAATAA ATGTATGATG

851 CACTCAATAA TAATCACAAG TACGTACGGT GTAGTACTTG TATGTTGTTT

901 ATGAAAAAAA AAAA (SEQ ID NO：5)

Pv-FRIL的氨基酸序列如下：AQSLSFNFTKFDLDQKDLIFQGDATSTNNVLQLTKLDSGGNPVGASVGRVLFSAPFHLWENSMAVSSFETNLTIQISTPHPYYAADGFAFFLAPHDTVIPPNSWGKFLGLYSNVFRNSPTSENQSFGDVNTDSRVVAVEFDTFPNANIDPNYRHIGIDVNSIKSKETARWEWQNGKTATARISYNSASKKSTVTTFYPGMEVVALSHDVDLHAELPEWVRVGLSASTGEEKQKNTIISWSFTSSLKNNEVKEPKEDMYIANVVRSYTWINDVLSYISNK*MYDALNNNHKYVRCSTCMLFMKKK (SEQ ID NO：6)

将Pv-FRIL的氨基酸序列与Dl-FRIL的氨基酸序列和PHA-E植物凝血素的氨基酸序列比较。图24B显示了该比较结果。

Pv-FRIL编码的植物表达载体和烟草转化

用重组PCR在Pv-FRIL cDNA克隆5’末端引入信号肽，使Pv-FRIL进入内质网。根据Higuchi(见上)的方法，在两次独立的PCR反应中扩增了信号肽和全长cDNA克隆。从携带豆α-淀粉酶抑制蛋白基因(Hoffman等，L.M.，Y.Ma和R.F.Barker，Nucleic Acid Res.10：7819-7828，1982；Moreno和Chrispeels，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7885-7889，1989)的完整序列的二元载体pTA4获得信号肽。

两个初次反应中使用的引物如下：

Sigforw BglII：AGA TCT ATG GCT TCC TCC AAC

Sigrew：AAA GAT AAT GAC TGA GCG GCT GAG TTT GCG TG

甘露糖植物凝血素cDNA的扩增：

SpMlforw：CAC GCA AAC TCA GCC GCT CAG TCA TTA TCT TT

APXhoI：CTC GAG GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGA

用于二次反应的引物Sigforw和AP设计成在5’产生BglII位点和在3’末端产生XhoI位点。同样的，如上进行初次和二次PCR反应。重组产物SpPv-FRIL在72℃与0.5单位Ampli-Taq聚合酶(Perkin Elmer)保温10分钟，克隆入克隆载体pCR2.1(图25)。如上确定PCR产物的核苷酸序列，来证实信号肽的正确结合。

在番茄植株中构建二元载体，用于组成型表达Pv-FRIL。将重组SpPv-FRIL克隆入在pM-SpPv-FRIL形成中得到的植物表达载体的BglII/XhoI位点(图26)。

将二元载体用An等，见上报道的冻融法转移到根癌土壤杆菌菌株C58中。如Horsh等(Science 227：1229-1231，1985)所述用携带表达载体pM-SpPv-FRIL的C58进行烟草叶片的土壤杆菌介导的转化。评价卡那霉素抗性植株在含3％蔗糖和100mg/l的硫酸卡那霉素(Sigma)的Murashige-Skoog培养基两步增殖中形成根的能力。

用该构建体转化的烟草植株在生长室中在受控条件下生长。收集幼龄植株的叶片(20克)，液氮冷冻并在研钵中用捣棒研成粉末。在含有1mM CaCl₂和蛋白酶抑制剂(PMSF、胃酶抑素和亮抑肽酶)的1×磷酸缓冲盐的缓冲混合物中搅拌粉末。2000rpm离心浆液，在Beckman超离心机中40,000rpm离心上清液。将澄清的上清液与1ml卵清蛋白-琼脂糖一起翻转3小时。用相同的缓冲液洗涤珠，与200mM海藻糖在含蛋白酶抑制剂混合物的1/10磷酸缓冲液中翻转过夜。考马斯兰染色凝胶显示该制备物是纯的Pv-FRIL。免疫印迹显示存在α和β亚基，因此转化的细胞在体内切开编码两个亚基的一条多肽链。与卵清蛋白-琼脂糖的结合和释放显示转基因的产物是活性植物凝血素。

实施例6

Dl-FRIL支持休眠人CD34+、CD38-/SCID-再生细胞的体外维持

为了进一步确定Dl-FRIL的祖细胞保护活性的特征，用原始人造血细胞的功能性体内试验确定细胞在严重联合性免疫缺陷Prkdc^scid突变纯合的受到亚致死量辐射的C.B.-17和NOD/LtSz小鼠的骨髓中定居并再生的能力(Lapidot等，Science255：1137，1992；Larochelle等，Nat.Med.2：1329-1337，1996)。为此，使用下列方法：

人细胞的制备

从足月分娩的婴儿获得人脐带血(CB)样品。血样在1∶1的不含Mg²⁺/Ca²⁺，补充有10％胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐(PBS)中稀释。在Ficoll-paque(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)上标准分离后收集低密度单核细胞，并在RPMI中用10％FBS洗涤。一些样品冷冻在10％DMSO中，其它新鲜使用。富集的CD34+细胞用mini MACS分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)根据厂商说明书进行CD34⁺细胞的富集。富集的CD34⁺细胞用一根柱的纯化是60-80％。在用mAb抗人CD34-FITL(Becton Dickinson)和抗人CD38 PE(Coul ter，Miami FL USA)染色CD34⁺富集的细胞后，用FACS分选(FACStar⁺，Becton Dickinson，San Jose，CA)纯化CD34⁺CD38^-/low细胞。

小鼠

用亚致死量的375cGy以67cGy/分钟从钴(⁶⁰Co)来源在移植前辐射在限制营养条件下喂养和维持在无菌微分离器笼中的8周龄NOD/LtSz-Prkdc^scid/Prkdc^scid(NOD-SCID)小鼠和NOD/SCID β2微球蛋白敲除的小鼠，下文称为NOD/SCID B2M^null(Christianson等，J.Immunol.158：3578-3586，1997)。

将人细胞在0.5ml RPMI和10％FBS中注射到辐射过的小鼠的尾静脉中。在一些实验中(如标出的)，未移植的辐射过的(1500cGy)CD34^-细胞作为载体细胞，与培养的细胞以最终浓度为0.5×10⁶细胞/小鼠共同移植。移植后1个月杀死小鼠，从每只小鼠的8根骨头(股骨、胫骨、肱骨和骨盆)冲洗出骨髓(BM)细胞。

体外培养

在含补充有10％FBS+1％BSA的24孔板(0.5毫升中2-4×10⁵个细胞)中培养人CD34⁺富集的细胞。体外培养物含有下列细胞因子组合：干细胞因子(SCF)-100ng/ml和Flt3配体(R&D Systems Inc.Minneapolis，MN，USA)，rhIL-6-50 ng/mL和sIL6R-1280 ng/mL，(InterPharm Laboratories，Ares-Serono Group，NessZiona，Israel)或Dl-FRIL-10 ng/mL(ImClone Systems Inc.，NY，USA)。在一些特别表明的实验中，生长因子混合物含有300 ng/mL SCF，300 ng/mL Flt3-L，50 ng/mL G-CSF，10 ng/mL IL-3(R&D Systems)和10 ng/mLIL-6。培养物在含5％CO₂的湿润大气中37℃培养。在3、6、10和13日后，收集细胞，计数并用FACS分析，接种在半固态培养物中，移植到NOD-SCID小鼠中。对于CD56⁺NK细胞的产生，将来自移植的小鼠的BM细胞与100ng/ml SCF和IL-15(R$D)一起培养10-14天。

Dl-FRIL的制备

从白扁豆(Dolichos lablab)的种子中用实施例1上述的方法分离出Dl-FRIL。

CFU实验

为了检测体外培养物中和移植的小鼠的骨髓中人祖细胞的水平，进行了半固体培养。将细胞铺在(4×10³细胞/ml)0.9％甲基纤维素(Sigma，St.Louis，MO，USA)、30％FBS，5×10^-5M 2ME，50ng/mL SCF，5ng/mL IL-3，5ng/mL GM-CSF(R&D)和2 u/mL Erythropoietin(Ortho Bio Tech，Don Mills，ON，Canada)中。将来自移植的小鼠BM的人细胞(2×10⁵细胞/ml)铺在15％FBS+15％仅对人集落有选择性的人血浆中。培养物在含5％CO₂的湿润大气中37℃培养，14天后用暗视野显微镜通过形态特征观察骨髓、红细胞样细胞和混合的集落。

细胞周期分析

通过用溴丙锭(Sigma)染色分析细胞的DNA含量。如所述培养细胞指定的3、6、10和13天。在各时间点，收集细胞，悬浮成最终浓度为0.1-1×10⁶细胞/ml，，与0.1％Triton X100(Sigma)一起在冰上孵育20分钟。在分析前加入50mg/ml碘丙锭(PI)。用FACSort(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行流式细胞分析。

