CN100345971C - 重组人干细胞因子的原核表达载体、工程菌及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及高效表达重组人干细胞因子(rhSCF)的表达载体、工程菌及制备方法。本发明还提供了通过优选的培养基成分及优化发酵参数,建立了工程菌高密度发酵方法。还提供了通过包涵体变性、蛋白复性、色谱分离制备高纯度重组人干细胞因子的方法。本发明中构建的重组人干细胞因子表达工程菌具有表达量高,表达稳定等优点,所采取的纯化工艺稳定可靠,得率高,利于大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域。更具体地,本发明涉及一种新的表达人干细胞因子的原核表达载体及工程菌,该工程菌高密度发酵方法以及从该工程菌中提取制备高活性重组人干细胞因子的方法。
背景技术
干细胞因子(stem cell factor,SCF),又称为肥大细胞生长因子(MGF),c-kit配体及Steel因子,为c-kit原癌基因编码的受体的配体蛋白。SCF主要由基质细胞产生,是一类刺激早期造血干细胞及祖细胞增殖和定居的造血生长因子,SCF在造血干细胞的发育、黑色素生成以及生殖细胞发育中发挥着重要作用。它参与机体发育过程中的多种细胞生长的调控,是造血干细胞增殖分化的关键因子。SCF与其它细胞因子(如GM-CSF、IL-3)合用时,能刺激来源于骨髓、外周血、脐带血中的造血干细胞的增殖。因此SCF在造血干细胞移植、肿瘤放疗、化疗导致的骨髓功能衰竭等的造血功能恢复治疗、再生障碍性贫血及其它血液病的治疗方面有着很广阔的应用前景。
编码人SCF基因位于第12号染色体(12q22-24),全长50kb左右。人SCF基因含有8个外显子,经克隆后编码人SCF的cDNA序列全长为543kb。由于编码基因剪切位点不同,可翻译成两种蛋白,表现为可溶性SCF(sSCF)和膜结合型SCF(mSCF)。这两种SCF的形成与mRNA的不同拼接方式有关,前者包含外显子6编码的氨基酸残基序列,编码的蛋白质有248个氨基酸,以SCE248表示,由于该分子含有跨膜区及由第6外显子编码的一个蛋白酶切割位点,酶切后的产物能以可溶性分子的形式可被分泌到细胞外。另一种编码产物含220个氨基酸残基,有跨膜区,但在由第6外显子编码的序列中缺乏相应的蛋白切割位点,翻译后的蛋白质以膜蛋白形式存在于细胞膜表面发挥相应的生物学活性,因而这种SCF为膜结合型,以SCF220表示。可溶性和膜结合型的SCF都有生物学活性。
由于天然SCF来源有限,难以大规模生产,不能满足日益增长的临床前研究及临床研究的需要。通过将人SCF膜外活性部分的165个氨基酸的cDNA克隆入表达载体,在大肠杆菌中表达出的SCF就有天然生物学活性,其分子量约为18kD,在溶液中通常以非共价键相连的二聚体形式存在。由于骨髓基质细胞和胸腺组织富含SCF mRNA,可通过逆转录PCR的方法扩增出人SCF基因,但由于组织细胞中的SCF mRNA较少,可通过多次PCR从组织细胞中扩增SCFmRNA;也可以直接从真核细胞基因文库筛选出SCF基因。
可用于表达SCF的原核表达载体很多,但表达量一般占总蛋白的10%左右(Martin,FH,1990,Cell,63(2):203-211;Langley,KE,1992,Arch Biochem Biophy,295(1):21-28),很少有高效表达SCF的载体。国内有进行密码子突变来进行高效表达,见中国公开专利号CN1314470A(申请号01109409.5)。研究发现,外源基因上游的一个SD序列在很多情况下不足以提供高水平表达。
T7噬菌体的基因10(gene 10 of the phage T7)编码噬菌体外壳蛋白,该蛋白是T7噬菌体感染大肠肝菌以后的主要表达产物。该基因上游由9个核苷酸组成的序列“TTAACTTTA”是一个非常高效的核糖体位点(RBS),通过与核糖体结合而启动下游基因的翻译,其效率超过一般的大肠杆菌RBS(即SD序列)数十倍,因而被称为“翻译增强子”。因此,在通常的原核表达质粒中引入该序列可能提高外源基因表达(Lehmeier B et al,1992,J of Biotechnol,23(2):153-165;Olins PO et al,1988,Gene,73(1):227-235)。然而,当在外源基因的上游仅有翻译增强子时,有时其表达量仍难以令人满意。
因此,本领域迫切需要开发新的高效表达干细胞因子的方法、表达载体和宿主细胞。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效表达人干细胞因子的方法、表达载体和宿主细胞。
