SK281486B6 - Dna sekvencia, polypeptid majúci hematopoetickú biologickú vlastnosť, jeho použitie a farmaceutická kompozícia - Google Patents

Abstract

DNA sekvencia na použitie na expresiu polypeptidového produktu majúceho hematopoetickú biologickú vlastnosť prirodzene sa vyskytujúceho kmeňového bunkového faktora v prokaryotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunke, kde uvedená DNA sekvencia je vybraná z: (a) DNA sekvencií uvedených na obrázku 42A-C alebo ich komplementárnych reťazcov, (b) DNA sekvencií, ktoré hybridizujú s DNA sekvenciami definovanými v (a) alebo s ich fragmentmi, a (c) DNA sekvencií, ktoré, keby neexistovala degenerácia genetického kódu, hybridizovali by s DNA sekvenciami definovanými v (a) a (b), pričom tieto sekvencie kódujú polypeptid majúci rovnakú aminokyselinovú sekvenciu. Čistený a izolovaný uvedený polypeptid, prípadne s metionínovým zvyškom na N-konci. Použitie tohto polypeptidu na výrobu liečiva na hematopoetickú terapiu cicavca. Farmaceutická kompozícia obsahujúca účinné množstvo tohto polypeptidu a farmaceuticky prijateľné riedidlo, prísadu alebo nosič.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka DNA sekvencie na expresiu polypeptidu majúceho hematopoetickú biologickú vlastnosť prirodzene sa vyskytujúceho faktora kmeňových buniek, tohto polypeptidu v čistenom a izolovanom stave, jeho použitia na výrobu liečiv a farmaceutickej kompozície na báze tohto peptidu.

Doterajší stav techniky

Ľudský krv vytvárajúci (hemopoetický) systém je zložený z variantov bielych krviniek (zahrnujúcich neutrofily, makrofágy, bazofily, „masť“ bunky, eozinofily, T a B bunky), červených krviniek (erytrocytov) a buniek vytvárajúcich zrazeninu (megakaryocyty, doštičky).

Predpokladá sa, že malé množstvo istých hemopoetických rastových faktorov zodpovedá za diferenciáciu malého množstva „kmeňových buniek“ („stem cells“) v rôznych progenitoroch krvných buniek na ohromnú proliferáciu týchto buniek a nevratnú diferenciáciu zrelých buniek z týchto línií. Pri normálnych podmienkach funguje hemopoetický regeneračný systém dobre. Hneď ako je stresovaný chemoterapiou, radiáciou alebo prirodzeným myelodysplastickým porušením, vyskytne sa u pacienta určité obdobie, počas ktorého sú pacienti postihnutý vážnou leukopéniou, anémiou alebo trombocytopéniou. Vývoj a použitie hemopoetických faktorov urýchľuje regeneráciu kostnej drene počas tejto nebezpečnej fázy.

V istých virusovo indukovaných poruchách, ako je syndróm získanej imunodeficiencie (AIDS), môžu byť krvné elementy, ako sú T-bunky, špecificky zničené. Zvýšenie produkcie T-buniek môže byť v takýchto prípadoch terapeutické.

Pretože hemopoetické rastové faktory sú prítomné v extrémne malých množstvách, je ich detekcia a identifikácia uskutočňovaná mnohými skúškami, ktoré doteraz jediné robili rozdiel medzi rôznymi faktormi, na báze stimulačných účinkov na kultivované bunky pri umelých podmienkach.

Aplikácia rekombinantných genetických techník bola vyjasnená pochopením biologických aktivít jednotlivých rastových faktorov. Napríklad aminokysclinová a DNA sekvencia pre ľudský erytropoetín (EPO), ktorý simuluje produkciu erytrocytov, bola získaná (pozri Lin, US patent 4703008, ktorý je tu uvedený ako odkaz). Rekombinantné metódy boli tiež aplikované s cieľom izolácie cDNA pre stimulačný faktor ľudských granulocytových buniek, G-CSF (pozri Souza, US patent č. 4810643, uvedený tu ako referencia) a stimulujúci faktor ľudských granulocytových makrofágových buniek (GM-CSP) (Lee a spol., Proc Nat. Acad. Sci. USA, 82 4360 - 4364 (1985), Wong a spol., Science, 228, 810 - 814 (1985)), myšací G- a GM-CSF (Yokota a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 81, 1070 (1984), Fung a spol., Náture, 307, 233 (1984), Gough a spol., Náture, 309, 763 (1984)) a ľudské makrofágové kolónie stimulujúci faktor (CSF-1) (Kawasaki a spol. Science, 230,291 (1985)).

High Proliferative Potential Colony Forming Celí (HPP-CFC) skúškový systém testuje činnosť faktorov v raných hemopoetických progenitoroch (Zont., J. Exp. Med. 159, 679 - 690 (1984)). V literatúre existuje množstvo správ o faktoroch, ktoré sú aktívne v HPP-CFC skúške. Zdroje týchto faktorov sú uvedené v tabuľke 1. Najlepšie charakterizované faktory sú uvedené ďalej.

Aktivita v upravenom médiu ľudskej sleziny bola pomenovaná synergický faktor (SF). Niekoľko ľudských tkanív, ľudských a myšacích bunkových línií produkuje SF označený SF-1, ktorý je synergický s CSF-1 pre stimuláciu ranej HPP-CFC. SF-1 bol zistený v upravenom médiu buniek ľudskej sleziny, ľudskej placenty, 5637 buniek (bunky karcinómu mechúra) a EMT-6 buniek (línia buniek karcinómu prsnej žľazy myši). Totožnosť SF-1 je práve určovaná. Začiatočné výsledky ukazovali aktivitu SF-1 z bunkovej línie 5637 prevyšujúcu aktivitu interleukinu (Zsebo a spol., Blood, 71, 962 - 968 (1988)). Ďalšie výsledky ukázali, že kombinácia interleukín-1 (IL-1) plus CSF-1 nemôže stimulovať rovnakú tvorbu kolónií, akú je možné získať s CSF-1 plus čiastočne čistenými prípravkami z 5637 upraveného média (McNiece, Blood, 73,919 (1989)).

Synergický faktor prítomný v extrakte z maternice brezivej myši je CFS-1. WEHI-3 bunky (bunková línia buniek myší myclomonocytovej leukémie) produkujú synergický faktor, ktorý sa zdá byť totožný s IL-3. Tak CSF-1, ako aj IL-3 stimulujú hemopoetické progenitory, ktoré sú zrelšie ako cielený SF-1.

Ukázalo sa, že iná trieda synergických faktorov je prítomná v médiu z buniek TC-1 (bunky odvodené od stromy kostného tkaniva). Táto bunková línia produkuje faktor, ktorý stimuluje rané myeloidné a lymfoidné bunkové typy. Bol pomenovaný ako hemolymfopoetický rastový faktor 1 (HLGF-1). Má zrejmú molekulovú hmotnosť 120 000 (McNiece a spol., Exp. Hematol., 16, 383 (1988)).

Zo známych interleukínov a CSF, IL-1, IL-3 a CSF-1 boli identifikované ako aktívne v skúške HPP-CFC. Ďalšie zdroje synergickej aktivity uvedené v tabuľke 1 neboli štruktúrne identifikované. Vztiahnuté na polypeptidovú sekvenciu a profil biologickej aktivity, týka sa predložený vynález molekúl, ktoré sa líšia od IL-1, IL-3, CSF-1 a SF-1.

Tabuľka 1

Prípravky obsahujúce faktory aktívne v HPP-CFC skúške

Zdroj1	Odkaz
CM ľudskej sleziny CM myšacej sleziny	(Kriegler, Blood, 60,503 (1982)) (Bradley, Exp. Hematol. Today Ba-

um. ed., 285 (1980))

CM potkanej slezi- _m ^{ľ J} (Bradley, supra, (1980))

CM myšacích pľúc CM ľudskej placenty pregnantná myšacia maternica	(Bradley, supra, (1980)) (Kriegler, supra, (1982)) (Bradley, supra, (1980))
GTC-C CM	(Bradley, supra, (1980))
RH3CM	(Bradley, supra, (1980))
PHA PBL	(Bradley, supra, (1980))
WEHI-3B CM	(McNiece, Celí Ciol. Int. Rep. 6, 243 (1982))
EMT-6 CM	(McNiece, Exp. Hematol., 15, 854 (1987))
CM L-buniek	(Kriegler, Exp. Hematol., 12, 844 (1984))
5637 CM	(Stanley, Celí, 45,667 (1986))
TC-1 CM 'CM - upravené médiá	(Song, Blood, 66,273 (1985))

Pri parenterálnom podaní sú proteíny často a rýchlo odstránené z obehu a môžu tu tak vyvolať relatívne krátku farmakologickú aktivitu. Môžu teda byť potrebné časté injekcie relatívne veľkých dávok bioaktívnych proteínov na udržanie terapeutickej pôsobnosti. Proteíny modifikované kovalentným spojením s polymérmi rozpustnými vo vode, ako je polyetylénglykol, kopolyméry polyetylénglykolu a polypropylénglykolu, karboxymetylcelulóza, dextrán, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón alebo polyprolín sú známe tým, že majú podstatne dlhší polčas v krvi po intravenóznej injekcii, než príslušné nemodifikované proteíny (Abuchowski a spol., v: „Enzýme as Drugs“, Holcenberg a spol., vyd. Wiley-Interscience, New York, NY, 367 až 383 (1981), Newmark a spol., J. Appl. Biochmc. 4: 185 až 189 (1982) a Katre a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,1487 - 1491 (1987)). Takéto modifikácie môžu tiež zvyšovať rozpustnosť proteínu vo vodných roztokoch, eliminovať agregáciu, zvýšiť fyzikálnu a chemickú stabilitu proteínu a značne znížiť imunogenicitu a antigenicitu proteínu. Výsledkom je, že požadované biologické aktivity in vivo je možné dosiahnuť podaním takéhoto aduktu polymérproteín s menšou frekvenciou alebo v menších dávkach, ako v prípade nemodifikovaného proteínu.

Pripojenie polyetylénglykolu (PEG) k proteínu je veľmi výhodné, pretože PEG má veľmi nízku toxicitu pre cicavce (Carpenter a spol., Toxicol Appl. Pharmacol., 18, 35 - 40 (1971)). Napríklad PEG adukt adenozín deaminázy bol v Spojených štátoch schválený na použitie u ľudí pri liečení ťažkých kombinovaných syndrómov imunodeficiencie. Druhou výhodou spojenou s konjugáciou s PEG je účinná redukcia imunogenicity a antigenicity heterológnych proteínov. Napríklad PEG adukt ľudského proteínu môže byť užitočný pri liečení chorôb v iných cicavčích druhoch bez rizika vyvolania ťažkej imunologickej odpovede.

Polyméry, ako je PEG, môžu byť vhodne nadviazané na jeden alebo viac reaktívnych aminokyselinových zvyškov v proteine, ako je alfa-aminoskupina aminokonca aminokyseliny, epsilon-aminoskupina vedľajšieho reťazca lyzínu, sulfhydrylové skupiny vedľajšieho reťazca cysteínu, karboxylové skupiny aspartylového reťazca a glutamylového vedľajšieho reťazca, alfa-karboxylová skupina karboxy 1-koncovej aminokyseliny, tyrozínové vedľajšie reťazce alebo k aktivovaným derivátom glykozylových reťazcov, pripojením k určitým asparagínovým, serínovým alebo treonínovým zvyškom.

Bolo opísané množstvo aktivovaných foriem PEG vhodných na priamu reakciu s proteínmi. Vhodné PEG reaktanty na reakciu s proteínovými aminoskupinami zahrnujú aktívne estery karboxylovej kyseliny alebo karbonátové deriváty, výhodne tie, v ktorých odštiepiteľné skupiny sú N-hydroxysukcínimid, p-nitrofenol, imidazol alebo l-hydroxy-2-nitrobenzén-4-sulfonát. PEG deriváty obsahujúce maleimido alebo halogénacetylové skupiny sú vhodnými reaktantmi na modifikáciu proteínov neobsahujúcich sulfhydrylové skupiny. Podobne, PEG reaktanty obsahujúce amínové, hydrazínové alebo hydrazidové skupiny sú vhodné na reakciu s aldehydmi generovanými jodistanovou oxidáciou karbohydrátových skupín v proteínoch.

Predmetom predkladaného vynálezu je poskytnutie faktora, ktorý spôsobuje rast raných hematopoetických progenitorových buniek.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je DNA sekvencia na použitie v expresii polypeptidového produktu majúceho hepatopoetickú biologickú vlastnosť prirodzene sa vyskytujúceho kmeňového bunkového faktora v prokaiyotickej alebo eukaiyotickej hostiteľskej bunke, kde uvedená DNA sekvencia je vybraná z:

a) DNA sekvencii uvedených na obrázku 42A-C alebo ich komplementárnych reťazcov,

b) DNA sekvencii, ktoré pri stringentných podmienkach hybridizujú k DNA sekvenciám definovaným a) alebo ich fragmentov a

c) DNA sekvencii, ktoré, keby neexistovala degenerácia genetického kódu, hybridzovali by k DNA sekvenciám definovaným v a) a b), pričom tieto sekvencie kódujú polypeptid majúci rovnakú aminokyselinovú sekvenciu.

Predmetom vynálezu sú ďalej výhodné realizácie DNA sekvencie podľa uvedenej základnej realizácie, ktoré zahrnujú:

a) DNA sekvenciu zahrnujúcu jeden alebo viac kodónov preferovaných na expresiu v ne-cicavčích bunkách;

b) DNA sekvenciu obsahujúcu jeden alebo viac kodónov preferovaných na expresiu v E. coli bunkách;

c) DNA sekvenciu obsahujúcu jeden alebo viac kodónov preferovaných na expresiu v kvasinkových bunkách;

d) DNA sekvenciu podľa základnej realizácie alebo podľa realizácií uvedených v odsekoch a) až c), ktorá kóduje expresiu metionylového zvyšku na N-terminálnej polohe maturovanej verzie uvedeného polypeptidu;

e) DNA sekvenciu podľa základnej realizácie alebo podľa realizácií uvedených v odsekoch a) až d), kovalentne spojenú s detegovateľným značením; a

f) DNA sekvenciu podľa odseku e), kde značenie je rádioaktívne značenie.

Predmetom vynálezu je tiež čistený a izolovaný polypeptid majúci celú alebo čiastočnú primárnu štruktúru sekvencie uvedenej na obr. 42A-C, prípadne s metionínovým zvyškom na N-konci, majúcu hematopoetickú biologickú vlastnosť prirodzene sa vyskytujúceho faktora kmeňových buniek.

Predmetom vynálezu sú ďalej výhodné realizácie čisteného a izolovaného polypeptidu podľa uvedenej základnej realizácie, ktoré zahrnujú:

a) čistený a izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu podľa obr. 42A-C: 1-248, 1-189, 1-188,

1-185, 1-180, 1-156, 1-141, 1-137, 1-130, 1-164, 2-164, 5-164 a 11-164, prípadne s metionínovým zvyškom na N-konci; a

b) čistený a izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu podľa obr. 42A-C: 1-120, 1-110, 1-100,

1-133, 1-127 a 1-123, pripadne s metionínovým zvyškom na N-konci.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež farmaceutická kompozícia, ktorej podstata spočíva v tom, že obsahuje účinné množstvo ktoréhokoľvek z opísaných polypeptidov podľa vynálezu a farmaceutický prijateľné riedidlo, prísadu alebo nosič.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež použitie ktoréhokoľvek z opísaných polypeptidov podľa vynálezu na výrobu liečiva na hematopoetickú terapiu cicavca.

Hlavne môže ísť o liečivo na:

a) liečenie leukopénie, liečenie trombocytopénie, liečenie anémie, zvýšenie príjmu transplantátu kostnej drene, zvýšenie obnovy kostnej drene pri liečení ožarovaním, chemicky alebo chemoterapeuticky indukovanej aplázie kostnej drene alebo myelosupresie a zvyšovanie citlivosti buniek na chemoterapiu;

b) zvýšenie počtu buniek schopných transplantácie po ašpirácii kostnej drene alebo periférnej krvnej leukoferéze;

c) liečenie AIDS, myelofibrózy, myelosklerózy, osteoporózy metastatického karcinómu, akútnej leukémie, mnohonásobného myelómu, Hodgkinovej choroby lymfómu, Geucherovej choroby, Niemanovej-Pickovej choroby, LetterovcjSiwovej choroby, odolnej erytroblastickej anémie, Di Gug lielmovho syndrómu, kongnestívnej splenomegálie, Kala azar, sarkoidózy, primárnej splenickej pancytopénie, miliámej tuberkulózy, rozosiatej plesňovej choroby, prudkej septikémie, malárie, deficiencie vitamínu Bu, deficiencie kyseliny listovej a pyridoxínovej deficiencie u cicavcov;

d) liečenie poškodenia nervov, infertility alebo intestinálneho poškodenia u cicavca; a

e) liečenie hypopigmentačnej poruchy.

Predmetom vynálezu je aj také použitie, kde vyrábané liečivo ďalej obsahuje aspoň jeden ďalší hematopoetický faktor vybraný z a) EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IGF-1 a M-GDF;

b) IL-8, IL-9 a IL-10; a

c) IL-11 aLIF.

Uvedené sekvencie DNA môžu byť zavedené do vhodných vektorov, týmito vektormi môžu byť transformované alebo transfekované vhodné hostiteľské bunky, ktoré je potom možné použiť na produkciu peptidov podľa vynálezu.

Predĺženie polčasu in vivo a zvýšená účinnosť u cicavcov sa môže dosiahnuť prevedením peptidov podľa vynálezu na konjugáty s vodorozpustnými polymérmi. Tento polymér je výhodne zvolený zo súboru zahrnujúceho polyetylénglykol a kopolyméry polyetylénglykolu a propylénglykolu. Tieto polyméry môžu byť nesubstituované alebo na jednom konci substituované alkylskupinou. Príprava takýchto aduktov zahrnuje reakciu SCF s polymérom rozpustným vo vode majúcim aspoň jednu koncovú reaktívnu skupinu a čistenie výsledného aduktu. Získané produkty majú predĺžený polčas zotrvania v obehovom systéme a zvýšenú biologickú účinnosť.

Faktor kmeňových buniek (SCF) sa môže získavať z materiálu, ktorý ho obsahuje, pri použití techník ionexovej chromatografie a/alebo separácie kvapalinovou chromatografiou s reverznou fázou.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 predstavuje anionovýmenný chromatogram z čistenia cicavčieho SCF.

Obr. 2 predstavuje chromatogram z gélovej filtrácie z čistenia cicavčieho SCF.

Obr. 3 predstavuje chromatogram na aglutiníne z pšeničných klíčkov - agaróze z čistenia cicavčieho SCF.

Obr. 4 predstavuje kationovýmenný chromatogram z čistenia cicavčieho SCF.

Obr. 5 predstavuje C₄ chromatogram z čistenia cicavčieho SCF.

Obr. 6 predstavuje elektroforézu na dodecylsulfát sodný (SDS) - polyakrylamidovom géli (PAGE) (SDS-PAGE) frakciou z C₄ kolóny z obr. 5.

Obr. 7 predstavuje analytický C₄ chromatogram cicavčieho SCF.

Obr. 8 predstavuje SDS-PAGE C₄ kolónových frakcií z obr. 7.

Obr. 9 predstavuje SDS-PAGE čisteného cicavčieho SCF a deglykozylovaného cicavčieho SCF.

Obr. 10 predstavuje analytický chromatogram čisteného cicavčieho SCF.

Obr. 11 predstavuje aminokyselinovú sekvenciu cicavčieho SCF odvodenú od sekvencovania proteínu.

Obr. 12 predstavuje:

A. oligonukleotidy potkanej SCF cDNA,

B. oligonukleotidy ľudskej SCF DNA,

C. univerzálne oligonukleotidy.

Obr. 13 predstavuje:

A. schému výstavby reťazca polymerázou (PCS) amplifikáciou potkanej SCF cDNA,

B. schému PCR amplifikácie ľudskej SCF cDNA.

Obr. 14 predstavuje:

A. sekvenčnú stratégiu pre potkaniu genómovú DNA,

B. sekvenciu nukleokyselín potkanej genómovej DNA,

C. sekvenciu nukleokyselín potkanej SCF cDNA a aminokyselinovú sekvenciu potkanieho SCF proteínu.

Obr. 15 predstavuje:

A. stratégiu sekvencovania ľudskej genómovej DNA,

B. sekvenciu nukleovej kyseliny ľudskej genómovej DNA,

C. kompozit sekvencie nukleovej kyseliny ľudskej SCF cDNA a aminokyselinové sekvencie SCF proteínu.

Obr. 16 predstavuje zoradené aminokyselinové sekvencie ľudského, opičieho, psieho, myšacieho a potkanieho SCF proteínu.

Obr. 17 predstavuje štruktúru expresného vektora V19.8 SCF cicavčích buniek.

Obr. 18 predstavuje štruktúru expresného vektora VDSVE.l cicavčích CHO buniek.

Obr. 19 predstavuje štruktúru E. coli expresného vektora pCFMl 156.

Obr. 20 predstavuje:

A. rádioimunoštúdiu cicavčieho SCF,

B. SDS-PAGE imunitné vyzrážaného cicavčieho SCF.

Obr. 21 predstavuje Westem analýzy rekombinantného ľudského SCF.

Obr. 22 predstavuje Westem analýzy rekombinantného potkanieho SCF.

Obr. 23 predstavuje stĺpcový diagram účinku COS-1 bunkami produkovaného rekombinantného potkanieho SCF na transplantáciu kostnej drene.

Obr. 24 predstavuje účinok rekombinantného potkanieho SCF na liečenie makrocytickej anémie myší Steel.

Obr. 25 predstavuje periférne biele krvinky (WBC) u myší Steel ošetrených rekombinantným potkaním SCF.

Obr. 26 predstavuje počet doštičiek myší Steel ošetrených rekombinantným potkaním SCF.

Obr. 27 predstavuje rozdiel v počte WBC u Steel myší ošetrených rekombinantným SCF¹¹⁶⁴PEG25.

Obr. 28 predstavuje lymfocytové subsety Steel myší ošetrených rekombinantým potkaním SCF^I1MPEG25.

Obr. 29 predstavuje účinok rekombinantnej ľudskej sekvencie SCF pri ošetrení normálnych primátov so zvýšeným počtom periférnych WBC.

Obr. 30 predstavuje účinok rekombinantnej ľudskej sekvencie SCF pri ošetrení normálnych primátov na zvýšenie počtu hematokritov a doštičiek.

Obr. 31 predstavuje fotografie:

A. kolónií ľudskej kostnej drene stimulovanej rekombinantným ľudským SCF¹'¹⁶²,

B. Wright-Giemse vyfarbených buniek z kolónií na obr. 31A.

Obr. 32 predstavuje SDS-PAGE frakcií z chromatogramu na stĺpci S-Sepharosy uvedeného na obr. 33:

A. s redukčným činidlom,

B. bez redukčného činidla.

Obr. 33 je chromatogram rekombinantného ľudského SCF odvodeného od E. coli na S-Sepharosovej kolóne.

Obr. 34 predstavuje SDS-PAGE frakcií C₄ kolóny z chromatogramu uvedeného na obr. 35:

A. s redukčným činidlom,

B. bez redukčného činidla.

Obr. 35 je chromatogram rekombinantného ľudského SCF odvodeného od E. coli na C₄ kolóne.

Obr. 36 je chromatogram na kolóne Q-Sepharosy od CHO odvodeného rekombinantného potkanieho SCF.

Obr. 37 je chromatogram C₄ kolóny rekombinantného potkanieho SCF odvodeného od CHO.

Obr. 38 predstavuje SDS-PAGE frakcií C₄ kolóny z chromatogramu uvedeného na obr. 37.

Obr. 39 predstavuje SDS-PAGE čisteného od CHO odvodeného rekombinantného potkanieho SCF pred deglykozyláciou a po deglykozylácii.

Obr. 40 predstavuje:

A. gélovú filtračnú chromatografiu reakčnej zmesi rekombinantného potkanieho pegylovaného SCF¹'¹⁶⁴,

B. gélovú filtračnú chromatografiu rekombinantného potkanieho SCF¹'¹⁶⁴, nemodifíkovaného.

Obr. 41 predstavuje rádioaktívne značený SCF viazaný na čerstvé leukemické blasty.

Obr. 42 predstavuje sekvenciu ľudskej SCF cDNA získanú z HT1080 fibrosarkómovej bunkovej línie.

Obr. 43 predstavuje autorádiograf z COS-7 buniek exprimujúcich ľudský SCF¹’²⁴⁸ a CHO buniek exprimujúcich ľudský SCF¹·¹⁶⁴.

Obr. 44 predstavuje cDNA sekvenciu ľudského SCF získaného z línie 5637 buniek karcinómu mechúra.

Obr. 45 predstavuje zvýšenie prežitia ožiarených myší po ošetrení SCF.

Obr. 46 predstavuje zvýšenie prežitia ožiarených myší po transplantácii kostnej drene s 5 % stehennej kosti a po ošetrení SCF.

Obr. 47 predstavuje zvýšenie prežitia ožiarených myší po transplantácii kostnej drene 0,1 a 20 % stehennej kosti a ošetrení SCF.

Množstvo aspektov a výhod predloženého vynálezu bude zrejmé odborníkom z nasledujúceho detailného opisu, ktorý slúži na ilustráciu praktickej realizácie vynálezu v jeho mimoriadne výhodných uskutočneniach.

Nasleduje detailný opis vynálezu.

V súlade s predloženým vynálezom sú poskytnuté nové faktory kmeňových buniek a DNA sekvencie kódujúce všetky časti takýchto SCF. Termín „faktor kmeňových buniek“ alebo „SCF“ tu použitý sa vzťahuje na prirodzene sa vyskytujúci SCF (to znamená prirodzený ľudský SCF), ako aj na prirodzene sa nevyskytujúce (to znamená odlišný od prirodzene sa vyskytujúcich) polypeptidy majúce aminokyselinové sekvencie a glykozyláciu dostatočne zhodnú s týmito vlastnosťami prirodzene sa vyskytujúceho faktora kmeňových buniek tak, aby poskytla schopnosť hematopoetickej biologickej aktivity prirodzene sa vyskytujúceho faktora kmeňových buniek. Faktor kmeňových buniek má schopnosť stimulovať rast raných hematopoetických progenitorov, ktoré sú schopné zrenia na erytrocyty, megakaryocyty, granulocyty, lymfocyty a makrofágy. Liečba cicavcov SCF priniesla výsledky v absolútnom zvýšení počtu hematopoetických buniek tak myeloidnej, ako aj lymfoidnej línie. Jednou z hlavných charakteristík kmeňových buniek je ich schopnosť diferencovať medzi myeloidnými a lymfoidnými bunkami ((Weissman Science, 241, 58 - 62 (1988)). Liečba Steel myší (príklad 8B) rekombinantným potkaním SCF priniesla zvýšenie počtu granulocytov, monocytov, erytrocytov, lymfocytov a krvných doštičiek. Liečba normálnych primátov rekombinantým ľudským SCF priniesla zvýšenie počtu myeloidných a lymfoidných buniek (príklad 8C).

Embryonálna expresia SCF prebieha v bunkách migračným spôsobom a v materských miestach melanoblastov, zárodočných buniek, hematopoetických buniek, mozgu a chrbtovej miechy.

Rané hematopoetické progenitorové bunky boli namnožené v kostnej dreni cicavcov, ktoré boli liečené 5-fluóruracilom (5-FU). Chemoterapeutické liečivo 5-FU selektívne vyčerpáva neskoré hematopoetické progenitory. SCF je aktívny v kostnej dreni na miestach 5-FU.

Biologická aktivita a model tkanivovej distribúcie SCF ukazuje jeho centrálnu úlohu v embryogenéze a hematopoéze, ako aj jeho schopnosť liečby rôznych deficiencií kmeňových buniek.

Predkladaný vynález poskytuje DNA sekvencie, ktoré obsahujú: inkorporáciu kodónov „výhodných“ na expresiu vybranými necicavčími hostiteľmi; vybavenie miest na štiepenie reštrikčnými endonukleázovými enzýmami; a vybavenie ďalšími začiatočnými, koncovými alebo intermediámymi DNA sekvenciami, ktoré umožňujú konštrukciu ľahko exprimovateľných vektorov. Predkladaný vynález tiež poskytuje DNA sekvencie kódujúce polypeptidové analógy alebo deriváty SCF, ktoré sa líšia od prirodzene sa vyskytujúcich foriem v zhodnosti alebo umiestení jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov (to znamená delečné analógy obsahujúce menej ako všetky zvyšky špecifické pre SCF, substitučné analógy, kde jeden alebo viac špecifických zvyškov je nahradených inými zvyškami, a adičné analógy, kde je na koncovej alebo strednej časti polypeptidu pridaný jeden alebo viac aminokyselinových zvyškov) a ktoré majú niektoré alebo všetky vlastnosti prirodzene sa vyskytujúcich foriem. Predkladaný vynález špecificky poskytuje DNA sekvencie kódujúce plnú dĺžku nespracovanej aminokyselinovej sekvencie, ako aj DNA sekvencie kódujúce spracovanú formu SCF.

Opisované nové DNA sekvencie zahrnujú sekvencie vhodné na zabezpečenie expresie v prokaryotických a eukaryotických hostiteľských bunkách polypeptidových produktov majúcich aspoň časť primárnej štruktúrnej konformácie a jednu alebo viac biologických vlastností prirodzene sa vyskytujúceho SCF. Takéto sekvencie špecificky zahrnujú: a) DNA sekvencie uvedené na obr. 42A-C alebo ich komplementárne reťazce, b) DNA sekvencie, ktoré hybridizujú (pri podmienkach hybridizácie opísaných v príklade 3, alebo pri ešte prísnejších podmienkach) na DNA sekvencie na obr. 42A-C, alebo ich fragmenty a c) DNA sekvencie, ktoré by hybridizovali na DNA sekvencie na obr. 42A-C, keby neexistovala degenerácia genetického kódu. Špecificky sú tie sekvencie, ktoré sú uvedené v časti b) a c), genómové DNA sekvencie kódujúce alelické varianty SCF a/alebo kódujúce SCF z iných cicavčích druhov a vyrobené DNA sekvencie kódujúce SCF, fragmenty SCF a analógy SCF. DNA sekvencie môžu inkorporovať kodóny uľahčujúce transkripciu a transláciu mesindžrovej RNA v mikrobiálnych hostiteľoch. Takéto sekvencie môžu byť ľahko konštruované metódami podľa Altona a spol., publikovaná PCT prihláška WO 83/04053.

V súlade s iným aspektom predloženého vynálezu, tu opísané sekvencie DNA, ktoré kódujú polypeptidy, majúce SCF aktivitu, sú cenné pre poskytovanie informácií týkajúcich sa aminokyselinovej sekvencie cicavčích proteínov, ktoré doteraz boli bezcenné. DNA sekvencie sú tiež cenné ako produkty užitočné pri realizovaní širokej škály syntéz SCF rôznymi rekombinantnými technikami. Použitím inej metódy sú DNA sekvencie poskytované vynálezom užitočné v generovaní nových a užitočných vírusových a cirkulámych plazmidových DNA vektorov, nových a užitočných transformovaných a transfekovaných prokaryotických a eukaryotických hostiteľských buniek (zahrnujúcich bakteriálne a kvasinkové bunky a kultivované cicavčie bunky) a nových a vhodných metódach kultivovania takýchto hostiteľských buniek schopných expresie SCF a od neho odvodených produktov.

DNA sekvencie podľa vynálezu sú tiež vhodným materiálom na značené sondy v izolácii ľudskej genómovej

SK 281486 Β6

DNA kódujúcej SCF a iných génov pre tieto proteíny, ako aj cNDA a genómové DNA sekvencie iných cicavčích druhov. DNA sekvencie môžu byť tiež využité v rôznych alternatívnych metódach proteínovej syntézy (napr. v hmyzích bunkách) alebo v genetickej terapii človeka alebo iných cicavcov. Predpokladá sa, že DNA sekvencie podľa vynálezu sú užitočné pri vývoji transgénnych cicavčích druhov, ktoré môžu slúžiť ako eukaryotickí hostitelia na produkciu SCF a SCF produktov, pozri Palmiter a spol., Science 222,809 - 814 (1983).

Predkladaný vynález poskytuje purifikovaný a izolovaný prirodzene sa vyskytujúci SCF (to znamená čistený z prírodného alebo vyrobený tak, že primárna, sekundárna a terciáma konformácia a glykozidačný model sú zhodné a prirodzene sa vyskytujúcim materiálom), ako aj prirodzene sa nevyskytujúci polypeptid majúci štruktúrnu konformáciu (to znamená kontinuálnu sekvenciu aminokyselinových zvyškov) a glykoziláciu dostatočne duplikatívnu s tým istým u prirodzene sa vyskytujúceho faktora kmeňových buniek a tak dovoľujúcu hematopoetickú biologickú aktivitu prirodzene sa vyskytujúceho SCF. Takéto polypeptidy zahrnujú deriváty a analógy.

Vo výhodnej realizácii je SCF charakterizovaný ako produkt expresie v prokaryotickom alebo eukaryotickom hostiteľovi (to znamená kultivovaných baktériách, kvasinkách, bunkách vyšších rastlín, hmyzu alebo cicavčích bunkách) exogénnych DNA sekvencií získaných genómovým alebo cDNA klonovaním, alebo génovou syntézou. SCF je v preferovanej realizácii „rekombinantný SCF“. Produkty expresie obyčajne v kvasinkách (napr. Saccharomycees cerevisiae) alebo prokaryotických (napr. E. coli) hostiteľských bunkách sú bez obsahu asociácie s inými cicavčími proteínmi. Produkty expresie v bunkách stavovcov (napr. cicavcov s výnimkou človeka (napr. COS alebo CHO) a vtákov sú bez obsahu asociácie s akýmikoľvek ľudskými proteínmi. V závislosti od použitého hostiteľa polypeptidy podľa vynálezu môžu byť glykozylované cicavčími alebo inými eukaryotickými karbohydrátmi alebo môžu byť neglykozylované. Hostiteľská bunka môže byť zmenená použitím techník, ako sú tie, ktoré sú opísané Leeom a kol., J. Biol. Chem. 264, 13848 (1989), práca je tu uvedená ako odkaz. Polypeptidy podľa vynálezu môžu tiež obsahovať iniciačný metionínový aminokyselinový zvyšok (v polohe 1).

