CN1234855C - 重组Flt3配体基因，及其融合基因与产物 - Google Patents

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CN1234855C CN 01132280 CN01132280A CN1234855C CN 1234855 C CN1234855 C CN 1234855C CN 01132280 CN01132280 CN 01132280 CN 01132280 A CN01132280 A CN 01132280A CN 1234855 C CN1234855 C CN 1234855C
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flt3
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ser
flt3 ligand
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高虹
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Abstract

本发明提供了一种重组Flt3配体基因，其中的密码子适合CHO细胞表达。本发明还提供一种包含该重组基因的融合基因。当本发明的基因或融合基因表达时，其在CHO等哺乳动物细胞中的表达量及其对Flt3的亲和力均显著提高。

Description

重组Flt3配体基因，及其融合基因与产物
发明领域
本发明涉及Flt3配体(c-fms样酪蛋白激酶3配体)的重组基因，以及含该重组基因的融合基因及其产物。
发明背景
Flt3配体有非常独特的生物学用途，它是早期造血生长因子，作用于表达Flt3受体的原始造血干/祖细胞，使之增殖和分化，并抑制它们的凋亡，是造血干细胞的激动剂和保护剂。其天然基因序列已被测定，并获得了GenBank登录号T03858。近来研究表明，Flt3配体还能显著地增加树突状细胞(Dendritic cells，DC)和自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)的数量和功能，由于DC和NK在机体的免疫监督和免疫调控中起到重要的作用，因此Flt3配体在抗肿瘤免疫方面有很好的应用前景。
鉴于DC和NK在机体免疫反应中的关键作用，因此Flt3配体有望应用于肿瘤的治疗中，其有效性已经在白血病、纤维肉瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、前列腺癌、乳癌、肺癌等多个动物实验中得到了证明。全身应用重组的Flt3配体蛋白，均能在这些不同的肿瘤实验模型中，引起部分肿瘤消退或者生长速度明显减慢，并且可能激发肿瘤特异性免疫反应。目前，Flt3配体的重组蛋白主要与其他细胞因子联合应用或进行基因治疗，提高了疗效。
但是，由于恶性肿瘤通过各种机制逃脱机体的免疫监控，在抑制机体的免疫力的同时，自身的异常抗原不被机体识别和有效提呈加速了肿瘤的形成和发展，这可能是Flt3配体对一些免疫原性差的肿瘤不能导致其完全消退和控制远处转移的原因之一。将其与肿瘤局部放疗联合，能导致肿瘤细胞凋亡，使照射后的细胞成为理想的癌抗原缓释库，DC能获得凋亡细胞的抗原并有效提呈，刺激特异性CD8+CTL的增生，在局部肿瘤消退的同时能减少肺脏远处转移，从而延长高度转移性的低免疫原性Lewis肺癌模型小鼠的生存率，首次证明了Flt3配体与放疗等肿瘤传统疗法联合应用的可能性。
因此，作为早期造血生长因子的Flt3配体，具备了独特而又强大的增强免疫功能，其重组蛋白单独或与其它细胞因子联合全身应用，或基因治疗均被证明能产生显著的抗肿瘤效果，在肿瘤的预防和治疗方面显示出很好的临床应用前景。然而，现在的技术仍然存在表达量低，Flt3配体与Flt3亲和力小的问题，不能满足本领域对抗肿瘤免疫日益增长的需要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组的Flt3配体基因，它能够提高该基因在哺乳动物细胞内的表达。
本发明的目的还在于提供一种含有该重组基因的融合基因，以及由此得到的融合蛋白，该融合蛋白具有更强的免疫活性。
本发明的目的还在于提供含有本发明重组基因的重组载体，可转染哺乳动物细胞而实现高表达。
在本发明的一个实施例中，提供了一种重组Flt3配体基因序列，该重组Flt3配体基因具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种融合基因，该融合基因含有重组Flt3配体基因序列和与之融合的人IgG1抗体可结晶片段(Fc，crystallizablefragment)基因。在本发明的一个优选例中，该融合基因还包含一段位于重组Flt3配体基因与人IgG1抗体Fc片段之间的接头序列，其DNA序列编码SEQ IDNO：5的氨基酸序列。在另一个优选例中，该接头的DNA序列是SEQ ID NO：4。
在本发明的还有一个实施例中，提供了一种重组载体，该重组载体含有上文实施例中所述的融合基因。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞被上述载体转染。
在本发明的一个实施例中，提供了一种蛋白质，该蛋白质含有Flt3配体和人IgG1抗体Fc片段。在本发明的一个优选例中，所述蛋白质还含有接头肽的氨基酸序列SEQ ID NO：5。
本文所用的术语“宿主细胞”意味着含有一表达载体并支持该表达载体复制或表达的细胞。宿主细胞可以是大肠杆菌等原核细胞，或酵母、昆虫、两栖类或CHO、HeLa等哺乳动物细胞等真核细胞，如培养的细胞、外植体和体内细胞。在本发明的一个优选例中，该宿主细胞是CHO。
本文所用的术语“载体”是重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列允许特定核酸在宿主细胞中转录的特定核酸元件。载体可以是质粒、病毒、或核酸片段的一部分。通常，载体包含与启动子可操纵性连接的待转录的核酸。
