CN1289526C - 干细胞因子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了新的干细胞因子、编码这些因子的寡核苷酸，以及其生产方法。还公开了治疗与血细胞有关之功能失常的医药组合物和治疗方法。

Description

干细胞因子
本申请是申请日为1990年10月16日，申请号为90109647.4，发明名称为“干细胞因子”的发明专利申请的分案申请。
本发明总地涉及刺激包括早期造血祖细胞在内之原始祖细胞的新因子，以及编码这些因子的DNA顺序。具体地说，本发明涉及这些新因子、其片段和多肽类似物，以及编码它们的DNA顺序。
人类造血系统由各种白血细胞(包括中性细胞、巨噬细胞、嗜碱细胞、肥大细胞、嗜伊红细胞、T和B细胞)、红血细胞(红细胞)和血块形成细胞(巨核细胞、血小板)组成。
据信少量的某些造血生长因子可使少量“干细胞”分化或各种血细胞的先祖细胞，并使之大量增殖，最后由这些细胞系分化成成熟的血细胞。在正常情况下，造血再生系统可很好地完成其功能。但当受到化学治疗、放射线照射或患有先天性骨髓功能失调的压力时，病人就会发生严重的白细胞减少、贫血或血小板减少等病征。在这一危险期发展和使用造血生长因子即可加速骨髓再生。
在某些病毒诱发的紊乱中，如获得性自发免疫缺陷症(AIDS)，T细胞等血液成分可能受到特异地破坏。对于这些病例，治疗的目的在于增加T细胞的产生。
因为造血生长因子只以极小量存在，故须依靠一系列检测方法来检测和鉴定这些因子，目前只能在人为条件下根据对培养之细胞的刺激作用来区分不同的因子。
应用基因重组技术已使人们对个别生长因子的生物学活性有了更清楚的了解。例如，现已弄清了可刺激红细胞产生之促红细胞生成素(EPO)的氨基酸与DNA顺序(参见Lin，U.S.Patent 4,703,008，该专利列为本文参考文献)。也已利用重组方法分离出人粒细胞集落刺激因子即G-CSF(Souza，U.S.Patent 4,810,643，列为本文参考文献)和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)[Lee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 82，4360-4364(1985)；Wong et al.，Science， 228，810-814(1985)]、小鼠G和GM-CSF[Yokota et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 81，1070(1984)；Fung，et al.，Nature， 307，233(1984)；Gough，et al.，Nature，309，763(1984)]以及人巨噬细胞集落刺激因子(CSF-1)[Ka-wasaki，et al.，Science， 230，291(1985)]的cDNA。
已用高增殖性潜在集落生成细胞(HPP-CFC)分析系统试验了这些因子对早期造血先祖细胞的作用[Zont，J.Exp.Med.， 159，679-690(1984)]。该文献中有许多关于在HPP-CFC试验中有活性之因子的报告。表1中示出了这些因子的来源。下面讨论已明显定性的因子。
已将一种在人睥细胞条件培养基中有活性的物质定名为协同因子(SF)。有几种人组织和人及小鼠细胞系可产生称为SF-1的SF，其可与CSF-1协同作用刺激最早期的HPP-CFC。已报导了存在于由人脾细胞、人胎盘细胞、5637细胞(一种膀胱癌细胞系)、EMT-6细胞(一种小鼠乳腺癌细胞系)限制的培养基中的SF-1。已经确定了SF-1的特性。早期研究证明，白细胞介素-1与得自细胞系5637[Zsebo et al.，Blood， 71，962-968(1988)的SF-1有交叉活性。但另外的报告则证明联合使用白细胞介素-1(IL-1)和CSF-1，不能同使用CSF-1加部分纯化之5637条件培养基制剂一样刺激同种细胞集落的生成[Mc-Niece，Blood， 73，919(1989)]。
存在于妊娠小鼠子宫提取物内的协同因子是CSF-1。WEHI-3细胞(小鼠髓单核细胞白血病细胞系)产生一种似乎与IL-3完全相同的协同因子。CSF-1和IL-3均刺激比SF-1之靶细胞更为成熟的造血祖细胞。
已证明在TC-1细胞的条件培养基中存在另一类协同因子。该细胞系可产生能刺激早期髓样和淋巴样细胞型的因子。已将其定名为血淋巴组织生成性生长因子1(HLGF-1)。其表观分子量为120,000[McNiece et al.，Exp.Hematol.， 16，383(1988)]。
已根据其在HPP-CFC试验中具有活性而鉴定了已知之白细胞介素和CSF中的IL-1、IL-3及CSF-1。尚没有从结构上鉴定表1中所示协同活性的其他来源。基于对多肽顺序和生物学活性的分析结果，可知本发明所涉及的是一种不同于IL-1、IL-3、CSF-1和SF-1的分子。
表1
含有在HPP-CFC试验中有活性之因子的制剂
  来源1   参考文献
  人脾CM小鼠脾CM   [Kriegler，Blood， 66，503(1982)][Bradley，Exp.Hematol.Today Baum，ed.，285(1980)]
  来源1   参考文献
  大鼠脾CM小鼠肺CM人胎盘CM妊娠小鼠子宫GTC-C CMRH3 CMPHA PBLWEHI-3B CMEMT-6CML-Cell CM5637CMTC-1CM   [Bradley，supra，(1980)][Bradley，supra，(1980)][Kriegler，supra，(1982)][Bradley，supra，(1980)][Bradley，supra，(1980)][Bradley，supra，(1980)][Bradley，supra，(1980)][McNiece，Cell Biol.Int.Rep.， 6，243(1982)][McNiece，Exp.Hematol.， 15，854(1987)][Kriegler，Exp.Hematol.， 12，844(1984)][Stanley，Cell， 45，667(1986)][Song，Blood， 66，273(1985)]
1CM＝条件培养
当经胃肠道外途径给药时，蛋白质常常由循环中迅速清除，因此可引发相对短期的药理学活性。这样就需要多次注射相对大剂量的生物活性蛋白质，以维持治疗效果。已知与相应未修饰的蛋白质相比，蛋白质与聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二酵的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸等水溶性聚合物共价结合被修饰后，在血液内的半寿期明显延长[Abuchowski et al.，“Enzymes as Drug”，Holcenberg et al.，eds.Wiley-Inters-cience，New York，NY，367-383(1981)；Newmark et al.，J.Appl.Biochem. 4：185-189(1982)；Kattre et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 84，1487-1491(1987)]。这种修饰作用也可增加蛋白质在水溶液中的溶解度，消除分子聚集，提高蛋白质的物理和化学稳定性，大大降低蛋白质的免疫原性和抗原性。从而，与使用未经修饰的蛋白质相比，以较少次数和较低剂量使用这种聚合物-蛋白质加合物即可达到所期望的体内生物学活性。
因为聚乙二醇(PEG)在哺乳动物体内毒性很低，所以将PEG与蛋白质结合是特别适宜的[Carpenter et al.，Toxicol.Appl.Pharmacol.， 18，35-40(1971)]。例如，在美国已获准使用腺嘌呤脱氨酶的PEG加合物治疗人的严重联合兔疫缺陷综合症。结合PEG所带来的第二个优点是可以有效地降低异源蛋白质的免疫原性和抗原性。例如，可用人蛋白质的PEG加合物治疗其他种哺乳动物的疾病，而没有激发严重兔疫反应的危险。
PEG等聚合物可以共价连接到蛋白质分子中的一个或多个反应性氨基酸残基上，如氨基末端氨基酸的α氨基基团，赖氨酸侧链的ε-氨基基团、半胱氨酸侧链的巯基基团、天冬氨酰和谷氨酰侧链的羧基基团、羧基末端氨基酸的α羧基基团及酪氨酸侧链等，或者连接到与某些天冬酰胺、丝氨酸或苏氨酸残基相连之糖基链的活化衍生物上。
已描述了适合与蛋白质直接反应的许多活化形式的PEG。可与蛋白质氨基基团反应的适用PEG试剂包括羧酸的活性酯或碳酸酯衍生物，特别是那些其中离去基团为N-羟基琥珀酰亚胺、对位硝基苯酚、咪唑或1-羟基-2-硝基苯-4-磺酸酯的衍生物。含有马来酰亚胺基或卤乙酰基团的PEG衍生物是适于修饰无巯基基团之蛋白质的有用试剂。同样，含有氨基、肼或酰肼基团的PEG试剂则适合与蛋白质中碳水化合物基团经高碘酸氧化所产生的醛反应。
本发明的目的在于提供一种引起早期造血祖细胞生长的因子。
本发明提供了本文称为“干细胞因子”(SCF)的新因子，该因子具有刺激包括早期造血祖细胞在内之原始祖细胞生长的能力。这些SCF也能够刺激神经干细胞和原生殖干细胞等非造血干细胞。这样因子包括纯化的、天然存在的干细胞因子。本发明还涉及具有与天然存在之干细胞因子完全相同的氨基酸顺序的非天然多肽，从而使之具有天然干细胞因子的造血生物学活性。
本发明还提供了适于在原核和真核宿主细胞中表达多肽产物的离体DNA顺序，该多肽产物完全复制了天然存在之干细胞因子的氨基酸顺序，从面具有天然干细胞因子的造血生物学活性。这样的DNA顺序包括：
a)图14B、14C、15B、15C、42和44中列出的DNA顺序或其互补链；
b)可与(a)中限定之DNA顺序或其片段杂交的DNA顺序；以及
c)除非有遗传密码子的简并外，可与(a)和(b)中限定的DNA顺序杂交的DNA顺序。
本发明还提供了含有这些DNA顺序的载体、用这些载体转化或转染的宿主细胞。本发明也包括以重组技术生产SCF的方法，以及治疗疾病的方法。另外，也提供了包含SCF的医药组合物以及与SCF特异结合的抗体。
本发明还涉及由含SCF的材料中有效地回收干细胞因子的方法，该方法包括离子交换层析和/或反向液相层析分离步骤。
本发明还提供了可延长体内半寿期并提高在哺乳动物体内之效力的生物学活性加合物，其包括共价结合到聚乙二醇或聚乙二醇与聚丙二醇之共聚物等水溶性聚合物上的SCF，其中所说的聚合物是在一端未被烷基基团取代或被取代的。本发明的另一个方面是涉及制备上述加合物的方法，该方法包括使SCF与至少具有一个反应性末端基团的水溶性聚合物反应、纯化所得到的加合物，以产生延长了循环半寿期并提高了生物学活性的产物。
图1是纯化哺乳动物SCF的阴离子交换层析图谱。
图2是纯化哺乳动物SCF的凝胶过滤层析图谱。
图3是纯化哺乳动物SCF的麦胚凝集素-琼脂糖层析图谱。
图4是纯化哺乳动物SCF的阳离子交换层析图谱。
图5是纯化哺乳动物SCF的C4层析图谱。
图6显示图5中C4柱洗脱物的十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(SDS-pAGE)结果。
图7是哺乳动物SCF的分析性C4层析图谱。
图8显示图7中C4柱洗脱物的SDS-PAGE结果。
图9显示纯化的哺乳动物SCF和去糖基化哺乳动物SCF的SDS-pAGE。
图10是纯化之哺乳动物SCF的分析性C4层析图。
图11显示由蛋白质顺序测定得出的哺乳动物SCF的氨基酸顺序。
图12显示：A.大鼠SCFcDNA的寡核苷核；B.人SCFDNA的寡核苷酸C.通用的寡核苷酸。
图13显示：A.聚合酶链反应(PCR)扩增大鼠SCFcDNA的流程；B.PCR扩增人SCF cDNA的流程。
图14显示：A.测定大鼠基因组DNA顺序的程序；B.大鼠基因组DNA的核酸顺序；C.大鼠SCF cDNA的核酸顺序和大鼠SCF蛋白质的氨基酸顺序。
图15显示：A.测定人基因组DNA顺序的程序；B.人基因组DNA的核酸顺序；C.人SCF cDNA的复合核酸顺序及SCF蛋白质的氨基酸顺序。
图16显示一一对应排列的人、猴、狗、小鼠和大鼠SCF蛋白质的氨基酸顺序。
图17显示哺乳动物细胞表达载体V19.8SCF的结构。
图18显示哺乳动物CHO细胞表达载体pDSVE.1的结构。
图19显示大肠杆菌表达载体pCFM1156的结构。
图20显示：A.哺乳动物SCF的放射免疫分析结果；B.免疫沉淀之哺乳动物SCF的SDS-PAGE结果。
图21显示重组人SCF的Western印迹。
图22显示重组大鼠SCF的western印迹。
图23显示COS-1细胞产生的重组大鼠SCF对骨髓移植之影响的直方图。
图24显示重组大鼠SCF治疗Steel小鼠巨细胞性贫血的效果。
图25显示用重组大鼠SCF处理之Steel小鼠的外周血白血细胞计数(WBC)。
图26显示用重组大鼠SCF处理之Steel小鼠的血小板计数。
图27显示用重组大鼠SCF1-164PEG25处理之Steel小鼠的分化WBC计数。
图28显示用重组大鼠SCF1-164PEG25处理之Steel小鼠的淋巴细胞亚群。
图29显示重组人顺序SCF处理正常灵长目动物后提高外周血WBC计数的效果。
图30显示重组人顺序SCF处理正常灵长目动物后提高血细胞比容和血小板计数的效果。
图31显示下列图谱：A.用重组人SCF1-162刺激的人骨髓细胞集落；B.图31A所示集落中Wright-Giemsa染色的细胞。
图32显示图33中所示层析图之S-Sepharose柱洗脱物的SDS-PAGE：A.加还原剂；B.无还原剂。
图33是对大肠杆菌产生之重组人SCF所作S-Sepharose柱层析的层析图。
图34显示对图35所示层析图中C4柱洗脱物所作SDS-PAGE分析的结果：A.加还原剂；B.无还原剂。
图35是对大肠杆菌产生之重组人SCF所作C4柱层析的层析图。
图36是对CHO产生的重组大鼠SCF所作Q-Sepharose柱层析的层析图。
图37是CHO产生的重组大鼠SCF之C4柱层析的层析图。
图38显示对图37所示层析图中C4柱洗脱物所作SDS-PAGE分析的结果。
图39显示CHO产生的、纯化的重组大鼠SCF在去糖基化前后所作SDS-PAGE分析的结果。
图40所示：A.重组大鼠聚乙二醇化SCF1-164反应混合物的凝胶过滤层析图；B.未修饰的重组大鼠SCF1-164的凝胶过滤层析图。
图41显示结合到新鲜白血病母细胞上的标记的SCF。
图42显示得自HT1080纤维肉瘤细胞系的人SCF cDNA顺序。
图43显示表达人SCF1-248之COS-7细胞和表达人SCF1-164之CHO细胞的放射自显影图谱。
图44显示得自5637膀胱癌细胞系的人SCF cDNA顺序。
图45显示受放射线照射小鼠经SCF处理后提高了存活期。
图46显示受幅射小鼠在作5％股骨骨髓移植和SCF处理后提高了存活期。
图47显示在作0.1和20％股骨骨髓移殖及SCF处理后，提高了受幅射之小鼠的存活期。
下文以优选方案的形式给出了实践本发明的举例说明，本领域内技术人员将会从以下的详细描述中了解到本发明的许多方面及优点。
根据本发明，提供了新的干细胞因子以及编码这些SCF之全部或其部分顺序的DNA顺序。术语“干细胞因子”或“SCF”是指天然存在的SCF(如天然人SCF)及非天然存在的多肽(即与天然SCF不同者)，后者具有天然存在之干细胞因子的氨基酸顺序及该顺序的糖基化复制本，从而使之具有天然存在之干细胞因子的造血生物学活性。干细胞因子具有刺激早期造血祖细胞生长的能力，使之能够成熟为红细胞样细胞、巨核细胞、粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞。用SCF处理哺乳动物可使髓样和淋巴样谱系的造血细胞数绝对增加。于细胞的一个特征性标志是它们能够分化成髓样和淋巴样细胞[Weis-sman，Science，241，58-62(1988)]。用重组大鼠SCF处理Steel小鼠(实施例8B)可以增加粒细胞、单核细胞、红细胞、淋巴细胞及血小板数。用重组人SCF处理正常灵长目动物可增加髓样和淋巴样细胞数(实施例8C)。
在成黑素细胞、生殖细胞、造血细胞、脑和脊索细胞的迁移途径及固定部位中，有细胞对SCF的胚胎期表达。
早期造血祖细胞已富集在用5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的哺乳动物骨髓中。化学治疗药物(5-FU)可选择性地消耗后期造血祖细胞。SCF对5-FU处理后的骨髓具有活性。
SCF的生物活性和组织分布的型式说明了其在治疗各种干细胞缺失的胚胎发生和血生成，以及其容量中的重要作用。
本发明提供的DNA顺序包括：掺入适于经选择之非哺乳动物宿主表达的“优选的”密码子；规定限制性核酸内切酶的切割位点；提供便于构建易表达之载体的其他起始、终止或中间DNA顺序。本发明还提供编码SCF之多肽类似物或衍生物的DNA顺序，前者在一个或多个氨基酸的特性或定位上不同于天然存在者(即含有比指定之SCF有较少残基的缺失类似物；取代类似物，其中一个或多个指定的残基被其他残基取代；以及其中有一个或多个氨基酸残基被加到多肽之末端或中间部分上的加成类似物)，且其可共有天然存在形式的某些或全部特性。本发明特别提供了编码SCF之全长未加工氨基酸顺序的DNA顺序以及编码已加工形式者的DNA顺序。
本发明的新的DNA顺序包括用于在原核和真核宿主细胞中表达多肽产物的顺序，该多肽产物至少具有天然存在之SCF的一部分原始结构构象以及一种或多种生物学特性。本发明的DNA顺序具体地包括：(a)图14B、14C、15B、15C、42和44中列出的DNA顺序或其互补链；(b)与图14B、14C、15B、15C、42和44中所示DNA顺序或其片段杂交(在实施例3所述的杂交条件或更为严格的条件下)的DNA顺序；以及(c)除存在基因密码子的简并性的情况外，可与图14B、14C、15B、15C、42和44中所示DNA顺序杂交的DNA顺序。(b)和(c)部分中所具体包括的是编码SCF之等位基因变异形式和/或编码其他种哺乳动物SCF的基因组DNA顺序，以及人工制造的编码SCF、SCF片段和SCF类似物的DNA顺序。该DNA顺序可掺入利于微生物宿主中信使RNA转录和翻译的密码子。可按照Alton等人的方法(PCT已公开的专利申请WO83/04053)很容易地构建这种人造的顺序。
根据本发明的另一个方面，本文描述的编码有SCF活性之多肽的DNA顺序，还具有信息资料价值，其提供了迄今尚不能得到的哺乳动物蛋白质的氨基酸顺序。该DNA的价值还在于它可作为一种以种种重组技术大规模合成SCF的有用产品。换句话说，本发明提供的DNA顺序可用于产生新的和有用的病毒及环形质粒DNA载体、新的和有用的被转化或转染的原核和真核宿主细胞(包括培养生长的细菌、酵母细胞和哺乳动物细胞)，以及培养这些可表达SCF和其相关产物之宿主细胞的方法。
本发明的DNA顺序也是用作标记探针的合适材料，该探针可用来分离编码SCF的人基因组DNA和编码相关蛋白质的其他基因，以及分离其他种哺乳动物的cDNA和基因组DNA顺序。DNA顺序也可用于合成蛋白质(如在昆虫细胞内)的各种可替代的方法中，或用于人或其他哺乳动物的基因治疗。可望将本发明的DNA顺序用于产生新的转基因哺乳动物，以其作为大量生产SCF和SCF产品的真核“宿主”[总地参见Palmiter et al.，Science， 222，809-814(1983)]。
本发明提供了纯化的和分离的天然SCF(即具有与天然形式相同一级、二级和三级构象的纯化或人工产物，且糖基化特征亦与天然材料完全相同者)，以及具有天然干细胞因子之一级结构构象(即氨基酸残基的连续顺序)并完全复现了天然干细胞因子的糖基化作用，从而使之具有天然SCF之造血生物学活性的非天然多肽。这样的多肽包括衍生物及类似物。
在一优选方案中，对SCF的定性是经基因组或c-DNA克隆方法或基因合成方法得到外源DNA顺序，然后制取该顺序在原核或真核宿主内表达的产物(如由培养的细菌、酵母、较高等植物、昆虫及哺乳动物细胞中表达)，进而证实其存在。即是说，在一优选实施方案中SCF是“重组的SCF”。在典型酵母菌(如酿酒酵母)或原核细胞(如大肠杆菌)宿主中表达的产物是与任何哺乳动物蛋白质都没有关联的。而在脊椎动物[如非人类哺乳动物(如COS或CHO)和鸟类]细胞中表达的产物也与任何人蛋白质没有关联。根据使用的宿主不同，本发明的多肽是由哺乳动物或其他真核生物的碳水化合物糖基化的，或者是非糖基化的。可使用Lee等人所述的技术[J.Biol.Chem.， 264，13848(1989)]改换宿主细胞。本发明的多肽还可包括起始蛋氨酸残基(在位置-1处)。
除天然存在的SCF的等位基因形式外，本发明还包括其他SCF产物，如SCF的多肽类似物。所说的类似物包括SCF的片段。依照上述已公开的Alton等人的方法(WO 83/04053)，可以很容易地设计并制得编码适于微生物表达之多肽的基因，这样的多肽就其一个或多个残基的特性或定位来说，具有不同于本文指定之多肽的一级构象(如取代、末端和中间加入及缺失)。另外，可以用已知的位点特异性诱变技术很容易地对cDNA和基因组基因进行修饰，用以产生SCF的类似物和衍生物。这些产物至少有一种SCF的生物学性质，而在其他方面则有所不同。例如本发明产物包括经缺失而缩短的；或对水解作用更为稳定的(因此也可以比天然产物有延长的或持续更长时间的效果)；或业经改变而加入或缺失一个或多个潜在的O-糖基化和/或N-糖基化作用的位点；或者有一个或多个缺失的半胱氨酸残基或被丙氨酸、丝氨酸等残基所取代，并使之更易于以活性形式由微生物体系中分离出来；或者具有一个或多个被苯丙氨酸取代的酪氨酸残基，从而能较为容易地结合到靶蛋白质或靶细胞的受体上。本发明还包括只重复SCF内一部分连续氨基酸顺序或二级构象的多肽片段，该片段可具有SCF的一种特性(如受体结合)而没有其他特性(如早期造血细胞生长活性)。值得注意的是，对于本发明的一种或多种产物来说，在用于治疗[见Weiland et al.，Blut， 44，173-175(1982)]或其他目的(如在SCF拮抗作用的检测中)时，有的活性并不是必不可少的。竞争性拮抗物是非常有用的，例如在过量产生SCF的情况下，或者在人白血病病例中恶性细胞过度表达SCF受体时(如实施例13所述白血病母细胞中可过度表达SCF受体)。
本发明的多肽类似物的适用性是具有报导中所说的合成肽的免疫学特性，该合成肽基本上复制了天然蛋白质、糖蛋白和核蛋白的氨基酸顺序。更具体地说，已证明有相对低分子量的多肽可参予在持续时间和程度上与生理学上有意义的蛋白质(如病毒抗原、多肽激素等)所引起之免疫反应相似的反应。这些多肽参予的免疫反应包括诱发免疫学活性动物体内特异抗体的生成[Lerner et al.，Cell， 23，309-310(1981)；Ross et al.，Nature， 294，654-656(1981)；Walteret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77，5197-5200(1980)；Lerner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78，3403-3407(1981)；Walter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 78，4882-4886(1981)；Wong et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 79，5322-5326(1982)；Baron et al.，Cell， 28，395-404(1982)；Dressmanet al.，Nature， 295，185-160(1982)；Lerner，Scientific Ame-rican， 248，66-74(1983)]。另外，Kaiser等人[Science， 223，249-255(1984)]述及合成多肽的生物学和免疫学性质，提到其具有肽激素的二级结构，而没有它们的一级结构构象。
本发明还包括一类由互补于人cDNA或SCF基因组DNA顺序的一部分DNA编码的多肽，即Tramontano等人所述的“互补性倒转蛋白质”(″complementary inverted proteins″Nucleic AcidRes.，12，5049-5059(1984))。
本发明的代表性SCF多肽包括但不仅限于图15C中所示的SCF1-148、SCF1-162、SCF1-164、SCF1-165、和SCF1-183；图42中所示的SCF185、SCF1-188、SCF1-189和SCF1-248；以及图44中所示的SCF1-157、SCF1-160、SCF1-161和SCF1-220。
可使用本领域内已知的技术纯化SCF。本发明的目的包括由条件培养基或人尿、血清等含SCF的材料中纯化SCF的方法，该方法包括下述的一个或多个步骤：对含SCF的材料进行离子交换层析(包括阳离子或阴离子交换层析)，对含SCF的材料进行反向液相层析(如使用固相化C4或C5树脂)、对液体材料进行固相化凝集素层析(即将SCF结合到固相凝集素上，并使用可竞争这种结合的糖进行洗脱)。有关这些方法的详细描述可参见涉及SCF纯化方法的实施例1、10和11。也可用Lai等人的美国专利4,667,016实施例2中所述的技术纯化干细胞因子。
可使用标准技术，如美国系列申请号421,444(共同申请人、题目为促红细胞生成素异构型，申请日1989年10月13日，已列为本文参考文献)中所述的技术分离异构型SCF。