在本发明的第一方面,提供了一种用于重组表达人干细胞因子的原核表达载体,所述的载体含有人干细胞因子表达盒以及与所述表达盒操作性相连的启动子,所述的表达盒从5’至3’依次具有:序列为TTAACTTTA的增强子、长度为14±2bp的上游间隔序列、和人干细胞因子的编码序列、终止密码子。
在另一优选例中,所述的表达载体为pBV220,且所述的上游间隔序列为SEQID NO:7中第10-23位,即TAAAGGAGGAATTC。
在另一优选例中,所述的人干细胞因子的编码序列编码人干细胞因子第1-165位的氨基酸序列。
在本发明的第二方面,提供了一种大肠杆菌,它含有本发明上述的原核表达载体。
在另一优选例中,所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α菌株。
在本发明的第三方面,提供了一种制备重组人干细胞因子的方法,包括步骤:
(a)培养本发明上述的大肠杆菌,至OD600值为30-45;
(b)诱导培养步骤(a)的大肠杆菌,从而表达重组人干细胞因子;
(c)分离出表达的重组人干细胞因子。
在另一优选例中,在步骤(a)中使用的初始培养基含有0.1-1mM浓度的微量元素、1-5%的葡萄糖、1-5%甘油和1-5%酵母浸出物,并且在培养过程中补充的养料为10-40%浓度的葡萄糖,5-10%酵母浸出物和5-10%蛋白胨。
在另一优选例中,所述的方法还包括步骤(d):对包涵体变性、复性、酸沉淀、阳离子交换、和反相柱层析,从而得到纯化的重组人干细胞因子。
在另一优选例中,所述的复性的复性时间为24-60小时,最佳复性时间为48±2小时,复性的蛋白浓度为200-500ug/ml,最佳的蛋白浓度为300±10ug/ml。
在另一优选例中,所述的酸沉淀条件是蛋白的浓度为0.5-2mg/ml,最佳的蛋白浓度为1.2±0.1mg/ml,所用的酸为10%的冰醋酸(V/V),沉淀时的pH为4.0-5.0,以4.5为最佳。
在另一优选例中,所述的阳离子交换层析条件是:pH为4.0-4.5,最佳为4.5,所采用的阳离子交换剂固定在载体底物上的磺基,优选的凝胶介质为Source30S(Amersham Phamarcia公司)。
在另一优选例中,反相柱层析的条件是:填料为Source15RPC(AmershamPhamarcia),洗脱剂为12.5mM HCl的80%乙醇溶液。
附图说明
图1显示了不同培养基对DH5α/pBV220-rhSCF原核表达工程菌SCF表达量的影响。
其中,泳道1:标准分子量;泳道2:2YT;泳道3:M9;泳道4:M9plus+2YT;泳道5:LB;泳道6:SOB;泳道7:SOC。结果表明,在2YT和M9plus+2YT中,分子量约18kD的rhSCF蛋白表达明显高于其它培养基。
图2显示了原核表达工程菌DH5α/pBV220-rhSCF发酵生长曲线。
经优化的SCF发酵方法,工程菌在发酵8-18小时内,基本以稳定的速率(约0.15 OD600/小时)增长,至发酵结束时细菌OD600可达约40。
图3显示了不同复性时间后SDS-PAGE分析rhSCF的复性效果。
其中,泳道1:标准分子量;泳道2:复性5小时后还原型电泳;泳道3:复性5小时后氧化型电泳;泳道4:未复性样品还原型电泳;泳道5:未复性样品氧化型电泳;泳道6:复性48小时后还原型电泳;泳道7:复性48小时后氧化型电泳。在48小时后氧化型电泳速度明显比还原型快,形成的二聚体明显少,显示复性已基本完成。
图4显示了不同pH值样品的阳离子交换层析分离效果。
图A:pH3.5的50mM枸橼酸钠缓冲液;图B:pH=4.0的50mM乙酸钠缓冲液;图C:pH=4.5的50mM乙酸钠缓冲液;图D:pH=5.0的50mM乙酸钠缓冲液。洗脱后第1峰内含rhSCF组分,第2峰为NaOH洗脱峰,主要为杂质成分、含少量SCF多聚体,rhSCF得率最高的是pH为4.5的阳离子交换层析图。
图5显示了Source15RPC分离去除二聚体色谱图。rhSCF的单体在40%-50%之间的乙醇处洗脱,而二聚体则在60%乙醇以后洗脱,显示Source15RPC去除二聚体效果佳。
图6显示了反相柱层析纯度分析。经色谱层析纯化的rhSCF终样品用WatersC4(25×390mm,300A,15μm)柱分析其纯度。单峰面积占95%以上。
图7显示了基于该工程菌表达的SCF的纯化过程。
泳道1:标准分子量;泳道2:全菌裂解液;泳道3:溶解的包涵体;泳道4:复性上清(还原型);泳道5:复性上清超滤浓缩后;泳道6:酸沉淀上清;泳道7:Resource 30S柱分离后(还原型);泳道8:Resource 30S柱分离后(氧化型);泳道9:Resource 15RPC分离后;泳道10:经Resource 30Q柱转换缓冲液后。显示经以上各步分离后,最终得高纯度的rhSCF。
