CZ500890A3 - Čištěný a izolovaný polypeptid, jeho použití, DNA sekvence pro jeho expresi a farmaceutická kompozice - Google Patents

Description

Vynález se týká čištěného a izolovaného polypeptidu vykazujícího hematopo^etickou biologickou vlastnost přirozeně se vyskytujícího faktoru kmenových buněk, jeho použití pro výrobu léčiv, DNA sekvence pro jeho expresi a farmaceutické kompozice na bázi tohoto peptidu.

Dosavadní stav technikv

Lidský krev-vytvářející (hem^póetický) systém je složen z variant bílých krvinek (zahrnujících neurofily, makrofágy, basofily, mast buňky, eosinof^ily, T a B buňky), červených krvinek (erytrocytú) a buněk, vytvářejících sraženinu (megakaryocyty, destičky).

Předpokládá se, že malé množství jistých hemp^oetických růstových faktorů odpovídá za diferenciaci malého množství kmenových buněk (stem cells) v různých progenitorech krevních buněk pro ohromnou proliferaci těchto buněk a nevratnou diferenciaci zralých buněk z těchto

-2< «ř · linií. Za normálních podmínek funguje t^ómjípoetický regenerační systém dobře. Jakmile je stresován chemoterapií, radiací nebo přirozeným myelodysplastickým porušením, vyskytne se u pacienta určité obdob/, během něhož / jsou pacienti postiženi vážnou leukopenií, anemií nebo trombocytopenu. Vývoj a užití hem^oetických faktorů urychluje regeneraci kostní dřeně během této nebezpečné fáze.

V jistých virově indukovaných poruchách jako je syndrom získané imunodeficience (AIDS), mohou být krevní elementy jako jsou T-buňky, specificky zničeny. Zvýšení produkce T buněk může být v takových případech terapeutické.

Protože hem^poetické růstové faktory jsou přítomné v extrémně malých množstvích, je jejich detekce a identifikace prováděna řadou zkoušek, které dosud jediné činí rozdíl mezi různými faktory, na bázi stimulačních účinků na kultivované buňky při umělých podmínkách.

Aplikace rekombinantních genetických technik byla vyjasněna pochopením biologických aktivit jednotlivých růstových faktorů. Například aminokyselinová a DNA sekvence pro lidský erytropjfotin (EPO), který stimuluje produkci erytrocytů byla získána (viz Lin, US patent 4703008, který je zde uveden jako odkaz). Rekombinantní metody byly také aplikovány pro izolaci cDNA pro stimulační faktor lidských granulocytových buněk, G-CSF (viz Souza, US patent č.4810643) uvedený zde jako reference) a stimulující faktor lidských gránulocytovýchamakrofágových buněk (GM-CSP) /Lee a spol., Proč. Nati.Acad.Sci. USA, 82 4360-4364/1985), Wong a spol., Science, 228, 810-814 (1985)/ myší G- a GM-CSF /Yokota a spol., Proč. Nati.Acad.Sci.(USA),

-381, 1070 (1984), Fung a spol., Nátuře, 307, 233 (1984), Gough a spol., Nátuře, 309, 763 (1984)/ a lidské makrofágové kolonie stimulující faktor (CSF-1) /Kawasaki a spol., Science, 230, 291 (1985)/.

High Proliferative- Potential Colony Forming Cell (HPP-CFC) zkouškový systém testuje činnost faktorů v ranných hempfpoetických progenitorech (Zont., J.Exp.Med,

159, 679-690 (1984)/. V literatuře existuje množství zpráv o faktorech, které jsou aktivní v HPP-CFC zkoušce. Zdroje těchto faktorů jsou uvedeny v tabulce 1. N_ejiépe charakterizované faktory jsou uvedeny dále.

Aktivita v.upraveném mediu lidské sleziny byla pojmenována synergický faktor (SF). Několik lidských tkání a lidských a myších buněčných linií produkuje SF označený SF-1, který je synergický s CSF-1 ke stimulaci ranné HPP-CFC. SF-1 byl zjištěn v upraveném mediu buněk lidské sleziny, lidské placenty, 5637 buněk (buňky karcinomu měchýře) a EMT-6 buněk (linie buněk l^cinomu prsní žlázy myši). Totožnost SF-1 je právě určována. Počáteční výsledky ukazovaly aktivity SF-1 z buněčné linie 5637 převyšující aktivitu interleukinu (Zsebo a spol., Blood, 71, 962-968 (1988)/.Další výsledky ukázaly, že kombinace interleukin-1 (IL-1) plus CSF-1 nemůže stimulovat stejnou tvorbu kolonií jakou je možno získat s CSF-1 plus částečně čištěnými přípravky z ₍5637 upraveného media (McNiece,

Blood, 73,919 .(1989)/.

Synergický faktor přítomný v extraktu z dělohy březí myši je CSF-1. WEHI-3 buňky (buněčná linie buněk myší myelomonocytové leukemie) produkují synergický faktor, který se zdá být totožný s IL-3. Jak CSF-1 tak IL-3 stimulují hem^poetické progenitory, které jsou zralejší než cílený SF-1. '

-4Bylo prokázáno, že jiná třída synergických faktorů je přítomna v mediu z buněk TC-1 (buňky odvozené ze stromatu kostní dřeně). Tato buněčná linie produkuje faktor, který stimuluje ranné myeloidní a lymfoidní buněčné typy. Byl pojmenován jako hemolymfopoetický růstový faktor 1 (HLGF-1). Má zjevnou molekulovou hmotnost 120000 (McNiece a spol., Exp.Hematol., 16, 383 (1988)/.

Ze známých interleukinů a CSFs, IL-1, IL-3 a CSF-1 byly identifikovány jako aktivní ve zkoušce HPP-CFC. Další zdroje synergické aktivity uvedené v tabulce <1 nebyly strukturně identifikovány. Vztaženo na polypeptidovou sekvenci a profil biologické aktivity, týká se předložený vynález molekul, které se liší od IL-1, IL-3, CSF-1 a SF-1.

Tabulka 1

Přípravky obsahující faktory aktivní v HPP-CFC zkoušce

Zdroj1	odkaz
CM lidské sleziny		(Kriegler, Blood, 60,503 (1982))
CM myší sleziny		(Bradley, Exp.Hematol.Today Baum.ed.,285(1980))
CM krysí sleziny		(Bradley, supra, (1980))
CM myších plic		(Bradley, supra,(1980))
CM lidské placenty		(Kriegler, supra(1982))
pregnantní myší děloha	(Bradley, supra, 1980))
GTC-C CM		(Bradley, supra (1980))
RH3 CM		(Bradley, supra (1980))
PHA PBL		(Bradley, supra (1980))
WEHI-3B CM	(McNiece,	Cell Ciol.Int.Rep.,6,243
		(1982))
EMT-6 CM	(McNiece,	Exp.Hematol., 15, 854(1987))
CM L-buněk	(Kriegler,	, Exp.Hematol., 12,-8440 984))

t (Stanley, Cell, 45,667 (1986)) (Song, Blood, 66, 273 (1985))

Tabíilka 1 (pokrač.)

5637 CM TC-1 CM

CM = upravená media 'Při parenterálním podání jsou proteiny často a rychle odstraněny z oběhu a mohou zde tak vyvolat relativně krátkou fprmakologickou aktivitu. Mohou tedy být potřebné časté injekce relativně velkých dávek bioaktiv» nich proteinů k udržení terapeutické působnosti. Proteiny modifikované kovalentním spojením s polymery rozpustnými ve vodě, jako jw polyethylenglykol, kópolymery polyethylenglykolu a polypropylenglykolu, karboxymethylceluloza, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon nebo polyprolin jsou známé tím, že vykazují podstatně delší poločas v krvi po intravenozní injekci než odpovídající nemodifikované proteiny (Abuchowski a spol., v:Enzymes as Drugs”, Holcenberg a spol., vyd.Wiley-Interscience,

New York,NY, 367-383 (1981)) Newmark a spol., J.Appl.Biochem.4:185-189 (1982) a Katre a spol., Proč.Nati.Acad.

&ci. USA 84 ,1487-1491 (1987)). Takové modifikace mohou také zvyšovat rozpustnost proteinu ee vodných roztocích, eliminovat agregaci, zvýšit fyzikální a chemickou stabilitu proteinu a značně snížit imunogenicitu a antigenicitu proteinu. Výsledkem je', že požadované biologické aktivity in vivo je možno dosáhnout podáním takového aduktu polymer-protein s menší frekvencí nebo v menších dávkách, než v případě nemodifikovaného proteinu.

Připojení polyethylenglykolu (PEG) k proteinu je zvléš tě výhodné, protože PEG má velmi,nízkou toxicitu pro savce (Carpenter a spol., Toxicol.Appl.Pharmacol., 18, 3540(1971)). Například PEG adukt adenosin deaminázy byl ve Spojených státech schválen pro použití u lidí při lé-6čení těžkých kombinovaných syndromů imunodeficience.

Druhou výhodou spojenou s konjugací s PEG je účinná redukce imunogenicity a antigenicity heterologních proteinů. Například PEG adukt lidského proteinu může být

Z ' užitečný pro léčbu chorob v jiných savčích druzích bez rizika vyvolání těžké imunologické odpovědi.

Rolymery jako je PEG mohou být vhodně navázány na jeden nebo více reaktivních aminokyselinových zbytků v proteinu, jako je alfa-aminoskupina aminokonce anyníkyseliny, epsilon-aminbskupina vedlejšího řetězce lysinu, sulfhydrylové skupinyr vedlejšího řetězce cysteinu, karboxylové skupiny aspartylového a glutamylováho vedlejšího řetězce, alfa-karboxylová skupina karboxyl-koncové aminokyseliny, tyrosinové vedlejší řetězce nebo k aktivovaným derivátům glykosylových řetězců, připojeným k určitým asparaginovým, serinovým nebo threoninovým zbytkům.

Bylo popsáno množství aktivovaných forem PEG vhodných pro přímou reakci s proteiny. Vhodné PEG reaktanty pro reakci s proteinovými amnoskupinami zahrnují aktivní estery karboxylové kyseliny nebo karbonátové deriváty, výhodně ty, ve kterých odštěpitelné skupiny jsou N-hydroxysukcinimid, p-nitrofenol, imidazol nebo 1-hydroxy-2nitrobenzen-4-sulfonát. PEG deriváty, obsahující maleimido nebo halogenacetylové skupiny jsou vhodnými reaktanty pro modifikaci proteinů prostých sulfhydrylových skupin. Podobně, PEG reaktanty obsahující aminoyé, hydrazinové nebo hydrazidové skupiny jsou vhodné pro reakci s aldehydy generovanými jodistanovou oxidací karbohydrátových skupin v proteinech. .

I

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí faktoru, který způsobuje růst ranných hematopoetických progenitorových buněk.

- Ί

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je čištěný a izolovaný polypeptid mající celou nebo částečnou primární strukturu sekvence uvedené na obr. 15C, popřípadě s methioninovým zbytkem na N-konci, vykazující hematopo/etickou biologickou vlastnost přirozeně se vyskytujícího faktoru kmenových buněk.

Předmětem vynálezu jsou dále výhodná provedení čištěného a izolovaného polypeptidu podle výše uvedeného základního provedení, která zahrnují:

a) čištěný a izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 1-183, jak je uvedena obr. 15C, popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci;

b) čištěný a izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 1-165, jak je uvedena na obr. 15C, popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci;

c) čištěný a izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 1-164, jak je uvedena na obr. 15C, popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci;

d) čištěný a izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 1-162, jak je uvedena na obr. 15C, popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci;

e) čištěný a izolovaný polypeptid vykazující hepatopo^fetickou aktivitu stimulace růstu raných hematopoietických progenitorových buněk;

f) čištěný a izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, zahrnující následující sekvence vzhledem k aminokyselinové sekvenci uvedené na obr. 15C: 1-178, 1-173, 1-168, 1-166, 1-163, 1-161, 1-159, 1-158, 1-157, 1-148 a 1-145; a

g) čištěný a izolovaný polypeptid podle provedení popsaného v odstavci f) obsahující další methioninový zbytek na N-konci.

Předmětem vynálezu je dále také DNA sekvence pro použití v expresi polypeptidových produktů popsaných výše v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce, kde uvedená DNA sekvence je vybrána z:

(a) DNA sekvencí uvedených na obrázku 15C nebo jejich komplementárních řetězců, (b) DNA sekvencí, které za stringentních podmínek hybridizují k DNA sekvencím definovaným pod (a) nebo jejich fragmentů a (c) DNA sekvencí, které nebýt degenerace genetického kódu by hybridizovaly k DNA sekvencím def inovaným v (a) a (b), přičemž tyto sekvence kóduj í polypeptid, mající stejnou aminokyselinovou sekvenci.

Předmětem vynálezu jsou dále výhodná provedení DNA sekvence podle výše uvedeného základního provedení, která zahrnuj í:

a) DNA sekvenci zahrnující jeden nebo více kodonů preferovaných pro expresi v ne-savčích buňkách;

b) DNA sekvenci obsahující jeden nebo více kodonů preferovaných pro expresi v E.coli buňkách;

c) DNA sekvenci obsahující jeden nebo více kodonů preferovaných pro expresi v kvasinkových buňkách;

d) DNA sekvenci, která kóduje expresi lidského faktoru kmenových buněk;

e) DNA sekvenci podle základního provedení nebo podle provedení uvedených v odstavcích a) až d), která kóduje expresi methionylového zbytku na N-terminální poloze maturované verze uvedeného polypeptidu;

f) DNA sekvenci podle základního provedení nebo podle provedení uvedených v odstavcích a) až d), kovalentně spojenou s detegovatelným značením; a

g) DNA sekvenci podle odstavce f), kde značení je radioaktivní značení.

Předmětem vynálezu je dále také farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje účinné množství kteréhokoliv z výše popsaných polypeptidů podle vynálezu a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič.

Předmětem vynálezu je dále také použití kteréhokoliv z výše popsaných polypeptidů podle vynálezu pro výrobu léčiva pro hematopoietickou terapii savce.

Zejména se může jednat o léčivo pro

a) léčbu leukopenie, léčbu trombocytopenie, léčbu anemie, zvýšení příjmu transplantátu kostní dřeně, zvýšení obnovy kostní dřeně při léčbě ozařováním, chemicky nebo chemoterapeuticky indukované aplasii kostní dřeně nebo myelosupresi a pro zvyšování citlivosti buněk k chemoterapii;

b) pro zvýšení počtu buněk schopných transplantace po aspiraci kostní dřeně nebo periferální krevní leukoferesi;

c) pro léčení AIDS, myelofibrosis, myelosklerosy, osteoporosy, metastatického karcinomu, akutní leukemie, mnohotného myelomu, Hodgkinovy choroby lymfomu, Gaucherovy choroby, Niemann-Pickovy choroby, Letterer-Siwovy choroby, odolné erythroblastické anemie, Di Guglielmova syndromu, kongestivní splenomegalie, Kala azar, sarkoidosy, primární splenické pancytopenie, miliární tuberkulózy, rozseté plísnové choroby, prudké septikémie, malarie, deficience vitaminu B₁₂z deficience kyseliny folové a pyridoxinové deficience u savců;

d) pro léčení poškození nervů, infertility nebo intestinálního poškození u savce; a

e) pro léčení hypopigmentační poruchy.

Předmětem vynálezu je i takové použití, kde vyráběné léčivo dále obsahuje alespoň jeden další hematopoietický faktor vybraný z

a) EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 a IGF-1;

b) IL-8, IL-9 a IL-10; a

c) IL-11 a LIF.

fy

- ,θέVýše uvedené sekvence DNA mohoK být zavedeny do vhodných vektorů, těmito vektory mohou být transformovány nebo transfekovány vhodné hostitelské buňky, kterých pak lze použít k produkci peptidů podle vynálezu.

Faktor kmenových buněk (SCF) se může získávat z materiálu, který jej obsahuje za použití technik ionexové chromatografie nebo/a separace kapalinovou chromatografií s reversní fází.

Prodloužení poločasu in vivo a zvýšené účinnosti u savců se může dosáhnout převedením peptidů podle vynálezu na konjugáty, v nichž je SCF kovalentně konjugovaný s polymerem, který je rozpustný ve vodě jako je polyethylenglykol nebo kopolymery póly ethy lengly kolu β polypropylenglykolu, přičemž uvedený polymer je nesubstituovaný nebo je na jednom konci substituován alkylovou skupinou. Příprava takového aduktu zahrnuje reakci SCF s polymerem rozpustným ve vodě, majícím alespoň jednu koncovou reaktivní skupinu a čištění výsledného aduktu za vzniku produktu s rozšířeným ohěhovým poločasem a zvýšenou biologickou účinností.

Přehled obr, na výkresech

Obr.1 představuje ani on to výměnný chromatogram z čištění savčího SCF.

Obr.2 představuje chromatogram z gelové filtrace z Čištění savčího SCF.

Obr.3 představuje chromatogram na aglutininu z pšeničných klíčků-agaroze z čištěni savčího SCF.

IN

Obr.4 představuje kationtovýměnný chromatogram z tění savčího QCF.

Obr.5 představuje C^ chromatogram z čištění savčího SCF. ’

Obr.6 představuje elektroforézu na dodecylsulfát sodný (SDS)-polyakrylamidovém gelu (PAGE) (SDS-PAGE) frak· cí z kolony z obr. 5.

Obr.7 představuje analytický C^ chromatogram savčího SCF.

Obr.8 představuje SDS-PAGE C^ kolonových frakcí z obr. 7.

Obr.9 představuje SDS-PAGE čištěného savčího SGF a deglykosylováného savčího SGF.

0br10 představuje analytický chromatogram čištěného savčího SGF.

Obr.11' představuje aminokyselinovou sekvenci savčího SGF odvozenou ze sekvenování proteinu.

Obr.l2 představuje

A. oligonukleotidy krysí SGF cDNA

B. oligonukleotidy lidské SCF DNA

C. univerzální oligonukleotidy.

Obr.13 představuje

A. schéma výstavby řetězce polymerázou (PCR) amplifikací krysí SCF cDNA

B. schéma PCR amplifikace lidské SCF cDNA.

Obr 14 představuje

A. sekvenční strategii pro krysí genomovou DNA

B. sekvenci nukleokyselin krysí genomové DNA.

C. sekvenci nukleokyselin krysí SCF cDNA a aminokyselinovou sekvenci krysího SCF proteinu.

Obr.15 představuje

A. strategii sekvenování lidské genomové DNA

B. sekvenci nukleové kyseliny lidské genomové DNA

C. kompozit sekvence nukleové kyseliny lidské SCF cDNA a aminokyselinové sekvence SCF proteinu.

β

-1.

Obr.16 představuje seřazené aminokyselinové sekvence lidského, opičího, psího, myšího a· krysího SCF proteinu.

Obr.17 představuje strukturu expresního vektoru VI9.8 SOF savčích buněk.

Obr.18 představuje strukturu expresního vektoru pDSVE.1 savčích CHO buněk.

Obr.19 představuje strukturu E.coli expresního vektoru pCFM1156.

Obr.20 představuje

A. radioimunostudiiX savčího SOF

B. SDS-PAGE imunitně vysráženého savčího SCF.

Obr.21 představuje Western analýzy rekombinantního lidského SCF.

Obr.22 představuje Western analýzy rekombinantního krysího SCF.

Obr.23 představuje sloupcový diagram účinku COŠ-1 * y buňkami produkovaného rekombinantního krysího SCF na trans plantaci kostní dřeně.

Obr.24 představuje účinek rekombinantního krysího SCF na léčení makrocytické anemie myší Steel.

°br.25 představuje periferní bílé krvinky (WBC) u myší Steel ošetřených rekombinantním krysím SCF.

Obr.26 představuje počet destiček u myěí Steel ošetřených rekombinantním krysím SCF.

Obr.27 představuje rozdíl v počtu WBC u Steel myší ošetřených fcekombinantním SCF^^^PEG25.

Obr.28 představuje lymfocytové subsety Steel myší ošetřených rekombinantním krysím SCF¹”¹^^PEG25.

Obr.29 představuje účinek rekombinantní lidské sekvence SCF při ošetření normálních primátů se zvýšeným počtem periferních WBC.

Obr.30 představuje účinek rekombinantní lidské sekvence SCF při ošetření normálních primátů na zvýšení |ia$tu hematokritů a destiček.

• Obr.31 představuje fotografie

-κA. kolonií lidské kostní dřeně stimulované rekombinantním lidským SCF¹“¹⁰²

B. Wright-Giemsa vybarvených buněk z kolonií na obr.

31A.

Obr.32 představuje SDS-PAGE frakcí z chromatogramu na sloupci S-Sepharosy uvedeného na obr. 33

A. s redukčním činidlem

B. bez redukčního činidla.

Obr.33 je chromatogram rekombinantního lidského SCF odvozeného z E.coli na S-Sepharosové koloně.

Obr.34 představuje SDS-PAGE frakcí C^ kolony z chromatogramu uvedeného na obr.35

A. s redukčním činidlem

B. bez redukčního činidla.

Obr.35 je chromatogram rekombinantního lidského SCF odvozeného z E.coli na C^ koloně.

Obr.36 je chromatogram na koloně Q-Sepharosy z CHO odvozeného rekombinantního krysího SCF.

Obr.37 je chromatogram C^ kolony rekombinantního krysího SCF odvozeného od CHO.

Obr.38 představuje SDS-PAGE frakcí C^ kolony z chromá togramu uvedeného na obr. 37.

Obr.39 představuje SDS-PAGE čištěného z CHO odvozeného rekombinantního krysího SCF před a po deglykosylaci.

Obr.40 představuje reakční směsi

A. gelovou filtrační chromatografii/rekombinantního krysího pegylovaného SCF \

B. gelová filtrační chromatografie rekombinantního krysího SCF^“^^, nemodifikovaného.

Obr.41 představuje radioaktivně značený SCF vázaný k čerstvým leukemickým blastům.

Obr.42 představuje sekvenci lidské SCF cDNA získanou z HT1080 fibrosarkomové buněčné linie.

Obr.43 představuje autoradiograf z COS-7 buněk expriimujících lidský SCfV”²^⁸ a CHO buněk exprimujících lidský

SCF

1-164 (Γ

Obr.44 představuje cDNA sekvenci lidského SGF získaného z linie 5637 buněk karcinomu měchýře.

Obr.45 představuje zvýšené přežití ozářených myší po ošetření SOF.

Obr.46 představuje zvýšení přežití ozářených myší po transplantaci kostní dřeně s 5 % stehenní kosti a ošetření SOF.

Obr.47 představuje zvýšení přežití ozářených myší po transplantaci kostní dřeně 0,1 a 20 % stehenní kosti a Ošetření SGF.

Množství aspektů a výhod předloženého vynálezu bude zřejmé odborníkům z následujícího detailního popisu, který slouží k ilustraci praktického provedení vynálezu v jeho zvláště výhodných provedeních.

ďše.taiTní-pOři.^^vynálezu

V\souladu s předloženým vynálezem jsou poskytnuty buse se nové faktory kmenových buněk a DNA sekvence,/kódující všechny části takových SOF. Termín faktor kmenových něk nebo SOF zde použitý se vztahuje' na přirozeně vyskytující SGF (tj. přirozený lidséý SOF) jakož i ná ./ ¹ přirozeně se nevyskytující (tj./odlišný od přirozeně vyskytujících) polypeptidy^májící aminokyselinové sekvence a glykosylaci dostatečhě shodnou s těmito vlastnostmi přirozeně se vyskytujíčího faktoru kmenových buněk ták, aby poskytla schopnost hematopoetické biologické aktivity přirozeně^.se vyskytujícího faktoru kmenových buněk. Faktor kmenových buněk má schopnost stimulovat růst ranných hematápoetických progenitorů, které jsou schpné \ zrání na erytrocyty, megakaryocyty, granulocyty, lymfor cyty a makrofégy. Léčba savců SOF. přinesla výsledky v 1 absolutním zvýšení počtu hematopoetických buněk jak^xmyep 'loidní tak lymfoidní linie. Jednou z hlavních čharakte

Množství aspektů a výhod předloženého vynálezu bude zřejmé odborníkům z následujícího podrobného popisu, který slouží' k ilustraci praktického provedení vynálezu v jeho zvláště výhodných provedeních.

Podrobný popis vynálezu

V souladu s předloženým vynálezem je poskytnut nový čištěný a izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 15C.

Dále je poskytnut čištěný a izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1 až 183 jak je uvedena na obr. 15C popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konc i.

Dále je poskytnut čištěný a izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1 až 165 jak je uvedena na obr. 15C popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konc i.

Dále je poskytnut čištěný a izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1 až 164 jak je uvedena na obr. 15C popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci.

Dále je poskytnut čištěný a izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1 až 162 jak je uvedena na obr. 15C popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konc i.

I

711

Výraz faktor kmenový buněk nebo SCF jak je zde použit, se vztahuje na přirozeně se vyskytující SCF (tj.přirozený lidský SCF) jakož i na přirozeně se nevyskytující (tj. odlišné od přirozeně se vyskytujících) polypeptidy, mající aminokyselinové sekvence a glykosylaci dostatečně shodnou s těmito vlastnostmi přirozeně se vyskytujícího faktoru kmenových buněk tak, aby poskytla schopnost hematopoetické biologické aktivity přirozeně se vyskytujícího faktoru kmenových buněk. Faktor kmenových buněk má schopnost stimulovat růst ranných hematopoetických progenitorú, které jsou schopné zrání na erytrocyty, megakaryocyty, granulocyty, lymfocyty a makrofágy. Léčba savců pomocí SCF přinesla výsledky v absolutním zvýšení počtu hematopoetických buněk jak myeloidní tak lymfoidní linie. Jednou z hlavních charakteristik kmenových buněk je jejich schopnost diferencovat mezi myeloidními a lymfoidními buňkami (Weissman, Science, 241, 58-62 (1988)). Léčba Steel myší (příklad 88) rekombinantním krysím SCF přinesla zvýšení počtu granulocytú, monocytů, erythrocytú, lymfocytů a krevních destiček. Léčba normálních primátů rekombinantním lidským SCF přinesla zvýšení počtu myeloidních a lymfoidních buněk (příklad 8C).

Embryonální exprese SCF probíhá v buňkách migračním způsobem a v mateřských místech me1anoblastů, zárodečných buněk, hematopC^tických buněk, mozku a hřbetní míchy.

Ranné hematopf^tické progenitorové buňky byly namnoženy v kostní dřeni savců, kteří byli léčeni 5-fluoruraci 1em (5-FU). ehemoterapeutické léčivo 5-FU selektivně vyčerpává pozdní hematopoetické progenitory. SCF je aktivní v kostní dřeni na místech 5-FU.

Biologická aktivita a model tkáňové distribuce SCF ukazuje jeho centrální úlohu v embryogenesi a hematopoese, jakož i jeho schopnost léčby různých deficiencí kmenových buněk.

Předkládaný vynález poskytuje DNA sekvence, které obsahují: inkorporaci kodonů výhodných pro expresi vybranými nesavčími hostiteli; opatření míst pro štěpení restrikčními endonukleasovými enzymy a opatření dalšími počátečními, koncovými nebo intermediárními DNA sekvencemi, které umožňují konstrukci snadno exprimovatelných vektorů. Předkládaný z* vynález tak£> poskytuje DNA sekvence, kódující polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci podle obr. 15C, které se liší od přirozeně se vyskytujících forem ve shodnosti nebo umístění jednoho nebo více aminokyselinových zbytků (tj. deleční analogyobsahující méně než všechny zbytky specifické pro polypeptid/s aminokyselinovou sekvencí podle obr. 15C, substituční analogy,kde jeden nebo více specifických zbytků je nahrazeno jinými zbytky a adiční analogy, kde je ke koncové nebo střední části polypeptidu přidán jeden nebo více aminokyselinových zbytkůý' a které mají některé nebo všechny vlastnosti přirozeně se vyskytujících forem. Předkládaný vynález specificky poskytuje DNA sekvence, kódující plnou délku nezpracované aminokyselinové sekvence jakož i DNA sekvence, kódující zpracovanou formu polypept idu/íJodle vynálezu.

Nové DNA sekvence podle vynálezu zahrnují sekvence vhodné k zabezpečení exprese v prokaryotických a eukaryotických hostitelských buňkách polypeptidových produktů, majících alespoň část primární strukturní konformace a jednu nebo více biologických vlastností přirozeně se vyskytujícího SCF. DNA sekvence podle vynálezu specificky zahrnují: a) DNA sekvence

uvedené na obr. 15C nebo jejich komplementární řetězce, b) DNA sekvence, které hybridizují (za podmínek hybridizace popsaných v příkladu 3 nebo za ještě přísnějších podmínek) na DNA sekvenci na obr. 15C nebo její fragmenty a c) DNA sekvence, které by hybridizovaly na DNA sekvenci na obr. 15C, nebýt degenerace genetického kódu. Specificky, jsou to ty sekvence, které jsou uvedeny v části b) a c) genomické DNA sekvence, kódující alelické varianty SCF a/nebo kódující SCF z jiných savčích druhů a vyrobené DNA sekvence, kódující SCF, fragmenty SCF a analogy SCF. DNA sekvence mohou inkorporovat ífcdony, usnadňující transkripci a translaci mesengerové RN^ v mikrobiálních hostitelích. Takové sekvence mohou být snadno konstruovány metodami podle Altona a spol., zveřejněná PCT přihláška WO 83/04053.

V souladu s jiným aspektem přeloženého vynálezu jsou zde popsané sekvence DNA, které kódují polypeptidy, mající SCF aktivitu, cenné pro poskytování informací, týkajících se aminokyselinové sekvence savčích proteinů, které dosud byly bezcenné. DNA sekvence jsou také cenné jako produkty užitečné při provádění široké škály syntéz SCF různými rekombinantními technikami. Použitím jiné metody jsou DNA sekvence poskytované vynálezem užitečné při generování nových a užitečných virových a cirkulárních plasmidových DNA vektorů, nových a užitečných transformovaných a transfektovaných prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk (zahrnujících bakteriální a kvasinkové buňky a kultivované savčí buňky) a nových a vhodných metodách kultivování takových hostitelských buněk schopných exprese SCF a od něho odvozených produktů.

DNA sekvence podle vynálezu jsou také vhodným materiálem pro značené sondy v izolaci lidské genomové DNA, kódující SCF /Iv

a jiných genů pro tyto proteiny, jakož i cDNA a genomové DNA sekvence jiných savčích druhů. DNA sekvence mohou být také využity v různých alternativních metodách proteinové syntézy (např. ve hmyzích buňkách) nebo v genové terapii člověka nebo jiných savců. Předpokládá se, že DNA sekvence podle vynálezu jsou užitečné při vývoji transgenních savčích druhů, které mohou sloužit jako eukaryotičtí hostitelé pro produkci SCF a SCF produktů. Viz Palmiter a spol., Science 222, 809 až 814 (1983) .

Předkládaný vynález poskytuje čištěný a izolovaný polypeptid, obsahující aminokyselinovou sekvenci podle obr.

15C (tj. čištěný z přírodního nebo vyrobený tak, že primární, sekundární a terciární konformace a glykosylační model jsou shodné s přirozeně se vyskytujícím materiálem), jakož i přirozeně se nevyskytující polypeptid, mající strukturní konformaci (tj. konformaci sekvencí aminokyselinových zbytkůja glykosylaci dostatečně duplikativní s tímtéž u přirozeně se vyskytujícího faktoru kmenových buněfy a tak dovolující hematopoetickou biologickou aktivitu přirozeně se vyskytujícího SCF. Takové polypeptidy zahrnují deriváty a analogy.

Ve výhodném provedení je SCF charakterizován jako produkt exprese v prokaryontním nebo eukaryontním hostiteli (tj. kultivovaných bakteriích, kvasinkách, buňkách vyšších rostlin, hmyzu nebo savčích buňkách) exogenních DNA sekvencí, získaných genomovým nebo cDNA klonováním nebo genovou syntézou. SCF je v preferovaném provedení rekombinantní SCF. Produkty exprese obyčejně ve kvasinkách (např. Saccharomyces cerevisiae) nebo prokaryotických (např. E.coli) hostitelských buňkách jsou prosté asociace s jinými savčími proteiny. Produkty exprese v

buňkách obratlovců např. savců s výjimkou člověka (např. COS nebo CHO) a ptáků, jsou prosté asociace s jakýmikoliv lidskými proteiny. V závislosti na použitém hostiteli mohou být polypeptidy podle vynálezu glykosylovány savčími nebo jinými eukaryotickými karbohydráty nebo mohou být neglykosylovány. Hostitelská buňky může být změněna použitím techniky jako jsou ty, které jsou popsány Leeem a kol., J.BiolChem. 264, 13848 (1989), práce je zde uvedena jako odkaz. Polypeptidy podle vynálezu mohou také obsahovat iniciační methioninový aminokyselinový zbytek (v poloze 1).