本发明还包括用于作SCF治疗的医药组合物，该组合物包含治疗有效量的本发明的多肽产物，以及适当的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这里所说的“治疗有效量”是指在一定条件和给药途径下，足以产生治疗效量的用药量。该组合物可以是液体或冻干品或干燥制剂，且包含有不同缓冲液成分(如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释剂、防止吸附于表面上的白蛋白或明胶等添加剂、去污剂(如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆酸盐)、增溶剂(如甘油、聚乙二醇)、抗氧剂(如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(如乙基汞硫代水杨酸钠、苯甲醇、parabens)、填充剂或张力校正剂(如乳糖、甘露糖)、且包括聚乙二醇等聚合物与蛋白质的共价结合(以下实施例12所述)、与金属的络合、或活性材料掺入到多聚化合物(如聚乳酸、聚羟基乙酸、水凝胶等)中或其颗粒制剂的表面上，或掺入脂质体、微乳剂、胶粒、单片层或多片层囊泡、血影细胞或原生质球中。这样的组合物将影响到SCF的物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率以及体内清除速率。对组合物的选择将依据于有SCF活性之蛋白质的物理和化学性质。例如，由膜结合形式之SCF制得的产品可要求使用含去污剂的配方。控制或维持释放的组合物应有亲脂性包裹物(如脂肪酸、蜡、油)。本发明还包括用聚合物(如polo-xamers或poloxamines)和SCF包层的颗粒组合物，其中SCF是与抗组织特异性受体的抗体配基或抗原偶联的，或与组织特异性受体的配基偶联的。有关本发明组合物的其他实施例涉及适于非胃肠道、肺、鼻和口腔等不同给药途径的颗粒形式、保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂等。
本发明还包括含一种或多种其他造血因子的组合物，这些附加因子包括EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IGF-1或LIF(白血病抑制因子)。
本发明的多肽可以是通过与可检测的标记物质结合而“被标记的”(如用125I放射标记的或生物素化的)，以提供用于检测或定量分析固体组织及血液或尿液样品中之SCF或其细胞受体的试剂。
生物素化的SCF可与固相化链霉抗生物素蛋白(streptavidin)合用，用以清除自体骨髓移植之骨髓中的白血病母细胞。生物素化的SCF还可与固相化链霉抗生物素蛋白合用，以在自体或异体骨髓移植中富集自体或异源于细胞。SCF的毒素结合物，如与蓖麻蛋白[Uhr，Prog.Clin，Biol.Res.， 288，403-412(1989)]、白喉内毒素[Moolten，J.Natl.Con.Inst.， 55，473-477(1975)]及放射性同位素的结合物可直接用于抗肿瘤治疗(实施例13)或作为骨髓移植的条件摄生剂。
当用可检测的标记物(如放射性标记和非同位素标记如生物素)标记后，本发明的核酸产物可用于杂交过程中，用以确定SCF基因或任何相关基因家族在染色体图中的位置。它们也可用于在基因水平上鉴定人SCF基因紊乱，并可作为基因标记物用于鉴定相邻基因及其紊乱。人SCF基因位于第12对染色体上，鼠SCF基因则位于第10对染色体的S1位点上。
单独使用SCF或SCF与其他治疗结合使用，可有效地治疗多种造血功能紊乱。单独使用SCF或结合使用一种或多种附加造血因子，如EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IGF-I或LIF，可用于治疗造血功能系乱。
可用SCF治疗一系列因毒性、辐射或免疫损伤造成的特征在于功能性骨髓细胞亚群数目减少的干细胞功能异常。再生障碍性贫血也是一种干细胞功能失调症，其表现为造血组织被脂肪所代替以及各类血细胞减少。SCF可增加造血细胞数，故可有效地治疗再生障碍性贫血(实施例8B)。可用Steel小鼠作为人再生障碍性贫血的模型[Jones，Exp.Hematol. 11，571-580，(1983)]。在治疗再生障碍性贫血中，利用相关的细胞激活素、GM-CSF已获得了理想的效果[Antin，et al.，Blood， 70，129a(1987)]。阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)是一种以形成有缺陷的血小板和粒细胞及异常红细胞为特征的干细胞功能失调症。
可用SCF治疗许多疾病。这些疾病包括脊髓纤维化症、脊髓硬化症、骨硬化症、转移性癌、急性白血病、复合性骨髓瘤、何杰金氏病、淋巴瘤、Gaucher氏病、尼曼氏病、累-塞二氏病、顽固性低色贫血、Di Guglielmo综合症、黑热病、结节病、原发性脾各类血细胞减少、粟粒性结核、暴发性败血症、播散性真菌病、疟疾、VB12和叶酸缺乏症、VB6缺乏症、先天再生障碍性贫血、高色素生成性疾病如花斑症和白瘢风。实施例8B和8C中举例说明了SCF对类红细胞、巨核细胞和粒细胞的刺激作用。
SCF可促进原始生殖细胞、神经脊衍生的黑素细胞、后脊素产生的连合轴突、消化道滤泡细胞、中肾和后肾小管以及嗅球的生长，当这些部位出现特异性组织损伤时是特别有用的。SCF可用于治疗神经损伤，并且是神经细胞的生长因子。SCF可用于体外受精过程或治疗不育症。SCF还可用于治疗因放射治疗或化疗引起的肠道损伤。
可用SCF、抗SCF抗体或SCF-毒素结合物治疗干细胞骨髓增殖性疾病，如真性红细胞增多、慢性髓细胞白血病、特发性骨髓外髓细胞化生、原发性血小板减少及急性白血病。
有许多病例记载造血细胞生长因子G-CSF、GM-CSF和IL-3促进了白血病细胞的增殖[Delwel et al.，Blood， 72，1944-1949(1988)]。因为许多化学治疗药物的成功取决于恶性细胞生活周期比正常细胞更活跃这一事实，所以单用SCF或结合其他因子使用，可以作为恶性细胞的生长因子，使之对化学治疗药物更为敏感。实施例13中即显示了白血病母细胞上可过度表达SCF受体。
目前正在研究许多重组造血因子提高因化学或放射治疗所造成的白细胞降低的能力问题。尽管这些因子在这方面是很有用的，但也存在着受到损伤的早期造血间隔期(特别是因辐射引起的)，因此必须在这些较晚作用的生长因子能发挥其最适作用之前使之再次增殖。单独使用SCF或与这些因子联合使用可进一步减少或消除因化疗或放射治疗引起的白细胞与血小板的降低。此外，SCF可使病人耐受更强力的抗肿瘤或放射治疗(实施例19)。
在同源、同种或自体骨髓移植中，可使用SCF增加造血祖细胞。已表明使用造血生长因子可以减少骨髓移植后嗜中性细胞数恢复的时间[Donahue et al.，Nature， 321，872-875(1986)；Welte et al.J.Exp.Med.， 165，941-948(1987)]。对于骨髓移植，可单独或联合使用以下三种方案：在抽骨髓或外周血白色体形成之前单用SCF或联合使用其他造血因子处理供体；移植前于体外处理骨髓，以活化或扩增细胞数；最后，可处理接受体以提高供体骨髓的植入量。
可基于转染(或用反录病毒感染)造血干细胞，用SCF提高基因治疗的效能。SCF可以促进被转染之早期造血祖细胞的生长和增殖。可单用SCF或联合使用IL-6、IL-3(或这两者)处理培养物。一旦被转染后，即可将这些骨髓移植物中的细胞输入有遗传疾病的病人体内[Lim，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 86，8892-8896(1989)]。可用于治疗遗传病的基因包括腺嘌呤脱氨酶、葡糖脑苷脂酶、血红蛋白及囊性纤维变性基因。
SCF可单独或联合其他因子如IL-7用于治疗获得性免疫缺陷症(AIDS)或严重的联合免疫缺陷状态(SCID)(实施例14)。这种作用的例证在于SCF治疗可以提高循环T辅助细胞CD4+，OKT4 +)的绝对水平。这些细胞是导致爱滋病病人免疫缺陷之人兔疫缺陷病毒(HIV)的主要靶细胞[Montagnier，″Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus″，ed.R.C.Gallo，ColdSpring Harbor，New York，369-379(1984)]。此外，SCF可用于对抗AZT等抗HIV药物的骨髓抑制作用[Gogu，Life Sciences， 45，No.4(1989)]。
急性失血后可用SCF加速造血功能的恢复。
用SCF作体内治疗，可加强免疫系统抗肿瘤能力。Rosenberg等人(N.Eng.J.Med.， 313，1485(1987)]描述了用最近克隆的细胞激活素(IL-2)直接增强免疫功能，即是这种治疗实用性的一个例子。
SCF与一种或多种其他造血因子合用时，可间隔短时间分开给药或一同给药。在用SCF治疗前，先扩增祖细胞群体，而后者可以对终末起作用的造血因子(如G＝CSF或EPO)起反应。给药途径可以是静脉内、腹腔内、皮下或肌肉内。
本发明还涉及与干细胞因子特异结合的抗体。下文实施例7描述了生产多克隆抗体的方法。本发明进一步的实施方案涉及与SCF特异结合的单克隆抗体(见实施例20)。与常用的(多克隆)抗体制剂(其典型地包括针对不同抗原决定基的不同抗体)相反，、每种单克隆抗体都是针对抗原上单一决定基的。单克隆抗体可用于改善借助抗原-抗体结合之诊断和分析方法的选择性和特异性。另外，还可用于中和或从血清中除去SCF。单克隆抗体的第二个优点是它们可由培养的杂交瘤细胞合成，而没有其他免疫球蛋白污染。可从培养的杂交瘤细胞或腹腔内注射了杂交瘤的小鼠腹水液中制取单克隆抗体。最初由Kohler和Milstein[Eur.J.Immunol. 6，511-519(1976)]描述的杂交瘤技术业已广泛用于产生能高水平分泌抗许多特异抗原之单克隆抗体的杂交细胞系。
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不构成对本发明范围的限制。
                          实施例1
由Buffalo大鼠肝细胞条件培养基中
纯化/鉴定干细胞因子
A.体外生物学试验
1.HPP-CFC试验
天然哺乳动物大鼠SCF和重组大鼠SCF蛋白质具有多种不同的生物学活性。活性之一是其对早期造血细胞的影响。可用高增殖性潜在集落形成细胞(HPP-CFC)检测法检测到这种活性[Zsebo，et al.，supra(1988)]、为了研究这些因子对早期造血细胞的影响，HPP-CFC检测系统中须使用从5-氟尿嘧啶(5-FU)处理后2天的动物体内得到的小鼠骨髓细胞。化疗药物5-FU可选择性地杀灭晚期造血祖细胞，因而检测早期祖细胞及作用于这些细胞的因子。在CSF-1或IL-6存在下将大鼠SCF接种到半固体培养物中。该琼脂培养物含有McCoys完全培养基(GIBCO)、20％胎牛血清、0.3％琼脂和2×105个骨髓细胞/ml。McCoys完全培养基含有下列成分：1×McCoys培养基中添加0.1mM丙酮酸盐、0.24×必需氨基酸、0.24×非必需氨基酸、0.027％碳酸氢钠、0.25×维生素、0.72mM甘氨酰胺、25μg/ml L-丝氨酸和12μg/ml L-天冬酰胺。骨髓细胞得自静脉注射了150mg/Kg 5-FU的Balb/c小鼠。用5-FU处理后2天收获小鼠股骨冲洗出骨髓。铺板前用红细胞溶解剂(BectonDickeson)溶解红细胞。将含上述混合物的试验物质铺敷在30mm平皿中。14天后刮下含数千个细胞的集落(直径大于1mm)。该检测法用于天然哺乳动物细胞产生之大鼠SCF的整个纯化过程。
在一典型试验中，大鼠SCF引起所铺敷的每200,000个细胞约有50个HPP-CFC增殖。大鼠对5-FU处理的小鼠骨髓细胞有协同增效活性；该检测中，如只存在单一因子而没有合用SCF和CSF-1或SCF和IL-6(有活性)则将不形成HPP-CFC集落。
2.MC/9检测法
天然产生的和重组的大鼠SCF的另一个有用的活性是能够引起IL-4依赖性小鼠肥大细胞系MC/9(ATCC CRL8306)的增殖。按照ATCC CRL8306法将MC/9细胞与一种IL-4源一起培养。该生物检测法中使用的培养基是RPMI-1640.4％胎牛血清、5×10-5M 2-巯基乙醇和1×谷氨酰胺-Pen-strep。不需加另外的生长因子，MC/9细胞即可对SCF有增殖反应。检测这种增殖的方法是，首先在没有生长因子的条件下将细胞培养24小时，在含试验样品之96小井培养板各小井内加5000个细胞培养48小时，用0.5μCi3H-胸苷(比放射活性为20Ci/mmol)脉冲处理4小时，将细胞收获到玻璃纤维滤膜上，然后测定特异结合的放射活性。在本实施例C2部分所述的ACA54凝胶过滤步骤之后，用该方法检测哺乳动物细胞衍生之大鼠SCF的纯化过程。一般说来，SCF可使cpm数超出本底4-10倍。
3.CFU-GM
已经确定了在没有干扰集落刺激因子(CSF)的情况下纯化的天然和重组哺乳动物SCF对正常未耗尽之小鼠骨髓细胞的作用。用GFU-GM检测法[Broxmeyer et al.，Exp.Hematol.， 5，87(1977)]估测SCF对正常骨髓的影响。简单地说，在溶解红血细胞后将整个骨髓细胞铺敷在含有试验物质的半固态琼脂培养基上。10天后记录含多于40个细胞簇的集落。可将琼脂培养物置于玻片上干燥、经特殊组织学染色确定细胞的形态学。
对于正常小鼠骨髓，纯化的哺乳动物大鼠SCF是一种多潜能CSF，其可在无需加其他因子的情况下刺激含成熟细胞、中性白细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞及巨核细胞之集落的生长。在铺敷的200,000个细胞中，有100多个细胞集落生长了10天以上。大鼠及人重组SCF与EPO合用可刺激红细胞样细胞的产生(见实施例9)。
B.条件培养基
将得自美国典型培养物保藏中心的Buffalo大鼠肝(BRL)3A细胞(ATCC CRL 1442)培养在20升灌注培养系统内的微载体上，以产生SCF。除用滤网固定微载体和充氧管路外，该系统还使用一个Biolafitte发酵器(ICC-20型)。通过一个阻隔阀和计算机控制的泵系统，定时反向冲洗，以保持75微米筛网不被微载体阻塞。每个筛网都可起到培养基供入和收集网的作用。这种振荡流动方式可确保筛网不被阻塞。通过一个装有硅酮管(长50英尺、内径0.25英时，壁厚0.03英时)的螺旋管提供氧合作用。用于培养BRL 3A细胞的生长培养基是最低基本培养基(含Earle氏盐)(GIBCO)、2mM谷氨酰胺、3g/L葡萄糖、磷酸胰蛋白胨(2.95g/L)、5％胎牛血清和5％小牛血清。除没有血清外，收获培养基与之相同。用生长于旋转瓶内并经胰酶消化除去的3×109个BRL 3A细胞接种含Cytodex2微载体(Pharmacia，浓度为5g/L)的反应器。使细胞附着子微载体上并在其上生长8天。必要时可根据葡萄糖消耗情况通过反应器输注生长培养基。葡萄糖浓度维持在大约1.5g/L。8天后，向反应器内输注6倍体积的无血清培养基以去除大部分血清(蛋白浓度＜50μg/ml)。反应器分批工作直到葡萄糖浓度降到2g/L以下。此后，使反应器以大约10升/天的连续输注速率工作。通过调整CO2流速将培养物的pH维持在6.9±0.3。必要时通过补充纯氧使溶解氧维持在20％以上。温度维持在37±0.5℃。
由上述系统中产生大约336升无血清条件培养基，用作纯化天然哺乳动物细胞衍生之大鼠SCF的起始材料。
C.纯化
除特别说明者外，所有纯化工作均在4℃下进行。
1.DEAE-纤维素阴离子交换层析
通过0.45μSartocapsules(Sartorius)过滤，澄清元血清培养BRL 3A细胞所产生的条件培养基。以相似方法，对不同批量的培养基(41升、27升、39升、30.2升、37.5升和161升)分别进行浓缩、渗滤/缓冲液交换和DEAE-纤维素阴离子交换层析。然后合并DEAE纤维素收集物，并在本实施例C2-5部分中作为一批作进一步加工。为举例说明，按下述方法处理41升这一批：使用有4个截留分子量为10,000之聚砜膜盒的Millipore Pellicon正切流动式超滤装置(总膜面积20ft2、泵速～1095ml/min，过滤速度250-315ml/min)将条件培养基浓缩到大约700ml。然后向浓缩物内加入500m 150mM Tris-HCl(pH7.8)、使用正切流动式超滤装置重新浓缩到500ml，并将此处理过程重复6次来完成渗滤/缓冲液交换，以准备阴离子交换层析。最后使浓缩/渗滤的制剂恢复到700ml。将制剂加到已用50mM Tris-HCl(pH7.8)缓冲液平衡的DEAE纤维素阴离子交换柱(5×20.4cm；Whatman DE-52树脂)上。加样后，用2050ml Tris-HCl缓冲液洗柱，并应用盐梯度[0-300mM NaCl(在Tris-HCl缓冲液中)；总体积4升]，以167ml/小时的流速，每管收集15ml。层析结果如图1所示。HPP-CFC集落数代表HPP-CEC试验中呈现的生物学活性；对各管分别取10.0μ作检测分析。图中没有显示加样和洗柱期间收集的洗脱部分，这些部分中未检测出生物学活性。
受到浓缩、渗滤/缓冲液交换和阴离子交换层析的各批条件培养基的行为均相似。以牛血清白蛋白作标准品，用Bradford方法[Anal.Biochem. 72，248-254(1976)]测得各批制剂的蛋白质浓度范围为30-50μg/ml。用于该制备过程之条件培养基的总体积约为336升。
2.ACA54凝胶过滤层析
合并按上述方法对六批条件培养基作DEAE纤维素柱层析得到的有生物学活性部分(如图1所示第87-114管)，并用Amicon搅拌槽和YM10超滤膜将其浓缩到终体积74ml。将该材料加到用50mM Tris-HCl、50mM NaCl(pH7.4)平衡过的ACA54(LKB)凝胶过滤柱上(图2)。以70ml/小时的流速洗脱并以14ml为一管收集。由于抑制因子与活性部分一同被洗脱，故活性峰(HPP-CEC集落数)出现分离现象；但根据先前的层析图，活性成份是与主蛋白峰共洗脱的，因此可得到一份活性部分的集合物。
3.麦胚凝集素-琼脂糖层析
合并由ACA54凝胶过滤柱洗脱的第70-112管(500ml)。将其分成两等份，每份均使用在20mM Tris-HCl、500mM NaCl(pH7.5)中平衡过的麦胚凝集素-琼脂糖柱(5×24.5cm；树脂得自E-Y Laboratories，San Mateo，CA；麦胚凝集素可识别某些碳水化合物结构)进行层析。上样后，用约2200ml柱缓冲液洗柱，然后加入350mM溶于柱缓冲液中的350mMN-乙酰-D-葡糖胺溶液，由图3所示约第210管开始洗脱结合的材料。以122ml/小时的流速洗脱并以每管l3.25ml收集之。图3中显示其中一份的层析情况。将检测部分对磷酸盐缓冲盐水透析；取5μl经过透析的材料作MC/9检测(cpm值如图3所示)，10μl作HPP-CFC检测(集落数如图3所示)。从中可以看出，活性材料被结合到柱上且可用N-乙酰-D-葡糖胺洗脱，而上样和洗柱期间大部分污染材料已通过了层析柱。
4.S-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析
合并图3所示得自麦胚凝集素-琼脂糖层析的第211-225管和得自第二次层析的同等部分(375ml)，并对25mM甲酸钠(pH4.2)透析。为使接触低pH的时间减小到最大限度，透析过程要对5升缓冲液进行8小时以上，且此期间换4次透析液。在此透析过程结束时，样品体积为480ml，样品的pH和导电率接近于透析缓冲液的pH和导电率。透析期间样品中出现了沉淀的材料。离心(22,000g，30分钟)除去沉淀物，并将上清液加到预先用甲酸钠缓冲液平衡的S-Sepharose Fast Flow阳离子交换柱(3.3×10.25cm；树脂购自pharmacia公司)上。流速465ml/小时；每管收集14.2ml。上样后，用240ml柱缓冲液洗柱，并提供0-750mM NaCl梯度(NaCl溶于缓冲液中，总梯度体积为2,200ml)，由图4所示约第45管开始洗脱结合的材料。图4中给出了洗脱曲线。加入200μl 0.97M Tris碱，将收集的部分调到pH7-7.4。图4中的cpm数还是指示MC/9生物学检测的结果；所指出的部分对磷酸盐缓冲盐水透析，并取20μl进行分析。从图4中可以看出，大部分生物活性材料通过了柱(未结合)；而大部分污染材料则在盐梯度中被洗脱(已结合)。
5.使用硅结合之碳氢化合物树脂的层析
合并图4所示由S-Sepharose柱洗脱的第4-40管(540ml)。450ml集合物与等体积缓冲液B(100mM乙酸铵(pH6)∶异丙醇＝25∶75)混合并以540ml/小时的流速加于用缓冲液A(60mM乙酸铵(pH6)∶异丙醇＝62.5∶37.5)平衡过的C4柱(Vydac Proteins C4；2.4×2cm)上。上样后，使流速降至154ml/小时，并用200ml缓冲液A洗柱。施加缓冲液A到缓冲液B的线性梯度(总体积140ml)并以每管9.1ml收集。将经S-Sephrose层析得到的合并部分、C4柱起始样品、过柱合并收集物、以及洗柱合并物均经加入适当体积的1mg/ml储备液使之达到含40μg/ml牛血清白蛋白，然后对磷酸盐缓冲盐水透析，得到用于生物学检测的制剂。同样，将40ul等分的梯度洗脱物与360μl含16μg牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水混合，然后对磷酸盐缓冲盐水透析以备作生物学检测。用MC/9检测法检测各部分的生物学活性(6.3μl等分的制备的梯度洗脱部分；cpm数示于图5中)。检测结果还表明，回收的活性中有大约75％在过柱和洗柱部分中，而25％则在梯度洗脱部分中(见图5)。图6中显示了各部分等分样品的SDS-PAGE[Laemmli，Nature，227，580-685(1970)；堆积胶含4％(W/V)丙烯酰胺；分离胶含12.5％(W/V)丙烯酰胺]。对于所述凝胶来说，等分样品在加入凝胶上之前均于真空下干燥，然后用20μl样品处理缓冲液(未还原，即没有2-巯基乙醇)重新溶解并煮沸5分钟。泳道A和B分别代表柱起始材料(890ml中取75μl)和过柱洗脱物(880ml中取75μl)；图中左测的数码标记代表分子量(Mr)为所示数据103倍之标记物的迁移位置(还原的)其中标记物是磷酸化酶b(Mr为97,000)、牛血清白蛋白(Mr为66,200)、卵白蛋白(Mr为42,700)、碳酸酐酶(Mr为31,000)、大豆胰蛋白酶抑制物(Mr为21,500)以及溶菌酶(Mr为14,400)；泳道4-9代表梯度洗脱时收集的相应部分(9.1ml中取60μl)。对凝胶进行银染色[Morrissey，Anal.Biochem.， 117，307-310(1981)]。比较泳道A和B可以看出，大部分可染色的材料均通过了柱。正好位在Mr 31,000分子量标准品之上和下方的第4-6管中的被染色材料与在梯度洗脱部分中测知的生物学活性相符，且代表了生物学活性材料。应注意的是，该材料可在泳道4-6中看到，但在泳道A和/或B中则没有看到，这是因为前者上样量占了总体积的较大部分(4-6泳道占0.66％，而泳道A和B仅占0.0084％)。合并由该柱上洗脱的第4-6管。
如上所述，约有75％被回收的活性物质通过了图5的C4柱。基本上按上述方法，使用C4树脂再次层析分离该材料，不同的是使用的柱子较大(1.4×7.8cm)，且流速较慢(50-60ml/小时)。回收的活性中约50％在通过柱子的样品中，且有50％在梯度洗脱物中，其在SDS-PAGE上的表现与图6中的活性梯度洗脱部分相似。合并各活性部分(29ml)。
基本上按上述方法进行分析性C4柱层析，并以两种生物检测法分析之。如图7所指出的由该分析性层析柱上洗脱的各管，其MC/9和HPP-CFC生物活性是共洗脱的。SDS-PAGE分析(图8)显示，在显示有两种生物学活性的柱洗脱部分中存在分子量约31,000的蛋白质。
已用C4柱层析法纯化了见于S-Sepharose层析之第二个(相对小的)活性峰中的活性材料(如图4所示之第62-72管，即盐梯度早期洗脱的部分)。其在SDS-PAGE上与过S-Sepharose柱后又经C4柱层析所得到的材料有相同的行为，并且有同样的N末端氨基酸顺序(见实施例2D)。
6.对纯化的总结
表2中给出了上面1-5中所述纯化步骤的总结。
表2
哺乳动物SCF纯化法概述
  步骤   体积(ml)   总蛋白(mg)5
  条件培养基DEAE纤维素1ACA-54麦胚凝集素-琼脂糖2S-SepharoseC4树脂3   335,7002,900550375540457.3   13,4752,1641,513413100.25-0.406
1.所给出的值代表文中所述不同批量之值的总和。
2.如该实施例中所述，经离心法除去S-Sepharose层析制备中透析该样品时出现的沉淀材料。离心后(480ml)样品含264mg总蛋白。
3.合并按上述顺序作两次C4柱层析后得到的活性梯度洗脱部分。
4.下一步骤只使用450ml这种材料(该实施例见上述)。
5.除另外指出之外，均用Bradford方法(supra，1976)测定。
6.估计值，基于SDS-PAGE后银染色的强度，以及实施例2的K部分中所述的氨基酸组成分析。
D.SDS-PAGE和糖苷酶处理
图9中显示了对两次大量C4柱层析后得到的集合之梯度洗脱物所作SDS-PAGE分析的结果。
取第一次C4柱洗脱集合物中的60μl上样(泳道1)，并取第二次C4柱洗脱集合物中的40μl上样(泳道2)。这些凝胶均进行银染色。分子量标志物同图6所示。如上所述，在Mr 31,000标志物位置上下分散迁移的材料代表了生物学活性材料；表现异质性在很大程度上是由于糖基化作用的异质性。