当对细胞或DNA、蛋白质或载体使用术语“重组”时，指该细胞、DNA、蛋白质或载体已通过引入异源DNA或蛋白质，或改变天然DNA或蛋白质而被修饰，或该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此例如，重组细胞表达了在细胞的天然(非重组)形式中未发现的基因，或表达低下或根本不表达天然基因。
附图简述
图1是pMG18的结构示意图。其中“hCMV pro”表示人巨细胞病毒启动子。
具体实施方式
根据GenBank的资料(登录号T03858)，Flt3配体基因的天然编码序列为(SEQ ID NO：1)：
acccaggact gctccttcca acacagcccc atctcctccg acttcgctgt caaaatccgt     60
gagctgtctg actacctgct tcaagattac ccagtcaccg tggcctccaa cctgcaggac    120
gaggagctct gcgggggcct ctggcggctg gtcctggcac agcgctggat ggagcggctc    180
aagactgtcg ctgggtccaa gatgcaaggc ttgctggagc gcgtgaacac ggagatacac    240
tttgtcacca aatgtgcctt tcagcccccc cccagctgtc ttcgcttcgt ccagaccaac    300
atctcccgcc tcctgcagga gacctccgag cagctggtgg cgctgaagcc ctggatcact    360
cgccagaact tctcccggtg cctggagctg cagtgtcagc ccgactcctc aaccctgcca    420
cccccatgga gtccccggcc cctggaggcc acagccccga cagccccc                 468
其氨基酸序列为(SEQ ID NO：2)：
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
1                5                  10                  15
Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val
            20                  25                  30
Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp
         35                 40                  45
Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala
    50                  55                   60
Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His
65                  70                   75                  80
Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe
                 85                  90                  95
Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu
            100                 105                 110
Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu
        115                 120                 125
Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser
    130                 135                  140
Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro
145                 150                 155
其中N-端23个氨基酸是信号肽。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种新的重组Flt3配体基因，其中的密码子符合哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，所述重组基因的序列为(SEQ ID NO：3)：
acccaggact gctccttcca gcactccccc atctcctccg acttcgccgt gaagatccgc     60
gagctgtccg actacctgct gcaggactac cccgtgaccg tggcctccaa cctgcaggac    120
gaggagctgt gcggcggcct gtggcgcctg gtgctggccc agcgctggat ggagcgcctg    180
aagaccgtgg ccggctccaa gatgcagggc ctgctggagc gcgtgaacac cgagatccac    240
ttcgtgacca agtgcgcctt ccagcccccc ccctcctgcc tgcgcttcgt gcagaccaac    300
atctcccgcc tgctgcagga gacctccgag cagctggtgg ccctgaagcc ctggatcacc    360