Kromě přirozeně se vyskytujících alelových forem SCF předložený vynález také obsahuje další SCF produkty jako jsou polypeptidové analogy SCF. Takové analogy zahrnují fragmenty SCF. Postupy podle výše uvedené zveřejněné přihlášky Altona a spol. (WO 83/04053) je možno snadno tvarovat a vyrobit kódující geny pro mikrobiální expresi polypeptidů, majících primární konformace, které se liší od zde specifikovaných v poměru shody a umístění jednoho nebo více zbytků (např. substitucí, terminální a intermediální adicí a delecí). Alternativně může být modifikace cDNA a genomických genů snadno dosaženo dobře známou místně řízenou mutagenezní technikou a být upotřebena ke generování analogů a derivátů SCF. Takové produkty mají alespoň jednu z biologických vlastností SCF, ale v ostatních se mohou lišit. Jako příklady zahrnují produkty podle vynálezu ty, které jsou zkráceny např. delecemi nebo ty, které jsou stabilnější k hydrolýze ( a mohou proto mít zřetelnější nebo déle trvající efekty, než přirozeně se vyskytující); nebo které jsou změněny vypuštěním nebo přidáním jednoho nebo více potenciálních míst pro

O-glykosyláci a/nebo N-glykosyláci. Kompetitivní antagoisté mohou být plně využity, například v případech nadprodukce SCF

nebo v případech lidské leukemie, kde maligní buňky exprimují příliš receptorů pro SCF, jak indikuje přílišná expreses SCF receptorů v leukoblastech (příklad 13).

Pro použitelnost polypeptidových analogů podle vynálezu jsou uvedeny jejich imunologické vlastnosti u syntetických peptidů, které v podstatě duplikují aminokyselinovou sekvenci, existující v přirozeně se vyskytujících proteinech, glykoproteinech a nukleoproteinech. Specifičtěji, polypeptidy s relativně malou molekulovou hmotností mohou participovat v imunitní reakci, která je podobná průběhu a rozsahu s imunitními reakcemi fyziologicky významných proteinů jako jsou virové antigeny, polypeptidové hormony a podobně. Množství imunitních reakcí takových polypeptidů podněcuje formování specifických protilátek v imunologicky aktivních zvířatech (Lerner a spol., Cell, 23, 309-310 (1981); Ross a spol., Nátuře, 294, 654-656 (1981); Walter a spol.,

Proč.Nat1.Acad.Sci.USA, 77, 5197-5200 (1980); Lener a spol., Proč.Nati.Acad.Sci.USA, 78, 3403-3407 (1981); Walter a spol., Proč. Nat1.Acad.SCI.USA, 78, 4882-4886 (1981); Wong a spol., Proč.Nat1.Acad.Sci.USA,79, 5322-5326 (1982); Baron a spol., Cell, 28, 395-404 (1982); Dressman a spol., Nátuře, 295, 185 až 160 (1982) a Lerner, Scientific American, 248, 66-74 (1983). Viz také Kaiser a spo1./Science, 223, 249.255 (1984) vzhledem k biologickým a imunologickým vlastnostem syntetických peptidů, které přibližně mají sekundární struktury peptidových hormonů, ale nemají jejich primární strukturní konformace.

Předložený vynález také zahrnuje tu třídu polypeptidů, kódovaných částí DNA komplementární k protein-kodujíčímu řetězci lidské cDNA nebo genomické sekvence SCF, tj.

iab

Z

komplementární Tramontanoem a (1984)) .

invertované proteiny jak je popsáno spol., (Nucleic Acid.Res., 12, 5049-5059

Reprezentativní SCF polypeptidy podle předloženého vynálezu zahrnují, ale nejsou tak omezeny, SCF^1-162, SCFi-164, SCFi-165 a SCFi-183 _{na o}br. 15C.

SCF muže být čištěn technikami známými v oboru. Je popsána metoda čištění SCF z SCF materiálu, jako jsou kondicionovaná media nebo lidská moč a sérum. Metoda zahrnuje jeden nebo více následujících stupňů: podrobení materiálu, obsahujícího SCF iontovýměnné chromatografii (bud kat iontovýměnné nebo aniontovýměnné chromatografii), zpracování ma-19teriálu obsahujícího SCF dělen^kapalinovou chromatograf ií s reverzní fází, zahrnující například imobilizovanou C^ nebo Cg pryskyřici; zpracování chromatograf ií s imobilizovaným lektinem, např. navázáním SCF na zmobilizovaný lektin a eluci za použití cukru, který se uchází o toto navázání, detaily těchto metod budou zřejmé z popisů uvedených v příkladech

1,10 a 11 pro čistění SCF. Techniky popsané v příkladu 2 Laiem a spol. US patent č. 4667016, který je zde uveden jako reference, jsou také vhodné pro čištění kmenového faktoru buněk.

ísoformy SCF jsou izolovány použitím standardních technik, jako jsou techniky uvedené v US prihlr

6. 421444 nazvané Erythropoietin Isoforms, podané 13. října 1989, která je zde uvedena jako odkaz (l/íJtcfcctPJ ^vbsahem vynálezu jsou také farmaceutické kompozice, obsahující terapeuticky účinné množství polypeptidového produktu podle tohoto vynálezu spolu se vhodnými ředidly, ochrannými látkami, solubilizátory, emulgátory a přísadami a/nebo nosiči užitečnými v SCF tera pii. Terapeuticky účinné množství je označeno množství, které poskytuje terapeutický efekt za daných podmínek a způsobu podávání, ^akové kompozice jsou kapaliny nebo lyofilizované nebo jinak sušené přípravky

a obsahují ředidla nebo různé pufry (např. Tris-HCl, acetátový, fosfátový), pH a iontové síly, aditiva jako je albumin nebo želatina pro prevenci adsorpce na povrchy, detergenty (např. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, soli kyseliny žlučové), solubilizační činidla (na př. glycerol, polyethylemglykol), antioxidanty (např. kyselina askorbová, metabisulfit sodný), ochranné látky (napr. Thimerosal, benzylalkohol, parabeny), botnací přísady.nebo modifikátory tonicity (např. laktoza, mannitol), kovalentní připojení polymerů jako je

-zo/ polyethylenglykol k proteinu (popsáno v příkladu 12 dále), komplexace s kovovými ionty nebo inkorporace materiálu do nebo na partikulární přípravky polymérních sloučenin jako je polymléčná kyselina, kyseliny polyglykolová, hydrogely atd, nebo do lipozomů, mikroemulzí, micelů, jednovrstvých nebo více vrstvých vehikulí, erytrocytových hostitelů nebo sferoplastů. Takové kompozice budou ovlivňovat fyzikální stav, rozpustnost, stabilitu, rychlost uvolňování in vivo a rychlost vylučování SCF in vivo. Výběr sloučeniny bude záviset na fyzikálních a chemických vlastnostech proteinu, majícího SCF aktivitu. Například produkt odvozený od membránově vázané formy SCF může vyžadovat přípravek, který obsahuje detergent. Přípravky s řízeným nebo postupným uvolňováním zahrnují prostředky s lipofilními depotními účinky (např. mastné kyseliny, vosky, ole je). V rozsahu vynálezu jsou také zahrnuty partikulární přípravky potažené poýymery (např. poloxamery nebo poloxaminy) a SCF spojený s protilátkami vůči tkáňově specifickým receptorům, ligandům nebo ántigenům nebo spojený s ligandy tkáňově specifických receptorů. Další provedení přípravků podle vynálezu zahrnují částicové formy, chránící potahy, inhibitory protej^hízg. nebo látky zvyšující permesci při různých způsobech podání, zahrnujících podání parenterální, pulmonární, nasální a orální.

Vynález také zahrnuje přípravky, obsahující jeden nebo více hematopoétických faktorů jako je EPO, G-CSF, GIACSF, CSF-1, lL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL8, 11-9, IL-10, 1L-11, IGF-I nebo LIF (faktor inhibující leukémii).

Polypeptidy podle vynálezu mohou být značeny” spojením s detek/ťovatelnou markerovou substancí (např. radioaktivně značenou ¹²⁵I nebo biotinylovanou^pro poskytnutí činidel vhodných pro detekci a kvantifikaci SCF nebo jeho receptor nesoucích buněk v pevné tkáni a v kapalných vzorcích jako je krev nebo moč.

Biotinylovaný SCF je užitečný ve spojení s imobilizovaným streptavidinem k čištění leukemických blastů z kostní dřeně v autologní transplantaci kostní dřeně. Biotinylovaný SC͹ je užitečný ve spojení s imobilizovaným str^ptavidinem k obohacení kmenových buněk v autologních nebo alogenních transplantacích kostní dřeně. Toxin napojený na SCF, jako je ricin /Uhr, Pro.Clin.Biol.Res.288, 403412 (1989)/, toxin difterie /Moolten, J.Natl.Con.Inst.,

55, 473-477 (1975)/ a radioisotopy jsou vhodné pro přímou antineoplastickou terapii (příklad 13) nebo jako kondiční režim pro transplantaci kostní dřeně.

Produkty nukleových kyselin podle vynálezu jsou vhodné, jsou-li označeny detek^ovatelnými markéry, jako jsou radioaktivní značkovače a neizotopové. značkovače jako je biotin a využívané v hybridizačním procesu k lokalizaci polohy lidského SCF genu a/nebo polohy některé takové genové rodiny na chromozomové mapě. Jsou také užitečné pro identifikaci porušení lidského SCF genu na úrovni DNA a použití jako genových markérů pro identifikaci sousedních genů a jejich porušení. Lidský gen pro SCF je kodován chromozomem 1 2 a myší SCF gen je mapován do chromozomu 10 při S1 lokusu.

SCF je užitečný samotný nebo v kombinaci s jinou terapií v léčbě množství poruch hematopoe^y. SCF může být užit samostatně nebo s jedním nebo více dalšími hematopoetickými faktory jako je EPO, G.CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL1 , .IGF-I nebo LIF při léčbě hematopoetických chorob i

Existuje skupina poruch kmenových buněk, která je charakterizována redukcí funkce kostní dřeně způsobenou toxickým, radiačním nebo imunologickým poškozením a která může být léčitelná BCF. Aplastická anemie je poškození kmenov vých buněk, při kterém je hematopoetická tkán nahrazena

-22tukem a pancytopenie. SOF zvyšuje hematopoetickou proliferaci a je vhodný při léčbě aplastické anemie (příklad 8B). Steel myši byly použity jako modely lidské aplastické anemie (Jones, ^xp.Hematol., 11, 571-580 (1983)J.Slibné výsledky byly získány použitím cytokinu příbuzného, GM-CSF v léčbě aplastické anemie (Antin a spol., Blood 70, 129a (1987)). Earoxysmální nocturélní hemoblobinurie je porucha kmenových buněk, charakterizovaná formováním dffektních destiček a granulocytú, jakož i abnormálních erytrocytů. Existuje mnoho chorob, které jsou léčitelné SCF. Patří sem následující: myelofibroza, myeloskleroza, osteopetroza, metastatický karcinom, akutní leukemíe, multiplikovaný myelom, Hodkinova choroba, lymfom, Gaucherova choroba, Nieman-Pickova choroba, Letterer-Siwe choroba, neústupná erytroblastické anemie, Di Guglielmův syndrom, kongestivní splenomegalie, Hodkinova choroba, Kala azar, sarcoidosis, primární slezinná pancytopenie, miliární tuberkulóza, houbové choroby, septikemie, malarie, nedostatek vitaminu B·, 2 ^a kyseliny listové, nedostatek pyridoxinu, Diamond Blackfan anemie, hypopigmentační choroby jako je vitiligo a piebaldismus. Erytroidy, megakaryocyty a granulocyty stimulující vlastnosti SCF jsou uvedeny v příkladech 8B a 8C.

0Z . ,

Nárůst růstu v nehematop(étických kmenových buňkách j jako jsou primordiélní zárodečné buňky, melanocyty odvozené od zárodečného hřebenu, commisurální axony pocházející ze hřbetní mí,chy, Buňky krypt střeva, mesonefrické a metanefrické ledvinové, tubuly a čichové bulby, je užitečný v situaci, kdy se na těchto místech vyskytuje poškození tkání. SCF je užitečný pro léčbu neurologických poškození a je růstovým faktorem pro nervové buňky. SCF je užitečný během in vitro fertilizačního procesu nebo při léčení infertility. SCF je užitečný pro léčbu poškození střev radiací nebo chemoterapií.

i ,<

-23Existují myeloproliferativní poškození kmenových buněk jako je polycythemia vera, chronická myelogenní leukemie, mye loidní mataplasie, primární trombocytemie a akutní leukemie,. které je možno léčit SCF, anti-SCF protilátkami nebo konjugáty SCF-toxin.

°e zde množsví případů, které dokumentují nárůst prolife race leukemických buněk podle hematopoetických růstových faktorů G-CSF, GM-rGSF a IL-3 /Delwel a spol., Blood, 72, 19441949 (1988)/. Protože úspěch mnohá chemoterapeutických léčiv v

závisí na .faktoru, že neoplastické buňky cyklují aktivněji než normální/fluňky SCF sám nebo v kombinaci s jinými faktory působí jako růstový faktor pro neoplastické buňky a senzibuje je k toxickému efektu chemoterapeutických léčiv. Nadprodukce SCF receptorů na leukoblastech je ukázána v příkladu 13.

Množství rekombinantních hematopoetických faktorů je podrobeno zkoumání pro jejich schopnost snižovat leukocytovou hranici následkem chemoterapie a radiačního ošetření. Ačkoliv tyto faktory jsou velmi užitečné v tomto sestavení, je zde ranný hernatop|etický komp$rtment, který je poškozen, zejména radiací a má být znovu vytvořen dříve, než tyto pozdně-působící růstové faktory mohou projevit optimální akci. Použití SCF samotného nebo v kombinaci s těmito faktory podporuje snižování nebo eliminaci leukocytové destičkové hladiny z chemoterapie nebo radiační léčby. Navíc SCF dovoluje intenzifikaci dávky v antineoplastickém nebo radiačním ošetření (příklad 19)·

SCF je užitečný pro expresi ranných hematopoetických progenitorů v> syngenních, alogenních nebo autologních transplantacích kostní dřeně, ^oužití hematopoetických růstových faktorů vykazuje snížení doby pro hahrazení neurofilů po transplantaci /Donahue a spol., Nátuře, 321, 872-875 (1986) a Welte a spol., J.Exp.Med., 165, 941-948 (1987)/· Pro transplantaci kostní dřeně jsou používány následující tři scénáře samostatně nebo v kombinaci: dárce je léčen SCF samotným nebo v

kombinaci s jiným hematopoetickým faktorem před aspirací kostní dřeně nebo periferální krevní leukoporesou pro zvýšení množství buněk vhodných pro transplantaci; kostní dřeň je léčena in vitro kvůli aktivaci nebo nárůstů počtu buněk před transplantací; nakonec je léčen příjemce kvůli zvýšení schopnosti přijmou^ dřeň dárce.

SCF je užitečný pro zvýšení schopnosti genové terapie založené na transfekcí Xnebo infekci retrovirovým vektorem) hematopoetických kmenových buněk. SCF dovoluje kultivaci a multiplikaci ranných hematopoetických kmenových buněk, které mají být transfektovány. Kultivace může být provedena se samotným SCF nebo jeho kombinací s IL-ó, IL-3 nebo oběma. Po transfektaci jsou pak tyto buňky zavedeny do kostní dřeně transplantované do pacienta trpícího genetickou poruchou (Lim, Proč.Nati.Acad.Sci., 85, 8892-8896 ( (1989)/. Příklady genů, které jsou vhodné pro léčbu genetických poškození jsou adenosindeamináza, glukocerebrosidáza, hemoglobin a cystická fibroza.

SCF je užitečný pro léčbu syhdromu získané imunodeficience (AIDS), nebo několika kombinovaných imunodeficitních stavů ( SCID) samotný nebo v kombinaci s jinými faktory jako je IL-7 (viz příklad 7)· Ilustrací těchto účinků je schopnost SCF léčby zvýšit absolutní hladinu cirkulujících T-helper (CD4⁺, OKT₄+) lymfocytů. Tyto buňky jsou primárním buněčným cílem viru lidské imunodeficience (HIV), což vede k imunodeficientnímu stavu AIDS pacientů ( Montagnier, v Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, vyd.R.C.Gallo, Cold Spring Harbor, New York, 369-379 (1984)/. Navíc je SCF užitečný při potlačení myleosupresivního účinku anti-HIV léčiv jako je AZT ( Gogu Life Sciences, 45, č. 4 (1989)/.

SCF je užitečný pro zvýšení hematopofetické náhrady po akutní ztrátě Jkrve.

Při léčbě in vivo je SCF užitečný pro povzbuzení imunitního systému pro boj s neoplasií (rakovinou). Příklad terapeutické schopnosti přímého zvýšení imunitní funkce nově klonovaným cytokinem (IL-2) je popsán Rosenbergem a spol., N.Eng.J.Med., 313 1485 (1987).

Podávání SCF s jinými činidly jako je jeden nebo více hematopoetických faktorů se provádí v určitých časových intervalech nebo jsou podávány společně. Předchozí léčba SCF rozšiřuje progenitorovou populaci, která odpovídá koncově-funkčním hematopoetickým faktorům jako je GC3F nebo EPO. Způsob podávání může být intravenozní, intraperitoneální, subkuténní nebo intramuskulérní.

Předložený vynález se také týká protilátek, které specificky vážou faktor kmenových buněk. Příklad 7, který je uveden dále, popisuje produkci polyklonálních protilátek. Dalším využitím vynálezu jsou monoklonální protilátky, které specificky vážou SCF (viz příklad 20). Oproti konvenčním protilátkovým (polyklonálním) preparátům ,které obvykle obsahují různé protilátky čízené proti různým determinantům (epitopům), každá monoklonální protilátka je řízena proti jednomu determinantu na antigenu. Monoklonální protilátky jsou užitečné pro zlepšení selektivity a specifity diagnostic kých a analytických zkušebních metod využívajícím vazby antigen-protilátka. I'aké jsou používány k neutralizaci nebo \ nahrazení SCF ze sera. Druhá výhoda monoklonálních protilátek je ta, že mohou být syntetizovány hybridními buňkami v kultuře, nekontaminované jinými imunoglobuliny. iftonoklonální protilátky mohou být připraveny xxfeunĚk ze supernatantu kultivovaných hybridomových buněk nebo ,z ascitu indukovaného naočkováním buněk hybridomů intraperitoneálně myši. Technika hybridomů popsaná původně Kbhlerem a Milsteinem/Eur.J.Immunol.6, 511-519 (1976)/ byla aplikována v širokém rozsahu pro produkci hybridních buněčných linií, které produkují vysoké hladiny monoklonálních protilátek proti specifickým antigenům.

Ví

-fPříklady provedení vynáleau

Následující příklady slouží k ilustraci předloženého vynálezu a v žádném případě jej nikterak neomezují.

Příklad 1

Čištění/charakteristika faktoru kmenových buněk z media získaného z buněk jater krys Buffalo

A.Biologické zkoušky in vitro

1. Zkouška HPP-CFC

Různé biologické aktivity mohou být vlastní přirozenému savčímu krysímu SCF jakož i rekombinantnímu SCF proteinu. ^ednou takovou aktivitou je jeho působení na ranné hematopoetické buňky. Tato aktivita může být měřena ve zkoušce High ^roliferative Potential Colóny Forming Cell (HPP-CFC)/Zsebo a spol., supra(1988)/. Pro hodnocení účinku faktorů bna ranné hematopoetické buňky utilizuje HPPCFC zkušební systém myší kostní dřeň získanou ze zvířat 2 dny po léčbě 5-fluoruracilem (5-FU). Chemoterapeutické léčivo 5-FU selektivně vyčerpává pozdní hematopoetické progenitory,s následující detekcí ranných progenitorových buněk a proto faktory, které působí na takové buňky. Krysí SCF je umístěn na plotny za přítomnosti CSF-1 nebo IL-6 v polopevné agarové kultuře. Agarová kultura obsahuje kompletní McCoysovo medium (GIBCO), 20 % fetálního hovězího sera, 0,3 % agaru a 2 x 10' buněk kostní dřeně/ml. McCoyovo kompletní medium obsahuje následující složky: IxMcCoyovo medium doplněné 0,1 mM pyruvátu, Q,24x esenciálními aminokyselinami, 0,24 x neesenciálními aminokyselinami, 0,027 % hydrogenuhličitanu sodného, 0,24x vitaminů, 0,72 mM glutaminu, 25 yúg/ml L-serinu a 12 ^ug/ml L-asparaginu. Buňky kostní dřeně byly získány z Balb/c myší injikovaných i.v.

150 mg/kg 5-FU. Femury se odeberou 2 dny po léčbě 5-FU myši a kostní dřeň je vybrána. Červené krvinky se lyžují s činidlem lyžujícím buňky červených krvinek (Becton Dickenson) před umístěním na plotny.- Testované substance s.e umístí na plotny s výše uvedenou směsí ve 30 mm miskách. 0 Čtrnáct dní požději jsou počítány kolonie (mm v průměru) * které obsahují tisíce buněk. Tato zkouška je používána ? '.· i.”'

všude pro čištění SCF z krysích přirozených buněk.

V obvyklé zkoušce krysí SCF způsobuje proliferaci přibližně 50 HPP-CFC z 20000 buněk na plotně. Krysí SCF má synergistickou aktivitu na buňky myší kostní dřeně, léčené 5-FUj HPP-CFC kolonie se nevytvářejí v přítomnosti samotných faktorů, ale v této zkoušce je aktivní kombinace SCF a CSF-1 aebo SCF a IL-6.

2. MC/9 zkouška

Jiná užitečná biologická aktivita přirozeně získaného a řekombinantního krysího SCF je schopnost způsobovat proliferaci na IL-4 závislé myší mast cell linie, MC/9 (ATCC CRL 8306).. MC/9 buňky jsou kultivovány se zdrojem IL-4 v souladu s ATCC CRL 8306 protokolem. Medium použité v biozkoušce je RPMI 1640, 4 % fetálního hovězího sera, 5 x 10“^ M 2-merkaptoethanolu a 1x glutamin-pen-strep. MC/9 buňky proliferují jako odezva na SCF bez potřeby jiných růstových faktorů. Tato proliferace je měřena první kultivací buněk po 24 hodin bez růstových faktorů, umístěním 5000 buněk v každé jamce plotny s 96 jamkami s testovaným vzorkem po 48 hodin, zpracováváním po 4 hodiny 0,5 _zuCi

H-thymidinem (specifická aktivita 20 Ci/mmol), získáním roztoku na filtBech ze skleněných vláken a pak měřením specificky navázané radioaktivity. Zkouška byla použita; pro čištění savčích buněk odvozených od krysího SCF po stupni ACA gelové filtrace, sekci C2 tohoto příkladu.

SCF působí 4-10násobné zvýšení CPM proti základu.

3. CFU-GM

Byla zjištována akce čištěného savčího SCF jak přirozaně získaného tak řekombinantního, bez interferujících kolonie stimulujících faktorů (CSFs), na normální nevyčerpané kostní dřeni-. CFU-GM zkouška /Bróxmeyer a spol., Exp.

Hematol., 5, 87 (1977)/ je použita ke zhodnocení účinku

vlivu SC^F na normální dřeň. Stručně, všechny buňky kostní dřeně po lýzi červených krvinek, jsou umístěny na plotny v polopevné agarové kultuře, obsahující testovanou substanci. Po 10 dnech jsou počítány kolonie, obsahující skupiny více než 40 buněk. Agarová kultura může být usušena na skleněných podložkách a specifickým histologickým barvením může být určena mořfologie buněk.

Na normální myší kostní dřeni byl čištěný savčí krysí SCF pluripotentní CSF, stijmulujícím růst kolonií, obsahujících nezralé buňky, neurofily, makrofágy, eosinofily a megakaryocyty, bez potřeby dalších faktorů. Z 200000 buněk umístěných na plotně vyrostlo během 1 0 dnů přes 100 kolonií. Jak krysí tak lidský rekombinantní SCF stimulují produkci erytroidních buněk v kombinaci s ΞΡ0, viz příklad 9.

B. Kondiciované medium

Jaterní buňky krys Buffalo (BRL) z American Type Culture Collection (ATCC CRL 1442), vyrůstaly na mikronosičích ve 201itrovém perfuzním kultivačním systému pro produkci SCF. Tento systém využívá Biolafitte fermentor (Model ICC-20) s výjimkou sít používaných pro zadržení mikronosičů a oxidačních trubiček. 75 mikrometrová sítka jsou zabezpečov-éna před ucpáním mikronosiči periodickým zpětným proplachováním dosaženým systémem řízených ventilůja počítačem řízených čerpadel. Každé síto alternativně pracuje jako přívod media a výchozí síto. Oscilující vyvolaný tok tak zabezpečuje, že se síta neucpávají. ^kysliče v

ní je zajištováno vinutými silikonovými přívody (50 stop délka, 0,25 palců vnitřní průměr, 0,03 palců stěna). Růstové medium použité pro kultivaci BRL 3A buněk bylo minimální základní medium (s Earleovými solemi) (GIBCO), 2 mM glutaminu, 3 g/1 glukózy, fosfát tryptozy (2,95 g/1), 5 % fetálního hovězího sera a 5 % fetálního telecího sera.

Získané medium bylo identické s výjimkou s výjimkou vynechání sera. Reaktor obsahující Cytodex 2 mikronosiče (Phar macia) v koncentraci 5 g/1 # byl očkován 3 x 10^ BRL

CA buněk rostlých ve válcovitých nádobách a přenesených trypsinizací. Buňky byly ponechány pro připojení a růst na mikronosičích po osm dnů. Růstové medium bylo perfundováno reaktorem v závislosti na spotřebě glykozy. Koncentrace glukózy byla udržována na přibližně 1,5 g/1. Po osmi dnech byl reaktor perfundován šesti objemy media prostého sera pro odstranění většiny sera (koncentrace pro teinu <· 50 /Ug/ml). Reaktor byl pak vsádkově provozován dokud koncentrace glukózy neklesla pod 2 g/1. Od tohoto bodu dále pracoval reaktor s kontinuální perfuzní rychlostí asi 10 1/den. ρΗ kultury bylo udržováno na 6,9+

0,3 upravou rychlosti průtoku C0₂· Rozpuštěný kyslík byl udržován na více než 20 % sycením vzduchem a pokud je to potřebné doplňováním čistým kyslíkem. Teplota byla udržována na 37+ 0,5 °C.

Z výše uvedeného systému bylo získáno přibližně 336 litrů kondiciovaného média prostého sera a bylo použito jako výchozí materiál pro čištění přirozeného zé savčích buněk odvozeného krysího SCF.

C. Čištění

Všechny práce zaměřené na čiatění byly prováděny při 4 °C, pokud není uvedeno jinak.

v

-30/

1. Aniontovýměnná chromatografie na DEAE-celuloze

Kondiciované medium získané ze sera prosté kultivace

BRL 3A buněk bylo čištěno filtrací přes *^,45 yum Sartocapsules (Sartorius). Několik různých podílů (41 1, 27 1,

1, 30,2 1, 37,5 1 a 161 1) bylo odděleně zahuštěno, zpracováno výměnou diafiltrace/pufr a aniontovýměnnou chromatografií na DEAE-celuloze, stejným postupem pro každý podíl. LEAE-celulozóvé pooly pak byly spojeny a zpracovány déle jako jed/en podíl v sekci G2-5 tohoto příkladu.

Pro ilustraci, zpracování 41 1 bylo následující. Filtrované kondiciované medium bylo zahuštěno na -700 ml za použití ultrafiltračního zařízení s tangenciální^ tokem Millipore Pellicon s kasetou dělící polysulfonové membrány 10000 mol. hmotnost (20 ft celkový plocha membrány; rychlost toku -1095 ml/min a filtrační rychlost 250 až 315 ml/min) •^iafiltrační/pufrové výměna shxbh při přípravě' pro aniontovýměnnou chromatografií byla přivedena přidáním 500 ml 50 mM tris-HCl, pH.7,8 ke koncentrátu, znovu bylo zahuštěno na 500 ml za použití ultrafiltračního zařízení s tangenciálním tokem a toto bylao opakováno šestkrát. ²ahuštěný/diafiltrovaný přípravek byl nakonec získán v objemu 700 ml. Přípravek byl aplikován na sloupec aniontovýměnné DEAE-celulozy (5 x 20,4 cm, Whatman DE-52 pryskyřice), která byla ekvilibrována 50 mM tris-HCl, pH 7,8 pufr. Po aplikaci vzorku byl sloupec promyt 2050 ml tris-HCl pufru a solným gradientem (0-300 mM NaCl v tris-HCl pufru, 4 1 celkový objem). *rakce 15 ml byly odebírány za rychlosti průtoku 167 ml/h. Chromatografie je uvedena na obr. 1t HPP-CFC počet kolonií odpovídá biologické aktivitě ve zkoušce HPPCFC; bylo zkoumáno 100 ^ul z indikovaných frakcí. Frakce odebrané během aplikace vzorku a vymyté nejsou uvedeny na obrázku, v těchto frakcích nebyla prokázána žádné biologické aktivita.

Chování všech podílů kondiciovaného media podrobených, \

zahuštění, výměně diafiltrace/pufr a aniontovýměnné chro-

I matografií bylo stejné. Koncentrace proteinu ve všech podílech, stanovené metodou podle Bradforda /Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976)/ s hovězím sérovým albuminem jako standardem byly v rozmezí 30 až 50 /Ug/ml. Celkový objem kondiciovaného media použitého v této přípravě byl 336 1.

2. ACA 54 gelovó filtrační chromatografie frakce mající biologickou aktivitu ze zpracování na sloupcích DEAE-celuloza pro každých šest podílů kondiciovaného media uvedených výše (například frakce 87-114 uvedené na obr. 1) byly spojeny (celkový objem 2900 ml) a zahuštěny na celkový objem 74 ml za použití míchaných zařízení Amicon a YM10 membrán. Tento materiál byl aplikován na ACA 54 (LKB) gelový filtrační sloupec (obr.· 2) ekvilibrovaný v 50 mM tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4. Frakce o objemu 14 ml byly odebírány při průtokové rychlosti 7θ ml/h.

Díky inhibičním faktorům koeluovaným s aktivními frakcemi, se pík aktivity (počet HPP-CFC sloupec) se jeví rozštěpený; nicméně vzhledem k předchozím chromatogramům, aktivita koeluuje s hlavním proteinovým pikem a proto byl připraven jeden pool frakcí.

3. Chromatografie na agarose s aglutininem z pšeničných klíčků

Frakce 7θ-112 z gelové filtrace na sloupci ACA 54 byly spojeny (500 ml). Pool byl rozdělen na polovinu a každá polovina byla zpracována chromatografií na sloupci agarozy s aglutininem z pšeničných klíčků (5 x 24,5 cm, prys kyřice od E-Y Laboratories, San ^ateo, CA; aglutinin z pšeničných klíčků rozpoznává určité karbohydrátové struktury) ekvilibrovaném ve 20 mM tris-HCl, 5θθ mM NaCl, pH 7,4. Po aplikacích vzorku byl sloupec promyt asi 2200 ml pufru sloupce a eluce vázaného materiálu pak byla provedena aplikací roztoku 350 mM N-acety1-D-glukosaminu rozpuštěného v pufru sloupce, při počátku u frakce -210 na obr. 3. Frakce

13,25 ml byly odebírány při rychlosti průtoku 122 ml/h. Průběh jedné chromatografie je uveden na obr. 3. Fodíly frakcí určených pro zkoušení byly dialyzovány vůči fosfátem pufrovanému salinickému roztoku; 5 /Ul dialyzovaných materiálů bylo umístěno do MC/9 zkoušky (cpm hodnoty na obr.

3) a 10 yul do HPP-GFC zkoušky (číselní hodnoty kolony na obr. 3). Je zřejmé, že aktivní materiál fcázaný na kolonu byl pak eluován N-acetyl-D-glukosaminem, přičemž kolonou během aplikace vzorku a promývání prošel kontaminující materiál.

4. ^is-ationtovýměnná chromatografie na S-^epharose s rychlým· průtokem

Frakce 211 až 225 z chromatografie na agaros® s alutininem z pšeničných klíčků, uvedené na obr.3 a ekvivalentní frakce z druhého pokusu byly spojeny (375 ml) a dialyzo- . vány proti 25 mM mravenčanu sodnému, pH 4_y2. Pro minimalizování doby vystavení účinku nízkého pH, byla dialýza prováděna během období 8 h, proti 51 pufru, se čtyřmi změnami během 8hodinového období. ^wa konci tohoto dialyzačního období byl objem vzorku 480 ml a pH a vodivost vzorku byly blízké těmto hodnotám dialyzačního pufru. Během dialýza se objevil ve vzorku vysrážený materiál. Tento byl odstraněn odstředěním při 22000 g po dobu 30 min a super/ natant z odstředěného vzorku byl aplikován na kolonu kationtové výměny na S-Sepharose s rychlým průtokem (3,3 x 10,25 cm; pryskyřice od fy Pharmacia), která byla ekvilibrována v pufru -mravenčanu sodném. Rychlost průtoku byla 465 ml/h a byly odebírány frakce 14,2 ml. Po aplikaci vzorku byla kolona promyta 240 ml pufru a eluce navázaného materiálu byla provedena aplikací gradientu 0-750 mM NaCl (NaCl rozpuštěný v pufru pro koíonu,_; celkový objem gradientu 2200 ml), počátek u frakce -45 na obr. 4. Eluční profil je uveden na obr. 4·. Spojené frakce byly upraveny na pH 7-7,4 přidáním 200 /Ul 0,97 M tris báze. cpm na obr. 4 se týká výsledků získaných v MC/9 biologické zkoušce; podíly dialyzavanýntnfrakcíJindikovanýchjproti fosfátem pufrovanému salinickému roztoku byly použity v množství 20 /Ul pro tuto zkoušku. Z obr. 4 je zřejmé, že hlavní podíl biologicky akSi tivního materiálu prošel kolonou nenavázaný, zatímco se kontaminující materiál navázal a byl eluován v solném gradien tu.