Okrem prirodzene sa vyskytujúcich alelových foriem SCF, predložený vynález tiež obsahuje ďalšie SCF produkty, ako sú polypeptidové analógy SCF. Takéto analógy zahrnujú fragmenty SCF. Postupy podľa uvedenej publikovanej prihlášky Altona a spol. (WO 83/04053) je možné ľahko tvarovať a vyrobiť kódujúce gény na mikrobiálnu expresiu polypeptidov majúcich primáme konformácie, ktoré sa odlišujú od tu špecifikovaných v pomere zhody a umiestenia jedného alebo viaceíých zvyškov (napr. substitúciou terminálnou a intermediámou adíciou a deléciou). Alternatívne modifikácia cDNA a genómových génov môže byť ľahko dosiahnuteľná dobre známou miestne riadenou mutagenéznou technikou a upotrebená na generovanie analógov a derivátov SCF. Takéto produkty majú aspoň jednu z biologických vlastností SCF, ale v ostatných sa môžu líšiť. Ako príklady zahrnujú produkty podľa vynálezu tie, ktoré sú skrátené napr. deléciami, alebo tie, ktoré sú stabilnejšie proti hydrolýze (a preto môžu mať zreteľnejšie alebo dlhšie trvajúce efekty než prirodzene sa vyskytujúce); alebo ktoré sú zmenené vypustením alebo pridaním jedného alebo viacerých potenciálnych miest pre O-glykozyláciu a/alebo N-glykozyláciu, alebo ktoré majú jeden alebo viac cysteínových zvyškov deletovaných alebo nahradených napríklad alanínovými alebo serínovými zvyškami a sú po tenciálne ľahšie izolované v aktívnej forme z mikrobiálnych systémov; alebo ktoré majú jeden alebo viac tyrozínových zvyškov nahradených fenylalanínom a viažu sa viac alebo menej ľahko na cieľový proteín alebo na receptory cieľových buniek. Tiež sú obsiahnuté polypeptidové fragmenty duplikujúce len časť súvislej aminokyselinovej sekvencie alebo sekundárne konformácie SCF; fragmenty môžu mať jednu vlastnosť SCF (napr. receptorovú väzbu) ale nie ďalšiu (napr. ranú hematopoetickú bunkovú rastovú aktivitu). Je pozoruhodné, že aktivita nie je nevyhnutná pre jeden alebo viac produktov podľa vynálezu na to, aby mali terapeutickú schopnosť (pozri Weiland a spol., Blut, 44, 173 - 175 (1982)), alebo schopnosť v inom kontexte, ako v skúške SCF antagonizmu. Kompetitívne antagonisty môžu byť úplne využité, napríklad v prípadoch nadprodukcie SCF alebo v prípadoch ľudskej leukémie, kde malígne bunky exprimujú príliš veľa receptorov pre SCF, ako indikuje prílišná expresia SCF receptorov v leukoplastoch (príklad 13).

Pre použiteľnosť polypeptidových analógov podľa vynálezu sú uvedené ich imunologické vlastnosti pri syntetických peptidoch, ktoré v podstate duplikujú aminokyselinovú sekvenciu existujúcu v prirodzene sa vyskytujúcich proteínoch, glykoproteínoch a nukleoproteínoch. Špecifickejšie, polypeptidy s relatívne malou molekulovou hmotnosťou môžu participovať v imunitnej reakcii, ktorá je podobná priebehu a rozsahu s imunitnými reakciami fyziologicky významných proteínov, ako sú vírusové antigény, polypeptidové hormóny a podobne. Množstvo imunitných reakcií takýchto polypeptidov podnecuje formovanie špecifických protilátok v imunologický aktívnych zvieratách (Lemer a spol. Celí, 23, 309 - 310 (1981); Ross a spol., Náture, 294, 654 - 656 (1981); Walter a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5197 - 5200 (1980); Lemer a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,3403 - 3407 (1981); Walter a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4882 - 4886 (1981); Wong a spol., Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 79, 5322 - 5326 (1982); Barón a spol., Celí, 28, 395 - 404 (1982); Dressman a spol., Náture, 295,185 - 160 (1982); a Lemer, Scientific Američan, 248, 66 - 74 (1983)). Pozri tiež Kaiser a spol./Science, 223, 249.255 (1984)) vzhľadom na biologické a imunologické vlastnosti syntetických peptidov, ktoré približne majú sekundárne štruktúry peptidových hormónov, ale nemajú ich primáme štruktúrne konformácie.

Predložený vynález tiež zahrnuje tu triedu polypeptidov, kódovaných častí DNA komplementárnej k proteín-kódujúcemu reťazcu ľudskej cDNA alebo genómovej DNA sekvencie SCF, to znamená „komplementárne invertované proteíny“, ako je to opísané Tramontanom a spol. (Nucleic Acid. Res., 12,5049 - 5059 (1984)).

SCF môže byť čistený technikami známymi v odbore. Predmet vynálezu zahrnuje metódu čistenia SCF z SCF materiálu, ako sú kondiciované médiá alebo ľudský moč, sérum. Metóda zahrnuje jeden alebo viac nasledujúcich stupňov: Podrobenie materiálu obsahujúceho SCF ionexovej chromatografi (buď kationovýmennej alebo anionovýmennej chromatografii), spracovanie materiálu obsahujúceho SCF delenie kvapalinovou chromatografiou s reverznou fázou, s obsahom napríklad imobilizovanej C₄ alebo C₆ živice; spracovanie chromatografiou s imobilizovaným laktínom, napr. nadviazaním SCF na imobilizovaný laktín a elúciu pri použití cukru, ktorý sa uchádza o toto nadviazanie. Detaily týchto metód budú zrejmé z opisov uvedených v príkladoch 1, 10 a 11 na čistenie SCF. Techniky opísané v príklade 2 Laiom a spol. US patent, č. 4667016, ktorý je tu uvedený ako referencia, sú tiež vhodné na čistenie kmeňového faktora buniek.

Izoformy SCF sú izolované použitím štandardných techník, ako sú techniky uvedené v US prihl. č. 421444 nazvanej Erythropoietin Isoforms, podanej 13. októbra 1989, ktorá je tu uvedená ako odkaz.

Obsahom vynálezu sú tiež farmaceutické kompozície obsahujúce terapeuticky účinné množstvo polypeptidového produktu podľa tohto vynálezu spolu s vhodnými riedidlami, ochrannými látkami, solubilizátormi, emulgátormi a prísadami a/alebo nosičmi užitočnými v SCF terapii. Ako „terapeuticky účinné množstvo“ je označené množstvo, ktoré poskytuje terapeutický efekt pri daných podmienkach a spôsobe podávania. Takéto kompozície sú kvapaliny alebo lyofilizované, alebo inak sušené prípravky a obsahujú riedidlá alebo rôzne pufre (napr. Tris-HCl, acetátový, fosfátový), pH a iónové sily, aditíva, ako je albumín alebo želatína na prevenciu adsorpcie na povrchy, detergenty (napr. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, soli kyseliny žlčovej), solubilizačné činidlá (napr. glycerol, polyetylénglykol), antioxidanty (napr. kyselina askorbová, metabisulfit sodný), ochranné látky (napr. Thimerosal, benzylalkohol, parabény), napučiavacie látky alebo modifikátory tonicity (napr. laktóza, manitol), kovalentné pripojenia polymérov, ako je polyetylénglykol k proteínu (opísané v príklade 12 ďalej), komplexácie s kovovými iónmi alebo inkorporácie materiálu do partikulámych prípravkov polymémych zlúčenín alebo na ne, ako je polymliečna kyselina, kyselina polyglykolová, hydrogély atď., alebo do lipozómov, mikroemulzií, micél, jednovrstvových alebo viacvrstvových vehikúl, erytrocytových hostiteľov alebo sféroplastov. Takéto kompozície budú ovplyvňovať fyzikálny stav, rozpustnosť, stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť vylučovania SCF in vivo. Výber zlúčeniny bude závisieť od fyzikálnych a chemických vlastnosti proteínu majúceho SCF aktivitu. Napríklad produkt odvodený od membránovo viazanej formy SCF môže vyžadovať prípravok, ktorý obsahuje detergent Prípravky s riadeným alebo postupným uvoľňovaním zahrnujú prípravky s lipofílnými depotnými účinkami (napr. mastné kyseliny, vosky, oleje). V rozsahu vynálezu sú tiež zahrnuté partikuláme prípravky potiahnuté polymérmi (napr. poloxaméry alebo poloxamíny) a SCF spojený s protilátkami proti tkanivovo špecifickým receptorom, ligandom alebo antigénom, alebo spojený s ligandmi tkanivovo špecifických receptorov. Ďalšie realizácie prípravkov podľa vynálezu zahrnujú časticové formy chrániace poťah, inhibitory proteinázy alebo látky zvyšujúce permeáciu pri rôznych spôsoboch podania zahrnujúcich podanie parenterálne, pulmonálne, nazálne a orálne.

Vynález tiež zahrnuje prípravky obsahujúce jeden alebo viac hematopoetických faktorov, ako je EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-I alebo LIF (faktor inhibujúci leukémiu).

Polypeptidy podľa vynálezu môžu byť „značené“ spojením s detegovateľnou markérovou substanciou (napr. rádioaktívne značenou ¹²⁵I alebo biotinylovanou) s cieľom poskytnäť činidlá vhodné na detekciu a kvantifikáciu SCF alebo jeho receptor nesúcich buniek v pevnom tkanive a v kvapalných vzorkách, ako je krv alebo moč.

Biotinylovaný SCF je užitočný v spojení s imobilizovaným streptavidínom na čistenie leukemických blastov z kostnej drene v autológnej transplantácii kostnej drene. Biotinylovaný SCF je užitočný v spojení s imobilizovaným streptavidínom na obohatenie kmeňových buniek v autológnych alebo alogénnych transplantáciách kostnej drene. Toxín napojený na SCF, ako je ricín (Uhr, Pro. Clin. Biol. Res. 288, 403 - 412 (1989)), toxín diftérie (Moolten, J. Natl. Con. Inst., 55,473 - 477 (1975)) a rádioizotopy sú vhod né na antineoplastickú terapiu (príklad 13) alebo kondičný režim na transplantáciu kostnej drene.

Produkty nukleových kyselín podľa vynálezu sú vhodné, ak sú označené detegovateľnými markérmi, ako sú rádioaktívne značkovače a neizotopové značkovače, ako je biotín a využívané v hybridizačnom procese na lokalizáciu polohy ľudského SCF génu a/alebo polohy niektorej takejto génovej rodiny na chromozómovej mape. Sú tiež užitočné na identifikáciu porušenia ľudského SCF génu na úrovni DNA a použitie ako génové markery na identifikáciu susedných génov a ich porušenia. Ľudský gén pre SCF je kódovaný chromozómom 12 a myšací SCF gén je mapovaný do chromozómu 10 pri SI lokuse.

SCF je užitočný samotný alebo v kombinácii s inou terapiou v liečbe množstva porúch hematopoézy. SCF môže byť použitý samostatne alebo s jedným alebo viacerými ďalšími hematopoetickými faktormi, ako je G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IGF-I alebo LIF pri liečení hematopoetických chorôb.

Existuje skupina porúch kmeňových buniek, ktorá je charakterizovaná redukciou funkcie kostnej drene spôsobenou toxickým, radiačným alebo imunologickým poškodením a ktorá môže byť liečiteľná SCF. Aplastická anémia je poškodenie kmeňových buniek, pri ktorom je hematopoetické tkanivo nahradené tukom, a pancytopénia. SCF zvyšuje hematopoetickú proliferáciu a je vhodné pri liečení aplastickej anémie (príklad 8B). Steel myši boli použité ako modely ľudskej aplastickej anémie (Dones, Exp. Hematol., 11, 571 - 580 (1983)). Sľubné výsledky boli získané použitím cytokínu príbuzného GM-CSF v liečení aplastickej anémie (Antin a spol., Blood 70, 129a (1987)). Paroxyzmálna nokturálna hemoglobinúria je porucha kmeňových buniek, charakterizovaná formovaním defektných doštičiek a granulocytov, ako aj abnormálnych erytrocytov. Existuje mnoho chorôb, ktoré sú liečiteľné SCF. Patria sem tieto choroby: myelofibrózy, myelosklerózy, osteoporózy, metastatický karcinóm, akútna leukémia, multiplikovaný myelóm, Hodkinova choroba, lymfóm, Gaucherova choroba, Niemen-pickova choroba, Letterer-Siwe choroba, neústupná eiytroblastická anémia, Di Guglielmov syndróm, kongestivna splenomegália, Hodkinova choroba, Kala azar, sarkoidóza, primárna slezinná pancytopénia, miliáma tuberkulóza, hubové choroby, septikémia, malária, nedostatok vitamínu B12 a kyseliny listovej, nedostatok pyridoxínu, Diamond-Blackfan anémia, hypopigmentačné choroby, ako je vitiligo a piebaldizmus. Erytroidy, megakaroycyty a granulocyty stimulujúce vlastnosti SCF sú uvedené v príkladoch 8B a 8C.

Nárast rastu v nehematopoetických kmeňových bunkách, ako sú primordiálne zárodkové bunky, melanocyty odvodené od zárodkového hrebeňa, komisurálne axóny pochádzajúce z chrbtovej miechy, bunky krýpt čreva, mezonefrické a metanefrické ľadvinové tubuly a čuchové bulby, je užitočný v situácii, keď sa na týchto miestach vyskytuje poškodenie tkaniva. SCF je užitočný pri liečení neurologických poškodení a je rastovým faktorom pre nervové bunky. SCF je užitočný počas in vitro fertilizačného procesu alebo pri liečení infertility. SCF je užitočný pri liečení poškodení čriev radiáciou alebo chemoterapiou.

Existujú myeoloproliferatívne poškodenia kmeňových buniek, ako je polycytémia vera, chronická myelogénna leukémia, myeloidná metaplázia, primárna trombocytémia a akútna leukémia, ktoré je možné liečiť SCF, anti-SCF protilátkami alebo konjugátmi SCF-toxín.

Je tu množstvo prípadov, ktoré dokumentujú nárast proliferácie leukemických buniek podľa hematopoetických rastových faktorov G-CSF, GM-CSF a IL-3 (Delwel a spol., Blood, 72, 1944 - 1949 (1988)). Pretože úspech mnohých chemoterapeutických liečiv závisí od faktora, že neoplastické bunky cyklizujú aktívnejšie ako normálne bunky, SCF sám alebo v kombinácii s inými faktormi pôsobí ako rastový faktor pre neoplastické bunky a senzibilizuje ich k toxickému afektu chemoterapeutických liečiv. Nadprodukcia SCF receptorov na leukoblastoch je ukázaná v príklade 13.

Množstvo rekombinantných hematopoetických faktorov je podrobené skúmaniu pre ich schopnosť znižovať leukocytovú hranicu následkom chemoterapie a radiačného ošetrenia. Aj keď tieto faktory sú veľmi užitočné v tejto zostave, je tu raný hematopoetický komportment, ktoiý je poškodený, predovšetkým radiáciou a má byť opäť vytvorený skôr, ako tieto neskoro pôsobiace rastové faktory môžu prejaviť optimálnu akciu. Použitie SCF samotného alebo v kombinácii s týmito faktormi podporuje znižovanie alebo elimináciu leukocytovej doštičkovej hladiny z chemoterapie alebo radiačnej liečby. Navyše SCF dovoľuje intenzifikáciu dávky v antineoplastickom alebo radiačnom ošetrení (príklad 19).

SCF je užitočný na expresiu raných hematopoetických progenitorov v asyngénnych, alogénnych alebo autológnych transplantáciách kostnej drene. Použitie hematopoetických rastových faktorov vykazuje zníženie času na nahradenie neutrofilov po transplantácii (Donahue a spol., Náture, 321, 872 - 873 (1986) a Welte a spol., J. Exp. Med., 165, 941 - 948 (1987)). Na transplantáciu kostnej drene sú používané nasledujúce tri scenáre samostatne alebo v kombinácii: darca je liečený SCF samotným alebo v kombinácii s iným hematopoetickým faktorom pred ašpiráciou kostnej drene alebo periférnou krvnou leukoporézou s cieľom zvýšiť množstvo buniek vhodných na transplantáciu; kostná dreň je liečená in vitro kvôli aktivácii alebo nárastu počtu buniek pred transplantáciou; nakoniec je liečený príjemca kvôli zvýšeniu schopnosti prijať dreň darcu.

SCF je užitočný pre zvýšenie schopnosti génovej terapie založenej na transfekcii (alebo infekcii retrovírusovým vektorom) hematopoetických kmeňových buniek. SCF dovoľuje kultiváciu a multiplikáciu raných hematopoetických kmeňových buniek, ktoré majú byť transfekované. Kultivácia môže byť uskutočnená so samotným SCF alebo jeho kombináciou s 1L-6, IL-3 alebo obidvoma. Po transfekcii sú potom tieto bunky zavedené do kostnej drene transplantovanej do pacienta trpiaceho genetickou poruchou (Lim, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 8892 - 8896 (1989)). Príklady génov, ktoré sú vhodné na liečbu genetických poškodení, sú adenozíndeamináza, glukocerebrozidáza, hemoglobín a cystická fibróza.

SCF je užitočný pri liečení syndrómu získanej imunodeficiencie (AIDS), alebo niekoľkých kombinovaných imunodeficitných stavov (SCID) samotný alebo v kombinácii s inými faktormi, ako je IL-7 (pozri príklad 7). Ilustráciou týchto účinkov je schopnosť SCF liečby zvýšiť absolútnu hladinu cirkulujúcich T-helper (CD4⁺, CKT₄ ⁺) lymfocytov. Tieto bunky sú primárnym bunkovým cieľom vírusu ľudskej imunodeficiencie (HľV), čo vedie k imunodeficientnému stavu AIDS pacientov (Montagnier, v Human T-Cell Leukemia/Lymphoma Virus, vyd. R. C. Gallo, Cold Spring Harbor, New York, 369 - 379 (1984)). Navyše je SCF užitočný pri potláčaní myelosupresívneho účinku anti-HIV liečiv, ako je AZT (Gogu Life Sciences, 45, č. 4 (1989)).

SCF je užitočný na zvýšenie hematopoetickej náhrady po akútnej strate krvi.

Pri liečbe in vivo je SCF užitočný na povzbudenie imunitného systému na boj s neopláziou (rakovinou). Prí klad terapeutickej schopnosti priameho zvýšenia imunitnej funkcie novoklonovaným cytokínom (IL-2) je opísaný Rosenbergom a spol., N. Eng. J. Med., 313 1485 (1987).

Podávanie SCF s inými činidlami, ako je jeden alebo viac hematopoetických faktorov, sa uskutočňuje v určitých časových intervaloch alebo sú podávané spoločne. Predchádzajúca liečba SCF rozširuje progenitorovú populáciu, ktorá zodpovedá koncovo funkčným hematopoetickým faktorom, ako je G-CSF alebo EPO. Spôsob podávania môže byť intravenózny, intraperitoneálny, subkutánny alebo intramuskulámy.

Predložený vynález sa tiež týka protilátok, ktoré špecificky viažu faktor kmeňových buniek. Príklad 7, ktorý je uvedený ďalej, opisuje produkciu polyklonálnych protilátok. Ďalším využitím vynálezu sú monoklonálne protilátky, ktoré špecificky viažu SCF (pozri príklad 20). Oproti konvenčným protilátkovým (polyklonálnym) preparátom, ktoré obvykle obsahujú rôzne protilátky riadené proti rôznym determinantom (epitopom), každá monoklonálna protilátka je riadená proti jednému determinantu na antigéne. Monoklonálne protilátky sú užitočné na zlepšenie selektivity a špecificity diagnostických a analytických skúšobných metód využitím väzby antigén-protilátka. Tiež sú používané na neutralizáciu alebo nahradenie SCF zo séra. Druhá výhoda monoklonálnych protilátok je tá, že môžu byť syntetizované hybridnými bunkami v kultúre nekontaminovanej inými imunoglobulínmi. Monoklonálne protilátky môžu byť pripravené zo supematantu kultivovaných hybridómových buniek alebo z ascitu indukovaného naočkovaním buniek hybridómov intraperitoneálne myši. Technika hybridómov opísaná pôvodne Kôhlerom a Milsteinom (Eur. J. Immunol. 6, 511 - 519 (1976)) bola aplikovaná v širokom rozsahu pre produkciu hybridných bunkových línií, ktoré produkujú vysoké hladiny monoklonálnych protilátok proti špecifickým antigénom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady slúžia na ilustráciu predloženého vynálezu a v žiadnom prípade ho neobmedzujú.

Príklad 1 Čistenie/charakteristika faktora kmeňových buniek z média získaného z buniek pečene potkana Buffalo

A. Biologické skúšky in vitro

1. Skúška HPP-CFC

Rôzne biologické aktivity môžu byť vlastné prirodzenému cicavčiemu potkaniemu SCF, ako aj rekombinantnému SCF proteínu. Jednou z takýchto aktivít je jeho pôsobenie na rané hematopoetické bunky. Táto aktivita môže byť meraná v skúške High Proliferative Potential Colony Forming Celí (HPP-CFC)/Zsebo a spol., supra (1988)). Na hodnotenie účinku faktora na rané hematopoetické bunky utilizuje HPP-CFC skúšobný systém myšaciu kostnú dreň získanú zo zvierat 2 dni po liečbe 5-fluóruracilom (5-FU). Chemoterapeutické liečivo 5-FU selektívne vyčerpáva neskoré hematopoetické progenitory s následnou detekciou raných progenitorových buniek, a preto faktory, ktoré pôsobia na takéto bunky. Potkaní SCF je umiestený na platni v prítomnosti CSF-1 alebo IL-6 v polopevnej agarovej kultúre. Agarová kultúra obsahuje kompletné McCoysovo médium (GIBCO), 20 % fetálneho hovädzieho séra, 0,3 % agaru a 2 x 10⁵ buniek kostnej drene/ml. McCoyovo kompletné médium obsahuje tieto zložky: lx McCoyovo médium doplnené 0,1 mM pyruvátom, 0,24 x esenciálnymi a minokyselinami, 0,24 x neesenciálnymi aminokyselinami, 0,027 % hydrogenuhličitanu sodného, 0,24 x vitamínmi, 0,72 mM glutamínu 25 pg/ml L-serínu a 12 pg/ml L-asparagínu. Bunky kostnej drene boli získané z Balb/c myší injikovaných i. v. 150 mg/kg 5-FU. Femury sa odoberú 2 dni po liečbe 5-FU myši a kostná dreň je vybraná. Červené krvinky sa lýzujú s činidlom lýzujúcim bunky červených krviniek (Becton Dickenson) pred umiestením na platne. Testované substancie sa umiestia na platne s uvedenou zmesou v 30 mm miskách. O štrnásť dní neskôr sú počítané kolónie (>1 mm v priemere), ktoré obsahujú tisíce buniek. Táto skúška je používaná všade na čistenie SCF z potkaních prirodzených buniek.

V obvyklej skúške potkaní SCF spôsobuje proliferáciu približne 50 HPP-CFC z 20 000 buniek na platni. Potkaní SCF má synergistickú aktivitu na bunky myšacej kostnej drene, liečené 5-FU; HPP-CFC kolónie sa nevytvárajú v prítomnosti samotných faktorov, ale v tejto skúške je aktívna kombinácia SCF a CSF-1 alebo SCF a IL-6.

2. MC/9 skúška

Iná užitočná biologická aktivita prirodzene získaného a rekombinantného potkanieho SCF je schopnosť spôsobovať proliferáciu od IL-4 závislej myšacej „mast celí“ línie, MC/9 (ATCC CRL 8306). MC/9 bunky sú kultivované so zdrojom IL-4 v súlade s ATCC CRL 8306 protokolom. Médium použité v bioskúške je RPMI 1640,4 % fetálneho hovädzieho séra, 5 x IO'⁵ M 2-merkaptoetanolu a 1 x glutamín-pen-STREP: MC/9 bunky proliferujú ako odpoveď na SCF bez potreby iných rastových faktorov. Táto proliferácia je meraná prvou kultiváciou buniek počas 24 hodín bez rastových faktorov, umiestením 5000 buniek v každej jamke platne s 96 jamkami s testovanou vzorkou počas 48 hodin, spracovaním počas 4 hodín 0,5 pCi ³H-tymidínom (špecifická aktivita 20 Ci/mmol), získaním roztoku na filtroch zo sklenených vláken a potom meraním špecificky nadviazanej rádioaktivity. Skúška bola použitá na čistenie cicavčích buniek odvodených od potkanieho SCF po stupni ACA gólovej filtrácie, sekcii C2 tohto príkladu. SCF pôsobí 4-10-násobné zvýšenie CPM oproti základu.

3. CFU-GM

Bola zistená akcia čistého cicavčieho SCF tak prirodzene získaného, ako aj rekombinantného, bez interferujúcich kolónie stimulujúcich faktorov (CSFs), na normálne nevyčerpanej kostnej dreni. CFU-GM skúška/Broxmeyer a spol., Exp. Hematol., 5, 87 (1977)) je použitá na zhodnotenie účinku vplyvu SCF na normálnu dreň. Stručne, všetky bunky kostnej drene po lýze červených krviniek, sú umiestené na platni v polopevnej agarovej kultúre obsahujúcej testovanú substanciu. Po 10 dňoch sú počítané kolónie obsahujúce skupiny viac ako 40 buniek. Agarová kultúra môže byť usušená na sklenených podložkách a špecifickým histologickým farbením môže byť určená morfológia buniek.

Na normálnej myšacej kostnej dreni bol čistený cicavčí potkaní SCF pluripotentný CSF, kde stimuluje rast kolónií, s obsahom nezrelých buniek, neutrofilov, makrofágov, eozinofilov a megakaryocytov, bez potreby ďalších faktorov. Z 200 000 buniek umiestených na platni vyrástlo počas 10 dní cez 100 kolónií. Tak potkaní, ako aj ľudský rekombinantý CF stimulujú produkciu erytroidných buniek v kombinácii s EPO, pozri príklad 9.

B. Kondiciované médium

Pečeňové bunky potkana Buffalo (BRL) z Američan Type Culture Collection (ATCC CRL 1442) vyrastali na mikronosičoch v 20-litrovom perfuznom kultivačnom sys téme na produkciu SCF. Tento systém využíva Biolafitte fermentor (Model ICC-20) s výnimkou sít používaných na zadržanie mikronosičov a oxidačných rúrok. 75-mikrometrové sitká sú zabezpečovaná pred upchatím mikronosičmi periodickým spätným preplachovaním dosiahnutým systémom riadených ventilov a počítačom riadených čerpadiel. Každé sito alternatívne pracuje ako prívod média a východiskové sito. Oscilujúci vyvolaný tok tak zabezpečuje, že sa sitá neupchávajú. Okysličenie je zaisťované vinúcimi sa silikónovými prívodmi (50 stôp dĺžka, 0,25 palca vnútorný priemer, 0,03 palca stena). Rastové médium použité na kultiváciu BRL 3A buniek bolo minimálne základné médium (s Earlovými soľami) (GIBCO), 2 mM glutamínu, 3 g/1 glukózy, fosfát tryptózy (2,95 g/1), 5 % fetálneho hovädzieho séra a 5 % fatálneho teľacieho séra. Získané médium bolo identické s výnimkou vynechania séra. Reaktor obsahujúci Cytodex 2 mikronosiče (Pharmacia) v koncentrácii 5 g/1 bol očkovaný 3 x 10⁹ BRL CA buniek, ktoré rástli vo valcovitých nádobách a prenesených trypsinizáciou. Bunky boli ponechané osem dní, aby sa pripojili a rástli na mikronosičoch. Rastové médium bolo perfundované reaktorom v závislosti od spotreby glukózy. Koncentrácia glukózy bola udržiavaná na približne 1,5 g/1. Po ôsmich dňoch bol reaktor perfundovaný šiestimi objemami média bez obsahu séra s cieľom odstrániť väčšinu séra (koncentrácia proteínu < 50 pg/ml). Reaktor bol potom vsádzkovo prevádzkovaný, dokiaľ koncentrácia glukózy neklesla pod 2 g/1. Od tohto bodu ďalej pracoval reaktor v kontinuálnej perfúznej rýchlosti asi 10 l/deň. pH kultúry bolo udržiavané na 6,9 ±0,3 úpravou rýchlosti prietoku CO₂. Rozpustený kyslík bol udržiavaný na viac ako 20 % sýtením vzduchom a ak je to potrebné, dopĺňaním čistým kyslíkom. Teplota bola udržiavaná na 37 ±0,5 °C.

Z uvedeného systému bolo získaných približne 336 litrov kondiciovaného média neobsahujúceho sérum a bolo použité ako východiskový materiál na čistenie prirodzeného od cicavčích buniek odvodeného potkanieho SCF.

C. Čistenie

Všetky práce zamerané na čistenie boli uskutočňované pri 4 °C, ak nie je uvedené niečo iné.

1. Aniónovýmenná chromatografia na DEAE-celulóze

Kondiciované médium získané zo sérum neobsahujúcej kultivácie BRL 3A buniek bolo čistené filtráciou cez 0,45 pm Sartocapsules (Sartorius). Niekoľko rôznych podielov (41 1, 27 1, 39 1, 30,2 1, 37,5 1 a 161 1) bolo oddelene zahustených, spracovaných výmenou diafiltrácia/pufer a anionovýmennou chromatografiou na DEAE-celulóze, rovnakým postupom pre každý podiel. DEAE-celulózové pooly potom boli spojené a spracované ďalej ako jeden podiel v sekcii C2-5 tohto príkladu. Na ilustráciu, spracovanie 41 1 bolo nasledujúce. Filtrované kondiciované médium bolo zahustené na -700 ml pri použití ultrafiltračného zariadenia s tangenciálnym tokom Millipore Pellicon s kazetou deliacou polysulfónové membrány 10 000 mol. hmotnosť (20 ft² celková plocha membrány; rýchlosť toku -1095 ml/min. a filtračná rýchlosť 250 až 315 ml/min.). Diafiltračná/pufrová výmena pri príprave na anionovýmennú chromatografiu bola uskutočnená pridaním 500 ml 50 mM tris-HCl, pH 7,8 ku koncentrátu, opäť sa zahustilo na 580 ml pri použití ultrafiltračného zariadenia s tangenciálnym tokom a toto bolo opakované šesťkrát. Zahustený/diafiltrovaný prípravok bol nakoniec získaný v objeme 700 ml. Prípravok bol aplikovaný na stĺpec anionovýmenncj DEAE-celulózy (5 x 20,4 cm, Wahtman DE-52 živice), ktorá bola ekvilibrovaná 50 mM tris-HCl, pH 7,8 pufer. Po aplikácii vzorky bol stĺpec pre mytý 2050 ml tris-HCl pufra a soľným gradientom (0 až 300 mM NaCl v tris-HCl pufri, 4 1 celkový objem). Frakcie boli odobrané pri rýchlosti prietoku 167 ml/h. Chromatografia je uvedená na obr. 1. HPP-CFC počet kolónií zodpovedá biologickej aktivite v skúške HPP-CFC; bolo skúmaných 100 μΐ z indikovaných frakcií. Frakcie odobrané počas aplikácie vzorky a vymyté nie sú uvedené na obrázku, v týchto frakciách nebola dokázaná žiadna biologická aktivita.

Správanie všetkých podielov kondiciovaného média podrobených zahusteniu, výmene diafiltrácia/filter a aníonovýmennej chromatografii bolo rovnaké. Koncentrácie proteínu vo všetkých podieloch, stanovené podľa Bradforda (Anál. Biochem. 72, 248 - 254 (1976)) s hovädzím sérovým albumínom ako štandardom, boli v rozmedzí 30 až 50 kg/ml. Celkový objem kondiciovaného média použitého v tejto príprave bol 336 1.

2. ACA 54 gélová filtračná chromatografia

Frakcie majúce biologickú aktivitu zo spracovania na stĺpcoch DEAE-celulóza pre každých šesť podielov kondiciovaného média uvedených skôr (napríklad frakcie 87 až 114 uvedené na obr. 1) boli spojené (celkový objem 2900 ml) a zahustené na celkový objem 74 ml pri použití miešaných zariadení Amicon a YM10 membrán. Tento materiál bol aplikovaný na ACA 54 (LKB) gélový filtračný stĺpec (obr, 2) ekvilibrovaný v 50 mM tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 7,4. Frakcie s objemom 14 ml boli odobrané pri prietokovej rýchlosti 70 ml/h. Vďaka inhibičným faktorom koeluvaným s aktívnymi frakciami, sa pík aktivity (počet HPP-CFC stĺpec) javí rozštiepený, ale vzhľadom na predchádzajúce chromatogramy, aktivita koeluuje s hlavným proteínovým píkom, a preto bol pripravený jeden pool frakcii.

3. Chromatografia na agaróze s aglutinínom z pšeničných klíčkov

Frakcie 70 - 112 z gélovej filtrácie na stĺpci ACA 54 boli spojené (500 ml). Pool bol rozdelený na polovicu a každá polovica bola spracovaná chromatografiou na stĺpci agarózy s aglutinínom z pšeničných klíčkov (5 x 24,5 cm, živica od E-Y Laboratories, San Matco, CA; aglutinín z pšeničných klíčkov rozpoznáva určité karbohydrátové štruktúry) ekvilibrované v 20 mM tris-HCl, pH 7,4. Po aplikácii vzorky bol stĺpec premytý asi 2200 ml pufra stĺpca a elúcia viazaného materiálu potom bola uskutočnená aplikácia roztoku 350 mM N-acetyl-D-glukozamínu rozpusteného v pufri stĺpca, pri začiatku pri frakcii -210 na obr. 3. Frakcie 13,25 ml boli odobrané pri rýchlosti prietoku 122 ml/h. Priebeh jednej chromatografie je uvedený na obr.

3. Podiely frakcií určených na skúšanie boli dialyzované proti fosfátom pufrovanému salinickému roztoku; 5 μΐ dialyzovaných materiálov bolo umiestených do MC/9 skúšky (cpm hodnoty na obr. 3) a 10 μΐ do HPP-CFC skúšky (číselné hodnoty na obr. 3). Je zrejmé, že aktívny materiál viazaný na kolónu bol potom eluovaný N-acetyl-Dglukozamínom, pričom kolónou počas aplikácie vzorky a premývania prešiel kontaminujúci materiál.

4. Kationovýmenná chromatografia na S-Sepharose s rýchlym prietokom

Frakcie 211 až 125 z chromatografie na agaróze s aglutinínom z pšeničných klíčkov, uvedené na obr. 3, a ekvivalentné frakcie z druhého pokusu boli spojené (375 ml) a dialyzované proti 25 mM mravčanu sodnému, pH 4,3. S cieľom minimalizovať čas vystavenia účinku nízkeho pH, bola dialýza uskutočňovaná počas obdobia 8 h, proti 5 1 pufra, so štyrmi zmenami počas 8-hodinového obdobia. Na konci tohto dialyzačného obdobia bol objem vzorky

480 ml, pH a vodivosť vzorky boli blízke týmto hodnotám dialyzačného pufra. Počas dialýzy sa objavil vo vzorke vyzrážaný produkt. Tento bol odstránený odstredením pri 22 000 g počas 30 minút a supematant z odstredenej vzorky bol aplikovaný na kolónu katiónovej výmeny na S-Sepharose s rýchlym prietokom (3,3 x 10,25 cm; živica od íy Pharmacia), ktorá bola ekvilibrovaná v pufri - mravčane sodnom. Rýchlosť prietoku bola 465 ml/h a boli odobrané frakcie 14,2 ml. Po aplikácii vzorky bola kolóna premytá 240 ml pufra a elúcia nadviazaného materiálu bola uskutočnená aplikáciou gradientu 0 - 750 mM NaCl :NaCl rozpustený v pufri pre kolónu, celkový objem gradientu 2200 ml), začiatok pri frakcii -45 na obr. 4. Elučný profil je uvedený na obr. 4. Spojené frakcie boli upravené na pH 7 - 7,4 pridaním 200 μΐ 0,97 M tris bázy, cpm na obr. 4 sa týka výsledkov získaných v MC/9 biologickej skúške; podiely indikovaných frakcií boli dialyzované proti fosfátom pufrovanému salinickému roztoku a boli použité v množstve 20 μΐ na túto skúšku. Z obr. 4 je zrejmé, že hlavný podiel biologicky aktívneho materiálu prešiel kolónou nenadviazaný, zatiaľ čo kontaminujúci materiál nadviazaný bol a bol eluovaný v soľnom gradiente.