图8显示了pBV220-rhSCF165质粒的结构图。
具体实施方式
本发明经过深入而广泛的研究发现,在SCF编码序列的上游的特定位置处(在ATG上游约12-16bp处)添加翻译增强子,可实现SCF的高效表达。在此基础上,本发明构建获得了高效表达SCF的表达载体和宿主细胞,并且优化了发酵、复性和纯化等过程,从而全面优化了SCF的生产工艺,实现了SCF的高效大规模生产。
在本发明中,术语“干细胞因子(stem cell factor,SCF)”指天然存在的或人工合成的这样一种蛋白质,它具有已知成熟的(无信号肽)可溶型人SCF相同的氨基酸序列(Martin,FH,1990,Cell,63(2):203-211),其与天然人SCF具相同生物学活性。
如本文所用,术语“上游间隔序列”指位于增强子和SCF的起始密码子ATG之间的序列。在本发明中,上游间隔序列的长度通常10-18bp,较佳地为12-16bp。一种优选的上游间隔序列是SEQ ID NO:7中第10-23位,即TAAAGGAGGAATTC。
在本发明中,可供使用的重组人干细胞因子的编码DNA序列可以是通过常用的RT-PCR方法克隆的cDNA序列,或是本领域研究人员运用人工合成的但编码与成熟可溶型人干细胞因子相当氨基酸序列的DNA片段。
本发明的一个方面,是通过已知的分子生物学方法,从胎肝细胞中抽提mRNA,通过反转录PCR克隆编码可溶型SCF的cDNA序列,通过优选翻译增强子,将cDNA序列插入原核表达载体,构建重组质粒,并转化宿主细胞大肠杆菌,筛选出稳定高表达SCF的原核工程菌。
许多表达载体可应用于SCF的原核表达,本发明通过比较研究发现,pBV220是一种特别优选的载体。pBV220是一种常用的原核表达载体,但外源性蛋白编码基因在该载体控制下的表达受到多种因素的制约。大肠杆菌表达系统中,外源基因的翻译效率并未达到最佳优化水平,外源基因上游的一个SD序列在很多情况下不足以提供高水平表达。本发明通过在诱导型原核质粒pBV220的SD序列上游的不同位置引入T7噬菌体翻译增强子,结果发现在ATG上游约10-18bp(较佳地12-16bp)处引入翻译增强子,特别适合SCF的高效表达。用PCR方法插入目标序列,并用DNA测序证实,其增强功能在rhSCF的表达中得到了证实。
可用于本发明的的宿主细胞没有特别限制,代表性例子包括DH5α、MM294、TOP10和ER2566等多种大肠杆菌菌株。优选的宿主细胞为DH5α。
简而言之,本发明的表达载体是这样构建的:采用中国人胎肝细胞作为人干细胞因子的来源,采用反转录PCR方法获得编码可溶性干细胞因子N端165个氨基酸的编码cDNA;将该cDNA序列克隆到经酶切处理的含翻译增强子的原核表达载体pBV220中,从而构建成重组表达载体pBV220-rhSCF165。采用大肠杆菌DH5α作为宿主细胞,用重组表达载体pBV220-rhSCF165转化宿主细胞,经过反复筛选和表达量检测分析,获得稳定高表达rhSCF的工程菌株DH5α/pBV220-rhSCF165。
对于本发明的工程菌,可用常规方法进行培养,诱导表达,然后从培养物中分离出所需的人干细胞因子。
在本发明的另一方面,还针对已筛选出原核高表达工程菌,通过对培养基的优化、发酵参数的优化、补料方案的选择,建立一套完整合适的高密度发酵工艺。
将构建好的热诱导pBV220-rhSCF表达质粒转化到DH-5α大肠杆菌中,表达工程菌DH-5α/pBV220-rhSCF是一株非分泌型表达工程菌,其rhSCF表达是在热诱导启动子的控制下,在32℃时不表达,但在升温到42℃时表达rhSCF。表达蛋白是以包涵体形式存在。理想的培养基即能让细菌快速生长,又有高的表达量。本发明观察了不同培养基对细菌生长和rhSCF表达量的影响,发现工程菌在LB、M9及2YT中生长迅速,但只有在2YT和M9plus+2YT中表达量最高。考虑到M9具有缓冲能力,有利于细菌发酵时pH值的稳定控制,故本实验以M9为基本培养基。通过优选试验,在M9培养基中添加不同的组份,包括不同浓度的葡萄糖、酵母浸出粉、酪蛋白水解物及不同的微量元素配方,以此培养基作为扩增培养基,在32℃进行培养,然后补充各种养料维持细菌以一定的速度生长,最后用2YT作为热诱导培养基,使最终发酵的工程菌中rhSCF表达量可占总蛋白的30%以上.。