流式细胞计数分析

用人血浆(1∶50)和抗小鼠Fc受体封闭剂(抗小鼠CD16/CD32 mAb，Pharmingen，San Diego，CA，USA)封闭来自移植的小鼠BM细胞上的人和小鼠Fc受体。用同型对照mAB排除假阳性细胞(Coulter，Miami FL USA)。用两种颜色染色，用抗人CD34FITC(Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)和抗人CD38 PE(Coulter)，分析在磁珠分离后纯化富集的亚群。用CD45 FITC(Immuno Quality Products，Groningen，The Netherlands)和抗人CD19 PE(Coulter)双染色检测pre B细胞，或用抗人CD56 PE(Coulter)检测NK细胞，检测移植的小鼠骨髓中人细胞和淋巴细胞谱系的水平。用补充了1％FBS和0.02％叠氮化物的PBS洗涤细胞，悬浮在0.1-1×10⁶细胞/ml的体积中，用直接标记的mAb染色，在冰上孵育25分钟。染色后，用相同的缓冲液洗涤细胞一次，用FACSort(Becton Dickinson)分析。用CELLquest软件(Becton Dickinson)进行分析。

人细胞植入分析

用流式细胞分析人骨髓样细胞CD45⁺和淋巴样细胞CD45⁺CD19⁺pre B细胞，和如前所述定量人DNA，确定人细胞植入的水平(Lapidot等，Science 255：1137，1992；Larochelle等，Nat.Med.2：1329-1337，1996；Peled等，Science283：845-848，1999)。简单说，从移植的小鼠的BM中，用酚/氯仿抽提获得了高分子量DNA。用EcoRI消化DNA(5g)，在0.6％琼脂糖凝胶上进行电泳，转印到尼龙膜上，与标记了³²P的人染色体17特异性α-卫星探针(p17H8)杂交(Lapidot等，见上)。将样品中条带强度与人工人/小鼠DNA混合物(0％、0.1％、1％和10％人DNA)比较，定量人DNA(图31中泳道4右侧的泳道)。对放射自显影进行多次曝光，来确保灵敏度降至0.01％人DNA。当在BM中同时检测到人骨髓样细胞和淋巴样细胞和人DNA时，将移植的小鼠评为阳性。

从这些实验，可获得下列结果：

Dl-FRIL维持但不增殖悬浮培养液中的CB CD34⁺祖细胞

如上所述，Dl-FRIL本身保护不成熟CB祖细胞达一个月，而不用更换培养液(见例如图14A和14B，以及表3)。为了将Dl-FRIL祖细胞保护性质和显示在悬浮培养中保护CD祖细胞细胞因子组合(SCF、Flt3-L、IL-6和sIL6-R)(Sui等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：2859，1995；Ebihara等，Blood 90：4363-4368，1997)比较，将富集的CB CD34⁺细胞与Dl-FRIL或细胞因子在含有10％FBS和1％BSA的RPMI培养基中培养3、6、10或13天。在第6天加入新鲜培养液和Dl-FRIL和/或细胞因子。计数各时间点收集的细胞，并铺在(即接种)半固态培养基测定克隆原性的祖细胞。

如图27A所示，Dl-FRIL培养物中的总细胞数随时间逐渐减少，从最初接种的2×10⁵个细胞减少到13天时的1.26×10⁵个细胞，与13天的预计的细胞因子培养物中增加14.3倍到2.8×10⁶个细胞相反。类似的，如图27B所示，Dl-FRIL培养物中的祖细胞水平在直到10天也维持相对稳定，然后减少到起始数量的9％(从第0天的24.7×10³个集落到13天的2.3×10³个集落)。祖细胞水平在细胞因子培养物中从开始到第13天的培养物增加了10倍(图27B)。

Dl-FRIL维持CD34⁺祖细胞在体外培养物中扩张能力达2周

为了确定悬浮培养物中Dl-FRIL保护的祖细胞的扩张能力，洗涤与Dl-FRIL培养6天的CD34⁺细胞，与细胞因子(不含Dl-FRIL)接触另外4天。进行全细胞计数和克隆原性祖细胞试验，将结果与和Dl-FRIL培养10天的细胞比较。在第6天加入新鲜培养基和Dl-FRIL。有趣的是，Dl-FRIL培养的细胞响应细胞因子刺激增殖，导致细胞数量增加了3.4倍(图28A)，祖细胞水平增加了13倍(图28B)。

进一步测试Dl-FRIL保护与Dl-FRIL培养10天，然后用细胞因子刺激3天，或仅与Fl-FRIL培养13天的细胞因子应答性CD34+祖细胞的能力。在第6天加入新鲜培养基和Dl-FRIL。在与Dl-FRIL培养10天，然后用细胞因子刺激3天的细胞中，与单独用Dl-FRIL培养13天的细胞比较，观察到总细胞数增加了2.9倍(图28C)和祖细胞增加了5.5倍(图28D)。这些结果提供证据表明，Dl-FRIL在悬浮培养中单独维持人祖细胞增殖能力达13天，而随后刺激用Dl-FRIL培养10天的细胞仍然响应细胞因子的增殖信号。

Dl-FRIL在体外培养物中维持SCID再生干细胞(SRC)

在培养期间的各时间点，收集人CB CD34+细胞，测定各孔内含物的祖细胞水平(如上所述)，将2×10⁵个剩余的细胞移植到一只小鼠中。一个月后，杀死小鼠，收集骨髓，测定人骨髓样细胞和淋巴样细胞的存在。试验前，用Southern印迹分析定量分析各移植小鼠的骨髓中的人DNA水平。图29E中提供了每只小鼠DNA中检测到0％、0.1％、1％和10％人DNA的代表性Southern印迹分析。

图29A-29D显示用体外培养的细胞移植的小鼠BM的代表性Southern印迹分析。图29A是代表性Southern印迹，显示用与FRIL培养6天(泳道1)、与FRIL培养10天(泳道2)，或与FRIL培养6天然后用细胞因子刺激4天(泳道3)的细胞移植的小鼠骨髓中人DNA。在一个典型实验中，与Dl-FRIL培养10天的细胞植入的水平与和Dl-FRIL培养6天的细胞相比下降了约10倍(图29A，泳道1和2)。然而当与Dl-FRIL培养6天的细胞随后用细胞因子刺激4天(图29A，泳道3)时，与单独用Dl-FRIL(泳道2)刺激10天相比植入提高了约10倍。与泳道1-2(单独与Dl-FRIL培养10天)相比，当如图29B，泳道3-4所示，移植来自其它供体的细胞(与Dl-FRIL培养6天，然后用细胞因子刺激4天)，在移植前获得了相同结果。Dl FRIL培养物在移植到小鼠中之前可以延长到甚至13天，如图28C-28D所示。比较接种前未与Dl-FRIL一起培养的原始细胞(图29C，泳道1)，和与Dl-FRIL培养13天的细胞(图29C，泳道2)移植到小鼠骨髓的结果，可见植入水平轻微提高。图28D显示另一个实验的结果，其中用与Dl-FRIL培养10天，或与Dl-FRIL培养6天，然后用细胞因子刺激4天的细胞获得的植入水平的差异很小。尽管如此，当与培养10天的细胞(图29D，泳道1和2)比较时，在用Dl-FRIL培养13天(图29D，泳道3)或与Dl-FRIL培养10天，然后用细胞因子刺激3天(图29D，泳道4)的细胞观察到10倍的增加。

图30总结了用Dl-FRIL培养10天(n＝12)或用Dl-FRIL培养6天(n＝33)，然后用细胞因子刺激4天的CD34⁺细胞移植的小鼠骨髓的人植入水平。用Dl-FRIL培养然后用细胞因子刺激的细胞，植入水平比仅用Dl-FRIL培养10天的细胞大7.4倍(图30，p＝0.05)。

为了测试Dl-FRIL对高度富含原始人SRC的CB群，用流式细胞计数基于不存在CD38表达进一步分选用免疫磁珠分离的CD34+细胞。单独与Dl-FRIL或Dl-FRI然后是细胞因子培养的CD34⁺CD38^-/low细胞(99％纯度)显示NOD/SCID B2M^null小鼠中移植的模式(Christianson等，见上)与CD34+细胞观察到的类似。这些小鼠已成功地用于次生人干细胞移植(Peled等，见上)，由于缺乏NK活性天然免疫较低，因此与NOD/SCID小鼠比较需要植入的人细胞更少。

图31是代表性Southern印迹(4个实验之一)，显示在移植到小鼠体内前，与Dl-FRIL培养10天(泳道4)与Dl-FRIL6天比较，然后用细胞因子刺激4天(泳道1-3)的细胞比较的相对植入水平。从移植的小鼠的BM获得了高分子量DNA，并在人DNA存在下进行Southern印迹分析。

基于这些结果，预期在Dl-FRIL后与细胞因子接触，细胞中植入的水平提高。因此，将泳道4同样地植入1只小鼠的原始细胞剂量分成泳道1-3中的三只小鼠中，当它们随后与细胞因子刺激接触时，表明Dl-FRIL培养的SRC扩增。用Dl-FRIL，然后是细胞因子处理后的细胞(图31，泳道1-3)移植的小鼠中植入水平比单独与Dl-FRIL培养(图31，泳道4)的细胞移植的小鼠高大约10倍。由于Dl-FRIL+细胞因子样品的细胞原始剂量分到三只小鼠中，对于用Dl-FRIL然后细胞因子刺激，与单独用Dl-FRIL比较CD34⁺CD38^-/low，观察到植入水平提高了30倍。另外，该结果代表CD34⁺CD38^-/low细胞的扩增水平比总的CD34+细胞高约三倍。图32总结了单独用Dl-FRIL培养的CD34⁺CD38^-/low细胞与随后用细胞因子刺激的细胞的6个实验(3个用NOD/SCID B2M^null小鼠和3个实验NOD/SCID小鼠，得到类似结果)中移植水平的倍数增加。这些数据显示CD34⁺CD38^-/low细胞SRC扩增30倍，而对应的实验中总CD34⁺细胞水平提高3倍。