为了证明糖基化作用的特征，用125I标记纯化的材料，用各种糖苷酶处理，并以放射自显影术经SDS-PAGE法(还原条件)分析之。结果示于图9中。泳道3和9为未经糖苷酶处理之125I标记的材料，泳道4-8代表用糖苷酶处理之125I标记的材料(见下述)。泳道4，神经氨酸苷酶；泳道5，神经氨酸苷酶和O-聚糖酶；泳道6，N-聚糖酶；泳道7，神经氨酸苷酶和N-聚糖酶；泳道8，神经氨酸苷酶、O-聚糖酶和N-聚糖酶。条件是在5mM 3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸酯(CHAPS)、33mM α-巯基乙醇、10mM Tris-HCl(pH7-7.2)中，37℃下3小时。所用种经氨酸苷酶(来源于 Arthrobacter  Ureafaciens；Calbiochem)终浓度为0.23单位/ml。O-聚糖酶(Genzyme；内-α-N-乙酰基-氨基半乳糖苷酶)为45毫单位/ml。N-聚糖酶(Genzyme；肽：N-糖苷酶F；肽-N4[N-乙酰基-β-葡糖胺基]天冬酰胺酰胺酶)为10单位/ml。
用糖苷酶处理未标记的纯化SCF，并在SDS-PAGE后经银染色对产物作观察，可得到与图9所示者相似的结果。
必要时可作各种对照保温。这些包括：在适当但没有糖苷酶的缓冲液中保温，以证明结果是否因加入糖苷酶制剂所致；加已知为糖苷酶底物的糖基化蛋白质(如糖基化重组人促红细胞生成素)保温，以证明所用糖苷酶是否有活性；以及加糖苷酶但不加底物保温，以证明糖苷酶本身并未产生可见的凝胶带或使该谱带模糊不清。
也可用内-β-N-乙酰葡糖酰胺酶F(endo F；NEN Dupont)及用内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶H(endo H；NEN Bupont)，再加适当的对照保温完成糖苷酶处理。内endo F处理的条件是：在1％(W/V)SDS、100mM 2-巯基乙醇、100mM EDTA、320mM磷酸钠(pH6)存在下煮沸3分钟，然后用Nonidet P-40(终浓度1.17％，V/V)、磷酸钠(终浓度200mM)和endo F(终浓度7单位/ml)的混合液作3倍稀释。endo H处理的条件与之相似，不同的是所用SDS浓度为0.5％(W/V)，endo H浓度为1μg/ml。用endo F处理的结果与用N聚糖酶处理结果相同，而endo H对纯化的SCF无影响。
由上述糖苷酶处理实验可以得出多个结论。用N-聚糖酶[其可除去复合物及高甘露糖N-连接的碳水化合物(Tarentino et al.，Biochemistry， 24，4665-4671)(1985)]、endo F[其作用与N-聚糖酶相似(Elder and Alexander，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，4540-4544)(1982)]、endo H(其可除去高甘露糖和某些杂合型N-连接的碳水化合物)[Tarentino et al.，Methods Enzymol.， 50C，574-580(1978)]、神经氨酸苷酸(其可除去唾液酸残基)及O-聚糖酶(其可除去某些O-连接的碳水化合物(Lambin et al.，Biochem.Soc.Tran.， 12，599-600，(1984)]所作的各种处理提示：存在N连接的和O连接的碳水化合物、大多数N连接的碳水化合物是复合物形式的。而且存在唾液酸，至少有些唾液酸是O连接部分的一部分。可从氨基酸顺序资料中得到关于N结合键之可能位点的某些信息(实施例2)。用N-聚糖酶、endo F和N-聚糖酶/神经氨酸苷酶处理可将SDS-PAGE显现的异源材料转化为更为同源之快速迁移形式，这一事实与所有材料均代表同一种多肽、且异质性系因糖基化作用的异质性所致的这一结论相符合。还值得提到的是，相对于SDS-PAGE中所用分子量标志物来说，联合用各种糖苷酶处理所得到的最小形式的分子量范围为18,000-20,000。
证实在SDS-PAGE上分子量31,000位置附近分散迁移的材料均代表了具有相同碱性多肽链的生物学活性材料，是根据得自在该区域内迁移之材料(如电泳转移并用溴化氰处理之后；实施例2)的氨基酸顺序资料与已证明用重组DNA方法表达分离的基因所产生的生物活性材料的氨基酸顺序(实施例4)相匹配之一事实而得出的。
                         实施例2
哺乳动物SCF的氨基酸顺序分析
A.对纯化蛋白质的反相高效液相层析(HPLC)
使用C4小孔径柱(Vydac，孔径300A，2mm×15cm)对实施例1中纯化的约5μg SCF(浓度＝0.117mg/ml)进行反相HPLC分析。在70分钟内用从97％流动相A(0.1％三氟乙酸)/3％流动相B(90％乙腈溶子0.1％三氟乙酸中)到30％流动相A/70％流动相B的线性梯度洗脱蛋白质，然后以每分钟0.2ml的流速再进行10分钟等临界洗脱(craticelution)。减去缓冲液空白层析分析值后，SCF表现为滞留时间70.05分钟的单一对称峰(见图10)。在这些条件下没有检测到大的污染蛋白峰。
B.电泳转移蛋白带的顺序测定
按下述方法用N-聚糖酶(一种特异性裂解共价结合到蛋白质上的Asn连接的碳水化合物部分的酶)处理实施例1中纯化的SCF(0.5-1.0nmol)(见实施例1D)。于真空下干燥6ml由图5所示C4柱洗脱之第4-6管得到的材料。然后如入150μl的14.25mM CHAPS、100mM 2-巯基乙醇、335mM磷酸钠(pH8.6)，并于37℃下保温95分钟。再加入300μl的74mM磷酸钠、15单位/ml N-聚糖酶(pH8.6)，继续保温19小时。然后使样品通过9-18％SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶(厚0.7mm；20×20cm)。使用10mM Caps缓冲液(pH10.5)以0.5安培的恒定电流电泳1小时[Matsudaira，J.Biol.Chem.，261，10035-10038(1987)]将凝胶中的蛋白质转移到聚二氟乙烯(PVDF，Millipore Corp.)上。经考马斯兰染色后即可看到被转移的蛋白带。这些带存在于分子量约29,000-33,000及约26,000处，即只产生了部分地去糖基化作用(参见实施例1D，图9)；前面一条带代表未被消化的材料，后面一条带代表已除去了N连接之碳水化合物的材料。切下这些带并直接加于(40％为Mr 29,000至33,000蛋白质；80％为Mr 26,000蛋白质)蛋白质顺序测定仪上(Applied Biosystems Inc.，477型)。按照厂商推荐的程序进行蛋白质顺序分析(Hewick et al.，J.Biol.Chem.， 256，7990-7997(1981)]，并使用微孔径C18反相HPLC连续分析所释放的乙内酰苯硫脲基氨基酸。两条带对20-28次顺序测定循环没有呈现信号，揭示两者使用Edman化学降解法均不能作顺序侧定。每次顺序测定的本底水平都在1-7pmol之间，此远低于存在于带中的蛋白量。这些数据表明存在于带中的蛋白质是N末端被封闭的。
C.电泳转移之蛋白质的原位CNBr裂解和顺序测定
为了进一步证实蛋白质确实是被封闭的，由顺序测定仪(B部分)上去掉膜并对印迹转移的蛋白质进行原位溴化氰(CN·Br)裂解[CNBr(5％，W/V)在70％甲酸中，45℃处理1小时]，然后干燥并作顺序分析。测出了强顺序信号，其代表经CNBr裂解甲硫氨酰肽键所得到的内肽。
在前5次操作过程中，两条带产生下列完全相同的混合顺序信号。
                  已鉴定的氨基酸
Cycle 1：Asp；Glu；Val；Ile；Leu
Cycle 2：Asp；Thr；Glu；Ala；Pro；Val
Cycle 3：Asn；Ser；His；Pro；Leu
Cycle-4：Asp；Asn；Ala；Pro；Leu
Cycle 5：Ser；Tyr；Pro直到第20次操作周期时，两条带仍产生相似的信号。Mr 26,000带的初始产率为40-115pmol，Mr 29,000-33,000带为40-150pmol。这些值与原来加到顺序分析仪上的蛋白质摩尔量差不多。结果进一步证实相当SCF的蛋白带含有被封闭的N末端。用于获得N末端被封闭蛋白质之顺序信息的方法包括：(a)使N末端去封闭(见D部分)；(b)用CNBr(见E部分)、胰蛋白酶(见F部分)和金黄色葡萄球菌(V-8菌株)蛋白酶(Glu-c)(见G部分)进行内部裂解产生肽。可在去除被封闭的N末端氨基酸或分离肽片段之后进行顺序分析。有关实施例详述如下。
D.用焦谷氨酸氨基肽酶处理之BRL干细胞因子的顺序分析
存在于SCF氨基末端的封闭部分的化学性质是难以预测的。封闭可发生在体内转译之后[F.Wold，Ann.Rev.Biochem.，50，783-814(1981)]或体外纯化过程中。有两种转译后修饰作用是最为常见的。在N-α-乙酰转移酶催化下，可发生某些N末端氨基酸如Ala、Ser等的乙酰化作用。此可通过分离和质谱分析N末端封闭肽得以证实。如果蛋白质的氨基末端是谷氨酰胺，则可能发生其r-酰胺的脱氨基作用。可使用焦谷氨酸氨基肽酶检测焦谷氨酸。该酶可除去焦谷氨酸残基，留下从第二个氨基酸开始的游离氨基末端。然后用Edman化学降解法进行顺序测定。
SCF(按实施例1所述纯化的；400pmol)在50mM磷酸钠缓冲液(pH7.6，含有二硫苏糖醇和EDTA)中与1.5单位小牛肝焦谷氨酸氨基肽酶(pE-AP)37℃下保温16小时。反应后将混合物直接加到蛋白质顺序分析仪上。经46次循环即可鉴定出主要顺序。初产率约为40％，重复得率为94.2％。含N末端焦谷氨酸之SCFN末端顺序是：
pE-AP裂解位点
      ↓                                10
pyroGlu-Glu-Ile-Cys-Arg-Asn-Pro-Val-Tnr-Asp-Asn-Val-Lys-Asp-Ile-Thr-Lys-
         20                                          30
Leu-Val-Ala-Asn-Leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Met-Ile-Thr-Leu-Asn-Tyr-Val-
                         40
Ala-Gly-Met-Asp-Val-Leu-Pro-Ser-His-xxx-Trp-Leu-Arg-Asp-....
              xxx，在第43位上没有给出具体的氨基酸
这些结果表明SCF含有作为其N末端的焦谷氨酸。
E.CNBr肽的分离和顺序分析
按实施例1所述用N聚糖酶处理实施例1中纯化的SCF(20-28μg；1.0-1.5nmol)。在该过程中完成向Mr 26,000材料的转化。干燥样品并在70％甲酸(5％)中室温下用CNBr处理18小时。用水稀释消化产物、干燥并重新溶解在0.1％三氟乙酸中。使用C4小孔径柱经反相HPLC法分离CNBr肽，洗脱条件同本实施例A部分所述。收集几个主要肽部分并作顺序分析。结果示于下表中：
  肽   滞留时间(分)   顺序4
  CB-4CB-61CB-8CB-10CB-152CB-14和CB-16   15.522.128.030.143.037.3   L-P-P---a.I-T-L-N-Y-V-A-G-(M)b.V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-S---L-G-P-E-K-D-S-R-V-S-V-(_)-K----D-V-L-P-S-H-C-W-L-R-D-(M)(含有CB-8的顺序)E-E-N-A-P-K-N-V-K-E-S-L-K-K-P-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-D3-R-S-I-D-A------两个肽都含有CB-15的相同顺序
1.12、13和25位上的氨基末测出。肽b没有分析到末端。
2.CB-15中的(N)未测出；它是根据可能的N连接之糖基化位点推断的。该肽顺序没有测完。
3.基于N-聚糖酶除去N连接的糖而认定Asn的位点可能已被转化为Asp。
4.所用单字母氨基酸代码分别是：A，Ala；C，Cys；
D，Asp；E，Glu；F，Phe；G，Gly；H，
His；I，Ile；K，Lys；L，Leu；M，Met；
N，Asn；P，Pro；Q，Gln；R，Arg；S，
Ser；T，Thr；V，Val；W，Trp；Y，Tyr。
F.BRL干细胞因子之胰蛋白酶消化片段的分离和顺序测定
用1μg胰蛋白酶对实施例1中纯化的SCF(20μg，在150μl 0.1M碳酸氢铵中)37℃下消化3.5小时。将消化产物直接加在小孔径C4柱中进行反相HPLC分离，所用洗脱条件同本实施例A部分所述。所有被洗脱肽的峰值滞留时间均不同于未消化的SCF(A部分)。被分离肽的顺序分析结果如下所示：
  肽   滞留时间(分)   顺序
  T-1T-21T-3T-42T-53   7.128.132.440.046.4a.   E-S-L-K-K-P-E-T-RV-S-V-(_)-KI-V-D-D-L-V-A-A-M-～E-E-N-A-P-KN-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(_)-RL-V-A-N-L-P-N-D-Y-M-I-T-L-N-Y-V-A-G-
T-74T-8 72.873.6   M-D-V-L-P-S-H-C-W-L-Rb.S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D-C-V-L-s-(_)-(_)-L-G----E-S-L-K-K-P-E-T-R-(N)-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(_)-RE-S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-D-R
1.4位的氨基酸未确定。
2.12位的氨基酸未确定。
3.肽T-5的b中，20和21位氨基酸未确定；
假定它们是O连接的糖的连接位点。
4.10位的氨基酸未测出；根据可能的N连接的糖基化位点推测其为Asn。21位的氨基酸未测出。
G.金黄色葡萄球菌Glu-C蛋白酶裂解后BRL干细胞因子肽的分离和顺序测定
以酶对底物1∶20的比例，37℃下用Glu-C蛋白酶将实施例1中纯化的SCF(20μg，在150μl 0.1M碳酸氢铵中)消化18小时。立即用反相小孔径C4柱HPLC分离消化产物。收集5个主要肽部分并作顺序测定(下示)：
  肽   带留时间   顺序
  S-1S-21S-32S-53S-63   5.127.746.371.072.6   N-A-P-K-N-V-K-ES-R-V-S-V-(_)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A)顺序未测知S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-DS-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-(N)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D
1.S-2肽的6位氨基酸未给出；其可能是O连接的糖的连接位点。只以低得率测到S-2肽之16位上的Ala。
2.肽S-3可能是衍生于SCF之N末端的N末端封闭肽。
3.括号内的N可能是N连接的糖的连接位点。
H.BNPS-粪臭素裂解后BRL干细胞因子的顺序分析
经真空离心使溶于10mM碳酸氢铵中的SCF(2μg)彻底干燥，然后重新溶解子100μl冰醋酸中。向溶液内加入10-20倍摩尔过量的BNPS-粪臭素，并将混合物于50℃下保温60分钟。然后经真空离心干燥反应混合物。先用100μl水，继之用50μl水提取干燥的残留物。然后接上述方法对合并的提取物作顺序分析。测得的顺序如下：
                                    10
Leu-Arg-Asp-Met-Val-Thr-His-Leu-Ser-Val-Ser-Leu-Thr-Thr-Leu-
                20
Leu-Asp-Lys-Phe-Ser-Asn-Ile-Ser-Glu-Gly-Leu-Ser-(Asn)-Tyr-
30                                      40
Ser-Ile-Ile-Asp-Lys-Leu-Gly-Lys-Ile-Val-Asp----28位氨基酸未被明确测出，基于可能的N连接的糖基化位点而将其定为Asn。
I.BRL干细胞因子的C末端氨基酸测定
将等份的SCF蛋白(500pmol)的缓冲液交换成10mM乙酸钠(pH4.0)(终体积90μl)，并加入Brij-35至0.05％(W/V)。取5μl等分样品作蛋白定量。用上述缓冲液将40μl样品稀释到100μl。以酶对底物1∶200的比例加入羧基肽酶P(来源于 penicillium  janthinellum)。于25℃下进行消化并于0、15、30、60和120分钟时各取20ml等分样品。在不同的时间点加入三氟乙酸到终浓度为5％，以终止消化。干燥样品并于70℃下与溶于0.2M NaHCO3(pH9.0)中的Dabsyl氯化物(二甲基氨基偶氨苯磺酰基氯)反应12分钟，以衍生释放的氨基酸[Chang et al.，Methods Enzymol.，90，41-48(1983)]。用Chang等人改进的小孔径反相HPHL法[Techniques in Proteinchemistry，T.Hugli ed.，Acad.Press，NY(1989)，pp.305-311]分析衍生的氨基酸。与衍生的氨基酸标准品(1pmol)比较后得到各时间点氨基酸组成的定量结果。在O时间可测到污染的甘氨酸。丙氨酸是唯一随保温时间延长而增加的氨基酸。保温2小时后，测得Ala总量为25pmol，相当于每摩尔蛋白质释放0.66mol Ala。这一结果表明天然哺乳动物SCF分子含有作为其羧基末端的Ala，此与对含C末端Ala之C末端肽S-2的顺序分析结果相符。这一结论也与已知的羧基肽酶P的特异性相一致[lu et al.，J.Chromatog.，447，351-364(1988)]。例如，如果遇有Pro-Val时，裂解即停止。肽S-2具有顺序S-R-V-S-V-(T)-K-P-F-M-L-P-P-V-A-(A)，并推测其为SCF的C末端肽(参见本实施例的J部分)。该C末端顺序---P-V-A-(A)限制了蛋白酶只裂解丙氨酸。肽S-2的氨基酸组成表明存在1个Thr、2个Ser、3个Pro、2个Ala、3个Val、1个Met、1个Leu、1个Phe、1个Lys和1个Arg，总共16个残基。测得2个Ala残基表明该肽的C末端可能有两个Ala残基(见G部分的表)。因此BRL SCF终止在Ala 164或Ala 165。
J.SCF的顺序
结合对(1)除去N末端焦谷氨酸后的完整干细胞因子，(2)CNBr肽，(3)胰蛋白酶肽，以及(4)Glu-C肽酶片段所作顺序分析的结果，推断出N末端顺序和C末端顺序(图11)。N末端顺序开始于焦谷氨酸并终止在Met-48处。C末端顺序含有84/85个氨基酸(82位至164/165位)。在各分离的肽中均未测出49位至81位的顺序。但在按本实施例H部分所述方法以BNPS一类臭素裂解BRL SCF后测出了一个大肽的顺序。由这些附加数据以及从大鼠SCF测得的DNA顺序(实施例3)，可将N和C末端顺序一一对准地列出，并可列出整个顺序(如图11所示)。分别经焦谷氨酸氨基肽酶消化和羧基肽酶P消化进一步证实分子的N末端是焦谷氨酸，且C末端是丙氨酸。
根据这些顺序资料，可知Asn-72是糖基化了的：Asn-109和Asn-120在某些分子中可能是糖基化的，但在另一些分子则不是。在作顺序分析时可测到Asn-65，因此其可能只是部分(而不是全部)糖基化的。根据DNA顺序推测，在氨基酸顺序分析期间可以测出Ser-142、Thr-143和Thr-155，因此其可能是O连接的碳水化合物的连接位点。图11中指出了这些可能的碳水化合物连接位点；实体字母指示N连接的碳水化合物，开放黑体字母指示O连接的碳水化合物。
K.BRL干细胞因子的氨基酸组成分析
经浓缩并将缓冲液换成50mM碳酸氢铵制备用于氨基酸组成分析的、得自图7所示C4柱洗脱物的材料。
两份70μl样品分别在含有0.1％苯酚和0.05％2-巯基乙醇的6N HCl中110℃下真空水解24小时。干燥水解产物，重新溶解在柠檬酸钠缓冲液中并使用离子交换层析(Beckman6300型氨基酸分析仪)分析之。结果如表3所示。用164个氨基酸(据蛋白质顺序分析资料)计算氨基酸组成可比使用193个氨基酸(如根据PCR得到的DNA顺序分析资料推测的，图14C)更好地与预测值相符合。
                           表3
                  哺乳动物SCF的定量氨基酸组成
氨基酸   每摩尔蛋白质中氨基酸组份的摩尔数1   推测的每分子残基数2
  Run #1   Run #2   (A)   (B)
  AsxThrSerGlxProGlyAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisLysTrpArg   24.4610.3714.5211.4410.905.818.62nd14.034.058.3117.022.867.962.1110.35nd4.93   24.2610.4314.3011.3710.856.208.35nd13.963.998.3316.972.847.922.1111.28nd4.99   25111610947/841569163821215   281224101058515710197831416
                            续表3
氨基酸   每摩尔蛋白质中氨基酸组份的摩尔数1   推测的每分子残基数2
  Run #1   Run #2   (A)   (B)
  Total   158   158   164/165   193
  计算的分子量   18,4243
1.基于蛋白质顺序分析测知的158个氨基酸(不包括Cys和Trp)。
2.根据蛋白质顺序资料(A)或DNA顺序资料(B)计算的理论值。
3.基于1-164氨基酸顺序。
在氨基酸组成分析中，包括已知量的内部标准品亦可定量样品中的蛋白质；被分析样品得出的数值为0.117mg/ml。
                      实施例3
克隆大鼠和人SCF基因
A.大鼠SCF cDNA片段的扩增和顺序分析
确定了大鼠SCF蛋白质片段的氨基酸顺序，便有可能设计出对大鼠SCF特异的混合的系列寡核苷酸。用该寡核苷酸作为杂交探针筛选大鼠cDNA和基因组文库；并作为引物使用聚合酶链反应(PCR)方法扩增部分cDNA[Mullis et al.，Methods inEnzymol.， 155，335-350(1987)]。用氨基磷酸酯法[Beaucage et al.，Tetrahedron Lett.， 22，1859-1862(1981)；McBride et al.，Te-trahedron Lett.， 24，245-248(1983)]合成寡脱氧核苷酸；其顺序示于图12A中。其中A代表腺嘌呤；T代表胸腺嘧啶；C代表胞嘧啶；G代表鸟嘌呤；I代表次黄苷。图中星号代表含限制性核酸内切酶识别顺序的寡核苷酸。顺序是按5′→3′方向写出的。
使用32P标记的基于实施例2中得到之氨基酸顺序合成的混合的寡核苷酸探针，219-21和219-22(图12A)，筛选大鼠基因组文库、大鼠肝cDNA文库及两个BRL cDNA文库。在这些使用cDNA克隆的标准方法[Maniatis et al.，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor，212-246(1982)]所作的实验中，没有分离到SCF克隆。
分离SCF核酸顺序的一个可替代的方法包括使用PCR技术。该方法学中，在有脱氧核苷三磷酸存在的热循环控制装置(cycler)中，通过多次由适当DNA聚合酶(如Tag I DNA聚合酶)催化的重复过程，于体外选择性地扩增两个DNA引物所包括的DNA区域。PCR扩增的特异性是以两个侧接在被扩增的DNA片段上并与相反链杂交的寡核苷酸引物为基础的。对复杂混合物中特定DNA区域有双侧特异性的PCR是使用两个有对该区域特异之顺序的引物完成的。有单侧特异性的PCR则是利用了一个区域特异性引物和第二个能在靶位点上起引发作用的引物，其中所说的靶位点存在于特定混合物之许多或所有DNA分子上[Loh et al.，Science， 243，217-220(1989)]。
成功地PCR扩增反应的DNA产物是DNA顺序资料的来源[Gyllensten，Biotechniques， 7，700-708(1989)]，并可用以制得比寡核苷酸探针具有更大长度和更高特异性的标记的杂交探针。也可用适当的引物顺序设计PCR产物，将其克隆到质粒载体中，用以表达被编码的肽产物。