原核表达系统因为缺乏蛋白质折叠所需的环境,表达产物结构与天然蛋白明显不同,高表达的蛋白质常以不溶性包涵体形式存在,并绝大多数无生物学活性。原核表达产物制备过程中,一般均涉及目的蛋白的变性和复性。复性过程直接影响蛋白质的得率及终产品的比活性。对复性条件的优化是重组表达目的蛋白生产工艺中最关键的环节。蛋白的纯化则影响蛋白的纯度、得率和比活性,色谱分离技术是蛋白质纯化最重要的手段,对其进行优化有非常重要意义。本发明同时包括基于上述高效表达工程菌表达的SCF的包涵体的溶解、复性和纯化的工艺研究。
本发明还提供了一种从含rhSCF的包涵体中通过变性及复性方法,制备具有生物学活性的简便方法。本发明中发酵终产物中rhSCF以包涵体形式存在,要制备含有生物学活性的rhSCF,必须对包涵体进行变性及复性。
首先必须选择适当的溶液溶解包涵体,常用的方法是在缓冲液中加入合适的变性剂,如高浓度的尿素、盐酸胍、SDS等。通过反复实验,选择了含5-8M尿素的缓冲液溶解rhSCF包涵体。
通过稀释后复性,经超滤浓缩及缓冲液转换后,制备具有生物学活性的rhSCF粗制品。优选的复性条件为50mM Tris/HCl,pH=8.0,2M尿素+1mMGSH/0.2mM GSSG,最佳的复性时间为40-60小时,更佳地为48小时。重组rhSCF在PH>7的缓冲液中,在体外很容易复性,但在复性时必须掌握好rhSCF的蛋白浓度,太高或太低的rhSCF浓度皆影响复性,而且明显影响比活性和复性得率,将rhSCF浓度控制在200-500μg/ml合适,以300ug/ml左右为最佳。
本发明还提供了一种简便快速的纯化干细胞因子的方法,该方法包括依次采用酸沉淀、Source30S阳离子柱层析、Source15RPC反相柱层析及Source30Q柱层析获得高纯度的重组人干细胞因子。酸沉淀时的蛋白浓度和酸沉淀时的pH值对rhSCF的得率和活性有明显的影响,其中蛋白浓度以0.5-2mg/ml为佳,尤以1.2mg/ml为最佳。酸沉淀时pH值,以pH4.0-5.0为合适,又以pH4.5为最佳。
在一优选例中,纯化方法包括首先将复性后SCF组分,用冰醋酸调节PH值为4.5,离心15000rpm×15min去除沉淀。然后将上清上样到预先用50mM乙酸钠,pH=4.5缓冲液平衡的Source30S,以50mM乙酸钠,PH=4.5,1N NaCl线性梯度洗脱,将收集的组份用12.5mMHCl酸化后,上样到Source15RPC,以含12.5mMHCl的80%乙醇线性梯度洗脱,收集SCF,最后用Source30Q转换缓冲液。
采用本发明优化的发酵、纯化工艺,可以在4天时间内,制备rhSCF表达量可占总蛋白的30%以上的培养物,经纯化后可得到纯度达95%以上的rhSCF(产率为0.13g/l)。
本发明的主要优点在于:
(a)本发明中构建的重组表达人干细胞因子的工程菌具有表达量高,表达稳定等优点。
(b)通过本发明方法制备重组人干细胞因子得率高、活性好,可用于肿瘤放疗、化疗后的造血功能重建,造血干细胞的体外培养等。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
原核高表达工程菌DH5α/pBV220-rhSCF的构建与筛选
人SCF的完整编码序列从人胎肝组织通过RT-PCR方法获得。克隆这一序列的引物由上海生工生物技术公司合成,序列如下:
上游引物:5’TAT
ATGAAGAAGACA CAAACTTGG(SEQ ID NO:1,下划线标示处为起始码),
人SCF最长的成熟蛋白包含248个氨基酸,前端信号肽长25个氨基酸,包含终止码的核苷酸序列全长为822bp。PCR产物大小接近822bp,与理论值相符。对该片段可以进行初步的酶切鉴定。在人SCF序列中有一EcoR I位点,可以将片段切成420bp和400bp的两个片段。PCR扩增的人SCF基因片段克隆入T载体(Promega公司)后测序鉴定。T载体上带有通用测序引物序列,由于插入片段长于800bp,所以双向测序。测序采用末端终止法,试剂为BigDye测序试剂(Perkin-Elmer),数据采集及分析使用ABI377型全自动测序仪。测序的结果示氨基酸序列与报道的序列完全一致。
将插入有人SCF基因的质粒将作为扩增人SCF表达基因片段的模板。人SCF在天然状态下存在由165个氨基酸残基组成的分泌型单体,即人SCF膜结合型上胞外段的一部分,这一分泌型蛋白的长度符合原核表达的最佳长度范围,并且没有跨膜区,从理论上来说适宜于原核表达,并且这一表达产物可以与人SCF的受体结合,具有人SCF的生物学活性。因而构建了表达这一分泌型单体的原核表达载体。