另一个研究已证明Dl-FRIL保护长期再生的干细胞。将收集的最初用在Dl-FRIL中培养的CD34+脐带血细胞移植的NOD/SCID小鼠的骨髓移植到第二组亚致死辐照的NOD/SCID小鼠受体中。一个月后，分析来自第二组受体的骨髓中人红细胞生成作用的存在，如用上述试验确定的。在第二组亚致死量辐照的NOD/SCID小鼠受体中观察到多谱系植入。在系列移植研究中观察到的再生的维持表明存在长期再生的干细胞。

Dl-FRIL保护小鼠BM中SRC的多谱系分化能力

Southern印迹分析检测并定量测定了移植的小鼠骨髓中人DNA的水平，不特别指定从小鼠BM中回收到的人细胞的分化状态。由于SCID再生干细胞(SRC)是用NOD/SCID小鼠中的骨髓样和淋巴样细胞的多谱系分化确定的，进一步研究了用Dl-FRIL培养的CB CD34+细胞在小鼠BM中的体内分化过程。为此，CD34+或分选过的CD34⁺CD38^-/low细胞与FRIL培养10天或与FRIL培养6天，然后在移植前用细胞因子刺激4天。1个月后收集移植小鼠的BM，将细胞接种在选择人集落的半固体培养基中(结果如图33A所示)或用流式细胞计数分析谱系特异性标记(结果如图33B-22F所示)。

用Dl-FRIL培养10天的人CB CD34+细胞的祖细胞，移植到NOD/SCID一个月后收集，在选择性促进人祖细胞生长的半固体-集落试验中评估。图33A显示当在移植前，用Dl-FRIL培养6天后，用细胞因子刺激SRC4天，与单独用Dl-FRIL培养10天相比较，移植的小鼠骨髓中人祖细胞水平提高了2.3倍。另外，在集落试验中同时形成了骨髓样和红细胞样细胞(数据未显示)，以及通过流式细胞计数确定人B细胞分化(图33C和图33D)，表明与Dl-FRIL一起培养为此了SRC的多谱系分化能力。代表性流式细胞计数分析证明在用Dl-FRIL培养10天的CD34+细胞(图33C)或CD34⁺CD38^-/low细胞(图33D)移植的小鼠骨髓中存在人CD45+CD19+pre-B细胞(分别是1％或10％CD19+细胞)。

为了确定移植的小鼠骨髓中的人淋巴样前体具有除了骨髓样细胞，还能分化来自其它细胞的能力，来自移植的小鼠骨髓的细胞还与SCF和IL-15培养10天。通过流式细胞计数用针对CD45和NK细胞抗原CD56的人特异性单克隆抗体分析从培养物收集的细胞中人NK细胞。显示用CD34+或CD34⁺CD38^-/low细胞移植的小鼠细胞(1％或7.7％CD56+细胞；分别是图33E和33F)。

与Flt3配体相比用Dl-FRIL体外保护早期祖细胞

用其刺激用Flt3转染的NIH 3T3细胞刺激增殖的能力，而不用未转染细胞或用相关的Fms酪氨酸激酶受体转染的细胞鉴定Dl-FRIL(Moore et al.，Blood 90supp.1：308，1997)。虽然Dl-FRIL和Flt3-L同时刺激Flt3 3T3细胞的增殖，它们对CD祖细胞施加不同的作用。Flt3-L诱导休眠原始细胞进入细胞周期(Lymanand Jacobsen，Blood 91：1101-11345，1998)。相反，Dl-FRIL本身维持血清限制培养液中的祖细胞15-29天，而不改变培养液(Colucci等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(2)：646-650，1999)。在存在和不存在细胞因子的情况下，比较Dl-FRIL或Flt3-L在10％FBS和1％BSA构成的RPMI悬浮培养物中维持CB CD34⁺祖细胞的能力。然后接种细胞用于CFU试验。

如图34A，10天后在Dl-FRIL中悬浮培养收集的总细胞数轻微增加了1.9倍，而单独用Flt3-L或Dl-FRIL分别增加了4.5倍和5.4倍(p＜0.05)。单独使用细胞因子或含有Dl-FRIL和Flt3-L的含CB CD34⁺细胞的培养物导致细胞数量的10.9-12.5倍增加；然而用Dl-FRIL单独培养，然后用细胞因子培养的细胞仅增加了4.6倍(图34A，p＜0.05)。

有趣的是，单独用Dl-FRIL或随后与细胞因子培养的细胞与其它处理相比，选择性维持更多数量和比例的原始粒细胞红细胞样细胞-巨噬细胞-巨核细胞集落形成单位(CFU-GEMM)(图34B，p＜0.05)。Dl-FRIL维持的约40％祖细胞是CFU-GEMM，相对于其它组合，用Dl-FRIL增加2.6-3.7倍。与Flt3-L相反，使首先用Dl-FRIL培养的细胞与细胞因子接触，维持CFY-GEMM的高百分数，分别是18.2％对38.6％(图34B，p＜0.05)。这些结果显示Dl-FRIL和Flt-3可以分别作用于培养基中的原始祖细胞。

与细胞因子处理的细胞相比，Dl-FRIL将更高水平的CD34⁺细胞维持在细胞周期的G₀/G₁相

在体内不成熟的CD34+细胞大多数是休眠的，未在周期内的细胞(Young等，Blood 87：545，1996；Movassagh等，Stem Cells 15：214-222，1997；Ladd et al.，Blood 90：658-668，1997)。由于Dl-FRIL在悬浮培养物中将祖细胞维持在相对稳定的水平，可随后响应细胞因子刺激(见图27)，调查了与Dl-FRIL一起培养的CD34+细胞的细胞周期状态，与细胞因子刺激的培养物比较。在分离细胞后立刻用流式细胞计数分析CB CD34+细胞的DNA含量。观察到平均96.6％细胞在G₀/G₁细胞周期相(图35A)。

在用Dl-FRIL或细胞因子组合(SCF、Flt3-L、G-CSF、IL-3、IL-6)培养3-13天的5个独立实验中分析CB CD34+细胞的细胞周期状态(Bhatia等，J.Exp.Med.186：619-624，1997；Conneally等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：9836-9841，1997)。两种培养物中SG₂M相中周期中细胞的百分数从第3天到第13天下降了一半，对于Dl-FRIl从17.7％到9.1％，对于细胞因子从50.9％-23.2％(表1)(原始接种的细胞3.4％在SG₂M中)。

表5

用Dl-FRIL或细胞因子培养3、6、10或13天的周期性CD34⁺细胞

(于SG₂M相)的百分数和数目培养 Dl-FRIL 细胞因子 Dl-FRIL 细胞细胞因子诱导天数 (％) (％) (细胞×10³) 因子的倍数增加第3天 17.7± 50.8±1.4 35 212 6

1.9第6天 20±2 26 43.6 389.5 9第10天 10±1.9 29.7+1 26.4 553 21第13天 9.1±4.1 23.14 11.4 664.6 60

CD34+细胞与Dl-FRIL或SCF+Flt3配体+IL-3+G-CSF+IL-6一起培养(2×10⁵细胞/0.5ml)。用碘化丙锭染色进行细胞周期分析。将总细胞数乘以周期细胞百分数计算出细胞数。数据代表来自5个实验的平均±SE值。

更有戏剧性的是，在培养期间SG2M相的细胞数与原始接种的SG2M相的6.8×10³个细胞不同。Dl-FRIL培养物中的周期性细胞的平均数保持相对稳定，从第3天的35×10³细胞和第6天的43.6×10³细胞下降到第10天的26.4×10³个细胞，和第13天的11.4×10³个细胞。细胞周期中该细胞模式解释了总细胞数和祖细胞的低水平(见图27)。相反，细胞因子培养物中周期性细胞的预期数量急剧增加。细胞因子培养物中SG2M相中细胞的平均数与培养物中接种的SG2M中6.8×10³个细胞相比，增加到第3天的31倍的212×10³个细胞，第6天57倍的389.5×10³个细胞，第10天81倍的553×10³个细胞，和第13天97.7倍的664.6×10³个周期细胞(表1)。总的说，这些结果支持与细胞因子处理的培养物相比，Dl-FRIL保护休眠的更不成熟的祖细胞达两周的描述。

为了测试Dl-FRIL是否在防止细胞因子诱导休眠祖细胞群进入SG2M相中起到主要作用，如图35A-35G和表6所示，悬浮培养3天后，分析在细胞因子存在与否的情况下用Dl-FRIL或Flt3-L培养的细胞的细胞周期状态。图35A-35G显示不添加(图35A)、单独加Dl-FRIL(图35B)或各种细胞因子或其组合(图35C-35G)培养3天的CD34+细胞的代表性细胞周期柱状图，表6总结了各细胞周期相中细胞的平均百分数。

表6

CD34+细胞，体外培养3天的细胞周期状态

培养条件 Sub G0/G1 G0/G1 SG2MDl-FRIL 9.4±2.8 72.9±2.8 17.7±1.9Flt3-L 9.4±3.3 68.4±2.1* 22.2±5.4*Dl-FRIL+Flt3-L 8.6±3.9 67.1±1.8* 24.3±5.65*细胞因子 2.6±1.7 46.5±4.5* 50.9±1.4*细胞因子+Dl-FRIL 2.5±0.6 47.5±2.2* 50.0±2.7*细胞因子+Flt3-L 2.1±0.5 47.7±2.4* 50.2±2.9*