5. Chromatografie používající uhlovodíkové pryskyřice navázané na oxidu křemičitém

Frakce 4-40-z kolony S-Sepharos.y na obr. 4 byly spojeny (540 ml). 450 ml tohoto poolu bylo spojeno se stejným objemem pufru B (100 mM octanu amonného, pH 6:isopropanol) a aplikováno průtokovou rychlostí 540 ml/h na C^ kolonu (Vydac -froteins C^, 2,4 x 2 cm) ekvilibrovanou pufrem A (60 mM octan amonný, pH 6:isopropanol, 62,5:37,5). -fo aplikaci vzorku byla průtoková rychlost snížena na 154 ml/h á kolona byla promyta 200 ml pufru A.Pak byl aplikován lineární gradient od pufru A k pufru B (celkový objem 140 ml) a byly odebírány frakce 9,1 ml. Rodily poolu z chromatograf ie na S-Sepharose, výchozí vzorek z kolony C^,bouhrn poolu a promyty ppol byly upraveny na 40 /Ug/ml hovězího sérového albuminu přidáním vhodného objemu zásobního roztoku o koncentraci 1 mg/ml a dialyzovány proti fosfáten pufrovanému salinickému roztoku pro přípravu biologické studie. Podobně byly 40 /Ul podíly gradientových frakcí spojeny s 360 /ul fosfátem pufrovaného salinického roztoku, obsahujícího 16 /Ug hovězího sérového albuminu a tyto byly pak dialyzovány proti fosfátem ^u/rovanému salinickému roztoku pro přípravu biologické studie. ^xyto různé frakce byly /

zkoušeny MC/9 zkouškou (6,3 /Ul podíly připravených gradientových frakcí, cpm na obr.5).Výsledky zkoušky také ukazují, že asi 75 % získané aktivity bylo v souhrnnýmh a promytých frakcích a 25 % v gradientových frakcích jak je uvedeno na obr.5. SDS-PAGE /Laemmli, Natire, 227, 680-685 (1970)); zásobní gely obsahují 4 % (hotn./obj.)akrylamidu a dělící gely obsahují 12,5 % (hmotn./obj.) akrylamidu/ podílů různých frakcí je uvedena na obr. 6, Pro gelové zpracování byly podíly vzorků sušeny za vakua a pak znovu rozpuštěny zjsr

za použití 20 /Ul vzorku ošetřeného pufrem (nerdukujícím, t$. bez 2-merkaptoethanolu) a vařeny 5 minut před nanesením na gel. Dráhy A a B představují výchozí kolonový materiál (75 /Ul z 890 ml) a materiál prošlý kolonou (75 ^ul z 880 ml), číslované značky na levé straně obr. představují migrační polohy (redukované) markérů, majících molekulovou hmotnost 10 krát větší než indikované hodnoty, kde markéry jsou fosforyláza Β (Μ_ρ 97400), hovězí sérový albumin (M 66200), ovalbumin (Mg 42700), uhlíkatá anhydréza (Μ_ρ 31000), inhibitor trypsinu sojových bobů (M_p 21500) a lysozym (M^ 14400), dráhy 4-9 představují odpovídající frakce odebrané během aplikace gradientu (60 yul z 9,1 ml). Gel byl postříbřen (Morrjjsssey, Anal.Biochem., 117, 307-310 (1981 )).

Ze srovnání drah A a B je zřejmé, že hlavní část barveného materiálu prošla kolonou. Obarvený materiál ve frakcích 4-6 v oblasti uvedené výše a pod M 31000 polohou standardu odpovídá biologické aktivitě detegované ve frakcích gradientu (obr.5) a představuje biologicky aktivní materiál. Je třeba poznamenat, že tento materiál je vizualizován ve drahách 4-6, ale ne ve drahách A a/nebo B, protože byl mnohem větší podíl celkového objemu (0,66 % celkového objemu frakcí 4-6 versus 0,0084 % celkového objemu pro dráhy A a B) použit pro zpracování. Prakce 4-6 z této kolony byly spojeny.

Jak je uvedeno výše, přibližně 75 %. získané aktivity prošlo kolonou, obr.5. Tento materiál byl rechromatografován na použití pryskyřice v podstatě popsané výše s tím rozdílem, že větší kolony (1,4 x 7,8 cm) a nižší průtoková rychlost (50-60 ml/h) byly použity. Přibližně 50 % získané aktivity bylo v průtoku a 50 % ve frakcích gradientových, vykazujících podobný průběh pfi ŠDS-PGE ' jako aktivní gradientově frakce na obr.6. Aktivní frakce byly spojeny(29 ml).

Analytická kolona byla provedena v podstatě jak je uvedeno výše a frakce byly zkoušeny oběma biozkouškami.

^Jak je uvedeno na obr.7 frakce z analytické kolony ko^euo35 ty# z

vály jak MC/9 tak HPP-CFC bioaktivity. SDS-PAGE analýza (obr. 8) odhaluje přítomnost -31000 proteinu ve frakcích z kolony, které obsahují biologickou aktivitu v obou zkouškách.

Aktivní materiál v píku druhé (relativně malé) aktivi ty zřejmý v S-Sepharosové chromátografii (tj. obr. 4, frak ce 62-72, časnější frakce v solném gradientu) byl také čištěn C^ chromátografií. Vykazuje stejné chování při SDSPAGE a měl stejné N-terminélní aminokyselinové sekvence (viz příklad 20) jako materiál získaný C^ chromatografií frakcí prošlých S-Sepharosou.

6. Shrnutí čištění

Shrnutí stupňů čištění popsaných ve stupních 1-5 výše je uvedeno v tabulce 2.

Tabulka 2

Shrnutí čištění savčích SCF celkem objem (ml) protein (mg)^ v

Stupen

kondiciované medium DEAE celulóza1	335,700 2,900	13,475 2,164
ACA-54	550	1,513
aglutinin pšeničných {CLíč-
ků-agaroza^	375	431
S-Sepharose	5404	10 /*
84 pryskyřice^	57,3	- 0,25-0,40°

· ^vedené hodnoty představují souhrn hodnot z různých vsádek popsaných v textu.

2. Jak je popsáno výše v příkladu, vysrážený materiál, který se objevil během dialýzy vzorku v přípravě pro

S-Sepharosovou chromatografii byl odstraněn odstředěním

Vzorek po odstředění (480 ml) obsahoval 264 mg celkového proteinu.

3. K-ombinace aktivních gradientových frakcí ze dvou pokusů na kolonách v sekvenci jak je popsáno.

4. ^pouze 450 ml tohoto materiálu bylo použito pro následující stupeň (tento příklad, výše).

5. Stanoveno metodou podle Bradforda (supra, 1976) pokud není uvedeno jinak.

6. Hodnoceno podle intenzity potažení stříbrem po SDS-PAGE, a podle analýzy aminokyselin jak je popsáno v sekci K příkladu 2.

D, SDS-PAGE a zpracování glykosidázou

SDS-PAGE spojeného gradientu frakcí ze dvou pokusů na koloně ve velkém měřítku jsou uvedeny na obr. 9· Šedesát ^ul poolu s první kolony bylo použito (dráha 1), a 40 /ul poolu ze druhé G^ kolony (dráha 2) v pokuse. Tyto gelové dráhy byly postříbřeny. Markéry molekulové hmotnosti ^byTy jak j^e popsáno u obrázku 6. Jak bylo uvedeno, materiál migrující nad a pod M^ 31000 markerovou polohu představuje biologicky -aktivní materiál; zřejmá r^e^.S§8nita je většinou způsobena heterogenitou v glykosylaci.

Pro charakterizování glykosylace byl čištěný materiál 1 25 jodován pomocí I, zpracován s různými glykosidázami a analyzován pomocí SDS-PAGE (redukční podmínky) autorádio^ grafií. Výsledky jsou uvedeny na obr.9· Dráhy 3 a 9, Iznačený materiál bez jakéhokoliv ošetření glykosidázou. Dréhy 4-8 představují ²I-značený materiál ošetřený glykosidázou následujícím způsobem. Dráha 5 neuraminidázou a O-glykanázou. Dráha 6 N-glykanázou. Dráha 7 neuraminidázou a N-glykanázou.,Dráha 8 neuraminidázou, O-glykanézou a N-glykanázou. Podmínky byly 5 mM 3“/(3-cholamidopropyl)dimethylamonio/-1-propansulfonát (CHAPS), 33 mM 2-merkaptoethanol, mM tris-HCl, pH 7-7,'2 po 3 h při 37 °C. Neuraminidéza (z Arthrobacter ureafaciens, Calbiochem) byla použita v konečné koncentraci 6,23 jednotek/ml. O-Glykanáza (Genžym, endo-alfa-N-acetyl-galaktosaminidéza) byla použita v koncentraci 45 milijjednotek/ml. N-Glykanóza (Genzym, peptid; N-glykosidáza F; peptid-N^/N-acetyl-beta-glukosami^yl/asparagín amidáza) byla použita v koncentraci 10 jednotek/ml.

Stejné výsledky jako na obr.9 byly získány při zpracování neznačeného čištěného SCF glykosidázou a vizualizací produktu postříbřením po SDS-PAGE.

Příležitostně byly provedeny různé kontrolní inkubace. Tyto zahrnují: inkubaci ve vhodném pufru, ale bez glykosidázy, pro ověření, že výsledky byly získány působením přidaného glykosidázového přípravku; inkubace s glykosylovaným proteinem (tj.například glykosylovaný rekombinantní lidský erythropoietin) známým jako substrát, pro glykosidázu, pro ověření, že použitý glykosidázový enzym byl aktivní; a inkubace s glykosidázou ale bez substrátu, pro ověření žeže glykosidéza samotná nevytváří pruhy na vizualizovaném gelu.

Ošetření glykosidázou byla také provedena s endo-betaN-acetylglukosamidázou (endo F; NEN Dupont) a s' endo-betaN-acetylglukosaminidázou H (endo H, NEN Dupont), vždy se vhod nými kontrolními inkubacemi. Podmínky ošetření s endo F byly: var 3 min za přítomnosti 1% (hmotn./obj.) SDS, 100 mM 2-merkaptoethanol, 100 mM EDTA, 320 mM fosfát sodný, pH 6, následovaný 3-násobným zředěním s Nonidetem -P-40 (1,17%, obj./obj.., konečná koncentrace), fosfát sodný (200 mM, konečná koncentrace) a endo F (7 jednotek/ml, konečná koncentrace). Podmínky endo H ošetření byly stejné s tou výjimkou, že SĎS koncentrace byla 0,5 % (hmotn./obj.) a endo H byla použita v koncentraci 1 /Ug/ml. Výsledky s endo F

byly stejné jako s N-glykanázou, zatímco endo H byla na čištěném SCF materiálu neúčinná.

^ávěry, které lze z výsledků odvodit jsou popsány dále pro pokusy s glykosidázou. Různá ošetření s N-glykanázou (která odstraňuje g&b komplex iíak vysoce,manosový Nzesítěný karbohydrát (Tarentino a spol., Biochemistry 24, 4665-4671)(1985)/, endo F(působící stejně jako N-glykanáza (Elder a Alexander, ^roc.Nati.Acad.Sci. USA 79, 4540-4544 (1982)/, endo H (odstranující^vysokou manosu tak určitý hybridní typ N-zesítěného karbohydrátu (Tarentino a spol., Methods Enzymol. 50C, 574-580 (1978)/, neuraminidázou v

(odstraňující zbytky sialové kyseliny) a 0-glykanázou (odstraňující určité O-zesítěné karbohydráty (Lambin a spol., Biochem.Soc.Trans.12, 599-600 (1984)/ potvrzují, že: jsou přítomny jak N-zesítěné tak O-zesítěné karbohydráty, největší podíl N-zesítěného karbohydrátu je komplexního typu, a je přítomna sialová kyselina, kde alespoň část je ve formě O-zesítěných skupin. Některé údaje o možných místech N-zesítění mohou být získány z aminokyselinových sekvenčních údajů (příklad 2). Skutečnost, že ošetření N-glykanázou, endo F a N-glykanézou/neuraminidázou může převést heterogenní materiál jak je zřejmé podle SDS-PAGE na rychle migrující formy, které jsou homogennější, je v souladu se závěrem, že všechen materiál představuje stejný polypeptid, s heterogenitou způsobenou heterogenitou při glykosylaci.

Je také pozoruhodné, že nejmenší formy získané kombinovanými ošetřeními s různými glykosylázami jsou v rozmezí M*. 18000-20000 vzhledem k markérům molekulové hmotnosti použitým v-SDS-PAGE.

Potvrzení, že difuzně migrující materiál kolem polohy

M 31000 na SDS-PAGE představuje biologicky aktivní materiál který má stejný polypeptidový řetězec, je dáno skutečností, že aminokyselinové sekvenční údaje získané z materiálu migI

rujícího v této oblasti (např. po elektroforetickém transferu a ošetření bromkyanem, příklad 2) odpovídají těm, které byly demonstrovány pro izolovaný gen, jehož exprese rekombinantnf DNA vede k biologicky aktivnímu materiálu (příklad 4).

Příklad 2

Aminokyselinová sekvenční analýza savčího SCF

A. Vysoce účinná kapalinová chromatografie s reverz'ní fází (HPLC) čištěného proteinu

Přibližně 5 /Ug SCF čištěného jako v příkladu 1 (koncentrace = ^υ,117 mg/ml) se podrobí HPLC s reverzní fází za použití C^ úzkovrtanou kolonou (Vydac, 300 A vrtání, 2 mm x 156m). Protein byl eluován lineárním gradientem 97 %mobilní fáze A (0,1% trifluoroctová kyselina)/3% mobilní fáze B (90 % acetonitrilu v 0,1% trifluoroctové kyselině) do 30% mobilní fáze A/70 % mobilní fáze B během 70 min s následující isokratickou elucí po dalších 10 minut při průtokové rychlosti 0,2 ml za min. Po odečtení slepého chromatogramu pufru se SCF jeví jako jednotlivý symetrický pruh(pík) s retenčním časem 70,05 min jak je uvedeno na-obr. 10. Za těchto podmínek nebyl detekován žádný hlavní pík kontaminujícího proteinu.

B. Sekvenování elektroforeticky transferovaných proteinových pruhů

SCF čištěný jako v příkladu 1 (0,5-1,0 nmol) se následujícím způsobem ošetří N-glykanézou, enzymem, který specificky štěpí Asn-zesítěné karbohydrátové skupiny kovalentně připojené k proteinům (viz příklad 1D). Šefct ml poolovaného materiálu z frakcí 4-6 z C^ kolony na obr.5 se suší za vakua. Pak se přidá 150 ^ul 14,25 mM CHAPS, 100 mM 2-merkap

-4//

1/ toethanolu, 335 JmM fosforečnanu sodného, pH 8,6 a inkubace se provádí po 95 minut při 37 °C. Přidá se 300 /ul 74 mM fosforečnanu sodného, 15 jednotek/ml N-glykanázy, pH 8,6 a v inkubaci se pokračuje 19 h. Vzorek se pak zpracuje na 9-18% SDS-polyakrylamidovém gradientovém gelu (0,7 mm tlouštka, 20x20 cm). Proteinové pruhy v gelu se elektroforeticky přenesou do polyvinyldifluoridu (PVDF, Milipore Corp.) za použití 10 mM Caps pufru (pH 10,5) při konstantním proudu 0,5 Amp po 1 h /Matsudaira, J.Biol.Chem., 261, 10035-10038 (1987)/. Přenesené proteinové pruhy se vizualizuji pomocí Coomasie Blue. Pruhy jsou přítomny při M*, -29000-33000 a -26000, tj.deglykosylace byla jen částečná (příklad 1D, obr. 9); dřívější pruh představuje neštěpený materiál a pozdější představuje materiál, ze kterého je odstraněn N-žesítěný karbohydrét. Pruhy byly vyříznuty a přímo vloženy (40% pro 29000-33000 proteinu a 80% pro 26000 proteinu) na proteinový sekvenátor (Applied Biosystems lne., model 477). Analýza proteinové sekvence byla provedena za použití programů doporučených výrobcem (Hewick a spol., J.Biol.Chem.,'256 7990-7997)/ a uvolněné fenylthiohydantoinylaminokyseliny byly analyzovány on-line za použití mikrovrtané HPLC s reverzní fází. Oba pruhy nedávají signály pro 20-28 sekvenční cykly, což potvrzuje, že jsou oba nes.ekvenovatelné metodou využívající Edman chemie. Základní hladina každého sekvenování byla mezi 1-7 pmol, je daleko nižší než množství proteinu přítomné v pruhu. Tyto údaje potvrzují, že protein v pruzích byl N-koncově blokován.

C. in šitu CNBr štěpení elektroforeticky transferovaného proteinu a sekvenování «r

Pro potvrzení, že protein, byl skutečně blokován, byla ze sekvenátoru odstraněna membrána /část B/ a bylo provedeno štěpení bromkyanem in sítu /CNBr 5%, hmotn./obj./ v 70% kyselině mravenčí 1 h při 45 °C/ s následujícím sušením a sekvenční analýzou. Byly delegovány silné sekvenční signály, představující vnitřní peptidy získané ze štěpení iaethlonylpeptidové vazby pomocí CNBr.

Oba pruhy poskytují identické směsné sekvenční signály uvedené dále v prvních, pěti cyklech..

Identifikované aminokyseliny

Cyklus	1:	Asp,	Glu,	Val,	Ile,	leu
Cyklus	2:	Asp,	Thr,	Clu,	Ala,	Iru, Val
Cyklus	3:	Asn,	Ser,	His,	Pro,	Leu
Cyklus	4í	Asp,	Asn,	Ala,	Pro,	Leu
Cyklus	5:	Ser,		Pro

Oba pruhy také poskytují podobné signály až do 20 eyklů. Počáteční výtěžky byly 40-115 pmol pro 26000 pruh. a 40-150 pmol pro M_r 29000-33000 pruh.. Tyto hodnoty jsou srovnatelné s původním, molárním množstvím proteinu vloženým do sekvenátoru. Výsledky potvrzují, že proteinové pruhy, odpovídající SCE obsahují blokovaný N-konec. Postupy použité pro získání potřebných sekvenčních informací pro N-koncově blokované proteiny zahrnují: a/ odblokování N-konce /viz sekce b/, a b/ a získání peptidů vnitřním štěpením pomocí CNBr /viz sekce E/, trypsinem /viz sekce E/ a Staphylococcus aureus /kmen Y-8/ proteázou /Glu-C//viz sekce 6/. Sekvenční analýza může být provedena po odstranění, blokované N-koncové aminokyseliny nebo po izolaci peptidových fragmentů. Příklady jsou detailně popsány dále.

D. Sekvenční analýza faktoru BEL kmenových buněk po zpracování s pyroglutamovou kyše linou-aminópeptidázou

-4^ Lf/

Předpovědět chemický charakter blokujíc! skupiny přítomné na amino zakončení SCF bylo obtížné. Blokování může být post-translační in vivo /F.Wold, Ann.Rev.Biochem.,50, 783814 /iB&iff nebo může vznikat in vitro během čištění. Obvykle jsou nejčastěji pozorovány dvě post-translační modifikace. Může probíhat acetylace určitých H-koncových aminokyselin jako je Ala, Ser, atd., katalyzovauá N- βζ-acetyltransferázou. Toto může být potvrzeno izolací a analýzou hmotovou spektrometrií H-koncově blokovaného peptidů» Jestliže je aminozakončením peptidů glutamin, může probíhal deamiďace jeho gama-amidu. Může pak probíhat eyklizace zahrnující gamakarboxylát a volný K-konec za vzniku pyroglutamátu. Pro detekci pyroglutamátu může být použit enzym pyroglutamát amlnopeptidáza. Tento enzym odstraňuje pyroglutamátový zbytek, štěpící volný aminokonee u druhé aminokyseliny. Pro sekvenování může být užito Edmanovy chemie.

SCJ? /čištěný jako v příkladu 1, 400 pmol/ v 50 mM. sodném fosfátovém pufru /pH. 7,6, obsahující dithíothreitol a EDTA/ byl ínkubován s 1,5 jednotkami pyroglutamové kyselinyaminopeptidázy telecích jater /pE-AP/ po 16 h při 37 °C. Po reakci byla směs přímo vžožena do proteinového sekvenátoru. Hlavní sekvence byla identifikována po 46 cyklech. Počáteční výtěžek byl asi 40 % a opakovaný výtěžek, byl 94,2 %. N-terminální sekvence SCF zahrnující N-koncovou pyroglutamovou kyselinu je:

PE-AP místo štěpení pyr oGlu- Glu- lle- Cys-Arg-Asn-P r o- Ya 1- Thr- Asp- Asn- Ya I- lys- Asp2.0 lle- Thr- lys- Leu- Val- A la- Asn- Leu-P ro- As n- Asp- Tyr- Met- lle- Th-r30 40 len* Asn- Tyr- Ya 1- Ala- G ly- Met- Asp- Ya 1- Leu-Ϊ r o- S er- His- xxx- Trpleu- Arg-Asp-......

xxx, v poloze 43 nestanoveno *·

Tyto výsledky prokazují , že SCF obsahuje ua svém Iř*koncl pyroglutamovou kyselinu.

E. Izolace a sekvenční analýza CNBr peptidů

SCF čištěný jako v příkladu 1 /20-28 yUg/,/1,0-1 ,5 nmol/ byl zpracován s N-glykanázou jak je popsáno vr příkladu 1.

Y tomto případě byla přeměna na materiál tt 26000 kompletní.

JL·

Vzorek byl sušen a štěpen CnBr v 70% kyselině mravenčí /5%jř po 18 h při teplotě místnosti. Eo štěpení byl materiál zředěn vodou, sušen a znovu rozpuštěn v 0,1% trifluoroctové kyselině. GNBr peptidy byly odděleny HPLC s reverzní fází za použití C^ narrowbore kolonou za elučních podmínek stejných jak jsou popsány v sekci A tohoto příkladu. Některá hlavni peptidové frakce byly Izolovány a sekvenovány a výsledky jsou sumarizovány následovně:

GB-14 a

CB-16

EeptiA

0-4

CB-6¹'

CB-B

CB-10

CB-15² retenční čas /min/ sekvence^

15.5 IrP-P--22.1 a. I-T-L-N-Y-Y-A-S-/H/ ________

b. Y- A- S-D-T-S-B-C- V- L-S-ýT//· L-G- ] • _ P-E-K-D-S-R-Y-S-Y-/_/-£—28,0 D-Y-L-P-S-H-C-r-L-R-B-/tt/

30.1 /obsahující sekvenci CB-B/ ,0 E-E- N-A-P- K- N-Y- K-E- S- L- K- K-P-T- R- /N/- F- T-P-E-Es- F- F- Sr-I- F-B^-R-S---37.5

£.

oba peptidy obsahují sekvenci CB-15

Ί. Nebyly detegovány aminokyseliny v polohách 12, 13 a 25» Peptld b nebyl sekvenován na konci.

2® /N/ v CB-15 nebyl detegován, byl odhadnut jako potenciální místo R-gly kosy láce. Peptld- nebyl na konci sekvenován.

5» Označené místo, kde Asn může být převeden na Asp N-glykanázovým odstraněním N-připojeného cukru.

4. Byl použít násiedující písmenový kod: A Ala,. C Cys, D Asp, K Glu_r F Phe, G Gly, H His, I Ile, K lys, i len, M Ket,

Η Asn, P Pro, Q Gin, R Arg, S Ser, T Thr, ¥ ¥al, V Trp a Y Tyr.

F. izolace a sekvenování faktoru BRL kmenových buněk jako tryptických fragmentů

SCF čištěný jako v příkladu 1 /20 yug ve 150 yttl 0,1 K hydrogenuhličitanu amonném/ hyl štěpen 1 yug ýrypsinu při 37 °C po 3,5 h. Materiál hyl ihned převeden na narrowhore C^ HPLC za použití e luč nich podmínek jak jsou popsány v sekci A tohoto příkladu. Všechny eluované peptidové píky měly retenční časy rozdílné od neštěpeného SCF /sekce A/» Sekvenční analýza izolovaných peptidů je uvedena dále:

retenční

Peptid doba sekvence /min/A.

T-1 7,1

OL-2¹ 28,1

T-3 32,4

5S4² 40,0

T-5³ 46,4

T-7⁴ 72,8

T-8 73,6

E- S- Ir- Κ- K-P-E- T-R v-s-y-/_/-k

L-Y-D-B-IrV-A-A-M-E-E-lř-A-P-K N- R- T-P-E-E- F- F- S-1- F- /_ /- R

a. IrV-A-R-IrP-N-B-Y-K-i-T^IrR-Y-V-A-G- K-D-V-I?P-S-H- C-W-Ir-R

h. S-i-D-A-F-K-B-F-ř^V-A-S-D-T-S-B-C-V- Ir- S- /_ /“ /_— /- Ir- G—-—

E- S- Ir K- K-P-E- T-R- /R/- F- T-P-E-E- F- F- S-I-F-Z^Z-R

E- S- Ir- Κ- K-P - Ε- T- R- H- F- T-P-E-E- F- F- S-i- F-B-R

1. Aminokyselina v poloze 4 nebyla označena

2. Aminokyselina v poloze 12 nebyla určena

-45^'rv

3. Aminokyseliny v polohách 20 a 21 v 6 peptidů f-5 nebyly identifikovány, byly odhadem určeny jako eísta O-přlpojení cukru.

4» Aminokyselina v poloze 10 nebyla detegována, byla považována za Asn vzhledem, k potenciálnímu N-vázanému glykosylačnímu místu. Aminokyselina v poloze 21 nebyla detegována.

G. izolace a sekvenování peptidů faktoru BR1 kmenových, buněk po štěpení S.aureus Glu- C proteázou

SCF čištěný jako v příkladu 1 /20 yUg ve 150 /Ul 0,1 M hydrogenuhličitanu amonného/ bylo podrobeno štěpení Glu-C proteázou při poměru proteáza-substrát 1t20. Štěpení bylo provedeno při 37 °C po 18 hodin. Materiál byl ihned oddělen narrowbore C^ HPLC s reverzní fází. Bylo odděleno pět hlavních peptidových frakcí a tyto byly sekvenoványť retenční

	Peptid	doba	/min/ sekvence
	S-1	5.1	N-A-P-K-N-Y-K-E
	S-21	27,7	S- R- Y- S- Y- /_ /- K-P - F- M- Ir P -P - Y- A- /A/
i	S-32	46,5	nedetekována žádná sekvence
	S-55	71,0	S- Ir K- K-P - E- I-R-N- F- I-P - Ε- E- F- F- S-1- F-
	-		- /N/-R«S-I-D-A-F-K-D-F-fr-Y-A-S-D
	S-65	72,6	S- Ir K-K-P-E-T-R-N-F—T-P-E-E- F-F- S-I-F-
i Vi ;'			- /N/-R- S- X-D-A- F-K-D- P-M- Y- A- S-D- T-S-D

1. Aminokyselina v poloze 6 S-2 peptidů nebyla určena, mohlo by to býtt místo připojení O-vázaného cukru. Ala v poloze 16 S-2 peptidů byl detegován v nízkém výtěžku.

2. Peptid S-3 může být N-koncově blokovaný peptid odvozený od N-konce SCF.

3. N v závorkách označuje potenciální místo připojení N-vázaného cukru.

-46Η. Sekvenční analýza faktoru BRL kmenových buněk po štěpení BNPS-skatolem

SCF /2 yug/ v 10 mM hydrogenuhličitanu amonného byl zcela vysušen vakuovým odstřelováním a pak znovu rozpuštěn v 100 yul ledové kyseliny octové. 10tí až 20tí násobný molárhí přebytek BNPS-skatolu byí přidán k roztoku a směs byla inkubována při 50 °C po 60 min. Reakční směs pak byla sušena vakuovým odstřelováním, Sušený zbytek byl extrahován 100 yul vody a opět 50 yul vody. Spojené extrakty pak byly podrobeny sekvenční analýze popsané výše. Byla detegována následující sekvence:

10

Leu- Arg-Asp- Met- Ya 1- Thr- His- Leu- Ser- Ya 1- Ser- Leu- Thr- Thr- Leu- Leu20 50 A sp- Lys-P he- Ser- Aén- Ile- Ser- Glu- Gly- Leu- Ser- /Asn/- Tyr- Ser- Ile-Ile

Asp-Lys-Leu-Gly-Ile-Yal-Asp---Poloha 28 nebyla pozitivně určena, byla určena jako A_sn jako potenciální místo it-vázané glykosylace.

lodíl SCP proteinu /500 pmol/ byl pufrem převeden do 10 mM octanu sodného, pH 4,0 /celkový objem 90 yul/ a byl přidán Brij-55 v koncentrací 0,05% /hmotn./obj»/. 5 yul podíl byl odebrán pro kvantifikací proteinu. Čtyřicet yul vzorku bylo zředěno na 100 yul výše popsaným púfrem. Byla přidána karboxypeptidáza P /z Penicillium janthinellum/ při poměru enzym-substrát 1:200» Štěpení bylo prováděno pří 25 °C a byly odebírány 20 yul podíly 0, 15» 30, 60 a 120 min» Štěpení bylo ukončeno v každé době přidáním trifluoroctové kyseliny v celkové koncentraci 5 %· Yzorky byly sušeny a uvolněné aminokyseliny byly derivatizovány reakcí s Dabsylchloriďem /dímethylaminoazobenzensulfonylchlorid/ v 0,2 M NaHCO^ v 0,2 K NaHCO^ /pR 9»Q/ pří 70 °C po 12 min /Chang a spol».

Methods Enzymol., 90, 41-48 /1983//. Derivatizavane aminokyseliny /jedna šestina každého vzorku/ byly analyzovány HPLC narrowbore reverzní fázi s modifikací postupu podle Changa a spol., /Techniques in Protein Chemistry, T.Hugli vyd.,

Acad. .Press, NT /1989/, str. 305-511/. Kvantitativní složení odpovídající určité době bylo získáno porovnáním standardů derivátizovaných aminokyselin /1 pmol/. Y době 0 byl delegován kontaminující glycin. Alanin byl jedinou aminokyselinou, která, stoupala s inkubačním časem. Eo 2 hodinách inkubace hyl Ala delegován v celkovém množství 25 pmol,ekvivalentní 0,66 mol Ala uvolněného na molproteinu. Výsledek indikuje, že přírodní savčí SGF molekuly obsahují Ala na svém karboxylovém konci, což. je v souladu se sekvenční-analýzou C-koncového peptidů,S-2, který obsahuje C-koncový Ala. Tento' závěr je také v souladu se známou specifikou karboxypeptidázy P /Lu a spol., J.Chromatog. 447, 351-364 /1988//. Například štěpení probíhá, jestliže je předpovězená sekvence Pro-Val. Peptid S-2 měl sekvenci S- R-Y-S-Y-/T/-K-P-P-ML-P-P-Y-A-/A/ a bylo předpokládáno, že je C-koncovým peptidem SGF /viz sekce J tohoto příkladu/. C-koncová sekvence -—P-Y-A-/Á/ omezuje proteázové štěpení pouze na alanin. Aminokyselinové složení peptidů. S-2 indikuje, xx přítomnost 1 Thr, 2 Ser, 3 Fro, 2 Ala, 3 Yal, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys a 1 Arg, celkem 16 zbytků. Detekce 2 Ala zbytků indikuje, že. zde mohou být dva Ala zbytky na C-konci tohoto peptidů /vit tabulka v sekci 6/. BUL CSE je tak zakončen Ala 164 nebo Ala 163.

Sekvence SCF

Kombinací výsledků získaných ze sekvenční analýzy /1/ intaktního faktoru kmenových buněk, po odstranění jeho N-terminální pyroglutamové kyseliny, 2/ CNBr peptidů, 3/ trypsin peptidů a 4/ Glu-C peptidázových fragmentů, N-koncové sekvence a C-koncové sekvence byly dedukovány /obr.11/. N-koncová sekvence začíná u pyroglutamové kyseliny a končí u Met-48. C-koncová sekvence obsahuje 84/85 aminokyselin /poloha 82 až 164/165/· Sekvence od polohy 49 do 81 nebyla detegována

-/η v žádném jk izolovaných peptidů. Nicméně sekvence byla delegována n velkého peptidu po BNPS-skatolovem štěpení BRL SCF jak je popsáno vt sekci H tohoto příkladu. Z těchto dalších údajů jakož i LNA sekvencí získaných z krysího SCF /příklad 3/ mohou být N- a C-koncové sekvence určeny a celková sekvence sestavena jak je uvedeno na obr.11. N-konec molekuly je pyroglutamová kyselina a C-konec je alanin jak je potvrzeno štěpením pyroglutamát aminopeptidázou a karboxypeptidázou P .

Ze sekvenčních údajů je zřejmé, že Asn-72 je glykosylován, Asn-109 a Asn-120 jsou pravděpodobně glýkosylovány v některých molekulách, ale v jiných ne. Asn-65 mohl být během sekvenční analýzy detegován a proto může být jen částečně glykosylován, pokud vůbec je. Ser-142, Thr-143 a Thr-155, před povězené z DNA sekvence, nebyly detegovány během aminokyselinové sekvenční analýzy a proto by mohly být místy 0-vázaného karbohydrátového připojení. Tato potenciální místa karbohydrátového připojení jsou uvedena na obr.11; N-vázaný karbohydrát je indikován polotučnými písmeny v závorkách,

0-vázaný karbohydrát volnými polotučnými písmeny.