许多表达载体可应用于SCF的原核表达,包括pBV220,pLCM182,pGEM等,本发明选用热诱导型的表达载体pBV220(见中国专利申请CN98105441.2,申请日:1998年3月6日,申请人:上海华晨生物技术研究所)。pBV220的质粒包含质粒复制起始子ori,氨苄青霉素抗性基因AmpR,来源于λ噬菌体的原核转录启动子PRPL,强转录终止序列rrnBT1T2,多克隆酶切位点MCS,和λ噬菌体来源的温敏突变的阻抑蛋白cIts857,该蛋白在30℃时可强烈阻抑基因转录,当温度升至42℃时,该蛋白失活,要表达的目的蛋白序列被置于PRPL启动子的下游,当热诱导时该PRPL启动子可使位于其下游的蛋白质编码序列翻译及表达。
研究发现,大肠杆菌表达系统(质粒)中,外源基因的翻译效率并未达到最佳优化水平,外源基因上游的一个SD序列在很多情况下不足以提供高水平表达。为了提高表达,本发明人在pBV220载体基础上进行改进:即用PCR方法加入噬菌体来源的翻译增强子TTAACTTTA,所用的合成引物如下:
上游引物:5’-GGCGG
GAATTCCTCCTTTATAAAGTTAAAT TTTTAACCAATGCTTCGTTTCGTATC-3’,(SEQ ID NO:3)
下游引物:5’-CC
GAATTCCCGGGGATCCGTCGACCTGCAG CCAAGCTT-3’(SEQ IDNO:4),下划线处为EcoRI酶切位点。
以EcoRI线性化的pBV220为模板扩增,扩增产物用T4 DNA连接酶连接即得到改构的pBV220载体。
rhSCF165的扩增则以下列引物从T载体中直接克隆,引物序列如下:
上游引物:5’TA
ATGGAAGGGATCTGCAGGAA(SEQ ID NO:5,下划线处为原核表达时加入的起始码蛋氨酸,双下划线为EcoRI酶切位点),
下游引物:5’CG
GGATCCTTAGGCTGCAACAGG GGGT(SEQ ID NO:6,下划线处为引入的BamH I酶切位点)。
将扩增的hSCF165以EcoRI和BamHI双酶切,并插入用EcoRI和BamHI酶切的改构pBV220载体,构建成pBV220-rhSCF165质粒,最后经测序证实其序列正确性。pBV220-rhSCF165质粒的结构图谱见图8。
得到序列正确的表达质粒克隆后,将质粒分别转化到其它大肠杆菌中。在本实施例中将构建好的表达质粒分别转化了DH5α,MM294,TOP10和ER2566等。作小量的诱导表达观察不同宿主菌对表达SCF的影响,结果表明,相比较而言,转入大肠杆菌DH5α所获得的工程菌DH5α/pBV220-rhSCF的表达最高。
实施例2
高表达原核工程菌DH5α/pBV220-rhSCF的大规模培养
发酵工艺研究的目的是建立一套完整合适的发酵工艺,基本思想是在终产物产率、操作的简便性和投入的经济性之间寻求最适的方案,其中终产物的产率是考虑的首要因素。本实施例研究了批式发酵技术生产注射用rhSCF的基本培养基和发酵过程中培养基补充等问题。大肠杆菌培养基包括四类营养成分:氮源物质,主要是氨基酸和蛋白质类;碳水化合物,主要是糖类和甘油等;无机盐类,包括各种所需盐类和微量元素;维生素类。
通过摇床发酵实验,本发明人观察了不同的培养基包括LB,2YT,SOB,SOC,M9和M9plus+2YT培养基对细菌生长和rhSCF表达量的影响。
结果表明,工程菌在LB、M9和2YT中生长迅速,但只有在2YT和M9plus+2YT中表达量最高(图1)。考虑到M9具有缓冲能力,有利于细菌发酵时pH值稳定,故本实验以M9为基本培养基。在此基础上,在M9培养基中添加不同的组份,包括适当浓度(1-5%)的葡萄糖,1-5%酵母浸出粉,和1-5%酪蛋白水解物及不同的微量元素配方,推荐的培养基配方如下。
NH4Cl 20mM
K2SO4 16.1mM
KH2PO4 7.8mM
Na2HPO4 12.2mM
MgSO4.7H2O 3mM
柠檬酸3钠.2H2O 1.5mM
MnSO4.4H2O 30μM
ZnSO4.7H2O 30μM
CuSO4.5H2O 3μM
L-色氨酸 70mg/l
FeSO47H2O 72μM
硫胺 20mg/l
葡萄糖 40g/l
酵母浸出粉 10g/L
酪蛋白水解物 10g/L
以此培养基作为扩增培养基,在32℃进行培养。待OD600为10时,开始补充各种养料,主要是葡萄糖,蛋白胨和酵母浸出份,补料速度以维持细菌OD600值以每小时0.2速度生长为佳,至OD值为40时,开始升温至42℃诱导表达,细菌发酵生长曲线见图2。
按生长菌种必须经过扩增,由于种子液的扩增无需工程菌表达rhSCF,因此要尽可能地增加细菌的扩增量。将种子液分别以2%、5%和10%的比例接种入2YT培养基中,在摇床中发酵2hr后,升温至42℃诱导表达6hr,细菌得率随接种比例增加而增加,但rhSCF得率在2%组与5%、10%组相比无明显差异,考虑到实际操作过程中,种子制备体积过大会增加操作时间,使种子发生杂菌污染的机率增大,因此最终发酵工艺中的接种量为2%。