cgccagaact tctcccgctg cctggagctg cagtgccagc ccgactcctc caccctgccc    420
cccccctggt ccccccgccc cctggaggcc accgccccca ccgccccc                 468
为了克隆和表达的目的，该基因编码产物N-端的前23个氨基酸是信号肽序列。
本发明还提供了含有上述重组Flt3配体基因序列的融合基因，其中该重组基因与人IgG1的Fc片段基因融合。
在本发明的一种优选实施方式中，重组Flt3配体基因通过一段接头序列与人IgG1的Fc片段融合，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：5
Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ser
1                5                   10                  15
Ser Ser Ala Ala
             20
该氨基酸序列的DNA序列之一为SEQ ID NO：4
tcctcctccg ccgcctcctc ctccgccgcc tcctcctccg ccgcctcctc ctccgccgcc    60
发明效果
本发明在构建人Flt3配体与人IgG1的Fc片段的融合基因时，通过人工重新设计Flt3配体基因及其与Fc片段之间的接头序列，使该融合蛋白的亲和力及其在CHO等哺乳动物细胞中的表达量得到了显著提高。
下列实施例是为了更好的说明本发明，不是为了限制本发明在权利要求中所限定的范围。
实施例
                          实施例1
                 全长重组Flt3配体基因的制备
Flt3配体基因的人工序列
根据哺乳动物细胞使用密码子的偏爱性，已知Flt3配体片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：2，GenBank登录号T03858)，设计了一段新的重组Flt3配体基因(SEQ ID NO：3)：
acccaggact gctccttcca gcactccccc atctcctccg acttcgccgt gaagatccgc     60
gagctgtccg actacctgct gcaggactac cccgtgaccg tggcctccaa cctgcaggac    120
gaggagctgt gcggcggcct gtggcgcctg gtgctggccc agcgctggat ggagcgcctg    180
aagaccgtgg ccggctccaa gatgcagggc ctgctggagc gcgtgaacac cgagatccac    240
ttcgtgacca agtgcgcctt ccagcccccc ccctcctgcc tgcgcttcgt gcagaccaac    300
atctcccgcc tgctgcagga gacctccgag cagctggtgg ccctgaagcc ctggatcacc    360
cgccagaact tctcccgctg cctggagctg cagtgccagc ccgactcctc caccctgccc    420
cccccctggt ccccccgccc cctggaggcc accgccccca ccgccccc                 468
其中该基因5′端的69个核苷酸是便于哺乳动物细胞分泌蛋白质的信号肽序列。
该产物的氨基酸序列为SEQ ID NO：2
Thr Gln Asp Cys Ser Phe Gln His Ser Pro Ile Ser Ser Asp Phe Ala
1                5                  10                  15
Val Lys Ile Arg Glu Leu Ser Asp Tyr Leu Leu Gln Asp Tyr Pro Val
            20                  25                  30
Thr Val Ala Ser Asn Leu Gln Asp Glu Glu Leu Cys Gly Gly Leu Trp
        35                  40                  45
Arg Leu Val Leu Ala Gln Arg Trp Met Glu Arg Leu Lys Thr Val Ala
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Met Gln Gly Leu Leu Glu Arg Val Asn Thr Glu Ile His
65                  70                  75                  80
Phe Val Thr Lys Cys Ala Phe Gln Pro Pro Pro Ser Cys Leu Arg Phe
                85                  90                  95
Val Gln Thr Asn Ile Ser Arg Leu Leu Gln Glu Thr Ser Glu Gln Leu
            100                 105                 110
Val Ala Leu Lys Pro Trp Ile Thr Arg Gln Asn Phe Ser Arg Cys Leu
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Glu Leu Gln Cys Gln Pro Asp Ser Ser Thr Leu Pro Pro Pro Trp Ser
    130                 135                  140