5. Chromatografia používajúca uhľovodíkové živice nadviazané na oxide kremičitom

Frakcie 4 - 40 z kolóny S-Sepharosy na obr. 4 boli spojené (540 ml). 450 ml tohto poolu bolo spojených s rovnakým objemom pufra B (100 mM octanu amónneho, pH 6:izopropanol) a aplikovaných prietokovou rýchlosťou 540 ml/h na C₄ kolónu (Vydac Proteins C₄, 2,4 x 2 cm) ekvilibrovanú pufrom A (60 mM octan amónny, pH 6:izopropanol, 62,5 : 37,5). Po aplikácii vzorky bola prietoková rýchlosť znížená na 154 ml/h a kolóna bola premytá 200 ml pufra A. Potom bol aplikovaný lineárny gradient od pufra A k pufru B (celkový objem 140 ml) a boli odobrané frakcie 9,1 ml. Podiely poolu z chromatografie na S-Sepharose, východisková vzorka z kolóny C₄, súhrn poolu a premytý pool boli upravené na 40 pg/ml hovädzieho sérového albumínu pridaním vhodného objemu zásobného roztoku s koncentráciou 1 mg/ml a dialyzované proti fosľátom pufrovanému salinickému roztoku na prípravu biologickej štúdie. Podobne boli 40 μΐ podiely gradientových frakcií spojené s 360 μΐ fosfátom pufrovaného salinického roztoku obsahujúceho 16 pg hovädzieho sérového albumínu a tieto boli potom dialyzované proti fosfátom pufrovanému salinickému roztoku na prípravu biologickej štúdie. Tieto rôzne frakcie boli skúšané MC/9 skúškou (6,3 μΐ podiely pripravených gradientových frakcií, cpm na obr. 5). Výsledky skúšky tiež ukazujú, že asi 75 % získanej aktivity bolo v súhrnných a premytých frakciách a 25 % gradientových frakciách, ako je to uvedené na obr. 5 SDS-PAGE (Laemmli, Náture, 227, 680 - 685 (1970)); zásobné gély obsahujú 4 % (hmotn./obj.) akrylamidu a deliace gély obsahujú 12,5 (hmotn./obj.) akrylamidu; podiely rôznych frakcií sú uvedené na obr. 6. Na gélové spracovanie boli podiely vzoriek sušené pri vákuu a potom opäť rozpustené pri použití 20 pl vzorky ošetrenej pufrom (neredukujúcim, to znamená bez 2-merkaptoetanolu) a varené 5 minút pred nanesením na gél. Dráhy A a B predstavujú východiskový kolónový materiál (75 pl z 890 ml) a materiál, ktorý prešiel kolónou (75 pl z 880 ml), očíslované značky na ľavej strane obr. predstavujú migračné polohy (redukované) markérov, majúcich molekulovú hmotnosť 10³-krát väčšiu než indikované hodnoty, kde markéry sú fosforyláza B (M_r 97 400), hovädzí sérový albumín (M_r 66 200), ovalbumín (M_r 42 700), uhlíkatá anhydráza (M_r 31 000), inhibítor trypsínu sójových bôbov (M_r 21500) a lyzozým (M_r

400), dráhy 4-9 predstavujú zodpovedajúce frakcie odoberané počas aplikácie gradientu (60 μΐ z 9,1 ml). Gél bol postriebrený (Morrissey, Anál. Biochem., 117, 307 až 310 (1981)). Z porovnaní dráh A a B je zrejmé, že hlavná časť farbeného materiálu prešla kolónou. Zafarbený materiál vo frakciách 4 - 6 v uvedenej oblasti a pod M_r 31 000 polohou štandardu zodpovedá biologickej aktivite detegovanej vo frakciách gradientu (obr. 5) a predstavuje biologicky aktívny materiál. Je nutné poznamenať, že tento materiál je vizualizovaný v dráhach 4-6, ale nie v dráhach A a/alebo B, pretože bol oveľa väčší podiel celkového objemu (0,66 % celkového objemu frakcií 4-6 verzus 0,0084 celkového objemu pre dráhy A a B) použitý na spracovanie. Frakcie 4 - 6 z tejto kolóny boli spojené.

Ako je uvedené, približne 75 % získanej aktivity prešlo C₄ kolónou, obr. 5. Tento materiál bol rechromatografovaný na použitie C₄ živice v podstate už opísanej s tým rozdielom, že boli použité väčšie kolóny (1,4 x 7,8 cm) a nižšia prietoková rýchlosť (50 - 60 ml/h). Približne 50 % získanej aktivity bolo v prietoku a 50 % vo frakciách gradientových, majúcich podobný priebeh pri SDS-PAGE ako aktívne gradientové frakcie na obr. 6. Aktívne frakcie boli spojené (29 ml).

Analytická C₄ kolóna bola zrealizovaná v podstate ako je uvedené a frakcie boli skúšané obidvoma skúškami. Ako je uvedené na obr. 7, frakcie z analytickej kolóny koeluovali tak MC/9, ako aj HPP-CFC bioaktivity. SDS-PAGE analýza (obr. 8) odhaľuje prítomnosť M_r -31 000 proteinu vo frakciách z kolóny, ktoré obsahujú biologickú aktivitu v obidvoch skúškach.

Aktívny materiál v piku druhej (relatívne malej) aktivity, zrejmý v S-Sepharosovej chromatografii (to znamená obr. 4, frakcie 62 - 72, skoršie frakcie v soľnom gradiente) bol tiež čistený C₄ chromatografiou. Má rovnaké správanie pri SDS-PAGE a mal rovnaké N-terminálne aminokyselinové sekvencie (pozri príklad 20) ako materiál získaný C₄ chromatografiou na frakciách, ktoré prešli S-Sepharosou.

6. Zhrnutie čistenia

Zhrnutie stupňov čistenia opísaných v stupňoch 1 - 5 je uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2

Zhrnutie čistených cicavčích SCF

Stupeň	celkovo
objem (ml)	protein (mg)5
kondiciované médium	335,700	13,475
DEAE celulóza1	2,900	2,164
ACA-54	550	1,513
aglutinín pšeničných	375	431
klíčkov-agaróza2
S-Sepharosa	5404	10
C4 živica3	57,3	0,25 - 0,406

¹ Uvedené hodnoty predstavujú súhrn hodnôt z rôznych vsádzok opísaných v texte.

² Ako je opísané v príklade, vyzrážaný materiál, ktorý sa objavil počas dialýzy vzorky v príprave pre S-Sepharosovú chromatografiu, bol odstránený odstredením. Vzorka po odstredení (480 ml) obsahovala 264 mg celkového proteinu.

³ Kombinácia aktívnych gradientových frakcií z dvoch pokusov na C₄ kolónach v sekvencii, ako je opísané.

⁴ Len 450 ml tohto materiálu bolo použitých pre nasledujúci stupeň (tento príklad, vyššie).

⁵ Stanovené metódou podľa Bradforda (supra, 1976), ak nie je uvedené niečo iné.

⁶ Hodnotené podľa intenzity potiahnutia striebrom po SDS-PAGE a podľa analýzy aminokyselín, ako je opísané v sekcii K príkladu 2.

D. SDS-PAGE a spracovanie glykozidázou

SDS-PAGE spojeného gradientu frakcií z dvoch pokusov na kolóne C₄ vo veľkej mierke sú uvedené na obr. 9. Šesťdesiat μί poolu z prvej C₄ kolóny bolo použitých (dráha 1) a 40 μί poolu z druhej C. kolóny (dráha 2) v pokuse. Tieto gélové dráhy boli postriebrené. Markery molekulovej hmotnosti boli,s ako je opísané pri obrázku 6. Ako bolo uvedené, materiál migrujúci nad a pod M_r 31000 markerovú polohu predstavuje biologický aktívny materiál; zrejmá heterogenita je väčšinou spôsobená heterogenitou v glykozylácii.

S cieľom charakterizovať glykozyláciu bol čistený materiál jódovaný pomocou ¹²⁵I, spracovaný s rôznymi glykozidázami a analyzovaný pomocou SDS-PAGE (redukčné podmienky) autorádiografiou. Výsledky sú uvedené na obr. 9. Dráhy 3 a 9, ^l25l-značený materiál bez akéhokoľvek ošetrenia glykozidázou. Dráhy 4 - 8 predstavujú ¹²³I-značený materiál ošetrený glykozidázou nasledujúcim spôsobom. Dráha 5 neuraminidázou a O-glykanázou. Dráha 6 N-glykanázou. Dráha 7 neuraminidázou a N-glykanázou. Dráha 8 neuraminidázou, O-glykanázou a N-glykanázou. Podmienky boli 5 mM 3-[(cholamidopropyl)dimetylamónio]-l-propánsulfonát (CHAPS), 33 mM 2-merkaptoetanol, 10 mM tris-HCl, pH 7 - 7,2 3 h pri 37 °C. Neuraminidáza (z Arthrobacter ureaíaciens, Calbiochem) bola použitá v konečnej koncentrácii 0,23 jednotiek/ml. O-Glykanáza (Genzym, endo-alfa-N-acetyl-galaktozaminidáza) bola použitá v koncentrácii 45 milijednotiek/ml. N-Glykanáza (Genzym, peptid; N-glykozidáza F; peptid-N⁴-(N-acetyl-beta-glukozaminyl)asparagín amidáza) bola použitá v koncentrácii 10 jednotiek/ml.

Rovnaké výsledky ako na obr. 9 boli získané pri spracovaní neznačeného čisteného SCF glykozidázou a vizualizáciou produktu postriebrením po SDS-PAGE.

Príležitostne boli uskutočnené rôzne kontrolné inkubácie. Tieto zahrnujú: inkubáciu vo vhodnom pufri, ale bez glykozidázy, na overenie, že výsledky boli získané pôsobením pridaného glykozidázového prípravku; inkubácie s glykozylovaným proteínom (to znamená glykozylovaný rekombinantný ľudský erytropoetín) známym ako substrát pre glykozidázu, na overenie, že použitý glykozidázový enzým bol aktívny; a inkubácie s glykozidázou ale bez substrátu, na overenie, že glykozidáza samotná nevytvára pruhy na vizualizovanom géli.

Ošetrenie glykozidázou bolo tiež uskutočnené s endobeta-N-acetylglukozamidázou (endo F; NEN Dupont) a s endo-beta-N-acetylglukozaminidázou H (endo H, NEN Dupont), vždy s vhodnými kontrolnými inkubáciami. Podmienky ošetrenia s endo F boli: var 3 in v prítomnosti 1 % (hmotn./obj.) SDS, 100 mM 2-merkaptoetanol, 100 mM EDTA, 320 mM fosfát sodný, pH 6, nasledovaný 3-násobným zriedením s Nonidetom P-40 (1,17 %, obj./obj., konečná koncentrácia), fosfát sodný (200 mM, konečná koncentrácia) a endo F (7 jednotiek/ml, konečná koncentrácia). Podmienky endo H ošetrenia boli rovnaké s tou výnimkou, že SDS koncentrácia bola 0,5 % (hmotn./obj.) a endo H bola použitá v koncentrácii 1 pg/ml. Výsledky s endo F boli rovnaké ako s N-glykanázou, zatiaľ čo endo H bola na čistenom CF materiáli neúčinná.

Závery, ktoré je možné z výsledkov odvodiť, sú opísané ďalej pre pokusy s glykozidázou. Rôzne ošetrenia s N

SK 281486 Β6

-glykanázou (ktorá odstraňuje tak komplex, ako aj vysoko manéžový N-zosieťovaný karbohydrát (Tarentino a spol., Biochemistry 24, 4665 - 4671 (1985)), endo F (pôsobí rovnako ako N-glykanáza (Elder a Alexander, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4540 - 4544 (1982)), endo H (odstraňuje ako vysokú manózu, tak aj určitý hybridný typ N-zosieťovaného karbohydrátu (Tarentino a spol., Methods Enzymol. 50C, 574 - 580 (1978)), neuraminidázou (odstraňuje zvyšky sfialovej kyseliny) a O-glykanázou (odstraňuje určité O-zosietené karbohydráty (Lambin a spol., Biochem. Soc. Trans. 12, 599 - 600 (1984)) potvrdzujú, že: sú prítomné tak N-zosietené, ako aj O-zosietené karbohydráty, najväčší podiel N-zosieteného karbohydrátu je komplexného typu aje prítomná sialová kyselina, kde aspoň časť je vo forme O-zosietených skupín. Niektoré údaje o možných miestach N-zosietení môžu byť získané z aminokyselinových sekvenčných údajov (príklad 2). Skutočnosť, že ošetrenie N-glykanázou, endo F a N-glykanázou/neuraminidázou môže previesť heterogénny materiál, ako je zrejmé podľa SDS-PAGE, na rýchlo migrujúce formy, ktoré sú homogénnejšie, je v súlade so záverom, že všetok materiál predstavuje rovnaký polypeptid, s heterogenitou spôsobenou heterogenitou pri glykozylácii. Je tiež pozoruhodné, že najmenšie formy získané kombináciami ošetreniami s rôznymi glykozylázami sú v rozmedzí M_r 18 000 - 20 000 vzhľadom na merkery molekulovej hmotnosti použité v SDS-PAGE.

Potvrdenie, že difúzne migrujúci materiál okolo platne M_r 31 000 na SDS-PAGE predstavuje biologický aktívny materiál, ktorý má rovnaký polypeptidový reťazec, je dané skutočnosťou, že aminokyselinové sekvenčné údaje získané z materiálu migrujúceho v tejto oblasti (napr. po elektroforetickom transfere a ošetrení brómkyánom, príklad 2) zodpovedajú tým, ktoré boli demonštrované pre izolovaný gén, ktoré expresia rekombinantnej DNA vedie k biologicky aktívnemu materiálu (príklad 4).

Príklad 2

Aminokyselinová sekvenčná analýza cicavčieho SCF

A. Vysoko účinná kvapalinová chromatografia s reverznou fázou (HPLC) čisteného proteínu

Približne 5 pg SCF čisteného ako v príklade 1 (koncentrácia = 0,117 mg/ml) sa podrobí HPLC s reverznou fázou pri použití C₄ úzko vŕtanou kolónou (Vydac, 300 A vŕtanie, 2 mm x 15 cm). Proteín bol eluovaný lineárnym gradientom 97 % mobilnej fázy A (0,1 % kyselina trifluóroctová)/3 % mobilnej fázy B (90 % acetonitrilu v 0,1 % kyseline trifluóroctovej) do 30 % mobilnej fázy A/70 % mobilnej fázy B počas 70 min. s nasledujúcou izokratickou elúciou počas ďalších 10 minút pri prietokovej rýchlosti 0,2 ml za min. Po odčítaní slepého chromatogramu pufŕa sa SCF javí ako jednotlivý symetrický pruh (pík) s retenčným časom 70,05 min., ako je uvedené na obr. 10. Pri týchto podmienkach nebol detegovaný žiadny hlavný pík kontaminujúceho proteínu.

B. Sekvencovanie elektroforeticky transferovaných proteínových pruhov

SCF čistený ako v príklade 1 (0,5 - 1,0 nmol) sa nasledujúcim spôsobom ošetrí N-glykanázou, enzýmom, ktorý špecificky štiepi Asn-zosietené karbohydrátové skupiny kovalentne pripojené k proteínom (pozri príklad ID). Šesť ml poolovaného materiálu z frakcií 4 - 6 z C₄ kolóny na obr. 5 sa suší pri vákuu. Potom sa pridá 150 μί 14,25 mM CHAPS, 100 mM 2-merkaptoetanolu, 335 mM fosforečnanu sodného, pH 8,6 a inkubácia sa uskutočňuje počas 95 minút pri 37 °C. Pridá sa 300 μί 74 mM fosforečnanu sodného, 15 jednotiek/ml N-glykanázy, pH 8,6 a v inkubácii sa pokračuje 19 h. Vzorka sa potom spracuje na 9 - 18 % SDS-polyakrylamidovom gradientovom géli (0,7 mm hrúbka, 20 x 20 cm). Proteínové pruhy v géli sa elektroforeticky prenesú do polyvinyldifluoridu (PVDF, Milipore Corp.) pri použití 10 mM Caps pufra (pH 10,5) pri konštantnom prúde 0,5 Amp počas 1 h (Matsudaira, J. Biol. Chem., 261, 10 035 - 10 038 (1987)). Prenesené proteínové pruhy sa vizualizujú Coomasie Blue. Pruhy sú prítomné pri M_r -29 000 - 33 000 a M_r -26 000, to znamená deglykozylácia bola len čiastočná (príklad ID, obr. 9); skorší pruh predstavuje neštiepený materiál a neskorší predstavuje materiál, z ktorého je odstránený N-zosietený karbohydrát. Pruhy boli vyrezané a priamo vložené (40 % pre M_r 29 000 až 33 000 proteínu a 80 % pre M_r 26 000 proteínu) na proteínový sekvenátor (Applied Biosystems Inc., Model 477). Analýza proteínovej sekvencie bola uskutočnená pri použití programov odporúčaných výrobcom (Hewick a spol., J. Biol. Chem., 256 7990 - 7997)) a uvoľnené fenyltiohydantionylaminokyseliny boli analyzované on-line pri použití mikrovŕtanej C₁₈ HPLC s reverznou fázou. Obidva pruhy nedávajú signály pre 20 - 28 sekvenčné cykly, čo potvrdzuje, že sú obidva nesekvencovateľné metódou využívajúcou Edman chémiu. Základná hladina každého sekvencovania bola medzi 1 - 7 pmol, je ďaleko nižšia ako množstvo proteínu prítomné v pruhu. Tieto údaje potvrdzujú, že proteín v pruhoch bol N-koncovo blokovaný.

C. In situ CNBr štiepenie elektroforeticky transferovaného proteínu a sekvencovanie

Na potvrdenie, že proteín bol skutočne blokovaný, bola zo sekvenátora odstránená membrána (časť B) a bolo uskutočnené štiepenie brómkyánu in situ (CNBr 5 %, hmotn./obj.) v 70 % kyseline mravčej 1 h pri 45 “C (s nasledujúcim sušením a sekvenčnou analýzou). Boli detegované silné sekvenčné signály predstavujúce vnútorné peptidy získané zo štiepenia metionylpeptidovej väzby pomocou CNBr.

Obidva prvky poskytujú identické zmesové sekvenčné signály uvedené ďalej v prvých piatich cykloch.

Identifikované aminokyseliny

Cyklus 1: Asp, Glu, Val, íle, Leu Cyklus 2: Asp, Thr, Glu, Ala, Pro, Val Cyklus 3: Asn, Ser, His, Pro, Leu Cyklus 4: Asp, Asn, Ala, Pro, Leu Cyklus 5: Ser, Tyr, Pro

Obidva pruhy tiež poskytujú podobné signály až do 20 cyklov. Začiatočné výťažky boli 4C-115 pmol pre M_r 26 000 pruh a 40 - 150 pmol pre M_r 29 000 - 33 000 pruh. Tieto hodnoty sú porovnateľné s pôvodným molámym množstvom proteínu vloženým do sekvenátora. Výsledky potvrdzujú, že proteínové pruhy, zodpovedajúce SCF, obsahujú blokovaný N-koniec. Postupy použité na získanie potrebných sekvenčných informácií pre N-koncovo blokované proteíny zahrnujú: a) odblokovanie N-konca (pozri sekcia D) a b) získanie peptidov vnútorným štiepením pomocou CNBr (pozri sekcia E), trypsínom (pozri sekcia F) a Staphylococcus aureus (kmeň V-8) proteázou (Glu-C) (pozri sekcia G). Sekvenčná analýza môže byť uskutočnená po odstránení blokovanej N-koncovej aminokyseliny alebo po izolácii peptidových fragmentov. Príklady sú detailne opísané ďalej.

D. Sekvenčná analýza faktora BRL kmeňových buniek po spracovaní s pyroglutámovou kyselinou-aminopeptidázou

Predpovedať chemický charakter blokujúcej skupiny prítomnej na aminozakončení SCF bolo ťažké. Blokovanie môže byť post-translačné in vivo (F. Wold, Ann. Rev. Biochem., 50, 783 - 814 (1981)) alebo môže vznikať in vitro počas čistenia. Obvykle sú najčastejšie pozorované dve post-translačné modifikácie. Môže prebiehať acetylácia určitých N-koncových aminokyselín, ako je Ala, Ser atď., katalyzovaná Ν-α-acetyltransferázou. To môže byť potvrdené izoláciou a analýzou hmotnostnou spektrometriou N-koncovo blokovaného peptidu. Ak je aminozakončením peptidu glutamín, môže prebiehať deamidácia jeho gama -amidu. Môže potom prebiehať cyklizácia zahrnujúca gamakarboxylát a voľný N-koniec za vzniku pyroglutamátu. Na detekciu pyroglutamátu môže byť použitý enzým pyroglutamát aminopeptidáza. Tento enzým odstraňuje pyroglutamátový zvyšok, štiepiaci voľný aminokoniec druhej aminokyseliny. Na sekvencovanie môže byť použitá Edmanova chémia.

SCF (čistený ako v príklade 1, 400 pmol) v 50 mM sodnom fosfátovom pufri (pH 7,6, obsahujúci ditiotreitol a EDTA) bol inkubovaný s 1,5 jednotkami pyroglutámovej kyseliny aminopeptidázy teľacích pečení (pE-AP) po 16 h pri 37 °C. Po reakcii bola zmes priamo vložená do proteínového sekvenátora. Hlavné sekvencie boli identifikované po 46 cykloch. Začiatočný výťažok bol asi 40 % a opakovaný výťažok bol 94,2 %. N-terminálne sekvencie SCF zahrnujúce N-koncovú pyroglutámovú kyselinu sú: PE-AP miesto štiepenia pyroGlu-Glu-Ile-Cys-Arg-Asn-Pro-Vla10 20

-Thr- ^AsP - Asn-V al-Lys- Asp-Ile-Thr-Lys-Leu-Val-^Ala 30

-Asn-Leu-Pro-Asn-Asp-Tyr-Met-Ile-Thr- Leu -Asn-Tyr-Val-Ala-Gly-Met-Asp-Val-Leu- -Ser-His-xxx-Trp-Leu-Arg-Asp-......

xxx, v polohe 43 nestanovené

Tieto výsledky dokazujú, že SCF obsahuje na svojom N-konci pyroglutámovú kyselinu.

E. Izolácia a sekvenčná analýza CNBr peptidov

SCF čistený ako v príklade 1 (20 - 28 pg), (1,0 až 1,5 nmol) bol spracovaný s N-glykanázou, ako je opísané v príklade 1. V tomto prípade bola premena na materiál M_r 26 000 kompletná. Vzorka bola sušená a štiepená CnBr v 70 % kyseline mravčej (5 % počas 18 h pri teplote miestnosti). Po štiepení bol materiál zriedený vodou, sušený a opäť rozpustený v 0,1 % kyseliny trifluóroctovej. CNBr peptidy boli oddelené v HPLC s reverznou fázou pri použití C₄ narrowbore kolónou pri elučných podmienkach rovnakých, ako sú opísané v sekcii A tohto príkladu. Niektoré hlavné peptidové frakcie boli izolované a sekvencované a výsledky sú sumarizované takto:

Peptid	retenčný čas (min)	sekvencie
CB-4	15,5	L-P-P—
CB-61	22,1	a. I-T-L-N-Y-V-A-G-(M) b. V-A-S-D-T-5-D-C-V-L-S-_-_-L-G- P-E-K-D-S-R-V-S-V-(_)-K----
CB-B	28,0	D-V-L—P-S-H-C-W-L-R-D-(M)
CB-10	30,1	(s obeabos sekvencie CB-B)
CB-152	43,0	E-E-N-A-P-K-N-V-K-E-S-Ľ-K-K-P-T-
		R- (N)-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F-D3-R-S-
		I-D-A------
CB-14 a	37,3
CB-16		obidva peptidy obsahujú sekvenciu CB-15

¹ Neboli detegované aminokyseliny v polohách 12, 13 a 25. Peptid b nebol sekvencovaný na konci.

² (N) v CB-15 nebol detegovaný, bol odhadnutý ako potenciálne miesto N-glykozylácie. Peptid nebol na konci sekvencovaný.

³ Označené miesto, kde Asn môže byť prevedený na Asp N-glykanázovým odstránením N-pripojeného cukru.

⁴ Bol použitý nasledujúci písmenový kód: A Ala, C Cys, D Asp, E Glu, F Phe, G Gly, H His, I íle, K Lys, L Leu, M Met, N Asn, P Pro, Q Gin, R Arg, S Ser, T Ihr, V Val, W Trp a Y Tyr.

F. Izolácia a sekvencovanie faktora BRL kmeňových buniek ako tryptických fragmentov

SCF čistený ako v príklade 1 (20 pg v 150 μί 0,1 M hydrogénuhličitanu amónneho) bol štiepený 1 pg trypsínu pri 37 °C počas 3,5 h. Materiál bol ihneď prevedený na narrowbore C₄ HPLC pri použití elučných podmienok, ako sú opísané v sekcii A tohto príkladu. Všetky eluované peptidové piky mali retenčné časy od neštiepeného SCF (sekcie A). Sekvenčná analýza izolovaných peptidov je uvedená ďalej:

Peptid retenčný sekvencie čas (min)

T-l7,1

T-2¹28,1

T-332,4

T-4²40,0

T-5³46,4

E-S-L-K-K-P-E-T-R

V-S-V-(_)-K

I-V-D-D-L-V-A-A-M-E-B-N-A-P-K H-F-T-p-g-B-F-y-S-I-F- (_)-R &. L-V-A-N-L-P-N-D-Y-M-I-T-L-N-Y-V-A-Gm-d-v-l-p-s-h-c-w-l-r

T-7*

T-8

b. S-I-D-A-F-K-D-F-N-V-A-S-D—T-S-D-C-VL-S-(_)-(_)-L-C---72,8 E-S-L-K-K-P-E-T-R-(N)-P-T-P-E-E-F-F_S-I-F-(_)-R

73,6 E-S-L-K-K-P-E-T-R-M-P-T-P-E-E-F-F-S-IF-D-R ¹ Aminokyselina v polohe 4 nebola označená.

² Aminokyselina v polohe 12 nebola určená.

³ Aminokyseliny v polohách 20 a 21 v 6 peptide T-5 neboli identifikované, boli odhadom určené ako miesta O-pripojenia cukru.

⁴ Aminokyselina v polohe 10 nebola detegovaná, bola považovaná na Asn vzhľadom na potenciálne N-viazané glykozylačné miesto. Aminokyselina v polohe 21 nebola detegovaná.

G. Izolácia a sekvencovanie peptidov faktora BRL kmeňových buniek po štiepení S. aureus Glu-C proteázou

SCF čistený ako v príklade 1 (20 pg v 150 pl 0,1 M hydrogénuhličitanu amónneho) bol podrobený štiepeniu Glu-C proteázou pri pomere proteáza-substrát 1 : 20. Štiepenie bolo uskutočnené pri 37 °C počas 18 hodín. Materiál bol ihneď oddelený marrowbore C₄ HPLC s reverznou fázou. Bolo oddelených päť hlavných peptidových frakcií a tieto boli sekvencované:

Peptid	retenčný čas (sin)	sekvencia4
S-l	5,1	N-A-P-K-N-V-K-E
S-21	27,7	S-R-V~S-(_)-K-P-F—M-I»-P-P”V-A-(A)
S-32	46,3	nedetegovaná žiadna sekvencia
S-53	71,0	S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F- (M)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D
S-63	72,6	S-L-K-K-P-E-T-R-N-F-T-P-E-E-F-F-S-I-F(M)-R-S-I-D-A-F-K-D-F-M-V-A-S-D-T-S-D

¹ Aminokyselina v polohe 6 S-2 peptidu nebola určená, mohlo by to byť miesto pripojenia O-viazaného cukru. Ale v polohe 16 S-2 peptidu bol detegovaný v nízkom výťažku.

² Peptid S-3 môže byť N-koncovo blokovaný peptid odvodený od N-konca SCF.

³ N v zátvorkách označuje potenciálne miesto pripojenia N- viazaného cukru.

H. Sekvenčná analýza faktora BRL kmeňových buniek po štiepení BNPS-skatolom

SCF (2 pg) v 10 mM hydrogenuhličitane amónnom bol úplne vysušený vákuovým odstreďovaním a potom opäť rozpustený v 100 μΐ ľadovej kyseliny octovej. 10- až 20-násobný molámy prebytok BNPS-skatolu bol pridaný k roztoku a zmes bola inkubovaná pri 50 °C počas 60 min. Reakčná zmes potom bol sušená vákuovým odstreďovaním. Sušený zvyšok bol extrahovaný 100 μΐ vody a opäť 50 μΐ vody. Spojené extrakty potom boli podrobené opísanej sekvenčnej analýze. Bola detegovaná nasledujúca sekvencia:

10 Leu-Arg-Äsp-Met-Val-Thr-Hls-Leu-Ser-VaL-Ser-Leu-Thr-Thr-Ijeu-Leu20 30

Asp-Lys-Phe-Ser-Asn-Ile-Ser-Glu-Gly-Leu-Ser-(Äsn)-Tyr-Ser-Ile-Ile

Asp-Lys-Leu-Gly-Ile-Val-Asp---Poloha 28+ nebola pozitívne určená, bola určená ako Asn ako potenciálne miesto N-viazanej glykozylácie.

Podiel SCF proteínu (500 pmol) bol pufrom prevedený do 10 mM octanu sodného, pH 4,0 (celkový objem 90 μί) a bol pridaný Brij-35 v koncentrácii 0,05 % (hmotn./obj.). 5 μΐ podiel bol odobraný na kvantifikáciu proteínu. Štyridsať μί vzorky bolo zriedených na 100 μΐ opísaným pufrom. Bola pridaná karboxypeptidáza P (z Penicillium janthinellum) pri pomere enzým-substrát 1 : 200. Štiepenie bolo uskutočňované pri 25 °C a boli odobrané 20 μί podiely 0, 15, 30, 60 a 120 min. Štiepenie bolo ukončené v každom čase pridaním trifluóroctovej kyseliny v celkovej koncentrácii 5 %. Vzorky boli sušené a uvoľnené aminokyseliny boli derivatizované reakciou s Dabsylchloridom (dimetylaminoazobenzénsulfonylchlorid) v 0,2 M NaHCOj (pH 9,0) pri 70 °C počas 12 min. (Chán a spol., Methods Enzymol., 90, 41 až 48 (1983)). Derivatizované aminokyseliny (jedna šestina každej vzorky) boli analyzované HPLC narrowbore reverznou fázou s modifikáciou postupu podľa Changa a spol., (Techniques in krotein Chemistry, T. Hugli vyd., Acad. Press, NY (1989), str. 305 - 311). Kvantitatívne zloženie zodpovedajúce určitému času bolo získané porovnaním štandardov derivatizovaných aminokyselín (1 pmol). V čase 0 bol detegovaný kontaminujúci glycín. Alanín bol jedinou aminokyselinou, ktorá stúpala s inkubačným časom. Po 2 hodinách inkubácie bol Ala detegovaný v celkovom množstve 25 pmol, čo je ekvivalentné 0,66 mol Ala uvoľneného na mol proteínu. Výsledok indikuje, že prírodné cicavčie SCF molekuly Ala na svojom karboxylovom konci, čo je v súlade so sekvenčnou analýzou C-koncového peptidu, S-2, ktorý obsahuje C-koncový Ala. Tento záver je tiež v súlade so známou špecifikou karboxypeptidázy P (Lu a spol., J. Chromatog. 447, 351 - 364 (1988)). Napríklad štiepenie prebieha, ak je predpovedaná sekvencia Pro-Val. Peptid S-2 mal sekvenciu S- R-V-S-V-(T)-K-P-P-M-L-P-P-V-A-(A) a bolo predpokladané, že je C-koncovým peptidom SCF (pozri sekcia J tohto príkladu). C-koncová sekvencia —P-V-A-(A) obmedzuje proteázové štiepenie len na alanín. Aminokyselinové zloženie peptidu S-2 indikuje prítomnosť 1 Thr, 2 Ser, 3 Pro, 2 Ala, 3 Val, 1 Met, 1 Leu, 1 Phe, 1 Lys a 1 Arg, celkovo 16 zvyškov. Detekcia 2 Ala zvyškov indikuje, že tu môžu byť dva Ala zvyšky na C-konci tohto peptidu (pozri tabuľka v sekcii G). BRL CSF je tak zakončená Ala 164 alebo Ala 165.

J. Sekvencia SCF

Kombináciou výsledkov získaných zo sekvenčnej analýzy (1) intaktného faktora kmeňových buniek po odstránení jeho N-terminálnej pyroglutámovej kyseliny, (2) CNBr peptidov, (3) trypsín peptidov a (4) Glu-C peptidázových fragmentov, N-koncové sekvencie a C-koncové sekvencie boli dedukované (obr. 11). N-koncová sekvencia začína pri pyroglutámovej kyseline a končí pri Met-48. C-koncová sekvencia obsahuje 84/85 aminokyselín (poloha 82 až 164/165). Sekvencia od polohy 49 do 81 nebola detegovaná v žiadnom z izolovaných peptidov. Ale sekvencia bola detegovaná pri veľkom peptide po BNPS-skatolovom štiepení BRL SCF, ako je opísané v sekcii K tohto príkladu. Z týchto ďalších údajov, ako aj DNA sekvencii získaných z potkanieho SCF (príklad 3) môžu byť N- a C-koncové sekvencic určené a celková sekvencia zostavená; ako je uvedené na obr. 11. N-koniec molekuly je pyroglutámová kyselina a C-koniec je alanín, ako je potvrdené štiepením pyroglutamátaminopeptidázou a karboxypeptidázou P.

Zo sekvenčných údajov je zrejmé, že Asn-72 je glykozylovaný, Asn-109 a Asn-120 sú pravdepodobne glykozylované v niektorých molekulách, ale v iných nie. Asn-65 mohol byť počas sekvenčnej analýzy detegovaný, a preto môže byť len čiastočne glykozylovaný, ak vôbec je. Ser-142, Thr-143 a Thr-155, predpovedané z DNA sekvencie, neboli detegované počas aminokyselinovej sekvenčnej analýzy, a preto mohli byť miestami O-viazaného karbohydrátového pripojenia. Tieto potenciálne miesta karbohydrátového pripojenia sú uvedené na obr. 11; N-viazaný karbohydrát je indikovaný polotučnými písmenami v zátvorkách, O-viazaný karbohydrát voľnými polotučnými písmenami.

K. Analýza zloženia aminokyselín faktora BRL kmeňových buniek

Materiál z C₄ kolóny na obr. 7 bol pripravený na analýzu zloženia aminokyselín zahustením a pufrovou výmenou do 50 mM hydrogenuhličitanu amónneho.