K. Analýza složení aminokyselin faktoru BR1 kmenových, buněk

Materiál z kolony na obr.7 byl připraven pro analýzu složení aminokyselin zahuštěním a pufrovou výměnou do 50 mM hydrogenuhličitanu amonného.

Dva 70 yul vzorky byly odděleně hydro lyžovány v 6 N HCl, obsahující 0,1 % fenolu a 0,05 % 2-merkaptoethanolu při 110 °G za vakua po 24 hodin. Hydrolyzáty byly sušeny, rekonstituovány v pufru na bázi citrátu sodného a analyzovány za použití iontovýměnné chromatografie /Beckman Model 6500 analyzátor aminokyselin/. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5. ^oužítí 164 aminokyselin /ze sekvenčních, proteinových dat/ pro výpočet složení aminokyselin poskytuje lepší předpověčí hodnot než použití 195 aminokyselin /jak je dedukováno z PCR odvozených DHA sekvenčních hodnot, obr. 140/.

-/ X

Tabulka 3 kvantitativní složení aminokyselin v savčím SCF

	složení aminokyselin	předpovídané 1 zbytky na molekulu
mol na mol	proteinu
Aminoky- seliny	pok.č.1	pok.č.2	(A)	(B)
Asx	24,46	24,26	25	28
Thr	10,37	10,43	11	12
Ser	14,52	14,30	16	24
Glx	11,44	11,37	10	10
Pro	10,90	10,85	9	1 0
Gly	5,81	6,20	4	5
Ala	8,62	8,35	7/8	8
Qys	nd	nd	4	5
Val	14,03	13,96	15	15
Met	4,05	3,99	6	7
Ile	8,31	8,33	9	10
Leu	17,02	16,97	16	19
Tyr	2,86	2,84	3	7
Phe	7,96	. 7,92	8	8
His'	2,11	2,11	2	3
Lys	10,35	11,28	12	14
Trp	nd	nd	1	1
Arg	4,93	4,99	5	6
celkem	158	158	164/165	193
vypočtená molekulová	hmotnost		18,4243

1. Vztaženo na 158 zbytků z proteinové sekvenční analýzy (s výjimkou Cys a Trp).

2. Teoretické hodnoty vypočtené z ůdajů proteinové sekvence (A) nebo z údajů DNA sekvence (B).

3. ^vztažěno na 1-164 sekvence.

-sv- rl

Zahrnutí známého množství vnitřního standardu v analýze aminokyselinového složení také umožňuje kvantifikaci proteinu ve vzorku, pro analyzovaný vzorek byla získána hodnota 0,117 mg/ml.

Příklad 3 ^lonování genů pro krysí a lidský SCF

A. Amplifikace a sekvenování krysích SCF cDNA fragmentů . -determinace aminokyselinové sekvence fragmentů krysího SCF proteinu umožnila označit smíšenou sekvenci oligonukleotidů, specifickou pro krysí SCF. Oligonukleotidy byly využity jako hybridizační sondy ke zjištění krysí cDNA a genomových knihoven a jako primerů v pokusech amplif ikovat části cDNA užitím ^olymerázové řetězové reakční (PCR) strategie (/Mullis a spol., Methods in Enzymol. 155, 335-350 (1987)/. ^vligodeoxynukleotidy byly, syntetizovány ¹ fosforamiditovou metodou /Beaucage a spol., Tetrahedron Lett., 22, 1859-1862 (1981), McBride a spol., Tetrahedron Bett., 24, 245-248 (1983)/, jejich sekvence jsou zobrazeny na obr.12A, Písmena znamenají A adenin, T thymin, C cytosin, G guanin, I inosin, x v obr.12A představuje oligonukleotidy, které obsahují sekvence zjistitelné restrikčními endonukleázami. Sekvence jsou zapsány 5*->3*.

Krysí genomové knihovna, krysí jaterní,genomová knihovna a dvě BRL cDNA knihovny byly zjištěny použitím Pznačených směsných oligonukleotidových sond, 219-21 a 21922 (obr.21 A), jejichž sekvence byly vztaženy na aminokyselinové sekvence získané v příkladu 2. Žádné SGF klony nebyly v tomto experimentu získány použitím standardních metod cDNA klonování /Maniatis a spol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 212-246 (1982)/.

/V alternativním pokusu, jehož výsledkem byla izolace sekvence nukleové kyseliny pro SCF se využila PCR technika. V těchto metodách je oblast DNA vymezená dvěma primery amplifikovaná in vitro multiplikovanými cykly replikace katalyzovanými vhodnou DNA polymerázou (jako je Taql DNA polymeréza) za přítomnosti deoxynukleosidtrifosfátů v zařízení pro tepelné cykly. Specifita PCR amplifikace spočívá na dvou oligonukleotideiých primerech, které ohraničují DNA segment, který má být amplifikován a hybridizován k protilehlému řetězci. PCR s dvoustrannou specifitou pro jednotlivé DNA oblasti v komplexu směsi je dosaženo užitím dvou pr.imerů se sekvencí dostatečně specifickou pro tento region. PCR s jednostrannou specifitou využívá primer specifický pro jednu oblast a druhý- primer, který může začínat v cílových místech přítomných na mnoha nebo všech DNA molekulách ve směsi /Loh a spol., Science, 243, 217220 (1989)/.

DNA produkty úspěšné PCR amplifikační reakce jsou zdrojem informace o DNA sekvenci (^Gyllesten, Biotechniques, 7, 700-708(1989)/ a mohou být využity k výrobě značených hybridních sond, majících větší délku a vyšší specifitu než oligonukleotidové sondy. PCR produkty mohou také být značeny, se vhodnou primerovou sekvencí, ke klonování do plasmidových vektorů, které dovolují expresi kódovaného peptidového produktu.

Základní strategie pro získání DNA sekvence krysí SCF cDNA je načrtnuta na obr.13A. M_aié šipky indikují DNA sekvenční reakce. PCR 90,6 a 96,2, ve spojení s DNA sekvenováním, byly použity k získání částečné nukleokyselinové sekvence pro krysí SCF cDNA. Primery použité v těchto PCR byly smíšené oligonukleotidy vztažené na aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 11. T_oužitím sekvenční informace získané z PCR 90,6 a 96,2,unikátní sekvenční primery (224-27 a 224-28, obr.12A) byly vyrobeny a použity v následující amplifikaci a sekvenčních reakcích. DNA, obsahující 5'konec cDNA byla získána v PCR 90,3, 96,6 a 625,1 použitím jednostranně specifické PCR. Další DNA sekvence blízko C-konce SCF proteinu byla získána v PCR 90,4. DNA sekvence pro zbytek kódujícího regionu krysí SCF cDNA byla získána z PCR produktů 630,1, 630,2, 84,1 a 84,2, jak je popsáno dále v sekci C tohoto příkladu. Techniky použité při získávání krysí SCF cDNA jsou popsány dále.

RNA byla připravena z BRL buněk jak popisuje Okayama a spol. /Methods Enzymol., 154, 3-28 (1987)/. PolyA+ RNA byla izolována za použití oligo(dT)celulozové kolony jak popisuje Jacobson v /Methods in Enzymology, sv. 152, 254261 (1987)/.

První řetězec cDNA byl syntetizován použitím 1 yUg BRL poly+ RNA jako templátů a (dT).|2_-jg jako primerů v. souladu s protokolem doplněným enzymem, Mo-MLV reverzní transkriptázou (Bethesda Research Laboratories). Degradace řetězce RNA byla provedena použitím 0,14 M NaOH při 84 °C za 10 minut nebo inkubací ve vroucí vodní lázni 5 minut. Přebytek octanu amonného byl přidán pro neutralizaci roztoku a cDNA byla nejprve extrahována fenol/chl.o__roformém, pak extrahována chloroformem/iso-amylalkoholem a pak vysrážena ethanolem. ^ro umožnění použití oligo(dC)- primerů v PCR s jednostrannou specifitou, byl poly(dG) konec přidán na 3'konec části prvního řetězce cDNA terminální transferázou z telecího thymu (Boeringer Mannheim) jak bylo dříve popsáno /Deng a spol., Methods Enzymol., 100, 96103 (1983)/.

Jestliže není uvedeno v dalších popisech, které následují, je denaturační krok v každém PCR cyklu prováděn při °C 1 minutu a elongace byla při 72 °C 3 nebo 4 minuty. Teplota a trvání chlazení byla růná podle PCR, často představují kompromis vztažený na odhad potřeby několika rozdílných PCR provedených současně. Jestliže příměrové koncentrace byly sníženy pro snížení akumulace příměrových artefaktů /Watson, Amplifications, 2, 56 (1989)/, je indikovánadelší doba anelace, když byla koncentrace PCR produktu vysoká, byla použita kratší doba a vyšší koncentrace primerů pro zvýšení výtěžku. Významným faktorem v určení teploty anelace byl odhad primer-cílové místo asociace /Suggs a spol., v Developmental Biology Using Purified Genes, vyd.Brown D.

D. a Fox C.F.(Academie, New York), str. 683-693 (1981)/.

Enzymy použité v amplifikaci byly získány od jednoho ze tří výrobců: Straragene, Promega nebo Perkin-Elmer Cetus. Reaktanty byly použity podle dopog^ení· výrobce. Amplifikace byla provedena v zařízení pro/tepelné cykly Coy Tempcycle nebo Perkin-Elmer Cetus.

Amplifikace SCF cDNA fragmentů byla obvykle zkoušena elektroforezou na agarozovém gelu za přítomnosti ethidiumbromidu a vizualizace fluorescencí DNA proužků stimulované ultrafialovým zářením. V některých případech, kde byly malé fragmenty anticipovány, byly PCR produkty analyzovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Ověření toho,že pozorované proužky reprezentuji SCF cDNA fragmenty bylo získáno pozorováním·příslušných DNA proužků následujících amplifi-_x kacích s jedním nebo více vnitřně usazenými primery. Konečné ověření bylo uskutečněno dideoxysekvenováním /Sanger a spol., Proč.Nati.Acad.Sci.USA, 74, 5463-5467 (1977)/ PCR produktů a srovnání předpokládaných translačních produktů se sekvenční informací SCF peptidu.

V počátečních PCR experimentech byly použity smíšené oligonukleotidy založené na SCF proteinové sekvenci /Gould,

Proč.Nati.Acad.Sci.USA, 86, 4934-1938 (1989)/. Dále jsou popsány PCR amplifikace, které byly použity k získání DNA sek-

venční informace pro krysí cDNA kódující aminokyseliny -25 až 162.

V PCR 90,6, BRL cDNA byla amplifikována se 4 pmol 222-11 a 223-6 v reakčním objemu 20 /ul. Část produktu PCR

90,6 byla elektroforézovény na agarozovém gelu a proužky přibližně očekávané velikosti byly pozorovány. Jeden /^ul PCR 90,6 produktu byl amplifikován dále s 20 pmol primerů 222-11 a 223-6 v 50 /Ul v 15 cyklech, anelován při 45 °C. Část tohoto produktu byla pak podrobena 25 cyklům amplifikace za přítomnosti primerů 222-11 a 219-25 (PCR 96,2), poskytla pak proužek jednoho hlavního produktu péi elektroforéze na agarozovém gelu. Asymetrická amplifikace produktu PCR 96,2 se stejnými dvěma primery produkovala templáty, které byly pak úspěšně sekvenovány. Další selektivní amplifikace SCF sekvencí v produktu 96,2 byla provedena PCR amplifikací produktu za přítomnosti 222-11 a usazeného primeru 219-21. Produkt této PCR byl použit jako templát pro asymetrickou amplifikací a výrobu radioaktivně značených sond (PCR2).

K izolování 5* konce cDNA krysího SCF, byly primery, obsahující (dC)_n sekvence, komplementární k poly(dG) koncům cDNA, využity jako nespecifické primery. PCR 90,3 obsahuje: (dG)^ (10 pmol) a 223-6 (4 pmol) jako primery a BRL cDNA jako templát. Reakční produkty vytvářejí agregáty velmi vysoké molekulové hmotnosti, zůstávajících v jamkách při elektroforéze na agarozovém gelu. ^deden ^ul produkovaného roztoku byl dále amplifikován za přítomnosti 25 pmol (dC)^ a 10 pmol 223-6 v objemu 25 /Ul v 15 cyklech, anelován při 45 °C. Růl /Ul tohoto produktu bylo pak amplifikováno po 25 cyklů s vnitřně usazeným primerem 219-25 a 201-7 (PCR 96,6). Sekvence 201-7 je znázorněna na obr.12C.Pri elektroforéze na agarozovém gelu nebyly pozorovány žádné proužky. Bylo ft provedeno 25 jiných cyklů PCR při 40 °C, po kterých byl pozorován jeden prominentní proužek. Bylo provedeno vypijákovéní” podle Southerna a jeden výrazný hybridizováný proužek pak byl pozorován. Dalších 20 cyklů PCR (625,1), při 45 °C, bylo provedeno za použití 201-7 a usazeného· primerů 224-27· Sekvenování bylo provedeno po asymetrické amplifikaci prostřednictvím PCR, získaly se sekvence, které obsahovaly po domnělém aminokonci předpokládanou signální peptid kódující sekvenci pre-SCF. Tato sekvence je využita k označení oligonukleotidového primerů 227-29, obsahujícího 5* konec kódujícího regionu cDNA krysího SCF. Obdobně 3'DNA sekvence končící na aminokyselině 162 byla získána sekvénováním PCR 90,4 (viz obr.13*A).

B. Klonování genomové DNA krysího buněčného kmenového fak) toru

Sondy získané z PCR amplifikace cDNA, kódující krysí SCF, jak je popsáno výše v části A, byly použity k prohledání knihovny, obsahující krysí genomové sekvence (získané od CLONTECH Laboratories, lne., kablogové číslo RL1022 j). Knihovna byla konstruována v bakteriofágovém -λ vektoru EMBL-3 SP6/T7 užitím DNA získané.z dospělého samce krysy Sprague-Dawley. Knihovna, jak je charakterizována dodavatelem, obsahuje 2,3x10⁸ nezávislých klonů s průměrnou inzertní velikostí 16 kb.

PCR byla použita ke generování P-značených sond použitých ve screeningu genomové knihovny. Sondy PCRT, (obr.13A) byly připraveny v reakci, která obsahuje 16,7 /UM ^²P(alfa)dATP, 200 _zuM dCTP, 200 /UM dGTP, 200 /UM dTTP, reakční pufr doporučený Perkin Elmer Cetus, Taa polymerázu (Perkin Elmer Cetus) při 0,05 jednotek/ml, 0,5 /UM 219-26, 0,05 /UM 223-6 a 1 /Ul templátu 90.1, obsahujícím cílová místa pro dva primery. Sonda PCR 2 byla vytvořena použitím stej-

ných reakčních podmínek, pouze primery a templát byly změněny. Sonda PCR 2 byla vyrobena použitím 0,5 /UM 222-11,

0,05 /UM 219-21 a 1 /Ul templátu odvozeného z PCR 96,2«

Přibližně 10^ bakteriofágů bylo umístěno na plotnu jak, popisuje Maniatis a spol. /supra(1982)/. Plaky byly transferovány na GeneScreen Plus filtry (22 cm x 22 cm, NEN/DuPont),které byly denaturovány, neutralizovány a sušeny,jak je popsáno v protokolu od výrobce. 2 každé plotny byly provedeny dva přenosy na filtr.

Filtry byly prehybridizovány v IM NaCl, 1% SDS, 0,1% albuminu hovězího sera, 0,1% ficollu, 0,1% pólyvinylpyrrolidonu (hydridizační roztok) po dobu přibližně 16 h při 65 °C a skladovány při -20 °C.Filtry byly transferovány do čeršt, 32 veho hybridizačního roztoku, obsahujícího P-značenou PCR o

sondu v 1,2x10 cpm/ml a hybridizovány 14 h při 65 C. Filtry byly vymyty v 0,9 M NaCl, 0,09 M citrátu ,sodném,

0,1% SDS, pH 7,2 (promývací roztok) 2 hodiny při teplotě místnosti s následujícím druhým promytím čerstvým promývacím roztokem 30 minut při 65 °C. ^akteriofágové klony z oblastí ploten, odpovídající radioaktivním bodům, byly přemístěny z ploten a znovu prohledány sondami PCR 1 a PCR 2.

DNA z pozitivních klonů byla štěpena restrikčními endonukleázami BamHI, Sphl nebo Sstl a výsledné fragmenty byly subklonovány do pUC119 a následně sekvenovány. Strategie pro sekvenovéní krysí genomové SCF DNA je schematický znázorněna na obr.14A. Na tomto obrázku křivka nakreslená nahoře představuje oblast krysí genomové DNA kódující SCF. Mezery ve křivce indikují oblasti, které nejsou sekvenovány. Mezery ve křivce indikují oblasti, které nebyly sekvenovány. ^velké rámečky představují exony kódujícího regionu SCF genu s odpovídající kodovanou aminokyselinou uvedenou nad každým rámečkem. Šipky představují individuální oblasti,

které byly sekvenovány a použity k sestavení souhlasné sekvence pro krysí SCF gen. Sekvence pro krysí SCF gen je uvedena na obr. 14B.

-Použitím PCR 1 sondy ke screeningu krysí genomové knihovny byly izolovány klony, odpovídající exonům, kódujícím aminokyseliny 19 - 176 SCF. Aby se získaly klony pro další exony kódujícího regionu pro aminokyselinu 19, byla knihovna sceenována použitím oligonukleotidových sond 22830. Stejná sada filtrů, jaká byla použita dříve se sondou PCR 1, byla prehybridizována jako předtím a hybridizována v hybridizačním roztoku, obsahujícím P-značený oligonukleotid 228-30 (0,03 picomol/ml) při 80 °C po 16 hodin. Filtry byly promyty v promývacím reztoku při teplotě místnosti po dobu 30 minut a následovně byly znovu promyty v Čerstvém promývacím roztoku při 45 °C po dobu 15 minut. ^Bak teriofágové klony z oblastí ploten, odpovídající radioaktiv ním bodům na autoradiogramech byly přemístěny z ploten a znovu screenovány sondou 228-30. DNA z pozitivních klonů byla štěpena restrikčními endonukleázami a subklonována jak bylo popsáno. -Použitím sondy 228-30 byly získány klony,odpovídající exonům, kódujícím aminokyseliny -20 až 18.

Bylo provedeno několik pokusů izolovat klony, odpovídající exonu(ům), obsahujícímu· 5'-netranslatovaný region pro aminokyseliny -25 až-21. Nebyly izolovány žádné klony pro tento region krysího SCF genu.

v

C. Klonování krysí cDNA pro expresi v savčích buňkách ^Bavčí buněčné expresní systémy byly vymyšleny pro' zjištění toho, jsou-li aktivní polypeptidové produkty krysího SCF schopny být exprimovány* a secernovány savčími buň-5y- (y kami. Expresní systémy byly vymyšleny pro expresi zkrácených verzí krysího SCF (SCF^1-162 a SCF¹“¹⁶⁴) a proteinu (SCF^{1 193}), předpovězených z translace genové sekvence na obr. 14C.

Upřesní vektor užitý v těchto studiích byl shuttle vektor, obsahující pUC119, SV40 a HTLVI sekvence. Vektor byl označen pro umožnění autonomní replikace jak v E.coli tak v savčích buňkách a k expresi vložené exogenní DNA pod kontrolou virových DNA sekvencí. Tento vektor, označený V19.8 v E.coli DH5 je uložen v American •'ype Culture Collec tion, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. (ATCC č.68124). Tento vektor je derivátem pSVDMI9 popsaného v Souzově US patentu č. 4810643, který je zde uveden jako odkaz.

cDNA pro krysí SCF byla vložena do plasmidového vektoru V19.8. cDNA sekvence je uvedena na obr. 14C. cDNA, která byla použita v této konstrukci byla syntetižována v PCR reakcích 630^1 a 630|r2, jak ukazuje obr.13A. Tyto PCR představují nezávislé amplifikace a využívají syntetických oligonukleotidových primerů 227-29 a 227-30. Sekvence pro tyto primery byla získány z PCR generované cDNA, jak je popsáno v sekci A tohoto příkladu. Reakční směs, 50 /^ul objem, obsahuje 1x reakční pufr (z Perkin Elmer Cetus kitu), 250 yuM dATP, 250 yUM dCTP, 250 /UM dGTP a 250 /UM dTTP,

200 ng oligo(dT)-primované cDNA, 1 picomol 227-29, 1 piconol 227-30 a 2,5 jednotky Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus). cDNA byla amplifikována v 10 cyklech za použití denaturační teploty 94 °C po 1 minutu a 2 minutovém chlazení na teplotu 37 °C a elongační teploty 72 °C po 1 minutu. Po těchto prvních kolech PCR amplifikace bylo přidáno 10 picomol 227-29 a 10 picomol 227-30? Amplifikace pokračovaly 30 cykly za stejných podmínek s výjimkou toho, že teplota chlazení byla změněna na 55 °C. Produkty PCR byly štěpeny restrikčními endonukleázami ffindlll a SstlI. V19.8 byl shodně

-60,- ér ^indlll a SstlI a v jedmom případě byl štěpený plasmidový vektor podroben působení telecí intestinální alkalické fosfatázy, v jiném případě byl dlouhý fragment ze štěpení izolován z agarového gelu. cDNA byla ligována do VI9.8 použitím T4 polynukleotidové ligázy. B_rodukty ligace byly transformovány do kompetentního E.coli kmenu DH5 jak bylo popsáno /Okayama a spol., supra(1987)/. DNA připravená z jednotlivých bakteriálních klonů byla sekvenována Sangerovou dideoxymetodou. Obr.17 představuje konstrukci V19.8 SCF. Tyto plasmidy byly využity k transfekci savčích buněk, jak je popsáno v příkladu 4 a příkladu 5.

Expresní vektor pró krysí SCF¹”¹64 byl konstruován

1 fi?

použitím strategie podobné té, která byla užita pro SCF Ve které cDNA byla syntetizována použitím PCR amplifikace a následně vložena do V19.8. cDNA použitá v konstrukcích byla syntetizována v PCR amplifikacích s V19.8, obsahujícím SCF¹ ”¹⁶²cDNA (V19.8:SCF¹”¹⁶²) jako templátem, 227-29 jako primerem'pro 5 '-konec genu a 237-19 jako primerem pro 3'-konec genu. reakce (50 /ul), obsahující 1x reakční pufr, 250 /uM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 2,5 jednotek Taq polymerázy, 20 ng V19.8:SCF¹”¹^² a 20 picomol každého primerů. cDNA byla amplifikována 35 cyklů použitím denaturační teploty 94 °C 1 minutu, teplotě chlazení 55 °O po 2 minuty a elongační teplotě 72 °C po 2 minuty. Produkty amplifikaci bylý štěpeny restrikčními endonukleázami HindlII a SstlI a inzertovány do V19.8. Výsledný vektor obsahuje kódující oblast pro aminokyseliny -25 až 164 SCF následovanou terminačním kodonem.

cDNA pro 193 aminokyselinami tvořený krysí SCF (krysí 1-193

SCF je předpovězen z translace DNA sekvence na obr.

14C) byla také vložena do plasmidového vektoru V19.8 použii 1 fi?

tím postupu shodného s postupem použitým pro krysí SCF— cDNA, která byla použita v této konstrukci byla syntetizována v PCR reakcích 84.1 a 84.2 (obr.13A) využitím oligonuk-⁶'Ζ (ά leotidů 227-29 a 230-25. Dvě reakce představují nezávislé amplifikace, začínající z rozdílných RNA preparátů. Sekvence 227-29 byla získána cestou PCR reakcí jak je popsáno v sekci A tohoto příkladu a sekvence pro primer 230-25 byla získána z krysí genomové DNA (obr.14B). Neakční směs, 50 ^ul objem, obsahovala 1x reakční pufr (z kitu Perkin Elmer Cetus), 250 /UM dATP, 250 /UM dCTP, 250 /UiM dGTP a 250 /UM dTTP, 200 mg oligo(dT)-primovaná cDNA, 10 pikomol 227-29, pikomol 230-25 a 2,5 jednotek í'aq polymerázy (jperkin , Elmer Cetus). cDNA byla amplifikována v 5 cyklech za použití denaturační teploty 94 °C po 1 1/2 minuty, teplotě chlazení 50 °C po 2 min a teplotě elongace 72 °C po 2 min. Po těchto počátečních cyklech pokračovala amplifikace za stejných podmínek s tou výjimkou, že teplota chlazení byla změněna na 60 °C. Produkty PCR amplifikace byly štěpeny restrikčními endonukleázami Hindlil a SstlI. V19.8 DNA byla štěpena Hindlil a SStlI a dlouhé fragmenty ze štěpení byly izolovány z agarozového gelu. cDNA byla ligovéna do V19.8 použitím polynukleotidové ligézy. ^rodukty ligace byly transformovány do kompetitivního E.coli kmenu DH5 a DNA připravená z jednotlivých bakteriálních klonů byla sekvenována. Tyto plasmidy byly použity k transfekci savčích buněk v příkladu 4.

D. Amplifikace a sekvenování PCR produktů lidské SCF cDNA

Lidská SCF cDNA byla získána z hepatomální buněčné linie HepG2 (ATCC HB 8065) za použití PCR amplifikace jak je znázorněno na obr. 13B. Základní strategie byla amplifikovat lidskou cDNA PCR s primery, jejichž sekvence byly získány z krysí SCF cDNA.

RNA byla připravena jak popisuje Maniatis a spol.(supra (1982)/. -ťolyA+ RNA byla připravena použitím oligo dT celulózy podle návodu výrobce (Collaborative Research Inc.).

První řetězec cDNA byl připraven jak je popsáno výše pro BRL cDNA s tou výjimkou, že syntéza byla začata 2 /UM oligonukleotidu 228-28, uvedeného na obr.12C, který obsahoval krátkou nahodilou sekvenci na 3'konci připojenou k delší unikátní sekvenci. Unikátní sekvence z 228-28 poskytuje cílové místo pro amplifikaci PCR s primerem 228-29 jako nespecifickým primerem. Lidská cDNA sekvence příbuzná alespoň části krysí SCF sekvence byla amplifikovéna z Hep62 cDNA PCR použitím primerů 227-29 a 228-29 (PCR 22,7, viz obr. 13B, 15 cykl chlazení při 60 °C následovaných 15 cykly ohrazení při 55 °C). Elektroforéza na agarozovém gelu ukázala nezřetelné proužky, pouze skvrny patrně heterogenní DNA. .j Další preferovaná amplifikace sekvencí týkajících se krysí SCF cDNA byla zkoušena provedením PCR s 1 yul produktu PCR

22.7 použitím vnitřně usazeného krysího SCF primerů 222-11 a primerů 228-29 ( PCR 24.3, 20 cyklů chlazení při 55 °C). ^novu byly pozorovány pouze heterogenní skvrny DNA produktů na agarozových gelech. Dvojstranná specifická amplifikace produktu PCR 24-3 s primery 222-11 a 227-30 (PCR 25.10, 10 cyklů) dalo vzniknout jednomu proužku majoritního produktu stejné velikosti jako odpovídající krysí SCF cDNA PCR produkt. Sekvenování asymetrického PCR produktu (PCR 33.1) DNA použitím 224-24 jako sekvenčního primerů, poskytlo okolo , bází lidských SCF sekvencí.

Podobně', amplifikace 1 /ul PCR 22.7 produktu, nejprve s primery 224-25 a 228-29 (PCR 24,7, 20 cyklů), pak s primery 224-25 a 227-30 (PCR 41.11) vyvolala jeden majoritní ' proužek té samé velikosti jako odpovídající krysí SCF produkt a po asymetrické amplifikaci (PCR 42.3) poskytla sekvenci, která byla vysoce homologní ke &*ysí SCF, jestliže byl

224-24 použit jako sekvenční primer. Unikátní sekvence oligo nukleotidů cílených pro lidskou SCF cDNA byly syntetizovány a jejich sekvence je uvedena na obr. 12B.

K získání lidského protějšku krysíK SCF PCR generované kódující sekvence, která byla použita ve studiu exprese a aktivity byla provedena PCR s primery 227-25 a 227-30 v 1 /Ul PCR 22.7 produktu v reakčním objemu 50 /ul (PCR 39.1). Amplifikace byla provedena v zařízení Coy-Tempcycler. Protože stupeň odlišnosti mezi lidskou SCF cDNA a krysím SCF unikátním primerem 227-30 byl neznámý, byla pro první tři cykly použita výrazného chlazení (37 °C),později bylo chlazeno na 50 °C. Prominetní proužek stejné velikosti (okolo 590 bp) jako krysí homolog se objevil a byl dále amplifikován zředěním malé dávky produktu PCR 39.1 a PCR se stejnými primery (PCR 41.1) Protože byl pozorován více než jeden proužek v produktech PCR 41.1, byla provedena další PCR s vnitřně usazenými primery, aby se determinovala alespoň část jeho sekvence před klonováním. Po 23 cyklech PCR s primery 231-27 a 227-29 (PCR 51.2), byl patrný samostatný intenzivní proužek. Asymetrická PCR s primery 227-29 a 231-27 a' sekvenovéní potvrdily přítomnost lidské SCF cDNA sekvence. Klonování PCR 41.1 SCF DNA do expresního vektoru V19.8 bylo provedeno tak, jak už bylo popsáno pro krysí SCF 1-162 PCR fragmenty v sekci C. DNA z jednotlivých bakteriálních klonů byla sekvenována Sangerovou dideoxymetodou.

E.Klonování genomové DNA lidských faktorů kmenových buněk.

PCR7 sonda získaná z PCR amplifikace cDNA, viz.obr.13B, bylo použita ke svreeningu knihovny, obsahující lidské genomové sekvence. Ribosonda komplementární k části lidské SCF cDNA, viz výše, byla použita k rescreeningu pozitivních plaků. PCR7 sonda byla připravena s produktem PCR41 jako výchozím materiálem (viz.obr.13B). Produkt PCR 4T.1 byl déle amplifikován s primery 227-29 a 227-30. Výsledný 590 bp fragment byl eluován z agarozového gelu a reamplifikován se stej

nými primery (PCR 58.1). Produkty PCR 58.1 byly zředěny lOOOx 50 /ul reakční směsi, obsahující 10 pmol 233-13 a amplifikovéný v 10 cyklech. Po přidání 10 pmol·227-30 k reakč ní směsi se PCR provádí ve 20 cyklech. -Přidá se dalších 80 pmol 233—13 a reakční objem se zvýší na 90 /ul a PCR pokračuje v dalších 15 cyklech. ^Reakční produkty byly zředěny 200krát> v 50 ^ul reakční směsi, bylo přidáno 20 pmol 231 — 27 a 20 pmol 233-13 a PCR byla provedena ve 35 cyklech za použití teploty chlazení 48 °C v reakci 96.1. Pro přípra32 ' vu P-značené PCR7 byly použity stejné reakční podmínky jako byly použity pro výrobu PCR1 s následujícími rozdíly: v reakčním objemu 50 yul, PCR 96.1 byla zředěna 100krát, bylo použito 5 pmol 331-27 jako prostý primer a 45 cyklů PCR bylo provedeno s denaturací při 94 °C po 1 minutu, chlazení 48 °C po 2 minuty a elongaci při 72 °C po 2 minuty.

Ribósonda, ribosonda 1, byla ^J P-značená jednořetézcová RNA komplementární k nukleotidům 2-436 hSCF DNA sekvence uvedené na obr. 15B. Ke konstrukci vektoru pro produkci této sondy byl PCŘ 41.1 (obr.13B) produkt DNA štěpen HindlII a EcoRI a klonován do polylinkeru plasmidového vektoru pGEM3:hSCF (Promega Madison, Wisconsin). Rekombinantní pGEM3:hSCF plasmidová DNA byla pak linearizována štěpěním HindlII. P-značená ribosonda 1 byla připravena z linearizovanéjríjé plasmidové DNA runoff transkripcí s T7 RNA polymerázou v souladu s instrukcemi poskytovanými Promegou. Reakční směs (3 /Ul) obsahovala 250 ng linearizované plasmidové DNA a 20 /UM ³²P-rCTP (katalog.č.NEG-008H, New England Nuclear (NEN) se žádnou další neznačenou CTP.

Lidská genomová knihovna byla získána ze Stratagene (La Jolla, CA, katalog.č.:946203). knihovna byla konstruována ve Fix II vektoru bakteriofégu Lambda použitím DNA připravené z bělošské samčí placenty. Knihovna jak je cha£ rakterizována dodavatelem, obsahovala 2.10 primárních pla^:h ků s průměrnou velikostí inzertů větší než 15 kb. Přibližně 10° bakteriofágů bylo umístěno na plotnu jak uvádí Maniatis a spol.(výše (1982)). Plaky byly transferovány do Gene Bcreen Plus^¹ filtrů (22 cm², NEN/DuPont) podle protokolu výrobce, ^rro každou plotnu byly provedeny dva transfery na filtr.