Pro Arg Pro Leu Glu Ala Thr Ala Pro Thr Ala Pro
145                 150                 155
加上接头的Flt3配体重组基因与接头融合的基因设计
在该基因3′-端加上接头(Ser3Ala2)4编码区，其编码序列为：5′-tcctcctccgccgcctcctc ctccgccgcc tcctcctccg ccgcctcctc ctccgccgcc-3′(SEQ ID NO：4)。
将该设计的全新基因和重组基因与已知的人IgG1的Fc片段(Genbank登录号P01857)融合，形成新的Flt3配体基因/接头/IgG1 Fc基因。
                           实施例2
           天然和人工设计的全Flt3配体基因的人工合成
将上述人工设计的Flt3配体基因序列、天然Flt3配体基因序列以及它们的互补链序列、接头序列按照每个DNA片段两端各有20个碱基互补区拆分成16个长度在83-86bp的寡核苷酸序列，进行PAGE纯化后，按照下述方法进行PCR。
反应体系：
         试剂名称                     数量(Tl)
         10XPCR缓冲液                 5
         Mg++(25毫摩尔/升)           2.5
         dNTP(10毫摩尔/升)            2
         Taq DNA聚合酶(5T/Tl)         1
         寡核苷酸(100T摩尔/升)        各1
         H2O                        至50微升
循环条件：
预变性：94℃2分钟
主循环：94℃1分钟，52℃1分钟，72℃1分钟，循环30次。
后延伸：72℃5分钟。
PCR完成后，在1％琼脂糖电泳上鉴定扩增的片段，发现在分子量450-500bp范围内有唯一的一条条带，用Promega公司的胶回收试剂盒回收后按照常规方法克隆到pGEM-T载体(Promega公司，Madison，MI)上，转化大肠杆菌DH5α菌株，然后经过蓝白斑筛选和酶切鉴定后选出5个候选克隆，对其中两个进行DNA测序，根据测序结果，确认其中一个序列完全正确。
把天然的Flt3配体基因记作Flt3/N，人工设计的Flt3配体基因记作Flt3/M，通过上述PCR工作，类似分别合成了人工设计的Flt3/M-IgG1Fc、Flt3/M-接头-IgG1Fc、天然编码序列的Flt3/N-IgG1Fc和Flt3/N-接头-IgG1Fc四个融合基因。
                          实施例3
                      表达载体的构建
用Xba I和Nhe I酶切实施例2中得到的4种融合蛋白基因克隆的DNA，以及质粒pMG18(DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTALMONITORING BASED ON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas School of Biological Sciences，University ofBirmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept ofMicrobiology，Belarus State University Scorina Av.4，Minsk 220080 Belarus)，其质粒图谱如图1。
用1％琼脂糖凝胶电泳分离后进行胶回收，所得纯化的DNA按常规方法克隆到pMG18载体上，转化大肠杆菌DH5α菌株。经过蓝白斑筛选和酶切鉴定后选出的5个候选克隆中的两个进行DNA测序，根据测序结果，确认其中一个序列完全正确。
用上述方法，构建了4种载体，分别表达人工设计的Flt3/M-IgG1Fc、Flt3/M-接头-IgG1Fc、天然编码序列的Flt3/N-IgG1Fc和Flt3/N-接头-IgG1Fc四种融合基因。
                          实施例4
                CHO细胞的转染与重组克隆的筛选
将如上述实施例3构建的4种表达载体转化的大肠杆菌DH5α菌株接种分别于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公式的UltraPure Plasmid DNAPurification Kit抽提纯化质粒DNA。纯化条件按照厂商说明书。
在选择培养基上进行连续9周筛选二氢叶酸还原酶活性和氨苄青霉素抗性，然后在96孔板上进行极限稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。先后获得了Flt3/M-IgG1Fc克隆86个，Flt3/M-接头-IgG1Fc克隆69个，Flt3/N-IgG1Fc克隆77个，Flt3/N-接头-IgG1Fc克隆91个。
                             实施例5
                      融合蛋白表达量的研究
挑出单克隆细胞系在RPM1641培养基上以37℃、5％CO2在培养箱中进行扩增培养，离心，用ELISA测定其表达量。结果发现Flt3/M-IgG1Fc和Flt3/M-接头-IgG1Fc细胞系的平均表达强度明显高于Flt3/N-IgG1Fc和Flt3/N-接头-IgG1Fc细胞系。结果列于表1。
                        表1融合基因的表达量的比较
  融合基因的结构   Flt3/M-IgG1Fc   Flt3/M-接头-IgG1Fc   Flt3/N-IgG1Fc   Flt3/N-接头-IgG1Fc
  表达量(毫克/升)   3.14   3.22   0.87   0.72