Dve 70 μί vzorky boli oddelene hydrolyzované v 6 N HC1, s obsahom 0,1 % fenolu a 0,05 % 2-merkaptoetanolu pri 110 °C pri vákuu počas 24 hodín. Hydrolyzáty boli sušené, rekonštituované v pufri na báze citrátu sodného a analyzované pri použití ionexovej chromatografie (Beckman Model 6300 analyzátor aminokyselín). Výsledky sú uvedené v tabuľke 3. Použitie 164 aminokyselín (zo sekvenčných proteínových dát) na výpočet zloženia aminokyselín poskytuje lepšiu predpoveď hodnôt než použitie 193 aminokyselín (ako je dedukované z PCR odvodených DNA sekvenčných hodnôt, obr. 14C).

Tabuľka 3

Kvantitatívne zloženie aminokyselín v cicavčom SCF

Aminokyseliny	zloženie aminokyselín mol na mol pratému'	predpovedané zvyšky na molekulu2
pok. č. 1	pok. č. 2	(A)	(B)
Asx	24,46	24,26	25	28
Thr	10,37	10,43	11	12
Ser	14,52	14,30	16	24
Glx	11,44	11,37	10	10
Pro	10,90	10,85	9	10
Gly	5,81	6,20	4	5
Ala	8,62	8,35	7/5	8
Cys	nd	nd	4	5
Val	14,03	13,96	15	15
Met	4,05	3,99	6	7
íle	8,31	8,33	9	10
Leu	17,02	16,97	16	19
Tyr	2,86	2,84	3	7
Phe	7,96	7,92	8	8
His	2,11	2,11	2	3

SK 281486 Β6

Lys	10,35	11,28	1	1
Trp	nd	nd	1	í
Arg	4,93	4,99	5	6
celkovo	158	158	164/165	193
vypočítaná molekulová hmotnosť		18,4243

¹ Vztiahnuté na 158 zvyškov z proteínovej sekvenčnej analýzy (s výnimkou Cys a Trp).

² Teoretické hodnoty vypočítané z údajov proteínovej sekvencie (A) alebo z údajov DNA sekvencie (B).

³ Vztiahnuté na 1-164 sekvencie.

Zahrnutie známeho množstva vnútorného štandardu v analýze aminokyselinového zloženia tiež umožňuje kvantifikáciu proteínu vo vzorke, pre analyzovanú vzorku bola získaná hodnota 0,117 mg/ml.

Príklad 3

Klonovanie génov pre potkaní a ľudský SCF

A. Amplifikácia a sekvencovanie potkaních SCF cDNA fragmentov

Determinácia aminokyselinovej sekvencie fragmentov potkanieho SCF proteínu umožnila označiť zmiešanú sekvenciu oligonukleotidov, špecifickú pre potkaní SCF. Oligonukleotidy boli využité ako hybridizačné sondy na zistenie potkanej cDNA a genómových knižníc a ako priméiy v pokusoch amplifikovať časti cDNA použitím polymerázovej reťazcovej reakčnej (PCR) stratégie (Mullis a spol., Methods in Enzymol. 155, 335 - 350 (1987)). Oligodeoxynukleotidy boli syntetizované fosforamiditovou metódou (Beaucage a spol., Tetrahedron Lett., 22, 1859 - 1862 (1981), McBride a spol., Tetrahedron Lett., 24, 245 - 248 (1983)), ich sekvencie sú zobrazené na obr. 12A. Písmená znamenajú: A adenín, T tymín, C cytozín, G guanín, I inozín, * v obr. 12A predstavuje oligonukleotidy, ktoré obsahujú sekvencie zistiteľné reštrikčnými endonukleázami. Sekvencie sú zapísané 5' —»3'.

Potkania genómová knižnica, potkania pečeňová genómová knižnica a dve BRL cDNA knižnice boli zistené použitím ³²P-značených zmesových oligonukleotidových sond, 219-21 a 219 - 22 (obr. 21 A), ktorých sekvencie boli vztiahnuté na aminokyselinové sekvencie získané v príklade 2. Žiadne SCF klony neboli v tomto experimente získané použitím štandardných metód cDNA klonovania (Maniatis a spol., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 212-246(1982)).

V alternatívnom pokuse, ktorého výsledkom bola izolácia sekvencie nukleovej kyseliny pre SCF, sa využila PCR technika. V týchto metódach je oblasť DNA vymedzená dvoma primármi amplifikovaná in vitro multiplikovanými cyklami replikácie katalyzovanými vhodnou DNA polymerázou (ako je Taql DNA polymeráza) v prítomnosti deoxynukleozidtrifosfátov v zariadení pre tepelné cykly. Špecifita PCR amplifikácie spočíva na dvoch oligonukleotidových priméroch, ktoré ohraničujú segment, ktorý má byť amplifikovaný a hybridizovaný k protiľahlému reťazcu. PCR s dvojstrannou špecifitou pre jednotlivé DNA oblasti v komplexe zmesi sa dosiahne použitím dvoch printerov so sekvenciou dostatočne špecifickou pre tento región. PCR s jednostrannou špecifitou využíva primér špecifický pre jednu oblasť a druhý primér, ktorý môže začínať v cieľových miestach prítomných na mnohých alebo všetkých DNA molekulách v zmesi (Loh a spol., Science, 243, 217 až 220 (1989)).

DNA produkty úspešnej PCR amplifikačnej reakcie sú zdrojom informácie o DNA sekvencií (Gyllesten, Biotechniques, 7, 700 - 708 (1989)) a môžu byť využité na výrobu značených hybridných sond majúcich väčšiu dĺžku a vyššiu špecifitu než oligonukleotidové sondy. PCR produkty tiež môžu byť značené, s vhodnou primérovou sekvenciou, na klonovanie do plazmidových vektorov, ktoré dovoľujú expresiu kódovaného peptidového produktu.

Základná stratégia získania DNA sekvencie potkanej SCF cDNA je načrtnutá na obr. 13 A. Malé šípky indikujú DNA sekvenčné frakcie. PCR 90,6 a 96,2, v spojení s DNA sekvencovaním, boli použité na získanie čiastočnej nukleokyselinovej sekvencie pre potkaniu SCF cDNA. Priméry použité v týchto PCR boli zmiešané oligonukleotidy vztiahnuté na aminokyselinové sekvencie uvedené na obr.

11. Použitím sekvenčnej informácie získanej z PCR 90,6 a

96.2, unikátne sekvenčné priméry (224 - 27 a 224 - 28, obr. 12A) boli vyrobené a použité v nasledujúcej amplifikácii a sekvenčných reakciách. DNA obsahujúca 5' koniec cDNA bola získaná v PCR 90,3, 96,6 a 625,1 použitím jednostranne špecifickej PCR. Ďalšia DNA sekvencia blízko C-konca SCF proteínu bola získaná v PCR 90,4. DNA sekvencia pre zvyšok kódujúceho regiónu potkanej SCF cDNA bola získaná z PCR produktov 630,1, 630,2, 84,1 a

84.2, ako je opísané ďalej v sekcii C tohto príkladu. Techniky použité pri získavaní potkanej SCF cDNA sú opísané ďalej.

RNA bola pripravená z BRL buniek, ako opisuje Okayama a spol. (Methods Enzymol., 154, 3 - 28 (1987)). Poly A+ RNA bola izolovaná pri použití oligo(dT)celulózovej kolóny, ako opisuje Jacobson v (Methods in Enzymology, zv. 152,254-261 (1987)).

Prvý reťazec cDNA bol syntetizovaný použitím 1 pg BRL poly+ RNA ako templátu a (dl)i2-t8 ako priméru v súlade s protokolom doplneným enzýmom, Mo-MLV reverznou transkriptázou (Bethesda Research Laboratories). Degradácia reťazca RNA bola uskutočnená použitím 0,14 M NaOH pri 84 °C za 10 minút alebo inkubáciou vo vriacom vodnom kúpeli 5 minút. Prebytok octanu amónneho bol pridaný s cieľom neutralizácie roztoku a cDNA bola najprv extrahovaná fenol/chloroformom, potom extrahovaná chloroformom/izo-amylalkoholom a potom vyzrážaná etanolom. Na umožnenie použitia oligo(dC)- primérov v PCR s jednostrannou špecifitou, bol poly(dG) koniec pridaný na 3' koniec časti prvého reťazca cDNA terminálnou transferázou z teľacieho týmusu (Boehringer Mannheim), ako bolo predtým opísané (Deng a spol., Methods Enzymol, 100,96- 103(1983)).

Ak nie je uvedené v ďalších opisoch, ktoré nasledujú, je denaturačný krok v každom PCR cykle uskutočňovaný pri 94 °C 1 minútu a elongácia bola pri 72 °C 3 alebo 4 minúty. Teplota a trvanie chladenia boli rôzne, podľa PCR, často predstavujú kompromis vztiahnutý na odhad potreby niekoľkých rozdielnych PCR realizovaných súčasne. Ak primérové koncentrácie boli znížené s cieľom znížiť akumuláciu primárových artefaktov (Watson, Amplifications, 2, 56 (1989)), je indikovaná dlhší čas anelácie, keď bola koncentrácia PCR produktu vysoká, bola použitá kratší čas a vyššia koncentrácia primérov s cieľom zvýšiť výťažok. Významným faktorom v určení teploty anelácie bol odhad T_d primér-cieľové miesto asociácie (Suggs a spol, v Developmental Biology Using Purifíed Genes, vyd. Brown D. D. a Fox C. F. (Academic, New York), str. 683 až 693 (1981)). Enzýmy použité v amplifikácii boli získané od jedného z troch výrobcov: Stratagene, Promega alebo Perkin-Elmer Cetus. Reaktanty boli použité podľa odporúčania výrobcu. Amplifikácia bola uskutočnená v zariadení na DNA tepelné cykly Coy Tempcycle alebo Perkin-Elmer Cetus.

Amplifikácia SCF cDNA fragmentov bola obvykle skúšaná elektroforézou na agarózovom géli v prítomnosti etídiumbromidu a vizualizácie fluorescenciou DNA prúžkov stimulovanej ultrafialovým žiarením. V niektorých prípadoch, kde boli malé fragmenty anticipované, boli PCR produkty analyzované elektroforézou na polyakrylamidovom géli. Overenie toho, že pozorované prúžky reprezentujú SCF cDNA fragmenty bolo získané pozorovaním príslušných DNA prúžkov nasledujúcich amplifikáciách s jedným alebo viacerými vnútorne usadenými primérmi. Konečné overenie bolo uskutočnené dideoxysekvencovaním (Sanger a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 až 5467 (1977)) PCR produktov a porovnaním predpokladaných translačných produktov so sekvenčnou informáciou SCF peptidu.

V začiatočných PCR experimentoch boli použité zmiešané oligonukleotidy založené na SCF proteínovej sekvencii (Gould, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1934 - 1938 (1989)). Ďalej sú opísané PCR amplifikácie, ktoré boli použité na získanie DNA sekvenčnej informácie pre potkaniu cDNA kódujúcu aminokyseliny -25 až 162.

V PCR 90,6, BRL cDNA bola amplifikovaná so 4 pmol

222- 11 a 223-6 v reakčnom objeme 20 μΐ. Časť produktu PCR 90,6 bola elektroforezovaná na agarózovom géli a prúžky približne s očakávanou veľkosťou boli pozorované. Jeden μΐ PCR 90,6 produktu bol amplifikovaný ďalej s 20 pmol primérov 222-11 a 223-6 v 50 μΐ v 15 cykloch, anulovaný pri 45 °C. Časť tohto produktu bola potom podrobená 25 cyklom amplifikácie v prítomnosti primérov 222 - 11 a 219-25 (PCR 96,2), poskytla potom prúžok jedného hlavného produktu pri elektroforéze na agarózovom géli. Asymetrická amplifikácia produktu PCR 96,2 s rovnakými dvoma primérmi produkovala templáty, ktoré boli potom úspešne sekvencované. Ďalšia selektívna amplifikácia SCF sekvencií v produkte 96,2 bola uskutočnená PCR amplifikáciou produktu v prítomnosti 222-11 a usadeného priméru 219-21. Produkt tejto PCR bol použitý ako templát na asymetrickú amplifikáciu a výrobu rádioaktívne značených sond (PCR2).

Na izolovanie 5' konca cDNA potkanieho SCF boli priméry, obsahujúce (dC)_n sekvencie, komplementárne k poly(dG) koncom cDNA, využité ako nešpecifické priméry. PCR 90,3 obsahuje (dC)_I2 (10 pmol) a 223-6 (4 pmol) ako priméry a BRL cDNA ako templát. Reakčné produkty vytvárajú agregáty s veľmi vysokou molekulovou hmotnosťou, pričom zostávajú v jamkách pri elektroforéze na agarózovom géli. Jeden μΐ produkovaného roztoku bol ďalej amplifikovaný v prítomnosti 25 pmol (dC)i₂ a 10 pmol

223- 6 v objeme 25 μΐ v 15 cykloch, anelovaný pri 45 °C. Pol μΐ tohto produktu bolo potom amplifikovaných počas 25 cyklov s vnútorne usadeným primérom 219-25 a 201-7 (PCR 96,6). Sekvencia 201-7 je znázornená na obr. 12C. Pri elektroforéze na agarózovom géli neboli pozorované žiadne prúžky. Bolo uskutočnených 25 iných cyklov PCR pri 40 °C, po ktorých bol pozorovaný jeden prominentný prúžok. Bolo uskutočnené „vypijákovanie“ podľa Southerna a jeden výrazný hybridizovaný prúžok potom bol pozorovaný. Ďalších 20 cyklov PCR (625,1), pri 45 °C, bolo uskutočnených pri použití 201-7 a usadeného priméru

224- 27. Sekvencovanie bolo uskutočnené po asymetrickej amplifikácii prostredníctvom PCR, získali sa sekvencie, ktoré obsahovali po zdanlivom aminokonci predpokladanú signálny peptid kódujúcu sekvenciu pre-SCF. Táto sekvencia je využitá na označenie oligonukleotidového priméru 227-29, obsahujúceho 5' koniec kódujúceho regiónu cDNA potkanieho SCF. Podobne 3'DNA sekvencia končiaca na aminokyseline 162 bola získaná sekvencovaním PCR 90,4 (pozri obr. 13. A).

B. Klonovanie genómovej DNA potkanieho bunkového kmeňového faktora

Sonda získaná z PCR amplifikácie cDNA, ktorá kóduje potkaní SCF, ako je opísané v časti A, bola použitá na prekladanie knižnice, ktorá obsahuje potkanie genómové sekvencie (získané od CLONTECH Laboratories, Inc., katalógové číslo RL1022 j). Knižnica bola konštruovaná v bakteriofágovom lambda vektore EMBL-3 SP6/T7 použitím DNA získanej z dospelého samca potkana Sprague-Dowley. Knižnica, ako je charakterizovaná dodávateľom, obsahuje 2,3 x 10⁶ nezávislých klonov s priemernou inzertnou veľkosťou 16 kb.

PCR bola použitá na generovanie ³²P-zračených sond použitých v skríningu genómovej knižnice. Sondy PCR1 (obr. 13A) boli pripravené v reakcii, ktorá obsahuje 16,7 μΜ ³²P(alfa)dATP, 200 μΜ dCTP, 200 μΜ dGTP, 200 μΜ dTTP, reakčný pufer odporúčaný Perkin Elmer Cetus, Taq polymerázu (Perkin Elmer Cetus,) pri 0,05 jednotiek/ml, 0,5 μΜ 219-26, 0,05 μΜ 223-6 a 1 μΜ templátu 90.1, s obsahom cieľového miesta na dva priméry. Sonda PCR 2 bola vytvorená použitím rovnakých reakčných podmienok, len primér a templát boli zmenené. Sonda PCR 2 bola vyrobená použitím 0,5 μΜ 222-11, 0,05 μΜ 219-21 a 1 μΐ templátu odvodeného od PCR 96,2.

Približne 10⁶ bakteriofágov bolo umiestených na platňu, ako to opisuje Maniatis a spol. (supia (1982)). Plaky boli transferované na GeneScreen Plus™ filtri (22 cm x 22 cm, NEN/DuPont), ktoré boli denaturované, neutralizované a sušené, ako je to opísané v protokole od výrobcu. Z každej platne boli uskutočnené dva prenosy na filter.

Filtre boli prehybridizované v IM NaCl, 1 % SDS, 0,1 % albumíne hovädzieho séra, 0,1 % ficollu, 0,1 % polyvinylpyrolidónu (hybridizačný roztok) počas približne 16 h pri 65 °C a skladované pri -20 °C. Filtre boli transferované do čerstvého hybridizačného roztoku obsahujúceho ³²P-značenú PCR 1 sondu v 1,2 x 10⁵ cpm/ml a hybridizované 14 h pri 65 °C. Filtre boli vymyté v 0,9 M NaCl, 0,09 M citráte sodnom, 0,1 % SDS, pH 7,2 (premývací roztok) 2 hodiny pri teplote miestnosti s nasledujúcim druhým premytím čerstvým premývacím roztokom 30 minút pri 65 °C. Bakteriofágové klony z oblastí platní, zodpovedajúce rádioaktívnym bodom, boli premiestené z platní a opäť prehľadávaného sondami PCR 1 a PCR 2.

DNA z pozitívnych klonov bola štiepená reštrikčnými endonukleázami BamHI, Sphl alebo SstI a výsledné fragmenty boli subklonované do pUCl 19 a potom sekvencované. Stratégia sekvencovania potkanej genómovej SCF DNA je schematicky znázornená na obr. 14A. Na tomto obrázku krivka nakreslená hore predstavuje oblasť potkanej genómovej DNA, ktorá kóduje SCF. Medzery v krivke indikujú oblasti, ktoré nie sú sekvencované. Veľké rámčeky predstavujú exóny kódujúceho regiónu SCF génu s príslušnou kódovanou aminokyselinou uvedenou nad každým rámčekom. Šípky predstavujú individuálne oblasti, ktoré boli sekvencované a použité na zostavenie súhlasnej sekvencie pre potkaní SCF gén. Sekvencia pre potkaní SCF gén je uvedenánaobr. 14B.

Použitím PCR 1 sondy na skríning potkanej genómovej knižnice boli izolované klony, zodpovedajúce exónom, kódujúcim aminokyseliny 19 -176 SCF. Aby sa získali klony pre ďalšie exóny kódujúceho regióny pre aminokyselinu 19, bola knižnica skríningovaná použitím oligonukleotidových sond 228-30. Rovnaká súprava filtrov, aká bola použitá predtým so sondou PCR 1, bola prehybridizovaná ako

SK 281486 Β6 predtým a hybridizovaná v hybridizačnom roztoku, obsahujúcom ³²P-značený oligonukleotid 228 - 30 (0,03 picomol/ml) pri 80 °C počas 16 hodín. Filtre boli premyté v premývacom roztoku pri teplote miestnosti počas 30 minút a potom boli opäť premyté v čerstvom premývacom roztoku pri 45 °C počas 15 minút. Bakteriofágové klony z oblastí platní, zodpovedajúce rádioaktívnym bodom na autorádiogramoch, boli premiestené z platní a opäť skríningované sondou 228 - 30. DNA z pozitívnych klonov bola štiepená reštrikčnými endonukleázami a subklonovaná, ako to bolo opísané. Použitím sondy 228 - 30 boli získané klony, zodpovedajúce exónom, kódujúcim aminokyseliny -20 až 18.

Bolo uskutočnených niekoľko pokusov izolovať klony, zodpovedajúce exónu, obsahujúcemu 5'-netranslátovaný región pre aminokyseliny -25 až -21. Neboli izolované žiadne klony pre tento región potkanieho SCF génu.

C. Klonovanie potkanej cDNA na expresiu v cicavčích bunkách

Cicavčie bunkové expresné systémy boli vymyslené na zistenie toho, či sú aktívne polypeptidové produkty potkanieho SCF schopné byť exprimované a ceremované cicavčími bunkami. Expresné systémy boli vymyslené na expresiu skrátených verzií potkanieho SCF (SCF¹'¹⁶² a SCF¹'¹⁶⁴) a proteínu (SCF^1-193), predpovedaných z translácie génovej sekvencie na obr. 14C.

Expresný vektor použitý v týchto štúdiách bol „shuttle“ vektor, obsahujúci pUC119, SV40 a HTLVI sekvencie. Vektor bol označený na umožnenie autonómnej replikácie tak v E. coli, ako aj v cicavčích bunkách a na expresiu vloženej exogénnej DNA pod kontrolou vírusových DNA sekvencií. Tento vektor, označený V 19.8 v E. coli DH5 je uložený v Američan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. (ATCC č. 68124). Tento vektor je derivátom pSVDMI9 opísaného v Souzovom US patente č. 4810643, ktorý je tu uvedený ako odkaz.

cDNA pre potkaní SCF¹'¹⁶² bola vložená do plazmidového vektora V19.8. cDNA sekvencia je uvedená na obr. 14C. cDNA, ktorá bola použitá v tejto konštrukcii, bola syntetizovaná v FCR reakciách 630 - 1 a 630 - 2, ako ukazuje obr. 13A. Tieto PCR predstavujú nezávislé ampíifikácie a využívajú syntetické oligonukleotidové priméry 227 - 29 a 227 - 30. Sekvencia pre tieto priméry bola získaná z PCR generovanej cDNA, ako je to opísané v sekcii A tohto príkladu. Reakčná zmes, 50 μΐ objem, obsahuje 1 x reakčný pufer (z Perkin Elmer Cetus kitu), 250 μΜ dATP, 250 μΜ dCTP, 250 μΜ dGTP a 250 μΜ dTTP, 200 ng oligo(dT)-primovanej cDNA, 1 pmol 227-29, 1 pmol 227 - 30 a 2,5 jednotky Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus). cDNA bola amplifikovaná v 10 cykloch pri použití denaturačnej teploty 94 °C počas 1 minúty a 2-minútovom chladení na teplotu 37 °C a elongačnej teplote 72 °C počas 1 minúty. Po týchto prvých kolách PCR ampíifikácie bolo pridaných 10 pmol 227-29 a 10 pmol 227-30. Ampíifikácie pokračovali 30 cyklami pri rovnakých podmienkach s výnimkou toho, že teplota chladenia bola zmenená na 55 °C. Produkty PCR boli štiepené reštrikčnými endonukleázami HindlII a SstlI. V19.8 bol zhodne HindlII a SstlI a v jednom prípade bol štiepený plazmidový vektor podrobený pôsobeniu teľacej intestinálnej alkalickej fosfatázy, v inom prípade bol dlhý fragment zo štiepenia izolovaný z agarového gélu. cDNA bola ligovaná do V 19.8 použitím T4 polynukleotidovej ligázy. Produkty ligácie boli transformované do kompetentného E. coli kmeňa DHS, ako to bolo opísané (Okayama a spol.; supra (1987)). DNA pripravená z jednotlivých bakteriálnych klonov bola sekvencovaná Sangerovou dideoxymetódou. Obr. 17 pred stavuje konštrukciu V19.8 SCF. Tieto plazmidy boli využité na transfekciu cicavčích buniek, ako je to opísané v príklade 4 a v príklade 5.

Expresný vektor pre potkaní SCF¹'¹⁶⁴ bol konštruovaný použitím stratégie podobnej tej, ktorá bola použitá pre SCF¹¹⁶² v ktorej cDNA bola syntetizovaná použitím PCR ampíifikácie a následne vložená do V19.8. cDNA použitá v konštrukciách, bola syntetizovaná v PCR amplifikáciách s V19.8, s obsahom SCF¹¹⁶² cDNA (V19.8:SCF¹¹⁶²) ako templátom, 227-29 ako primérom pre 5'-koniec génu a 237 - 19 ako primérom pre 3'-koniec génu. Ďalšia reakcia (50 μΐ), obsah: 1 x reakčného pufra, 250 μΜ každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP, 2,5 jednotky Taq polymerázy, 20 ng V19.8:SCF'·¹⁶² a 20 pmol každého priméru. cDNA bola amplifikovaná 35 cyklov použitím denaturačnej teploty 94 °C 1 minútu, teplota chladenia 55 °C počas 2 minút a elongačná teplota 72 °C počas 2 minút. Produkty amplifikácie boli štiepené reštrikčnými endonukleázami HindlII a SstlI a inzertované do V19.8. Výsledný vektor obsahuje kódujúcu oblasť pre aminokyseliny -25 až 164 SCF nasledovanú terminačným kodónom.

cDNA pre 193 aminokyselinami tvorený potkaní SCF (potkaní SCF¹'¹⁹³ je predpovedaný z translácie DNA sekvencie na obr. 14C) bola tiež vložená do plazmidového vektora V19.8 použitím postupu zhodného s postupom použitým pre potkaní SCF¹¹⁶². cDNA, ktorá bola použitá v tejto kombinácii, bola syntetizovaná v PCR reakciách 84.1 a 84.2 (obr. 13 A) využitím oligonukleotidov 227 - 29 a 230 až 25. Dve reakcie predstavujú nezávislé ampíifikácie, začínajúce z rôznych RNA preparátov. Sekvencia 227 - 29 bola získaná cestou PCR reakcií, ako je to opísané v sekcii A tohto príkladu, a sekvencia pre primér 230 - 25 bola získaná z potkanej genómovej DNA (obr. 14B). Reakčná zmes, 50 μΐ objem, obsahovala lx reakčný pufer (z kitu Perkin Elmer Cetus), 250 μΜ dATP, 250 μΜ dCTP, 250 μΜ dGTP a 250 μΜ dTTP, 200 mg oligo(dT)-primovanej cDNA, 10 pmol 227-29, 10 pmol 230 - 25 a 2m5 jednotky Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus). cDNA bola amplifikovaná v 5 cykloch pri použití denaturačnej teploty 94 °C počas 1 1/2 minúty teplote chladenia 50 °C počas 2 minút a teplote elongácie 72 °C počas 2 minút. Po týchto začiatočných cykloch pokračovala amplifikácia pri rovnakých podmienkach s tou výnimkou, že teplota chladenia bola zmenená na 60 °C. Produkty PCR ampíifikácie boli štiepané reštrikčnými endonukleázami HindlII a SstlI. V19.8 DNA bola štiepaná HindlII a SstlI a dlhé fragmenty zo štiepenia boli izolované z agarózového gélu. cDNA bola ligovaná do V19.8 použitím polynukleotidovej ligázy. Produkty ligácie boli transformované do kompetitivneho E. coli kmeňa DH5 a DNA pripravená z jednotlivých bakteriálnych klonov bola sekvencovaná. Tieto plazmidy boli použité na transfekciu cicavčích buniek v príklade 4.

D. Amplifikácia a sekvencovanie PCR produktov ľudskej SF cDNA

Ľudská SCF cDNA bola získaná z hepatomálnej bunkovej línie HepG2 (ATCC HB 8065) pri použití PCR amplifikácie, ako je to znázornené na obr. 13B, Základná stratégia bola amplifikovať ľudskú cDNA PCR s primérmi, ktorých sekvencie boli získané z potkanej SCF cDNA.

RNA bola pripravená, ako to opisuje Maniatis a spol. (supra (1982)). PolyA+ RNA bola pripravená použitím oligo dT celulózy podľa návodu výrobcu (Collaborative Research Inc.).

Prvý reťazec cDNA bol pripravený, ako je to opísané pre BRL cDNA, s tou výnimkou, že syntéza bola začatá 2 μΜ oligonukleotidu 1228 - 28, uvedeného na obr. 12C,

SK 281486 Β6 ktorý obsahoval krátku náhodnú sekvenciu na 3'konci pripojenú k dlhšej unikátnej sekvencii. Unikátna sekvencia z 228 - 28 poskytuje cieľové miesto na amplifikácie PCR s primérom 228 - 29 ako nešpecifickým primérom. Ľudská cDNA sekvencia príbuzná aspoň čiastočne s potkaňou SCF sekvenciou, bola amplifikovaná z Hep62 cDNA PCR použitím 227 - 29 a 228 - 29 (PCR 22,7, pozri obr. 13B, 15 cyklov chladenia pri 60 °C, nasledovaných 15 cyklami chladenia pri 55 °Č). Elektroforéza na agarózovom géli ukázala nezreteľné prúžky, len škvrny zrejme heterogénnej DNA. Ďalšia preferovaná amplifikácia sekvencii týkajúcich sa potkanej SCF cDNA bola skúšaná realizáciou PCR s 1 μΐ produktu PCR 22.7 použitím vnútorne usadeného potkanieho SCF priméru 222-11 a priméru 228-29 (PCR 24.3, 20 cyklov chladenia pri 55 °C). Opäť boli pozorované len heterogénne škvrny DNA produktov na agarózových géloch. Dvojstranná špecifická amplifikácia produktu PCR 24.3 s primármi 222 - 11 a 227 - 30 (PCR 25.10, 10 cyklov) dala vzniknúť jednému prúžku majoritného produktu s rovnakou veľkosťou ako príslušný potkaní SCF cDNA PCR produkt. Sekvencovanie asymetrického PCR produktu (PCR 33.1) DNA použitím 224 - 24, ako sekvenčného priméru, poskytlo okolo 70 báz ľudských SCF sekvencii.

Podobne, amplifikácia 1 μΐ PCR 22.7 produktu, najprv s primármi 224 - 25 a 228-29 (PCR 24,7, 20 cyklov), potom s primármi 224 - 25 a 227-30 (PCR 41.11) vyvolala jeden majoritný prúžok s tou istou veľkosťou ako zodpovedajúci potkaní SCF produkt a po asymetrickej amplifikácii (PCR 42.3) poskytla sekvenciu, ktorá bola vysoko homológna proti potkanej SCF, ak bol 224 - 24 použitý ako sekvenčný primér. Unikátne sekvencie oligonukleotidov cielených pre ľudskú SCF cDNA boli syntetizované a ich sekvencia je uvedená na obr. 12B.

Aby sa získal ľudský náprotivok potkanej SCF PCR generovanej kódujúcej sekvencie, ktorá bola použitá v štúdii expresie a aktivity, bola uskutočnená PCR s primármi 227 - 29 a 227 - 30 v 1 μΐ PCR 22.7 produktu v reakčnom objeme 50 μΐ (PCR 39.1). Amplifikácia bola uskutočnená v zariadení Coy-Tempcycler. Pretože stupeň odlišnosti medzi ľudskou SCF cDNA a potkaním SCF unikátnym primérom 227-30 bol neznámy, bolo pre prvé tri cykly použité výrazné chladenie (37 °C), neskôr sa chladilo na 50 °C. Prominentný prúžok s rovnakou veľkosťou (okolo 590 bp) ako potkaní homológ sa objavil a bol ďalej amplifikovaný zriedením malej dávky produktu PCR 39.1 a PCR s rovnakými primérmi (PCR 41.1). Pretože bol pozorovaný viac ako jeden prúžok v produktoch PCR 41.1, bola uskutočnená ďalšia PCR s vnútorne usadenými primérmi, aby sa determinovala aspoň časť jeho sekvencie pred klonovaním. Po 23 cykloch PCR s primérmi 231 - 27 a 227 - 29 (PCR 51.2), bol zrejmý samostatný intenzívny prúžok. Asymetrická PCR s primérmi 227 - 29 a 231 - 27 a sekvencovania potvrdili prítomnosť ľudskej SCF cDNA sekvencie. Klonovanie PCR 41.1 SCF DNA do expresného vektora V19.8 bolo uskutočnené tak, ako už bolo opísané pre potkanie SCF 1-162 PCR fragmenty v sekcii C. DNA z jednotlivých bakteriálnych klonov bola sekvencovaná Sangerovou didoxymetódou.

E. Klonovanie genómovej DNA ľudských faktorov kmeňových buniek

PCR 7 sonda získaná z PCR amplifikácie cDNA, pozri obr. 13B, bola použitá na skríning knižnice s obsahom ľudskej genómovej sekvencie. Ribosonda komplementárna k časti ľudskej SCF cDNA, pozri vyššie, bola použitá na skríning pozitívnych plakov. PCR7 sonda bola pripravená s produktom PCR41 ako východiskovým materiálom (pozri obr. 13B). Produkt PCR 41.1 bol ďalej amplifikovaný s primérmi 227 - 29 a 227 - 30. Výsledný 590 bp fragment bol eluovaný z agarózového gélu a reamplifikovaný s rovnakými primérmi (PCR 58.1). Produkty PCR 58.1 boli zriedené 1000 x 50 μΐ reakčnej zmesi, s obsahom 10 pmol 233-13 a amplifikované v 10 cykloch. Po pridaní 10 pmol 227-30 k reakčnej zmesi sa PCR uskutočňuje v 20 cykloch. Pridá sa ďalších 80 pmol 233-13 a reakčný objem sa zvýši na 90 μΐ a PCR pokračuje v ďalších 15 cykloch. Reakčné produkty boli zriedené 200-krát v 50 μΐ reakčnej zmesi, bolo pridaných 20 pmol 231 - 27 a 20 pmol 233 - 13 a PCR bola uskutočnená v 35 cykloch pri použití teploty chladenia 48 °C v reakcii 96.1. Na prípravu ³²P-inačenej PCR7 boli použité rovnaké reakčné podmienky ako boli použité na výrobu PCR1 s nasledujúcimi rozdielmi: v reakčnom objeme 50 μΐ, PCR 96.1 bola zriedená 100-krát, použilo sa 5 pmol 231 - 27 ako jednoduchý primér a 45 cyklov PCR bolo uskutočnených s denaturáciou pri 94 °C počas 1 minúty, chladilo sa 2 minúty pri 48 °C a elongácia trvala 2 minúty pri 72 °C.

Ribosonda, ribosonda 1, bola ³²P-značená jednoreťazcová RNA komplementárna k nukleotidom 2-436 hSCF DNA sekvencie uvedenej na obr. 15B. Na konštrukciu vektora na produkciu tejto sondy bol PCR 41.1 (obr. 13B) produkt DNA štiepený HindlII a EcoRI a klonovaný do polylinkéra plazmidového vektora pGEM3:hSCF (Promega Madison, Wisconsin). Rekombinantný pGEM3:hSCF plazmidová DNA bola potom linearizovaná štiepením Hindlll. ³²P-značená ribosonda 1 bola pripravená z linearizovanej plazmidovej DNA „fiinoff ‘ transkripciou s T7 RNA polymerázou v súlade s inštrukciami poskytovanými Promegou. Reakčná zmes (3 μΐ) obsahovala 250 ng linearizovanej plazmidovej DNA a 20 μΜ ³²P-rCTP (katalóg, č.: NEG-008H New England Nuclear (NEN) so žiadnou ďalšou neznačenou CTP.

Ľudská genómová knižnica bola získaná zo Stratagene (La Jolla, CA, katalóg, č.: 946203). Knižnica bola konštruovaná vo Fix II vektore bakteriofágu Lambda, použitím DNA pripravenej z belošskej samčej placenty. Knižnica, ako je charakterizovaná dodávateľom, obsahovala 2 . 10⁶ primárnych plakov s priemernou veľkosťou inzertov väčšou ako 15 kb. Približne 10⁶ bakteriofägov bolo umiestených na platňu, ako uvádza Maniatis a spol. (1982). Plaky boli transľerované do Gene Screen Plus™ filtrov (22 cm², NFN/DuPont) podľa protokolu výrobcu. Pre každú platňu je boli uskutočnené dva transfery na filter.