图13A中概略说明了获得大鼠SCF cDNA之DNA顺序的基本方案。小箭头指示PCR扩增，大箭头则指示DNA顺序测定反应。PCR 90.6和96.2与DNA顺序测定相结合，用以获得大鼠SCF cDNA的部分核酸顺序。用于这些PCR的引物是基于图11中所示氨基酸顺序的混合的寡核苷酸。使用由PCR 90.6和96.2得到的顺序资料，制成特有的顺序引物(224-27和224-28，图12A)并用于继后的扩增和顺序测定反应。使用单侧特异性PCR在PCR 90.3、96.6和625.1中得到含有cDNA之5′末端的DNA。在PCR 90.4中得到另一个接近SCF蛋白之C末端的DNA顺序。按本实施例C部分中所述的方法，由PCR产物630.1、630.2、84.1和84.2中得到大鼠SCFcDNA之其余编码区的DNA顺序。用以获得大鼠SCF cDNA的技术如下所述。
按Okayama等人所述方法[Methods in Enzymol.， 154，3-28(1987)]由BRL细胞制备RNA。按照Jacobson所述方法[Methods inEnzymol.， 152，254-261(1987)]用Oligo(dT)纤维素柱分离poly A+RNA。
用1μg BRL poly A+RNA作模板，(dT)12-18作引物，按照Mo-MLV反转录酶提供者(Bethesda Research Labora-tories)推荐的方法合成第一条cDNA链。RNA链用0.14MNaOH于84℃下降解10分钟，或在沸水浴中降解5分钟。加入过量醋酸铵中和该溶液，先用苯酚/氯仿，再用氯仿/异戊醇提取cDNA，然后用乙醇沉淀之。为了使Oligo(dc)相关引物在PCR中有单侧特异性，按照以前所述方法[Deng et al.，Methods in Enzy-mol.， 100，96-103(1983)]，用得自小牛胸腺的末端转移酶[BoeringerMannheim]在第一条cDNA链的3′末端加上一个poly(dG)尾部。
除特别指出者外，各次PCR循环中的变性步骤均在94℃下进行1分钟，链延长反应在72℃下进行3或4分钟。退火的温度和时间对每次PCR来说均不相同，通常根据同时进行的几个不同PCR的大致条件而定。当引物浓度降低致使引物制品的积聚量下降时[Watson，Amplifica-tions， 2，56(1989)]，表明需要较长退火时间；当PCR产物的浓度高时，则要使用较短的退火时间和较高的引物浓度以增加得率。决定退火温度的主要因素是引物-靶联系的Td估算值[Suggs et al.，″Developmental Biology Using Purified Genes″，eds.Brown，D.D.and Fox，C.F.(Academic，New York)PP.683-693(1981)]。用于扩增的酶可购自下列任一个制造厂商：Stratagene，Promega或Per-kin-Elmer Cetus。反应化合物均按厂商推荐的方法使用。扩增反应可在Coy Tempcycle或Perkin Elmer Cetus DNA热循环控制装置中进行。
通常是在溴乙锭存在下，通过琼脂糖凝胶电泳对SCF cDNA片段的扩增进行分析，并经用紫外光照射DNA谱带，激发荧光后观察之。在某些提前产生小片段的情况下，可用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析PCR产物。可在用一个或多个内部套装引物(internally-nestedprimers)进行下一次扩增时观察适当的DNA带，来进一步确定所观察到的代表SCF cDNA片段的带。最后则要根据对PCR产物的二脱氧顺序测定[Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463-5467(1977)]结果，并将预略的翻译产物与SCF肽顺序资料相比较来证实之。
在最初的PCR实验中，使用了基于SCF蛋白质顺序[Gould，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 86，1934-1938(1989)]合成的混合寡核苷酸。下面叙述用于得到大鼠cDNA编码氨基酸-25到162之DNA顺序资料的PCR扩增方法。
在PCR 90.6中，各用4pmol反应体积为20μl的222-11和223-6扩增BRL cDNA。取一等份PCR 90.6产物在琼脂糖凝胶上作电泳分离，并观察有预期大小的带。进一步用各20pmol反应体积为50μl的引物222-11和223-6扩增1μl PCR 90.6产物，反应进行15次，退火温度为45℃。然后在引物222-11和219-25(PCR 96.2)存在下使该产物的一部分扩增25次，经琼脂糖凝胶电泳后可见产生了一条主产物带。用同样两个引物对PCR 96.2的产物进行不对称扩增可产生被成功地编定了顺序的模板。在222-11和套装引物219-21存在下，经产物的PCR扩增过程进一步完成对96.2产物中SCF顺序的选择性扩增。用该PCR的产物作为模板进行不对称扩增并制备放射标记的探针(PCR2)。
为了分离大鼠SCF cDNA的5′端，利用含有(dC)n顺序并互补于cDNA poly(dG)尾部的引物作为非特异性引物。用含有(dC)12(10pmol)和223-6(4pmol)的PCR 90.3作引物并用BRL cDNA作为模板。该反应产物很象一个有很高分子量的聚集体，在琼脂糖凝胶电泳中保留在接近点样孔的位置上。在体积为25μl的25pmol(dC)12c和10pmol 223-6存在下，对1μl产物溶液再进行15次扩增循环，退火温度为45℃。然后用内部套装引物219-25和201-7(PCR 96.6)对0.5μl该产物再进行25次扩增。201-7的顺序示子图12C中。琼脂糖凝胶电泳未观察到可见的带。以40℃退火温度再次进行25次PCR后，可见到一条明显的带。进行Southrern印迹分析后观察到一条明显的杂交带。使用201-7和套装引物224-27，以45℃退火温度再次进行20次PCR(625.1)。经PCR不对称扩增后作顺序测定，得到超出假定的前SCF信号肽编码顺序之推测氨基末端的顺序。用该顺序设计含有大鼠SCF cDNA编码区之5′末端的寡核苷酸引物227-29。同样，测定PCR 90.4的顺序可得到终止在氨基酸162处的3′DNA编码顺序(见图13.A)。
B.克隆大鼠干细胞因子基因组DNA
用按上面A部所述对编码大鼠SCF的cDNA作PCR扩增制得的探针筛选含有大鼠基因组顺序的基因文库(得自CLONTECHLaboratories，Inc.；catalog No.RL1022J)。使用得自成年雄性Spraque-Dawley大鼠的DNA在噬菌体λ载体EMBL-3 SP 6/T 7中构建该库。据提供者鉴定，该库含2.3×106个平均插入段大小为16Kb的独克隆。
用PCR法产生用于筛选该基因组文库的32P标记的探针。在含有16.7μM 32P[α]-dATP、200μM d CTP、200μM dGTP、200μM dTTP、由Perkin Elmer Cetus提供的反应缓冲液、0.05单位/ml的Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)、0.5μM 219-26、0.05μM 223-6和1μl含有两引物之靶位点模板90.1的反应混合物中制备探针PCR1(图13A)。除改变引物和模板外，使用相以反应条件制备探针PCR2。该探针制备中使用了0.5μM 222-11、0.05μM 219-21和1μl得自PCR 96.2的模板。
按照Maniatis等人[supra(1982)]所述方法接种约106个噬菌体。按厂商推荐的方法将噬斑转移到已变性的Gene Screen PlusTM滤膜(22cm×22cm，NEN/Dupont)上，中和并干燥之。对每个平皿均作两次滤膜转移。
滤膜在1M NaCl、1％SDS、0.1％牛血清白蛋白、0.1％Ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮(杂交溶液)中65℃下预杂交约16小时并于-20℃下保存。将滤膜转移到含有32P标记的PCR1探针(1.2×105cpm/ml)的新鲜杂交溶液中，65℃下杂交14小时。室温下在0.9M NaCl、0.09M柠檬酸钠、0.1％SDS(pH7.2)(洗涤溶液)中将滤膜洗2小时，然后再于65℃下在新鲜洗涤溶液中洗30分钟。由平皿上除去相当于放射自显影图谱上放射活性点之平皿区域中的噬菌体克隆，并再次用探针PCR1和PCR2筛选之。
用限制性核酸内切酶BamHI、SphI或SstI消化得自阳性克隆的DNA，将所得片段再克隆到pUC 119中，然后作顺序分析。图14A中图解显示了对大鼠基因组SCF DNA进行顺序分析的战略(方案)。该图中，顶部的线代表编码SCF的大鼠基因组DNA区域。线上的缺口指示已测定了顺序的区域。大方框代表具有上面各方框指示的相应被编码氨基酸之SCF基因编码区域的外显子。箭头代表已确定顺序并用以组装大鼠SCF基因之相符顺序的个别区域。大鼠SCF基因的顺序如图14B中所示。
使用PCR1探针筛选大鼠基因组文库，分离出相应子编码氨基酸19至176之外显子的克隆。为了得到氨基酸19编码区上游之外显子的克隆，可使用寡核苷酸探针228-30筛选该基因库。按前述方法用同一组滤膜与探针PCR1预杂交，并在含有32P标记之寡核苷酸228-30(0.03pmole/ml)的杂交溶液中50℃下杂交16小时。室温下在洗涤溶液中洗滤膜30分钟，然后再在新鲜洗涤溶液中于45℃下洗15分钟。由平皿上除去相当于放射自显影图上放射活性点之区域内的噬菌体克隆并用探针228-30重新筛选之。用限制性核酸内切酶消化得自阳性克隆的DNA并再克隆之。使用探针228-30，得到相当于编码氨基酸-20至18之外显子的克隆。
为分离相当于含5′未转译区和氨基酸-25至-21编码区之外显子的克隆而作了几种尝试。结果没有分离到大鼠SCF基因这个区域的克隆。
C.克隆适于在哺乳动物细胞内表达的大鼠cDNA
设计哺乳动物细胞表达系统，以确定大鼠SCF的活性多肽产物是否能在哺乳动物细胞内表达并被分泌出来。所设计的系统用于表达大鼠SCF之剪短的转译产物(SCF1-162和SCF1-164)以及根据图14C所示基因顺序之翻译推测的蛋白质(SCF1-193)。
用于这些研究工作中的表达载体是含有pUC119、SV40和HTLVI顺序的穿梭载体。设计这些载体，使之可以在大肠杆菌和哺乳动物细胞内自身复制，并在病毒DNA顺序的控制下表达被插入的外源DNA。该存在于大肠杆菌DH5中的定名为V19.8的载体已寄存在美国典型培养物保藏中心(12301 ParklawnDrive，Rockville，Md.)(ATCC No.68124)。该载体是Souza的美国专利4,810,643号(已列为本文参考文献)中所述之pSVDM19的衍生物。
将大鼠SCF1-162cDNA插入到质粒载体V19.8中。该cDNA顺序如图14C中所示。如图13A所示，在PCR反应630.1和630.2中合成用于该构建过程的cDNA。这些PCR代表了独立的扩增并利用了合成的寡核苷酸引物227-29和227-30。这些引物的顺序是按本实施例A部分所示由PCR产生的cDNA中获得的。反应混合物体积为50μl，其由1×反应缓冲液(得自Perkin Elmer Cetus试剂盒)、250μm dATP、250μMdCTP、250μM dGTP和250μM dTTP、200ng oligo(dT)引导的cDNA、1pmol 227-29、1pmol 227-30以及2.5单位Taq聚合酶(Perkin Elmer Cetus)组成。经在94℃下变性1分钟、37℃下退火2分钟及72℃下链延长反应1分钟，对该cDNA进行10个周期的扩增。在经过这些最初的PCR扩增周期后，向各反应内加入10pmol的227-29和10pmol的227-30。将退火温度改为55℃，继续按上述方法进行30个周期的扩增。用限制性核酸内切酶HindIII和SstII消化PCR的产物。同样用HindIII和SstII消化V19.8，且其中一种情况是用小牛肠碱性磷酸酶处理业经消化的质粒载体；而另一种情况下则由琼脂糖凝胶中分离消化后产生的大片段。使用T4多核苷酸连接酶将该cDNA连接到V19.8上。按已述方法[Okayama et al.，supra(1987)]将此连接产物转化到感受态大肠杆菌株DH5中。用Sanger的二脱氧方法测定由个别细菌克隆制备之DNA的顺序。图17显示了V19.8SCF的构建过程。按实施例4和5中所述用这些质粒转染哺乳动物细胞。
用构建上述表达SCF1-162之载体的相似的方法构建用于表达大鼠SCF1-164的载体，其中包括使用PCR扩增法合成cDNA，然后插入V19.8中。用含SCF1-162cDNA的V19.8(V19.8：SCF1-162)作模板，227-29作基因之5′端的引物，237-19作基因之3′端的引物，以PCR扩增法合成用于该构建过程的cDNA。重复的反应混合物(50μl)含有1×反应缓冲液、250μM dATP、dCTP、dGTP和dTTP、2.5单位Taq聚合酶、20ng V19.8：SCF1-162和各20pmol引物。经于94℃下变性1分钟、55℃下退火2分钟和72℃下链延长2分钟，对cDNA作35个周期的扩增。用限制性核酸内切酶HindIII和SstII消化扩增的产物并插入V19.8中。所得载体含有SCF氨基酸-25至164的编码区，继后是终止密码子。
同时使用用于大鼠SCF1-162的相似方法，将193氨基酸形式的大鼠SCF(大鼠SCF1-193是根据图14C所示DNA顺序的翻译产物推测的)的cDNA插入到质粒载体V19.8中。用于该构建过程的cDNA是利用寡核苷酸227-29和230-25在PCR反应84.1和84.2(图13A)中合成的。两反应代表了由不同的RNA制备物开始的独立扩增。通过本实施例A部分中所述的PCR反应得到227-29的顺序，并由大鼠基因组DNA(图14B)得到引物230-25的顺序。反应混合物(50μl)由1×反应缓冲液(得自Perkin Elmer Cetus试剂盒)、250uMdATP、250μM dCTP、250μM dGTP、和250μM dTTP、200ng Oligo(dT)引导的cDNA、10pmol227-29、10pmol 230-25及2.5单位Taq聚合酶(Perkin ElmerCetus)组成。使用下列条件将该cDNA扩增5个周期：94℃下变性11/2分钟，50℃下退火2分钟，72℃下链延长2分钟。经过这些最初的扩增周期后，再于60℃的退火温度下，按上述条件继续进行35个周期的扩增。用限制性核酸内切酶HindIII和SstII消化PCR扩增的产物。用HindIII和SstII消化V19.8DNA并由琼脂糖凝胶电泳带中分离消化后的大片段。使用T4多核苷酸连接酶将该cDNA连接到V19.8上。将此连接产物转染到感受态大肠杆菌菌株DH5中并测定由个别克隆制备之DNA的顺序。按实施例4中所述用这些质粒转染哺乳动物细胞。
D.人SCF cDNA PCR产物的扩增和顺序分析
如图13B所示，使用PCR扩增法由肝癌细胞系Hep G2(ATCCHB8065)中得到人SCF cDNA。其基本方案是用有由大鼠SCFcDNA推知之顺序的引物，经PCR来扩增人cDNA。
按Maniatis等人[supra(1982)]所述方法制备RNA，并按厂商推荐的方法使用Oligo dT纤维素制备Poly A+RNA(CollaborativeResearch Inc.)。
按上述制备BRL cDNA的方法制备第一股cDNA链，不同的是用2μM寡核苷酸228-28(见图12C)引导合成，该引物在连接到较长特有顺序的3′端处有一个短的随机顺序。该228-28的特有顺序部分提供了一个用引物228-29作非特异性引物经PCR进行扩增的靶位点。至少与大鼠SCF顺序的一部分有关的人cDNA顺序是使用引物227-29和228-29经PCR由HepG2 cDNA扩增的(PCR22.7，见图13B；于60℃下.退火进行15次扩增，然后再于55℃下退火进行15次扩增)。琼脂糖凝胶电泳没有出现清楚的带，只看到一个模糊不清的显然是异源的DNA。进一步使用内部套装的大鼠SCF引物222-11和引物228-29，与1μl PCR22.7产物进行PCR(PCR24.3；于55℃退火条件下进行20次扩增)，以试图优先扩增与大鼠SCFcDNA密切相关的顺序。结果在琼脂糖凝胶上只观察到一个模糊的异源DNA产物。用引物222-11和227-30双侧特异性扩增PCR24.3产物(PCR25.10；20次)，产生了一条与相应的大鼠SCF cDNA PCR产物有同样大小的主产物带。使用224-24作为顺序分析引物测定非对称PCR产物(PCR33.1)的顺序，测出了大约有70个碱基的人SCF顺序。
相似地，首先用引物224-25和228-29(PCR24.7.20次)，然后用引物224-25和227-30(PCR41.11)扩增1μl PCR 22.7产物，结果产生了一条与相应的大鼠SCF产物有同样大小的主带，而且在非对称扩增(PCR42.3)之后产生了与大鼠SCF高度同源的顺序(使用224-24作为顺序分析引物)。合成有针对人SCF cDNA之独特顺序的寡脱氧核苷酸，其顺序如图12B中所示。
为了得到大鼠SCF PCR产生之编码顺序的人对应物(用于表达和活性研究)，用引物227-29和227-30在50μl反应混合物中对1μl PCR22.7产物进行PCR(PCR39.1)。扩增反应在Coy Tempcycler中完成。因为对人SCF cDNA和大鼠SCF特定引物227-30之间的错配程度尚不明了，所以在前三个反应周期里使用了低严格的退火条件(37℃)；然后才在55℃下退火。结果显现了一条与大鼠同系物有同样大小的清晰的带(约590bp)，然后进一步稀释小部分PCR39.1产物并与同一引物进行PCR(PCR41.1)。因为在PCR41.1的产物中观察到了一个以上的带，故进一步与内部套装的引物进行PCR，以在克隆之前至少确定其一部分顺序。经用引物231-27和227-29进行23次PCR循环(PCR51.2)后，出现一条很明显的带。用引物227-29和231-27进行非对称PCR并作顺序分析，进一步证实了人SCF cDNA顺序的存在。按上文C部分所述克隆大鼠SCF1-162PCR片段的方法，将PCR41.1 SCF DNA克隆到表达载体V19.8中。用Sanger的二脱氧方法测定个别细胞克隆的DNA顺序。
E.克隆人干细胞因子基因组DNA
使用扩增cDNA制得的PCR7探针(图13B)筛选含人基因组顺序的基因库。使用互补于人SCF cDNA之一部分的核糖探针(riboprobe)(见下述)再次筛选阳性噬斑。用PCR4 f.1(图13B)的产物起始制备PCR7探针。进一步用引物227-29和227-30扩增PCR41.1的产物。由琼脂糖凝胶上洗脱所得的590bp片段并再次用同一引物(PCR58.1)扩增之。在含有10pmol 233-13的50μl反应混合物中将PCR58.1的产物稀释1,000倍并扩增10次。向该反应混合物中加入10pmole227-30后，继续进行20次PCR。再加入80pmole 233-13，使反应体积增加到90μl并继续进行15次PCR。以50μl反应体积将反应产物稀释200倍，加入20pmole 231-27和20pmole 233-13，使用48℃的退火温度以反应96.1进行35次PCR。使用相似于制备PCR1的反应条件制备32P标记的PCR7，其中不同的是：以50μl的反应体积将PCR96.1稀释100倍；用5pmole的231-27作单一引物；以94℃下变性1分钟、48℃下退火2分钟及72℃下链延长2分钟的反应条件，进行45次PCR。
核糖探针(核糖探针1)是一种32P标记的互补于图15B所示人SCF DNA之核苷酸2-436的单链RNA。为了构建产生该探针的载体，用HindIII和EcoRI消化PCR41.1(图13B)产物DNA并克隆到质粒载体pGEM3(Promega，Madison，Wisconsin)的多聚接头中。然后用HindIII消化将重组pGEM3:hSCF质粒DNA切成线形。按照Promega公司产品说明书所述使用方法用T7RNA聚合酶经脱落(run-off)转录由线性化的质粒DNA制备32P标记的核糖探针1。反应混合物(3μl)含有250ng线性化质粒DNA和20μM 32P-rCTP(catalog #NEG-008H，New England Nuc-lear-(NEN))(没有未标记的CTP)。
从Stratagene公司(La Jolla，CA；catalog #：946203)得到人基因组库。该文库是使用由白种人男性胎盘制得的DNA在λ噬菌体FixII载体中构建的。由提供者鉴定的该文库特征是含有2×106个平均插入段长度大于15Kb的初级噬斑。按Maniatis等人[supra(1982)]所述方法铺敷大约106个噬菌体。按照厂商推荐的方法将斑转移到Gene Screen PlusTM滤膜上。(22cm2；NEN/Dupont)。每个平皿作两片滤膜转移。
滤膜在6×SSC(0.9M NaCl、0.09M柠檬酸钠，pH7.5)、1％SDS中，于60℃下预杂交，并于62℃下在6×SSC、含有32P标记之PCR7探针(2×105cpm/ml)的1％SDS溶液中杂交20小时。滤膜于62℃下在6×SSC、1％SDS中洗16小时。从相当于放射自显影图上放射活性点的平皿区域内除去噬菌体积结物并用探针PCR7和核糖探针1再次筛选。用PCR7探针再次筛选的条件基本上同上所述。用核糖探针1再次筛选的方法是：滤膜在6×SSC、1％SDS中预杂交，并于62℃下在0.25M Na3 PO4(pH7.5)、0.25MNaCl、0.001M EDTA、15％甲酰胺、7％SDS和1×106cpm/ml的核糖探针中杂交18小时。滤膜于62℃下在6×SSC、1％SDS中洗30分钟，再在1×SSC、1％SDS中(62℃)洗30分钟。用限制性核酸内切酶BamHI、SphI或SstI消化阳性克隆的DNA，并将所得片段再克隆到PUC119中，之后进行顺序测定。
使用探针PCR7，得到一个包含编码氨基酸40至176之外显子的克隆，该克隆已保藏在ATCC(保藏号40681)。为得到其他SCF外显子的克隆，用核糖探针2和寡核苷酸探针235-29筛选人基因组文库，筛选方法大致同前，但其中不同的是：于37℃下与探针235-29杂交并于37℃下将该杂交滤膜洗1小时，再于44℃下洗1小时。用核糖探针2、核糖探针3和寡核苷酸探针235-29与236-31重新筛选陌性克隆。使用产生核糖探针1的相似方法制得核糖探针2和3，其中不同的是：(a)用限制性核酸内切酶PvuII(核糖探针2)或PstI(核糖探针3)将重组pGEM3:hSCF质粒DNA切成线形，以及(b)使用SP6RNA聚合酶(Promega)合成核糖探针3。
图15A显示用于确定人基因组DNA顺序的战略。该图中，顶部的线代表人基因组DNA编码SCF的区域。线上的缺口指示已测定了顺序的区域。大方框代表SCF基因编码区的外显子，并在每个方框上方标出了相应的被编码的氨基酸。该人SCF基因的顺序如图15B所示。图15C中显示了用PCR技术得到之人SCF cDNA的顺序。
F.人SCF cDNA5′区的顺序
对由两个基因特异性引物引导PCR得到的产物作顺序分析，揭示了两个引物之3′末端结合区域的顺序。如实施例3A所述，一侧PCR可产生测翼区域的顺序。一侧PCR被用于扩展人SCFcDNA之5′未翻译区的顺序。
按实施例3D所述，用寡核苷酸228-28(图12C)作探针，由得自人膀胱癌细胞系5637(ATCC HTB9)的polyA+RNA制备第一条cDNA链。用dG残基为该cDNA接尾，然后使用含(dC)n顺序的引物连同SCF特异性引物进行一侧PCR扩增，结果没有产生延伸已知顺序之(5′)上游区的cDNA片段。
对寡核苷酸228-28引导合成第二条链的产物进行PCR扩增，可得到小量顺序信息。上述未接尾的5637第一股cDNA链(50ng)和2pmole 228-28与Klenow聚合酶及各0.5mMdATP、dCTP、dGTP和dTTP在10μl 1×缺口翻译缓冲液[Maniatis et al.，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1982)]中10-12℃保温30分钟。用引物228-29连同套装SCF引物(依次使用：235-30、233-14、236-31和235-29)经连续一侧PCR扩增所得的cDNA，产生了在琼脂糖凝胶上显现模糊的复杂产物混合物。当用两个SCF引物(227-29和235-29，例如产生一大约150bp的产物)扩增差不多体积的连续一测PCR产物时，可观察到有渐渐增加密度的特异性产物带，表明大量富集了SCF相关的cDNA片段。试图通过去掉琼脂糖凝胶上模糊不清的部分，并经PCR再次扩增以选择有特定大小范围的产物，结果在多数情况下都没有产生含有SCF相关顺序的确切的带。
一个只含有235-29引物的反应(PCR16.17)，正如用限制性酶PvuII和PstI作酶切分析和用套装引物进行PCR分析所显示的，结果产生了显然是在除预期位点之外的一个编码区5′端的未知位点上由235-29引导产生的带。用凝胶电泳法纯化该产物并用引物235-29再次扩增，同时尝试使用32P标记的引物228-30，以Sanger氏双脱氧法测定其顺序。所得顺序即为设计寡核苷酸254-9(图12B)的基础。当将该3′定向引物与5′定向SCF引物合用于继后的PCR时，则得到有预期大小的带。对这些PCR产物进行直接Sanger法顺序分析，得到了图15C所示人SCF cDNA顺序的核苷酸180至204。