从上述结果可见，经过人工设计的重组Flt3配体基因在CHO细胞中的表达强度比天然基因高约4倍。用Protein A亲核层析和离子交换层析，从上述4种细胞系表达的上清液中获得了经SDS-PAGE电泳检查证明，纯度大于92％的重组蛋白质。
上述亲和层析的产物再次经分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。所得的样品用于下列进一步的研究。
                        实施例6
                       亲和力研究
将5×106小鼠WWF7(表达Flt3)细胞平分成15管，将待测重组Flt3配体融合蛋白(1.2毫克/毫升)按照2，4，8，16ug/管的量加入到细胞中，37℃5％CO2培养箱中培养24小时后加入MTT(四甲基偶氮唑)至终浓度1毫克/升，继续培养1小时，在酶标仪上读取570纳米处的光吸收。下文表2是实验结果(表中数据为占16微克阳性对照的百分数)。
                                  表2亲和力比较
  融合基因的结构   阳性对照   Flt3/M-IgG1Fc   Flt3/M-接头-IgG1Fc   Flt3/N-IgG1Fc   Flt3/N-接头-IgG1Fc
  2微克   21.1   23.7   101.7   22.0   113.6
  4微克   49.6   46.2   266.2   50.7   301.4
  8微克   67.7   67.4   374.3   86.5   365.5
  16微克   100.0   103.8   467.6   99.7   456.7
上述结果说明，比较含有接头和不含有接头的融合蛋白的亲和力，由于该融合基因中接头序列的加入，使得其亲和力提高了5倍以上。
                        序列表
<110>上海兰生国健生物技术研究中心
<120>重组Flt3配体基因，及其融合基因与产物
<130>016012
<160>5
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>468
<212>DNA
<213>人(Homo Sapiens)
<400>1
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<210>2
<211>156
<212>PRT
<213>人(Homo Sapiens)
<400>2
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<210>3
<211>468
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>重新设计的Flt3配体编码序列
<400>3
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aagaccgtgg ccggctccaa gatgcagggc ctgctggagc gcgtgaacac cgagatccac    240
ttcgtgacca agtgcgcctt ccagcccccc ccctcctgcc tgcgcttcgt gcagaccaac    300
atctcccgcc tgctgcagga gacctccgag cagctggtgg ccctgaagcc ctggatcacc    360
cgccagaact tctcccgctg cctggagctg cagtgccagc ccgactcctc caccctgccc    420
cccccctggt ccccccgccc cctggaggcc accgccccca ccgccccc                 468
<210>4
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>接头肽编码序列
<400>4
tcctcctccg ccgcctcctc ctccgccgcc tcctcctccg ccgcctcctc ctccgccgcc    60
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>接头肽
<400>5
Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ser
1               5                   10                  15
Ser Ser Ala Ala
            20

Claims (8)

1.一种重组Flt3配体基因序列，其特征在于，该Flt3配体基因具有SEQ IDNO：3的核苷酸序列。
2.一种融合基因，其特征在于，该融合基因含有如权利要求1所述的重组Flt3配体基因序列和与之融合的人IgG1抗体Fc片段基因。
3.如权利要求2所述的融合基因，其特征在于，该融合基因还包含一段位于重组Flt3配体基因与人IgG1抗体可结晶片段之间的接头序列，所述接头序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。
4.如权利要求3所述的融合基因，其特征在于，所述接头的DNA序列为SEQID NO：4。
5.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求2所述的融合基因。
6.一种重组宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞含有权利要求5所述的载体。
7.一种重组蛋白质，其特征在于，该蛋白质是Flt3配体和人IgG1抗体可结晶片段的融合蛋白，所述Flt3配体是权利要求1所述的重组Flt3配体基因序列编码的。
8.如权利要求7所述的重组蛋白质，其特征在于，该蛋白质还含有位于重组Flt3配体基因与人IgG1抗体可结晶片段之间的接头肽氨基酸序列SEQ IDNO：5。
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