显示的数据是平均百分数±SE，来自4个独立的实验。

p值＝(对Dl-FRIL)：^*p＜0.05。

如表5所示，与用细胞因子刺激(图35C-35G和表6)相比，Dl-FRIL含有显著更高的休眠细胞和更低的周期性细胞百分数(图35B和表6)。单独用Flt3-L培养与单独用Dl-FRIL培养的细胞相比，导致轻微但明显的G0/G1细胞百分数下降(p＜0.05)，和相应SG2M相的增加(表6)。同时含有Dl-FRIL和Flt3-L的培养物显著增加SG2M相中祖细胞的百分数，从17.7％(单独用Dl-FRIL)-24.3％(p＜0.05，表6)。如表5所示，CB CD34+细胞与细胞因子接触3天，与单独用Dl-FRIL培养相比，诱导足够大的比例的细胞进入SG2M相(p＜0.05)。当在Dl-FRIL中培养，用subG0/G1群确定的经历凋亡的细胞百分数比细胞因子条件下的稍高。在这些培养条件下，Dl-FRIL和Flt3-L都不影响大部分休眠CD34+细胞群被细胞因子诱导进入SG2M相(表6)。

实施例7

Dl-FRIL在强刺激剂的存在下保护休眠状态的CB祖细胞

如实施例1所示从扁豆纯化Dl-FRIL。以5个对数剂量范围(10ng/ml-1,000ng/ml)对培养在含有琼脂糖-白细胞条件培养基，广谱刺激剂的强大来源，血清限制的培养基上在人CB MNC上进行Dl-FRIL试验。在培养5天后评估存活的MNC和祖细胞数量。在培养终点，存活的MNC数量在含有10-1,000ng/ml的Dl-FRIL培养基中减少了1.7-5倍。这些培养物中骨髓样和红细胞样祖细胞的频率对于相同的剂量范围提高了1.4-2.4倍。

表7

Dl-FRIL(ng/ml)	MNC(×10^-4)	祖细胞频率(集落/10^-5MNC)
Dl-FRIL(ng/ml)	MNC(×10^-4)	祖细胞频率(集落/10^-5MNC)				骨髓样	红细胞样
1,000	20	90+/-85	150+/-42			骨髓样	红细胞样
1,000	20	90+/-85	150+/-42	100	55	44+/-15	85+/-12
10	70	77+/-12	103+/-6	100	55	44+/-15	85+/-12
10	70	77+/-12	103+/-6	1	120	16+/-2	38+/-7
0.1	115	21+/-7	50+/-7	1	120	16+/-2	38+/-7
0.1	115	21+/-7	50+/-7	0	120	38+/-7	63+/-32

CB MNC在Dl-FRIL中培养得到较少的MNC和较多频率的祖细胞。4×10⁶CB MNC在2ml含有Agar-SCM(StemCell Technologies)的AIMV(Life Technologies)中培养，改变Dl-FRIL的浓度。5天后收集培养物，评估可变MNC和祖细胞数目。显示的祖细胞标定为每10⁵个MNC的祖细胞频率。

强刺激剂存在下含Dl-FRIL的培养物中细胞数量的减少和祖细胞频率的相应增加与我们的假设一致，即Dl-FRIL能防止祖细胞被细胞因子诱导的增殖和分化。下文表8显示了在含Dl-FRIL的培养物中，与对照相比MNC的相对减少，和祖细胞频率的相对增加。如预料，祖细胞的总数减少(祖细胞在分化的不同阶段，预计在祖细胞数量和MNC之间没有直接关系)。

表8

	倍数减少	倍数增加
	倍数减少	倍数增加		Dl-FRIL(ng/ml)	MNC	祖细胞频率
		骨髓样	红细胞样	Dl-FRIL(ng/ml)	MNC	祖细胞频率
		骨髓样	红细胞样	100	2.0	1.2	1.4
10	1.7	2.1	1.6	100	2.0	1.2	1.4

1	1.0	0.4	0.6
1	1.0	0.4	0.6	0.1	1.0	0.6	0.8
0	1.0	1.0	1.0	0.1	1.0	0.6	0.8

MNC的减少与祖细胞频率的相对增加有关。Dl-FRIL培养物的MNC中的相对减少与对应样品中增加的祖细胞频率一致。

实施例8

Dl-FRIL保护CB MNC抵抗化疗药物的毒性

显示Dl-FRIL可保护CB祖细胞在含有强刺激剂的培养物中增殖和分化的实验表明，Dl-FRIL保护祖细胞抵抗细胞周期活性的化疗药物毒性。将上述培养系统用于96孔板形式，在存在和不存在Dl-FRIL的情况下培养的CB MNC平板上试验在5-对数剂量范围内的广泛使用的化疗剂、阿糖胞苷(Ara-C)(图36A)、阿霉素(Dox)(图36B)和5-氟尿苷(5-FU)(图36C)(见图36A-36C)。如上在实施例1中所述从扁豆纯化Dl-FRIL。含Dl-FRIl的培养物(10ng/ml或100ng/ml)导致CB MNC对Ara-C(图36A)和Dox(图36B)的2-3 log的剂量漂移。如图36C所示，在5-FU培养物中存在Dl-FRIL在大剂量范围中提高了存活率。Dl-FRIL对Ara-C和Dox的剂量漂移之间的差异与5-FU比较，可用最近的报道解释，该报道显示5-FU通过RNA机制起作用，而不是DNA特异性药物(Bunz等，J.Clin.Invest.104：263-269，1999)。

实施例9

Dl-FRIL的小鼠耐受高水平

在小鼠中测定了Dl-FRIL的体内毒性。最初，对小鼠静脉内施用0.006-1mg/kg的3-log剂量范围(0.32-20微克/小鼠)。Dl-FRIL良好耐受，这些小鼠随后接受2个月的Dl-FRIL攻击，而未观察到任何短期或长期副作用。

测试小鼠中化学保护作用的方法通常涉及4-10天的每天预处理方案，然后开始化疗。用该框架作为起始点，每日静脉注射5mg/kg(100微克/小鼠)的Dl-FRIL4天。在150只用该剂量方案处理的小鼠中未观察到肉眼可见的副作用。从扁豆如上文实施例1所述纯化Dl-FRIL。

以500mg/kg在小鼠腹膜内注射一Dl-FRIL的丸剂(配合1毫升体积)进一步探索了Dl-FRIL毒性的上限，并监测小鼠的存活48小时。在4只接受该处理(2雄2雌，5月龄)的小鼠中，仅1只小鼠(雄性)活过48小时。存活的小鼠体重在开始的2天内下降了约15％，在第4天恢复正常。存活的小鼠的血液计数在注射FRIL后3天在正常范围内。该结果显示非常大剂量的Dl-FRIL也不是完全毒性的。

进行了其它剂量范围寻找研究，来确定接受用各种途径(静脉内、腹膜内、皮下和口腔)施用的高剂量Dl-FRIL对小鼠的毒性。

实施例10

Dl-FRIL在小鼠中体内调节祖细胞

使用最初计划的用于测量化学保护的Dl-FRIL剂量方案(5mg/kg×4天)，在小鼠中完成Dl-FRIL治疗后3、5和7天检测造血参数。如上实施例1中所述从扁豆中纯化Dl-FRIL。用0.2ml Dl-FRIL(500mg/ml)或0.2ml HBSS每天静脉内注射重量相当的BALB/c小鼠(雌性，8周龄)4天。在完成Dl-FRIL治疗后3、5和7天评估各组的两只小鼠。在用CO₂杀死小鼠前通过眼球放血收集肝素化的血液。从各小鼠收集两根股骨和脾脏，在1小时内加工样品。用标准造血集落试验(StemCellTechnologies)评估祖细胞。该研究的结果如表9所示。

表9

Dl-FRIL处理后3、5和7天的造血参数(5mg/kg×4天)

细胞构成

天数 RBC WBC BM 脾脏

3 0.58 0.34 0.59 1.01

5 1.26 0.98 0.75 0.72

7 0.95 0.82 0.91 1.12

骨髓祖细胞

天数 CFU-C CFU-E BFU-E+Mix

频率总计频率总计频率总计

3 1.85 1.10 1.63 1.01 1.61 1.01

5 1.17 0.87 0.86 0.63 1.03 0.80

7 1.81 1.69 0.61 0.57 2.59 2.47

脾脏祖细胞

天数 CFU-C CFU-E BFU-E+Mix

频率总计频率总计频率总计

3 - - 2.83 3.35 - -

5 2.41 1.68 0.95 0.63 2.12 1.42

7 - - 1.74 1.78 - -

Dl-FRIL数据报道成相对于对照值。

如表9所示，发现Dl-FRIL处理的小鼠外周血计数(红血细胞(RBC)和白血细胞(WBC))在第3天分别下降了1.7和2.9倍，在第5天恢复正常。骨髓(BM)细胞构成也在第3天下降了2.5倍，在7天后恢复正常。脾脏细胞组成在第5天较低，但在第3天和第7天是正常的。

如表9所示，祖细胞频率在骨髓中轻微增加，在第3天增加了1.6-1.85倍，但骨髓中的祖细胞总数维持不变。在脾脏中，当代偿器官在造血压力下，第3天观察到高2.83倍的频率和高3.35倍的红细胞样祖细胞数量(见表9)。骨髓中祖细胞的频率和总数看来在第5天是正常的，但在第7天观察到更原始的祖细胞(BFU-E/Mix)。在脾脏中第5天观察到类似的CFU-E减少；另外，祖细胞的频率和总数从第3-7天开始增加。