为了得到更多的hSCF cDNA5′端顺序，使用SCF特异性引物(2pmol的233-14)，在16μl含0.2单位MMLV逆转录酶(购自BRL)和各500μM dNTP的反应混合物中由5637poly A+RNA(约300ng)制备第一股cDNA链。经过标准的苯酚-氯仿和氯仿提取及乙醇沉淀(从1M乙酸铵中)步骤后，将核酸悬浮在20μl水中，在沸水浴中5分钟，然后冷却并在8μMdATP存在下于含CoCl2缓冲液中用末端转移酶接尾[Deng andWu，Methods in Enzymology， 100，pp96-103]。经苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀以纯化所得产物(dA)n接尾的第一股cDNA链，并悬浮在20μl 10mM Tris(pH8.0)和1mM EDTA中。
按下述方法由大约20ng(dA)n接尾的5637 cDNA中富集并扩增人SCF相关的cDNA5′末端片段：于SCF特异性引物236-31和在3′端或其附近含有(dT)n顺序的引物或引物混合物，如引物221-12或引物220-3、220-7及220-11(图12C)的混合物存在下，进行最初的26次一侧PCR循环。然后在第二组PCR中，用引物221-12和235-29扩增这些PCR的产物(1μl)。经琼脂糖凝胶分析后，均观察到一条约370bp的主产物带。用巴斯德吸管的尖端由凝胶上吸出含该带之一部分的凝胶栓，并转移到小的微量离心管中。加入10μl水并于84℃加热锅中熔化该凝胶栓。将含有引物221-12和235-29(各8pmole)的PCR混合物在40μl反应体积中与2μl熔化并稀释的凝胶栓一起保温。15个反应周期后，经琼脂糖凝胶分析可见到一大约370bp的轻微弥散的带。进行非对称PCR以产生顶和底链顺序测定模板：各反应混合物均含有4ulPCR反应产物和40pmole引物221-12或235-29，并在总反应体积100μl中进行25次PCR(1分钟、95℃；30秒，55℃；40秒，72℃)。用32P标记的引物262-13(图12B)对221-12引发的PCR产物混合物作直接顺序分析(于标准的提取和乙醇沉淀步骤之后)，得到从核苷酸1到179的5′顺序(图15C)。
G.对干细胞因子之第一编码外显子位点处的人基因组DNA的扩增和顺序分析
用SCF寡核苷酸探针筛选人基因组文库，没有发现任何含有第一编码外显子之已知部分的克隆。然后使用一侧PCR技术扩增并克隆该外显子周围的基因组顺序。
使用非SCF引物如228-28或221-11，并借助DNA聚合酶I(Klenow酶，大片段；Boehringer-Mannheim)，于适合在许多不同位点上引导的非严格(低温度)条件下(如12℃)对热变性的人胎盘DNA(购自Sigma公司)进行引物延伸。然后用含有Taq聚合酶和各100μM dNTP的Taq DNA聚合酶缓冲液将各反应混合物稀释5倍，并于72℃下使DNA链延伸反应进行10分钟。然后于SCF第一外显子寡核苷酸(如254-9)和适当的非SCF引物(228-29或221-11)存在下，经PCR富集符合干细胞因子第一外显子顺序的产物。琼脂糖凝胶电泳结果表明，大多数产物都是短链的(小于300bp)。为富集较长的产物，切下相当于长度大于300bp之琼脂糖凝胶部分，并以电泳法洗脱之。经乙醇沉淀后重新悬浮在水中，将该凝胶纯化的PCR产物作为HindIII至SfiI的片段克隆到含有SfiI位点的pGEM4衍生物中。
用SCF第一外显子寡核苷酸筛选细胞集落。鉴定出几个阳性集落并用Sanger氏法测定出插入段的顺序。如图15B所示，所得顺序通过相符外显子-内含子交界点由第一外显子向下游延伸到相邻内含子。
H.对小鼠、猴和狗的SCF cDNA编码区的扩增和顺序测定
由得自猴肝细胞(购自Clontech)和NIH-3T3细胞系(小鼠，ATCC CRL1658)及D17(狗，ATCC CCL183)的总RNA或poly A+RNA制备第一条cDNA链。用于合成第一条cDNA链的引物是非特异性引物228-28或SCF引物(227-30，237-19，237-20，230-25或241-6)。用引物227-29和引物227-30、237-19或237-20之一进行PCR扩增，得到了一个有预期大小的片段，然后直接或于克隆到V19.8中或p GEM载体中之后测定其顺序。
利用SCF特异性引物连同254-9或228-29一起，经PCR扩增得到接近SCF cDNA之5′端的附加顺序。使用230-25或241-6，必要时还使用3′定向SCF引物，对230-25引导的cDNA(对于小鼠细胞来源者)或241-6引导的cDNA(对于猴细胞来源者)进行PCR扩增后，得到SCF编码区之3′端的附加顺序。在扩增D17 cDNA的相似实验中，没有得到SCF PCR产物带。使用非特异性引物228-28由D17总RNA合成第一条链，并用3′定向的SCF引物(如227-29或225-31)连同228-29一起经PCR富集所得复杂产物混合物中的SCF相关顺序。用SfiI切割该产物混合物，并作为SfiI位点到平端的片段将其克隆到含有SfiI位点的p GEM4(Promega，Madison，Wisconsin)衍生物中。用放射标记的237-20筛选所得的异质性文库，测定几个阳性克隆的DNA顺序，得到狗SCF3′端顺序。图16中显示了一一对应之人(图42)、猴、狗、小鼠和大鼠SCF成熟蛋白质的氨基酸顺序。
已知的SCF氨基酸顺序就其大部分顺序来说都是高度同源的。在所有5个种的编码区中，都存在同样的相符信号肽顺序。图中数字1指示的是通过据大鼠SCF类推，预期为成熟蛋白质之氨基末端的氨基酸。狗cDNA顺序含有一个不明确的密码子(密码子129)，致使相应氨基酸顺序中有一未定的缬氨酸/亮氨酸。人、猴、大鼠和小鼠氨基酸顺序均成一线并列，而没有任何插入或缺失。与其他种动物相比较，狗顺序在130位上有一个多出的残基。人和猴只在一个位置上有所不同，即130位的缬氨酸(人)被丙氨酸(猴)保守取代。在残基164附近的位点处进行假想的加工之前或之后，各个种之间的推测的SCF顺序是高度保守的。
                       实施例4
重组大鼠SCF在COS-1细胞中的表达
为在COS-1细胞(ATCC CRL1650)中进行暂时表达，将含有大鼠SCF1-162和SCF1-183基因的载体V19.8(实施例3C)转染到重复的60mm平皿中(Wigler et al.，Cell，14，725-731(1978)]。质粒V19.8SCF如图17中所示。作为对照，也用没有插入段的载体进行转染。在翻译后的不同时间点收获组织培养物上清液并分析其生物学活性。表4总结了HPP-CFC生物检测的结果，表5总结了由各典型转染实验得到的MC/93H-胸苷摄入数据。用下列质粒转染的COS-1细胞上清液所作生物检测的结果如表4和5所示：C末端在氨基酸162位之C末端剪短形式的大鼠SCF(V19.8大鼠SCF1-162)、在81位含谷氨酸的SCF1-162[V19.8大鼠SCF1-162(Glu81)]，以及在19位上含有丙氨酸的SCF1-162[V19.8大鼠SCF1-162(Ala19)]。这些氨基酸取代是实施例3所述的大鼠SCF1-162扩增过程中进行PCR反应的产物。测定个别V19.8大鼠SCF1-162克隆的顺序，发现两个克隆有氨基酸取代。从表4和5中可以看出，重组大鼠SCF在用以纯化天然哺乳动物SCF(实施例1)的生物检测法中是有活性的。
                          表4
       对大鼠SCF DNA转染之COS-1细胞的培养物上清液
                 所作的HPP-CFC检测
  样品 分析CM的体积(μl)   集落数/200,000细胞
  V19.8(无插入段)V19.8大鼠SCF1-162V19.8大鼠SCF1-162(Glu81)V19.8大鼠SCF1-162(Ala19)   100502512100502512631005025121005025   0000＞50＞50＞50＞5030826102041185
  样品   分析CM的体积(μl)   集落数/200,000细胞
  1263   000
                    表5
     对大鼠SCF DNA转染之COS-1细胞的培养物上清液
          所作的MC/93H-胸苷摄入试验
  样品   分析CM的体积(μl)   cpm
  V19.8(无插入段)V19.8SCF1-162V19.8SCF1-162(Glu81)   251263251263251263   1,9362,2522,1821,68211,64811,32211,4829,6386,2205,3843,6921,980
  V19.8SCF1-162(Ala19)   251263   8,3966,6464,5663,182
在用于检测正常骨髓细胞增殖作用的人CFU-GM[Broxmeyeret al.，supra(1977)]试验中分别检测重组大鼠SCF及其他因子，结果如表6所示。表6中显示了用V19.8 SCF1-162及其他因子转染4天后，对培养物的COS-1上清液所作检测的结果。集落数为三份重复培养物的平均值。
在CFU-GM试验中，重组大鼠SCF对正常人骨髓具有协同活性。在表6所示的实验中，SCF与人GM-CSF、人IL-3及人CSF-1均有协同作用。在其他试验中，还观察到G-SCF的协同活性。使用大鼠SCF处理14天后，可见有人骨髓的增殖；但这些群落均不足40个细胞。用天然哺乳动物衍生的SCF获得了相似的结果。
                       表6
        对大鼠SCF DNA转染之COS-1细胞培养物
              上清液所作的人CFU-GM检测
  样品   集落数/100,000细胞(±SEM)
  盐水GM-CSFG-CSFIL-3   07±124±15±1
  样品   集落数/100,000细胞(±SEM)
  CSF-1SCF1-162GM-CSF+SCF1-162G-CSF+SCF1-162IL-3+SCF1-162CSF-1+SCF1-162   0029±620±111±14±0
                     实施例5
           重组3CF在中国仓鼠卵细胞内的表达
本实施例涉及一种用于由CHO细胞(DHFR-；ATCCCCL61)分泌SCF的稳定的哺乳动物表达系统。
A.重组大鼠SCF
用以产生SCF的表达载体是V19.8(图17)。用以建立稳定转化体的可选择标志物是质粒pDSVE.1中的二氢叶酸还原酶基因质粒pDSVE.1(图18)是pDSVE的衍生体，是用限制酶SalI消化pDSVE，并连接到由两个寡核苷酸，即
5′TCGAC CCGGA TCCCC 3′和
3′G GGCCT AGGGG AGCT 5′组成的寡核苷酸片段上而构建的。
美国专利系列申请号025,344和152,045中已描述了载体pDSVE。V19.8和pDSVE.1的载体部分包含一个较长的同源部分，其包括细菌COIEI复制原点、氨苄青毒素抗性基因以及SV40复制原点。这种交迭可在转化过程中导致同源重组，以利于共转化。
在有或没有10μg载体小鼠DNA的情况下，使用1.0或0.1μg已用限制酶PvuI切成线性的pDSVE.1和10μgV19.8SCF，完成V19.8SCF构建物和pDSVE.1的磷酸钙共沉淀[Wigler et al.，supra(1978)]。基于来自pDSVE.1之DHFR基因的表达来选择集落。使用克隆唧管摘取能在没有加入——和胸苷的培养基中生长的集落，并扩充为独立的细胞系。以MC/93H-胸苷掺入试验检测个别细胞系的细胞上清液。典型实验的结果示于表7中。
                           表7
           对大鼠SCF DNA转染的稳定的CHO细胞上清液
              所作的MC/93H胸苷掺入试验
  转染的DNA   检测的条件培养基的体积   cpm
  V19.8SCF1-162None   2512631.52512631   33,92634,97330,65714,7147,1606941,0828806721,354
B.重组人SCF
还使用共同专利申请系列号No.501,904(申请日1990年3月29日)中所述的表达载体pDSVRα2来实现SCF在CHO细胞内的表达。该载体包含一个基于DHFR基因的表达进行克隆选择和扩增的基因。经过两个步骤产生克隆pDSRα2 SCF。用限制酶BamHI消化V19.8 SCF，并将SCF插入段连接到pGEM3的BamHI位点上。用HindIII和SalI消化pGEM3 SCF的DNA，并连接到用HindIII和SalI消化的pDSRα2中。重复同样方法，以得到在图15C所示顺序之162、164和183位氨基酸和图42所示顺序之248位上编码羧基末端的人基因。用10nM氨甲喋呤攻击已建立的细胞系[Shimke，″Methods in Enzymology，151，85-104(1987)]，以提高DHFR和相邻SCF基因的表达水平。用放射免疫法(如在实施例7中)，和/或用人外周血淋巴细胞体外诱导集落形成法来检测重组人SCF的表达水平。该试验基本上按实施例9(表12)中所述方法进行，不同的是使用外周血代替骨髓，并于人EPO(10单位/ml)存在下，在20％O2、5％CO2和75％N2环境下进行保温。表8中显示了典型实验的结果。表达人SCF1-164的CHO克隆已于1990年9月25B保藏在ATCC(CRL10557)，并定名为Hu164 SCF17。
                          表8
              对用人SCF DNA转染的稳定CHO细胞系之
                 条件培养基所作的hPBL集落检测
  转染的DNA  检测的培养基(μl)   集落数/105细胞
  pDSRα2hSCF1-164pDSRα2hSCF1-162None(CHO对照)   502512.56.25102.51.250.62550   5345271343443117214
                        实施例6
               重组SCF在大肠杆菌中的表达
A.重组大鼠SCF
本实验涉及借助表达[Met-1]大鼠SCF1-183(图14C)编码的DNA顺序在大肠杆菌中表达SCF多肽。虽然可使用任何一种适于用该DNA进行蛋白质表达的载体，但这里所选用的质粒是pCFM1156(图19)。
可很容易地由pCFM836(参见已列为本文参考文献的美国专利4,710,473号)构建该质粒，其大致方法是用T4聚合酶进行末端充填，以破坏两个内源性NdeI限制性位点，然后进行平端连接，并用下示的小寡核苷酸取代唯一ClaI和KpnI限制性位点间的小DNA顺序：
5′CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3′
3′TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC       5′借助合成的λPL启动子控制pCFM1156质粒中的蛋白质表达，其中前者本身则处于温度敏感性λCI857抑制基因[如由大肠杆菌菌株FM5(ATCC保藏号53911)或K12△Htrp中得到的]的控制下。构建pCFM1156，使之具有一个含最适化核糖体结合位点和直接接在合成PL启动子3′端上的起始密码子的DNA顺序。含有ATG起始密码子的唯一NdeI限制性位点，位子其后接有λt-oop转录终止顺序之多限制性位点克隆群的前面。
用Bg1II和SstII消化如实施例3中所述由PCR扩增的cDNA(图14C)克隆的含大鼠SCF1-183基因之质粒V19.8 SCF1-183，并分离一个603bp DNA片段。为了提供Met起始密码子并保留大鼠SCF多肽之前三个氨基酸残基(Gln、Glu和Ile)的密码子，制得有Nde I和BglII粘性末端的合成的寡核苷酸接头
5′TATGCAGGA 3′
ACGTCCTCTAG 5′，将此小寡核苷酸和大鼠SCF1-183基因片段在图19所示质粒的唯一NdeI和SstII位点处插入pCFM1156中。此连接反应的产物即为表达质粒pCFM1156大鼠SCF1-183。
将pCFM1156大鼠SCF1-183质粒转化到感受态FM5大肠杆菌宿主细胞中。基于pCFM1156载体上携带的抗生素(卡那霉素)抗性标志选择含质粒的细胞。由培养的细胞中分离质粒DNA，经DNA顺序分析进一步确定合成寡核苷酸的DNA顺序及其与大鼠SCF基因相接处的DNA顺序。
为构建编码[Met-1]大鼠SCF1-162多肽的质粒pCFM1156大鼠SCF1-162，由V19.8大鼠SCF1-162中分离EcoRI至SstII的限制性片段，并经连接反应，在唯一的EcoRI和SstII限制性位点上插入到质粒pCFM大鼠SCF1-183中，从而取代大鼠SCF基因羧基末端的编码区。
为了构建分别编码[Met-1]大鼠SCF1-164和[Met-1]大鼠SCF1-165多肽的质粒pCFM1155大鼠SCF1-164及pCFM1156大鼠SCF1-165，由PCR扩增的编码SCF基因之3′末端的DNA中分离EcoRI至SstII的限制性片段，并设计在编码SCF基因之羧基末端区域的DNA中引入位点特异性改变。在pCFM1156大鼠SCF1-164的构建中使用寡核苷酸引物227-29和237-19，在pCFM1156大鼠SCF1-165的构建中使用227-29和237-20，以进行DNA扩增。
B.重组的人SCF
本实施例涉及借助编码[Met-1]人SCF1-164和[Met-1]人SCF1-183的DNA顺序(图15C)在大肠杆菌中表达人SCF多肽。用含有人SCF1-182基因的质粒V19.8人SCF1-182作为PCR扩增人SCF基因的模板。用寡核苷酸引物227-29和237-19产生PCR DNA，然后用限制性核酸内切酶PstI和SstII消化之。为了提供Met起始密码子并保留人SCF多肽之前四个氨基酸残基(Glu、Gly、Ile、Cys)的密码子，制备具有NdeI和PstI粘性末端的合成寡核苷酸接头：
5′TATGGAAGGTATCTGCA 3′
3′ACCTTCCATAG       5′经连接反应将此小寡聚接头和PCR衍生的人SCF基因片段在图19所示质粒的唯一NdeI和SstII位点处插入表达质粒pCFM1156(如前所述)中。
将pCFM1156人SCF1-164质粒转化到感受态FM5大肠杆菌宿主细胞内。基于携带在pCFM1156载体上的抗生素(卡那霉素)抗性标志选择含质粒的细胞。由培养的细胞中分离质粒DNA，并经DNA顺序分析进一步确定人SCF基因的DNA顺序。
为了构建编码[Met-1]人SCF1-183(图15C)多肽的质粒pCFM1156人SCF1-183，由pGEM人SCF114-183(见下述)中分离编码人SCF基因之羧基末端的EcoRI至HindIII限制性片段，由pCFM1156人SCF1-164中分离编码人SCF基因之氨基末端的SstI至EcoRI限制性片段，并从pCFM1156中分离大的Hindm至SstI限制性片段。将这三个DNA片段连接在一起，形成pCFM1156人SCF1-183质粒，然后将其转化到FM5大肠杆菌宿主细胞内。利用卡那霉素抗性选择细胞集落后，分离质粒DNA并经DNA顺序分析进一步确定其正确DNA顺序。pGEM人SCF114-183质粒是含有EcoRI-SphI片段之pGEM3的衍生物，其中EcoRI-SphI片段包括如图15C所示的人SCF cDNA顺序的核苷酸609至820。用寡核苷酸引物235-31和241-6(图12B)以及PCR22.7(图13B)作模板，由PCR中分离该质粒中的EcoRI-SphI插入段。引物241-6的顺序是以人基因组顺序至含氨基酸176密码子之外显子的3′侧为基础的。
C.发酵培养产生人SCF1-164的大肠杆菌
在16升发酵罐内发酵培养含有质粒pCFM1156人SCF1-164的FM5大肠杆菌K12宿主，以制备SCF1-164。种子培养物于-80℃下保存在含17％甘油的Luria培养液内。为制备接种物，将100μl融化的种子储备物转移到装在2升埃伦美厄培养瓶内的500ml Luria培养液中，并在摇库(250BPM)上使之30℃生长过夜。
为制备大肠杆菌细胞糊状物，用以作为纯化本实施例所述人SCF1-164的起始材料，可使用下述的发酵条件。
将接种培养物无菌操作下转移到含8升分批培养基(见表9)的16升发酵器内。使培养物以批量方式生长，直到其OD-600约为3.5。此时，使用蠕动泵将无菌发酵原料(发酵原料1，表10)送入发酵器以控制进料速度。进料速度随时间成指数增加达到生长速度为0.15/小时。生长期间温度控制在30℃。通过控制空气流速、搅拌速度、管内回流压力及补氧量，将发酵器内溶解氧的浓度自动控制在50％饱和度。使用磷酸和氢氧化铵将pH自动控制在7.0。在OD-600约为30时，将发酵器内温度提高到42℃，以诱导发酵的生产期。同时停止供给发酵原料1，而以200ml/小时的速度加入发酵原料2(表11)。约6小时后，将发酵器内容物冷却到15℃。SCF1-164的产率约为30mg/OD-L。在BeckmanJ6-B转子中以3000g离心1小时收获细胞沉淀物。收获的细胞糊状物于-70℃下冷冻保存。
生产SCF1-164的优选方法与上述者相似，不同的是作了如下改动：
1)直到培养物的OD-600值达到5-6时方开始加入发酵原料1。
2)原料1的给料速度增加更为缓慢，以使生长速度更慢(约0.08)。
3)OD-600为20时开始诱导培养物。
4)向发酵器内引入原料2的速度为300ml/小时。
其他所有操作，包括培养基均与上述者相似。
使用该方法，在OD＝25时所达到的产率约为35-40mg/OD-L。
                表9
          分批培养基的组成
  酵母浸膏葡萄糖K2 HPO4KH2 PO4MgSO4·7H2ONaClDow P-2000消泡剂维生素溶液b微量金属元素溶液c   10ag/L53.5410.6255ml/8L2ml/L2ml/L
a.除特别注明者外，所有成分均以g/L为单位。
b.维生素溶液：核黄素，0.42g/L；泛酸5.4g/L；
烟酸，6g/L；吡哆醇，1.4g/L；生物素，0.06g/L；
叶酸，0.04g/L。
c.微量金属元素溶液：FeCl3·6H2O，27g/L；
ZnCl2·4H2O，2g/L；CaCl2·6H2O，
2g/L；Na2MoO4·2H2O，2g/L；CuSO4·5H2O，1.9g/L；浓盐酸，100ml/L。
                 表10
           原料培养基1的组成
  酵母浸膏葡萄糖MgSO4·7H2O微量金属元素溶液维生素溶液c   50ag/L4508.610ml/L10ml/L
a.除特别注明者外，所有成分均以g/L为单位。
b.微量金属元素溶液：FeCl3·6H2O，27g/L；ZnCl2·4H2O，2g/L；CaCl2·6H2O，g/L；Na2MoO4·2H2O，2g/L；CuSO4·5H2O，1.9g/L；浓盐酸，100ml/L。
c.维生素溶液：核黄素，0.42g/L；泛酸5.4g/L；烟酸，6g/L；吡哆醇，1.4g/L；生物素，0.06g/L；叶酸，0.04g/L。
         表11
  原料培养基2的组成
  胰蛋白胨酵母浸膏葡萄糖   172a86258
a.所有成分均以g/L为单位。
                        实施例7
                   免疫检测法检测SCF
按下述程序完成定量测定SCF的放射免疫检测法(R1A)。
将如实施例1中所述由BRL3A细胞中纯化的SCF制剂与抗血清一起，于37℃下保温2小时。保温2小时后，在冰上冷却样品管，加入125I-SCF，并在4℃下至少保温20小时。各试管均含有500μl由50μl稀释的抗血清、约60,000cpm125I-SCF(3.8×107cpm/μg)、5μl trasylol和0-400μl SCF标准品组成的保温混合物[加缓冲液(磷酸盐缓冲盐水、0.1％牛血清白蛋白、0.05％Triton X-100、0.025％叠氮化物)补足体积]。抗血清是用得自BRL3A条件培养基的50％纯天然SCF制剂免疫兔，并由第二次试验采血血样制得的。试验中所用的终抗血清稀释度为1∶2000。
加入150μl Staph A(Calbiochem)沉淀抗体结合的125I-SCF。室温下保温1小时后，离心样品并用0.75ml含0.15MNaCl、2mM EDTA和0.05％Triton X-100的10mMTris-HCl(pH8.2)洗细胞沉淀物两次。洗过的沉淀物在T计数器上计数，以确定125I-SCF结合的百分比。由全部最终数值中减去无血清管的结合计数，以纠正非特异性沉淀误差。图20中显示了一典型RIA的结果。由未标记之标准品产生的对125I-SCF结合的百分抑制率是剂量依赖性的(图20A)，而且如图20B所示，当用SDS-PAGE和放射自显影技术检验免疫沉淀物时，可见125I-SCF蛋白质带受到竞争。图20B中，泳道1是125I-SCF，泳道2、3、4和5是分别受到0、2、100和200ng SCF标准品竞争的免疫沉淀的125I-SCF。正如根据RIA管中抗体可沉淀之cpm数值减少，以及免疫沉淀的125I-SCF蛋白带(约在Mr31,000处迁移)减弱所看出的，该多克隆抗血清能够误别按实施例1所述方法纯化的SCF标准品。