Filtry byly prehybridizovány v 6XSSC (0,9 M NaCl, 0,09

M citrát sodný pH 7,5), 1% SDS při 60 °C. Filtry byly h^arb. 32 ndizovany v čerstvém 6XSSC, 1% SDS roztoku obsahujícím P5 značenou PCR 7 sondu při 2x10 cpm/ml a hybridizovány po 20 h při 62 °C. Filtry byly promyty v 6XSSC, 1 % SDS po 16 h při 62 °C. Bakteriofágové výřezy byly přemístěny z plochy plotny odpovídající radioaktivním bodům na autoradiogramech a rescreenovány sondou PCR 7 a ribosondou 1. Rescreening sondou PCR 7 byl proveden za podmínek shodných s podmínkami při počátečním screeningu. Rescreening ribosondou 1 byl proveden následovně: filtry byly prehybridizovány v 6XSSC, % SDS a hybridizovány při 62 °C po 18 h v'0,25 M NaPO^, (pH 7,5), 0,25 M NaCl, 0,001 M EDTA, 15 % formamid, 7 %

SDS a ribosonda při 1X10⁶ cpm/ml, Filtry byly promývény v 6XSSC, 1 % SDS po 30 min při 62 °C a dále 1XSSC, 1 % SDS po 30 min při 62 °C. DNA z pozitivních klonů byla štěpena restrikčními endonukleázami Sam Hl, Sphl nebo Sstl a výsledné fragmenty byly subklonovény.do pUC119 a potom sekvenovány.

Soužitím.sondy PCR 7 byly získány klony, obsahující e exony kódující aminokyseliny 40-176 a tyto klony jsou uloženy v ATCC (depon.č. 40681). K získání klonů pro další SCF exony byla lidské genomové knihovna sceeenována ribosondou 2 a oligonukleotidovou sondou 235-29..Knihovna byla screenována do určité míry stejně jako předchozí s následujícími výjimkami: hybridizace sondou 235-29 byla provedena při 37 °C a promývání pro tuto hybridizací bylo 1 hodinu při 37 °C a 1 h při 44 °C. Pozitivní klony byly rescreenovány ribosondou 2, ribosondou 3 a oligonukleotidovými sondami • ' ) ~⁶Υ γ

235-29 a 236-31 . Ribosondy 2 a 3 byly vyrobeny podle stejného postupu, který byl použit k výrobě ribosondy 1 , s násle dujícími výjimkami: a) rekombinantní pGEM3:hSCF plasmidová DNA byla linearizována restrikční endonukleázou PVtflI (ribosonda 2) nebo Pstl (ribosonda 3) a b) k syntéze ribosondy 3 byla použita SP6 RNA polymeréza (Promega).

Obrázek 1 5A představuje strategii použitou k sekvenování lidské genomové DNA. Na tomto obrázku křivka nahoře představuje oblast lidské genomové DNA kódující SCF. Mezery ve křivce indikují oblasti, které nebyly sekvenovány. Velké rámečky představují exony, kódující oblast SCF genu s odpovídajícími kódovanými aminokyselinami uvedenými nad každým ráměčkem. Sekvence lidského SCF genu je uvedena na obr. 15B. Sekvence lidské SCF cDNA získané PCR technikou je uvedena na obr. 15C.

B. Sekvence lidské SCF cDNA 5'oblasti

Sekvenování produktů PCR primovaných dvěma genově specifickými primery, odhalilo sekvenci oblasti ohraničené 3'koncem dvou primerů. Jednostranná PCR, jak ukazuje příklad 3A, může přinést sekvenci sousedních oblastí. Jednostranné PCR bylo použito k poskytnutí sekvence 5'-nétranslatovatelné oblasti lidské SCF cDNA.

Rrvní řetězec cDNA byl připraven z polyA+, RNA z lidské buněčné linie karcinomu měchýře 5637 (ATCC HTB 9) za použití. oligonukleotidů 228-28 (obr.12C) jako primerů, jak popisuje příklad 3D. Konec této cDNA s dG zbytky s následující jednostrannou PCR amplifikací používajících primerů, obsahujících (dC) sekvence v kombinaci se SCF-specifickými primery, neposkytl cDNA fragmenty, poskytující ve směru (5') známé sekvence.

Malé množství sekvenční informace bylo získáno z PCR amplifikace produktů syntézy druhého řetězce primovaného oligonukleotidem 228-28. Nepřipevněný 5637 první řetězec cDNA popsaný výše (okolo 50 ng) .a 2 pmol 228-28 byly inkubovány s Klenow polymerázou a 0,6 mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP při 10 až 12 °C po 30 minut v 10 /Ul IxNick-translačního pufru /Maniatis a spol., Molecular Cloníng, a Bqboratory ManuXal, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)/. Amplifikace výsledné cDNA sekvenčními jednostrannými PCR s primereiji 228-29 v kombinaci s usazenými SCF primery (v poradí použití: 235-30, 233-14, 236-31 a konečně 235-29) přinesly komplexní směs produktů, které se jevily jako skvrny na agarozovém gelu. Významné zvýšení SCF cDNA fragmentů bylo indikováno zvýšením intenzity proužku, specifického produktu pozorovaného, když srovnatelné objemy úspěšných produktů jednomístné PCR byly amplifikovóny se dvěma SCF primery (227-29 a 235-29, např. poskytlo produkty o 150 bp). Pokusy selektovat výhodná rozmezí velikosti produktů rozštěpením skvrn na agarozovém gelu a reamplifikací PCR ve většině případů neposkytlo dobře definované proužky, obsahující sekvence, týkající se SCF.

Jedna reakce, PCR 16.17, která obsahovala pouze 235-29 primer, poskytla proužek, který patrně vznikl z primování 235-29 v neznámém místě 5'kódující oblasti vedle očekávaného místa, jak ukazuje mapování restrikčními enzymy PvuII a Pstl a PCR analýzy s usazenými' primery. ‘‘‘yto produkty byly gelově čištěny a reamplifikovány s primery 235-29 a sekvenování bylo zkoušeno Sangerovou dideoxymetodou za použití 3 2

P značeného primeru 228-30. Výsledná sekvence baží pro označení oligonukleotidu 254-9 (pbr.12B). Když tento 3* řízený primer byl použit v následujících PCR v kombinaci s 5* řízenými SCF primery, byly získány proužky očekávané velikosti. Přímé sekvenování dle Sangera takových PCR produktů poskytlo nukleotidy 180 až 204 lidské SCF cDNA sekvence, obr. 150.

^a účelem získání více sekvenci na 5*konci hSCF cDNA, byl první řetězec cDNA připraven ze 5637 polyA+ RNA (asi 300 /Ug), použitím SCF specifického primerů (2 pmol 23314) v 16 /Ul reakční směsi, obsahující 0,2 j.*MMLV reverzní transkriptázy (získané z BRL) a 500 /UM každé dNTP. Po standardní fenol-chloroformové a chloroformové extrakci a srážení ethanolem (z 1 M octanu amonného), byly nukleové kyseliny resuspendovány ve 20 /Ul vody, umístěny do vařící vodní lázně na 5 minut, pak chlazeny koncem terminální transferázou za přítomnosti 8 /UM dATP v pofru obsahujícím CoClg /Deng a Wu, Methods in Enzymology, 1Ó0, str. 96-103/. -^rodukt, (dA)_n-koncem opatřený první řetězec cDNA byl čištěn extrakcí fenol-chloroformem a srážen ethanolem a resuspendovén ve 20 /ul 10 mM tris, pH 8,0 a 1 mM EDTA..

Obohacení a.amplifikace lidského SCF týkající se 5* koncových fragmentů cDNA z asi 20 /Ug (dA)_n-koncem opatřené 5637 cDNA bylo provedeno následovně: počátečních 26 cyklů jednostranné PGR bylo provedeno za přítomnosti SCF specifického primerů 236-31 a primerů nébo směsi primerů, obsahující (ůT)_n sekvence u nebo blízké 3*konci, například primer 221-12 nebo směs primerů 220-3, 220-4 a 220-11 (obř. 12C). Produkty (1 /Ul) těchto PCR byly pak amplifikovány ve druhé sadě PCR, obsahujícími primery 221-12 a 235-29. Proužek hlavního produktu přibližně 370' bP byl pozorován v každém případě analýza na agarozovém gelu. ^elový výřez, ob sáhující část tohoto proužku, byl vypíchnut z gelu špičkou Pasteurovy pipety a přemístěn do suché mikrofugové zkumavky Bylo přidáno 1Ó /Ul vody a výřez byl roztaven při 84 °C v tavném bloku. PCR, obsahující primery 221-12 a 235-29 (8 pmol oba) ve 40 /Ul bylo naočkováno 2 yul roztaveného, zředěného gelového výřezu. Po 15 cyklech byl viditelný nepatrný difuzní proužek přibližně 370 bp při analýze na agarozovém gelu. Gelové výřezy, obsahující části tohoto proužku

-69;

byly vyjmuty z gelu špičkou Pasterovy pipety a přemístěny do malé mikrofugové trubice. 10 /Ul vody bylo přidáno a výřez byl roztaven při 84 °C v topném bloku. PCR, obsahující primery 221-12 a 235-29 (8 pmol každý) ve 40 /Ul byl naočkován 2 /ul roztaveného, zředěného gelového výřezu. Po 15 cyklech byl pozorován nepatrný difuzní proužek přibližně 370 bp při analýze na agarózovém gelu. Asymetrické PCR byly provedeny, aby se generoval horní a dolní konec řetězce sekvenovaných templátů: pro-každou reakci 4 /ul PCR reakčního produktu a 40 pmol buá primeru 221-12 nebp primeru 235-29 v celkovém reakčním objemu 10 /Ul bylo podrobeno 25 cyklům PCR (1 minuta, 95 °C, 30 sekund, 55 °C, 40 sekund, 72 °C). Přímé sekvenování 221-12 směsi primovaných PCR produktů (po standardní extrakci a ethanolovém 32 srážení) se P-značeným primerem 262-13 (obr.12B) poskytlo 5* sekvenci nukleotidů 1-179 (obr.15C).

6. Amplifikace a sekvenování lidské genomové DNA v místě prvního kódujícího exonu faktoru kmenových buněk

Screening lidské genomové knihovny SCF oligonukleotidovými sondami neodhalil žádné klony, obsahující známou část prvního kódujícího exonu. Pokus byl pak iniciován použitím jednostranné PCR techniky k amplifikaci a klonování genomových sekvencí, obklopujících tento exon.

Prodloužení primerem teplem denaturované lidské placentami DNA (získané od Sigma ) bylo provedeno DÍjA polymerázou (Klenow enzym, dlouhý fragment, Boehringer Mannheim) za použití ne-SCF primeru jako je 228-28 nebo 221-11 za nenáročných (nízká teplota) podmínek, jako je 12 °C, pro usnadnění primingu na velkém množství různých míst. Každá

- reakční směs byla pak zředěna 5x do Taql DNA polymerézového pufru, obsahujícího Taql polymerázu a 100 /UM každého z dNTP a elongace DNA řetězců byla prováděna při 72 C po 10 minut, ^rrodukt byl pak obohacen první exonovou sekvencí pro faktor kmenových buněk pomocí PCR za přítomnosti SCF prvního exonového oligonukleotidu (jako je 254-9) a vhodného ne-SCF primeru (228-29 nebo 221-11). Elektroforéza na agarosovém gelu odhalila, že většina produktů byla krátkých (menších než 300 bp). K obohacení delších druhů byla část každého agarosového gelového proužku odpovídajícího délce větší než 300 bp vyříznuta a elektroforeticky eluována. ^xo ethanolovém srážení a znovu rozpuštění ve vodě byla gelově přečištěné PCR produkty klonovány do derivátů pGEM|,obsahujících Sfil místó^^fíindlll až Sfil\ fragment.

~i O

Kolonie byly screenovány ^J P značeným prvním exonovým oligonukleotidem SCF. Bylo identifikováno několik pozitivních kolonií a sekvence inzertů byly získány Sangerovou metodou. Výsledná sekvence, která je v protisměru k prvnímu exonu přes dohodnutou hranici exon-intron, do nejbližšího intronu, je uvedená na obr«15B.

H. Amplifikace a sekvenování SCF cDNA kódující oblasti z myši, opice a psa.

První řetězec cDNA byl připraven z celkové RNA nebo polyA+ RNA z opičích jater (získaných od Clontech) a z buněčných linií NIH-3T3 (myš, ATCC CRL 1Ó58) a D17 (pes, ATCC CCL 183). Primer použitý v syntéze prvního řetězce cDNA byl buá nespecifický primer 228-28 nebo SCF primer (227-30, 237-19, 237-20, 230-25 nebo 241-6). PCR amplifikace s primerem 227-29 a jedním z primerů 227-30, 237-19 aebo 237-20 poskytla fragment očekávané velikosti, který byl sekvenován buá hned nebo po klonování do V19.8 nebo pGEM vektoru. '

Další sekvence blízké 5' konci SCF cDNA byly získány

PCR amplifikacemi za využití SCF-specifických primerů v komv binaci buď 254-9 nebo 128-29. -^alší sekvence na 3 * konci SCF kódující#/ oblasti byly získány po PCR amplifikaci cDNA primované 230-25 (v tomto případě myší) nebo cDNA primované 241-6 (v tomto případě opičí) s buď 230-25 nebo 241-6 jak je to vhodné a 3' řízeným SCF primerem. Žádné proužky SCF PCR produktu nebyly získány ve stejných pokusech amplifikovat D17 cDNA. Nespecifický primer 228-28 byl použit k primování syntézy prvního řetězce z D17 celkové RNA a výsled ná komplexní směs produktu byla obohacena SCF se týkajícími sekvencemi pomocí PCR se 3' řízenými SCF primery, jako je 227-29 nebo 225-31 v kombinaci s 228-29. Směs produktu byla štěpena Sfil a klonována do derivátů pGEM4 (Promega, Madison, Wisconsin), obsahujících Sfil místo jako je fragment od Sfil místa štěpení do tupého konce fragmentu. Výsledná heterogenní knihovna byla screenována radioaktivně značeným 237-20 a několik pozitivních klonů bylo sekvenováno a přineslo sekvenci 3' konce psího SCF. Seřazené aminokyselinové sekvence lidského (obr.42), opičího, psíh_o, myšího a krysího SCF zralého proteinu je zobrazena na obr.16 í / v * É

Známá SCF aminokyselinové sekvence jsou vysoce homologní vě většině jejich délky. Identické souhlasné sekven?ce signálního peptidu jsou přítomny v kódující oblasti všch pěti druhů® Aminokyselina očekávaná na aminokonci zralé ho proteinu podle analogie s krysím SCF je označena na tomto obrázku číslem 1 . Psí cDNA sekvence obsahuje nejasnost,· která se projevuje dvojznačností valin/leucin v aminokyselinové sekvenci v kodonu 12a. Lidská, opičí, krysí a myší aminokyselinová sekvence koaligují bez inzercí a delecí.

Psí sekvence má jeden zvláštní zbytek v poloze 120 ve srovnání s jinými druhy. Lidský a opičí se liší pouze v jedné pozici konzervativním nahrazením valinu (lidský) alani nem (opičí) v poloze 130. Předpokládaná SCF sekvence bezprostředně před a po domnělém zpracování místa blízko zbytku 164 je vysoce mezi druhy konzervována.

I

Příklad 4

Exprese rekombinantního SCF v COS-1 buňkách

Pro transientní expresi v COS-1 buňkách (ATCC CRL 1650) byl transfektován vektor V19.8 (příklad 3C), obsahující krysí SCF¹”¹62 _a SCF¹“¹^ geny duplicitně na 60mm plotny /Wigler a spol., Cell, 14, 725-731 (1978)/. Plasmid VI9.8 SCF je uveden na obr. 17. Vektor bez inzertu byl také transfektován pro kontrolu. Tkáňová kultura supernatantů byla odebrána v různém čase po transfekci a byla zkoušena její biologická aktivita. Tabulka 4 sumarizuje výsledky HPP-CFC biozkoušky a tabulka 5 sumarizuje MC/9 „ ³H-thymidinem získaná data z typického transfekčního experimentu. Výsledky biozkoušky supernatantů z COS-1 buněk transfektovaných následujícími plasmidy, jsou uvedeny v tabulce 4 a 5: C-koncový okleštěný tvar krysího SCF s

C-koncem v aminokyselinové poloze 162 (V19.8 krysí SCF¹”¹62) 1 “ 16 2

SCF obsahující kyselinu glutamovou v poloze 81 /V19.8 krysí SCF^{1 162} (Glu81)/ aSCF^{1 162}, obsahující alanin v poloze 16,/V19.8 krysí SCF¹”¹^² (Ala19)/. Aminokyselinové substituce byly produktem PCR reakcí provedených — 1 fiP v amplifikaci krysího SCF , jak ukazuje příklad 3.

— 1 fi P

Jednotlivé klony V19.8 krysího SCF byly sekvenovány a u dvou klonů byla nalezena aminokyselinová substituce. ^uak je zřejmé z tabulek 4 a 5, je rekombinantní krysí SCF aktivní v biozkouškách použitých k čištění přírodního savčího SCF v příkladu 1.

-73- Ή

Tabulka 4

HPP-CFC zkouška COS-t supernatantů z buněk transfektovaných krysí SCF DNA

Vzorek objem ______ zkoušeného CM (,/ul)

V19.8 (bez inzertu) 100 %

V19.8 krysí SCF^{1 162} 100

25 1 2

VI9.8 krysí SCF^1-162 100 (Glu81) 50

12

VI9.8 krysí SCF^1-162 100 (Ala19) 50 ¹² kolonie

ě./200000 buněk > 50 >50 >50 >50

1 0 .

o

Tabulka 5 3

MC/9 H-thymidinová absorpce v COS-1 supernatantech z buněk transfektovaných krysí SCF DNA

Vzorek objem zkoušeného cpm ___________kultiv.media Qul)_____ v19.8(bez inzertu) 25 1,936

2,252

2,182

1,682 v19.8 SCF^{1 162} 25 11,648

11,322

11,482

9,638

V19.8 SCF^1_162(Glu81) 25 ¹ 6,220 ' 5,384

3,692

1,980 v19.8 SCF¹”^l62(Ala19) 25 8,396

6,646 . 6 4,566

3,182

Rekombinantní krysí SCF a jiné faktory byly testovány jednotlivě v lidské CFU-GM /Broxmeyer a spol., supra (1977)/ zkoušce, která měří proliferaci buněk normální kostní dřeně a data jsou kázána v tabulce 6. Výsledky pro COS-1 —Ί 62 supernatanty z kultur 4 dny po transfekci V19.8 SCF v kombinaci s jinými faktory, jsou také uvedeny v tabulce 6. Množství kolonií je průměrný počet ze tří kultur.

aktivitu na normální lidskou kostní dřeň v CFU-GM zkoušce.

V experimentu v tabulce 5 byl SC-E synergistou 1 lidskému GM-CSF, lidskému IL-3 a lidskému CSF-1. V další zkoušce byl také pozorován synergismus s G-CSF. Byla pozorována určité proliferace lidské kostní dřeně po 14 dnech s krysím SCF; skupiny buněk se skládaly z <.40 buněk. Stejné výsledky byly získány v přírodním savčím SCF.

Tabulka 6 Lidská CFU-GM zkouška COS-1 supernatantů z buněk transfektovaných krysí SCF DNA

Vzorek kolonie č./100000 buněk (+SEM) salinický , ' . 0

GM-SCF 7 + 1

G-CSF 24+1

IL-3'

CSF-1

GM-CSF + SCF^{1 162} G-CSF + SCF^1-162 IL-3 + SCF^1-162 CSF-1 + SCF^{1 162}

29+6 20 + 1 11 + 1

4+0

Příklad 5

Ěxprese rekombinantního SCF v buňkách ovarya čínského křečka 'Tento příklad se týká stálých savčích expresních systémů pro sekreci SCF z CHO buněk (ATCC CCL 61 selektovaných DHFR-).

A. Rekombinantní krysí SCF

Expresní vektor použitý pro produkci SCF byl V19.8 (obr.17). Selektující markér použitý pro zjištění stálých transformantů byl gen pro dihydrofolát reduktézu v plasmidu pDSVE.1. Plasmid pDSVE.1 (obr.18) je derivátem pDSVE konstruovaným štěpením pDSVE restrikčním enzymem Sall a ligaci k oligonukleotidovému fragmentu, obsahujícímu dva oligonukleotidy

5'TCGAC CCGGA TCCCC 3'

3' G GGCCT AGGGG AGCT /.

Vektor pDSVE je popsán v US přihláškách č. 025344 a 152045, uvedených zde jako odkaz. Část vektoru V19.8 a pDSVE.1 obsahuje dlouhé úseky, které jsou homologní, zahrnujíc v to bakteriální ColEl původ replikace a gen pro ampicilinovou rezistenci a SV40 původ replikace. Tyto přesahující úseky mohou přispět k homologní rekombinaci během transformačního procesu, takto usnadňují ko-transformaci.

Byly připraveny kalciumfosfátové ko-sraženiny V19.8 SCF konstruktů a pDSVE.1 za přítomnosti nebo nepřítomnosti 10 /Ug přenašečové myší DNA použitím 1,0 nebo 0,1 ^ug pDSVE.1, který byl linearizovén restrikční endonukleázou Pvul a 10 yug V19.8 SCF jak popisuje /Wigler a spol., supra (1978)/. Kolonie byly selektovány vzhledem k expresi

DHFR genu z pDSVE.1. Kolonie schopné růstu bez přídavku hypoxanthinu a thymidinu byly vybrány použitím klonovacích válců a rozšiřovány jako nezávislé buněčné linie. Buněčné supernatanty z jednotlivých buněčných linií byly testovány v MC/9 ^H-thymidinové absorpční zkoušce. Výsledky z charak teristického experimentu jsou uvedeny v tabulce 7.

Tabulka 7

Zkouška absorpce ^H-thymidinu ze stabilních CHO buněk

Transfektovaná DNA

V 19.8 SCF¹-^2 žádná

objem zkoušeného kondiciovaného media	cpm
25	22,926
1 2	34,973
6	30,657
. 3	14,714
1,5	7,160
25	694
1 2	1,082
6	880
3	672
1	1,354

B. Rekombinantní lidský SCF ^xprese SCF v CHO buňkách byla také dosažena použitím expresního vektoru pDSVR w. 2, který je popsán v US přihlášce č. 501904 podané 29.3.1990, která je zde uvedena ja ko odkaz. Tento vektor obsahuje gen pro selekci a amplifikaci klonů založených na expresi DHFR genu. Klon pDSRtf 2 SCF byl získán dvoustupňovým způsobem. V19.8 SCF byl š'těpen restrikčním enzymem BamHI a SCF inzert byl ligován do BamHI místa pGEM3. DNA z~pGEM3 SCF byla štěpena s Hindlil

a Sall a ligo.vána do pDSR 2 štěpeného HindlII a G_an. Stejný postup byl opakován pro lidské geny kódující COOHkonec aminokyselinových poloh 162, 164 a 183 sekvence uvedené na obr.15C a polohy 248 sekvence uvedené na obr. 42. Stabilizované buněčné linie byly stimulovány methotrexátem /Shimke, v Methods in Enzymology, 151 85-104 (1987)/ při 10 nM pro zvýšení hladin exprese DHFR genu a sousedního SCF genu. ^rlladiny exprese rekombinantního lidského SCF byly zkoušeny radioimunostudií jako v příkladu 7 a/nebo indukcí tvorby kolonií in vitro za použití lidských periferních krevních leukocytů. ^xato zkouška se provádí jak je popsáno v příkladu 9 (tabulka 12) s tím rozdílem, že se použije periferní krev místo kostní dřeně a inkubace se provádí při 20 % 5 % COg a 75 # za přítomnosti lidského EPO (10 j/ml). Výsledky z typických pokusů jsou uvedeny v tabulce 8. CHO klon exprimující lidský SCF¹”¹⁶⁴ byl deponován 25.září 1990 v ATCC (CRE 10557) a označen Hu164SCF17.

Tabulka 8

Zkouška hPBL kolonií kondiciovaného media ze stabilních CHO buněčných linií transfektovaných lidskou SCF DNA

Transferovaná DNA zkoušené medium (/ul) počet kolonií/1^0⁵ pBSRj. 2 hSCF¹“¹⁶⁴ pDSR&2 hSCF¹”¹⁶² žádná (CHO kontrola)

50	53
25	45
12,5	27
6,25	13
10	43
5	44
.2,5	31
1,25	17
0,625	21
50	4

Příklad 6

Exprese rekombinantního SCF v E.coli

A. Rekombinantní krysí SCF

Tento příklad se týká exprese v E.coli SCF polypeptidů pomocí DNA sekvence kódující /Met”¹/krysí SCF¹”¹93 (obr.14C). I když může být použit jakýkoliv vhodný vektor pro expresi proteinu za použití této DNA, užitý plasmid byl pCFM1156 (obr.19). Rento plasmid může být snadno konstruován z pCFM 836 (viz US-patent č. 4710473, který je zde uveden pro úplnost jako odkaz) rozrušením na dvou endogenních Ndel restrikčních místech zaplněním konce T4 polymerázovým enzymem s následující ligací tupého konce a substitucí'malé DNA sekvence mezi jedinečná Clal a KpnI restrikční místa malým ollgonukleotidem uvedeným dále.

'CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3* 3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC /

Řízení exprese proteinu v pCFM1156 plasmidu je pomocí syntetického lambda P^ promotoru, který je sám pod kontrolou teplotně citlivého lambda CI857 represorového genu /jaký je poskytován ve kmenech E.coli FMS (ATCC dep.číslo 53911 nebo K12 Htrp/. pCFM1156 vektor je konstruován tak, aby měl DNA sekvenci, obsahující optimální ribosomová vazebná místa a iniciační kodon přímo 3'syntetického PL promotoru. ^unikátní Ndel restrikční místo, které obsahuje AT6 iniciační kodon, předchází multireštrikční místo klonující skupiny následované lambda t-oop transkripční stop sekvencí.

Plasmid V19.8 SCF¹”¹^^ obsahující krysí SCF¹”¹93 gen klonovaný z PCR amplifikované cDNA (obr.14C), jak popisuje přiklad 3 byl štěpen BglII a ástll a 603 bp DNA fragment byl izolován. ^rro poskytnutí Met iniciačního kodonu a obnovení kodonů pro první tři aminokyselinové zbytky (Gin, Glu a

Tle) krysího SCF polypeptidu, byl vyroben syntetický oligonukleotidový linker

5' TATGCAGGA 3'

3' ACGTCCTCTAG 5' s Ndel a BglII lepivými konci. Malý oligonukleotid a krysí SCF^{1 193} genový fragment byly vloženy ligací do pCFM1156 v unikátních Ndel a ^stll místech plasmidu uvedených na obr.19. ^ročtuktem této reakce je expresní plasmid, pCFM1156 krysí SCF^{1 193}.

pCFM1156 krysí SCF.^1-193 plasmid byl transformován do kompetentních FMS E.coli hostitelských buněk. Selekce buněk, obsahujících plasmid, byla na bázi markerového genu pro antibiotickou rezistenci (kanamycin) přenášenou pCFM1156 vektorem. Plasmidová DNA byla izolována z kultivovaných buněk a DNA sekvence syntetického oligonukleotidu a jeho spojení s krysím SCF genem bylo potvrzeno DNA sekvenováním.

— 1 P

Pro konstrukci plasmidu pCFM1156 krysí SCF kodujícíh/Met ¹ / krysíKó SCF^{1 1}^² polypeptidjá, byl izolován restrikční fragment od ScoRI k SstlI z V19.S krysího SCF a vložen ligací do plasmidu pCFM krysího SCF¹”¹⁹³ v unikátních restrikčních místech EcoRI a SstlI a taktc^se nahradí kódující oblast pro karboxylový konec krysího SCF genu.

^rro konstrukci plasmidů pCFM1156 krysího SCF¹”¹^⁴ a pCFM1156 krysího SCF^1-1^⁹ kódujících /Met”¹/ krysí SCF¹“¹^⁴ a /Met ¹/ krysí SCF^{1 1}^⁹ , byly izolovány EcóRI až SstlI restrikční fragmenty z PCR amplifikované DNA, kódující fa konec SCF genu a byly označpny a byly označeny pro zavedení místně řízených změn v DNA v oblasti kódující karboxy-

lovy konec SCF genu. DNA amplifikace byly provedeny použitím oligonukleotidových primerů 227-29 a 237-19 v konstrukci pCFM1156 krysího SCF^1-164 a 227-29 a 237-20 v konstrukci pCFM1156 krysího SCF^{1 165}.

B. Rekombinantní lidský SCF

Tento příklad se týká exprese v E.coli lidského SCF polypeptidu pomocí DNA sekvence kódující /Met“¹/lidský SCF¹“¹⁸⁴ a /Met“¹/ lidský SCF¹“¹⁸³ (obr. 150. Plasmid V19.8 lidského SCF¹“¹⁸², obsahující lidský SCF¹”¹⁸² gen byl použit jako templét pro PCR amplifikace lidského SCF genu. Oligonukleotidové primery 227-29 a 237-19 byly použity ke generování PCR DNA, která pak byla štěpena Pstl a SstlI restrikčními endonukleázami. ^a účelem získání ^iáet iniciačního kodonu a obnovu kodonů pro první čtyři aminokyselinové zbytky (Glu, Gly, Tle, Cys) lidského SCF polypeptidu, byl připraven syntetický oligonukleotidový linker

5^Z TATGGAAGGTATCTGCA 3*

3' ACCTTCCATAG 5' s Ndel a Pstl lepivými, konci. Malý oligolinker a PCR odvozený genový fragment lidského SCF genu byly vloženy ligací do expresního plasmidu pCFM1156 (jak již bylo popsáno) v unikátních Ndel a SstlI místech v plasmidu, jak je uvedeno na obr.19.

pCFM lidský SCF¹“¹⁸⁴ plasmid byl transformován do kompetentních FMS E.coli hostitelských buněk, ^elekce na plasmid obsahující buněčné hostitele byla provedena na bázi markérového genu pro antibiótickou rezistenci (kanamycin) přenášeném na pCFM1156 vektoru. Plasmidové DNA byla izolována z kultivovaných buněk a DNA sekvenováním byla potvrzena DNA sekvence lidského SCF genu.

Ke konstrukci plasmidu pCFM1156 lidského SCF¹”¹^ kódujícího /Met V lidský SCF^1-1θ3 (obr.15C), byl izolován EciRI až HindlII restri^iní fragment kódující karboxylový konec lidského SCF genu z pGEM lidského SCF¹¹^¹^ (p_Op_sa_ ného níže) a Sstl až EcoRI restrikční fragment kódující aminokonec lidského SCF genu, z pCEE11 56 lidského SCF^1-1^, a delší restrikční fragment z pCFM1156 byl též izolován.

Tři DNA fragmenty byly spolu ligovány za vzniku pCFM1156 lidského SCF ^J plasmidu, který byl pak transformován do FM5 E.coli hostitelských buněk. Po selekci kolonií použitím rezistence na kanamycin byla plasmidová DNA izolována a opravená DNA sekvence byla potvrzena DNA sekvenováním. pGEM lidský-SCF¹¹4 ^3 pi_asmičl je odvozen od pGEM3, který obsahuje EcoRI-Sphl fragment, který zahrnuje nukleotidy 609-820 lidské SCF cDNA sekvence uvedené na obr.15C. EcoRISphl inzert v tomto plasmidu byl izolován z PCR, která využívala oligonukleotidové primery 225-31 a 241-6 (obr.12B) a PCR 22.7 (obr. 13.B) jako templét. Sekvence primerů 241-6 byla založena nalidské genomové sekvenci na 3' straně exonu, obsahujícího kodon pro aminokyselinu 176.

C. Fermentace E.coli, produkujících lidský SCF¹”¹^

Fermentace pro přípravu SCF 1-164 byly prováděny v 16 litrovýmh fermentorech za použití E.coli K12 hostitele, obsahujícího plasmid pCFM 1156 lidského SCF^1-1^^. ^ésobní očkovací materiál pro produkční kulturu byl udržován při -8.0 °C v 17% glycerolu v Luria půdě. ^rro produkci inokula bylo 100 ^ul rozmraženého zásobního materiálu přeneseno do 500 yml Mrria půdy ve 21itrové Erlenmeyerově baňce a ponecháno růst přes noc při 30 °C na rotační třepačce (250 ot.min’¹).

Pro produkci, pasty buněk E.coli použité jako výchozí materiál pro čištění lidského SCF¹ v tomto příkladu, byly použity následující fermentační podmínky.

Kultura inokulal>byla asepticky přenesena do 16litrového

fermentoru, obsahujícího Slitrovou vsádku media (viz tabulka 9). kultura byla kultivována vaádkovým způsobem dokud OD-600 kultury nebylo 3,5· ⁷ této době bylo zavedeno sterilní živné medium (živné medium 1, tabulka 10) do fermentoru za použití peristaltického řerpadla pro řízení rychlosti živin. Rychlost živného media byla exponenciálně s časem zvyšována do dosažení rychlosti růsto 0,15 h^-1. Teplota byla udržována na 30 °C během růstové fáze. Koncentrace rozpuštěného kyslíku ve fermentoru byla automaticky udržována na 50 % nasycení za použití rychlosti průtoku vzduchu, rychlosti míchání, tlaku v nádobě a doplňování kyslíku. pH ve fermentoru bylo automaticky řízeno na 7,0 za použití kyseliny fosforečné a hydroxidu amonného. Při OD-600 přibližně 30, byla indukována produkční fáze fermeptace zvýšením fermentační teploty na 42 °C. V této době byl ukončen přídavek živin 1 a bylo zahájeno přidánání živin 2 (tabulka 11) rychlostí 200 ml/h. Přibližně šest hodin po zvýšení teploty fermentoru byl obsah fermentoru ochlazen na 15 °C. Výtěžek SCF¹”¹⁵⁴ byl vytěžen v množství 30 mg/OD-L. Buněčné pelety pak byly získány odstředěním v Beckmanově J6-B rotoru při 3000 x g po dobu jedné hodiny. Buněčná pasta byla uchovávána zmrazená při -70 °C.