Filtre boli prehybridizované v 6XSSC (0,9 M NaCl, 0,09 M citrát sodný, pH 7,5), 1 % SDS pri 60 °C. Filtre boli hybridizované v čerstvom 6XSSC, 10 SDS roztoku obsahujúcom ³²P-značenú PCR 7 sondu pri 2 x 10⁵ cpm/ml a hybridizované počas 20 h pri 62 °C. Filtre boli premyté v 6XSSC, 1 % SDSD počas 16 h pri 62 °C. Bakteriofágové výrezy boli premiestené z plochy platne zodpovedajúcej rádioaktívnym bodom na autorádiogramoch a skríningované sondou PCR 7 a ribosondou L Reskrining sondou PCR bol uskutočnený pri podmienkach zhodných s podmienkami pri začiatočnom skríningu. Reskrining ribosondou 1 bol uskutočnený takto: filtre boli prehybridizované v 6XSSC, 1 % SDS a hybridizované pri 62 °C počas 18 h v 0,25 M NaPO₄, (pH 7,5), 0,25 M NaCl, 0,001 M EDTA, 15 % formamid, 7 % SDS a ribosonda pri 1 X 10⁶ cpm/ml. Filtre boli premývané v 6XSSC, 1 % SDS počas 30 min pri 62 °C a ďalej 1XSSC, 1 % SDS počas 30 min pri 62 °C. DNA z pozitívnych klonov bola štiepená reštrikčnými endonukleázami Bam Hl, Sphl alebo SstI a výsledné fragmenty boli subklonované do pUCl 19 a potom sekvencované.

Použitím sondy PCR 7 boli získané klony obsahujúce exóny kódujúce aminokyseliny 40 - 176 a tieto klony sú uložené v ATCC (depon. č. 40681). S cieľom získať klony pre ďalšie SCF exóny bola ľudská genómová knižnica skríningovaná ribosondou 2 a oligonukleotidovou sondou

235 - 29. Knižnica bola skríningovaná do určitej miery rovnako ako predchádzajúca s výnimkami: hydridizácia sondou 235 - 29 bola uskutočnená pri 37 °C a premývanie pre túto hybridizáciu bolo 1 hodinu pri 37 °C a 1 h pri 44 °C. Pozitívne klony boli reskríningované ribosondou 2, ribosondou 3 a oligonukleotidovými sondami 235 - 29 a

236 - 31. Ribosondy 2 a 3 boli vyrobené podľa rovnakého postupu, ktorý bol použitý na výrobu ribosondy 1, s týmito výnimkami: a) rekombinantná pGEM3:hSCF plazmidové DNA bola linerizovaná reštrikčnou endonukleázou PvuII (ribosonda 2) alebo PstI (ribosonda 3) a b) na syntézu ribosondy 3 bola použitá SP6 RNA polymeráza (Promega).

Obrázok 15A predstavuje stratégiu použitú na sekvencovanie ľudskej genómovej DNA. Na tomto obrázku krivka hore predstavuje oblasť ľudskej genómovej DNA, ktorá kóduje SCF. Medzery v krivke indikujú oblasti, ktoré neboli sekvencované. Veľké rámčeky predstavujú exóny, kódujúce oblasť SCF génu s príslušnými kódovanými aminokyselinami uvedenými nad každým rámčekom. Sekvencia ľudského SCF génu je uvedená na obr. 15B. Sekvencia ľudskej SCF cDNA získanej PCR technikou je uvedená na obr. 15C.

F. Sekvencia ľudskej SCF cDNA 5'oblasti

Sekvencovanie produktov PCR primovaných dvoma génovo špecifickými primérmi, odhalilo sekvenciu oblasti ohraničenej 3'koncom dvoch primérov. Jednostranná PCR, ako ukazuje príklad 3A, môže priniesť sekvenciu susedných oblastí. Jednostranná PCR bola použitá s cieľom poskytnúť sekvencie 5'-netranslátovanej oblasti ľudskej SCF cDNA.

Prvý reťazec cDNA bol pripravený z polyA+ RNA z ľudskej bunkovej línie karcinómu mechúra 5637 (ATCC HTB 9) pri použití oligonukleotidov 228 - 28 (obr. 12C) ako primérov, ako to opisuje príklad 3D. Koniec tejto cDNA s dG zvyškami s nasledujúcou jednostrannou PCR amplifikáciou používajúcou priméry s obsahom (dC)_n sekvencie v kombinácii so SCF-špecifickými primérmi, neposkytol cDNA fragmenty, poskytujúce v smere (5') známe sekvencie.

Malé množstvo sekvenčnej informácie bolo získané z PCR amplifikácie produktov syntézy druhého reťazca primovaného oligonukleotidom 228 - 28. Nepripravený 5637 prvý reťazec cDNA opísaný vyššie (okolo 50 ng) a 2 pmol 228 - 28 boli inkubované s Klenow polymerázou a 0,6 mM každého z dATP, dCTP, dGTP a dTTP pri 10 až 12 °C počas 30 minút v 10 μΐ1 x Nick-translačného pufra (Maniatis a spol., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Amplifikácie výslednej cDNA sekvenčnými jednostrannými PCR s primérmi 228 - 29 v kombinácii s usadenými SCF primérmi (v poradí použitia: 235 - 30,233 - 14, 23 - 31 a napokon - 29) priniesli komplexnú zmes produktov, ktoré sa javili ako škvrny na agarózovom géli. Významné zvýšenie SCF cDNA fragmentov bolo indikované zvýšením intenzity prúžku, špecifického produktu pozorovaného, keď porovnateľné objemy úspešných produktov jednomiestnej PCR boli amplifikované s dvoma SCF primérmi (227 - 29 a 23 - 29, napr. poskytlo produkty so 150 bp). Pokusy selektovať výhodné rozmedzie veľkosti produktov rozštiepením škvŕn na agarózovom géli a reamplifíkáciou PCR vo väčšine prípadov neposkytlo dobre definované prúžky s obsahom sekvencií, ktoré sa týkajú SCF.

Jedna reakcia, PCR 16.17, ktorá obsahovala len 235 - 29 primér, poskytla prúžok, ktorý zrejme vznikol z primovania 235-29 v neznámom mieste 5'kódujúcej oblasti vedľa očakávaného miesta, ako ukazuje mapovanie reštrikčnými enzýmami PvuII a PstI a PCR analýzy s usadenými primérmi. Tieto produkty boli gélovo čistené a reamplifikované s primérmi 235 - 29 a sekvencovanie bolo skúšané Sangerovou dideoxymetódou pri použití ³²P značeného priméru 228 - 30. Výsledná sekvencia báz na označenie oligonukleotidu 254 - 9 (obr. 12B). Keď tento 3'riadený primér bol použitý v nasledujúcich PCR v kombináciou s 5' riadenými SCF primérmi, boli získané prúžky s očakávanou veľkosťou. Priame sekvencovanie podľa Sangera takýchto PCR produktov poskytlo nukleotidy 180 až 204 ľudskej SCF cDNA sekvencie, obr. 15C. S cieľom získať viaceré sekvencie na 5'konci hSCF cDNA, bol prvý reťazec cDNA pripravený z 5637 polaA+ RNA (asi 300 pg), použitím SCF špecifického priméru (2 pmol 233 - 14) 16 pl reakčnej zmesi s obsahom 0,2 j. MMLV reverznej transkriptázy (získanej z BRL) a 500 pM každej dNTP. Po štandardnej fenol-chloroformovej a chloroformovej extrakcii a zrážaní etanolom (z 1 M octanu amónneho), boli nukleové kyseliny resuspendované v 20 pl vody, umiestené do vriaceho kúpeľa na 5 minút, potom ochladené koncom terminálnou transferázou za prítomnosti 8 pM dATP v pufri obsahujúcom CoCl₂ (Deng a Wu, Methods in Enzymology, 100, str. 96 - 103). Produkt, (dA)_n-koncom vybavený prvý reťazec cDNA bol čistený extrakciou fenol-chloroformom a zrážaný etanolom a resuspendovaný v 20 pl 10 mM tris, pH 8,0 a 1 mM EDTA.

Obohatenie a amplifikácia ľudského SCF týkajúce sa 5'koncových fragmentov cDNA z asi 20 pg (dA)-koncom vybavenej 5637 cDNA boli uskutočnené takto: začiatočných 26 cyklov jednostrannej PCR bolo uskutočňovaných v prítomnosti SCF špecifického priméru 236 - 31 a priméru alebo zmesi primérov, s obsahom (dT)_n sekvencií pri alebo blízko 3'konca, napríklad primér 221 - 12 alebo zmes primérov 220 - 3, 220 - 4 a 220 - 11 (obr. 12C). Produkty (1 pl)t týchto PCR boli potom amplifikované v druhej súprave PCR s obsahom primérov 221 -12 a 235 - 29. Prúžok hlavného produktu približne 370 bp bol pozorovaný v každom prípade analýzou na agarózovom géli. Gélový výrez obsahujúci časť tohto prúžku, bol vypichnutý z gélu špičkou Pasteurovej pipety a premiestený do suchej mikrofúgovej skúmavky. Bolo pridaných 10 pl vody a výrez bol roztavený pri 84 °C v tavnom bloku. PCR obsahujúca priméry 221 -12 a 235 - 29 (8 pmol obidva) v 40 pl sa naočkuje 2 pl roztaveného, zriedeného gólového výrezu. Po 15 cykloch bol viditeľný nepatrný difúzny prúžok približne 370 bp pri analýze na agarózovom géli. Gélové výrezy, obsahujúce časti tohto prúžku, boli vybrané z gélu špičkou Pasteurovej pipety a premiestené do malej mikrofúgovej rúrky. 10 pl vody bolo pridaných a výrez bol roztavený pri 84 °C vo výhrevnom bloku. PCR obsahujúci priméry 221 -12 a 235 - 29 (8 pmol každý) v 40 pl bol naočkovaný 2 pl roztaveného, zriedeného gélového výrezu. Po 15 cykloch bol pozorovaný nepatrný difúzny prúžok približne 370 bp pri analýze na agarózovom géli. Boli uskutočnené asymetrické PCR, aby sa generoval horný a dolný koniec reťazca sekvencovaných templátov: pre každú reakciu 4 pl PCR reakčného produktu a 40 pmol buď priméru 221 - 12 alebo priméru 235 - 29 v celkovom reakčnom objeme 10 pl bolo podrobených 25 cyklom PCR (1 minúta, 95 °C, 30 sekúnd, 55 °C, 40 sekúnd, 72 °C). Priame sekvencovanie 221 - 12 zmesi primovaných PCR produktov (po štandardnej extrakcii a etanolovom zrážaní) s ³²P-značeným primérom 262 19

- 13 (obr. 12B) poskytlo 5'sekvenciu nukleotidov 1-179 (obr. 15C).

6. Amplifikácia a sekvencovanie ľudskej genómovej DNA v mieste prvého kódujúceho exónu faktora kmeňových buniek

Skríning ľudskej genómovej knižnice SCF oligonukleotidovými sondami neodhalil žiadne klony obsahujúce známu časť prvého kódujúceho exónu. Pokus bol potom iniciovaný použitím jednostrannej PCR techniky na amplifikáciu a klonovanie genómových sekvencií obklopujúcich tento exón.

Predĺženie primérom teplom denaturovanej ľudskej placentámej DNA (získanej od Sigma) bolo uskutočnené DNA polymerázou (Klenov enzým, dlhý fragment, Boehringer Mannheim) pri použití nie-SCF priméru, ako je 228 až 28 alebo 221 - 11 pri nenáročných podmienkach (nízka teplota), ako je 12 °C, na uľahčenie primingu na veľkom množstve rôznych miest. Každá reakčná zmes bola potom zriedená 5x do Taql DNA polymerázového pufra obsahujúceho Taql polymerázu a 100 μΜ každého z dNTP a elongácia DNA reťazcov bola uskutočňovaná pri 72 °C počas 10 minút. Produkt bol potom obohatený prvou exónovou sekvenciou pre faktor kmeňových buniek pomocou PCR v prítomnosti SCF prvého exónového oligonukleotidu (ako je 254 - 9) a vhodného nie-SCF priméru (228 - 29 alebo 221 - 11). Elektroforéza na agarózovom géli odhalila, že väčšina produktov bola krátkych (menších ako 300 bp). Na obohatenie dlhších druhov bola časť každého agarózového gélového prúžku zodpovedajúceho dĺžke väčšej ako 300 bp vyrezaná a elektroforeticky eluovaná. Po etanolovom zrážaní a opäť rozpustení vo vode boli gélovo prečistené PCR produkty klonované do derivátov pGEM4 obsahujúcich SfíT miesto ako HindlII až Sfil fragment.

Kolónie boli skríningované ³²P značeným prvým exónovým oligonukleotidom SCF. Identifikovalo sa niekoľko pozitívnych kolónií a sekvencie inzertov boli získané Sangerovou metódou. Výsledná sekvencia, ktorá je v protismere k prvému exónu cez dohodnutú hranicu exón-intrón, do najbližšieho intrónu, je uvedená na obr. 15B.

H. Amplifikácia a sekvencovanie SCF cDNA kódujúcej oblasti z myši, opice a psa

Prvý reťazec cDNA bol pripravený z celkovej RNA alebo polyA+ RNA z opičích pečení (získaných od Clontech) a z bunkových línií NIH-3T3 (myš, ATCC CRL 1658) a D17 (pes, ATCC CCL 183). Primér použitý v syntéze prvého reťazca cDNA bol buď nešpecifický primér 228 - 28 alebo SCF primér (227 - 30, 237 - 19, 237 - 20, 230 - 25 alebo 241 - 6). PCR amplifikácia s primérom 227 -

- 29 a jedným z primérov 227 - 30, 237 - 19 alebo 237-20 poskytla fragment s očakávanou veľkosťou, ktorý bol sekvencovaný buď hneď alebo po klonovaní do V19.8 alebo pGEM vektora.

Ďalšie sekvencie blízke 5' koncu SCF cDNA boli získané PCR amplifikáciami pri využití SCF-špecifických primérov v kombinácii buď 254 - 9 alebo 228 - 9. Ďalšie sekvencie na 3' konci SCF kódujúcej oblasti boli získané po PCR amplifikácii cDNA primovanej 230 - 25 (v tomto prípade myšacej) alebo cDNA primovanej 2416 (v tomto prípade opičej) s buď 230 - 25 alebo 241-6, ako je to vhodné a 3'riadeným SCF primérom. Žiadne prúžky SCF PCR produktu neboli získané v rovnakých pokusoch amplifikovať D17 cDNA. Nešpecifický primér 228 - 28 bol použitý na primovanie syntézy prvého reťazca z D17 celkovej RNA a výsledná komplexná zmes produktu bola obohatená SCF sa týkajúcimi sekvenciami pomocou PCR a 3' riadenými SCF primérmi, ako je 227-29 alebo 225-31 v kombinácii s 228 - 29. Zmes produktu bola štiepená Sfil a klonovaná do derivátov pGEM4 (Promega, Madison, Wisconsin), obsahujúcich Sfil miesto, ako je fragment od Sfil miesta štiepenia do tupého konca fragmentu. Výsledná heterogénna knižnica bola skríningovaná rádioaktívne značeným 237 - 20 a niekoľko pozitívnych klonov bolo sekvencovaných a prinieslo sekvenciu 3'konca psieho SCF. Zoradené aminokyselinové sekvencie ľudského (obr. 42), opičieho, psieho, myšacieho a potkanieho SCF zrelého proteínu je zobrazená na obr. 16.

Známe SCF aminokyselinové sekvencie sú vysoko homológne vo väčšine ich dĺžky. Identické súhlasné sekvencie signálneho peptidu sú prítomné v kódujúcej oblasti všetkých piatich druhov. Aminokyselina očakávaná na aminokonci zrelého proteínu podľa analógie s potkaním SCF je označená na tomto obrázku číslom 1. Psia cDNA sekvencia obsahuje nejasnosť, ktorá sa prejavuje dvojznačnosťou valín/leucín v aminokyselinovej sekvencií v kodóne 12a. Ľudská, opičia, potkania a myšacia aminokyselinová sekvencia koaligujú bez inzercií a delécií. Psia sekvencia má jeden zvláštny zvyšok v polohe 120 v porovnaní s inými druhmi. Ľudský a opičí sa líšia len v jednej pozícii konzervatívnym nahradením valínu (ľudský) alanínom (opičí) v polohe 130. Predpokladaná SCF sekvencia bezprostredne pred domnelým spracovaním miesta a po ňom blízko zvyšku 164 je vysoko medzi druhmi konzervovaná.

Príklad 4

Expresia rekombinantného SCF v COS-1 bunkách

Na transientnú expresiu v COS-1 bunkách (ATCC CRL 1650) bol transfekovaný vektor V19.8 (príklad 3C), obsahujúci potkanie SCF¹¹⁶² a SCF¹¹⁹³ gény duplicitne na 60 mm platni (Wigler a spol., Celí, 14, 725 - 731 (1979)). Plazmid V19.8 SCF je uvedený na obr. 17. Vektor bez inzertu bol tiež transformovaný na kontrolu. Tkanivová kultúra supematantu bola odobraná v rôznom čase po transfekcii a bola skúšaná jej biologická aktivita. Tabuľka 4 sumarizuje výsledky HPP-CFC bioskúšky a tabuľka 5 sumarizuje MC/9 ³H-tymidínom získané dáta z typického transfekčného experimentu. Výsledky bioskúšky supematantov z COS-1 buniek transfekovaných nasledujúcimi plazmidmi sú uvedené v tabuľke 4 a 5: C-koncový oklieštený tvar potkanieho SCF s C-koncom v aminokyselinovej polohe 162 (V19.8 potkaní SCF¹’¹⁶²), SCF¹’¹⁶² s obsahom kyseliny glutámovej v polohe 81 (V19.8 potkaní SCF¹¹⁶² (Glu81)) a SCF¹¹⁶² s obsahom alanínu v polohe 16 (V 19.8 potkaní SCF'¹⁶² (Alal9)). Aminokyselinové substitúcie boli produktom PCR rekcií uskutočnených v amplifikácii potkanieho SCF¹¹⁶², ako ukazuje príklad 3. Jednotlivé klony V19.8 potkanieho SCF¹'¹⁶² boli sekvencované a pri dvoch klonoch bola zistená aminokyselinová substitúcia. Ako je zrejmé z tabuliek 4 a 5, je rekombinantný potkaní SCF aktívny v bioskúškach použitých na čistenie prírodného cicavčieho SCF v príklade L

Tabuľka 4

HPP-CFC skúška COS-1 supematantov z buniek transfekovaných potkaňou SCF DNA

Vzorka objem skúšaného CM (μΐ) kolónia

Č./200 000 buniek

V19.8 (bez inzertu) 1000

500

250

120

V19.8 potkaní SCF¹¹⁶² 100>50

50	>50
	25	>50
	12	>50
	6	30
	3	8
V19.8 potkaní SCF1’162	100	26
(Glu81)	50	10
	25	2
	12	0
V19.8 potkaní SCF1162	100	41
(Alal9)	50	18
	25	5
	12	0
	6	0
	3	0

Tabuľka 5,

MC/9³H-tymidínová absorpcia v COS-1 supematantoch z buniek transfekovaných potkaňou SCF DNA

Vzorka	objem skúšaného kultiv. média (μ!)	cpm
vl9.8 (bez inzertu)	25	1,936
	12	2,252
	6	2,182
	3	1,682
vl 9.8 SCF1162	25	11,648
	12	11,322
	6	11,482
	3	9,638
V19.8 SCF1162 (Glu81)	25	6,220
	12	5,384
	6	3,692
	3	1,980
V19.8 SCF1162(Alal9)	25	8,396
	12	6,646
	6	4,566
	3	3,182

Rekombinantné potkanie SCF a iné faktory boli testované jednotlivo v ľudskej CFU-GM (Broxmeyer a spol., supra (1977)) skúške, ktorá meria proliferáciu buniek normálnej kostnej drene a dáta sú uvedené v tabuľke 6. Výsledky pre COS-1 supematanty z kultúr 4 dni po transfekcii V19.8 SCF¹¹⁶² v kombinácii s inými faktormi, sú tiež uvedené v tabuľke 6. Množstvo kolónií je priemerný počet z troch kultúr.

Rekombinantný potkaní SCF má v prvom rade synergistickú aktivitu na normálnu ľudskú kostnú dreň v CFU-GM skúške. V experimente v tabuľke 6 bol SCF synergistom 1 ľudskému GM-CSF, ľudskému IL-3 a ľudskému CSF-1. V ďalšej skúške bol tiež pozorovaný synergizmus G-CSF. Bola pozorovaná určitá proliferácia ľudskej kostnej drene po 14 dňoch s potkaním SCF; skupiny buniek sa skladali z <40 buniek. Rovnaké výsledky boli získané v prírodnom cicavčom SCF.

Tabuľka 6

Ľudská CFU-GM skúška COS-1 supematantov z buniek transfekovaných potkaňou SCF DNA

Vzorka	kolónia Č./100 000 buniek (±SEM)
salinický	0
GM-SCF	7±1
G-CSF	24 ±1
IL-3	5±1
CSF-1	0
SCF1-162	0

GM-CSF + SCF1162	29 ±6
G-CSF + SCF1'162	20 ±1
IL-3 + SCF1162	11 ±1
CSF-1 + SCF1’162	4±0

Príklad 5

Expresia rekombinantného SCF v bunkách ovária čínskeho chrčka

Tento príklad sa týka stálych cicavčích expresných systémov na sekréciu SCF z CHO buniek (ATCC CCL 61 selektovaných DHFR-).

A. Rekombinantný potkaní SCF

Expresný vektor použitý na produkciu SCF bol V 19.8 (obr. 17). Selektujúci marker použitý na zaistenie stálych transformantov bol gén pre dihydrofolát reduktázu v plazmide pDSVE.l. Plazmid pDSVE.l (obr. 18) je derivátom pDSVE konštruovaným štiepením pDSVE reštrikčným enzýmom Sali a ligáciou k oligonukleotidovému fragmentu obsahujúcemu dva oligonukleotidy

5'TCGAC CCGGA TCCCC 3' 3' G GGCCT AGGGG AGCT 5’.

Vektor pDSVE je opísaný v US prihláškach č. 025344 a 152045, uvedených tu ako odkaz. Časť vektora V 19.8 a pDSVE.l obsahuje dlhé úseky, ktoré sú homológne, zahrnujúc do toho bakteriálny ColEl pôvod replikácie a gén na ampicilínovú rezistenciu a SV40 pôvod replikácie. Tieto presahujúce úseky môžu prispieť k homológnej rekombinácii počas transformačného procesu, takto uľahčujú ko-transformáciu.

Boli pripravené kalciumfosfátové ko-zrazeniny V 19.8 SCF konštruktov a pDSVE.l v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 pg prenášačovej myšacej DNA použitím 1,0 alebo 0,1 pg pDSVE.l, ktorý bol linearizovaný reštrikčnou endonukleázou Pvul a 10 pg V19.8 SCF, ako to opisuje Wigler a spol., supra (1978). Kolónie boli selektované vzhľadom na expresiu DHFR génu z pDSVE. 1. Kolónie schopné rastu bez prídavku hypoxantínu a tymidínu boli vybrané použitím klonovacích valcov a rozširované ako nezávislé bunkové línie. Bunkové supematanty z jednotlivých bunkových línií boli testované v MC/9 ³H-tymidínovej absorpčnej skúške. Výsledky z charakteristického experimentu sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7

Skúška absorpcie ³H-tymidínu zo stabilných CHO buniek

Transfektovaná DNA

V 19.8 SCF¹’¹⁶² žiadna objem skúšaného kondiciovaného média cpm

3

1,5

22,926

34,973

30,657

14,714

7,160

694

1,082

880

672

1,354

B. Rekombinantný ľudský SCF

Expresia SCF v CHO bunkách bola tiež dosiahnutá použitím expresného vektora pDSVE a 2, ktorý je opísaný v US prihláške č. 501904 podanej 29.3.1990, ktorá je tu uvedená ako odkaz. Tento vektor obsahuje gén na selekciu a amplifikáciu klonov založených na expresii DHFR génu. Kloň pDSRa2 SCF bol získaný dvojstupňovým spôsobom.

SK 281486 Β6

V19.8 SCF bol Štiepený reštrikčným enzýmom a BamHI a SCF inzert bol ligovaný do BamHI miesta pGEM3. DNA z pGEM3 SCF bola štiepená s HindlII a Sali a ligovaná do pDSR 2 štiepeného HindlII a Sali. Rovnaký postup bol opakovaný pre ľudské gény kódujúce COOH-koniec aminokyselinových polôh 162, 164 a 183 sekvencie uvedenej na obr. 15C a polohy 248 sekvencie uvedenej na obr. 42. Stabilizované bunkové línie boli stimulované metotrexátom (Shimke, v Methods in Enzymology, 151 85 - 104 (1987)) pri 10 mM, s cieľom zvýšiť hladiny expresie DHFR génu a susedného SCF génu. Hladiny expresie rekombinantného ľudského SCF boli skúšané rádioimunoštúdiou ako v príklade 7 a/alebo indukciou tvorby kolónii in vitro pri použití ľudských periférnych krvných leukocytov. Táto skúška sa uskutočňuje tak, ako je to opísané v príklade 9 (tabuľka lľ ) s tým rozdielom, že sa použije periférna krv namiesto kostnej drene a inkubácia sa uskutočňuje pri 20 % O₂, 5 % CO₂ a 75 % N₂ v prítomnosti ľudského EPO (10 j/ml). Výsledky z typických pokusov sú uvedené v tabuľke 8. CHO kloň exprimujúci ľudský SCF¹'¹⁶⁴ bol deponovaný 25. septembra 1990 v ATCC (CRL10557) a označený Hul64SCF17.

Tabuľka 8

Skúška hPBL kolónií kondiciovaného média pri stabilných CHO bunkových línií transfekovaných ľudskou SCF DNA

Transfektovaná DNA	skúšané médium (μί)	počet kolónií/105
pDSRa2 hSCF1164	50	53
	25	45
	12,5	27
	6,25	13
pDSRa2 hSCF1162	10	43
	5	44
	2,5	31
	1,25	17
	0,625	21
žiadna (CHO kontrola)	50	4

Príklad 6

Expresia rekombinantného SCF v E. coli

A. Rekombinantný potkaní SCF

Tento príklad sa týka expresie v E. coli SCF polypeptidov pomocou DNA sekvencie kódujúcej (Meť’)potkaní SCF¹¹’³ (obr. 140). Aj keď môže byť použitý akýkoľvek vhodný vektor na expresiu proteínu pri použití tejto DNA, použitý plazmid bol pCFMl 156 (obr. 19). Tento plazmid môže byť ľahko konštruovaný z pCFM 836 (pozri US patent č. 4710473, ktorý je tu uvedený pre úplnosť ako odkaz) rozrušením na dvoch endogénnych Ndel reštrikčných miestach zaplnením konca T4 polymerázovým enzýmom s nasledujúcou ligáciou tupého konca a substitúciou malej DNA sekvencie medzi jedinečné Clal a KpnI reštrikčné miesta malým oligonukleotidom uvedeným ďalej.

’CGATTTGATTCATGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3 3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTÄAGC 5

Riadenie expresie proteínu v pCFMl 156 plazmide je pomocou syntetického lambda P_L promótora, ktorý je sám pod kontrolou teplotné citlivého lambda CI857 represorového génu (aký je poskytovaný v kmeňoch E. coli FMS (ATCC dep. číslo 53911 alebo K12 Htrp). pCFMl 156 vektor je konštruovaný tak, aby mal DNA sekvenciu obsahujúcu optimálne ribozómové väzbové miesta a iniciačný kodón priamo 3'syntetického PL promótora. Unikátne Ndel reštrikčné miesto, ktoré obsahuje AT6 iniciačný kodón, predchádza multireštrikčné miesto vzhľadom na klonujúce skupiny nasledované lambda t-oop transkripčnou stop sekvenciou.

Plazmid VI9.8 SCF¹¹⁹³ obsahujúci potkaní SCF¹'¹⁹³ gén klonovaný z PCR amplifikovanej cDNA (obr. 14C), ako opisuje príklad 3 bol štiepený Bglll a SstlI 603 bp DNA fragment bol izolovaný. S cieľom poskytnúť Met iniciačného kodónu a obnovenie kodónov pre prvé tri aminokyselinové zvyšky (Gin, Glu a íle) potkanieho SCF polypeptidu, bol vyrobený syntetický oligonukleotidový linkér · TATGCAGCA 3'

3' ACGTCCTCTAG 5' s Ndel a Bglll lepivými koncami. Malý oligonukleotid a potkaní SCF¹'¹⁹³ génový fragment boli vložené ligáciou do pCFMl 156 v unikátnych Ndel a SstlI miestach plazmidu uvedených na obr. 19. Produktom tejto reakcie je expresný plazmid pCFMl 156 potkaní SCF¹ ’⁹³.

pCFMl 156 potkaní SCF¹’¹⁹³ plazmid bol transformovaný do kompetentných FMS E. coli hostiteľských buniek. Selekcia buniek, obsahujúcich plazmid, bola na báze markerového génu na antibiotickú rezistenciu (kanamycín) prenášanú pCFMl 156 vektorom. Plazmidová DNA bola izolovaná z kultivovaných buniek a DNA sekvencia syntetického oligonukleotidu a jeho spojenie s potkaním SCF génom bolo potvrdené DNA sekvencovaním.

Pre konštrukciu plazmidu pCFMl 156 potkanieho gQpi-162 Zdujúceho (Meť¹) potkaní SCF¹’¹⁶² polypeptid bol izolovaný reštrikčný fragment od EcoRI k SstlI z V19.8 potkanieho SCF a vložený do plazmidu pCFM potkanieho SCF¹¹⁹³ v unikátnych reštrikčných miestach EcoRI a SstlI a takto sa nahradí kódujúca oblasť pre karboxylový koniec potkanieho SCF génu.

Pre konštrukciu plazmidov pCFMl 156 potkanieho SCF¹'¹⁶⁴ a pCFMl 156 potkanieho SCF¹¹⁶⁵ kódujúcich (meť¹) potkaní SCF¹'¹⁶⁴ a (Meť¹) potkaní SCF¹’¹⁶⁵ boli izolované EcoRI až SstlI reštrikčné fragmenty z PCR amplifikovanej DNA kódujúcej 3' koniec SCF génu a boli označené na zavedenie miestne riadených zmien v DNA v oblasti kódujúcej karboxylový koniec SCF génu. DNA amplifikácie boli uskutočnené použitím oligonukleotidových primérov 227 -29a237-19v konštrukcii pCFMl 156 potkanieho SCF¹'¹⁶⁴ a 227-29 a 237-20 v konštrukcii pCFMl 156 potkanieho SCF¹¹⁶⁵.

B. Rekombinantný ľudský SCF

Tento príklad sa týka expresie v E. coli ľudského SCF polypeptidu pomocou DNA sekvencie kódujúcej (Meť¹) ľudský SCF¹¹⁶⁴ a (Meť¹) ľudský SCF¹¹⁸³ (obr. 15C). Plazmid V19.8 ľudského SCF¹ , obsahujúci ľudský gQpi-162 β₀[ p_Oujjjý _ak₀ templát na PCR amplifikáciu ľudského SCF génu. Oligonukleotidové priméry 227-29 a 237-19 boli použité na generovanie PCR DNA, ktorá potom bola štiepená Pstl a SstlI reštrikčnými endonukleázami. S cieľom získať Met iniciačný kodón a obnovy kodónov pre prvé štyri aminokyselinové zvyšky (Glu, Gly, íle, Cys) ľudského SCF polypeptidu bol pripravený syntetický oligonukleotidový linkér

S' TATGGAAGGTATCTGCA 3 ¹

3' ACCTTCCATAG 5' s Ndel a Pstl lepivými koncami. Malý oligolinkér a PCR odvodený génový fragment ľudského SCF génu boli vložené ligáciou do expresného plazmidu pCFMl 156 (ako už bolo opísané) v unikátnych Ndel a SstlI miestach v plazmide, ako je uvedené na obr. 19.

pCFM ľudský SCF¹¹⁶⁴ plazmid bol transformovaný do kompetentných FMS E. coli hostiteľských buniek. Selekcia na plazmid obsahujúcich bunkových hostiteľov bola uskutočnená na báze markerového génu pre antibiotickú rezistenciu (kanamycín) prenášanom na pCFM1156 vektore. Plazmidová DNA bola izolovaná z kultivovaných buniek a DNA sekvencovaním bola potvrdená DNA sekvencia ľudského SCF génu.

Pre konštrukciu plazmidu pCFM1156 ľudského SCF¹'¹⁸³ kódujúceho (Meť¹) ľudský SCF¹'¹⁸³ (obr. 15C) bol izolovaný EcoRI až HindlII reštrikčný fragment kódujúci karboxylový koniec ľudského SCF génu z pCFM ľudského gQpiií-183 (opísalo ďalej) _a SstI až EcoRI reštrikčný fragment kódujúci aminokoniec ľudského SCF génu, z pCFMl 156 ľudského SCF¹¹⁶⁴ a dlhší reštrikčný fragment z pCFM1156 bol tiež izolovaný. Tri DNA fragmenty boli spolu ligované za vzniku pCFMl 156 ľudského SCF^{1 183} plazmidu, ktorý bol potom transformovaný do FM5 E. coli hostiteľských buniek. Po selekcii kolónií použitím rezistencie na kanamycín bola plazmidová DNA izolovaná a opravená DNA sekvencia bola potvrdená DNA sekvencovaním. pGEM ľudský SCF¹¹⁴’¹⁸³ plazmid je odvodený od pGEM3, ktorý obsahuje EcoRI-Sphl fragment, ktorý zahrnuje nukleotidy 609 - 820 ľudskej SCF cDNA sekvencie uvedenej na obr. 15C. EcoRI-Sphl inzert v tomto plazmide bol izolovaný z PCR, ktorá využívala oligonukleotidové priméry 225 - 31 a 241 - 6 (obr. 12B) a PCR 22.7 (obr. 13B) ako templát. Sekvencia priméru 241 - 6 bola založená na ľudskej genómovej sekvencií na 3' strane exónu obsahujúceho kodón pre aminokyselinu 176.

C. Fermentácia E. coli, produkujúcich ľudský SCF¹'¹⁶⁴

Fermentácie na prípravu SCF 1-164 boli uskutočňované v 16-litrových fermentoroch pri použití E. coli kl2 hostiteľa, obsahujúceho plazmid pCFM 1156 ľudského SCF¹'¹⁶⁴. Zásobný očkovací materiál pre produkčnú kultúru bol udržiavaný pri -80 °C v 17 % glycerole v Luria pôde. Pre produkciu inokula bolo 100 μί rozmrazeného zásobného materiálu prenesených do 500 μί Luria pôdy v 2-litrovej Erlenmeyerovej banke a ponechaných rásť cez noc pri teplote 30 °C na rotačnej trepačke (250 ot. min’¹).

Na produkciu pasty buniek E. coli použitej ako východiskový materiál na čistenie ľudského SCF¹¹⁶⁴ v tomto príklade boli použité nasledujúce fermentačné podmienky.