也可用Western印迹法检测在大肠杆菌、COS-1和CHO细胞中表达的重组SCF。用SDS-PAGE法分离部分纯化之大肠杆菌表达的大鼠SCF1-183(实施例10)、COS-1细胞表达的大鼠SCF1-162和SCF1-183以及人SCF1-162(实施例4和9)和CHO细胞表达的大鼠SCF1-162(实施例5)。电泳后，使用Bio-Rad Transblot装置将蛋白带转移到0.2μm硝化纤维素滤膜上(60V，5小时)。在含有10％羊血清的PBS(pH7.6)中封闭硝化纤维素滤膜4小时，然后加入1∶200稀释的兔预免疫或免疫血清(免疫方法同上所述)，室温下保温14小时。加入辣根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG试剂(Vector Laboratories.)和4-氯代-1-萘酚显色剂后即可显现出抗体-抗血清复合物。
图21和22中给出了两次Western分析的结果。图21中，泳道3和5是200μl COS-1细胞产生的人SCF1-162；泳道1和7是200μl COS-1细胞产生的人EPO(用V19.8EPO转染的COS-1细胞)；泳道8是预染色的分子量标志物。泳道1-4与预免疫血清保温，泳道5-8加免疫血清保温。该免疫血清可特异地识别表观分子量约30,000道尔顿的弥散带，后者来自产生人SCF1-162的COS-1细胞，而不是来自产生人EPO的COS-1细胞。
在图22所示的Western印迹中，泳道1和7是1μg大肠杆菌中产生之大鼠SCF1-183的部分纯化制剂；泳道2和8是麦胚凝集素-琼脂糖纯化之COS-1细胞产生的大鼠SCF1-183；泳道4和9是麦胚凝集素-琼脂糖纯化之COS-1细胞产生的大鼠SCF1-162；泳道5和10是麦胚凝集素-琼脂糖纯化之CHO细胞产生的大鼠SCF1-162；泳道6是预染色的分子量标志物。泳道1-5和泳道6-10分别加预免疫和免疫血清保温。大肠杆菌产生的大鼠SCF1-183(泳道1和7)以表观分子量约24,000道尔顿迁移，而COS-1细胞产生的大鼠SCF1-183(泳道2和8)则以表观分子量约24-36,000道尔顿迁移。这种分子量上的差异是可以想见的，因为哺乳动物细胞能够产生糖基化作用，而细菌细胞则不能。用编码大鼠SCF1-162的顺序转染COS-1(泳道4和9)或CHO细胞(泳道5和10)可比用编码SCF1-183的顺序转染泳道2和8表达有更低平均分子量的SCF。
COS-1和CHO细胞表达的大鼠SCF1-162产物是一系列表观分子量为24-36,000道尔顿的带。被表达的SCF的这种异质性很可能是由于碳水化合物的变异，致使SCF多肽受到不同程度的糖基化作用。
总地说来，Western分析表明用天然哺乳动物SCF免疫之兔的免疫血清可识别大肠杆菌、COS-1和CHO细胞中产生的重组SCF，但不能识别包含COS-1细胞产生之EPO的对照样品中的带。另外，同一兔的预免疫血清没有与任何大鼠或人SCF表达产物反应，也进一步证明了SCF抗血清的特异性。
                       实施例8
                 重组SCF的体内活性
A.骨髓移植中使用大鼠SCF
按实施例4所述，进行用V19.8 SCF1-162转染COS-1细胞的大容量实验(T175cm2培养瓶代替60mm培养皿)。收获约270ml上清液。基本上按实施例1中所述，在麦胚凝集素-琼脂糖柱和S-Sepharose柱上层析分离该上清液。在基于小鼠W/Wv遗传学的骨髓移植模型中估测重组SCF的活性。W/Wv小鼠具有干细胞缺陷，而导致巨细胞性贫血(大红细胞)，并可以由正常动物体内移植骨髓而不必照射受体动物[Russel et al.，Science， 144，844-846(1964)]。移植后正常供体干细胞比有缺陷的受体细胞生长快。
下列实施例中，各组均包括6只年令相当的小鼠。由正常供体小鼠体内收集骨髓并移植到W/Wv小鼠体内。在移植后不同时间化验全血血象，并根据受体外周血细胞向供体表现型的转化来确定供体骨髓是否已被接受。而受体向供体表现型的转化则是借助子监测红细胞的前向散射图形(FASCAN，Becton Dickenson)而确定的。在每个时间点比较各移植动物与供体和受体未移植动物的血象。使用以Kolmogorov-Smirnov统计学为基础的计算机程序分析得自血流系统的直方图来完成这一比较[Young，J.Histochem.and Cytochem.， 25，935-941(1977)]。移植物生长的一个独立的定性指征是通过对受体血液的血红蛋白电泳分析所确定的血红蛋白类型[Wong et al.，Mol.and Cell.Biol.，9，798-808(1989)]，此与根据Kolmogorov-Smirnov统计学分析得出的良好结果完全符合。
将大约3×105个细胞在没有作SCF处理(图23对照组)的情况下由C56BL/6J供体小鼠移植给W/Wv受体动物。第二组则接受3×105个已用SCF(600单位/ml)于37℃下处理20分钟并被一同注射的供体细胞(图23预处理组)。(1单位SCF定义为在MC/9生物检测法中产生的最大半刺激量)。第三组中，移植3×105个供体细胞后，以每天大约400单位SCF的剂量给受体小鼠作皮下注射(sub-Q)三天(图23皮下注射组)。如图23所示，在两个SCF处理组中供体骨髓接植比未处理的对照组快。移植后29天时，SCF预处理组已转化为供体表现型。这一实例说明了SCF在骨髓移植中的治疗作用。
B.大鼠SCF在Steel小鼠体内的活性
S1位点的突变可导致造血细胞、色素细胞和生殖细胞的缺失。造血细胞缺乏的明显表现是红细胞[Russell，In Al Gorden，Regu-lation of Hematopoiesis，Vol.1，649-675，Appleton-Century-Crafts，New York(1970)]、中性白细胞[Ruscetti，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.， 152，398(1970)]、单核细胞[Shibata，J.Immunol.， 135，3905(1985)]、巨核细胞[Ebbe，EXP，Hematol.，6，201(1978)]天然杀伤细胞[Clark，Immuno Genetics， 12，601(1981)]及肥大细胞[Hayashi，Dev.Biol.， 109，234(1985)]数目的减少。Steel小鼠支持干细胞的能力差，因此是一种骨髓移植的不良受体[Bannerman，Prog.Hematol.， 8，131(1973)]。Steel(S1/S1)小鼠体内缺乏编码SCF的基因。
Steel小鼠对SCF活性有体内敏感性。利用Steel-Dickie(S1/S1d)小鼠对各种不同的重组SCF蛋白质作不同时间的检测。由JackenLabs，Bar Harbor，ME购得6至10周令的Steel小鼠。用SYSMEX F-800微型细胞计数器(Baxtor，Irvine，CA)检测外周血红细胞、白红蛋白和血小板。用Coulter Channelyzer 256(Coulter Elec-tronics，Marietta，GA)细胞计数装置计数外周血白细胞(WBC)。
在图24所示的实验中，用大肠杆菌产生的、按实施例10所述方法纯化的SCF1-164，以每天每公斤体重100μg的剂量给Steel-dickie小鼠注射30天，然后再以每天每公斤体重30μg的剂量注射20天。注射时用生理盐水(Abbott Labs，North Chiacago，IL)+0.1％胎牛血清配制该蛋白质。每日皮下注射1次。在图24中所示的时间采集约50μl尾血检验外周血象。将采集的血样放入3％EDTA包被的注射器中并分散到涂擦EDTA粉末的微量离心管内(Brinkman，Westburg，NY)。相对于对照组，处理组动物可发生非常明显的巨大红细胞性贫血。停止治疗后治疗组动物又回复到原来的巨红细胞性贫血状态。在图25和26所示的实验中，用上述各种重组形式的SCF以100μg/公斤/天的剂量给Steel小鼠注射20天。按实施例10所述方法制备两种形式的大肠杆菌产生的大鼠SCF，即SCF1-164和SCF1-183。另外，还检测按实施例12所述方法制得的结合了聚乙二醇的大肠杆菌SCF1-164(即SCF1-164PEG25)。还检测了按实施例5所述方法制备并按实施例11所述方法纯化的CHO产生的SCF1-162。用3％EDTA包被的注射器经心脏穿刺由动物体内采血并分散到用EDTA粉擦过的试管中。处理20天后的外周血象如图25、26所示，其中图25显示白细胞(WBC)、图26显示血小板。SCF1-164 PEG25组的WBC差异如图27所示。可见有中性白细胞、单核细胞、淋巴细胞和血小板数的绝对增多。使用SCF1-164 PEG25可显示出最为突出的效果。
还对不同类型的淋巴细胞亚群作了检测，所得数据如图28所示。人CD4的鼠类等同物，或T辅助细胞的标志物是L3T4[Dialynas，J.Immunol.， 131，2445(1983)]。LYT-2是细胞毒性T细胞上的鼠抗原[Ledbetter，J.Exp.Med.， 153，1503(1981)]。用抗这两种抗原的单克隆抗体来估测治疗组动物的T细胞亚类。
按下述方法染全血中的T淋巴细胞亚群：从个别动物体内抽取200μl全血并加到EDTA处理过的试管中。每份血样品均用无菌去离子水溶解60分钟，然后制成10×Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)(Gibco，Grand Island，NY)的等渗液。用含有0.1％胎牛血清(Flow Laboratory，Mclean，VA)和0.1％叠氮钠的1×PBS(Gibco，Grand Island，NY)将溶解的血样品洗两次。使各份血样品沉淀到96孔园底群集皿中，并离心之将细胞沉淀物(含2-10×105细胞)重新悬浮于20μl结合有藻红蛋白(PE)(Becton Dickinson，MountainView，CA)的大鼠抗小鼠L3 T4和20μl结合有异硫氰酸荧光素的大鼠抗小鼠Lyt-2中，并在冰上(4℃)保温30分钟。保温后在上述1×PBS中洗细胞2次。然后在FACScan细胞分析系统(Becton Dickinson，Mountain View，CA)中分析各血样。使用标准自动补偿方法和校准小珠(Calibrite beads)(Becton Dickin-son，Mountain View，CA)对该系统进行校正使之标准化。所得数据表明了辅助性T细胞群和细胞毒性T细胞数目的绝对增加。
C.SCF在灵长类动物体内的活性
检测大肠杆菌中表达的(实施例6B)并按实施例10中所述方法纯化的同种人SCF1-164在正常灵长类动物体内的活性。将成年雄性狒狒(Papio sp.)分成三组进行研究：未治疗组，n＝3；SCF100μg/公斤/天给药组，n＝6；SCF30μg/公斤/天给药组，n＝6。治疗组每天接受一次SCF皮下注射。在氯胺酮麻醉下自动物体内采血。在给药的第1、6、11、15、.20和25天采集血样并作全血细胞计数、网织红细胞计数和血小板计数。
所有被治疗动物均存活，并且对SCF无任何不良反应。如图29中所示，给予100μg/公斤/体重的动物表现白细胞数增加。图29中还列出了外周血涂片经Wright-Giemsa染色后，作人工计数所得到的不同细胞计数植。可见中性白细胞、淋巴细胞及单核细胞均呈现绝对增多。如图30所示，100μg/公斤体重治疗组的血细胞比容和血小板数也有所增加。
以200μg/Kg/天的剂量，给正常狒狒连续静脉输注人SCF(按实施例12中所述方法用聚乙二醇修饰的hSCF1-164)，检测其在动物体内的作用并与未修饰的蛋白质比较。从0天开始给药，共处理28天。所得外周血WBC计数结果如下表所示。从中可以看出，PEG修饰的SCF可比未经修饰的SCF更早地引起外周血WBC数目的增加。
用每天每公斤体重200μg hSCF1-164处理：
动物 # M 88320                          动物 # M 88129
天数      WBC数                         天数      WBC数
0         5800                          0         6800
+7        10700                         +7        7400
+14       12600                         +14       20900
+16       22000                         +21       18400
+22       31100                         +23       24900
+24       28100                         +29       13000
+29       9600                          +30       23000
+36       6600                          +37       12100
+43       5800                          +44       10700
                                        +51       7800
用每天每公斤体重200μg PEG-hSCF1-164处理：
动物 # M 88350                          动物 # M 89116
天数      WBC数                         天数      WBC数
-7        12400                         -5        7900
-2        11600                         0         7400
+4        24700                         +6        16400
+7        20400                         +9        17100
+11       24700                         +13       18700
+14       32600                         +16       19400
动物 # M 88350                      动物 # M 89116
天数      WBC数                     天数      WBC数
+18       33600                     +20       27800
+21       26400                     +23       20700
+25       16600                     +27       20200
+28       26900                     +29       18600
+32       9200                      +33       7600
                          实施例9
                    重组人SCF的体外活性
按实施例4中所述表达大鼠SCF的方法，在COS-1细胞中表达经实施例3D所述PCR反应制得的相应于氨基酸1-162的人SCF的cDNA。用人骨髓及小鼠HPP-CFC和MC/9检测法检测COS-1上清液。在小鼠检测法中，于所试浓度下该人蛋白质没有活性，但它对人骨髓是有活性的。检测所用的培养条件如下：以Ficoll-Hypaque梯度(Pharmacia)离心取自健康自愿者的人骨髓并培养在2.1％甲基纤维素、30％胎牛血清、6×10-5M 2-巯基乙醇、2mM谷氨酰胺、ISCOVE氏培养基(GIBCO)、20U/ml EPO中，并在含有7％O2、10％CO2和83％N2的湿气中以1×105细胞/ml的浓度培养14天。表12中显示了由重组人和大鼠SCF COS-1上清液产生的集落数。其中只计数那些大小等于或大于0.2mm的集落。
                                  表12
                    在对SCF反应中人骨髓细胞集落的生长
  转染的质粒   检测的CM体积μl   集落数/100,000细胞±SD
  V19.8未插入V19.8人SCF1-162V19.8大鼠SCF1-162   100501005010050   0033±722±313±110
图31A中显示了生长14天后的集落(放大12倍)。箭头指示一典型集落。这些集落就其大体积(平均0.5mm)来说相似于小鼠HPP-CEC集落。由于存在EPO，使得某些集落血红蛋白化。当使用Cytospin(Shandon)分离集落并离心在玻片上，然后用Wright-Giemsa染色时，可见主要细胞类型为如图31B中所示具有大核：胞浆比例的未分化细胞(放大400×)。图31B中箭头分别指示下列结构：箭头1，胞浆；箭头2，核；箭头3，液泡。未成熟细胞为一类大细胞，当其成熟时细胞逐渐变小[Diggs et al.，The Morpho-logy of Human Blood Cells，Abbott Labs，3(1978)]。造血成熟过程中，早期细胞的核相对于胞浆来说要大些。另外，用Wright-Giemsa染色后，未成熟细胞的胞浆比核深些。而当细胞成熟时，核染色则比胞浆深些。从含重组人SCF之培养物得到的人骨髓细胞的形态学看，可以认为SCF作用的靶细胞的直接产物是相对未成熟的造血祖细胞。
在琼脂集落检测中，试验了重组人SCF与上述其他生长因子对人骨髓细胞的作用，结果如表13所示。就个别CSF来说，SCF与G-CSF、GM-CSF、IL-3和EPO有协同作用，可加速骨髓靶细胞的增殖。
                     表13
     重组人SCF与其他人集落刺激因子的协同作用
  集落数/105细胞(14天)
  空白对照hG-CSFhG-CSF+hSCFhGM-CSFhGM-CSF+hSCFhIL-3hIL-3+hSCFhEPOhEPO+IL-3hEPO+hSCFhSCF   032±374±114±2108±523±1108±310±517±186±100
重组人SCF的另一活性是能够引起软琼脂中人急性髓性白血病(AML)细胞系KG-1(ATCC CCL246)的增殖。基本上按已述的KG-1琼脂克隆法[Koeffler et al.，Science，200，1153-1154(1978)]试验得自转染细胞的COS-1上清液，方法上不同的是铺板细胞浓度为3000个/ml。表14中给出了各组三份培养物的统计学数据。
                           表14
                      KG-1软琼脂克隆试验
  转染的质粒   分析的体积   集落数/3000细胞±SD
  V19.8(未插入段)V19.8人SCF1-162V19.8大鼠SCF1-162人GM-CSF   252512631.52550(5ng/ml)   2±114±08±09±56±46±66±114±5
                           实施例10
                在大肠杆菌中表达的重组SCF产物的纯化
按实施例6C所述方法发酵培养可表达人SCF1-164的大肠杆菌。将收获的细胞(912g湿重)悬浮在水中至体积为4.6升，然后使之三次通过实验室匀浆器(Gaulin Model 15MR-8TBA)(8000psi)。离心(17700×g，30分钟，4℃)得到破碎的细胞团块，用水洗一次(再次悬浮并离心)，然后悬浮在水中至体积为400ml。将含有不溶性SCF(约10-12g SCF)的细胞碎片加到3950ml适当混合物中，该混合物内各组分及终浓度分别为8M尿素(超纯品)、0.1mM EDTA、50mM乙酸钠，pH6-7；估计SCF浓度为1.5mg/ml。室温下保温4小时以溶解SCF。离心(17700g，30分钟，室温)除去其余的不溶性物质。为使已溶解的SCF重新拆迭/再氧化，搅拌下将上清部分缓缓加入39.15升适当混合物中，该混合物内的各成分及其终浓度为2.5M尿素(超纯品)、0.01mM EDTA、5mM乙酸钠、50mM Tris-HCl(pH8.5)、1mM谷胱甘肽、0.02％(重量/体积)叠氮钠。SCF的浓度约为150μg/ml。室温下搅拌约60小时后[也可以是较短时间，如约20小时]，使用有3个截留分子量为10000之聚砜膜(总面积15平方英尺)的Millipore Pellicon超滤装置将该混合物浓缩2倍，然后对7倍体积的20mM Tris-HCl(pH8)透析。浓缩/超滤期间的温度为4℃，泵送速率为5升/分钟，过滤速度为600ml/分钟。回收之滞留物的终体积为26.5升。用SDS-PAGE法检测样品有或没有还原，此证明大多数(＞80％)细胞碎片SCF经与8M尿素保温而被溶解，并如对未还原样品所作SDS-PAGE分析中看到的，在拆迭/氧化之后存在多种形式的SCF。如图9所示，代表正确氧化之主要形式的SCF(见下述)，相对于分子量标志物(还原的)，其迁移的表观分子量约为17,000(未还原的)。其他形式包括以表观分子量约18-20,000迁移的材料(未还原的)，其代表有不正确链内二硫键的SCF；而以表观分子量范围为37,000(未还原的)迁移的带(或更大的带)则被认为是代表不同的SCF形式，它们具有可导致这样一些SCF多肽链的链内二硫键，即它们可以共价连接以分别形成二聚体或较大的寡聚体。经分离步骤后，可除去余留的大肠杆菌污染物和不要的SCF形式，从而得到生物学活性构象上有明显均质性的纯化的SCF。
加入375ml 10％(体积/体积)乙酸，将超滤滞留物的pH调到4.5，从而出现可见的沉淀物质。60分钟后，大部分沉淀物即已沉到容器底部，弃去上层之24升并通过CunoTM 30SP深滤器以500ml/分钟的速度过滤，直到完全澄清。然后用水将滤液稀释1.5倍，并于-4℃下加至在25mM乙酸钠(pH4.5)中平衡过的S-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia)上。在4℃下，以5L/h流速进行柱层析。加入样品后，用5倍柱床体积(约6升)的柱缓冲液洗柱，并用在缓冲液中的0至0.35M NaCl梯度洗脱。总梯度体积为20升，所收集的每部分(管)为200ml。洗脱曲线如图33所示。用SDS-PAGE法分析从S-Sepharose柱中收集的各等份(10μl)还原(图32A)和未还原(图32B)的样品。由分析可以看出，实际上在280nm处的所有吸收(图32和33)都是由于SCF材料的存在。
在主吸收峰(第22-38管，图33)中，是以正确氧化的形式占优势。见于各部分中的次要形式包括在SDS-PAGE分析中表观分子量为18-20,000的非正确氧化的物质(未还原的)，其出现于主吸收峰的前肩部(第10-21管，图32B)；且二硫键结合的二聚体材料则存在于整个吸收区域(第10-38管，图32B)中。
合并由S-Sepharose柱上收集的第22-38部分(管)，加入约11毫升6NHCl将其pH调到2.2，并于4℃下加到用50％(体积/体积)乙醇、12.5mM HCl(溶液A)平衡的VydacC4柱(高8.4cm，直径9cm)上。柱树脂的制备是先将干树脂悬浮于80％(体积/体积)乙醇、12.5mM HCl(溶液B)中，然后用溶液A平衡之。加样品之前，用溶液A到溶液B(总体积6升)的空白梯度过柱，然后再用溶液A平衡。加样品之后，用2.5升溶液A洗柱，并以2670ml/小时的流速用溶液A至溶液B的梯度(总体积18升)洗脱结合在柱上的SCF材料。以每管50ml收集286管，并按上述方法用280nm吸光率(图35)和SDS-PAGE法(每管25μl)分析各等分部分(图34A，还原条件；图34B，非还原条件)。合并含有高纯度正确氧化之SCF的第62-161管[其后在该梯度中洗脱了小量分子量约18-20,000的非正确氧化的单体(未还原的)(约为第166-211管)及后来的二硫键结合的二聚体(约为第199-235管，图35)]。
为了由第62-161管的集合物中除去乙醇并浓缩SCF，继后须使用Q-Sepharose Fast Flow离子交换树脂(Pharmacia)。用水稀释集合物(5升)至15.625升，使乙醇浓度约达到20％(体积/体积)。然后加入1M Tris碱(135ml)至pH8，再加入1M Tris-HCl，pH8(23.6ml)，使总Tris浓度达到10mM。进一步加入10mM Tris-HCl，pH8(约15.5升)，至总体积为31.25升，乙醇浓度约为10％(体积/体积)。将所得材料于4℃加至用10mM Tris-HCl(pH8)平衡的Q-SephoroseFast Flow柱(高6.5cm，直径7cm)上，然后用2.5升柱缓冲液洗柱。加样品和洗柱期间的流速约为5.5升/小时。为洗脱结合的SCF，以反方向通过柱泵入200mM NaCl、10mMTris-HCl(pH8)，流速约200ml/小时。各管约收集12ml，并按上述280nm吸光率及SDS-PAGE法分析之。合并第16-28管(157ml)。
将含有SCF的合并物加至两个分离的、用4℃盐酸缓冲盐水平衡的Sephacryls-200HR(Pharmacia)凝胶过滤柱(5×138cm)上(各加78.5ml)。以大约75ml/小时的流速收集，每管约收集15ml。各层析柱上，根据280nm吸光率洗脱的主峰各管大致相当于1370至1635ml的洗脱体积。将两个柱上相当于吸收峰的各管合并，约得到525ml集合物，其中约含有2.3gSCF。使用Millipore Millipak 20膜性滤筒过滤除菌。