Výhodná metoda pro produkci SCF^1-154 je podobná metodě popsané výše s tou výjimkou, že byly provedeny následující modifikace:

) N_ezag_ne přidávání živin 1 dokud OD-600 kultury nedosáhne 5-6.

2) Rychlost přidávání živin 1 je zvyšována pomaleji, což ve de k pomalejší rychlosti růstu (přibližně 0,08).

3) Kultura je indukována při OD-600 20.

4) Živiny 2 jsou zaváděny do fermentoru rychlostí 300 ml/h.

Všechny ostatní operace jsou stejné jako u výše popsa*⁸⁴/ ného postupu, včetně medií.

2a použití těchto postupů byly získány výtěžky SCF^ ^4 přibližně 35-40 mg/OD-L při OD=25.

Tabulka 9

Složení vsé.dkového media kvasničný extrakt 10^a g/1 glukóza 5

K₂HPO₄ 3,5

KH₂P0₄ 4

MgS0₄.7H₂0 1

NaCl 0,625

Dow P-2000, protipěnivá přísada 5 ml/8 1 vitaminový roztok*⁵ 2 ml/1 roztok stopových kovů^c 2 ml/1 ^a£okud není uvedeno jinak, jsou všechy složky míněny jako g/L.

^Roztok stopových kovů: FeClj.6H₂O 27 g/1, 2nCl₂.4H₂0 2 g/1, CaCl₂.6H₂O 2 g/1, Na₂&lo0₄.2H₂0 2 g/1, CuSC>₄.5H₂O 1,9 g/1, koncentrovaná HC1, 100 ml/1.

_{c Λ} at

Vitaminový roztok: riboflavin 0_}42 g/1, kyselina pantbtlhenová 5,4 g/1, niacin 6 g/1, pyridoxin 1,4 g/1, biotin 0,06 g/1, kyselina listová 0,04 g/1.

'8/

Tabulka 10

Složení živného media kvasničný extrakt glukóza

MgSO₄.7H₂O roztok stopových kovů⁶

Λ vitaminový roztok

50^a

450

8,6 ml/1 10 ml/1 okud není uvedeno jinak, jsou všechny složky míněny jako g/1.

⁶Roztok stopových kovů: FeCl^.óHgO 27 g/1, ZnCl₂.4H₂0 2 g/1, °aCl₂.6 H₂0 2 g/1, Na₂MoO₄.2 HgO 2 g/1, CuSO₄.5 H₂0 1,9 g/1, koncentrovaná HC1 100 ml/1.

^cVitaminový roztok: riboflavin 0,42 g/1, kyselina pantothenová 5,4 g/1, niacin 6 g/1, pyridoxin 1,4 g/1, biotin 0,06 g/1, kyselina listová 0,04 g/1.

Iabulka 11

Složení živného media 2 r

Trypton 172^a kvasničný extrakt 86 glukóza 258 všechny složky jsou uváděny v g/1.

Příklad 7

Imunozkouáka detekce SCF

Radioimunozkoušky (RIA) byly použity pro kvantitativní detekci SCF ve vzorcích a byly provedeny následujícím způsobem.

SCF přípravek z BRL 3A buněk čištěný jako v příkladu byl inkubovén spolu s antiserem po dvě hodiny při 37 °C.

?o dvou hodinách inkubace bylopak zkumavky se vzorky ochla. 125 zeny na ledu, byl přidán I-SCF a zkumavky byly mkubovány při 4 °C nejméně 20 h. Každá zkumavka obsahovala 500 /Ul ikubační směsi, obsahující·50 /ul zředěného antisera, ' -60000 cpm ¹²⁵I-SCF (3,8 x 10⁷ cpm/^ug), /Ul trasyloli a 0.400 /ul SCF standardu, s pufrem (fosfátem pufrovaný salinický roztok, 0,1% hovězí sérový albumin 0,05 Triton X-100, 0,025% azid) tvořícím zbytek objemu. Antiserum pro druhý test bylo získáno z krve králíků imunizovaných s 50% čistým přípravkem přírodního SCF z BRL 3A kondicicvaného media. Konečné zředění antisera ve zkoušce bylo 1:2000.

25

S protilátkou vázaný ^yI-SCF byl vysrážen přídavkem

150 /Ul Staph A (Calbiochem). -^o 1 hodině inkubace při tepltě místnosti byly vzorky odstředěny a pelety byly promyty dvakrát 0,75 ml 10 mM Tris-HCl pH 8,2, obsahujícím 0,1 5M

NaCl, 2 mM EDTA a 0,05 %Tritonu X-100. Promyté pelety byly 1 25 proměřena v gama počítači pro,stanovení procent I-SCF . vazeb. Počty vazeb ve zkumavkách postrádajících sérum byly odečítány ze všech konečných hodnot pro korekci nespecifického srážení. Charakteristická RIA je uvedena na obr.20. Procenta inhibiee ^I-SCF vazby produkované neznačeným standardem je dávka dependentní (obr.20A) a jak je uvedeno na obr.20B, při zkouškách pelet, které byly imunoprecipi1 25 továny, pomocí SDS-PAGE á autoradiografíčky, je pruh . ISCF proteinu konkurující, ^a obr. 20B, je dráha 1 ^{1 2}^I-SCF.

A dráhy 2,3,4 a 5 jscu imunoprecipitovaný

-/ ¹²⁹I-SCF porovnávaný s 0, 2, 100 a 200 ng SCF standardu.

Jak je stanoveno jak snížením ve precipitaci protilátkou v cpm pozorovaném v RIA zkumavkách tak snížením v pruhu imunoprecipitovaného ^yI-SCF proteinu (migrující při asi

31000), polyklonální protilátka rozeznává SCF standard, který byl čištěn jako v příkladu 1.

Westernový postupy byly také aplikovány pro stanovení rekombinantního SCF exprimovaného v E.coli, COS-1 a CHO v ~ 1-162 buňkách. Částečně čištěný E.coli exprimovaný krysí SCF a SCF^{1 193} jakož i lidský SCF^1-162 (příklady 4 a 9) a CHO buňkou exprimovaný krysí SCF (příklad 5), byly podrobeny SDS-PAGE. Při následující elektroforéze byly proteinové pruhy přeneseny na 0,2 ^um nitrocelulozu za použití zařízení Bio-Rad Transblot při 60 V po dobu 5 hodin. Nitrocelulozové filtry byly blokovány po 4 h v PBS, pH 7,6, obsahujícím 10% kozí sérum a dále inkubovány po 14 h při teplotě místnosti s ředěním 1:200 buň králičího preimunního nebo imunního sera (imunizace popsána výše). Komplexy protilótka-antiserum byly vizualizovány za použití reagencií peroxidáza křenu- konjugovaný kozí anti-králičí IgG (Vector laboratories) a 4-chlor-1-naftolu jako činidla vyvíjejícího zbarvení.

Příklady dvou Westernových analýz jsou uvedeny na obr. 21 a 22. Na obr. 21, dráhy 3 a 5 jsou 200 ^ul COS-1 buňkami produkovaného lidského SCF¹’¹^^, ^p^hy 1 a 7 jsou 200 /ul COS-1 buňkami produkovaného lidského EPO (COS-T buňky transfektované s V19.8 EPO), a dráha 8 je drahou markérů molekulární hmotnosti. Dráhy 1-4 byly inkubovány s preimunním šerem a dráhy 5-° byly inkubovány s imunním šerem. Imunní sérum specificky rozpoznává difuzňí pruh s Mr asi 30000 daltonů z COS-1 buněk produkujících lidský SCF^1-1^, _ai_{e ne} z COS-1 buněk produkujících lidský EPO.

-8^

Ve Westernově analýze uvedené na obr. 22 dráhy 1 a 7 jsou 1 /Ug částečně čištěného přípravku krysího SOF^{1 193} ' 1 —1Q3 produkovaného v E.coli, dráhy 2 a8 jsou krysí SCF ⁷ produkovaný COS-1 buňkou a čištěný na agaroze s' aglutininem z pšeničných klíčků, dráhy 4 a 9 jsou krysí SCF^{1 1}^² produkovaný COS-1 buňkou čištěný na agaroze s aglutininem z

1—1 fi?

pšeničných klíčků, dráhy 5 a 10 jsou krysí SCF produkovaný CHO buňkou a čištěný na agaroze s aglutininem z pšeničných klíčků, a dráha 6 jeou zabarvené markéry molekulové hmotnosti. Dráhy 1-5 a dráhy 6-10 byly inkubovány s králičím preimunním a imunním šerem. E.coli produkovaný krysí SCF¹”¹93 (aráhy ] a γ) migruje při zřejmé -24000 daltonů, zatímco COS-1 buňkou produkovaný krysí SCF¹ *¹ (dráhy 2 a 8) migruje při M 24-36000 daltonů. Tento rozdíl v molekulové hmotnosti je očekávaný, protože savčí buňky, ale ne bakterie, jsou schopné glykosylace. Transfekce sekvence kódující krysí SCF¹”¹^² v COS-1 (dráhy 4 a 9) nebo GHO buňkách (dráhy 5 a 10), vede k expresi SOF s nižší průměrnou molekulovou hmotností než je produkován transfekci s SCF^1-193 (dráhy 2 a 8).

Expresní produkty krysího SCF^1-1^² z COS-1 a CHO buněk jsou.serie pruhů v rozmezí zřejmé mol.hmotnosti M mezi 24-36000 daltonů. Heterogenita exprimovaného SCF je pravděpodobně způsobena změnami v obsahu karbohydrátů, jelikož SCF polypeptid je glykosylován v různé míře.

Souhrnně, V/es ternový analýzy indikují, že imunní sérum z králíků imunizovaných s· přírodním savčím SCF rozpoznává rekombinantní SCF produkovaný v E.coli, COS-1 a GHO buňkách, ale nerozpoznává jakékoliv pruhy v kontrolním vzorku, obsahujícím COS-1 buňkami produkovaný EPO. Jako další podporu specifity SCF antisera lze uvést; že preimunní sérum ze stejnýhh králíka nereaguje s jakýmkoliv krysími nebo lidskými SCF expresními produkty.

Příklad 8

In vivo aktivita rekombinantního SCF

A. Krysí SCF při transplantaci kostní dřeně

COS-1 buňky byly transfektovány s V19.8 SCF^{1 1}v pokusu ve velkém měřítku (T175 cm nádoby místo 60 mm misek) způsobem popsaným v příkladu 4. Bylo získáno přibližně 270 ml supernatantu. Tento supernatant byl chromatografován na agaroze s aglutininem z pšeničných klíčků a SSephar.oze v podstatě stejným způsobem jak je popsáno v příkladu 1. Rekombinantní SCF byl hodnocen na modelu transplantace kostní dřeně založeném na myších _o Myš W/W^v měla defektní kmenovou buňku, což mimo jiné vede k makrocytove anemii (velké červené krvinky) a umožňuje transplantaci kostní dřeně z normálních živočichů bez potřeby ozařování příjemců /Russel a spol., Science, 144, 844-846 (1964)/. Kmenové buňky normálního dárce rostou po transplantaci rychleji než defektní recipientovy buňky.

V následujícím příkladu obsahuje každá skupina šest myší odpovídajícího stáří. Kostní dřeň byla získána z normálních dárcovských myší a transplantována W/W^v myším. Krevní profil příjemců je sledován v různých časech po transplantaci a přihojení kostní dřeně je stanoveno změnami periferních krevních buněk z recipientova fenotypu na donorův. K_{0nver2e z} recipienta na donorův fenotyp je detegována.monitorováním předního scatter” profilu (FASCAN·, Becton Dickenson) červených krvinek. Profil pro každé transplantaci pro každé zvíře byl porovnán s profilem pro kontrolní zvířata jak donora tak recipienta ve stejné době. dorovnání bylo provedeno za využití počítačového programu založeného na Kolmogorov-Smirnov statistikách pro analýzy histogramů z průtočných systémů /Young, J.Histochem.and ^yfochem., 25, 935-941 /1977//. Nezávislým kvalitativním indikátorem přihojení je hemoglobin, detegovaný elektroforézou hemoglobinu příjemcovy krve /Wong a spol., Mol.and Cell.Biol.,

9, 798-808 (1989)/ , což je v souladu se závěry statistiky podle Kolmogorova-Smirnova.

Přibližně 3 x 10 buněk bylo transplantováno bez ošetření SCF (kontrolní skupina na obr. 23) z C56BL/6J dárců W/W příjemcům. Druhá skupina dostala 3x10 buněk donora, které byly ošetřeny SCF (600 j/ml) při 37 °C po 20 min a injektovány společně (gre-ošetřená skupina na obr. 23) (Jedna jednotka SCF je definována jako množství, které vede k polovině maximální stimulace v MC/9 biozkouŠce). Ve třetí skupině, recipientní myši byly injektovány subkutánně (sub-Q) přibližně 400 j SCF/den 3 dny po transplantaci 3 x 10 dárcovských buněk (sub-Q injeck skupina na obr. 23). Jak je uvedeno na obr. $3 v obou SCF-ošetřených skupinách je kostní dřeň přihojena rychleji než v neošetřené kontrole.

dní po transplantaci byla SCF pre-ošetřená skupina přeměněna na donorův fenotyp. ^Ayto příklady ilustrují vhodnost SCF terapie při transplantaci kostní dřeně.

B. In vivo aktivita krysího SCF u Steel myší

M_utace v S1 lokusu působí deficienci hematopoetických buněk, pigmentových buněk a zárodečných buněk. Hepatopoetický defekt je manifestován jako snížený .počet červených krvinek /Russell, v: AI Gordon, Regulation of Hematopoiesis, sv.I, 649-675 Appleton-Century-Crafts, New York (1970)/, neu rofilů /Ruscetti, Proč.Soc.Exp.Biol.Med., 152, 398 (1976)/, monocytů /Shibata, J.Immunol. 135, 3905 (1985)/, megakaryo-t .cytů /Ebbe, Εχρ. Hematol., 6, 201 (1978)/, přirozených žabí jedových buněk /(Clark, Immunogenetics, 12, 601, (1981)/ a mast buněk /Hayashi, Dev.Biol., 109, 234 (1985)/. Steel myši jsou čistými příjemci transplantátu kostní dřeně pro svoji sníženou schopnost poskytovat kmenové buňky /Banner-

man, Prog.Hematol., 8, 131 (1973)/. Gen kódující SCF je u Steel my í (S1/S1) vypuštěn.

Steel myši poskytuji senzitivní in vivo model pro SCF aktivitu. Různé rekombinantní SCF proteiny byly těstovány na Steel-Dickie (S1/S1^Q) myš/ích v různě dlouhých časech. S_est až deset týdnů staré.Steel myši (WCB6F1-S1/S1^) byly získány od Jackson Labs, Bar Harbor, ME..Periferní krev byla monitorována mikroburiěčným počítačem SYSMEX F-800 (Baxter, Trvine, CA) na červené krvinky, hemoglobin a destičky. Pro spočtení periferních bílých krvinek (%'BC) byl použit Coulter Channelyzer 256 (Coulter Electronics, Marietta, GA).

• ’* »

V pokusu na obr. 24, byly Steel-Dickie myši ošetřeny SCF 1-164 získaným z E.coli, čištěným jako v příkladu 10, v dávce 100 /Ug/kg/den po 30 dní, pak dalších 20 dní dávkou 30 /Ug/kg/den. Protein byl formulován v salinickém roztoku pro injekce (Abbott Labs, North Chicago, IL) + 0,1% fetálního hovězího sera. Injekce byly podávány denně subkutánně. Periferní krev byla monitorována v ocase oflebráním 50 /ul v časech uvedených na obr. 24. Krev byla odebrána do 3 % EDTA povlečených stříkaček a přenesena do mikrogugových zku mavek s práškovaným EDTA (Brinkmann, Westbury, NY.). Existu je výrazná korekce makrocytové anemie u ošetřených zvířat vzhledem ke zvířatům kontrolním. Při ukončení ošetření se ošetřovaná zvířata navrátila do počátečního stavu makrocytové anemie.

V pokusu uvedeném na obr.25 a 26, byly Steel-Dickie my ši ošetřeny různými rekombinantními formami SCF jak je popsáno výše, ale v dávce 100 /Ug/kg/den po 20 dnů. Byly produkovány dvě forma.z E.coli získaného krysího SCF, SCF^{1 184} a SCF¹“¹9³, jak je popsáno v příkladu 10. Dále byl také testován E.coli SCF^1-184, modifikovaný přídavkem polyethylenglykolu (SCF¹~¹⁸⁴PEG25) jako v příkladu 12. Rovněž byl / ·

1—1 fi?

testován z CHO získaný SCF produkovaný jako v příkladu 5 a čištěný jako v příkladu 11. Zvířata byla podrobena odebrání krve srdeční punkcí stříkačkami se 3 % EDTA a tato byla umístěna do zkumavek s práškovanou EDTA.· Profily periferní krve po 20 dnech po ošetření jsou uvedeny na obr.23 pro bílé krvinky (WBC) a obr. 26 pro destičky. WBC rozdíly pro skupinu SCF¹“^{164 PEG25} jsou _uvej_eny _{na o}br. 27* Absolutně jsou zvýšeny neurofily, monocyty, lymfocyty a destičky. Nejdramatičtější efekt je zřejmý s SCF¹”*¹⁶⁴PEG 25.

Nezávislé měření lymfocytů byla rovněž provedena a údaje jsou uvedeny na obr.28. Myší ekvivalent lidské CD4 nebo markér T pomocných buněk, je L3T4 /Dialynas, J.Immunol., 131 , 2445 (1983)/. Lyt-2 je myší antigen cytotoxických T buněk /Ledbetter, J.Exp.Med., 153, 1503 (1981)/. Monoklonální protilátky vůči těmto antigenům byly použity pro hodnocení T buněčných podskupin u ošetřených zvířat.

^Ikrev byly hodnocena na T lymfocyty následovně. D_vgstě mikrolitrů krve bylo odebráno od jednotlivých zvířat do EDTA ošetřených zkumavek, ^aždý vzorek krve byl lyžován sterilní deionizovanou vodou po 60 sekund a pak zpracován isotonicky s 10X Dulbecco fosfátovým pufrovaným salinickým roztokem

PBS (Gibco, Grand Island, NY). Takto lyžovaná krev byla promyta dvakrát 1X PBS (Gibco, Grand Island, NY) doplněným θ,1 % fetálního hovězího sera (Flow Laboratory, McLean, VA) a 0,1 % azidu sodného. ^lvaždý vzorek krve byl umístěn do misky s 96 jamkami s kulatým dnem a odstředěn. Buněčná 5 peleta (obsahující 2-10 x 10^ buněk) byla resuspendována Š 20 mikrolitry krysí anti-myší L3T4 konjugovaného s phycoerythrinem (PE) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) a 20 mikrolitry krysí anti-myší Lyt-2 konjugovaného s fluoresceinémothiokyanátem, inkubovaným na ledu (4 °C) po 30 mi-

nut (Becton Dickinson). Následující inkubace buněk byly promyty dvakrát v 1X PBS doplněným jak je uvedeno výše. *aždý vzorek krve pak byla analyzován na FACScan cell analytickém systému (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Tento systém byl standardizován za použití standardních autokompenzačních postupů a Galibrite Beads (Becton Dickin son, ^ountain View, CA), ^yto údaje indikují zvýšení jak pomocných T buněk, zak cytotoxických buněk T.

C. In vivo aktivita SCF u primátů \

Lidský SCF 1-164-exprimovaný v E.coli (příklad 6B) a čištěný do homogenity jako v příkladu 10 byl testován na in vivo biologickou aktivitu u normálních primátů. Dpspělí samci paviánů (Papio sp.)' byli studováni ve třech skupinách: neošetřená, n=3, SCF 100 /Ug/kg/den, n=6, a SCF 30 /Ug/kg/den n=6. Ošetřená zvířata dostávala jednou denně subkutánní injekce SCF. Zkušební vzorky krve byly získány od zvířat pod' ketaminem.Vzorky komplentní krve, retikulocy tů a destiček byly získány ve dnech 1, 6, 11, 15, 20 a 25 po ošetření.

Všechna zvířata přežívají a nemají žádnou negativní reakci vzhledem k terapii SCF. ^xočet bílých krvinek se u zvířat ošetřených 100 ^ug/kg zvýšil jak je uvedeno na obr.29. Rozdílný počet, získaný ručně ze Wright Giemsa vybarvených skvrn periferní krve, je také uveden na obr.29. Bylo zde absolutní zvýšení u neurofilů, lymfocytů a monocy tů. Jak je.uvedeno na obr. 30 při dávce 100 yU^/kg také došlo ke zvýšení hematokrytů a destiček.

Lidský SGF (hSCF*”*^^ modifikovaný přídavkem polyethylenglykolu jako v příkladu 12) byl také testován na nor mélních paviánech v dávce 200 ^ug/kg-den, podávané kontinuálně intravenozní infuzí a porovnán s nemodifikovaným proteinem. Zvířata začala dostávat SOF v den 0 a byla ošetřována 28 dnů. Výsledky periferní WBC jsou uvedeny v následující tabulce. PEG modifikovaný SGF vyvolává časnější zvýšení periferní WBC než nemodifikovaný SCF.

i

Ošetření 200 /Ug/kg-den hSCF^{1 164}

Zvíře	č.	M88320	zvíře	Č. M88129
den		WBC	den	WBC
0		5800	0	6800
+7		10700	+7	7400
+ 14		1 2600	+ 14	20900
+ 16		22000	+21	18400
+ 22		31100	+23	24900
+ 24		28100	+ 29	13000
+29		9600	+30	23000
+36		6600	+37	1 2100
+43		5600	+44 +51	10700 7800
ošetření	200 /Ug/kg-den PEG-hSCF1	-164. •
zvíře	č.	M88350	zvíře	δ. M89116
den		WBC	den	WBC
-7		1 2400	-5	7900
-2		1 1 600	0	7400
+4		24700	+6	16400
+7		20400	+9	17100
+ 1 1		24700	+ 13	18700
+ 14		32600	+ 16	19400
+ 18		33600	+20	27800
+ 21		26400	+23	20700
+25		16600	+ 27	20200
+ 28		26900	+29	18600.
+32		9200	+33	7600

I lot

Příklad 9

In vitro aktivita řekombinantního lidského SCF cDNA lidského SCF odpovídájícho aminokyselinám 1-162 získaná PCR reakcemi jako v příkladu 3D, byla exprimována v COS-buňkách jak je popsáno pro krysí SCF v příkladu 4.

COS-1 supernatanty byly zkoušeny na lidské kostní dřeni jakož i v myších HPP-CFC a MC/9 zkouškách. Lidský protein nebyl aktivní při koncentracích testovaných v obou zkouškách · na myších, byl aktivní na lidské kostní dřeni. Kultivační podmínky byly následující: lidská kostní dřeň od zídavých dobrovolníků byla odstředěna nad Ficoll-Hypaque gradienty

XPharmacia) a kultivována v 2,1% methylceluloze, 30% fetál—5 ního telecího sera, 6 x 10 M 2-merkaptoethanolu, 2 mM glutaminu, ISCOVE mediu (GIBCO), 20 j/ml EPO a 1 x 10⁹ buněk/ ml po 14 dnů ve zvlhčené atmosféře, obsahující 7 % O₂, % CO₂ a 83 % N₂· Počet kolonií vzniklých s rekombinantními lidskými a krysími SCF COS-1 supernatanty je uveden v tabulce 12. Jsou započteny pouze ty kolonie, které mají velikost 0,2 mm nebo větší.

^ab.ulka 12

Růst kolonií lidské kostní dřeně jako odezva na SCF

Transfektovaný plasmid objem CM kolonie poč./100000 ________zkouš. pul)__buněk + stand.odch.

V19.8 (bez inzertu)	100	0
	50	0
V19.8 lidský SCF1 162	100	33+7
	5°	22+3
V19.8 krysí SCF1“162	100	1 3+1
	50	10

Kolonie, které rostly během čtvrnáctidenního období jsou uvedeny na obr. 31A (zvětšeno 12χ). Šipka upozorňuje na typickou kolonii. Kolonie se podobají koloniím myšího HPP-CFC svými rozměry (průměr 0,5 mm). Díky přítomnosti EPO byly některé kolonie hernoglobinovány. Po izolaci kolonií a odstředění na skleněných destičkách za použití Cytospinu /Shandon/ s následujícím vybarvením pomocí Wright-Giemsy, byl převládajícím buněčným typem typ buňky nerozdělené s vel kým jádrem:cytoplasma poměrem, jak je uvedena na obr 31B (zvětšení 400x). šipky na obr. 31B představují: šipka 1 cytoplasma, šipka 2 - jádro, šipka 3 -vakuola. +maturované buňky jako třída jsou velké a získané buňky jsou menší než zralé(Digs a spol., The Morphology of Human Blood₍Cells, Abbott Labs, 3 (1978)). Jádra ranných buněk z hematopoetinové maturované sekvence jsou relativně velká vzhledem k cytoplasmě. Déle cytoplasma imaturovaných buněk se zbarvuje pomocí Wright-Giemsy tmaběji než jádro. Jak buňky zrají, je jádro proti cytoplasmě tmavší. Morfologie buněk lidské kostní dřeně vzniklých z kultury s rekombinantním

lidským .SCF je v souladu se závěry, že konečným produktem a meziproduktem působení SCF je relativně imaturovaný hematopoetický progenitor.

Rekombinantní lidský SCF byl testován zkouškou kolonií na agaru. na lidské kostní dřeni v kombinaci s dalšími růstovými faktory popsanými výše. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13. SCF synergizuje s G-CSF, GM-CSF, IL-3 a EPO pro zvýšení proliferace kostní dřeně pro individuální CSF.

Tabulka 13

Synergismus rekombinantního lidského SCF s dalšími faktory stimulujícími lidské kolonie kolonie počet/1Cr buněk (14 dní)

slepý pokus	0
hG-CSF	32+ 3
hG-CSF + hSCF	74+ 1
hGM-CSF	14+2
hGM-CŠF + hSCF	108+ 5
hIL-3	23+ 1
hIL-3 + hSCF	108+ 3
hEPO	10+ 5
hEPO+ IL-3	17+1
hEPO + hSCF	86+10
hSCF	0

Další aktivitou rekombinantního lidského SCF je schopnost vyvolávat proliferaci lidské akutní myelogenové leukemické (AML) buněčné linie, KG-1 (ATCC CCL 246) v měkkém agaru. COS-1 supernatanty z transfektóváných buněk byly testovány v KG-1 agarové klonovací zkoušce /Koeffler á spol., Science,. *200, 1 153-1154 (1978)/ v podstatě tak, jak je popsána s výjimkou že buňky byly umístěny na plotnu v koncentraci 3000/ml. Údaje ze tří kultur jsou uvedeny v lok tabulce 14.

/ \ '·

Tabulka 14

Zkouška klonování KG-1 na měkkém agaru

Ťrapsfektovaný plasmid zkoušený kolonie poč./3000 ____________objem Qul)__buněk + SD (stand.odch.)

V19.8 (bez inzertu)	25	2+1
V19.8 lidský SCF1 162	25	14+0
	12	8+0
	6	9+5
	3	6+4
	1,5	6+6
V19.8 krysí SCF1-162	25	6+1
lidský GM-CSF	50 (5 ng/1)	' 14+5

Příklad 10

Čištění rekombinantních SCF produktů exprimovaných v E. coli '

Fermentace E.coli lidského SCF^{1 1}^ byla provedena podle příkladu 6C. Získané buňky (912 g vlhké hmotnosti) byly suspendovány ve vodě v obejmu 4,61 celkem a ponechány rozrušit trojím průchodem laboratorním homogenizátorem (Gaulin Model Í5MR-8TBA) při 8000 psi. Pelety rozrušených buněk byly získány odstředěním (17700 x g, .30 min, 4 °C), promyty jednou vodou (resuspendovény a recentrifugovóny) a nakonec suspendovány ve vodě na objem 400 ml.

Frakce pelet, obsahujících nerozpustný SCF (přibližně

10-12 g SCF) byla přidána do 3950 ml vhodné směsi tak, že

vhodné směsi tak, že koncentrace konečná složek ve směsi byla 8 M močoviny (ultračistá), 0., 1 mM EDTA, 50 mM octanu sodného, pH 6-7;’SCF koncentrace byla hodnocena jako 1,5 mg/ml. Inkubace byla prováděna při teplotě místnosti po 4 hodiny pro rozpuštění SCF. Zbylý nerozpustný materiál byl odstraněn odstředěním (17700 x g, 30 min, teplota místnosti. Pro složení/reoxidaci rozpuštěného SCF, byly supernatantní frakce pomalu přidány za míchání, do 39,15 1 vhodné směsi, takže konečné koncentrace složek ve směsi byly 2,5 M močoviny (ultračistá), 0,01 mM EDTA, 5 mM octan sodný, 50 mM Tris-HCl, pH8,5, 1 mM glutathion, 0,02 % (hmotn./obj.) azid sodný. SCF koncentrace byla hodnocena jako 150 /Ug/ml.'Po 60 h při teplotě místnosti /kratší doba (např. -20 h) je také vhodná/, byla směs zahuštěna dvojnásobným průchodem ultrafiltračním zařízením Millipore Pellicon s polysulfonovými membránovými kazetami pro dělení mol. hmotnosti 10 000 /tři kazety/ /15 ft² celkový povrch/ a pak diafiltrovéagr proti 7 objemům 20 mM Tris-HCl, pH 8. Teplota během koncentrace/ultrafiltrace byla 4 °C, rychlost čerpání byla 5 1/min, a rychlost filtrace 600 ml/min. Konečný objem získaného retentátu byl 26,5

1. použitím SDS-PAGE provedeným jak s tak bez redukce vzorků, je zřejmé, že· nejvýee. ( >80 %) pelet frakcí SCF je solubilizovsno inkubací s 8 M močoviny a za po složení/ oxidaci jsou přítomny násobné druhy (formy) SCF, jak‘je zřejmé z SDS-PAGE neredukovaných vzorků. Hlavní forma, která představuje správně oxidovaný SCF (viz níže), migruje se zjevnou M*. asi 17000 (neredukovaná) vzhledem k markérům molekulové hmotnosti (redukované) popsaným na obr. 9. Další formy obsahují materiál migrující se zjevnou M_r asi 18-20000 (neredukováno), předpokládá se, že představují SCF s nesprávnými disulfidovými vazbami uvnitř řetězce; a pruhy, migrující se zjevnými M_f v rozmezí 37000 (neredukováno) nebo větší, o čemž se předpokládá, že

představuje různé SCF formy mající vnitrní disulfidové vazby vzniklé v SCF polypeptidových řetězcích, které jsou kovalentně navázány' za vzniku dimerů nebo dlouhých oligomerů. Následující stupně frakcionace spočívají v odstranění zbývajících E.coli kontaminantů a neočekávaných SCF fóre,, takže se získá SCF čištěný do zjevné homogenity v biologicky aktivní konformaci.

. fit -t pH ultrafíltračního tehentátu bylo uprave/io na 4,5 přídavkem 375 ml 10% (obj./obj.) kyseliny octové, což vede k vysrážení materiálu. Po 60 minutách, to jest době, kdy se usadí na dně nádoby nejvíce materiálu, se horních 24 1 TM dekantuje a zfiltruje přes Cuno 30SP tlustý filtr při 500 ml/min pro úplné vyjasnění roztoku. Filtrát se pak zředí 1,5krát vodou a aplikuje při 4 °C na kolonu S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (9 x 18,5 cm) ekvilibrovanou ve 25 mM octanu sodném, pH 4,5. Kolonou materiál protékal rychlostí 5 1/h při 4 °C. ^ro aplikaci vzorku byla kolona promyta pěti objemy kolony ( 6 1) kolonového pufru a SCF materál, který je vázán na kolonu , byl eluován gradientem od 0 do 0,35 M NaCl kolonovým pufrem. ^Velkový objem gradientu byl 20 1 a byly odebírány frakce 200 ml. Eluční profil je znázorněn na obr. 33. Podíly (10 /ul) z frakcí odebíraných z S-Bepharosové kolony, byly analyzovány SDS-PAGE provedené jak s (obr.32A) tak bez (obr.32B) redukce vzorku.

Z těchto analýz je zřejmé, že pravděpodobně všechny absorbance při 280 nm (obr.32 a 33) jsou způsobeny SCF materiálem.

Správně oxidovaná forma převládá v píku hlavní absorbance (frakce 22-38, obr.33). Menší, druhy (formy), které mohou být vizualizovány ve frakcích zahrnují nesprávně oxidovaný materiál se zjevnou M 18-20000 na SDS-PAGE (neredukovaná), přítomný ve vzestupný ramenu hlavního absorbančního píku (frakce 10-21, obr.32B); a disulfidový vázaný dimerní. materiál, přítomný v oblasti absorbance (frakce 10-102

Μ

38, obr. 32B).