Kultúra inokula bola aseptický prenesená do 16-litrového fermentora obsahujúceho 8-litrovú vsádzku média (pozri tabuľka 9). Kultúra bola kultivovaná vsádzkovým spôsobom dokiaľ OD-600 kultúry nebolo 3,5. V tomto čase bolo zavedené sterilné živné médium (živné médium 1, tabuľka 10) do fermentora pri použití peristaltického čerpadla na riadenie rýchlosti živín. Rýchlosť živného média bola exponenciálne s časom zvyšovaná o dosiahnutie rýchlosti rastu 0,15 h'¹. Teplota bola udržiavaná na 30 °C počas rastovej fázy. Koncentrácia rozpusteného kyslíka vo fermentore bola automaticky udržiavaná na 50 % nasýtení pri použití iýchlosti prietoku vzduchu, rýchlosti miešania, tlaku v nádobe a doplňovania kyslíka. pH vo fermentore bolo automaticky riadené na 7,0 pri použití kyseliny fosforečnej a hydroxidu amónneho. Pri OD-600 približne 30 bola indukovaná produkčná fáza fermentácie zvýšením fermentačnej teploty na 42 °C. V tomto čase bol ukončený prídavok živín 1 a bolo začaté pridávanie živín 2 (tabuľka 11) rýchlosťou 200 ml/h. Približne šesť hodín po zvýšení teploty fermentora bol obsah fermentora ochladený na 15 °C. Výťažok SCF¹¹⁶⁴ bol vyťažený v množstve 30 mg/OD-L. Bunkové pelety potom boli získané odstredením v Beckmanovom J6-B rotore pri 3000 x g počas jednej hodiny. Bunková pasta bola uchovávaná zmrazená pri -70 °C.

Výhodná metóda produkcie SCF¹¹⁶⁴ je podobná metóde opísanej s tou výnimkou, že boli uskutočnené nasledujúce modifikácie:

1. Nezačne podávanie živín 1, dokiaľ OD-600 kultúry nedosiahne 5-6.

2. Rýchlosť pridávania živín 1 je zvýšená pomalšie, čo vedie k pomalšej rýchlosti rastu (približne 0,08).

3. Kultúra je indukovaná pri OD-600 20.

4. Živiny 2 sú zavádzané do fermentora rýchlosťou 300 ml/h.

Všetky ostatné operácie sú rovnaké ako pri opísanom postupe vrátane médií.

Pri použití týchto postupov boli získané výťažky SCF¹¹⁶⁴ približne 35 - 40 mg/OD-L pri OD = 25.

Tabuľka 9 Zloženie vsádzkového média
kvasnicový extrakt	10ag/l
glukóza	5
K2HPO4	3,5
kh2po4	4
MgSO4.7H2O	1
NaCl	0,625
Dow P-2000, protipenivá prísada	5ml/81
vitamínový roztokb	2 ml/1
roztok stopových kovov0	2ml/l

^a Ak nie je uvedené niečo iné, sú všetky zložky mienené ako g/1.

^b Roztok stopových kovov: FeCl₃.6H₂O 27 g/1, ZnCl₂.4H₂O 2 g/ζ CaCl₂.6H₂O 2 g/1, Na₂MoO₄. 2H₂O 2 g/1, CuSO₄.5H₂O

1,9 g/1, koncentrovaná HC1,100 ml/1.

^c Vitamínový roztok: riboflavín 0,42 g/1, kyselina pantoténová 5,4 g/1, niacín 6 g/1, pyridoxín 1,4 g/1, biotin 0,06 g/1, kyselina listová 0,04 g/1.

Tabuľka 10

Zloženie živného média

kvasnicový extrakt	50a
glukóza	450
MgSO4.7H2O	8,6
roztok stopových kovovb	10 ml/1
vitamínový roztok0	10ml/l

^a Ak nie je uvedené niečo iné, sú všetky zložky mienené ako g/1.

^b Roztok stopových kovov: FeCl₃.6H₂O 27 g/1, ZnCl₂.4H₂O 2 g/1, CaCl₂.6H₂O 2g/l, Na₂Mo0₄. 2H₂O 2 g/1, CuSO₄. 5H₂O

1,9 g/1, koncentrovaná HC1,100 ml/1.

⁰ Vitamínový roztok: riboflavín 0,42 g/1, kyselina pantoténová 5,4 g/1, niacín 6 g/1, pyridoxín 1,4 g/1, biotin 0,06 g/1, kyselina listová 0,04 g/1.

Tabuľka 11

Zloženie živného média 2

Tryptón	172a
kvasnicový extrakt	86
glukóza	258

^a Všetky zložky sú uvádzané v g/1.

Príklad 7

Imunoskúška detekcie SCF

Rádioimunoskúšky (RIA) boli použité na kvantitatívnu detekciu SCF vo vzorcoch a boli uskutočnené nasledujúcim spôsobom.

SK 281486 Β6

SCF prípravok z BRL 3A buniek čistený ako v príklade 1 bol inkubovaný spolu s antisérom počas dvoch hodín pri 37 °C. Po dvoch hodinách inkubácie boli potom skúmavky so vzorkami ochladené na ľade, bol pridaný ¹²⁵I-SCF a skúmavky boli inkubované pri 4 °C najmenej 20 h. Každá skúmavka obsahovala 500 μΐ inkubačnej zmesi, s obsahom 50 μΐ zriedeného antiséra, -600 000 cpm ¹²⁵I-SCF (3,8 x x 10⁷ cpm/pg), 5 μΐ trasyloli a 0,400 μΐ SCF štandardu, s pufrom (fosfátom pufrovaný salinický roztok, 0,1 % hovädzí sérový albumín 0,05 Triton X-100, 0,025 % azid) tvoriacim zvyšok objemu. Antisérum na druhý test bolo získané z krvi králikov imunizovaných s 50 % čistým prípravkom prírodného SCF z BRL 3A kondiciovaného média. Konečné zriedenie antiséra v skúške bolo 1 :2000.

S protilátkou viazaný ^l25I-SCF bol vyzrážaný prídavkom 150 μΐ Staph, A (Calbiochem). Po 1 hodine inkubácie pri teplote miestnosti boli vzorky odstredené a pelety boli premyté dvakrát 0,75 ml 10 mM Tris-HCl pH 8,2, s obsahom 0,15M NaCl, 2 mM EDTA a 0,05 % Tritonu X-100. Premyté gelety boli premerané v gama počítači na stanovenie percent ¹²⁵I-SCF väzieb. Počty väzieb v skúmavkách, ktorým chýba sérum, boli odčítané zo všetkých konečných hodnôt pre korekciu nešpecifického zrážania. Charakteristická RIA je uvedená na obr. 20. Percentá inhibície ^l25I-SCF väzby, ktorá je produkovaná neznačeným štandardom, je dávka dependentná (obr. 20A) a ako je uvedené na obr. 20B, pri skúškach geliet, ktoré boli imunoprecipitované, pomocou SDS-PAGE a autorádografícky, je pruh ^l25I-SCF proteínu konkurujúci. Na obr. 20B je dráha 1 ¹²⁵1SCF a dráhy 2,3,4 a 5 sú imunoprecipitovaný ¹²⁵I-SCF porovnávaný s 0, 2, 100 a 200 ng SCF štandardu. Ako je stanovené tak znížením v precipitácii protilátkou v cpm pozorovanom v RIA skúmavkách, ako aj znížením v pruhu imunoprecipitovaného ¹²⁵I-SCF proteínu (migrujúci pri asi M_r 31 000), polyklonálna protilátka rozoznáva SCF štandard, ktorý bol čistený ako v príklade 1.

Westemove postupy boli tiež aplikované na stanovenie rekombinantného SCF exprimovaného v E. coli, COS-1 a CHO bunkách. Čiastočne čistený E. coli epxrimovaný potkaní SCF¹-¹⁶² a SCF’’”³, ako aj ľudský SCF¹'¹⁶² (príklady 4 a 9) a CHO bunkou exprimovaný potkaní SCF¹'¹⁶² (príklad 5), boli podrobené SDS-PAGE. Pri nasledujúcej elektroforéze boli proteínové pruhy prenesené na 0,2 pm nitrocelulózou pri použití zriadenia Bio-Rad Transblot pri 60 V počas 5 hodín. Nitrocelulózové filtre boli blokované počas 4 h v PBS, pH 7,6, s obsahom 10 % kozieho séra a ďalej inkubované počas 14 h pri teplote miestnosti s riedením 1 : 200 buď králičieho preimúnneho alebo imúnneho séra (imunizácia opísaná). Komplexy protilátka-antisérum vizualizované pri použití reagencií peroxidáza chrenu-konjugovaný kozí anti-králičí IgG (Vector laboratories) a 4-chlór-l-naftolu ako činidla vyvíjacieho zafarbenia.

Príklady dvoch Westemových analýz sú uvedené na obr. 21 a 22. Na obr. 21, dráhy 3 a 5 sú 200 μΐ COS-1 bunkami produkovaného ľudského SCF¹’¹⁶², dráhy 1 a 7 sú 200 μΐ COS-1 bunkami produkovaného ľudského EPO (COS-1 bunky transfekované s V19.8 EPO) a dráha 8 je dráhou markerov molekulovej hmotnosti. Dráhy 1-4 boli inkubované s preimúnnym sérom a dráhy 5-8 boli inkubované s imúnnym sérom. Imúnne sérum špecificky rozpoznáva difúzny pruh s Mr asi 30 000 daltonov z COS-1 buniek produkujúcich ľudský SCF¹'¹⁶², ale nie z COS-1 buniek produkujúcich ľudský EPO.

Vo Westemovej analýze uvedené na obr. 22 dráhy 1 a 7 sú 1 pg čiastočne čisteného prípravku potkanieho SCF¹¹⁹³ produkovaného v E. coli, dráhy 2 a 8 sú potkaní SCF¹' ¹⁹³ produkovaný COS-1 bunkou a čistený na agaróze s ag lutinínom zo pšeničných klíčkov. Dráhy 4 a 9 sú potkaní SCF^1-162 produkovaný COS-1 bunkou čistený na agaróze s aglutinínom zo pšeničných klíčkov, dráhy 5 a 10 sú potkaní SCF¹¹⁶² produkovaný CHO bunkou a čistený na agaróze s aglutinínom zo pšeničných klíčkov a dráha 6 sú zafarbené markery molekulovej hmotnosti. Dráhy 1 - 5 a dráhy 6-10 boli inkubované s králičím preimúnnym a imúnnym sérom. E. coli produkovaný potkaní SCF¹¹⁹³ (dráhy 1 a 7) migruje pri zrejmej M^r -24 000 daltonov, zatiaľ čo COS-1 bunkou produkovaný potkaní SCF¹'¹⁹³ (dráhy 2 a 8) migruje pri M^r 24 - 36 000 daltonov. Tento rozdiel v molekulovej hmotnosti je očakávaný, pretože cicavčie bunky, ale nie baktérie, sú schopné glykozylácie. Transfekcia sekvencie kódujúcej potkaní SCF^1-162 v COS-1 (dráhy 4 a 9) alebo CHO bunkách (dráhy 5 a 10) vedie k expresii SCF s nižšou priemernou molekulovou hmotnosťou než je produkovaný transfekciou s SCF¹'¹⁹³ (dráhy 2 a 8).

Expresné produkty potkanieho SCF¹¹⁶² z COS-1- a CHO buniek sú série pruhov v rozmedzí zrejmej mol. hmotnosti M_r medzi 24 - 36 000 daltonov. Heterogenita exprimovaného SCF je pravdepodobne spôsobená zmenami v obsahu karbohydrátov, keďže SCF polypeptid je glykozylovaný v rôznej miere.

Súhrnne, Westemove analýzy indikujú, že imúnne sérum z králikov imunizovaných s prírodným cicavčím SCF rozpoznáva rekombinantný SCF produkovaný v E. coli, COS-1 a CHO bunkách, ale nerozpoznáva akékoľvek pruhy v kontrolnej vzorke, s obsahom COS-1 bunkami produkovaného EPO. Ako ďalšiu podporu špecifity SCF antiséra je možné uviesť, že preimúnne sérum z rovnakého králika nereaguje s akýmkoľvek potkaním alebo s ľudskými SCF expresnými produktmi.

Príklad 8

In vivo aktivita rekombinantného SCF

A. Potkaní SCF pri transplantácii kostnej drene

COS-1 bunky boli transfekované s V19.8 SCF¹¹⁶² v pokuse vo veľkej mierke (T175 cm² nádoby namiesto 60 m misiek) spôsobom opísaným v príklade 4. Získalo sa približne 270 ml supematantu. Tento supematant bol chromatografovaný na agaróze s aglutinínom zo pšeničných klíčkov a S-Sepharose v podstate rovnakým spôsobom, ako je opísaný v príklade 1. Rekombinantný SCF bol hodnotený na modeli transplantácie kostnej drene založenom na myšiach W/W^v. Myš W/W^v mala defektnú kmeňovú bunku, čo okrem iného vedie k makrocytovej anémii (veľké červené krvinky) a umožňuje transplantáciu kostnej drene z normálnych živočíchov bez potreby ožarovania príjemcov (Russel a spol., Science, 144, 844 - 846 (1964)). Kmeňové buky normálneho darcu rastú po transplantácii rýchlejšie ako defektne recipientove bunky.

V nasledujúcom príklade obsahuje každá skupina šesť myší príslušného veku. Kostná dreň bola získaná z normálnych darcovských myší a transplantovaná W/W^v myšiam. Krvný profil príjemcu je sledovaný v rôznych časoch po transplantácii a prihojenie kostnej drene je stanovené zmenami periférnych krvných buniek z recipientovho fenotypu na donorov. Konverzia z recipienta na donorov fenotyp je detegovaná monitorovaním predného „scatter“ profilu (FASCAN, Becton Dickenson) červených krviniek. Profil pre každú transplantáciu pre každé zviera bol porovnaný s profilom pre kontrolné zvieratá tak donora, ako aj recipienta, v rovnakom čase. Porovnanie bolo uskutočnené pri využití počítačového programu založeného na Kolmogorových-Smimových štatistikách na analýzy histogramov z prietokových systémov (Young, J. Histochem. and Cyto chem., 25, 935 - 941 (1977)). Nezávislým kvalitatívnym indikátorom prihojenia je hemoglobín, detegovaný elektroforézou hemoglobínu príjemcovej krvi (Wong a spol., Mol. and Celí. Biol., 9, 798 - 808 (1989)), čo je v súlade so závermi štatistiky podľa Kolmogorova-Smimova.

Približne 3 x 10⁵ buniek bolo transplantovaných bez ošetrenia SCF (kontrolná skupina na obr. 23) z C56BL/6J darcov W/W^v príjemcom. Druhá skupina dostala 3 x 10⁵ buniek donora, ktoré boli ošetrené SCF (600 j/ml) pri 37 °C počas 20 min. a injektované spoločne (pre-ošetrená skupina na obr. 23). (Jedna jednotka SCF je definovaná ako množstvo, ktoré vedie k polovici maximálnej stimulácie v MC/9 bioskúške). V tretej skupine, recipientné myši boli inejktované subkutánne (sub-Q) približne 400 j SCF/deň, 3 dni po transplantácii 3 x 10⁵ darcovských buniek (sub-Q inj. skupina na obr. 23). Ako je uvedené na obr. 23, v obidvoch SCF-ošetrených skupinách je kostná dreň prihojená rýchlejšie v neošetrenej kontrole. 29 dní po transplantácii bola SCF pre-ošetrená skupina premenená na donorov fenotyp. Tieto príklady ilustrujú vhodnosť SCF terapie pri transplantácii kostnej drene.

B. In vivo aktivita potkanieho SCF u Steel myší

Mutácie v SI lokuse spôsobujú deficienciu hematopoetických buniek, pigmentových buniek a zárodočných buniek. Hematopoetický defekt je manifestovaný ako znížený počet červených krviniek (Russell, v: Al Gordon, Regulation of Hematopoiesis, zv. I, 649 - 675 Appleton-CentruyCrafts, New York (1970)), neutrofilov (Ruscetti, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 152, 398 (1976)), monocytov (Shibata, J. Immunol. 135, 3905 (1985)), megakaryocytov (Ebbe, Exp. Hematol., 6, 201 (1978)), prirodzených zabíjačových buniek (Clark, Immunogenetics, 12, 601, (1981)) a mast buniek (Hayashi,, Dev. Biol., 109, 234 (1985)). Steel myši sú čistými príjemcami transplantátu kostnej drene pre svoju schopnosť poskytovať kmeňové bunky (Bannerman, Prog. Hematol., 8, 131 (1973)). Gén kódujúci SCF je u Steel myší (Sl/Sl) vypustený.

Steel myši poskytujú senzitívny in vivo model pre SCF aktivitu. Rôzne rekombinantné SCF proteíny boli testované na Steel-Dickic (Sl/Sl^d) myšiach rôzne dlhý čas. Šesť až desať týždňov staré Steel myši (WCB671-Sl/Sl^d) boli získané od Jackson Labs, Ber Harbor, ME. Periférna krv bola monitorovaná mikrobunkovým počítačom SYSMEX F-800 (Baxter, Irvine, CA) na červené krvinky, hemoglobín a doštičky. Na spočítanie periférnych bielych krviniek (WBC) bol použitý Coulter Channalyzer 256 (Coulter Electronis, Marietta, GA).

V pokuse na obr. 24 boli Steel-Dickie myši ošetrené SCF

1-164 získaným z E. coli, čisteným ako v príklade 10, v dávke 100 pg/kg/deň počas 30 dní, potom ďalších 20 dní dávkou 30 pg/kg/defl. Proteín bol formulovaný v salinickom roztoku na injekcie (Abbott Labs, North Chicago, IL) + 0,1 % fetálneho hovädzieho séra. Injekcie boli podávané denne subkutánne. Periférna krv bola monitorovaná v chvoste odohraním 50 pl v časoch uvedených na obr. 24. Krv bola odobraná do 3 % EDTA potiahnutých striekačiek a prenesená do mikrofúgových skúmaviek s práškovým EDTA (Brinkmann, Westburry, NY). Existuje výrazná korekcia makrocytovej anémie u ošetrených zvierat vzhľadom na zvieratá kontrolné. Pri ukončení ošetrenia sa ošetrované zvieratá vrátili do začiatočného stavu makrocytovej anémie.

V pokuse uvedenom na obr. 25 a 26 boli Steel-Dickie myši ošetrené rôznymi rekombinantnými formami SCF, ako je to opísané, v dávke 100 pg/kg/deň počas 20 dní. Boli produkované dve formy z E. coli získaného potkanieho SCF, SCF¹'¹⁶⁴ a SCF¹’¹⁹³, ako je to opísané v príklade 10.

Ďalej bol tiež testovaný E. coli SCF¹¹⁶⁴ modifikovaný prídavkom polyetylénglykolu (SCF''¹⁶⁴PEG25) ako v príklade

12. Takisto bol testovaný z CHO získaný SCF¹’¹⁶² produkovaný ako v príklade 5 a čistený ako v príklade 1L Zvieratá boli podrobené odohraniu krvi srdcovou punkciou striekačkami s 3 % EDTA a tá bola umiestená do skúmaviek s práškovou EDTA. Profily periférnej krvi po 20 dňoch po ošetrení sú uvedené na obr. 23 pre biele krvinky (WBC) a obr. 26 pre doštičky. WBC rozdiely pre skupinu SCF¹'¹⁶⁴ pEG25 sú uvedené na obr. 27. Absolútne sú zvýšené neutroflly, monocyty, lymfocyty a doštičky. Najdramatickejší efekt je zrejmý s SCF^M64PEG25.

Nezávislé merania lymfocytov boli tiež uskutočnené a údaje sú uvedené na obr. 28. Myšací ekvivalent ľudskej CD4 alebo markér T pomocných buniek, je L3T4 (Dialynas, J. Immunol., 131, 2445 (1983)). Lyt-2 je myšací antigén cytotoxických T buniek (Ledbetter, J. exp. Med., 153, 1503 (1981)). Monoklonálne protilátky proti týmto antigénom boli použité na hodnotenie T bunkových podskupín u ošetrených zvierat.

Krv bola hodnotená na T lymfocyty nasledujúcim spôsobom. Dvesto mikrolitrov krvi bolo odobraných od jednotlivých zvierat do EDTA ošetrených skúmaviek. Každá vzorka krvi bola lýzovaná sterilnou deionizovanou vodou počas 60 sekúnd a potom spracovaná izotonicky s 10 x x Dulbecco fosfátovým pufrovaným salinickým roztokom PBS (Gibco, Grand Island, NY). Takto lýzovaná krv bola premytá dvakrát lx PBS (Gibco, Grand Island, NY) doplneným 0,1 % fetálneho hovädzieho séra (Flow Laboratory, McLean, VA) a 0,1 % azidu sodného. Každá vzorka krvi bola umiestená do misky s 96 jamkami s guľatým dnom a odstredená. Bunková paleta (obsahujúca 2-10 x 10⁵ buniek) bola resuspendovaná s 20 mikrolitrami L3T4 (potkaní antimyší) konjugovaného s phycoerytrínom (PE) (Becton Dickinson, Mountain View, CA) a 20 mikrolitrami Lyt-2 (potkaní anti-myší) konjugovaného s fluoresceinizotiokyanátom, inkubovaným na ľade (4 °C) počas 30 minút (Becton Dickinson). Nasledujúce inkubácie buniek boli premyté dvakrát v lx PBS, doplneným ako je to uvedené. Každá vzorka krvi potom bola analyzovaná na FACScan celí analytickom systéme (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Tento systém bol štandardizovaný pri použití štandardných autokompenzačných postupov a Calibrite Beads (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Tieto údaje indikujú zvýšenie tak pomocných T buniek, ako aj cytotoxických buniek T.

C. In vivo aktivita SCF u primátov

Ľudský SCF 1-164 exprimovaný v E. coli (príklad 6B) a čistený do homogenity ako v príklade 10 bol testovaný na in vivo biologickú aktivitu u normálnych primátov. Dospelé samce paviánov (Papio sp.) boli študované v troch skupinách: neošetrená, n = 3, SCF 100 pg/kg/deň, n = 6 a SCF 30 pg/kg/deň n = 6. Ošetrené zvieratá dostávali raz denne subkutánne injekcie SCF. Skúšobné vzorky krvi boli získané od zvierat pod ketamínom. Vzorky kompletnej krvi, retikulocytov a doštičiek boli získané L, 6., 11., 15. 20. a 25. deň po ošetrení.

Všetky zvieratá prežívajú a nemajú žiadnu negatívnu reakciu vzhľadom na terapiu SCF. Počet bielych krviniek sa u zvierat ošetrených 100 pg/kg zvýšil, ako je to uvedené na obr. 29. Rozdielny počet, získaný ručne z Wright Giemsa vyfarbených škvŕn periférnej krvi, je tiež uvedený na obr. 29. Bolo tu absolútne zvýšenie u neutrofilov, lymfocytov a monocytov. Ako je uvedené na obr. 30 pri dávke 100 pg/kg tiež došlo k zvýšeniu hematocytov a doštičiek.

Ľudský SCF (hSCF¹¹⁶⁴ modifikovaný prídavkom polyetylénglykolu, ako v príklade 12) bol tiež testovaný na normálnych paviánoch v dávke 200 pg/kg/deň, podávanej kontinuálne intravenóznou infúziou a porovnávaný s nemodifíkovaným proteínom. Zvieratá začali dostávať SCF 0. deň a boli ošetrované 28 dní. Výsledky periférnej WBC sú uvedené v nasledujúcej tabuľke. PEG modifikovaný SCF vyvoláva skoršie zvýšenie periférnej WBC než modifikovaný SCF.

Ošetrenie 200 pg/kg/deň hSCF¹’¹⁶⁴:

Zviera č. M88320	Zviera č. M88129
deň	WBC	deň	WBC
0	5 880	0	6 800
+7	10 700	+7	7 400
+14	12 600	+14	20 900
+16	22 000	+21	18 400
+22	31 100	+23	24 900
+24	28 100	+29	13 000
+29	9 600	+30	23 000
+36	6 600	+37	12 100
+43	5 600	+44	10 700

+51 7 800

Ošetrenie 200 pg/kg/deň PEG-hSCF¹’¹⁶⁴:

Zviera č. M88350	Zviera č. M89116
deň	WBC	deň	WBC
-7	12400	-5	7 900
-2	11 600	0	7 400
+4	24 700	+6	16 400
+7	20400	+9	17 100
+11	24 700	+13	18 700
+14	32 600	+16	19 400
+18	33 600	+20	27 800
+21	26 400	+23	20 700
+25	16 600	+27	20 200
+28	26 900	+29	18 600
+32	9 200	+33	7 600

Príklad 9

In vitro aktivita rekombinantného ľudského SCF cDNA ľudského SCF korešpondujúc aminokyselinám 1-162 získaná PCR reakciami ako v príklade 3D, bola exprimovaná v COS-bunkách, ako je to opísané pre potkaní SCF v príklade 4. COS-1 supematanty boli skúšané na ľudskej kostnej dreni, ako aj v myšacích HPP-CFC a MC/9 skúškach. Ľudský proteín nebol aktívny pri koncentráciách testovaných v obidvoch skúškach na myšiach, bol aktívny na ľudskej kostnej dreni. Kultivačné podmienky boli nasledujúce: ľudská kostná dreň od zdravých dobrovoľníkov bola odstredená nad Picoli-hypaque gradientmi (Pharmacia) a kultivovaná v 2,1 % metylcelulóze, 30 % fetálneho teľacieho séra, 6 x 10'⁵ M 2-merkaptoetanolu, 2 mM glutamínu, ISCOVE médiu (GIBCO), 20 j/ml EPO a 1 x 10⁵ buniek/ml 14 dní v navlhčenej atmosfére, s obsahom 7 % O₂, 10 % CO₂ a 83 % N₂. Počet kolónií vzniknutých s rekombinantnými ľudskými a potkaními SCF CSO-1 supernatantmi je uvedený v tabuľke 1. Sú započítané len tie kolónie, ktoré majú veľkosť 0,2 mm alebo väčšiu.

Tabuľka 12

Rast kolónií ľudskej kostnej drene ako odpoveď na SCF

Transfektovaný plazmid	objem CM skúš. (μί)	kolónie poč./lOOOOO buniek + štand. odch.
V19.8 (bez inzertu)	100	0
	50	0
V19.8 ľudský SCF''162	100	33 ±7
	50	22 ±3
V19.8 potkaní SCF1162	100	13+1
	50	10

Kolónie, ktoré rástli počas štrnásťdenného obdobia, sú uvedené na obr. 31A (zväčšené 12x). Šípka upozorňuje na typickú kolóniu. Kolónie sa podobajú kolóniám myšacieho HPP-CFC svojimi rozmermi (priemer 0,5 mm). Vďaka prítomnosti EPO boli niektoré kolónie hemoglobizované. Po izolácii kolónií a odstredení na sklenených doštičkách pri použití Cytospinu (Shandon) s nasledujúcim vyfarbením pomocou Wright-Giemsy, bol prevládajúcim bunkovým typom typ bunky nerozdelenej s veľkým jadrom: cytoplazma pomerom, ako je uvedené na obr. 13B (zväčšenie 400 x). Šípky na obr. 31B predstavujú: šípka 1 - cytoplazma, šípka 2 - jadro, šípka 3- vakuola. Imaturované bunky ako trieda sú veľké a získané bunky sú menšie ako zrelé (Dis a spol., The Morphology of Human Blood Cells, Abbott Labs, 3 (1978)). Jadrá raných buniek z hematopoetínovej maturovanej sekvencie sú relatívne veľké vzhľadom na cytoplazmu. Ďalej cytoplazma imaturovaných buniek sa zafarbuje pomocou Wright-Giemsy tmavšie ako jadro. Ako bunky dozrievajú, je jadro oproti cytoplazme tmavšie. Morfológia buniek ľudskej kostnej drene vzniknutých z kultúry s rekombinantným ľudským SCF je v súlade so závermi, že konečným produktom a medziproduktom pôsobenia SCF je relatívne imaturovaný hematopoetický progenitor.

Rekombinantný ľudský SCF bol testovaný skúškou kolóniou na agare na ľudskej kostnej dreni v kombinácii s ďalšími rastovými faktormi opísanými skôr. Výsledky sú uvedené v tabuľke 13. SCF synergizuje s G-CSF, GM-CSF, IL-3 a EPO na zvýšenie proliferácie kostnej drene pre individuálny CSF.

Tabuľka 13

Synergizmus rekombinantného ľudského SCF s ďalšími faktormi stimulujúcimi ľudské kolónie

kolónie počet/105 buniek (14 dní)
slepý pokus	0
hG-CSF	32 ±3
hG-CSF + hSCF	74 ±1
hGM-CSF	14 ±2
hGN-CSF + hSCF	108 ±5
hIL-3	23 ±1
ML-3+hSCF	108+3
hEPO	10 ±5
hEPO + IL-3	17+1
hEPO + hSCF	86+10
hSCF	0

Ďalšou aktivitou rekombinantného ľudského SCF je schopnosť vyvolávať proliferáciu ľudskej akútnej myelogénovej leukemickej (AML) bunkovej línie, KG-1 (ATCC CCL 246) v mäkkom agare. COS-1 supematanty z transfekovaných buniek boli testované v KG-1 agarovej klonovacej skúške (Koeffler a spol. Science, 200, 1153 - 1154 (1978)) v podstate tak, ako je opísaná, s výnimkou, že bunky boli umiestené na platňu v koncentrácii 3000/ml. Údaje z troch kultúr sú uvedené v tabuľke 14.

Tabuľka 14 Skúška klonovania KG-1 na mäkkom agare
Transfektovaný plazmid	skúšaný objem (μί)	kolónie poč./3000 buniek + SD (štand. odch.)
VI 9.8 (bez inzertu)	25	2±1
V19.8 ľudský SCF1-162	25	14 ±0
	12	8±0
	6	9 ±5
	3	6 ±4
	1,5	6 ±6
V19.8 potkaní SCF1'62	25	6±1

ľudský GM-CSF 50 (5 ng/1) 14 ±5

Príklad 10

Čistenie rekombinantných SCF produktov exprimovaných v E. coli

Fermentácia E. coli ľudského SCF¹¹⁶⁴ bola uskutočnená podľa príkladu 6C. Získané bunky (912 g vlhkej hmotnosti) boli suspendované vo vode v objeme 4,6 1 celkovo a ponechané rozrušiť trojitým prechodom cez laboratórny homogenizátor (Gaulin Model 15MR-8TBA) pri 8000 psi. Pelety rozrušených buniek boli získané odstredením (17 700 x g, 30 min., 4 °C), premyté raz vodou (nesuspendované a necentrifiigované) a nakoniec suspendované vo vode na objem 400 ml.

Frakcia peliet obsahujúcich nerozpustný SCF (približne 10 -12 g SCF) bola pridaná do 3950 ml vhodnej zmesi tak, že konečná koncentrácia zložiek v zmesi bola 8 M močoviny (ultračistá), 0,1 mM EDTA, 50 m octanu sodného, pH 6 - 7; SCF koncentrácia bola hodnotená ako 1,5 mg/ml. Inkubácia bola uskutočňovaná pri teplote miestnosti počas hodín, aby sa rozpustilo SCF. Zvyšný nerozpustný materiál bol odstránený odstredením (17 700 x g, 30 min., teplota miestnosti). S cieľom zložiť/reoxidovať rozpustený SCF, boli supematantné frakcie pomaly pridané pri miešaní, do 39,15 1 vhodnej zmesi, takže konečné koncentrácie zložiek v zmesi boli 2,5 M močoviny (ultračistá), 0,01 mM EDTA, 5 mM octan sodný, 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 1 mM glutatión, 0,02 % (hmotn./obj.) azid sodný. SCF koncentrácia bola hodnotená ako 150 pg/ml. Po 60 h pri teplote miestnosti (kratší čas (napr. -20 h) je tiež vhodný), bola zmes zahustená dvojnásobným prechodom cez ultrafiltračné zariadenie Millipore Pellion s polysulfónovými membránovými kazetami na delenie mol. hmotnosti 10 000 (tri kazety) (15 ft² celkový povrch) a potom diafiltrovaná proti 7 objemom 20 mM Tris-HCl, pH 8. Teplota počas koncentrácie/ultrafiltrácie bola 4 °C, rýchlosť čerpania bola

1/min. a rýchlosť filtrácie 600 ml/min. Konečný objem získaného retentátu bol 26,5 1. Použitím SDS-PAGE, uskutočnené tak s redukciou, ako aj bez redukcie vzoriek, je zrejmé, že najviac (> 80 %) peliet frakcií SCF je solubilizovaných inkubáciou s 8 M močoviny a po zložení/oxidácii sú prítomné násobné druhy (formy) SCF, ako je zrejmé z SDS-PAGE neredukovaných vzoriek. Hlavná forma, ktorá predstavuje správne oxidovaný SCF (pozri ďalej), migruje so zrejmou M_r asi 17 000 (neredukované) vzhľadom na markery molekulovej hmotnosti (redukované) opísané na obr. 9. Ďalšie formy obsahujú materiál migrujúci so zrejmou M_r asi 18 - 20 000 (neredukované), predpokladá sa, že predstavujú SCF s nesprávnymi disulfidovými väzbami vnútri reťazca; a pruhy migrujúce so zrejmými M_r v rozmedzí 37 000 (neredukované) alebo väčšie, o čom sa predpokladá, že to predstavuje rôzne SCF formy majúce vnútorné disulfidové väzby vzniknuté v SCF polypeptidových reťazcoch, ktoré sú kovalentne naviazané za vzniku dimérov alebo dlhých oligomérov. Nasledujúce stupne frakcionizácie spočívajú v odstránení zvyšných E. coli kontaminantov a neočakávaných SCF fóre, takže sa získa SCF čistený do zrejmej homogenity v biologicky aktívnej konformácii.

pH ultrafiltračného retentátu bolo upravené na 4,5 prídavkom 375 ml 10 % (obj./obj.) kyseliny octovej, čo vedie k vyzrážaniu materiálu. Po 60 minútach, to znamená čase, keď sa usadí na dne nádoby najviac materiálu, sa horných 24 1 dekantuje a prefiltruje cez Cuno™ 30SP hrubý filter pri 500 ml/min. s cieľom úplného vyjasnenia roztoku. Filtrát sa potom zriedi 1,5-krát vodou a aplikuje pri 4 °C na kolónu S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) (9 x 18,5 cm) ekvilibrovanú v 25 mM octane sodnom, pH 4,5. Cez kolónu materiál pretekal rýchlosťou 5 1/h pri 4 “C. Po aplikácii vzorky bola kolóna premytá piatimi objemami kolóny (6 1) kolónového pufra a SCF materiál, ktoiý je viazaný na kolónu, bol eluovaný gradientom od 0 do 0,35 M NaCl kolónovým pufrom. Celkový objem gradientu bol 20 1 a boli odobrané frakcie 200 ml. Elučný profil je znázornený na obr. 33. Podiely (10 μί) z frakcií odoberaných zo S-Sepharosovej kolóny boli analyzované SDS-PAGE; uskutočňované tak s redukciou (obr. 32A), ako aj bez (obr. 32B) redukcie vzorky. Z týchto analýz je zrejmé, že pravdepodobne všetky absorbancie pri 280 nm (obr. 32 a 33) sú spôsobené SCF materiálom.