另外，也可在过滤除菌前超滤浓缩并渗析缓冲液交换C4柱洗脱的材料。
分离的重组人SCF1-164材料是高纯度的(对SDS-PAGE胶块作银染色证明纯度＞98％)，并可看作是医药级的。使用实施例2中所述方法，发现该材料的氨基酸组成与根据SCF基因推测者一致，并且如所期望的，其N末端氨基酸顺序为Met-Glu-Gly-Ile...，并保有由起始密码子编码的Met。
使用与回收在大肠杆菌中表达之人SCF1-164的相近方法，可以具有高生物学特异活性的纯化状态回收大鼠SCF1-164(发酵后也在细胞内以不溶性形式存在)。同样也可以回收人SCF1-183和大鼠SCF1-183。在拆迭/氧化期间，大鼠SCF1-183倾向于形成各种形式氧化的品种，而且更难于经层析除去不需要的形式。
在回收早期阶段，即溶解和拆迭/氧化阶段，大鼠SCF1-183和人SCF1-183倾向于蛋白水解降解。蛋白水解作用的主要部位在残基160和170之间。可经适当控制操作条件(如SCF浓度、pH值、加入2-5mM的EDTA或其他蛋白酶抑制剂)来减小蛋白水解作用，并可通过适当的分级分离步骤除去已存在的部分降解物。
虽然较好方案是，在拆迭/氧化期间使用尿素溶解(如前所述)，但也可以有效地利用其他助溶剂，如盐酸胍(如溶解期间用6M，拆迭/氧化期间用1.25M)和月桂酰肌氨酸钠。拆迭/氧化后除去所用试剂，继之可使用适当分离步骤回收经SDS-PAGE证实的纯化之SCF。
此外，虽然拆迭/氧化期间使用1mM谷胱甘肽是一优选方案，但也可以利用具有相同或相近效果的其他条件。例如，这些条件包括用2mM谷胱甘肽加0.2mM氧化态谷胱甘肽，或4mM谷胱甘肽加0.4mM氧化态谷胱甘肽，或用1mM 2-巯基乙醇或其他硫醇试剂代替1mM谷胱甘肽。
除上述层析方法外，用于回收纯化之活性SCF的其他方法包括疏水相互作用层析法[如使用苯基-Sepharose(Pharmacia)，于1.7M硫酸铵存在下，中性pH时加样，并用降低硫酸铵的梯度洗脱]、固相化金属亲合层析法[如使用带有Cu2+离子的螯合-Sepharose(Pharmacia)，在接近中性pH并存在1mM咪唑的条件下加样，并用增加咪唑的梯度洗脱]、羟基磷灰石层析[在中性pH和1mM磷酸盐存在下加样，并用增加磷酸盐的梯度洗脱]，以及其他本领域技术人员已知的方法。
也可以在大肠杆菌中表达相当于由图42中氨基酸1-248编码的全部或部分开放读码，或相当于由可能存在之切接mRNA编码的开放读码(如由图44中cDNA顺序代表者)的其他形式的人SCF，并按本实施例中所述的相似方法或其他本领域已知方法以纯化形式回收之。
包括如实施例16所述之所谓跨膜区的其他形式SCF的纯化和配制方法，可涉及利用去污剂(包括非离子型去污剂)和脂质(包括含磷脂的脂质体结构)。
                        实施例11
               来自哺乳动物细胞的重组SCF
A.发酵培养产生SCF的CHO细胞
在20升灌注培养系统中，在微载体上培养重组的中国仓鼠卵(CHO)细胞(CHO pDSRα2 hSCF1-162细胞株)以产生人SCF1-162。其发酵器系统与培养BRL3A细胞(实施例1B)所用者相似，不同的是：用于培养CHO细胞的生长培养基是Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)与Ham氏F-12营养混合物以1∶1比例混合的混合培养基(GIBCO)，其中添加了2mM谷氨酸胺、非必需氨基酸(用1∶100稀释的Gibco # 320-1140使已有浓度加倍)及5％胎牛血清。除去掉血清外，收获培养基完全相同。用生长于两个3升转瓶中的5.6×109个CHO细胞接种反应器。使细胞生长至浓度为4×105细胞/ml。此时将100g预灭菌的cytodex-2微载体(pharmacia)作为3升在磷酸盐缓冲盐水中的悬液，加到反应器内。使细胞接触微载体并在其上生长4天。可根据葡萄糖消耗情况，通过反应器灌注生长培养基。葡萄糖浓度维持在大约2.0g/L。四天后向反应器内加入六倍体积的元血清培养基，以除去大部分血清(蛋白质浓度＜50μg/ml)。然后不连续分批工作，直到葡萄糖浓度降至2g/L以下。从该点之后，反应器以大约20升/天的连续灌注速率进行工作。调整CO2流速使培养物的pH保持在6.9±0.3。必要时经补充纯氧以使溶解氧保持在20％空气饱和度。温度保持在37±0.5℃。
由上述体系中约产生450升无血清条件培养基，并用作纯化重组人SCF1-162的起始材料。
使用细胞株CHO pDSRα2 rSCF1-162，也可按相似方式产生约589升无血清条件培养基，并用作纯化大鼠SCF1-162的起始材料。
B.纯化重组哺乳动物细胞表达的大鼠SCF1-162
除特别指出者外，所有纯化工作均在4℃下进行。
1.浓缩和透滤(diafiltration)
通过0.45μSartocapsules(Sartorius)过滤以澄清上文A部分所述无血清培养细胞株CHO pDSRα2大鼠SCF1-162所产生的条件培养基。对几批材料(36升、101升、102升、200升和150升)分别进行浓缩和透滤/缓冲液交换。下面以36升批份为例说明操作方法。使用有3个截留分子量为10,000之醋酸纤维素膜卡盒的Millipore Pellicon正切流动超滤装置，将过滤的条件培养基浓缩至大约500ml(总膜面积15ft2，泵速～2,200ml/min，过滤速度～750ml/min)。然后向浓缩物内加入1000ml 10mM Tris-HCl(pH6.7-6.8)、再使用正切流动超滤装置浓缩至500ml，并如此再重复5次，以完成阴离子交换层析制备中的渗滤/缓冲液交换。最后回收的浓缩/渗滤之制剂体积为1000ml。受到浓缩和透滤/缓冲液交换之各批条件培养基的行为均相似。接Bradford方法[Anal.Bioch.， 72，248-254(1976)]，用牛血清白蛋白作标准品测得各批份的蛋白质浓度为70-90μg/ml。用于该制备之条件培养基的总体积约为589升。
2.Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析
合并按上述方法由5批条件培养基浓缩/透滤的制剂(总体积5,000ml)。加入1M HCl将pH调到6.75。使用2000ml 10mM Tris-HCl(pH6.7)，使导电率达到约0.700mmho。将该制剂加到已用10mM Tris-HCl(pH6.7缓冲液)平衡的Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(36×14cm；Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow树脂)上。加样后，用28,700mlTris缓冲液洗柱；再用23,000m 15mM醋酸/1mM甘氨酸/6M尿素/20μM CuSO4(约pH4.5)洗柱；然后用10mM Tris-HCl、20μM CuSO4、pH6.7缓冲液洗柱，使pH回复到中性并除去尿素，再加以盐梯度(0-700mM NaCl在10mM Tris-HCl、20μM CuSO4，pH6.7缓冲液中；总体积40升)。以大约3,250ml/小时的流速，按每部分490ml收集。层析图形如图36所示。“MC/9cpm”是指MC/9检测中的生物学活性；所指示各部份每份检测5μl。图中未显示加样和洗柱期间收集的洗脱物；在这些部分中测不出生物学活性。
3.使用硅结合的碳氢化合物树脂层析
合并图36中所示的第44-66部分(11200ml)，并加入EDTA到终浓度为1mM。将该材料以大约2000ml/小时的流速加到用缓冲液A(10mM Tris，pH6.7/20％乙醇)平衡的C4柱(Vydac Proteins C4；7×8cm)上。加样后用1000ml缓冲液A洗柱。然后加以从缓冲液A到缓冲液B(10mM Tris，pH6.7/94％乙醇)的线性梯度(总体积6000ml)，并按30-50ml分段收集。在制备进行生物学分析的制剂时，除0.5ml等分梯度洗脱部分外，C4柱起始样品、过柱集合物和洗涤集合物均对磷酸盐缓冲盐水透析。用MC/9检测法检测上述各部分(5ul等份的梯度洗脱部份；cpm数示于图37中)。图38显示了各部分之等分样品的SDS-pAGE[Laemmli，Nature 227，680-685(1970)；堆积胶含有4％(W/V)丙烯酰胺，分离胶含有12.5％(W/V)丙烯酰胺]结果。所示各凝胶均于真空下干燥等分样品(100μl)，然后用20μl样品处理缓冲液重新溶解(还原，即用2-巯基乙醇)并在加到凝胶上之前煮沸5分钟。图左侧的编号标志代表分子量标志物(还原的)的迁移位置(同图6)。编号泳道代表加最后一部分梯度洗脱液时收集的相应部分。对凝胶进行银染色[Morrissey，Anal.Bioch， 117，307-310(1981)]。
4.Q-Sepharose Fast How阴离子交换层析
合并由图37中所示C4柱上收集的第98-124部分(管)(1050ml)。用10mM Tris，pH6.7缓冲液按1∶1稀释合并的洗脱物，以降低乙醇浓度。然后将稀释的集合洗脱物加至已用10mM Tris-HCl(pH6.7)缓冲液平衡的Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱(3.2×3cm，Phrmacia Q-Sepharose Fast Flow树脂)上。流速为463ml/小时。上样后用135ml柱缓冲液洗柱并用10mM Tris-HCl、350mM NaCl(pH6.7)洗脱结合的材料。倒转柱内的流动方向以减小被洗脱物的体积，并在洗脱时收集到7.8ml洗脱部分。
5.Sephacryl S-200HR凝胶过滤层析
合并盐洗脱Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱得到的含被洗脱蛋白质的各部分(31ml)。将30ml洗脱物加到在磷酸盐缓冲盐水中平衡的Sephacryl S-200HR(Pharmacia)凝胶过滤柱(5×55.5cm)上。以68ml/小时的流速收集6.8ml部分。合并相当子280nm吸光率峰值的各部分，即为最后纯化的材料。
该纯化过程的总结示于表15中。
                          表15
   对哺乳动物细胞表达之大鼠SCF1-162纯化过程的总结
  步骤   体积(ml)   总蛋白(mg)*
  条件培养基(浓缩的)Q-Sepharose Fast FlowC 4树脂Q-Sepharose Fast FlowSephacryl S-200HR   7,00011,2001,0503182   28,420974192019**
*用Bradford方法(文献同上，1976)测定。
**使用与实施例2中所述者相似的方法，经定量氨基酸分析测定为47.3mg。
用实施例2所述方法测定纯大鼠SCF1-162之N末端氨基酸顺序大约一半是Gln-Glu-Ile...，一半是pyroGlu-Glu-Ile...。这一结果表明大鼠SCF1-162是在图14C中所示残基(-1)(Thr)和(+1)(Gln)之间蛋白水解加工/裂解的产物。相似地，由转染的CHO细胞条件培养基纯化者(下方)具有N末端氨基酸顺序Glu-Gly-Ile，此表明其为在图15C所示残基序号(-1)(Thr)和(+1)(Glu)之间加工/裂解的产物。
使用上述方法，可产生在CHO细胞内表达之重组形式的或天然衍生的纯化人SCF蛋白。
适用于纯化哺乳动物细胞衍生之重组SCF的其他纯化方法包括实施例1和10中所述者，以及本领域技术人员熟知的其他方法。
也可以在哺乳动物细胞中表达相当于由图42所示氨基酸1-248编码的全部或部分开放读码，或相当于由可能存在之裂接mRNA编码之开放读码(如由图44中cDNA顺序代表者)的其他形式的人SCF，并可按与该实施例中所述相似的方法，或其他本领域已知的方法，以纯化的形式回收之。
C.SDS-PAGE的糖苷酶处理
图39中显示了合并的Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱洗脱部分的SDS-PAGE结果。装柱量为2.5μl集合物(泳道1)。该泳道是经过银染色的。分子量标志物(泳道6)同图6所示。上方不同的迁移材料和稍下方分子量31,000标志物位置代表了生物学活性材料；这种表观异源性在很大程度上是由于糖基化作用的异源性。
为鉴定糖基化作用的特征，对纯化的材料用各种糖苷酶处理、用SDS-PAGE法分析(还原条件)并经银染色作肉眼观察。结果示于图39中。泳道2，神经氨酸酶；泳道3，神经氨酸酶和O-聚糖酶；泳道4，神经氨酸酶、O-聚糖酶和N-聚糖酶；泳道5，神经氨酸酶和N-聚糖酶；泳道7，N-聚糖酶；泳道8，N-聚糖酶(没有底物)；泳道9，O-聚糖酶(没有底物)。条件是加10mM3-[(3-乙醇氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内酯(CHAPS)、66.6mM 2-巯基乙醇、0.04％(W/V)叠氮钠、磷酸盐缓冲盐水，37℃保温30分钟，然后在糖苷酶存在下，加入所述浓度的一半37℃保温18小时。所用神经氨酸酶(得自Arthrobacterureafaciens，由Calbiochem公司提供)浓度为0.5单位/ml，0-聚糖酶(Genzyme；内-α-N-乙酰基-氨基半乳糖苷酶)浓度为7.5毫单位/ml，N-聚糖酶(Genzyme；肽：N-糖苷酶F；肽-N4[N-乙酰基-β-葡糖胺基]天冬酰胺酶)浓度为10单位/ml。
可根据需要进行各种对照保温。可加糖苷酶保温，以证实所得结果系由于加入了糖苷酶制剂所加致；入已知为糖苷酶底物的糖基化蛋白质(如糖基化重组人促红细胞生成素)保温，以证实所用糖苷酶是有活性的；加糖苷酶而不加底物保温，以判定糖苷酶制剂呈现或掩敝可见的凝胶带(图39，泳道8和9)。
由上述实验可得出多个结论。用N-聚糖酶[其可除去复合物及高甘露糖N连接的碳水化合物(Tarentino et al.，Biochemistry 24，4665-4671(1988)]、神经氨酸酶(其可可除去唾液酸残留物)、及O-聚糖酶〔其可除去某些O连接的碳水化合物(Lambin et al.，Biochem.，Soc.Trans. 12，599-600(1984)]所作各种处理提示：存在N连接的和O连接的碳水化合物，且存在唾液酸，同时至少有些是O连接之部分的一部分。事实上用N-聚糖酶处理可以将经过SDS-PAGE分析显现的异质性材料转化为较快速迁移的形式，后者同源性更好表明所有材料均代表同一种多肽，且这种异质性主要是因糖基化作用的异质性所致。
                     实施例12
              重组SCF1-164 PEG的制备
用按照实施例6A和10所述方法由重组大肠杆菌表达系统纯化的大鼠SCF1-164作为进行下述聚乙二醇修饰的起始材料。
将溶于0.327ml去离子水中的甲氧聚乙二醇-琥珀酰亚氨基-琥珀酸酯(18.1mg＝3.63μmol；SS-MPEG＝Sigma Chemical Co.no.M3152，分子量～5,000)加至溶于1.0ml 138mM磷酸钠、62mM NaCl、0.62mM乙酸钠(pH8.0)中的13.3mg(0.727μmol)重组大鼠SCF1-164内。室温下将所得溶液轻轻摇动(100rpm)30分钟。然后将1.0ml等分的最终反应混合物(10mg蛋白质)加到Pharmacia Superdex 75凝胶过滤柱(1.6×50cm)上，并于室温干用100mM磷酸钠(pH6.9)以0.25ml/分钟的速率洗脱。弃去前10ml柱洗脱物，然后以每管1.0ml收集。连续监测柱洗脱物的UV吸光率(280nm)，结果如图40A所示。合并第25至27管，通过0.2μ聚砜膜(GelmanSciences no.4454)超滤除菌并将所得物定名为PEG-25。同样地合并第28至32管内容物，超滤除菌并定名为PEG-32。根据1.0mg/ml未修饰大鼠SCF1-164溶液的吸光率为0.66，由A280测定结果算出合并的PEG-25部分含有3.06mg蛋白质，且合并的PEG-32部分含有3.55mg蛋白质。在第34至37管中洗脱得到占反应混合物内总蛋白11.8％的未处理的大鼠SCF1-164。于相似的层析条件下，洗脱出未经修饰的大鼠SCF1-164，其为一个滞留体积45.6ml的主峰(图40B)。第77至80管(图40A)含有N-羟基琥珀酰亚胺，其为大鼠SCF1-164与SS-MPEG反应的付产物。
大鼠SCF1-164中的潜在反应性氨基基团包括12个赖氨酸残基和N末端谷氨酰胺残基的α氨基基团。按Habeeb所述方法[Anal.Biochem. 14：328-336(1966)]，用三硝基苯磺酸(TNBS)作分光光度滴定，测得合并的PEG-25部分内每摩尔蛋白质含9.3mol反应性氨基基团。同样，合并的PEG-32部分每摩尔蛋白质含有10.4mol反应性氨基基团，且未修饰的大鼠SCF1-164含有13.7mol反应性氨基基团。可见，合并的PEG-32部分内平均有3.3(13.7减10.4)个大鼠SCF1-164的氨基基团经与SS-MPEG反应而受到修饰。相似地，合并的PEG-25部分中则平均有4.4个大鼠SCF1-164的氨基基团被修饰。也使用上述方法对实施例10中产生的人SCF(hSCF1-164)作了修饰。具体地说是使714mg(38.5μmol)hSCF1-164与溶于75ml 0.1M磷酸钠缓冲液(pH8.0)的962.5mg(192.5umol)SS-MPEG室温下反应30分钟。将该反应混合物加到Sephacryl S-200 HR柱(5×134c m)上并用PBS(没有CaCl2和MgCl2的Gibco Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水)以102ml/小时的流率洗脱，然后以每管14.3ml收集。将相似于上述PEG-25集合物(图40A)的第39-53管合并，发现其中共含有354mg蛋白质。图8C中显示了该经过修饰的灵长目动物SCF的体内活性。
                      实施例13
           白血病母细胞上的SCF受体表达
由混合谱系白血病病人的外周血中收获白血病母细胞。用密度梯度离心法纯化细胞并除去粘附。按实施例7中所述方法碘化人SCF1-164。按已述方法[Broudy，Blood，75，1622-1626(1990)]将细胞与不同浓度碘化的SCF一起保温。该受体结合实验的结果示于图41中。估计受体密度约为70,000个受体/细胞。
                     实施例14
          大鼠SCF对早期淋巴样前体细胞的活性
在小鼠骨髓的琼脂胶培养物中研究了重组体大鼠SCF1-164(rrSCF1-164)与IL-7协同作用以提高淋巴样细胞增殖的能力。该试验中，只加rrSCF1-164所形成的集落含有单核细胞、嗜中性白细胞和母细胞，而单用IL-7或与rrSCF1-164联合刺激的集落则主要含有前B细胞。使用荧光标记的抗B220抗原[Coffman，Immunol.Rev.， 69，5(1982)]和抗表面Ig(FITC-羊抗-K，SouthernBiotechnology Assoc.，Birmingham，AL)抗体对合并的细胞进行FACS分析，鉴定特征为B220+、sIg-、Cu+的前B细胞；并使用荧光标记的抗体(TRITC-羊抗-μ，Southern BiotechnologyAssoc.，)对胞浆μ表达进行Cytospin玻片分析。重组人IL-7(rhIL-7)得自Biosource International(Westlake Village，CA)。当将rrSCF1-164与前B细胞生长因子结合加入时，可观察到其对集落形成有协同促进作用(表16)，进而表明rrSCF1-164对早期B细胞的祖细胞有刺激作用。
表16：rrSCF1-164与hIL-7对前B细胞集落形成
            的刺激作用
  生长因子   集落数1
  盐水rrSCF1-164 200ng100ng50ngrhIL-7 200ng100ng50ng25ngrhIL-7 200ng+rrSCF1-164200ng100ng+200ng50ng+200ng25ng+200ng   013±27±44±221±618±613±64±260±048±824±1021±2
1每5×104个铺板的小鼠骨髓细胞形成的集落数。
各数值均为三份重复样品的平均值±SD。
                       实施例15
                     SCF受体的鉴定
A.C-kit是SCF1-164的受体
为试验SCF1-164是否为C-kit的配体，使用得自SCF1-164反应性肥大细胞系MC/9[Nabel et al.，Nature  291，332-334(1981)的DNA与根据已公开之顺序设计的引物进行PCR反应，以扩增整个小鼠C-kit[Qiu et al，EMBO J. 7，1003-1011(1988)]的cDNA。使用相似技术克隆来自人红白血病细胞系HEL[Martinand Papayannopoulou，Science， 216，1233-1235(1982)]，由氨基酸1-549编码的人c-kit的配基结合和跨膜区域[Yarden etal.，EMBO J.， 6，3341-3351(1987)]。将c-kit cDNA插入转染到COS-1细胞内的哺乳动物表达载体V19.8中，并按照下文B和C部分所述的方法，制备使用大鼠或人125I-SCF1-164进行结合试验的膜材料。表17显示了典型结合试验的数据。其中未测知125I人SCF1-164能特异地结合到只用V19.8转染的COS-1细胞上。但表达人重组C-kit配基结合加跨膜区(hckit-LTI)的COS-1细胞则结合了125I-hSCF1-164(表17)。加入200倍摩尔过量的未标记人SCF1-164可降低结合至本底水平。相似地，用全长小鼠c-kit(mckit-L1)转染的COS-1细胞可与大鼠125I-SCF1-164结合。在只用V19.8转染的COS-1细胞中可检测到小量大鼠125I-SCF1-164结合，而且也已在未转染的细胞中观察到相似结果(未示出)，此表明COS-1细胞可表达内源性c-kit。这一发现是与c-kit表达的广泛细胞分布相一致的。大鼠125I-SCF1-164可相似地与人和小鼠c-kit结合，而人125I-SCF1-164则以较低活性与小鼠c-kit结合(表17)。这一数据符合于种间SCF1-164交叉反应性的特征。大鼠SCF1-164可诱导人骨髓的增殖，其比活性相似于人SCF1-164；而人SCF1-164则可诱导小鼠肥大细胞的增殖，其比活性比大鼠蛋白质小800倍。
总之，这些发现进一步证实由W或S1突变小鼠表达的表型异常是c-kit受体/配基相互作用之基本缺陷的结果，而这些对于各种各样细胞型的发育都是很关键的。
表17：SCF1-164与COS-1细胞内表达之重组c-kit的结合
  转染的质粒   结合的CPMa
  人SCF1-164   大鼠SCF1-164
 125I-SCFb  125I-SCF+Coldc  125I-SCFd  125I-SCF+Colde
  V19.8V19.8：hckit-LT1V19.8：mckit-L1   2,16059,3509,500   2,1502,3801,100   1,10070,00052,700   5501,100600
a.显示重复测定的平均值；已独立完成实验，且三次结果均相似。
b.1.6nM人125I-SCF1-164
c.1.6nM人125I-SCF1-164+320nM未标记的人SCF1-164
d.1.6nM大鼠125I-SCF1-164
e.1.6nM大鼠125I-SCF1-164+320nM未标记的大鼠SCF1-164
B.COS-1细胞中重组c-kit的表达
分别由人红白血病细胞系HEL和MC/9细胞中经酸性苯酚/氯仿提取法[Chomczynsky and Sacchi，Anal.Biochem.， 162，156-159(1987)]分离总RNA，然后用PCR技术[Saikietal.，Science，239，487-491(1988)]从中分别得到人和小鼠c-kitcDNA克隆。根据已公开的人和小鼠c-kit顺序没计有独特顺序的寡核苷酸。使用c-kit反义寡核苷酸作引物，依照已述使用酶，Mo-MLV反向转录酶(Bethesda Research Laboratories，Bethesda，MD)的方法由总RNA合成第一股cDNA。使用适当的c-kit引物对，扩增c-kit配基结合区和酪氨酸激酶区的交迭区域。将这些区域克隆到适于在COS-1细胞内表达的哺乳动物表达载体V19.8中(图17)。对几个克隆的DNA顺序分析结果表明，RCR扩增期间各克隆可能产生独立突变。通过装配来自分立之克隆的非突变限制片段，而构建成一个没有这些突变的克隆。在所有或大约一半的克隆中，出现了不同于已公开之顺序的某些差异，这些可能是所用细胞系内存在的真正顺序差异，并可能代表了不同子已公开顺序的等位基因差异。在V19.8中构建了下列质粒：V19.8：mckit-LT1，其为完整的小鼠c-kit；以及V19.8：hckit-L1，其含有人c-kit的配基结合加跨膜区(氨基酸1-549)。
大致按实施例4中所述方法将质粒转染到COS-1细胞中。
C.125I-SCF1-164与表达重组c-kit之COS-1细胞的结合