Frakce 22-38 ze S-Sepharosové kolony byly spojeny a tento pool byl upraven na pH 2,2 přidáním asi 11 ml 6N HCl a aplikován na Vydac C^ kolonu (výška 8,4 cm, průměr 9 cm) ekvilibrovanou s 50% (obj./obj.) ethanolem, 12,5 mM HCl (roztok A) a operace byla prováděna při 4 °C. Pryskyřice kolony byla připravena suspendováním suché pryskyřice v 80% /obj./obj.) ethanolu, 12,5 mM HCl (roztok B) a pak ekvilibrováním v roztoku A. Před aplikací vzorku byl aplikován slepý gradient od roztoku A k roztoku B (6 1' celkového objemu) a kolona byla pak reekvilibrovéna roztokem A. Po aplikaci vzorku byla kolona promyta 2,5 1 roztoku A a SCF materiál vázaný na kolonu byl eluován gradientem od roztoku A do roztoku B (18 1 celkový objem) při rychlosti průtoku 2670 ml/h. Bylo odebráno 286 frakcí po 50 ml a podíly byly analyzovány absorbancí při 280 nm /obr.35/, a SDS-PAGE (25 /ul na frakci) jak. je popsáno výše (obr.34A, redukční podmínky, obr. 34B neredukční podmínky), ^rakce 62-161, obsahující správně oxidovaný SCF ve vysoce čistém stavu, byly spojeny (relativně malá množství nesprávně oxidovaného monomeru s Μ_ρ asi 18-20000 (neredukováno) eluovaným později v gradientu (asi frakce 166-211) adisulfidový dimerový materiál byl také eluován později (asi frakce 199-235) (obr.35)/»

Bro odstranění ethanolu z poolu frakcí 62-161 a pro zahuštění SCF byl použit následující postup využívající Q-Sepharosovou Fast Flow (Pharmacia) iontovýměnnou pryskyřici. Pool (5 1) byl zředěn vodou na objem 16,625 1, na koncentraci ethanolu asi 20 % (obj./obj.). Pak byla přidána 1 M Tris báze (135 ml) pro upravení pH na hodnotu 8, déle 1 M Tris-HCl, pH 8 (23,6 ml) pro upravení celkové iris koncentrace' na 10 mM. Dalších 10 mM Tris-HCl, pH 8 (^15,5 1) bylo přidáno na celkový objem asi 10%

-v>yioi (obj./obj.). Materiál byl pak aplikován při 4 °C na kolonu Q-Sepharose Past Flow (výška 5,5 cm, průměr 7 cm), ekvilibrovanou 10 mM Tris-HCl a pak následovalo promývéní kolony 2,5 1 kolonového pufru. Rychlost průtoku vzorku při aplikaci a promývéní byla asi 5,5 1/h. Pro eluci vázaného SCF bylo čerpáno 200 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8 v opačném směru kolonou rychlostí asi 200 ml/h. ^rakce asi 12 ml byly odebrány a analyzovány absorbancí při 280 nm a SDS-PAGE * jak je uvedeno výše. Frakce 16-28 byly spojeny (157 ml).

Pool, obsahující SCF byl pak aplikován ve dvou oddělených chromatografických pokusech ,(78,5 ml použito v každém) na Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) kolonu pro gelovou filtraci (5 x 138 cm) ekvilibrovanou fosfátem pufrovaným salinickým roztokem při 4 °C. Frakce asi 15 ml byly odebrány při ptůokové rychlosti asi 75 ml/h. V každém případě hlavní pík materiálu s absorbancí při 280 nm*eluovaný ve frakcích odpovídá zhruba elučnímu objemu v rozmezí od 1370 do 1635 ml. Frakce, představující absorbční píky ze dvou kolonových pokusů byly spojeny do objemu 525 ml, obsahujícího asi 2,3 g SCF. Tento materiál byl sterilizován filtrací za použití zařízení Millipore Millipak 20 membránová vložka.

Alternativně, materiál z kolony C^ může být koncentrován ultrafiltrací a půfr vyměněn diafiltrací, před sterilní filtrací.

Izolovaný rekombinantní lidský SCF^1-1.materiál je vysoce čistý ( z* 98 % podle SDS-PAGE s vyvoláním stříbrem) a je pokládán za farmaceuticky čistý. 2a použití metod z příkladu 2, je zjištěno, že materiál má aminokyselinové složení, odpovídající analýze SCF genu a má N-koncov<^>u aminokyselinovou sekvenci Met-Glu-Gly-Ile..., podle očekávání, s udržením Met kódovaného iniciačním kodonem.

“¹°4/

Podobnými postupy uvedenými pro lidský SCF^{1 184} exprimovaný v E.coli, může být také získán krysí SCF^{1 1}^⁴ (také přítomný v nerozpustné formě uvnitř buňky po fermentaci) v čistém stavu s vysokou biologickou specifickou atkiivitou. Stejně může být získán lidský SCF^{1 1}®³ a krysí SCF^{1 193}» Krysí SCF^1-193 během skládání/oxidace jeví sklon ke tvorbě různě oxidovaných druhů a je nesnadnější odstranit tyto neočekávané druhy chromatografický.

Krysí SCF^{1 193} a lidský SCF¹”¹⁸³ jsou náchylné k proteolytické degradaci během počátečních stupňů získávání,tj. solubilizace a skládání/oxidace. Primární místo proteolýzy je umístěno mezi zbytky 160 a 170. Proteolýza může být minimalizována vhodnou úpravou podmínek (např. koncentrace SCF, změnou pH, přidáním EDTA na 2-5 mM, nebo jinými inhibitory proteézy) a očekávané degradované formy mohou být odstraněny vhodnými dělícími stupni.

Zatímco použití močoviny pro solubilizaci a během skládání/oxidace, jak je uvedeno, je výhodným provedením, mohou být použita i další solubilizační činidla jako je guanidin.HCl (např. 6 M během solubilizace a 1,25 M během skládání/oxidace) a N-lauroylsarkosin sodný. Po odstranění činidel po skládání/oxidaci, může být získán vyčištěný SCF jak je stanoveno SDS-PAGE, použitím vhodných dělících stupňů.

Dále je výhodným provedením použití glutathionu v koroentraci 1 mM během skládání/oxidace, mohou být ovšem použity další podmínky se stejným nebo blízkým účinkem. Tyto například zahrnují poůžití místo 1 mM glutahionu 2 mM glutathronu plus 0,2 mM oxidovaného glutathionu, nebo 4 mM glutathionu plus ,0,4 mM oxidovaného glutahionu nebo 1 mM 2-merkaptoethanolu nebo jiného thiolu.

Mimo chromatografických popsaných postupů jsou vhodné i jiné postupy pro získání SCF ve vyčištěné aktivní formě, které zahrnují hydrofobní interakční chromatografii (např*. použití fenyl-Sepharosy (Pharmacia), používající vzorek v neutrálním pH za přítomnosti 1,7 M síranu amonného a eluci gradientem snižující se koncentrace síranu amonného); afinitní chromatografie s imobilizovaným kovem /napr. použití chelatované-Sepharosy (Pharmacia) s Cu ionty, aplikace vzorku při téměř neutrálním pH za přítomnosti 1 mM imidazolu a elucí gradientem zvyšující se koncentrace imidazolu/; hydroxylapatitové chromatografie /aplikace vzorku při neutrálním pH za přítomnosti 1 mM fosfátu a elucí zvyšujícím se gradientem fosfátu/ a dalšími postupy, které jsou zřejmé odborníkům.

Další formy lidského SCF, odpovídající celému nebo části otevřeného čtecího rámečku kódujícího aminokyseliny 1-248 na obr. 42, nebo odpovídající otevřenému čtecímu rámečku.' ' . kódovanému alternativně spojovanými mRNA, který může existovat (jak je reprezentován cDNA sekvencí na obr. 44), mohou také být exprimovány v E.coli a získány v čištěné formě postupy stejnými jak jsou výše popsány v tomto příkladu, a dalšími postupy, které jsou zřejmé pro odborníky.

Čištění a příprava forem, zahrnujících tak zvanéu transmembránovou oblast uvedené v příkladu 16 mohou využívat detergenty, zahrnující neionogenní detergenty, a lipidy, zahrnující fosfolipidy obsahující liposomovou strukturu.

Příklad 11

I “ekombínantní SCF ze savčích buněk

A. ^ermentace CHO buněk, produkujících SCF

Rekombinantní buňky ovarya čínského křečka (CHO) (kmen CHO pDSR «<2 hSCF¹”^{1 62}) byly kultivovány na mikrono-

sicích ve 20litrovém perfuzním kultivačním systému pro 1^1 go produkci lidského SCF . Fermentorový systém byl podobný systému použitému při kultivaci BRL SA buněk, příklad IB, s výjimkou následujících podmínek: kultivačním mediem použitým pro kultivaci CHO buněk byla směs media Dulbecco*s ^Modified Eagle Medium (DMEM) a Ham*s F-12 živná směs.v poměrů 1:1 (GIBCO), doplněné 2 mM glutaminu, neesenciálními aminokyselinami (ke zdvojnásobení existující koncentrace za použití 1:100 zředění Gibco č.320-1140) a 5% fetálního bovinního sera. Získané medium bylo identické s výjimkou vynechání sera. Reaktor byl inokulován 5,6 x 10^ CHO buňkami kultivovanými ve dvou 3-litrových nádobách.

Buňky byly ponechány růst do koncentrace 4 x 10 buněk/ml.

V tomto bodě bylo do reaktoru přidáno 100 gramů presterilizovaného mikronosiče cytodex-2 (Pharmacia) jako suspenze ve 3 litrech fosfátem pufrovaného salinického roztoku.

Buňky byly ponechány napojit a růst na mikronosi čích po dobu čtyř dhů. Růstové medium bylo perfundováno reaktorem podle potřeby vzhledem ke spotřebě glukózy. Koncentrace glukózy byla udržována přibližně na 2,0 g/1. Po čtyřech dnech hyl reaktor perfundován Šesti objemy sera-prostého media pro pdstranění většiny sera (koncentrace proteinu <, 50 yug/ml). Reaktor byl pak provozován vsádkově, dokud koncentrace, glukózy neklesla pod 2 g/1. Od tohoto momentu byl reaktor provozován s kontinuální perfuzní rychlostí asi 20 1/den. pH kultury bylo udržováno na 6,9 + 0,3 úpravou průtoku C0₂« Rozpuštěný kyslík byl udržován na hladině vyšší než 20 % sycením vzduchem a podle potřeby doplňováním čistým kyslíkem. Teplota byla udržována na 37 + 0,5 °C..

výše uvedeného systému bylo získáno přibližně 450 litrů kondiciovaného media a toto bylo použito jako výchozí materiál pro čištění rekombinantního lidského SOF

-'/-//z

Přibližně 589 litrů sera prostého kondiciovaného media bylo také získáno stejným postupem, ale za použití kmene CHO pDSRo^2 rSCF¹”¹^² bylo použito jako výchozí materiál pro čištění krysího SCF^1-1^²,

3. Čištění řekombinantního savčího exprimovaného krysího SCF^{1 162}

Všechny čistící postupy byly prováděny při 4 °C pokud není uvedeno jinak.

1. Koncentrace a diafiltrace ^ondiciované medium získané ze sera prosté kultivace buríěkčného kmene CHO pDSR«\2 krysího SCF¹”¹^² jak je popsáno v sekci A výše, bylo vyčiřeno filtrací přes 0,45 /Um Sartocapsules (Šartorius). ^ěkolik rozdílných vsédek (36 1, 101 1, 102 1, 200 1 a 150 1) bylo odděleně zahuštěno a provedena výměna diafiltrace/pufr. Pro ilustraci, zpracování 36 1 vsédky bylo následující. Filtrované kondiciované medium bylo zahuštěno na 500 ml za použití ultrafiltračního zařízení s tangenciálním průtokem Millipore Pellicon s membránovými kazetami z acetátu celulózy (tři kazety) oddělujícími molekulovou hmotnost 10000 (1 5 ft celková plocha membrány, rychlost Čerpání /v 2200 ml/min a rychlost filtrace n- 750 ml/min). Výměna diafiltrace/pufr pro aniontnovýměnnou chromatografii byla pak provedena přidáním 1000 ml 10 mM Tris-HCl, pH 6,7-6,8 pro, koncentrát, znovuzahuštěním na 500 ml za použití zařízení ' pro ultrafiltraci s tangenciálním průtokem a opakováním tohoto přidávání 5krát. Koncentrovaný/diafiltrovaný přípravek byl nakonec získán v objemu 1000 ml. Postup pro všechny vsádky kondiciovaného media podroSené zahuštění t

a diafiltraci/výměně pufru byl stejný. Koncentrace proteinu ve vsádkách, stanovené metodou podle Bradforda /Anal.

Biochem.72, 248-254 (1976)/ s hovězím sérovým albuminem jako standardem, byly v rozmezí 70-90 /Ug/ml. Celkový objem kondiciovaného media použitého pro tuto přípravu byl asi 589 1.

2.Aniontovýměnná chromatografie ns ^-Sepharose- s rychlým průtokem

Koncentrované/diafiltrované přípravky z každé z pěti vsádek kondiciovaného media uvedené výše byly spojeny (celkový objem 5000 ml), pH bylo upraveno na 6,75 přidáním 1 M HC1. 2000 ml 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 bylo použito pro úpravu vodivosti na asi 0,700 mmho. Přípravek byl aplikován na aniontovýměnnou kolonu Q-Sepharosy s rychlým průtokem (36 x 14 cm, praskvřice Q-Sepharose Fast Flow Pharmacia), která byla ekvilibrována s 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 pufr.. Po aplikaci vzorku byla kolona promyta 28700 ml Tris pufru. Po tomto promýváni byla kolona promyta 23000 ml 5 mM octové kyseliny/1 mM glycin/6 M močovina/20 /UM CuSO^ s pH asi 4,5. kolona byla pak promyta 10 mM Tris-HCl, 20 /um CuSO^, pH 6,7, pufru pro obnovení neutrálního pH a odstranění močoviny, a solným gradientem (0-700 mM NaCl, v 10 mM Tris-HCl, 20 /UM CuSO^, pH 6,7 pufr,· 40 1 objem celkem).

Byly odebírány frakce velikosti asi 490 ml při průtokové rychlosti 3250 ml/h. Chromatogram je uveden na obr.36.

MC/9. cpm udává biologickou aktivitu v MC/9 zkoušce; 5 /ul z každé označené frakce bylo zkoušeno. Eluáty odebrané během aplikace vzorku a promýváné nejsou na obrázku uvedeny, v těchto frakcích nebyla detegována žádná biologická aktivita.

I

3. Chromatografie za použití na silikagelu vázané uhlovo-'· dikové pryskyřice ^rakce 44-66 z pokusu uvedeného na obr. 36 byly spojeny (11200 ml) a byla přidána EDTA do konečné koncentrace 1 mM. Tento materiál byl aplikován průtokovou rychlostí asi 2000 ml/h na kolonu (Vydac Proteins C^, 7x8 cm) ekvilibrovanou pufrem A (10 mM Tris pH 6,7/20 % ethanolu).

Po aplikaci vzorku na kolonu byla kolona promyta 1000 ml puf ru A. Pak byl aplikován lineární gradient od pufru A do pufru B (10 mM Tris pH 6,7/94 % ethanolu)(celkový objem 6000 ml) a byly odebrány frakce 30 až 50 ml. 'Podíly ze startu vzorku na koloně C^, souhrnného poolu a promývacího poolu přidané k 0,5 ml podílům gradientových frakcí byly dialyzovány proti fosfátem pufrovanému salinickému roztoku při přípravě pro biologickou zkoušku. Tyto různé frakce byly zkoušeny.v MC/9 zkoušce (5 yul podíly připravených gradientových frakcí; cpm na obr.37). SDS-PAGE /Laemli, Nátuře 227, 680-685 (1970); zásobní gely obsahují 4 % (hmotn./obj.) akrylamidu a separační gely, obsahují 12,5 % (hmotn./obj.) akrylamidu/ podílů různých frakcí je uvedena na obr. /38. Pro použití na gelu byly vzorky podílů (100 /ul) sušeny za vakua a pak znovu rozpuštěny za použití 20 yul pufru pro zpracování vzorku (redukční,-tj. s 2-merkaptoethanolem) a vařeny 5 min před vložením na gel. číslované značky na levé straně obrázku představují migrační polohy markérů molekulové hmotnosti (redukované) jako na obr.6. Číslované dráhy představují odpovídající frakce Bfkejjrané během aplikace poslední části gradientu. Gely byly vyvolány stříbrem /Morrissey, Anal. Bioch. 117, 307-310(T981)/«,

4. Aniontovýměnné chromatografie 'na Q-Sepharose s rychlým průtokem ^rakce 98-124 z C^ kolony jsou uvedeny na obr.37, tyto byly spojeny (1050 ml). Pool byl zředěn 1:1 10 mM Tris, pH

6,7 pufrem pro snížení koncentrace ethanolu. Zředěný pool ~^uo/A byl pak aplikován na aniontovýměnnou Q-Sepharosovou kolonu ' s rychlým průtokem (3,2 x 3 cm, pryskyřice Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow), která byla ekvilibrována 10 mM Tris-HCl, ^f pH 6,7 pufrem. Rychlost průtoku byla 463 ml/h. Po aplikaci vzorku byla kolona promyta 135 ml kolonového pufru a eluce navázaného materiálu byla provedena promytím 10 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, pH 6,7. Směr průtoku kolonou byl obrácen, ab.y se minimalizoval objem eluovaného materiálu a byly během eluce odebírány frakce 7,8 ml.

5. Sephacryl S-200 HP gelová filtrační chromatografie

Frakceobsahující eluovaný protein z promývání/kolo.nyAanmont&výaaHpáarose ast Flow solí byly spojeny (31 ml).

ml bylo aplikováno na gelovou filtrační kolonu Sephacryl

S-200 HR (Pharmacia) (5 x 55,5 cm) ekvilibrovanou ve fosfátem pufrováném salinickém roztoku. Frakce 6,8 ml byly odebrány při průtokové rychlosti 68 ml/h. Frakce odpovídající píku absorbance při 280 nm byly spojeny a představují finální vyčištěný materiál.

^xabulka^5 představuje souhrn čištění.

Tabulka 1.5

Souhrnný přehled čištění savčího exprimováného krysího SCF¹ ”^{1 62} ' ¹ celkem

Stupen_- _ob.jem(ml) protein(mg) kondicibvané medium

(koncentrované)	7000	28420
Q-Sepharose Fast Flow	11200	974
pryskyřice	1050 ,	19
Q-Sepharose ^ast Flow	31	20
Sephacryl S-200 HR	82	19'

-1 1 ^xStanoveno metodou podle Bradforda (výše, 1976)

Stanoveno jako 47,3 mg kvantitativní aminokyselinovou analýzou za použití metody stejné jak je uvedena v příkladu 2.

N-Koncová aminokyselinová'sekvence čištěného krysího 1 1 62

SCF je přibližně polovina Gln-Glu-Ile... a polovina

PyreGlu-Glu-Ile..., jak bylo stanoveno metodami podle příkladu 2. '‘•'yto výsledky prokazují, že krysí SCF je pro duktem proteolytických štěpení mezi zbytky označovanými jako čísla (-1) (Thr) a (+1)(Gin) na obr.14C. Podobně, čiš i—i 62 těný lidský SCF z kondiciovaného media transfektovaných CHO buněk (níže) měl N-koncovou aminokyselinovou sekvenci Glu-Gly-Ile, indikující, že je produktem štěpení mezi zbytky označenými jako čísla (-1)(Thr) a (+1)(Glu) na obr. 15C.

Za použití výše uvedeného postupu byl získán čištěný lidský SCF protein, bučí rekombinantně vytvořený expresí v CHO buňkách nebo přirozeně získaný.

Další čistící metody, které jsou vhodné pro čištění ze savčích buněk získaného rekombinantního SCF zahrnují · postupy uvedené v příkladu 1 a 10 a další metody zřejmé odborníkům.

Další formy lidského SCF, odpovídající celému nebo části čtecího otevřeného rámečku, kódujícího aminokyseliny 1-248 uvedené na obr.4^^l38dpovídající otevřenému čtecímu rámečku kódujícímu alternativně spojené mRNA, které mohou existovat (jako cDNA sekvence na obr. 44), mohou být také exprimovány v savčích buňkách a získány v čištěné formě postupy podobnými postupům popsaným v tomto příkladu a dalšími postupy zřejmými odborníkům.

-112

G. SDS-PAGE a zpracování glykosidázou

SDS-PAGE spojených frakcí z gelové filtrační kolony Sephacryl S-200 HP je uvedeno na obr. 39. 2,5 /Ul spojené frakce bylo vloženo na gel (dráha 1). Dráha byla vyvolána stříbrem. Markéry molekulové hmotnosti jsou uvedeny na obr.

(dráha 6). Různý materiál migrující po a nad M_p 31000 polohou markéru představuje biologicky aktivní materiál; zře má heterogenita je do značné míry způsobeny heterogenitou při glykosylaci.

Bro charakterizování glykosylace,čištěnýKů materiálů .byl zpracován s různými glykosidézami, analyzován SDS-PAGE (redukční podmínky) a byl vizualizovén postříbřením. Výsledky jsou uve eny na obr.39. Dráha 2 - neuraminidáza.

Dráha 3 - neuraminidáza a O-glykanáza, Dráha 4 -neuraminidéza, O-glykanáza a N-glykanáza. Dráha 5 - neuraminidáza a N-glykanáza. Dráha 7 - N-glykanáza. Dráha 9 -N-glykanáza bez substrátu. Dráha 9 - O-glykanáza bez substrátu.

P.odmínky byly⁷ 1 0 mM 3-/(3-cholamidopropyl)dimethylamonio/1-propansulfonát (CHAPS), 66,6 mM 2-merkaptoethanol, 0,04 % (hmotn./obj.) azid sodný, fosfátem pufrovaný salinický roztok, 30 minut při 37 °C, s následující inkubací při polovině uvedených koncentrací za přítomnosti glykosidáz po 18 h při 37 °C. Neuraminidáza (z Arthrobacter ureafaciens, dodaný Calbiochem) byla použita při konečné koncentraci 0,5 jednotky/ml. O-Glykanáza (Genzyme; endo-alfa-N-acetylgalaktosaminidáza) byla použita v koncentraci 7,5 milijednotek/ml. N-Glykanáza (Genzyme; peptid:N-glykosidáza F; peptid-N^/N-acetyl-beta-glukosaminylJasparaginamidéza) byla použita při koncentraci 10 jednotek/ml.

Kde je to žádoucí, byly provedeny různé kontrolní inkubace. Tyto zahrnují: inkubaci bez glykosidáz, pro ověrepí, ι

-113/ -Mjf že výsledky jsou způsobeny přidanými přípravky glykosidázy; inkubace s glykosylovanými' proteiny (např. glykosylovaný rekombinantní lidský erythropietin) známých jako substráty pro glykosylázy, pro ověření, že použité glykosidá— zové enzymy byly aktivní; a inkubace s glykosidázami, ale bez substrátu, pro posouzení , zda glykosidázové přípravky přispívají nebo zatemňují vizualizaci gelových pruhů (obr. 8 a 9).

řočetná hodnocení je možno provést z výše uvedených v

pokusů. Různá zpracování s N-glykanázou /která odstraňuje jak komplex tak vysoce-manosou N-vázaný karbohydrát /Tarentino a spol., Biochemistry 24, 4665-4671 (1988)/, neuraminiv dázou /která odstraňuje.zbytky sialové kyseliny/, a O-glykanázou /která odstraňuje určité O-vázané karbohydráty (Lambin a spol., Biochem. Soc. Trans. 12, 599-600 (1984)/, potvrzují, že: jsou přítomny jak N-vázaný tak 0-vázaný karbohydrát; je přítomna siaiová kyselina, kde alespoň její část tvoří O-vázané skupiny. Skutečnost, že ošetření N-glykanázou může převést heterogenní materiál podle SDS-PAGE na rychleji migrující formu, která je mnohem více homogenní indikuje, že všechen materiál představuje stejný polypeptid, s heteřogenitou, která je způsobena hlavně hetero¹ . J ♦ gemtou při glykosylaci.

Příklad 12

Příprava rekombinantního SCF^1-164PEG 'Krysí SCF¹”¹⁶⁴, čištěný z rekombinantního E.coli expresního systému podle příkladů 6A a 10, byl použit jako výchozí materiál pro modifikaci s polyethylenglykolem jak je popsáno dále.

Methoxypolyethylenglykol-sukcinimidylsukcinát (18,1 mg ~ 3,63 umol, SS-MPEG = Sigma Chemical Co. č. M3152, přibližná mol. hmotnost = 5000) v 0,327 ml deionizované vody byl přidán ke 13,3 mg (0,727 umol) rekombinantního krysího

-114

SCF¹ 1°4 v i,θ ί3θ mM fosforečnanu sodném, 62 mM NaCl, 0,62 mM octanu sodného, pH 8,0. Výsledný roztok byl šetrně třepán (100 ot.min“^{1 *} ) při teplotě místnosti po 30 minut. 1,0 ml podíly konečné reakční směsi (10 mg proteinu) pak byly aplikovány na felovou filtrační kolonu Pharmacia Súperdex 75 (1,6 x 50 cm) a eluovény 100 mM fosfátem sodným, pH 6,9, při rychlosti 0,25 ml/min při teplotě místnosti, rvních 10 ml z kolony bylo odloženo a pak byly odebírány 1,0 ml frakce. Byla monitorována UV absorbance při 280 nm u eluentu z kolony a tato absorbance je uvedena na obr.40A. Frakce č. 25 až 27 byly spojeny a sterilizovány ultrafiltraci pres 0,2 ^um polysulfonovou membránu (Gelman Sciences č. 4454) a výsledný pool byl označen PEG-25.Podobně byly frakce č. 28 až 32 spojeny, sterilizovány ultrafiltraci a označeny jako PEG-25. Spojené frak-; ce PEG-25 obsahují 3,06 mg proteinu a spojené frakce PEG-32 obsahují 3,55 mg proteinu jak je vypočteno z měření A280 za použití kalibrace dané absorbancí roztoku 1,0 ml/ml nemodifikovaného krysího SCF^{1 1}při 0,66. Nezreagovaný krysí SCF^1-164, představující 11,8 % celkového proteinu v reakční směsi, byl eluovén ve frakcích číslo 34 až 37. Za stejných chromatografických podmínek, byl nemodifikovaný krysí SCF¹“¹64 eluován jako hlavní pík s retenčním objemem

45,6 ml, obr.40B. Frakce č. 77 až 80 na obr.40A, obsahují// N-hydroxysukcinimiď, vedlejší produkt reakce krysího SCF¹“¹⁶⁴ se SS-MPE£.

1 /i

Potenciálně reaktivní aminoskupiny v krysím SCF ⁴ zahrnují 12 lysinových zbytků a alfa-aminoskupinu na N-konci. glutaminového zbytku. Poolované frakce PEG-25 obsahují

9,3 mol reaktivních aminoskupin na mol proteinu, stanoveno spektroskopickou titraci ňrinitrobenzensulfonovou kyselinou (TNBS) za použití metody popsané Habeebem, Anal. Biochem, 14:328-336 (1966). Podobně, spojené frakce PEG-32 obsahují 10,4 mol a nemodifikovaný krysí SCF¹“¹64 obsahuje

13,7 mol reaktivních aminoskupin na mol proteinu. Průměrně 3,3 (13,7 minus 10,4) aminoskupin krysího SCF ve spojené frakci PEG-32 bylo modifikováno reakcí s SS-IvIPEG. Podobně průměrně 4,4 aminoskupiny krysího SCF¹’¹^^ ve spojené frakci PEG-25 byly modifikovány. Lidský SCF (hSQF¹”¹^^) produkovaný jako v příkladu 10 byl také modifikován postupem uvedeným výše. Specificky, 714 mg (38,5 umol) hSCF¹“¹^ reagovalo s 962,5 mg (192,5 umol) SS-MPEG v 75 ml 0,1 Rl pufru-fosforečnanu sodného, pH 8,0 po 30 minut při teplotě místnosti. Reakční směs byla apl-ikována na kolonu Sephacrylu S-200HR (5 x 134 cm) a eluovéno PBS (Gibco Dulbecco fosfátem pufrovaný salinický roztok bez CaCl₂ a MgCl₂) rychlostí 102 ml/h, a byly odebírány frakce 14,3 ml. Frakce č. 39-53 analogické PEG-25 poolu popsanému výše a na obr. 40A, byly spojeny a bylo zjištěno, že obsahují celkem 354 mg proteinu. Aktivita in vivo takto modifikovaného SCF u primátů je popsána v příkladu 8C.

Příklad 13

Exprese receptoru SCF na leukemických blastech

Leukoblasty byly získány z periferní krve pacienta se smíšenou leukémií. Buňky byly čištěny odstředovéním gradientovou hustotou a potlačením adh.eze. Lidský SCF¹“¹^^ . byl jodován podle popisu uvedeného v příkladu 7. Buňky byly inkubovány s různými koncentracemi jodovaného SCF jak bylo popsáno /Broudy, 75 1622-1626 (1990)/. Výsledky pokusu vazby receptoru jsou uvedeny na obr. 41. Hustota receptoru je přibližně 70000 receptorů/buňka.

Příklad 14

Aktivita krysího SCF na ranných lýmfoidních prekursorech

Schopnost rekombinantního krysího SCF¹”¹°^ (rrSCF¹^^), působit synergicky s IL-7 pro zvýšení proliferace lymfoidních buněk byla studována na . agarových kulturách myší kostní dřeně. V této zkoušce kolonie vytvořené se samotným#

řrSCF^{1 1}^⁴ obsahují monocyty, neuřofily a blastové buňky, zatímco kolonie stimulované samotným IL-7 nebo v kombinaci

1—164 . v v s rrSCF obsahují převážně pre-B buňky. Pre-B buňky, • > “I ** t*^- charakterizované jako B220 , slg , C/U , byly identifikovány FACS analýzou spojených' buněk za použití fluorescenčsě značených protilátek k B220 antigenu /Coffman, ImmUnol. Rev., 69, 5 (1982)/ a k povrchovému lg (FITC-kozí anti-K, Southern Biotechnology Assoc., Birningham,AL) a analýzou cytospinových sklíček pro cytoplasmickou /u expresi za použití fluorescenčně značených protilátek (TRITC-kozí antiku, Southern Biotechnology Assoc.). Rekombinantní lidský IL-7 (rhIL-7) byl získán od Biosource Tnternational (Westlake Village, CA). Když byl přidán rrSCF¹~¹^4 ₇ kombinaci s pre-B faktorem růstu buněk IL-7, byi>pozorováno synergické zvýšení tvorby kolonií (tabulka 16), indikující stimulující roli rrSCF ” ⁴ na časných B buněčných progenitorech.

Tabulka 16 . .

1 fi 4

Stimulace tvorby kolonií Pre-B buněk pomocí rrSCF “ ⁴ v kombinaci s hIL-7

Růstové faktory salinický roztok rrSCF¹·¹⁶⁴ 200 ng

100 ng 50 ng 200 ng 100 ng 50 ng 25 ng počet kolonií¹ 0

13+2

7+4 + 2 21+6 18+6 13 + 6 + 2 rhIL-7·

Tabulka 16 (pokračování)

rhIL-7 200	ng	+ rrSCF1“164	200	ng	60	+	0
100	ng	+	200	ng	48	+	8
50	ng	+	200	ng	24	+	10
25	ng	+	20 0	ng	21	+	2

¹ Počet kolonií na 5 x 10⁴ buněk myší kostní dřeně, které byly umístěny na plotnu.

V

Každá hodnota je průměr ze tří ploten + stád.odchylka.

Příklad 15 identifikace receptoru pro SCF

A. c-kit je receptorem pro SCF^1-164

Pro testování, zda SCF^1-164 je ligandem pro c-kit, byla cDNA pro celý myší c-kit /Qiu a spol., EMBO J., 7, 10031011 (1988)/ byla amplifikována za použití PCR z SCF^1-164 citlivé mast cell, linie..MC/9 /Nabel a spol., Nátuře, 291, 332-334 (1981)/ s primery podle publikované sekvence. Ligand vazby a transmembránové domény lidského c-kitu, kódovaného aminokyselinami 1-549 /Yarden a.spol., EMBO J., 6, 3341-3351 (1987)/, byly klonovány za použití stejných technik z lidské erythroleukemické buněčné linie, HEL /Martin a Papayannopoulou, Science, 216, 1233-1235 (1982)/. cDNA c-kitu byly inzertovány do savčího expresního vektoru V19.8 transfektovaného do COS-1 buněk a membránových frakcí připravených pro vazbovou zkoušku použitím buč krysího nebo lidského ¹²⁵I-SCF¹⁶⁴ podle metod popsaných v sekci B a C dále. Tabulka 17 představuje údaje z typické vazbové zkoušky. Nejsou zde specifické vazby ¹²⁵I lidského SCF^1-164 na COS-1 buňky transfektované samotným V19.8. Nicméně COS-1 buňky exprimující lidský rekombinantní c-kit ligandové vazby p^-Ůs transmembránové domény (hfekit-LTl) vázaly ²⁵I-hSCF^{1 164} (tabulka 17)· Přídavek 200 násobku molárního přebytku neznačeného lidského SCF¹”¹⁶⁴ snižuje vazbu na zá-119 kladní úroveň. Podobně COS-1 buňky transfektované plnou délkou myšího c-kitu (mckit-Ll) vážou krysí ¹²^I-SCF¹”¹64, Malé množství vazby krysího ¹²^I-SCF¹”¹64 bylo detegováno v COS-1 buňkách transfektovaných samotným V19.8 a bylo, také pozorováno v netransfektovaných buňkách (neznázorněno), což indikuje, že COS-1 buňky exprimují endogenní c-kit.