Správne oxidovaná forma prevláda v piku hlavnej absorbancie (frakcie 22 - 38, obr. 33). Menšie druhy (formy), ktoré môžu byť vizualizované vo frakciách, zahrnujú nesprávne oxidovaný materiál so zrejmou M_r 18 - 20 000 na SDS-PAGE (neredukované), prítomný vo vzostupnom ramene hlavného absorbančného piku (frakcie 10 - 21, obr. 32B); a disulfidový viazaný dimémy materiál prítomný v oblasti absorbancie (frakcie 10-38, bor. 32B).

Frakcie 22 - 38 zo S-Sepharosovej kolóny boli spojené a tento podiel bol upravený na pH 2,2 pridaním asi 11 ml 6n HCl a aplikovaný na Vydac C₄ kolónu (výšky 8,4 cm, priemer 9 cm) ekvilibrovanú s 50 % (obj./obj.) etanolom,

12.5 mM HCl (roztok A) a operácia bola uskutočnená pri 4 °C. Živica kolóny bola pripravená suspendovaním suchej živice v 80 % (obj./obj.) etanole, 11,5 mM HCl (roztok B) a potom ekvilibrovaním v roztoku A. Pred aplikáciou vzorky bol aplikovaný slepý gradient od roztoku A k roztoku B (6 1 celkového objemu) a kolóna bola potom reekvilibrovaná roztokom A. Po aplikácii vzorky bola kolóna premytá

2.5 1 roztoku A a SCF materiál viazaný na kolónu bol eluovaný gradientom od roztoku A do roztoku B (18 1 celkový objem) pri rýchlosti prietoku 2 670 ml/h. Bolo odobraných 286 frakcií po 50 ml a podiely boli analyzované absorbanciou pri 280 nm (obr. 35) a SDS-PAGE (25 μί na frakciu), ako je to opísané (obr. 34A, redukčné podmienky, obr. 34B neredukčné podmienky). Frakcie 62 - 161, obsahujúce správne oxidovaný SCF vo vysoko čistom stave, boli spojené (relatívne malé množstvo nesprávne oxidovaného monoméru s M_r asi 18- 20 000 (neredukované), eluovaný neskôr v gradiente (asi frakcie 166 - 211) a disulfidový dimé27 rový materiál tiež eluovaný neskôr (asi frakcie 199 - 235) (obr. 35)).

Na odstránenie etanolu z poolu frakcií 62 - 161 a na zahustenie SCF bol použitý nasledujúci postup využívajúci Q-Sepharosovú Fast Flow (Pharmacia) ionexovú živicu. Pool (5 1) bol zriedený vodou na objem 16,625 1, na koncentráciu etanolu asi 20 % (obj./obj.). Potom bola pridaná 1 M Tris báza (135 ml) na upravenie pH na hodnotu 8, ďalej 1 M Tris-HCl, pH 8 (23,6 ml) na upravenie celkovej Tris koncentrácie na 10 mM. Ďalších 10 mM Tris-HCl, pH 8 (~15,5 1) bolo pridaných na celkový objem asi 10 % (obj./obj.). Materiál bol potom aplikovaný pri 4 °C na kolónu Q-Sepharose Fast Flow (výška 6,5 cm, priemer 7 cm), ekvilibrovanú 10 mM Tris-HCl a potom nasledovalo premývanie kolóny 2,5 1 kolónového pufra. Rýchlosť prietoku vzorky pri aplikácii a premývaní bola asi 5,5 1/h. Na elúciu viazaného SCF sa čerpalo 200 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8 v opačnom smere kolónou rýchlosťou asi 200 ml/h. Frakcie asi 12 ml boli odobrané a analyzované absorbanciou pri 280 nm a SDS-PAGE, ako je uvedené. Frakcie 16 až 28 boli spojené (157 ml).

Pool, obsahujúci SCF, bol potom aplikovaný v dvoch oddelených chromatografických pokusoch (78,5 ml použitých v každom) na Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) kolónu na gélovú filtráciu, (5 x 138 cm) ekvilibrovanú fosfátom pufrovaným salinickým roztokom pri 4 °C. Frakcie asi 15 ml boli odobrané pri prietokovej rýchlosti asi 75 ml/h. V každom prípade hlavný pík materiálov s absorbanciou pri 280 nm eluovaný vo frakciách zodpovedá približne elučnému objemu v rozmedzí od 1370 do 1635 ml. Frakcie, predstavujúce absorpčné piky z dvoch kolónových pokusov, boli spojené do objemu 525 ml, obsahujúceho asi 2,3 g SCF. Tento materiál bol sterilizovaný filtráciou pri použití zariadenia Millipore Millipak 20 membránová vložka.

Alternatívne, materiál z kolóny C₄ môže byť koncentrovaný ultrafiltráciou a pufer vymenený diafiltráciou pred sterilnou filtráciou.

Izolovaný rekombinantný ľudský SCF¹¹⁶⁴ materiál je vysoko čistý (> 98 % podľa SDS-PAGE s vyvolaním striebrom) a je pokladaný za farmaceutický čistý. Pri použití metód z príkladu 2 sa zistilo, že materiál má aminokyselinové zloženie zodpovedajúce analýze SCF génu a má N-koncovú aminokyselinovú sekvenciu Met-Glu-Gly-Ile..., podľa očakávania, s udržaním Met kódovaného iniciačným kodónom.

Podobnými postupmi uvedenými pre ľudský SCF¹¹⁶⁴ exprimovaný v E. coli, môže byť tiež získaný potkaní SCF¹'¹⁶⁴ (tiež prítomný v nerozpustnej forme vnútri bunky po fermentácii) v čistom stave s vysokou biologickou špecifickou aktivitou. Rovnako môže byť získaný ľudský CF¹'¹⁸³ a potkaní SCF¹’¹⁹³, potkaní SCF¹'¹⁹³ počas skladania/oxidácie javí sklon k tvorbe rôzne oxidovaných druhov a je komplikovanejšie odstrániť tieto neočakávané druhy chromatograficky.

Potkaní SCF¹'¹⁹³ a ľudský SCF¹'¹⁸³ sú náchylné na proteolytickú degradáciu počas začiatočných stupňov získavania, to znamená solubilizácie a skladania/oxidácie. Primáme miesto proteolýzy je umiestené medzi zvyšky 160 a 170. Proteolýza môže byť minimalizovaná vhodnou úpravou podmienok (napr. koncentrácie SCF, zmenou pH, pridaním EDTA na 2 - 5 mM, alebo inými inhibitormi proteázy) a očakávané degradované formy môžu byť odstránené vhodnými deliacimi stupňami.

Zatiaľ čo použitie močoviny na solubilizáciu a počas skladania/oxidácie, ako je uvedené, je výhodnou realizáciou, môžu byť použité aj ďalšie solubilizačné činidlá, ako je guanidin . HC1 (napr. 6 M počas solubilizácie a 1,25 M počas skladania/oxidácie) a N-laurylsarkozín sodný. Po odstránení činidiel, po skladaní/oxidácii môže byť získaný vyčistený SCF, ako je stanovené SDS-PAGE, použitím vhodných deliacich stupňov.

Ďalej je výhodnou realizáciou použitie glutatiónu v koncentrácii 1 mM počas skladania/oxidácie, môžu byť však použité ďalšie podmienky s rovnakým alebo blízkym účinkom. Tieto napríklad zahrnujú použitie namiesto 1 mM glutatiónu mM glutatiónu plus 0,2 mM oxidovaného glutatiónu, alebo 4 mM glutatiónu plus 0,4 mM oxidovaného glutatiónu, alebo 1 mM 2-merkaptoetanolu, alebo iného tiolu.

Okrem opísaných chromatografických postupov sú vhodné aj iné postupy získania SCF vo vyčistenej aktívnej forme, ktoré zahrnujú hydrofóbnú interakčnú chromatografiu (napr. použitie fenyl-Sepharosy (Pharmacia), používajúcu vzorku v neutrálnom pH v prítomnosti 1,7 M síranu amónneho a elúciu gradientom znižujúcej sa koncentrácie síranu amónneho); afinitná chromatografia s imobilizovaným kovom (napr. použitie chelatovanej Sepharosy (Pharmacia) s Cu²⁺ iónmi, aplikácia vzorky pri takmer neutrálnom pH v prítomnosti 1 mM imidazolu a elúcia gradientom zvyšujúcej sa koncentrácie imidazolu); hydroxylapatitové chromatografie (aplikácia vzorky pri neutrálnom pH v prítomnosti 1 mM fosfátu a elúcii zvyšujúcim sa gradientom fosfátu) a ďalšie postupy, ktoré sú zrejmé odborníkom.

Ďalšie formy ľudského SCF, zodpovedajúce celému alebo časti otvoreného čítacieho rámca kódujúceho aminokyseliny 1-248 na obr. 42, alebo zodpovedajúce otvorenému čítaciemu rámcu kódovanému alternatívne spájanými mRNA, ktorý môže existovať (ako je reprezentovaný cDNA sekvenciou na obr. 44), môžu byť tiež exprimované v E. coli a získané v čistenej forme postupmi rovnakými, ako sú opísané v tomto príklade a ďalšími postupmi, ktoré sú zrejmé pre odborníkov.

Čistenia a príprava foriem zahrnujúcich takzvanú transmembránovú oblasť (príklad 16) môžu využívať detergenty zahrnujúce neionogénne detergenty a lipidy zahrnujúce fosfolipidy obsahujúce lipozómovú štruktúru.

Príkladll

Rekombinantný SCF z cicavčích buniek

A. Fermentácia CIIO buniek produkujúcich SCF

Rekombinantné bunky ovária čínskeho chrčka (CHO) (kmeň CHO pDSRa hSCF¹’¹⁶²) boli kultivované na mikronosičoch v 20-litrovom perfúznom kultivačnom systéme na produkciu ľudského SCF¹¹⁶². Fermentorový systém bol podobný systému použitému pri kultivácii BRL 3A buniek, príklad IB, s výnimkou nasledujúcich podmienok: kultivačným médiom použitým na kultiváciu CHO buniek bola zmes média Dulbecco's Modified Eagle Médium (DMEM) a Ham's F-12 živná zmes v pomere 1 : 1 (GIBCO), doplnené 2 mM glutamínu, neesenciálnymi aminokyselinami (na zdvojnásobenie existujúcej koncentrácie pri použití 1 : 100 zriedenia Gibco č. 320 - 1140) a 5 % fetálneho bovinného séra. Získané médium bolo identické s výnimkou vynechania séra. Reaktor bol inokulovaný 5,6 x 10⁹ CHO bunkami kultivovanými v dvoch 3-litrových nádobách. Bunky boli ponechané rásť do koncentrácie 4 x 10^s buniek/ml. V tomto bode bolo do reaktora pridaných 100 gramov pasterizovaného mikronosiča cytodex-2 (Pharmacia) ako suspenzia v litroch fosfátom pufrovaného salinického roztoku. Bunky boli ponechané napojiť a rásť na mikronosičoch počas 4 dní. Rastové médium bolo perfúndované reaktorom podľa potreby vzhľadom na spotrebu glukózy. Koncentrácia glukózy bola udržiavaná približne na 2,0 g/. Po štyroch dňoch bol reaktor perfúndovaný šiestimi objemami média neob

SK 281486 Β6 sahujúceho sérum s cieľom odstrániť väčšinu séra (koncentrácia proteínu < 50 pg/ml). Reaktor bol potvrdzovaný vsádzkovo, dokiaľ koncentrácia glukózy neklesla pod 2 g/1. Od tohto momentu bol reaktor prevádzkovaný kontinuálnou perfúznou rýchlosťou asi 20 1/deň. pH kultúry bolo udržiavané na 6,9 + 0,3 úpravou prietoku CO₂. Rozpustený kyslík bol udržiavaný na hladine vyššej ako 20 % sýtením vzduchom a podľa potreby doplňovaný čistým kyslíkom. Teplota bola udržiavaná na 37 ±0,5 °C.

Z uvedeného systému bolo získaných približne 450 litrov kondiciovaného média, a to bolo použité ako východiskový materiál na čistenie rekombinantného ľudského SCF¹' ¹⁶². Približne 589 litrov kondiciovaného média neobsahujúceho sérum bolo tiež získaných rovnakým postupom, ale pri použití kmeňa CHO pDSRa2 rSCF^{1 162} sa použilo ako východiskový materiál na čistenie potkanieho SCF¹'¹⁶².

B. Čistenie rekombinantného cicavčieho exprimovaného potkanieho SCF¹’¹⁶²

Všetky čistiace postupy boli uskutočňované pri 4 °C, ak nie je uvedené niečo iné.

1. Koncentrácia a diafiltrácia

Kondiciované médium získané zo sérum neobsahujúcej kultivácie bunkového kmeňa CHO pDSRa2 potkanieho SCF¹’¹⁶², ako je opísané v sekcii A, bolo vyčírené filtráciou cez 0,45 gm Sartocapsules (Sartorius). Niekoľko rozdielnych vsádzok (36 1, 1011, 102 1,200 1 a 150 1) bolo oddelene zahustených a uskutočnila sa výmena diafiltrácia/pufer. Na ilustráciu, spracovanie 36 1 vsádzky bolo nasledujúce. Filtrované kondiciované médium bolo zahustené na 500 ml pri použití ultrafiltračného zariadenia s tangenciálnym prietokom Millipore Pellion s membránovými kazetami z acetátu celulózy (tri kazety) oddeľujúcimi molekulovú hmotnosť 10 000 (15 ft² celková plocha membrány, rýchlosť čerpania 2200 ml/min. a rýchlosť filtrácie ~750 ml/min.). Výmena diafiltrácia/pufer pre anionovýmennú chromatografiu bola potom uskutočnená pridaním 1000 ml 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 - 6,8 pre koncentrát, znovuzahustením na 500 ml pri použití zariadenia na ultrafiltráciu s tangenciálnym prietokom a opakovaním tohto pridávania 5-krát. Koncentrovaný/diafiltrovaný prípravok bol nakoniec získaný v objeme 1000 ml. Postup pre všetky vsádzky kondiciovaného média podrobené zahusteniu a diafiltrácii/výmene pufra bol rovnaký. Koncentácie proteínu vo vsádzkach, stanovené metódou podľa Bradforda (Anal. Biochem. 72, 248 - 254 (1976)) s hovädzím sérový albumínom ako štandardom, boli v rozmedzí 70 - 90 pg/ml. Celkový objem kondiciovaného média použitého na túto prípravu bol asi 589 1.

2. Anionovýmenná chromatografia na Q-Sepharose s rýchlym prietokom

Koncentrované/diafiltrované prípravky z každej z piatich vsádzok kondiciovaného média uvedené boli spojené (celkový objem 5000 ml). pH bolo upravené na 6,75 pridaním 1 M HCI. 2000 ml 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 bolo použité na úpravu vodivosti na asi 0,700 mmho. Prípravok bol aplikovaný na anionovýmennú kolónu Q-Sepharosy s rýchlym prietokom (36 x 14 cm, živica Q-Sepharose Fast Flow Pharmacia), ktorá bola ekvilibrovaná s 10 mM TrisHCl, pH 6,7 pufer. Po aplikácii vzorky bola kolóna premytá 28 700 ml Tris pufra Po tomto premývaní bola kolóna premytá 23 000 ml 5 M kyseliny octovej/1 mM glycín/6 M močovina/20 μΜ CuSO₄ s pH asi 4,5. Kolóna bola potom premytá 10 mM Tris-HCl, 20 gm CuSO₄, pH 6,7, pufra na obnovenie neutrálneho pH a odstránenie močoviny a soľným roztokom (0 - 700 mM NaCl, v 10 mM Tris-HCl, 20 μΜ CuSO₄, pH 6,7 pufer; 401 objem celkovo). Boli odobrané frakcie s veľkosťou asi 490 ml pri prietokovej rýchlosti 3250 ml/h. Chromatogram je uvedený na obr. 36. „MC/9 cpm“ udáva biologickú aktivitu v MC/9 skúške; 5 gl z každej označenej frakcie bolo skúšaných. Eluáty odobrané počas aplikácie vzorky a premývané nie sú na obrázku uvedené, v týchto frakciách nebola žiadna biologická aktivita

3. Chromatografia pri použití na silikagéli viazanej uhľovodíkovej živice

Frakcie 44-66 z pokusu uvedeného na obr. 36 boli spojené (11 200 ml) a bola pridaná EDTA do konečnej koncentrácie 1 mM. Tento materiál bol aplikovaný prietokovou rýchlosťou asi 2000 ml/h na C₄ kolónu (Vydac Proteins C₄, 7 x 8 cm) ekvilibrovaňou pufrom A (10 mM Tris pH 6 ,7/20 % etanolu). Po aplikácii vzorky na kolónu bola kolóna premytá 1000 ml pufra A. Potom bol aplikovaný lineárny gradient od pufra A do pufra B (10 mM Tris pH 6,7/94 % etanolu) (celkový objem 6000 ml) a boli odobrané frakcie 30 až 50 ml. Podiely zo štartu vzorky na kolóne C₄, súhrnného poolu a premývacieho poolu pridané k 0,5 ml podielom gradientových frakcií boli dialyzované proti fosfátom pufrovanému salinickému roztoku pri príprave na biologickú skúšku. Tieto rôzne frakcie boli skúšané v MC/9 skúške (5 gl podiely pripravených gradientových frakcií; cpm na obr. 37). SDS-PAGE (Laemli, Náture 227, 680 - 685 (1970); zásobné gély obsahujú 4 % (hmotn./obj.) akrylamidu a separačné gély obsahujú 12,5 % (hmotn./obj.) akrylamidu) podielov rôznych frakcií je uvedená na obr. 38. Na použitie na géli boli vzorky podielov (100 gl) sušené pri vákuu a potom opäť rozpustené pri použití 20 gl pufra na spracovanie vzorky (redukčné, to znamená s 2-merkaptoetanolom) a varené 5 min. pred vložením na gél. Číslované značky na ľavej strane obrázka predstavujú migračné polohy markerov molekulovej hmotnosť (redukované) ako na obr. 6. Číslované dráhy predstavujú zodpovedajúce frakcie odobrané počas aplikácie poslednej časti gradientu. Gély boli vyvolané striebrom (Morrisey, Ana. Bioch. 117, 307 - 310 (1981)).

4. Anionovýmenná chromatografia na Q-Sepharose s rýchlym prietokom

Frakcie 98 - 124 z C₄ kolóny sú uvedené na obr. 37, tieto boli spojené (1050 ml). Pool bol zriedený 1:110 mM Tris, pH 6,7 pufrom na zníženie koncentrácie etanolu. Zriedený pool bol potom aplikovaný na anionovýmennú Q-Sepharosovú kolónu s rýchlym prietokom (3,2 x 3 cm, živica Pharmacia Q-Sepharosa Fast Flow), ktorá bola ekvilibrovaná 10 mM Tris-HCl, pH 6,7 pufrom. Rýchlosť prietoku bola 463 ml/h. Po aplikácii vzorky bola kolóna premytá 135 ml kolónového pufra a elúcia nadviazaného materiálu bola uskutočnená premytím 10 mM Tris-HCl, 350 mM NaCl, pH 6,7. Smer prietoku cez kolónu bol obrátený, aby sa minimalizoval objem eluovaného materiálu a boli počas elúcie odobrané frakcie 7,8 ml.

5. Sephacryl S-200 HR gélová filtračná chromatografia

Frakcie obsahujúce eluovaný proteín z premývania kolóny aniónovou Sepharose Fast Flow soľou boli spojené (31 ml). 30 ml bolo aplikovaných na gélovú filtračnú kolónu Sephacryl S-200 (Pharmacia) (5 x 55,5 cm) ekvilibrovanou vo fosfátom pufrovanom salinickom roztoku. Frakcie 6,8 ml boli odobrané pri prietokovej rýchlosti 68 ml/h. Frakcie zodpovedajúce piku absorbancie pri 280 nm boli spojené a predstavujú finálny vyčistený materiál.

Tabuľka 15 predstavuje súhrn čistení.

Tabuľka 15

Súhrnný prehľad čistenia cicavčieho exprimovaného potkanieho SCF¹¹⁶²

Stupeň celkovo

	objem (ml)	proteín (mg)x
kondiciované médium	7 000	28 420
(koncentrované)
Q-Sepharose Fast Flow	11 200	974
C4 živica	1 050	19
Q-Sepharose Fast Flow	31	20
Sephacryl S-200 HR	82	19

* Stanovené metódou podľa Bradforda (skôr, 1976) Stanovené ako 47,3 mg kvantitatívnou aminokyselinovou analýzou pri použití metódy rovnakej, ako je uvedená v príklade 2.

N-Koncová aminokyselinová sekvencia čisteného potkanieho SCF¹¹⁶² je približne polovica Gln-Glu-Ile... a polovica Pyr-Glu-Glu-Ile..., ako bolo stanovené metódami podľa príkladu 2. Tieto výsledky dokazujú, že potkaní SCF¹'¹⁶² je produktom proteolytických štiepení medzi zvyškami označovanými ako číslo (-1) (Thr) a (+1) (Gin) na obr. 14C. Podobne, čistený ľudský SCF'^-162 z kondiciovaného média transfekovaných CHO buniek (ďalej) mal N-koncovú aminokyselinovú sekvenciu Glu-Gly-Ile, indikujúcu, že je produktom štiepenia medzi zvyškami označenými ako čísla (-1) (Thr) a (+1) (Glu) na obr. 15C.

Pri použití uvedeného postupu bol získaný čistený ľudský SCF proteín, buď rekombinantne vytvorený expresiou v CHO bunkách alebo prirodzene získaný.

Ďalšie čistiace metódy, ktoré sú vhodné na čistenie z cicavčích buniek získaného rekombinantného SCF, zahrnujú postupy uvedené v príklade 1 a 10 a ďalšie metódy zrejmé odborníkom.

Ďalšie formy ľudského SCF, zodpovedajúce celému alebo časti čítacieho otvoreného rámca, kódujúceho aminokyseliny 1-248 uvedené na obr. 42, alebo zodpovedajúce otvorenému čítaciemu rámcu kódujúcemu alternatívne spojené mRNA, ktoré môžu existovať (ako cDNA sekvencia na obr. 44), môžu byť tiež exprimované v cicavčích bunkách a získané v čistenej forme postupmi podobnými postupom opísaným v tomto príklade a ďalšími postupmi zrejmými odborníkom.

C. SDS-PAGE a spracovanie glykozidázou

SDS-PAGE spojených frakcií z gélovej filtračnej kolóny Sephacryl S-200 HR je uvedené na obr. 39. 2,5 pl spojenej frakcie bolo vložených na gél (dráha 1). Dráha bola vyvolaná striebrom. Markery molekulovej hmotnosti sú uvedené na obr. 6 (dráha 6). Rôzny materiál migrujúci po a nad M_r 31 000 polohou markera predstavuje biologicky aktívny materiál; zrejmá heterogenita je do značnej miery spôsobená heterogenitou pri glykozylácii.

Na charakterizovanie glykozylácie bol čistený materiál spracovaný s rôznymi glykozidázami, analyzovaný SDS-PAGE (redukčné podmienky) a bol vizualizovaný postriebrením. Výsledky sú uvedené na obr. 39. Dráha 2 - neuraminidáza. Dráha 3 - neuraminidáza a O-glykanáza. Dráha 4 - neuraminidáza, O-glykanáza a N-glykanáza. Dráha 5 - neuraminidáza a N-glykanáza. Dráha 7 - N-glykanáza. Dráha 9 - N-glykanáza bez substrátu. Dráha 9 - O-glykanáza bez substrátu. Podmienky boli 10 mM 3-[(3-cholamidopropyl)dimetylamónio]-l-propánsulfonát (CHAPS), 66,6 mM 2-merkaptoetanol, 0,04 % (hmotn./obj.) azid sodný, fosfátom pufrovaný salinický roztok, 30 minút pri 37 °C, s nasledujúcou inkubáciou pri polovici uvedených koncentrácií v prítomnosti glykozidáz po 18 h pri 37 °C.

Neuraminidáza (z Arthrobacter ureafaciens, dodaný Calbiochem) bola použitá pri konečnej koncentrácii 0,5 jednotky/ml. O-Glykanáza (Genzyme; endo-alfa-N-acetylgalaktozaminidáza) bola použitá v koncentrácii 7,5 milijednotiek/ml. N-Glykanáza (Genzyme; peptid :N-glykozidáza F; peptid-N⁴(N-acetyl-beta-glukozaminyl)asparagínamidáza) bola použitá pri koncentrácii lOjednotiek/ml.

Kde je to žiaduce, boli uskutočnené rôzne kontrolné inkubácie. Tieto zahrnujú: inkubáciu bez glykozidáz, na overenie, že výsledky sú spôsobené pridanými prípravkami glykozidázy; inkubácia s glykozylovanými proteínmi (napr. glykozylovaný rekombinantný ľudský erytropoetín), ktoré sú známe ako substráty pre glykozylázy, na overenie, že použité glykozidázové enzýmy boli aktívne; a inkubácie s glykozidázami, ale bez substrátu, na posúdenie, či glykozidázové prípravky prispievajú alebo zatemňujú vizualizáciu gélových pruhov (obr. 8 a 9).

Početné hodnotenie je možné uskutočniť z uvedených pokusov. Rôzne spracovania s N-glykanázou (ktorá odstraňuje tak komplex, ako aj vysoko manózou N-viazaný karbohydrát (Tarentino a spol., Biochemistry 24, 4665 - 4671 (1988)), neuraminidázou (ktorá odstraňuje zvyšky kyseliny sialovej) a O-glykanázou (ktorá odstraňuje určité O-viazané karbohydráty (Lambin a spol., Biochem. Soc. Trans. 12, 599 - 600 (1984)), potvrdzujú, že: sú prítomné tak N-viazaný, ako aj O-viazaný karbohydrát; je prítomná kyselina sialová, kde aspoň jej časť tvoria O-viazané skupiny. Skutočnosť, že ošetrenie N-glykanázou môže previesť heterogénny materiál podľa SDS-PAGE na rýchlejšiu migrujúcu formu, ktorá je oveľa viac homogénnejšia, indikuje, že všetok materiál predstavuje rovnaký polypeptid, s heterogenitou, ktorá je spôsobená hlavne heterogenitou pri glykozylácii.

Príklad 12

Príprava rekombinantného SCF^bl64PEG

Potkaní SCF¹’¹⁶⁴, čistený z rekombinantného E. coli expresného systému podľa príkladov 6A a 10, bol použitý ako východiskový materiál na modifikáciu s polyetylénglykolom, ako je to opísané ďalej.

Metoxypolyetylénglykol-sukcínimidylsukcinát (18,1 mg = = 3,63 pmol, SS-MPEG = Sigma Chemical Co. č. M3152, približná mol. hmotnosť = 5000) v 0,327 ml deionizovanej vody bol pridaný k 13,3 mg (0,727 pmol) rekombinantného potkanieho SCF¹¹⁶⁴ v 1,0 ml 138 mM fosforečnane sodnom, 62 mM NaCl, 0,62 mM octane sodnom, pH 8,0. Výsledný roztok bol šetrne trepaný (100 ot. min'’) pri teplote miestnosti počas 30 minút. 1,0 ml podiely konečnej reakčnej zmesi (10 mg proteínu) potom boli aplikované na felovú filtračnú kolónu Pharmacia Superdex 75 (1,6 x 50 cm) a eluované 100 mM fosfátom sodným, pH 6,9, pri rýchlosti 0,25 ml/min. pri teplote miestnosti. Prvých 10 ml z kolóny bolo odložených a potom boli odobrané 1,0 ml frakcie. Bola monitorovaná UV absorbancia pri 280 nm pre eluent z kolóny a táto absorbancia je uvedená na obr. 40A. Frakcie č. 25 až 27 boli spojené a sterilizované ultrafiltráciou cez 0,2 pm polysulfónovú membránu (Gelman Sciences č. 4454) a výsledný pool bol označený PEG-25. Podobne boli frakcie č. 28 až 32 spojené, sterilizované ultrafiltráciou a označené ako PEG-25. Spojené frakcie PEG-25 obsahujú 3,06 mg proteínu a spojené frakcie PEG-32 obsahujú 3,55 mg proteínu, ako je to vypočítané z merania A280 pri použití kalibrácie danej absorbanciou roztoku 1,0 ml/ml nemodifikovaného potkanieho SCF¹’¹⁶⁴ pri 0,66. Nezreagovaný potkaní SCF¹'¹⁶⁴, predstavujúci 11,8 % celkového proteínu v reakčnej zmesi, bol eluovaný vo frakciách číslo 34 až 37. Pri rovnakých chromatografických podmienkach bol nemodifikovaný potkaní SCF¹¹⁶⁴ eluovaný ako hlavný pík s retenčným objemom 45,6 ml, obr. 40B. Frakcie č. 77 až 80 na obr. 40A obsahujú N-hydroxysukcínimid, vedľajší produkt reakcie potkanieho SCF¹¹⁶⁴ so SS-MPEG.

Potenciálne reaktívne aminoskupiny v potkaňom SCF¹'¹⁶⁴ zahrnujú 12 lyzínových zvyškov a alfa-aminoskupinu na N-konci glutamínového zvyšku. Poolované frakcie PEG-25 obsahujú 9,3 mol reaktívnych aminoskupín na mol proteínu, stanovené spektroskopickou titráciou kyselinou trinitrobenzénsulfónovou (TNBS) pri použití metódy opísanej Habeebom, Anál. Biochem., 14:328 - 336 (1966). Podobne, spojené frakcie PEG-32 obsahujú 10,4 mol a nemodifikovaný potkaní SCF¹¹⁶⁴ obsahuje 13,7 mol reaktívnych aminoskupín na mol proteinu. Priemerne 3,3 (13,7 mínus 10,4) aminoskupín potkanieho SCF¹’¹⁶⁴ v spojenej frakcii PEG-32 bolo modifikovaných reakciou s SS-MPEG. Podobne priemerne 4,4 aminoskupiny potkanieho SCF¹'¹⁶⁴ v spojenej frakcii PEG-25 bolo modifikovaných. Ľudský SCF (hSCF¹'¹⁶⁴) produkovaný ako v príklade 10 bol tiež modifikovaný uvedeným postupom. Špecificky, 714 mg (38,5 pmol) hSCF¹¹⁶⁴ reagovalo s 962,5 mg (192,5 pmol) SS-MPEG v 75 ml 0,1 M pufra-fosforečnanu sodného, pH 8,0 počas 30 minút pri teplote miestnosti. Reakčná zmes bola aplikovaná na kolónu Sephacrylu S-200HR (5 x 134 cm) a eluovalo sa PBS (Gibco Dulbecco fosfátom pufrovaný salinický roztok bez CaCl₂ a MgCl₂) týchlosťou 102 ml/h a boli odobrané frakcie 14,3 ml. Frakcie č. 39 - 53 analogické PEG-25 opísanému poolu a uvedenému na obr. 40A, boli spojené a zistilo sa, že obsahujú celkovo 354 mg proteinu. Aktivita in vivo takto modifikovaného SCF u primátov je opísaná v príklade 8C.

Príklad 13

Expresia receptora SCF na leukemických blastoch

Leukoblasty boli získané z periférnej krvi pacienta so zmiešanou leukémiou. Bunky boli čistené odstreďovaním gradientovou hustotou a potlačením adhézie. Ľudský SCF¹¹⁶⁴ bol jódovaný podľa opisu uvedeného v príklade 7. Bunky boli inkubované s rôznymi koncentráciami jódovaného SCF, ako to bolo opísané (Broudy, 75 1622 - 1626 (1990)). Výsledky pokusu väzby receptora sú uvedené na obr. 41. Hustota receptora je približne 70 000 receptore v/bunka.

Príklad 14

Aktivita potkanieho SCF na raných lymfoidných prekurzoroch

Schopnosť rekombinantného potkanieho SCF¹’¹⁶⁴ (rrSCF^{1 164}) pôsobiť synergický s IL-7 na zvýšenie proliferácie lymfoidných buniek bola študovaná na agarových kultúrach myšacej kostnej drene. V tejto skúške kolónie vytvorené so samotným rrSCF¹¹⁶⁴ obsahujú monocyty, neutrofily a blastové bunky, zatiaľ čo kolónie stimulované samotným IL-7 alebo v kombinácii s rrSCF¹¹⁶⁴ obsahujú prevažne pre-B bunky. Pre-B bunky, charakterizované ako B220⁺, slg, cp⁺, boli identifikované FACS analýzou spojených buniek pri použití fluorescenčné značených protilátok k B220 antigénu (Coffman, Immunol. Rev., 69, 5 (1982)) a k povrchovému lg (FITC-kozia anti-K, Southem Biotechnology Assoc., Birmingham, AL) a analýzou cytospinových sklíčok na cytoplazmatickú pexpresiu pri použití fluorescenčné značených protilátok (TRITC-kozia anti-μ, Southem Biotechnology Assoc.). Rekombinantný ľudský IL-7 (rhIL-7) bol získaný od Biosource Intemationol (Westlake Village, CA). Keď bol pridaný rrSCF¹⁴⁶⁴ v kombinácii s pre-B faktorom rastu buniek IL-7, bolo pozorované synergické zvýšenie tvorby kolónií (tabuľka 16), indikujúce sti mulujúcu úlohu rrSCF¹¹⁶⁴ na skorých B bunkových progenitoroch.

Tabuľka 16

Stimulácia tvorby kolónií Pre-B buniek pomocou rrSCF^{1 164} v kombinácii s hIL-7

Rastové faktory	počet kolónií1
salinický roztok			0
rrSCF1 164	200 ng		13 ±2
	lOOng		7 ±4
	50 ng		4 ±2
rhlL-7	200 ng		21 ±6
	lOOng		18 ±6
	50 ng		13 ±6
	25 ng		4 ±2
rhIL-7	200 ng +rrSCF1164	200 ng	60 ±0
	100 ng +	200 ng	48 ±8
	50 ng +	200 ng	24 ±10
	25ng +	200 ng	21 ±2

¹ Počet kolónii na 5 x 10⁴ buniek myšacej kostnej drene, ktoré boli umiestené na platňu.

Každá hodnota je priemer z troch platní ± štand. odchýlka.