转染两天后，从培养皿上刮下COS-1细胞，在PBS中洗涤并冷冻备用。熔融后，将细胞悬浮在含有1mM PMSF、100μg/ml aprotinin、25ug/ml抑酶醛肽、2μg/ml抑胃肽和200μg/ml TLCK-HCl的10mM Tris-HCl、1mM MgCl2中。用吸管吸入并滴下5次以使悬液分散均匀，在冰上保温15分钟，然后用Dounce匀浆器上下往复15-20次将细胞制成匀浆。向匀浆液内加入蔗糖(250mM)，并离心(500g，5分钟)沉淀出核和残留未破碎的细胞。再以25,000g离心(4℃)30分钟进一步除去残留的细胞碎片。使用氯胺T法[Hunterand Greenwood，Nature， 194，495-496(1962)]以放射性碘标记人和大鼠SCF1-164。在含有RPMI培养基并添加1％牛血清白蛋白和50mM HEPES(pH7.4)的结合缓冲液中，加或不加200倍过量(摩尔量)的未标记SCF1-164，使COS-1细胞膜部分与人或大鼠125I-SCF1-164(1.6nM)于22℃下一起保温1小时。在结合保温终止时，将膜制剂轻轻铺敷在150μl邻苯二甲酸酯油上，并在Beckman微量离心管11中离心20分钟，直到由游离125I-SCF1-164中分离出膜结合的125I-SCF1-164。剪除沉淀碎片并测定膜结合的125I-SCF1-164。
                   实施例16
               分离人SCF cDNA
A.HT-1080 cDNA文库的构建
用酸式硫氰酸鈲-苯酚-氯仿提取法[Chomczynski et al.，Anal.Biochem. 162，156(1987)]由人纤维肉瘤细胞系HT-1080(ATCC CCL121)中分离总RNA，并使用购自Clontech公司的Oligo(dT)柱回收poly(A)RNA。在提供者推荐的条件下，用BRL(Bethesda Research Laboratory)cDNA合成试剂盒由2μg poly(A)RNA制备双链cDNA。将大约100ng平均大小约2kb的柱分离之双链cDNA连接到300ng SalI/NotI消化的载体pSPORT 1[D′Alessio et al.，Focus， 12，47-50(1990)]上，并用电穿孔法[Dower et al.，Nucl.Acids Res.，16，6127-6145(1988)]转化到DH5α(BRL，Bethesda，MD)细胞中。
B.cDNA文库的筛选
将大约2.2×105个初级转化体分成44份，各含有～5000个克隆。用已述的CTAB-DNA沉淀法[Del Sal etal.，Biotechniques， 7，514-519(1989)]由各份集合物中制备质粒DNA。由各质粒DNA池中各取2μg用限制酶NotI消化并经凝胶电泳分离之。将线性化DNA转移到Gene Screen Plus膜(DuPont)上，在前述条件下[Lin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 82，7580-7584(1985)]与32P标记的PCR产生的人SCF cDNA(实施例3)杂交。根据杂交结果鉴定出三个含阳性信号的集合物。以集落杂交法[Lin et al.，Gene， 44，201-209(1986)]再次筛选这些集落集合物，直至由其中各自得到单个集落。这三个分别克隆之cDNA的大小约在5.0到5.4kb之间。对5-末端所作限制酶消化和核苷酸顺序测定的结果表明，其中有两个克隆是相同的(10-1a和21-7a)。它们均含有编码区和大约200bp的5′非翻译区(5′UTR)。第三个克隆(25-1a)5′端约比另外两个克隆短400bp。该人SCF cDNA的顺序示于图42中。应特别提到的是，疏水跨膜区顺序由氨基酸186-190的区域开始并终止在氨基酸212处。
C.pDSRα2 hSCF1-248的构建
按下述方法使用质粒10-1a(见实施例16B)和pGEM3hSCF1-164制得pDSRα2 hSCF1-248：将得自pGEM3hSCF1-164的HindIII插入段转移到M13mp18上。使用反义寡核苷酸
5′-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T 3′和购自Amersham公司的寡核苷酸指导的体外诱变系统试剂盒及操作程序，经定点诱变将ATG起始密码子相连的上游核苷酸由tttccttATG改变为gccgccgccATG，以产生M13m p18 hSCFK1-164。用HindIII消化该DNA并插入已用HindIII消化的pDSRα2中。该克隆被称为pDSRα2 hscFK1-164用Xbal消化pDRα2hSCFK1-164的DNA并加入Klenow酶和四种dNTP将此DNA修成平头。该反应终止后，进一步用Spel酶消化之。用DraI消化克隆10-1a以在插入段内产生3′端至开放读码的平头，同时用可在pDSRα2 hSCFK1-164和10-1a之基因内同一位点切割的SpeI酶消化之。将这些DNA连接在一起，以得到pDSRα2 hSCFK1-248。
D.用pDSRα2。hSCFK1-248DNA转染并免疫沉淀COS细胞
用如上构建的DNA转染COS-7(ATCC CRL1651)细胞。用10μg pDSRα2 hSCFK1-248DNA或10μg pDSRα2载体DNA(载体对照)以1600V对0.8ml DMEM+5％FBS中的4×106个细胞进行电穿孔。电穿孔后，将细胞重新铺敷在两个60mm培养皿中。24小时后更换新鲜培养基。
转染72小时后，按照改良的Yarden等人的方法(PNAS，87，2569-2573，1990)用35S-培养基标记各培养皿。用PBS洗细胞(一次)，然后加入元蛋氨酸、无半胱氨酸DMEM(met-cys-DMEM)保温30分钟.除去培养基后向各平皿内加入1ml含100μCi/ml Tran 35S标记(ICN)的met-Cys-DMEM。于37℃下保温8小时。收获培养基，离心除去细胞碎片并于-20℃下冷冻保存。
按照Yarden等人改良的方法(EMBO，J.， 6，3341-3351，1987)，将COS/pDSRα2 hSCFK1-248和COS/pDSRα2载体对照的标记的条件培养基等分样品与35S-标记的CHO/pDSRα2 hSCF1-164克隆17细胞(见实施例5)一起进行免疫沉淀。用10μl预免疫兔血清(#1379P.I.)处理各1ml条件培养基样品。样品于4℃下保温5小时。向各管内加入100微升在0.15M NaCl、20mM Tris(pH7.5)、0.2％Triton X-100中的金黄色葡萄球菌(Pansor-bin，Calbiochem.)的10％悬浮液。样品于4℃下继续保温1小时。以13,000g离心5分钟以沉淀免疫复合物。将上清移入新的试管中，并与5μl实施例11中纯化的、抗CHO衍生之hSCF1-162的兔多克隆抗血清4℃下保温过夜。加入100μl Pansorbin保温1小时，并按前述方法沉淀免疫复合物。沉淀物用溶解缓冲液(0.5％脱氧胆酸钠、0.5％NP40、50mM NaCl、25mM Tris，pH8)洗1次，用洗涤缓冲液(0.5M NaCl、20mM Tris pH7.5、0.2％Triton X-100)洗3次，再用20mM Tris(pH7.5)洗1次。然后悬浮于50μl 10mM Tris pH7.5、0.1％SDS、0.1Mβ-巯基乙醇中。经煮沸5分钟洗提SCF蛋白。样品以13,000g离心5分钟，然后回收上清液。
按下述方法完成糖苷酶处理过程：向25μl免疫复合物样品中加入3微升含1.6mU O-聚糖酶、0.5U N-聚糖酶和0.02U神经氨酸苷酶的75mM CHAPS，并于37℃下保温3小时。加入等体积2×PAGE样品缓冲液并将样品煮沸3分钟。经消化和未经消化的样品均在15％SDS聚丙烯酰胺还原凝胶上以8m A电泳过夜。在甲醇-乙酸中固定凝胶，用Enlightening增强剂(NEN)处理30分钟、干燥并于-70℃下与Kodok XAR-5胶片接触曝光。
图43显示所得的放射自显影图谱。泳道1和2是对照COS/pDSRα2培养物样品；泳道3和4得自COS/pSRα2hSCFK1-248；泳道5和6得自CHO/pDSRα2 hSCF1-164。泳道1、3和5是未经消化的免疫沉淀物；泳道2、4和6是已用聚糖酶消化过的(见上述)。分子量标志物的位置示于左侧。SCF在pDSRα2 hSCFK1-248转染的COS细胞内的加工非常类似于由pDSRα.2 hSCF1-164转染之CHO细胞分泌的hSCF1-164(实施例11)。这一现象提示由细胞释放的SCF天然蛋白水解加工位点是在氨基酸164附近。
                   实施例17
            人SCF的四级结构分析
校准按实施例1所述用于由BRL细胞培养基中纯化SCF的凝胶过滤柱(ACA54)(加有分子量标准品)，并由其他校准的凝胶过滤柱洗脱纯化的SCF后，可以看出由BRL细胞培养基纯化的SCF相对于分子量标准品，表观分子量约为70,000-90,000。反之，经SDS-PAGE分析测得的表观分子量约为28,000-35,000。虽然可以了解到糖基化蛋白质在此种分析中可能有异常行为，但这些结果却提示，在非变性条件下，BRL衍生的大鼠SCF可以作为非共价结合的二聚体存在。重组SCF形式(如由大肠杆菌产生的大鼠和人SCF1-164和得自CHO细胞的大鼠和人SCF1-162)也显示相似结果，其中在非变性条件下以凝胶过滤法估计的分子大小约为在变性条件下(如存在SDS)以凝胶过滤法或特殊情况时使用SDS-PAGE法估计的分子大小的两倍。另外用沉降速度分析法(该方法可准确地测定溶液中材料的分子量)测得大肠杆菌产生之重组人SCF1-184的分子量约为36,000。该值仍约为SDS-PAGE测得值(约18,000～19,000)的两倍。因此，尽管存在多种寡聚态(包括一聚态)，但在一定的溶解条件下显然以二聚态占优势。
                        实施例18
           分离得自5637细胞系的人SCF cDNA克隆
A.5637cDNA文库的构建
用酸性硫氰酸鈲-苯酚-氯仿提取法[Chomczynski et al.，Anal.Biochem.， 162，156(1987)]由人膀胱癌细胞系5637(ATCCHTB-9)中分离总RNA，并使用购自Clontech的Oligo(dT)柱回收poly(A)RNA。在提供者推荐的条件下用BRL cDNA合成试剂盒由2μg poly(A)RNA制备双链cDNA。将经80ng约经柱层析分离的、平均大小为2kb的双链cDNA连接到300ng SalI/NotI消化的载体pSPORT1(D′Alessio et al.，Focus，12，47-50(1990)]上并用电穿孔法[Dower et al.，Nucl.AcidsRes.， 16，6127-6145(1988)]转化到DH5α细胞中。
B.cDNA文库的筛选
将大约1.5×105个初级转化体分成30份集合物，其中各约含5,000个克隆。用已述的CTAB-DNA沉淀法[Del Salet al.，Biotechniques， 7，517-519(1989)]由各集合体制备质粒DNA。各取2微克质粒DNA用限制酶NotI消化并以凝胶电泳法分离之。将线性化的DNA转移到Gene Screen Plus膜(DuPont)上，并于前述条件[Lin et al.， PNAS USA， 82，7580-7584(1985)]下与32P标记的得自HT1080细胞系(实施例16)的全长人SCF cDNA杂交。根据杂交结果鉴定出七份含阳性信号的集合物。用32P标记的PCR、经集落杂交法[Lin et al.，Gene， 44，201-209(1986)]产生的人SCF cDNA再次筛选集落池(集合物)，直到由四个集落池中得到单个集落。这四个分离的克隆之插入段的大小约为5.3kb。对克隆之5′端所作限制酶消化及核苷酸顺序分析表明，这四个克隆都是相同的。图44中显示了该人cDNA的顺序。图44所示cDNA编码的多肽中，图42所示顺序的氨基酸149-177被一个Gly残基所取代。
                     实施例19
        致死量放射线照射后SCF提高存活期的作用
A.致死放射线照射后，SCF对存活期的影响
试验了致死量放射线照射后，SCF对小鼠存活期的影响。所用小鼠为10至12周令雌性Balb/c。所有实验中小鼠均按5只一组，各实验内所用小鼠的体重均相近。以850或950拉得(rad)为一次剂量照射小鼠。单用因子或因子加正常Balb/c骨髓细胞注射。第一种情况下，于照射后24小时给小鼠静脉内注射由大肠杆菌中纯化并按实施例12所述加聚乙二醇修饰的大鼠PEG-SCF1-164(20μg/Kg)，或注射盐水作为对照组。对于骨髓移植模型，则于照射后4小时注射各种细胞剂量的正常Balb/c骨髓。为了用大鼠PEG-SCF1-164处理，于注射前向细胞悬液内加入200μg/Kg大鼠PEG-SCF1-164，然后再以因子加细胞作一次静脉注射。
850拉得照射后，给小鼠注射大鼠PEG-SCF1-164或盐水。结果如图45所示。与对照组动物相比，注射大鼠PEG-SCF1-164可显著延长小鼠的存活时间(P＜0.0001)。注射盐水小鼠的平均存活7.7天，而注射大鼠PEG-SCF1-164者则平均存活9.4天(图45)。图45所示结果代表了对每个处理组30只小鼠，共四次实验的总结。
用大鼠PEG-SCF1-164处理小鼠提高了存活期，此提示SCF对被照射小鼠之骨髓细胞的影响。对这些动物之血象参数的初步研究显示，在照射后5天时血小板水平较对照组稍有增加，而在照射后7天时则与对照组无明显差异。已测知RBC或WBC水平或骨髓细胞活力无差异。
B.用SCF处理之接受移植小鼠的存活期
将10％剂量的正常Balb/c骨髓细胞移植到经过850拉得射线照射的小鼠体内，结果可挽救90％或更多的动物(数据未示出)。因此使用850拉得的照射剂量和5％的移植物剂量来研究大鼠PEG-SCF1-164对存活期的影响。这一细胞剂量是可行的，这样较大比例未接受SCF的小鼠将不能存活；如大鼠PEG-SCF1-164能刺激被移植的细胞，存活期便可增加。如图46所示，约30％的对照组动物子照射后存活了8天。用PEG-SCF1-164处理，则使这些小鼠中95％以上的存活期显著提高到至少30天(图46)。图46所示结果代表对对照组和大鼠PEG-SCF1-164处理组各20只小鼠所作的4次实验的总结。在使用更高照射剂量时，用大鼠PEG-SCF1-164结合骨髓移植物处理动物，也可提高存活期(图47)。以950拉得照射并移植10％骨髓的对照组小鼠在第8天死亡，而用大鼠PEG-SCF1-164处理的小鼠约有40％存活了20天或更长。只有20％移植了20％骨髓的对照组小鼠存活20天以上，而rSCF处理组则有80％存活20天以上(图47)。
                 实施例20
          抗SCF单克隆抗体的生产
8周令雌性Balb/c小鼠(Charles River，Wilmington，MA)皮下注射20μg由大肠杆菌表达的人SCF1-164[在完全弗氏佐剂(H37-Ra；Difco Labaratories，Detroit，MI)中]。于第14、38和57天时将50μg同一抗原加到不完全弗氏佐剂中经皮下给药作加强免疫。未次注射后3天，杀死两只小鼠取其脾细胞，按Nowinski等人所述方法[Virology，93，111-116(1979)]与sp2/0骨髓瘤细胞融合。
用于培养sp2/0和杂交瘤细胞的培养基是添加20％热失活胎牛血清(Phibro Chem.，Fort Lee，NJ)、110mg/ml丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100mcg/ml链霉素(Gibco)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)(Gibco，ChagrinFalls，Ohio)。融合后在含有10-4M次黄嘌呤、4×10-7M氨甲嘌呤和1.6×10-5M胸苷的HAT培养基中培养2周，然后在含有次黄嘌呤和胸苷的培养基中培养2周，以选择杂交细胞。
按下述方法筛选杂交瘤：
室温下用存在于50μl 50mM碳酸氢盐缓冲液(pH9.2)中的0.25μg人SCF1-164 (E.coli)致敏聚乙烯小井(Coster，Cambridge，MA)2小时，然后4℃过夜。室温下用5％BSA(在PBS中)将培养板封闭30分钟，然后在37℃下与杂交瘤培养物上清液保温1小时。弃去溶液并使结合的抗体与1∶500稀释的、结合了辣根过氧化物酶(Boehringer Mannheim Biochemi-cals，Indianapolis，IN)的羊抗小鼠IgG于37℃下保温1小时。用洗涤溶液(KPL，Gaithersburg，MD)洗培养板后加H2O2和ABTS(KPL)的混合物显色。测405nm的吸光率(比色)。
同杂交瘤筛选法一样，用ELISA法试验分泌抗人SCF1-164 (E.coli)特异抗体的杂交瘤细胞培养物，看是否其分泌产物与人SCF1-162(CHO)有交叉反应。用有限稀释法再次克隆杂交瘤细胞。所试验的55个小井的杂交瘤上清液与人SCF1-164 (E.coli)呈强阳性反应；其中有9个与人SCF1-162(CHO)有交叉反应。
         已克隆的几株杂交瘤细胞如下所示：
  单克隆   IgG异型   与人SCF1-162(CHO)的反应性
 4G12-136C9A8H7A   IgG1IgG1IgG1   无无有
杂交瘤4G12-13和8H7A已于1990年9月26日寄存在ATCC。
             *           *          *
虽然本发明已描述了上述优选实施方案，但应明确是，任何改动和变更对本领域技术人员来说都将是显而易见的。因此，其待批权利要求倾向于复盖这些等效变动，且后者亦应属本发明之范围内的。

Claims (37)

1.一种质粒或病毒DNA载体，包括用于在原核或真核宿主细胞中表达一种多肽的DNA序列，所述多肽包括天然存在的干细胞因子一级结构或其片段，并具有天然存在的干细胞因子的造血生物活性，所述DNA序列选自：
(a)图14B、图14C、图15B、图15C、图42和图44给出的DNA序列或它们的互补链；
(b)与(a)中DNA序列杂交的DNA序列或(a)中所定义的DNA序列的片段，其中所述杂交在62℃的1％SDS和6×SSC中进行；最后在62℃的1％SDS和6×SSC中洗；和
(c)由于遗传密码的简并性而与分离的上述(a)和(b)的DNA在核苷酸序列上不同的分离DNA序列，并且所述序列编码具有与(a)和(b)中所编码的相同的氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列包含一个或多个适于在非哺乳动物细胞中表达的密码子。
3.根据权利要求2的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列包含一个或多个适于在大肠杆菌细胞中表达的密码子。
4.根据权利要求1的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列包含一个或多个适于在酵母细胞中表达的密码子。
5.根据权利要求1的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列编码人干细胞因子。
6.根据权利要求1的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列编码人干细胞因子多肽，根据图42的编号，所述多肽选自SCF1-162、SCF1-164、SCF1-165和SCF1-248。
7.根据权利要求1的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列编码人干细胞因子多肽，根据图44的编号，所述多肽选自SCFmet1-157、SCF1-157、SCFmet1-160、SCF1-160、SCFmet1-161、SCF1-161、SCFmet1-220、SCF1-220。
8.根据权利要求1的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列编码所述多肽成熟形式的N末端甲硫氨酰残基。
9.根据权利要求1-8中任一项的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列与可检测标记共价结合。
10.根据权利要求9的质粒或病毒DNA载体，其中DNA序列被放射性标记。
11.一种原核或真核宿主细胞，其用权利要求1-8中任一项的包括DNA序列的质粒或DNA载体转化或转染，使得宿主细胞表达所述多肽产物。
12.根据权利要求11的宿主细胞，其中宿主细胞是大肠杆菌。
13.根据权利要求11的宿主细胞，其中宿主细胞是哺乳动物细胞。
14.一种药物组合物，其含有有效量的多肽和药用稀释剂、佐剂或载体，其中多肽是用特征如下的方法制备的：在适当的营养条件下培养原核或真核宿主细胞，所述细胞用权利要求1-8中任一项的包括DNA序列的质粒或DNA载体转化或转染，使得宿主细胞表达所述多肽，分离DNA序列表达的所述多肽产物。
15.用权利要求14中的方法制备的多肽在制备治疗哺乳动物造血疾病的药物中的应用。
16.根据权利要求15的应用，其中所述治疗选自白血球减少、血小板减少、贫血、移植时促进骨髓的移入、在放射性治疗中促进骨髓的恢复、化学品或化疗引发的骨髓发育不全或骨髓抑制、使细胞对化疗敏感。
17.根据权利要求15的应用，其中所述药物在骨髓吸入或外周血leucopheresis后增加用于移植的细胞的数量。
18.用权利要求14中的方法制备的多肽在制备治疗哺乳动物的与干细胞因子相关的如下疾病的药物中的应用：AIDS、脊髓纤维化、脊髓硬化、骨硬化、转移性癌、急性白血病、复合性骨髓瘤、何杰金氏病、淋巴瘤、Gaucher氏病、尼曼氏病、累-塞二氏病、顽固性低色贫血、Di Guglielmo综合症、充血性脾大、黑热病、类肉瘤、原发性脾各类血细胞减少、粟粒性结核、播散性真菌病、暴发性败血症、疟疾、VB12缺乏症、叶酸缺乏症和pyrodoxine缺乏症。
19.用权利要求14中的方法制备的多肽在制备治疗哺乳动物的神经损伤、不育或肠损伤的药物中的应用。
20.用权利要求14中的方法制备的多肽在制备治疗哺乳动物的低色素生成性疾病的药物中的应用。
21.根据权利要求15-20中任一项的应用，其中治疗包括施用选自EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和IGF-1的至少一种附加的造血因子。
22.根据权利要求15-20中任一项的应用，其中治疗包括施用选自IL-8、IL-9和IL-10的至少一种附加的造血因子。
23.根据权利要求15-20中任一项的应用，其中治疗包括施用选自IL-11和LIF的至少一种附加的造血因子。
24.用外源DNA转染造血细胞的方法，包括：
(i)使造血细胞与一种多肽进行培养，所述多肽包括图15C、42、44或14C给出的序列一级结构或其片段，并具有天然存在的干细胞因子造血生物活性；
(ii)用外源DNA转染培养的细胞。
25.含有用于培养骨髓细胞或外周血祖细胞的组分的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)任选地在药用载体中的一种多肽，所述多肽包括图15C、42、44或14C给出的序列一级结构或其片段，并具有天然存在的干细胞因子造血生物活性；
(ii)适于制备用于培养骨髓细胞或外周血祖细胞的培养基的组分。
26.根据权利要求25的试剂盒，其中组分包括选自EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和IGF-1的至少一种附加的造血因子。
27.根据权利要求25的试剂盒，其中组分包括选自IL-8、IL-9和IL-10的至少一种附加的造血因子。
28.根据权利要求25的试剂盒，其中组分包括选自IL-11和LIF的至少一种附加的造血因子。
29.一种体外培养造血细胞的方法，所述方法包括：
(i)将细胞置于适当的培养基中，所述适当培养基含有一种多肽，该多肽包括图15C、42、44或14C给出的序列一级结构或其片段，并具有天然存在的干细胞因子造血生物活性；
(ii)提供造血细胞生长的适当条件。
30.根据权利要求29的方法，其中适当的培养基含有选自EPO、G-CSF、GM-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和IGF-1的至少一种附加的造血因子。
31.根据权利要求30的方法，其中附加的造血因子是IL-3、IL-6和G-CSF。
32.根据权利要求29的方法，其中适当的培养基含有选自IL-8、IL-9和IL-10的至少一种附加的造血因子。
33.根据权利要求29的方法，其中适当的培养基含有选自IL-11和LIF的至少一种附加的造血因子。
34.根据权利要求29-33中任一项的方法，其中造血细胞是骨髓细胞。
35.根据权利要求29-33中任一项的方法，其中造血细胞是外周血干细胞。
36.含有与水溶性聚合物共价结合的多肽的组合物，所述多肽包括图15C、42、44或14C给出的序列一级结构或其片段，并具有天然存在的干细胞因子造血生物活性。
37.根据权利要求36的组合物，其中聚合物选自聚乙二醇，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
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