实施例11

Dl-FRIL保护小鼠在关键的第一周免受5-FU诱导的死亡

建立了剂量来确定是否FRIL保护小鼠不受Ara-C和dox的造血细胞毒性导致的死亡。该小鼠5-FU化学保护模型是基于研究显示单剂5-FU(150mg/kg)导致骨髓细胞组成下降大于90％，但对于干细胞的细胞毒性作用有限(Lerner和Harrison，Exp.Hematol.18：114-118，1990)。该发现与位于骨髓中的干细胞大部分是休眠状态的认识有关。这些小鼠中的骨髓细胞组成在2周后通过募集休眠祖细胞和逃脱5-FU毒性的反应性干细胞恢复。在最初剂量后3-7天施用第二剂量的5-FU(也是150mg/kg)，杀死响应5-FU的第一次治疗的干细胞和进入S相的祖细胞(Lerner和Harrison，见上)。

de Hann等(Blood 87：4581-4588，1996)将该模型用于测试是否用造血调节剂，聚乙二醇化的SCF+IL11预防治疗小鼠能扩增干细胞和原始祖细胞区域，并更好的保护小鼠不受5-FU诱导的造血毒性的死亡。这些实验证明虽然当与对照比较时，SCF+IL11预处理在进行4-5天后能加速造血细胞回收(从约11天到7天存活40％)，但在干细胞脱落的关键的第一周内施用第二剂5-FU时，SCF-IL11细胞因子预处理策略不能拯救小鼠死亡(de Haan等，见上)。

在下面的该研究中，选择上述Dl-FRIL预处理剂量方案(5mg/kg×4天)，因为在开始化疗前用细胞因子处理动物数天的需要，和因为Dl-FRIL处理过的动物轻易地耐受比用于细胞因子的10倍-100倍的剂量(5mg/kg)。由于FRIL和细胞因子以相同的浓度范围作用于祖细胞(ng/ml)，用该预处理剂量方案来测试是否Dl-FRIL能保护小鼠抵抗在第一周的2个间隔施用的5-FU：在第0日注射5-FU(150mg/kg)，然后在第3天(d0/3剂量间隔)或第5天(d0/5剂量间隔)注射第二剂(也是150mg/kg)。Haan等(见上)在第3天未观察到第3天间隔的存活。

如上在实施例1中所述从扁豆纯化Dl-FRIL。

用0.2毫升Dl-FRIL(500mg/ml)或0.2毫升HBSS每日静脉内注射重量相当的BALB/c小鼠(10只小鼠/组)4天。Dl-FRIL最后处理后2小时，用5-FU(150mg/kg)腹膜内注射小鼠。小鼠组在第3天或第5天接受第二剂5-FU(150mg/kg)。没有小鼠因为单剂5-FU死亡。

如表10所示，Dl-FRIL预处理改进了小鼠在两个独立实验中的存活。

表10

5-FU剂量间隔

实验小鼠 D0/3 D0/5

FRIL HBSS FRIL HBSS

1 雄性，16周 3/10 0/10 N.T. N.T.

2 雌性，8周 0/10 0/10 4/10 1/10

在经历0/3天和0/5天的5-FU剂量间隔之前用FRIL(5mg/kg×4天)预处理改善了小鼠的存活。

在第一个实验中，与HBSS预处理对照中无小鼠存活相比，10只小鼠中有3只在5-FU的0/3天剂量间隔中存活下来。在第二个实验中，与HBSS预处理对照中10只小鼠只有1只小鼠存活相比，10只小鼠中有4只在5-FU的0/5天剂量间隔中存活下来。

实施例12

FRIL家族成员保护小鼠抵抗5-FU诱导的死亡的剂量方案的优化

FRIL家族成员在豆科植物中相对丰富。例如Dl-FRIL占白扁豆质量的约0.02％。

用糖类亲和层析如实施例1中所述纯化Dl-FRIL，并用SDS-PAGE测定纯度(在超载的凝胶上可见5条清晰条带，见图37)；用氨基酸分析来分析质量和组成；在上述脐带血祖细胞试验中测试。

用小鼠5-FU化学保护形式(Lerner和Harrison，见上；de Haan，见上)经验性衍生出Dl-FRIL保护小鼠抵抗死亡的最佳剂量方案。用各种方案(包括在化疗前用Dl-FRIL处理(从化疗的3天-2小时前每日处理)和在化疗期间)对小鼠静脉内施用Dl-FRIL，跨越3个对数剂量范围(5-5,000mg/kg)。

用于这些研究的小鼠是BALB/c雌性小鼠，在开始实验时为8-10周龄(JacksonLaboratory，Bar Harbor，ME)，为了实验每只重量匹配，其中每组10只。收集接受5,000mg/kgFRIL(不用5-FU处理)剂量的小鼠的器官用于毒性研究。

5种剂量是0、5、50、500和5,000微克/公斤。Dl-FRIL的4个剂量方案是用5-FU治疗前2小时；1天和2小时；2天、1天和2小时；3天、2天、1天和2小时。两种维持方案是每天×7天(2小时到7天)或每隔一天(第0、2、4、6天)。因此一组小鼠将每日接受Dl-FRIL的剂量7天；虽然第二组将每隔一天接受Dl-FRIL的剂量7天。

150mg/kg的5-FU剂量间隔是0/3天，0/5天和0/7天。

实施例13

FRIL家族成员对广泛使用的细胞周期活性化疗剂具有化学保护性质。

在建立FRIL家族成员的最佳剂量方案后，FRIL家族成员保护小鼠抵抗阿糖胞苷(Ara-C)和阿霉素的死亡的能力。

阿糖胞苷(Ara-C)和阿霉素的最初剂量方案如下：阿霉素：14mg/kg单丸剂腹膜内注射(Grzegorzewski等，J.Exp.Med.180：1047-1057，1994)；Ara-C 300mg/kg在0和12小时腹膜内注射(Paukovits等，Blood 77：1313-1319，1991)。其它研究基于关注的临床表征。

实施例14

FRIL家族成员保护小鼠抵抗5-FU死亡的最佳剂量方案中小鼠造血细胞状态的特征

在接受最佳剂量方案的FRIL家族成员期间和之后，在小鼠中确定外周血计数和造血祖细胞状态(频率、总数和周期状态)的特征。

为此，在用FRIL家族成员治疗期间或一周后每天评估用FRIL家族成员治疗方案注射，而不用5-FU治疗的小鼠。评估该小鼠下列造血作用参数：WBC和RBC计数；骨髓和脾脏细胞组成；和祖细胞状态，它包括造血集落试验(StemCellTechnologies)。测定的祖细胞是骨髓样(CFU-C)、红细胞样(CFU-E)和原始、多能(BFU-E/Mix)。确定了频率和总数，并用³-胸腺嘧啶自杀试验测量这些细胞的周期状态(Moore等，Exp.Hematol.14：222-229，1986)。

实施例15

小鼠中FRIL的药理学和毒理学分析

用初步药物动力学确定体内从循环中清除FRIL家族成员及其聚集。

为了这些研究，对小鼠注射¹²⁵I-FRIL(FRIL剂量基于最佳结果)。在注射后下列时间点评估血液中FRIL的清除：5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、36小时、48小时。在各时间点评估2只小鼠。在该研究后，杀死小鼠，收集器官并评估。

寻找剂量范围的试验确定了FRIL家族成员通过各种给药途径(静脉内、腹膜内、皮下和口腔)的最大耐受剂量。为了进行该寻找剂量范围的研究，使用了4种剂量的4条途径。给药的途径是静脉内、腹膜内、皮下、口腔。FRIL家族成员的最高剂量是1g/kg。FRIL家族成员的剂量减少了2倍，直到小鼠存活。在治疗后48小时测量存活。进行了其它临床观察，包括行为、致命性、发音、腹泻。进行了CBC分析。进行尸体解剖评估动物(即肉眼损害)。在该研究后，杀死动物，收集器官并评估。

急性剂量的毒性研究鉴定出可在接触FRIL家族成员后产生损害的靶器官。对这些急性剂量毒性研究，选择剂量，每日注射FRIL家族成员7天。在7天评估急性毒性，并在21天评估急性毒性的恢复。评估了血液化学、靶器官、骨髓和血液，以及其它健康指标。

在豚鼠中进行超敏性研究，测试任何不良免疫反应。为此，使用了15只豚鼠(5 FRIL，5 DNCB阳性对照，5盐水阴性对照)。以0.1毫升透皮注射FRIL家族成员。每日临床观察红肿和水肿的位点，与DNCB阳性对照比较。用0.05毫升FRIL家族成员攻击FRIL豚鼠2周，每日观察。

测定在接受FRIL家族成员处理的小鼠中产生小鼠抗-FRIL家族成员抗体，以测定身体对FRIL家族成员反应的程度和性质。为此，将FRIL家族成员与Dynal的甲苯磺酰活化磁珠结合。用FRIL家族成员包裹的珠与来自接受FRIL家族成员治疗的小鼠的血浆(合并或单独)一起培养。使用家兔和大鼠对FRIL的抗血清作为阳性对照，用SDS-PAGE和Western印迹分析(辣根过氧化物酶或化学发光)评估FRIL家族成员特异性抗体的存在。最后，进行测定是否糖封闭了抗体结合(α-D-甘露吡喃糖苷和阴性对照)。