Príklad 15

Identifikácia receptora pre SCF

A. c-kit je receptorom pre SCF^{1 164}

S cieľom testovania, či SCF^{1 164} je ligandom pre c-kit, bola cDNA pre celý myšací c-kit (Qiu a spol., EMBO J., 7, 1003 - 1011 (1988) amplifikovaná pri použití PCR z SCF^{1 164} citlivej mast celí línie MC/9 (Nabel a spol., Náture, 291, 332 - 334 (1981)) s primérmi podľa publikovanej sekvencie. Ligand väzby a transmembránovej domény ľudského c-kitu, kódovaného aminokyselinami 1-549 (Yarden a spol., EMBO J., 6, 3341 - 3351 (1987)), boli klonované pri použití rovnakých techník z ľudskej erytroleukemickej bunkovej línie, HEL (Martin a Papaynnopoulou, Science, 216,1233 - 1235 (1982)). cDNA c-kitu boli inzertované do cicavčieho expresného vektora V 19.8 transfekovaného do COS-1 buniek a membránových frakcií pripravených na väzbovú skúšku použitím buď potkanieho alebo ľudského ¹²⁵I-SCF'¹⁶⁴ podľa metód opísaných v sekcii B a C ďalej. Tabuľka 17 predstavuje údaje z typickej väzbovej skúšky. Nie sú tu špecifické väzby ¹²³I ľudského SCF^{1 164} na COS-1 bunky transfekované samotným V19.8. Ale COS-1 bunky exprimujúce ľudský rekombinantný c-kit ligandovej väzby plus transmembránovej domény (hckit-LTl) viazali ¹²⁵I-hSCF¹¹⁶⁴ (tabuľka 17). Prídavok 200-násobku molárneho prebytku neznačeného ľudského SCF^{1 164} znižuje väzbu na základnú úroveň. Podobne COS-1 bunky transfekované plnou dĺžkou myšacieho c-kitu (mckit-Ll) viažu potkaní ’^I-SCF^{1 164}. Malé množstvo väzby potkanieho ¹²⁵I-SCF¹¹⁶⁴ bolo detegované v COS-1 bunkách transfekovaných samotným V19.8 a bolo tiež pozorované v netransfekovaných bunkách (neznázomené), čo indikuje, že COS-1 bunky exprimujú endogénny c-kit. Toto zistenie je v súlade so širokou molekulárnou distribúciou c-kitu. Potkaní ¹²⁵I-SCF’¹⁶⁴ sa viaže rovnako tak k ľudskému, ako aj k myšaciemu c-kitu, zatiaľ čo ľudský ¹²⁵I-SCF’¹⁶⁴ sa viaže s nižšou aktivitou k myšaciemu c-kitu (tabuľka 17). Tieto údaje sú v súlade s modelom krížovej reaktivity SCF^{1 164} medzi druhmi. Potkaní SCF^{1 164} indukuje proliferáciu ľudskej kostnej drene so špecifickou aktivitou rovnako ako ľudský SCF^{1 164}, zatiaľ čo ľudský SCF^{1 164} indukuje proli feráciu myšacích mast buniek so špecifickou aktivitou 800-krát nižšou ako potkaní proteín.

Súhrnne sú tieto údaje v súlade s tým, že fenotypové abnormality exprimované W alebo SI mutantnou myšou sú následkom primárnych defektov v c-kite interakciou receptor/ligand, ktoré sú kritické pre vývoj rôznych typov buniek.

Tabuľka 17 g^pi-164 rekombinantnému c-kitu exprimovanému v COS-1 bunkách

Transfektovaný plazmid	CPM väzba3
ľudský SCF1·164 125I-SCFb 125I-SCF+nezn.c	potkaní SCF1464
125I-SCFd	125I-SCF+ nezn.e
V19.8	2,160	2,150	1,100	550
V19.8:	59,350	2,380	70,000	1,100
hckit-LTl
V19.8:	9500	1,100	52,700	600
mckit-Ll

‘ Je uvedený priemer z dvoch meraní; pokus bol uskutočnený nezávisle s rovnakými výsledkami trikrát.

^b 1,6 nM ľudský ¹²⁵I 1-SCF^{1464 c} ľudský nm ľudský ¹²⁵I-SCF¹⁴⁶⁴ + 320 nM neznačený ľudský SCF¹'^{64 d} 1,6 nM potkaní ¹²³I-SCF^{1464 e} 1,6 nM potkaní ¹²⁵I -SCF¹¹⁶⁴ + 320 nM neznačený potkaní SCF¹¹⁶⁴

B. Expresia rekombinantného c-kitu v COS-1 bunkách

Klony ľudskej a myšacej c-kitovej cNDA boli získané použitím PCR techník (Saiki a spol. Science, 239, 487 - 491 (1988)) z celkovej RNA izolovanej postupom kyslej fenol/chloroformovej extrakcie (Chomczynsky a Sachi, Anal. Biochem., 162, 156 - 159 (1987)) z ľudskej erytroleukemickej bunkovej línie HEL a MC/9 buniek. Unikátne sekvencie oligonukleotidov boli navrhnuté z publikovaných ľudských a myšacích c-kitových sekvencií. Prvý reťazec cDNA bol syntetizovaný z celkovej RNA podľa protokolu získaného s enzýmom, Mo-MLV reverzná transkripcia (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD), pri použití opačných c-kitových oligonukleotidov ako primérov. Amplifikácia presahujúcich oblastí c-kitovej ligandovej väzby a domén tyrozín kinázy bola uskutočnená pri použití vhodných párov c-kitových primérov. Tieto oblasti boli klonované do cicavčieho expresného vektora V 19.8 (obr. 17) na expresiu v COS-1 bunkách. DNA sekvencovanie niektorých klonov odhaľuje nezávislé mutácie, prevažne vzniknuté počas PCR amplifikácie, v každom kroku. Kloň neobsahujúci tieto mutácie bol konštruovaný znovuzostavcním mutácií neobsahujúcich reštrikčné fragmenty zo separátnych klonov. Určité odchýlky od publikovaných sekvencií sa objavili vo všetkých alebo v asi polovici klonov; tieto boli považované za aktuálne sekvencie prítomné v použitej bunkovej línii a môžu predstavovať alelové diferencie publikovaných sekvencií: V19.8: mckit-LTl, celý myšací c-kit; a V19.8: kckit-Ll, obsahujúci ligandovú väzbu plus transmembránovú oblasť (aminokyseliny 1-549) ľudského c-kitu.

Plazmidy boli transfekované do COS-1 buniek v podstate rovnako, ako je to opísané v príklade 4.

C. ¹²⁵l-SCF¹⁴⁶⁴ väzba k COS-1 bunkám exprimujúcim rekombinantný c-kit

Dna dni po transfekcii COS-1 bunky boli zoškriabané z misky, premyté v PBS a zmrazené do použitia. Po roztopení boli bunky resuspendované v 10 mM Tris-HCl, 1 mM

MgCl₂ s obsahom 1 mM PMSF, 100 pg/ml aprotinínu, 15 pg/ml leupeptínu, 2 ph/ml pepstatínu a 200 pg/ml TLCK-HC1. Suspenzia bola dispergovaná nasatím a vypustením z pipety päťkrát, inkubovaná na ľade 15 minút a bunky boli homogenizované 15-20 nárazmi Dounce homogenizéra. Sacharóza (250 mM) bola pridaná k homogenátu a jadrové frakcie a zvyšné nerozrušené bunky boli peletizované odstredením pri 500 x g počas 5 minút. Supernatant bol odstredený pri 25 000 g počas 30 minút pri 4 °C na peletovanie zvyšných bunkových kusov. Ľudský a potkaní SCF¹¹⁶⁴ boli označené rádioaktívnym jódom pri použití chlóramínu-Z (Hunter a Greenwood, Náture, 194, 495 -

- 496 (1962)). COS-1 membránové frakcie boli inkubované buď s ľudským alebo potkaním ^l23I-SCF¹⁴⁶⁴ (1,6 nM) s prebytkom alebo bez 200-násobného prebytku neznačeného SCF¹'¹⁶⁴ vo viazacom pufri, obsahujúcom RPMI doplnený 1 % hovädzieho sérového albumínu a 50 mM HEPES (pH 7,4) počas 1 hodiny pri 22 °C. Pri ukončení inkubácie väzby boli membránové prípravky šetrne rozvrstvené na 150 pl ftalátového oleja a odstreďované počas 20 minút v Beckman Microfuge 11 s cieľom oddeliť membránovo viazaný ¹²⁵I-SCF’' ¹⁶⁴ od voľného 125I-SCF¹'⁶⁴, pelety boli oddelené a membránovo napojený ¹²⁵I-SCF'¹⁶⁴ bol kvantifikovaný.

Príklad 16

A. Izolácia cDNA ľudského SCF

Celková RNA bola izolovaná z ľudskej fibrosarkómovej bunkovej línie HT-1080 (ATCC CCL 121) metódou extrakcie pri použití zmesi kyslý guanidíniumtiokyanát-fenol-chloroform (Chomczynski a spol., Anál. Biochem. 162,156 (1987)) a poly(A) RNA boli získané pri použití oligo(dT) kolóny získanej od Clontech. Dvojreťazcová cDNA bola pripravená z 2 pg poly(A) RNA s BRL (Bethesda Research Laboratory) cDNA syntéznym kitom pri podmienkach odporúčaných výrobcom. Približne 100 ng na kolóne delenej dvojreťazcovcj cDNA s priemernou veľkosťou 2kb bolo ligovaných k 300 ng Sall/NotI štiepeného vektora pSPORT 1 (D'Alessio a spol., Focus, 12, 47 - 50 (1990)) a transformovaných do DH5a (BRL, Bethesda, MD) buniek elektroporáciou (Dower a spol., Nucl. Acids Res., 16,6127-6145 (1988)).

B. Skríning cDNA knižnice

Približne 2,2 x 10⁵ primárnych transformantov bolo rozdelených do 44 poolov, každý s obsahom '5000 individuálnych klonov. Plazmidová DNA bola pripravená z každého poolu CTAB-DNA zrážacou metódou, ako je opísaná (Del Sal a spol., Biotechniques, 7, 514 - 519 (1989)). Dva mikrogramy každého poolu plazmidovej DNA boli štiepené reštrikčným enzýmom NotI a oddelené gélovou elektroforézou. Lineraizovaná DNA bola transferovaná na GeneScreen Plus membránu (DuPont) a hybridizovaná s ³²P-značenou PCR generovanou ľudskou SCF cNDA (príklad 3) pri podmienkach opísaných predtým (Lin a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7580 - 7584 (1985)). Tri pooly obsahujúce pozitívny signál boli identifikované z hybridizácie. Tieto pooly kolónií boli reskríningované hybridizačným kolóniovým postupom (Lin a spol., Gene 44, 201 -

- 209 (1986)), až bola z každého poola získaná jedna kolónia. Veľkosť cDNA týchto troch izolovaných klonov bola medzi 5,0 až 5,4 kb. Štiepenie reštrikčnými enzýmami a stanovenie nukleotidovej sekvencie na 5' konci indikujú, že dva z týchto troch klonov sú identické (10-la a 21-7a). Obidva obsahujú kódujúcu oblasť a približne 200 bp 5' netranslátovanej oblasti (5'UTR). Tretí kloň (26-la) je približne o 400 bp kratší na 5' konci než druhé dva klony.

Sekvencia cDNA ľudského SCF je uvedená na obr. 42. Mimoriadne podrobne zaznamenaná je hydrofóbna transmembránová doménová sekvencia začínajúca v oblasti aminokyselín 186 - 190 a končiaca pri aminokyseline 212.

C. Konštrukcia pDSRa2 hSCF¹’²⁴⁸ pDSRa2 hSCF¹’²⁴⁸ bol generovaný pri použití plazmidov 10-la (ako je to opísané v príklade 16B) a pGEM3 hSCF¹¹⁶⁴ takto: HindlII inzert z pGEM3 hSCF¹¹⁶⁴ bol transferovaný do M13pml8. Nukleotidy bezprostredne v protismere k ATG iniciačnému kodónu boli vymenené riadenou mutagenézou z tttccttATG na gccgccgccATG pri použití opačného oligonukleotidu

5'-TCT TCT TCA TGG CGG CGG CAA GCT T 3' a oligonukleotidom riadeným in vitro kitovým mutagenéznym systémom a protokolmi Amersham Corp. na generovanie M13mpl8 hSCF^K1'¹⁶⁴. Táto DNA bola štiepená Hin-dlll a inzertovaná do pDSR<x2, ktorý bol štiepený HindlII. Tento kloň je označený pDSRa2 hSCF^K1‘¹⁶⁴. DNA z pDSRa2 hSCFK¹'¹⁶⁴ bol štiepený Xbal a DNA bola vybavená tupými koncami pridaním Klenowho enzýmu a štyroch dNIP. Po ukončení tejto reakcie bola DNA ďalej štiepená enzýmom Spel. Kloň 10-la bol štiepený pomocou Dral na vytvorenie tupého konca 3' pre otvorený čítací rámec v inzerte a pomocou Spel, ktorý štiepi na rovnakom mieste v géne ako v pDSRotž hSCF^K1164 a 10-la. Tieto DNA boli spoločne spojené za vzniku pDSRa2 hSCF^KI'²⁴⁸.

D. Transfekcia a imunoprecipitácia COS buniek s pDSRa2 hSCF^K1'²⁴⁸ DNA

COS-7 (ATCC CRL 1651) bunky boli transfekované s DNA konštruovanou opísaným spôsobom. 4 x 10⁶ buniek v 0,8 ml DMEM + 5 % FBS bolo elektroporovaných pri 1600 V buď 10 pg pDSRa2 hSCF^K1'²⁴⁸ DNA alebo 10 pg pDSR 2 vektorovej DNA (vektorová kontrola). Po elektroporácii boli bunky umiestené do dvoch 60 mm misiek. Po 24 hodinách bolo médium nahradené čerstvým kompletným médiom.

h po transfekcii bola každá miska označená ^3SS-médiom podľa modifikácie protokolu Yardena a spol. (PNAS 87, 2569 - 2573, 1990). Bunky boli premyté raz PBS a potom inkubované s DMEM neobsahujúcim metionín, neobsahujúcim cysteín (metcys'DMEM) počas 30 minút. Médium bolo odstránené a na každej miske bol pridaný 1 ml met cys'DMEM, obsahujúci 100 pCi/ml Tran³⁵S-značeného (ICN). Bunky boli inkubované pri 37 °C počas 8 hodín. Médium bolo odobrané, vyčírené odstredením, na odstránenie zlomkov buniek a zmrazené na -20 °C.

Podiely značeného kondiciovaného média z COS/pDSR 2 hSCF^K1'²⁴⁸ a COS/pDSRa2 vektorovej kontroly boli imunoprecipitované spolu so vzorkami média z ³⁵S-značeného CHO/pDSR«2 hSCF¹¹⁶⁴ klonu 17 buniek (pozri príklad 5) v súlade s modifikáciou protokolu Yardena a spol., (EMBO, J., 6, 3341 - 3351, 1987). Jeden ml každej vzorky kondiciovaného média bol spracovaný s 10 pl pre-imúnneho králičieho séra (č. 1379 P. I.). Vzorky boli inkubované počas 5 hodín pri 4 °C. Sto mikrolitrov 10 % suspenzie Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem) v 0,15 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,2 % Triton X-100 bolo pridaných ku každej skúmavke. Vzorky boli inkubované ďalšiu jednu hodinu pri 4 °C. Imúnne komplexy boli peletizované odstredením pri 13 000 x g počas 5 minút. Supematanty boli transferované do nových skúmaviek a inkubované s 5 pl králičieho polyklonálneho antiséra (č. 1381 TB4), čisteného ako v príklade 1, proti hSCF¹’¹⁶² z CHO cez noc pri 4 °C. 100 pl Pansorbínu bolo pridávaných počas 1 hodiny a imúnne komplexy boli peletizované ako predtým. Pelety boli premyté lx pufrom na lýzu (0,5 % N-deoxycholát, 0,5 % NP-40, 50 mM NaCl. 25 mM Tris pH 8), 3 x premývacím pufrom (0,5 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 0,2 % Triton X-100) a 1 x 20 mM Tris pH 7,5. Pelety boli resuspendované v 50 pl 10 mM Tris pH 7,5, 0,1 % SDS, 0,1 M β-merkaptoetanolu. SCF proteín bol eluovaný varom počas 5 min. Vzorky boli odstredené pri 13 000 x g počas 5 minút a supematanty boli odstránené.

Ošetrenie glykozidázami bolo uskutočnené takto: tri mikrolitre 75 mM CHAPS, obsahujúceho 1,6 mU O-glykanázy, 0,5 U N-glykanázy a 0,02 U neuraminidázy, boli pridané k 25 pl imúnneho komplexu a inkubovalo sa 3 hodiny pri 37 °C. Bol pridaný rovnaký objem 2xPAGE vzorkového pufŕa a vzorky boli povarené 3 minúty. Štiepené a neštiepené vzorky boli spracované elektroforézou na 15 % SDS-polyakrylamidovom redukčnom géli cez noc pri 8 mA. Gél bol fixovaný v metanole-kyseline octovej, spracovaný s NEN počas 30 minút, sušený a exponovaný pri -70 °C na film Kodak XAR-5.

Obrázok 43 predstavuje autorádiograf výsledkov. Dráhy 1 a 2 sú vzorky z kontrolných COS/pDSRa2 kultúr, dráhy 3 a 4 z COS/pDSRa2 hSCF^K1’²⁴⁸, dráhy 5 a 6 z CHO/pDSRcc2 hSCF¹’¹⁶⁴. Dráhy 1, 3 a 5 sú neštiepené imúnne zrazeniny, dráhy 2, 4 a 6 boli štiepené glykanázami, ako je už opísané. Polohy markerov molekulovej hmotnosti sú označené vľavo. Príprava SCF v COS transfekovaných pDSRa2 hSCF^c1'²⁴⁸ je v súlade s hSCF^11<4 sekretovanými CHO transfekovanými pDSR 2 hSCF¹'¹⁶⁴ (príklad 11). Táto skutočnosť silne naznačuje že prirodzené proteolytické miesto uvoľňujúce SCF z bunky leží v susedstve aminokyseliny 164.

Príklad 17

Kvartéma štruktúrna analýza ľudského SCF

Pri kalibrácii gélovej filtračnej kolóny (ACA 5) opísanej v príklade 1 na čistenie SCF z BRL bunkového média so štandardmi molekulovej hmotnosti a pri elúcii čisteného SCF z iných kalibrovaných gólových filtračných kolón je zrejmé, že SCF čistený z BRL bunkového média a prejavuje zo zrejmou molekulovou hmotnosťou približne 70 000 až 90 000, vztiahnuté na molekulové hmotnosti štandardov. V protiklade k tomu je zrejmá molekulová hmotnosť podľa SDSPAGE približne 28 000 - 35 000. Aj keď je zistené, že glykozylované proteíny sa môžu správať v takýchto analýzach anomálne, výsledky potvrdzujú, že potkaní SCF odvodený od BRL môže existovať ako nekovalentne asociovaný dimér pri nedenaturačných podmienkach. Podobné výsledky platia pre rekombinantné SCF formy (napr. potkaní a ľudský SCF¹' ⁶⁴ získaný z E. coli, potkaní a ľudský SCF¹'¹⁶² získaný z CHO buniek), ktorých veľkosť molekuly stanovená gélovou filtráciou pri nedenaturačných podmienkach je približne dvakrát väčšia ako stanovená gélovou filtráciou pri denaturačných podmienkach (to znamená v prítomnosti SDS), alebo pomocou SDS-PAGE, v každom jednotlivom prípade. Ďalej sedimentačná rýchlostná analýza, ktorá poskytuje presné stanovenie molekulovej hmotnosti v roztoku, poskytuje hodnotu asi 36 000 pre molekulovú hmotnosť rekombinantného ľudského SCF '^IM získaného z E. coli. Táto hodnota je opäť približne dvojnásobná ako poskytnutá z SDSPAGE (~18 000 - 19 000). Preto, aj keď je možné pripustiť, že môžu existovať násobné oligoméme stavy (vrátane monomémeho stavu), je zrejmé, že dimémy stav v roztoku pri určitých okolnostiach prevláda

Príklad 18

Izolácia klonov cDNA ľudského SCF z bunkovej línie 5637

A. Konštrukcia 5637 cDNA knižnice

SK 281486 Β6

Celková RNA izolovaná z ľudskej krvnej karcinómovej bunkovej línie 5637 (ATCC HTB-9) extrakčnou metódou, využívajúcou kyslý guanidíniumtiokyanát-fenol-chloroform (Chomczynski a spol., Anál. Biochem, 162, 156 (1987)) a poly(A) RNA boli získané pri použití oligo(dT) kolóny získanej od Clontcch. Dvojreťazcová cDNA bola pripravená z 2 pg pola(A) RNA s BRL cDNA syntéznym kitom pri podmienkach odporúčaných dodávateľom. Približne 80 ng na kolóne farkcionovanej dvojreťazcovej cDNA s priemernou veľkosťou 2 kb bolo ligovaných k 300 ng Sall/NotI štiepeného vektora pSPORT 1 (D'Alessio a spol., Focus, 12, 47 - 50 (1990)) a transformovaných do DH5a buniek elektroporáciou (Dower a spol., Nucl. Acids Res., 16,6127-6145(1988)).

B. Skríning cDNA knižnice

Približne 1,5 x 10⁵ primárnych transformantov bolo rozdelených do 30 poolov, kde každý približne obsahoval 5000 individuálnych klonov. Plazmidová DNA bola pripravená z každého poolu CTAB-DNA zrážaním, ktoré je opísané (Dcl Sal a spol., Biotechniques, 7, 514 - 519 (1989)). Dva mikrogramy každej plazmidovej DNA z poolu boli štiepené reštrikčným enzýmom Nôti a separované gélovou elektroforézou. Linearizovaná DNA bola transferovaná na GeneScreen Plus membránu (DuPont) a hybridizovaná ³²P-značenou cDNA cclcj dĺžky ľudského SCF izolovanou z HT1080 bunkovej línie (príklad 16) pri už opísaných podmienkach (Lin a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7580 - 7584 (1985)). Hybridizáciou bolo identifikovaných sedem poolov obsahujúcich pozitívny signál. Pooly kolónií boli reskríningované ³²P-značenou PCR získanou cDNA ľudského SCF (príklad 3) postupom hybridizácie kolónií (Lin a spol., Gene, 44,201 - 209 (1986)), dokiaľ nebola získaná jedna kolónia zo štyroch poolov. Veľkosti inzertu zo štyroch izolovaných klonov sú približne 5,3 kb. Štiepenie reštrikčným enzýmom a nukleotidová analýza 5'-konca klonov dokazuje, že štyri klony sú identické. Sekvencia tejto ľudskej cDNA je uvedená na obr. 44. cDNA na obr. 44 kóduje polypeptid, v ktorom aminokyseliny 149 až 177 sekvencie na obr. 42 sú nahradené Gly zvyškom.

Príklad 19

Vplyv SCF na prežitie po letálnej iradiácii

A. Účinok in vivo SCF na prežitie po letálnej iradiácii

Vplyv SCF na prežitie myši po letálnej iradiácii bol testovaný. Použité myši boli 10 až 12 týždňov staré samice Balb/c. Boli použité skupiny 5 myší vo všetkých pokusoch a myši boli pred každým pokusom odvážené. Myši boli ožiarené 850 rad alebo 950 rad v jednej dávke. Myšiam boli injektované samotné faktory alebo faktory plus normálne Balb/c bunky kostnej drene. V prvom prípade boli myši injikované intravenózne 24 hodín po ožiarení potkaním PEG-SCF¹’¹⁶⁴ (20 pg/kg), čisteným z E. coli a modifikovaným prídavkom polyetylénglykolu ako v príklade 12, alebo salinickým roztokom, pokiaľ ide o kontrolné zvieratá. Pre transplantačný model boli myši injikované i. v. rôznymi dávkami buniek normálnej Balb/c kostnej drene 4 hodiny po ožiarení. Ošetrenie s potkaním PEG-SCF¹’¹⁶⁴ bolo uskutočnené pridaním 200 gg/kg potkanieho PEG-SCF¹’¹⁶⁴ k suspenzii buniek 1 hodinu pred injekciou a podávalo sa ako jednotlivá i. v. injekcia faktora plus buniek.

Po ožiarení pri 850 rad, boli myši injikované potkanom PEG-SCF¹’¹⁶⁴ alebo salinickým roztokom. Výsledky sú uvedené na obr. 45. Injekcia potkanieho PEG-SCF¹’¹⁶⁴ výrazne zvyšuje čas prežitia myši v porovnaní s kontrolnými zvieratami (p 0,0001). Myši injikované salinickým rozto kom prežívajú priemerne 7,7 dňa, zatiaľ čo PEG-SCF¹’¹⁶⁴ ošetrené myši prežívajú priemerne 9,4 dňa (obr. 45). Výsledky uvedené na obr. 45 predstavujú súhrn zo 4 oddelených pokusov s 30 myšami v každej ošetrovanej skupine.

Zvýšene prežitia myši ošetrených potkaním PEG-SCF¹’ ¹⁶⁴ potvrdzuje účinok SCF na bunky kostnej drene ožiarených zvierat. Predbežná štúdia hematologických parametrov týchto zvierat ukazuje slabé zvýšenie hladín doštičiek v porovnaní s kontrolnými zvieratami 5 dní po ožiarení, ale 7 dni po ožiarení nie sú hladiny doštičiek výrazne rozdielne od kontrolných zvierat. Neboli detegované žiadne rozdiely v RBC alebo WBC hladinách alebo bunkovej stavbe kostnej drene.

B. Prežitie transplantovaných myší ošetrených SCF

Dávky 10 % buniek kostnej drene femuru normálnych Balb/c myší transplantované do myší ožiarených pri 850 rad môžu zachrániť 90 % alebo viac zvierat (dáta nie sú uvedené). Preto bola použitá dávka ožiarenia 850 rad s transplantačnou dávkou 5 % femuru na štúdium účinkov potkanieho PEG-SCF¹’¹⁶⁴ na prežitie. Pri tejto bunkovej dávke sa predpokladalo, že veľké percento myší, ktoré nedostanú SCF neprežije; v prípade, že potkaní PEG-SCF¹’¹⁶⁴ by mohol stimulovať transplantované bunky, prežitie by sa mohlo zvýšiť. Ako je uvedené na obr. 46, približne 30 % kontrolných myší prežívalo 8 dni po ožiarení. Ošetrenie potkaním PEG-SCF¹’¹⁶⁴ malo za následok výrazné zvýšenie prežitia s viac ako 90 % myší, ktoré prežívajú viac ako 30 dní (obr. 46). Výsledky uvedené na obr. 46 predstavujú kompiláciu výsledkov zo 4 separátnych pokusov, kde bolo použitých 20 myší, tak pokiaľ ide o kontrolné myši, ako aj myši ošetrené potkaním PEG-SCF¹’¹⁶⁴. Pri vyšších dávkach ožiarenia ošetrenie myší potkaním PEG-SCF¹’¹⁶⁴ v súvislosti s transplantáciou drene tiež vedie k zvýšenému prežívaniu zvierat (obr. 7). Kontrolné myši ožiarené 950 rad a s transplantáciou 10 % femuru uhynuli 8. deň, zatiaľ čo 40 % myší ošetrených potkaním PEG-SCF¹’¹⁶⁴ prežívalo 20 dní alebo dlhšie. 20 % kontrolných myší s transplantovanými 20 % femuru prežívalo počas 20 dní; pri ošetrení rSCF prežívalo 80 % pokusných zvierat (obr. 47).

Príklad 20

Tvorba monoklonálnych protilátok proti SCF týždňov staré samice Balb/c myší (Charles River, Wilmington, MA) boli subkutánne injektované 20 pg ľudského SCF¹’¹⁶⁴ exprimovaného v E. coli v kompletnom Freudovom adjuvans (H37-Ra; Difco Labortories, Detroit, MI). Ďalšie imunizácie 50 gg rovnakého antigénu v nekompletnom Freudovom adjuvans boli následne podané 14., 38. a 57. deň. Tri dni po poslednej injekcii boli 2 myši usmrtené a ich slezinné bunky fuzované s sp 2/0 myelómovou líniou postupom opísaným Nowinskim a spol., (Virology 93, 111 - 116(1979)).

Médium použité na bunkovú kultúru sp 2/0 a hybridómy bolo Dulbecco modifikované Eaglovo médium (DMEM), (Gibco, Chagrin Falls, Ohio) doplnené 20 % teplom inaktivovaného fatálneho hovädzieho séra (Phibro Chem., Fort Lee, NJ), 110 mg/ml pyruvát sodný, -100 U/ml penicilín a 100 mcg/ml streptomycín (Gibco). Po bunkovej fúzii boli hybridómy selektované v HAT médiu,obsahujúcom 10⁴ M hypoxantínu, 4 x 10’⁷ aminopterínu a 1,6 x 10’⁵ tymidínu, počas dvoch týždňov, potom kultivované v médiu obsahujúcom hypokantín a tymidín dva týždne.

Hybridómy boli skríningované takto: polystyrénové jamky (Costar, Cambridge, MA) boli syntetizované 0,25 gg ľudského SCF¹’¹⁶⁴ (E, coli) v 50 gl 50 mM hydrogenuhličitanového pufra pH 9,2 počas dvoch hodín pri teplote

SK 281486 Β6 miestnosti, potom cez noc pri 4 °C. Platne potom boli blokované 5 % BSA v PBS počas 30 minút pri teplote miestnosti, potom inkubované so supematantom hybridómovej kultúry počas jednej hodiny pri 37 °C. Roztok bol dekantovaný a nadviazané protilátky inkubované s 1 : 500 riedením kozí-anti-myšacieho IgG konjugovaného s chrenovou peroxidázou (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianopolis, IN) počas jednej hodiny pri 37 °C. Platne boli premyté premývacím roztokom (KPL, Gaitherburg, MD), potom vyvíjané so zmesou H₂O₂ a ABTS (KBL). Kolorimetria bola uskutočňovaná pri 405 nm.

Kultúry hybridómových buniek sekretujúcich protilátku špecifickú pre ľudský SCF¹¹⁶⁴ (E, coli) boli testované ELISA, ako aj postupmi skríningu hybridómov, na krížové reaktivity k ľudskému SCF¹'¹⁶² (CHO). Hybridómy boli subklonované limitnou riediacou metódou. 55 jamiek hybridómového supematantu je v teste silne pozitívnych proti ľudskému SCF¹¹⁶⁴ (E. coli): 9 z nich je krížovo reaktívnych proti ľudskému SCF¹¹⁶² (CHO).

Niektoré hybridómové bunky boli klonované takto:

Monoklonálne	IgG izotyp	reaktivita proti ľudskému SCF1162 (CHO)
4G12-13	IgGl	nie
6C9A	IgGl	nie
8H7A	IgGl	áno

Hybridómy 4612-13 a 8H7A boli uložené v ATCC 26. septembra 1990.

Aj keď predložený vynález bol opísaný výhodnými realizáciami, je nutné upozorniť, že odborníkom budú zrejmé ďalšie modifikácie a variácie tejto realizácie. Predložené nároky pokrývajú všetky takéto možné variácie, ktoré patria do rozsahu predloženého vynálezu.

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. DNA sekvencia na použitie na expresiu polypeptidového produktu majúceho hematopoetickú biologickú vlastnosť prirodzene sa vyskytujúceho kmeňového bunkového faktora v prokaiyotickej alebo eukaryotickej hostiteľskej bunke, kde uvedená DNA sekvencia je vybraná z:

   a) DNA sekvencií uvedených na obr. 42A-C alebo ich komplementárnych reťazcov,

   b) DNA sekvencií, ktoré hybridizujú s DNA sekvenciami definovanými v (a) alebo s ich fragmentmi, a

   c) DNA sekvencií, ktoré, keby neexistovala degenerácia genetického kódu, hybridizovali by s DNA sekvenciami definovanými v (a) a (b), pričom tieto sekvencie kódujú polypeptid majúci rovnakú aminokyselinovú sekvenciu.
2. 2. DNA sekvencia podľa nároku 1 zahrnujúca jeden alebo viac kodónov preferovaných pri expresii v ne-cicavčích bunkách.
3. 3. DNA sekvencia podľa nároku 1 obsahujúca jeden alebo viac kodónov preferovaných pri expresii v E. coli bunkách.
4. 4. DNA sekvencia podľa nároku 1 obsahujúca jeden alebo viac kodónov preferovaných pri expresii v kvasinkových bunkách.
5. 5. DNA sekvencia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorá kóduje expresiu metionylového zvyšku na N-terminálnej polohe maturovanej verzie uvedeného polypeptidu.
6. 6. DNA sekvencia podlo ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kovalentne spojená s detegovateľný značením.
7. 7. DNA sekvencia podľa nároku 6, kde značenie je rádioaktívne značenie.
8. 8. Čistený a izolovaný polypeptid majúci celú alebo čiastočnú primárnu štruktúru sekvencie uvedenej na obr. 42A-C, prípadne s metionínovým zvyškom na N-konci, majúci hematopoetickú biologickú vlastnosť prirodzene sa vyskytujúceho kmeňového bunkového faktora.
9. 9. Čistený a izolovaný polypeptid podľa nároku 8, obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu podľa obr. 42A-C:

   1-248, 1-189, 1-188, 1-185, 1-180, 1-156, 1-141, 1-137,

   1-130, 1-164, 2-164, 5-164 a 11-164, prípadne s metionínovým zvyškom na N-konci.
10. 10. Čistený a izolovaný polypeptid podľa nároku 8, obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu podľa obr. 42A-C:

    1-120, 1-110, 1-100, 1-133, 1-127 a 1-123, prípadne s metionínovým zvyškom na N-konci.
11. 11. Farmaceutická kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné množstvo polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 a farmaceutický prijateľné riedidlo, prísadu alebo nosič.
12. 12. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na hematopoetickú terapiu cicavca.
13. 13. Použitie podľa nároku 12 na výrobu liečiva na liečenie leukopénie, liečenie trombocytopénie, liečenie anémie, zvýšenie príjmu transplantátu kostnej drene, zvýšenie obnovy kostnej drene pri liečení ožarovaním, chemicky alebo chemoterapeuticky indukovanej aplázie kostnej drene alebo myelosupresie a na zvyšovanie citlivosti buniek na chemoterapiu.
14. 14. Použitie podľa nároku 12 na výrobu liečiva na zvýšenie počtu buniek schopných transplantácie po ašpirácii kostnej drene alebo periférnej krvnej leukoferéze.
15. 15. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na liečenie AIDS, myelofibrózy, myelosklerózy, osteoporózy, metastatického karcinómu, akútnej leukémie, mnohonásobného myelómu, Hodgkinovej choroby lymfómu, Gaucherovej choroby, Niemannovej-Pickovej choroby, Letterovej-Siwovej choroby, odolnej erytroblastickej anémie, Di Guglielmovho syndrómu, kongestívnej splenoznegálie, Kala azar, sarkoidózy, primárnej splenickej pancytopénie, miliámej tuberkulózy, rozosiatej plesňovej choroby, prudkej septikémie, malárie, deficiencie vitamínu B₁₂, deficiencie kyseliny listovej a pyridoxínovej deficiencie cicavcov.
16. 16. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na liečenie poškodenia nervov, infertility alebo intestinálneho poškodenia cicavca.
17. 17. Použitie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 až 10 na výrobu liečiva na liečenie hypopigmentačnej poruchy.
18. 18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 17 na výrobu liečiva ďalej obsahujúceho aspoň jeden ďalší hematopoetický faktor vybraný z EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IGF-1 a M-GDF.
19. 19. Použitie podľa nároku 18 na výrobu liečiva ďalej obsahujúceho aspoň jeden ďalší hematopoetický faktor vybraný z EPO, G-CSF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7aIGF-l.
20. 20. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 17 na výrobu liečiva ďalej obsahujúceho aspoň jeden ďalší hematopoetický faktor vybraný z IL-8, IL-9 a IL-10.
21. 21. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 17 na výrobu liečiva ďalej obsahujúceho aspoň jeden ďalší hematopoetický faktor vybraný z IL-11 a LIF.