pH值的波动对rhSCF的表达产生明显的影响,当pH值在6.5-7.4之间时rhSCF表达基本不受影响,但当低于6.5时rhSCF的表达明显受到抑制。由于M9培养基中含有缓冲对,在摇床发酵下可控制在6.5以上。但当在发酵罐中发酵时,由于细菌生长过程中不断产生酸性物质,因此必须不断补充碱性物质如氨水、氢氧化钾溶液等。
溶氧是一个对细菌生长影响极大的参数。在发酵罐培养中溶氧主要受到三个因素的控制,即转速、通气量和罐压,加大任何一项都可使溶氧值增加。一般大肠杆菌的培养,溶氧值通常设定在30-80%之间。本发明观察到DH-5α/pBV220-rhSCF在30-60%溶氧值之间其rhSCF表达并无明显差别。溶氧值大于60%,由于必须通过增加转速或通气量来维持设定的溶氧值,因而加大了对细菌的剪切,细菌的结构受到破坏,此时rhSCF的表达量反而减少;而溶氧值小于30%时,细菌生长周期将延长,故将转速、通气量与溶氧控制级联(最高转速不得大于800rpm),而通气量最少定为2L/min,罐压定为6PSI,以保证溶氧控制在30%以上。在发酵过程中,工程菌DH-5α/pBV220-rhSCF细菌在32℃培养后,升温至42℃进行热诱导。
在诱导的开始阶段,表达产物随着诱导的时间延长而不断增加,但随着诱导时间的延长,其表达量不再增加,有时反而因为外源性重组蛋白在细菌内的酶解作用而下降。因此在工艺研究过程中,观察热诱导后1h,2h,3h,4h,5h,6h和7h rhSCF表达量的变化。
结果表明,细菌在诱导后2h后rhSCF即有明显的表达,6h达最高峰,在优化的表达条件下rhSCF的表达量可达细菌菌体蛋白的31.8%。因此,最后选6h作为发酵诱导表达时间。
实施例3
重组人干细胞因子的包涵体的溶解与复性
包涵体的分离与溶解是原核重组表达蛋白制备中的一个重要步骤。原核表达系统因为缺乏蛋白质折叠所需的环境,表达产物结构与天然蛋白明显不同,许多蛋白质常以不溶性包涵体形式存在,并绝大多数无生物学活性。包涵体作为原核表达产物的一种主要存在形式,为目的蛋白的富集及后续的分离纯化提供了十分便利的条件。本发明中高表达rhSCF是以不溶的包涵体形式存在,经高压破菌(1000psi)后细菌,离心收集沉淀即为包涵体。
用含低浓度去垢剂如尿素或盐酸胍的缓冲液洗涤,洗涤目的是在保证靶蛋白基本不损失的情况下,去除部分菌体蛋白和杂质,简化后面的纯化步骤,由于盐酸胍影响离子交换层析,因此首先采用1M和2M尿素洗涤包涵体,2M尿素洗涤效果较1M稍佳,但是目的蛋白损失也较多,因此最后选用1M尿素洗涤。由于包涵体是变性的rhSCF的聚合体,因此必须采用变性剂如高浓度的尿素或盐酸胍溶解,本发明采用含8M尿素的Tris缓冲液(pH=8.0)溶解包涵体。
用8M尿素变性的包涵体要复性为有功能活性的靶蛋白,必须降低或去除高浓度尿素,目前较常用的去除方法有稀释和透析两种,后者因不易控制内毒素等的污染,且在大规模制备中不易操作,而前者相对简单,因此本实验用稀释法降低尿素浓度,最后优选的复性液为pH=8.0 50mMTris缓冲液(含2M尿素+1mmGSH/0.2mMGSSG)。
重组rhSCF在PH>7的缓冲液中,在体外很容易复性,但在复性时必须掌握好rhSCF的蛋白浓度,当蛋白浓度过高时,很容易出现大量的二聚体,从而影响重组制品的质量和得率。rhSCF浓度测定方法是先测定溶液中总蛋白的浓度,然后行SDS-PAGE电泳,用图像分析仪计算rhSCF的相对含量,估算rhSCF的含量。复性过程中可用SDS-PAGE电泳监测rhSCF的复性程度,复性正确的rhSCF其氧化型电泳速率比还原型快,太高或太低的rhSCF浓度皆影响复性,而且明显影响比活性和复性得率(表1)。
本发明人发现将rhSCF浓度控制在200-500μg/ml范围比较合适,尤以300ug/ml左右最佳。复性的时间对正确复性也有明显的影响,太短时间复性不完全,复性后的蛋白不稳定,最后选择复性时间控制在40-60小时合适,以48小时左右为最佳(图3)。
表1 不同rhSCF蛋白浓度复性后rhSCF的得率和比活性
rhSCF蛋白浓度(mg/ml) | 复性得率 | 比活性 |
1.000.600.300.15 | 36.5%48.2%60.4%50.3% | 5.2×105U/mg5.9×105U/mg7.5×105U/mg7.5×105U/mg |
实施例4
采用酸沉淀从复性液中浓缩分离rhSCF
复性后的蛋白溶液中含有许多杂蛋白,对pH的变化非常敏感,酸沉淀既要考虑尽可能去除杂蛋白,又要保证靶蛋白活性和得率损失最少,在pH降低至6以下时,有大量白色雾状沉淀出现,降至4.0-5.0时,沉淀继续增多,尤以pH为4.5时,沉淀达最多,且SDS-PAGE电泳示沉淀中大部分为杂蛋白,少量rhSCF单体和非共价键形成的rhSCF二聚体。
比较酸沉淀和将复性后样品直接用阴离子交换柱分离的效果,发现用阴离子交换柱虽然可得到更多的rhSCF,但是其中含有许多复性不正确的rhSCF,在随后的阳离子交换色谱纯化过程中,复性不正确的rhSCF去除后,其得率反比直接用酸沉淀低。因此最后选用将样品直接用酸沉淀去除大部分杂质。酸沉淀时rhSCF浓度对酸沉淀得率有明显的影响,蛋白浓度过高大于2mg/ml时,酸沉淀得率反而低,蛋白浓度过低,则酸沉淀后样品体积太大,影响了后续的柱层析纯化过程,因此最后将rhSCF蛋白浓度控制在0.6-2mg/ml为合适,最适为1.2mg/ml(表2)。
表2 不同rhSCF蛋白浓度对酸沉淀得率影响
rhSCF蛋白浓度(mg/ml) | 酸沉淀后得率 |
5.002.401.200.60 | 8.5%21.2%30.4%35.3% |
实施例5
层析法分离rhSCF
由于rhSCF等电点为5.2,用酸沉淀去除大部分杂蛋白后的样品用阳离子交换色谱可进一步得到纯化,通过对不同阳离子交换填料的实验比较,选用的填料是Pharmacia Source 30S阳离子交换填料。该填料属BioProcess填料,可满足于中试生产放大需要,便于在位清洗及消毒。而且具有很好的刚性,适合应用于对大体积样品进行高流速的快速纯化过程。
首先对不同pH值缓冲液对阳离子交换柱分离效果进行了比较研究。在1ml的小体积柱上,研究了pH为3.5、4.0、4.5和5.0的条件下采用Souce30S填料对酸沉淀后的样品进行层析分离的效果(图4)。经过观察,发现选用不同pH值缓冲液进行阳离子交换时,会对rhSCF的最终得率产生较大的影响。pH值过低,可能导致蛋白质在填料上吸附过强,使得率降低。pH值过高,可能会使目的蛋白离子交换填料上吸附力减弱,一方面使填料的上样量减少(部分目的蛋白出现在上样时的流穿峰中),从而使rhSCF的回收率下降。通过比较,本发明人最终选用的最适层析条件为:缓冲液A为pH4.5的50mM乙酸钠缓冲液,B则为缓冲液A+1M NaCl。
将阳离子交换分离的rhSCF组份用反相柱层析进一步分离。反相柱填料为Pharmacia公司的Source15RPC。样品用12.5mM HCl酸化后,非共价键形成的二聚体易于解离,而共价键形成的二聚体则不易解离,用反相的方法可区分开,常用的反相洗脱剂有乙腈和乙醇,由于乙腈很容易使SCF生物活性物质丢失、对人体毒性较大,且成本相对乙醇高,因此选用乙醇。最后优化的洗脱方案为用12.5mM HCl酸化的乙醇洗脱,可将rhSCF中共价键形成的二聚体和单体分离(图5)。分离的rhSCF单体用Source30Q转换缓冲液至PBS溶液中。经过以上各步分离后的rhSCF样品,经用反相层析分析柱鉴定示其纯度在95%以上(图6)。各步纯化过程和杂质去除效果总结于图7。
实施例6
制备的rhSCF的生物活性测定
rhSCF对祖系造血干细胞有促生长分化的作用,因此本实验选择了用UT-7(巨核细胞系造血干细胞)/MTT法测定rhSCF生物学活性。
取适量96孔细胞培养板做相应标记,将实验所用的溶液预温到37℃。取足量UT-7细胞培养物,1200rpm离心5min后,弃上清,重悬于10ml PBS缓冲液中,37℃条件下放置5min后离心。重复三次后,用含10%血清的1640培养基调整细胞浓度为4×105/ml,置37℃备用。
取rhSCF标准品用含10%血清的1640培养基稀释至500IU/ml。将待测样品稀释到1μg/ml浓度。将待测样品进行倍比稀释,并设标准品对照。每孔加入细胞悬液培养50μl细胞悬液,37℃,5%CO2条件下培养40小时。采用MTT法检测细胞增殖情况。
用以上方法测定本发明中纯化的rhSCF的活性非常稳定,比活性为6-7×105IU/mg。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>第二军医大学免疫学研究所
<120>重组人干细胞因子的原核表达载体、工程菌及制备方法
<130>033706
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>引物
<400>1
tatatgaaga agacacaaac ttgg 24
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
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cgggatcctt acacttcttg aaactctctc tc 32
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<212>DNA
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ggcgggaatt cctcctttat aaagttaaat ttttaaccaa tgcttcgttt cgtatc 56
<210>4
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ccgaattccc ggggatccgt cgacctgcag ccaagctt 38
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<222>(1)..(28)
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<400>5
tagaattcat ggaagggatc tgcaggaa 28
<210>6
<211>27
<212>DNA
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<220>
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<222>(1)..(2)
<223>引物
<400>6
cgggatcctt aggctgcaac agggggt 27
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(27)
<223>含增强子的ATG上游序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>增强子序列
<400>7
ttaactttat aaaggaggaa ttc 23
Claims (10)
1.一种用于重组表达人干细胞因子的原核表达载体,其特征在于,所述的载体含有人干细胞因子表达盒以及与所述表达盒操作性相连的启动子,所述的表达盒从5’至3’依次具有:序列为TTAACTTTA的增强子、长度为14±2bp的上游间隔序列、和人干细胞因子的编码序列、终止密码子;
其中所述的上游间隔序列具有SEQ ID NO:7中第10-23位的序列。
2.如权利要求1所述的重组表达载体,其特征在于,表达载体为pBV220,且所述的上游间隔序列为SEQ ID NO:7中第10-23位。
3.一种大肠杆菌,其特征在于,它含有权利要求1所述的原核表达载体。
4.如权利要求3所述的大肠杆菌,其特征在于,所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5c菌株。
5.一种制备重组人干细胞因子的方法,其特征在于,包括步骤:
(a)培养权利要求3所述的大肠杆菌,至OD600值为30-45;
(b)诱导培养步骤(a)的大肠杆菌,从而表达重组人干细胞因子;
(c)分离出表达的重组人干细胞因子。
6.权利要求5所述的方法,其特征在于,在步骤(a)中使用的初始培养基含有0.1mM-1mM浓度的微量元素、1%-5%的葡萄糖、1%-5%甘油和1%-5%酵母浸出物,并且在培养过程中补充的养料为10%-40%浓度的葡萄糖,5%-10%酵母浸出物和5%-10%蛋白胨。
7.如权利要求5所述的方法,其特征在于,还包括步骤(d):对包涵体变性、复性、酸沉淀、阳离子交换、和反相柱层析,从而得到纯化的重组人干细胞因子。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的复性的复性时间为24-60小时,复性的蛋白浓度为200-500ug/ml。
9、如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的酸沉淀条件是蛋白的浓度为0.5-2mg/ml,沉淀时的pH为4.0-5.0。
10、如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的阳离子交换层析条件是pH为4.0-4.5,所采用的阳离子交换剂固定在载体底物上的磺基;
反相柱层析时的洗脱剂为12.5mM HCl的80%乙醇溶液。
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