实施例16

用Dl-FRIL包裹的磁珠纯化祖细胞

用非限制性FRIL家族成员Dl-FRIL包裹的磁珠分离并确定祖细胞群。为此，使用了下列方法。

细胞分离的FRIL-珠制备

如上所述在实施例1中从扁豆纯化Dl-FRIL。可将Dl-FRIL通过植物凝血素的氨基和巯基根据厂商说明书固定在磁珠(甲苯磺酰活化的M-280Dynabeads，LakeSuccess，NY)上。Dl-FRIL还可以通过生物素-链霉亲和素相互作用固定在磁珠上。

在该实施例中，通过生物素-链霉亲和素相互作用将Dl-FRIL固定在磁珠上。根据厂商说明书通过伯胺基团(EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-生物素，PierceChemicai Company，Rockford，IL)生物素化Dl-FRIL。生物素化的Dl-FRIL与链霉亲和素标记的磁珠(Dynal或Miltenyi Biotec，Auburn，CA)根据厂商说明书孵育。

细胞的制备

通过在Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上根据厂商说明书密度离心，在6个小时内将人脐带血(CB)、外周血和骨髓收集在含抗凝血剂(例如肝素、EDTA)的无菌容器中。洗涤在血浆和Ficoll-Paque界面收集的单核细胞，重新悬浮在血清限制培养基(例如XVIVO-10，Biowhittaker，Walkerville，MD或AIM-V，Life Technologies，Rockville，MD)中。

Dl-FRIL珠细胞分离

Dl-FRIL包裹的珠与CB、外周血和骨髓中发现的小mnc群特异性结合。10倍过量的Dl-FRIL-珠与细胞一起孵育。对于CB，其中Dl-FRIL-珠捕获约1％mnc，珠与细胞的比例是1∶10，或对于每种靶细胞珠的数量多10倍。表达其它Flt3细胞群(造血和非造血细胞)的比例是通过细胞与新鲜的Dl-FRIL珠系列接触实验确定的。

在使用前，Dl-FRIL-珠在血清限制培养液中洗涤2次。在15毫升锥形离心管(Falcon，Becton-Dickinson，Lincoln，NJ)中的10毫升血清限制培养液中加入等份的Dl-FRIL-珠，混合，置于磁铁(Dynal或Miltenyi Biotec，根据磁珠来源而定)上10分钟。用10毫升滴管吸取培养液，但不搅动通过磁铁的磁力与离心管壁结合的珠。洗涤后，在试管中加入0.5毫升血清限制培养液，将珠从壁上洗到锥形管底部。以小体积(＜2毫升)将培养液加到珠上，在冷藏室(即约4℃)中的摇床上振摇1小时。孵育后，将血清限制的培养液加到最终浓度为10毫升，将试管置于磁铁上10分钟。吸取培养液，而不搅动与离心管壁上通过磁力结合的Dl-FRIL-珠结合的细胞。从磁铁上取下锥形管，第二次洗涤细胞，加入10毫升血清限制的培养基，混合细胞，并将锥形管置于磁铁上。吸取培养液后，将最终体积调节到2毫升。

来自细胞的Dl-FRIL珠分离

对于一些应用，优选Dl-FRIL-珠与细胞分离。大约一半Dl-FRIL-珠在冷藏室中的摇床上过夜孵育后与CB mnc分离。虽然结合研究已显示过量的甘露糖和α-甲基α-D-甘露糖苷防止Dl-FRIL与Flt3结合，CB mnc释放的糖都不与Dl-FRIL紧密结合。为了从该细胞亚群除去Dl-FRIL珠，在冷藏室中的摇床上，在100mM海藻糖(Sigma，St.Louis，MO)中孵育一小时。

应注意由于与Dynabeads(约10微米)相比Miltenyi珠非常小(约50nm)，因此当Miltenyi珠用于纯化与Dl-FRIL结合的祖细胞时，珠能够与纯化的祖细胞保持结合。

受体酪氨酸基因表达

用RT-PCR确定受体酪氨酸激酶基因的表达。

用这些方法，获得下列结果：

Dl-FRIL珠选择的CB mnc的功能性质

在促进造血细胞或内皮细胞谱系增殖和分化的条件下，在甲基纤维素集落试验中测试了Dl-FRIL-选择的CB mnc祖细胞能力(如上所述)。表11显示了在培养未选择细胞(CB mnc)、Dl-FRIL-选择的细胞(Dl-FRIL⁺)和不与Dl-FRIL珠结合的(Dl-FRIL^-)CB mnc后，造血细胞集落(骨髓样、红细胞样和mix)和内皮细胞集落(其它)的数目。

表11

Dl-FRIL-选择的细胞对造血细胞和内皮细胞刺激的应答

刺激剂骨髓样红细胞样 Mix 其它总计

-CSFs CBmnc 1 3 2 0 6

Dl-FRIL⁺ 14 10 4 0 28

Dl-FRIL^- 1 1 2 0 4

+VEGF CB mnc 0 0 0 2 2

Dl-FRIL⁺ 0 0 0 19 19

Dl-FRIL^- 0 0 0 5 5

用Ficoll-Paque，珠选择并铺在MethoCult^TM，StemCell Technologies，Vancouver，BC，Canada中，分离脐带血单核细胞。

如表11所示，Dl-FRIL-选择增加了造血细胞集落数(用集落刺激因子(CSF)刺激，骨髓样细胞增加了14倍，红细胞样集落(CB mnc和Dl-FRIL-珠分别)增加了3.3-10倍)，混合集落增加了2倍。对于内皮集落观察到DI-FRIL-珠富集相似水平(用血管内皮生长因子(VEGF)刺激)：比CB mnc高9.5倍，对于Dl-FRIL^-细胞是3.8倍。

Dl-FRIL珠-选择的CB mnc的细胞表面表型性质

用流式细胞计数确定Dl-FRIL珠选择的CB mnc的细胞表面表型性质。表12显示了三种细胞群的表型(用表达细胞表面表型标记的细胞百分数)：(1)Dl-FRIL不选择的细胞(Dl-FRIL^-)；(2)在冷藏室中在摇床上过夜培养后从Dl-FRIL-珠上分离的细胞；和(3)在过夜培养(Dl-FRIL⁺⁺)后保留Dl-FRIL珠的细胞。分别分析两种Dl-FRIL结合的细胞群，来观察是否结合的紧密(亲和力)与所选的细胞类型有关。同种型对照水平定位2％；2％代表的所有值代表与测试的抗体无反应性。

表12

抗原细胞类型 Dl-FRIL- Dl-FRIL+ Dl-FRIL++

(％) (％) (％)CD3 成熟T 26 35 6CD11b Mac-1，CR3 19 35 67CD11c LeuCAMc 10 22 32CD13 Pan骨髓样，CFU-GM 5 ＜2 ＜2CD19 Pan B 4 5 12CD32 低亲和力IgG Fcγ-R 5 19 26CD33 骨髓样祖细胞 3 2 8CD34 Pan祖细胞＜2 ＜2 ＜2CD38 活化的T 88 96 93CD42a 血小板gpIX 5 2 7CD69 早期活化ag(EA-1) 6 8 14CDw90 Thy-1，祖细胞亚组 8 14 13CD117 c-kit，祖细胞 4 2 2

如表12所示，Dl-FRIL-珠不捕获表达CD34，造血干细胞和祖细胞的检验标记的CB mnc。该观察是出乎意料的，因为Dl-FRIL-选择的细胞是富含祖细胞的(见表11)。虽然CB CD34⁺细胞单一表达FLT3，仅70％Flt3⁺CB mnc还表达CD34(Rappold等，Blood 90：111-125，1997)。类似的，30％CB mnc表达CD34-Flt3⁺表型。Dl-FRIL-珠似乎捕获这后一种细胞群。

表达树突细胞(DC)标记、CD11b和CD11c的细胞在Dl-FRIL⁺细胞群中富集约2倍，并在Dl-FRIL⁺⁺细胞群中富集3倍以上(表12)。该观察与报道Flt3在小鼠(Pulendran等，J.Immunol.159：2222-2231，1997)和人(Miller等，Blood93：96-106.，1999)中涉及树突细胞增殖和成熟一致。该稀少的造血样树突细胞群用于诱导肿瘤退化和治疗AIDS。

在Dl-FRIL⁺和Dl-FRIL⁺⁺CB细胞之间观察到细胞表面表型的差异(见表11)。CD3 T细胞的百分数对于Dl-FRIL⁺CB下降了35％下降到Dl-FRIL⁺⁺细胞的6％。相反的，CD11b⁺细胞和CD11c⁺细胞的百分数对于Dl-FRIL⁺和Dl-FRIL⁺⁺细胞群分别从35％提高到67％，从22％提高到32％。

观察到在冷藏室中的摇床上过夜培养后保留Dl-FRIL珠的细胞是单细胞，或珠-结合细胞的簇。这些簇不被机械作用或用竞争性蔗糖、甘露糖或甘露糖衍生物洗脱(数据未显示)。从确定Dl-FRIL的糖结合性质特征的研究看，α，α-海藻糖显示比甘露糖高3.6倍的效能，比测试的α-甲基α-D-甘露糖苷衍生物高1.6-2.1倍的效能(Mo等，Glycobiology 9：173-179，1999)。成簇的Dl-FRIL-珠结合的细胞与100mM海藻糖一起孵育，有效打碎成簇的细胞，并从细胞上除去更多的Dl-FRIL-珠。