Toto zjištění je v souladu se širokou molekulární distribucí exprese c-kitu. Krysí ¹I-SCF¹“¹se váže stejně jak k lidskému tak myšímu c-kitu,- zatímco lidský ¹²^I-SCF¹”¹ se váže s nižší aktivitou k myšímu c-kitu (tabulka 17).

Tyto údaje jsou v souladu s modelem křížové reaktivity SCF^{1 1}64 mezí druhy. Krysí SCF¹”¹⁰^ indukuje proliferaci lidské kostní dřeně se specifickou aktivitou stejně jako lidský SCF^{1 1}64zatímco lidský SCF¹”¹ 64 indukuje proliferaci myších mast buněk se specifickou aktivitou 800 krát nižší než krysí protein.

Souhrnně jsou tyto údaje v souladu s tím, že fenotypové abnormality exprimované W nebo S1 mutantní myší jsou následkem primárních defektů v c-kitu interakcí receptor/ ligand, které jsou kritické pro vývoj různých typů buněk.

Tabulka 17

SCF ” vazba k rekombinantnímu c-kitu exprimovanému v COS-1 buňkách

CPM vazba^a

Transfektcvaný lidský SCF¹“¹64 krásí SCF¹“¹64 plasmid ¹²⁵I-SCF^{b 125}I-SCF+nezn.^{c 125}I-SCF^{d 125}I-SCF+ e

nezn.

V19.8	2,160	2	,150	1,100	550
V19.8:hckit-LT1	59,350	2	,380	• 70,000	1,100
V19.8:mckit-L1	9500	1	,100	52,700	600

^aDe uveden průměr ze dvou měřeníj pokus byl proveden nezávisle se stejnými výsledky třikrát.

^b1,6nM lidský ¹²⁵I-SCF¹”¹⁶⁴ _ c

-1 20

^C1,6 nM lidský ^1?5I-SCF^1_164 + 320 nM neznačený lidský SCF^{1-164 d}1,6 nM krysí ¹²⁵I-SCF^{] 164 e}1,6 nM krysí ¹I-SCF^1_1^⁴ + 320 nM neznačený krysí SCF^{1 1} ^⁴

B. Exprese rekombinantního c-kitu v COS-1 buňkách

Klony lidské a myší c-kitové cDNA byly získány použitím PCR technik /Saiki a spol., Science, 239, 487-491 (1988)/ z celkové RNA izolované postupem kyselé fenol/chloroformové extrakce /Chomczynsky a Sacchi, Anal. Biochem., 162, 156-159 (1987)/ z lidské erythroleukemické buněčné linie HEL a MC/9 buněk, nikátní sekvence oligonukleotidu byly nacrženy z publikovaných lidských a myších c-kitových sekvencí. První řetězec cDNA byl syntetizován z celkové RNA podle protokolů získaného s enzymem, Mo-MLV reverzní transkripce (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD), za použití opačných c-kitových oligonukleotidů jako primerů. Amplifikace přesahujících oblastí c-kitové ligandové vazby a domén tyrosin kinázy byla provedena za použití vhodných párů c-kitových primerů. ^Ayto oblasti byly klonovány do savčího expresního vektoru V19.8 (obr. 17) pro expresi v COS-1 buňkách. DNA sekvenování některých klonů odhaluje nezávislé mutace,převážně vzniklých během PCR amplifikace, v každém klonu. Klon prostý těchto mutací byl konstruován znovusestavením. mutací prostých restrikčních fragmentů ze separátních klonů. Určité odchylky od publikovaných sekvencích se objevily ve všech nebo v asi polovině klonů; tyto byly považovány za aktuální sekvence přítomné v použité buněčné linii a mohou představovat alelové diference publikovaných sekvencí. Ve V19.8 byly konstruovány následující plasmidy: V19.8:mckit-LT1, celý myší c-kit; a V19.8: kckit-L1, obsahující ligandovou vazbu plus transmembránovou oblast (aminokyseliny 1-549) lidského c-kitu.

-'2Z

Plasmidy byly transfektovány do COS-1 buněk v podstatě stejně jak je popsáno v příkladu 4.

C. ¹^^I-SCF^{1 1}64 bazba k COS-1 buňkám exprimujícím rekombinantní c-kit

Dva dny po transfekcí, COS-1 buňky byly seškrábnuty z misky, promyty v PSS a zmrazený do použití. Po roztáni byly buňky re suspendovány v 10 mM/Tris-HCl, 1 mM MgCl^ obsahující 1 mM PMSF, 100 ^ug/ml aprotinin, 15 /Ug/ml leupeptin, 2 yug/ml pepstatin a 200 yUg/ml TLCK-HC1. Suspenze byla dispergována nasátím a vypuštěním z pipety pětkrát, inkubována na ledu 15 minut a buňky byly homogenizovaný 1520 nárazy Dounce homogenizeru. Sacharoza (250 mM) byla přidána k homogenátu a jaderné frakce a zbylé nerozruŠené buňky byly peletovény odstředěním při 500 x g po dobu 5 minut. Supernatant byl odstředěn při 25000 g po 30 minut při 4 °C pro» peletování zbylých buněčných kusů. Lidský a krysí SCF¹ ^64 byly označeny radioaktivním jodem za použití chloraminu-T /Hunter a Greenwood, Nátuře, 194, 495-496 (1962)/ COS-1 membránové frakce byly inkubovány buď s lidským nebo krysím ¹ ^^I-SCF¹~¹(1,6 nM) s nebo bez 200 násobného přebytku neznačeného SCF^{1 1}ve vázacím pufru, obsahujícím RPMI doplněný 1 % hovězího sérového albuminu a 50 mM HEPES (pH 7,4) po'1 hodinu při 22 °C. Při ukončení inkubace vazby, býly membránové přípravky šetrně rozvrstveny na 150 y-ul ftalátového oleje a odstřeďovány pó 20 minut v Beckman * 125 1 Ť 6

Microfuge 11 pro oddělení membránově vázaného ^?I-SCF ~ ⁴ od volného ¹ ^^I-SCF¹”¹Pelety byly odděleny a membránově napojený ¹ ^^I-SCF^1-1byl kvantifikován.

Příklad 16

A. Izolace cDNA lidského SCF

Celková RNA byla izolována z lidské fibrosarkomóvé bu-. něčné linie HT-1080 (ATCC CCL 121) metodou extrakce za pomoci směsi· kyselý guanidiniumthiokyanát-fenol-chlOroform

/Chomczynski a spol., Anal. Biochem. 162, 156 (1987)/, a póly(A) RNÁ byla získány za použití oligo(dT) kolony získané' od Clontech. Dvqjřetězcová cDNA byla připravena z 2 ^ug póly(A) RNA s BRL (Bethesda E_esea_rch Laboratory) cDNA syntézním kitem za podmínek doporučených dodavatelem. Přibližně 100 ng na koloně dělené dvojřetězcová cDNA s průměrnou velikostí 2kb bylo ligováno k 300 ng Sall/Notl štěpeného vektoru pSPORT Ό/D^Alessio a spol., Focus, 12, 47-50(1990)/ a transformováno do DH5 (BRL, Bethesda, MD) buněk elektroporací /Dower a spol., Nucl. Ácids Res., 16, 6127-6145 (1988)/.

i

B. Screening cDNA knihovny

Přibližně 2,2 x 10^ primárních transformantů bylo rozděleno do 44 poolů, každý o obsahu 5000 individuálních klonů. PlasmiSXÉNA byla připravera z každého poolíi ÓTAB-DNA srážecí metodou jak je popsána /Del Sal a spol., Biotechniques, 7, 514-519 (1989)/» Dva mikrogramy každého poolu plasmidové DNA byly štěpeny restrikčním enzymem-Notl a odděleny gelovou elektroforézou. Linearizovaná DMA byla transferovány na GeneScreen Plus membránu (DuPont) a hybridizována s P-značenou PCR generovanou lidskou SCF cDNA (příklad 3) za podmínek popsaných dříve /Lin a spol., Proč.Nati, Acad.Sci.USA, 82, 7580-7584 (1985)/. Tři pooly, obsahující pozitivní signál byly identifikovány z hybridizace. '/yto pooly kolonií byly rescreenovány hybridizačním koloniovým postupem /Lin a spol., Gene 44, 201-209 (1986)/ až byla z každého poolu získána jedna kolonie. Velikost cDNA těchto tří izolovaných klonů byla mezi 5,0 až 5,4 kb. Štěpení restrikčními enzymy a stanovení nukleotidové sekvence na 5* konci indikují, že dva z těchto tří klonů jsou identické (10—1a a 21-7a). Oba obsahují kódující oblast a přibližně 200 bp 5^f netranslatoyané oblasti (5^#UTR). Třetí klon (261a) je zhruba?400 bp křaů&ý na 5*konci než druhé dva klony. Sekvence cDNA lidského SCF je uvedena na “obr. 42» Zvláště podrobně zaznamenána je hydrofobní transmembránové domě-12/ 7 fy nové sekvence začínající v oblasti aminokyselin 186-190 a končící u aminokyseliny 212. ¹

C. Konstrukce pDSRo<2 hSCF¹“²⁴⁸ pDSR<^ 2 hSCF^{1 248} byl generován za použití plasmidů 10-1 a (jak je popsáno v příkladu 1 6B) a pGEM3 hSCF¹“¹⁸⁴ následovně: HindlII inzert z pGEM3 hSCF^{1 184} byl transferován do M13pm18. Nukleotidy bezprostředně v protisměru k ATG iniciačnímu kodonu byly vyměněny místně řízenou mutagenezí z tttccttATG na gccgccgccATG za použití opačného oligonukleotidu

5*-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GGT T 3 ' a oligonukleotidam rízenýh in vitro kitovým mutagenezním systémem a protokoly Amersham Gorp. pro generování M13mp18 hSCF^l ^⁴. Tato DNA byla štěpena HindlII a ipzertovéna do pDSR«A2, který byl štěpen HindlII. Tento klon je označen pDSRe<2 hSCF¹^^{1 164}. DNA z pDSRtX 2 hSCř^¹“¹⁶⁴ byl štěpen Xbal a DNA byla opatřena tupými konci přidáním Klenowova enzymu a čtyř dNTP. Po ukončení této reakce byla DNA dále štěpena enzymem Spěl. Klon 10-1 a byl štěpen pomocí Dral pro vytvoření tupého konce 3' pro otevřený čtecí rámeček v inzertu a pomocí Spěl, který štěpí na stejném místě v genu jak v pDSR ^2 hSCF^^{7 1}°⁴ a 10—la. Tyto DNA byly spoluečně spojeny za vzniku pDSR<2 hSCF^K1~²⁴⁸.

D. Transfekce a imunoprecipitáce COS buněk s pDSRo<2 hSCF^⁷“²⁴⁸ DNA.

C03-7 (ATCC CRL 1651) buňky byly transfektovány s DNA konstruovanou výše popsaným způsobem. 4x10⁸ buněk v 0,8 ml DMEM + 5% FBS bylo elektroporováno při 1600 V bud 10 ^ug pDSRo\2 hSCF^K1-248 DNA nebo 10 yUg pDSR 2 vektorové DNA (vektorová kontrola).T'o elektroporaci byly buňky umístěny

do dvou 60mm misek. Po 24 hodinách bylo medium nahrazeno čerstvým kompletním mediem.

. 35 h po transfekci byla každé miska označena Smediem podle modifikace protokolu Yardena a spol. (PNAS 87, 2569-2573, 1990). Buňky byly promyty jednou PBS a pak inkubovány s DMEM prostým methioninu, prostým cysteinu (met”cys”DMEM) po 30 minut. Medium bylo odstraněno a ke každé misce byl přidán 1 ml met~cys”DMEIú, obsahující'

100 yuGi/ml Tran S-značeného(ICN). Buňky byly inkubovány při 37 °C po 8 hodin. Medium bylo odebráno, vyčiřeno odstředění, pro odstranění zlomků buněk a zmraženo na -20 °C.

<

Podíly .značeného kondiciovaného media z COS/pDSR 2 hSCF^’²⁴® a COS/pDSR«12 vektorové kontroly byly imunoprecipitovény spolu se vzorky media z ^j:?S-značeného CHO/pDSR⁰^ hSCF^1-164 ^i_onu i? buněk (viz příklad 5) v souladu s modifikací protokolu Yardena a spol.(EMBO,J.,·6, 3341-3351, 1987). Jeden ml každého'vzorku kondiciovaného media byl zpracován s 10 /ul pre-imunního králičího sera (č.1379 Ρ» » Λ

I.). Vzorky byly inkubovány po 5 hodin při 4 C. Sto mikrolitrů 10% suspenze Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem.) v 0,15 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,2 % Triton-/ X-100 bylo přidáno kekažbé zkumavce. Vzorky byly inkubovány další jednu hodinu při 4 °C. Imunní komplexy byly peletovány odstředěním při 13000 x g po 5 minut. Supernatanty byly trasferovány do nových zkumavek a inkubovány' s 5 /Ul králičího polyklonálního antiséra (č.1381 TB4), čiš/ iro těného jako v příkladu 1, proti hSCF z CHO přes noc při °C. 100 /ul Pansorbinú bylo přidáváno po 1 hodinu a imunní komplexy bylá peletovány jako dříve. Pelety byly promyty 1x pufrem pro lýzi (0,5% N-deoxycholát, 0,5% NP-40, mM NaCl. 25 mM Tris pH 8), 3x promývacím pufrem (0,5 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,2% Triton X-100) a 1x 20 mM

-125/4^

Tris ρΗ 7,5. Pelety byly resuspendovány v 50 /Ul 10 mM iris pH 7,5, 0,1% SDS, 0,1 Μ β-merkaptoethanolu. SCF protein byl eluován varem po 5 min. Vzorky byly odstředěny při 13000 x g po 5 minut a supernatanty byly odstraněny.

Ošetření glykosidázami bylo provedeno následovně: tři mikrolitry 75 mM CHAPS,' obsahujícího 1,6 mU O-glykanázy, 0,5 U N-glykanázy a 0,02 U neuraminidázy byly přidány ke 25 /Ul imunního komplexu a inkubováno bylo po 3 hodiny při 37 °C. Byl přidán stejný objem 2xPAGE vzorkového pufru a vzorky byly povařeny 3 minuty. Štěpené a neštěpené vzorky byly zpracovány elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém redukčním gelu přes noc při 8 mA. Gel byl fixován v methanolu-kyselině octové, zpracován s NEN po 30 minut, sušen a exponován při -70,°C na film Kodak XAR-5.

Obrázek 43 představuje autoradiograf výsledků. Dráhy 1 a 2 jsou vzorky z kontrolních COS/pDSIM2 kultur, dráhy 3 a 4 z COS/pSR^2hSCF^{K1 248}, dráhy 5 a 6 z CH0/pDSR’<2 hSCF^{1 184}. Dráhy 1,3 a 5 jsou neštěpené imunní sraženiny, dráhy 2,4 a 6 byly štěpeny glykanázami jak je popsáno výše. Polohy markérů molekulové hmotnosti jsou označeny na levo. Příprava SCF v COS transfektovaných ,pDSRe<2 hSCF^K'¹'’”²⁴⁸ je v souladu s hSCF¹”¹⁸⁴ sekretovaným CHO transfektovanými pDS.R 2 hSCF^1-184 (příklad 11). Tato skutečnost silně naznačuje, že přirozené prote,olytické místo uvolňující SCF z buňky je v sousedství aminokyseliny 164.

Příklad 17 Kvarterní strukturní analýza lidského SCF

Při kalibraci gelové filtrační kolony (ACA 54) popsané v příkladu 1 pro čištění SCF z BRL buněčného media se standardy molekulové hmotnosti, a při eluci čištěného SCF z jiných kalibrovaných gelových filtračních kolon je zřejmé, že SCF čištěný z BRL buněčného media se projevuje ze zřejmou molekulovou hmotností přibližně 70000 až 90000

-1 26^ vztaženo k molekulovým hmotnostem stamdardů. V protikladu k tomu je zřejmá molekulová hmotnost podle SDS-PAGE přibližně 28000-35000. i když je zjištěno, že glykosylované proteiny se mohou chovat v takových analýzách anomálně, výs ledky potvrzují, že krysí SCF odvozený z BRL může existovat jako nekovalentně asociovaný dimer za nedenaturačníct} podmínek. Podobné výsledky platí pro rekombinantní

SCF formy (např. krysí a lidský SCF¹”¹⁵⁴ získaný z E.coli, _ 1 krysí a lidský SCF získaný z CHO buněk), u kterých velikost molekuly stanovená gelovou filtrací za nedenaturačních podmínek je přibližně dvakrát větší než stanovená gelovou filtrací za denaturačních podmínek (tj. za přítomnosti SDS), nebo pomocí SDS-PAGE, v každém jednotlivém případě. Dále sedimentační rychlostní analýza, která poskytuje přesně stanovení molekulové hmotnosti v roztoku, poskytuje hodnotu asi 36000 pro molekulovou hmotnost rekombinantního lidského SCF^{1 154} získaného z E. coli.

Tato hodnota je opět přibližně dvojnásobná než poskytnutá z SDS-PAGE ( 18000-19000). Proto, i když je možno připustit, že mohou existovat násobné oligomerní stavy (včetně monomerního stavu), je zřejmé, že dimerní stav v roztoku za určitých okolností převládá.'

Příklad 18

Izolace klonů cDNA lidského SCF z buněčné linie 5637

A. Konstrukce 5637 cDNA knihovny

Celková PNA izolovaná z lidské krevní karcinomové buněčné linie 5637 (ATCC HTB-9) extrakční·metodou, využívající kyselý guanidiniumthiokyanát-fenol-chloroform (Chomczynki a spol., Anal.Biochem, 162,· 156 (1987)) a póly(A) PNA byla získána za použití oligo(dT) kolony získané od Clontech. Dvojřetězcová cDNA byla připravena ze 2 ^ug póly(A) RNA s BRL cDNA syntézním kitem za podmínek doporučených dodavatelem, Přibližně 80 ng na koloně frakcionované dvouuřetězcové cDNA s průměrnou velikostí 2 kb bylo ligováno ke 300 ng Sall/Notl štěpeného vektoru pSPORT 1 /Q^zAlessio a spol., Focus, 12, '47-50 (1990)/ a transfor-r mováno do DH5o< buněk elektroporací /Dower a spol., Nucl.Acmds Res., 16, 6127-6145 /1988)/.

B. Screeníng cDNA knihovny

Přibližně 1,5 x 10^ primárních transformantů bylo rozděleno do 30 poolů, kde každý přibližně obsahoval 5000 individuálních klonů. Plasmidová DNA byla připravena z každého poolu CTAB-DNA srážením, které je popsáno /Del Sal a spol., Biotechniques, 7, 514-519 (1989)/. Dva mikrográmy každé plasmidová DNA z poolu byly štěpeny restrikčním enzymem Notl a s.eparovány gelovou elektroforézou. Linearizovaná DN4í byla transferována na GeneScreen Plus membránu (DuPont} a hybridizována ^J P-znaSenou cDNA celé délky lids kého SCF izolovanou z HT1080 buněčné linie (příklad 16) za již popsaných podmínek (Lin a spol., Proč.Nati. Acad.Sci. USA, 82, 7580-7584 (1985)/. Hybridizací bylo identifikováno sedm poolů, obsahujících pozitivní signál. Pooly kolónií byly rescreenovány P značenou PCR získanou cDNA lidského SCF (příklad 3) postupem hybridizace kolonií (Lin a spol., Gene, 44, 201-209 (1986)/ dokud nebyla získána jedna kolonie ze čtyř poolů. Velikosti inzertu ze čtyř izolovaných klonů jsou přibližně 5,3 kb. Štěpení restrikčním enzymem a nukleotidová analýza 5 '-konce klonů prokazuje, že čtyři klony jsou identické» Sekvence této lidské cDNA je uvedena na obr.44. cDNA na obr.44 kóduje polypeptid, ve kterém aminokyseliny 149-177 sekvence na.obr.

jsou nahrazeny jediným Gly zbytkem.

Příklad 19

Vliv SCF na přežití po letální iradiaci

A.^činek in vivo SCF na přežití po letální iradiaci

Vliv SCF na přežití myši po letální iradiaci byl těsto

I ván. Použité myši byly 10 až 12 týdný staré samice Balb/c.

Byly použity skupiny 5 myší ve všech pokusech a myši byly před každým pokusem zváženy. Myši byly ozářeny 850 rad nebo 950 rad v jedné dávce. Myším byly injektovány samotné .faktory nebo faktory plus normální Balb/c buňky kostní dřeně. V prvním případě byly myši injikovény intravenozně 24 hodin po ozáření krysám PEG-SCF^1_164 (20/Ug/kg), čištěným z E.coli a modifikovaným přídavkem polyethylenglykolu jako v příkladu 12, nebo salinickým roztokem u kontrolních zvířat. Pro transplantační model byly myši injikovány i.v. různými dávkami buněk normální Balb/c kostní dřeně 4 hodiny po ozáření. Ošetření s krysím PEGSCF^{1 1}64 bylo provedeno přidáním 200 ^ug/kg krysího PEG-SCF¹ £ suspenzi buněk 1 hodinu před injekcí a a podáno jako jednotlivá i.v. injekce faktoru plus buněk.

Po ozáření při 850 rad, byly myši injikovány krysím PEG-SGF nebo salinickým roztokem. Výsledky jsou uvedeny na obr. 45. Injekce krysího PEG-SCF¹ ”¹ ^4 výrazně zvyšuje dobu přežití myší ve srovnání s kontrolními zvířaty (p 0,,0001 ). Myši injikované salinickým roztokem přežívají průměrně 7,7 dne, zatímco krysím PEG-SCF¹“¹°4 ošetřené myši přežívají v průměru 9,4 dne (obr.45). Výsledky uvedené na obr. 45 představují souhrn ze 4 oddělených pokusů se 30 myšmi v každé ošetřované^skupině.

Zvýšení přežití myší ošetřených s krysím PEG-SCF¹”¹ ^4 potvrzuje účinek SCF na buňky kostní dřeně u ozářených zvířat. Předběžná studie hematologických parametrů těchto zvířat ukazuje slabá zvýšení hladin destiček ve srovnání s kontrolními zvířaty 5 dnů po ozáření, nicméně 7 dnů po ozáření nejsou hladiny destiček výrazně rozdílné od kontrolních zvířat. Nebyly detegovány žádné rozdíly v RBC nebo WBC hladinách nebo buněčné stavbě kostní dřeně.

¹²^/ //

B. Přežití transplantovaných myší ošetřených SCF buněk

Dávky 10%/kosthí dřeně femuru normálních Balb/c myší transplantované dó myší ozářených při 850 rad mohou zachránit 90 % nebo více zvířat (data nejsou uvedena). Proto byla použita dávka ozáření 850 rad s transplantační dávkou 5 % femuru ke studiu účinků krysího PEG-SCF¹~¹^4 na přežití. Při této buněčné dávce bylo předpokládáno, že velké procento myší,které nedostanou SCF nepřežije; v případě, že krysí PEG-SCF^1-1^4 _mohx stimulovat transplantované buňky přežirí by se mohlo zvýšit. ^dak je. uvedeno na obr. 46, přibližně 30 % kontrolních myší přežívalo 8 dní po ozáření. Ošetření krysím PEG-SCF¹”¹^4 mělo za následek výrazné zvýšení přežití s více než 90 % myší, které přežívají více než 30 dní (obr. 46). Výsledky uvedené na obr. 46 představují kompilaci výsledků ze 4 separátních pokusů, kde bylo použito 20 myší jak u kontrolních myší tak u myší ošetřených krysím PEG-SCF¹ ^ři vyšších dávkách ozáření, ošetření myší krysím PEGSCF “ ⁴ v souvislosti s transplantací dřeně také vede ke zvýšenému přežívání zvířat (obr. 47). Kontrolní myši ozářené 950 rad a s transplantací 10 % femuru uhynuly 8 den, zatímco přibližně 40 % myší ošetřených krysím PEGSCF^1-1^4 přežívalo 20 dní nebo déle. 20 % kontrolních myší s transplantovanými 20 % femuru přežíval© po 20 dní, při ošetření rSCF přežívalo 80 % pokusných zvířat (obr. 47). ·

Příklad 20 ffvorba monoklonálních protilátek vůči SCF týdnů staré samice BALB/c myší (Charles River, Wilmington, MA) byly subkutánně injektovány 20 ^ug lidského

SCF^{1 1}64 _eXp_rikovaného v E.coli v kompletním Freudově adju /

-U0-

vans (H37-Ra; Difco Laboratories, Detroit, MI). Další imunizace 50 ^ug stejného antigenu v nekompletním Freudově adjuvantu byly následně podány 14., 38. a 57.den. Tři dny po poslední injekci byly 2 myši usmrceny a jejich slezinné v

buňky fúzovány se sp 2/0 myelomovou linií postupem popsaným Nowinskim a spol., (Virology 93, 111-116(1979)).

Medium použité pro buněčnou kulturu sp 2/0 a hybridomy bylo Dulbecco modifikované Eaglovo medium (DMEM), (Gib co, Chagrin Falls, Ohio) doplněné 20 % teplem inaktivováného fetálního hovězího sera (Phibro Chem., Fort Lee, NJ), 110 mg/ml pyruvét sodný, -100 U/ml penicilín a 100 mcg/ml streptomycin (Gibco). Po buněčné fúzi byly hybridomy selektovány v HAT mediu, obsahujícím 10“Sl hypoxanthinu,

4x10 aminopterinu a 1,6x10 M thymidinu, po dobu dvou týdnů, pak kultivovány v mediu, obsahujícím hypocanthin a thymidin po dva týdny.

Hybridomy byly screenovány následovně: polystyrénové jamky (Costar, Cambridge, MA) byly senzitizovány 0,25 /Ug lidského SCF¹’^-184 (E.coli) v 50 /Ul 50 mM hydrogenuhličitanového pufru pH 9,2 po dvě hodiny při teplotě místnosti, pak přes noc při 4 °C. Plotny pak byly blokovány 5% BSA v PBS po 30 minut při teplotě místnosti, pak inkubovány se supernatantem hybridomové kultury po jednu hodinu při 37 °C. Roztok byl dekantovén a navázané protilátky inkubovány s 1:500 ředěním kozí-anti-myšího IgG konjugovaného s křenovou peroxidézou (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) po jednu hodinu při 37 °C. Plotny byly promyty promývacím roztokem (KPL, Gaithersburg, MD),pak vyvíjeny se směsí H2O2 a ABTS (KEE). Kolorimetrie byla provedena při 405 nm.

Kultury hybridomových buněk sekretujících protilátku specifickou pro lidský SCF¹“¹^⁴ (E.coli) byly testovány \

-131ELISA, jakož i postupy screeningu hybridomu, na křížové reaktivity k lidskému SCF (CHO). Hybridomy. byly subklonovány limitní ředící metodou. 55 jamek hybridomového supernatantu je v testu silně pozitivní k lidskému SCF' (E.coli); 9 z nich je křížově reaktivních k lidskému SCF^1_162(CHO).

Některé hybridomové buňky byly klonovány následovně:

Monoklonální IgG isotyp reaktivita k lidskému SCF^{1 _162}(CHO)

4G1 2-13	IgG1	ne
6C9A	IgG1	ne
8H7A	IgG1	ano

Hybridomy 4G12-13 a 8H?A byly uloženy v ATCC 26. září 1990.

I když předložený vynález byl popsán výhodnými provedeními, je nutno upozornit, že odborníkům budou zřejmé další modifikace a variace tohoto provedení. Předložené nároky pokrývají všechny takové možné variace, které spadají do rozsahu předloženého vynálezu.

Claims (26)

1. Čištěný a izolovaný polypeptid mající celou nebo částečnou primární strukturu sekvence uvedené na obr. 15C, popřípadě s methioninovým zbytkem na N-konci, vykazující hematopo/etickou biologickou vlastnost přirozeně se vyskytujícího faktoru kmenových buněk.

2. Čištěný a izolovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1-183, jak je uvedena obr. 15C, popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci.

3. Čištěný a izolovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1-165, jak je uvedena na obr. 15C, popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci.

4. Čištěný a izolovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1-164, jak je uvedena na obr. 15C, popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci.

5. Čištěný a izolovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující aminokyselinovou sekvenci 1-162, jak je uvedena na obr. 15C, popřípadě s dalším methioninovým zbytkem na N-konci.

6. Čištěný a izolovaný polypeptid podle nároku 1, vykazující hepatopojfetickou aktivitu stimulace růstu raných hematopoietických progenitorových buněk.

7. Čištěný a izolovaný polypeptid podle nároku 1, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, zahrnující následující sekvence vzhledem k aminokyselinové sekvenci uvedené na obr. 15C: 1-178, 1-173, 1-168, 1-166, 1-163, 1-161, 1-159, 1-158, 1-157, 1-148 a 1-145.

8. Čištěný a izolovaný polypeptid podle nároku 7, obsahující další methioninový zbytek na N-konci.

9. DNA sekvence pro použití v expresi polypeptidového produktu podle kteréhokoliv z předchozích nároků v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce, kde uvedená DNA sekvence je vybrána z:

(a) DNA sekvencí uvedených na obrázku 15C nebo jejich komplementárních řetězců, (b) DNA sekvencí, které za stringentních podmínek hybridi zují k DNA sekvencím definovaným pod (a) nebo jejich fragmentů a (c) DNA sekvencí, které nebýt degenerace genetického kódu by hybridizovaly k DNA sekvencím definovaným v (a) a (b), přičemž tyto sekvence kódují polypeptid, mající stejnou aminokyselinovou sekvenci.

10. DNA sekvence podle nároku 9 zahrnující jeden nebo více kodonů preferovaných pro expresi v ne-savčích buňkách.

11. DNA sekvence podle nároku 9 obsahující jeden nebo více kodonů preferovaných pro expresi v E.coli buňkách.

12. DNA sekvence podle nároku 9 obsahující jeden nebo více kodonů preferovaných pro expresi v kvasinkových buňkách.

-

13X13. DNA sekvence podle nároku 9, která kóduje expresi lidského faktoru kmenových buněk.

14. DNA sekvence podle kteréhokoliv z nároků 9 až 13, která kóduje expresi methionylového zbytku na N-terminální poloze maturované verze uvedeného polypeptidu.

15. DNA sekvence podle kteréhokoliv z nároků 9 až 13, kovalentně spojená s de testovatelným značením.

16. DNA sekvence podle nároku 15, kde značení je radioaktivní značení.

17. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící se t í m, že obsahuje účinné množství polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič.

18. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro výrobu léčiva pro hematopo/etickou terapii savce.

19. Použití podle nároku 18 pro výrobu léčiva pro léčbu leukopenie, léčbu trombocytopenie, léčbu anemie, zvýšení příjmu transplantátu kostní dřeně, zvýšení obnovy kostní dřeně při léčbě ozařováním, chemicky nebo chemoterapeuticky indukované aplasii kostní dřeně nebo myelosupresi a pro zvyšování citlivosti buněk k chemoterapii.

20. Použití podle nároku 18 pro výrobu léčiva pro zvýšení počtu buněk schopných transplantace po aspiraci kostní dřeně nebo periferální krevní leukoferesi.

21. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro výrobu léčiva pro léčení AIDS, myelofibrosis, myelosklerosy, osteoporosy, metastatického karcinomu, akutní leukemie,mnohotného myelomu, Hodgkinovy choroby lymfomu, Gaucherovy choroby, Niemann-Pickovy choroby, Letterer-Siwovy choroby, odolné erythroblastické anemie, Di Guglielmova syndromu, kongestivní splenomegalie, Kala azar, sarkoidosy, primární splenické pancytopenie, miliární tuberkulózy, rozseté plísňové choroby, prudké septikémie, malarie, deficience vitaminu B₁₂' deficience kyseliny folové a pyridoxinové deficience u savců.

22. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro výrobu léčiva pro léčení poškození nervů, infertility nebo intestinálního poškození u savce.

23. Použití polypeptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro výrobu léčiva pro léčení hypopigmentační poruchy.

24. Použití podle kteréhokoliv z nároků 18 až 23 pro výrobu léčiva dále obsahujícího alespoň jeden další hematopo/etický faktor vybraný z EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 a IGF-1.

25. Použití podle kteréhokoliv z nároků 18 až 23 pro výrobu léčiva dále obsahujícího alespoň jeden další hernatopo/etický faktor vybraný z IL-8, IL-9 a IL-10.

26. Použití podle kteréhokoliv z nároků 18 až 23 pro výrobu léčiva dále obsahujícího alespoň jeden další hematopo/etický faktor vybraný z IL-11 a LIF.

01-1209-90-Če

C> 41 f\s /i ( t s <

Anotace

Název vynálezu: Čištěny a izolovaný polypeptid, ~ieho použití, DNA sekvence pro jeho expresi a farmaceutická kompozice

Čištěný a izolovaný polypeptid,mající celou nebo částečnou primární strukturu sekvence,definované v popisu, popřípadě s methioninovým zbytkem na N-konci, vykazující hematopojřetickou biologickou vlastnost přirozeně se vyskytujícího faktoru kmenových buněk. Použití tohoto polypeptidu pro výrobu léčiva pro hernatopo/(etickou terapii savce. Farmaceutická kompozice,obsahující účinné množství tohoto polypeptidu a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič. DNA sekvence pro použití při expresi tohoto polypeptidu v prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňce.