CN1511849A - 新型α干扰素突变体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多种新型α干扰素突变体及其制备方法，特别是涉及一种高抗病毒活性的重组新型α干扰素突变体及其制备方法。它们具有抗病毒活性高的优点。本发明的目的是：1.提供多种新型α干扰素突变体(抗病毒比活性≥5×108IU/mg，WISH细胞病变抑制法测活)，及其编码这些蛋白的氨基酸序列、它们的基因表达载体及其构建方法、基因表达产物的纯化方法。2.本发明的另一目的是提供一个新型α干扰素突变体MIIFN(其抗病毒比活性≥8×108IU/mg，WISH细胞病变抑制法测活)，及其人工合成基因的高效表达系统和制备表达产物的纯化方法。
Description
本发明涉及多种新型α干扰素突变体及其制备方法和用途，特别是涉及一种高抗病毒活性的重组新型α干扰素突变体及其制备方法和用途。这类新型干扰素具有抗病毒活性高的优点。
干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。至今哺乳动物的干扰素可以分为α、β、γ、ω等几型，其中α型干扰素又分为I型和II型。人干扰素的I型家族有20多个基因成员，其中大部分编码功能蛋白，彼此在核苷酸水平上有大约90％的同源性。而人干扰素的II型家族有5-6个基因成员，与I型家族有50％的同源性。
1986年美国FDA首先批准基因工程α2a干扰素(Roche公司)和基因工程α2b干扰素(Schering公司)上市。基因工程β、γ干扰素也相继获准上市。我国科学家首创的α1b干扰素也于1996年正式获准上市。
经临床大量研究证明，α型干扰素是一种重要的抗病毒和抗肿瘤治疗药物。另外美国Amgen公司根据13种α型干扰素的基因序列同源性，设计出一种全新的蛋白质工程药物-INFERGEN(干复津)，并经美国FDA批准1997年在美国上市，用于治疗丙型肝炎，其抗病毒活性是α2b干扰素的5-10倍。但副作用同时增加。
本发明的目的在于通过体外进化技术对多种α型干扰素进行重组，获得活性更高，副反应更小，更适合于中国人治疗用的α型干扰素。
在本发明之前，尚没有公开过本发明所涉及的新型干扰素突变体的氨基酸或核苷酸序列。
本发明的目的是提供多种新型α干扰素突变体。其抗病毒比活性≥5×108IU/mg(采用干扰素效价测定常用的WISH细胞病变抑制法)。
本发明的另一目的是提供编码这些蛋白的氨基酸序列。
本发明的另一目的是提供构建这些蛋白基因表达的载体及其方法。
本发明的另一目的是提供这些蛋白基因表达产物的纯化方法。
本发明的另一目的是提供一个新型α干扰素突变体MIIFN。其抗病毒比活性≥8×108IU/mg(采用干扰素效价测定常用的WISH细胞病变抑制法)。
本发明的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的人工合成高效表达DNA序列。
本发明的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的氨基酸序列。
本发明的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的高效表达载体及其构建方法。
本发明的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的高效表达基因工程菌菌株及其构建方法。
本发明的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN基因工程菌表达产物的纯化方法。
本发明的另一目的是提供新型α干扰素突变体MIIFN的相关理化性质。
本发明所提供的新型α干扰素突变体具有高效的抗病毒活性，在治疗病毒性感染和癌症等疾病中具有应用前景。
本发明中附图仅用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明的范围。
图1.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN的人工合成DNA序列的PGR扩增结果。
图2.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN重组质粒pET-rMIIFN经Nde I/BamHI双酶切后的电泳图谱。
图3.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN重组质粒pET-rMIIFN在基因工程菌BL21(DE3)中的高效表达。
图4.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN重组表达质粒pET-rMIIFN的稳定性考察。
图5.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN种子库菌种表达量稳定性考察。
图6.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN的纯化流程。
图7.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN的基因工程表达纯化产物HPLC分子筛检测。
图8.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN的基因工程表达纯化产物飞行时间质谱分析测定分子量。
图9.是本发明的新型α干扰素突变体rMIIFN的基因工程表达纯化产物等电点测定。
本发明实施方案概述：
对14种不同的α家族干扰素表达基因经DNase I酶消化成50bp-30bp大小的DNA片段后，通过无引物PCR方法随机重组，构建α家族干扰素分子体外进化文库。并通过对文库中阳性重组克隆序列测定，筛选有意义重组份子，并构建基因工程表达载体进行小量表达，然后对表达产物通过α家族干扰素单克隆抗体(由本公司自行研制)一步亲合纯化法获得纯度＞85％的样品蛋白，并且筛选抗病毒比活性≥1×108IU/mg的分子，并对这些分子进行DEAE阴离子交换-单克隆抗体亲合层析-S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺进一步纯化，得到纯度在95％以上的蛋白质样品。筛选比活性≥5×108IU/mg的分子。并将其作为高活性新型干扰素突变分子(纯度＞95％)，其氨基酸序列如附录SEQ ID NO：1-4所示(MIFN1-4)。其中有一分子比活性≥8×108IU/mg，其氨基酸序列如附录SEQ ID NO4(MIFN4)，命名为MIIFN。根据rMIIFN氨基酸序列，采用大肠杆菌偏性密码子，合成了rMIIFN的全长DNA序列，将rMIIFN DNA亚克隆入表达载体pET-23b中，获得了可编码rMIIFN成熟蛋白的重组质粒pET-rMIIFN。该重组子在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS受体细胞中，可高效稳定的表达，表达产物主要以包涵体形式存在，占菌体总蛋白量的30％左右，经研究BL21(DE3)/pET-rMIIFN工程菌种稳定性很好。rMIIFN新型干扰素突变分子的高度纯化工艺采用了DEAE阴离子交换-Cu2+鏊合层析-S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。通过以上三步纯化，得到高纯度的rMIIFN。理化性质检测显示：纯度达到98.92％；分子量为18856.96道尔顿；等电点在5.8-6.6之间；比活性≥8×108 IU/mg(WISH细胞病变抑制法测活)。
本发明是通过下列实施例进行实施：
实施例1体外进化文库的构建
14种含有不同干扰素基因的质粒(α1b、α2b、α2a、α4b、α5、α6、α7、α8、α10、α14、α16、α17、α21和IFN-con)，均由北京三元基因工程有限公司提供。经NdeI和BamHI双酶切后，纯化回收500bp的干扰素DNA片段；将其等量混合至终浓度约为0.1μg/μl，DNase I酶消化2min，马上移至90℃水浴灭活10min，2％琼脂糖凝胶电泳回收50bp-30bp大小的片段。采用无引物PCR方法组装干扰素基因片段，反应条件为：95℃ 3min，然后94℃ 30s，55℃30s，72℃60s共40个循环，最后72℃延伸7min。接着以上述无引物PCR产物为模板，用干扰素5’和3’端保守序列引物P1，P2为模板，进行PCR扩增：引物根据α家族5’和3’端序列的保守特点，设计上游5’端2条引物，下游3’端3条引物，分别进行混合扩增。
5’端2条引物：1. 5’atgtgtgatttacctcaaactcat 3’
2. 5’atgtgtgatttacctgaaactcat 3’
3’端3条引物：1. 5’ctattattctttacggcgcag 3’
2. 5’ctattattctttactgcgcag 3’
3. 5’ctattaatctttacggcgcag 3’
反应条件为：95℃3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃60s共30个循环，最后72℃延伸7min。产物经琼脂糖电泳分离后，选择500bp左右的DNA片段克隆进T-载体，连接反应具体如下进行：DNA片段3μl，2×T4连接酶反应缓冲液5μl，T-载体1μl，T4连接酶1μl，总体积10μl)，4℃连接过夜。将连接反应混合物转化DH5α感受态细胞，经37℃培养过夜后，从琼脂板上挑取转化子，接种含氨苄青霉素的LB培养基，培养过夜后，小量制备质粒。质粒用Nde I和BamH I进行酶切，分别在3kb左右和520bp左右出现特异DNA条带，与预计情况相符，说明重组质粒构建成功，将获得的阳性重组子命名为pGEM-MIFNs。构建的体外进化文库为MIFNs库。
实施例2 体外进化文库克隆的筛选
首先对阳性克隆全部进行DNA序列的测定，测序工作由上海生工工程公司完成。将所有克隆的测序结果应用生物软件进行翻译及比对，筛除没有完整阅读框架(ORF)的克隆、与母体模板分子(α1b、α2b、α2a、α4b、α5、α6、α7、α8、α10、α14、α16、α17、α21和IFN-con)氨基酸序列完全相同的克隆、有阅读框架但PCR所致突变氨基酸突变率＞30％的克隆，保留杂交克隆的条件：基本上保持了母体模板的阅读框架(α1b、α2b、α2a、α4b、α5、α6、α7、α8、α10、α14、α16、α17、α21和IFN-con)，但在不同的位点上均呈现氨基酸的杂交特点，杂交位点分布在氨基端，羧基端和中间位置不同，数量有1个到数十个不等。分别命名为克隆MIFN1-MIFNn。
实施例3 小量表达载体的构建及转化
由于单纯从结构上不能鉴定上述分子的功能活性，我们采用将这些分子的DNA序列插入到pT23b表达载体中，构建pET-MIFNs重组子，通过JM109(pTrcINF)基因工程菌进行小量表达。
将大肠杆菌表达载体pET-23b质粒，经Nde I和BamH I进行酶切。然后用1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的样品，从胶中纯化出pET23b 3.7kb大小的酶切片段。与此同时将pGEM-MIFNs质粒进行Nde I和BamH I双酶切，经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收520bp的MIFNs的DNA片段。再将上述两种回收产物在T4 DNA连接酶催化下连接成重组质粒，然后将连接产物转化JM109(pTrcINF)感受态细胞，涂LB-Amp琼脂平板，置37℃培养。
小量制备转化子质粒。质粒用Nde I和BamH I进行酶切可产生两条DNA片段，分别为3.7kb大小的pET-23b载体片段和520bp的rMIIFN DNA片段，与预计情况相符。将获得的阳性重组子命名为pET-MIFNs。阳性重组子进行序列测定。
实施例4 阳性克隆的小量表达和纯化。
诱导后表达的MIFNs，约占菌体总蛋白的10％。，主要以包涵体的形式存在。复性后，用pH7.0 PB缓冲液4℃透析过夜。4℃离心，收集上清液。使用单克隆抗体亲合层析一步法纯化表达的蛋白质(α家族干扰素单克隆抗体由本公司自行研制，具有对α家族干扰素较好的结合特异性，并已申报专利)。用pH7.0 PB缓冲液平衡单克隆抗体柱，将离心后上清液上柱，分别用10个柱体积的M1、M2、M3缓冲液洗脱(M1：0.1％Tween-20/25mmol/L PBS pH7.0，M2：25mmol/L PBS pH7.0，M3：0.1mol/L 甘氨酸-HCl pH2.5)收集M3洗脱峰，立即调pH至7.0。并用pH7.0PB缓冲液4℃透析过夜。经单克隆抗体亲合层析一步法纯化后，即可获得纯度＞85％的样品蛋白。
实施例5 阳性克隆体外活性测定
由于突变分子属于干扰素类蛋白质，因此对其功能活性的测定采用干扰素效价测定常用的细胞病变抑制法。具体包括：WISH细胞的培养；标准溶液制备(IFNα2b)；VSV(水疱炎性口炎病毒)病毒液的制备；攻毒；结晶紫染色和脱色；比色和结果的计算，结果计算采用直线回归法进行处理。分别计算各实验样品的半效稀释倍数(即从样品溶液至相当于标准品50％最大效应点的稀释倍数)，并按下式计算实验结果。
按照上述的方法分别对rMIFNs表达的纯化产物，用WISH细胞病变抑制法检测蛋白质活性，并同时与Infergen(干复津，Amgen公司)做对比，筛选比活性≥1×108IU/mg的分子。进行进一步纯化(纯度＞95％)。
实施例6 MIFNs干扰素分子的精纯
本操作采用了DEAE阴离子交换-单克隆抗体亲合层析-S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。首先对实施例5中筛选到的比活性≥1×108IU/mg分子的复性液进行25mMTris-HCI(pH8.0)透析，透析液通过DEAE弱阴离子交换剂，使MIFNs得到初级纯化，然后利用α家族干扰素单克隆抗体和MIFNs的特异性亲合作用力，将离子交换层析的收集液通过亲合层析柱，使其得到进一步纯化，最后将亲合层析的收集液通过S-100凝胶排阻介质，在脱盐的同时，使其得到精纯。通过以上三步纯化，得到高纯度的rMIFNs。
1)DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析：
首先对复性液进行25mM Tris-HCI(pH8.0)透析，上DEAE柱，用25mmol/LTris-HCl pH(8.0)/0.3MNaCl pH(8.0)洗脱液洗脱，收集洗脱峰组份。
2)单克隆抗体亲合层析
用pH7.0 PB缓冲液平衡单克隆抗体柱，将上洗脱峰收集液上柱，分别用10个柱体积的M1、M2、M3缓冲液洗脱，收集M3洗脱峰，立即调pH至7.0。
M1：0.1％Tween-20/25mmol/L PBS pH7.0
M2：25mmol/L PBS pH7.0
M3：0.1mol/L甘氨酸-HCl pH2.5
3)Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析：
将处理好的上一级收集组份上样，用25mMPBS(pH7.0)缓冲液洗脱，收集主峰即得到rMIFNs半成品。经过整个纯化流程后，rMIFNs的纯度在95％以上，非还原性SDS-PAGE蛋白电泳检查结果表明二聚体所占比率低于5％。
实施例7 高活性新型干扰素突变分子的获得
由于突变分子属于干扰素类蛋白质，因此对其功能活性的测定采用干扰素效价测定常用的细胞病变抑制法。具体的实验内容如：实施例5阳性克隆体外活性测定。筛选比活性≥5×108IU/mg的分子。并将其作为高活性新型干扰素突变分子(纯度＞95％)，其氨基酸序列如附录SEQ ID NO：1-4所示(MIFN1-4)。其中有一分子比活性≥8×108IU/mg，其氨基酸序列如附录SEQ ID NO4(MIFN4)，命名为MIIFN(即MIIFN4)。
实施例8 新型干扰素分子MIIFN的高表达基因和表达载体的人工构建
根据本发明的高活性新型干扰素突变分子(MIIFN)编码的蛋白质的氨基酸序列(附录SEQ ID NO4)，充分利用全基因合成的技术优势，在保证MIIFN的氨基酸序列不变的情况下，将编码MIIFN的密码子，全部换成在大肠杆菌中使用频率最高的密码子，改建后的由MIIFN氨基酸序列推断出的DNA序列如附录SEQ ID NO5所示。然后将合成的MIIFN DNA克隆到大肠杆菌高效表达载体pET-23b中，并经IPTG诱导获得在BL21(DE3)基因工程菌高效表达。
1.化学合成寡聚脱氧核苷酸片段及PCR引物
根据MIIFN的全基因序列，设计20条寡聚脱氧核苷酸片段及两条PCR引物。为便于与表达载体pET-23b连接，在基因的5’端和3’端分别加入Nde I和BamH I限制性酶切位点。
2.寡核甘酸5’端磷酸化反应(2#-19#分别进行)
3.退火反应：1#、20#用1×T4磷酸激酶反应缓冲液稀释至终浓度12.5pmol/10μl互补片段(1#，2#；3#，4#；为互补片段，并由此类推至19#，20#)，各取10μl(等摩尔)分别混合，65℃，15分钟，短暂离心至管底，自然冷却至室温。
4..连接反应：每组退火产物各取1μl，混匀，共10μl，T4连接酶作用下16℃连接过夜。
5.PCR反应：高保真Pyrobest DNA聚合酶作用下，引物为加入 Nde I和BamHI限制性酶切位点的基因5’端和3’端特异性引物，以上述连接混合物为模板PCR，反应条件：95℃，2分钟→(94℃，30秒→65℃，1分钟→72℃，1分钟)×30个循环→72℃，10分钟→4℃。PCR产物在
1.2％琼脂糖胶中进行电泳分析，如附图1。
6.表达载体和受体菌特性
表达载体pET-23b，即依赖T7 RNA聚合酶表达的载体。
载体各组份来源
复制子(ori) pBR322 origin
选择标记 Ampr
启动子 T7噬菌体φ10基因的启动子
终止序列 T7噬菌体φ10基因的终止序列
插入位点 Nde I-BamH I
表达载体特点
要求受体菌中含有T7噬菌体RNA聚合酶的基因，在诱导后产生T7噬菌体RNA聚合酶。由此酶与表达载体上的T7噬菌体的启动子结合而转录表达目的基因。载体同时含翻译用核糖体结合位点(S.D.＝RBS)，使转录产物可直接利用E.coli的翻译机制合成蛋白。
受体菌特性
受体菌：E.coli BL21(DE3)pLysS[8]
基因型：F-ompT-rB-mB-(DE3)pLysS，Cmr
ompT-：外膜蛋白酶缺乏，降低了对表达产物的降解。
rB-mB-：I型限制酶EcoB识别部位蛋白变异。
DE3：是指携带LacUV5启动子指导的T7噬菌体RNA聚合酶基因的λ噬菌体，整合在E.coli的染色体DNA中，可由IPTG诱导表达T7 RNA聚合酶。
pLysS：是另一质粒(LysS是T7溶菌酶基因)，具有氯霉素抗性标记。表达提供少量T7溶菌酶。它是T7噬菌体RNA聚合酶的天然抑制剂，能降低本底表达的T7聚合酶的活性而使靶基因更稳定，也有利于细胞的裂解处理。
7.表达载体的构建及转化
将大肠杆菌表达载体pET-23b质粒，先经Nde I酶切，再用BamH I进行酶切。然后用1％琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的样品，从胶中纯化出pET23b 3.7kb大小的酶切片段。
与此同时目的基因进行Nde I和BamH I双酶切，经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离后，回收520bp的MIIFN的DNA片段。再将上述两种回收产物在T4 DNA连接酶催化下连接成重组质粒，然后将连接产物转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞，涂LB-Amp琼脂平板，置37℃培养过夜。
8.重组表达载体的酶切鉴定及序列分析
用小量制备转化子质粒。质粒用Nde I和BamH I进行酶切可产生两条DNA片段，如附图2所示，分别为3.7kb大小的pET-23b载体片段和520bp的rMIIFNDNA片段，与预计情况相符。将获得的阳性重组子命名为pET-rMIIFN。阳性重组子进行序列测定，测序结果显示，所获得的阳性重组子序列与设计完一致。
9.rMIIFN基因在E.coli中的高效表达
rMIIFN的表达，是用IPTG诱导E.coli染色体上LacUV5启动子，启动合成T7噬菌体RNA聚合酶，由此RNA聚合酶启动重组质粒pET-rMIIFN上的T7启动子，转录出编码rMIIFN的mRNA。此mRNA上含有核糖体结合位点(RBS)，利用E.coli的翻译体系可合成出rMIIFN蛋白。诱导后表达的rMIIFN，约占菌体总蛋白的30％。菌体经超声破碎后，经SDS-PAGE电泳分析，表达产物主要以包涵体形式存在，见附图3。
10.pET-rMIIFN工程菌种子库的建立和遗传稳定性
原始种子库：
菌种来源：原始工程菌种为带有rMIIFN DNA的表达质粒pET-rMIIFN转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。该工程菌经诱导后表达pET-rMIIFN蛋白。
原始种子库的建立
从上述原始种子的平板上挑取单菌落接种于LB-Amp培养基中，37℃摇荡培养14小时，所获的培养液与30％灭菌甘油混合，使甘油终浓度为15％，再分装成40个冻存管，作好标签，放于-70℃保存。每次取出后不得再放回。同时也做成冻干粉保存。此为原始种子库。
pET-rMIIFN工程菌用平板连续传代的稳定性
从原始种子库传出一支pET-rMIIFN/BL21(DE3)pLysS，在LB平板上划线生长，作为第一代种子；从第一代种子接种，在无选择压力的LB平板上划线，37℃生长12小时，作为第二代种子；依次类推传至第一百代。选取第一代、第十代、第二十五代、第五十代、第七十代、第一百代种子，提取质粒，经电泳检查，质粒的有无及大小均无变化，见附图4。同时，取上述各代种子，摇床培养，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE电泳检测，各代种子的表达水平无明显变化，见附图5。上述结果证明，工程菌pET-rMIIFN/BL21(DE3)pLysS在无选择压力下用平板连续传一百代仍是稳定的。
根据rMIIFN氨基酸序列，采用大肠杆菌偏性密码子，合成了rMIIFN的全长DNA序列，将rMIIFN DNA亚克隆入表达载体pET-23b中，获得了可编码rMIIFN成熟蛋白的重组质粒pET-rMIIFN。该重组子在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS受体细胞中，可高效稳定的表达，表达产物主要以包涵体形式存在，占菌体总蛋白量的30％左右，工程菌种稳定性很好。故已得到了适合用于生产的rMIIFN基因工程菌种。
实施例9 rMIIFN新型干扰素突变分子的高度纯化工艺
粗纯：将发酵收集的菌体以1∶50的比例用裂解液(50mM TE pH8.0，50ml TE/1g菌)溶解，4℃下超声破碎菌体(超声条件：功率600W、每次打15秒、歇10秒、每批处理30分钟)。将超声波裂解产物12000rpm离心20分钟，收集包涵体沉淀，1∶10的比例用7M Gu.HCl缓冲液，于4℃搅拌裂解包涵体，室温放置2小时。4℃离心，取上清液，以0.15M pH9.5硼酸1∶100缓慢成比例稀释复性，复性液置4℃过夜。4℃离心，取上清液，即为粗纯rMIIFN。
精纯：本操作采用了DEAE阴离子交换-Cu2+鏊合层析-S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。通过以上三步纯化，得到高纯度的rMIIFN。如附图6。具体纯化工艺如下：
1)DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析：
考虑到复性液体积较大且杂蛋白较多，如果直接上亲合层析柱的话，亲合层析柱的纯化压力较大，先走一步阴离子交换柱，使上清得到初步纯化就可以解决这个问题。首先对复性液进行25mMTris-HCI(pH8.0)透析，上DEAE柱，用25mmol/L Tris-HCl pH(8.0)/0.3MNaCl pH(8.0)洗脱液洗脱，收集洗脱峰组份。研究结果表明，这一步可以去除掉绝大多数的杂蛋白，经过这一步，rMIIFN纯度达到80％以上。
2)Cu2+鏊合层析-Chelating Sepharose Fast Flow亲合层析柱层析：
第一步洗脱峰组份上样到充分平衡好的Cu2+鏊合层析-Chelating SepharoseFast Flow亲合层析柱上，上样完毕用2个柱体积的50mM Tris-HCl(pH7.5)/100uMCuSO4/50mM NaCI即平衡液冲洗，随后分别用2个柱体积的50mMTris-HCl(pH7.5)/100uM CuSO4/0.5MNaCI洗脱，最后用50mM NaCI/100mM甘氨酸(pH2.5)洗脱，收集洗脱峰组份，用盐酸调pH值到7.0，以备下一级柱层析即Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析。研究结果表明，经过这一步柱层析分离，使rMIIFN纯度进一步提高到90％以上，杂蛋白含量已经微乎其微，同时将蛋白液进一步浓缩，为最后一步样品的纯化提供了很好的处理浓度和体积条件。
3)Sephacryl S-100凝胶过滤柱层析：
将处理好的上一级收集组份上样，用25mMPBS(pH7.0)缓冲液洗脱，收集主峰即得到rMIIFN半成品。经过整个纯化流程后，rMIIFN的纯度在95％以上，非还原性SDS-PAGE蛋白电泳检查结果表明二聚体所占比率低于5％。
实施例10 rMIIFN新型干扰素突变分子的理化性质检测
rMIIFN纯度检测：非还原SDS-PAGE检测和HPLC分子筛检测显示纯度＞98％。HPLC分子筛条件：上样量90ug；洗脱条件为0.125M NaCI/20mM PBS pH7.0，流速0.5ml/min。计算洗脱峰面积为98.92％，如附图7。
rMIIFN氨基端测序：序列测定为M C D L P Q T H S L G S RR T L其中从Met开始的占15％，从Cys开始的占85％。
rMIIFN分子量测定：还原SDS-PAGE检测显示其分子量在19000±10％。飞行时间质谱分析测定分子量为18856.96 Da(道尔顿)。如附图8。
rMIIFN等电点测定：等点聚焦电泳测定蛋白质主区带分布在5.8-6.6之间。如附图9。
实施例11 rMIIFN新型干扰素突变分子的抗病毒活性检测
对其功能活性的测定采用干扰素效价测定常用的WISH细胞病变抑制法。具体的实验内容如实施例5：体外活性测定及新型干扰素突变分子的获得，所示。并同时以IFN-α2b(中国药品生物制品检定所提供)为标准品。rMIIFN比活性≥8×108IU/mg。
说明书附录
<110>北京三元基因工程有限公司
<120>新型α干扰素突变分子
<160>5
<210>1
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Ala
1 5 10 15
Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys
20 25 30
Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp
35 40 45
Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu
50 55 60
Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
65 70 75
Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu
80 85 90
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val
95 100 105
Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala
110 115 120
Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys
125 130 135
Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met
140 145 150
Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg
155 160 165
Lys Asp - -
167
<110>北京三元基因工程有限公司
<120>新型α干扰素突变分子
<160>5
<210>2
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr
1 5 10 15
Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys
20 25 30
Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp
35 40 45
Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu
50 55 60
Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
65 70 75
Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu
80 85 90
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val
95 100 105
Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala
110 115 120
Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys
125 130 135
Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met
140 145 150
Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Arg Leu Arg Arg
155 160 165
Lys Asp - -
167
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<120>新型α干扰素突变分子
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr
1 5 10 15
Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys
20 25 30
Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp
35 40 45
Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu
50 55 60
Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
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Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val
95 100 105
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140 145 150
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg Thr
1 5 10 15
Leu Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys
20 25 30
Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp
35 40 45
Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu
50 55 60
Met Ile Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser
65 70 75
Ala Ala Trp Asp Glu Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu
80 85 90
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val
95 100 105
Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Val
110 115 120
Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys
125 130 135
Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met
140 145 150
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155 160 165
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<210>5
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
atgtgtgacc tgccgcagac ccactctctg ggttctcgtc gtaccctgat cctgctggct 60
cagatgcgtc gtatctctcc gttctcttgc ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg 120
caggaagagt tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctctgt tctgcacgaa 180
atgatccagc agaccttcaa cctgttctct accaaagact cttctgctgc ttgggacgaa 240
tctctgctgg aaaaattcta caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcatgc 300
gttatccagg aagttggtgt tgaagaaacc ccgctgatga acgttgactc tatcctggtt 360
gttaaaaaat acttccagcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctctccgtgt 420
gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttctttct ctctgtctac caacctgcag 480
gaacgtctgc gtcgtaaaga ctaatag 507
Claims (9)
1.多种新型α干扰素突变体，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO1-4。
2.多种多核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：1-4所述氨基酸序列的蛋白质。
3.一种重组载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸序列。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求3所述的载体。
5.一种α干扰素突变体的制备方法，其特征在于，该方法包含：在适合表达权利要求1所述的蛋白质的条件下，培养权利要求4所述的的宿主细胞。从培养物中分离出权利要求1所述的蛋白质。
6.根据权利要求5的制备方法所制取的权利要求1所述的蛋白质药品。
7.一个人工合成的干扰素MIIFN基因在大肠杆菌中的高效表达系统，其特征在于：
1)其编码的蛋白质序列与权利要求1中所述的氨基酸序列SEQ ID NO4相同。
2)人工设计的基因序列为(DNA序列与SEQ ID NO5相同)：
1
atgtgtgacctgccgcagacccactctctgggttctcgtcgtaccctgatcctgctggct
M C D L P Q T H S L G S R R T L I L L A
61
cagatgcgtcgtatctctccgttctcttgcctgaaagaccgtcacgacttcggtttcccg
Q M R R I S P F S C L K D R H D F G F P
121
caggaagagttcgacggtaaccagttccagaaagctcaggctatctctgttctgcacgaa
Q E E F D G N Q F Q K A Q A I S V L H E
181
atgatccagcagaccttcaacctgttctctaccaaagactcttctgctgcttgggacgaa
M I Q Q T F N L F S T K D S S A A W D E
241
tctctgctggaaaaattctacaccgaactgtaccagcagctgaacgacctggaagcatgc
S L L E K F Y T E L Y Q Q L N D L E A C
301
gttatccaggaagttggtgttgaagaaaccccgctgatgaacgttgactctatcctggtt
V I Q E V G V E E T P L M N V D S I L V
361
gttaaaaaatacttccagcgtatcaccctgtacctgaccgaaaaaaaatactctccgtgt
V K K Y F Q R I T L Y L T E K K Y S P C
421
gcttgggaagttgttcgtgctgaaatcatgcgttctttctctctgtctaccaacctgcag
A W E V V R A E I M R S F S L S T N L Q
481
gaacgtctgcgtcgtaaagactaatag
E R L R R K D - -
3)将合成基因装入高效表达载体pET-23b，构建成pET-rMI IFN表达质粒。
4)将pET-rMIIFN表达质粒转化BL21(DE3)工程菌，构建成BL21(DE3)/pET-rMIIFN工程菌株。
8.一种纯化方法，其特征在于，
1)纯化权利要求7所述的表达产物。
2)7M盐酸胍溶解包涵体。
3)0.15M pH9.5硼酸稀释复性。
4)相继使用DEAE阴离子交换-Cu2+鏊合层析-S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。
9.应用于药物生产和其它产品，其特征在于，
1)应用了权利要求7所述的高效表达系统。
2)应用了权利要求8所述的纯化方法。
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