用流式细胞计数分析两群海藻糖打散的Dl-FRIL⁺⁺细胞：不再与珠结合的细胞(Dl-FRIL⁺⁺)和在与海藻糖一起孵育后仍保留珠的细胞(Dl-FRIL⁺⁺⁺)。表13显示了一个实验的结果。

表13

在与海藻糖接触后，Dl-FRIL-选择的CB mnc的流式细胞计数分析

抗原细胞类型 Dl-FRIL++(％) Dl-FRIL+++(％)

CD3 成熟的T 6 3

CD11b Mac-1，CR3 52 76

CD11c LeuCAMc 16 43

CD13 Pan骨髓样，CFU-GM 72 46

CD19 Pan B 5 9

CD32 低亲和力IgG Fc-γ 43 19

CD33 骨髓样祖细胞 56 15

CD34 Pan祖细胞 2 2

CD117 c-kit，祖细胞 2 12

CD135 Flt3，祖细胞 2 5

表13中Dl-FRIL⁺⁺细胞和Dl-FRIL⁺⁺⁺细胞之间细胞表面表型的差异比在表12的Dl-FRIL⁺细胞和Dl-FRIL⁺⁺细胞之间观察到的大。在表13中，CD3、CD13、CD32和CD33细胞的百分数在Dl-FRIL⁺⁺⁺细胞中比Dl-FRIL⁺⁺细胞减少了1.6-3.7倍。相反，CD11b、CD11c、CD19、CD117和CD135细胞的百分数在Dl-FRIL⁺⁺⁺细胞中比Dl-FRIL⁺⁺细胞增加了1.5-6％。对于两种细胞群，也未观察到CD34。

表达CD117和CD135，两种对于造血干细胞和祖细胞功能起中心作用(Lyman和Jacobson，Blood 91：1101-1134，1998)的酪氨酸激酶受体的细胞百分数的增加，提示Dl-FRIL-珠与细胞结合的亲和力可能对应于细胞的原始状态。本文所述的该确定Dl-FRIL的糖类结合性质的研究支持该意见。Dl-FRIL既不是衍生的糖类联合-合并位点，也不是附近有临近的疏水结合位点(Mo等，Glycobiology9：173-179，1999)。Dl-FRIL与三海藻糖酰基结构最紧密，该结构是哺乳动物中N-连接的糖基化的基础。因此，Dl-FRIL可以与经历较少糖基化加工的细胞结合，这与更原始的细胞一致。Dl-FRIL结合的该性质可以提供一种独特的方法，来分离目前不可能用针对CD34的抗体分离的原始细胞。因此，Dl-FRIL与正常糖基化的FLT3受体的结合，比FLT3-配体与正常糖基化的FLT3结合更紧密。Dl-FRIL与正常糖基化的FLT3受体的结合比典型的抗体与特异性配体结合更紧密。

在Dl-FRIL选择的CB细胞中的受体酪氨酸激酶基因表达

细胞表面受体和标记的数目随着多能造血干细胞增殖和分化而增加。最原始的细胞上功能性受体的数目可能少于10个。流式细胞计数的检测水平可能在几百个细胞表面分子的范围内。因此，分析原始细胞群不能用流式细胞计数分析。

进一步用RT-PCR确定原始细胞上功能性酪氨酸激酶的受体存在与否的特征。对于CB mnc、CD34-选择的细胞和Dl-FRIL-选择的细胞测定了Flt3、Kit、Fms、Flk1、Flt1和Flt4 mRNA的表达。对于CB mnc，受体的PCR产品是微弱或不可检测的。被CD34-珠或Dl-FRIL-珠选择的细胞的基因表达模式相同；所有酪氨酸激酶受体显示强PCR信号。这些数据提示与干细胞有关的受体(Flt3和Kit)和原始内皮细胞有关的受体(Flk1、Flt1和Flt4)还在Dl-FRIL选择的细胞中检测到。

实施例17

用FRIL家族成员包裹的珠分离CD34^-原始干细胞

鉴定了稀有的具有CD34^-CD38^-Lin表型的人干细胞群在NOD/SCID小鼠中建立多谱系移植体的能力(Bhatia等，Nat.Med.4：1038-1045，1998)。这些再生细胞产生表达检验CD34标记的干细胞。分离CD34^-CD38^-Lin^-细胞是非常辛苦的阴性选择方法，包括用免疫磁珠和流式细胞计数耗竭表达CD34、CD38和谱系标记的细胞。快速、有效、阳性选择CD34^-CD38^-Lin^-细胞是临床应用优选的。然而缺乏高度表达CD34的标记和在该稀有细胞区群上内伤功能性受体数量少将阻止使用抗体来分离细胞。

在一种独特方法中使用与磁珠结合的FRIL通过结合表达该表型的原始细胞，来分离该稀有的CD34^-CD38^-Lin^-细胞群。分离CD34^-CD38^-Lin^-是通过一步细胞分离实现的。然而，由于FRIL-珠还识别表达CD11b、CD11c和CD38的细胞，通过首先用与CD11b、CD11c和/或CD38结合的磁珠阴性选择，改进CD34^-CD38^-Lin^-细胞的最佳分离。

实施例18

用被FRIL家族成员包裹的珠从患有白血病的病人分离正常干细胞

大多数白血病病人表达CD34⁺Flt3⁺表型(Carow等，Blood 87：1089-1096，1996)。因此，依赖于CD34表达的方法不能识别病人骨髓和外周血中来自白血病细胞的正常干细胞和祖细胞。

FRIL不和具有CD34⁺Flt3⁺表型的两种细胞白血病谱系(KGl-A和ML-1)相互作用。FRIL不影响这些白血病细胞谱系的生长，FRIL-珠也不捕获可检测数量的细胞(数据未显示)。由于FRIL-珠选择具有CD34^-Flt3⁺表型的正常祖细胞，因此FRIL-珠提供了一种识别正常和白血病细胞的独特方法。

用与磁珠结合的FRIL家族成员从白血病病人的骨髓和外周血分离正常造血干细胞和祖细胞。这是用与白细胞分离置换法相似的方法实现的，其中血液通过保留感兴趣的细胞的装置。在该实施例中，FRIL-珠与CD34^-Flt3⁺正常细胞结合。由于FRIL还与表达Flt3的CD11b和CD11c细胞结合，在接触和回收细胞前，除去与CD11b和/或CD11c结合的免疫磁珠可富集原始细胞。

实施例19

用FRIL-珠从正常个体来分离树突状祖细胞和成熟细胞

树突细胞(DC)是捕获抗原和引发T细胞介导的免疫应答的免疫细胞(Banchereau和Steinman，Nature 392：245-252，1998)。DC起到了皮肤、肠和淋巴器官中第一道防线的作用。在DC上的抗原能活化原始和休眠的T细胞，少量用低剂量的抗原脉冲的DC刺激强T细胞应答。在某些情况下，DC还诱导T细胞耐受。因此DC的独特性质对用这些细胞治疗癌症和AIDS引起了显著的兴趣。DC衍生自人骨髓中的CD34⁺祖细胞。细胞因子GM-CSF、TNT-α和Flt3(FL)影响DC发育(Banchereau和Steinman，supra；Pulendran et al.，J.Immunol.159：2222-2231，1997)。在小鼠中注射FLT3-配体，急剧提高DC数量(Pulendran等，见上)。

FRIL与DC上的Flt3受体相互作用，FRIL-珠捕获细胞与CD11b和CD11c的树突表型相互作用。选择具有FRIL-珠的树突细胞，从人骨髓、外周血或脐带血能快速有效的分离DC用于临床应用。

实施例20

用FRIL-珠分离内皮干细胞和祖细胞

内皮干细胞和祖细胞产生在血管生成作用过程中形成血管的细胞。在中风和心脏病发作中，需要新的血管来修复损伤。活化内皮干细胞和祖细胞，产生更成熟的细胞是通过活化Flk1/KDR、Flt1和Flt4酪氨酸激酶受体的细胞因子介导的。Flt3在非常原始的内皮祖细胞上表达。用FRIL-珠捕获一群来自脐带血的表达所有这些受体的细胞。

实施例21

用FRIL家族成员和非-FRIL家族成员植物凝血素改变信号转导和其它细胞途径

设计改变信号转导的药物需要特异性识别靶细胞。FRIL用作靶向载体，来向表达Flt3的细胞，例如干细胞、祖细胞和树突细胞传递小分子。FRIL对于药物传递有几个优点：1)FRIL对Flt3是特异性的；2)FRIL在细胞质中是稳定的；3)FRIL能经历与小分子的偶联；4)FRIL可以剂量应答性方式传递；和5)FRIL提供对重叠的信号转导途径的特异性。

其它豆科或鳞茎衍生的植物凝血素也可对特定细胞群传递小分子药物。例如，植物凝血素PHA和ConA同时与CD3-T细胞受体复合物和FC-γ受体(CD32)结合(Leca等，Scand.J.Immunol.23：535-544，1986)；UDA与T细胞受体的Vβ结构域结合(Galelli等，J.Immunol.1 51：1821-1831，1993)。

用标准偶联方法使小分子、寡聚物或酶与植物凝血素结合。

实施例22

在咖啡磨中磨碎豆薯的干种子，用5体积的10mM乙酸钠缓冲液，pH5.2，含有1mM CaCl₂在4℃提取粉末1小时。离心后，用Tris-HCl pH8.0中和澄清上清液。

通过吸附在卵清蛋白凝胶亲和柱(Sigma)上实现YamFril纯化，并用200mM海藻糖洗脱。

得到的蛋白质分级成2种多肽，进行N-末端氨基酸测序。

β条带：AQSVSFTFTKFDSDQ (SEQ ID NO：9)

α条带：AASNNVVAVEFDTXPN (SEQ ID NO：10)

在从International Institute of Tropical Agriculture(Ibadan，OyoState，Nigeria)获得的总RNA上进行反转录酶PCR，使用基于α和β的N-末端序列(即分别是SEQ ID NO：10 and SEQ ID NO：9)的简并引物。

在总和polyA+RNA上用基因特异性引物和锚定引物进行3’RACE PCR。

获得部分cDNA并推测出如下序列：YamFril：部分mRNA序列ACGAAGTTCGACAGCGACCAAAAGGATCTTATGTTCCAAGGTCATACCATTTCTAGCAGCAATGTCATACAACTCACCAAGTTAGACAGTAATGGAAACCCTGTGAGTACCAGTGTGGGAAGAGTGTTATACTCTGCACCATTGCGCCTTTGGGAAAGCTCTACAGTAGTGTCAACCTTTGAGACCACTTTCACCTTTCAAATCTCAACACCTTACACTAGTCCTCCTGGTGATGGGCTCGCCTTCTTCCTTGCACCATATGACACTGTCATCCCTCCAAATTCTGCTGGCAATCTTCTTGGACTCTTTCCTAACTTAAATGCTTTAAGAAACTCCACCACCAGTAAAGAAACCACTATTGATGTCAATGCTGCATCTAACAACGTTGTTGCCGTTGAATTTGACACCTACCCTAACGACAATATTGGTGATCCAAGATACAAACACATTGGAATCGATGTCAACTCTATCAGGTCCAAGGCAACTGTTGCGTGGGACTGGCAAAATGGGAAAACAGCCACTGCACACATCAGCTATAACTCTGCCTCTAAAAGACTATCTGTTACTACTTTTTATCCTGGGGGTAAAGCTGTGAGTCTTTCCCATGACGTTGAGCTCACTCAAGTGCTTCCTCAATGGATTAGAGTAGGGTTCTCTGCTTCAACAGGATTAGAGAAA (SEQ ID NO：7)YamFril：推测的氨基酸序列AQSVSFTFTKFDSDQKDLMFQGHTISSSNVIQLTKLDSNGNPVSTSVGRVLYSAPLRLWESSTVVSTFETTFTFQISTPYTSPPGDGLAFFLAPYDTVIPPNSAGNLLGLFPNLNALRNSTTSKETTIDVNAASNNVVAVEFDTYPNDNIGDPRYKHIGIDVNSIRSKATVAWDWQNGKTATAHISYNSASKRLSVTTFYPGGKAVSLSHDVELTQVLPQWIRVGFSASTGLEK(SEQ ID NO：8)

Claims

1.一种祖细胞保护因子FRIL家族的一个或多个成员的基本纯的组成成分。

2.如权利要求1所述的组成成分，其特征在于，所述FRIL家族成员是来自豆科植物。

3.如权利要求2所述的组成成分，其特征在于，所述豆科植物是菜豆。

4.如权利要求2所述的组成成分，其特征在于，所述豆科植物是扁豆。

5.如权利要求2所述的组成成分，其特征在于，所述豆科植物是豆薯。

6.如权利要求1所述的组成成分，其特征在于，所述FRIL家族成员是衍生自FRIL家族的第二个成员的突变物，其中所述突变物选自取代突变物、缺失突变物、添加突变物或其组合。

7.如权利要求1所述的组成成分，其特征在于，所述FRIL家族成员是含有第一和第二部分的融合蛋白，其中所述第一部分衍生自FRIL家族的第二个成员。

8.一种编码权利要求1所述的组成成分的重组核酸。

9.一种含有权利要求1所述的组成成分和药物学上可接受的载体的药物制剂。

10.如权利要求9所述的制剂，其特征在于，在用具有造血祖细胞耗竭活性的治疗性处理治疗病人前，对病人施用有效量的该制剂可在病人体内缓解或减轻治疗处理的造血祖细胞耗竭活性。

11.如权利要求10所述的制剂，其特征在于，所述患者是人。

12.如权利要求11所述的制剂，其特征在于，所述病人患有癌症。

13.如权利要求12所述的制剂，其特征在于，所述治疗处理选自放疗、化疗或放疗和化疗的组合。

14.如权利要求13所述的制剂，其特征在于，所述化疗剂选自阿糖胞苷、阿霉素和5-氟尿苷。

15.一种在患者中缓解或减轻治疗处理的造血祖细胞耗竭活性的方法，其特征在于，该方法包括在对患者施用治疗处理前，对动物施用治疗有效量的FRIL家族成员的组成成分。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述患者是人。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述患者患有癌症。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述治疗处理选自放疗、化疗或放疗和化疗的组合。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述化疗剂选自阿糖胞苷、阿霉素和5-氟尿苷。

20.一种分离祖细胞群的方法，其特征在于，该方法包括使一群细胞与多种FRIL家族成员分子接触，并分离未结合细胞，其中与FRIL家族成员分子结合的细胞是已分离的祖细胞群。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述分离的祖细胞群是来自人类。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述FRIL家族成员分子是被可检测标记的。

23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述FRIL家族成员分子固定在固相载体上。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述固相载体是珠。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述珠是磁性的。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述未结合的细胞是通过对与固定在磁珠上的FRIL家族成员分子接触的细胞群使用磁铁。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，在使用磁铁的同时，用生理学上可接受的溶液漂洗与固定在磁珠上的FRIL家族成员分子结合的细胞群。

28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述固相载体是组织培养板的底部。

29.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述分离的祖细胞群是造血祖细胞群。

30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述细胞群选自全血、脐带血、骨髓细胞和胎肝细胞。

31.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述细胞群是一群经分选过的细胞，其中经分选过群中的细胞不表达选自CD11b、CD11c和CD38的细胞表面分子。

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述分选过的细胞群是用流式细胞计数或磁珠筛选分选的。

33.一群用权利要求20所述的方法分离的祖细胞。

34.如权利要求33所述的一群分离的祖细胞，其特征在于，该群分离的祖细胞来自人类。

35.如权利要求33所述的细胞，其特征在于，该群分离的祖细胞中的细胞不表达CD34。

36.如权利要求33所述的细胞，其特征在于，该群分离的祖细胞表达选自FLK1、FLT1、FLT3、FLT4和Kit的受体酪氨酸激酶。

37.如权利要求33所述的细胞，其特征在于，该群分离的祖细胞表达选自CD11b和CD11c的细胞表面分子。

38.如权利要求33所述的细胞，其特征在于，该群分离的祖细胞表达选自FLT3。

39.如权利要求33所述的分离的祖细胞群，其特征在于，所述分离的祖细胞群的细胞选自成血管细胞、间质干细胞、骨祖细胞、肝祖细胞、内皮祖细胞、造血祖细胞、胚性干细胞、脑祖细胞或树突状祖细胞。

40.如权利要求33所述的分离的祖细胞群，其特征在于，所述分离的祖细胞群的细胞是造血祖细胞。

41.如权利要求33所述的分离的祖细胞群，其特征在于，将分离的祖细胞群移植到缺乏足够使动物存活的造血祖细胞群的动物中，重建动物，其中被移植的动物存活。

42.一种体外保护祖细胞的方法，其特征在于，使一群含有至少一种祖细胞的细胞群与有效量的FRIL家族成员接触一段有效时间，其中使得该群中的祖细胞休眠。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述祖细胞来自人类。

44.如权利要求42所述的方法，其特征在于，该细胞群是骨髓细胞。

45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，该细胞群中的非祖细胞分化或死亡。

46.如权利要求42所述的方法，其特征在于，在用具有造血祖细胞耗竭活性的治疗处理治疗癌症病人前，从癌症病人中取出该细胞群。

47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述治疗处理选自放疗、化疗或放疗和化疗的组合。

48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述化疗剂选自阿糖胞苷、阿霉素和5-氟尿苷。

49.一种体内保护祖细胞的方法，其特征在于，对患者施用有效量的含FRIL家族成员的组成成分一段有效时间，其中使得患者中的祖细胞休眠。

50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，该患者是人类。

51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，该患者是癌症病人。

52.如权利要求50所述的方法，其特征在于，在用具有造血祖细胞耗竭活性的治疗处理治疗癌症病人前，施用有效量的FRIL家族成员的组成成分。

53.一种鉴定祖细胞的方法，其特征在于，使候选细胞与FRIL家族成员分子接触，其中通过候选细胞与FRIL家族成员分子的结合鉴定出作为祖细胞的候选细胞。

54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述候选细胞在一群细胞中。

55.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述候选细胞来自人类。

56.用权利要求53所述的方法鉴定的祖细胞。

57.一种鉴定祖细胞保护因子的FRIL家族成员的组成成分的方法，其特征在于，该方法包括使候选化合物和FLT3受体的糖基化胞外结构域接触，其中FLT3受体的胞外结构域的糖基化模式与正常糖基化的FLT3受体的胞外结构域的糖基化模式相同，其中与FLT3受体的糖基化胞外结构域结合的候选化合物被鉴定为FRIL家族成员的组成成分。

58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述候选化合物是植物凝血素。

59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述植物凝血素是合成的。

60.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述植物凝血素是来自豆科植物。

61.一种用权利要求58所述的方法鉴定出来的FRIL家族成员分子的基本纯的组成成分。